NO144002B - Anordning for anvendelse ved vaeskestroemsfotometri - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en anordning for anvendelse ved væskestrømsfotometri. Denne anordning kan benyttes for måling av enhver type mikroskopiske partikler slik som f.eks. celler, industrielle partikler osv. Oppfinnelsen skal i det følgende forklares og omtales under spesiell henvisning til cellemåling.

Cytofotometri er en viktig arbeidsmetode innen cellebiologisk forskning, spesielt på området omfattende kre-ftforskning. Her legges det således vekt på undersøkelse av den abnorme vekst hos cellepopulasjoner hvorved nye celler dannes ved celledeling. Cellen vil under sin syntesefase fordoble sitt DNA-innhold slik at man ved celledelingen (mitose-fasen) får dannet to nye celler. Ved måling av DNA-mengden pr. celle er det mulig å bestemme fordelingen av cellene på de enkelte celle-cyklusfaser. Andelen av celler med et forøket DNA-innhold i en cellepopulasjon kan være et mål for formeringsaktiviteten. Fordelingen av cellene i en cel-lepopulasj on på de enkelte cellecyklusfaser må kunne bestemmes med stor nøyaktighet. Statistiske feil kan unngås bare dersom flere tusen celler måles. Dette nødvendiggjør at de individuelle målinger utføres meget hurtig.

En teknikk som idag bl.a. anvendes for slike målinger, er den såkalte væskestrømscytofotometri som stadig blir mer utbredt både når det gjelder forskning og diagnost-iske formål. Prinsippet ved en slik metode er å føre en be-grenset strøm av celler farget med et fluoriserende fargestoff som bindes kvantitativt til den eller de eellebestand-deler som skal studeres, gjennom en stråle av eksiterende lys og måle intensiteten av de resulterende fluorescens-pulser. Fordelingen av cellene med henblikk på en bestemt bestanddel, slik som DNA, kan således bestemmes med stor nøy-aktighet og med en hastighet av størrelsesorden 10^ pr. sek-und. Cellene transporteres automatisk til målestedet i en væskestrøm, vanligvis vann. Cellene er således ikke ut-spredt på objektglass, men befinner seg suspendert i en væske. Denne suspensjon drives gjennom kapillarrør, og cellestrømmen blir ved hjelp av en konsentrisk omhyllingsstrøm som strømmer rundt nevnte rør og i samme retning som cellene og er fri for partikler, hydrodynamisk fokusert slik at cellene passerer gjennom et nøye avgrenset område i cytofotometrets målefokus. Cellene passerer etter hverandre gjennom dette måleområdet med høy hastighet slik som omtalt ovenfor.

Målingen av cellebestanddelene utføres med et mikrofluorometer. En betingelse for dette er at cellebestand-delen, som nevnt ovenfor, er farget med et fluoriserende fargestoff. Når en celle inneholdende fluoriserende fargestoff passerer gjennom mikroskopobjektivets fokuseringsområde, ut-sender den fluoriserende lys som oppsamles av objektivet og føres til en fotomultiplikator. Signalet fra denne regist-reres og er et uttrykk for cellens innhold av vedkommende bestanddel.

Et kjent væskestrømcytofotometer anvender oven-nevnte teknikk og omfatter et lukket system med et omhyllings-strømmålekammer. Dette kammer består av et glass- eller met-allegeme med kanaler i T-form. Her blir en omhyllingsstrøm

sammen med partikkelsuspensjonen som skal måles, ved hjelp av sug ført gjennom den kanal som danner T-formens stamme, og

i sentrert nøyaktig langs systemets optiske akse, slik at man får et måleområde ved T-formens toppunkt, dvs. ved området for de tverrgående kanaler som utgjør T-formens armer. Den ene av disse tverrgående kanaler fører rense<y>æske, mens den andre representerer en dreneringskanal for utføring av væske-strøm med målte partikler. Ved denne kjente teknikk har man altså tilførsel av partikler langs den optiske akse med fokusering av hver partikkel gjennom det optiske brennpunkt beliggende i måleåpningsplanet. Det optiske system som her benyttes omfatter en såkalt olje-immersjonsoptikk, som er kjent

for fagmannen, og hvorved optikken er i kontakt med væske-suspensjonen inneholdende de partikler eller celler som skal undersøkes.

Det er også kjent væskestrømscytofotometre som benytter lukkede omhyllingsstrøm-målekamre, men hvor væske-

, strømmen føres vinkelrett gjennom den eksiterende lysstråle i måleområdet.

Det er videre kjent væskestrømscytofotometre hvor en fokusert væskestråle inneholdende partikler som skal undersøkes føres i luft gjennom et på væskestrålen fallende eksitasjonslys. Dette lys er fokusert i væskestrålen slik at når enkeltpartikler, som kan være farget med et fluoriserende stoff, passerer dette lysfokus, vil man få en puls av fluorescenslys som oppfanges av en foto-celle .

Ovenfor omtalte kjente væskestrømningscyto-fotometre er komplisert oppbygget, hvliket fører til høye konstruksjonskostnader, og det er idag et stadig voksende behov for et enkelt og billig instrument som kan brukes i forbindelse med rutinemessige undersøkelser. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en konstruksjon som benytter et standard fluorescensmikroskop fortrinnsvis med immersjonsoptikk, med et egnet fotometer, samt hydrodynamisk fokusering av en partikkelsuspensjon, hvilken konstruksjon er re-lativt billig og lettvint å betjene, samt gir en høy opp-løsning og stabilitet.

I følge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebrakt en anordning for anvendelse ved væskestrøms-fotometri omfattende en innretning for hydrodynamisk fokusering av en partikkelsuspensjon mot et måleområde, samt et optisk eksitasjons- og deteksjonssystem, fortrinnsvis basert på oljeimmersjonsoptikk i et standard fluorescensmikroskop, og denne anordning er kjennetegnet ved at fokuseringsinnret-ningen er utformet som et i forhold til systemets optiske akse dreibart anordnet utsprøytningslegeme som er innrettet mot en i forhold til den omgivende atmosfære frittliggende og på optikken beliggende flate som utgjør optikkens måleområde, hvorved det oppnås en laminær væskestrøm av nevnte suspensjon på deteksjonssystemets måleområde.

Med betegnelsen "i forhold til den omgivende atmosfære frittliggende måleområde" menes at man ved foreliggende anordning ikke anvender et lukket kammer, som omtalt ovenfor, hvori partikkelsuspensjonen føres og fokuseres, men normalt lar væskestrålen gå i luft mot måleområdet. Det vil således være foretrukket at også utsprøytingslegemets munnstykke befinner seg i den omgivende frie atmosfære. Ifølge oppfinnelsen kan måleområdet utgjøres av overflaten av en gjennomsiktig plate, f.eks. et utskiftbart dekkglass, i kontakt med optikken.

Med foreliggende konstruksjon oppnår man måleresultater som er minst like gode som de beste som er opp-nådd med de ovenfor omtalte konstruksjoner. Videre utgjør foreliggende anordning at apparatet er meget enklere å opp-stille og innstille enn kjente systemer. På grunn av at måleområdet og selve munnstykket for utsprøytingslegemet befinner seg i friluft, vil man lettere kunne komme til ved en inspeksjon og rengjøring. Således kan dekkglasset på måleområdet lett spyles rent eller utskiftes. Videre er det lett å gjennomspyle den hydrodynamiske fokuseringsinnretning som omfatter utsprøytingslegemet.

Ved at utsprøytingslegemet er dreibart i forhold til systemets optiske akse, kan man oppnå forskjellige innfallsvinkler for den partikkelholdige væskestråle, og ut-sprøytingslegemet kan således dreies mellom vertikal- og horisontal-stilling i forhold til måleområdets plan. Denne dreibare anordning av utsprøytingslegemet gjør at man kan foreta en måling av asymmetrieffekter hos de partikler eller celler som undersøkes. Dette er av interesse når man ønsker opplysninger om partiklenes form. Slike effekter lar seg vanskelig måle når væskestrålen er permanent innrettet verti-kalt på måleområdets plan, slik som hos det ovenfor omtalte kjente system hvor man benytter et lukket væskestrømnings-kammer.

Det er foretrukket å ha en dreneringsinnretning

i utkanten av optikkens måleområde, og denne innretning ut-gjøres fortrinnsvis av et rør koplet til et sug.

Oppfinnelsen skal i det følgende omtales under henvisning til den medfølgende tegning som viser et skjematisk sidesnitt av foreliggende anordning med utsprøytingslegeme innstilt slik at det danner en spiss vinkel med måleområdets plan.

Utsprøytingslegemet (1) er montert i en holder (2) med et inntaksrør (3) for den prøvesuspensjon med partikler som skal undersøkes. Dette inntaksrør (3) går over i en hul-nål som munner ut sentralt og aksialt inne i utsprøytnings-legemet (1). Holderen (2) har videre inntaksrør (5) for omhyllingsvæske og dette rør har utløp i utsprøytingslegemet (1) slik at omhyllingsvæsken kan strømme omkring hulnålen (4). Utsprøytingslegemet har en munnstykkedel (6) som har sitt ut-løp over et dekkglass (7) som ligger over og er i kontakt med et immersjonsoljelag (8) på et mikroskopobjektiv (9). På figuren er det vist at dekkglasset (7) hviler på en holder (10) forbundet med selve mikroskopstativet (11). Som nevnt ovenfor, er utsprøytingslegemet (1) anordnet dreibart i forhold til systemets optiske akse, dvs. mellom vertikal og horisontal stilling som representeres henholdsvis ved y-aksen, som representerer den optiske akse, og x-aksen, på figuren. På figuren er holderen (2) med utsprøytingslegemet (1) og munnstykket (6) vist dreiet i forhold til y-aksen med en innfallsvinkel betegnet a. Por å fjerne væske fra dekkglasset (7) etterhvert som denne påføres fra munnstykket (6), er det anordnet en drenering (12) som står i forbindelse med et sug.

Når det gjelder beskrivelse av væskestrømscyto-fotometret forøvrig hvori den foreliggende og skjematisk viste anordning anvendes, skal man vise til og inkludere litteratur på området som er kjent for fagmannen.

Ved bruk av foreliggende anordning i et væske-strømscytof otometer føres en partikkel- eller cellesuspen-sjon gjennom røret (3) samtidig som en omhyllingsvæske føres gjennom røret (5), og disse to medier skaper ved hjelp av munnstykket (6) på utsprøytingslegemet (1) en hydrodynamisk fokusert prøvestrøm som utgjøres av væskestråle i luft og som rettes på mikroskop-dekkglasset (7) på objektivsystemet (8,9). Man får da på dekk-glasset (7) dannet et laminært, veldefinert og stabilt som betraktes gjennom fluorescensmikroskopet i på-lys (Epi), dvs. med eksitasjonslyset fokusert gjennom objektivet (9). Væsken fjernes fra dekkglasset (7) ved hjelp av dreneringen (12).

Man har funnet at store innfallsvinkler, f.eks. a=70° gir bedre måleresultater enn hva som oppnås ved andre innfallsvinkel-innstillinger, f.eks. ved ct = 0°, dvs. når væskestrømmen påføres perpendikulært på dekkglasset (7). Foreliggende anordning kan i det vesentlige anvendes i forbindelse med et hvilket som helst fluorescensmikroskop som har belysning gjennom objektivet. Den høye hastighet på væskestrålen i luft (tilnærmet 10 m/sek) og det laminære strømningsmønster på dekkglasset, tillater at system-et kan orienteres i en hvilken som helst retning. Foreliggende anordning vil sette fagmannen i stand til å oppsette et væske-strømscytof otometer som er overlegent med hensyn til oppløs-ning og enkelhet, samt rasjonell bruk, og som muliggjør opp-nåelse av måleresultater som er minst like gode som de som oppnås ved kjente kommersielt tilgjengelige systemer.

Foreliggende anordning kan i vertikal oppset-ting anvendes for volummålinger basert på Coulter-prinsippet ved å påføre et metallbelegg på den indre overflaten av munnstykket (6) og som en ring på den øvre overflaten av dekk-glasset (7) for derved å gi elektroder for den ioniske strøm som anvendes ved slike målinger. Den korte væskestrålen mellom munnstykket (6) og dekkglasset (7) vil dermed utgjøre avfølingsområdet for en forandring i elektrisk impedanse in-dusert av en passerende partikkel eller celle. Videre kan man foreta lysspredningsmålinger ved benyttelse av et mørke-feltsobjektiv og en detektor plassert i mørkefeltet. Store innfallsvinkler (dvs. 70° eller mer) vil være mest hensikts-messig for slike lysspredningsmålinger fordi slike innfallsvinkler tillater sentrering av en lysspredningsdetektor i området ved den optiske akse.

Claims (5)

1. Anordning for anvendelse ved væskestrømsfoto-metri omfattende en innretning for hydrodynamisk fokusering av en partikkelsuspensjon mot et måleområde, samt et optisk eksitasjons- og deteksjonssystem, fortrinnsvis basert på oljeimmersjonsoptikk i et standard fluorescensmikroskop, karakterisert ved at fokuseringsinnret-ningen er utformet som et i forhold til systemets optiske akse dreibart anordnet utsprøytingslegeme som er innrettet mot en i forhold til den omgivende atmosfære frittliggende og på optikken beliggende flate som utgjør optikkens måleområde, hvorved det oppnås en laminær væskestrøm av nevnte suspensjon på deteksjonssystemets måleområde.

2. Anordning i følge krav 1, karakterisert ved at utsprøytningslegemets munnstykke befinner seg i den omgivende frie atmosfære.

3- Anordning i følge krav 1, karakterisert ved at måleområdet utgjøres av overflaten av en gjennomsiktig plate, f.eks. et utskiftbart dekkglass, i kontakt med optikken.

4. Anordning i følge krav 1, karakterisert ved at utsprøytingslegemet kan dreies mellom vertikal- og horisontal-stilling.

5. Anordning i følge krav 1, karakterisert ved at det er anordnet en dreneringsinnretning som utgjøres av et rør koblet til et sug, i utkanten av måleområdet.