CS268157B2 - Method of particular biological cells separation from other cells and device for realization of this method - Google Patents

Description

Vynález ее týká způsobu oddělování určitých biologických buněk od jiných buněk a zařízení к provádění tohoto způsobu, zejména takových způsobů á zařízení, která zachycují jednotlivé buňky na znáaých «lstech, aby bylo možné provést selekci alespoň jedné subpopulace buněk za použití definovaných parametrů společných pro členy subpopulace z daleko Širší obecné populace buněk·

Zařízení a způsoby pro selekci a oddělování subpopulací biologických buněk, například buněk obsažených v krvi, jsou známy· Níže bude uvedeno několik metod, které jsou považovány za důležité a charakteristické pro dosavadní stav techniky·

Oddělování založené na adhesi buněk· Ta to metoda není velmi účinná a není vhodná pro oddělování různých buněk, které mají stejné membránové vlastnosti, například buněk, které ulpívají na skle·

Oddělování immunofluorescencí· Tento způsob je založen na známývh vlastnostech vázání subpopulací buněk na určité antigeny nebo/a antltělesa. Jejich vazba к buňkám v později ía stadiu «ůže být použita pro identifikaci buňky· Avšak tato metoda Je značně omezená, jelikož jí nelze použít pro oddělování buněk na základě měření jejich biologických aktivit nebo odezvy na vázanou látku·

Elektroforéza· Tato metoda je založena na oddělování buněk podle elektrického náboje buňky· Proto ji nelze použít pro oddělování různých skupin buněk, jež mají stejný náboj nebo hmotnost·

Metody používající záření, jako immunologické pokusy, pokusy s radioaktivními látkami, pokusy se včleňováním radioaktivních látek· Radíoenzymologické zkoušky· Tímto způsobem nelze oddělovat od sebe skupiny buněk, ani rozeznávat podskupinu uvnitř skupiny na základě její aktivity nebo neaktivity a její reakce·

Morfologie· Rozlišování mezi buňkami je založeno na jejich fyzickém vzhledu· Tato metoda je rychlá, avšak je ze všech nejhrubší·

Oddělování buněk podle jejich specifické hustoty (gradientově technika)· Při tomto postupu buňky plují na izotopickém roztoku známé hustoty, se známým osmotickým tlakem a viskositou· Tato konfigurace se vystaví urychlujícím silám odstřelováním při dané teplotě a zrychlení· Buňky, mající specifickou hmotnost větší než roztok, klesnou· Ty buňky, jež mají specifickou hustotu stejnou jako roztok, jsou v roztoku suspendovány a buňky, jež nají specifickou hustotu menší než roztok, plují nad roztokem· Hlavním problémem této metody je zařazení buněk do komůrek uvnitř gradientu hustoty, což je ovlivňováno okolními podmínkami, jako teplota, oamotický tlak, zrychlení, například vzdálenost rozhraní mezi krví a gradient od osy roztáčení·

Kromě shora uvedených nevýhod různých dosavadních způsobů, mají tyto způsoby nevýhodu společnou pro všechny v důsledku skutečnosti, že oddělené buňky téměř vždy zahrnují buňky náležející jinam než je uvažovaná skupina nebo podstkuplna· Z toho důvodu je jakákiliv diagnóza buněk, oddělených kterýmkoliv shora uvedeným způsobem, nutně nepřesná, i když všechny kroky byly provedeny s nejvyšší přesností·

Například t· Cerek et al· popisují test SCM (Structuredness of Cytoplastic Metr ix) v Biophys· červenec 1978, sv· 23, č· 1, str· 395 a další· v tomto článku autoři připouštějí, že při shora popaané gradientově metodě obsahovaly oddělené buňky asi 50 % nežádoucích buněk navzdor velké péčí, se kterou byla zkouška prováděna·

Z toho důvodu je hlavním účelem vynálezu vytvořit způsob a zařízení pro selekci skupiny buněk z jiných buněk a dále oddělit vybrané buňky jednu od druhé· Každá ze zvolených buněk, navzájem od aebe oddělených, má být na přesném známém místě· Všechny vybrané buňky mohou být podrobeny společným zkouškám, avšak účinek na každou jednotlivou buňku je určitelný, čímž ae umožní přesnější diagnóza· zkoušky a působení na každou buňku ae provádějí automaticky za účelem snížení doby zkoušení, což je výkon, který mohou provádět relativně neěkolené síly·

CS 268157 82

Neschopnost úplně oddělit určitou skupinu buněk ode všech ostatních, oá značný vliv na přesnost diagnózy· Děle, což je nejvýznačněJší, и shora popsaných úkonů» je oddělování buněk a následující zkoušky na niob prováděné na «akrozákladně «píše než na •ikrozákladně, tj· základna, při které vybrané buňky jsou navzáje· odděleny a každá buňka nůže být odděleně zkoušena a zkoumána. Oakákoliv soustava a způsob pro oddělování vybraných zajímavých buněk od ostatních buněk a dále pro oddělení vybraných buněk od sebe navzájem, takže každá nůže být odděleně zkoušena nebo/a vyšetřována, aby aěly velký význam pro prováděni diagnózy různých biologických stavů a pro jiné účely· Zkoušení a vyěctřovéní jednotlivých vybraných buněk by odstranilo oayly, které nyní existují při anohých diagnózách, založených ne nepřesných statistických kritériích.

Předmět·· vynálezu je způsob oddělování určitých biologických buněk od jiných buněk pro pozorování a zpracování těchto buněk, vyznačující se ti·, že se ze saěeí různých buněk oddělí pouze buňky požadované velikostí zadržení· v otvorech o velikosti, odpovídej lei velikostí buněk, na otvory se zachycenými buňka·! se aplikuje síla к usnadnění zachycení nebo к uvolnění buněk z otvorů, vlastností zachycených buněk se zkouaají a zachycené nebo uvolněné buňky se zpracovávají požadovaný· způsobe··

Předměte· vynálezu je rovněž zařízení pro selekcí určitých biologických buněk, vyznačující se tí·, že obsahuje nosič přede· zvolené tloušťky mezí horní· a spodní· povrche·, eezi horní· a protilehlý· spodní· povrche· probíhá větší počet otvorů v přede· zvolené· uspořádání, otvory aají přede· zvolenou konfiguraci a přede· zvolené rozměry na horní* a spodní· povrchu nosič·, definovatelné jako horní a spodní rozaěry, přičemž horní rozměr každého otvoru je větší než jeho nejaenši vnitřní příčný rozaěr a tloušEke nosiče a horní rozměr každého otvoru odpovídají rozoěrůs určitých biologických buněk, dále obsahuje držáky pro uložení nosiče v určité· aístě, každý otvor nosiče je uložen na stanovišti, definovatelné· Jako adresa vůči držáku a popřípadě střední Část, selektivně přeatavítelnou vzhlede· к držáku a řídícíau přístroji a zařízení je určeno к zachycení jednoho lyefocytu v každé· otvoru·

Zařízení a výhodou obsahuje alespoň jeden prostředek pro aplikaci síly ze skupiny vodiče, uloženého v přede· určené poloze vzhlede· к otvorů·, prostředků к vytvoření tlakového rozdílu a/nebo prostředků pro zvýšení přilnavostí buněk к otvorů·, a to spodní část, horní Část a těsnící lištu průtokové komory a na držáku je uložena řada od sebe oddálených nosičů a otvory, odpovídející·i rozměrů· buněk, každý otvor nosiče je uložen na stanovišti, definovatelné· jako adresa vůči držáku a případná střední část je selektivně posunutelná vzhlede· к držáku, dále zařízení obsahuje přístroje pro pozorování e/nebo měření vlastnosti buněk a řídící přístroj, upravený pro řízeni relativního pohybu těchto přístrojů vzhlede· к nosiči, na držáku je uložena řada od sobe oddálených nosičů a otvory, odpovídějícími rozměrů· buněk, střední část je posunutelná vzhlede· к držáku a řídicí přistroj je upraven pro řízení pohybu přístrojů pro pozorování a/nebo «ěření vlastností buněk vzhlede· к nosičů·, a dřžák a střední část jsou posunutelné vzhlede· к sobě navzáje··

Buňky v nosných otvorech lze pak podrobit biologický· zkoušká· a jejich zvláštní vlastnosti jsou měřeny na bázi buňka po buňce, aby se určilo, které z buněk náležejí do určité podskupiny na základě jejich zvláštních vlastností a jejich Měřených parametrů· Jakmile byla identifikována podskupina buněk, jelikož keždá její buňka je na známé adrese, jsou znáay adresy všech buněk podskupiny· Takto lze vystevit všechny buňky jednoau nebo několika testů·, avšak také vyšetřovat vlastnosti pouze keždé jednotlivé buňky v podskupině tí·, že se určité Měřicí nebo/a diagnostické nástroje nařídí na jedinečnou adresu buňky·

Další účely o znaky vynálezu vyplynou z následujícího popisu různých provedení vynálezu v souvislosti s výkresy· CS 268157 81

Obr· IA - IC Jsou schematická znázornění, částečně v pohledu v řezu, výhodných buňkových nosičů podle vynálezu·

Obr· 2A - 20 znázorňují jedno provedení držáku pro několikanásobný buňkový nosič za účele· provádění Měřicích cyklů na větším počtu buňkových nosičů·

Obr· ЗА a 38 jsou zvětšené pohledy v průřezu na dalěí provedení nosiče·

Obr· 4 schematicky znázorňuje optický analyzátor pro individuální skenování buněk populace obsažených v buňkové· nosiči·

Obr. 5 znázorňuje schematicky druhé provedení optického analyzátoru.

Obr. 6A až 6C znázorňují upravené provedení držáků podle provedení na obr. ЗА a 38·

Obr. 7A a 78 znázorňuje provedení průtokové komory pro dolní stranu analyzující soustavy.

Obr. 8 je Jiné provedení průtokové komory podle obr· 7.

Obr. 9 Je Jiné provedení držáku a průtokové komory pro zdokonalený analyzující systém· .

Obr. 10 je oddělovací jednotka pro vložení držáku podle obr. 6 za účelem naplnění buňkových nosičů buňkami·

Obr· 11 je pohled v řezu na části provedení znázorněného na obr. 10.

Obr· 12A a 128 znázorňují oddělovací jednotku pro vložení držáku podle obr· 9 za účele· naplnění buňkových nosičů buňka·!·

Obr· 13A až 13C jsou podrobnosti členu pro přívod krve, uzpůsobeného pro použití s oddělovací Jednotkou podle obr. 12·

Obr. 14 je pohled v řezu ňa jiné provedení členu pro přívod krve, uzpůsobeného pro použití a oddělovací jednotkou podle obr· 12·

Obr· 15A a 153 znázorňují provedení soustavy s mnoha nosiči pro klinické použití, kde Jsou kombinovány oddělovací a měřicí kroky·

Obr· 16 je schematické celkové znázornění optického diagnostického systému podle vynálezu·

Obr· 17 znázorňuje buňkový nosič pro selektivní přitahování nebo uvolňování Žádaných buněk· *

Vynález bude nyní příkladem popsán s ohledem na selekcí a analyzování určité populace buněk daného typu obsažené v biologické tekutině od Jiných populací buněk· Kromě toho může být další selekce zvláštní subpopulace oddělena od určité zvolené populace· Vynález bude podrobněji nejdříve popsán ve spojení se selekcí a analyzováním určité subpopulace lymfocytů, které jsou přítomny v lidské krvi, že se nejdříve oddělí lymfocyty od ostatních typů buněk a pak se lymfocyty prozkoumají za účelem identifikace subpopulace nebo podskupiny uvnitř skupiny lymfocytů·

L. Cercek a 8· Cercek v článcích uveřejněných v Europen Oournal of Cancer“, svazek 17, 1981, str. 167 - 171J tentýž časopis sv. 13, 1977, str. 903 - 915* а V *810physical Oournal*, sv· 23, 1978, str· 397 - 406, diskutují excitační a emisní polarizační spektra fluorescainu v živých buňkách (článek v Biophysical Ooornal) ve vztahu к aplikaci jevů změn struktury cytoplysrnatické matrice (SCM) při diagnóze zhoubných chorob· zkrátka řečeno, provádí L. cercek a B· cercek tzv· zkoušku SCM, když se nejdříve pokusili oddělit určitou podskupinu lymfocytů od ostatních lymfocytů stejně tak jako od ostatních typů buněk technickou gradientu hustoty· ’ Tato technika, jak bylo shora zdůrazněno, je velmi neuspokojivá, především spotřebuje mnoho Času, jak bylo odhadnuto odborníky a jak je jasně patrno ze shora uvedených článků Cercekových· za druhé, jak uznávají L· Cercek a B. Cercek, nenáležejí коCS 268157 82 nečně oddělené buňky do pouze jedné hledané podskupiny_t avšak zahrnují velký počet, řádové 50 %_t jiných lymfocytů. Takto je analýza jejich reakce na stimulaci oddělených buněk velel omezená. Za třetí, což je nejvýznačně Jáí, jsou všechna měření popudů i odezvy prováděná shora uvedenými autory na oddělených buňkách prováděna na všech buňkách v dávce a nikoliv na bází buňka po buňce· 3e však zřejmé, že analysa buňka po buňce poskytuje daleko více informce pro porozumění biologickým implikacím studovaných jevů·

Vynález umožňuje provádět takové analýzy velmi rychůe a přesně. V tomto zvláštním případě Jsou Jak rychlost tak i přesnost velmi důležité, uvalujeme-11 možný počet zkoušek pro rozeznání rakoviny, které může být zapotřebí provádět· vynález. Jak pokud jde o způsob, tak pokud jde o zařízení, dává možnost oddělovat biologické buňky jednu od druhé tím, že se každá oddělená buňka umístí ne známé adrese, ke které se lze navrátit pro opakování pozorování buňky nebo/a pro opakované popudy, za nimž následuje analýza·

StruČnš řečeno, podle vynálezu se velký počet buněk například lymfocytů v krvi, o nichž lze předpokládat, že představují skupinu nebo populaci buněk, nejdříve oddělí od všech ostatních buněk, tj. od doličných skupin nebo populací buněk. Při oddělovací* ději se oddělené lyefocyty kromě Jejich oddělení od ostatních buněk také oddělí jeden od druhého, a každý je na známé* místě, Jež bude dále označováno Jako adresa. Všechny oddělené lymfocyty se pak současně vystaví vybraným zkouškám a potom se každá buňka odděleně vyšetřuje, Jeví-li nebo nejeví-li, jako výsledek zkoušky nebo popudu, určitou vlastnost· Adresa každé buňky projevující tuto vlastnost se zaznamená· так po vyšetření všech oddělení buněk Jsou známy adresy všech buněk, které projevily určitou vlastnost· Tyto buňky představují zvláštní podskupinu lymfocytů uvnitř širší celkové skupiny lymfocytů· 3akmile byly identifikovány buňky v podskupině, mohou být společně se zbytke* lymfocytů vystaveny jedné nebo několika přídavným zkouškám· Avšak pokud jde o vyšetřování vlastností buněk jako výsledek těchto přídavných zkoušek, *ůže být olezeno pouze na buňky v podskupině. Každá buňka v podskupině se individuálně vyšetřuje tím, že se směruje vyšetřující přístroj na jedinečné známé stanoviště nebo adresu buňky· Oakmile buňky v podskupině byly identifikovány, pouze ony Jsou potom vyšetřovány, zatímco všechny ostatní buňky, i když náležejí ke stejné skupině, avšak nejsou Částí podskupiny, se ignorují v tom směru, Že se nevystaví žádnému vyšetřování· 3ak*ile tedy byla podstkuplna identifikována, vyšetřují se pouze její buňky, čímž Je doba vyšetřování oaezena pouze na buňky podskupiny, o které je zájem· Oelikož vyšetřování se provádí na bází buňka po buňce, lze obdržet přesnější údaje, což znamená zvýšenou přesnost diagnózy. Další přednosti identifikace buněk podskupiny a jejich individuálního vyšetřování budou uvedeny níže.

Зак bylo shora zdůrazněno, v první* kroku se lymfocyty oddělí od ostatních buněk obsažených v krvi· Oddělení se provede perforovaným buňkovým nosičem 1, jak je znázorněn v obr. 1A.

Buňkový nosič 1 muže mít různé konfigurace otvorů nebo dutin 2, stejně jako různé způsoby, jak jsou uspořádány· Na obr. 1A se předpokládá, že jsou uspořádány v řadách a sloupcích podél os X popř. y. Otvory jsou znázorněny tak, Že *ají nahoře větší otvory než dole, jak je znázorněno na obr. ιβ· и právě popisovaného provedení mají otvory takovou velikost, Že jsou vhodné přo příjem lymfocytů, mezi nimž jsou dvě hlavni velikosti asi 7 yum a asi 10 - 15 yUm. Ne horním povrchu nebo straně lt nosiče 1 mají otvory v průřezu rozměr přibližně 10 ^um· otvory na dolním povrchu nebo straně lb mají v průřezu rozměry přibližně 6 yum. Postranní stěny otvorů mohou se sbíhat spojitě nebo ve stupních. Jak Je znázorněno na obr· 1C směrem к dírce na spodní straně lb buňkového nosiče·

Celkově má být otvor tvarován tak, že bud ne Jeho spodní straně nebo v průřezu mezi stranami lt a lb Je průřezový rozměr menší než na horní straně, takže žádaná buňka vstupující do otvoru neprojde skrze otvor, nýbrž Je v nčm držena. 3e také důležité zvýšit tloušťku nosiče mezi stranami lt a lb, takže velikost otvoru je ve vztahu к veCS 268157 02 llkosti žádaných buněk, takže když žádaná buňka vstoupí do otvoru, je prakticky celá uvnitř otvoru a nemůže pak být vymyta při omývání, jak bude popsáno.

Tvar otvorů 2 umožňuje, aby buňky byly účinně přidržovány к nosiči tím, že se užije pomůcek, jako tlakového rozdílu mezi horní a spodní stranou nosiče nebo elektromagnetických sil. Stručně řečeno, pro první oddělení zvláštní skupiny buněk od buněk jiných skupin, jelikož buňky v každé skupině mají známou velikost nebo velikosti, jež se typicky liší od velikostí v ostatních skupinách, je nosič 1 zvolen tak, aby měl otvory takových velikostí, Že když se materiál, například krev, obsahující různé skupiny buněk, umístí na nosiči 1, jsou otvory ve své většině, ηβ-li všechny otvory, zabrány buňkami žádané skupiny, a to jedna buňka na každý otvor.

Зак bylo shora uvedeno, jsou otvory 2 v nosiči 1 pravidelně uspořádány přes nosič nebo v nosiči, například v řadách a sloupcích, aby byla umožněna jasná identifikace polohy každého otvoru 2, například jeho souřadnicemi X a Y v rovině nosiče. U popsaného provedení jsou otvory, umístěny v řadách a sloupcích, probíhajících navzájem kolmo, čímž se vytvoří struktura na způsob matrice. Počet otvorů se zvolí v závislostí na počtu buněk, které mají být neseny. Například je-li 100 otvorů na každém řádku a sloupci, je zde celkem 10 000 otvoru pro nesení 10 000 buněk na nosiči v popsaném provedení, přičemž každý otvor má svou jedinečnou polohu vyjádřeno v X a Y. Nosič 1 samotný může mít kruhový obvod, jak je patrno z obr. 6C. Зак je tam znázorněno, má nosič větší počet výčnělků 8, aby se nosič vyrovnal v držákové konstrukci 40, která má dvojicí zářezů 9 probíhajících od horního vybrání, ve kterém je nosič uložen. Kolem tohoto vybrání probíhá osově otvor v držáku 40. V rámci vynálezu lze také užít jiných pomůcek pro nastavení polohy, jako kolíků nebo nosičů určitého tvaru.

Nosič 1 je zhotoven z jakéhokoliv vhodného materiálu, například kovů, jako měČ, zlato, nikl, stříbro nebo jiných, nebo z plastické hmoty, kteréžto nosiče z plastické hmoty mohou být opatřeny elektricky vodivými úseky, probíhajícími mezi otvory 2, jak je znázorněno na obr. 17. Takto lze ovlivňovat elektrický potenciál na kterémkoliv otvoru obsahujícím buňku, aby se vyvolala Interakce s elektrickým nábojem buňky. Řízením potenciálu na různých otvorech mohou být buňky v těchto otvorech elektricky vázány к nosiči, jakož i od něho uvolňovány. . *

Při praktickém provádění způsobu se na buňkový nosič nakape několik kapek roztoku obsahujícího lymfocyty. Kapalina projde otvory v nosiči. Avšak buňky zůstanou na nosiči □elikož velikosti otvorů 2 jsou zvoleny pouze pro umístění lymfocytu, tyto lymfocyty vstoupí do otvoru. Každý otvor obsahuje pouze jednu buňku. Přebytečné a jiné buňky se smyjí s povrchu nosiče, například buňky takových velikostí, že nemohou vstoupit do žádného otvoru, nebo/a přebytečné buňky většího počtu než je počet otvorů. Potom, aby se zabránilo buňkám v otvorech v opuštění nosiče, mohou být к němu připevněny, a to různými pomůckami, například pokrytím nosiče adhesním koloidovatelným materiálem a jejich elektrickým nabitím elektrickými nebo/a magnetickými poli. 3iná kombinovaná metoda pro izolování této populace a její samočinné připevnění к nosiči bude uvedeno níže ve spojení s obr. 10, 11, 12A a 120.

Každý noclč opatřený svou skupinou žádaných buněk, tj. lymfocyty, se umístí v držáku průtokové komory, jako je držák 10 (obr. 20), aby se dosáhlo potřebného okolí pro zkušební nebo měřicí cykly, které budou popsány níže.

U prvního provedení znázorněného v obr. 2A až 20, ЗА а 3B se větší počet matric nebo buňkových nosičů 1 umísti na držáku 10 (obr. 20 а ЗА). Зе možná pouze jedna orientace nosičů, takže perforace (díry), nosičů jsou vyrovnány podle definovaných os, například

X a Y (viz obr. 1A). OrŽák 10, který Je horní částí průtokové komory, je odnímátelně uložen na střední části Ц (obr. 2A) průtokové komory. Střední část 11 vymezuje větší počet kanálů 12, z nichž každý je na obou koncích připojen к jedné z většího počtu trubek 13 za účelem přivádění a odvádění žádaného roztoku. Střední část je na spodku

CS 268157 02 upevněna dolní Částí 14 (obr. 28) průtokové komory_t obsahující průhlednou stěnu 15, které je potřebná, když se užívá dopadajícího nebo procházejícího světla pro analyzování buněk na nosiči.

□ak může být patrno z obr. ЗА, což je pohled na řez kolmý ke směru kanálu 12 (roztok, který proudí do roviny výkresu), zajlituje směrovač 16 průtoku, že roztok je ve styku a buňkovým nosičem 1. Na obr, 38 je schematicky znázorněn boční pohled na toto uspořádání.

Na držáku 10 jsou umístěny nosiče 1 různých odliěných Individuí (pacientů) umístěných v jedné řadě probíhající podle kanálů 12, zatímco sloupec nosičů od stejné osoby probíhá kolmo к těmto kanálům. Každý kanál 12 je vztažen na jeden typ testu, takže počet testů, které mají být prováděny, určuje počet kanálů 12 v průtokové komoře.

Jakýkoliv rozsah, který proudí kterýmkollv z kanálů, smáčí proto viechny buňky v nosiči nad tímto kanálem, z nichž každý náleží jinému pacientovi. Buňkové nosiče 1 mohou být zakryty skleněnou deskou 17, aby se umožnilo použití ieersní kapaliny pro optickou skanovacl soustavu, je-li to zapotřebí.

Podle obr. 2A má průtoková komora sedm kanálů 12. V takovém případě jsou buňky od každého pacienta neseny na sedmi nosičích, jednom na každý kanál, zatímco podél každého kanálu jsou uloženy nosiče a buňkami od různých pacientů, jak je znázorněno na obr. 20. Takové uspořádání umožňuje stimulovat buňky různých pacientů různými popudy přes každý kanál bud současně nebo postupně a pak zkoumat nebo analyzovat odezvu každé buňky na určitý popud. Jiná provedení, která budou popsóna, také obsahují vět*! počet kanálů. Tak v každém mnohokanálovém provedení je počet buňkových nosičů od každého pacienta typicky roven počtu kanálu. Avšak, Jak vyplyne z následujícího popisu, není vynález omezen na mnohokanálová uspořádání. Bylo z jí*táno, že buňky, které byly stimulovány určitými popudy a vyšetřovány, mohou být očiltfiny a navráceny do jejich stavu před stimulací, aby byly potom stimulovány odllíným popudem. Z toho důvodu lze užit na každého pacienta pouze jeden buňkový nosič, je-li žádáno. Buňky na tomto nosiči mohou být postupně stimulovány a po každé stimulaci a analýze mohou být opláchnuty pro další stimulační a analyzující kroky.

Dříve, než bude popsáno dali! provedení průtokových komor, je pravděpodobně účelné popsat podrobnosti jednoho výhodného způsobu a zařízení pro individuální analyzování buněk umístěných na definovaných místech na nosiči a zavedených do průtokové komory. Za tím účelem se poukazuje na test SCM, popsaný L. a 8. Cercekem et al. ve shora uvedených publikacích. Podle L· a 8. Cerceka existují nejméně dvě charakterlstické vlastnosti podskupiny lymfocytů, které jsou vhodné pro test SCM. Rozeznání specifického antigenu způsobí přechod lymfocytů z klidu do stimulovaného stavu. Jestliže v lymfocytech jsou začleněny molekuly fluoresceinu, pak užitím dobře známého jevu zvaného fluorochromasla, vede přechod z klidová fáze do stimulované fáze ke kritickým změnám v popularizaci fluorescence fluorescelnu v uvedených lymfocytech. Lymfoclty, ve kterých stimulační děje mohou vyvolat takové kritické změny, odlišují se od ostatních lymfocytů nejméně dvěma charakteristickými vlastnostmi: specifickou hustotou a skutečnosti. Že pro tyto buňky je pozorována poměrně vysoká (řídící) hodnota polarizace fluorescenčního záření pouze pro velmi úzké pásmo emisního spektra kolem 510 m«.

Této druhé vlastnosti se výhodně využije pro vyznačení nebo identifikování vhodných lymfocytů mezi celou populaci lymfocytů a tak se zabrání nutnosti jejich fyzického oddělení. Je to ta skupina lymfocytů. která projevuje toto zvláštní spektrální chování, na které se pak vyzkouší všechny další stimulační děje, zatímco všechny ostatní lymfocyty budou nadále zanedbány vyhodnocovací technikou soustavy. Jiným způsobem vyjádřeno, se podle vynálezu nejdříve užije nosiče pro oddělení lymfocytů v kapce krve některé osoby od ostatních buněk typů buněk za pomoci velikosti otvorů v nosiči. Otvory jsou v podstatě vyplněny lymfocyty a to jednou buňkou na každý otvor. Menší buňky procházeCS 268157 82 jící otvory a větší buňky ·· smyjí z horního povrchu nosiče. Poto· se lymfocyty na no•lči skropí FDA ♦ PBS, který se fluorochromasií přemění uvnitř buněk na fluoroscein. Potom se změří a zaznamená polarizace fluorescenčního záření uvnitř úzkého pásma emisního spektra kolem 510 nm z každé buňky. Pouze ty lymfocytové buňky, z nichž každá projevuje poměrně vysokou hodnotu polarizace fluorescenčního záření, definovatelného jako P, jsou uvažovány, že náležejí ke zvláštní zájmové podskupině. Jelikož adresa každé buňky na uspořádání otvorů nosiče je známa, je známa adresa každé buňky v podskupině. Jakmile tedy jsou známy buňky náležející podskupině, provedou se všechna následující měření nebo/a pozorování, jež nohou být prováděna, pouze na buňkách v podskupině, zatímco všechny ostatní lymfocytové buňky na nosiči, které náležejí к podskupině, mohou být zanedbány v tom, že se na nich neprovádějí ani věření, ani pozorování· Omezení nás ledujících měření nebo pozorování pouze na buňky v podskupině značně snižuje dobu analyzování, což má velký význam. Dále je snad ještě důležitější, že v důsledku toho, Že adresa každé buňky je známa, může být zaznamenána jedinečná odezva buňky na každý popud, Čímž se obdrží jedinečná informace, dosud nedosažitelná v důsledku okolnosti, že měření a pozorování byla prováděna na dávkách buněk nebo na skupinách užívajících průtočných soustav. I když se pozoruje určitá buňka pod mikroskopem, nebylo by potom možné ji stimulovat jiným popudem a pozorovat reakci buňky na tento popud. To je důsledek okolnosti, Že dosud nebyly jednotlivé buňky umístěny v pevném uspořádáni se známou adresou každé buňky, takže měřicí nebo pozorovací přístroje mohly být směrovány opakovaně na tutéž adresu pro pozorování stejně buňky.

Lze určit vhodné kriterium minimálního poměru polarizací měřených na dvou vlnových délkách fluorescenční emise, totiž 510nm a pří 515 nm. proto jako první krok se buňky kritické podskupiny lymfocytů identifikují zkoušením tohoto kriteria pro každou jednotlivou buňku na nosiči. Po přechodu do stavu stimulace klesne stupeň polarizace stimulovaných členů uvedené podskupiny na hodnotu asi 0,14 pro tuto emisní vlnovou délku 510 nm. Tato změna stupně polarizace se zkoumá pouze pro identifikované buňky uvedené podskup iny.

Nyní bude popsána soustav pro provádění těchto zkoušek pro každou buňku na nosiči ve spojeni s obr. 4. Buňky na nosiči 1 se nejdříve typicky opláchnou roztokem chloridu sodného pufrovaného fosfátem (PBS) a fluoresceln diacetátem (FOA)· Roztok se v důsledku jevu fluorochromasie přemění uvnitř každé lymfocytové buňky na fluoresceln. Potom se fluoroscein. Potom se fluoroscein excituje zářením o vlnové délce 470 nm, načež vyšle své charakteristické emisní spektrum. Určení, která z lymfocytových buněk na nosiči náleží к zájmové podskupině, se provede krokovým skenováním každé jednotlivé buňky na nosiči pomocí optického analyzátoru 20 znázorněného na. obr. 4.

Tento analyzátor obsahuje zirkonovou lampu (nebo laser) 21, který slouží jako světelný zdroj s vrcholem při 470,1 nm a 468 nm, čímž se odstraní potřeba excitačního filtru pro filtrováni jakéhokoliv světla v uvažovaném rozsahu, tj. 510 nm a 515 nm. Světlo je rovinně polarizováno kolmo к rovině obr. 4 polarlzátorem 22, po průchodu sběrnou čočkou 21a. Rovina polarlsace je znázorněna malými kroužky. Svazek rovinně polarizovaného světla dopadne na zrcadlo 23, které působí jako dělič svazku v tom směru, že propouští světlo o vlnové délceýt > 500 nm a odráží světlo pod touto vlnovou délkou. Tak je světlo ze zdroje 21 odráženo к nosiči 1 Čočkou 24.

Fluorescence vysílaná každou buňkou na nosiči se oddě leně měří a zaznamenává. Fluorescenční záření se odděleně měří a zaznamenává. Fluorescenční záření z buňky prochází zrcadlem 23 a čočkou 24a ke Glenn-Thompsonovu polarizátoru 25. V zásadě polarizátor 25 rozděluje fluorescenční záření na dvě částij jednu polarizovanou rovnoběžně s rovinou výkresu (vyznačenou čárkami na obr. 4), která postupuje v původním směru dopadu, a druhou polarizovanou kolmo к rovině výkresu (vyznačenou kroužky na obr. 4), která ee odráží kolmo ke směru dopadu. Každý z polarizovaných svazků je rozdělen na dva stejné а к sobě kolmé svazky děličem 26, 27 svazku. Každý z těchto Čtyř nově vyCS 268157 82 tvořených svazků prochází lnterferenčcnía filtre· 28# 29, popř. 28*. 29* na 510 n· popř. 515 nn a jejich intenzity jsou eěřeny současná čtyř·! trubkový·! fotonásobíči 30# 31.

Tyto Čtyři eěřené Intenzity se zavádějí do pamětí v počítačové soustavě# příklade· znázorněné na obr. 16# a vypočte se stupeň polarizace pro každou vlnovou délku# tj. X - 510 nsi Д · 515 n·. Stupeň polarizace je definován jako

P · (I И - I_£ )/(I || ♦ Ij> )

Po výpočtu P₅₁₀ a P₅₁₅# tj. Р_51О/Р₅₁₅* představující kontrolní hodnotu# se vypočítá v reálné· čase. Adresa každá buňky vyjádřená v jejich souřadnicích X a Y je známa# a je uložena v pamětí společně s jejich kontrolní hodnotou. Když byly vyšetřeny všechny buňky a Jejich kontrolní hodnoty# určeny a uloženy v paměti# je vel«i jednoduché určit buňky mající kontrolní hodnotu nikoliv menší než 1,3. To jsou ty buňky# které náležejí к hledané podskupině. Jakaile bylo provedeno toto určení# všechna následující měření nebo pozorování reakce buněk na různá stíaulační činidla ee provádějí na buňkách pouze v podskupině a ignorují ee všechny ostatní buňky. Například se znovu vyšetřují pouze buňky v podskupině# aby ae zjistilo# která z nich projevuje změnu ve stupni polarizace dostatečnou pro jejích identifikováni jako aktivní a tak schopné identifikovat určitý antigen.

□e patrno# Že pro vyzkoušení každé buňky jednotlivě musí mít optický analyzátor 20 (obr. 4) optickou rozlišovací schopnost v rozmezí průeěru jedné buňky# Čehož se dosáhne pomocí objektivu mikroskopu. Nosič s buňkami se po krocích posunuje pod mikroskopem od jedné perforace к sousední perforací. Эе tedy zapotřebí přesný mechanický posouvací systém# jak je popsán na obr. 16.

U jiného provedení optického analyzátoru je odstraněna potřeba krokového posouvání buňkového nosiče a to užitím laseru jako excitačního světelného zdroje. Na obr. 5 Je toto provedení znázorněno schematicky. Laserový svazek 131 přiměřené vlnové délky prochází řízený· odchylovacím optickým členem# jako například rotující· zrcadle· 130. Laserový svazek 131 má průřez# který odpovídá v podstatě velikostí buňky. Pomocí odchylovacího členu 130 svazek 131 skenuje buňky v otvorech postupně# číaž excituje každou buňku# jednu po druhé. V kterémkoliv daném čase je pouze jedna.buňka zasažena laserovým svazkem a proto pouze tato buňka vysílá v tomto okamžiku fluorescenční záření. Optický analyzátor 131X# umístěný na druhé straně nosiče 1# má zorné pole# pokrývající celý povrch nosiče 1. V okamžiku příjmu emisního signálu je Intenzita tohoto signálu vztažena na polohu skenujícího laserového svazku 131# a tak každý přijatý a analyzovaný světelný signál je vztažen na polohu příslušné buňky# ze které byl vyslán. Зак lze vidět na obr. 5# provádí se buzení čili excitace od široké strany otvorů 2 v nosiči 1. Pro optickou analýzu naopak ae a výhodou užije emisního světla opouštějícího každý otvor úzkým koncem# a to z důvodů# které budou vysvětleny níže.

Po vysvětlení výhodných analyzujících soustav používajících vynálezu je zřejmé* že lze užít analogových soustav pro měření ostatních parametrů za předpokladu# Že je možné zaostření na každou jednotlivou buňku v nosiči, příklady měřitelných parametrů zahrnují intenzitu světla# optickou hustotu, index Iobu# elektromagnetické vlastnosti# absorpci a rozptyl. Dále není akanovací děj omezen na svazky viditelného světla ultrafialového a infračerveného a na elektronové optické soustavy# nýbrž může také zahrnovat zkousání pře· fyzikální kontakt na každé buňce. Oalší příklady měřitelných nebo pozorovatelných vlastností zahrnují jadernou magnetickou rezonanci (NMR), hodnotu pH stejně jako morfologii buňky a její zaěny v odezvu na různé popudy. Například lze šněrovat výstup alkroskopu# zaostřený na kteroukoliv buňku# к zaznaaenávači obrazců

CS 268157 82 pro vytvoření dvourozměrného záznamu obrazce buněk. Lze také provádět a zaznamenávat měření teploty buňky nebo/a změny teploty. V souhrnu lze kteroukoliv měřitelnou nebo pozorovatelnou vlastnost buňky působit na buňku, a to po jedné. 3elikoŽ adresa každé buňky Je známa, lze kdykoliv se navrátit ke stejné buňce pro přídavná měření nebo/a pozorování. Všechna měření a pozorování pro každou buňku mohou být zaznamenána pro získání jedinečné informace pro každou jednotlivou buňku. Tato informace může být uvedena do příslušného vztahu pro získání dosud nedosažitelných údajů a diagnózy.

Nyní bude vysvětleno provedení vynálezu pro praktické klinické použití ve spojení s obr. 6A - 6C, které znázorňují upravený držák 40 pro větší počet buňkových nosičů 1. Držák 40 je vytvořen vlnovitě, aby jeho žlaby 41 mohly být ponořeny do roztoků proudících v kanálech 12 na vyšší úrovni. Buňkové nosiče, které jsou uloženy na dnu žlabů 41, mohou být zvlhčeny, aby skrápěly nebo jinak stimulovaly buňky Jak z horní strany tak i z boční strany· Z toho důvodu není u tohoto provedení zapotřebí směrovačů toku, Jak bylo předtím vysvětleno s obr. 2A, ЗВ. Зак bylo popsáno ve spojení s obr. 2A - 20, náležejí buňkové nosiče umístěné na stejném Žlabu 41 různým pacientům. Navzdory tomu není žádné nebezpečí smíšeného účinku stimulace lymfocytů, jelikož mezi nosiči není žádného fyzického spojení. I když by se buňka oddělila z jednoho nosiče, je pravděpodobnost, že bude vypláchnuta, daleko větší, než ta, že bude uložena na jiném nosiči· Na obr. 6A Jsou znázorněny nosiče pouze v jednom žlabu. Avšak v praxi je pro každého pacienta přítomen nosič v každém žlabu.

Na obr· 6C je znázorněn nosič 1, který je odstranitelný z držáku 40· Avšak aby bylo definováno uspořádání jeho otvorů v souřadnicích x a Y, obsahuje výčnělky 8, které mohou zapadnout do výřezu 9.

Delikož buňkové nosiče 1 podle tohoto provedení jsou ponořeny do roztoku proudícího každým kanálem 12, je mikroskop optické soustavy pro skanování buněk opatřen křemennou objímkou 42 (obr· 68) umístěnou na válci jeho objektivu. Kanály 12 a žlaby 41 mají rozměry, které umožňují relativní pohyby objektivu, a nosičů potřebné pro skanování celého povrchu každého nosiče·

Зак bylo shora uvedeno, jaou pro výběr podskupiny buněk založeny na shora popsané kontrolní hodnotě, kanály nejdříve zásobeny roztokem TBS ♦ FDA při kontrolním cyklu pro identifikování správných buněk na každém nosiči, náležející к podskupině. Potom pro určeni reakce vybraných buněk na různá stimulační Činidla zásobí každý kanál odlišným stimulačním činidlem, například fytohemagglutininem (PHA), EF, Ca8P, extrakty z tumorů nebo jiným žádaným mitogenem nebo antigenem. Potom se zjistí e zaznamenají reakce pouze vybraných buněk· pro shora uvedené stimulátory bylo objeveno, že stimulace buněk jedním stimulátorem nevadí jakékoliv následující stimulaci, jestliže stimulátor se spláchne nebo/a neutralizuje před příštím stimulačním testem, aby ae zabránilo jakékoliv přímé interakce nebo jakémukoliv soutěžnímu účinku mezi nimi. Dále bylo zjištěno, Že vázání buněk na nosič nemá žádný účinek na jejich aktivaci. V důsledku toho mohou být stimulační děje opakovány na atejné buňce na stejném místě na nosiči, a to s různými aktivačními činidly. Tak lze získat přesný profil odezvy každé jednotlivé buňky podskupiny na aktivaci ve funkci času a je tedy možné znát přesný počet a reakci aktivovaných buněk a jejich místa na matrici, což zůstává stejné v průběhu shora uvedených měřících cyklů a po nich.

Většina soustav držáků nosičů, shora popsaných, byla určena pro skanování shora, tj. pro analyzování vysílaného fluorescenčního záření z velké horní strany otvorů v nosiči, což umožňuje použití stejné optické soustavy pro optické vyšetření a analýzu buněk. V jiných provedeních, která budou popsána níže, se umístí optický analyzátor tak, že přijímá emisní světlo procházející úzkou stranou čili dnem otvorů 2. Tak lze odstranit rušivé účinky vyvolané světelnou emisí fluoresceinu, který prosakuje a je přítomen v jejich okolí. Světlo vysílané obklopujícím fluorescinem představuje nežá10 doučí optické pozadí· Pohled na buňky od úzké strany nebo dna otvorů, umožňuje podstatné snížení tohoto pozadí, jelikož zužující se kužel působí jako stínítko proti nežádoucím emisnímu světlu· Kromě toho v případě, že excitační světlo vstupuje do otvorů jejich širokými stranami, čili vrcholy, mohou nastat odrazy na kuželovitých stěnách, čímž se jak dopadající světlo, tak i fluorescenční světlo odrazí nazpět. Jiný výhodný účinek vyvolaný prováděním optické analýzy uvedeným způsobem, je ten, že na každém místě na nosiči se přijímá pouze emisní světlo buňky uchycené uvnitř příslušného otvoru, kdežto Jiné buňky, které mohou být ve výjimečných případech přítomny pa horním povrchu nosiče, neovlivňují výsledky měření. Ještě další výhoda spočívá v okolnosti, že v důsledku menší velikosti otvorů je v praxi mnohem snadnější analyzovat emisní světlo každé buňky odděleně bez nebezpečí 'přeslechů* mezi sousedními buňkami, jestliže seřizovači mechanismus optické soustavy vůči otvorům nemá krajní přesnost.

Za pomoci obr. 7A, 7B, 8a 9 jsou znázorněna různá provedení, která umožňují provádění optické analýzy, jak bylo shora vysvětleno, и prvního provedení pro užití s optickým analyzátorem opatřeným mikroskopem (obr. 7A a 78), obsahuje spodní stěna 1Ю průtokové komory pružné (kaučukové) držáky lli skla,, z nichž každý nese skleněnou desku 112 seřízenou vůči shora umístěnému buňkovému nosiči 1. Pružný držák 111 skla tvoří tekutino těsný uzávěr mezi skleněnou deskou 112 a spodní stěnou no průtokové komory a umožňuje, aby objektivy 113 mikroskopu byly pohybovány dostatečně těsně к buňkovému nosiči 1 pro skenování jeho jednotlivých míst nebo otvorů zdola, (obr. 78). Jestliže objektiv

113 mikroskopu je v Jeho dolní poloze, Je kanál průtokové komory otevřen na Jeho počáteční šířku· U obměny tohoto provedení podle obr. 8 jsou dno 1 postřenice průtokové komory provedeny v Jednom celku a kaučuku.

U druhého provedení (obr· 9) se provádí optická anolýza horní strany. Avšak držák

114 pro buňkové nosiče 1 je uložen horní stranou dolů na spodní části 115 průtokové komory,, když byl dříve opatřen buňkami ve zvláštní jednotce (což bude popsáno ve spojení s obr. 12A a 128), takže kuželové otvory v nosičích 1 se rozbíhají směrem dolů. Aby buňky byly drženy na místě a aby byly účinně vázány na nosič, vytvoří se takový rozdíl mezi spodní částí 115 (obr. 9) a horní Částí 116 průtokové komory, přičemž tekutina ve spodní části 115 má poněkud vyšší tlak než v horní části 116. Těsnicí lišty 117 zabraňují prosakování obou částí průtokové komory. U tohoto provedení lze užít optického analyzátoru podle obr. 4 pro skenování buněk na nosičích 1, aniž by bylo nutno upustit od shora popsaných výhod.

Navrátíme-li ее nyní к problému vytvoření buňkových nosičů s buňkami určité žádané populace nebo skupiny, což v zásadě by mohlo být provedeno v podstatě běžným způsobem, jak shora popsáno, zobrazují obr. 6, 7A a 78 soustavu pro současné oddělování uvedené populace buněk od ostatních skupin buněk Jinak než běžnými nevýhodnými způsoby oddělení. buněk. Uvedené provedení Je také popsáno se zřetelem na oddělování lymfocytů od ostatních krevních buněk pro užití ve shora uvedeném testu SCM.

Jak je patrno z obr. 10 a 11, spočívá držák 50, který je vkladatelný do průtokové komory na obr. 6A, na uspořádání trubek 51, z nichž každá Je po délce rozdělena na horní část 53 a dolní část 52« Oolní část 52 tvoří tekutinové vedení (pro vzduch nebo kapalinu) o nižším tlaku pro odvádění kapalin a nevhodných krevních buněk v horní části 53. Horní část obsahuje můstky 54, pod kterými Jsou drenážní otvory 55 a mezi kterými Jsou ssací otvory 56 ležící v jedné čáře s nosiči 1 na držáku 50. Na obr· 10 jsou znázorněny nosiče pro držení buněk pauze od Jednoho pacienta. Horní a dolní části 53 a 52 jsou zásobovány kapalinou, například roztokem PBS. Jak je zřejmé z průřezu na obr. 11, prochází tekutina v horní části pod můstky 54 a vhodnými štěrbinami 57 v držáku 50· Kapalina dolní části 52 Je výstupky 58 nucena proudit vyšlí rychlostí v oblasti drenážních otvorů 55, ssacích otvorů 56, čímž vytváří místní podtlak v těchto otvorech, z toho důvodu Je kapalina na počátku proudící horní částí 53 částečně odtahována к dolní části těmito otvory·

Člen 60 pro přívod krve, odstranitelně umístěný na držáku 50 slouží pro zásobování nosičů 1 krví. Stojiny 61 přívodního členu 60 zabraňují přecházení kapaliny z jedné řady štěrbin 57 v držáku 50 do druhé řady.

*)

b)

c)

d)

e)

O

9) □ako teoretická základna pro porozumění oddělování buněk třeba zdůraznit následující skutečností:

reagujících lymfocytů ^7 makrofágů, granulocytú je erytrocytů může dosáhnout velké lymfocyty - 15 ^u;

destiček je zanedbatelná* mohou rozpadnout, když se ve 1ikost velikost velikost jsou zde velikost buňky ae rozpětí shora uvedenou jednotkou.

7^u: rU 20/U - 35 yU; З’/U - 5 /U;

ponechají v destilované vodě;

životnosti erytrocytů v destilované vodě je mnohem menší než и lymfocytů

Držák 50 buňkových nosičů se nejdříve umísti na trubkové uspořádání, tak, že nosiče první řady (kolmé ke kanálům) jsou umístěny nad otvory. Přívodní člen 60 je svými stojinami 61 umístěn po obou stranách buňkových nosičů. Celá soustava je sestavena, jak je znázorněno na obr. 11. Na obr. 11 jsou znázorněny dva takové držáky pro různé pacienty. Proudění krve z každé z trubek je řízeno tím, že se působí vhodným tlakem na > stříkačku. Stříkačka plná krve od pacienta se před tím umístí v držáku 62 stříkačky. Na obr. 11 jsou znázorněny dva takové držáky pro dva různé pacienty. Krev přichází na všech výstupech trubek P1 а P2 (od dvou různých pacientů) po prvních několika málo tlakových impulsech.

V určitém okamžiku nosičů, velikost otvorů nosiče ke druhé. Za tím jak bylo popsáno shora, prostředně pod nosič.

způsobí tlakový impuls spadnutí kapky krve na každý z buňkových v nosiči nedovolí, aby krev přešla od jedné strany buňkového účelem se vytvoří podtlak na dolní polovině oddělovací trubky, tím, že se pouští PBS touto částí trubky. Krev se vsaje bezMenší buňky projdou nosičem a budou opláchnuty proudem PBS. Buňky s velikostí po dobnou horní části otvorů nosiče, např. 7 yum se zastaví na nosiči a ty největší spočinou nad nosičem. Aby se zabránilo zablokování nosiče, zastaví se přívod krve a PBS proudí napříč horní částí matrice pro spláchnutí větších buněk, většina z nich se nasaje do drenážních otvorů 55 (obr. 11). Menšina buněk se dostane к příštímu nosiči (ve směru proudění) a vyjde ven. Зак bylo shora zdůrazněno, jsou všechny buňkové nosiče, umístěné kolmo к průběhu kanálu, naplněny krví jednoho dárce. Není tedy zde problém, že by se krev smísila s krví od jiného dárce.

V příštím stádiu se zastaví horní proudění a ukápne se jiná kapka krve a cyklus se oapkauje tak často, jak je zapotřebí. Po několika kapkách krve se provede tzv. 'horní rozrušoveci úkon '· V postupu se pokračuje, až je nosič dostatečně naplněn. Hrubá zkouška této okolnosti může být provedena zjištěním elektrického specifického odporu nosiče po každé kapce. Destilovaná voda proudí po jakoukoliv žádanou dobu a vyvolává rozrušení erytrocytů. Destilovaná voda vyvolává nabobtnání buněk a z toho důvodu tyto erytrocyty prasknou, zatímco lymfocyty zesílí své uložení v otvorech nosiče. Na konci žádaného časového intervalu se zavede PBS. Látka zbavená rozrušených erytrocytů nemůžo ovlivňovat lymfocyty, jelikož trvalé proudění roztoku odstraňuje tyto látky omýváním. Elektrické nabití nebo opětné nabití matrice nebo připojení nebo odpojení elektromagnetických polí je analogické uváděni matrice do vibrací ultrazvukovými nebo jinými technikami, jichž lze také užít. Tento postup může být přidán nebo sdružen s obdobími promývání. Méně než 1 cm³ krve bude zapotřebí od každého pacienta p , P₂, atd.

CS 268157 02

Tento oddělovací děj trvá nejvýše 5 minut, počet krevních vzorků, z nichž mohou být současně odděleny buňky, není omezen· Držák 50 se pak odstraní z oddělovacího systému a vloží se do průtokové komory podle obr· 4 pro optické skenování, jak bylo shora popsáno·

Podobný oddělovací systém, avšak přizpůsobený držáku 114 podle obr. 9 bude vysvětlen pomocí obr. 12A a 128. Základní deska 120 je opatřena kanály 121 pro proudění kapaliny, což vytváří nutný místní podtlak v oblasti pod nosiči 1 a. drenážními otvory 55. Za tím účelem se vytvoří výčnělky 122 na základně kanálů 121. Držák 114 se odnímáte 1 ně umístí na základní desce 120, takže Jeho nosiče 1 Jsou v jedné čáře a výčnělky 122, jak Je vidět na obr. 128, takže jejich kuželovité otvory se rozevírají směrem vzhůru, tj. směrem к nad nimi ležícímu odstranitelnému přívodnímu členu 123, Jehož funkce Je podobná funkcí přívodního členu 60 podle obr· 10. Přívodní Člen 123 může zásobovat buňkové nosiče buňkami pouze působením tlaku, jak bylo vysvětleno ve spojení s obr. 10. Je však možné podpořit účinnost přívodu kreve tím, Že se upraví roztírací členy, které jsou přemístitelné vůči nosičům, Jak Je znázorněno na obr· 13A, 138, 13C a 14. Na obr. 13A, 138 а 13C je znázorněno provedení, které je opatřeno kluznými deskami 124 probíhajícími v přívodním Členu 123 v jedné čáře s kanály 121.

Na každém výstupu přívodního vedení je umístěn pružný roztírací Člen 125, jak je patrno z obr. 13B а 13C. Na obr. 13B je znázorněn průřez roztíracím Členem 125 kolmo ke směru kluzné desky 124, kdežto obr. 13C znázorňuje průřez podél prodloužení této desky 124. šířka pružného roztíracího členu 125 odpovídá v podstatě postranní délce nosiče a tvoří malý výstup pro lineární posouvání přes povrch nosiče, když se pohybuje kluzná deska 124, takže každý nosič je povlečen tenkou vrsévou buněk. Potom se provádějí shora popsané omývací kroky.

Na obr. 14 je znázorněno jiné provedení roztíracího členu v průřezu kolmo ke kanálu 121· V otáčivé tyči 126 probíhající podél každého kanálu 121 je vytvořeno krevní vedení 127, které и každého nosiče 1 je opetřeno výstupem s rozváděcím kartáčem 128« Když se přivede krev к nosiči, otáčivá tyč 126 ae několikrát pootočí, čímž se kartáčem nanesou buňky na nosič 1.

Zatímco ve shora uvedeném provedení se přívod krve a *hrubé* oddělení provádí za pomoci speciální oddělovací jednotky, načež se držáky 40, popř. 50, popř. 114 musí umístit na průtokovou komoru pro optické skenování, může být v některých případech žádoucí tento krok odatranit. U dalšího provedení vynálezu, které je znázorněno v obr. 15A a 158, je oddělování buněk a optické skenování spojeno v jednom přístroji.

Nosná soustava 70 je opatřena povrchovými kanály 71, 72 probíhájícíml napříč к tobě navzájem, a vnitřními vedeními 73, 74 rovněž probíhajícími vůči sobě napříč. Na každém uzlu je umístěn nosič 1 na otáčivém držáku 75, jehož část je znázorněna na obr. 158. Na jeho základně je vytvořen pastorek 76, který spolupracuje s příslušnou ozubnicí 77 procházející nosným členem 70. Jedna oxubníce 77 pohání všechny držáky 75 příslušného sloupce. Lineární pohyb této ozubnice 77 vyvolává otáčení držáku 75. Směr zavádění krve pro hrubé oddělení, tj. pro oddělení skupiny lymfocytů od ostatní skupiny krevních buněk je kolmý к rovině, ve kterém je buňkový nosič skenován pod mikroskopem, Tak po oddělení lymfocytů od ostatních krevních buněk ae držáky 75 otočí o 90° pro sksnovací děj.

Aby byla možná technika *procházejícího světla* (měřicí světlo vychází ze spodního konce otvoru) ve shora uvedeném provedení, je část kanálu, která kříží držák 75 pod buňkovými nosiči, vytvořena jako skleněná trubka 78« která je rozdělena v délkovém směru. Tato trubka je uspořádána tak, že její otevřená strana směřuje к nosiči, (viz obr. 15B). Tímto způsobem se umožní vodorovný proud kapaliny držákem, zatímco současně je světlo přenášeno ve svislém směru, podtlak v této soustavě se vyvolá tím. že vnitřní vedení 73, 74 se provedou uzavřená a tenčí, zatímco horní kanály 71, 72 Jsou Širší a otevřené. Stejného účinku lze dosáhnout jinými technikami, jako zvýšením průtočnostl ve vnitřních vedeních oproti průtočnosti v horních kanálech.

CS 268157 82

Celý postup může být shrnut následující· způsobe·: pomocí řídícího ústrojí O - 90° ее určí poloho držáku 75. V první· období, kdy ее provádí *hrubé oddělení*, jsou v činností kanály 71 a vedení 73. Po dokončení tohoto období ее držáky 75 otočí o 90°. так ее kanály 71 a vedení 73 zablokují nebo uzavřou a kanály 72 a vedení 74 se otevřou·

U tohoto provedení eůže být hlava-kapající krev připojena ke skanovací hlavě, např· eíkroskop· Potom v odezvu na povelové signály z řídícího ústrojí, například samočinného počítače, ее oddělování a optické skenování provádí samočinně a bez potřeby školeného pracovníka· Pracovník musí pouze umlátit stříkačky, jak je znázorněno na obr. 6, a vyměnit držáky 75 po dokončení zkoušek·

Na obr. 16 je znázorněn celkový systém oddělování buněk, skenování aialýzy (diagnóza)· průtoková komora 81, jak byla popsána shora, je umístěna na desce 82, která je posouvatelná podle tří os X, Y, Z příslušnými krokovými motory 83, 84, 85, řízenými počítačem· Optická soustava obsahuje mikroskop 86 s optickým analyzátorem 87, jak ]e popsán na obr· 4. Excitační světelný zdroj 88, například zirkonová lampa, používá stejné optické soustavy v obráceném směru· V nádržce 89 pro roztoky jsou uloženy všechny roztoky potřebné pro oddělování buněk a zkoušení. Řídicí jednotkou 90 pro roztoky ae řídí dodávání příslušného roztoku· Aby se stabilizovala koncentrace fluoresceinu v buňkách, což může ovlivňovat absolutní hodnotu polarizace, je použito elektrooptického mechanického zpětnovazebního řízení, přičemž se periodicky měří fluorescence vysílaného světla a srovnává ее s referenční hodnotou· Oakákoliv odchylka měřené hodnoty od referenční hodnoty může být použita pro vyvolání změny v koncentraci roztoku FOA v P8S. Analýza měřené hodnoty může být prováděna jakýmkoliv známým počítačovým systémem. Rozhraní 91 předřazeného počítače slouží pro přeměnu měřených hodnot na informaci, kterou může číst počítač a která je typicky číslicová. V počítači 92 ее provádějí potřebně výpočetní a identifikační kroky a uloží se v paměti 93· Koncový počítačový řídící přístroj 94 generuje řídicí signál pro krokové motory a jednotku pro řízení roztoků.

Činnost shora uvedené soustavy může být shrnuta takto; po provedení hrubého oddělení se průtoková komora upevní na desce 82. Mikroskop se seřídí· Od tohoto okamžiku zkouška probíhá samočinně· Roztok PBS ♦ EDA ae zavádí kanály a vedeními, část tohoto roztoku proniká nosiči z horních kanálů do dolních vedení a' část proudí dále horními kanály a omývá buňky shora. Po zvolené přestávce, například 20 minut, započne skenování. Polarizace každé jednotlivé buňky ae měří na žádaných vlnových dálkách. Není zde nebezpečí nadměrného vyatavení buňky excitačníau avětlu, například 470 n·, jelikož skenování se provádí vel·! rychle.

Optická inforaace ae po přeaěně na impuls elektrického proudu zavádí do počítače, vyhodnotí a uloží do pamětí. Každá jednotlivá buňka je identifikována v paměti podle jejích souřadnic, tj. adresy na nosičích. Od tohoto stadia ae všechno, co může být řečeno o každé jednotlivé buňce, uloží v pamětí počítače ae zřetele· na její adresu.

Shromažďování dat aůže být ohrnuto takto: Kontrolní hodnoty buněk všech pacientů, jejichž nosiče byly seřazeny v jedno· kanálu, se určí nejdříve. Pak ae akanovací hlava přenese к nejbllžftímu kanálu (snížení desky a její odsunutí) a užije se při určování kontrolních hodnot všech buněk na nosičích seřazených ve druhém kanálu. Současně se shromažďováním dat z druhého kanálu ae do prvního kanálu zavádí stimulační roztok, po ukončení shromažďování dat druhého kanálu se akanovací hlava přenese к třetímu kanálu a druhý stiaulační roztok zavádí do druhého kanálu, atd.

Po shromáždění dat od všech nosičů se skanovací hlava navrátí do její první polohy. Poto· se skanovací děj opakuje na stimulovaných buňkách. Tentokrát bude shromažďování dat selektivní a budou znovu čteny pouze buňky, které splňují popsané optické kriterium, tj. buňky, které náležejí к určité podskupině, v důsledku toho inforaa14

CS 268157 82 ce, která bude nashromážděna v počítači, bude sestávat z polohy buňky, kontrolních hodnot, polarizačních hodnot po stimulaci prostřednictvím pha, hodnot polarizace po stimulací pomocí CaBP, reakční poměr SCm (viz L· Cercek et al· v Europ· □· Canner, av. 17, str. 167 - 171, 1961), hodnoty polarizace po stimulaci specifickými nádorovými popudy a pod·

Rozlišení mezi buňkovými nosiči různých pacientů může být provedeno magnetickým nebo optickým zakódováním, které může být umístěno na držácích v průběhu období hrubého oddělení· Magnetický nebo optický snímač může být připojen к optické skanovací hlavě, která přečte kód pacienta a přenese jej do počítače. Veškerá informace vztahující se na každého pacienta může být přenesena na předem určené místo v paměti počítače.

Touto soustavou může být určen přesný počet aktivovaných lymfocytů pro každé stimulační Činidlo. Pro odborníka umožňuje vynález rozeznat rakovinu ve velmi časném stadiu. I když vynález byl popsán především ve spojení s diagnózou rakoviny, je zřejmé, že způsob a zařízení podle vynálezu nejsou na tento příklad omezeny. Obecně udávají způsob a zařízení pro rychlé provádění biologických pokusů a zkoušek, vedoucích к novým klinickým diagnózám a léčení, jakož i к novým aplikacím na polí biotechnologie a biologické chemie· □ak bylo shora uvedeno, je přesná poloha každé aktivované buňky na nosiči určena a uložena v paměti· Proto je možné isolovat Žádanou skupinu nebo podskupinu buněk na nosiči selektivním odstraněním všech ostatních buněk z nosiče, takže na něm zůstane pouze podskupina buněk, nebo uvolnění a odstranění pouze buněk podskupiny z nosiče. Za tím účelem lze využít známé skutečnosti, že buňky nejsou elektricky neutrální, nýbrž mají elektrické povrchové náboje. Této skutečnosti může být ve shora uvedených provedeních využito provázání nebo jiné upevnění buněk к nosiči· Stejného jevu lze využít pro selektivní uvolnění nebo držení žádaných buněk· .Toho lze dosáhnout upraveným provedením buňkového nosiče podle obr. 1A, což bude nyní vysvětleno vé spojitostí s obr· 17· Vnější tvar nosiče 100 je stejný, jak znázorněno na obr· 1A· Avšek nosič 10 je opatřen elektrickými vodiči 101 probíhejícímí mezi otvory 102 v mřížovité konfiguraci a elektricky izolovanými od sebe navzájem. Na obvodu nosiče jsou vodiče spojeny známým způsobem (technika IC) s přepínacím zařízením, řízeným počítačem, pro selektivní ovlivňování elektrického potenciálu každého vodiče 101· Pro upevnění buněk na nosiči mohou být všechny vodiče 101 udržovány na stejném potenciálu opačném než je potenciál náboje buňky, což vede к elektrickému přitahování buněk· pro uvolnění kterékoliv buňky, například buňky v otvoru označeném A na obr· 17, mohou být sousední vodiče ν_χ2, ν_χ3. Vyj, Vy₂ nastaveny na vhodný potenciál pro vyvolání vyhození buňky v otvoru A z nosiče.

Buňkový nosič 100 může být vyroben mnohavrstvou technikou, známou z výroby IC· V případě, že se užije iontového roztoku, například pes, je třeba učinit opatření pro zabránění nežádoucího vlivu případných povrchových nábojů na držák· Za tím účelem může být povlečen izolací a opatřen vodivými Členy končícími v kanálu· To by způsobilo přitahování a neutralizování lontů a zabránilo vytvoření iontového krytu přes povrch držáku, což by mohlo mít vliv na potenciál nosiče· Jiná možnost je použít neiontových organických roztoků, například lipidů pro potažení nosiče v tomto ebdebí výroby·

Oddělení zvláštních buněk soustavou podle vynálezu od všech ostatních buněk je jedinečně použitelné v oblasti kritického zpracování při výrobě klonů· Klony mohou být vyrobeny z určitých buněk, které byly vybrány z ostatních buněk na základě jakékoliv zvolené vlastnosti v souhlasu a návodem vynálezu· Například je velmi dobře známo, Že tělo osoby, postižené určitými nemocemi například rakovinou kůže, vytváří identifikovatelné buňky pro potírání nebo vyléčení nemoci· Aby však to bylo úspěšné, může být nutno, aby v těle byl velký počet takových buněk, jež budou nadále označovány jako buňky se schopností fagocytózy. Podle vynálezu lze jako zdroje takových buněk krve, lymfatických uzlin a odlišných tělových tkání obsahujících buňky se schopností fygocytózy.

CS 268157 82 po jejich oddělení_t jak bylo shora popsáno, od všech ostatních buněk, nohou být buňky ее schopností fagocytozy rozmnoženy vhodnými technikami pro růst buněk a pak zavedeny do pacienta za kterého byly odebrány původní buňky za účelem potírání nemoci, v takovémto případě se neočekává žádné odmítnutí buněk, jelikož buňky pocházely z těla pacienta. Takto lze vynálezu použít к tonu, aby tělo pacienta bylo opatřeno dostatečným množstvím buněk pro léčení jeho vlastní choroby.

□e třeba zdůraznit, že zatímco dosud může být oddělení mezi žádanými buňkami na nosiči a mezi ostatními buňkami vyvoláno odstranění bud žádaných buněk z nosiče, takže na něm zůstanou pouze ostatní buňky, nebo odstraněním buněk kde nejsou žádány a zůstavení pouze vybraných buněk na nosiči, může být takové oddělení v případě potřeby provedeno rozrušením buněk, které nejsou žádány, pokud jsou v otvorech nosiče, takže jediné živé buňky zůstávající na nosiči,jsou žádané buňky. Rozrušení buněk v otvorech, tj. in šitu, může být dosaženo směrováním laserového svazku na každou buňku na její známé adrese, jakož i podobnými a analogickými prostředky. Rozrušená buňka, tj. mrtvá buňka, i když je na nosiči, může být považována za oddělenou nebo odstraněnou z nosiče, jelikož pro všechny praktické účely není brána po rozrušení v úvahu, výraz odstranění” nebo 'vyhnáni* buňky jek je ho zde užíváno, má zahrnovat také odstranění buňky z nosiče nebo její rozrušení in sítu.

Pokud jde o rozmnožení žádaných buněk, je zřejmé, že může být provedeno a/ poté kdy buňky určené к rozmnožení byly odstraněny z nosiče nesoucího na sobě živé buňky, které nejsou žádány, a b/ po odstranění buněk, které nejsou žádány z nosiče, a potom rozmnožením Žádaných buněk pro účely růstu, а с/ po rozrušení buněk, které nejsou žádány, když ještě jsou v otvorech, a rozmnožení buněk žádaných in sítu, tj. zatímco jsou v jejich otvorech nosiče.

I když zásady vynálezu byly popsány ve spojitosti ae specifickými systémy, aplikacemi a postupy. Je třeba zdůraznit, že tento popis je určen pouze pro vysvětlení a nikoliv pro omezení rozsahu vynálezu.

Vynález otvírá mnoho nových aplikací v biologickém bádání, klinickém ošetřování a průmyslové výrobě, očekává se, a bylo to již potvrzeno do uspokojivé míry, že existují optické parametry mající vztah к cyklické fází buněk, vynálezem je umožněno rozdělit populaci buněk podle stáři buněk, stavu jejich cyklu a jejich vlastní funkce a provádět příslušná šetření. Klinická aplikace této možnosti záleží v časném rozeznání leukémie, která se vyznačuje přítomností vysokého počtu mladých buněk určitého typu nebo typů v krvi a v kostním morku.

□ako jiná klinické aplikace mohou být prováděny testy immunoreaktivity pro transplantace různých orgánů. Za tím účelem se užije přípravek z transplantovaného orgánu jako stimulační činidlo podle vynálezu.

Obecný a důležitý rys přednosti vynálezu je skutečnost, že doba potřebná pro biologické zkoušky a pokusy je značně zkrácena, jelikož identifikace a zkoušení buněk se provádí ve značně kratším čase než и běžných biologických postupů, kde přirozený vývoj často musí být reprodukován při umělých podmínkách, což vede к nejistým výsledkům, vyžadujícím rozsáhlá statistická vyhodnocování_rt vynález snižuje vliv okolí a umožňuje numerickou analýzu a minimální statistikou. Potřeba Času pro provedeni měření podle vynálezu je velmi krátká v absolutních hodnotách při srovnání c dřívějším stavem techniky, Čímž se sníží účinek změn v okolních podmínkách, jako je teplota, vlhkost, átd.

I když shora byly popsány a znázorněny zvláštní provedení vynálezu, je zřejmé, že odborník je schopen udat různé jeho modifikace a obměny, které vesměs spadají do rámce vynálezu.

Claims (14)

1· Způsob oddělování určitých biologických buněk od Jiných buněk pro pozorování a zpracování těchto buněk/ vyznačující se tí·/ že se ze eněsi různých buněk oddělí pouze buňky požadované velikosti zadržením V Otvorech o velikosti/ odpovídající velikosti buněk, na otvory se zachycenými buňkami se aplikuje síla к usnadnění zachycení nebo к uvolnění buněk z otvorů, vlastnosti zachycených buněk se zkoumají a zachycené nebo uvolněné buňky se zpracovávají požadovaným způsobem.

2. Způsob podle bodu 1/ vyznačující se tím, že okolí otvorů se omyje pro odstranění buněk/ nezachycených v otvorech.

3. Způsob podle bodu 1 nebo 2, vyznačující se tím/ že aplikace síly spočívá v přitaženi к otvoru, ve zvý&ení přilnavostí buňky к otvoru nebo ve vypuzení buňky z otvoru·

4· Způsob podle bodů 1 až 3, vyznačující ae tím, že ae užije elektromagnetické síly·

5« Způsob podle bodů 1 až 4, vyznačující ae tím, Že ae vytvoří tlakový rozdíl.

6· Způsob podle bodů 1 až 5, vyznačující ae tím, Že ae zachycené buňky stimulují·

7. Způsob podle bodů 1 až 5/ vyznačující se tí·/ že se zachycené buňky stimulují a pak se měří jejich vlastnosti.

8· Způsob podle bodů 6 nebo 7/ vyznačující ae tím, že se stimulované buňky rozruší nebo množí nebo ae navrátí do svého předchozího stavu nebo ae neutralizují a pak stimulují způsobe·/ od1líným od první stimulace·

9· Způsob podle bodů 1 až 6/ vyznačující se tím. Že se aplikací síly vypudí buňky z otvorů a vypuzené buňky se rozruší.

10· Způsob podle bodů 1 až 6/ vyznačující se tím, že se aplikací síly vypudí buňky, zachycené v otvorech a vypuzené buňky se množí·

11· Zařízení pro selekcí určitých biologických buněk, vyznačující se tím, že obsahuje nosič (1) předem zvolené tloušEky mezi horním a spodním povrchem, mezi horním a protilehlým spodním povrchem probíhá větší počet otvorů (2) v předem zvoleném uspořádání, otvory mají předem zvolenou konfiguraci a předem zvolené rozměry na horním a spodním povrchu nosiče, definovatelné jako horni a spodní rozměry, přičemž horní rozměr každého otvoru Je větší než Jeho nejmenŠÍ vnitřní příčný rozměr a tlouSlka nosiče a horní rozměr každého otvoru odpovídají rozměrům určitých biologických buněk, dále obsahuje držáky (10, 40) pro uložení nosiče v určitém místě, každý otvor nosiče je uložen na stanovišti, definovatelném jako adresa vůči držáku a popřípadě střední část (11), selektivně přestavitelnou vzhledem к držáku (10, 40) a řídícímu přístroji (94) a prostředky pro aplikaci síly, a to

a) vodič (101), uložený v předem určené poloze vzhledem к otvorům,

b) prostředky к vytvoření tlakového rozdílu a/nebo

c) spodní Část (115), horní část (116) a těsnicí lištu (117) průtokové komory jako prostředky pro zvýšení přilnavosti buněk к otvorům·

CS 266157 B2

12. Zařízení podle bodu 11, vyznačující se tím. Že nosič je v podstatě rovinný a přesné umístění každého otvoru je dáno jeho souřadnicemi vzhledem к osám x a y.

13· Zařízení podle bodu 11, vyznačující se tím, že jako přístroje pro pozorování a/nebo měření vlastností buňky obsahuje optické skanovací ústrojí, a to mikroskop (86) a optický analyzátor (87).

14. Zařízení podle bodu 11, vyznačující se tím, že na držáku (10) je uložena řada od sebe oddálených nosičů.