NO134984B - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av de nye forbindelser 3-fluor-D-alanin, 2-deutero-3-fluor-D-alanin eller 2,3,3-trideutero-3-fluor-D-alanin, samt salter av disse forbindelser.

Den racemiske forbindelse 3-fluor-D,L-alanin er en kjent forbindelse beskrevet av Lettre et al., i Ann. Chem. 708, 75-85

(1967). De optiske isomerer har imidlertid ikke vært beskrevet,

og heller ikke har den antibakterielle aktivitet av racematet vært undersokt. 3-fluor-D-alanin og dets optiske isomer fremstilles ikke ifolge oppfinnelsen- ved spaltning av det kjente racemat, men, som det vil fremgå senere, ved direkte fluorering av de kjente og kommersielt tilgjengelige D-alaniner.

Forbausende nok har det vist seg at bare under spesielle in vitro antibakterielle prøvemetoder gjorde den inhiberende aktivitet av 3-fluor-D-alanin seg gjeldende. Det var derfor mulig å vise at

den in vitro antibakterielle aktivitet av de optiske isomerer er sammen-lignbare. Allikevel skiller isomerene seg markert in vivo. D-isomeren bibeholder sine antibakterielle egenskaper og tjener til å beskytte det infiserte dyr mens L-isomeren synes å mangle evnen til å beskytte bakterielt infiserte dyr og er enndog drepende for disse dyr i selv moderate dosemengder.

De nye forbindelser og deres salter er antibakterielle midler som er nyttige til å inhibere veksten av pato-gene bakterier av både gram-positive og gram-negative slekter som Streptoeoccus, Escherichia, Staphylocoecus, Salmonella, Pseudomonas, Diplococcus, Klebsiella, Proteus, Mycobacterium, Vibrio, Pasteurella og Serratia, såvel som antibiotisk resistente stammer derav. Illustrerende for slike patogener er Escherichia coli, Salmonella schott-muelleri, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis, Pseudomonas aerugin-osa, Stephylococcus aureus og Streptoeoccus pyogenes. De nye forbindelser og deres salter kan således anvendes som antiseptiske midler for å fjerne påvirkelige organismer fra farma-søytisk, dentalt og medisinsk utstyr, og kan også anvendes på andre områder som er utsatt for infeksjon av slike organismer.

D-isomeren av de nye forbindelser og deres salter er særlig verdifulle fordi de ikke bare har den ovennevnte anvendbarhet, men de er også nyttige ved behandling av sykdommer fremkalt av de oven-stående organismer i mennesker og dyr, og kan administreres i en lang rekke terapeutiske doseringer i konvensjonelle medier som f.eks. ved oral administrasjon i form av en kapsel eller tablett eller i en flytende opplosning eller suspensjon. Egnede formuler-inger kan innbefatte fortynningsmidler, granuleringsmidler, konser-veringsmidler, bindemidler, smaksstoffer og belegningsmidler som er vel kjent i faget, og dosene for produktene kan varieres over et vidt område med en ovre grense som bestemmes av den autoantagonistiske terskelverdi av den infiserende organisme med hensyn på 3-fluor-D-alanin i det umiddelbare område for ventet antibakterie11 virkning. Eksempelvis ville doser variere fra ca. 250 mg til ca. 500 mg 2 - k ganger daglig av aktiv bestanddel pr. 70 kg voksent menneske. Et voksende fordyr på veksttillatende terapi bor få ca. 100 g/tonn total-f(5r. Alternativt kan de administreres parenteralt ved injeksjon i et sterilt hjelpemedium.

Entydeligheten av den in vitro antibakterielle prove nevnt ovenfor skyldes den uvanlige egenskap hos 3-fluor-D-alanin at det er autoantagonistisk ved hoye konsentrasjoner. I standard antibakterielle utskillelsesforsbk som er beregnet på å plukke opp aktiviteter av meget lav størrelsesorden, og hvor folgelig relativt hoye konsentrasjoner av forsoksforbindelse anvendes, ville folgelig aktiviteten av 3-fluor-D-alanin bli oversett.

Denne autoantagonistiske egenskap begrenser ikke dets anvendbarhet, da den bare opptrer f.eks. in vivo ved doser storre enn ca.

10 ganger det gjennomsnittlige effektive helbredelsesnivå.

Mens 3-fluor-L-alanin metaboliseres hurtig og fullstendig med toksiske folger, er 3-fluor-D-alanin utsatt,for en meget langsommere nedbrytning in vivo. En mulig årsak er D-aminosyre-oxydaseenzymet som er tilstede i rikelige mengder i mennesker og rotter, men i meget lavere utstrekning i mus og visse planteetende husdyr. Hverken metabolisme-hastigheten, som- den kan påvirke blodinnholdet av den terapeutiske forbindelse, eller biproduktene fra denne metabolisme taler imidlertid mot anvendelsen av forbindelsen ved den dosemengde som er foreslått for mennesker eller dyr.

Det har videre vist seg

at deuterering gir nye deutero-analoger som er betraktelig mindre utsatt for angrep av D-aminosyre-oxydase og allikevel bibeholder den antibakterielle styrke av opphavsforbindelsen. In vivo aktiviteten bkes og opprettholdes derved.

Virksomheten av 3- fluor- D- alanin sammenlignet med andre antibiotika ved behandling av infiserte mus. CD. 1 hunmus av gjennomsnittsvekt 21,0 g ble injisert intraperitonealt med 0,5 ml av en passende fortynning av en 16 timers buljongkultur inneholdende de angitte patogener.

Infiseringsgraden er i hvert tilfelle angitt som det multippel av fortynningen av buljongkulturen som var dodelig for bare 50$ av den ubehandlede bestand, LD^Q-dosen.) Den terapeutiske forbindelse ble så straks administrert i et 0,5 ml volum ved en av de angitte veier, enten subcutant på ryggen (S.C.), intraperitonealt (I.P.) eller med sonde (oralt P.O.). I tilfelle av mus infisert med Streptoeoccus- eller Diplococcus-organismer ble dessuten en annen dose av terapeutisk middel administrert 6 timer efter infeksjon. Resultatene av disse forsok er uttrykt som den statistisk interpolerte dose som kreves for å beskytte ^ 0% av den infiserte bestand i et tidsrom av 7 dager efter smitte og behandling, (dodsfall blant dyr med mis-lykket behandling eller ubehandlede kontrolldyr inntrer i alle tilfelle i lopet av de forste 3 dager). Forkortelser hsr anvendt for forbindelsene som sammenlignes er: 3FDA - 3-fluor-D-alanin;

CYC = D-cycloserin*,' TET = tetracyclin; CLM'= kloramfenikol.

En markert overlegenhet 1 styrke for behandling av et bredt spektrum av bakterielle infeksjoner oppvises av 3-fluor-D-alanin. Særlig ved den praktiske orale administrasjon gir 3-fluor-D-alanin en grad av virksomhet som tilsvarer eller overgår den for de inn-arbeidede antibiotika kloramfenikol og tetracyclin.

Sammenligning av sikkerhet og helbredende virksomhet i mus av 3- fluor- L- alanin ( 3- FLA) og 3- f luor- D- alanin ( 3FDA).

Grupper på fem CD 1 hunmus av gjennomsnittsvekt 21 g tjente

enten som uinfiserte kontroller eller som objekter for antibakteri-ell terapi efter intraperitoneal injeksjon med 0,5 ml av en fortynnet buljongkultur av Escherichia coli 2017 som representerte 7 LD^q av bakterielle patogener. Terapeuticumet ble administrert i de angitte doser i et 0,5 ml volum ad oral vei i hvert tilfelle.

Toleransen hos mus overfor 3-FDA ovérstiger den overfor 3-FLA med en faktor på minst 10. Under den maksimalt tolererte dose er 3-FLA uten terapeutisk virkning. Mens moderate mengder av 3-FDA er fullstendig beskyttende, Oppviser hoyere mengder in vivo, som de gjor in vitro., tegn på auto ant ag on isme.

Innflytelse på bakterievekst av konseritrasjonsgradienter av

3- FDA og 3- FLA, illustrerende autoantagonisme

Overflaten av et 2 mm tykt næringsagarskikt i en petriskål ble k p

belagt med 10 organisme/cm av en'"kultur av Escherichia coli 2017 og der ble så lagt på dem papirskiver, 7 mm i diameter, med de angitte mengder av 3-FDA eller 3-FLA. Efter inkubasjon ved 37°C i

16 timer ble de sirkulære soner som var fri for bakterievekst rundt skivene målt. Enestående i tilfelle av 3-FDA, og der bare ved hoy-

ere drogeméngder, ble der iakttatt en ring av vekst som heftet til papirskiven så fulgt av en ring av bakteriefri agar. Den indre vekstsone, noyaktig i det hoye konsentrasjonsområde av konsentra-sjonsgradienten frembragt av diffunderende droger, er angitt som sonen for autoantagonisme.

De nye fluorerte aminosyrer fremstilles ifolge oppfinnelsen ved en fremgangsmåte som omfatter å behandle substratet med et fluoroxy-perfluoralkan eller fluoroxypentafluorsvovel under innflytelse av en fri radikal initiator som lys som innbefatter ultrafiolett lys, ioniserende bestråling som a-stråler eller mikrobolger, eller kjem-iske kjedeinitiatorer som azoforbindelser, f.eks. azo-bis-isobutyro-nitril eller kombinasjoner av slike fri radikalinitiatorer. Den fore-trukne arbeidsmåte er å opplose substratet i et passende opplosnings-middel som er inert overfor fluoreringsreaksjonen som flytende hydro-genfluorid, fluorsulfonsyre, trifluoreddiksyre eller svovelsyre, å eksponere opplesningen til den fri radikalinitiator, under kraftig roring og opprettholdelse av temperaturen, å tilsette den nodvendige mengde av fluoroxyreagenset langsomt til reaksjonsblandingen, og fortsette omroringen og bestrålingen inntil reaksjonen er fullstendig.

På grunn av det lave kokepunkt av reagensene er det bekvemt å utfore reaksjonen ved temperaturer så lave som -80°C i hvilket tilfelle reaksjonen forloper ved atmosfæretrykk.

Et passende reaksjonskar for atmosfæretrykkceaksjoner er et fremstilt av en "Kel-F" stav forsynt med et ultrafiolett gjennomslipp-bart vindu. Alternativt kan reaksjonen utfores i et trykkar som en "Hastelloy"-bombe eller en stålbombe med platinaforing, i hvilket tilfelle hoyere temperaturer, f.eks. opp til ca. 100°C kan anvendes.

I slike tilfelle er anvendelsen av a-stråler eller røntgenstråler

som fri radikalinitiator bekvem, da disse hoyenergistråler trenger

'gjennom veggen av reaktoren.

Den ovenfor beskrevne fremgangsmåte kan utfores ved konvensjonelle satsmetoder, eller alternativt kan den kjores kontinuerlig i

en rorformig reaktor enten med eller uten pakning som Ras.chig-ringer, sadler eller lignende, hvorigjennom substratet eller en opplosning av det og fluoreringsmidler pumpes, fortrinnsvis i motstrbm mens de ut-settes for radikalgenererende bestråling.

En bekvem kilde til bestråling for radikalgenerering har vist seg å være en "Hanovia"-kvikksblv-xenon-buelampe nr. 9778-I, drevet av en 1000 W krafttilførsel. Lampen var montert i enSchoeffel LH 15 1-N" projektor forsynt med en kvarts kondensorlinse og et varme-filter (vann).

Eksempel 1

3- fluor- D- alanin

I en oppløsning av 1,822 g D-(-)-alanin i V 5 ml flytende HF ble innfort 0,6 g fluoroxytrifluormethangass i lopet av en time under magnetisk omrbring, avkjblt i et tbrris-acetonbad og bestrålt med ultrafiolett lys. Efter 80 minutters ytterligere ultrafiolett bestråling ble ytterligere 2 g fluoroxytrifluormethangass innfort under ultrafiolett bestråling i lbpet av 1,5 timer, fulgt av ytterligere 1 times ultrafiolett bestråling.

Opplbsningsmidlet ble fjernet ved å blåse gjennom det en strbm av nitrogengass. Residuet ble opplost i is^vann og en prove av det ble analysert i Spinco-Beckman-aminosyreanalyætoren som viste et <h>l%- ±g utbytte av 3-f luor-D-alanin, og 3, 2% ureagert utgangsmateriale. For isolasjon ble blandingen kromatografert på "Dowex 50 x 8" kation-bytteharpiks (H+<->formen). Til fortynning ble 2N saltsyre anvendt. Fra de passende fraksjoner fikk man ved inndampning i vakuum rent 3-fluor-D-alanin-hydroklorid. 3-fluor-D-alanin ble frigjort fra hydrokloridet i vann-pyridin-isopropanolblanding, smeltepunkt 166-168°C (spaltning), [a]^°, -9,3° (C = 2 i IN HC1).

Eksempel 2

2- deutero- 3- fluor- D- alanin

Deuterium ble innfort i a-stillingen på D-alanin ved å ut-sette L-alanin for påvirkning av alanin-racemase i <2>H^O, idet der til dette formål ble anvendt et rått enzympreparat fra Staphylo-coccus aureus [E. Ito og J. L. Strominger, J. Biol. Chem. £32) 2689 (1962)] som var blitt uttommende dialysert mot pufret H2O. Efter utvinnelse av det saltfrie alanin fra reaksjonsblandingen ved ionebyttemetoder, ble D-alaninet som var dannet, skilt'fra det opprinnelige L-alanin ved reaksjonsrekken: kjemisk N-acetyler-.ing og spesifikk enzymatisk deacetylering av L-isoraeren med svinenyre-acylase I som beskrevet av J. P. Greenstein og M. Winitz i <n>Chemistry of the Amino Acids", Vol. 3, s. 1831 (Wiley and Sons, New York 1961). 2/ 2H-D-alanin erholdt efter syrehydrolyse av det acylerte residuum var 95$ anriket på <2>H spesielt i 2-stillingen (bestemt ved NMR) og inneholdt mindre enn 1% L-alanin bestemt enzymatisk med L-alanin: oxoglutarat-trans-aminase.

Ved å anvende fremgangsmåten i eksempel 1, men ved å erstatte D-alaninet anvendt der med en ekvivalent mengde 2-deutero-D-alanin, fremstilt som ovenfor, fikk man 2-deutero-3-fluor-D-alanin, smp.

169°C, [a]p° -9,2 (C = 2, i IN HC1). '

Eksempel '-4-

2, 3, 3- trideutero- 3- fluor- D- alanin

2,3,3-trideutero D-alanin ble spaltet fra det kommersielt tilgjengelige perdeutero-alanin-racemat ved kjemisk N-acetylering fulgt av enzymatisk deacetylering av L-enheten som beskrevet i eksempel 2.

Fotofluorering av perdeutero-D-alaninet ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1, gir 2,3,3-trideutero-3-fluor-D-alanin.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av 3-fluor-D-alanin, 2-deutero-3-fluor-D-alanin eller 2,3,3-trideutero-3-fluor-D-alanin, samt salter av disse forbindelser, karakterisert ved at D-alanin eller en av deuteroanalogene 2-deutero-D-alanin, hhv. 2,3}3?3-'tetradeutero-D-alanin, omsettes med et fluoroxy-perfluoralkan med 1-5 carbon-atomer eller fluoroxy-pentafluorsvovel i nærvær av en fri radikalinitiator, og at eventuelt et erholdt alanin overfores til dets salt, hhv. at alaninet frigjores fra et erholdt salt.

2. Fremgangsmåte ifolge krav 1, karakterisert ved at D-alanin omsettes med fluoroxy-trifluormethan i nærvær av ultrafiolett lys.