NL9900036A - Recombinant pox-virus contg. Morbillivirus DNA - Google Patents

Abstract

Recombinant poxvirus (I) contg. DNA from Morbilli-virus in a nonessential region of the poxvirus genome is new. Also described are: (1) a vaccine for inducing an immunological response in a host animal inoculated with the vaccine, the vaccine comprising a carrier and (I); and (2) a method for protecting a dog against canine distemper, which comprises inoculating the dog. with (I). In (I) the Morbillivirus is the measles virus and the DNA codes for measles virus haemagglutinin glycoprotein and/or measles virus fusion protein. DNA is expressed in host by the prodn. of a measles virus glycoprotein. Poxvirus is a vaccinia, avipox or canarypox virus and contains a promoter for expressing the Morbillivurs DNA.

Description

Recombinant virus en vaccin dat dit virus omvat.Recombinant virus and vaccine comprising this virus.

Terrein van de uitvinding.FIELD OF THE INVENTION

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een gemodificeerd pokkenvirus en op werkwijzen voor het maken en gebruiken daarvan. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een recombinant pokkenvirus dat' genprodukten van een gen van Morbillivirus tot expressie. brengt, en op vaccins die beschermende immuniteit geven tégen Morbillivirusinfecties.The present invention relates to a modified pox virus and to methods of making and using it. More specifically, the invention relates to a recombinant pox virus expressing gene products from a Morbillivirus gene. and on vaccines that provide protective immunity against Morbillivirus infections.

In deze aanvrage worden verschillende publicaties •aangehaald met Arabische cijfers tussen haakjes. Een . volledige vermelding van deze referenties is te vinden aan het eind van de beschrijving direkt voorafgaande aan de conclusies. Deze referenties beschrijven de stand der techniek waarmee deze uitvinding verband houdt.Various publications are cited in this application with Arabic numerals in parentheses. A . full reference to these references can be found at the end of the description immediately preceding the claims. These references describe the prior art to which this invention relates.

Achtergrond van de uitvinding.BACKGROUND OF THE INVENTION

Vacciniavirus en meer recentelijk andere pokkenvirussen zijn gebruikt voor de insertie en expressie van vreemde genen. De basistechniek voor de insertie van vreemde genen in levend infectieus pokkenvirus houdt recombinatie in tussen pokken-DNA-sequenties die een vreemd genetisch element flankeren in een donorplasmide, en homologe sequenties die aanwezig zijn in het ontvangende pokkenvirus (Piccini et al., 1987).Vaccinia virus and more recently other smallpox viruses have been used for the insertion and expression of foreign genes. The basic technique for inserting foreign genes into live infectious pox virus involves recombination between pox DNA sequences flanking a foreign genetic element in a donor plasmid, and homologous sequences present in the recipient pox virus (Piccini et al., 1987).

Specifiek worden de recombinante pokkenvirussen geconstrueerd in twee stappen die bekend zijn in het vakgebied en die analoog, zijn aan de werkwijzen voor het creëren van synthetische recombinanten van het vacciniavirus, beschreven in Amerikaans octrooischrift 4.603.112, waarvan de beschrijving hier bij referentie wordt opgenomen .Specifically, the recombinant poxviruses are constructed in two steps which are known in the art and which are analogous to the methods for creating synthetic recombinants of the vaccinia virus, described in U.S. Patent No. 4,603,112, the disclosure of which is incorporated herein by reference.

Eerst wordt de DNA-gensequentie die in het virus geïnserteerd moet worden, in het bijzonder een open lees-frame uit een niet-pokkenbron, gebracht' in een plasmidecon-struct van E. coli waarin DNA geïnserteerd is dat homoloog is · met een stuk DNA van het pokkenvirus. De te inserteren DNA-gensequentie wordt afzonderlijk geligeerd aan een promotor. De promotor-genkoppeling wordt zo in het piasmi-deconstruct gepositioneerd dat de promotor-genkoppeling aan beide uiteinden wordt geflankeerd door DNA dat homoloog is aan een DNA-sequentie die een gebied van pokken-DNA flankeert dat een niet-essentiële locus bevat. Het resulterende plasmideconstruct wordt vervolgens geamplificeerd door kweken in E. coli bacteriën (Clewell, 1972) en geïsoleerd (Clewell et al., 1969; Maniatis et al; 1982).First, the DNA gene sequence to be inserted into the virus, in particular an open reading frame from a non-pox source, is introduced into a E. coli plasmid construct that has DNA inserted that is homologous with a piece DNA of the smallpox virus. The DNA gene sequence to be inserted is ligated separately to a promoter. The promoter gene linkage is positioned in the piasmic construct so that the promoter gene linkage is flanked at both ends by DNA homologous to a DNA sequence flanking a region of pox DNA containing a non-essential locus. The resulting plasmid construct is then amplified by cultures in E. coli bacteria (Clewell, 1972) and isolated (Clewell et al., 1969; Maniatis et al; 1982).

Vervolgens wordt het geïsoleerde plasmide met daarin de te inserteren DNA-gensequentie getransfecteerd in een celcultuur, bijvoorbeeld kippe-embryo-fibroblasten, samen met het pokkenvirus. Recombinatie tussen homoloog pokken-DNA in respectievelijk het plasmide en het virale genoom geeft een pokkenvirus dat gemodificeerd is door de aanwezigheid, in een niet-essentieel gebied .van zijn genoom, van vreemde DNA-sequenties. Met de uitdrukking "vreemd" DNA wordt exogeen DNA aangeduid, in het bijzonder DNA uit een niet-pokkenbron, dat codeert voor genprodukten die normaliter niet geproduceerd worden door het genoom waarin het exogene DNA geplaatst is.Subsequently, the isolated plasmid containing the DNA gene sequence to be inserted is transfected into a cell culture, for example chicken embryo fibroblasts, together with the pox virus. Recombination between homologous pox DNA in the plasmid and the viral genome, respectively, results in a pox virus modified by the presence, in a non-essential region, of its genome, of foreign DNA sequences. The term "foreign" DNA refers to exogenous DNA, in particular DNA from a non-pox source, which codes for gene products that are not normally produced by the genome in which the exogenous DNA is placed.

Genetische recombinatie is in het algemeen de uitwisseling van homologe stukken DNA tussen twee strengen DNA. In bepaalde virussen kan DNA vervangen zijn door .RNA. Homologe stukken nucleïnezuur zijn stukken nucleïnezuur (DNA of RNA) die dezelfde volgorde van nucleotidebasen hebben.Genetic recombination is generally the exchange of homologous pieces of DNA between two strands of DNA. In certain viruses, DNA can be replaced by .RNA. Homologous stretches of nucleic acid are stretches of nucleic acid (DNA or RNA) that have the same sequence of nucleotide bases.

Genetische recombinatie kan op natuurlijke wijze plaatsvinden tijdens de replicatie of vervaardiging van nieuwe virale genomen binnen de geïnfecteerde gastheercel. Zo kan genetische recombinatie tussen virale genen optreden tijdens de virale replicatiecyclus die plaatsvindt in een gastheercel die gecoinfecteerd is met twee of meer verschillende virussen of andere genetische constructen. Een stuk DNA van een eerste genoom wordt uitwisselbaar gebruikt bij het construeren van het stuk van het genoom van een tweede coinfeeterend virus waarvan het DNA homoloog is met dat van het eerste virale genoom.Genetic recombination can occur naturally during the replication or production of new viral genomes within the infected host cell. For example, genetic recombination between viral genes can occur during the viral replication cycle that takes place in a host cell that is co-infected with two or more different viruses or other genetic constructs. A piece of DNA from a first genome is used interchangeably in constructing the piece from the genome of a second co-infecting virus whose DNA is homologous to that of the first viral genome.

Recombinatie kan echter ook plaatsvinden tussen stukken DNA in verschillende genomen die niet volmaakt homoloog zijn. Als één dergelijk stuk van een eerste genoom homoloog is met een stuk van een ander genoom, met uitzondering van de aanwezigheid in het eerste stuk van bijvoorbeeld een genetische merker of een gen dat codeert voor een antigene determinant dat geïnserteerd is in een deel van het homologe DNA, kan toch recombinatie plaatsvinden en de produkten van die recombinatie zijn dan te detecteren door de aanwezigheid van die genetische merker of dat gen in het recombinante virale genoom.However, recombination can also take place between pieces of DNA in different genomes that are not perfectly homologous. If one such piece from a first genome is homologous to a piece from another genome, with the exception of the presence in the first piece of, for example, a genetic marker or a gene encoding an antigenic determinant that is inserted into a part of the homologue DNA, recombination can nevertheless take place and the products of that recombination can then be detected by the presence of that genetic marker or gene in the recombinant viral genome.

Voor succesvolle expressie van de geinserteerde DNA-gensequentie door het gemodificeerde infectieuze virus moet aan twee voorwaarden voldaan worden. Ten eerste moet de insertie in een niet-essentieel gebied van het virus plaatsvinden om het gemodificeerde virus levensvatbaar te doen blijven. De tweede voorwaarde voor expressie van geïnserteerd DNA is de aanwezigheid van een promotor met de juiste betrekking tot het geinserteerde DNA. De promotor moet zo geplaatst zijn dat die stroomopwaarts van de tot expressie te brengen DNA-sequentie gelokaliseerd is.For successful expression of the inserted DNA gene sequence by the modified infectious virus, two conditions must be met. First, the insertion must take place in a non-essential region of the virus in order for the modified virus to remain viable. The second condition for inserting inserted DNA is the presence of a promoter with the correct relation to the inserted DNA. The promoter must be positioned so that it is located upstream of the DNA sequence to be expressed.

Hondeziektevirus (CDV) en mazelenvirus (MV) zijn leden van de Morbillivirus subgroep van de familie van het geslacht Paramyxovirus (Diallo, 1990; Kingsbury et al., 1978) . De virussen bevatten een niet-gesegmenteerd enkel-strengs RNA-genoom met negatieve polariteit. Hondeziekte is een zeer infectieuze met koorts gepaard gaande ziekte van honden en andere carnivoren. De mortaliteit is hoog; variërend tussen 30 en 80%. Overlevende honden hebben vaak een permanente schade aan het centraal zenuwstelsel (Fenner et al., 1987). Evenzo veroorzaakt het mazelenvirus een acute infectieuze met koorts gepaard gaande ziekte, die gekenmerkt wordt door een gegeneraliseerde huiduitslag met papels. De ziekte treft voornamelijk kinderen.Dog disease virus (CDV) and measles virus (MV) are members of the Morbillivirus subgroup of the family of the genus Paramyxovirus (Diallo, 1990; Kingsbury et al., 1978). The viruses contain a non-segmented single-stranded RNA genome with negative polarity. Dog disease is a highly infectious fever-associated disease of dogs and other carnivores. The mortality is high; ranging between 30 and 80%. Surviving dogs often have permanent damage to the central nervous system (Fenner et al., 1987). Similarly, the measles virus causes an acute infectious fever-associated illness characterized by a generalized rash with papules. The disease mainly affects children.

Van de eigenschappen van Morbillivirussen is onlangs een overzicht verschenen van de hand van Norrby en Oxman (1990) en Diallo (1990) . Zoals vermeld voor andere Paramyxovirussen (Avery en Niven, 1979; Merz et al., 1980) zijn twee structurele eiwitten cruciaal voor de inductie van een beschermende immuunré spons. Dit zijn het membraan-glycoproteïne hemagglutinine (HA) , dat verantwoordelijk is voor de hemagglutinatie en de aanhechting van het virus aan de gastheercel, en het fusieglycoproteïne (F) , dat mem-braanfusie veroorzaakt tussen het virus en de geïnfecteerde cel of tussen de geïnfecteerde en de aangrenzende niet-geïnfecteerde cellen (Graves et al., 1978). De volgorde van de genen in het MV-genoom is afgeleid door Richardson et al. (1985)' en Dowling et al. (1986). De nucleotidensequen-tie van het MVHA-gen en het MVF-gen is bepaald door respectievelijk Alkhatib en Briedis (1986) en Richardson et al. (1986) .An overview of the characteristics of Morbilliviruses has recently been published by Norrby and Oxman (1990) and Diallo (1990). As stated for other Paramyxoviruses (Avery and Niven, 1979; Merz et al., 1980), two structural proteins are crucial for the induction of a protective immune sponge. These are the membrane glycoprotein hemagglutinin (HA), which is responsible for the hemagglutination and the attachment of the virus to the host cell, and the fusion glycoprotein (F), which causes membrane fusion between the virus and the infected cell or between the infected cell and the adjacent uninfected cells (Graves et al., 1978). The sequence of genes in the MV genome is derived by Richardson et al. (1985) and Dowling et al. (1986). The nucleotide sequence of the MVHA gene and the MVF gene is determined by Alkhatib and Briedis (1986) and Richardson et al. (1986), respectively.

CDV en MV vertonen een structurele gelijkenis en zijn serologisch nauw verwant. Immunoprecipitatiestudies hebben aangetoond dat antiserum tegen MV alle eiwitten van CDV (P, NP, F, HA en M) zal precipiteren. Daarentegen zal antiserum tegen CDV alle MV-eiwitten precipiteren behalve het HA glycoproteïne (Hall et al., 1980; Orvell et al., 1980; Stephenson et al., 1979). In het licht van deze nauwe serologische verwantschap is eerder aangetoond dat vaccinatie met MV bescherming tegen een provocatie met CDV in honden zal uitlokken (Gillespie et al., 1960; Moura et al., 1961; Warren et al., 1960). Neutraliserende antilichamen tegen CDV zijn vermeld in menselijke anti-MV sera (Adams et al., 1957; Imagawa et al., 1960; Karzon, 1955; Karzon, 1962) maar neutraliserende antilichamen tegen MV zijn niet gevonden in anti-CDV sera van honden (Delay et al., 1965; Karzon, 1962; Roberts, 1965).CDV and MV have a structural similarity and are closely related serologically. Immunoprecipitation studies have shown that anti-MV antiserum will precipitate all proteins of CDV (P, NP, F, HA and M). In contrast, anti-CDV antiserum will precipitate all MV proteins except the HA glycoprotein (Hall et al., 1980; Orvell et al., 1980; Stephenson et al., 1979). In view of this close serological relationship, it has previously been shown that vaccination with MV will provoke protection against CDV provocation in dogs (Gillespie et al., 1960; Moura et al., 1961; Warren et al., 1960). Neutralizing anti-CDV antibodies have been reported in human anti-MV sera (Adams et al., 1957; Imagawa et al., 1960; Karzon, 1955; Karzon, 1962) but neutralizing anti-MV antibodies have not been found in dog anti-CDV sera (Delay et al., 1965; Karzon, 1962; Roberts, 1965).

HA- en F-genen van MV zijn tot expressie gebracht in verschillende virale vectoren waaronder vacciniavirus (Drillien et al., 1988; Wild et al., 1991), vogelpokkenvi-rus (Spehner et al., 1990; Wild et al., 1990), adenovirus (Alkhatib et al., 1990) en baculovirus (Vialard et al., 1990). In deze studies werden authentieke MV-eiwitten tot expressie gebracht die werkzaam waren in hemagglutinatie (Vialard et al., 1990), hemolyse (Alkhatib et al., 1990; Vialard et al., 1990) of celfusie (Alkhatib et al., 1990; Vialard et al., 1990; Wild et al., 1991) bepalingen. Bij insertie in een vacciniavirusvector was de expressie van ofwel het HA- ofwel het F-eiwit in staat tot het uitlokken van een beschermende immuunrespons in muizen tegen MV-encefalitis (Drillien et al., 1988). Evenzo lokte de expressie van het F-eiwit in een vogelpokkenvirusvector beschermende immuniteit uit tegen MV-encefalitis in muizen (Wild et al., 1990). Er werden geen studies naar bescherming vermeld met andere vectoren.MV HA and F genes have been expressed in various viral vectors including vaccinia virus (Drillien et al., 1988; Wild et al., 1991), bird pox virus (Spehner et al., 1990; Wild et al., 1990), adenovirus (Alkhatib et al., 1990) and baculovirus (Vialard et al., 1990). In these studies, authentic MV proteins were expressed that were active in hemagglutination (Vialard et al., 1990), hemolysis (Alkhatib et al., 1990; Vialard et al., 1990) or cell fusion (Alkhatib et al., 1990 ; Vialard et al., 1990; Wild et al., 1991) assays. Upon insertion into a vaccinia virus vector, the expression of either the HA or F protein was able to elicit a protective immune response in mice against MV encephalitis (Drillien et al., 1988). Similarly, the expression of the F protein in a fowlpox virus vector elicited protective immunity against MV encephalitis in mice (Wild et al., 1990). No studies of protection were reported with other vectors.

Europese octrooiaanvrage 0.314.569 heeft betrekking op de expressie van een MV-gen in vogelpokken.European patent application 0.314.569 relates to the expression of an MV gene in bird pox.

Perkus et al. (1990) beschreef onlangs de definitie van twee unieke genen voor het gastheerbereik in vacciniavirus. Deze genen coderen voor gastheerbereik-functies die de replicatie van vacciniavirus mogelijk maken op verschillende celsubstraten in vitro. De genen coderen voor gastheerbereik-functies voor replicatie van vacciniavirus in menselijke cellen alsook cellen die afkomstig zijn van het konijn en het varken. Definitie van deze genen maakt de ontwikkeling mogelijk van een vacciniavirusvector die, terwijl hij nog steeds belangrijke vreemde genen tot expressie brengt, ernstig beperkt zou zijn in zijn vermogen te repliceren in bepaaldie cellen. Dit zou de veiligheids-kenmerken van vacciniavirusrecombinanten in hoge mate verbeteren.Perkus et al. (1990) recently described the definition of two unique genes for the host range in vaccinia virus. These genes encode host range functions that permit the replication of vaccinia virus on different cell substrates in vitro. The genes encode host range functions for replication of vaccinia virus in human cells as well as cells derived from the rabbit and the pig. Definition of these genes allows the development of a vaccinia virus vector which, while still expressing important foreign genes, would be severely limited in its ability to replicate in particular cells. This would greatly improve the safety features of vaccinia virus recombinants.

Er is een verzwakte vector ontwikkeld door de achtereenvolgende deletie van zes niet-essentiële gebieden uit de Copenhagenstam van vacciniavirus. Van deze gebieden is bekend dat ze coderen door eiwitten die een rol kunnen spelen in de virale virulentie. De verwijderde gebieden zijn het tk-gen, het hemorrhagische gen, het A-type inclu-siegen, het hemagglutinine-gen en het gen dat codeert voor de grote subunit van het ribonucleotidereductase alsook de eerder gedefinieerde sequenties van C7L tot en met KIL (Perkus et al., 1990). De sequenties en lokaties op het genoom van deze genen in de Copenhagenstam van het vaccini-avirus zijn eerder gedefinieerd (Goebel et al., 1990 a,b) . De resulterende verzwakte vaccinia stam wordt aangeduid als NYVAC.A weakened vector has been developed by the successive deletion of six non-essential regions from the Copenhagen strain of vaccinia virus. These areas are known to encode proteins that can play a role in viral virulence. The deleted regions are the tk gene, the hemorrhagic gene, the A type including the hemagglutinin gene and the gene encoding the large subunit of the ribonucleotide reductase as well as the previously defined sequences from C7L to KIL (Perkus et al., 1990). The sequences and locations on the genome of these genes in the Copenhagen strain of the vaccinia avirus have been previously defined (Goebel et al., 1990 a, b). The resulting attenuated vaccinia strain is referred to as NYVAC.

De technologie van het genereren van vacciniavi-rusrecombinanten is onlangs uitgebreid tot andere leden van de familie van pokkenvirussen die een beperkter gastheerbe-reik hebben. Het vogelpokkenvirus is gemanipuleerd tot een recombinantvirus dat het rabies G-gen tot expressie brengt (Taylor et al., 1988b). Dit recombinante virus wordt ook beschreven in PCT publicatie nummer W089/03429. Bij inocu-latie van de recombinant in een aantal niet-vogel-species wordt een immuunrespons tegen rabies uitgelokt die in muizen, katten en honden bescherming biedt tegen een dodelijke provocatie met rabies.The technology for generating vaccinia virus recombinants has recently been extended to other members of the family of smallpox viruses that have a more limited host range. The bird pox virus has been engineered into a recombinant virus that expresses the rabies G gene (Taylor et al., 1988b). This recombinant virus is also described in PCT publication number WO89 / 03429. Upon inoculation of the recombinant in a number of non-avian species, an immune response to rabies is elicited which in mice, cats and dogs provides protection against a deadly provocation with rabies.

Zowel hondeziekte als mazelen worden op het moment bestreden met behulp van levende verzwakte vaccins (Penner et al., 1987; Preblud et al., 1988) . Voor de bestrijding van CDV wordt immunisering aanbevolen met behulp van een levend verzwakt vaccin op een leeftijd van 8 weken en nogmaals op een leeftijd van 12-16 weken. Hoewel de immuniteit tegen CDV levenslang is, wordt, vanwege de in hoge mate infectieuze aard van de verwekker en de ernst van de ziekte, een jaarlijkse revaccinatie gewoonlijk aanbevolen.Both dog disease and measles are currently being controlled with the help of live attenuated vaccines (Penner et al., 1987; Preblud et al., 1988). For the control of CDV, immunization is recommended using a live attenuated vaccine at the age of 8 weeks and again at the age of 12-16 weeks. Although CDV immunity is lifelong, due to the highly infectious nature of the causative agent and the severity of the disease, annual revaccination is usually recommended.

Eén probleem met het huidige beleid van continue revaccinatie is dat CDV-immune moeders neutraliserend antilichaam doorgeven aan hun nakomelingen in het colostrum. Het is moeilijk vast te stellen wanneer het gehalte aan deze antilichamen zover is afgenomen dat de jongen gevaccineerd kunnen worden. Hierdoor blijft een periode over waarin de jongen vatbaar kunnen zijn voor CDV-infec-tie. Gebruik van een recombinant vaccin dat alleen de glycoproteïnen van het mazelenvirus tot expressie brengt, kan voorzien in een manier om de remmende effecten van het van de moeder afkomstige antilichaam teniet te doen en vaccinatie van pasgeborenen mogelijk te maken. In feite is aangetoond dat CDV-specifieke antilichamen in jongen die werden gezoogd door CDV-immune moeders, de ontwikkeling van MV-specifieke antilichamen niet verhinderden bij inoculatie met een MV-vaccin (Baker et al., 1966).One problem with the current policy of continuous revaccination is that CDV immune mothers pass on neutralizing antibody to their offspring in the colostrum. It is difficult to determine when the level of these antibodies has decreased to such an extent that the young can be vaccinated. This leaves a period in which the young can be susceptible to CDV infection. Use of a recombinant vaccine that only expresses measles virus glycoproteins can provide a way to eliminate the inhibitory effects of the mother-derived antibody and to allow vaccination of newborns. In fact, it has been shown that CDV-specific antibodies in pups suckled by CDV immune mothers did not prevent the development of MV-specific antibodies upon inoculation with an MV vaccine (Baker et al., 1966).

Andere beperkingen van de gewoonlijk gebruikte gemodificeerde levende CDV-vaccins zijn eerder beschreven (Tizard, 1990) en zijn gekoppeld aan het vermogen van deze vaccinstammen te repliceren in de gevaccineerde dieren. Deze schadelijke effecten zijn het meest opmerkelijk wanneer de CDV-vaccinstam gelijktijdig geïnoculeerd wordt met honde-adenovirus 1 en 2 in honden, wat resulteert in immunosuppressie, trombocytopenie en encefalitis (Bestetti et al., 1978; Hartley, 1974; Phillips et al., 1989). Het is ook gebleken dat de gemodificeerde levende CDV-vaccins distemper induceren in andere diersoorten waaronder vossen, rolstaartberen, fretten en de panda (Bush et al·., 1976;Other limitations of the commonly used modified live CDV vaccines have been previously described (Tizard, 1990) and are linked to the ability of these vaccine strains to replicate in the vaccinated animals. These harmful effects are most noticeable when the CDV vaccine strain is co-inoculated with dog adenovirus 1 and 2 in dogs, resulting in immunosuppression, thrombocytopenia and encephalitis (Bestetti et al., 1978; Hartley, 1974; Phillips et al., 1989). It has also been found that the modified live CDV vaccines induce a more distant induction in other species including foxes, rolled tail bears, ferrets and the panda (Bush et al., 1976;

Carpenter et al., 1976; Kazacos et al., 1981). Daarom zou bij gebruik van een recombinant CDV-vaccin de voortdurende introductie van gemodificeerd CDV in de omgeving en potentiële met het vaccin verbonden en door het vaccin geïnduceerde complicaties die opgetreden zij bij gebruik van de gebruikelijke CDV-vaccins, geëlimineerd worden.Carpenter et al., 1976; Kazacos et al., 1981). Therefore, the use of a recombinant CDV vaccine would eliminate the continued introduction of modified CDV into the environment and potential vaccine-associated and vaccine-induced complications that occurred when using conventional CDV vaccines.

Het gebruik van pokkenvirusvectoren kan ook voorzien in een wijze voor het ondervangen van het beschre-. ven remmende effect dat antilichaam van de moeder heeft op vaccinatie met momenteel gebruikte levende verzwakte CDV-stammen in honden.'Bij jongen die geboren zijn uit moeders die eerder op jonge leeftijd geïmmuniseerd zijn met een pokkenvirusrecombinant, kan de interferentie van CDV-specifiek antilichaam van de moeder voorkomen worden. Bovendien biedt het vermogen van zowel vacciniavirus- als kanariepokkenvirusvectoren met daarin HA- en F-genen van MV tot het opwekken van deze respons en het ontbreken van serologische kruisreactiviteit tussen de twee pokkenvirussen een volgend voordeel, in die zin, dat de ene vector vroeg in het leven van het jong gebruikt zou kunnen worden en de andere later, om CDV-specifieke immuniteit te verhogen. Hierdoor wordt het vrijkomen van levende verzwakte CDV-stammen in de omgeving voorkomen, een gebeurtenis die gekoppeld is aan het optreden van door vaccin geïnduceerde en met vaccin verbonden complicaties (Tizard, 1990) .The use of smallpox virus vectors may also provide a method for overcoming the description. With the inhibitory effect of maternal antibody on vaccination with currently used live attenuated CDV strains in dogs. "For pups born to mothers previously immunized with a smallpox virus recombinant at an early age, the interference of CDV-specific antibody from the mother. In addition, the ability of both vaccinia virus and canarypox virus vectors containing MV HA and F genes to elicit this response and the lack of serological cross-reactivity between the two pox viruses offers a further advantage in that one vector early in the life of the young could be used and the other later, to increase CDV-specific immunity. This prevents the release of live attenuated CDV strains into the environment, an event linked to the occurrence of vaccine-induced and vaccine-related complications (Tizard, 1990).

Het is dus duidelijk dat de beschikbaarheid van een Morbillivirus-recombinant pokkenvirus, en van vaccins die beschermende immuniteit bieden tegen Morbillivirusin-fecties, een zeer wenselijke vooruitgang zou betekenen ten opzichte van de huidige stand der techniek.Thus, it is clear that the availability of a Morbillivirus recombinant pox virus, and of vaccines that offer protective immunity to Morbillivirus infections, would represent a highly desirable advance over the current state of the art.

Doelstellingen van de uitvinding.OBJECTS OF THE INVENTION

Het is dan ook een doelstelling van deze uitvinding te voorzien in recombinante pokkenvirussen, welke virussen genprodukten van Morbillivirussen tot expressie brengen, en te voorzien in een werkwijze voor het maken van dergelijke recombinante pokkenvirussen.It is therefore an object of this invention to provide recombinant poxviruses, which viruses express gene products of Morbilliviruses, and to provide a method for making such recombinant poxviruses.

Het is bovendien een doelstelling van deze uitvinding te voorzien in de klonering en expressie van coderende sequenties van Morbillivirus, in het bijzonder coderende sequenties van mazelenvirus, in een pokkenvirusvector, in het bijzonder vacciniavirus- of kanariepokkenvirusvectoren.It is furthermore an object of this invention to provide for the cloning and expression of morbillivirus coding sequences, in particular measles virus coding sequences, in a poxvirus vector, in particular vaccinia virus or canarypox virus vectors.

Een volgende doelstelling van deze uitvinding is te voorzien in een vaccin dat in staat is tot het opw ekkeii van Morbillivirus neutraliserende antilichamen, hemaggluti-natieremmende antilichamen en beschermende immuniteit, tegen Morbillivirusinfeetie en een lethale provocatie met Morbillivirus, waarbij in het bijzonder voorzien wordt in kruis-bescherming van honden tegen hondeziekte met behulp van een mazelenvirus-recombinant pokkenvirusvaccin.A further object of this invention is to provide a vaccine capable of eliciting Morbillivirus neutralizing antibodies, hemagglutination inhibiting antibodies and protective immunity against Morbillivirus infection and lethal provocation with Morbillivirus, in particular providing cross protection of dogs against dog disease using a measles virus recombinant smallpox virus vaccine.

Deze en andere doelstellingen en voordelen van de onderhavige uitvinding zullen duidelijker worden na beschouwing van het navolgende.These and other objects and advantages of the present invention will become more apparent upon consideration of the following.

Uiteenzetting van de uitvinding.Explanation of the invention.

In één aspect heeft 'de onderhavige uitvinding betrekking op een recombinant pokkenvirus met daarin een DNA-sequentie van Morbillivirus in een niet-essentieel gebied van het pokkenvirusgenoom. Het heeft voordelen als het pokkenvirus een vacciniavirus of een vogelpokkenvirus, zoals een kanariepokkenvirus is. Het heeft voordelen als het Morbillivirus. het mazelenvirus is.In one aspect, the present invention relates to a recombinant pox virus containing a Morbillivirus DNA sequence in a non-essential region of the pox virus genome. It is advantageous if the smallpox virus is a vaccinia virus or a birdpox virus, such as a canarypox virus. It has benefits like the Morbillivirus. is the measles virus.

Volgens de onderhavige uitvinding vertoont het recombinante pokkenvirus expressie van genprodukten van het vreemde Morbillivirus-gen. In het bijzonder codeert het vreemde DNA voor een glycoproteïne van mazelenvirus, in een gunstig geval hemagglutinine-glycoproteïne van mazelenvirus en fusieglycoproteïne van mazelenvirus. Het is gunstig als meerdere glycoproteïnen van mazelenvirus tegelijkertijd tot expressie komen in de gastheer door het recombinante pokkenvirus.According to the present invention, the recombinant poxvirus shows expression of gene products from the foreign Morbillivirus gene. In particular, the foreign DNA codes for measles virus glycoprotein, measles virus hemagglutinin glycoprotein and measles virus fusion glycoprotein. Advantageously, multiple measles virus glycoproteins are simultaneously expressed in the host by the recombinant pox virus.

In een volgend aspect heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een vaccin voor het induceren van een immunologische respons in een gastheerdier dat geïnoculeerd is met het vaccin, waarbij dat vaccin een drager bevat en een recombinant pokkenvirus met, in een niet-essentieel gebied daarvan, DNA van Morbillivirus, in het bijzonder mazelenvirus. Het is gunstig als het DNA codeert voor een glycoproteïne van mazelenvirus en dit tot expressie brengt, in het bijzonder hemagglutinine-glycoproteïne van mazelenvirus en fusieglycoproteïne van mazelenvirus. Het is gunstig als meerdere glycoproteïnen van mazelenvirus tegelijkertijd tot expressie komen in de gastheer. Het in het vaccin volgens de onderhavige uitvinding gebruikte pokkenvirus is gunstig een vacciniavirus of een vogelpok-kenvirus, zoals kanariepokkenvirus.In a further aspect, the present invention relates to a vaccine for inducing an immunological response in a host animal inoculated with the vaccine, said vaccine containing a carrier and a recombinant pox virus having DNA in a non-essential region thereof of Morbillivirus, in particular measles virus. Advantageously, the DNA encodes and expresses measles virus glycoprotein, particularly measles virus hemagglutinin glycoprotein and measles virus fusion glycoprotein. It is beneficial if multiple measles virus glycoproteins are expressed simultaneously in the host. The smallpox virus used in the vaccine of the present invention is advantageously a vaccinia virus or a birdpox virus, such as canarypox virus.

Korte beschrijving van de tekeningen.Brief description of the drawings.

De onderhavige uitvinding zal beter begrepen worden aan de hand van de begeleidende tekeningen waarin:The present invention will be better understood with reference to the accompanying drawings in which:

Figuur 1 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pSPM2LHAVC dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant vacciniavirus VP557 dat het MV-hemagglutinine-gen tot expressie brengt;Figure 1 schematically shows a method for the construction of plasmid pSPM2LHAVC used to obtain recombinant vaccinia virus VP557 expressing the MV hemagglutinin gene;

Figuur 2 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pSPMFVC dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant vacciniavirus vP455 dat het MV-fusie-gen tot expressie brengt;Figure 2 schematically shows a method for the construction of plasmid pSPMFVC used to obtain recombinant vaccinia virus vP455 expressing the MV fusion gene;

Figuur 3 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW843 dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant vacciniavirus vP756 dat het MV-hemagglutinine-gen tot expressie brengt;Figure 3 schematically shows a method for the construction of plasmid pRW843 that has been used to obtain recombinant vaccinia virus vP756 expressing the MV hemagglutinin gene;

Figuur 4 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW850 dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant vacciniavirus vP800 dat het MV-fusie-gen tot expressie brengt;Figure 4 schematically shows a method for the construction of plasmid pRW850 used to obtain recombinant vaccinia virus vP800 expressing the MV fusion gene;

Figuur 5 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW800 dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant kanariepokkenvirus vCP40 dat het MV-fusie-gen tot expressie brengt:Figure 5 schematically shows a method for the construction of plasmid pRW800 used to obtain recombinant canarypox virus vCP40 expressing the MV fusion gene:

Figuur 6 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW810 dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinante kanariepokkenvirussen vCP50 dat het MV-hemagglutinine-gen tot expressie brengt, en VCP57 dat de MV-fusie- en -hemagglutinine-genen tegelijkertijd tot expressie brengt;Figure 6 schematically shows a method for the construction of plasmid pRW810 used to obtain recombinant canarypox viruses vCP50 expressing the MV hemagglutinin gene, and VCP57 expressing the MV fusion and hemagglutinin genes simultaneously brings;

Figuur 7 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW852 dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant kanariepokkenvirus vCP85 dat het MV-hemagglutinine-gen tot expressie brengt;Figure 7 schematically shows a method for the construction of plasmid pRW852 used to obtain recombinant canarypox virus vCP85 expressing the MV hemagglutinin gene;

Figuur 8 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW583A dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant kanariepokkenvirus vCP82 dat de MV-hemagglutinine- en - fusie-genen tegelijkertijd tot expressie brengt;Figure 8 schematically shows a method for the construction of plasmid pRW583A that has been used to obtain recombinant canarypox virus vCP82 that simultaneously expresses the MV hemagglutinin and fusion genes;

Figuur 9 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pSD460 voor de deletie van het thymidinekinase-gen en de vorming van recombinant vaccinia-virus vP410;Figure 9 schematically shows a method for the construction of plasmid pSD460 for the deletion of the thymidine kinase gene and the generation of recombinant vaccinia virus vP410;

Figuur 10 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pSD486 voor de deletie van het hemorrhagische gebied en de vorming van recombinant vacci-niavirus vP553;Figure 10 schematically shows a method for the construction of plasmid pSD486 for the deletion of the hemorrhagic region and the formation of recombinant vaccinia virus vP553;

Figuur 11 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide ρΜΡ494Δ voor de deletie van het ATI-gebied en de vorming van recombinant vacciniavirus VP618;Figure 11 schematically shows a method for the construction of plasmid ρΜΡ494Δ for the deletion of the ATI region and the generation of recombinant vaccinia virus VP618;

Figuur 12 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pSD467 voor de deletie van het hemagglutinine-gen en de vorming van recombinant vacciniavirus vP723;Figure 12 schematically shows a method for the construction of plasmid pSD467 for the deletion of the hemagglutinin gene and the generation of recombinant vaccinia virus vP723;

Figuur 13 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pMPCSKlA voor de deletie van genencluster [C7L - KIL] en de vorming van recombinant vacciniavirus vP804;Figure 13 schematically shows a method for the construction of plasmid pMPCSK1A for deletion of gene cluster [C7L - KIL] and the generation of recombinant vaccinia virus vP804;

Figuur 14 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pSD548 voor de deletie van de grote subunit van ribonucleotidereductase en de vorming van recombinant vacciniavirus vP866 (NYVAC); enFigure 14 schematically shows a method for the construction of plasmid pSD548 for the deletion of the large subunit of ribonucleotide reductase and the generation of recombinant vaccinia virus vP866 (NYVAC); and

Figuur 15 schematisch een werkwijze laat zien voor de constructie van plasmide pRW857 dat gebruikt is voor het verkrijgen van recombinant NYVAC virus vP913 dat de MV-hemagglutinine- en -fusiegenen tegelijkertijd tot expressie brengt.Figure 15 schematically shows a method for the construction of plasmid pRW857 used to obtain recombinant NYVAC virus vP913 that simultaneously expresses the MV hemagglutinin and fusion genes.

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding.Detailed description of the invention.

De onderhavige uitvinding en de vele voordelen ervan zullen beter begrepen worden aan de hand van de volgende ter illustratie gegeven voorbeelden.The present invention and its many advantages will be better understood with reference to the following illustrative examples.

Voorbeeld 1 - VORMING VAN VACCINIAVIRUSRECOMBINANTEN METExample 1 - FORMATION OF VACCINIA VIRUS RECOMBINANTS WITH

HET MAZELEN-HEMAGGLUTININE-GEN.THE MEASLES-HEMAGGLUTININE-GEN.

Het bij de produktie van beide recombinanten gebruikte ontvangende virus was de Copenhagenstam van vacciniavirus, waaruit het thymidinekinase-gen was verwijderd. Het kweken van alle virussen en het bepalen van de titer geschiedde op monolagen van Vero cellen.The recipient virus used in the production of both recombinants was the Copenhagen strain of vaccinia virus, from which the thymidine kinase gene had been removed. The cultivation of all viruses and the determination of the titer were done on monolayers of Vero cells.

De vroege late vacciniavirus H6 promotor (Rosel et al., 1986; Taylor et al., 1988a,b) werd geconstrueerd door annealing van vier overlappende oligonucleotiden, H6SYN A-D. De resulterende H6 sequentie.is als volgt: Vacciniavirus H6 Promotor (SEQ ID NO:l/SEQ ID NO:2):The early late vaccinia virus H6 promoter (Rosel et al., 1986; Taylor et al., 1988a, b) was constructed by annealing of four overlapping oligonucleotides, H6SYN A-D. The resulting H6 sequence is as follows: Vaccinia virus H6 Promoter (SEQ ID NO: 1 / SEQ ID NO: 2):

HindiIIHindiII

5 ' AGCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGG GTTGT5 'AGCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGG GTTGT

AGAAATAAGATATGAATTTTTCACTTTTATTTATGTTTCCAAGAACTCCCAACAAGAAATAAGATATGAATTTTTCACTTTTATTTATGTTTCCAAGAACTCCCAACA

GTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTT

AAGTTAAGTT

CAATTTAACTTTCGCTCTTTATTAGTATTTAATAAAGTAATAGCGCTATAGGCAACAATTTAACTTTCGCTCTTTATTAGTATTTAATAAAGTAATAGCGCTATAGGCAA

TTCAATTCAA

TGTATCGTAC-3 ' ACATAGCATGAGCT-5 'TGTATCGTAC-3 'ACATAGCATGAGCT-5'

XholXhol

Met verwijzing nu naar figuur 1 werden de "annea-led" · H6SYN oligonucleotiden geligeerd in pMP2LVC dat geknipt was met XhoI/HindlII. wat het plasmide pSP131 opleverde. Het plasmide pMP2LVC bevat de meest linkse 0,4 kbp van het HindiII K gebied van het vacciniavirus (Copen-hagenstam) in pUC18. De constructie van pMP2LVC werd als volgt uitgevoerd: een HindiII/SalI-fragment van 0,4 kbp van het HindiII K gebied werd geïsoleerd en van stompe uiteinden voorzien met het Klenow fragment van het E. coli DNA-polymerase in aanwezigheid van 2 mM dNTPs. Dit fragment werd geïnserteerd in pUC18 dat geknipt was met PvuII. Het resulterende plasmide werd pMP2VC genoemd. Het plasmide pMP2VC werd gelineariseerd met Sspl. Synthetische oligonu-cleotiden MPSYN52 (SEQ IDNO:3) (5'-ATTATTTTTATAAGCTTGGA-TCCCTCGAGGGTACCCCCGGGGAGCTCGAATTCT-3 ' ) en MPSYN53 (SEQ ID NO:4) (5 1 - AGAATTCGAGCTCCCCGGGGGTACCCTCGAGGGATCCAAGCTTATAAAAATAAT- 3 ' ) werden "annealed" en geïnserteerd in de meest links gelegen van de twee Sspl-plaatsen die gelokaliseerd zijn in de vacciniavirussequenties. Het resulterende plasmide pMP2LVC bevat een meervoudig kloneringsgebied in het intergene gebied tussen de KIL en K2L open leesframes.Referring now to Figure 1, the "annea-led" H6 SYN oligonucleotides were ligated into pMP2LVC digested with Xho I / Hind II. yielding the plasmid pSP131. The plasmid pMP2LVC contains the leftmost 0.4 kbp of the HindiII K region of the vaccinia virus (Copen hedge strain) in pUC18. The construction of pMP2LVC was performed as follows: a 0.4 kbp HindiII / SalI fragment from the HindiII K region was isolated and blunt-ended with the Klenow fragment of the E. coli DNA polymerase in the presence of 2 mM dNTPs . This fragment was inserted into pUC18 cut with PvuII. The resulting plasmid was called pMP2VC. The plasmid pMP2VC was linearized with Sspl. Synthetic oligonucleotide nucleotides MPSYN52 (SEQ ID NO: 3) (5'-ATTATTTTTATAAGCTTGGA-TCCCTCGAGGGTACCCCCGGGGAGCTCGAATTCT-3 '), and MPSYN53 (SEQ ID NO: 4) (5 1 - AGAATTCGAGCTCCCCGGGGGTACCCTCGAGGGATCCAAGCTTATAAAAATAAT- 3') were "annealed" and inserted into the left-most located from the two Sspl sites located in the vaccinia virus sequences. The resulting plasmid pMP2LVC contains a multiple cloning region in the intergenic region between the KIL and K2L open reading frames.

"Annealed" oligonucleotiden 3P1 (SEQ ID NO:5) (5'- GGGAAG-ATGGAACCAATCGCAGATAG-3 1 ) en 3P2 (SEQ ID NO: 6) (5·- AATTCTATCTG-CGATTGGGGTTCCATCTTCCC-3 ' ) die de uiterste 3'-sequenties van het HA-gen en een plakkend EcoRI-uiteinde bevatten, werden geligeerd aan een Xhol/Smal-fragment van pMH22 van 1,8 kbp dat de rest van het HA-gen bevat, en pSP131 dat geknipt was met Xhol en EcoRI. Het resulterende plasmide werd pSPMHAll genoemd. Het plasmide pMH22 werd afgeleid van een cDNA-kloon van volledige lengte van het mazelen-HA-gen door vorming van een Xhol-plaats bij het ATG initiatiecodon (Alkhatib et al., 1986)."Annealed" oligonucleotides 3P1 (SEQ ID NO: 5) (5'-GGGAAG-ATGGAACCAATCGCAGATAG-3 1) and 3P2 (SEQ ID NO: 6) (5 · - AATTCTATCTG-CGATTGGGGTTCCATCTTCCC-3 ') that the ultimate 3' sequences of the HA gene and a sticky Eco RI end were ligated to a 1.8 kbp XhoI / SmaI fragment of pMH22 containing the rest of the HA gene, and pSP131 digested with XhoI and EcoRI. The resulting plasmid was called pSPMHA11. The plasmid pMH22 was derived from a full length cDNA clone of the measles HA gene by formation of a Xho I site at the ATG initiation codon (Alkhatib et al., 1986).

Een HindiII/EcoRI-fragment van 1,9 kbp van pSPMHAll met daarop het mazelen-HA-gen werd geïsoleerd en van stompe uiteinden voorzien met het Klenow fragment van het E. coli DNA-polymerase in aanwezigheid van 2 mM dNTPs. Het geïsoleerde fragment werd geïnserteerd in pMP409DVC (Guo et al., 1989) dat geknipt was met BqlII en van stompe uiteinden voorzien door behandeling met "mung bean" nuclea-se. Insertie in deze vector leverde het plasmide pSPMHA41 op. De Xhol-plaats tussen de H6 promotor en het initiatie-codon van het HA-gen werd verwijderd met behulp van oligo-nucleotide-gestuurde mutagenese door het breken van de dubbele streng (Mandecki, 1982) met behulp van oligonucleo-tide HAXHOD (SEQ ID NO:7) (5'- ATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCACCACAACGAGACCGGAT-3 ' ) . Met deze werkwijze werd plasmide pSPM2LHAVC gevormd. Insertie-plasmide pSPM2LHAVC werd gebruikt in in vitro recombinatie-experimenten met vacciniavirus VP458 als het ontvangende virus voor de vorming van recombinant vP557. vP458 bevat het E. coli lac Z gen in de M2L insertieplaats van vP410. Deze vacciniavirusrecombinant bevat het mazelen-HA-gen in de M2L locus van het genoom, waar het het lac Z gen vervangt .A 1.9 kbp HindiII / EcoRI fragment of pSPMHA11 bearing the measles HA gene was isolated and blunt-ended with the Klenow fragment of the E. coli DNA polymerase in the presence of 2 mM dNTPs. The isolated fragment was inserted into pMP409DVC (Guo et al., 1989) cut with Bq11 and blunt-ended by treatment with "mung bean" nuclear. Insertion into this vector yielded the plasmid pSPMHA41. The Xho I site between the H6 promoter and the initiation codon of the HA gene was removed by oligo-nucleotide-directed mutagenesis by breaking the double strand (Mandecki, 1982) using oligonucleotide HAXHOD (SEQ ID NO: 7) (5'-ATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCACCACAACGAGACCGGAT-3 '). Plasmid pSPM2LHAVC was formed with this method. Insertion plasmid pSPM2LHAVC was used in in vitro recombination experiments with vaccinia virus VP458 as the recipient virus for the formation of recombinant vP557. vP458 contains the E. coli lac Z gene in the M2L insertion site of vP410. This vaccinia virus recombinant contains the measles HA gene in the M2L locus of the genome, where it replaces the lac Z gene.

Voorbeeld 2 - VORMING VAN VACCINIAVIRUSRECOMBINANTEN METExample 2 - FORMATION OF VACCINIA VIRUS RECOMBINANTS WITH

HET MAZELEN-FUSIE-GEN.THE MEASLES-FUSION GEN.

Met verwijzing nu naar figuur 2 werden "annealed" oligonucleotiden 3PA (SEQ ID NO: 8). (5'-CCTAAAGCCTGATCTTACGGGAACATCAAAATCCTAT- GTAAGGTCGCTCTGATTTTTATCGGCCGA-3 1 ) en 3PB (SEQ ID NO: 9) (5 ’ - AGCTTCGGCCGATAAAAATCAGAGCGACCTTACATAGGATTTTGATGTTCCCGTAAG-ATCAGGCTTTAGG-3') met daarop het 31-uiteinde van het mazelen-fusiegen, een vroeg transcriptieterminatiesignaal van vacciniavirus (Yuen et al., 1987) en Eagl- en HindlII-uiteinden geligeerd aan een Sall/HaelII-fragment van 1 kbp van pCRF2 (verkregen van C. Richardson, National Research Council of Canada (Biotechnology Institute), Montreal, Canada H3A 1A1) en pUC8 dat geknipt was met Sall en HindiII. Het resplterende plasmide pMF3PR14 bevat het 3'-uiteinde van het fragment van 1 kbp van het mazelen-fusie-gen.With reference now to Figure 2, "annealed" oligonucleotides became 3PA (SEQ ID NO: 8). (5'-CCTAAAGCCTGATCTTACGGGAACATCAAAATCCTAT- GTAAGGTCGCTCTGATTTTTATCGGCCGA-3 1), and 3PB (SEQ ID NO: 9) (5 '- AGCTTCGGCCGATAAAAATCAGAGCGACCTTACATAGGATTTTGATGTTCCCGTAAG-ATCAGGCTTTAGG-3') having thereon the 31 'end of the measles fusion gene, a vaccinia virus early transcription termination signal of (Yuen et al., 1987) and Eagl and HindIII ends ligated to a 1 kbp Sall / HaelII fragment of pCRF2 (obtained from C. Richardson, National Research Council of Canada (Biotechnology Institute), Montreal, Canada H3A 1A1) and pUC8 that was cut with Sall and HindiII. The plasmid pMF3PR14 contains the 3 'end of the 1 kbp fragment of the measles fusion gene.

"Annealed" oligonucleotiden 5PA (SEQ ID NO:10) (5'- GGGATGGGTCTCAAGGTGAACGTCTCTGCCATATTC-3' en 5PB (SEQ ID NO:11) (5'-ATGGCAGAGACGTTCACCTTGAGACCCATCCC-3') met een 5'-"Annealed" oligonucleotides 5PA (SEQ ID NO: 10) (5'-GGGATGGGTCTCAAGGTGAACGTCTCTGCCATATTC-3 'and 5PB (SEQ ID NO: 11) (5'-ATGGCAGAGACGTTCACCTTGAGACCCATCCC-3')

Smal-plaats en een 31-BstXI-plaats werden geligeerd aan een BstXI/Sall-fragment van 820 bp van pCRF2 en pUC8 dat geknipt was met Smal en Sall. Het resulterende plasmide pSPMF5P16 bevat het 5'-deel van het mazelen-fusiegen. Het Smal/Sall-fragment van 820 bp van pSPMF5P16 en het Sall/Sma I site and a 31-Bst XI site were ligated to an 820 bp Bst XI / Sal I fragment of pCRF2 and pUC8 digested with Sma I and Sal I. The resulting plasmid pSPMF5P16 contains the 5 'part of the measles fusion gene. The 820 bp Smal / Sal I fragment of pSPMF5P16 and the Sal I / S

Eagl- fragment van 1 kbp van pMF3PR14 werden geligeerd in pTP15 dat geknipt was met Smal en Eagl. Het plasmide pTP15 (Guo et al. , 1989) bevat de vroege/late H6 promotor van vacciniavirus, geflankeerd door sequenties van de HA-locus van het genoom van vacciniavirus (Copenhagenstam) . Het resulterende plasmide met het mazelen-fusiegen aan de 3'-kant geplaatst naast de H6 promotor binnen het HA-insertie-plasmide werd pSPHMF7 genoemd.1 kbp Eagl fragment from pMF3PR14 were ligated into pTP15 cut with Smal and Eagl. The plasmid pTP15 (Guo et al., 1989) contains the vaccinia virus early / late H6 promoter, flanked by HA locus sequences of the vaccinia virus genome (Copenhagen strain). The resulting plasmid with the measles fusion gene on the 3 'side adjacent to the H6 promoter within the HA insert plasmid was called pSPHMF7.

Oligonucleotide-gestuurde mutagenese werd uitgevoerd op pSPHMF7. Eerst werd een in vitro mutagenesereactie (Mandecki, 1982) uitgevoerd voor het vormen van een precieze ATG:ATG koppeling van de H6 promotor met het mazelen-fusiegen door de Smal-plaats te verwijderen met behulp van het oligonucleotide SPMAD (SEQ ID N0:12) (5' -TATCCGTTAAGT- TTGTATGGTAATGGGTCTCAAGGTGAACGTCT-3 ' ) . Dit resulteerde in de vorming van pSPMF75M20. Vervolgens werd de BqlII-plaats aan het 51-uiteinde van de H6 promotor verwijderd met behulp van oligonucleotide SPBGLD (SEQ ID NO: 13) (5'-AATAAAT- CACTTTTTATACTAATTCTTTATTCTATACTTAAAAAGT-3 ' ) volgens een bekende werkwijze (Mandecki, 1982). Het resulterende plasmide werd pSPMFVC genoemd. Dit plasmide werd gebruikt in in vitro recombinatie-experimenten met vacciniavirus vP410 als ontvangend virus om vP455 te vormen.Oligonucleotide-directed mutagenesis was performed on pSPHMF7. First, an in vitro mutagenesis reaction (Mandecki, 1982) was performed to form a precise ATG: ATG linkage of the H6 promoter with the measles fusion gene by removing the Sma I site using the oligonucleotide SPMAD (SEQ ID NO: 12) ) (5 '-TATCCGTTAAGT-TTGTATGGTAATGGGTCTCAAGGTGAACGTCT-3'). This resulted in the formation of pSPMF75M20. The Bq11 site at the 51 end of the H6 promoter was then removed using oligonucleotide SPBGLD (SEQ ID NO: 13) (5'-AATAAAT-CACTTTTTATACTAATTCTTTATTCTATACTTAAAAAGT-3 ') according to a known method (Mandecki, 1982). The resulting plasmid was called pSPMFVC. This plasmid was used in in vitro recombination experiments with vaccinia virus vP410 as recipient virus to form vP455.

Voorbeeld 3 - IMMUNOPRECIPÏTATIEANALYSE..Example 3 - IMMUNOPRECIPATION ANALYSIS ..

Teneinde vast te stellen dat recombinanten vP455 en vP557 authentieke eiwitten tot expressie brachten, werden immunoprecipitatie-experimenten uitgevoerd in wezen zoals beschreven (Taylor et al., 1990). In het kort werden monolagen van Vero cellen geïnfecteerd met 10 pfu per cel met ofwel oudervirus ofwel recombinantvirus in aanwezigheid van 35S-methionine. Het fusie-eiwit werd specifiek geprecipiteerd uit het lysaat van geïnfecteerde cellen met behulp van een konijne-antiserum dat gericht was tegen een car-boxy-eindstandig fusiepeptide. Het hemagglutinine-eiwit werd specifiek geprecipiteerd uit het lysaat van geïnfecteerde cellen met behulp van een polyklonaal monospecifiek anti-hemagglutinineserum.In order to determine that recombinants vP455 and vP557 expressed authentic proteins, immunoprecipitation experiments were performed essentially as described (Taylor et al., 1990). Briefly, monolayers of Vero cells were infected with 10 pfu per cell with either parent virus or recombinant virus in the presence of 35 S-methionine. The fusion protein was specifically precipitated from the lysate of infected cells using a rabbit antiserum directed against a carboxy-terminal fusion peptide. The hemagglutinin protein was specifically precipitated from the lysate of infected cells using a polyclonal monospecific anti-hemagglutinin serum.

Met betrekking tot de immunoprecipitatie met behulp van een fusiespecifiek serum werden geen radioactief gemerkte produkten gedetecteerd in niet-geïnfecteerde Vero cellen, met oudervirus geïnfecteerde Vero cellen, of cellen die geïnfecteerd waren met de HA-recombinant vP557. In cellen die geïnfecteerd waren met de fussierecombinant vP4 55 werden de fusieprecursor F0 met een molecuulgewicht van ongeveer 60 kd en de twee splitsingsprodukten F1 en F2 met molecuulgewichten van 44 kd en 23 kd gedetecteerd. Evenzo werden, met betrekking tot de immunoprecipitatie van de geglycosyleerde vorm van het HA-eiwit met een molecuulgewicht van ongeveer 75-77 kd, geen produkten gedetecteerd in niet-geïnfecteerde Vero cellen, met oudervirus geïnfecteerde cellen, of met vP455 geïnfecteerde Vero cellen.With regard to immunoprecipitation using a fusion-specific serum, no radiolabeled products were detected in uninfected Vero cells, parental virus-infected Vero cells, or cells infected with the HA recombinant vP557. In cells infected with the fusion recombinant vP4 55, the fusion precursor F0 with a molecular weight of approximately 60 kd and the two cleavage products F1 and F2 with molecular weights of 44 kd and 23 kd were detected. Similarly, with regard to the immunoprecipitation of the glycosylated form of the HA protein with a molecular weight of about 75-77 kd, no products were detected in uninfected Vero cells, parental virus infected cells, or vP455 infected Vero cells.

Bovendien gaven immunofluorescentiestudies aan dat beide eiwitten tot expressie kwamen op het oppervlak van de geïnfecteerde cel.In addition, immunofluorescence studies indicated that both proteins were expressed on the surface of the infected cell.

Voorbeeld 4 - CELFUSIE-EXPERIMENTENExample 4 - CELFUSION EXPERIMENTS

Een kenmerk van de cytopathogeniteit van Morbilli-virus is de vorming van syncytia die ontstaan door fusie van geïnfecteerde cellen met omringende niet-geïnfecteerde cellen, gevolg door migratie van de nuclei naar het centrum van het syncytium (Norrby et al., 1982). Het is gebleken dat dit een belangrijke methode van virale verspreiding is, die voor Paramyxovirussen kan optreden in aanwezigheid van hemagglutinine-specifiek antilichaam (Merz et al., 198.0). Dit vermogen is in analogie met andere Paramyxovirussen toegeschreven aan het amino-uiteinde van het F1 peptide (Choppin et al., 1981; Novick et al., 1988; Paterson et al. , 1987) .A characteristic of the cytopathogenicity of Morbilli virus is the formation of syncytia that result from fusion of infected cells with surrounding uninfected cells, followed by migration of the nuclei to the center of the syncytium (Norrby et al., 1982). This has been found to be an important method of viral spread that can occur for Paramyxoviruses in the presence of hemagglutinin-specific antibody (Merz et al., 198.0). This ability is analogous to other Paramyxoviruses attributed to the amino terminus of the F1 peptide (Choppin et al., 1981; Novick et al., 1988; Paterson et al., 1987).

Teneinde vast te stellen dat de mazelen-eiwitten die tot expressie werden gebracht in vacciniavirus functioneel actief waren, werden monolagen van Vero cellen geïnocculeerd met respectievelijk oudervirus of recombi-nante virussen vP455 en vP557 met 1 pfu per cel. Na 1 uur absorptie bij 37°C werd het inoculum verwijderd, het bovenstaande medium vervangen, . en werden de schaaltjes overnacht geïncubeerd bij 37°C. 18 Uur na infectie werden de platen onderzocht met een microscoop en gefotografeerd. Er was geen celfusie-activiteit zichtbaar in Vero cellen die geïnoculeerd waren met oudervirus, vP455 of vP557.In order to establish that the measles proteins expressed in vaccinia virus were functionally active, monolayers of Vero cells were inoculated with parent virus or recombinant viruses vP455 and vP557 with 1 pfu per cell, respectively. After 1 hour of absorption at 37 ° C, the inoculum was removed, the above medium replaced. and the dishes were incubated overnight at 37 ° C. 18 hours after infection, the plates were examined with a microscope and photographed. No cell fusion activity was visible in Vero cells inoculated with parental virus, vP455 or vP557.

. Wanneer echter vP455 en vP557 tegelijkertijd werden geïno-culeerd, werd efficiënte celfusie-activiteit waargenomen.. However, when vP455 and vP557 were inoculated at the same time, efficient cell fusion activity was observed.

Dit resultaat is onlangs bevestigd door Wild et al. (1991) die vaststelden dat voor syncytiumvorming in een verscheidenheid aan cellijnen die geïnfecteerd waren met mazelen/vacciniavirusrecombinanten expressie van zowel het fusie- als het hemagglutinine-gen nodig was. Het resultaat is echter in tegenstelling met een eerdere vermelding (Alkhatib, 1990) waarin celfusie beschreven wordt in 293 cellen die geïnfecteerd waren met hoge multipliciteiten van een adenovirus recombinant die het mazelen-fusie-eiwit tot expressie brengt. Evenzo is vermeld (Vialard et al., 1990) dat celfusie werd waargenomen in insectencellen die geïnfecteerd waren met een baculovirus recombinant die het mazelen-fusie-eiwit tot expressie bracht, maar alleen bij incubatie bij pH 5,8. In geen van deze gevallen werd de fusie-activiteit verhoogd door co-infectie met de betreffende recombinant met expressie van het mazelen-hemaggluti-. nine-eiwit. Variabelen die betrokken kunnen zijn bij het fusieproces zijn het celtype (Giraudon et al., 1984), pH van het medium (Vialard et al., 1990) en expressieniveau van het fusie-eiwit (Norrby et al., 1982).This result has recently been confirmed by Wild et al. (1991) who found that syncytium formation in a variety of cell lines infected with measles / vaccinia virus recombinants required expression of both the fusion and hemagglutinin gene. However, the result is in contrast to an earlier mention (Alkhatib, 1990) in which cell fusion is described in 293 cells infected with high multiplicities of an adenovirus recombinant expressing the measles fusion protein. Similarly, it is reported (Vialard et al., 1990) that cell fusion was observed in insect cells infected with a baculovirus recombinant expressing the measles fusion protein, but only on incubation at pH 5.8. In none of these cases was the fusion activity increased by co-infection with the relevant recombinant expressing the measles-hemaggluti. nine protein. Variables that may be involved in the fusion process are the cell type (Giraudon et al., 1984), pH of the medium (Vialard et al., 1990) and expression level of the fusion protein (Norrby et al., 1982).

Voorbeeld 5 - SEROLOGISCHE TESTSExample 5 - SEROLOGICAL TESTS

De techniek voor het testen van virus neutraliserend (VN) antilichaam werd eerder in detail beschreven (Appel et al., 1973). Het testen op CDV-VN antilichaamti-ters werd gedaan in Vero cellen met de aangepaste Onder-stepoortstam van CDV. Het testen op MV-VN antilichaamtiters werd gedaan in Vero cellen met de aangepaste Edmonston stam van MV. De resultaten van de serologische tests worden getoond in tabel 1.The technique for testing virus neutralizing (VN) antibody was previously described in detail (Appel et al., 1973). Testing for CDV-VN antibody titers was done in Vero cells with the modified Onder-step strain of CDV. The testing for MV-VN antibody titers was done in Vero cells with the modified Edmonston strain of MV. The results of the serological tests are shown in Table 1.

Honden die geïmmuniseerd waren zoals beschreven in voorbeeld 6 met ofwel het vaccinia oudervirus of vP455 met expressie van het mazelen-fusie-eiwit, ontwikkelden géén neutraliserend antilichaam tegen MV. Honden die geïmmuniseerd waren met ofwel vP557 met expressie van het HA-eiwit ofwel gelijktijdig geïnoculeerd waren met beide recombinanten vP455 en vP557, ontwikkelden neutraliserende antilicha-men na 1 inoculatie. Antilichaamgehalten waren equivalent aan die welke geïnduceerd worden door inoculatie met de verzwakte Edmonston stam van MV.Dogs immunized as described in Example 6 with either the vaccinia parental virus or vP455 expressing the measles fusion protein did not develop a neutralizing anti-MV antibody. Dogs immunized with either vP557 expressing the HA protein or co-inoculated with both recombinants vP455 and vP557 developed neutralizing antibodies after 1 inoculation. Antibody levels were equivalent to those induced by inoculation with the attenuated Edmonston strain of MV.

Tabel 1Table 1

Mazelenvirus neutraliserende antilichaamtiters in respons op vaccinatieMeasles virus neutralizing antibody titers in response to vaccination

Dagen na vaccinatieDays after vaccination

Immunisatie Hond No. 0a 7 · 14 21b 28 35cImmunization Dog 0a 7 · 14 21b 28 35c

Vacc. 4/1 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 4/2 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 VP455 4/3 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 4/4 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 vP557 4/5 <1,0 2,2d 2,9 2,9 3,4 3,4 4/6 <1,0 2,7 .2,9 2,9 3,9 3,4 VP455 & VP557 4/7 <1,0 2,7 3,4 3,2 3,4 3,4 4/8 <1,0 2,5 2,9 2,9 3,6 2,9 MV 4/14 <1,0 2,9 4/15 <1,0 3,2 a) Tijdstip van de eerste immunisatie b) Tijdstip van de tweede immunisatie (eerste immunisatie met MV) c) Tijdstip van de provocatie d) Titer, uitgedrukt als log10 van de laatste antilichaamverdunning die volledige neutralisatie van de infectiviteit laat zien in een microtiter neutralisatietest zoals beschreven door Appel et al. (1973).Vacc. 4/1 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 4/2 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 VP455 4/3 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 4/4 <1.0 <1.0 <1.0 <1, 0 <1.0 <1.0 vP557 4/5 <1.0 2.2d 2.9 2.9 3.4 3.4 4/6 <1.0 2.7 .2.9 2.9 3 , 9 3.4 VP455 & VP557 4/7 <1.0 2.7 3.4 3.2 3.4 3.4 4/8 <1.0 2.5 2.9 2.9 3.6 2 , 9 MV 4/14 <1.0 2.9 4/15 <1.0 3.2 a) Time of the first immunization b) Time of the second immunization (first immunization with MV) c) Time of the provocation d ) Titer, expressed as log10 of the last antibody dilution that shows complete neutralization of infectivity in a microtiter neutralization test as described by Appel et al. (1973).

Voorbeeld 6 - BESCHERMXNGSSTUDIES BIJ DIERENExample 6 - ANIMAL PROTECTION STUDIES

Teneinde vast te stellen of expressie van de mazelenvirus-eiwitten in honden die geïnoculeerd waren met de recombinanten voldoende was om een beschermende immuun-respons te induceren tegen CDV-provocatie, werden 14 10 weken oude specifiek pathogeenvrije beagles bestudeerd. Bloedmonsters werden genomen bij aanvang van het experiment en herhaaldelijk daarna. Vier groepen met twee honden per groep werden geïmmuniseerd met twee injecties met een tussentijd van drie weken. De eerste groep kreeg alleen vacciniavirus. De tweede groep kreeg vacciniavirus met een insertie voor het F-eiwit van mazelenvirus (vP455). De derde groep kreeg vacciniavirus met een insertie voor het HA-antigeen van MV (vP557) en de vierde groep kreeg een combinatie van twee en drie. Elke hond werd geïnoculeerd met ongeveer 4 x 108 pfu vacciniavirus in hoeveelheden van 1 ml (0,6 ml subcutaan en 0,4 ml intramusculair) . Twee controlehonden kregen intramusculair 105 50% weefselkweek infectieuse doses (TCID50) van de verzwakte Edmonston stam van MV (1 ml) en twee controlehonden kregen subcutaan 104 TCIDS0 van de verzwakte Rockborn stam van CDV twee weken voor provocatie met virulent CDV. Twee controlehonden bleven niet-geïnoculeerd vóór provocatie.In order to determine whether expression of the measles virus proteins in dogs inoculated with the recombinants was sufficient to induce a protective immune response to CDV challenge, 14-week-old specifically pathogen-free beagles were studied. Blood samples were taken at the start of the experiment and repeatedly afterwards. Four groups with two dogs per group were immunized with two injections three weeks apart. The first group only received vaccinia virus. The second group received vaccinia virus with an insert for measles virus F protein (vP455). The third group received vaccinia virus with an insertion for the HA antigen from MV (vP557) and the fourth group received a combination of two and three. Each dog was inoculated with approximately 4 x 10 8 pfu vaccinia virus in 1 ml amounts (0.6 ml subcutaneously and 0.4 ml intramuscularly). Two control dogs received intramuscularly 105% tissue culture infectious doses (TCID50) of the attenuated Edmonston strain of MV (1 ml) and two control dogs received subcutaneously 104 TCIDS0 of the attenuated Rockborn strain of CDV two weeks before provocation with virulent CDV. Two control dogs remained inoculated before provocation.

Alle honden werden twee weken na' de laatste inoculatie geprovoceerd door intranasale inoculatie met 1 ml weefselkweekvloeistof met daarin 104 TCIDS0 van de Snyder Hill stam van virulent CDV. De klinische reacties van de honden werden gevolgd door dagelijkse observatie en door registratie van de lichaamstemperatuur en door tweewekelijkse registratie van gewichtstoename of -verlies. Circulerende bloedlymfocyten werden geteld vóór provocatie en op de dagen 3, 5, 7 en 10 na provocatie (dpc). Isolatie van virus uit cellen van de "buffy coat" door samen te kweken met longmacrofagen van de hond (Appel et al., 1967) werd ondernomen op dpc 3, 5, 7 en 10. Bloedmonsters vóór serologisch tests werden afgenomen voor vaccinatie en met tussenpozen van een week tot het tijdstip van provocatie, en op dpc 7, 10 en 20.All dogs were challenged two weeks after the last inoculation by intranasal inoculation with 1 ml tissue culture fluid containing 104 TCIDS0 from the Snyder Hill strain of virulent CDV. The clinical reactions of the dogs were followed by daily observation and by recording body temperature and by biweekly recording of weight gain or loss. Circulating blood lymphocytes were counted before provocation and on days 3, 5, 7 and 10 after provocation (dpc). Isolation of virus from buffy coat cells by co-cultivation with dog lung macrophages (Appel et al., 1967) was undertaken on dpc 3, 5, 7 and 10. Blood samples prior to serological testing were taken for vaccination and with one week intervals until the time of provocation, and on dpc 7, 10 and 20.

De resultaten van de provocatie worden getoond in tabel 2.The results of the provocation are shown in Table 2.

Tabel 2Table 2

Effecten van immunisatie op klinische svmptonen na blootstelling van honden aan virulent CDV_Effects of immunization on clinical sms tones after exposure of dogs to virulent CDV_

Aantal dagen na inoculatie met virulent CDVNumber of days after inoculation with virulent CDV

Verhoogde Lymfo- VirusIncreased Lympho Virus

Immunisatie_Hond No._Depressie_Gewichtsverlies_lichaamstemp._feniab_isolatie doodImmunization_Dog No._Depression_Weight loss_body temp._pheniab_isolation dead

Vacc. 4/1 4-10d 3-10 4,5,7,10 7-10 3-7 10 4/2 4-10d 3-10 4,5,8-10 3-10 3-7 10 VP455 4/3 4-8 7-10 4,5,7-10 5,7 5-7 4/4 4-6 7-10 4-6 7 5-7 VP557 4/5 NDe ND 6,7 10 7 4/6 ND ND ND ND ND - vP455 & VP557 4/7 ND ND 7 7 7 - 4/8 ND 7 6 ND 7Vacc. 4/1 4-10d 3-10 4.5,7.10 7-10 3-7 10 4/2 4-10d 3-10 4.5.8-10 3-10 3-7 10 VP455 4/3 4-8 7-10 4.5.7-10 5.7 5-7 4/4 4-6 7-10 4-6 7 5-7 VP557 4/5 NDe ND 6.7 10 7 4/6 ND ND ND ND ND - vP455 & VP557 4/7 ND ND 7 7 7 - 4/8 ND 7 6 ND 7

MV 4/14 ND ND ND 7 NDMV 4/14 ND ND ND 7 ND

4/15 ND 7 5 5 ND4/15 ND 7 5 5 ND

CDV-Ro 4/16 ND ND ND ND NDCDV-Ro 4/16 ND ND ND ND ND

4/17 ND ND ND ND ND -4/17 ND ND ND ND ND -

Geen 4/18 6,14-17d 7-17 5,7 13-17 10 17 4/19 4 - 10d 3-10 4,5,7 3,7,10 3-10 10None 4/18 6.14-17d 7-17 5.7 13-17 10 17 4/19 4 - 10d 3-10 4.5.7 3.7.10 3-10 10

a) Hoger dan 39,5°Ca) Higher than 39.5 ° C

b) Minder dan 2 x 103 lymfocyten per mm3 c) Geïsoleerd uit cellen van de "buffy coat" samen gekweekt met longmacrofagen van de hond d) Hond raakte gedehydreerd en werd uit zijn lijden verlost e) Niet gedetecteerdb) Less than 2 x 103 lymphocytes per mm3 c) Isolated from "buffy coat" cells co-cultured with dog lung macrophages d) Dog became dehydrated and released from suffering e) Not detected

Niet-geïmmuniseerde controlehonden en met vaccinia oudervirus gevaccineerde honden ontwikkelden klinische symptomen van ernstige ziekte en werden uit hun lijden verlost wanneer dehydratie evident was. Beide met vP455 geïmmuniseerde honden vertoonden enige symptomen van infectie met CDV waaronder gewichtsverlies, verhoogde lichaamstemperatuur en lymfopenie hoewel deze symptomen van kortere duur waren dan bij controlehonden. Desalniettemin overleefden beide honden een letale provocatie met CDV. Honden die geïnoculeerd waren met vP557 of gelijktijdig geïnoculeerd met beide recombinanten vertoonden minimale symptonen van infectie en overleefden de provocatie. Honden die geïnoculeerd waren met ofwel de verzwakte Edmonston stam van MV ofwel de verzwakte Rockborn stam van CDV overleefden ook de provocatie met minimale ziekteverschijnselen.Non-immunized control dogs and vaccinia parental virus vaccinated dogs developed clinical symptoms of serious illness and were relieved of their suffering when dehydration was evident. Both dogs immunized with vP455 showed some symptoms of CDV infection including weight loss, elevated body temperature and lymphopenia although these symptoms were shorter in duration than in control dogs. Nevertheless, both dogs survived a lethal provocation with CDV. Dogs that were inoculated with vP557 or co-inoculated with both recombinants showed minimal symptoms of infection and survived the challenge. Dogs inoculated with either the weakened Edmonston strain of MV or the weakened Rockborn strain of CDV also survived the provocation with minimal disease symptoms.

Voorbeeld 7 - AANVULLENDE VACCINIA/MAZELENCONSTRUCTENExample 7 - ADDITIONAL VACCINIA / MEASURES CONSTRUCTS

Met verwijzing nu naar figuur 3 werd een tweede vacciniavirusrecombinant gevormd (vP756) die het mazelen HA-gen bevat in de tk-locus, met behulp van insertieplasmi-.de pRW843. pRW843 werd geconstrueerd op de volgende manier. Uit pSPM2LHAVC werd een EcoRV/Smal-fragment van 1,8 kbp geïsoleerd dat de het meest aan de 3' -kant gelegen 24 bp van de H6 promotor bevat, gefuseerd in een precieze ATG:ATG configuratie met het HA-gen dat de het meest aan de 3'-kant gelegen 26 bp mist. Dit fragment werd gebruikt om het EcoRV/Smal-fragment van 1,8 kbp van pSPMHAll te vervangen om zo pRW803 te vormen. Plasmide pRW803 bevat de complete H6 promotor, op exacte wijze gekoppeld aan het complete mazelen-HA-gen.Referring now to Figure 3, a second vaccinia virus recombinant was formed (vP756) containing the measles HA gene in the tk locus, using insertion plasmid pRW843. pRW843 was constructed in the following manner. From pSPM2LHAVC an 1.8 kbp Eco RV / Smal fragment was isolated that contains the 3 b side most of the H6 promoter fused to a precise ATG: ATG configuration with the HA gene containing the HA gene 26 bp on the 3 'side. This fragment was used to replace the 1.8 kbp Eco RV / Smal fragment of pSPMHA11 to form pRW803. Plasmid pRW803 contains the complete H6 promoter, precisely linked to the complete measles HA gene.

Bij de bevestiging van eerdere constructen met het mazelen-HA-gen was opgemerkt dat de sequentie voor codon 18 (CCC) verdwenen was bij vergelijking met de gepubliceerde sequentie (Alkhatib et al., 1986). De CCC-sequentie werd weer op zijn plaats gezet met oligonucleotide-mutagenese via de methode van Kunkel (Kunkel, 1985) met behulp van oligonucleotide RW117 (SEQ ID N0:14) (5'-GACTATCCTACTT- CCCTTGGGATGGGGGTTATCTTTGTA-3').When confirming earlier constructs with the measles HA gene, it was noted that the sequence for codon 18 (CCC) had disappeared when compared to the published sequence (Alkhatib et al., 1986). The CCC sequence was put back in place with oligonucleotide mutagenesis via the method of Kunkel (Kunkel, 1985) using oligonucleotide RW117 (SEQ ID NO: 14) (5'-GACTATCCTACTT-CCCTTGGGATGGGGGTTATCTTTGTA-3 ').

Pro 18Pro 18

Enkelstrengs-template werd afgeleid van plasmide pRW819 dat de H6/HA-cassette uit pRW803 bevat in pIBI25 (IBI, New Haven, CT.). Het gemutageniseerde plasmide met daarin het ingevoegde (CCC) dat codeert voor een proline-rest bij codon 18, werd pRW820 genoemd. De sequentie tussen de HindlII- en Xbal-plaatsen van pRW820 werd bevestigd met nucleotidensequentie-analyse. De HindiII-plaats is gelegen aan de 5'-grens van de H6 promotor, terwijl de Xbal-plaats 230 bp stroomafwaarts van het initiatiecodon van het HA-gen gelegen is. Een Xbal/EcoRI- fragment van 1,6 kbp van pRW803 met daarop de voor HA coderende sequenties stroomafwaarts van de Xbal-plaats en met het terminatiecodon werd gebruikt om het equivalente fragment van pRW820 te vervangen, wat resulteerde in de vorming van pRW837. De gemutageniseerde expressiecassette die zich bevindt in pRW837 werd verkregen door digestie met HindlII en EcoRI. van stompe uiteinden voorzien met behulp van het Klenow fragment van E.coli DNA-polymerase in aanwezigheid van 2mM dNTPs, en gexnserteerd in de Smal-plaats van pSD573VCVQ, wat pRW843 opleverde. Het plasmide pRW843 werd gebruikt in in vitro recombinatie experimenten met vP618 als het ontvangende virus en men verkreeg zo vP756. Oudervirus vP618 is een virus van de Copenhagen stam waaruit het thymidinekinase-gen, het hemorrhagische gen en het A-type inclusiegen verwijderd zijn. Met immunoprecipitatie-analyse is gebleken dat recombinant vP756 correcte expressie vertoont van een hemagglutinine-glycoproteïne van ongeveer 75 kd.Single-stranded template was derived from plasmid pRW819 containing the H6 / HA cassette from pRW803 in pIBI25 (IBI, New Haven, CT.). The mutagenized plasmid containing the inserted (CCC) encoding a proline moiety at codon 18 was called pRW820. The sequence between the HindIII and Xbal sites of pRW820 was confirmed by nucleotide sequence analysis. The HindIII site is located at the 5 'border of the H6 promoter, while the Xbal site is located 230 bp downstream of the initiation codon of the HA gene. A 1.6 kbp Xbal / Eco RI fragment of pRW803 with the HA coding sequences downstream of the Xbal site and with the termination codon was used to replace the equivalent fragment of pRW820, resulting in the formation of pRW837. The mutagenized expression cassette contained in pRW837 was obtained by digestion with HindIII and EcoRI. blunted ends using the Klenow fragment of E.coli DNA polymerase in the presence of 2mM dNTPs, and inserted into the Sma I site of pSD573VCVQ, yielding pRW843. The plasmid pRW843 was used in in vitro recombination experiments with vP618 as the recipient virus and thus obtained vP756. Parent virus vP618 is a virus of the Copenhagen strain from which the thymidine kinase gene, the hemorrhagic gene and the A-type inclusion gene have been removed. Immunoprecipitation analysis has shown that recombinant vP756 shows correct expression of a hemagglutinin glycoprotein of approximately 75 kd.

Met verwijzing naar figuur 4 werd een tweede vacciniavirus recombinant (vP800) die het mazelen-fusiegen herbergt in de ATI locus van het genoom, gevormd met behulp van insertieplasmide pRW850. Voor de constructie van pRW850 werden de volgende manipulaties uitgevoerd. Het plasmide pSPMF75M20 met daarop het mazelen-fusiegen in een precieze ATG:ATG configuratie gekoppeld aan de H6 promotor, werd geknipt met. Nrul en Eagl. Het fragment, van 1,7 kbp met stompe uiteinden met daarop de 28 bp die het meest aan de 3'-kant van de H6 promotor liggen en het complete fusiegen werd geïsoleerd en gexnserteerd in pRW823 dat geknipt was met Nrul en Xbal en van stompe uiteinden was voorzien. Het resulterende plasmide pRW841 bevat de H6 promotor gekoppeld aan het mazelen-fusiegen in de pIBI25 plasmidevector (IBI, New Haven, CT.). De H6/mazelen-fusie-expressiecassette werd verkregen uit pRW841 door digestie met Smal en het resulterende fragment van 1,8 kbp werd geinserteerd in pSD4 94VC dat geknipt was met Smal en zo verkreeg men pRW850. Het plasmide pRW850 werd in in vitro recombinatie experimenten gebruikt met vP618 als het ontvangende virus om zo vP800 te verkrijgen. Met immunoprecipitat ie -analyse is gebleken dat recombinant vP800 een authentiek bewerkt fusie-glycoprote-ine tot expressie brengt.With reference to Figure 4, a second vaccinia virus recombinant (vP800) harboring the measles fusion gene in the ATI locus of the genome was formed using insert plasmid pRW850. The following manipulations were performed for the construction of pRW850. The plasmid pSPMF75M20 with the measles fusion gene on it in a precise ATG: ATG configuration linked to the H6 promoter was cut with. Nrul and Eagl. The 1.7 kbp fragment with blunt ends with the 28 bp most on the 3 'side of the H6 promoter and the complete fusion gene was isolated and inserted into pRW823 cut with Nrul and Xbal and blunt ends was provided. The resulting plasmid pRW841 contains the H6 promoter linked to the measles fusion gene in the pIBI25 plasmid vector (IBI, New Haven, CT.). The H6 / measles fusion expression cassette was obtained from pRW841 by digestion with Smal and the resulting 1.8 kbp fragment was inserted into pSD4 94VC that was digested with Smal to obtain pRW850. The plasmid pRW850 was used in in vitro recombination experiments with vP618 as the recipient virus to obtain vP800. Immunoprecipitation analysis has shown that recombinant vP800 expresses an authenticated fusion glycoprotein.

Voorbeeld 8 - BEPALING VAN MAZELEN NEUTRALISEREND ANTILI-CHAAM IN MET vP455 GEINOCULEERDE CAVIA’S EN KONIJNENExample 8 - DETERMINATION OF MEASLES NEUTRALIZING ANTIBI CHAAM IN CAVIA AND RABBITS INOCULATED WITH VP455

Twee konijnen werden intradermaal geinoculeerd op 5 plaatsen met een totaal van 1 x 108 pfu recombinant vP455 die het mazelen-fusie-eiwit tot expressie brengt. Beide konijnen kregen in week 12 een boosters met een identieke inoculatie. Seriële bloedmonsters werden verzameld en in week 14, twee weken na de booster, werden de konijnen getest op de aanwezigheid van neutraliserende antilichamen in het serum.Two rabbits were inoculated intradermally at 5 sites with a total of 1 x 10 8 pfu recombinant vP455 expressing the measles fusion protein. Both rabbits received a booster with an identical inoculation in week 12. Serial blood samples were collected and at week 14, two weeks after the booster, the rabbits were tested for the presence of neutralizing antibodies in the serum.

Vier cavia's werden subcutaan geinoculeerd met elk 1 x 108 pfu recombinant vP455. Een identieke booster-inoculatie werd gegeven na 21 dagen. Seriele bloedmonsters werden verzameld.Four guinea pigs were inoculated subcutaneously with 1 x 108 pfu of recombinant vP455 each. An identical booster inoculation was given after 21 days. Serial blood samples were collected.

De aanwezigheid van mazelenvirus neutraliserend antilichaam in serum werd bepaald met een microtitertest (Appel et al., 1973) met 10 TCID50 virus per microtiterput-je. De resultaten worden getoond in tabel 3.The presence of measles virus neutralizing antibody in serum was determined by a microtiter test (Appel et al., 1973) with 10 TCID 50 virus per microtiter well. The results are shown in Table 3.

Tabel 3Table 3

Resultaten van mazelenvirus neutraliserende antilichamen in serum van met vP455 geinoculeerde cavia's en konijnenResults of measles virus neutralizing antibodies in vP455 inoculated guinea pigs and rabbits

Weken na inoculatie 0 2 3 4 5 7 14Weeks after inoculation 0 2 3 4 5 7 14

DierAnimal

CaviaGuinea pig

1 N.D.a N.D. N.D.-0,8b 1,3-1,3 1,3-1,5 1,3 N.TC1 N.D.a N.D. N.D.-0.8b 1.3-1.3 1.3-1.5 1.3 N.TC

2 N.D. N.D. 0,8-1,0 0,8-1,3 1,3-1,5 N.D. N.T.2 N.D. N.D. 0.8-1.0 0.8-1.3 1.3-1.5 N.D. N.T.

3 N.D. N.D. N.D.-0,8 0,8-1,5 . 1,0-1,3 1,0 N.T.3 N.D. N.D. N.D.-0.8 0.8-1.5. 1.0-1.3 1.0 N.T.

6 N.D. N.D. 0,8-0,8 0,8-0,8 1,0-1,3 1,0 N.T.6 N.D. N.D. 0.8-0.8 0.8-0.8 1.0-1.3 1.0 N.T.

Konijn W44 N.D. N.T. N.T. N.T. N.T. N.T. 1,5 W86 N.D. N.T. N.T. N.T. N.T. N.T 1,5 a) Niet detecteerbaar b) Resultaten van twee bepalingen c) Niet getestRabbit W44 N.D. N.T. N.T. N.T. N.T. N.T. 1.5 W86 N.D. N.T. N.T. N.T. N.T. N / A 1.5 a) Not detectable b) Results of two determinations c) Not tested

Voorbeeld 9 - VORMING VAN MAZELENVIRUS-RECOMBINANT KANARIE-POKKENVIRUSExample 9 - FORMATION OF MEASLES VIRUS RECOMBINANT CANARY-POKKENVIRUS

Mazelen/kanariepokkenvirusrecombinanten werden ontwikkeld met behulp van eenzelfde strategie als die eerder beschreven is voor vogelpokkenvirus (Taylor et al., 1988 a,b).Measles / canarypox virus recombinants were developed using the same strategy as previously described for birdpox virus (Taylor et al., 1988 a, b).

Plasmiden voor insertie van de mazelen F- en HA-genen in kanariepokkenvirus werden als volgt gegenereerd.Plasmids for insertion of measles F and HA genes into canary pox virus were generated as follows.

Met verwijzing nu naar figuur 5 werd het BolII/ Eagl-fragment van 1,8 kbp met stompe uiteinden van pSPMF75M20 met daarop het door de H6 promotor gecontroleerde mazelen F-gen ingevoegd in de van stompe uiteinden voorziene EcoRI-plaats van pRW784.2. Plasmide pRW764.2 bevat een PvuII-fragment' van 3,4 kbp van het kanariepokken-genoom met een unieke EcoRI-plaats waarvan vastgesteld is dat die niet essentieel is voor virale replicatie. Het resulterende plasmide met het mazelen F-gen werd pRW800 genoemd en werd gebruikt in recombinatie experimenten met kanariepokken als het ontvangende virus voor de vorming van vCP40.Referring now to Figure 5, the 1.8 kbp BolII / Eagl fragment with blunt ends of pSPMF75M20 with the measles F gene controlled by the H6 promoter was inserted into the blunt-ended Eco RI site of pRW784.2. Plasmid pRW764.2 contains a 3.4 kbp PvuII fragment of the canarypox genome with a unique EcoRI site that has been determined not to be essential for viral replication. The resulting measles F gene plasmid was named pRW800 and was used in recombination experiments with canarypox as the recipient virus for the formation of vCP40.

Met verwijzing nu naar figuur 6 werd het EcoRV/ Smal-fragment van 1,8 kbp van pSPM2LHA met de het meest aan de 3'-kant gelegen 28 bp van de H6 promotor, in een precieze ATG:ATG configuratie gefuseerd met HA, geïnserteerd tussen de EcoRV- en Smal-plaatsen van pSPMHAll. Het resulterende plasmide werd pRW803 genoemd. Een Hindi11/EcoRI-fragment van 2 kbp van pRW803 met daarop het door de H6-promotor gecontroleerde mazelen-HA-gen werd van stompe uiteinden voorzien en geïnserteerd in de van stompe uiteinden voorziene BqlII-plaats van plasmide pRW764.5. Plasmide pRW764.5 bevat een PvuII-fragment van 800 bp van het kanariepokkengenoom met een unieke BqlII-plaats waarvan eerder is vastgesteld dat die niet essentieel is voor virale groei. Met 'deze insertie werd plasmide pRW810 gevormd dat gebruikt werd in recombinatietests voor de vorming van vCP50.Referring now to Figure 6, the 1.8 kbp Eco RV / Smal fragment of pSPM2LHA with the 3 'most-situated 28 bp of the H6 promoter, was inserted into a precise ATG: ATG configuration fused with HA. between the Eco RV and Sma I sites of pSPMHA11. The resulting plasmid was named pRW803. A 2 kbp Hindi11 / EcoRI fragment of pRW803 with the measles HA gene controlled by the H6 promoter was blunt-ended and inserted into the blunt-ended Bq11 site of plasmid pRW764.5. Plasmid pRW764.5 contains an 800 bp PvuII fragment of the canarypox genome with a unique BqII site that has previously been found not to be essential for viral growth. With this insert, plasmid pRW810 was formed which was used in recombination assays for the formation of vCP50.

Insertie van de mazelen F- en HA-sequenties leiden afzonderlijk tot de ontwikkeling van respectievelijk recombinanten vCP40 en vCP50. Teneinde een dubbele recombi- nant te vormen werd de enkelvoudige F-recombinant vCP40 gebruikt als een ontvangend virus voor de insertie van het HA-gen dat aanwezig was in pRW810. Dit leidde, tot de ontwikkeling van de dubbele recombinant vCP57.Insertion of the measles F and HA sequences separately lead to the development of recombinants vCP40 and vCP50, respectively. In order to form a double recombinant, the single F-recombinant vCP40 was used as a recipient virus for the insertion of the HA gene present in pRW810. This led to the development of the double recombinant vCP57.

Voorbeeld 10 - IMMÜNOPRECIPITATIEANALYSEExample 10 - IMMUNE RECEPTION ANALYSIS

Teneinde te bevestigen dat recombinanten vCP40, vCP50 en vCP57 authentieke eiwitten tot expressie brachten, werd immunoprecipitatieanalyse uitgevoerd met behulp van monospecifieke sera, gericht tegen ofwel het HA- ofwel het F-eiwit. Een correct bewerkt fusiepolypeptide werd specifiek geprecipiteerd uit lysaten van cellen die geïnfecteerd waren met vCP40 en vCP57. De fusieprecursor F0 met een molecuulgewicht van ongeveer 60 kd en de twee splitsings-producten Fx en F2 met molecuulgewichten van respectievelijk ongeveer 44 en 23 kb werden gedetecteerd. Er waren geen fusie-specif ieke produkten te detecteren in niet-geïnfecteerde CEF cellen, met oudervirus geïnfecteerde CEF cellen of met de HA-recombinant vCP50 geïnfecteerde CEF cellen. Evenzo werd een glycoproteïne van ongeveer 75 kd specifiek geprecipiteerd uit CEF cellen die geïnfecteerd waren met de enkelvoudige HA-recombinant vCP50 en de dubbele recombinant vCP57. Er werden geen HA-specifieke produkten gedetecteerd in niet-geïnfecteerde cellen, met oudervirus geïnfecteerde cellen of met fusierecombinant vCP40 geïnfecteerde cellen.In order to confirm that recombinants vCP40, vCP50 and vCP57 expressed authentic proteins, immunoprecipitation analysis was performed using monospecific sera directed against either the HA or F protein. A properly processed fusion polypeptide was specifically precipitated from lysates of cells infected with vCP40 and vCP57. The fusion precursor F0 with a molecular weight of approximately 60 kd and the two cleavage products Fx and F2 with molecular weights of approximately 44 and 23 kb were detected. No fusion-specific products could be detected in uninfected CEF cells, parental virus-infected CEF cells, or HA-recombinant vCP50-infected CEF cells. Similarly, an approximately 75 kd glycoprotein was specifically precipitated from CEF cells infected with the single HA recombinant vCP50 and the double recombinant vCP57. No HA-specific products were detected in uninfected cells, parental virus infected cells, or fusion recombinant vCP40 infected cells.

Voorbeeld 11 - CELFUSIE-EXPERIMENTENExample 11 - CELFUSION EXPERIMENTS

Teneinde vast te stellen dat de mazelenvirusrecom-binanten functioneel actief waren, werden celfusie-analyses uitgevoerd. Monolagen van Vero cellen werden geïnfecteerd met 1 pfu per cel CP-oudervirus of recombinante virussen en 18 uur na infectie onderzocht op cytopathische effecten. Er was geen celfusie-activiteit zichtbaar in Vero cellen die geïnoculeerd waren met oudervirus, vCP40 of vCP50 virussen. Wanneer Vero cellen' echter werden geïnoculeerd met de dubbele recombinant vCP57 of wanneer cellen worden geco-infecteerd met zowel vCP40 als vCP50, is er een duidelijke efficiënte celfusie-activiteit.In order to establish that the measles virus recombinants were functionally active, cell fusion analyzes were performed. Monolayers of Vero cells were infected with 1 pfu per cell CP parent virus or recombinant viruses and examined for cytopathic effects 18 hours after infection. No cell fusion activity was visible in Vero cells inoculated with parental virus, vCP40 or vCP50 viruses. However, when Vero cells' were inoculated with the double recombinant vCP57 or when cells are co-infected with both vCP40 and vCP50, there is a clear efficient cell fusion activity.

Voorbeeld 12 - SEROLOGISCHE TESTSExample 12 - SEROLOGICAL TESTS

Honden die geïnoculeerd waren zoals beschreven in voorbeeld 13 met de kanariepokken/HA recombinant vCP50, vaccinia/HA recombinant vP557, de kanariepokken/HA/F dubbele recombinant vCP57, of die gelijktijdig geïnoculeerd waren met vP455 en vP557 ontwikkelden een significante hoeveelheid neutraliserend antilichaam in het serum tegen mazelenvirus na 1 inoculatie. Geen van de twee honden die geïnoculeerd waren met de kanariepokken/F recombinant vCP40 ontwikkelde neutraliserend antilichaam na 1 of 2 inocula-ties. De resultaten van de serologische tests worden getoond in tabel 4.Dogs that were inoculated as described in Example 13 with the canarypox / HA recombinant vCP50, vaccinia / HA recombinant vP557, the canarypox / HA / F double recombinant vCP57, or that were simultaneously inoculated with vP455 and vP557 developed a significant amount of neutralizing antibody in the serum against measles virus after 1 inoculation. Neither of the two dogs inoculated with the canarypox / F recombinant vCP40 developed neutralizing antibody after 1 or 2 inoculations. The results of the serological tests are shown in Table 4.

Bovendien ontwikkelden cavia1s die geïnoculeerd waren met de vCP4 0 recombinant lage maar reproduceerbare gehalten neutraliserend antilichaam in het serum.In addition, guinea pigs inoculated with the vCP4 developed recombinantly low but reproducible levels of neutralizing antibody in the serum.

Tabel 4Table 4

Mazelenvirus neutraliserende antilichaamtitiers (in log10)Measles virus neutralizing antibody titers (in log10)

Dagen na vaccinatieDays after vaccination

Immunisatie Hond No. 0a 7 14 21b 28 35cImmunization Dog 0a 7 14 21b 28 35c

Kanariepokkenvirus 9/1 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 (CPV) 9/2 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 VCP50 9/3 <1,0 2,7d 2,9 3,2 4,4 4,1 9/4 <1,0 1,7 2,7 2,7 3,9 3,9 vCP40 9/5 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 9/6 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 <1,0 VCP57 9/7 <1,0 2,0 2,7 2,5 3,9 3,6 9/8 <1,0 1,0 2,2 2,0 3,6 3,4 vP455 9/9 <1,0 <1,0 <1,0 1,0 1,0 1,0 vP557 9/10 <1,0 2,9 2,5 3,2 3,4 3,4 vP455 & vP557 9/11 <1,0 1,3 2,9 2,9 2,9 2,9 MV 9/12 <1,0 2,5 2,5Canary Pox Virus 9/1 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 (CPV) 9/2 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 VCP50 9/3 <1.0 2.7d 2.9 3.2 4.4 4.1 9/4 <1.0 1.7 2.7 2.7 3.9 3.9 vCP40 9/5 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 9/6 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 <1.0 VCP57 9/7 <1.0 2.0 2.7 2.5 3.9 3.6 9/8 <1.0 1.0 2.2 2.0 3.6 3.4 vP455 9/9 <1.0 <1.0 <1.0 1.0 1.0 1.0 vP557 9/10 <1.0 2.9 2.5 3.2 3.4 3, 4 vP455 & vP557 9/11 <1.0 1.3 2.9 2.9 2.9 2.9 MV 9/12 <1.0 2.5 2.5

Controle 9/13 <1,0 9/14 <1,0 CDV-Ro 9/15 <1,0 <1,0 <1,0 a) Tijdstip van de eerste immunisatie b) Tijdstip van de tweede immunisatie (eerste immunisatie met MV en CDV-Ro) c) Tijdstip van provocatie d) Bepaling van serum-neutralisatietiters bepaald op bekende wijze (Appel et al., 1973)Control 9/13 <1.0 9/14 <1.0 CDV-Ro 9/15 <1.0 <1.0 <1.0 a) Time of the first immunization b) Time of the second immunization (first immunization with MV and CDV-Ro) c) Time of provocation d) Determination of serum neutralization titers determined in known manner (Appel et al., 1973)

Voorbeeld 13 - BESCHERMINGSSTÜDIES BIJ DIERENExample 13 - ANIMAL PROTECTION STUDIES

Teneinde vast te stellen of niet-replicerende kanariepokkenvectoren met expressie van mazelenvirus eiwitten een beschermende immuunrespons tegen CDV-provoca-tie zouden induceren, werden 10 weken oude specifiek pathogeenvrije beagles geinoculeerd met kanariepokken-oudervirus en recombinante kanariepokkenvirussen. Twee honden werden tegelijkertijd geinoculeerd met twee subcuta-ne injecties van 1 x 108 pfu van elke recombinant met tussenpozen van drie weken. Ter vergelijking werd één hond volgens hetzelfde schema geinoculeerd met elk van de enkelvoudige vacciniavirusrecombinanten vP455 en vP557 en een combinatie van beide. Eén hond werd ook intramusculair geinoculeerd met 1 dosis van 105 TCID50 van de verzwakte Edmonston stam van MV. Eén hond werd subcutaan geinoculeerd met 1 dosis van 104 TCID50 van de verzwakte Rockborn stam van CDV. De honden werden twee weken na de laatste inocula-tie geprovoceerd via intranasale inöculatie met een letale dosis van 104 TCID50 van de virulente Snyder Hill stam van CDV. Klinische reacties van de honden werden dagelijks gevolgd. De resultaten worden getoond in tabel 5.In order to determine whether non-replicating canarypox vectors expressing measles virus proteins would induce a protective immune response to CDV challenge, 10-week-old specifically pathogen-free beagles were inoculated with canarypox parent virus and recombinant canarypox viruses. Two dogs were inoculated simultaneously with two subcutaneous injections of 1 x 108 pfu from each recombinant at three week intervals. For comparison, one dog was inoculated according to the same scheme with each of the single vaccinia virus recombinants vP455 and vP557 and a combination of both. One dog was also inoculated intramuscularly with 1 dose of 10 5 TCID 50 of the attenuated Edmonston strain of MV. One dog was inoculated subcutaneously with 1 dose of 10 4 TCID 50 from the attenuated Rockborn strain of CDV. The dogs were challenged two weeks after the last inoculation via intranasal inoculation with a lethal dose of 10 4 TCID 50 of the virulent Snyder Hill strain of CDV. Clinical responses from the dogs were monitored daily. The results are shown in Table 5.

Tabel 5Table 5

Effecten van immunisatie op klinische symptomen na blootstelling van honden aan virulent CDV_Effects of immunization on clinical symptoms after exposure of dogs to virulent CDV_

Aantal dagen na inoculatie met virulent CDVNumber of days after inoculation with virulent CDV

Verhoogde Lymfo- VirusIncreased Lympho Virus

Immunisatie_Hond No. _Depressie_Gewichtsvërlies_lichaamstemp._penieb_isolatieImmunization_Dog _Depression_Weight loss_body temp._penieb_isolation

Kanariepokken- 9/1 4-10d 3-10 4,5,7,8 5-10 3-10 virus (CPV) 9/2 4-10d 7-10 4,5,7,8 3-10 3-10 VCP50 9/3 ND'5 7-10 5-7 5-7 7Canary Pox- 9/1 4-10d 3-10 4.5.7.8 5-10 3-10 Virus (CPV) 9/2 4-10d 7-10 4.5.7.8 3-10 3-10 VCP50 9/3 ND'5 7-10 5-7 5-7 7

9/4 ND 7 6,7 7 ND9/4 ND 7 6.7 7 ND

vCP40 9/5 4-10 3-10 4 5-10 5-7 9/6 4-6 3-10 4-6 5 5-7vCP40 9/5 4-10 3-10 4 5-10 5-7 9/6 4-6 3-10 4-6 5 5-7

VCP57 9/7 ND 7-10 5,6 5 NDVCP57 9/7 ND 7-10 5.6 ND

9/8 ND 7-10 4-7,10 7-10 5-7 VP455 9/9 6-8 7-10 4,5,8,9 5-10 3-109/8 ND 7-10 4-7.10 7-10 5-7 VP455 9/9 6-8 7-10 4.5.8.9 5-10 3-10

VP557 9/10 ND 3-10 ND ND NDVP557 9/10 ND 3-10 ND ND ND

vP455 & vP 557 9/11 ND 3-10 ND 5-7 NDvP455 & vP 557 9/11 ND 3-10 ND 5-7 ND

MV 9/12 ND 7-10 ND 5 5MV 9/12 ND 7-10 ND 5 5

Geen 9/13 4-10d 3-10 4-6 5-10 5-10 9/14 4-10“ 3-10 4-5 3-10 5-7 CDV-Ro_;_9/15_ND_ND_ND_;_ND_ ND_None 9/13 4-10d 3-10 4-6 5-10 5-10 9/14 4-10 “3-10 4-5 3-10 5-7 CDV-Ro _; _ 9 / 15_ND_ND_ND _; _ ND_ ND_

a) Hoger dan 39,5°Ca) Higher than 39.5 ° C

b) Minder dan 2 x 103 lymfocyten per mm3 c) Geïsoleerd uit cellen van de "buffy coat" samengekweekt met longmacrofagen van de hond op bekende wijze (Appel et al., 1967) d) Hond raakte gedehydreerd en werd uit zijn lijden verlost e) niet gedetecteerdb) Less than 2 x 10 3 lymphocytes per mm 3 c) Isolated from "buffy coat" cells cultured with dog lung macrophages in a known manner (Appel et al., 1967) d) Dog became dehydrated and released from suffering ) not detected

Bij geen van de honden werden ongunstige reacties op de vaccinatie opgemerkt tijdens het experiment. De twee honden die geïmmuniseerd waren met kanariepokken-oudervirus en twee niet-geïmmuniseerde controlehonden vertoonden ernstige ziekte na provocatie met virulent CDV. Alle vier honden raakten gedeprimeerd, vertoonden hoge lichaamstemperatuur, gewichtsverlies, lymfopenie en ernstige dehydratie. Met CDV-Rockborn geïmmuniseerde honden ontwikkelden in het serum neutraliserende antilichamen tegen CDV maar niet tegen MV vóór de provocatie eh overleefden de provocatie zonder symptomen. Met, verzwakt MV geïmmuniseerde honden ontwikkelden in het serum neutraliserende antilichamen tegen MV maar niet tegen CDV vóór de provocatie, en overleefden de provocatie met lichte verschijnselen van infectie. Honden die geïnoculeerd waren met vCP50, vCP57, vP557 of die gelijktijdig geïnoculeerd waren met vP455 en vP557 ontwikkelden in het serum significante hoeveelheden neutraliserend antilichaam tegen MV na 1 inoculatie en overleefden provocatie met slechts lichte verschijnselen van infectie.None of the dogs reported adverse reactions to vaccination during the experiment. The two dogs immunized with canarypox parent virus and two non-immunized control dogs showed severe disease after provocation with virulent CDV. All four dogs became depressed, showed high body temperature, weight loss, lymphopenia and severe dehydration. Dogs immunized with CDV-Rockborn developed neutralizing antibodies against CDV in the serum but not against MV before the provocation, and the provocation survived without symptoms. With, weakened MV immunized dogs developed neutralizing antibodies against MV but not against CDV in the serum before the challenge, and survived the challenge with mild symptoms of infection. Dogs inoculated with vCP50, vCP57, vP557 or co-inoculated with vP455 and vP557 developed significant amounts of neutralizing anti-MV antibody after inoculation in the serum and survived provocation with only mild signs of infection.

Voorbeeld 14 - AANVULLENDE KANARIEPOKKEN/MAZELENCONSTRUCTENExample 14 - ADDITIONAL CANARY PACKS / MEASURES CONSTRUCTS

Met verwijzing nu naar figuur 7 werden voor het genereren van een kanariepokkenvirusrecombinant met expressie van het MV HA-gen de volgende insertieplasmiden gevormd. Een EcoRV/EcoRI-fragment van 1,8 kbp van pRW837 met daarop de het meest aan de 3' -kant gelegen 26 bp van de H6 promotor, op precieze wijze gekoppeld aan het mazelen-HA, werd geligeerd aan een EcoRV/EcoRI-fragment van 3,2 kbp van pRW838. Het van pRW838 afkomstige fragment bevat het 5'-deel van de H6 promotor en flankerende armen van de C5-locus. Plasmiden pRW838 en pRW831 (zie hieronder) werden als volgt afgeleid.Referring now to Figure 7, the following insertion plasmids were generated to generate a canarypox virus recombinant expressing the MV HA gene. An 1.8 kbp Eco RV / Eco RI fragment from pRW837 with the Hb promoter 26 bp closest to the 3 'side, precisely coupled to the measles HA, was ligated to an Eco RV / Eco RI 3.2 kbp fragment of pRW838. The fragment from pRW838 contains the 5 'part of the H6 promoter and flanking arms of the C5 locus. Plasmids pRW838 and pRW831 (see below) were derived as follows.

Een PvuII-fragment van 880 bp van het kanariepok-kengenoom werd geïnserteerd tussen de PvuII-plaatsen van pUC9. Het resulterende plasmide werd pRW 764.5 genoemd. De nucleotidensequentie van het kanariepokkenfragment van 880 bp werd bepaald met behulp van de gemodificeerde T7 enzym Sequenase™ Kit (United States Biochemical, Cleveland, OH) volgens de specificaties van de fabrikant. Bij de sequen- cingreacties werd gebruik gemaakt van op maat gesynthetiseerde primers (17-18-meren), bereid met de Biosearch 8700 (San Rafael, CA) of Applied Biosystems 3800 (Foster City, CA) . Hierdoor werd de definitie van het open leesframe voor C5 mogelijk.An 880 bp PvuII fragment of the canarypox kengenome was inserted between the PvuII sites of pUC9. The resulting plasmid was named pRW 764.5. The nucleotide sequence of the 880 bp canarypox fragment was determined using the modified T7 enzyme Sequenase ™ Kit (United States Biochemical, Cleveland, OH) according to the manufacturer's specifications. The sequencing reactions used custom synthesized primers (17-18 lakes) prepared with the Biosearch 8700 (San Rafael, CA) or Applied Biosystems 3800 (Foster City, CA). This made the definition of the open reading frame for C5 possible.

Voor de specifieke deletie van het open leesframe voor C5 werd pRW764.5 gedeeltelijk geknipt met RsaX en het lineaire produkt werd geïsoleerd. Het lineaire Rsal-fragment werd opnieuw geknipt met BqlII en het fragment van pRW764.5 met een Rsal-BqlII-deletie van positie 156 tot positie 462 werd geïsoleerd en gebruikt als een vector voor de volgende synthetische oligonucleotiden: RW145 (SEQ ID NO:15): (5'-ACTCTCA- AAAGCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTTTTATAAA-3') RW146 (SEQ ID NO:16): (5'- GATCTTTATAAAAACTAGCTAGCTAGAATTCCCGGGAAGCTTTTGAGAGT - 3 1 ) Oligonucleotiden RW145 en RW146 werden "annealed" en geïnserteerd in de bovenbeschreven pRW764.5 Rsal-BglII-vector. Het resulterende plasmide is pRW831.For the specific deletion of the open reading frame for C5, pRW764.5 was partially cut with RsaX and the linear product was isolated. The linear Rsal fragment was rescaled with BqlII and the fragment of pRW764.5 with an Rsal-BqlII deletion from position 156 to position 462 was isolated and used as a vector for the following synthetic oligonucleotides: RW145 (SEQ ID NO: 15) ): (5'-ACTCTCA- AAAGCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTTTTATAAA-3 ') RW146 (SEQ ID NO: 16): (5'-GATCTTTATAAAAACTAGCTAGCTAGAATTCCCGGGAAGCTTTTGAGAGT - 3 1) Oligon45ot R4 waswg RW14 "R614 and R14" Rigon146 enw. -vector. The resulting plasmid is pRW831.

Dit C5-deletieplasmide werd geconstrueerd zonder onderbreking van andere open leesframes van kanariepokken-virus. De C5-coderende sequentie werd vervangen door de bovengenoemde "annealed" oligonucleotiden (RW145 en RW146) die de restrictieplaatsen voor HindiII. Smal en EcoRI bevatten.This C5 deletion plasmid was constructed without interruption from other open reading frames of canarypox virus. The C5 coding sequence was replaced with the aforementioned "annealed" oligonucleotides (RW145 and RW146) which are the restriction sites for HindiII. Narrow and EcoRI.

Het plasmide pRW838 werd afgeleid van pRW831 door de insertie van een Smal-fragment met daarop het Rabies G-gen (Taylor et al., 1988b) aan de 3'-kant naast de vaccini-avirus H6 promotor. Ligatie van het EcoRV/EcoRI-fragment van 1,8 kbp van pRW837 met het EcoRV/EcoRI-fragment van 3,2 kbp van pRW838 leidde tot de constructie van plasmide pRW 852. Plasmide pRW852 werd gebruikt in recombinatie-experimenten met een kanariepokkenisolaat, genaamd ALVAC, voor het verkrijgen van vCP85.' ALVAC is een uit een plaque gekloneerd isolaat van kanariepokkenvirus (CPV), afgeleid van de Rentschler stam, een in hoge mate verzwakte stam van CPV die gebruikt voor vaccinatie van kanaries. Replicatie van ALVAC en daarvan afgeleide recombinanten is beperkt tot vogelsoorten. Met imunoprecipitatieanalyse is bevestigd dat een eiwit van ongeveer 75 kd dat herkend wordt door een konijne-anti-HA serum, tot expressie gebracht wordt in CEF cellen die geïnfecteerd zijn met recombinant vCP85.The plasmid pRW838 was derived from pRW831 by the insertion of a Sma I fragment with the Rabies G gene (Taylor et al., 1988b) on the 3 'side next to the vaccine avirus H6 promoter. Ligation of the 1.8 kbp Eco RV / Eco RI fragment of pRW837 with the 3.2 kbp Eco RV / Eco RI fragment of pRW838 led to the construction of plasmid pRW 852. Plasmid pRW852 was used in recombination experiments with a canarypox isolate, called ALVAC, for obtaining vCP85. " ALVAC is a plaque cloned isolate of canarypox virus (CPV), derived from the Rentschler strain, a highly attenuated strain of CPV used for vaccination of canaries. Replication of ALVAC and recombinants derived therefrom is limited to bird species. It has been confirmed by imunoprecipitation analysis that a protein of approximately 75 kd recognized by a rabbit anti-HA serum is expressed in CEF cells infected with recombinant vCP85.

Met verwijzing nu naar figuur 8 werden voor het genereren van een kanariepokkenvirusrecombinant die zowel het HA-als het F-gen van MV bevat, de volgende constructen gebouwd. Er werden Smal-restrictieplaatsen toegevoegd aan de uiteinden van het door de H5 promotor gecontroleerde mazelen-fusiegen. Om dit te bereiken werd pRW823, dat pIBI25 met daarin de vacciniavirus H6 promotor is, stroomafwaarts van de promotorsequentie bij de Xbal-plaats geknipt. De uiteinden werden stomp gemaakt met het Klenow fragment van het E. coli DNA-polymerase in aanwezigheid van 2 mM dNTPs. Het van stompe uiteinden voorziene DNA werd vervolgens geknipt met Nrul om een fragment van 3,0 kbp vrij te maken dat de het meest aan de 5'-kant gelegen 100 bp van de H6 promotor bevat. Dit fragment werd geïsoleerd en geligeerd aan een van stompe uiteinden voorzien Eaol/Nrul-fragment van 1,7 kbp van pSPMF75. Het resulterende plasmide werd pRW841 genoemd.Referring now to Figure 8, the following constructs were built to generate a canarypox virus recombinant containing both the HA and F gene of MV. Sma I restriction sites were added to the ends of the measles fusion gene checked by the H5 promoter. To achieve this, pRW823, which is pIBI25 containing the vaccinia virus H6 promoter, was cut downstream of the promoter sequence at the Xbal site. The ends were blunted with the Klenow fragment of the E. coli DNA polymerase in the presence of 2 mM dNTPs. The blunt-ended DNA was then digested with Nrul to release a 3.0 kbp fragment containing the 5'-most 100 bp of the H6 promoter. This fragment was isolated and ligated to a blunt-ended Eaol / Nrul fragment of pSPMF75 of 1.7 kbp. The resulting plasmid was named pRW841.

Het door digestie van pRW841 verkregen Smal-fragment van 1,8 kbp werd geïnserteerd in de C5-deletievec-tor pRW831. Het plasmide pRW851 werd gelineariseerd op de EcoRI-plaats die aan de 3'-kant van het fusiegen gesitueerd is, en werd van stompe uiteinden voorzien met het Klenow fragment van het E. coli DNA-polymerase in aanwezigheid van 2 mM dNTPs. Het plasmide pRW837 met daarin het mazelen HA-gen aan de 3'-kant naast de H6 promotor sequenties, werd geknipt met HindiII en EcoRI en van stompe uiteinden voorzien met het Klenow fragment. Het resulterende fragment van 1,8 kbp werd geïsoleerd en geïnserteerd in pRW851 dat gelineariseerd was met EcoRI en van stompe uiteinden was voorzien. Het resulterende plasmide, dat beide genen bevat in een staart-staart-configuratie, werd pRW853A genoemd en werd gebruikt in in vitro recombinatie-experimenten met kanariepokken (ALVAC) als het ontvangende virus voor het genereren van vCP82, ook genoemd ALVAC-MV. Expressieanalyse met behulp van immunoprecipitatie en immunofluorescentie· bevestigde dat in cellen die geïnfecteerd waren met recom- binant vCP82 authentiek bewerkte HA- en F-eiwitten tot expressie werden gebracht. De recombinant was ook functioneel wat betreft celfusie-activiteit.The 1.8 kbp Smal fragment obtained by digestion of pRW841 was inserted into the C5 deletion vector pRW831. The plasmid pRW851 was linearized at the Eco RI site located on the 3 'side of the fusion gene, and was blunt-ended with the Klenow fragment of the E. coli DNA polymerase in the presence of 2 mM dNTPs. The plasmid pRW837 containing the measles HA gene on the 3 'side next to the H6 promoter sequences, was cut with HindIII and EcoRI and blunt-ended with the Klenow fragment. The resulting 1.8 kbp fragment was isolated and inserted into pRW851 that was linearized with Eco RI and blunted. The resulting plasmid, which contains both genes in a tail-to-tail configuration, was named pRW853A and was used in in vitro recombination experiments with canarypox (ALVAC) as the recipient virus for generating vCP82, also called ALVAC-MV. Expression analysis using immunoprecipitation and immunofluorescence confirmed that authenticated HA and F proteins were expressed in cells infected with recombinant vCP82. The recombinant was also functional with regard to cell fusion activity.

Resultaten van seroloqische analyse van sera van met ALVAC-MV (vCP82) aeinoculeerde konijnen en cavia's.Results of serological analysis of sera from rabbits and guinea pigs inoculated with ALVAC-MV (vCP82).

Vier cavia's werden langs subcutane weg geïnocu-leerd met ALVAC-MV (vCP82) . Twee dieren (026 en 027) ontvingen elk 1x10® pfu en twee dieren (028 en 029) ontvingen elk lxlO7 pfu. Na 28 dagen werden de dieren opnieuw geïnoculeerd met een identieke dosis. Twee konijnen werden geïnoculeerd met lxlO8 pfu ALVAC-MV (VCP82) langs subcutane weg. Na 28 dagen werden de dieren opnieuw geïnoculeerd met een identieke dosis. Seriële bloedmonsters van deze dieren werden geanalyseerd op mazelenvirus neutraliserende activiteit met behulp van ofwel een microtiterneutralisatietest beschreven door Appel en Robson (1973) of een plaque-reduc-tie neutralisatietest beschreven door Albrecht et al. (1981). Bovendien werden sera geanalyseerd op de aanwezigheid van antilichaam dat in staat was door mazelenvirus geïnduceerde cel-celfusie te blokkeren in een anti-fusie bepaling, uitgevoerd zoals beschreven door Merz et al. (1980).Four guinea pigs were inoculated subcutaneously with ALVAC-MV (vCP82). Two animals (026 and 027) each received 1x10® pfu and two animals (028 and 029) each received 1x10 7 pfu. After 28 days, the animals were re-inoculated with an identical dose. Two rabbits were inoculated with 1x10 8 pfu ALVAC-MV (VCP82) by subcutaneous route. After 28 days, the animals were re-inoculated with an identical dose. Serial blood samples from these animals were analyzed for measles virus neutralizing activity using either a microtiter neutralization test described by Appel and Robson (1973) or a plaque-reduction neutralization test described by Albrecht et al. (1981). In addition, sera were analyzed for the presence of antibody capable of blocking measles virus-induced cell-cell fusion in an anti-fusion assay performed as described by Merz et al. (1980).

De resultaten van de analyse op de aanwezigheid van mazelenvirus neutraliserend antilichaam in serum worden getoond in tabel 6 en 7. De beide cavia's (026 en 027) die lxlO8 pfu ALVAC-MV ontvingen, vertoonden seroconversie na één enkele inoculatie en de sera vertoonden een stijging in antilichaam na de booster-inbculatie. Eén dier (029) dat lxlO7 pfu ontving, vertoonde ook seroconversie na één inoculatie. Het vierde dier (028) vertoonde geen detecteerbare respons na één inoculatie maar bereikte gelijkwaardige titers na de tweede inoculatie.The results of the analysis for the presence of measles virus neutralizing antibody in serum are shown in Tables 6 and 7. Both guinea pigs (026 and 027) receiving 1x10 8 pfu ALVAC-MV showed seroconversion after a single inoculation and the sera showed an increase in antibody after the booster incubation. One animal (029) receiving 1x10 7 pfu also showed seroconversion after one inoculation. The fourth animal (028) showed no detectable response after one inoculation, but achieved equivalent titers after the second inoculation.

Konijnensera werden ook geanalyseerd met behulp van een plaque-reductie neutralisatiemethode. De resultaten worden getoond in tabel 7. Beide dieren vertoonden seroconversie na één inoculatie. Serum van konijn 036 werd getest met zowel de microtiterneutralisatietest als de plaque-reductie neutralisatietest. De bereikte titers waren vergelijkbaar bij gebruik van beide werkwijzen. Vermeld is dat een minimale neutraliserende titer van het serum van 1,2 tot 1,9 in gevaccineerde kinderen vereist is voor bescherming tegen ziekte (Lennon en Black, 1986; Black et al. 1984) . Aan de hand van deze criteria vertoonden alle dieren, behalve de ene cavia die geen seroconversie vertoonde tot de tweede inoculatie, een beschermend gehalte aan antilichamen na één inoculatie.Rabbit sera were also analyzed using a plaque-reduction neutralization method. The results are shown in Table 7. Both animals showed seroconversion after one inoculation. Serum from rabbit 036 was tested with both the microtiter neutralization test and the plaque-reduction neutralization test. The titers achieved were similar using both methods. It has been reported that a minimum neutralizing serum titer of 1.2 to 1.9 in vaccinated children is required for protection against disease (Lennon and Black, 1986; Black et al. 1984). Based on these criteria, all animals, except for one guinea pig that did not show seroconversion until the second inoculation, showed a protective level of antibodies after one inoculation.

Tabel 6Table 6

Serologische analyse van sera van cavia's, geïnoculeerd met ALVAC-MV (vCP82): Analyse uitgevoerd met microtiter serum neutralisatieassay.Serological analysis of guinea pig sera, inoculated with ALVAC-MV (vCP82): Analysis performed with microtiter serum neutralization assay.

a) niet getest.a) not tested.

b) Titer uitgedrukt als log10 van de reciproke van de laatste verdunning die volledige neutralisatie van het cytopathisch effect geeft.b) Titer expressed as log 10 of the reciprocal of the last dilution giving complete neutralization of the cytopathic effect.

c) Dieren kregen een booster 28 dagen na inoculatie.c) Animals received a booster 28 days after inoculation.

d) Dieren Ό26 en 027 kregen lxlO8 pfu.d) Animals Ό26 and 027 received 1x10 8 pfu.

e) Dieren 028 en 029 kregen lxlO7 pfu.e) Animals 028 and 029 received 1x10 7 pfu.

Tabel 7Table 7

Serologische analyse van sera van konijnen, geïnoculeerd met ALVAC-MV (vCP82)Serological analysis of rabbit sera, inoculated with ALVAC-MV (vCP82)

a) Titer uitgedrukt als lög10~ van de reciproke van de · laatste verdunning die een vermindering van 50% van het aantal plaques geeft vergeleken met pre-inoculatie serum.a) Titer expressed as lög10 ~ of the reciprocal of the · last dilution giving a 50% reduction in the number of plaques compared to pre-inoculation serum.

b) Dieren kregen een booster 28 dagen na inoculatie.b) Animals received a booster 28 days after inoculation.

c) Titer uitgedrukt als log10 van de reciproke van de laatste verdunning die een volledige neutralisatie van het cytophatiSch effect geeft.c) Titer expressed as log10 of the reciprocal of the last dilution that gives a complete neutralization of the cytophatic effect.

Eerdere studies hebben aangetoond dat een geïnactiveerd vaccin gepaard ging met een weinig doeltreffende bescherming en een versterkt ziektebeeld van mazelen bij opnieuw blootstellen aan het virus. Ontvangers van het geïnactiveerde vaccin vertoonden een afwezigheid van antilichamen tegen het fusie-eiwit en geopperd werd dat het inactiveringsproces het eiwit niet-immunogeen had gemaakt (Norrby en Gollmar, 1975; Norrby et al., 1975). Bovendien is voor andere paramyxovirussen aangetoond dat antilichaam tegen het F-eiwit de verspreiding van cel naar cel van het virus in weefselkweek kan remmen, terwijl antilichaam tegen de hemagglutinine component dat niet kan (Merz et al., 1980) .Previous studies have shown that an inactivated vaccine was accompanied by poorly effective protection and increased measles disease upon re-exposure to the virus. Recipients of the inactivated vaccine showed an absence of antibodies to the fusion protein and it was suggested that the inactivation process had made the protein non-immunogenic (Norrby and Gollmar, 1975; Norrby et al., 1975). In addition, for other paramyxoviruses, anti-F protein antibody has been shown to inhibit cell to cell spread of the virus in tissue culture, while anti-hemagglutinin component antibody cannot (Merz et al., 1980).

Het was derhalve van belang aan te tonen dat dieren de geïnoculeerd waren met ALVAC-MV (vCP82) antilichaam tegen de F-component konden induceren dat in staat was de overdracht van mazelenvirus van cel naar cel te blokkeren. De resultaten van deze anti-fusie-analyse worden getoond in tabel 8. Anti-fusie-activiteit was duidelijk in sera van zowel cavia's als konijnen die geïnoculeerd waren met ALVAC-MV (vCP82) . Het geanalyseerde serum werd 2 of 3 weken na de booster-inoculatie af genomen.· Er kon geen anti-fusie-activiteit gedetecteerd worden in sera van konijnen die geïnoculeerd waren met het ALVAC oudervirus.It was therefore important to demonstrate that animals that were inoculated with ALVAC-MV (vCP82) could induce anti-F-component antibody capable of blocking the transmission of measles virus from cell to cell. The results of this anti-fusion analysis are shown in Table 8. Anti-fusion activity was evident in sera from both guinea pigs and rabbits inoculated with ALVAC-MV (vCP82). The analyzed serum was taken 2 or 3 weeks after the booster inoculation · No anti-fusion activity could be detected in sera from rabbits inoculated with the ALVAC parental virus.

Tabel 8Table 8

Analyse van sera van cavia's en konijnen, geïnoculeerd met ALVAC-MV op anti-fusieactiviteit.Analysis of guinea pig and rabbit sera, inoculated with ALVAC-MV for anti-fusion activity.

a) Caviasera getest 7 weken na vaccinatie.a) Caviasera tested 7 weeks after vaccination.

b) Titer uitgedrukt als log10 van de reciproke van de hoogste verdunning die volledige remming van door mazelenvirus geïnduceerde celfusie-activiteit geeft.b) Titer expressed as log10 of the reciprocal of the highest dilution that gives complete inhibition of measles virus-induced cell fusion activity.

c) Konijnesera getest 6 weken na vaccinatie.c) Rabbit sera tested 6 weeks after vaccination.

In volgende tests voor het aantonen van de aanwezigheid van antilichaam tegen zowel het MV-hemagglutinine als het MV-fusie-eiwit in sera van dieren die geinoculeerd waren met ALVAC-MV, werden immunoprecipitatie-experimenten uitgevoerd. Aangetoond werd dat serum van met ALVAC-MV geïnoculeerde konijnen specifiek zowel het hemagglutinine-als het fusie-eiwit precipiteerde uit radioactief gemerkte lysaten van Vero cellen die geïnfecteerd waren met Emonston stam MV.In subsequent tests to detect the presence of antibody to both the MV hemagglutinin and the MV fusion protein in sera from animals inoculated with ALVAC-MV, immunoprecipitation experiments were performed. Serum from ALVAC-MV inoculated rabbits was shown to specifically precipitate both the hemagglutinin and fusion proteins from radio-labeled lysates of Vero cells infected with Emonston strain MV.

In een vergelijkbare studie werden groepen cavia's, konijnen en muizen geinoculeerd langs intramusculaire weg met ALVAC-MV., en werd hun serologische respons op mazelenvirus gevolgd met behulp van de hemagglutinatie-inhibitie (Hl) test. De serologische respons op kanariepok-kenvirus werd gevolgd met een ELI SA bepaling. In deze studie werden vijf cavia's geinoculeerd met 5,5 log10 TCID50, werden dertig muizen geinoculeerd met 4,8 log10 TCID50 en werden vijf konijnen geinoculeerd met 5,8 log10 TCID50. Alle dieren werden na 28 dagen opnieuw geinoculeerd met een equivalente dosis. Op gezette tijden werden bloedmonsters van de dieren genomen en werd hun respons op mazelenvirus bepaald met een Hl-bepaling. De detectielimiet van de Hl-bepaling komt overeen met een log10 titer van 1 en seropositieve (beschermde) kinderen worden geacht een serum titer te hebben in het bereik van 1,6-2,8. De resultaten van de analyse worden getoond in tabel 9, 10 en 11.In a similar study, groups of guinea pigs, rabbits, and mice were inoculated intramuscularly with ALVAC-MV., And their serological response to measles virus was monitored using the hemagglutination inhibition (H1) test. The serological response to canarypox virus was monitored with an ELI SA assay. In this study, five guinea pigs were inoculated with 5.5 log10 TCID50, thirty mice were inoculated with 4.8 log10 TCID50 and five rabbits were inoculated with 5.8 log10 TCID50. All animals were inoculated again after 28 days with an equivalent dose. Blood samples were taken from the animals at set times and their response to measles virus was determined with an H1 assay. The detection limit of the H1 determination corresponds to a log10 titer of 1 and seropositive (protected) children are considered to have a serum titer in the range of 1.6-2.8. The results of the analysis are shown in Tables 9, 10 and 11.

Sera van muizen werden geanalyseerd in groepen van vijf dieren (tabel 9). Alle dieren vertoonden een primaire respons op kanariepokkenvirus dat als een booster. werd gegeven na de tweede inoculatie. De muizen vertoonden geen respons op MV na één inoculatie. Drie van de zes. groepen vertoonden 8 weken na inoculatie titers binnen het beschermende bereik. Evenzo vertoonden alle cavia's (tabel 10) een respons op kanariepokkenvirus na één inoculatie die als een booster werd gegeven na de tweede inoculatie. Vier van de vijf dieren ontwikkelden anti-HI titers na één inoculatie, waarvan één in het beschermende bereik. Eén week na de tweede inoculatie waren de titers van alle dieren in het beschermende bereik. Deze titers bleven op peil tot en met 8 weken na inoculatie wanneer het experiment werd beëindigd. Alle konijnen (tabel 11) die geïnoculeerd waren met ALVAC-MV (vCP82) vertoonden een serologische respons op inoculatie met kanariepokken. Vier van de vijf dieren vertoonden seroconversie op mazelenvirus na één inoculatie. (één in het beschermende bereik) . De serumtiters van alle dieren lagen 1 week na de tweede inoculatie in het bescher-mènde bereik.Sera from mice were analyzed in groups of five animals (Table 9). All animals showed a primary response to canarypox virus as a booster. was given after the second inoculation. The mice did not respond to MV after one inoculation. Three out of six. groups showed titers within the protective range 8 weeks after inoculation. Similarly, all guinea pigs (Table 10) showed a response to canarypox virus after one inoculation given as a booster after the second inoculation. Four of the five animals developed anti-HI titers after one inoculation, one of which in the protective range. One week after the second inoculation, the titers of all animals were in the protective range. These titers were maintained up to and including 8 weeks after inoculation when the experiment was terminated. All rabbits (Table 11) inoculated with ALVAC-MV (vCP82) showed a serological response to inoculation with canarypox. Four out of five animals showed measles virus seroconversion after one inoculation. (one in the protective range). The serum titers of all animals were in the protected range 1 week after the second inoculation.

Tabel 9Table 9

Serologische respons van muizen op inoculatie met ALVAOMVSerological response of mice to inoculation with ALVAOMV

(vCP82).(vCP82).

Anti-kanariepokkenresponsAnti-canarypox response

Ant i-ma zelenresponsAnt i-ma soul response

_______ , al Bij groepen van vijf muizen werd bloed afgenomen en werden de sera samengevoegd._______, Blood was collected from groups of five mice and the sera were pooled.

b) Optische dichtheid in een ELISA-bepaling van 1:800 verdund serum.b) Optical density in an ELISA determination of 1: 800 diluted serum.

c) .Detectielimiet in Hl-test komt overeen met een log10 titer van 1, dat wil zeggen een 1:10 verdunning. Titer uitgedrukt als log10 van de reciproke van de hoogste verdunning die remming van de hemagglutinatie geeft.c). Detection limit in H1 test corresponds to a log10 titer of 1, ie a 1:10 dilution. Titer expressed as log10 of the reciprocal of the highest dilution that gives inhibition of hemagglutination.

Tabel 10Table 10

Serologische respons van cavia's op inoculatie met ALVAC-MVSerological response of guinea pigs to inoculation with ALVAC-MV

(vCP82).(vCP82).

Anti-kanar iepokkenresponsAnti-canary pox response

__

Anti-mazelenresponsAnti measles response

¥) Optische dichtheid in een ELISA-bepaling van 1:3200 verdund serum.¥) Optical density in an ELISA assay of 1: 3200 diluted serum.

b) Detectielimiet in Hl- test komt overeen met een log10 titer van 1, dat wil zeggen een 1:10 verdunning. Titer uitgedrukt zoals in legende bij tabel 9.b) Detection limit in H1 test corresponds to a log10 titer of 1, ie a 1:10 dilution. Titer expressed as in legend to table 9.

Tabel 11 .Serologische respons van konijnen op inoculatie met ALVAC- MV (vCP2).Table 11. Serological response of rabbits to inoculation with ALVAC-MV (vCP2).

Ant i-kanarieookkenre sponsAnt i canary smoke sponge

Anti-mazelenresponsAnti measles response

a) Optische dichtheid in een ELISA-bepaling van 1:1600 ' verdund serum.a) Optical density in an ELISA assay of diluted 1: 1600 'serum.

b) Detectielimiet in Hl-test komt overeen met een log10 titer van 1, dat wil zeggen een 1:10 verdunning. Titer uitgedrukt zoals in legende bij tabel 9.b) H1 test detection limit corresponds to a log10 titer of 1, ie a 1:10 dilution. Titer expressed as in legend to table 9.

Resultaten van serolocrische analyse van sera van doodshoofdaapjes. geïnoculeerd met ALVAC-MV (vCP82): invloed van eerdere blootstelling aan pokkenvirus op inductie van een mazelenvirus-specifieke immuunrespons.Results of serolocrian analysis of sera from squirrel monkeys. inoculated with ALVAC-MV (vCP82): influence of previous exposure to smallpox virus on induction of measles virus-specific immune response.

Negen doodshoofdaapjes (Saimiri sciureus) werden geïnoculeerd met ALVAC-MV (vCP82). Alle aapjes waren niet eerdere blootgesteld geweest aan mazelenvirus. Zeven van de aapjes waren in het verleden blootgesteld aan vacciniavirus en/of kanariepokkenvirus. Het verleden van de immunisatie wordt getoond in tabel 12. Alle aapjes werden geïnoculeerd met l dosis van 5,8 log10 pfu langs subcutane weg. Vier van de dieren (#39, 42, 53 en 58) werden 15 weken na de primaire inoculatie opnieuw geïnoculeerd met een equivalente dosis. Anti-mazelen antilichaam werd gemeten met de Hl test. De resultaten worden getoond in tabel 12.Nine skulls (Saimiri sciureus) were inoculated with ALVAC-MV (vCP82). All monkeys had not previously been exposed to measles virus. Seven of the monkeys were exposed to vaccinia virus and / or canarypox virus in the past. The past of the immunization is shown in Table 12. All monkeys were inoculated with 1 dose of 5.8 log10 pfu by subcutaneous route. Four of the animals (# 39, 42, 53 and 58) were re-inoculated with an equivalent dose 15 weeks after primary inoculation. Anti-measles antibody was measured with the H1 test. The results are shown in Table 12.

Na de eerste inoculatie vertoonden twee van de negen aapjes een lage respons op inoculatie met ALVAC-MV. Na de tweede inoculatie vertoonden alle vier opnieuw geïnoculeerde aapjes seroconversie met significante antili-chaamtiters in het voor beschermende immuniteit vereiste bereik. De bereikte titers waren equivalent ongeacht of het aapje in het verleden blootgesteld was geweest aan vacciniavirus en ALVAC of geen eerdere blootstelling aan pokkenvirus had.After the first inoculation, two of the nine monkeys showed a low response to inoculation with ALVAC-MV. After the second inoculation, all four re-inoculated monkeys showed seroconversion with significant antibody titers in the range required for protective immunity. The titers achieved were equivalent regardless of whether the monkey had been exposed to vaccinia virus and ALVAC in the past or had no prior exposure to smallpox virus.

Tabel 12Table 12

Inoculatie van doodshoofdaapjes met ALVAC-MV (vCP82): Immuunrespons in aanwezigheid van reeds bestaande ALVAC immuniteit.Inoculation of squirrel monkeys with ALVAC-MV (vCP82): Immune response in the presence of pre-existing ALVAC immunity.

a) Dieren kregen 5,8 log10 pfu s.c. " ’ b) Dieren 39, 42, 52 en 53 kregen een booster met een identieke dosis 15 weken na de eerste inoculatie.a) Animals received 5.8 log10 pfu s.c. "’ B) Animals 39, 42, 52 and 53 received a booster with an identical dose 15 weeks after the first inoculation.

Voorbeeld 15 - VERZWAKTE VACCINIA VACCINSTAM NYVACExample 15 - WEAKENED VACCINIA VACCINSTAM NYVAC

Om een nieuwe vaccinia-vaccinstam te ontwikkelen werd de Copenhagen vaccinstam van vacciniavirus gemodificeerd door de deletie van zes niet-essentiële gebieden van het genoom die coderen voor bekende of potentiële virulen-tiefactoren. De achtereenvolgende deleties worden hieronder in detail beschreven. Alle aanduidingen van vaccinia restrictiefragmenten, open leesframes en nucleotideposities zijn gebaseerd op de door Goebel et al. (1990a,b) vermelde terminologie.To develop a new vaccinia vaccine strain, the Copenhagen vaccinia virus vaccine strain was modified by the deletion of six non-essential regions of the genome encoding known or potential virulence factors. The successive deletions are described in detail below. All indications of vaccinia restriction fragments, open reading frames and nucleotide positions are based on the terminology mentioned by Goebel et al. (1990a, b).

De deletie-loei werden ook geconstrueerd . als ontvanger-loei voor de insertie van vreemde genen.The deletion loci were also constructed. as a recipient loci for the insertion of foreign genes.

De achtereenvolgens door deletie verwijderde gebieden in NYVAC worden hieronder gegeven. Ook gegeven worden de afkortingen en aanduidingen van de open leesframes voor de verwijderde gebieden (Goebel et al.,1990a,b) en de aanduiding van de vacciniarecombinant (vP) die alle deleties tot en met de gespecificeerde deletie bevat: (1) thymidinekinase-gen (TK; J2R) vP410; (2) hemorrhagisch gebied (u; B13R+B14R) vP553; (3) A type "inclusion body" gebied (ATI; A26L) vP618; (4) hemagglutinine-gen (HA; A56R) vP723; (5) gastheerbereikgenengebied (C7L-K1L) vP804; en (6) grote subunit van ribonucleotidereductase (I4L) vP866 (NYVAC).The successively deleted areas in NYVAC by deletion are given below. Also given are the abbreviations and designations of the open reading frames for the deleted regions (Goebel et al., 1990a, b) and the designation of the vaccinia recombinant (vP) which contains all deletions up to the specified deletion: (1) thymidine kinase gene (TK; J2R) vP410; (2) hemorrhagic region (u; B13R + B14R) vP553; (3) A type "inclusion body" region (ATI; A26L) vP618; (4) hemagglutinin gene (HA; A56R) vP723; (5) host range gene region (C7L-K1L) vP804; and (6) large subunit of ribonucleotide reductase (I4L) vP866 (NYVAC).

DNA-klonerinq en -synthese.DNA cloning and synthesis.

Plasmiden werden geconstrueerd, gescreend en gekweekt met standaardwerkwijzen (Maniatis et al., 1986; Perkus et al., 1985; Piccini et al., 1987). Restrictie-endonucleasen werden verkregen van GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD, New England Biolabs, Beverly, MA; en Boehringer Mann-heim Biochemicals, Indianapolis, IN. Klenow fragment van E. coli polymerase werd verkregen van Boehringer Mannheim Biochemicals. BAL-31 exonuclease en faag T4 DNA-ligase werden verkregen van New England Biolabs. De reagentia werden gebruikt volgens de specificatie van de diverse leveranciers.Plasmids were constructed, screened and cultured by standard methods (Maniatis et al., 1986; Perkus et al., 1985; Piccini et al., 1987). Restriction endonucleases were obtained from GIBCO / BRL, Gaithersburg, MD, New England Biolabs, Beverly, MA; and Boehringer Mann-heim Biochemicals, Indianapolis, IN. Klenow fragment of E. coli polymerase was obtained from Boehringer Mannheim Biochemicals. BAL-31 exonuclease and phage T4 DNA ligase were obtained from New England Biolabs. The reagents were used according to the specifications of the various suppliers.

Synthetische oligodeoxyribonucleotiden werden bereid op een Biosearch 8750 of Applied Biosystems 380B DNA synthesizer zoals eerder beschreven (Perkus et al., 1989). DNA-sequencing werd uitgevoerd met de dideoxy-ketenbeëin-digingsmethode (Sanger et al., 1977) met behulp van Seque-nase (Tabor et al., 1987) zoals eerder beschreven (Guo et al.,1989). DNA-amplificatie met de polymerase-kettingreactie (PCR) voor het verifiëren van de sequentie (Engelke et al.,1988) werd uitgevoerd met behulp van op maat gesynthetiseerde oligonucleotideprimers en GeneAmp DNA amplifi-cation Reagent Kit (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) in een geautomatiseerde Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler. Overtollige DNA-sequenties werden uit plasmiden verwijderd door digestie met restrictie-edonuclease, gevolgd door beperkte digestie met BAL-31 exonuclease en mutagenese (Mandecki, 1986) met behulp van synthetische oligonucleoti-den.Synthetic oligodeoxyribonucleotides were prepared on a Biosearch 8750 or Applied Biosystems 380B DNA synthesizer as previously described (Perkus et al., 1989). DNA sequencing was performed by the dideoxy chain termination method (Sanger et al., 1977) using Sequence (Tabor et al., 1987) as previously described (Guo et al., 1989). DNA amplification with the polymerase chain reaction (PCR) for sequence verification (Engelke et al., 1988) was performed using custom-synthesized oligonucleotide primers and GeneAmp DNA amplification Reagent Kit (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT ) in an automated Perkin Elmer Cetus DNA Thermal Cycler. Excess DNA sequences were removed from plasmids by digestion with restriction edonuclease, followed by limited digestion with BAL-31 exonuclease and mutagenesis (Mandecki, 1986) using synthetic oligonucleotides.

Cellen, virus en transfectie.Cells, virus and transfection.

De oorsprong en kweekomstandigheden van de Copen-hagenstam van vacciniavirus zijn eerder beschreven (Guo et al.,1989). Het genereren van recombinant virus door recom-binatie, in situ hybridisatie van nitrocellulosefilters en het screenen op Beta-galactosidase-activiteit zijn zoals eerder beschreven (Panicali-et al., 1982; Perkus et al., 1989).The origin and culture conditions of the Copen hedge strain of vaccinia virus have been previously described (Guo et al., 1989). The generation of recombinant virus by recombination, in situ hybridization of nitrocellulose filters and screening for Beta-galactosidase activity are as previously described (Panicali-et al., 1982; Perkus et al., 1989).

Constructie van plasmide PSD460 voor deletie van thvmidinekinase-qen (J2R)Construction of plasmid PSD460 for deletion of thvmidine kinase (J2R)

Met verwijzing nu naar figuur 9 bevat plasmide pSD406 vaccinia HindiII J (pos. 83359-88377) gekloneerd in pUC8. pSD406 werd geknipt met Hindi II en PvuII, en het fragment van l,7kb van de linkerkant van HindiII J werd gekloneerd in pUC8 dat geknipt was met HindiII/Smal. waarmee pSD447 werd gevormd. pSD447 bevat het complete gen voor J2R (pos. 83855-84385). Het initiatiecodon bevindt zich in een NlalII-plaats en het terminatiecodon bevindt zich in een Sspl-plaats. De richting van de transcriptie wordt aangegeven met een pijl in figuur 9.Referring now to Figure 9, plasmid pSD406 contains vaccinia HindiII J (pos. 83359-88377) cloned into pUC8. pSD406 was cut with Hindi II and PvuII, and the 1.7kb fragment from the left side of HindiII J was cloned into pUC8 that was cut with HindiII / Smal. with which pSD447 was formed. pSD447 contains the complete gene for J2R (pos. 83855-84385). The initiation codon is in an N11II site and the termination codon is in an Ssp1 site. The direction of the transcription is indicated with an arrow in Figure 9.

Om een flankerende arm aan de linkerkant te verkrijgen werd een HindiII-EcoRIfragment van 0,8 kb geïsoleerd uit pSD447, daarna geknipt met NlalII en werd eenTo obtain a flanking arm on the left, a 0.8 kb HindiII EcoRI fragment was isolated from pSD447, then cut with NlalII and a

HindiII/NlalII-fragment van 0,5 kb geïsoleerd. "Annealed" synthetische oligonucleotiden MPSYN43/MPSYN44 (SEQ ID NO :17/SEQ ID NO:18)0.5 kb HindiII / NlIIII fragment isolated. "Annealed" synthetic oligonucleotides MPSYN43 / MPSYN44 (SEQ ID NO: 17 / SEQ ID NO: 18)

Smal MPSYN43 5' TAATTAACTAGCTACCCGGG 3' MPSYN44 3 ' GTACATTAATTGATCGATGGGCCCTTAA 5'Narrow MPSYN43 5 'TAATTAACTAGCTACCCGGG 3' MPSYN44 3 'GTACATTAATTGATCGATGGGCCCTTAA 5'

NlalII EcoRIN11 II Eco RI

werden met het HindiII/NlalII-fracrment van 0,5 kb geligeerd in pUCl8 vectorplasmide dat geknipt was met HindiII-EcoRI, waarmee plasmide pSD449 werd gegenereerd.were ligated with the 0.5 kb HindiII / NalIIII fragment into pUC18 vector plasmid digested with HindiII-EcoRI, generating plasmid pSD449.

Om een restrictiefragment te verkrijgen met een flankerende arm van vaccinia aan de rechterkant en vector-sequenties van pUC, werd pSD447 geknipt met SspI (gedeeltelijk) binnen vacciniasequenties en met HindiII bij de PUC/vaccinia-verbinding, en werd een vectorfragment van 2,9 kb geïsoleerd. Dit vectorfragment werd geligeerd met "annealed" synthethische oligonucleotide MPSYN45/MPSYN46 (SEQ ID NO:19/SEQ ID NO:20)To obtain a restriction fragment with a flanking right arm of vaccinia and vector sequences of pUC, pSD447 was digested with SspI (partially) within vaccinia sequences and with HindiII at the PUC / vaccinia compound, and a vector fragment of 2.9 kb isolated. This vector fragment was ligated with "annealed" synthetic oligonucleotide MPSYN45 / MPSYN46 (SEQ ID NO: 19 / SEQ ID NO: 20)

HindiII SmalHindiII Narrow

MPSYN45 5' AGCTTCCCGGGTAAGTAATACGTCAAGGAGAAAACGAA MPSYN46 3' AGGGCCCATTCATTATGCAGTTCCTCTTTTGCTTMPSYN45 5 'AGCTTCCCGGGTAAGTAATACGTCAAGGAGAAAACGAA MPSYN46 3' AGGGCCCATTCATTATGCAGTTCCTCTTTTGCTT

Not I SspINot I SspI

ACGATCTGTAGTTAGCGGCCGCCTAATTAACTAAT 31 MPSYN45 TGCTAGACATCAATCGCCGGCGGATTAATTGATTA 5' MPSYN46 waarmee pSD459 werd gegenereerd.ACGATCTGTAGTTAGCGGCCGCCTAATTAACT 31 MPSYN45 TGCTAGACATCAATCGCCGGCGGATTAATTGATTA 5 'MPSYN46 with which pSD459 was generated.

Om de linker en rechter flankerende armen te combineren tot één plasmide werd een HindiII/Smal-fragment van 0,5 kb geïsoleerd uit pSD449 en geligeerd met pSD459 vector plasmide dat geknipt was met HindiII/Smal. waarmee' plasmide pSD460 werd gegenereerd. pSD460 werd gebruikt als donorplasmide voor recombinatie met wild type vaccinia oudervirus Copenhagen stam VC-2. 32P-gemerkte probe werd gesynthetiseerd door ketenverlenging van de primer met behulp van MPSYN45 (SEQ ID NO: 19) als template en het complementaire 20-meer oligonucleotide MPSYN47 (SEQ ID . NO:21) (5'-TTAGTTAATTAGGCGGCCGC-3') als primer. Recombinant virus vP410 werd geïdentificeerd met plaque-hybridisatie.To combine the left and right flanking arms into one plasmid, a 0.5 kb HindiII / Smal fragment was isolated from pSD449 and ligated with pSD459 vector plasmid digested with HindiII / Smal. with which plasmid pSD460 was generated. pSD460 was used as a donor plasmid for recombination with wild-type vaccinia parental virus Copenhagen strain VC-2. 32 P-labeled probe was synthesized by chain extension of the primer using MPSYN45 (SEQ ID NO: 19) as a template and the complementary 20-mer oligonucleotide MPSYN47 (SEQ ID. NO: 21) (5'-TTAGTTAATTAGGCGGCCGC-3 ') as primer. Recombinant virus vP410 was identified by plaque hybridization.

Constructie van plasmide PSD486 voor deletie van het hemorhaqische gebied (B13R +B14R)Construction of plasmid PSD486 for deletion of the haemorrhagic region (B13R + B14R)

Met verwijzing nu naar figuur 10 bevat plasmide pSD419 vaccinia Sall G (pos. 160.744-173.351) gekloneerd in pUC8. pSD422 bevat het aangrenzende vaccinia Sall-fragment aan de rechterkant, Sall J (pos. 173.351-182.746) gekloneerd in pUC8. Om een plasmide te construeren met deletie van het hemorrhagische gebied, u,B13R-B14R (pos. 172.549-173.552), werd pSD419 gebruikt als de bron voor de linker flankerende arm en werd pSD422 gebruikt als de bron voor de rechter flankerende arm. De richting van transcriptie voor het u gebied wordt aangegeven met een pijl in figuur 10.With reference now to Figure 10, plasmid pSD419 contains vaccinia SalI G (pos. 160,744-173,351) cloned into pUC8. pSD422 contains the adjacent vaccinia Sall fragment on the right, Sall J (pos. 173,351-182,746) cloned into pUC8. To construct a plasmid with deletion of the hemorrhagic region, u, B13R-B14R (pos. 172,549-173,552), pSD419 was used as the source for the left flanking arm and pSD422 was used as the source for the right flanking arm. The direction of transcription for the u region is indicated by an arrow in Figure 10.

Om ongewenste sequenties uit pSD419 te verwijderen werden sequenties links van de Ncol-plaats (pos. 172.-253) verwijderd door digestie van pSD419 met Ncol/Smal gevolgd door stompmaken van de uiteinden met Klenow fragment van E. coli polymerase en ligatie, waarmee plasmide pSD476 werd gegenereerd. Een rechter flankerende arm van vaccinia werd verkregen door digestie van pSD422 met Hoal bij het terminatiecodon van B14R en door digestie met Nrul 0,3 kb rechts daarvan. Dit fragment van 0,3 kb werd geïsoleerd en geligeerd met een HincII-vectorfragment van 3,4 kb, geïsoleerd uit pSD476, waarmee plasmide pSD477 werd gegenereerd. De plaats van de gedeeltelijke deletie van het vaccinia u gebied in pSD477 wordt aangegeven met een driehoek. De resterende B13R coderende sequenties in pSD477 werden verwijderd door digestie met Clal/Hpal en het resulterende vectorfragment werd geligeerd met "annealed" synthetische oligonucleotiden SD22mer/SD20mer (SEQ ID NO :.22/SEQ ID NO: 23)To remove unwanted sequences from pSD419, sequences to the left of the Ncol site (pos. 172.-253) were removed by digesting pSD419 with Ncol / Smal followed by blunting the ends with Klenow fragment of E. coli polymerase and ligation, thereby plasmid pSD476 was generated. A right flanking vaccinia arm was obtained by digestion of pSD422 with Hoal at the termination codon of B14R and by digestion with Nrul 0.3 kb to the right. This 0.3 kb fragment was isolated and ligated with a 3.4 kb HincII vector fragment isolated from pSD476, thereby generating plasmid pSD477. The partial deletion site of the vaccinia u region in pSD477 is indicated by a triangle. The remaining B13R coding sequences in pSD477 were removed by digestion with Clal / Hpal and the resulting vector fragment was ligated with "annealed" synthetic oligonucleotides SD22mer / SD20mer (SEQ ID NO: 22 / SEQ ID NO: 23)

Clal BamHI Hoal SD22mer 5' CGATTACTATGAAGGATCCGTT 3' SD20mer 3' TAATGATACTTCCTAGGCAA 5' waarmee pSD479 werd gegenereerd. pSD479 bevat een initia-tiecodon (onderstreept) gevolgd door een BamHI-plaats. Om Beta-galactosidase van E. coli te plaatsen in de B13-B14 (u) deletielocus onder controle van de u promotor werd een BamHI-fragment van 3,2 kb met daarop het Beta-galactosida-se-gen (Shapira et al., 1983) geïnserteèrd in de BamHI-plaats van pSD479, waarmee pSD479BG werd gegenereerd. pSD 479BG werd gebruikt als donorplasmide voor recombinatie met vacciniavirus vP410. Recombinant vacciniavirus vP533 werd geïsoleerd als een blauwe plaque in aanwezigheid van chromogeen substraat X-gal. In vP533 is het B13R-B14R gebied verwijderd en vervangen door Beta-galactosidase. Om Beta-galactosidasesequenties uit vP533 te verwijderen werd plasmide pSD486 gebruikt, en derivaat van pSD477 met een polylinkergebied maar geen initiatiecodon bij de verbinding met de u deletie. Eerst werd het bovengenoemde Clal/Hpal-vectorfragment uit pSD477 geligeerd met "annealed" synthetische oligonucleotiden SD42mer/SD40mer (SEQ ID N0:24/SEQ ID NO:25)Clal BamHI Hoal SD22mer 5 'CGATTACTATGAAGGATCCGTT 3' SD20mer 3 'TAATGATACTTCCTAGGCAA 5' with which pSD479 was generated. pSD479 contains an initiation codon (underlined) followed by a Bam HI site. To place E. coli Beta-galactosidase in the B13-B14 (u) deletion focus under the control of the u promoter, a 3.2 kb Bam HI fragment bearing the Beta-galactosidase gene (Shapira et al. , 1983) inserted into the Bam HI site of pSD479, thereby generating pSD479BG. pSD 479BG was used as a donor plasmid for recombination with vaccinia virus vP410. Recombinant vaccinia virus vP533 was isolated as a blue plaque in the presence of chromogenic substrate X-gal. In vP533, the B13R-B14R region has been deleted and replaced with Beta-galactosidase. To remove Beta-galactosidase sequences from vP533, plasmid pSD486 was used, and derivative of pSD477 with a polylinker region but no initiation codon in the u deletion compound. First, the above Clal / Hpal vector fragment from pSD477 was ligated with "annealed" synthetic oligonucleotides SD42mer / SD40mer (SEQ ID NO: 24 / SEQ ID NO: 25)

Clal SacI Xhol Hpal SD42mer 5' CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGATCCGTT 3' SD40mer 3' TAATGATCTAGACTCGAGGGGCCCGAGCTCCCTAGGCAA 51Clal SacI Xhol Hpal SD42mer 5 'CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGATCCGTT 3' SD40mer 3 'TAATGATCTAGACTCGAGGGGCCCGAGCTCCCTAGGCAA 51

BcrlII Smal BamHIBcr11. Narrow BamHI

waarmee plasmide pSD478 werd gegenereerd. Vervolgens werd de EcoRI-plaats bij de pUC/vaccinia-verbinding vernietigd door digestie van pSD478 met EcoRI. gevolgd door het voorzien van stompe uiteinden met Klenow fragment van E. coli polymerase en ligatie, waarmee plasmide pSD478E’ werd gegenereerd. pSD478E" werd geknipt met BamHI en Hpal en geligeerd met "annealed" synthetische oligonuncleotiden. HEM5/HEM6 (SEQ ID NO:26/SEQ ID NO:27)with which plasmid pSD478 was generated. Subsequently, the Eco RI site at the pUC / vaccinia compound was destroyed by digestion of pSD478 with Eco RI. followed by blunt ends with Klenow fragment of E. coli polymerase and ligation, thereby generating plasmid pSD478E ". pSD478E "was cut with BamHI and Hpal and ligated with" annealed "synthetic oligonucleotides. HEM5 / HEM6 (SEQ ID NO: 26 / SEQ ID NO: 27)

BamHI EcoRI Hpal HEM5 5' GATCCGAATTCTAGCT 3' HEM6 3 ' GCTTAAGATCGA 5' waarmee plasmide pSD486 werd gegenereerd. pSD486 werd gebruikt als donorplasmide voor recombinatie met recombinant vacciniavirus vP533, onder vorming van vP553, dat geïsoleerd werd als een kleurloze plaque in aanwezigheid van X-gal.BamHI EcoRI Hpal HEM5 5 'GATCCGAATTCTAGCT 3' HEM6 3 'GCTTAAGATCGA 5' with which plasmid pSD486 was generated. pSD486 was used as a donor plasmid for recombination with recombinant vaccinia virus vP533, forming vP553, which was isolated as a colorless plaque in the presence of X-gal.

Constructie van plasmide pMP494a voor deletie van het ATI gebied (A26L)Construction of plasmid pMP494a for deletion of the ATI region (A26L)

Met verwijzing nu naar figuur 11 bevat pSD414 Sall B, gekloneerd in pUC8. Om ongewenste DNA-sequenties links van het A26L gebied te verwijderen werd pSD414 geknipt met Xbal in vacciniasequenties (pos. 137.079) en. met HindiII bij de pUC/vaccinia verbinding, vervolgens van stompe uiteinden voorzien met Klenow fragment van E. coli polymerase en geligeerd, wat resulteerde in plasmide pSD483. Om ongewenste vaccinia DNA-sequenties rechts van het A26LReferring now to Figure 11, pSD414 contains SalI B cloned into pUC8. To remove unwanted DNA sequences to the left of the A26L region, pSD414 was digested with Xbal in vaccinia sequences (pos. 137,079) and. with HindiII at the pUC / vaccinia compound, then blunt-ended with Klenow fragment of E. coli polymerase and ligated, resulting in plasmid pSD483. To remove unwanted vaccinia DNA sequences to the right of the A26L

gebied te verwijderen werd pSD483 geknipt met EcoRI (pos. 140.665 en bij de pCU/vaccinia verbinding) en geligeerd, onder vorming van plasmide pSD484. Om het coderende gebied van A26L te verwijderen werd pSD484 geknipt met Ndel (gedeeltelijk) enigszins stroomopwaarts van het A26L ORF (pos. 139.004) en met Hpal (pos. 137.889) enigszins stroomafwaarts van het A26L ORF. Het vectorfragment van 5,2 kb werd geïsoleerd en geligeerd met "annealed" synthetische oligonucleotiden AT13/AT14 (SEQ ID NO:28/SEQ ID NO:29)To remove the region, pSD483 was digested with EcoRI (pos. 140,665 and with the pCU / vaccinia compound) and ligated to form plasmid pSD484. To remove the coding region of A26L, pSD484 was cut with NdeI (partially) slightly upstream of the A26L ORF (pos. 139,004) and with Hpal (pos. 137,889) slightly downstream from the A26L ORF. The 5.2 kb vector fragment was isolated and ligated with annealed synthetic oligonucleotides AT13 / AT14 (SEQ ID NO: 28 / SEQ ID NO: 29)

NdelNdel

ATI 3 5 ' TATGAGTAACTTAACTCTTTTGTTAATTAAAAGTATATTCAAAAAATAAGT ATI4 3 1 ACTCATTGAATTGAGAAAACAATTAATTTTCATATAAGTTTTTTATTCAATI 3 5 'TATGAGTAACTTAACTCTTTTGTTAATTAAAAGTATATTCAAAAAATAAGT ATI4 3 1 ACTCATTGAATTGAGAAAACAATTAATTTTCATATAAGTTTTTTTTTCA

BglII EcoRI Hpal TATATAAATAGATCTGAATTCGTT 3 1 ATI 3 ATATATTTATCTAGACTTAAGCAA 5’ ATI 4 waardoor het gebied stroomopwaarts van A26L werd gereconstrueerd en het A26L ORF werd vervangen door een kort polylinkergebied met de restrictieplaatsen BglII, EcoRI en Hpal. zoals boven aangegeven. Het resulterende plasmide werd pSD485 genoemd. Omdat de BglII- en EcoRI-plaatsen in het polylinkergebied van pSD485 niet uniek zijn, werden ongewenste BglII- en EcoRI-plaatsen uit plasmide pSD483 (bovenbeschreven) verwijderd door digestie met BglII (pos. 140.136) en met EcoRI bij de pUC/vaccinia verbinding, gevolgd door voorzien van stompe uiteinden met Klenow fragment van E. coli polymerase en ligatie. Het resulterende plasmide werd pSD489 genoemd. Het Clal (pos. 137.198)/E-coRV (pos. 139.048)-fragment van 1,8 kb van pSD489 met het A26L ORF werd vervangen door het overeenkomstige polylinker bevattende Clal/EcoRV-fragment van 0,7 kb van pSD485, waarmee pSD492 werd gegenereerd. De BglII- en EcoRV-plaat-sen in het polylinkergebied van pSD492 zijn uniek.BglII EcoRI Hpal TATATAAATAGATCTGAATTCGTT 3 1 ATI 3 ATATATTTATCTAGACTTAAGCAA 5 ’ATI 4 whereby the upstream of A26L was reconstructed and the A26L ORF was replaced by a short polylinker area with the restriction sites BglII, EcoRI and Hpal. as indicated above. The resulting plasmid was named pSD485. Because the BglII and EcoRI sites in the polylinker region of pSD485 are not unique, unwanted BglII and EcoRI sites were removed from plasmid pSD483 (described above) by digestion with BglII (pos. 140,136) and with EcoRI at the pUC / vaccinia compound followed by blunt ends with Klenow fragment of E. coli polymerase and ligation. The resulting plasmid was named pSD489. The 1.8 kb Clal (pos. 137,198) / E-coRV (pos. 139,048) fragment of pSD489 with the A26L ORF was replaced by the corresponding 0.7 kb polyalinker containing Clal / Eco RV fragment of pSD485, pSD492 was generated. The BglII and Eco RV sites in the polylinker region of pSD492 are unique.

Een BglII-cassette van 3,3 kb met daarop het E. coli Beta-galactosidase-gen (Shapira et al.,1983) onder controle van de vaccinia 11 kDa promotor (Bertholet'et al. , 1985; Perkus et al., 1990) werd geïnserteerd in de BalII-plaats van pSD492, waardoor pSD493KBG werd gevormd. Plasmide pSD493KBG werd gebruikt bij recombinatie met ontvangend virus vP553. Recombinant vacciniavirus, vP581, met Bèta- galactosidase in het A26L deletiegebied, werd geïsoleerd als een blauwe plaque in aanwezigheid van X-gal.A 3.3 kb BglII cassette with the E. coli Beta-galactosidase gene (Shapira et al., 1983) under the control of the vaccinia 11 kDa promoter (Bertholet'et al., 1985; Perkus et al., 1990) was inserted into the Bal II site of pSD492, thereby forming pSD493KBG. Plasmid pSD493KBG was used in recombination with recipient virus vP553. Recombinant vaccinia virus, vP581, with Beta-galactosidase in the A26L deletion region, was isolated as a blue plaque in the presence of X-gal.

Voor het genereren van een plasmide voor de verwijdering van Beta-galactosidasesequenties uit vaccinia recombinant virus vP581 werd het polylinkergebied van plasmide pSD492 verwijderd door mutagenese (Mandecki, 1986) met behulp van synthetisch oligonucleotide MPSYN177 (SEQ ID NO : 3 0) (5 ' - AAAATGGGCGTGGATTGTTAACTTTATATA- ACTTATTTTTTGAAT - ATAC-3')· In het resulterende plasmide, ρΜΡ494Δ, is het vaccinia DNA dat posities [137.889-183.937] omvat, waarop het complete A26L ORF, verwijderd. Recombinatie tussen het ΡΜΡ494Δ en de Beta-galactisodasebevattende vacciniarecom-binant vP581, resulteerde in vaccinia deletiemutant vP618, die geïsoleerd werd als een kleurloze plaque in aanwezigheid van X-gal.To generate a plasmid for the removal of Beta-galactosidase sequences from vaccinia recombinant virus vP581, the polylinker region of plasmid pSD492 was removed by mutagenesis (Mandecki, 1986) using synthetic oligonucleotide MPSYN177 (SEQ ID NO: 3,0) (5 '-) AAAATGGGCGTGGATTGTTAACTTTATATA-ACTTATTTTTTGAAT - ATAC-3 ') · In the resulting plasmid, ρΜΡ494Δ, the vaccinia DNA comprising positions [137,889-183,937], on which the complete A26L ORF, is deleted. Recombination between the ΡΜΡ494Δ and the Beta-galactisodase-containing vaccinia recombinant vP581 resulted in vaccinia deletion mutant vP618, which was isolated as a colorless plaque in the presence of X-gal.

Constructie van plasmide PSD467 voor deletie van het hemagglutinine-gen (A56R)Construction of plasmid PSD467 for deletion of the hemagglutinin gene (A56R)

Met verwijzing nu naar figuur 12 loopt het vaccinia Sall G restrictiefragment (pos. 160.744-173.351) tot voorbij de HindlII A/B verbinding (pos. 162.539). pSD419 bevat vaccinia Sall G gekloneerd in pUC8. De richting van de transcriptie voor het hemagglutinine (HA) gen wordt aangegeven met een pijl in figuur 12. Van HindlII B afkomstige vacciniasequenties werden verwijderd door digestie van pSD419 met HindlII in vacciniasequenties en bij de pUC/vaccinia verbinding, gevolgd door ligatie. Het resulterende plasmide, pSD456, bevat het HA-gen, A56R, geflankeerd door een vacciniasequentie van 0,4 kb aan de linkerkant en een vacciniasequentie van 0,4 kb aan de rechterkant. Coderende sequenties van A56R werden verwijderd door pSD456 te knippen met Rsal (gedeeltelijk; pos. 161.090) stroomopwaarts van de coderende sequenties van A56R, en met Eagl (pos. 162.054) dicht bij het eind van het gen. Het Rsal/ Eagl-vectorfragment van 3,6 kb van pSD456 werd geïsoleerd en geligeerd met "annealed" synthetische, oligonucleotiden MPSYN59 (SEQ IDN0:31), MPSY62 (SEQ IDNO:32), MPSYN60 (SEQ ID NO:33) , en MPSYN 61 (SEQ ID NO:34)Referring now to Figure 12, the vaccinia Sall G restriction fragment (pos. 160,744-173,351) extends beyond the HindIII A / B connection (pos. 162,539). pSD419 contains vaccinia Sall G cloned into pUC8. The direction of the transcription for the hemagglutinin (HA) gene is indicated by an arrow in Figure 12. Vaccinia sequences derived from Hind11II B were removed by digestion of pSD419 with Hind11II in vaccinia sequences and at the pUC / vaccinia compound, followed by ligation. The resulting plasmid, pSD456, contains the HA gene, A56R, flanked by a 0.4 kb vaccinia sequence on the left and a 0.4 kb vaccinia sequence on the right. A56R coding sequences were deleted by cutting pSD456 with Rsal (partial; pos. 161,090) upstream of the A56R coding sequences, and with Eagl (pos. 162,054) close to the end of the gene. The 3.6 kb Rsal / Eagl vector fragment of pSD456 was isolated and ligated with annealed synthetic oligonucleotides MPSYN59 (SEQ ID NO: 31), MPSY62 (SEQ ID NO: 32), MPSYN60 (SEQ ID NO: 33), and MPSYN 61 (SEQ ID NO: 34)

RsalRsal

MPSYN59 5' ACACGAATGATTTTCTAAAGTATTTGGAAAGTTTTATAGGTAGTTGA-TAGAMPSYN59 5 'ACACGAATGATTTTCTAAAGTATTTGGAAAGTTTTATAGGTAGTTGA-TAGA

MGSYN62 3' TGTGCTTACTAAAAGATTTCATAAAC CTTT CAAAATAT C C AT CAAC -TATCT 5' MPSYN59 -ACAAAATACATAATTT 3'MGSYN62 3 'TGTGCTTACTAAAAGATTTCATAAAC CTTT CAAAATAT C C AT CAAC -TATCT 5' MPSYN59 -ACAAAATACATAATTT 3 '

Bal IIBall II

MPSYN60 5' TGTAAAAATAAATCACTTTTTATACTAAGATCT- MPSYN61 3 1 TGTTTTATGTATTAAAACATTTTTATTTAGTGAAAAATATGATTCTAGA-MPSYN60 5 'TGTAAAAATAAATCACTTTTTATACTAAGATCT- MPSYN61 3 1 TGTTTTATGTATTAAAACATTTTTTTAGTGAAAAATATGATTCTAGA-

Smal PstI Eaal MPSYN60 -CCCGGGCTGCAGC 3' MPSYN61 -GGGCCCGACGTCGCCGG 5' waarmee de DNA-sequenties stroomopwaarts van het A56R ORF werden gereconstrueerd en het A56R ORF werden vervangen door een polylinkergebied zoals boven aangegeven. Het resulterende plasmide is pSD466. De vacciniadeletie in pSD466 omvat posities [161.185-162.053]. De plaats van de deletie in pSD466 wordt aangegeven met een driehoek in figuur 12.Narrow PstI Eal MPSYN60 -CCCGGGCTGCAGC 3 'MPSYN61 -GGGCCCGACGTCGCCGG 5' that reconstructed the DNA sequences upstream of the A56R ORF and replaced the A56R ORF with a polylinker region as indicated above. The resulting plasmid is pSD466. The vaccinia deletion in pSD466 includes positions [161,185-162,053]. The location of the deletion in pSD466 is indicated by a triangle in Figure 12.

Een BglII/BamHI (gedeeltelijk)-cassette met daarop het E. Coli Beta-galactosidase-gen (Shapira et al., 1983) onder controle van de vaccinia 11 kDa promotor (Bertholet et al., 1985; Guo et al., 1989) werd geïnserteerd in de ΒσΙΙΙ-plaats van pSD466, waarmee pSD466KBG werd gevormd. Plasmide pSD466KBG werd gebruikt in recombinatie met ontvangend virus vP618. Recombinant vacciniavirus, vP708, dat Beta-galactosidase in de A56R deletie bevat, werd geïsoleerd als éen blauwe plaque in aanwezigheid van X-gal.A BglII / BamHI (partial) cassette with the E. Coli Beta galactosidase gene (Shapira et al., 1983) under the control of the vaccinia 11 kDa promoter (Bertholet et al., 1985; Guo et al., 1989 ) was inserted into the ΒσΙΙΙ site of pSD466, thereby forming pSD466KBG. Plasmid pSD466KBG was used in recombination with recipient virus vP618. Recombinant vaccinia virus, vP708, containing Beta-galactosidase in the A56R deletion, was isolated as a blue plaque in the presence of X-gal.

Beta-galactosidasesequenties werden uit vP708 verwijderd met behulp van donorplasmide pSD467. pSD467 is identiek aan pSD466, behalve dat EcoRI-. Smal- en BamHI-plaatsen verwijderd waren uit de pUC/vaccinia verbinding door digestie van pSD466 met EcoRI/BamHI. gevolgd door stompmaken van de uiteinden met Klenow fragment van E. coli polymerase en ligatie. Recombinatie tussen vP708 en pSD467 resulteerde in de recombinante vaccinia deletiemutant, vP723, die geïsoleerd werd als een kleurloze plaque in aanwezigheid van X-gal.Beta-galactosidase sequences were removed from vP708 using donor plasmid pSD467. pSD467 is identical to pSD466, except that EcoRI-. Narrow and Bam HI sites were removed from the pUC / vaccinia compound by digestion of pSD466 with Eco RI / Bam HI. followed by blunting the ends with Klenow fragment of E. coli polymerase and ligation. Recombination between vP708 and pSD467 resulted in the recombinant vaccinia deletion mutant, vP723, which was isolated as a colorless plaque in the presence of X-gal.

Constructie van plasmide pMPCSKIa voor deletie van open leesframes fC7L-KlLlConstruction of plasmid pMPCSKIA for deletion of open reading frames fC7L-KlL1

Met verwijzing nu naar figuur 13 werden de volgende vacciniaklonen gebruikt bij de constructie van pMPCSKIDA. pSD420 is Sall H gekloneerd in pUC8. pSD435 is Knnl F gekloneerd in pUC18. pSD435 werd geknipt met Sphl en weer geligeerd, waardoor pSD451 werd gevormd. In pSD451 zijn DNA-sequenties links van de Sphl-olaats (pos. 27.416) in HindiII M verwijderd (Perkus et al., 1990). pSD409 is HindiII M gedoneerd in pUC8.Referring now to Figure 13, the following vaccinia clones were used in the construction of pMPCSKIDA. pSD420, Sal I is cloned into pUC8. pSD435, Knnl F is cloned into pUC18. pSD435 was cut with Sphl and ligated again, thereby forming pSD451. In pSD451, DNA sequences to the left of the Sphl olates (pos. 27,416) in HindiII M have been deleted (Perkus et al., 1990). pSD409 is HindiII M donated in pUC8.

Om te voorzien in een substraat voor de deletie van de [C7L-K1L] -genencluster uit vaccinia, werd E. coli Beta-galactosidase eerst als volgt geïnserteerd in de vaccinia M2L deletielocus (Guo et al., 1990). Om de BolII-plaats in pSD409 te elimineren werd het plasmide geknipt met BglII in vacciniasequenties (pos. 28.212) en met BamHI bij de pUC/vaccinia verbinding en daarna geligeerd om zo plasmide pMP409B te vormen. pMP409B werd geknipt op de unieke Sphl-plaats (pos. 27.416). Coderende sequenties van M2L werden verwijderd door mutagenese (Guo et al., 1990; Mandecki, 1986) met behulp van het synthetische oligonucle-otideTo provide a substrate for deletion of the vaccinia [C7L-K1L] gene cluster, E. coli Beta-galactosidase was first inserted into the vaccinia M2L deletion locus (Guo et al., 1990) as follows. To eliminate the BolII site in pSD409, the plasmid was digested with BglII in vaccinia sequences (pos. 28,212) and with BamHI at the pUC / vaccinia compound and then ligated to form plasmid pMP409B. pMP409B was cut at the unique Sphl site (pos. 27,416). M2L coding sequences were removed by mutagenesis (Guo et al., 1990; Mandecki, 1986) using the synthetic oligonucleotide

BglIIBglII

MPSYN82 (SEQ ID NO:35) 5' TTTCTGTATATTTGCACCAATTTAGATCTTACTCAAAA TATGTAACAATA 3'MPSYN82 (SEQ ID NO: 35) 5 'TTTCTGTATATTTGCACCAATTTAGATCTTACTCAAAA TATGTAACAATA 3'

Het resulterende plasmide, pMP409D, bevat een unieke BglII-plaats, geïnserteerd in de M2L deletielocus zoals boven aangegeven. Een BamHI(gedeeltelijk)/BglII-cassette van 3,2 kb met daarop het E. coli Beta-galactosidase-gen (Shapira et al., 1983) onder controle van de 11 kDa promotor (Bert-holet et al., 1985) werd geïnserteerd in pMP409D dat geknipt was met BglII. Het resulterende plasmide, pMP409DBG (Guo et al.,1990) werd gebruikt als donorplasmide voor recombinatie met ontvangend vacciniavirus vP723. Recombinant vacciniavirus, vP784, dat β-galactosidase geïnserteerd in de M2L deletielocus bevat, werd geïsoleerd als een blauwe plaque in aanwezigheid van X-gal.The resulting plasmid, pMP409D, contains a unique BglII site inserted in the M2L deletion locus as indicated above. A 3.2 kb Bam HI (partial) / Bgl II cassette with the E. coli Beta-galactosidase gene (Shapira et al., 1983) under control of the 11 kDa promoter (Bert-holet et al., 1985) was inserted into pMP409D digested with BglII. The resulting plasmid, pMP409DBG (Guo et al., 1990) was used as a donor plasmid for recombination with receiving vaccinia virus vP723. Recombinant vaccinia virus, vP784, containing β-galactosidase inserted in the M2L deletion locus, was isolated as a blue plaque in the presence of X-gal.

Een plasmide met deletie van vacciniagenen [C7L -KIL] werd opgebouwd in pUC8 dat geknipt was met Smal, HindiII en van stompe uiteinden voorzien met Klenow fragment van E. coli polymerase. De linker flankerende arm bestaande uit vaccinia HindlII C-sequenties werd verkregen door digestie van pSD420 met Xbal (pos. 18.628), gevolgd door stomp maken van de uiteinden met Klenow fragment van E. coli polymerase en digestie met BolII (pos. 19.706). De rechter flankerende arm bestaande uit vaccinia HindiII K-sequenties werd verkregen door digestie van pSD451 met Bgl.II (pos. 29.062) en EcoRV (pos. 29.778) . Het resulterende plasmide, pMP581CK, heeft een deletie van de vacciniase-quenties tussen de BqlII-plaats (pos. 19.706) in HindiII C en de BglII-plaats (pos. 29.062) in HindiII K. De plaats van de deletie van de vacciniasequenties in plasmide pMP581CK wordt aangegeven met een driehoek in figuur 13.A plasmid with deletion of vaccinia genes [C7L-KIL] was constructed in pUC8 that was digested with Sma I, Hind II and blunt-ended with Klenow fragment of E. coli polymerase. The left flanking arm consisting of vaccinia HindIII C sequences was obtained by digesting pSD420 with Xbal (pos. 18,628), followed by blunting the ends with Klenow fragment of E. coli polymerase and digestion with BolII (pos. 19,706). The right flanking arm consisting of vaccinia HindiII K sequences was obtained by digestion of pSD451 with Bgl.II (pos. 29,062) and Eco RV (pos. 29,778). The resulting plasmid, pMP581CK, has a deletion of the vaccinia sequences between the BqII site (pos. 19,706) in HindiII C and the BglII site (pos. 29,062) in HindiII K. The site of the deletion of the vaccinia sequences in plasmid pMP581CK is indicated with a triangle in Figure 13.

Om overtollig DNA bij de vacciniadeletieverbinding te verwijderen werd plasmide pMP581CK geknipt bij de Ncol-plaatsen binnen vacciniasequenties (pos. 18.811; 19.655), behandeld met Bal-31 exonuclease en onderworpen aan mutage-nese (Mandecki, 1986) met behulp van het synthetische oligonucleotide MPSYN233 (SEQ ID NO:36) 5'- TGTCATTTAACACTATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT-3 ' . Het resulterende plasmide, pMPCSKla, heeft een deletie van vacciniasequenties posities 18.805-29.108, omvattende 12 open leesframes van vaccinia [C7L - KIL] . Recombinatie tussen pMPCSKlA en de β-galactosidase bevattende vaccinia-recombinant vP784 resulteerde in vaccinia dèletiemutant vP804, die geïsoleerd werd als een kleurloze plaque in aanwezigheid van X-gal.To remove excess DNA at the vaccination deletion compound, plasmid pMP581CK was cut at the Ncol sites within vaccinia sequences (pos. 18,811; 19,655), treated with Bal-31 exonuclease and subjected to mutagenesis (Mandecki, 1986) using the synthetic oligonucleotide MPSYN233 (SEQ ID NO: 36) 5'-TGTCATTTAACACTATACTCATATTAATAAAAATAATATTTATT-3 '. The resulting plasmid, pMPCSK1a, has a deletion of vaccinia sequences positions 18,805-29,108, including 12 open reading frames of vaccinia [C7L - KIL]. Recombination between pMPCSK1A and the β-galactosidase containing vaccinia recombinant vP784 resulted in vaccinia deletion mutant vP804, which was isolated as a colorless plaque in the presence of X-gal.

Constructie van plasmide PSD548 voor deletie van de grote subunit van ribonucleotidereductase (I4L).Construction of plasmid PSD548 for deletion of the large subunit of ribonucleotide reductase (I4L).

Met verwijzing nu naar figuur 14 bevat plasmide pSD405 vaccinia HindiII I (pos. 63.875-70.367), gekloneerd in pUC8. pSD405 werd geknipt met EcoRV binnen vacciniasequenties (pos. 67.933) en met Smal bij de. pUC/vaccinia verbinding en geligeerd, waarmee plasmide pSD518 werd gevormd. pSD518 werd gebruikt als de bron van alle vaccinia restrictief ragmenten die gebruikt werden bij de constructie van pSD548.Referring now to Figure 14, plasmid pSD405 contains vaccinia HindiII I (pos. 63,875-70,367), cloned into pUC8. pSD405 was cut with Eco RV within vaccinia sequences (pos. 67,933) and with Smal at the. pUC / vaccinia compound and ligated, thereby forming plasmid pSD518. pSD518 was used as the source of all vaccinia restrictive ragments used in the construction of pSD548.

Het vaccinia I4L-gen loopt van positie 67.371-65.059. De richting van de transcriptie voor I4L wordt aangegeven met een pijl in figuur 14. Om' een vector-plasmidefragment te verkrijgen met een deletie van een deel van de coderende sequenties van I4L werd pSD518 geknipt met BamHI (pos. 65.381) en Hpal (pos. 67.001) en van stompe . uiteinden voorzien met behulp van Klenow fragment van E. coli polymerase. Dit vectorfragment van 4,8 kb werd geli-geerd met een Smal-cassette van 3,2 kb met daarop het E. coli β-galactosidase-gen (Shapira et al., 1983) onder controle van de vaccinia 11 kDa promotor (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990), wat resulteerde in plasmide pSD524KBG. pSD524KBG werd gebruikt als donorplasmide voor recombinatie met vacciniavirus vP804. Recombinant vaccinia-virus, vP855, dat β-galactosidase bevat in een gedeeltelijke deletie van het I4L-gen, werd geïsoleerd als een blauwe plaque in aanwezigheid van X-gal.The vaccinia I4L gene runs from position 67.371-65.059. The direction of transcription for I4L is indicated by an arrow in Figure 14. To obtain a vector plasmid fragment with a deletion of a portion of the coding sequences of I4L, pSD518 was digested with BamHI (pos. 65,381) and Hpal (pos 67.001) and of blunt. ends provided with Klenow fragment of E. coli polymerase. This 4.8 kb vector fragment was ligated with a 3.2 kb Smal cassette with the E. coli β-galactosidase gene (Shapira et al., 1983) under control of the vaccinia 11 kDa promoter (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990), which resulted in plasmid pSD524KBG. pSD524KBG was used as a donor plasmid for recombination with vaccinia virus vP804. Recombinant vaccinia virus, vP855, containing β-galactosidase in a partial deletion of the I4L gene, was isolated as a blue plaque in the presence of X-gal.

Om β-galactosidase en de rest van het I4L ORF uit vP855 te verwijderen werd deletieplasmide pSD548 geconstrueerd. De linker en rechter flankerende armen van vaccinia werden afzonderlijk ingebouwd in pUC8 zoals hieronder gedetailleerd beschreven en zoals schematisch weergegeven in figuur 14.To remove β-galactosidase and the rest of the I4L ORF from vP855, deletion plasmid pSD548 was constructed. The left and right flanking arms of vaccinia were separately incorporated into pUC8 as described in detail below and as shown schematically in Figure 14.

Om een vectorplasmide te construeren voor het opnemen van de linker flankerende arm van vaccinia werd pUC8 geknipt met BamHI/EcoRI en geligeerd met "annealed" synthetische oligonucleotiden 518A1/518A2 (SEQ ID NO:37/SEQ ID NO:38)To construct a vector plasmid for incorporating the left flanking arm of vaccinia, pUC8 was digested with BamHI / EcoRI and ligated with "annealed" synthetic oligonucleotides 518A1 / 518A2 (SEQ ID NO: 37 / SEQ ID NO: 38)

BamHI RsalBamHI Rsal

518A1 5' GATCCTGAGTACTTTGTAATATAATGATATATATTTTCACTTTATCTCAT 518A2 3' GACTCATGAAACATTATATTACTATATATAAAAGTGAAATAGAGTA518A1 5 'GATCCTGAGTACTTTGTAATATAATGATATATATTTTCACTTTATCTCAT 518A2 3' GACTCATGAAACATTATATTACTATATATAAAAGTGAAATAGAGTA

ΒσΙΙΙ EcoRIRIσΙΙΙ EcoRI

TTGAGAATAAAAAGATCTTAGG 3' 518A1 AACTCTTATTTTTCTAGAATCCTTAA 5' 518A2 waarmee plasmide pSD531 werd gevormd. pSD531 werd geknipt met Rsal (gedeeltelijk) en BamHI en er werd een vectorfragment van 2,7 kb geïsoleerd. pSD518 werd geknipt met BglII (pos. 64.459)/Rsal (pos. 64.994) en er werd een fragment van 0,5 kb geïsoleerd. De twee fragmenten werden aan elkaar geligeerd, waarmee pSD537 werd gevormd dat de complete flankerende arm van vaccinia links van de coderende sequenties van I4L bevat.TTGAGAATAAAAAGATCTTAGG 3 '518A1 AACTCTTATTTTTCTAGAATCCTTAA 5' 518A2 with which plasmid pSD531 was formed. pSD531 was cut with Rsal (partial) and BamHI and a vector fragment of 2.7 kb was isolated. pSD518 was cut with BglII (pos. 64,459) / Rsal (pos. 64,994) and a 0.5 kb fragment was isolated. The two fragments were ligated together to form pSD537 containing the complete flanking arm of vaccinia to the left of the coding sequences of I4L.

Om een vectorplasmide te construeren voor het opnemen van de rechter flankerende arm van vaccinia werd pUC8 geknipt met BamHI/EcoRI en geligeerd met "annealed" synthetische oligonucleotiden 518B1/518B2 (SEQ ID NO:39/SEQ ID NO:40)To construct a vector plasmid for incorporating the right flanking arm of vaccinia, pUC8 was digested with BamHI / EcoRI and ligated with annealed synthetic oligonucleotides 518B1 / 518B2 (SEQ ID NO: 39 / SEQ ID NO: 40)

BamHI BqlII Smal 518B1 5' GATCCAGATCTCCCGGGAAAAAAATTATTTAACTTTTCATTAATAGGGATTT 518B2 3'BamHI BqlII Narrow 518B1 5 'GATCCAGATCTCCCGGGAAAAAAATTATTTAACTTTTCATTAATAGGGATTT 518B2 3'

GTCTAGAGGGCCCTTTTTTTAATAAATTGAAAAGTAATTATCCCTAAAGTCTAGAGGGCCCTTTTTTTAATAAATTGAAAAGTAATTATCCCTAAA

Rsal EcoRIRsal EcoRI

GACGTATGTAGCGTACTAGG 3' 518B1 CTGCATACTACGCATGATCCTTAA 5' 518B2 waarmee plasmide pSD532 werd gevormd. pSD532 werd geknipt met Rsal (gedeeltelijk)/EcoRI en er werd een vectorfragment van 2,7 kb geïsoleerd. pSD518 werd geknipt met Rsal binnen vacciniasequenties (pos. 67.436) en EcoRI bij de vacci-nia/pUC verbinding en er werd een fragment van 0,6 kb geïsoleerd. Be twee fragmenten werden aan elkaar geligeerd, waarmee pSD538 werd gevormd dat de complete flankerende arm van vaccinia rechts van de coderende sequenties van I4L bevat.GACGTATGTAGCGTACTAGG 3 '518B1 CTGCATACTACGCATGATCCTTAA 5' 518B2 with which plasmid pSD532 was formed. pSD532 was cut with Rsal (partial) / EcoRI and a vector fragment of 2.7 kb was isolated. pSD518 was digested with Rsal within vaccinia sequences (pos. 67,436) and EcoRI at the vaccinia / pUC compound and a 0.6 kb fragment was isolated. The two fragments were ligated together to form pSD538 that contains the complete flanking arm of vaccinia to the right of the coding sequences of I4L.

De rechter flankerende arm van vaccinia werd geïsoleerd als een EcoRI /Bgl 11 - fragment van 0,6 kb uit pSD538 en geligeerd in pSD537 vectorplasmide dat geknipt was met EcoRI/BglII. In het resulterende plasmide, pSD539, is het I4L ORF (pos. 65.047-67.386) vervangen door een polylinkergebied dat geflankeerd wordt door 0,6 kb vaccinia DNA aan de linkerkant en 0,6 kb vaccinia DNA aan de rechterkant, dit alles op een pUC achtergrond. De plaats van de deletie in de vacciniasequenties wordt aangegeven met een driehoek in figuur 14. Om mogelijke recombinatie van β-galactosidasesequenties in het van pUC afkomstige deel van pSD539 met β-galactosidasesequenties in recombinant vacci-niavirus vP855 te vermijden werd de vaccinia I4L-deletie-cassette uit pSD539 overgebracht in pRCll, een pUC-derivaat waaruit alle β-galactosidasesequenties verwijderd zijn en' vervangen zijn door een polylinkergebied (Colinas et al., 1990) . pSD539 werd geknipt met EcoRI/PstI en het fragment van 1,2 kb werd geïsoleerd. Dit fragment werd geligeerd in pRCll dat geknipt was met EcoRI/PstI (2,35 kb), waardoor pSD548 werd gevormd. Recombinatie tussen pSD548 en de S-galactosidase bevattende vacciniarecombinant vP855 resulteerde in vaccinia deletiemutant VP866 die geïsoleerd werd als een kleurloze plaque in aanwezigheid van X-gal.The right flanking vaccinia arm was isolated as a 0.6 kb EcoRI / Bgl II fragment from pSD538 and ligated into pSD537 vector plasmid digested with EcoRI / BglII. In the resulting plasmid, pSD539, the I4L ORF (pos. 65,047-67,386) is replaced by a polylinker region flanked by 0.6 kb vaccinia DNA on the left and 0.6 kb vaccinia DNA on the right, all on a pUC background. The location of the deletion in the vaccinia sequences is indicated with a triangle in Figure 14. To avoid possible recombination of β-galactosidase sequences in the pUC-derived part of pSD539 with β-galactosidase sequences in recombinant vaccinia virus vP855, the vaccinia I4L deletion was cassette from pSD539 transferred to pRC11, a pUC derivative from which all β-galactosidase sequences have been deleted and replaced by a polylinker region (Colinas et al., 1990). pSD539 was cut with Eco RI / Pst I and the 1.2 kb fragment was isolated. This fragment was ligated into pRC11 cut with Eco RI / Pst I (2.35 kb) to form pSD548. Recombination between pSD548 and the S-galactosidase containing vaccinia recombinant vP855 resulted in vaccinia deletion mutant VP866 isolated as a colorless plaque in the presence of X-gal.

DNA van recombinant vacciniavirus vP866 werd geanalyseerd met behulp van restrictiedigestie, gevolgd door elektroforese op een agarosegel. De restrictiepatronen waren zoals verwacht. Polymerase-kettingreacties (PCR) (Engelke et al., 1988) met behulp van vP866 als de template en met primers die de zes boven beschreven deletieloci flankeerden, leverde DNA-fragmenten op van de verwachte grootten. Sequentieanalyse van de met PCR gegenereerde fragmenten rond de gebieden van de deletieverbindingen bevestigde dat de verbindingen waren zoals verwacht werd. Recombinant vacciniavirus vP866, met de zes als boven beschreven geconstrueerde deleties, werd vaccinia vaccin-stam "NYVAC" genoemd.DNA from recombinant vaccinia virus vP866 was analyzed by restriction digest, followed by electrophoresis on an agarose gel. The restriction patterns were as expected. Polymerase chain reactions (PCR) (Engelke et al., 1988) using vP866 as the template and with primers flanking the six deletion loci described above yielded DNA fragments of the expected sizes. Sequence analysis of the PCR generated fragments around the regions of the deletion compounds confirmed that the compounds were as expected. Recombinant vaccinia virus vP866, with the six deletions constructed as described above, was called vaccinia vaccine strain "NYVAC".

Voorbeeld 16 - CONSTRUCTIE VAN NYVAC-MV RECOMBINANT METExample 16 - CONSTRUCTION OF NYVAC-MV RECOMBINANT WITH

EXPRESSIE VAN MAZELEN FUSIE- EN HEMAGGLP-TININE-GLYCOPROTEINENEXPRESSION OF MEASURES FUSION AND HEMAGGLP TININE GLYCOPROTEINS

cDNA-kopieën van de sequenties die coderen voor de HA- en F-eiwitten van mazelenvirus MV (Edmonston stam), werden geïnserteerd in NYVAC om zo een dubbele recombinant te vormen die NYVAC-MV (vP913) werd genoemd. De recombinant vertoonde authentieke expressie van beide mazelenglycopro-teïnen op het oppervlak van geïnfecteerde cellen. Met immunoprecipitatieanalyse werd aangetoond dat de F- en HA-glycoproteïnen beide op correcte wijze werden bewerkt. De recombinant bleek ook vorming van syncytia te induceren.cDNA copies of the sequences encoding measles virus MV HA and F proteins (Edmonston strain) were inserted into NYVAC to form a double recombinant called NYVAC-MV (vP913). The recombinant showed authentic expression of both measles glycoproteins on the surface of infected cells. It was demonstrated by immunoprecipitation analysis that the F and HA glycoproteins were both processed correctly. The recombinant was also found to induce syncytia formation.

Cellen en virussenCells and viruses

Het ontvangende virus dat gebruikt werd bij de productie van NYVAC-MV was de gemodificeerde Copenhagenstam van vacciniavirus met de aanduiding NYVAC. Het kweken en bepalen van de titers van alle virussen geschiedde op monolagen van Vero cellen.The recipient virus used in the production of NYVAC-MV was the modified Copenhagen strain of vaccinia virus with the designation NYVAC. The cultivation and determination of the titers of all viruses was done on monolayers of Vero cells.

PlamideconstructiePlamid construction

Met verwijzing nu naar figuur 15 en Taylor et al., (1991) bevat het plasmide pSPM2LHA het complete mazelen HA- gen, in een precieze ATG:ATG configuratie gekoppeld aan de vacciniavirus H6 promotor die eerder beschreven is (Taylor et al., 1988a,b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989). Een EcoRV/Smal-fragment van 1,8 kbp met daarop de het meeste aan de 3'-kant gelegen 24 bp van de H6 promotor, in een precieze ATG:ATG configuratie gefuseerd met het HA-gen dat de het meeste aan de 31-kant gelegen 26 bp mist, werd geïsoleerd uit pSPM2LHA. Dit fragment werd gebruikt om het EcoRV/Smal-fragment van 1,8 kbp van pSPMHAll (Taylor et al., 1991) te vervangen om zo pRW803 te genereren. Plasmide pRW803 bevat de complete H6 promotor, op precieze wijze gekoppeld aan het complete mazelen HA-gen.With reference now to Figure 15 and Taylor et al., (1991), the plasmid pSPM2LHA contains the complete measles HA gene, in a precise ATG: ATG configuration linked to the vaccinia virus H6 promoter previously described (Taylor et al., 1988a , b; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989). A 1.8 kbp Eco RV / Sma I fragment containing the most 3 'side 24 bp of the H6 promoter, in a precise ATG: ATG configuration fused to the HA gene that is most of the 31 -side 26 bp fog, was isolated from pSPM2LHA. This fragment was used to replace the 1.8 kbp Eco RV / Smal fragment of pSPMHA11 (Taylor et al., 1991) to generate pRW803. Plasmid pRW803 contains the complete H6 promoter, precisely linked to the complete measles HA gene.

Plasmide pSD513VCVQ werd afgeleid van plasmide pSD460 door toevoeging van polylinkersequenties. Plasmide pSD460 werd gemaakt om deletie van het thymidinekinase-gen uit vacciniavirus mogelijk te maken (figuur 9).Plasmid pSD513VCVQ was derived from plasmid pSD460 by addition of polylinker sequences. Plasmid pSD460 was made to allow deletion of the vaccinia virus thymidine kinase gene (Figure 9).

Om het mazelenvirus F-gen te inserteren in het HA-insertieplasmide werden manipulaties uitgevoerd op pSPHMF7. Plasmide pSPHMF7 (Taylor et al., 1991) bevat het mazelen F-gen aan de 3'-kant naast de eerder beschreven vacciniavirus H6 promotor. Om een perfecte ATG:ATG configuratie te verkrijgen en om interveniërende sequenties tussen het 31 -uiteinde van de promotor en het ATG van het mazelen F-gen te verwijderen werd oligonucleotide-gestuurde mutagenese uitgevoerd met behulp van oligonucleotide SPMAD (SEQ ID NO:41).To insert the measles virus F gene into the HA insert plasmid, manipulations were performed on pSPHMF7. Plasmid pSPHMF7 (Taylor et al., 1991) contains the measles F gene on the 3 'side in addition to the previously described vaccinia virus H6 promoter. To obtain a perfect ATG: ATG configuration and to remove intervening sequences between the 31 end of the promoter and the ATG of the measles F gene, oligonucleotide-directed mutagenesis was performed using oligonucleotide SPMAD (SEQ ID NO: 41) .

SPMAD: 5’-TATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGTCTCAAGGTGAACGTCT-3' Het resulterende plasmide werd pSPMF75M20 genoemd.SPMAD: 5'-TATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGTCTCAAGGTGAACGTCT-3 'The resulting plasmid was named pSPMF75M20.

Het plasmide pSPMF75M20 dat het mazelen F-gen bevat dat nu in een precieze ATG:ATG configuratie gekoppeld is aan de H6 promotor, werd geknipt met Nrul en Eacrl. Het resulterende fragment van 1,7 kbp met stompe uiteinden met daarop de het meest aan de 3'-kant gelegen 27 bp van de H6 promotor en het complete fusiegen werd geïsoleerd en geïnserteerd in een intermediair plasmide pRW823 dat geknipt was met Nrul en Xbal en van stompe uiteinden was voorzien. Het resulterende plasmide pRW841 bevat . de H6 promotor gekoppeld aan het mazelen F-gen in de pIBI25 plasmidevector (IBI, New Haven, CT). De H6/mazelen F- cassette werd uit pRW841 geknipt door digestie met Smal en het resulterende fragment van 1,8 kb werd geïnserteerd in pRW843 (dat het mazelen HA-gen bevat). Plasmide pRW843 werd eerst geknipt met Notl en van stompe uiteinden voorzien met Klenow fragment van E. coli DNA-polymerase in aanwezigheid van 2mM dNTPs. Het resulterende plasmide, pRW857, bevat daardoor de mazëlenvirus F- en HA-genen gekoppeld in een staart-staartconfiguratie. Beide genen zijn gekoppeld aan de vacciniavirus H6 promotor.The plasmid pSPMF75M20 containing the measles F gene now linked to the H6 promoter in a precise ATG: ATG configuration was cut with Nrul and Eacrl. The resulting 1.7 kbp fragment with blunt ends with the 3 'most-situated 27 bp of the H6 promoter and the complete fusion gene was isolated and inserted into an intermediate plasmid pRW823 cut with Nrul and Xbal and with blunt ends. The resulting plasmid contains pRW841. the H6 promoter linked to the measles F gene in the pIBI25 plasmid vector (IBI, New Haven, CT). The H6 / measles F cassette was cut from pRW841 by digest with Smal and the resulting 1.8 kb fragment was inserted into pRW843 (containing the measles HA gene). Plasmid pRW843 was first digested with NotI and blunt-ended with Klenow fragment of E. coli DNA polymerase in the presence of 2mM dNTPs. The resulting plasmid, pRW857, therefore contains the measles virus F and HA genes linked in a tail-to-tail configuration. Both genes are linked to the vaccinia virus H6 promoter.

Ontwikkeling van. NYVAC-MVDevelopment of. NYVAC-MV

Plasmide pRW857 werd getransfecteerd in met NYVAC (vP866) geïnfecteerde Vero cellen met behulp van de eerder beschreven calciumfosfaatprecipitatie werkwijze (Panicali et al., 1982; Piccini et al., 1987). Positieve plaques werden geselecteerd op basis van in situ plaque-hybridisa-tie met specifieke radioactief gemerkte MV-, F- en HA-probes en onderworpen aan zes achtereenvolgende plaquezui-veringsronden totdat een zuivere populatie was verkregen. Eén representatieve plaque werd vervolgens geamplificeerd en de resulterende recombinant werd NYVAC-MV (vP913) genoemd.Plasmid pRW857 was transfected into NYVAC (vP866) infected Vero cells using the previously described calcium phosphate precipitation method (Panicali et al., 1982; Piccini et al., 1987). Positive plaques were selected based on in situ plaque hybridization with specific radiolabeled MV, F and HA probes and subjected to six consecutive plaque purification rounds until a pure population was obtained. One representative plaque was then amplified and the resulting recombinant was named NYVAC-MV (vP913).

ImmunofluorescentieImmunofluorescence

Indirecte immunofluorescentie werd uitgevoerd zoals eerder beschreven (Taylor et al., 1990). Gebruikte mono specifieke reagentia waren sera die gegenereerd waren door inoculatie van konijnen met kanariepokkenrecombinanten met expressie van ofwel het mazelen F-gen ofwel het mazelen HA-gen.Indirect immunofluorescence was performed as previously described (Taylor et al., 1990). Mono-specific reagents used were sera generated by inoculation of rabbits with canarypox recombinants expressing either the measles F gene or the measles HA gene.

ImmunoprecipitatieImmunoprecipitation

Immunoprecipitatiereacties werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (Taylor et al., 1990) met behulp van een cavia-anti-mazelen serum (Whittaker M.A. Bioproducts, Walkersville, MD).Immunoprecipitation reactions were performed as previously described (Taylor et al., 1990) using a guinea pig anti-measles serum (Whittaker M.A. Bioproducts, Walkersville, MD).

Celfusie-experimentenCell fusion experiments

Monolagen van Vero cellen in schaaltjes van 60 mm werden geïnoculeerd met een multipliciteit van 1 pfu per cel met oudervirus of recombinante virussen. Na 1 uur absorptie bij 37°C werd het inoculum verwijderd, het bovenstaande medium vervangen en werden de schaaltjes overnacht geïncubeerd bij 37°C. 20 Uur na infectie werden de schaaltjes onderzocht.Monolayers of Vero cells in 60 mm dishes were inoculated with a multiplicity of 1 pfu per cell with parental virus or recombinant viruses. After 1 hour of absorption at 37 ° C, the inoculum was removed, the supernatant was replaced, and the dishes were incubated overnight at 37 ° C. The dishes were examined 20 hours after infection.

Teneinde vast te stellen dat de expressieproducten van de mazelenvirus F- en HA-genen beide aanwezig waren op het oppervlak van de geïnfecteerde cellen werd indirecte immunofluorescentieanalyse uitgevoerd met behulp van monospecifieke sera die gegenereerd waren in konijnen tegen kanariepokkenrecombinanten met expressie van ofwel het F-ofwel het HA-gen van mazelenvirus. De resultaten gaven aan dat de F- en HA-genproducten beide tot expressie werden gebracht op het oppervlak van de geïnfecteerde cellen, zoals werd aangetoond met sterke oppervlakfluorescentie met beide monospecifieke sera. Er was geen duidelijke achter-grondkleuring met beide sera op cellen die geïnoculeerd waren met de NYVAC ouderstam, noch was er kruisreactieve kleuring als monospecifieke sera werden getest tegen enkelvoudige vacciniarecombinanten met expressie van ofwel het HA- ofwel het F-gen.In order to determine that the measles virus F and HA genes expression products were both present on the surface of the infected cells, indirect immunofluorescence analysis was performed using monospecific sera generated in rabbits against canarypox recombinants expressing either the F or measles virus HA gene. The results indicated that the F and HA gene products were both expressed on the surface of the infected cells, as demonstrated by strong surface fluorescence with both monospecific sera. There was no clear background staining with both sera on cells inoculated with the NYVAC parental strain, nor was cross-reactive staining when monospecific sera were tested against single vaccinia recombinants expressing either the HA or the F gene.

Teneinde aan te tonen dat de door NYVAC-MV tot expressie gebrachte eiwitten immunoreactief waren met mazelenvirus-specifieke sera en op authentieke wijze bewerkt werden in de geïnfecteerde cel, werd immunoprecipi-tatieanalyse uitgevoerd. Monolagen van Vero cellen werden geïnoculeerd met een multipliciteit van 10 pfu/cel oudervi-rus of recombinantvirus in aanwezigheid van 35S-methionine. Immunoprecipitatieanalyse toonde een HA-glycoproteïne aan van ongeveer 76 kDa en de gesplitste fusieproducten F1 en F2 met molecuulgewichten van respectievelijk 44 kDa en 23 kDa. Er werden geen mazelen-specifieke producten gedetecteerd in niet-geïnfecteerde Vero cellen of in Vero cellen die geïnfecteerd waren met het NYVAC oudervirus.In order to demonstrate that the proteins expressed by NYVAC-MV were immunoreactive with measles virus-specific sera and were processed in the infected cell in an authentic manner, immunoprecipitation analysis was performed. Monolayers of Vero cells were inoculated with a multiplicity of 10 pfu / cell parental virus or recombinant virus in the presence of 35 S-methionine. Immunoprecipitation analysis revealed an HA glycoprotein of approximately 76 kDa and the split fusion products F1 and F2 with molecular weights of 44 kDa and 23 kDa, respectively. No measles-specific products were detected in uninfected Vero cells or in Vero cells infected with the NYVAC parental virus.

Een kenmerk van de cytopathologie van MV is de vorming van syncytia die ontstaan door fusie van geïnfecteerde cellen met omringende geïnfecteerde of niet-geïnfecteerde cellen, gevolgd door migratie van de nuclei naar het centrum van het syncytium (Norrby et al., 1982) .' Gebleken is dat dit een belangrijke methode voor verspreiding van het virus is, die voor paramyxovirussen kan optreden in aanwezigheid van HA-specifiek virusneutraliserend antili- chaam (Merz et al., 1980). Teneinde vast te stellen dat de in de vacciniavirus tot expressie gebrachte MV-eiwitten functioneel actief waren, werden monolagen van Vero cellen geïnoculeerd met NYVAC en NYVAC-MV en onderzocht op cytopa-tische effecten. In met NYVAC-MV geïnfecteerde Vero cellen werd ongeveer 18 uur na infectie een duidelijke sterke celfusie-activiteit waargenomen. Er was geen duidelijke celfusie-activiteit in cellen die geïnfecteerd waren met NYVAC oudervirus.A characteristic of the cytopathology of MV is the formation of syncytia that result from fusion of infected cells with surrounding infected or uninfected cells, followed by migration of the nuclei to the center of the syncytium (Norrby et al., 1982). It has been found that this is an important method for spreading the virus, which can occur for paramyxoviruses in the presence of HA-specific virus-neutralizing antibody (Merz et al., 1980). In order to establish that the MV proteins expressed in the vaccinia virus were functionally active, monolayers of Vero cells were inoculated with NYVAC and NYVAC-MV and examined for cytopathic effects. Significant strong cell fusion activity was observed in Vero cells infected with NYVAC-MV approximately 18 hours after infection. There was no apparent cell fusion activity in cells infected with NYVAC parental virus.

Resultaten van serologische analyse van sera van met NYVAC-MV (vP9l3) geïnoculeerde konijnenResults of serological analysis of sera from rabbits inoculated with NYVAC-MV (vP913)

In deze studie werden twee konijnen geïnoculeerd met 1 x 108 pfu NYVAC-MV (vP913) langs subcutane weg. Na 28 dagen kregen de dieren een booster met een equivalente dosis. Seriële bloedmonsters werden geanalyseerd op MV-neutraliserende activiteit met behulp van de plaque-reduc-tiemethode. De resultaten worden getoond in Tabel 13. De resultaten tonen aan dat geen van de konijnen een respons vertoonde op de aanvankelijke inoculatie met NYVAC-MV. De abrupt stijgende respons na de tweede inoculatie echter geeft aan dat de dieren gestimuleerd waren. Beide dieren bereikten neutraliserende antilichaamtiters in het beschermende bereik.In this study, two rabbits were inoculated with 1 x 108 pfu NYVAC-MV (vP913) by subcutaneous route. After 28 days the animals received a booster with an equivalent dose. Serial blood samples were analyzed for MV neutralizing activity using the plaque reduction method. The results are shown in Table 13. The results show that none of the rabbits showed a response to the initial inoculation with NYVAC-MV. However, the abruptly rising response after the second inoculation indicates that the animals were stimulated. Both animals achieved neutralizing antibody titers in the protective range.

De in voorbeeld 14 getoonde in vivo analyse van de immunogeniteit van ALVAC-MV (vCP82) geeft aan dat de recombinant bij inoculatie van een reeks species in staat is een serologische respons te induceren die meetbaar is met serologische standaardtests. De bereikte titers zijn in het bereik dat vereist is voor bescherming tegen ziekte. Inoculatie van NYVAC-MV (vP913) in konijnen induceert op soortgelijke wijze een gehalte aan mazelenvirus neutraliserend antilichaam dat bescherming zou bieden.The in vivo analysis of the immunogenicity of ALVAC-MV (vCP82) shown in Example 14 indicates that the recombinant upon inoculation of a series of species is able to induce a serological response measurable with standard serological tests. The titers achieved are in the range required for protection against disease. Inoculation of NYVAC-MV (vP913) in rabbits similarly induces a measles virus neutralizing antibody level that would provide protection.

TABEL 13TABLE 13

. in sera van. in sera from

Anti-mazelen neutraliserend antilichaamtiters (ΐσ»1υ konijnen geinoculeerd met NYVAC-MV (vP913)Anti-measles neutralizing antibody titers (ΐσ »1υ rabbits inoculated with NYVAC-MV (vP913)

Dier Titer weken na inoculatie WO W2Animal Titer weeks after inoculation WO W2

W4C W5 _Y!1_W4C W5 _Y! 1_

Konijn A116 <1 <1 <1 2,8b 2'2 2'2 _A117 <1_<1_<1_1,9 !t9 a) ! Konijnen kregen 8,0 log10 pfu NYVAC-MV (vpsu) s.c.Rabbit A116 <1 <1 <1 2.8b 2'2 2'2 _A117 <1_ <1_ <1_1.9! T9 a)! Rabbits received 8.0 log10 pfu NYVAC-MV (vpsu) s.c.

b) Titer uitgedrukt als log10 van de reciproke van de laatste verdunning die een vermindering van 50 % van het aantal plaques geeft vergeleken met pre-inoculatie serum.b) Titer expressed as log10 of the reciprocal of the last dilution giving a 50% reduction in the number of plaques compared to pre-inoculation serum.

c) Dieren werden opnieuw geinoculeerd na 28 dagen.c) Animals were inoculated again after 28 days.

LITERATUURLITERATURE

1. Adams, J.M., en D.T. Imagawa, Proc. Soc. Ex-per. Biol. Med. 96, 240-244 (1957).1. Adams, J.M., and D.T. Imagawa, Proc. Soc. Ex-per. Biol. Med. 96, 240-244 (1957).

2. Albrecht, P. , K. Herrman, en G.R. Burns, J. Virol. Methods 3, 251-260 (1981).2. Albrecht, P., K. Herrman, and G.R. Burns, J. Virol. Methods 3, 251-260 (1981).

3. Alkhatib, G. , en D. Briedis, Virology 150, 479-490 (1986) .3. Alkhatib, G., and D. Briedis, Virology 150, 479-490 (1986).

4. Alkhatib, G. , C. Richardson, en S-H. Shen, Virology 175, 262-270 (1990).4. Alkhatib, G., C. Richardson, and S-H. Shen, Virology 175, 262-270 (1990).

5. Appel, M.J.G., en O.R. Jones, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 126, 571-574 (1967).5. Appel, M.J.G., and O.R. Jones, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 126, 571-574 (1967).

6. Appel, M.J.G., en D.S. Robson, Am. J. Vet. Res. 34, 1459-1463 (1973).6. Appel, M.J.G., and D. S. Robson, Am. J. Vet. Res. 34, 1459-1463 (1973).

7. Avery, R.J., en J. Niven, Infect. Immun. 26, 795.-801 (1979) .7. Avery, R. J., and J. Niven, Infect. Immun. 26, 795, 801 (1979).

8. Baker, J.A., B.E. Sheffy, D.S. Robson, J. Gilmartin, Cornell Vet (USA) 56, 588-594 (1966) .8. Baker, J.A., B.E. Sheffy, D. S. Robson, J. Gilmartin, Cornell Vet (USA) 56, 588-594 (1966).

9. Bertholet, C., R. Drillien, en R. Wittek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2096-2100 (1985) .9. Bertholet, C., R. Drillien, and R. Wittek, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 2096-2100 (1985).

10. Bestetti, G. , R. Fatzer, en R. Frankhauser, Acta Neuropathol. 43, 69-75 (1978).10. Bestetti, G., R. Fatzer, and R. Frankhauser, Acta Neuropathol. 43, 69-75 (1978).

Tl. Black, F.L., L.L. Berman, M. Libel, C.A. Rei-chelt, F. de P. Pinheiro, A.T. da Rosa, F. Figuera, en E.S. Gonzales, Buil, W.H.O. 62, 315-319 (1984) .Tl. Black, F.L., L.L. Berman, M. Libel, C.A. Reichelt, F. de P. Pinheiro, A. T. da Rosa, F. Figuera, and E.S. Gonzales, Buil, W.H.O. 62, 315-319 (1984).

12. Bush, M. , R.J. Montali, D. Brownstein, A.E. James, Jr. , en M.J.G. Appel, J. Am. Vet. Med. Assoc. 169, 959-960 (1976).12. Bush, M., R.J. Montali, D. Brownstein, A.E. James, Jr. , and M.J.G. Appel, J. Am. Vet. Med. Assoc. 169, 959-960 (1976).

13. Carpenter, J.W., M.J.G. Appel, R.C. Erickson, en M.N. Novilla, J. Am. Vet. Med. Assoc. 169, 961-964 (1976) .13. Carpenter, J.W., M.J.G. Appel, R.C. Erickson, and M.N. Novilla, J. Am. Vet. Med. Assoc. 169, 961-964 (1976).

14. Choppin, P.W., C.D. Richardson, D.C. Merz, W.W. Hall, en A. Scheid, J. Infect. Dis. 143, 352-363 (1981) .14. Choppin, P. W., C. D. Richardson, D. C. Merz, W.W. Hall, and A. Scheid, J. Infect. Dis. 143, 352-363 (1981).

15. Clewell, D.B., J. Bacteriol, 110, 667-676 (1972) .15. Clewell, D. B., J. Bacteriol, 110, 667-676 (1972).

16. Clewell, D.B., en D.R. Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1159-1166 (1969).16. Clewell, D.B., and D.R. Helinski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62, 1159-1166 (1969).

17. Colinas, R.J., R.C. Condit, en E. Paoletti, Virus Research 18, 49-70 (1990).17. Colinas, R.J., R.C. Condit, and E. Paoletti, Virus Research 18, 49-70 (1990).

18. DeLay, P.D., S.S. Stone, D.T. Karzon, S. Katz, en J. Enders, Am. J. Vet. Res. 26, 1359-1373 (1965).18. DeLay, P.D., S.S. Stone, D.T. Karzon, S. Katz, and J. Enders, Am. J. Vet. Res. 26, 1359-1373 (1965).

19. Diallo, A., Vet. Micro. 23., 155-163 (1990).19. Diallo, A., Vet. Micro. 23., 155-163 (1990).

20. Dowling, P.C., B.M. Blumberg, J. Menonna, J.E.20. Dowling, P.C., B.M. Blumberg, J. Menonna, J.E.

Adamus, P. Cook, J.C. Crowley, D. Kolakofsky, en S.D. Cook, J. Gen. Virol, 67, 1987-1992 (1986) .Adamus, P. Cook, J.C. Crowley, D. Kolakofsky, and S.D. Cook, J. Gen. Virol, 67, 1987-1992 (1986).

21. Drillien, R., D. Spehner, A. Kirn, P. Girau-don, R. Buckland, F. Wild, en J.P. Lecocq, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1252-1256 (1988) .21. Drillien, R., D. Spehner, A. Kirn, P. Girau-don, R. Buckland, F. Wild, and J.P. Lecocq, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 1252-1256 (1988).

22. Engelke, D.R., P.A. Hoener, en F.S. Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 544-548 (1988).22. Engelke, D.R., P.A. Hoener, and F.S. Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 544-548 (1988).

23. Penner, F., P.A. Bachmann, E.P.J. Gibbs, F.A. Murphy, M.J. Studdert, en D.O. White, In Vete-rinary Virology, ed. F. Fenner, (Academie Press, Ine., New York) pp. 485-503 (1987).23. Penner, F., P.A. Bachmann, E.P.J. Gibbs, F.A. Murphy, M.J. Studdert, and D.O. White, In Veterinary Virology, ed. F. Fenner, (Academic Press, Ine., New York) pp. 485-503 (1987).

24. Gillespie, J.H., en D.T. Karzon, Proc. Soc. Exp. Biol Med. 105,. 547-551 (1960) .24. Gillespie, J.H., and D.T. Karzon, Proc. Soc. Exp. Biol Med. 105 ,. 547-551 (1960).

25. Giraudon, P., Ch. Gerald, en'T.F. Wild, In-tervirology 21, 110-120 (1984).25. Giraudon, P., Ch. Gerald, and 'T.F. Wild, Inervirology 21, 110-120 (1984).

26. Goebel, S.J., G.P. Johnson, M.E. Perkus, S.W. Davis, J.P. Winslow, en E.. Paoletti, Virology 179, 247-266 (1990a).26. Goebel, S.J., G.P. Johnson, M.E. Perkus, S.W. Davis, J.P. Winslow, and E. Paoletti, Virology 179, 247-266 (1990a).

27. Goebel, S.J., G.P. Johnson, M.E. Perkus, S.W. Davis, J.P. Winslow, en E. Paoletti, Virology 179, 517-563 (1990b).27. Goebel, S.J., G.P. Johnson, M.E. Perkus, S.W. Davis, J.P. Winslow, and E. Paoletti, Virology 179, 517-563 (1990b).

28. Graves, M.C., S.M. Silver, en P.W. Choppin,28. Graves, M.C., S.M. Silver, and P.W. Choppin,

Virology 86, 254-263 (1978).Virology 86, 254-263 (1978).

29. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, B.29. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, B.

Languet, P. Desmettre, G. Allen, en E. Paoletti, J. Virol. 63, 4189-4198 (1989).Languet, P. Desmettre, G. Allen, and E. Paoletti, J. Virol. 63, 4189-4198 (1989).

30. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, J.30. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M.E. Perkus, J.

Taylor, E. Norton, G. Allen, B. Languet, P.Taylor, E. Norton, G. Allen, B. Languet, P.

Desmettre, en E. Paoletti, J. Virol. 64, 2399-2406 (1990).Desmettre, and E. Paoletti, J. Virol. 64, 2399-2406 (1990).

31. Hall, W.W. , R.A. Latnb, en P.W. Choppin, Viro-logy 100, 433-449 (1980).31. Hall, W.W. , R.A. Latnb, and P.W. Choppin, Virology 100, 433-449 (1980).

32. Hartley, W.J., Vet. Path. 11, 301-312 (1974).32. Hartley, W. J., Vet. Path. 11, 301-312 (1974).

33. Imagawa, D.T., P. Goret, en J.M. Adams, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46, 1119-1123 (1960).33. Imagawa, D.T., P. Goret, and J.M. Adams, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46, 1119-1123 (1960).

34. Karzon, D.T., Pediatrics 16, 809-818 (1955).34. Karzon, D. T., Pediatrics 16, 809-818 (1955).

35. Karzon, D.T., Annals of the N.Y. Academy of Sci. 101, 527-539 (1962).35. Karzon, D. T., Annals of the N.Y. Academy of Sci. 101, 527-539 (1962).

36. Kazacos, K.R., H.L. Thacker, H.L. Shivaprasad, en P.P. Burger, J. Am. Vet. Med. Assoc. 179, 1166-1169 (.1981) .36. Kazacos, K.R., H.L. Thacker, H.L. Shivaprasad, and P.P. Burger, J. Am. Vet. Med. Assoc. 179, 1166-1169 (.1981).

37. Kingsbury, D.W., M.A. Bratt, P.W. Choppin, R.P. Hanson, T. Hosaka, V. ter Meulen, E. Norrby, W. Plowright, R. Rott, en W.H. Wunner, Intervirology 10, 137-152 (1978) .37. Kingsbury, D.W., M.A. Bratt, P.W. Choppin, R.P. Hanson, T. Hosaka, V. ter Meulen, E. Norrby, W. Plowright, R. Rott, and W.H. Wunner, Intervirology 10, 137-152 (1978).

38. Kunkel, T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985).38. Kunkel, T. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 488-492 (1985).

39. Lennon, J.L^, en F.L. Black, J, Ped. 108, 671-676 (1986).39. Lennon, J.L., and F.L. Black, J, Ped. 108, 671-676 (1986).

40. Mandecki, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7181 (1982).40. Mandecki, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7181 (1982).

41. Mandecki, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7181 (1986).41. Mandecki, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-7181 (1986).

42. Maniatis, T., E.F. Fritsch, en J. Sambrook,42. Maniatis, T., E.F. Fritsch and J. Sambrook,

Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Labora-tory, NY 545 pagina's (1982).Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, NY 545 pages (1982).

43. Maniatis, T., E.F. Fritsch, en J. Sambrook,43. Maniatis, T., E.F. Fritsch and J. Sambrook,

Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Labora-tory, NY 545 pagina's (1986) .Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, NY 545 pages (1986).

44. Merz, D.C., A. Schied, en P. Choppin, J. Exp. Med. 151, 275-288 (1980).44. Merz, D.C., A. Schied, and P. Choppin, J. Exp. Med. 151, 275-288 (1980).

45. Moura, R.A. , en J. Warren, J. Bact. 82, 702- 705 (1961).45. Moura, R.A. , and J. Warren, J. Bact. 82, 702-770 (1961).

46. Norrby, E., en Y. Gollmar, Infect. Immun. 11, 231-239 (1975).46. Norrby, E., and Y. Gollmar, Infect. Immun. 11, 231-239 (1975).

47. Norrby, E., G. Enders-Ruckle, en V. ter Meulen, J. Infect. Dis. 132, 262-269 (1975) .47. Norrby, E., G. Enders-Ruckle, and V. ter Meulen, J. Infect. Dis. 132, 262-269 (1975).

48. Norrby, E., S.N. Chen, T. Togashi, H. Shesbe-radaran, en K.P. Johnson, Archives of Virology 71, 1-11 (1982).48. Norrby, E., S.N. Chen, T. Togashi, H. Shesbe-radaran, and K.P. Johnson, Archives of Virology 71, 1-11 (1982).

49. Norrby, E.f en M.N. Oxman, In Fields Virology 2nd Ed., B.N. Fields en D.M. Knipe, eds. (Raven Press, NY) pp. 1013-1044 (1990) .49. Norrby, E.f and M.N. Oxman, In Fields Virology 2nd Ed., B.N. Fields and D.M. Knipe, eds. (Raven Press, NY) pp. 1013-1044 (1990).

50. Novick, S.L. en D. Hoekstra, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7433-7437 (1988).50. Novick, S.L. and D. Hoekstra, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7433-7437 (1988).

51. Orvell, C., en E. Norrby, J. Gen. Virol. 50, 231-245 (1980).51. Orvell, C., and E. Norrby, J. Gen. Virol. 50, 231-245 (1980).

52. Panicali, D., en E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982) .52. Panicali, D., and E. Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931 (1982).

53. Peterson, R.G., en R.A. Lamb, Cell 48, 441-452 (1987).53. Peterson, R.G., and R.A. Lamb, Cell 48, 441-452 (1987).

54. Perkus, M.E., A. Piccini, B.R. Lipinskas, en E. Paoletti, Science 229, 981-984 (1985) .54. Perkus, M.E., A. Piccini, B.R. Lipinskas, and E. Paoletti, Science 229, 981-984 (1985).

55. Perkus, M.E., K. Limbach, en E. Paoletti, J.55. Perkus, M.E., K. Limbach, and E. Paoletti, J.

Virol. 63, 3829-3836 (1989).Virol. 63, 3829-3836 (1989).

56. Perkus, M.E., S.J. Goebel, S.W. Davis, G.P.56. Perkus, M.E., S.J. Goebel, S.W. Davis, G.P.

Johnson, K. Limbach, E.K. Norton, en E. Pao letti, Virology 179, 276-286 (1990) .Johnson, K. Limbach, E.K. Norton, and E. Pao letti, Virology 179, 276-286 (1990).

57. Phillips, T.R., J.L. Jensen, M.J. Rubino, W.C. Yang, en R.D. Schultz, Can. J. Vet. Res. 53, 154-160 (1989).57. Phillips, T.R., J.L. Jensen, M.J. Rubino, W.C. Yang, and R.D. Schultz, Can. J. Vet. Res. 53, 154-160 (1989).

58. Piccini, A. , M.E. Perkus, en E. Paoletti, In Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R., en Grossman, L., (Academie Press) pp. 545-563 (1987) .58. Piccini, A., M.E. Perkus, and E. Paoletti, In Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R., and Grossman, L., (Academic Press) pp. 545-563 (1987).

59. Preblud, S.R., en S.L. Katz, In Vaccines, eds.59. Preblud, S.R., and S.L. Katz, In Vaccines, eds.

S.A. Plotkin en E.A. Mortimer, (W.B. Saunders Co.) pp. 182-222 (1988).S.A. Plotkin and E.A. Mortimer, (W.B. Saunders Co.) pp. 182-222 (1988).

60. Richardson, C.D., A. Berkovich, S. Rozenblatt, en W. Bellini, J. Virol. 54, 186-193 (1985).60. Richardson, C.D., A. Berkovich, S. Rozenblatt, and W. Bellini, J. Virol. 54, 186-193 (1985).

61. Richardson, C., D. Huil, P. Greer, K. Hasel, A. Berkovich, G. Englund, W. Bellini, B. Rima, en R. Lazzarini, Virology 155, 508-523 (1986) .61. Richardson, C., D. Huil, P. Greer, K. Hasel, A. Berkovich, G. Englund, W. Bellini, B. Rima, and R. Lazzarini, Virology 155, 508-523 (1986).

62. Roberts, J.A., J. Immunol. 94, 622-628 (1965).62. Roberts, J. A., J. Immunol. 94, 622-628 (1965).

63. Rosel, J.L., P.L. Earl, J.P. Weir, en B. Moss, J. Virol. 60, 436-449 (1986).63. Rosel, J.L., P.L. Earl, J.P. Weir, and B. Moss, J. Virol. 60, 436-449 (1986).

64. Sanger, F., S. Nicklen, en A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977) .64. Sanger, F., S. Nicklen, and A.R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977).

65. Shapira, S.K., J. Chou, F.V. Richaud, en M.J. Casadaban, Gene 25, 71-82 (1983).65. Shapira, S. K., J. Chou, F. V. Richaud, and M.J. Casadaban, Gene 25, 71-82 (1983).

66. Spehner, D., R. Drillien, en J.P. Lecocq, J. Virol. 64, 527-533 (1990).66. Spehner, D., R. Drillien, and J.P. Lecocq, J. Virol. 64, 527-533 (1990).

67. Stephenson, J.R. en V. ter Meulen, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 6601-6605 (1979).67. Stephenson, J.R. and V. ter Meulen, Proc. Wet. Acad. Sci. USA 76, 6601-6605 (1979).

68. Tabor, S., en C.C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767-4771 (1987).68. Tabor, S., and C.C. Richardson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 4767-4771 (1987).

69. Taylor, J., R. Weinberg, Y. Kawaoka, R.G.69. Taylor, J., R. Weinberg, Y. Kawaoka, R.G.

Webster, en E. Paoletti, Vaccine 6, 504-508 (1988a).Webster, and E. Paoletti, Vaccine 6, 504-508 (1988a).

70. Taylor, J., R. Weinberg, B. Languet, P. Des- mettre en E. Paoletti, Vaccine 6, 497-503 (1988b).70. Taylor, J., R. Weinberg, B. Languet, P. Desmettre and E. Paoletti, Vaccine 6, 497-503 (1988b).

71. Taylor, J., C. Edbauer, A. Rey-Senelonge, J.F. Bouquet, E. Norton, S. Goebel, P. Desmettre, en E. Paoletti, J. Virol. 64, 1441-1450 (1990) .71. Taylor, J., C. Edbauer, A. Rey-Senelonge, J.F. Bouquet, E. Norton, S. Goebel, P. Desmettre, and E. Paoletti, J. Virol. 64, 1441-1450 (1990).

72. Taylor, J., S. Pincus, J. Tartaglia, C. Richardson, G. Alkhatib, D. Briedis, M. Appel, E. Norton, en E. Paoletti, J. Virol. 65, 4263-4272 (1991) .72. Taylor, J., S. Pincus, J. Tartaglia, C. Richardson, G. Alkhatib, D. Briedis, M. Appel, E. Norton, and E. Paoletti, J. Virol. 65, 4263-4272 (1991).

73. Tizard, I., J. Am. Vet. Med. Assoc. 196, 1851-1858 (1990) .73. Tizard, I., J. Am. Vet. Med. Assoc. 196, 1851-1858 (1990).

74. Vialard, J. , M. Lalumiere, T. Vernet, D. Briedis, G. Alkhatib, D. Henning, D. Levin, en C. Richardson, J. Virol. 64, 37-50 (1990).74. Vialard, J., M. Lalumiere, T. Vernet, D. Briedis, G. Alkhatib, D. Henning, D. Levin, and C. Richardson, J. Virol. 64, 37-50 (1990).

75. Warren, J., M.K. Nadel, E. Slater, en S.J. Millian, Amer. J. Vet. Res. 21, 111-119 (1960) .75. Warren, J., M.K. Nadel, E. Slater, and S.J. Millian, Amer. J. Vet. Res. 21, 111-119 (1960).

76. Wild, T.F., E. Malvoisin, en R. Buckland, J. Gen. Virol. 72, 439-442 (1991).76. Wild, T.F., E. Malvoisin, and R. Buckland, J. Gen. Virol. 72, 439-442 (1991).

77. Wild, F., P. Giraudon, D. Spehner, R. Drillien, en J-P. Lecocq, Vaccine 8, 441-442 (1990) .77. Wild, F., P. Giraudon, D. Spehner, R. Drillien, and J-P. Lecocq, Vaccine 8, 441-442 (1990).

78. Yuen, L., en B. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6417-6421 (1987).78. Yuen, L., and B. Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6417-6421 (1987).

Claims (9)

1. Recombinant pokkenvirus, dat DNA uit mazelen-virus bevat dat codeert voor ten minste één van mazelenvi-rus hemagglutinine-glycoproteïne en mazelenvirus fusiegly-coproteïne in een niet-essentieel gebied van het pokkenvirusvirusgenoom, met het kenmerk, dat het pokkenvirus een ALVAC vogelpokkenvirus is.Recombinant smallpox virus, comprising measles virus DNA encoding at least one of measles virus hemagglutinin glycoprotein and measles virus fusion glycoprotein in a non-essential region of the smallpox virus virus genome, characterized in that the pox virus is an ALVAC bird pox virus is. 2. Recombinant vogelpokkenvirus volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het DNA uit mazelenvirus DNA is dat codeert voor mazelenvirus hemagglutinine-glycoproteïne.Recombinant bird pox virus according to claim 1, characterized in that the DNA from measles virus is DNA encoding measles virus hemagglutinin glycoprotein. 3. Recombinant vogelpokkenvirus volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het DNA uit mazelenvirus DNA is dat codeert voor mazelenvirus fusieglycoproteïne.Recombinant bird pox virus according to claim 1, characterized in that the DNA from measles virus is DNA encoding measles virus fusion glycoprotein. 4. Recombinant vogelpokkenvirus volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het DNA uit mazelenvirus DNA is dat codeert voor mazelenvirus hemagglutinine-glycoproteïne en mazelenvirus fusieglycoproteïne.Recombinant bird pox virus according to claim 1, characterized in that the DNA from measles virus is DNA encoding measles virus hemagglutinin glycoprotein and measles virus fusion glycoprotein. 5. Recombinant vogelpokkenvirus volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het DNA uit mazelenvirus DNA uit de Edmonston stam uit mazelenvirus is en onder de transcrip-tionele controle van een H6 promotor staat.The recombinant bird pox virus according to claim 1, characterized in that the measles virus DNA is Edmonston strain from measles virus and is under the transcriptional control of an H6 promoter. 6. Recombinant vogelpokkenvirus volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het vogelpokkenvirus vCP82 is.Recombinant bird pox virus according to claim 1, characterized in that the bird pox virus is vCP82. 7. Recombinant vogelpokkenvirus volgens één van de conclusies 1-6, met het kenmerk, dat het vogelpokkenvirus is voor toepassing als profylactisch middel of geneesmiddel ter bescherming van honden tegen hondeziekte door inocu-lering van de honden met het vogelpokkenvirus.A recombinant bird pox virus according to any one of claims 1-6, characterized in that the bird pox virus is for use as a prophylactic agent or medicament for protecting dogs against dog disease by inoculating the birds with the bird pox virus. 8. Vaccin voor het induceren van een immunologische respons in een gastheerdier, welk vaccin een drager en een recombinant pokkenvirus omvat, met het kenmerk, dat het recombinante pokkenvirus een recombinant vogelpokkenvirus volgens één van de conclusies 1-6 is.A vaccine for inducing an immunological response in a host animal, which vaccine comprises a carrier and a recombinant pox virus, characterized in that the recombinant pox virus is a recombinant bird pox virus according to any of claims 1-6. 9. Vaccin volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het vaccin is voor toepassing als profylactisch middel of geneesmiddel ter bescherming van honden tegen hondeziek-te door inoculering van de honden met het vogelpokkenvirus.Vaccine according to claim 8, characterized in that the vaccine is for use as a prophylactic agent or medicine for the protection of dogs against dog disease by inoculation of the dogs with the bird pox virus.