DK143165B - Fremgangsmaade til fremstilling af 6-aminopenicillansyre ved enzymatisk omsaetning af penicillin med en penicillinamidaseproducerende mikroorganisme - Google Patents

Description

/3?

V Ρ BkJ

(11) FREMLÆGOELSESSKRIFT 1U3165 DANMARK (B1) Int. Cl.3 c 12 ρ 37/06 // C 12 N 11/08 «(21) Ansøgning nr. 1 587/74 (22) Indisvørst døn 22. mar. 1 974 (24) Løbtdtg 22. mar, 1974 (44) Ansøgningen fremlagt og frømtaggeisøsskriftat offentliggjort den 6 · jul. T 9&1

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet bageret fra den

24. mar. 1973# 33769/73* JP

(4l) Altn. tilg. 25· sep. 1974 <71> TANABE SEIYAKU CO. LTD., 21, DoBhomachl 3-ehome, Higashi-ku, Osaka, 7P.

(72) Opfinder: Ichiro Chibata, 13-2, 4-ehome, Pujishirodai, Suita-shi,

Osaka-fu, JP: Tetsuya Tosa, 35-4, Nishi-machi, Tojiin, Klta-ku,

Kyoto-shi, Kyoto-fu, JT: Tadashi Sato, 8-20, Winaml-Matsubara-cho, Takatsuki-shi, Osaka-fu, JP.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Dansk Patent Kontor ApS.

" 11111 1 1" ............. , I") . .1 MllLUU M 1.11.1.1.11' i-ll.L M .1 j| * |l I I

(64) Fremgangsmåde til fremstilling af β-amlnapenlelllansyre ved enzyms* tisk omsætning af penicillin med en penicillinamidase-producerende mikroorganisme.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af 6-aminopenicillansyre (i det følgende forkortet til "6-APA") ved enzymatisk reaktion af en immobillseret penicillinamidase-produ-cerende mikroorganisme med penicillin.

Det er kendt, at 6-APA kan fremstilles ved enzymatisk deacylering af penicillin, d.v.s. ved reaktion af penicillin med penicillinamidase eller en penicillinamidase-producerende mikroorganisme. Denne metode er imidlertid ufordelagtig til produktion i stor skala. 6-APA fremstillet ifølge denne metode er nemlig forurenet med enzymet, mikrobielle celler, næringsmiddelkilder og/eller proteiner. Yderligere trin 2 1 A3165 til fjernelse af enzymet, mikrobielle celler og/eller andre forureningskilder fra produktet er således nødvendige til udvinding af 6-APA i høj renhed. Når den enzymatiske reaktion er tilendebragt, koges og/eller syrnes reaktionsblandingen endvidere for at ødelægge enzymet eller mikroorganismen, og bundfald af enzymet eller mikroorganismen frafiltreres. Penicillinamidasen eller den penicillinamidase-producerende mikroorganisme kan således kun anvendes én gang og må herefter bortkastes.

Alternativt er det kendt, at 6-APA kan fremstilles ved kemisk deacyl-ering af penicillin. F.eks. bringes penicillin til reaktion med tri-- phenylmethylchlorid, hvorved triphenylmethylesteren af penicillin dannes, og denne ester behandles med phosphortrichlorid. Derefter bringes den således opnåede triphenylmethylester af N-imino-chlor-peni-cillin til reaktion med methanol, hvorved der dannes den tilsvarende N-imino-methoxy-penieillinester. Endelig opnås 6-APA ved hydrolysering af N-imino-methoxy-penicillinesteren med vandig ammoniak. Ved den kommercielle produktion af 6-APA er denne kemiske metode imidlertid også ufordelagtig på grund af deri indeholdte langstrakte procestrin og/eller det lave udbytte af 6-APA.

Det er endvidere kendt at fremstille 6-APA ved enzymatisk omsætning af penicillin med en immobiliseret penicillinamidase. Fra US-pa-tentbeskrivelse nr. 3.619.371, GB-patentbeskrivelse nr. 1.193.918 og nr. 1.261.711 er det således kendt at immobilisere penicillinamidase med en polymer bærer som f.eks. carboxymethylamino-chlor-s-triazinylcellulose, bromacetylcellulose og cyanbromid-aktiveret "Sepharose". Den således immobiliserede penicillinamidase anvendes derpå til fremstilling af 6-APA ud fra penicillin. Fra Acta Chem.

Scand. 24 (1970), 2084-2092 er det desuden kendt at fremstille tværbundne enzympræparater under anvendelse af visse acryipoly-mere og -copolymere som matrix.

Det har vist sig, at der kan fremstilles en immobiliseret peni-cillinamidase-producerende mikroorganisme, som ved enzymatisk omsætning med penicillin danner 6-APA i højt udbytte, og som bevarer høj aktivitet over et længere tidsrum.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at 3 143165 man polymeriserer mindst én acryloylmonomer valgt blandt acrylo-ylamid, N,N'-(C^-C4)-alkylen-bis-acryloylamid/ bis(acryloylamido-methyl)ether og N,N'-di-acryloyl-ethylen-urinstof ved en temperatur på 20 til 40°C, fortrinsvis 30 til 37°C, i 10 til 60 minutter, fortrinsvis 30-60 minutter, under atmosfærisk tryk i en vandig suspension af en penicillin-amidase-producerende mikroorganisme under tilstedeværelse af en polymerisationsinitiator og en polymerisationsaccelerator til frembringelse af en immobiliseret, penicillinamidase-producerende mikroorganisme og underkaster denne enzymatisk reaktion med penicillin.

Eksempler på foretrukne penicillinamidase-producerende mikroorganismer, der anvendes ifølge opfindelsen,er Escherichia coli ATCC 9637, Escherichia coli ATGC 11105, Streptomyces griseus IFO (Institute for Fermentation, Osaka, Japan) 3355, Nocardia gardneri ATGC 9604, Micrococcus roseus IFO 3764, Pseudomonas aeruginosa OUT (Faculty of Technology, Osaka University, Japan) 8252 og Alkaligenes faecalis OUT S025. Alle disse mikroorganismer er offentligt tilgængelige på de ovenfor nævnte deponeringssteder. Det skal imidlertid bemærkes, at den foreliggende opfindelse ikke er begrænset til anvendelsen af disse specifikke mikroorganismer, men også omfatter anvendelsen af alle øvrige penicillinamidase-producerende mikroorganismer, såsom sådanne tilhørende slægterne Escherichia, Streptomyces, Nocardia, Alkaligenes, Micrococcus og Pseudomonas. En ved opfindelsen passende anvendt mængde af den penicillinamidase-producerende mikroorganisme er 0,32-3,2 g, især 0,95-1,9 g,pr. g anvendt acryloylmonomer eller -monomere. Polymerisationsreaktionen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen tjener til stramt at fastholde hver enkelt af mikroorganismerne i et gitter af polymeren for derved at yde høj enzymatisk aktivitet over et længere tidsrum.

Polymerisationsreaktionen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen udføres i nærværelse af en polymerisationsinitiator og en polymerisationsaccelerator. Kaliumpersulfat, ammoniumpersulfat, vitamin Bg og methylenblåt er egnede som polymerisationsinitiatorer. p-(Dimethyl-amino)-propionitril og N,N,Nf,NT-tetramethyl-ethylendiamin kan anvendes som polymerisationsacceleratorer. En passende mængde polymerisationsinitiator sat til den vandige suspension af den penicillinamidase-producerende mikroorganisme er 5-50 mg pr. g acryloylmonomer eller -monomere. En passende mængde tilsat polymerisationsaccelerator er , U3165 4 1,5-15 mg pr. g acryloylmonomer eller -monomere. Reaktionen fuldføres indenfor fra 10 til 60 minutter. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det hensigtsmæssigt at fastholde den penicillinamidase-producerende mikroorganisme ved hjælp af en polymer, opnået ud fra en eller to af de ovenfor nævnte monomere, særlig ved hjælp af en copolymer af acryloylamid og N,N' - C^-c4)-alkylen-bis~acryloylamid, bis(acryloyl-amidomethyl)ether eller Ν,Ν'-di-acryloyl-ethylenurin-stof. Som N,Ν'-alkylen-bis-acryloylamid anvendes fortrinsvis N,N'-methylen-bis acryloylamid og Ν,Ν'-propylen-bis-acryloylamid. En passende mængde af N,N'-alkylen-bis-acryloylamid, bis(acryloylamid-methyl)ether eller N,N'-di-acryloyl-ethylenurinstof anvendt til copolymerisation anvendt til copolymerisation med acryloylamid er 5- 160 mg, især 15-130 mg, specielt 25-80 mg, pr. g acryloylamid.

Efter at polymerisationsreaktionen er fuldført som ovenfor, granuleres det opnåede immobiliserede penieillinamidase-producerende mikroorganismepræparat, idet det presses gennem en sigte til dannelse af partikler med 2,5-5,5 mm, især 3-4 mm,diameter.

6- APA fremstilles ved enzymatisk reaktion af det immobiliserede peni-cillinamidase-producerende mikroorganismepræparat med penicillin. Den enzymatiske reaktion udføres ved 25-50°C, især ved 30-45°G. Det er foretrukket at udføre reaktionen ved en pH-værdi på mellem 7 og 9,5, især mellem δ og 9. Ethvert kendt penicillin kan anvendes som substrat ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. Repræsentative eksempler på sådanne penicilliner har formlen /\ R-CONH-CH·-OH C (OH,)« I I i 3

CH-N-CH-C00H

hvori R er en alkyl-, alkenyl- eller aryl-alkylgruppe eller en gruppe med formlen R^-X-CHg-, hvori er en alkyl-, alkenyl- eller aryl-

gruppe, og X er oxygen eller svovl. Nærmere betegnet er de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendte, kendte penicilliner f.eks. penicillin G(= benzylpenicillin), penicillin K(= n-heptylpenicillin), penicillin X(= p-hydroxy-benzylpenicillin), penicillin F( = 2-pentenyl-penicillin), dihydropenicillin F(= n-amyl-penicillin), penicillin AT

143165 (= allylmercaptomethylpenicillin), penicillin BT(= butylthiomethylpenicillin) , penicillin S(= ^-chlorcrotylmercaptomethylpenicillin) og penicillin V(= phenoxymethyl-penicillin).

Mængden af substrat opløst i en vandig suspension af den penicillin-amidase-producerende mikroorganisme er ikke kritisk ved den omhandlende fremgangsmåde; f.eks. kan penicillin være opløst i vand i enhver koncentration. Når det ovennævnte immobiliserede mikr o o rg ani sme præparat er suspenderet i en vandig penicillinopløsning, omrøres opløsningen. Efter at reaktionen er fuldført filtreres eller centrifugeres blandingen til udvinding af det immobiliserede mikroorganismepræparat til efterfølgende anvendelse. 6-APA vindes af filtratet eller den foroven stående opløsning.Den optimale betingelse for fuldstændig omdannelse af penicillin til 6-APA kan let bestemmes ved at regulere reaktionstiden. Alternativt kan den omhandlede enzymatiske reaktion udføres efter en søjlemetode. Søjlemetoden gør det muligt at udføre reaktionen successivt. F.eks. kommes det immobiliserede mikroorganismepræparat i en søjle, og en vandig penicillinopløsning føres gennem søjlen med en passende gennemstrømningshastighed. Som udløbsvæske opnås en vandig opløsning indeholdende 6-APA. 6-APA udvindes efter en i og for sig kendt metode, f.eks. ved indstilling af udløbsvæskens pH-værdi til 4-5· Ved udførelsen af den enzymatiske reaktion afhænger omdannelseshastigheden af penicillin til 6-APA hovedsagelig af den enzymatiske styrke af det immobiliserede mikroorganismepræparat, af temperaturen og af reaktionstiden. I tilfældet søjlemetode kan den optimale reaktionsbetingelse for fuldstændig omdannelse af penicillin til 6-APA imidlertid let opnås ved regulering af substratopløsningens gennemstrømningshastighed.

I hvert tilfælde bibeholder det omhandlede immobiliserede mikroorganismepræparat et højt enzymatisk aktivitetsniveau under reaktionen. På grund af det omhandlede immobiliserede mikroorganismepræparats tilstrækkeligt vedvarende enzymatiske aktivitet kan mikroorganismepræparatet desuden anvendes gentagne gange til den enzymatiske reaktion. Praktisk udførlige og foretrukne udførelsesformer af den foreliggende opfindelse illustreres med de følgende eksempler. I disse udtrykkes penicillinamidaseaktiviteten af en mikroorganisme eller et ixnmobi-liseret mikroorganismepræparat i ^enheder", hvor en "enhed" er defineret som den.aktivitet af en mikroorganisme eller et immobi-liseret mikroorganismepræparat, ved hvilken der hydrolyseres 1 mg 143165 6 penicillin G ved reaktion af en vandig suspension af mikroorganismen eller mikroorganismepræparatet med penicillinet ved pH 9,0 og 40°C i en time. Mængden af 6-APA i en opløsning bestemmes endvidere ifølge metoden beskrevet i "Industrial and Engineering Chemistry", 18, side 619, (1946), og "Analytical Chemistry", 33, side 648, (1961); dvs. en 6-APA-opløsning indstilles til pH-værdi 2,0 ved hjælp af 2 N saltsyre og vaskes med methylisobutylketon til fjernelse af penicillin og andre forureningskilder. Mængden af 6-APA i det således opnåede vandige lag bestemmes først kolorimetrisk ifølge iod-absorptionsmetoden. Derefter behandles det vandige lag yderligere med phenylacetylchlorid for at omdanne 6-APA til penicillin G.

Mængden af 6-APA i denne vandige opløsning beregnes igen på basis af dens antimikrobielle aktivitet ifølge filtrerpapirmetoden.

Sammenligningseksempel

Der anvendtes de i US-PS 3.619.371, eksempel 1, GB-PS 1.193.918, eksempel 1, og GB-PS 1.261.711, eksempel 12, angivne metoder til immobilisering af penicillinamidase. Til sammenligning med den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen immobiliserede mikroorganisme fremstilledes desuden en immobiliseret penicillinamidase efter den i Acta Chem. Scand. 2£ (1970), 2084-2092, beskrevne metode, der har den største lighed med den omhandlede fremgangsmåde med hensyn til immobiliseringsprincip eller -mekanisme. I disse sammenligningsforsøg anvendtes Escherichia coli ATCC 9637 som et. eksempel på en penicillinamidase-producerende mikroorganisme.

(A) Dyrkning af en penicillinamidase-producerende mikro organisme:

Escherichia coli ATCC 9637 inokuleredes i 1 1 af et næringsmedium (pH 750), som indeholdt pepton (2 vægt/ vol.%), monokaliumphosphat (0,3 vægt /vol. %), dika-liumphosphat (0,7 vægt/vol.%), gærekstrakt (0,5 vægt/ vol.%), magnesiumsulfat 7 hydrat (0,02 væg/vol.%), ferrichlorid (0,02 vægt/vol.%), natrium-l-glut.amat (0,5 vægt/vol.%) og phenosyeddikesyre (0,2 vægt/vol.%).

Mediet dyrkedes ved 30°C i 24 timer under omrystning.

Efter dyrkning samledes de mikrobielle celler ved centrifugering. 12 g intakte mikrobielle celler (i våd form) af Escherichia coli ATCC 9637 opnåedes.

7 143165 (B) Adskillelse af penicillinamidase fra de intakte mikro-Melle celler: 12 g af de intakte mikrobielle celler (i våd form), der opnåedes i (A), suspenderedes i 24 ml af en 0,01 M phosphatpufferopløsning (pH 7?0)· Suspensionen behandledes ved 4°C i 15 minutter med en 9 kHz oscillator (Insonator 200M, Kubota Seisakusho Co., Ltd., Japan), og centrifugeredes derefter ved 20.000 x g i 15 minut-ter til fjernelse af cellerester. Superaatanten mættedes 30% med ammoniumsulfat. Bundfaldet fjernedes ved centrifugering ved 20.000 x g i 15 minutter. Supernatanten mættedes derefter 65% med ammoniumsulfat og centrifugeredes ved 20.000 x g i 15 minutter.

Let således opsamlede bundfald opløstes i 20 ml vand og dialyseredes med vand ved 4°C i 16 timer. Der opnåedes 24 ml af en enzymopløsning af Escherichia coli ATCC 9637· Penicillinamidaseaktivitet: 11,4 enheder/ml. Proteinindhold: 51 mg/ml.

(C) Immobilisering af penicillinamidase ifølge eksempel 1 US. Patentskrift nr. 3619371·* (a) 7»2 g natriumhydrogencarbonat opløstes i en blanding af 60 ml IN glycerinopløsning, 50 ml destilleret vand og 50 ml acetone. Der tilsattes en opløsning af 354 g cyanursyrechlorid i 100 ml acetone, og blandingen omrørtes kraftigt i 1 minut. Efter endt reaktion sænkedes blandingens pH til 2,5 ved tilsætning af fortyndet saltsyre, og det udviklede carbondioxid udblæstes med en nitrogenstrøm. Blandingen inddampedes derefter ved 35° C under reduceret tryk til fjernelse af opløsningsmidlet. Det krystallinske bundfald opsamledes ved filtrering, vaskedes med destilleret vand og tørredes. Bundfaldet omkrystalliseredes ved opløsning i en 50 v/v-% vand-acetoneblanding og fjernelse af acetonet derfra ved 35°C. 2,8 g af det således opnåede 2,4-dichlor-6-carboxymethylamino-s-triazin sattes til 5 ml destilleret vand, og blandingen indstilledes til pH 6 med4N natriumhydroxidopløsning.

143165 8

Ved dette pH opløstes s-triazinforbindelsen fuldstændigt. Efter forøgelse af opløsningens totale volumen til 10 ml ved tilsætning af destilleret vand, tilsattes 2 g cellulosepulver. Blandingens pH forøgedes til 11 og holdtes på denne værdi ved dråhevis tilsætning af en 411 natriumhydroxidopløsning. Omsætningen udførtes i et vandbad ved 25°C. Blandingen pipetteredes i 20 ml af en 20 v/v-% eddikesyreopløsning, filtreredes og vaskedes med deioniseret vand, indtil filtratet var chloridfrit. Blandingen omrørtes derefter i 16 timer i 10 ml destilleret vand, og det krystallinske bundfald opsamledes ved filtrering. 4,2 g carb-oxymethylamino-chlor-s-triazinyl-cellulose (i våd form) opnåedes.

(b) 2 ml af den i (B) opnåede enzymopløsning sattes til 20 ml af en 0,01 M phosphatpufferopløsning (pH 8,0), og der tilsattes 2 g carboxymethylamino-chlor-s-tciazinyl-cellulose (i våd form). Blandingen omrørtes ved 4° C i 24 timer. Efter endt omsætning opsamledes bundfaldet ved filtrering og vaskedes derefter med en 0,5 M natriumchlorid-0,01 j·! phosphatpufferopløsning (pH 8,0) og med vand. Der opnåedes 10 ml af et immohiliseret enzympræparat.

(D) Immobilisering af penicillinamidase ifølge eksempel 1 i britisk patentskrift 1195918: 5 ml af den i (B) opnåede enzymopløsning sattes til 5 ml bromacetylcellulose, og blandingen indstilledes derefter til pH 8,5 med natriumhydroxidopløsning.

Blandingen omrørtes derefter ved 4°C i 12 timer.

Efter endt reaktion opsamledes bundfaldet ved centrifugering og vaskedes med en fysiologisk saltopløsning og med en vandig 0,01 M boratpufferopløsning (pH 8,0).

Der opnåedes 5 ml af en immobiliseret enzymopløsning.

(E) Immobilisering af penicillinamidase ifølge eksempel 12 i britisk patentskrift nr. 1261711: 5 ml af den i (B) opnåede enzymopløsning sattes til 10 ml cyanbromid-aktiveret "Sepharose 4B", og bian- 9 143165 dingen indstilledes til pH 7,0 med eddikesyre.

Blandingen omrørtes derefter ved 4°C i 24 timer. Efter endt reaktion opsamledes bundfaldet ved filtrering og vaskedes med destilleret vand og med en vandig 0,01 M boratpufferopløsning (pH 8,0). Der opnåedes 10 ml af et immobiliseret enzymprseparat.

(F) Immobilisering af penicillinamidase ifølge Acta

Chem. Scand. 24 (1970). 2084 - 2092; 6 ml af den i (B) opnåede enzymopløsning sattes til 6 ml af en fysiologisk saltopløsning. 2,25 g acryl-amid, 120 mg Ν,Ν'-methylen-bis (acrylamid), 1,5 ml 5% p-(dimethylamino)-propionitril og 1,5 ml 2,5% kalium-persulfat sattes til opløsningen. Blandingen henstilledes derefter ved 37°C i 40 minutter. Der opnåedes 30 ml af et immobiliseret enzymprseparat, ^ Immobilisering af en penicillinamidase-producerende mikro- organismeved frengangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse: 12 g af de i (A) opnåede intakte mikrobielle celler suspenderedes i 48 ml af en fysiologisk saltopløsning.

9 g acrylamid, 480 mg N,Ν'-methylen-bis-(acrylamid), 6 ml 5% p-(dimethylamino)-propionitril og 6 ml 2,5% kaliumpersulfat sattes til suspensionen. Suspensionen henstilledes derefter ved 37°C i 50 minutter. Efter e endt reaktion filtreredes suspensionen. Den opnåede stive gel granuleredes i partikler på 2 - 3 mm's diameter. Der opnåedes 120 ml af en immobiliseret mikroorganisme.

(H) Stabilitet af penicillinamidaseaktiviteten:

Det immobiliserede enzympræparat eller den immobili-serede mikroorganisme, der opnåedes i et af afsnittene (D) til (G), pakkedes i en søjle (den mængde, der pakkes i søjlen, er vist i tabel 2). En mandig 0,01 Mpuffer-opløsning (pH 8,0) indeholdende 50 mM benzylpenicil-lin sendtes gennem søjlen med en hastighed på 3 ml/time. Mængden af den producerede 6-aminopenicillansyre i elu-atet prøvedes med mellemrum ved metoden ifølge 143166 ίο J. Bomstein et al, [Analytical Chemistry (1965)» p. 576], og penicillinamidaseaktiviteten af det immobiliserede enzymprseparat eller den immobiliserede mikroorganisme beregnedes deraf.

Be sul tat erne er vist i de følgende tabeller 1 og 2. Tabel 1 viser penicillinamidaseaktiviteten af de immobiliserede enzympræparater og de immobiliserede mikroorganismer, der opnåedes i (C) til (G). På den anden side viser tabel 2 stabiliteten af penicillinamidaseaktiviteten beregnet ifølge den i (H) beskrevne metode. I tabel 1 og 2 er hver af de i (A) og (C) til (G) opnåede prøver angivet ved de følgende prøvenumre:

Prøve nr.

Nr. 1: De intakte mikrobielle celler, der opnåedes i (A).

Nr·. 2: Det immobiliserede enzymprseparat, der opnåedes i (C).

Nr. 3: Det immobiliserede enzymprsgparat, der opnåedes i (D).

Nr. 4: Det immobiliserede enzymprseparat, der opnåedes i (E).

Nr. 5: Det immobiliserede enzymprseparat, der opnåedes i (F).

Nr. 6: Den immobiliserede mikroorganisme, der opnåedes i (G).

143166 11

Tabel 1

Penicillinamidaseaktivitet af de immobiliserede enzympræparater og af den immobi l i senede mikroorganisme.

4)

Prøve nr._Penicillinamidaseaktivitet Aktivitetsudbytte (Intakte mikrobielle celler)

Nr. 1 14,2 enheder ^ 100% (Enzympræparat immobiliseret ifølge US patentskrift nr, 3619371)

Nr. 2 0,4 enheder 2,8% (Enzympræparat immobiliseret ifølge britisk patentskrift nr. 1193918)

Nr. 3 0,7 enheder 2^ 4,9$ (Enzympræparat immobiliseret ifølge britisk patentskrift nr. 1261711)

Nr. 4 1,8 enheder'12,7$ (Enzympræparat immobiliseret ifølge Acta Chem. Scand.)

Nr. 5 9,1 enheder2"1 64,1% (Immobiliseret mikroorganisme , fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse)

Nr. 6 12,5 enheder^ 88,0%

Note 1: Penicillinamidaseaktivitet af 1 g af de intakte mikrobielle celler.

Note 2: Penicillinamidaseaktivitet af det immobiliserede enzympræparat, der opnåedes af 1 g af de intakte mikrobielle celler.

Note 3: Penicillinamodaseaktivitet af den immobiliserede mikroorganisme, der opnåedes af 1 g af de intakte mikrobielle celler.

Note 4: Aktivitetsudbyttet beregnedes efter den følgende formel: 143165 12

Penicillinamidaseaktivitet af det immobiliserede enzym1 præparat eller den i τητηοΜΙίserede mikroorganisme der

opnåedes af 1 s af de intakte mikrobielle celler_ xlOO

Penicillinamidaseaktivitet af 1 g af de intakte mikrobielle celler 13 143165

LfN I

Cl) I

rrj J_3 I CQ CO

•Η Φ £ « g> jj jj ί> b β

CQ Ή Η -H O

bO > £0 g O

β -H CD (Τ' CO ΙΑ (D P g fj •H ft bO ^ . n S -¾ ?H rM cO n Ij cd co b o i-h a

> H

H β •'•H cl) CO O 'η O b tu ft « -H g

β R R

bO ω ω

™ CD R rH

s-\ "T; ^a O ·Η

^a LA Ά H -H > P

O - Ί2 l> - P O

CN - CO w R - CO CO 0 -LA - rH Ti (Τ' l>- CD - 0

VD O W O w i Q, H w +? ¥-H

H ^a ^a o -g J} CO H 0 Stifi

.—I f—1 .. /Ά CQ <D

O' CN $ Ca ft β b LA H ^ H - ® jH r

O' (0 5 - o b R

H 0¾ S, O CO - CD

ft r g]H| Hl 1 g Aj w Al 0 H .

“ φ . . ij H CQ <D CD

•Th-S r r ^a ^ ω-ρ £ Φ R -ά 3 la ^a g ^ P S-P 3)

Η Ρ (Τ' - OOh^-CT'COCDCO-P

_p p ·Ρ (\l - -P C\J O LA- (H*'·' ^‘H

ΜΦ l·) r CVJ ίΛ *τ-\ ^ O I—I cd CO p

cd OJ ·ΗΗ4··Η OJw/^Ov-/ - cm 00 -H ?H Pr H

(D - H R A^ R · S ^ S ω

SS B ‘S s “ g S S, σ, °. S “SS

a > ®iA(Oi ®u\co taco - i? ~ oo

cO-Η ft - LA ft - R- •'CD <3 ι-t (O fH φ R H

Cj ft 00 CO rH '—' CO LA ^ (Ί ^ CD b CD CD

.η w Ph ft a li cdtd

H®b0 CD ^ R R CD R

_l CD CO Cd -¾ p ^A ,. ^ CD bDb h) b ra b m w O C0 CQ -H -ri · Jj O - R β g

ri b 60 ft ft ci C\|IA 1 - CO

OJ β -H El ·Η ή -P *Ή j J (Τ' β P CQ

ω a CQ (Ο β I β I o B ^ w CD

Η P g R P P < ra mmp® βτ Cj O r- CD (D *rl _

o ft ·Η ft ω ^a CD 'Ά CD -Ά H ^a P-PjOjR

CO CO Η ω 4-ω AJ 60 LA g Al Η ω o 6

PH Η H -H · H O' - iu ' ^PØcA

JJJ.H tSt O rH ta IN- LA tS -IN 4-1 r LA -H -H a

φ O ft — [A. ft - (D ft AJ p· LA (Τ' ft |> ·Η H

jo -P A ·Η OJ a^· -H Jt a^ ·Η Hv W ^ ft Ή Ή

,ρβ CD C0-P-P-P

Η Φ ft ft P Θ

>rj Q. CD /-A CD s n (D ^A ra /-N CQ CO Ό) P

η β LA β Ca β LA ·Η ^ CD -CD -®C\i- CicO - β βββ 4J CQ A (Τ' CQ Η β" CQ *-(\] £0 - 00 -Η O β Η CG ·Η - 00 p - CO -rH la (Τ' 60 .3-; (Τ' 0 Ρ . « OJ HOJw HC£)w Η OJn-/ β CM ^ CO β ft

•Η ·Η ·Η Ο β β CD

η A Ρ Ο ·γΙ CD Ρ β Ο Ο Ο β ι—I τβ CD C0 a r"A a ^a a *—n ^a i—ihh i> a o a o a ho ή o' ο ·ηρ·η

•HCJDO -HOJO ·Η -O a -O OCQ|>(D

-Η -H CaH β" Η Ή 60·Η 0

Η -PAI'-' -PCNa^ -ρ OJw -ρ OJ w β β -Ρ CQ

CO CO CO ^α CD ^Α (D ·Η Sc| ·Η ^ ^Αβ ^Αβ ββ βΡπβΦβ

C0 β C0 β® (DCD CD

t<D ft CD ft •b CQ b

b ® b fe CD ·Η CD

CD β II CD β II Ρ Η P

βφ^Α. ft II P ft Pft R H 11 SiTi b β a Ή a <~Hpa i-hcdp cd la

CD bO CD h CAH Φ h ct a ® h CA a O^DH

>βΗ tQØN N rH g 0 (T CD

Stm’iD β · 00 β · VQ Al β · Ο ' Η · ' Ρ β ρ ta Η βοο - W βΗ *·Η βΚΛΑ- Η βορ- ο ftw CQ w Sa^OJ W έ5Α-βΝ1 a-' SwAJ W s AJ Al 3 143165 14 φ 'ti ti φ

bD

Η 5 'Η φ Ο

Ο 1—I

6 W

φ Μ Ρ Ή 'ti Φ ·Η -Ρ Ρ φ Φ ti ti 6D ί> Φ ·Η ti &ρ Φ ti ,Ω 05

ρ OJ &D

φ C0 Ρ Η 'ti ri Φ ϊ> Ρ •Η ® Η Ρ Ρ Μ Φ 05 -ri Ρ Φ

Φ ti &Q

,k| Φ ti 01 nti Φ •H ti Ρ ti Ο 05 Φ Ρ £{ "Ρ ρΐ <Ρ =05 Ν Φ ft ti Φ Ρ Ρ Φ Φ Φ ti ti

ί> &D &D

•Η Φ Φ Ρ ti ti 05 Φ Φ Η Ρ Ρ Φ ti Ρ Ρ Φ Φ ti Ρ Ρ Φ ·Η Ή nti ί> ί> •Η ·Η ti Ρ Ρ Ο Μ <Ρ 05 05 Φ Φ ρ mm ofl5 05 05 ρ nti nti CQ ·Η ·Η d d CQ 05 05 φ ti ti ·* ρ Ή ·Η ρ ti Η Η

05 Φ i—I i—I

CQ ti ·Η Ή Ρ 05 Ο Ο ti Pc ·Η ·Η Ο ti ti <Ρ ·Η Φ Φ Ρη Ρη oj φ ·· ti Η Η Φ Φ φ Η d Ρ Η ti 05 05 Ο Ρ &Ι 'Η 15 143165

Det fremgår af tabel 1, at det ved fremgangsmåden ifølge US-PS 3.619.371, GB-PS 1.193.918 og 1.261.711 immobiliserede enzym havde en tydeligt lavere penicillinamidaseaktivitet end den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen immobiliserede mikroorganisme. Udbyttet af penicillinamidaseaktivitet (dvs. det angivne "aktivitetsudbytte") var i det ifølge disse patentskrifter immobiliserede enzympræparat kun ca. 3 - 13%, medens den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen immobiliserede mikroorganisme bibeholdt 88% af de intakte E. coli ATCC 9637-cellers penicillinamidaseaktivitet .

Det fremgår endvidere af tabel 1, at det ved fremgangsmåden ifølge Acta Chem. Scand. 24 (1970), 2084-2092, immobiliserede enzym har en relativt høj penicillinamidaseaktivitet. F.eks. var udbyttet af penicillinamidaseaktivitet (dvs. "aktivitetsudbyttet") i det ved denne fremgangsmåde immobiliserede enzym ca. 64%. Imidlertid formindskes det immobiliserede enzyms penicillinamidaseaktivitet hurtigt, idet halveringstiden for dets penicillinamidaseaktivitet kun var ca. 5 dage. F.eks. viser tabel 2, at penicillinamidaseaktiviteten af dette immobiliserede enzym formindskedes til 50% af begyndelsesaktiviteten, når det underkastedes kontinuert enzymatisk reaktion med benzylpenicillin i 5 dage. I modsætning hertil bibeholdt den ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen immobiliserede mikroorganisme ca. 79% af sin begyndelsesaktivitet, selv efter kontinuert enzymatisk reaktion i 16 dage. Endvidere var halveringstiden for den omhandlede immobiliserede mikroorganismes penicillinamidaseaktivitet 36 dage og dermed ca. 7 gange længere end den for aktiviteten af det ifølge Acta Chem. Scand. immobiliserede enzym.

Eksempel 1 1) Der fremstilles et vandigt næringsmedium (pH 7,0) indeholdende følgende bestanddele: 16 143165 Vægt/volumen-^

Pepton 2,0

Kaliumhydrogenphosphat 0,3

Kaliumdihydrogenphosphat 0,7 Gærekstrakt 0,5

Magnesiumsulfat * 7^0 0,02

Ferrichlorid · 6H20 0,02

Natrium-L-glutamat 0,5

Phenoxyeddikesyre 0,2

Escherichia coli ATCC 9637 indpodes i en liter af mediet. Mediet dyrkes ved 30°C i 24 timer under omrystning. Derefter centrifugeres mediet. De således samlede mikrobielle celler udviser en penicillinamid-ase-aktivitet på 6,5 enheder/g. 12 g af de mikrobielle celler suspenderes i 46 ml af en fysiologisk saltopløsning. Til suspensionen sættes 9 g acryloylamid, 4&0 mg N,Mf-methylen-bis-acryloylamid, 6 ml 5%'s β-(dimethylamino)-propionitril og 6 ml 2,5$Ts kaliumpersulfat. Derefter henstår suspensionen ved 37°G i 30 minutter. Efter at reaktionen er fuldført, filtreres suspensionen. Den opnåede stive gel granuleres, idet den presses gennem en sigte til dannelse af partikler med 3 mm diameter. Der opnås 120 ml af et immobiliseret præparat af Escherichia coli ATCC 9637. Penicillinamidaseaktiviteten er 4,7 enheder/ml. 1 120 ml af det immobiliserede præparat af Escherichia coli ATCC 9637 kommes i en 2,1 cm x 34,6 cm søjle. 500 ml af en vandig 1%'s kaliumpenicillin G-opløsning (pH 9,0) føres gennem søjlen ved 40°C med en gennemstrømningshastighed på 16 ml/h. Den således opnåede udløbsvæske indstilles til pH-værdi 2,0 ved hjælp af 2 N saltsyre og vaskes to gange med 10 ml methylisobutylketon for at fjerne phenyleddikesyren.

Det vandige lag indstilles til pH 7,0 ved hjælp af 2 N natriumhydroxidopløsning. Derefter inddampes det vandige lag under formindsket tryk ved 50°C, indtil det samlede volumen er 5 ml. Efter indstilling til pH 4,3 ved hjælp af 2 N saltsyre henstår den inddampede opløsning i 16 timer ved 27°C. Det krystallinske bundfald samles ved filtrering og tørres ved 50°C under formindsket tryk. Der opnås 2,23 g 6-APA; udbytte 85%; smp. 204-207°C (sønderdeling).

17 143165

Eksempel 2.

Et immobiliseret præparat af Escherichia coli ATCC 9637 fremstilles på samme måde som beskrevet i eksempel 1, 1). 120 ml af det immobilisere-de præparat kommes i en 2,1 cm x 34,δ cm søjle. En vandig 1%’s opløsning (pH 9,0) af kalium-penicillin G føres gennem søjlen ved 40°C med den i tabel 1 viste gennemstrømningshastighed. Den procentuelle omdannelse af penicillin G til 6-APA, som den findes i udløbsvæsken,er vist i tabel 1.

Tabel 1.

Gennemstrømningshastighed Omdannelse til 6-APA (%) (ml/h) 10 90,6 15 90,2 30 74,2 60 56,1 72 42,2 110 34,4

Eksempel 3.

1) Escherichia coli ATCC 11105 indpodes i en liter af et vandigt næringsmedium (pH 7,0) indeholdende de samme bestanddele som beskrevet i eksempel 1, 1). Mediet dyrkes ved 30°C i 24 timer under omrystning. Derefter centrifugeres mediet. De således samlede mikrobielle celler udviser en penicillinamidaseaktivitet på 6,9 enheder/g.

12 g af de mikrobielle celler suspenderes i 46 ml af en fysiologisk saltopløsning. Til suspensionen sættes 9 g acryloylamid, 460 mg N,Nf-methylen-bis-acryloylamid, 6 ml 5$fs β-(dimethylamino)-propionitril og 6 ml 2,5$,skaliumpersulfat.Derefter henstår suspensionen ved 37°C i 30 minutter. Den opnåede stive gel granuleres, idet den presses gennem en sigte til dannelse af partikler med 3 mm diameter. Der opnås 120 ml af et immobiliseret præparat af Escherichia coli ATCC 11105. Penicillinamidaseaktiviteten er 5 enheder/ml.

18 143165 2} 10 g penicillin Y suspenderes i 450 ml vand, og suspensionen indstilles til pH 9)0 ved hjælp af 2 N natriumhydroxidopløsning, således at penicillin V opløses. Til den fremstillede vandige penicillin Y-opløsning sættes vand, indtil et totalvolumen på 500 ml. Derefter suspenderes 120 ml af det immobiliserede præparat af Escherichia coli ATCC 11105 i den vandige penicillin V-opløsning. Den således opnåede suspension omrøres i et vist tidsrum ved 40°C. Den procentuelle omdannelse af penicillin V til 6-APA i suspensionen er vist i tabel 2.

Tabel 2.

Reaktionstid Omdannelse til 6-APA {%) (timer) 2 12 4 26 6 42 10 89 24 92 30 91

Efter at penicillin Y-suspensionen er omrørt i 30 timer som beskrevet ovenfor, filtreres den til fjernelse af uopløseligt materiale. Det således opnåed'e filtrat behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 1, 2), Der opnås 5,27 g 6-APA; smp. 204-207°0 (sønderdeling).

Eksempel 4.

1) Escherichia coli ATCC 11105 indpodes i en liter af et vandigt næringsmedium (pH 7,0) indeholdende de samme bestanddele som beskrevet i eksempel 1, 1). Mediet dyrkes ved 30°C i 24 timer under omrystning. Derefter centrifugeres mediet. De således samlede mikrobielle celler udviser en penicillinamidaseaktivitet på 6,9 enheder/g.

12 g af de mikrobielle celler suspenderes i 48 ml af en fysiologisk saltopløsning. Til suspensionen sættes 9 g acryloylamid, 480 mg bis-(acryloylamidmethyl) ether, 6 ml 5$f s β-(dimethylamino)-propionitril og 6 ml 2,5$Ts ammoniumpersulfat. Derefter henstår suspensionen ved 37°C i en time. Den opnåede stive gel granuleres, idet den presses

19 U316B

gennem en sigte til dannelse af partikler med 3 mm diameter. Der opnås 120 ml af et immobiliseret præparat af Escherichia coli ATCC 11105. Penicillinamidaseaktiviteten er 5 enheder/ml.

2) 120 ml af det immobiliserede præparat af Escherichia coli ATCC 11105 kommes i en 2,1 cm x 34,0 cm søjle. En vandig 2%'s opløsning (pH 9,0) af penicillin G føres kontinuerligt gennem søjlen ved 40°C med en gennemstrømningshastighed som vist i tabel 3. Den procentuelle omdannelse af penicillin G til 6-APA, som den foreligger i udløbsvæ-sken, bestemmes med 24 timers intervaller. Resultaterne er vist i tabel 3.

Tabel 3.

Omdannelse til 6-APA (%)

Behandlingstid Gennemstrømningshastighed (h) 30 ml/h 15 ml/h 24 52 92 48 51 92 72 52 90 96 49 92 120 50 91 144 53 S9 168 51 90

Eksempel 5» 1) Der fremstilles et vandigt næringsmedium (pH 7,0) indeholdende følgende bestanddele: vægt/volumen-^

Glucose 3,0

Majsstøbevæske 2,5 Gærekstrakt 0,5

Natriumchlorid 0,5

Calciumcarbonat 0,2

Phenoxyeddikesyre 0,2 20 143165

Streptomyces griseus IFO 3355 indpodes i en liter af mediet. Mediet dyrkes ved 30°C i 48 timer. Derefter centrifugeres mediet. De således samlede mikrobielle celler udviser en penicillinamidaseaktivitet på 3,6 enheder/g. 24 g af de mikrobielle celler suspenderes i 96 ml af en fysiologisk saltopløsning. Til suspensionen sættes 1# g acryloylamid, 960 mg N, Nr-methylen-bis-acryloylamid, 12 ml 5$rs β-(dimethylamino)-propionitril og 12 ml 2,5$Ts kaliumpersulfat. Derefter henstår suspensionen ved 37°C i 30 minutter. Den opnåede stive gel granuleres, idet den presses gennem en sigte til dannelse af partikler med 3 mm diameter. Der opnås 240 ml af et immobiliseret præparat af Streptomyces griseus IFO 3355· Penicillinamidaseaktiviteten er 0,5 enheder/ml.

2) Til 500 ml af en vandig 2%'s opløsning (pH 9,0) af penicillin Y sættes 240 ml af det immobiliserede præparat af Streptomyces griseus IFO 3355· Blandingen omrøres i 30 timer ved 40°C. Derefter filtreres reaktionsblandingen, og det således opnåede filtrat behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 1, 2)· Der opnås 5,11 g 6-APAj smp. 204-207°C (sønderdeling).

Eksempel 6.

1) Nocardia gardneri ATCC 9604 indpodes i en liter af et vandigt næringsmedium (pH 7,0) indeholdende de samme bestanddele som beskrevet i eksempel 5, 1). Mediet dyrkes ved 30°C i 72 timer under omrystning. Derefter centrifugeres mediet. De således samlede mikrobielle celler udviser en penicillinamidaseaktivitet på 3,6 enheder/g.

24 g af de mikrobielle celler behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 5, 1). Der opnås 240 ml af et immobiliseret præparat af Nocardia gardneri ATCC 9604. Penicillinamidaseaktiviteten er 0,5 enheder/ml. 1

Til 500 ml af en vandig 2$fs opløsning (pH 9,0) af penicillin G sættes 240 ml af det immobiliserede præparat af Nocardia gardneri ATCC 9604. Blandingen omrøres i 30 timer ved 40°C. Derefter filtreres reaktionsblandingen, og det således opnåede filtrat behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 1, 2). Der opnås 5,26 g 6-APA; smp.

204-207°C (sønderdeling).

21 143165

Eksempel 7.

1) 24 g af de mikrobielle celler af Escherichia coli ATCC 11105 suspenderes i 96 ml af en fysiologisk saltopløsning. Til suspensionen sættes 18 g acryloylamid, 960 mg Ν,Ν’-di-acryloylethylenurinstof, 12 ml 5fo*s ø-(dimethylamino)-propionitril og 12 ml 2,5$rs ammoniumpersulfat. Derefter henstår suspensionen i 30 minutter ved 37°C. Den opnåede stive gel granuleres, idet den presses gennem en sigte til dannelse af partikler med 3 mm diameter. Der opnås 240 ml af et immobiliseret præparat af Escherichia coli ATCC 11105. Penicillinamidaseaktiviteten er 0,5 enheder/ml.

2) Til 500 ml af en vandig 2$’s opløsning (pH 9,0) af penicillin V sættes 240 ml af det immobiliserede præparat af Escherichia coli ATCC 11105. Blandingen omrøres i 30 timer ved 40°C. Derefter filtreres reaktionsblandingen, og det således opnåede filtrat behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 1, 2). Der opnås 5,11 S 6-APA; smp. 204-207°C (sønderdeling).

Eksempel 8.

1) 24 g af de mikrobielle celler af Escherichia coli ATCC 11105 suspenderes i 24Ο ml af en fysiologisk saltopløsning. Til suspensionen sættes 600 mg bis(acrylamidomethyl)ether, 18 ml 0,112$’s Ν,Ν,Ν’,Ν*-tetramethylen-diamin og 2 ml 2,5$’s ammoniumpersulfat. Derefter henstår suspensionen i 60 minutter ved 37°C. Den opnåede stive gel granuleres, idet den presses gennem en sigte til dannelse af partikler med 3 mm diameter. Der opnås 420 ml af et immobiliseret præparat af Escherichia coli ATCC 11105. Penicillinamidaseaktiviteten er 0,3 enheder/ml. 1

Til 500 ml af en vandig 2$’s opløsning (pH 9,0) af penicillin G sættes 420 ml af det immobiliserede præparat af Escherichia coli ATCC IIIO5. Blandingen omrøres i 30 timer ved 40°C, Derefter filtreres reaktionsblandingen, og det således opnåede filtrat behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 1, 2). Der opnås 5,26 g 6-APA; smp. 204-207°C (sønderdeling).

22 143165

Eksempel 9.

1) 24 g af de mikrobielle celler af Escherichia coli ATCC 11105 suspenderes i 240 ml af en fysiologisk saltopløsning. Til suspensionen sættes 600 mg NjN’-methylen-bisiacrylamid), 18 ml 0,112$fs N,N,N’,NT-tetramethylen-diamin og 2 ml 2,5%1 s ammoniumpersulfat. Derefter henstår suspensionen i 60 minutter ved 30°C. Den opnåede stive gel granuleres, idet den presses gennem en sigte til dannelse af partikler med 3 mm diameter. Der opnås 420 ml af et immobiliseret præparat af Escherichia coli ATCC 11105. Penicillinamidaseaktiviteten er 0,3 enheder/ml.

2) Til 500 ml af en vandig 2%'s opløsning (pH 9,0) af penicillin G sættes 420 ml af det immobiliserede præparat af Escherichia coli ATCC 11105. Blandingen omrøres i 30 timer ved 40°C. Derefter filtreres reaktionsblandingen, og det således opnåede filtrat behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 1, 2). Der opnås 5,26 g 6-APA; smp. 204-207°C (sønderdeling).

Eksempel 10.

1) 24 g af de mikrobielle celler af Escherichia coli ATCC 11105 suspenderes i 240 ml af en fysiologisk saltopløsning. Til suspensionen sættes 600 mg N,N’-di-acryloyl-ethylenurinstof, 18 ml 0,112$Ts N,N,NT ^’-tetramethylen-diamin og 2 ml 2,5%'s kaliumpersulfat. Derefter henstår suspensionen i 30 minutter ved 37°C. Den opnåede stive gel granuleres, idet den presses gennem en sigte til dannelse af partikler med 3 mm diameter. Der opnås 420 ml af et immobiliseret præparat af Escherichia coli ATCC 11105. Penicillinamidaseaktiviteten er 0,2 enheder/ml. 1

Til 500 ml af en vandig 2%'s opløsning (pH 9,0) af penicillin V sættes 420 ml af det immobiliserede præparat af Escherichia coli ATCC 11105. Blandingen omrøres i 48 timer ved 40°C. Derefter filtreres reaktionsblandingen, og det således opnåede filtrat behandles på samme måde som beskrevet i eksempel 1, 2). Der opnås 5,11 g 6-APA; smp. 204-207°C (sønderdeling).