CH683921A5 - Recombinant poxvirus vaccine against measles virus. . - Google Patents

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La présente invention est relative à un poxvirus modifié et à des procédés pour le préparer et l'utiliser. Plus particulièrement, l'invention est relative à un poxvirus recombinant, virus qui exprime les produits de gène d'un gène de Morbillivirus, et à des vaccins qui impartissent une immunité protectrice contre les infections par le Mobillivirus. The present invention relates to a modified poxvirus and methods for preparing and using it. More particularly, the invention relates to a recombinant poxvirus, a virus which expresses the gene products of a Morbillivirus gene, and to vaccines which impart protective immunity against infections by Mobillivirus.

On se réfère dans la présente demande à plusieurs publications énumérées avec des chiffres arabes entre parenthèses. La citation complète de ces documents se trouve à la fin de la description proprement dite, immédiatement avant les revendications. Ces documents antérieurs décrivent l'état de la technique à laquelle l'invention appartient. In the present application, reference is made to several publications listed with Arabic numerals in parentheses. The full citation of these documents is found at the end of the description itself, immediately before the claims. These prior documents describe the state of the art to which the invention belongs.

Les virus de la vaccine et plus récemment d'autres poxvirus ont été utilisés pour l'insertion et l'expression de gènes étrangers. La technique de base pour insérer des gènes étrangers dans un poxvirus infectieux vivant implique la recombinaison entre des séquences de ADN de poxvirus flanquant un élément génétique étranger dans un plasmide donneur et des séquences homologues présentes dans le poxvirus de sauvetage (Piccini et al., 1987). Vaccinia viruses and more recently other poxviruses have been used for the insertion and expression of foreign genes. The basic technique for inserting foreign genes into a live infectious poxvirus involves recombination between DNA sequences of poxviruses flanking a foreign genetic element in a donor plasmid and homologous sequences present in the rescue poxvirus (Piccini et al., 1987 ).

Spécifiquement, les poxvirus recombinants sont construits en deux étapes connues dans la technique et analogues aux procédés pour créer des recombinants synthétiques du virus de la vaccine décrits dans le brevet des Etats-Unis n° 4 603 112, dont l'enseignement est incorporé dans la présente par référence. Specifically, the recombinant poxviruses are constructed in two stages known in the art and analogous to the methods for creating synthetic vaccinia virus recombinants described in U.S. Patent No. 4,603,112, the teaching of which is incorporated into present by reference.

En premier lieu, la séquence génétique de l'ADN à être insérée dans le virus, en particulier un cadre de lecture ouvert en provenance d'une source non-pox, est placée dans une structure construite de plasmide de E.coli dans laquelle de l'ADN homologue à une section de l'ADN du poxvirus a été introduit. Séparément, la séquence de l'ADN du gène à être insérée est réunie par ligation à un promoteur. La liaison promoteur-gène est positionnée dans la structure construite de plasmide de sorte que la liaison promoteur-gène soit encadrée par l'ADN homologue à une séquence d'ADN flanquant une région d'ADN de pox contenant un locus non essentiel. La structure construite de plasmide résultante est ensuite amplifiée par croissance à l'intérieur de la bactérie E.coli (Clewell, 1972) et isolée (Clewell et al., 1969; Maniatis et al., 1982). First, the genetic sequence of DNA to be inserted into the virus, in particular an open reading frame from a non-pox source, is placed in a constructed structure of E.coli plasmid in which DNA homologous to a section of poxvirus DNA was introduced. Separately, the DNA sequence of the gene to be inserted is ligated to a promoter. The promoter-gene link is positioned in the constructed plasmid structure so that the promoter-gene link is flanked by DNA homologous to a DNA sequence flanking a pox DNA region containing a nonessential locus. The resulting plasmid constructed structure is then amplified by growth inside the E. coli bacterium (Clewell, 1972) and isolated (Clewell et al., 1969; Maniatis et al., 1982).

Ensuite, le plasmide isolé contenant la séquence de l'ADN du gène à être insérée est transfecté dans une culture de cellules, par exemple de fibroblastes d'embryons de poulets, en même temps que le poxvirus. La recombinaison entre l'ADN de pox homologue dans le plasmide et le génome viral respectivement donnent un poxvirus modifié par la présence, dans une région non essentielle de son génome, de séquences d'ADN étranger. L'expression ADN «étranger« désigne un ADN exogène, en particulier un ADN provenant d'une source non pox, qui code pour des produits de gène qui ne sont pas ordinairement produits par le génome dans lequel l'ADN étranger est placé. Next, the isolated plasmid containing the DNA sequence of the gene to be inserted is transfected into a culture of cells, for example from fibroblasts of chicken embryos, together with the poxvirus. The recombination between the homologous pox DNA in the plasmid and the viral genome respectively gives a poxvirus modified by the presence, in a nonessential region of its genome, of foreign DNA sequences. The term "foreign" DNA refers to exogenous DNA, particularly DNA from a non-pox source, which codes for gene products which are not ordinarily produced by the genome in which the foreign DNA is placed.

La recombinaison génétique est en général l'échange de sections homologues d'ADN entre deux brins d'ADN. Chez certains virus de l'ARN peut remplacer l'ADN. Des sections homologues d'acide nucléique sont des sections d'acide nucléique (ADN ou ARN) qui ont la même séquence de bases nucléotides. Genetic recombination is generally the exchange of homologous sections of DNA between two strands of DNA. In some RNA viruses can replace DNA. Homologous nucleic acid sections are sections of nucleic acid (DNA or RNA) that have the same nucleotide base sequence.

La recombinaison génétique peut se produire naturellement au cours de la réplication ou fabrication de nouveaux génomes viraux à l'intérieur de la cellule hôte infectée. Ainsi, une recombinaison génétique entre des gènes viraux peut se produire au cours du cycle de réplication virale qui a eu lieu dans une cellule hôte qui est co-infectée par deux ou plusieurs virus différents ou autres structures génétiques. Une section d'ADN à partir d'un premier génome est utilisée d'une manière interchangeable dans la construction de la section du génomène d'un second virus coinfectant dans lequel l'ADN est homologue à celui du premier génome viral. Genetic recombination can occur naturally during the replication or manufacture of new viral genomes within the infected host cell. Thus, genetic recombination between viral genes can occur during the viral replication cycle that has taken place in a host cell that is co-infected with two or more different viruses or other genetic structures. A section of DNA from a first genome is used interchangeably in the construction of the section of the genomene of a second coinfecting virus in which the DNA is homologous to that of the first viral genome.

Cependant, la recombinaison peut également se produire entre des sections d'ADN dans des génomes différents qui ne sont pas parfaitement homologues. Si une première telle section, qui appartient à un premier génome, est homologue à une section d'un autre génome, à part la présence dans la première section de, par exemple, un marqueur génétique ou un gène codant pour un déterminant antigé-nique inséré dans une portion de l'ADN homologue, la recombinaison peut encore se produire et les produits de cette recombinaison sont alors détectables par la présence de ce marqueur génétique ou gène dans le génome viral recombinant. However, recombination can also occur between sections of DNA in different genomes that are not perfectly homologous. If a first such section, which belongs to a first genome, is homologous to a section of another genome, apart from the presence in the first section of, for example, a genetic marker or a gene coding for an antigenic determinant inserted into a portion of homologous DNA, recombination can still occur and the products of this recombination are then detectable by the presence of this genetic marker or gene in the recombinant viral genome.

L'expression réussie de la séquence génétique de l'ADN insérée, par le virus infectieux modifié, exige deux conditions. La première condition est que l'insertion doit être présente dans une région non essentielle du virus afin que le virus modifié reste viable. La seconde condition pour l'expression de l'ADN inséré est la présence d'un promoteur en relation convenable avec l'ADN inséré. Le promoteur doit être placé de sorte que il soit disposé en amont de la séquence d'ADN à exprimer. Successful expression of the genetic sequence of the inserted DNA by the modified infectious virus requires two conditions. The first condition is that the insertion must be present in a nonessential region of the virus in order for the modified virus to remain viable. The second condition for the expression of the inserted DNA is the presence of a promoter in a suitable relationship with the inserted DNA. The promoter must be placed so that it is arranged upstream of the DNA sequence to be expressed.

Le virus de la maladie des chiens (CDV) et le virus de la rougeole (MV) sont des membres du sous-groupe des Morbillivirus de la famille du genre Paramyxovirus (Diallo, 1990; Kingsbury et al., 1978). Les virus contiennent un génome à ARN à un seul brin et non segmenté de polarité négative. La maladie des chiens est une maladie fébrile hautement infectieuse des chiens et autres carnivores. Le taux de mortalité est élevé, compris entre 30 et 80%. Les chiens qui survivent présentent une détérioration permanente du système nerveux central (Fenner et al., 1987). De même, le virus de la rougeole provoque une maladie fébrile infectieuse aiguë caractérisée par une éruption macropapuleuse généralisée. La maladie affecte principalement les enfants. Dog disease virus (CDV) and measles virus (MV) are members of the subgroup of Morbilliviruses of the genus Paramyxovirus family (Diallo, 1990; Kingsbury et al., 1978). Viruses contain a single-stranded, non-segmented RNA genome of negative polarity. Dog disease is a highly infectious febrile illness of dogs and other carnivores. The mortality rate is high, between 30 and 80%. Surviving dogs show permanent deterioration of the central nervous system (Fenner et al., 1987). Likewise, the measles virus causes an acute infectious febrile illness characterized by a generalized macropapular rash. The disease mainly affects children.

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Les caractéristiques des Morbillivirus ont été récemment revues par Norrby et Oxman (1990) et Dial-lo (1990). Comme rapporté pour d'autres Paramyxovirus (Avery et Niven, 1979; Merz et al., 1980), deux protéines structurelles sont cruciales pour l'induction d'une réponse immunitaire protectrice. Celles-ci sont la glycoprotéine hémagglutinine (HA) de membrane, qui est responsable de l'hémagglutination et la fixation du virus sur la cellule hôte, et la glycoproteine de fusion (F), qui provoque une fusion de membranes entre le virus et la cellule infectée ou entre des cellules infectées et non infectées adjacentes (Graves et al., 1978). L'ordre des gènes dans le génome du MV a été déduit par Richardson et al. (1985) et Dowling et al. (1986). Les séquences de nucléotides du gène de MVHA et du gène de MVF ont été déterminées par Alkhatib et Briedis (1986) et Richardson et al. (1986), respectivement. The characteristics of Morbilliviruses were recently reviewed by Norrby and Oxman (1990) and Dial-lo (1990). As reported for other Paramyxoviruses (Avery and Niven, 1979; Merz et al., 1980), two structural proteins are crucial for the induction of a protective immune response. These are the hemagglutinin glycoprotein (HA) membrane, which is responsible for hemagglutination and binding of the virus to the host cell, and the fusion glycoprotein (F), which causes a fusion of membranes between the virus and the infected cell or between adjacent infected and uninfected cells (Graves et al., 1978). The order of genes in the genome of MV has been deduced by Richardson et al. (1985) and Dowling et al. (1986). The nucleotide sequences of the MVHA gene and the MVF gene were determined by Alkhatib and Briedis (1986) and Richardson et al. (1986), respectively.

CDV et MV sont structurellement semblables et partagent une relation sérologique étroite. Des études d'immunoprécipitation ont montré que de l'antisérum vis-à-vis de MV fait précipiter toutes les protéines du CDV (P, NP, F, HA et M). Par contre, l'antisérum vis-à-vis de CDV fait précipiter toutes les pro-teines du MV excepté la glycoprotéine HA (Hall et al., 1980; Orvell et al., 1980; Stephenson et al., 1979). A la lumière de cette relation sérologique étroite, il a été précédemment démontré que la vaccination au moyen de MV provoque la protection contre l'attaque par CDV chez les chiens (Gillespie et al. 1960; Moura et al., 1961; Warren et al., 1960). La neutralisation des anticorps contre le CDV a été rapportée dans les sérums anti-MV humains (Adams et al., 1957; Imagawa et al., 1960; Karzon, 1955; Karzon, 1962), mais des anticorps neutralisants contre MV n'ont pas été découverts dans les sérums anti-CDV à partir des chiens (Delay et al., 1965; Karzon, 1962; Roberts, 1965). CDV and MV are structurally similar and share a close serological relationship. Immunoprecipitation studies have shown that antiserum against MV causes all the CDV proteins to precipitate (P, NP, F, HA and M). On the other hand, the antiserum vis-à-vis CDV causes all the MV proteins except the HA glycoprotein to precipitate (Hall et al., 1980; Orvell et al., 1980; Stephenson et al., 1979). In light of this close serological relationship, vaccination with MV has previously been shown to protect against CDV attack in dogs (Gillespie et al. 1960; Moura et al., 1961; Warren et al ., 1960). Neutralization of antibodies against CDV has been reported in human anti-VM sera (Adams et al., 1957; Imagawa et al., 1960; Karzon, 1955; Karzon, 1962), but neutralizing antibodies against MV have not not found in anti-CDV sera from dogs (Delay et al., 1965; Karzon, 1962; Roberts, 1965).

Les gènes de MV HA et de F ont été exprimés dans plusieurs secteurs viraux, y compris le virus de la vaccine (Drillien et al., 1988; Wild et al., 1991), le virus de la diphtérie (ou peste) ou pox aviaire (Spehner et al., 1990; Wild et al., 1990) l'adénovirus (Alkhatib et al., 1990) et le baculovirus (Vialard et al., 1990). Dans ces études, des protéines de MV authentiques ont été exprimées et elles sont effectivement fonctionnelles dans des essais d'hémagglutination (Vialard et al., 1990), d'hémolyse (Alkhatib et al., 1990; Vialard et al. 1190), ou de fusion de cellules (Alkhatib et al., 1990; Vialard et al., 1990; Wild et al., 1990). Lorsqu'elle est insérée dans un vecteur de virus de vaccine, l'expression soit de la protéine de HA ou de la protéine de F a été capable de provoquer une réponse immunitaire protectrice chez les souris contre l'encéphalite par MV (Drillien et al., 1988). De même, l'expression de la protéine de F dans un vecteur de virus de la diphtérie aviaire a provoqué une immunité protectrice contre l'encéphalite par MV chez les souris (Wild et al., 1990). On n'a pas rapporté d'études de protection au moyen d'autres vecteurs. The MV HA and F genes have been expressed in several viral sectors, including vaccinia virus (Drillien et al., 1988; Wild et al., 1991), diphtheria (or plague) virus or pox avian (Spehner et al., 1990; Wild et al., 1990) adenovirus (Alkhatib et al., 1990) and baculovirus (Vialard et al., 1990). In these studies, authentic VM proteins have been expressed and they are effectively functional in hemagglutination (Vialard et al., 1990), hemolysis (Alkhatib et al., 1990; Vialard et al. 1190) tests, or cell fusion (Alkhatib et al., 1990; Vialard et al., 1990; Wild et al., 1990). When inserted into a vaccinia virus vector, expression of either HA protein or F protein was able to elicit a protective immune response in mice against encephalitis by MV (Drillien et al ., 1988). Likewise, the expression of the F protein in an avian diphtheria virus vector caused protective immunity against encephalitis by MV in mice (Wild et al., 1990). Protection studies with other vectors have not been reported.

La demande de brevet Européen n° 0 314 569 est relative à l'expression d'un gène de MV dans la diphtérie aviaire. European patent application No. 0 314 569 relates to the expression of an MV gene in avian diphtheria.

Perkus et al. (1990) ont décrit récemment la définition de deux gènes à domaine d'hôte (host range) uniques dans le virus de vaccine. Ces gènes codent des fonctions de domaine d'hôte, c'est-à-dire de gamme d'hôtes assurant la réplication du virus de la vaccine sur différents substrats de cellule in vitro. Les gènes codent les fonctions de domaine d'hôte ou spectre d'activité pour la réplication du virus de la vaccine sur des cellules humaines aussi bien que sur des cellules d'origine lapine ou porcine. La définition de ces gènes assure le développement d'un vecteur de virus de la vaccine qui, tout en exprimant des gènes étrangers intéressants, serait sévèrement restreint dans sa capacité à se répliquer dans des cellules définies. Ceci augmenterait grandement les caractéristiques de sécurité des recombinants de virus de la vaccine. Perkus et al. (1990) recently described the definition of two unique host range genes in vaccinia virus. These genes encode functions of the host domain, that is to say of the host range ensuring replication of the vaccinia virus on different cell substrates in vitro. The genes encode the host domain or activity spectrum functions for the replication of the vaccinia virus on human cells as well as on cells of rabbit or porcine origin. The definition of these genes ensures the development of a vaccinia virus vector which, while expressing interesting foreign genes, would be severely restricted in its ability to replicate in defined cells. This would greatly enhance the safety characteristics of vaccinia virus recombinants.

Un vecteur atténué a été développé par la suppression séquentielle de six régions non essentielles de la souche Copenhagen (Copenhague) du virus de la vaccine. An attenuated vector was developed by the sequential deletion of six nonessential regions of the Copenhagen (Copenhagen) strain of vaccinia virus.

Ces régions sont connues pour coder des protéines qui peuvent avoir un rôle dans la virulence virale. Les régions supprimées sont le gène tk, le gène hémorragique, le gène d'inclusion de type A, le gène d'hémagglutinine et le gène codant pour l'importante sous-unité de la ribonucléotide réductase, aussi bien que les séquences C7L à KIL définies précédemment (Perkus et al., 1990). Les séquences et les emplacements génomiques de ces gènes dans la souche Copenhagen du virus de la vaccine ont été définis précédemment (Goebel et al., 1990 a, b). La souche de vaccine atténuée résultante est désignée NYVAC. These regions are known to encode proteins which may have a role in viral virulence. The deleted regions are the tk gene, the hemorrhagic gene, the type A inclusion gene, the hemagglutinin gene and the gene coding for the important ribonucleotide reductase subunit, as well as the C7L to KIL sequences. previously defined (Perkus et al., 1990). The sequences and the genomic locations of these genes in the Copenhagen strain of the vaccinia virus have been defined previously (Goebel et al., 1990 a, b). The resulting attenuated vaccinia strain is designated NYVAC.

La technologie de la production de recombinants du virus de la vaccine a été étendue récemment à d'autres membres de la famille des poxvirus qui ont un domaine d'hôte ou spectre d'activité plus restreint. Le poxvirus aviaire, la diphtérie ou peste aviaire ont été construites en tant que virus recombinant exprimant le gène G de la rage (Taylor et al., 1988b). Ce virus recombinant est également décrit dans la demande de brevet PCT publiée n° WO 89/03 429. Lors de l'inoculation du recombinant dans un certain nombre d'espèces non aviaires, une réponse immunitaire à la rage a été provoquée, qui, chez les souris, les chats et les chiens, est protectrice contre une attaque mortelle de la rage. The technology for the production of vaccinia virus recombinants has recently been extended to other members of the poxvirus family which have a more restricted host domain or spectrum of activity. The avian poxvirus, diphtheria or avian plague were constructed as a recombinant virus expressing the G gene of rabies (Taylor et al., 1988b). This recombinant virus is also described in PCT patent application published No. WO 89/03 429. During the inoculation of the recombinant in a number of non-avian species, an immune response to rabies has been elicited, which, in mice, cats and dogs, is protective against a fatal attack of rabies.

Tant la maladie des chiens que la rougeole sont contrôlées couramment par l'utilisation de vaccins atténués vivants (Fenner et al., 1987; Preblud et al., 1988). L'immunisation est recommandée pour le contrôle de CDV en utilisant un vaccin atténué vivant à l'âge de huit semaines et de nouveau à l'âge de 12 à 16 semaines. Bien que l'immunité au CDV dure toute la vie, on recommande généralement une revaccination annuelle, étant donné la nature hautement infectieuse de l'agent et la sévérité de la maladie. Both dog disease and measles are commonly controlled with the use of live attenuated vaccines (Fenner et al., 1987; Preblud et al., 1988). Immunization is recommended for CDV control using a live attenuated vaccine at eight weeks of age and again at 12 to 16 weeks of age. Although immunity to CDV lasts a lifetime, annual revaccination is generally recommended, given the highly infectious nature of the agent and the severity of the disease.

Un problème qui se pose avec la politique habituelle de revaccination continuelle est que les mères A problem with the usual policy of continual revaccination is that mothers

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ayant une immunité vis-à-vis du CDV passent l'anticorps neutralisant à leurs descendants dans le Colostrum. Il est difficile de déterminer lorsque les niveaux d'anticorps vont disparaître suffisamment pour que les chiots puissent être vaccinés. having immunity to CDV pass the neutralizing antibody to their descendants in Colostrum. It is difficult to determine when the antibody levels will drop enough for the puppies to be vaccinated.

Ceci laisse un créneau temporel au cours duquel les chiots peuvent être susceptibles d'être infectés par CDV. L'utilisation d'un vaccin recombinant exprimant seulement les glycoprotéines du virus de la rougeole peut fournir un moyen pour surmonter les effets inhibitoires des anticorps maternels et permettre la vaccination des nouveaux-nés. En fait, on a démontré que des anticorps spécifiques vis-à-vis du CDV chez des chiots qui ont tété des mères qui sont immunisées contre CDV n'empêchent pas le développement d'anticorps spécifiques vis-à-vis du MV lorsqu'ils sont inoculés avec un vaccin MV (Baker et al., 1966). This leaves a time window in which puppies may be susceptible to CDV infection. The use of a recombinant vaccine expressing only the measles virus glycoproteins can provide a means to overcome the inhibitory effects of maternal antibodies and allow vaccination of newborns. In fact, it has been shown that specific antibodies to CDV in puppies that have suckled mothers who are immunized against CDV do not prevent the development of specific antibodies to MV when are inoculated with an MV vaccine (Baker et al., 1966).

D'autres limitations des vaccins à CDV vivant modifié, qui sont utilisées habituellement, ont été discutées précédemment (Tizard, 1990) et sont liées à la possibilité de ces souches de vaccins de se répliquer chez les animaux vaccinés. Ces effets nuisibles sont les plus apparents lorsque la souche de vaccin à CDV est co-inoculée avec des adénovirus canins 1 et 2 chez des chiens, en provoquant une im-munosuppression, une thrombocytopénie et une encéphalite (Bestetti et al., 1978; Hartley, 1974; Phillips et al., 1989). Les vaccins à CDV vivant modifié ont également été indiqués comme induisant des maladies chez d'autres animaux particuliers y compris les renards Kinkajous, les furets et les pandas (Bush et al., 1976; Carpenter et al., 1976; Kazacos et al., 1981). C'est pourquoi l'utilisation de vaccin à CDV recombinant, en tant que candidat, éliminerait l'introduction continuelle de CDV vivant modifié dans l'environnement et des complications potentielles associées au vaccin et induites par le vaccin, qui se sont produites lors d'utilisation de vaccins à CDV classiques. Other limitations of live modified CDV vaccines, which are commonly used, have been discussed previously (Tizard, 1990) and are related to the ability of these vaccine strains to replicate in vaccinated animals. These adverse effects are most apparent when the CDV vaccine strain is co-inoculated with canine adenoviruses 1 and 2 in dogs, causing immunosuppression, thrombocytopenia and encephalitis (Bestetti et al., 1978; Hartley , 1974; Phillips et al., 1989). Live modified CDV vaccines have also been reported to induce disease in other specific animals including Kinkajous foxes, ferrets and pandas (Bush et al. 1976; Carpenter et al. 1976; Kazacos et al. , nineteen eighty one). Therefore, the use of recombinant CDV vaccine, as a candidate, would eliminate the continual introduction of living modified CDV into the environment and the potential vaccine-related and vaccine-related complications that have occurred during use of conventional VCT vaccines.

L'utilisation de vecteurs de poxvirus peut également fournir un moyen pour surmonter l'effet inhibitoire bien connu que les anticorps maternels ont sur la vaccination avec les souches de CDV atténuées vivantes chez les chiens. Des chiots nés de mères précédemment immunisées à l'âge jeune au moyen d'un poxvirus recombinant peuvent éviter l'interférence des anticorps maternels spécifiques vis-à-vis du CDV. The use of poxvirus vectors can also provide a means to overcome the well-known inhibitory effect that maternal antibodies have on vaccination with live attenuated CDV strains in dogs. Puppies born to mothers previously immunized at young age with a recombinant poxvirus can avoid interference from specific maternal antibodies to CDV.

En outre, la possibilité tant pour les vecteurs de virus de la vaccine que pour les vecteurs de virus du pox du canari abritant les gènes du MV HA et du F de provoquer ces réponses et le manque de réactivité croisée sérologique entre les deux poxvirus fournit un avantage supplémentaire en ce qu'un des vecteurs peut être utilisé précocement dans la vie du chiot et l'autre vecteur plus tard, afin d'accroître l'immunité spécifique vis-à-vis du CDV. Ceci éliminerait la libération de souches de CDV atténuées vivantes dans l'environnement, un événement lié à la production de complications induites par le vaccin et associées au vaccin (Tizard, 1990). In addition, the possibility for both vaccinia virus vectors and canary pox virus vectors harboring the MV HA and F genes to elicit these responses and the lack of serological cross-reactivity between the two poxviruses additional advantage in that one of the vectors can be used early in the life of the puppy and the other vector later, in order to increase specific immunity to CDV. This would eliminate the release of live attenuated CDV strains into the environment, an event related to the production of vaccine-induced complications associated with the vaccine (Tizard, 1990).

On peut ainsi apprécier que la production d'un poxvirus recombinant de Morbillivirus et de vaccins qui impartissent une immunité protectrice contre les infections par le Morbillivirus serait un progrès hautement désirable par rapport à l'état actuel de la technologie. It can thus be appreciated that the production of a recombinant Morbillivirus poxvirus and of vaccines which impart protective immunity against Morbillivirus infections would be a highly desirable advance over the current state of technology.

C'est pourquoi l'invention a pour objet de fournir des poxvirus recombinants, virus qui expriment des produits de gène des Morbillivirus, et de fournir un procédé pour préparer de tels poxvirus recombinants. This is why the object of the invention is to provide recombinant poxviruses, viruses which express gene products of Morbilliviruses, and to provide a process for preparing such recombinant poxviruses.

C'est un objet supplémentaire de l'invention de réaliser le clonage et l'expression des séquences de codage du Morbillivirus, en particulier des séquences de codage du virus de la rougeole, dans un vecteur de poxvirus particulièrement dans des vecteurs de virus de la vaccine ou de virus du pox du canari. It is an additional object of the invention to carry out the cloning and the expression of the coding sequences of the Morbillivirus, in particular the coding sequences of the measles virus, in a poxvirus vector particularly in vectors of the virus vaccinia or canary pox virus.

C'est un autre objet de l'invention de fournir un vaccin qui soit capable de provoquer la production d'anticorps neutralisant le Morbillivirus, des anticorps inhibant Phémagglutination et de produire une immunité protectrice contre l'infection par le Morbillivirus et une attaque mortelle par le Morbillivirus, particulièrement en fournissant une protection croisée des chiens contre la maladie des chiens en utilisant un vaccin contre le poxvirus à base de virus recombinant de la rougeole. It is another object of the invention to provide a vaccine which is capable of causing the production of antibodies neutralizing Morbillivirus, antibodies inhibiting haemagglutination and of producing protective immunity against infection by Morbillivirus and a fatal attack by Morbillivirus, particularly by providing cross-protection of dogs against dog disease using a poxvirus vaccine based on recombinant measles virus.

Ces objets et d'autres objets et avantages de la présente invention apparaîtront encore davantage après la considération de la description détaillée qui va suivre. These objects and other objects and advantages of the present invention will become even more apparent after consideration of the detailed description which follows.

Suivant un aspect, la présente invention est relative à un poxvirus recombinant contenant une séquence d'ADN à partir du Morbillivirus dans une région non essentielle du génomène du poxvirus. Le poxvirus qui est avantageusement un virus de la vaccine ou un virus du pox ou peste aviaire, tel que le virus du pox ou du canari. Le Morbillivirus est avantageusement le virus de la rougeole. According to one aspect, the present invention relates to a recombinant poxvirus containing a DNA sequence from the Morbillivirus in a nonessential region of the genomene of the poxvirus. The poxvirus which is advantageously a vaccinia virus or a pox or avian plague virus, such as the pox or canary virus. The Morbillivirus is advantageously the measles virus.

Selon la présente invention, le poxvirus recombinant exprime des produits de gène du gène de Morbillivirus étranger. En particulier, l'ADN étranger code pour une glycoprotéine du virus de la rougeole, de préférence la glycoprotéine d'hémagglutinine du virus de la rougeole et la glycoprotéine de fusion du virus de la rougeole. Avantageusement, plusieurs glycoprotéines du virus de la rougeole sont co-expri-mées chez l'hôte par le poxvirus recombinant. According to the present invention, the recombinant poxvirus expresses gene products of the foreign Morbillivirus gene. In particular, foreign DNA codes for a measles virus glycoprotein, preferably the measles virus hemagglutinin glycoprotein and the measles virus fusion glycoprotein. Advantageously, several glycoproteins of the measles virus are co-expressed in the host by the recombinant poxvirus.

Selon un autre aspect, la présente invention est relative à un vaccin pour induire une réponse immu-nologique chez un animal hôte inoculé avec le vaccin, ledit vaccin comprenant un véhicule et un poxvirus recombinant contenant, dans une région non essentielle de celui-ci, de l'ADN provenant du Morbillivirus, en particulier du virus de la rougeole. Avantageusement, l'ADN code pour, et exprime, une glycoprotéine du virus de la rougeole, en particulier une glycoprotéine de l'hémagglutinine du virus de la rougeole et une glycoprotéine de fusion du virus de la rougeole. Plusieurs glycoprotéines du virus de la According to another aspect, the present invention relates to a vaccine for inducing an immunological response in a host animal inoculated with the vaccine, said vaccine comprising a vehicle and a recombinant poxvirus containing, in a nonessential region thereof, DNA from the Morbillivirus, particularly the measles virus. Advantageously, DNA codes for, and expresses, a measles virus glycoprotein, in particular a measles virus hemagglutinin glycoprotein and a measles virus fusion glycoprotein. Several glycoproteins of the

4 4

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

rougeole sont avantageusement co-exprimées chez l'hôte. Le poxvirus utilisé dans le vaccin selon la présente invention est avantageusement un virus de la vaccine ou un virus du pox aviaire (ou avipox virus), tel que le virus du pox du canari. measles are advantageously co-expressed in the host. The poxvirus used in the vaccine according to the present invention is advantageously a vaccinia virus or an avian pox virus (or avipox virus), such as the canary pox virus.

Une meilleure compréhension de la présente invention sera également obtenue en se référant aux dessins annexés sur lesquels: A better understanding of the present invention will also be obtained by referring to the appended drawings in which:

La fig. 1 représente schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pSPM2LHAVC utilisé pour dériver un virus de vaccine recombinant vP557 exprimant le gène de l'hémaggiutinine de MV; Fig. 1 schematically represents a method for the construction of the plasmid pSPM2LHAVC used to derive a recombinant vaccinia virus vP557 expressing the hemaggiutinin gene of MV;

La fig. 2 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pSPMFVC utilisé pour dériver un virus de vaccine recombinant vP455 exprimant le gène de fusion de MV; Fig. 2 schematically illustrates a method for the construction of the plasmid pSPMFVC used to derive a recombinant vaccinia virus vP455 expressing the MV fusion gene;

La fig. 3 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pRW843 utilisé pour dériver un virus de vaccine recombinant vP756 exprimant le gène de l'hémaggiutinine de MV; Fig. 3 schematically illustrates a method for the construction of the plasmid pRW843 used to derive a recombinant vaccinia virus vP756 expressing the hemaggiutinin gene of MV;

La fig. 4 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pRW850 utilisé pour deriver un virus de vaccine recombinant vP800 exprimant le gène de fusion de MV; Fig. 4 schematically illustrates a method for the construction of the plasmid pRW850 used to derive a recombinant vaccinia virus vP800 expressing the MV fusion gene;

La fig. 5 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pRW800 utilisé pour dériver un virus de vaccine recombinant vCP40 exprimant le gène de fusion de MV; Fig. 5 schematically illustrates a method for the construction of the plasmid pRW800 used to derive a recombinant vaccinia virus vCP40 expressing the MV fusion gene;

La fig. 6 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pRW810 utilisé pour dériver des virus de canaripox recombinant vCP50 exprimant le gène de l'hémaggiutinine de MV et vCP57 co-exprimant les gènes de fusion de MV et de l'hémaggiutinine; Fig. 6 schematically illustrates a method for the construction of the plasmid pRW810 used to derive recombinant canaripox viruses vCP50 expressing the hemaggiutinin gene of MV and vCP57 co-expressing the fusion genes of MV and hemaggiutinin;

La fig. 7 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pRW852 utilisé pour dériver un virus de canaripox recombinant vCP85 exprimant le gène de l'hémaggiutinine de MV; Fig. 7 schematically illustrates a method for the construction of the plasmid pRW852 used to derive a recombinant canaripox virus vCP85 expressing the hemaggiutinin gene of MV;

La fig. 8 représente schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pRW853A utilisé pour dériver le virus de canaripox recombinant vCP82 co-exprimant les gènes de l'hémaggiutinine de MV et de fusion; Fig. 8 schematically represents a method for the construction of the plasmid pRW853A used to derive the recombinant canaripox virus vCP82 co-expressing the genes of the hemaggiutinin of MV and fusion;

La fig. 9 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pSD460 pour la suppression du gène de la thymidine kinase et pour la production du virus de vaccine recombinant vP410; Fig. 9 schematically illustrates a process for the construction of the plasmid pSD460 for the suppression of the thymidine kinase gene and for the production of the recombinant vaccinia virus vP410;

La fig. 10 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pSD486 pour la suppression de la région hémorragique et pour la production du virus de vaccine recombinant vP553; Fig. 10 schematically illustrates a process for the construction of the plasmid pSD486 for the suppression of the hemorrhagic region and for the production of the recombinant vaccinia virus vP553;

La fig. 11 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pMP494 A pour la suppression de la région ATI et pour la production du virus de vaccine recombinant vP618; Fig. 11 schematically illustrates a process for the construction of the plasmid pMP494 A for the suppression of the ATI region and for the production of the recombinant vaccinia virus vP618;

La fig. 12 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pSD467 pour la suppression du gène de l'hémaggiutinine et pour la production du virus de vaccine recombinant vP723; Fig. 12 schematically illustrates a method for the construction of the plasmid pSD467 for the suppression of the hemaggiutinin gene and for the production of the recombinant vaccinia virus vP723;

La fig. 13 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pMPCSKI A pour la suppression de la grappe de gènes (C7L-K1L] et pour la production du virus de vaccine recombinant vP804; Fig. 13 schematically illustrates a process for the construction of the plasmid pMPCSKI A for the suppression of the gene cluster (C7L-K1L] and for the production of the recombinant vaccinia virus vP804;

La fig. 14 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pSD548 pour la suppression de la sous-unité importante, la ribonucléotide réductase, et pour la production du virus de vaccine recombinant vP866 (NYVAC); et Fig. 14 schematically illustrates a process for the construction of the plasmid pSD548 for the suppression of the important subunit, the ribonucleotide reductase, and for the production of the recombinant vaccinia virus vP866 (NYVAC); and

La fig. 15 illustre schématiquement un procédé pour la construction du plasmide pRW857 utilisé pour dériver le virus NYVAC recombinant vP913 co-exprimant les gènes de l'hémaggiutinine de MV et de fusion. Fig. 15 schematically illustrates a method for the construction of the plasmid pRW857 used to derive the recombinant NYVAC virus vP913 co-expressing the hemaggiutinin genes of MV and fusion.

Les exemples qui vont suivre et qui sont donnés à titre d'illustration, sans aucun caractère limitatif permettent une meilleure compréhension de la présente invention et de ses nombreux avantages. The examples which follow and which are given by way of illustration, without any limiting character, allow a better understanding of the present invention and of its numerous advantages.

EXEMPLE 1 - Production de virus recombinants de la vaccine contenant le gène d'hémaaglutinine de la rougeole. EXAMPLE 1 Production of Recombinant Vaccinia Viruses Containing the Measles Hemaaglutinin Gene

Le virus de sauvetage utilisé dans la production des deux recombinants était la souche Copenhagen (ou Copenhague) du virus de la vaccine dont le gène de thymidine kinase a été supprime. Tous les virus ont été cultivés et titrés (analysées) sur des monocouches de cellules de VERO. The rescue virus used in the production of the two recombinants was the Copenhagen (or Copenhagen) strain of the vaccinia virus from which the thymidine kinase gene was deleted. All viruses were cultured and titrated (analyzed) on VERO cell monolayers.

Le promoteur H6 du virus de la vaccine précoce/tardif (Rosei et al., 1986; Taylor et al., 1988a, b) a été construit par hybridation ou circularisation de quatre oligonucléotides H6SYN A-D chevauchant. La séquence H6 résultante est la suivante: The early / late vaccinia virus H6 promoter (Rosei et al., 1986; Taylor et al., 1988a, b) was constructed by hybridization or circularization of four overlapping H6SYN A-D oligonucleotides. The resulting H6 sequence is as follows:

5 5

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

Promoteur H6 du virus de la vaccine (SER ID NO:1/SEQ ID H6 vaccinia virus promoter (SER ID NO: 1 / SEQ ID

NO:2): HindIII NO: 2): HindIII

5 * AGCTTCTTTATTCTATAXTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGT 5 * AGCTTCTTTATTCTATAXTTAAAAAGTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGT

AGAAATAAGATATGAATTTTTCACTTTTATTTATGTTTCCAAGAACTCCCAACA GTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAAGTT CAATTTAACTTTCGCTCTTTATTAGTATTTAATAAAGTAATAGCGCTATAGGCAATTCAA TGTATCGTAC-3' AGAAATAAGATATGAATTTTTCACTTTTATTTATGTTTCCAAGAACTCCCAACA GTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAAGTT CAATTTAACTTTCGCTCTTTATTAGTATTTAATAAAGTAATAGCGCTATAGGCAATTCAA TGTATCT

ACATAGCATGAGCT-5' ACATAGCATGAGCT-5 '

Xhol Xhol

En se référant maintenant à la fig. 1, les oligonucléotides H6SYN hybridés sont réunis par ligation ou soudure en pMP2LVC, digérés au moyen de Xhol/Hindlll pour donner le plasmide pSP131. Le plasmide pMP2LVC contient les 0,4 kbp les plus à gauche du virus de la vaccine (souche Copenhagen) région HindIII K dans pUC18. La construction de pMP2LVC a été réalisée comme suit: un fragment Hindlll/Sall de 0,4 kbp de la région HindIII X a été isolé et doté d'une extrémité franche au moyen d'un fragment de Klenow de l'ADN polimérase de E. coli en présence de 2mM dnTPs. Ce fragment a été inséré dans pUC18 qui a été digéré avec Pvulll. Le plasmide résultant est désigné pMP2VC. Le plasmide pMP2VC a été linéarisé au moyen de SsPI. Les oligonucléotides synthétiques MPSYN52 (SER ID NO:3) (5-ATTAI I I I IATAAGCTTGGATCCCTCGAGGGTACCCCCGGGGAGCTCGAATTCT-3') et MPSYN53 (SER ID N0:4) (5-AGAATTCGAGCTCCCCGGGGGTACCCTCGAGGGATCCAAGCTTATAAAAATAAT-3') ont été hybridés et insérés dans le plus à gauche des deux sites SsPI disposées a l'intérieur des séquences du virus de la vaccine. Le plasmide résultant pMP2LVC contient une région de clonage multiple dans la région intergénique entre les cadres de lecture ouverts K1L et K2L. Referring now to FIG. 1, the hybridized H6SYN oligonucleotides are combined by ligation or welding to pMP2LVC, digested using Xhol / Hindlll to give the plasmid pSP131. The plasmid pMP2LVC contains the leftmost 0.4 kbp of the vaccinia virus (Copenhagen strain) HindIII K region in pUC18. The construction of pMP2LVC was carried out as follows: a 0.4 kbp Hindlll / SalI fragment of the HindIII X region was isolated and provided with a blunt end by means of a Klenow fragment of DNA polimerase from E coli in the presence of 2mM dnTPs. This fragment was inserted into pUC18 which was digested with Pvul11. The resulting plasmid is designated pMP2VC. Plasmid pMP2VC was linearized using SsPI. Synthetic oligonucleotides MPSYN52 (SER ID NO: 3) (5-ATTAI III IATAAGCTTGGATCCCTCGAGGGTACCCCCGGGGAGCTCGAATTCT-3 ') and MPSYN53 (SER ID N0: 4) (5-AGAATTCGAGCTCCCCGGGGGGTACCCAGATGGGTACCCAGATGGGTTACCCAGATGTGGTGTA SsPI sites arranged within the vaccinia virus sequences. The resulting plasmid pMP2LVC contains a multiple cloning region in the intergenic region between the open reading frames K1L and K2L.

Les oligonucléotides hybridés 3P1 (SEQ ID N0:5) (5-GGGAAGATGGAACCAATCGCAGATAG-3') et 3P2 (SEQ ID NO:6) (5-AATTCTATCTGCGATTGGGGTTCCATCTTCCC-3') contenant les séquences 3' extrêmes du gène HA et une extrémité EcoRI cohésive ont été réunis par ligation a un fragment Xhol/ Smal de 1,8 kbp provenant de pMH22 contenant la partie restante du gène de HA et pSP131 a été digéré au moyen de Xhol et EcoRI. Le plasmide résultant a été désigné pSPMHAH. Le plasmide pMH22 a été déduit à partir d'un clone de CADN de longueur complète du gène HA de la rougeole en créant un site XHOI au codon d'initiation ATG (Alkhatib et al., 1986). The 3P1 hybridized oligonucleotides (SEQ ID N0: 5) (5-GGGAAGATGGAACCAATCGCAGATAG-3 ') and 3P2 (SEQ ID NO: 6) (5-AATTCTATCTGCGATTGGGGTTCCATCTTCCC-3') containing the 3 'extreme sequences of the HA gene and a cohesive EcoRI end were ligated to a 1.8 kbp Xhol / Smal fragment from pMH22 containing the remaining part of the HA gene and pSP131 was digested using Xhol and EcoRI. The resulting plasmid was designated pSPMHAH. The plasmid pMH22 was deduced from a full length CADN clone of the HA gene of measles by creating an XHOI site at the ATG initiation codon (Alkhatib et al., 1986).

Le fragment Hindi ll-/EcoRI de 1,9 kbp provenant de pSPMHA11, contenant le gène HA de la rougeole, a été isolé et doté d'une extrémité franche au moyen du fragment de Klenow de l'ADN polymérase de E. coli en présence de 2mM dNTPs. Le fragment isolé a été inséré dans pMP409DVC (Guo et al., 1989) digéré au moyen de Bfllll et doté d'une extrémité franche par traitement avec ia nucléase de mung bean. L'insertion dans ce vecteur a donné le plasmide pSPMHA41. Le site Xhol entre le promoteur H6 et le codon d'initiation du gène HA a été éliminé par mutagénèse de rupture de double brin dirigée par oligonucléotide (Mandecki, 1982) en utilisant l'oligonucléotide HAXHOD (SEQ ID NO:7) (5-ATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCACCACAACGAGACCGGAT-3'). Le plasmi- de pSPM2LHAVC a été engendré par ce procédé. Le plasmide d'insertion pSPM2LHAVC a été utilisé dans des expériences de recombinaison in vitro au moyen du virus de vaccine vP458 en tant que virus de sauvetage pour engendrer le recombinant vP557. Le vP458 contient le gène lac Z de E.coli dans le site d'insertion m2L de vP410. Ce virus de vaccine recombinant contient le gène HA de la rougeole dans le locus M2L du génome remplaçant le gène lac Z. The 1.9 kbp Hindi ll- / EcoRI fragment from pSPMHA11, containing the HA measles gene, was isolated and blunt-ended using the Klenow fragment of E. coli DNA polymerase in presence of 2mM dNTPs. The isolated fragment was inserted into pMP409DVC (Guo et al., 1989) digested with BllII and end blunted by treatment with mung bean nuclease. Insertion into this vector gave the plasmid pSPMHA41. The Xhol site between the H6 promoter and the HA gene initiation codon was eliminated by oligonucleotide-directed double-strand rupture mutagenesis (Mandecki, 1982) using the oligonucleotide HAXHOD (SEQ ID NO: 7) (5- ATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGTCACCACAACGAGACCGGAT-3 '). The pSPM2LHAVC plasma was generated by this process. The insertion plasmid pSPM2LHAVC was used in in vitro recombination experiments using vaccinia virus vP458 as a rescue virus to generate the recombinant vP557. VP458 contains the lac Z gene from E. coli in the m2L insertion site of vP410. This recombinant vaccinia virus contains the HA gene for measles in the M2L locus of the genome replacing the lac Z gene.

EXEMPLE 2 - EXAMPLE 2 -

En se référant maintenant à la fig. 2, des 30 oligonucléotides hybridés 3PA (SEQ ID NO:8) (5'-CCTAAAGCCTGATCTTACGGGAACATCAAAATCCTATGTAAGGTCGCTCTGAI I I I IATCGGCCGA-3') et 3PB (SEQ ID NO:9) (5'-AGCTTCGGCCGATAAAAATCAGAGCGACCTTACATAGGATTTTGATG-TTCCCGTAAGATCAGGCTTTAGG-3') contenant l'extrémité 3' du gène de fusion de la rougeole, un signal de terminaison de transcription précoce du virus de la vaccine (Yuen et al., 1987) et les extrémités Eagl et HindIII ont été réunis par ligation à un fragment Sall/Haelll de 1 kbp à partir de pCRF2 [obtenu C. Richardson, National Research Council of Canada (Biotechnology Institute), Montreal, Canada H3A 1 Al] et pUC8 digéré au moyen de Sali et HindIII. Le plasmide résultant pMF3PR14 contient l'extrémité 3' du fragment de 1 kbp du gène de fusion de la rougeole. Referring now to FIG. 2, the 30 oligonucleotides hybridized 3PA (SEQ ID NO: 8) (5'-CCTAAAGCCTGATCTTACGGGAACATCAAAATCCTATGTAAGGTCGCTCTGAI IATCGGCCGA III-3 ') and 3PB (SEQ ID NO: 9) (5'-AGCTTCGGCCGATAAAAATCAGAGCGACCTTACATAGGATTTTGATG-TTCCCGTAAGATCAGGCTTTAGG-3') containing the 3 of the measles fusion gene, an early transcription termination signal of the vaccinia virus (Yuen et al., 1987) and the Eagl and HindIII ends were ligated to a 1 kbp Sall / Haelll fragment to from pCRF2 [obtained C. Richardson, National Research Council of Canada (Biotechnology Institute), Montreal, Canada H3A 1 Al] and pUC8 digested using Sali and HindIII. The resulting plasmid pMF3PR14 contains the 3 'end of the 1 kbp fragment of the measles fusion gene.

Les oligonucléotides hybridés 5PA (SEQ ID NQ:10) (5-GGGATGGGTCTCAAGGTGAACGTCTCTGC- 5PA hybridized oligonucleotides (SEQ ID NQ: 10) (5-GGGATGGGTCTCAAGGTGAACGTCTCTGC-

6 6

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

CATATTC-3') et 5PB (SEQ ID NO:11) (5-ATGGCAGAGACGTTCACCTTGAGACCCATCCC-3'), contenant un site 5'Smal et un site 3'BstXI. ont été réunis par ligation à un fragment BstXI/Sall de 820bp à partir de pCRF2 et pUC8 digérés au moyen de Smal et Sali. Le plasmide résultant pSPMF5P16 contient la portion 5' du gène de fusion de la rougeole. Le fragment Smal/Sall de 820bp de pSPMF5P16 et le fragment Sall/Eagl de 1 kbp à partir de pMF3PR14 ont été réunis par ligation en pTP15 digérés par Smal et Eagl. Le plasmide pTP15 (Guo et al., 1989) contient le promoteur H6 précoce/tardif de du virus de la vaccine flanqué par des séquences du locus HA du génome du virus de la vaccine (souche Copenhagen). Le plasmide résultant contenant le gène de fusion de la rougeole juxtapose 3' au promoteur H6 à l'intérieur du plasmide d'insertion HA a été désigné pSPHMF7. CATATTC-3 ') and 5PB (SEQ ID NO: 11) (5-ATGGCAGAGACGTTCACCTTGAGACCCATCCC-3'), containing a 5'Smal site and a 3'BstXI site. were ligated to a BstXI / Sall fragment of 820bp from pCRF2 and pUC8 digested using SmaI and SalI. The resulting plasmid pSPMF5P16 contains the 5 'portion of the measles fusion gene. The Smal / Sall fragment of 820bp from pSPMF5P16 and the Sall / Eagl fragment of 1 kbp from pMF3PR14 were ligated into pTP15 digested with Smal and Eagl. Plasmid pTP15 (Guo et al., 1989) contains the early / late H6 promoter of vaccinia virus flanked by sequences of the HA locus of the vaccinia virus genome (strain Copenhagen). The resulting plasmid containing the measles fusion gene juxtaposes 3 'to the H6 promoter inside the HA insertion plasmid was designated pSPHMF7.

La mutagénese dirigée par oligonucléotide a été réalisée sur pSPHMF7. Initialement, une réaction de mutagénèse in vitro (Mandecki, 1982) a été réalisée pour créer une liaison précise ATG:ATG du promoteur H6 avec le gène de fusion de la rougeole en éliminant le site Smal en utilisant l'oligonucléotide SPMAD (SEQ ID NO: 12)(5'TATCCGTTAAGTTTGTATGGTAATGGGTCTCAAGGTGAACGTCT-3'). Ceci a eu pour résultat la production de pSPMF75M20. Ensuite, le site Bçtlll à l'extrémité 5' du promoteur H6 a été enlevé en utilisant l'oligonucléotide SPBGLD (SEQ ID NO:13) (5-AATAAATCACI I I l lATAC-TAATTCTTTATTCTATACTTAAAAAGT-3') suivant un procédé connu (Mandecki, 1982). Le plasmide résultant a été désigné pSPMFVC. Ce plasmide a été utilisé dans des expériences de recombinaison in vitro avec le virus de la vaccine vP410 comme virus de sauvetage pour engendrer vP455. Mutagenesis directed by oligonucleotide was carried out on pSPHMF7. Initially, an in vitro mutagenesis reaction (Mandecki, 1982) was carried out to create a precise ATG: ATG binding of the H6 promoter with the measles fusion gene by eliminating the SmaI site using the oligonucleotide SPMAD (SEQ ID NO : 12) (5'TATCCGTTAAGTTTGTATGGTAATGGGTCTCAAGGTGAACGTCT-3 '). This resulted in the production of pSPMF75M20. Then, the Btlll site at the 5 ′ end of the H6 promoter was removed using the oligonucleotide SPBGLD (SEQ ID NO: 13) (5-AATAAATCACI II l lATAC-TAATTCTTTATTCTATACTTAAAAAGT-3 ') according to a known method (Mandecki, 1982). The resulting plasmid was designated pSPMFVC. This plasmid was used in in vitro recombination experiments with the vaccinia virus vP410 as a rescue virus to generate vP455.

EXEMPLE 3 - Analyse d'immunoprécipitation. EXAMPLE 3 - Immunoprecipitation analysis.

Pour déterminer que les recombinants vP455 et vP557 expriment des protéines authentiques, des expériences d'immunoprécipitation ont été réalisées essentiellement comme décrit (Taylor et al., 1990). En bref, des monocouches de cellules de VERO ont été infectées au moyen de 10 pfu par cellule soit avec des virus parents soit avec des virus recombinants en présence de 35S-méthionine. La protéine de fusion a été spécifiquement précipitée à partir du lysat de cellules infectées en utilisant un antisérum de lapin dirigé contre un peptide de fusion terminal (ou distal) carboxy. La protéine d'hémagglutinine a été spécifiquement précipitée à partir du lysat de cellules infectées en utilisant un sérum anti-hémagglu-tinine monospécifique polyclonal. To determine that the vP455 and vP557 recombinants express authentic proteins, immunoprecipitation experiments were carried out essentially as described (Taylor et al., 1990). Briefly, VERO cell monolayers were infected with 10 pfu per cell either with parent viruses or with recombinant viruses in the presence of 35S-methionine. The fusion protein was specifically precipitated from the lysate of infected cells using rabbit antiserum directed against a carboxy terminal (or distal) fusion peptide. The hemagglutinin protein was specifically precipitated from the lysate of infected cells using a polyclonal monospecific anti-hemagglutinin serum.

En ce qui concerne l'immunoprécipitation en utilisant un sérum spécifique de fusion, on n'a pas détecté de produits marqués radioactivement dans les cellules de VERO non infectées, dans les cellules de VERO infectées partialement ou dans des cellules infectées avec le HA recombinant vP557. Dans les cellules infectées par le recombinant de fusion vP455, le précurseur de fusion F0, avec un poids moléculaire d'environ 60 kd, et les deux produits de coupure Fi et F2, avec des poids moléculaires de 44 kd et 23 kd, ont été détectés. De même, en ce qui concerne l'immunoprécipitation de la forme gly-cosylée de la protéine HA avec un poids moléculaire d'approximativement 75-77 kd, on n'a pas détecté de produits dans les cellules de VERO non infectées, dans les cellules infectées partialement ou les cellules de VERO infectées avec vP455. With regard to immunoprecipitation using a specific fusion serum, radioactively labeled products were not detected in uninfected VERO cells, in partially infected VERO cells or in cells infected with recombinant HA vP557 . In cells infected with the fusion recombinant vP455, the fusion precursor F0, with a molecular weight of approximately 60 kd, and the two cleavage products Fi and F2, with molecular weights of 44 kd and 23 kd, were detected. Likewise, with respect to immunoprecipitation of the gly-cosylated form of HA protein with a molecular weight of approximately 75-77 kd, no products were detected in uninfected VERO cells, in partially infected cells or VERO cells infected with vP455.

En outre, les études d'immunofluorescence indiquaient que les deux protéines étaient exprimées à la surface des cellules infectées. In addition, immunofluorescence studies indicated that both proteins were expressed on the surface of infected cells.

EXEMPLE 4 - Expériences de fusion de cellule EXAMPLE 4 Cell Experiments

Une caractéristique de la cytopathogénéicité du Morbillivirus est la formation de syncytiums qui se produit par fusion des cellules infestées avec des cellules non infestées environnantes suivie par la migration des noyaux vers le centre du syncytium (Norrby et al., 1982). Ceci a été montré comme étant un procédé important de propagation virale, qui, pour les Paramyxovirus, peut se produire en présence de l'anticorps spécifique hémagglutinine (Merz et al., 1980). Cette possibilité a été assignée par analogie avec d'autres Paramyxovirus à la terminaison amino du peptide Fi (Choppin et al., 1981; Novick et al., 1988; Paterson et al., 1987). A feature of the cytopathogenicity of Morbillivirus is the formation of syncytiums which occurs by fusion of infested cells with surrounding uninfested cells followed by migration of nuclei to the center of the syncytium (Norrby et al., 1982). This has been shown to be an important method of viral propagation, which, for Paramyxoviruses, can occur in the presence of the specific antibody hemagglutinin (Merz et al., 1980). This possibility has been assigned by analogy with other Paramyxoviruses to the amino terminus of the peptide Fi (Choppin et al., 1981; Novick et al., 1988; Paterson et al., 1987).

En vue de déterminer que les protéines de la rougeole exprimées dans le virus de la vaccine étaient fonctionnellement actives, des mono-couches de cellules de VERO ont été inoculées au moyen des virus parents et recombinants vP455 et vP557, respectivement, à la dose de 1 pfu par cellule. Après 1 heure d'absorption à 37°C l'inocuium a été enlevé, le milieu de recouvrement remplacé et les boîtes incubées pendant la nuit à 37°C. 18 heures après l'infection, les plaques ont été examinées au microscope et photographiées. Aucune activité de fusion de cellules n'a été visible dans les cellules de VERO inoculées avec un virus parent vP455 ou vP557. Cependant, lorsque vP455 et vP557 ont été co-inocu-lées, une activité de fusion de cellule efficace a été observée. In order to determine that the measles proteins expressed in the vaccinia virus were functionally active, monolayers of VERO cells were inoculated with the parent and recombinant viruses vP455 and vP557, respectively, at a dose of 1 pfu per cell. After 1 hour of absorption at 37 ° C., the inocuium was removed, the covering medium replaced and the dishes incubated overnight at 37 ° C. 18 hours after infection, the plates were examined under a microscope and photographed. No cell fusion activity was seen in VERO cells inoculated with a parent virus vP455 or vP557. However, when vP455 and vP557 were co-inoculated, efficient cell fusion activity was observed.

Ce résultat a été confirmé récemment par Wild et al. (1991) qui ont déterminé que la formation de syncytium dans une variété des lignées cellulaires infectées au moyen de virus recombinants rougeole/ vaccine exigeait l'expression à la fois des gènes de fusion et des gènes d'hémagglutinine. Le résultat, cependant, est en contradiction avec un rapport précédent (Alkhatib, 1990) qui décrit la fusion de cellules dans 293 cellules infectées au moyen de multiplicités élevées d'un adénovirus recombinant exprimant la protéine de fusion de la rougeole. De même, il a été rapporté (Vialard et al., 1990) qu'une fusion de cellules a été observée dans des cellules d'insecte infectées avec un baculovirus recombinant This result was recently confirmed by Wild et al. (1991) who determined that the formation of syncytium in a variety of cell lines infected with recombinant measles / vaccinia viruses required expression of both fusion and hemagglutinin genes. The result, however, contradicts a previous report (Alkhatib, 1990) which describes cell fusion in 293 infected cells using high multiplicities of a recombinant adenovirus expressing the measles fusion protein. Similarly, it has been reported (Vialard et al., 1990) that cell fusion has been observed in insect cells infected with a recombinant baculovirus

7 7

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

exprimant la protéine de fusion de la rougeole, mais seulement lorsque il y a eu incubation à pH 5,8. Dans aucun de ces deux cas, l'activité de fusion n'a été accrue par co-infection avec le recombinant approprié exprimant la protéine d'hémagglutinine de la rougeole. Des variables qui peuvent être impliquées dans le procédé de fusion sont le type de cellule (Giraudon et al., 1984), le pH du milieu (Vialard et al., 1990) et le niveau d'expression de la protéine de fusion (Norrby et al., 1982). expressing the fusion protein of measles, but only when there has been an incubation at pH 5.8. In neither of these two cases was fusion activity increased by co-infection with the appropriate recombinant expressing the hemagglutinin protein of measles. Variables that may be involved in the fusion process are the cell type (Giraudon et al., 1984), the pH of the medium (Vialard et al., 1990) and the level of expression of the fusion protein (Norrby et al., 1982).

EXEMPLE 5 - Essais séroloaiaues EXAMPLE 5 - Serological tests

La technique pour l'essai des anticorps neutralisant le virus (VN) a été décrite précédemment en détail (Appel et al., 1973). L'essai pour les titres d'anticorps CDV-VN a été fait dans des cellules de VERO avec la souche Onderstepoort adaptée de CDV. L'essai pour les titres d'anticorps MV-VN a été fait dans des cellules de VERO avec la souche Edmonston adaptée de MV. Les résultats des essais sérologiques sont indiqués dans le tableau 1. The technique for testing virus neutralizing antibodies (VN) has been previously described in detail (Appel et al., 1973). The assay for CDV-VN antibody titers was done in VERO cells with the Onderstepoort strain adapted from CDV. The assay for MV-VN antibody titers was done in VERO cells with the Edmonston strain adapted from MV. The results of the serological tests are shown in Table 1.

Des chiens immunisés comme décrit dans l'exemple 6, soit avec le virus parent de la vaccine soit avec vP455 exprimant la protéine de fusion de ia rougeole, n'ont pas développé d'anticorps neutralisant vis-à-vis de MV. Des chiens immunisés, soit avec vP557 exprimant la protéine HA ou coinoculés avec les deux recombinants vP455 et vP557, n'ont pas développé d'anticorps neutralisant après une inoculation les niveaux d'anticorps étaient équivalent à ceux induits par l'inoculation avec la souche Edmonston atténuée de MV. Dogs immunized as described in Example 6, either with the parent vaccinia virus or with vP455 expressing the fusion protein of measles, did not develop neutralizing antibodies against MV. Dogs immunized, either with vP557 expressing the HA protein or coinoculated with the two recombinants vP455 and vP557, did not develop antibodies neutralizing after inoculation the antibody levels were equivalent to those induced by inoculation with the strain Edmonston attenuated from MV.

TABLEAU 1 TABLE 1

Titre d'anti-corps neutralisant le virus de la rougeole en réponse à la vaccination Title of measles-neutralizing antibody in response to vaccination

Jours après la vaccination Days after vaccination

Immunisation Immunization

Chien N° Dog No.

0a 0a

7 7

14 14

21b 21b

28 28

35e 35th

Vacc. Vacc.

4/1 4/1

<1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

<1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

<1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

4/2 4/2

< 1,0 <1.0

<1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

<1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

vP455 vP455

4/3 4/3

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

<1,0 <1.0

<1,0 <1.0

4/4 4/4

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

<1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

vP557 vP557

4/5 4/5

<1,0 <1.0

2,2d 2.2d

2,9 2.9

2,9 2.9

3,4 3.4

3,4 3.4

4/6 4/6

< 1,0 <1.0

2,7 2.7

2,9 2.9

2,9 2.9

3,9 3.9

3,4 3.4

VP455 & VP557 VP455 & VP557

4/7 4/7

< 1,0 <1.0

2,7 2.7

3,4 3.4

3,2 3.2

3,4 3.4

3,4 3.4

4/8 4/8

< 1,0 <1.0

2,5 2.5

2,9 2.9

2,9 2.9

3,6 3.6

2,9 2.9

MV MV

4/14 4/14

<1,0 <1.0

2,9 2.9

4/15 4/15

< 1,0 <1.0

3,2 3.2

a) instant de la première immunisation b) Instant de la seconde immunisation (première immunisation avec MV) a) time of first immunization b) time of second immunization (first immunization with MV)

c) Instant de l'attaque d) Titre exprimé en tant que log10 de la dernière dilution d'anti-corps montrant une neutralisation complète de l'infectivité dans un essai de neutralisation de microtitre comme décrit par Appel et al. (1973). c) Time of attack d) Title expressed as log10 of the last dilution of antibody showing complete neutralization of the infectivity in a microtiter neutralization test as described by Appel et al. (1973).

EXEMPLE 6 - Etudes de Protection d'animaux EXAMPLE 6 - Animal Protection Studies

En vue de déterminer si l'expression des protéines du virus de la rougeole chez les chiens inoculés avec les recombinants était suffisante pour induire une réponse immunitaire protectrice contre une attaque par CDV, quatorze chiens bigles exempts de pathogènes spécifiques et âgés de 10 semaines, ont été étudiés. Des échantillons sanguins ont été collectés au début de l'expérimentation et d'une façon répétée ensuite. Quatre groupes, avec de deux chiens dans chaque groupe, ont été immunisés au moyen de deux injections séparées par trois semaines. Le premier groupe a reçu seulement le virus de la vaccine. Le second groupe a reçu le virus de la vaccine avec un segment d'insertion pour la protéine F du virus de ia rougeole (vP455). Le troisième groupe a reçu le virus de la vaccine avec un segment d'insertion pour l'antigène HA de MV (vP557). Le quatrième groupe a reçu une combinaison de 2 et de In order to determine whether the expression of measles virus proteins in dogs inoculated with the recombinants was sufficient to induce a protective immune response against CDV attack, fourteen 10-week-old bigle dogs free of specific pathogens were been studied. Blood samples were collected at the start of the experiment and repeatedly thereafter. Four groups, with two dogs in each group, were immunized with two injections separated by three weeks. The first group received only the vaccinia virus. The second group received vaccinia virus with an insert for F protein of measles ia virus (vP455). The third group received vaccinia virus with an insert for the HA HA antigen (vP557). The fourth group received a combination of 2 and

3. Chaque chien a été inoculé avec environ 4 x 108 pfu de virus de la vaccine en quantités de 1 ml (0,6 ml par voie sous-cutanée et 0,4 ml par voie intramusculaire). Deux chiens de contrôle ont reçu 105 closes infectieuses de culture de tissu à 50% (TCIDso) de la souche d'Edmonston atténuée de MV par voie intramusculaire (en une quantité de 1 ml) et deux chiens de contrôle ont reçu 104 doses TCIDso 3. Each dog was inoculated with approximately 4 x 108 pfu of vaccinia virus in amounts of 1 ml (0.6 ml subcutaneously and 0.4 ml intramuscularly). Two control dogs received 105 infective 50% tissue culture (TCID50) closes of Edmonston strain attenuated by intramuscular MV (in an amount of 1 ml) and two control dogs received 104 doses TCIDso

8 8

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

de la souche de Rockborn atténuée de CDV par voie sous-cutanée deux semaines avant l'attaque avec du CDV virulent, c'est-à-dire l'exposition au CD virulent. Deux chiens de contrôle sont restés non inoculés avant l'attaque ou exposition. of the Rockborn strain attenuated by CDV subcutaneously two weeks before the attack with virulent CDV, that is to say exposure to virulent CD. Two control dogs remained uninoculated before the attack or exposure.

Tous les chiens ont été attaqués par inoculation intranasale de 1 ml de fluide de culture de tissu contenant 104 TCIDso de la souche de Snyder Hill de CDV virulent deux semaines après la dernière inoculation. Les réactions cliniques des chiens a été surveillée par des observations journalières et enregistrement de la température du corps et par enregistrement deux fois par semaine du gain ou de la perte de poids. Les lymphocytes du sang en circulation circule ont été comptés avant l'attaque et les jours 3, 5, 7 et 10 après attaque (dpc). L'isolation du virus à partir des cellules du caillot blanc (buffy coat par co-cultivation avec des macrophages de poumon de chien (Appel et al., 1967) a été essayée aux jours 3, 5 et 10 après attaque. Des échantillons sanguins pour des tests sérologiques ont été prélevés avant vaccination et à intervalles d'une semaine jusqu'à l'époque de l'attaque et aux jours 7, 10 et 20 après attaque. All dogs were attacked by intranasal inoculation of 1 ml of tissue culture fluid containing 104 TCID 50 of the Snyder Hill strain of CDV virulent two weeks after the last inoculation. The clinical reactions of the dogs was monitored by daily observations and recording of body temperature and by twice weekly recording of weight gain or loss. The circulating blood lymphocytes were counted before the attack and the days 3, 5, 7 and 10 after attack (dpc). Isolation of the virus from white clot cells (buffy coat by co-cultivation with dog lung macrophages (Appel et al., 1967) was attempted on days 3, 5 and 10 after attack. Blood samples for serological tests were taken before vaccination and at intervals of one week until the time of the attack and on days 7, 10 and 20 after the attack.

Les résultats de l'attaque ont été illustrés dans le tableau 2. The results of the attack are illustrated in Table 2.

TABLEAU 2 TABLE 2

Effet de l'immunisation sur les signes cliniques après exposition des chiens au CDV virulent Effect of immunization on clinical signs after exposure of dogs to virulent CDV

Nombre de jours après inoculation avec du CDV virulent Number of days after inoculation with virulent CDV

Immunisation Immunization

Chien N° Dog No.

Dépression Depression

Perte de poids Weightloss

Elévation de temp du corps Body temp rise

Lympho-pen iab Lympho-pen iab

Isolation du virusc Virus isolation

Mort Dead

Vacc. Vacc.

4/1 4/1

4-10d 4-10d

3-10 3-10

4,5,7,10 4,5,7,10

7-10 7-10

3-7 3-7

10 10

4/2 4/2

4-1 Od 4-1 Od

3-10 3-10

4,5,8-10 4,5,8-10

3-10 3-10

3-7 3-7

10 10

vP455 vP455

4/3 4/3

4-8 4-8

7-10 7-10

4,5,7-10 4,5,7-10

5,7 5.7

5-7 5-7

- -

4/4 4/4

4-6 4-6

7-10 7-10

4,6 4.6

7 7

5-7 5-7

- -

vP557 vP557

4/5 4/5

NDe NDe

DN DN

6,7 6.7

10 10

7 7

- -

4/6 4/6

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

- -

VP455 & VP557 VP455 & VP557

4/7 4/7

ND ND

DN DN

7 7

7 7

7 7

- -

4/8 4/8

ND ND

7 7

6 6

ND ND

7 7

- -

MV MV

4/14 4/14

ND ND

DN DN

ND ND

7 7

ND ND

- -

4/15 4/15

ND ND

7 7

5 5

5 5

ND ND

- -

CDV-Ro CDV-Ro

4/16 4/16

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

- -

4/17 4/17

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

- -

Aucune Any

4/18 4/18

6,14-17d 6.14-17d

7-17 7-17

5,7 5.7

13-17 13-17

10 10

17 17

4/19 4/19

4-1 (P 4-1 (P

3-10 3-10

4,5-7 4.5-7

3,7,10 3,7,10

3-10 3-10

10 10

a) au-dessus de 39,5°C a) above 39.5 ° C

b> moins que 2 x IO3 lymphocytes par mm3 b> less than 2 x IO3 lymphocytes per mm3

c) isolé à partir des cellules du caillot blanc co-cultivées avec des macrophages de poumon de chien d) le chien s'est déshydraté et a été eutnanasié c) isolated from white clot cells co-cultured with dog lung macrophages d) the dog became dehydrated and was euthanized

e) aucune détection e) no detection

Des chiens de contrôle non immunisés et des chiens vaccinés avec le virus de la vaccine parent ont développé des signes cliniques de maladie sévère et ont été euthanasiés lorsque la déshydratation était évidente. Les deux chiens immunisés avec vP455 ont montré quelques signes d'infection par CDV, y compris une perte de poids, une température du corps élevée et une lymphopénie, bien que ces symptômes étaient de durée plus courte que ceux apparaissant chez les chiens de contrôle. Néanmoins, les deux chiens ont survécu à l'attaque léthale par CDV. Des chiens inoculés avec vP557 ou co-inoculés avec les deux recombinants ont montré des signes minimaux d'infection et ont survécu à l'attaque. Des chiens inoculés soit avec la souche Edmonston atténuée de MV soit avec la souche Rockborn atténuée de CDV ont également survécu à l'attaque avec des signes minimaux de maladie. Non-immune control dogs and dogs vaccinated with the parent vaccinia virus developed clinical signs of severe disease and were euthanized when dehydration was evident. Both dogs immunized with vP455 showed some signs of CDV infection, including weight loss, elevated body temperature, and lymphopenia, although these symptoms were shorter in duration than those seen in control dogs. However, the two dogs survived the lethal attack by CDV. Dogs inoculated with vP557 or co-inoculated with the two recombinants showed minimal signs of infection and survived the attack. Dogs inoculated with either the attenuated Edmonston strain of MV or the attenuated Rockborn strain of CDV also survived the attack with minimal signs of disease.

EXEMPLE 7 - Construction supplémentaire vaccine/rougeole EXAMPLE 7 - Additional vaccine / measles construction

En se référant maintenant à la fig. 3, un second virus de vaccine recombinant contenant le gène HA de la rougeole à l'intérieur du locus tk a été engendré (vP756) en utilisant le plasmide d'insertion pRW843. Ce dernier a été construit de la manière suivante: un fragment EcoRV/Smal de 1,8 kbp con- Referring now to FIG. 3, a second recombinant vaccinia virus containing the HA gene for measles within the tk locus was generated (vP756) using the insertion plasmid pRW843. The latter was constructed as follows: a 1.8 kbp EcoRV / Smal fragment

9 9

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

tenant les 24 bp les plus 3' du promoteur H6 fusionné en une configuration précise ATG:ATG avec le gène HA, privé des 26 bp les plus 3', a été isolé à partir de pSPM2LHAVC. Ce fragment a été utilisé pour remplacer le fragment EcoRV/Smal de 1,8 kbp de pSPMHA11 pour engendrer pRW803. Le plasmide pRW803 contient l'entier promoteur H6 lié précisément à tout le gène HA de la rougeole. holding the 24 plus 3 ′ bp of the H6 promoter fused into a precise ATG configuration: ATG with the HA gene, deprived of the most 3 ′ 26 bp, was isolated from pSPM2LHAVC. This fragment was used to replace the 1.8 kbp EcoRV / Smal fragment of pSPMHA11 to generate pRW803. The plasmid pRW803 contains the entire H6 promoter linked precisely to the entire HA gene of measles.

En confirmation des structures construites précédentes avec le gène HA de la rougeole, on a noté que la séquence pour le codon 18 (CCC) a été supprimée en comparaison avec la séquence publiée (Alkhatib et al., 1986). La séquence CCC a été remplacée par mutagénèse d'oligonucléotide par la méthode de Kunkel (Kunkel, 1985) en utilisant l'oligonucléotide In confirmation of the previous constructed structures with the HA gene of measles, it was noted that the sequence for codon 18 (CCC) has been deleted in comparison with the published sequence (Alkhatib et al., 1986). The sequence CCC has been replaced by mutagenesis of oligonucleotide by the method of Kunkel (Kunkel, 1985) using the oligonucleotide

RW117 (SEQ ID NO:14) ( 5'-GACTATCCTACTTCCCTTGGGATGGGGGTTATCTTTGTA-3'). RW117 (SEQ ID NO: 14) (5'-GACTATCCTACTTCCCTTGGGATGGGGGTTATCTTTGTA-3 ').

Pro 18 Pro 18

La matrice constituée par un seul brin a été dérivée du plasmide pRW819 qui contient la cassette H6/HA de pRW803 dans plBI25 (IBI, New Häven, CT). Le plasmide mutagéné contenant le CCC inséré pour coder pour un résidu de proline au codon 18 a été désigné pRW820. La séquence entre les sites HindIII et Xbal de pRW820 a été confirmée par analyse de séquence de nucléotides. Le site HindIII est situé à la bordure 5' du promoteur H6, alors que le site Xbal est situé 230bp en aval du codon d'initiation du gène HA. Un fragment Xbal/EcoRI de 1,6 kbp de pRW803, contenant les séquences de codage de HA en aval du site XBAI et comprenant le codon de terminaison a été utilisé pour remplacer le fragment équivalent de pRW820, ce qui a résulté dans la production de pRW837. La cassette d'expression mutagénée contenue dans pRW837 a été dérivée par digestion au moyen de HindIII et EcoRI. dotée d'une terminaison franche en utilisant le fragment de Klenow de i'ADN polymérase de E.coli en présence de 2mM dNTPs, et insérée dans le site Smal de pSD573VCVQ pour donner pRW843. Le plasmide pRW843 a été utilisé dans des expériences de combinaison in vitro au moyen de vP618 comme virus de sauvetage pour donner vP756. Le virus parent vP618 est un virus de la souche Copenhagen à partir duquel les gènes de thymidine kinase hémorrhagiques et d'inclusion de type A ont été supprimés. Le vP756 recombinant a, comme établi par analyse d'immunoprécipitation, exprimé correctement une hé-magglutinine glycoprotéine d'environ 75 kd. The single-stranded template was derived from plasmid pRW819 which contains the H6 / HA cassette of pRW803 in plBI25 (IBI, New Häven, CT). The mutagenized plasmid containing the CCC inserted to code for a proline residue at codon 18 was designated pRW820. The sequence between the HindIII and Xbal sites of pRW820 was confirmed by nucleotide sequence analysis. The HindIII site is located at the 5 ′ border of the H6 promoter, while the Xbal site is located 230 bp downstream of the HA gene initiation codon. A 1.6 kbp Xbal / EcoRI fragment of pRW803, containing the HA coding sequences downstream of the XBAI site and comprising the termination codon was used to replace the equivalent fragment of pRW820, which resulted in the production of pRW837. The mutagenic expression cassette contained in pRW837 was derived by digestion using HindIII and EcoRI. bluntly terminated using the Klenow fragment of E.coli DNA polymerase in the presence of 2mM dNTPs, and inserted into the SmaI site of pSD573VCVQ to give pRW843. Plasmid pRW843 was used in in vitro combination experiments using vP618 as a rescue virus to give vP756. The parent virus vP618 is a Copenhagen strain virus from which the hemorrhagic and inclusion type A thymidine kinase genes have been deleted. Recombinant vP756 has, as established by immunoprecipitation analysis, correctly expressed a hegagglutinin glycoprotein of about 75 kd.

En se référant maintenant à la fig. 4, un second virus de vaccine recombinant (vP800) abritant le gène de fusion de la rougeole au locus ATI du génomène a été engendré en utilisant le plasmide d'insertion pRW850. Pour construire pRW850, les manipulations suivantes ont été effectuées: Le plasmide pSPMF75M20 contenant le gène de fusion de la rougeole lié en une configuration précise ATG:ATG au promoteur H6 a été digéré au moyen de Nrul et Eaal. Le fragment à extrémité franche de 1,7 kbp, contenant les 28 bp les plus 3' du promoteur H6 et le gène de fusion en entier, a été isolé et inséré dans pRW823, digéré par Nrul et Xbal et terminé par une extrémité franche. Le plasmide résultant pRW841 contient le promoteur H6 lié au gène de fusion de la rougeole dans le plasmide vecteur plBI25 (IBI, New Häven, CT). La cassette d'expression de fusion H6/rougeole a été dérivée du pRW841 par digestion au moyen de Smal et le fragment de 1,8 kbp résultant a été inséré dans pSD494VC digéré au moyen de Smal pour donner pRW850. Le plasmide pRW850 a été utilisé dans des expériences de combinaison in vitro avec vP618 comme virus de sauvetage pour donner vP800. On a montré, par analyse d'immunoprécipitation, que vP800 recombinant exprime une glycoproprotéine de fusion authentiquement traitée. Referring now to FIG. 4, a second recombinant vaccinia virus (vP800) harboring the measles fusion gene at the ATI locus of the genomene was generated using the insertion plasmid pRW850. To construct pRW850, the following manipulations were carried out: The plasmid pSPMF75M20 containing the measles fusion gene linked in a precise configuration ATG: ATG to the H6 promoter was digested using Nrul and Eaal. The blunt-ended 1.7 kbp fragment, containing the 28 plus 3 'bp of the H6 promoter and the entire fusion gene, was isolated and inserted into pRW823, digested with Nrul and Xbal and terminated with a blunt end. The resulting plasmid pRW841 contains the H6 promoter linked to the measles fusion gene in the vector plasmid plBI25 (IBI, New Häven, CT). The H6 / measles fusion expression cassette was derived from pRW841 by digestion with SmaI and the resulting 1.8 kbp fragment was inserted into pSD494VC digested with SmaI to give pRW850. Plasmid pRW850 was used in in vitro combination experiments with vP618 as the rescue virus to give vP800. It has been shown, by immunoprecipitation analysis, that recombinant vP800 expresses an authentically treated fusion glycopropotein.

EXEMPLE 8 - Vérification d'anticorps neutralisant la rougeole chez des cobaves ou cochons d'inde et des lapins inoculés par vP455. EXAMPLE 8 Verification of antibodies neutralizing measles in guinea pigs and guinea pigs and rabbits inoculated with vP455.

Deux lapins ont été inoculés intradermiquement en cinq sites au moyen de 1 x 108 pfu au total de vP455 recombinant exprimant la protéine de fusion de la rougeole. Les deux lapins ont été renforcés au moyen d'une inoculation de rappel identique à la douzième semaine. Des saignées en série ont été recueillies et à la quatorzième semaine, deux semaines après le renouvellement de l'injection, les lapins ont été testés pour la présence d'anticorps neutralisant le sérum. Two rabbits were intradermally inoculated at five sites using a total of 1 x 108 pfu of recombinant vP455 expressing the fusion protein of measles. The two rabbits were reinforced with a booster inoculation identical to the twelfth week. Serial bleeds were collected and at week fourteen, two weeks after the repeat injection, the rabbits were tested for the presence of antibodies neutralizing the serum.

Quatre cobayes ou cochons d'inde ont été inoculés sous-cutanément chacun au moyen de 1 x 108 pfu chacun du vP455 recombinant. Une inoculation de rappel identique a été donnée après 21 jours. Des saignées en série ont été recueillies. Four guinea pigs or guinea pigs were inoculated each subcutaneously with 1 x 108 pfu each of the recombinant vP455. An identical booster inoculation was given after 21 days. Serial bleeding was collected.

La présence d'anticorps neutralisant le sérum du virus de la rougeole a été établie en utilisant un essai de microtitre (Appel et al., 1973) au moyen de 10 TCIDso de virus par puits de microtitre. Les résultats sont indiqués dans le tableau 3. The presence of measles virus-neutralizing antibodies was established using a microtiter assay (Appel et al., 1973) using 10 TCID 50 of virus per microtiter well. The results are shown in Table 3.

10 10

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

TABLEAU 3 TABLE 3

Résultats des anti-corps neutralisant le sérum du virus de la rougeole chez les cochons d'inde et les lapins inoculés au moyen de vP455 Results of measles-neutralizing antibodies in guinea pigs and rabbits inoculated with vP455

Semaines après inoculation Weeks after inoculation

0 2 3 4 5 7 14 0 2 3 4 5 7 14

Animal Animal

Cochon d'inde Guinea pig

1 1

N.D.a N.D.a

N.D. N.D.

N.D.-0,8b N.D.-0.8b

1,3-1,3 1.3-1.3

1,3-1,5 1.3-1.5

1,3 1.3

N.T.c N.T.c

2 2

N.D. N.D.

N.D. N.D.

0,8-1,0 0.8-1.0

0,8-1,3 0.8-1.3

1,3-1,5 1.3-1.5

N.D. N.D.

N.T. N.T.

3 3

N.D. N.D.

N.D. N.D.

N.D.-0.8 N.D.-0.8

0,8-1,5 0.8-1.5

1,0-1,3 1.0-1.3

1,0 1.0

N.T. N.T.

6 6

N.D. N.D.

N.D. N.D.

0,8-0,8 0.8-0.8

0,8-0,8 0.8-0.8

1,0-1,3 1.0-1.3

1,0 1.0

N.T. N.T.

Lapin Rabbit

W44 W44

N.D. N.D.

N.T. N.T.

N.T. N.T.

N.T. N.T.

N.T. N.T.

N.T N.T

1,5 1.5

W86 W86

N.D. N.D.

N.T. N.T.

N.T. N.T.

N.T. N.T.

N.T. N.T.

N.T. N.T.

1,5 1.5

a) non détectable b) résultats de deux essais o) non testés a) not detectable b) results of two tests o) not tested

EXEMPLE 9 - Production du virus de canaripox recombinant du virus de la rougeole. EXAMPLE 9 Production of the recombinant canaripox virus of the measles virus.

Les recombinants des virus rougeole/canaripox ont été développés en utilisant une stratégie similaire à celle décrite précédemment pour le virus du pox aviaire (Taylor et al., 1988 a, b). The recombinants of the measles / canaripox virus were developed using a strategy similar to that described previously for the avian pox virus (Taylor et al., 1988 a, b).

On a produit comme suit des plasmides pour insérer les gènes F et HA de la rougeole dans le virus du canaripox. Plasmids were produced as follows to insert the F and HA genes of measles into the canaripox virus.

En se référant maintenant à la fig. 5, le fragment par Bgklll/Eaol à extrémité franche de 1,8 kbp de pSPMF75M20 contenant le gène F de la rougeole promu par H6 a été inséré dans le site EcoRI à extrémité franche de pRW764,2. Le plasmide pRW764,2 contient un fragment de pVull de 3,4 kbp provenant du génomène du canaripox ayant un site EcoRI unique qui a été déterminé comme étant non-es-sentiel pour la réplication du virus. Le plasmide résultant contenant le gène F de la rougeole a été désigné pRW800 et a été utilisé dans des expériences de recombinaison avec le canaripox en tant que virus de sauvetage pour engendrer vCP40. Referring now to FIG. 5, the 1.8 kbp blunt-ended Bgklll / Eaol fragment of pSPMF75M20 containing the H6-promoted measles F gene was inserted into the blunt-ended EcoRI site of pRW764,2. Plasmid pRW764,2 contains a 3.4 kbp pVull fragment from the canaripox genomene having a unique EcoRI site which has been determined to be non-essential for virus replication. The resulting plasmid containing the measles F gene was designated pRW800 and was used in recombination experiments with canaripox as a rescue virus to generate vCP40.

En se référant maintenant à la fig. 6, le fragment EcoRV/Smal de 1,8 kbp de pSPM2LHA, contenant les 28bp les plus 3' du promoteur H6 et joint en une configuration précise ATC:ATG à HA, a été inséré entre les sites EcoRV et Smal de pSPMHAH. Le plasmide résultant a été appelé pRW803. Un fragment Hindlll/EcoRI de 2 kbp de pRW803 contenant le gène HA de la rougeole promu par H6 a été doté d'une extremité franche et inséré dans le site Bgill à extrémité franche du plasmide pRW764,5. Ce plasmide PRW764.5 contient un fragment Pvull de 800 bp du génomène du canaripox ayant un site fiaill unique qui a été précédemment déterminé comme étant non essentiel pour la croissance virale. Cette insertion a créé le plasmide pRW810 qui a été utilisé dans des essais de recombinaison pour engendrer vCP50. Referring now to FIG. 6, the 1.8 kbp EcoRV / Smal fragment of pSPM2LHA, containing the most 3 '28bp of the H6 promoter and joined in a precise ATC configuration: ATG to HA, was inserted between the EcoRV and Smal sites of pSPMHAH. The resulting plasmid was called pRW803. A 2 kbp HindIII / EcoRI fragment of pRW803 containing the HA gene of H6-promoted measles was blunt-ended and inserted into the blunt-ended Bgill site of plasmid pRW764.5. This plasmid PRW764.5 contains an 800 bp Pvull fragment of the canaripox genomene having a unique binding site which has previously been determined to be nonessential for viral growth. This insertion created the plasmid pRW810 which was used in recombination assays to generate vCP50.

L'insertion des séquences F et HA de ia rougeole individuellement a conduit individuellement au développement des recombinants vCP40 et vCP50, respectivement. Afin de créer un double recombinant, le recombinant vCP40 F seul a été utilisé comme virus de sauvetage pour l'insertion du gène HA contenu dans pRW810. Ceci a conduit au développement du double recombinant vCP57. The insertion of the F and HA sequences of measles ia individually led individually to the development of the recombinants vCP40 and vCP50, respectively. In order to create a double recombinant, the recombinant vCP40 F alone was used as a rescue virus for the insertion of the HA gene contained in pRW810. This led to the development of the double recombinant vCP57.

EXEMPLE 10 - Analyse d'immunoprécipitation EXAMPLE 10 Immunoprecipitation Analysis

En vue de confirmer que les recombinants vCP40, vCP50 et vCP57 expriment des protéines authentiques, une analyse d'immunoprécipitation a été réalisée en utilisant des sérums mono-specifiques dirigés contre soit les protéines HA soit les protéines F. Un polypeptide de fusion correctement traité a été spécifiquement précipité à partir de lysats de cellules infectées par vCP40 et vCP57. Le précurseur de fusion Fo ayant un poids moléculaire d'environ 60kd et les deux produits de coupure Fi et F2, avec des poids moléculaires d'environ 44 et 23kd respectivement, ont été détectés. Aucun produit spécifique de fusion n'a été détectable dans les cellules CEF non infectées, les cellules CEF affectées partialement ou les cellules CEF infectées au moyen de HA recombinant vCP50. De même, une glycoprotéine d'environ 75kd a été spécifiquement précipitée à partir de cellules CEF infectées au moyen du HA recombinant vCP50 seul et du recombinant vCP57 double. Aucun produit spécifique de HA n'a été détecté In order to confirm that the vCP40, vCP50 and vCP57 recombinants express authentic proteins, an immunoprecipitation analysis was carried out using mono-specific sera directed against either the HA proteins or the F proteins. A correctly treated fusion polypeptide has was specifically precipitated from lysates of cells infected with vCP40 and vCP57. The Fo fusion precursor having a molecular weight of approximately 60kd and the two cleavage products Fi and F2, with molecular weights of approximately 44 and 23kd respectively, were detected. No specific fusion product was detectable in uninfected CEF cells, partially affected CEF cells, or CEF cells infected with recombinant HA vCP50. Similarly, a glycoprotein of about 75kd was specifically precipitated from infected CEF cells using the recombinant HA vCP50 alone and the recombinant vCP57 double. No specific HA product was detected

11 11

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

dans les cellules non infectées, les cellules infectées partialement ou les cellules infectées avec le recombinant de fusion vCP40. in uninfected cells, partially infected cells, or cells infected with the fusion recombinant vCP40.

EXEMPLE 11 - Expériences de fusion de cellule EXAMPLE 11 - Cell fusion experiments

En vue de déterminer que les recombinants du virus de la rougeole étaient fonctionnellement actifs, des essais de fusion de cellules ont été réalisés. Des mono-couches de cellules de VERO ont été infectées au moyen de 1 pfu par cellule de virus de CP parental ou recombinant et examinées pour effets cytopathiques 18 heures après l'infection. Aucune activité de fusion de cellules n'a été mise en évidence dans les cellules de VERO inoculées au moyen de virus parent, vCP40 ou vCP50. Cependant, lorsque les cellules de VERO avaient été inoculées au moyen du recombinant vCP57 double ou lorsque des cellules avaient été co-infectées à la fois par vCP40 et vCP50, une activité de fusion de cellules efficace à été mise en évidence. In order to determine that the measles virus recombinants were functionally active, cell fusion assays were performed. Monolayers of VERO cells were infected with 1 pfu per cell of parental or recombinant CP virus and examined for cytopathic effects 18 hours after infection. No cell fusion activity was demonstrated in VERO cells inoculated with parent virus, vCP40 or vCP50. However, when VERO cells had been inoculated using the double recombinant vCP57 or when cells had been co-infected with both vCP40 and vCP50, effective cell fusion activity was demonstrated.

EXEMPLE 12 - Essais séroloaiaues EXAMPLE 12 - Serological tests

Des chiens inoculés comme décrit dans l'exemple 13, au moyen du recombinant canaripox/HA vCP50, le recombinant vaccine/HA vP557, le recombinant double canaripox/HA/FA/cP57 ou co-inoculé au moyen de vP455 et vP557, ont développé des anticorps significatifs neutralisant le sérum vis-à-vis du virus de la rougeole après une inoculation. Aucun des deux chiens inoculés au moyen du recombinant canaripox/FvCP40 n'a développé d'anticorps neutralisant après une ou deux inoculations. Les résultats des essais sérologiques sont illustrés sur la fig. 4. Dogs inoculated as described in Example 13, using the canaripox / HA recombinant vCP50, the vaccinia / HA recombinant vP557, the double canaripox / HA / FA / cP57 recombinant or co-inoculated using vP455 and vP557, have developed significant antibodies neutralizing the serum vis-à-vis the measles virus after an inoculation. Neither dog inoculated with the canaripox / FvCP40 recombinant developed neutralizing antibodies after one or two inoculations. The results of the serological tests are illustrated in fig. 4.

En outre, des cochons d'inde inoculés au moyen de vCP40 recombinant ont développé des niveaux faibles mais reproductibles, d'anticorps neutralisant le sérum. In addition, guinea pigs inoculated with recombinant vCP40 have developed low but reproducible levels of serum neutralizing antibodies.

TABLEAU 4 TABLE 4

Titres (en logio) d'anti-corps neutralisant le virus de la rougeole Titles (in logio) of antibodies to neutralize the measles virus

Jours après la vaccination Days after vaccination

Immunisation Immunization

Chien N° Dog No.

01 01

7 7

14 14

21b 21b

28 28

35c 35c

Virus du Canaripox (CPV) Canaripox virus (CPV)

9/1 9/1

<1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

<1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

<1,0 <1.0

9/2 9/2

<1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

<1,0 <1.0

vCP50 vCP50

9/3 9/3

<1,0 <1.0

2,7d 2.7d

2,9 2.9

3,2 3.2

4,4 4.4

4,1 4.1

9/4 9/4

< 1,0 <1.0

1,7 1.7

2,7 2.7

2,7 2.7

3,9 3.9

3,9 3.9

vCP40 vCP40

9/5 9/5

< 1,0 <1.0

<1,0 <1.0

<1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

<1,0 <1.0

9/6 9/6

<1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

<1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

< 1,0 <1.0

vCP57 vCP57

9/7 9/7

<1,0 <1.0

2,0 2.0

2,7 2.7

2,5 2.5

3,9 3.9

3,6 3.6

9/8 9/8

<1,0 <1.0

1,0 1.0

2,2 2.2

2,0 2.0

3,6 3.6

3,4 3.4

VP455 VP455

9/9 9/9

<1,0 <1.0

<1,0 <1.0

<1,0 <1.0

1,0 1.0

1,0 1.0

1,0 1.0

VP557 VP557

9/10 9/10

< 1,0 <1.0

2,9 2.9

2,5 2.5

3,2 3.2

3,4 3.4

3,4 3.4

vP455 & vP557 vP455 & vP557

9/11 9/11

<1,0 <1.0

1,3 1.3

2,9 2.9

2,9 2.9

2,9 2.9

2,9 2.9

MV MV

9/12 9/12

< 1,0 <1.0

2,5 2.5

2,5 2.5

Contrôle Control

9/13 9/14 9/13 9/14

< 1,0 <1,0 <1.0 <1.0

CDV-Ro CDV-Ro

9/15 9/15

<1,0 <1.0

a) instant de la première immunisation b) instant de la seconde immunisation (1ère immunisation au moyen de MV et CDV-Ro) a) time of first immunization b) time of second immunization (1st immunization using MV and CDV-Ro)

°) instant de l'attaque. °) instant of the attack.

d) détermination des titres de neutralisation du sérum établie de la manière connue (Appel et al., 1973.) d) determination of the serum neutralization titers established in known manner (Appel et al., 1973.)

EXEMPLE 13 - Etudes de protection des animaux EXAMPLE 13 - Animal protection studies

En vue de déterminer si les vecteurs du canaripox non répliquants exprimant les protéines du virus de la rougeole induisent une réponse immunitaire protectrice contre une attaque ou infection par CDV, des chiens Biggles exempts de pathogènes spécifiques et âgés de 10 semaines ont été inoculés au In order to determine whether the non-replicating canaripox vectors expressing the measles virus proteins induce a protective immune response against CDV attack or infection, Biggles dogs free of specific pathogens and 10 weeks old were inoculated with

12 12

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

moyen de virus parentaux et recombinants du canaripox. Deux chiens ont été inoculés simultanément au moyen de deux injections sous-cutanées de 1 x 108 pfu de chaque recombinant à intervalles de 3 semaines. A titre de comparaison, un chien a été inoculé sous le même régime avec chacun des virus de vaccine recombinant vP455 et vP457 seuls et avec une combinaison de ceux-ci. Un chien a été également inoculé intramusculairement avec une dose 105 TCIDso de la souche Edmonston atténuée de MV. Un chien a été inoculé souscutanément avec une dose de 104 TCIDso de la souche Rockborn atténuée de CDV. Les chiens ont été soumis à l'attaque ou infection deux semaines après l'inoculation finale au moyen d'une inoculation intranasale avec une dose mortelle de 104 TCIDso de la souche virulente Snyder Hill de CDV. Les réactions cliniques des chiens ont été surveillées quotidiennement. Les résultats sont illustrés dans le tableau 5 using parental and recombinant canaripox viruses. Two dogs were inoculated simultaneously with two subcutaneous injections of 1 x 108 pfu of each recombinant at 3 week intervals. By way of comparison, a dog was inoculated under the same regime with each of the recombinant vaccinia viruses vP455 and vP457 alone and with a combination of these. One dog was also inoculated intramuscularly with a 105 TCID 50 dose of the attenuated Edmonston strain of MV. One dog was inoculated subcutaneously with a dose of 104 TCID 50 of the attenuated Rockborn strain of CDV. The dogs were attacked or infected two weeks after final inoculation by intranasal inoculation with a lethal dose of 104 TCID 50 of the virulent Snyder Hill strain of CDV. The clinical reactions of the dogs were monitored daily. The results are illustrated in Table 5

TABLEAU 5 TABLE 5

Effets de l'immunisation sur les signes cliniques après exposition de chiens à du CDV virulent Effects of immunization on clinical signs after exposure of dogs to virulent CDV

Nombre de jours après l'inoculation au moyen de CDV virulent Immunisation Chien Dépression Perte de poids Elévation de la Lymphopénieb Isolation Number of days after inoculation with virulent VCT Immunization Dog Depression Weight loss Increased Lymphopeniab Isolation

N° No.

temp, du corps body temp

du virus0 virus0

virus du Canaripox Canaripox virus

9/1 9/1

4-10d 4-10d

3-10 3-10

4,5,7,8 4,5,7,8

5-10 5-10

3-10 3-10

(CPV) (CPV)

9/2 9/2

4-1 Od 4-1 Od

7-10 7-10

4,5,7,8 4,5,7,8

3-10 3-10

3-10 3-10

vCP50 vCP50

9/3 9/3

NDe NDe

7-10 7-10

5-7 5-7

5-7 5-7

7 7

9/4 9/4

ND ND

7 7

6,7 6.7

7 7

ND ND

vCP40 vCP40

9/5 9/5

4-10 4-10

3-10 3-10

4 4

5-10 5-10

5-7 5-7

9/6 9/6

4-6 4-6

3-10 3-10

4-6 4-6

5 5

5-7 5-7

vCP57 vCP57

9/7 9/7

ND ND

7-10 7-10

5,6 5.6

5 5

ND ND

9/8 9/8

ND ND

7-10 7-10

4,7,10 4,7,10

7-10 7-10

5-7 5-7

vP455 vP455

9/9 9/9

6-8 6-8

7-10 7-10

4,5,8,9 4,5,8,9

5-10 5-10

3-10 3-10

vP557 vP557

9/10 9/10

ND ND

3-10 3-10

ND ND

ND ND

ND ND

vP455 & vP447 vP455 & vP447

9/11 9/11

ND ND

3-10 3-10

ND ND

5-7 5-7

ND ND

MV MV

9/12 9/12

ND ND

7-10 7-10

ND ND

5 5

5 5

aucun no

9/13 9/13

4-10d 4-10d

3-10 3-10

4-6 4-6

5-10 5-10

5-10 5-10

9/14 9/14

4-1 Od 4-1 Od

3-10 3-10

4-5 4-5

3-10 3-10

5-7 5-7

CDV-Ro CDV-Ro

9/15 9/15

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

ND ND

a) au-dessus de 39,5°C a) above 39.5 ° C

t>) moins de 2 x 103 lymphocytes par mm3 t>) less than 2 x 103 lymphocytes per mm3

c) Isole à partir de cellules du caillot blanc co-cultivé avec des macrophases de poumon de chien de la manière connue (Appel et al., 1967) c) Isolate from white clot cells co-cultured with dog lung macrophases in the known manner (Appel et al., 1967)

d) le chien est deshydraté et a été euthanasié d) rien n'a été détecté d) the dog is dehydrated and has been euthanized d) nothing has been detected

On n'a noté aucune réaction contraire à la vaccination dans l'un quelconque des chiens au cours de l'expérience. Les deux chiens immunisés avec du virus de canaripox parental et les deux chiens de contrôle non immunisés ont montré une maladie sévère après attaque par du CDV virulent. Tous les quatre chiens sont devenus déprimés, ont montré une température du corps élevée, une perte de poids, une lymphopénie et une déshydratation sévère. Des chiens immunisés au moyen de CDV, souche Rockborn, ont produit des anticorps neutralisant le sérum à l'encontre du CDV, mais non du MV, avant l'attaque et ont survécu à celle-ci, sans symptômes. Des chiens immunisés au moyen de MV atténué ont produit des anticorps neutralisant le sérum à l'encontre du MV, mais non du CDV, avant l'attaque et ont survécu à celle-ci avec de faibles signes d'infection. Les chiens inoculés au moyen de vCP50, vCP57, vP557 ou co-inoculés avec vP455 et vP557 ont produit, d'une manière significative, des anticorps neutralisant le sérum à l'encontre du MV après une inoculation et ont survécu à l'attaque avec simplement de faibles signes d'infection. No adverse reaction to vaccination was noted in any of the dogs during the experiment. The two dogs immunized with parental canaripox virus and the two non-immunized control dogs showed severe disease after attack with virulent CDV. All four dogs became depressed, showed elevated body temperature, weight loss, lymphopenia, and severe dehydration. Dogs immunized with CDV, strain Rockborn, produced serum-neutralizing antibodies against CDV, but not MV, before the attack and survived it without symptoms. Dogs immunized with attenuated MV produced serum neutralizing antibodies against MV, but not CDV, before the attack and survived the attack with weak signs of infection. Dogs inoculated with vCP50, vCP57, vP557 or co-inoculated with vP455 and vP557 produced significantly serum neutralizing antibodies against MV after inoculation and survived the attack with just weak signs of infection.

EXEMPLE 14 - Construction supplémentaire canaripox/rouaeole EXAMPLE 14 - Additional construction canaripox / rouaeole

En se référant maintenant à la fig. 7, on a crée les plasmides d'insertion ci-après pour produire un virus de canaripox recombinant exprimant le gène MV HA. Un fragment EcoRV/EcoRI de 1,8 kbp de Referring now to FIG. 7, the following insertion plasmids were created to produce a recombinant canaripox virus expressing the MV HA gene. A 1.8 kbp EcoRV / EcoRI fragment of

13 13

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

pRW837, contenant les 26bp les plus 3' du promoteur H6 et uni précisément au HA de la rougeole, a été uni par ligation à un fragment EcoRV/EcoRI de 3,2 kbp de pRW838. Le fragment dérivé de pRW838 comprend la portion 5' du promoteur H6 et les bras flanquant le locus C5. Les Plasmides pRW838 et pRW831 (voir ci-après) sont obtenus comme suit: pRW837, containing the most 3 '26bp of the H6 promoter and precisely linked to the HA of measles, was ligated to a 3.2 kbp EcoRV / EcoRI fragment of pRW838. The fragment derived from pRW838 comprises the 5 ′ portion of the H6 promoter and the arms flanking the C5 locus. Plasmids pRW838 and pRW831 (see below) are obtained as follows:

Un fragment génomique de canaripox pvUll de 880 bp a été inséré entre les sites pVull de pUC9. Le plasmide résultant a été appelé pRW764,5. La séquence de nucléotides du fragment de canaripox de 880 bp a été déterminée en utilisant l'enzyme 17 modifiée Sequenase™ Kit (United States Bioche-mical, Cleveland, Ohio) selon les spécifications du fabricant. Les réactions de séquence ont utilisé des amorges synthétisées sur mesure (17-18 mers) préparés au moyen de Biosearch 8700 (San Rafael, Californie) ou Applied Biosystems 3800 (Foster City, Californie). Ceci a permis la définition du cadre de lecture ouverte C5. A genomic fragment of canaripox pvUll of 880 bp was inserted between the pVull sites of pUC9. The resulting plasmid was called pRW764.5. The nucleotide sequence of the 880 bp canaripox fragment was determined using the modified enzyme 17 Sequenase ™ Kit (United States Bioche-mical, Cleveland, Ohio) according to the manufacturer's specifications. The sequence reactions used custom synthesized primers (17-18 seas) prepared using Biosearch 8700 (San Rafael, California) or Applied Biosystems 3800 (Foster City, California). This made it possible to define the C5 open reading frame.

Pour supprimer spécifiquement le cadre de lecture ouvert C5, pRW764,5 a été partiellement coupé au moyen de Rsal et le produit linéaire a été isolé. Le fragment linéaire Rsal a été recoupé au moyen de Ëgill et le fragment pRW764,5 avec une suppression Rsal-Bgllll à partir de la position 156jusqu'à la position 462 a été isolé et utilisé en tant que vecteur pour les oligonucléotides synthétiques suivants: RW145 (SEQ ID NO:15):(5'-ACTCTCAAAAGCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAG I I I I IATAA-3') RW146 (SEQ ID NO:16):(5'-GATCTTTATAAAAACTAGCTAGCTAGAATTCCCGGAAGCTTTTGAGAGT-3'). Les oligonucléotides RW145 et RW146 ont été hybridés et insérés dans le vecteur pRW764,5 Rsal-Balll décrit ci-dessus. Le plasmide résultant est pRW831. To specifically remove the C5 open reading frame, pRW764.5 was partially cut using Rsal and the linear product was isolated. The linear fragment Rsal was cut using Ëgill and the fragment pRW764.5 with Rsal-Bglll1 deletion from position 156 until position 462 was isolated and used as a vector for the following synthetic oligonucleotides: RW145 (SEQ ID NO: 15) :( 5'-ACTCTCAAAAGCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAG IIII IATAA-3 ') RW146 (SEQ ID NO: 16) :( 5'-GATCTTTATAAAAACTAGCTAGCTAGAATTCCCGGAAGCTTTTGAGAGT-3'). The oligonucleotides RW145 and RW146 were hybridized and inserted into the vector pRW764.5 Rsal-Balll described above. The resulting plasmid is pRW831.

Le plasmide de suppression de C5 a été construit sans interruption d'autres cadres de lecture ouverts du virus du canaripox. La séquence de codage C5 a été remplacée par les oligonucléotides hybridés précédents (RW145 et RW146) qui comprennent les sites de restriction pour HindIII. Smal. et EcoRI. The C5 suppressing plasmid was constructed without interruption from other open canaripox virus reading frames. The coding sequence C5 has been replaced by the previous hybridized oligonucleotides (RW145 and RW146) which include the restriction sites for HindIII. Smal. and EcoRI.

Le plasmide PRW838, a été dérivé de pRW831 par l'insertion d'un fragment Smal contenant le gène G de la rage (Taylor et al., 1988) juxtaposé en 3' au promoteur H6 du virus de la vaccine. La ligation du fragment EcoRV/EcoRI de 1,8 kbp de pRW837 avec le fragment EcoRV/EcoRI de 3,2 kbp de pRW838 a conduit à la construction du plasmide pRW852. Ce plasmide PRW852 a été utilisé dans des expériences de recombinaison avec un isolât de canaripox, désigné ALVAC, pour donner vCP85. ALVAC est un isolât cloné sur plaque du virus du canaripox (CPV) dérivé de la souche Rentschler, une souche hautement atténuée de CPV utilisée pour la vaccination des canaris. La réplication de ALVAC et des recombinants dérivés est restreinte aux espèces aviaires. L'analyse d'immunoprécipitation a confirmé qu'une protéine d'approximativement 75kd reconnue par un sérum anti-HA de lapin est exprimée dans des cellules CEF infectées par le recombinant vCP85. The plasmid PRW838, was derived from pRW831 by the insertion of a SmaI fragment containing the G gene of rabies (Taylor et al., 1988) juxtaposed in 3 'to the H6 promoter of the vaccinia virus. Ligation of the 1.8 kbp EcoRV / EcoRI fragment from pRW837 with the 3.2 kbp EcoRV / EcoRI fragment from pRW838 led to the construction of the plasmid pRW852. This plasmid PRW852 was used in recombination experiments with a canaripox isolate, designated ALVAC, to give vCP85. ALVAC is a cloned canaripox virus (CPV) plate isolate derived from the Rentschler strain, a highly attenuated CPV strain used for canary vaccination. Replication of ALVAC and the recombinant derivatives is restricted to avian species. Immunoprecipitation analysis confirmed that an approximately 75kd protein recognized by rabbit anti-HA serum is expressed in CEF cells infected with the recombinant vCP85.

En se référant maintenant à la fig. 8, pour engendrer un virus de canaripox recombinant abritant à la fois les gènes MV HA et F, les constructions ci-après ont été réalisées. Des sites de restriction Smal ont été ajoutés aux extrémités du gène de fusion de la rougeole promu par H6. Pour réaliser cette opération, pRW823, qui est plBI25 contenant le promoteur H6 du virus de la vaccine, a été digéré en aval de la séquence de promoteur au site Xbal. Les extrémités ont été rendues franches au moyen du fragment de Klenow de l'ADN polymérase de E.coli en présence de 2mM dNTPs. L'ADN à extrémité franche a été digéré ensuite au moyen de Nrul pour libérer un fragment de 3,0 kbp contenant les 100bp les plus 5' du promoteur H6. Ce fragment a été isolé et uni par ligation à un fragment Eagl/Nrul. à extrémité franche, de 1,7 kbp de pSPMF75. Le plasmide résultant a été appelé pRW841. Referring now to FIG. 8, to generate a recombinant canaripox virus harboring both the MV HA and F genes, the following constructions were carried out. Smal restriction sites have been added to the ends of the H6-promoted measles fusion gene. To perform this operation, pRW823, which is plBI25 containing the vaccinia virus H6 promoter, was digested downstream of the promoter sequence at the Xbal site. The ends were made blunt using the Klenow fragment of E.coli DNA polymerase in the presence of 2mM dNTPs. The blunt-ended DNA was then digested with Nrul to release a 3.0 kbp fragment containing the most 5 '100bp of the H6 promoter. This fragment was isolated and ligated to an Eagl / Nrul fragment. blunt-ended, 1.7 kbp pSPMF75. The resulting plasmid was called pRW841.

Le fragment Smal de 1,8 kbp, dérivé par digestion de pRW841, a été inséré dans le vecteur de suppression C5, à savoir pRW831. Le plasmide pRW851 a été linéarisé au site EcoRI situé en 3' par rapport au gène de fusion et a été muni d'une extrémité franche au moyen du fragment de Klenow de l'ADN polymérase de E.coli en présence de 2mM dNTPs. Le plasmide PRW837, contenant le gène HA de la rougeole juxtaposé en 3' aux séquences du promoteur H6, a été digéré au moyen de HindIII et EcoRI et doté d'une extrémité franche par le fragment de Klenow. Le fragment de 1,8 kbp résultant a été isolé et inséré dans pRW851 qui a été linéarisé au moyen de EcoRI et doté d'une extrémité franche. Le plasmide résultant, qui contient les deux gènes dans une configuration queue à queue, a été désigné pRW853A et a été utilise dans des expériences de recombinaison in vitro avec le canaripox (ALVAC), en tant que virus de sauvetage pour produire vCP82, désigné également ALVAC-MV. L'analyse d'expression utilisant l'immunoprécipitation et l'immunofluorescence a confirmé que, dans les cellules infectées au moyen de vCP82 recombinant, des protéines HA et F, authentiquement traitées, ont été exprimées. Le recombinant est également fonctionnel pour l'activité de fusion de cellules. The 1.8 kbp SmaI fragment, derived by digestion from pRW841, was inserted into the suppression vector C5, namely pRW831. The plasmid pRW851 was linearized at the EcoRI site located 3 ′ with respect to the fusion gene and was provided with a blunt end by means of the Klenow fragment of the DNA polymerase of E. coli in the presence of 2mM dNTPs. Plasmid PRW837, containing the measles HA gene juxtaposed 3 'to the H6 promoter sequences, was digested using HindIII and EcoRI and provided with a blunt end by the Klenow fragment. The resulting 1.8 kbp fragment was isolated and inserted into pRW851 which was linearized using EcoRI and provided with a blunt end. The resulting plasmid, which contains the two genes in a tail-to-tail configuration, was designated pRW853A and was used in in vitro recombination experiments with canaripox (ALVAC), as a rescue virus to produce vCP82, also designated ALVAC-MV. Expression analysis using immunoprecipitation and immunofluorescence confirmed that, in cells infected with recombinant vCP82, HA and F proteins, authentically treated, were expressed. The recombinant is also functional for cell fusion activity.

Résultats d'analyses sérologiques de sérums de lapins et de cochons d'inde inoculés au moven de ALVAC-MV fvCP82i. Results of serological analyzes of sera from rabbits and guinea pigs inoculated with ALVAC-MV fvCP82i.

Quatre cochons d'inde ont été inoculés par voie sous-cutanée avec ALVAC-MV (vCP82). Deux animaux (026 et 027) ont reçu chacun 1 x 108 pfu et deux animaux (028 et 029) ont reçu chacun 1 x 107 pfu. Apres 28 jours, les animaux ont été re-inoculés au moyen d'une dose identique. Deux lapins ont été inoculés au moyen de 1 x 108 pfu de ALVAC-MV (vCP82) par voie sous-cutanée. Après 28 jours, les animaux ont été reinoculés avec une dose identique. Des saignées en série de ces animaux ont été analysées pour l'activité neutralisant le virus de la rougeole en utilisant soit un essai de neutralisa14 Four guinea pigs were inoculated subcutaneously with ALVAC-MV (vCP82). Two animals (026 and 027) each received 1 x 108 pfu and two animals (028 and 029) each received 1 x 107 pfu. After 28 days, the animals were re-inoculated using an identical dose. Two rabbits were inoculated with 1 x 108 pfu ALVAC-MV (vCP82) subcutaneously. After 28 days, the animals were reinoculated with an identical dose. Serial bleeding from these animals was analyzed for measles neutralizing activity using either a neutralization assay14

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

tion avec microtitres décrit par Appel et Robson (1973) ou un essai de réduction neutralisation sur plaque décrit par Albrecht et al. (1981). En outre, des sérums ont été analysés pour déterminer la présence d'anticorps capables de bloquer le virus de la rougeole induit par fusion cellule-cellule dans un essai anti-fusion comme décrit dans Merz et al. (1980). tion with microtitles described by Appel and Robson (1973) or a plate neutralization reduction test described by Albrecht et al. (nineteen eighty one). In addition, sera were analyzed to determine the presence of antibodies capable of blocking the measles virus induced by cell-cell fusion in an anti-fusion assay as described in Merz et al. (1980).

Les résultats de l'analyse pour la présence d'anticorps neutralisant le sérum du virus de la rougeole sont illustrés sous les tableaux 6 et 7. Les deux cochons d'inde (026 et 027) ayant reçu 1 x 108 pfu de ALVAC-MV furent séroconvertis après une seule incolution et les sérums ont montré une augmentation d'anticorps après une inoculation de rappel. Un animal (029) ayant reçu 1 x 107 pfu a été également séroconverti après une inoculation. Le quatrième animal (028) n'a pas manifesté de réponse détectable après une inoculation mais a atteint des titres équivalents après la seconde inoculation. The results of the analysis for the presence of antibodies neutralizing the serum of the measles virus are illustrated in Tables 6 and 7. The two guinea pigs (026 and 027) having received 1 x 108 pfu of ALVAC-MV were seroconverted after a single incolution and the sera showed an increase in antibody after a booster inoculation. One animal (029) having received 1 x 107 pfu was also seroconverted after inoculation. The fourth animal (028) did not show a detectable response after an inoculation but reached equivalent titers after the second inoculation.

Les sérums de lapins ont été également analysés en utilisant une méthode de réduction neutralisation sur plaque. Les résultats sont illustrés dans le tableau 7. Les deux animaux étaient séro-convertis après une inoculation. Des sérums de lapins 063 ont été testés tant par essai de neutralisation de micro-titre que par essai de réduction neutralisation sur plaque. Les titres obtenus étaient semblables par l'utilisation des deux méthodes. On a rapporté qu'un titre de neutralisation de sérum minimal de 1,2 à 1,9 chez les enfants vaccinés est exigé pour la protection contre la maladie (Lennon and Black, 1986): Black et al., 1984. En utilisant ce critère, tous les animaux, excepté le cochon d'inde qui n'a pas été séro-converti jusqu'à la seconde inoculation, ont montré un niveau de protection par anticorps après une inoculation. Rabbit sera were also analyzed using a plate neutralization reduction method. The results are shown in Table 7. The two animals were sero-converted after inoculation. Sera from rabbits 063 were tested both by microtiter neutralization test and by plate neutralization reduction test. The titles obtained were similar by the use of the two methods. It has been reported that a minimum serum neutralization titer of 1.2 to 1.9 in vaccinated children is required for protection against disease (Lennon and Black, 1986): Black et al., 1984. Using this criterion, all animals, except the guinea pig which was not sero-converted until the second inoculation, showed a level of protection by antibodies after an inoculation.

TABLEAU 6 TABLE 6

Analyse sérologique de sérums de cochons d'inde inoculés au moyen de ALVAC-MV (vCP82): Analyse réalisée par l'essai de neutralisation de sérum (microtitre). Serological analysis of sera from guinea pigs inoculated using ALVAC-MV (vCP82): Analysis carried out by the serum neutralization test (microtiter).

Jours après inoculation Animal 0 14 21 28= 42 48 56 Days after inoculation Animal 0 14 21 28 = 42 48 56

Cochon d'inde Guinea pig

026d 026d

N.T.a N.T.a

1,25b 1.25b

1,49 1.49

2,45 2.45

2,68 2.68

2,92 2.92

027 027

N.T. N.T.

1,97 1.97

1,49 1.49

2,68 2.68

2,45 2.45

2,21 2.21

028e 028th

N.T. N.T.

- -

- -

1,73 1.73

2,45 2.45

1,97 1.97

029 029

N.T. N.T.

0,8 0.8

1,49 1.49

2,45 2.45

2,45 2.45

2,45 2.45

a) Non essayé a) Not tried

b) Titre exprimé en tant que logio de l'inverse de la dernière dilution montrant la neutralisation complète de l'effet cytopathique. b) Title expressed as the log of the inverse of the last dilution showing the complete neutralization of the cytopathic effect.

°) Animaux ayant subi une inoculation de rappel 28 jours après l'inoculation. °) Animals having undergone a booster inoculation 28 days after inoculation.

d) Les animaux 026 et 027 ont reçu 1x10® pfu. d) Animals 026 and 027 received 1x10® pfu.

e) Les animaux 028 et 029 ont reçu 1x10? pfu. e) Animals 028 and 029 received 1x10? pfu.

TABLEAU 7 TABLE 7

Analyse sérologique de sérum de lapins inoculés au moyen d'ALVAC-MV (vCP82) Serological analysis of serum from inoculated rabbits using ALVAC-MV (vCP82)

Animal Jours après inoculation Animal Days after inoculation

0 14 21 28b 42 56 0 14 21 28b 42 56

Méthode des réduction sur plaque Plate reduction method

063 - 1,9a 2,8 1,6 2,2 2,2 063 - 1.9a 2.8 1.6 2.2 2.2

064 - 2,2 2,5 2,8 3,1 2,8 Méthode de neutralisation (micro-titre) 064 - 2.2 2.5 2.8 3.1 2.8 Neutralization method (micro-titer)

063 - 1,5c 1,7 1,5 1,7 063 - 1.5c 1.7 1.5 1.7

a) Titre exprimé en tant que logio de l'inverse de la dernière dilution montrant une réduction de 50% sur le nombre sur plaque tel que comparé au sérum avant inoculation. a) Title expressed as the log of the inverse of the last dilution showing a reduction of 50% on the number on plate as compared to the serum before inoculation.

b) Animaux ayant subi une inoculation de rappel 28 jours après l'inoculation c) Titre exprimé en tant que logio de l'inverse de la dernière dilution montrant une neutralisation complète de l'effet cytophatique. b) Animals having undergone a booster inoculation 28 days after inoculation c) Title expressed as the log of the inverse of the last dilution showing a complete neutralization of the cytophatic effect.

15 15

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

Des études antérieures ont montré qu'un vaccin inactivé était associé à une efficité protectrice faible et une maladie de la rougeole accure lors de la réexposition au virus. Ce qui ont reçu le vaccin inactivé ont montré une absence d'anticorps vis-à-vis de la protéine de fusion et on a proposé que le procédé d'inactivation a rendu la protéine non immunogène (Norrby et Gollmar, 1975; Norrby et al. 1975). En outre, il a été montré pour d'autres paramyxovirus que l'anticorps vis-à-vis de la protéine F est capable d'inhiber la diffusion de cellule à cellule du virus dans des cultures de tissu alors que l'anticorps du composant hémagglutinine ne l'est pas (Merz et al., 1980). Previous studies have shown that an inactivated vaccine is associated with poor protective efficacy, and measles disease develops when re-exposed to the virus. Those who received the inactivated vaccine showed an absence of antibodies to the fusion protein and it was proposed that the inactivation process made the protein non-immunogenic (Norrby and Gollmar, 1975; Norrby et al 1975). In addition, it has been shown for other paramyxoviruses that the antibody to the F protein is capable of inhibiting cell-to-cell diffusion of the virus in tissue cultures while the component's antibody hemagglutinin is not (Merz et al., 1980).

Il est par conséquent significatif de démontrer que les animaux inoculés au moyen d'ALVAC-MV (vCP82) sont capables d'induire des anticorps vis-à-vis du composant F, qui sont capables de bloquer la transmission de cellule à cellule du virus de la rougeole. Les résultats de cet essai d'antifusion sont illustrés dans le tableau 8. L'activité antifusion a été mise en évidence dans des sérums tant de cochons d'inde que de lapins inoculés au moyen de ALVAC-MV (vCP82). Les sérums analysés ont été prélevés deux ou trois semaines après l'inoculation de rappel. Aucune activité anti-fusion n'a pu être détectée dans les sérums de lapins inoculés avec le virus parent ALVAC. It is therefore significant to demonstrate that animals inoculated with ALVAC-MV (vCP82) are capable of inducing antibodies to component F, which are capable of blocking cell-to-cell transmission of the virus. measles. The results of this anti-fusion test are illustrated in Table 8. The anti-fusion activity was demonstrated in sera from both guinea pigs and rabbits inoculated using ALVAC-MV (vCP82). The sera analyzed were collected two or three weeks after the booster inoculation. No anti-fusion activity could be detected in the sera of rabbits inoculated with the parent virus ALVAC.

TABLEAU 8 TABLE 8

Analyse des sérums de cochons d'inde et de lapins inoculés au moyen d'ALVAC-MV au point de vue activité anti-fusion. Analysis of sera from guinea pigs and rabbits inoculated using ALVAC-MV from the point of view of anti-fusion activity.

Animal Animal

Désignation Designation

Immunogène Immunogenic

Titre anti-fusion Avant inoc. Anti-fusion title Before inoc.

après vacc. after vacc.

Cochon d'inde Guinea pig

026 026

ALVAC-MV ALVAC-MV

- -

2,4 a.b 2.4 a.b

027 027

ALVAC-MV ALVAC-MV

- -

1,2 1.2

Lapin Rabbit

063 063

ALVAC-MV ALVAC-MV

- -

1,8e 1.8e

064 064

ALVAC-MV ALVAC-MV

- -

1,8 1.8

Lapin Rabbit

W121 W121

ALVAC ALVAC

- -

- -

W123 W123

ALVAC ALVAC

- -

- -

a) Sérums de cochons d'inde testés 7 semaines après vaccination. a) Sera of guinea pigs tested 7 weeks after vaccination.

b) Titre exprimé en tant que logio de l'inverse de la plus haute dilution montrant une inhibition complète de l'activité de fusion de cellule induite par le virus de la rougeoie. b) Title expressed as the log of the inverse of the highest dilution showing complete inhibition of cell fusion activity induced by the glow virus.

c) Essais de sérums de lapins 6 semaines après vaccination. c) Testing of rabbit sera 6 weeks after vaccination.

Dans des essais supplémentaires destinés à démontrer la présence d'anticorps vis-à-vis à la fois des protéines de l'MV hémagglutinine et des protéines de fusion de MV dans des sérums d'animaux inoculés au moyen d'ALVAC-MV, des expériences d'immunoprécipitation ont été réalisées. Des sérums de lapins inoculés au moyen de ALVAC-MV ont montré une précipitation spécifique à la fois des protéines d'hémagglutinine et des protéines de fusion à partir de lysats marqués radioactivement de cellules de VERO infectées au moyen de la souche Edmonston de MV. In additional assays to demonstrate the presence of antibodies to both MV hemagglutinin proteins and MV fusion proteins in sera from animals inoculated with ALVAC-MV, immunoprecipitation experiments were performed. Sera from rabbits inoculated with ALVAC-MV showed specific precipitation of both hemagglutinin proteins and fusion proteins from radioactively labeled lysates from VERO cells infected with the Edmonston strain of MV.

Dans une étude similaire, des groupes de cochons d'inde, de lapins et de souris ont été inoculées par voie intramusculaire au moyen d'ALVAC-MV et leur réponse sérologique au virus de la rougeole déterminée en utilisant le test d'hémagglutination -inhibition (Hl). La réponse sérologique au virus du canaripox a été déterminée par l'essai ELISA. Au cours de cette étude, cinq cochons d'inde ont été inoculés au moyen de 5,5 logio TCIDso, 30 souris ont été inoculées au moyen de 4,8 logio TCIDso, et cinq lapins ont été inoculés au moyen de 5,8 logio TCIDso. Tous les animaux ont été re-inoculés au bout de 28 jours avec une dose équivalente. Les animaux ont été saignés à intervalle régulier et leur réponse au virus de la rougeole déterminée dans un essai Hl. La limite de détection dans l'essai HI correspond à un titre logio de 1 et il est considéré que des enfants séropositifs (protégés) ont un titre de sérum compris entre 1,6 et 2,8. Les résultats des analyses sont illustrés sur les tableaux 9, 10 et 11. In a similar study, groups of guinea pigs, rabbits and mice were inoculated intramuscularly using ALVAC-MV and their serological response to the measles virus determined using the hemagglutination-inhibition test (Hl). The serological response to the canaripox virus was determined by the ELISA test. In this study, five guinea pigs were inoculated using 5.5 log10 TCIDso, 30 mice were inoculated using 4.8 logio TCIDso, and five rabbits were inoculated using 5.8 logio TCIDso. All animals were re-inoculated after 28 days with an equivalent dose. The animals were bled at regular intervals and their response to the measles virus determined in an Hl test. The detection limit in the HI trial corresponds to a log titer of 1 and it is considered that HIV-positive (protected) children have a serum titer between 1.6 and 2.8. The results of the analyzes are illustrated in Tables 9, 10 and 11.

Des sérums de souris ont été analysés par groupes de 5 animaux (tableau 9). Tous les animaux ont montré une réponse primaire au virus du canaripox qui a été accrue après la seconde inoculation. Les souris n'ont pas manifesté une réponse à MV après une inoculation. Trois des six groupes ont montré des titres dans le domaine de protection 8 semaines après l'inoculation. De même, tous les cochons d'inde (tableau 10) ont montré une réponse au virus du canaripox après une inoculation, qui a été améliorée après la seconde inoculation. Quatre des cinq animaux ont développé des titres anti-HI après une inoculation, un de ceux-ci étant dans le domaine de protection. Ces titres se sont maintenus pendant 8 semaines après inoculation lorsque l'expérience a été terminée. Tous les lapins (tableau 11) inoculés au moyen d'ALVAC-MV (vCP82) ont répondu sérologiquement à l'inoculation par le canaripox. Quatre des cinq animaux ont été séroconvertis au virus de la rougeole après une inoculation (un dans le domaine de protection). Les titres de sérum de tous les animaux étaient dans le domaine de protection une semaine après la seconde inoculation. Mouse sera were analyzed by groups of 5 animals (Table 9). All animals showed a primary response to the canaripox virus which was increased after the second inoculation. The mice did not manifest a response to MV after an inoculation. Three of the six groups showed protective domain titers 8 weeks after inoculation. Likewise, all guinea pigs (Table 10) showed a response to the canaripox virus after an inoculation, which was improved after the second inoculation. Four of the five animals developed anti-HI titers after inoculation, one of which was in the protective area. These titers were maintained for 8 weeks after inoculation when the experiment was finished. All rabbits (Table 11) inoculated with ALVAC-MV (vCP82) responded serologically to inoculation with canaripox. Four of the five animals were seroconverted to the measles virus after inoculation (one in the protective area). The serum titers of all animals were in the protective domain one week after the second inoculation.

16 16

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

Résultats d'analvses séroloqiques de sérums de sagouins inoculés au moven d'ALVAC-MV (vCP82i: Influence d'une exposition antérieure au poxvirus sur l'induction d'une réponse immunitaire spécifique vis-à-vis du virus de la rougeole. Results of serological analyzes of sago sera sera inoculated with ALVAC-MV moven (vCP82i: Influence of previous exposure to poxvirus on the induction of a specific immune response to the measles virus.

Neuf sagouins (Saimiri Scinreus) ont été inoculés au moyen d'ALVAC-MV (vCP82). Tous les sagouins étaient naïfs vis-à-vis du virus de la rougeole. Sept parmi les singes avaient auparavant été exposés au virus de la vaccine et/ou au virus du canaripox. L'histoire de l'immunisation précédente est illustrée dans le tableau 12. Tous les sagouins ont été inoculés avec une dose de 5,8 logio pfu par voie sous-cutanée. Quatre parmi les animaux (n° 39, 42, 53 et 58) ont été inoculés à nouveau au moyen d'une dose équivalente quinze semaines après la première inoculation. La quantité d'anticorps anti-rougeole a été mesurée par le test HI. Les résultats sont illustrés sur le tableau 12. Nine sagarins (Saimiri Scinreus) were inoculated using ALVAC-MV (vCP82). All the sagouins were naive towards the measles virus. Seven of the monkeys had previously been exposed to the vaccinia virus and / or the canaripox virus. The history of the previous immunization is illustrated in Table 12. All the sagouins were inoculated with a dose of 5.8 log 10 pfu subcutaneously. Four of the animals (nos. 39, 42, 53 and 58) were re-inoculated with an equivalent dose fifteen weeks after the first inoculation. The amount of anti-measles antibodies was measured by the HI test. The results are illustrated in Table 12.

Après la première inoculation, deux des neufs sagouins ont montré une faible réponse à l'inoculation au moyen d'ALVAC-MV. Après la seconde inoculation, les quatre singes ré-inoculés étaient tous séroconvertis au moyen de titres d'anticorps significatifs dans le domaine exigé pour l'immunité de protection. Les titres atteints étaient équivalents que les sagouins aient été soumis auparavant à l'exposition au virus de la vaccine et à ('ALVAC ou sans exposition antérieure au poxvirus. After the first inoculation, two of the nine sagouins showed a weak response to inoculation using ALVAC-MV. After the second inoculation, the four re-inoculated monkeys were all seroconverted using significant antibody titers in the domain required for protective immunity. The titers achieved were equivalent whether the sagouins had previously been exposed to the vaccinia virus and to the ALVAC or without prior exposure to the poxvirus.

EXEMPLE 15 - Vaccin de vaccine atténué souche NYVAC EXAMPLE 15 Attenuated Vaccine Vaccine NYVAC Strain

Pour développer une nouvelle souche de vaccins contre la vaccine, la souche de vaccin Copenhagen du virus de la vaccine a été modifiée par la suppression de six régions non essentielles du génome codant des facteurs de virulence connus ou potentiels. Les suppressions séquentielles sont détaillées ci-après. Toutes les désignations des fragments de restriction de la vaccine, des cadres de lecture ouverts et des positions de nucléotides sont basées sur la terminologie rapportée dans Goebel et al. (1990 a, b). To develop a new vaccine strain of vaccines, the Copenhagen vaccine strain vaccine has been modified by deleting six nonessential regions of the genome encoding known or potential virulence factors. The sequential deletions are detailed below. All designations of vaccinia restriction fragments, open reading frames and nucleotide positions are based on the terminology reported in Goebel et al. (1990 a, b).

Les locus de suppression ont été également construits en tant que locus de réception pour l'insertion de gènes étrangers. Suppression loci have also been constructed as receiving loci for the insertion of foreign genes.

Les régions séguentiellement supprimées dans NYVAC sont énumérées ci-après. Sont également énumérées les abréviations et les désignations de cadres de lecture ouverts pour les régions supprimées (Goebel et al., 1990 a, b) et la désignation de la vaccine recombinante (vP) contenant toutes les suppressions par la suppression spécifiée: The regions sequentially deleted in NYVAC are listed below. Also listed are the abbreviations and designations of open reading frames for the deleted regions (Goebel et al., 1990 a, b) and the designation of the recombinant vaccinia (vP) containing all the deletions by the specified deletion:

1 ) gène de la thymidine kinase (TK; J2R) vP410; 1) thymidine kinase gene (TK; J2R) vP410;

2) région hémorragique (u; B13R + B14R) vP553; 2) hemorrhagic region (u; B13R + B14R) vP553;

3) Une région de corps d'inclusion typique (ATI;A26L) vP618; 3) A typical inclusion body region (ATI; A26L) vP618;

4) gène de l'hémaggiutinine (HA; A56R) vP723; 4) hemaggiutinin gene (HA; A56R) vP723;

5) région du gène du domaine de l'hôte (C7L-K1L) vP804; et 5) region of the host domain gene (C7L-K1L) vP804; and

6) grande sous-unité, ribonucléotide réductase (I4L) vP866 (NYVAC). 6) large subunit, ribonucleotide reductase (I4L) vP866 (NYVAC).

TABLEAU 9 TABLE 9

Réponse sérologique de souris à une inoculation au moyen d'ALVAC-MV (vCP82) Mouse serological response to inoculation with ALVAC-MV (vCP82)

Réponse anti-canaripox Anti-canaripox response

TITRE ELISA Semaines après inoculation TITLE ELISA Weeks after inoculation

Groupe de souris 0 2 4 5 6 8 Group of mice 0 2 4 5 6 8

1a 1a

-0,009b -0.009b

0,364 0.364

0,193 0.193

1,821 1.821

1,616 1.616

1,123 1.123

2 2

-0,026 -0.026

0,047 0.047

0,240 0.240

1,739 1,739

1,963 1,963

1,986 1,986

3 3

-0,006 -0.006

0,148 0.148

0,641 0.641

1,860 1,860

1,861 1,861

1,947 1,947

4 4

-0,005 -0.005

0,130 0.130

0,451 0.451

1,506 1,506

1,937 1,937

1,124 1,124

5 5

0,687 0.687

0,542 0.542

Moyenne Average

-0,012 -0.012

0,275 0.275

0,413 0.413

1,732 1,732

1,844 1,844

1,395 1,395

17 17

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

Réponse anti-rougeole Anti-measles response

TITRE HI TITLE HI

Semaines après inoculation Weeks after inoculation

Groupe de souris Group of mice

0 0

2 2

4 4

5 5

6 6

8 8

1 1

< 1c <1c

< 1 <1

< 1 <1

< 1 <1

1 1

1 1

2 2

< 1 <1

< 1 <1

< 1 <1

1 1

1,6 1.6

1,6 1.6

3 3

< 1 <1

< 1 <1

1 1

1 1

2,2 2.2

2,2 2.2

4 4

< 1 <1

< 1 <1

< 1 <1

1,6 1.6

1 1

1,8 1.8

5 5

< 1 <1

< 1 <1

< 1 <1

1,3 1.3

1,8 1.8

1,2 1.2

Moyenne Average

- -

- -

1 1

1,2 1.2

1,5 1.5

1,5 1.5

a) Des groupes de 5 souris ont été vidés de leur sang et leurs sérums mélangés. a) Groups of 5 mice were emptied of their blood and their sera mixed.

b) Densité optique dans l'essai ELISA sur des sérums à la dilution de 1:800 b) Optical density in the ELISA test on sera at a dilution of 1: 800

c) La limite de détection dans l'essai HI correspond à un titre logio de 1, c'est-à-dire une dilution de 1:10. Le titre exprimé en tant que logio de l'inverse de la plus haute dilution montrant l'inhibition de l'hémaggiutinine. c) The detection limit in the HI test corresponds to a log titer of 1, that is to say a dilution of 1:10. The titer expressed as the log of the inverse of the highest dilution showing the inhibition of hemaggiutinin.

TABLEAU 10 TABLE 10

Réponse sérologique de cochons d'inde à l'inoculation avec ALVAC-MV (vCP82) Serological response of guinea pigs to inoculation with ALVAC-MV (vCP82)

Réponse anti-canaripox Anti-canaripox response

TITRE ELISA Semaines après inoculation TITLE ELISA Weeks after inoculation

Cochon d'inde Guinea pig

0 0

2 2

4 4

5 5

6 6

8 8

1 1

0,038a 0.038a

0,045 0.045

0,111 0.111

1,771 1,771

1,970 1,970

1,856 1.856

2 2

0,010 0.010

0,072 0.072

0,234 0.234

1,768 1,768

1,786 1,786

1,785 1,785

3 3

-0,011 -0.011

0,426 0.426

0,529 0.529

1,567 1.567

1,586 1,586

1,700 1,700

4 4

0,016 0.016

0,045 0.045

0,076 0.076

1,583 1.583

1,696 1,696

1,635 1.635

5 5

-0,020 -0.020

0,012 0.012

0,050 0.050

1,583 1.583

1,859 1.859

1,847 1,847

Réponse anti-rougeole Anti-measles response

TITRE HI Semaines après inoculation TITLE HI Weeks after inoculation

Cochon d'inde 0 2 4 5 6 8 Guinea pig 0 2 4 5 6 8

1 1

< 1b <1b

1,18 1.18

1,90 1.90

3,11 3.11

3,41 3.41

3,11 3.11

2 2

< 1 <1

< 1 <1

1,00 1.00

2,20 2.20

2,20 2.20

2,08 2.08

3 3

< 1 <1

< 1 <1

1,18 1.18

2,51 2.51

2,68 2.68

2,98 2.98

4 4

< 1 <1

< 1 <1

< 1 <1

1,60 1.60

1,90 1.90

1,90 1.90

5 5

< 1 <1

< 1 <1

1,30 1.30

1,90 1.90

2,20 2.20

2,20 2.20

a) Densité optique dans un essai ELISA sur du sérum à une dilution de 1:3200. a) Optical density in an ELISA test on serum at a dilution of 1: 3200.

b) La limite de détection dans l'essai HI correspond à un titre logio de 1, c'est-à-dire une dilution de 1:10. Le titre exprimé comme dans la légende du tableau 9. b) The detection limit in the HI test corresponds to a log titer of 1, that is to say a dilution of 1:10. The title expressed as in the legend of table 9.

18 18

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

TABLEAU 11 TABLE 11

Réponse sérologique de lapins à l'inoculation avec ALVAC-MV (vCP82) Serological response of rabbits to inoculation with ALVAC-MV (vCP82)

Réponse anti-canaripox Anti-canaripox response

TITRE ELISA Semaines après inoculation TITLE ELISA Weeks after inoculation

Lapin Rabbit

0 0

2 2

4 4

5 5

6 6

8 8

1a 1a

-0,009a -0.009a

0,085 0.085

0,113 0.113

1,953 1.953

1,754 1.754

1,249 1,249

2 2

-0,002 -0.002

0,065 0.065

0,068 0.068

0,717 0.717

0,567 0.567

0,353 0.353

3 3

-0,003 -0.003

0,090 0.090

0,079 0.079

0,921 0.921

0,692 0.692

0,481 0.481

4 4

-0,005 -0.005

0,034 0.034

0,068 0.068

1,558 1.558

1,324 1,324

1,076 1.076

5 5

-0,003 -0.003

0,072 0.072

0,092 0.092

1,785 1,785

1,226 1.226

0,710 0.710

Réponse anti-rougeole Anti-measles response

TITRE HI Semaines après inoculation TITLE HI Weeks after inoculation

Lapin 0 2 4 5 6 8 Rabbit 0 2 4 5 6 8

1 1

< 1b <1b

< 1 <1

1,00 1.00

2,81 2.81

2,51 2.51

2,20 2.20

2 2

< 1 <1

< 1 <1

< 1 <1

2,20 2.20

1,90 1.90

1,60 1.60

3 3

< 1 <1

< 1 <1

1,30 1.30

2,81 2.81

2,51 2.51

2,38 2.38

4 4

< 1 <1

1,30 1.30

1,60 1.60

3,11 3.11

3,11 3.11

2,51 2.51

5 5

< 1 <1

1,00 1.00

1,30 1.30

2,68 2.68

2,38 2.38

1,90 1.90

a> Densité optique dans un essai ELISA sur des sérums à une dilution de 1:1600 b) La limite de détection dans l'essai HI correspond à un titre logio de 1, c'est-à-dire une dilution de 1:10. Le titre exprimé comme dans la légende du tableau 9. a> Optical density in an ELISA test on sera at a dilution of 1: 1600 b) The detection limit in the HI test corresponds to a log titer of 1, that is to say a dilution of 1:10 . The title expressed as in the legend of table 9.

TABLEAU 12 TABLE 12

Inoculation de sagouins au moyen d'ALVAC-MV (vCP82) réponse immunitaire vis-à-vis de l'immunité ALVAC préexistante. Inoculation of sagouins using ALVAC-MV (vCP82) immune response to pre-existing ALVAC immunity.

Singe N° Monkey No.

Immunité antérieure aux Poxvirus Immunity before Poxviruses

Réponse HI anti-rougeole HI anti-measles response

primaire3 primary3

rappelb reminderb

36 36

VV, ALVAC VV, ALVAC

< 1 <1

N.B. N.B.

37 37

VV, ALVAC-RG VV, ALVAC-RG

< 1 <1

N.B. N.B.

39 39

VV, ALVAC-RG, CP-FeLV VV, ALVAC-RG, CP-FeLV

1 1

2,2 2.2

40 40

VV, CP-FeLV VV, CP-FeLV

< 1 <1

N.B. N.B.

42 42

Aucune Any

< 1 <1

2,2 2.2

52 52

ALVAC ALVAC

< 1 <1

N.B. N.B.

53 53

ALVAC-RG, ALVAC-RG ALVAC-RG, ALVAC-RG

< 1 <1

1,6 1.6

56 56

CP-FeLV CP-FeLV

< 1 <1

N.B. N.B.

58 58

Aucune Any

1 1

2,2 2.2

19 19

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

VV VV

ALVAC-RG ALVAC-RG

CP-FeLV CP-FeLV

NB NB

Virus de la vaccine, souche Copenhaguen ALVAC recombinant exprimant le gène G de la rage Canaripox recombinant exprimant le gène FeLV env Pas de rappel d'inoculation a) Les animaux ont reçu 5,8 logio par voie sous-cutanée. Vaccinia virus, Copenhagen recombinant ALVAC strain expressing the rabies G gene Canaripox recombinant expressing the FeLV env gene No inoculation booster a) The animals received 5.8 log 10 subcutaneously.

b) Les animaux 39, 42, 52 et 53 ont reçu une inoculation de rappel au moyen d'une dose identique 15 semaines après la première inoculation. b) Animals 39, 42, 52 and 53 received a booster inoculation with an identical dose 15 weeks after the first inoculation.

Clonage et synthèse de l'ADN DNA cloning and synthesis

On a construit des plasmides qui ont été sélectionnés et cultivés par des procédés standards (Mania-tis et al., 1986; Perkus et al., 1985; Piccini et al., 1987). On a obtenu des endonucléases de restriction à partir de GIBCO/BRL; Gaithersburg, MD, New England Biolabs, Beverly, MA; et Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, In. Le fragment de Klenow de E.coli polymérase a été obtenu chez Boehringer Mannheim Biochemicals. L'endonucléase BAL-31 et le phaqe T4 ADN ligase ont été obtenus à partir de New England Biolabs. Les réactifs ont été utilisés comme spécifiés par les différents fournisseurs. Plasmids were constructed which were selected and grown by standard methods (Mania-tis et al., 1986; Perkus et al., 1985; Piccini et al., 1987). Restriction endonucleases were obtained from GIBCO / BRL; Gaithersburg, MD, New England Biolabs, Beverly, MA; and Boehringer Mannheim Biochemicals, Indianapolis, In. The Klenow fragment of E. coli polymerase was obtained from Boehringer Mannheim Biochemicals. The endonuclease BAL-31 and the phaqe T4 DNA ligase were obtained from New England Biolabs. The reagents were used as specified by the various suppliers.

On a préparé des oligodéoxyribonucléotides synthétiques sur un synthétiseur ADN Biosearch 8750 ou Applied Biosystems 380B comme décrit précédemment (Perkus et al., 1989). Le séquençage de l'ADN a été réalisé par la méthode de terminaison de chaîne didéoxy (Sanger et al., 1977) en utilisant séquanase (Tabor et al., 1987) comme précédemment décrit (Guo et al., 1989). L'amplification de l'ADN par une réaction en chaîne de polymérase (PCR) pour la vérification de séquence (Engelke et al., 1988) a été réalisée en utilisant des amorces d'oligonucléotide synthétisées sur mesure et le Kit de réactif d'amplification d'ADN GeneAmp (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) dans un cycliseur thermique d'ADN Perkin Elmer Cetus. Les séquences d'ADN en excès ont été supprimées des plasmides par digestion au moyen d'une endonucléase de restriction suivie par une digestion limitée par Pexonucléase BAL-31 et mutagénèse (Mandecki, 1986) en utilisant des oligonucléotides synthétiques. Synthetic oligodeoxyribonucleotides were prepared on a Biosearch 8750 or Applied Biosystems 380B DNA synthesizer as described previously (Perkus et al., 1989). DNA sequencing was accomplished by the dideoxy chain termination method (Sanger et al., 1977) using sequanase (Tabor et al., 1987) as previously described (Guo et al., 1989). Amplification of DNA by a polymerase chain reaction (PCR) for sequence verification (Engelke et al., 1988) was carried out using custom synthesized oligonucleotide primers and the Reagent Kit. DNA amplification GeneAmp (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) in a thermal cycler of DNA Perkin Elmer Cetus. Excess DNA sequences were removed from plasmids by digestion using a restriction endonuclease followed by limited digestion by BAL-31 exonuclease and mutagenesis (Mandecki, 1986) using synthetic oligonucleotides.

Cellules, virus et transfection. Cells, viruses and transfection.

Les origines et conditions de culture de la souche Copenhagen du virus de la vaccine ont été précédemment décrites (Guo et al. 1989). La production du virus recombinant par recombinaison, hybridation in situ de filtres en nitrocellulose et sélection pour l'activité béta-gaiactosidase ont été décrits précédemment par (Panicali et al., 1982; Perkus et al., 1989). The origins and culture conditions of the Copenhagen strain of vaccinia virus have been previously described (Guo et al. 1989). The production of the recombinant virus by recombination, in situ hybridization of nitrocellulose filters and selection for beta-gaiactosidase activity have been described previously by (Panicali et al., 1982; Perkus et al., 1989).

Construction du Plasmide dSD460 pour supprimer le gène fJ2R) de la Thymidine Kinase Construction of the dSD460 Plasmid to suppress the Thymidine Kinase gene (fJ2R)

En se référant maintenant à la fig. 9, le plasmide pSD406 contient le vaccin HindIII J (pos. 83359-88377) cloné en pUC8. pSD406 a été coupé au moyen de HindIII et Pvull et le fragment de 1,7 kb de la partie gauche de HindIII J cloné dans pUC8 coupé au moyen de Hindlll/Smal. en formant pSD447. pSD447 contient le gène entier pour J2R (pos. 83855-84385). Le codon d'initiation est contenu dans le site Malli et le codon de terminaison est contenu dans le site Sspl. La direction de transcription est indiquée par une flèche sur la fig. 9. Referring now to FIG. 9, the plasmid pSD406 contains the HindIII J vaccine (pos. 83359-88377) cloned in pUC8. pSD406 was cut using HindIII and Pvull and the 1.7 kb fragment from the left part of HindIII J cloned into pUC8 cut using HindIII / SmaI. by forming pSD447. pSD447 contains the entire gene for J2R (pos. 83855-84385). The initiation codon is contained in the Malli site and the termination codon is contained in the Sspl site. The direction of transcription is indicated by an arrow in fig. 9.

Pour obtenir le bras flanquant de gauche, on a isolé un fragment Hindlll/EcoRI de 0,8 kb de pSD447 puis on l'a digéré au moyen de Malli et isolé un fragment de Hindlll/Nlalll de 0,5 kb. Les oligonucléotides synthétiques hybridés MPSYN43/MPSYN44 (SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:18) To obtain the left flanking arm, a 0.8 kb Hindlll / EcoRI fragment of pSD447 was isolated and then digested with Malli and a 0.5 kb Hindlll / NallII fragment was isolated. Synthetic oligonucleotides hybridized MPSYN43 / MPSYN44 (SEQ ID NO: 17 / SEQ ID NO: 18)

ont été unis par ligation avec le fragment Hindlll/Nlalll de 0,5 kb en plasmide vecteur pl)C18 coupé au moyen de Hindlll/EcoRI en engendrant le plasmide pSD449. were ligated with the Hindlll / Nlalll fragment of 0.5 kb in vector plasmid pl) C18 cut using Hindlll / EcoRI, generating the plasmid pSD449.

Pour obtenir un fragment de restriction contenant un bras de flanc droit de la vaccine et les séquences du vecteur pUC, on a coupé pSD447 au moyen de Sspl (partiel) à l'intérieur des séquences de vaccine et HindIII à la jonction pUC/vaccine, et isolé un fragment de vecteur de 2,9 kb. Ce fragment de In order to obtain a restriction fragment containing a right flank arm of vaccinia and the sequences of the vector pUC, pSD447 was cut using Sspl (partial) inside the vaccinia and HindIII sequences at the pUC / vaccine junction, and isolated a 2.9 kb vector fragment. This fragment of

Smal Smal

MPSYN43 5' TAATTAACTAGCTACCCGGG 3' MPSYN43 5 'TAATTAACTAGCTACCCGGG 3'

MPSYN44 3' GTACATTAATTGATCGATGGGCCCTTAA 5' MPSYN44 3 'GTACATTAATTGATCGATGGGCCCTTAA 5'

NlalII NlalII

EcoRI EcoRI

20 20

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

vecteur a été uni par ligation aux oligonucléotides synthétiques hybridés MPSYN45/MPSYN46 (SEQ ID NO:19/SEQ ID N0:20) vector was ligated to hybridized synthetic oligonucleotides MPSYN45 / MPSYN46 (SEQ ID NO: 19 / SEQ ID N0: 20)

HindIII Smal HindIII Smal

MPSYN45 5' AGCTTCCCGGGTAAGTAATACGTCAAGGAGAAAACGAA MPSYN46 3' AGGGCCCATTCATTATGCAGTTCCTCTTTTGCTT MPSYN45 5 'AGCTTCCCGGGTAAGTAATACGTCAAGGAGAAAACGAA MPSYN46 3' AGGGCCCATTCATTATGCAGTTCCTCTTTTGCTT

Noti Sspl Noti Sspl

ACGATCTGTAGTTAGCGGCCGCCTAATTAACTAAT 3' MPSYN45 TGCTAGACATCAATCGCCGGCGGATTAATTGATTA 5' MPSYN46 ACGATCTGTAGTTAGCGGCCGCCTAATTAACTAAT 3 'MPSYN45 TGCTAGACATCAATCGCCGGCGGATTAATTGATTA 5' MPSYN46

en engendrant pSD459. by generating pSD459.

Pour combiner les bras flanquants, de droite et de gauche, en un plasmide, on a isolé à partir de pSD449 un fragment Hindlll/Smal de 0,5 kb et on l'a uni par ligation au plasmide vecteur pSD459 coupé au moyen de Hindlll/Smal. en engendrant le plasmide pSD460. pSD460 a été utilisé en tant que plasmide donneur pour recombinaison avec le virus de la vaccine parent, type sauvage, souche Copenhagen VC-2. Une sonde marquée au phosphore32 a été synthétisée par extension d'amorçe en utilisant MPSYN45 (SEQ ID NO:19) en tant que matrice et l'oligonucléotide 20mer complémentaire MPSYN47 (SEQ ID NO:21) (5'-TTAGTTAATTAGGCGGCCGC-3') en tant qu'amorce. Le virus recombinant vP410 a été identifié par hybridation sur plaque. To combine the flanking arms, right and left, into a plasmid, a 0.5 kb Hindlll / Smal fragment was isolated from pSD449 and ligated to the vector plasmid pSD459 cut using Hindlll / Smal. by generating the plasmid pSD460. pSD460 was used as a donor plasmid for recombination with the parent vaccinia virus, wild type, strain Copenhagen VC-2. A phosphorus-labeled probe32 was synthesized by primer extension using MPSYN45 (SEQ ID NO: 19) as a template and the complementary 20mer oligonucleotide MPSYN47 (SEQ ID NO: 21) (5'-TTAGTTAATTAGGCGGCCGC-3 ') as a primer. The recombinant virus vP410 was identified by plate hybridization.

Construction du Plasmide pSD486 pour suppression de la région hémorragique (B13R + B14F0 Construction of Plasmid pSD486 for suppression of the hemorrhagic region (B13R + B14F0

En se référant maintenant à la fig. 10, le plasmide pSD419 contient la vaccine Sali G (pos. 160.744-173.351) cloné en pUC8. pSD422 contient le fragment Sali de la vaccine contigue vers la droite, Sali J (pos. 173.351-182.746) cloné en pUC8. Pour construire un plasmide supprimé pour la région hémorragique u, B13R-B14R (pos. 172.549-173.552), pSD419 a été utilisé en tant que source pour le bras de flanc de gauche et pSD442 a été utilisé comme source pour le bras de flanc de droite. La direction de transcription pour la région u est indiquée par une flèche sur la fig. 10. Referring now to FIG. 10, the plasmid pSD419 contains the vaccinia Sali G (pos. 160.744-173.351) cloned in pUC8. pSD422 contains the Sali fragment of the vaccine contiguous to the right, Sali J (pos. 173.351-182.746) cloned in pUC8. To construct a deleted plasmid for the hemorrhagic region u, B13R-B14R (pos. 172.549-173.552), pSD419 was used as the source for the left flank arm and pSD442 was used as the source for the flank arm. right. The direction of transcription for region u is indicated by an arrow in fig. 10.

Pour éliminer les séquences non désirées de pSD419, on a éliminé les séquences vers la gauche du site Ncol (pos. 172.253) par digestion de pSD419 au moyen de Ncol/Smal. puis par formation d'une terminaison franche au moyen d'un fragment de Klenow de la E. coli polymérase et ligation, en engendrant le plasmide pSD476. Un bras flanquant droit de la vaccine a été obtenu par digestion de pSD422 au moyen de Hpal au codon de terminaison de B14R et par digestion au moyen de Nrul 0,3 kb vers la droite. Ce fragment de 0,3 kb a été isolé et uni par ligation avec un fragment vecteur Hincll de 3,4 kb isolé à partir de pSD476, en engendrant le plasmide pSD477. L'emplacement de la suppression partielle de la région u de la vaccine dans pSD477 est indiqué par un triangle. Les séquences de codage B13R restantes dans pSD477 ont été éliminees par digestion au moyen de Clal/Hpal et le fragment vecteur résultant a été uni par ligation aux oligonucléotides synthétiques hybridés SD22mer/SD20mer (SEQ ID NO;22/SEQ ID NO:23). To remove unwanted sequences from pSD419, the sequences were removed to the left of the Ncol site (pos. 172.253) by digestion of pSD419 using Ncol / SmaI. then by formation of a blunt termination by means of a Klenow fragment of E. coli polymerase and ligation, by generating the plasmid pSD476. A right flanking arm of vaccinia was obtained by digestion of pSD422 using Hpal at the termination codon of B14R and by digestion using Nrul 0.3 kb to the right. This 0.3 kb fragment was isolated and ligated with a 3.4 kb Hincll vector fragment isolated from pSD476, generating the plasmid pSD477. The location of the partial deletion of the vaccinia u region in pSD477 is indicated by a triangle. The remaining B13R coding sequences in pSD477 were removed by digestion using ClaI / Hpal and the resulting vector fragment was ligated to the hybridized synthetic oligonucleotides SD22mer / SD20mer (SEQ ID NO; 22 / SEQ ID NO: 23).

Clal BamHI Hpal Clal BamHI Hpal

SD22mer 5' CGATTACTATGAAGGATCCGTT 3' SD22mer 5 'CGATTACTATGAAGGATCCGTT 3'

SD20mer 3' TAATGATACTTCCTAGGCAA 5' SD20mer 3 'TAATGATACTTCCTAGGCAA 5'

en engendrant pSD479. pSD479 contient un codon d'initiation (souligné) suivi par un site BamHI. Pour placer E. coli béta-galactosidase dans le locus de suppression B13-B14 (u) sous le contrôle du promoteur u, on a inséré un fragment de BamHI de 3,2 kb, contenant le gène de béta-galactosidase (Shapira et al., 1983), au site BamHI de pSD479, en engendrant pSD479BG. pSD479BG a été utilisé comme plasmide donneur pour la recombinaison avec le virus de la vaccine vP410. Le virus de vaccine recombinant vP433 a été isolé sous la forme d'une plaque bleue en présence de substrat X-gal chromogéni-que. On a supprimé dans vP533 la région B13R-B14R et on l'a remplacé par béta-galactosidase. by generating pSD479. pSD479 contains an initiation codon (underlined) followed by a BamHI site. To place E. coli beta-galactosidase in the suppression locus B13-B14 (u) under the control of the promoter u, a 3.2 kb BamHI fragment containing the beta-galactosidase gene (Shapira et al.) Was inserted. ., 1983), at the BamHI site of pSD479, generating pSD479BG. pSD479BG was used as a donor plasmid for recombination with the vaccinia virus vP410. The recombinant vaccinia virus vP433 was isolated in the form of a blue plate in the presence of chromogenic X-gal substrate. The B13R-B14R region was deleted in vP533 and replaced with beta-galactosidase.

Pour enlever des séquences de béta-galactosidase de vP533, on a utilisé le plasmide pSD486, un dérivé de pSD477 contenant une région de polylinker mais aucun codon d'initiation à la jonction de To remove beta-galactosidase sequences from vP533, plasmid pSD486, a derivative of pSD477 containing a polylinker region but no initiation codon at the junction, was used.

21 21

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

suppression u. On a d'abord uni par ligation le fragment vecteur Clal/Hpal de pSD477, mentionné ci-dessus, aux oligonucléotides synthétiques hybridés SD42mer/SD40mer (SEQ ID NO:24/SEQ ID NO:25) deletion u. The ClaI / Hpal vector fragment of pSD477, mentioned above, was first ligated to the synthetic oligonucleotides SD42mer / SD40mer (SEQ ID NO: 24 / SEQ ID NO: 25)

Clal Sacl Xhol Hpal Clal Sacl Xhol Hpal

SD4 2mer 5' CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGATCCGTT 3' SD40mer 3' TAATGATCTAGACTCGAGGGGCCCGAGCTCCCTAGGCAA 5' SD4 2mer 5 'CGATTACTAGATCTGAGCTCCCCGGGCTCGAGGGATCCGTT 3' SD40mer 3 'TAATGATCTAGACTCGAGGGGCCCGAGCTCCCTAGGCAA 5'

Balli Smal BamHI Balli Smal BamHI

en engendrant le plasmide pSD478. Ensuite ie site EcoRI à la jonction pUC/vaccine a été détruit par digestion de pSD478 au moyen de EcoRI. suivie par la formation d'une coupure franche au moyen du fragment de Klenow de E. coli polymérase et ligation, en engendrant le plasmide pSD478E_. pSD478E~ a été digéré au moyen de BamHI et Hpal et uni par ligation aux oligonucléotides synthétiques hybridés HEM5/HEM6 (SEQ ID NO:26/SEQ ID NO:27) by generating the plasmid pSD478. Then the EcoRI site at the pUC / vaccinia junction was destroyed by digestion of pSD478 with EcoRI. followed by the formation of a blunt cut using the Klenow fragment of E. coli polymerase and ligation, generating the plasmid pSD478E_. pSD478E ~ was digested using BamHI and Hpal and ligated to synthetic oligonucleotides hybridized HEM5 / HEM6 (SEQ ID NO: 26 / SEQ ID NO: 27)

BamHI EcoRI Hpal HEM5 5' GATCCGAATTCTAGCT 3' HEM6 3' GCTTAAGATCGA 5' BamHI EcoRI Hpal HEM5 5 'GATCCGAATTCTAGCT 3' HEM6 3 'GCTTAAGATCGA 5'

en engendrant le plasmide pSD486. pSD486 a été utilisé en tant que plasmide donneur pour recombinaison avec le virus de vaccine recombinant vP533, en engendrant vP553 qui a été isolé sous la forme d'une plaque claire en présence de X-gal. by generating the plasmid pSD486. pSD486 was used as a donor plasmid for recombination with the recombinant vaccinia virus vP533, generating vP553 which was isolated as a clear plate in the presence of X-gal.

Construction du plasmide pMP494A pour la suppression de la région ATI fA26ü Construction of the plasmid pMP494A for the suppression of the ATI region fA26ü

En se référant maintenant à la fig. 11, pSD414 contient Sali B cloné en pUC8. Pour éliminer les séquences d'ADN non desirées vers la gauche de la région A26L, on a coupé pSD414 au moyen de Xbal à l'intérieur des séquences de vaccine (pos. 137 079) et au moyen de HindIII à la jonction pUC/ vaccine, puis on a réalisé une coupure franche au moyen d'un fragment de Klenow de E. coli polymérase et réalise une ligation, ce qui a donné le plasmide pSD483. Pour éliminer les séquences d'ADN de vaccine non désirées à la droite de la région A26L, on a coupé pSD483 au moyen d'EcoRI (pos. 140 665 et à la jonction pUC/vaccine) et on a uni par ligation, en formant le plasmide pSD484. Pour eliminer la région de codage A26L, on a coupé pSD484 au moyen de Ndel (partiel) légèrement en amont de A26L ORF (pos. 139 004) et avec Hpal (pos. 137 889) légèrement en aval de A26L ORF. Le fragment vecteur de 5,2 kb a été isolé et uni par ligation avec les oligonucléotides synthétiques hybridés ATI3/ATI4 (SEQ ID NO:28/SEQ ID NO:29) Referring now to FIG. 11, pSD414 contains Sali B cloned into pUC8. To remove the DNA sequences not desired to the left of the A26L region, pSD414 was cut using Xbal within the vaccinia sequences (pos. 137 079) and using HindIII at the pUC / vaccinia junction , then a clear cut was made using a Klenow fragment of E. coli polymerase and carried out a ligation, which gave the plasmid pSD483. To remove unwanted vaccinia DNA sequences to the right of the A26L region, pSD483 was cut using EcoRI (pos. 140,665 and at the pUC / vaccinia junction) and ligated, forming the plasmid pSD484. To eliminate the A26L coding region, pSD484 was cut using Ndel (partial) slightly upstream of A26L ORF (pos. 139 004) and with Hpal (pos. 137 889) slightly downstream of A26L ORF. The 5.2 kb vector fragment was isolated and ligated with synthetic ATI3 / ATI4 hybridized oligonucleotides (SEQ ID NO: 28 / SEQ ID NO: 29)

Ndel Edel

ATI 3 5 ' TATGAGTAACTTAACTCTTTTGTTAATTAAAAGTATATTCAAAAAATAAGT ATI4 3' ACTCATTGAATTGAGAAAACAATTAATTTTCATATAAGTTTTTTATTCA ATI 3 5 'TATGAGTAACTTAACTCTTTTGTTAATTAAAAGTATATTCAAAAAATAAGT ATI4 3' ACTCATTGAATTGAGAAAACAATTAATTTTCATATAAGTTTTTTATTCA

Balli EcoRI Hpal TATATAAATAGATCTGAATTCGTT 3' AT13 ATATATTTATCTAGACTTAAGCAA 5' ATI4 Balli EcoRI Hpal TATATAAATAGATCTGAATTCGTT 3 'AT13 ATATATTTATCTAGACTTAAGCAA 5' ATI4

en reconstruisant la région en amont de A26L et en remplaçant A26L ORF par une courte région de polyiinker contenant les sites de restriction Bgill, EcoRI et Hoal. comme indiqué ci-dessus. Le plasmide résultant a été appelé pSD485. Etant donné que les sites Bgill et EcoRI dans la région de polylinker de pSD485 ne sont pas uniques, les sites non désirés EgiH et EcoRI ont été éliminés du plasmide pSD483 (décrit ci-dessus) par digestion au moyen de Bgill (pos. 140 136) et avec EcoRI a la jonction pUC/vaccine, suivi par formation d'une coupure franche au moyen d'un fragment de Klenow de E. coli polymérase et ligation. Le plasmide résultant a été appelé pSD489. Le fragment £!âl (pos. 137 198)/ EcoRV (pos. 139 048) de 1,8 kb de pSD489 contenant le A26L ORF a été remplacé par le fragment by reconstructing the region upstream of A26L and replacing A26L ORF with a short polyiinker region containing the restriction sites Bgill, EcoRI and Hoal. as shown above. The resulting plasmid was called pSD485. Since the Bgill and EcoRI sites in the polylinker region of pSD485 are not unique, the unwanted EgiH and EcoRI sites were removed from the plasmid pSD483 (described above) by digestion using Bgill (pos. 140,136 ) and with EcoRI at the pUC / vaccine junction, followed by the formation of a blunt cut using a Klenow fragment of E. coli polymerase and ligation. The resulting plasmid was called pSD489. The 1.8 kb £! Âl (pos. 137 198) / EcoRV (pos. 139 048) fragment of pSD489 containing the A26L ORF was replaced by the fragment

22 22

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

Clal/EcoRV contenant le polylinker de 0,7 kb de pSD485 en engendrant pSD492. Les sites Bgill et EcoRI dans la région de polylinker de pSD492 sont uniques. Clal / EcoRV containing the 0.7 kb polylinker of pSD485 generating pSD492. The Bgill and EcoRI sites in the polylinker region of pSD492 are unique.

Une cassette Bgill de 3,3 kb contenant le gène E. coli bétagalactosidase (Shapira et AL, 1983) sous le contrôle du promoteur de vaccine de 11 kDa (Bertholet et Al., 1985; Perkus et Al., 1990) a été insérée dans le site J2gNI de pSD492 en formant pSD493KBG. Le plasmide pSD493KBG a été utilisé en recombinaison avec le virus de sauvetage vP553. Le virus de vaccine recombinant vP581 contenant la béta-galactosidase dans la région de suppression A26L a été isolé en tant que plaque bleue en présence de X-gal. A 3.3 kb Bgill cassette containing the E. coli betagalactosidase gene (Shapira et AL, 1983) under the control of the 11 kDa vaccinia promoter (Bertholet et Al., 1985; Perkus et Al., 1990) was inserted in the J2gNI site of pSD492 by forming pSD493KBG. The plasmid pSD493KBG was used in recombination with the rescue virus vP553. The recombinant vaccinia virus vP581 containing beta-galactosidase in the A26L suppression region was isolated as a blue plate in the presence of X-gal.

Pour engendrer un plasmide pour l'élimination des séquences de béta-galactosidase du virus de vaccine recombinant vP581, la région de polylinker du plasmide pSD492 a été supprimée par mutagénèse (Mandecki, 1986) en utilisant l'oligonucléotide synthétique MPSYN177 (SEQ ID N0:30) (5-AAAATGG-GCGTGGATTGTTAACTTTATATAACTTATTTTTTGAATATAC-3'). Dans le plasmide résultant pMP494A, les positions (137 889-138 937) entourant l'ADN de la vaccine, comprenant tout le A26L ORF sont supprimées. La recombinaison entre pMP494A et la bétagalactosidase contenant la vaccine recombinante vP581 a résulté dans le mutant de suppression de la vaccine, vP618, qui a été isolé sous la forme d'une plaque claire en présence de X-gal. Construction du plasmide pSD467 pour la suppression du gène de l'hémaggiutinine (A56R). To generate a plasmid for the elimination of the beta-galactosidase sequences from the recombinant vaccinia virus vP581, the polylinker region of the plasmid pSD492 was deleted by mutagenesis (Mandecki, 1986) using the synthetic oligonucleotide MPSYN177 (SEQ ID NO: 30) (5-AAAATGG-GCGTGGATTGTTAACTTTATATAACTTATTTTTTGAATATAC-3 '). In the resulting plasmid pMP494A, the positions (137 889-138 937) surrounding the vaccinia DNA, comprising all of the A26L ORF are deleted. The recombination between pMP494A and the betagalactosidase containing the recombinant vaccinia vP581 resulted in the vaccinia suppression mutant, vP618, which was isolated as a clear plate in the presence of X-gal. Construction of the plasmid pSD467 for the suppression of the hemaggiutinin gene (A56R).

En se référant maintenant à la fig. 12, le fragment de restriction Sali G de la vaccine (pos. 160 744-173 351) traverse la jonction HindIII A/B (pos. 162 539). pSD419 contient Sali G de la vaccine cloné en pUC8. La direction de transcription pour le gène d'hémagglutinine (HA) est indiquée par une flèche sur la fig. 12. Les séquences de vaccine dérivées de HindIII B sont éliminées par digestion de pSD419 avec HindIII à l'intérieur des séquences de vaccine et la jonction pUC/vaccine, suivie par une ligation. Le plasmide résultant, pSD456 contient le gène HA, A56R, flanqué par 0,4 kb de séquences de vaccine vers la gauche et 0,4 kb de séquences de vaccine vers la droite. Les séquences de codage A56R sont éliminées par coupure de pSD456 au moyen de Rsal (partiel; pos. 161 090) en amont des séquences de codage A56R et au moyen de Eagl (pos. 162 064) au voisinage de l'extrémité du gène. Le fragment vecteur Rsal/Eagl de 3,6 kb de pSD456 a été isolé et uni par ligation avec les oligonucléotides synthétiques hybridés MPSYN59 (SEQ ID NO:31), MPSYN62 (SEQ ID NO:32), MPSYN60 (SEQ ID NO:33), et MPSYN 61 (SEQ ID NO:34) Referring now to FIG. 12, the Sali G restriction fragment of vaccinia (pos. 160 744-173 351) crosses the HindIII junction A / B (pos. 162 539). pSD419 contains Sali G from vaccinia cloned into pUC8. The direction of transcription for the hemagglutinin (HA) gene is indicated by an arrow in fig. 12. The vaccinia sequences derived from HindIII B are eliminated by digestion of pSD419 with HindIII inside the vaccinia sequences and the pUC / vaccinia junction, followed by ligation. The resulting plasmid, pSD456 contains the HA gene, A56R, flanked by 0.4 kb of vaccinia sequences to the left and 0.4 kb of vaccinia sequences to the right. The A56R coding sequences are eliminated by cleavage of pSD456 by means of Rsal (partial; pos. 161,090) upstream of the A56R coding sequences and by means of Eagl (pos. 162,064) near the end of the gene. The 3.6 kb Rsal / Eagl vector fragment of pSD456 was isolated and ligated with the hybridized synthetic oligonucleotides MPSYN59 (SEQ ID NO: 31), MPSYN62 (SEQ ID NO: 32), MPSYN60 (SEQ ID NO: 33 ), and MPSYN 61 (SEQ ID NO: 34)

Rsal Rsal

MPSYN59 5' ACACGAATGATTTTCTAAAGTATTTGGAAAGTTTTATAGGTAGTTGATAGA-MPSYN62 3' TGTGCTTACTAAAAGATTTCATAAACCTTTCAAAATATCCATCAACTATCT 5' MPSYN59 5 'ACACGAATGATTTTCTAAAGTATTTGGAAAGTTTTATAGGTAGTTGATAGA-MPSYN62 3' TGTGCTTACTAAAAGATTTCATAAACCTTTCAAAATATCCATCAACTATCT 5 '

MPSYN59 -ACAAAATACATAATTT 3' MPSYN59 -ACAAAATACATAATTT 3 '

Balli Balli

MPSYN60 5' TGTAAAAATAAATCACTTTTTATACTAAGATCT- MPSYN60 5 'TGTAAAAATAAATCACTTTTTATACTAAGATCT-

MPSYN61 3' TGTTTTATGTATTAAAACATTTTTATTTAGTGAAAAATATGATTCTAGA- MPSYN61 3 'TGTTTTATGTATTAAAACATTTTTATTTAGTGAAAAATATGATTCTAGA-

Smal PstI Eaal MPSYN60 -CCCGGGCTGCAGC 3' Smal PstI Eaal MPSYN60 -CCCGGGCTCTAGAGC 3 '

MPSYN61 -GGGCCCGACGTCGCCGG 5' MPSYN61 -GGGCCCGACGTCGCCGG 5 '

en reconstruisant les séquences d'ADN en amont de A56R ORF et en remplaçant le A56R ORF par une région de polylinker comme indiqué ci-dessus. Le plasmide résultant est pSD466. La suppression de la vaccine dans pSD466 comprend les positions (161 185-162 053). Le site de la suppression dans pSD466 est indiqué par un triangle sur la fig. 12. by reconstructing the DNA sequences upstream of A56R ORF and replacing the A56R ORF with a polylinker region as indicated above. The resulting plasmid is pSD466. The suppression of vaccinia in pSD466 includes the positions (161 185-162 053). The site of deletion in pSD466 is indicated by a triangle in fig. 12.

Une cassette Balll/BamHI (partiel) de 3,2 kb contenant le gène de E. coli béta-galactosidase (Shapira et Al., 1983) sous le contrôle du promoteur de la vaccine de 11 kDa (Bertholet et Al., 1985; Guo et Al., 1989) a été insérée dans le site Bgill de pSD466 en formant pSD466KBG. Le plasmide pSD466KBG a été utilisé en recombinaison avec le virus de sauvetage vP618. Le virus 25 recombinant de la vaccine, vP708, contenant la béta-galactosidase dans la suppression A56R, a été isolé en tant que plaque bleue en présence de X-gal. A 3.2 kb Balll / BamHI cassette (partial) containing the E. coli beta-galactosidase gene (Shapira et Al., 1983) under the control of the 11 kDa vaccinia promoter (Bertholet et Al., 1985; Guo et al., 1989) was inserted into the Bgill site of pSD466 forming pSD466KBG. The plasmid pSD466KBG was used in recombination with the rescue virus vP618. The recombinant vaccinia virus, vP708, containing beta-galactosidase in suppression A56R, was isolated as a blue plate in the presence of X-gal.

Les séquences de béta-galactosidase ont été supprimées de vP708 en utilisant le plasmide donneur pSD467. pSD467 est identique à pSD466,+ excepté que les sites EcoRI. Smal et BamHI ont été sup23 The beta-galactosidase sequences were deleted from vP708 using the donor plasmid pSD467. pSD467 is identical to pSD466, + except that the EcoRI sites. Smal and BamHI were sup23

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

primés de ia jonction pUC/vaccine par digestion de pSD466 au moyen d'EcoRI/BamHI suivie par la formation d'une coupure franche au moyen du fragment de Klenow de E. coli polymérase et ligation. La recombinaison entre vP708 et pSD467 a résulté dans le mutant de suppression de vaccine recombinante vP723, qui a été isolé en tant que plaque claire en présence de X-gal. award winning pUC / vaccine junction by digesting pSD466 using EcoRI / BamHI followed by the formation of a blunt cut using the Klenow fragment of E. coli polymerase and ligation. Recombination between vP708 and pSD467 resulted in the recombinant vaccinia suppression mutant vP723, which was isolated as a clear plate in the presence of X-gal.

Construction du Plasmide pMPCSKlA pour la suppression des cadres de lecture ouverts (C7L-K1Ü Construction of the pMPCSKlA Plasmid for the suppression of open reading frames (C7L-K1Ü

En se référant maintenant à la fig. 13, les clones de vaccine ci-après ont été utilisés dans la construction de pMPCSKlA. pSD420 est cloné par Sali H en puC8. pSD435 est cloné par Kpnl F en pUC18. pSD435 est coupé au moyen de Sphl et re-soumis à ligation en formant pSD451. Dans pSD451 les séquences d'ADN à la gauche du site Sphl (pos. 27 416) dans HindIII M sont supprimés (Perkus et Al., 1990). pSD409 est cloné par HindIII M en pUC8. Referring now to FIG. 13, the following vaccinia clones were used in the construction of pMPCSKlA. pSD420 is cloned by Sali H into puC8. pSD435 is cloned by Kpnl F into pUC18. pSD435 is cut using Sphl and re-subjected to ligation forming pSD451. In pSD451 the DNA sequences to the left of the Sphl site (pos. 27,416) in HindIII M are deleted (Perkus et Al., 1990). pSD409 is cloned by HindIII M into pUC8.

Pour fournir un substrat pour la suppression de la grappe de gène (C7L-K1L) à partir de la vaccine, on a d'abord inséré l'E. coli béta-galactosidase dans le locus de suppression M2L de la vaccine (Guo et Al., 1990) comme suit. Pour éliminer le site Bgill de pSD409, le plasmide a été coupé au moyen de Balli dans les séquences de vaccine (pos. 28 212) et au moyen de BamHI à la jonction pUC/vaccine, puis soumis à une ligation pour former le plasmide pMP409B. pMP409B a été coupé au site unique Sphl (pos. 27 416). Les séquences de codage M2L ont été supprimées par mutagénèse (Guo et AL, 1990; Mandecki, 1986) en utilisant l'oligonucléotide synthétique To provide a substrate for the suppression of the gene cluster (C7L-K1L) from vaccinia, E was first inserted. coli beta-galactosidase in the M2L suppression locus of vaccinia (Guo et al., 1990) as follows. To remove the Bgill site from pSD409, the plasmid was cut using Balli in the vaccinia sequences (pos. 28 212) and using BamHI at the pUC / vaccinia junction, then ligated to form the plasmid pMP409B . pMP409B was cut at the single Sphl site (pos. 27,416). M2L coding sequences were deleted by mutagenesis (Guo et AL, 1990; Mandecki, 1986) using the synthetic oligonucleotide

BcrlII BcrlII

MPSYN82 (SEQ ID NO:35) 5' TTTCTGTATATTTGCACCAATTTAGATCTTACTCAAAA MPSYN82 (SEQ ID NO: 35) 5 'TTTCTGTATATTTGCACCAATTTAGATCTTACTCAAAA

TATGTAACAATA 3' TATGTAACAATA 3 '

Le plasmide résultant, pMP409D, contient un site Bgill unique inséré dans le locus de suppression M2L comme indiqué précédemment. Une cassette BamHI (partieli/Balll de 3,2 kb contenant le gène de E. coli béta-galactosidase (Shapira et Al., 1983) sous le contrôle du promoteur de 11 kDA (Bertholet et AL, 1985) a été inséré dans pMP409D coupé au moyen de Bgill. Le plasmide résultant, pMP409DBG (Guo et AL, 1990), a été utilisé comme plasmide donneur pour la recombinaison au moyen du virus de la vaccine de sauvetage vP723. Le virus de vaccine recombinant, 35 vP744, contenant la béta-galacto-sidase insérée dans le locus de suppression M2L, a été isolé sous la forme d'une plaque bleue en présence de X-gal. The resulting plasmid, pMP409D, contains a unique Bgill site inserted into the M2L suppression locus as previously indicated. A BamHI cassette (3.2 kb partiali / Balll containing the E. coli beta-galactosidase gene (Shapira et Al., 1983) under the control of the 11 kDA promoter (Bertholet et AL, 1985) was inserted into pMP409D cut with Bgill. The resulting plasmid, pMP409DBG (Guo et AL, 1990), was used as a donor plasmid for recombination using the vaccinia rescue virus vP723. The recombinant vaccinia virus, vP744, containing beta-galactosidase inserted in the M2L suppression locus, was isolated in the form of a blue plate in the presence of X-gal.

Un plasmide supprimé en ce qui concerne les gènes de vaccine (C7L-K1L) a été assemblé en pUC8 coupé au moyen de Smal. HindIII et terminé par une coupure franche au moyen du fragment de Klenow de E. coli polymérase. Le bras flanquant gauche consistant en séquences HindIII C de la vaccine a été obtenu en digérant pSD420 au moyen de Xbal (pos. 18 628) suivie de la formation d'une coupure franche au moyen du fragment de Klenow de E. coli polymérase et digestion par Bgill (pos. 19 706). Le bras flanquant de droite consistant en séquences HindIII K de la vaccine a été obtenu par digestion de pSD451 au moyen de Bgill (pos. 29 062) et EcoRV (pos. 29 778). Le plasmide résultant, pMP581CK, est privé des séquences de vaccine entre le site Bgill (pos. 19 706) dans HindIII C et le site SMII (pos. 29 062) dans HindIII K. Le site de suppression des séquences de vaccine du plasmide pMP581CK est indiqué par un triangle sur la fig. 13. A plasmid deleted with regard to the vaccinia genes (C7L-K1L) was assembled into pUC8 cut using SmaI. HindIII and terminated by a blunt cut using the Klenow fragment of E. coli polymerase. The left flanking arm consisting of HindIII C vaccinia sequences was obtained by digesting pSD420 using Xbal (pos. 18,628) followed by the formation of a blunt cut using the Klenow fragment of E. coli polymerase and digestion by Bgill (pos. 19,706). The right flanking arm consisting of vaccinia HindIII K sequences was obtained by digestion of pSD451 using Bgill (pos. 29,062) and EcoRV (pos. 29,778). The resulting plasmid, pMP581CK, is deprived of the vaccinia sequences between the Bgill site (pos. 19,706) in HindIII C and the SMII site (pos. 29,062) in HindIII K. The vaccinia sequence suppression site of the plasmid pMP581CK is indicated by a triangle in fig. 13.

Pour enlever l'excès d'ADN à la jonction de suppression de la vaccine, le plasmide pMP581 CK a été coupé aux sites Ncol dans les séquences de vaccine (pos. 18 811; 19 655), traité au moyen d'exonu-cléase Bal-31 et soumis à la mutagénèse (Mandecki, 1986) en utilisant l'oligonucléotide synthétique MPSYN233 (SEQ ID NO:36) 5'-T GT C ATTTAAC ACTATACT CATATTAATA AA A ATAATATTTATT-3'. Le plasmide résultant pMPCSKlA, est débarassé des positions 18 805-29 108, de séquence de vaccine, entourant 12 cadres de lecture ouverts de la vaccine (C7L- K1L). La recombinaison entre pMPCSKlA et la vaccine recombinante contenant la béta-galactosidase, vP784, a résulté dans le mutant de suppression de la vaccine, vP804, qui a été isolé en tant que plaque claire en présence de X-gal. To remove excess DNA at the vaccinia suppressing junction, the plasmid pMP581 CK was cut at the NcoI sites in the vaccinia sequences (pos. 18,811; 19,655), treated with exonu-clase Bal-31 and subjected to mutagenesis (Mandecki, 1986) using the synthetic oligonucleotide MPSYN233 (SEQ ID NO: 36) 5'-T GT C ATTTAAC ACTATACT CATATTAATA AA A ATAATATTTATT-3 '. The resulting plasmid pMPCSKlA, is freed from positions 18 805-29 108, of vaccinia sequence, surrounding 12 open vaccinia reading frames (C7L-K1L). Recombination between pMPCSKlA and the recombinant vaccinia containing beta-galactosidase, vP784, resulted in the vaccinia suppression mutant, vP804, which was isolated as a clear plaque in the presence of X-gal.

Construction du plasmide pSD548 pour la suppression de l'importante sous-unité ribonucléotide réduc-tase (I4LÌ Construction of the plasmid pSD548 for the suppression of the important ribonucleotide reductase subunit (I4LÌ

En se référant maintenant à la fig. 14, le plasmide pSD405 contient la vaccine HindIII I (pos. 63 875-70 367) clonée en pUC8. pSD405 a été digéré au moyen de EcoRV dans les séquences de la vaccine (pos. 67 933) et au moyen de Smal à la jonction pUC/vaccine et uni par ligation, en formant le plasmide pSD518. pSD518 a été utilisé comme source de tous les fragments de restriction de vaccine utilisé dans la construction de pSD548. Referring now to FIG. 14, the plasmid pSD405 contains the vaccinia HindIII I (pos. 63 875-70 367) cloned in pUC8. pSD405 was digested using EcoRV in the vaccinia sequences (pos. 67 933) and using SmaI at the pUC / vaccinia junction and ligated to form the plasmid pSD518. pSD518 was used as the source of all of the vaccinia restriction fragments used in the construction of pSD548.

Le gène I4L de vaccine s'étend de la position 67 371 à la position 65 059. La direction de transcription pour I4L est indiquée par une flèche sur la fig. 14. Pour obtenir un fragment de plasmide vecteur The vaccinia gene I4L extends from position 67,371 to position 65,059. The direction of transcription for I4L is indicated by an arrow in FIG. 14. To obtain a vector plasmid fragment

24 24

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

débarassé d'une portion des séquences de codage I4L, on a digéré pSD518 au moyen de BamHI (pos. 65 381) et Hpal (pos. 67 001) et on a réalisé une coupure franche en utilisant un fragment de Klenow de E. coli polymérase. Ce fragment de vecteur de 4,8 kb a été uni par ligation avec une cassette de Smal de 3,2 kb contenant le gène de E. coli béta-galactosidase (Shapira et Al., 1983) sous le contrôle du promoteur de 11 kDa de vaccine (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990) en donnant le plasmide pSD524KBG. pSD524KBG a été utilisé comme plasmide donneur pour la recombinaison avec le virus de la vaccine vP804. Le virus de vaccine recombinant, vP855, contenant la béta-galactosidase en une suppression partielle du gène I4L, a été isolé sous la forme d'une plaque bleue en présence de X-gal. rid of a portion of the I4L coding sequences, pSD518 was digested using BamHI (pos. 65,381) and Hpal (pos. 67,001) and a blunt cut was made using a Klenow fragment from E. coli polymerase. This 4.8 kb vector fragment was ligated with a 3.2 kb Smal cassette containing the E. coli beta-galactosidase gene (Shapira et Al., 1983) under the control of the 11 kDa promoter vaccinia (Bertholet et al., 1985; Perkus et al., 1990) by giving the plasmid pSD524KBG. pSD524KBG was used as the donor plasmid for recombination with the vaccinia virus vP804. The recombinant vaccinia virus, vP855, containing beta-galactosidase in partial suppression of the I4L gene, was isolated in the form of a blue plate in the presence of X-gal.

Pour supprimer la béta-galactosidase et le restant de 14L ORF de vP855, on a construit le plasmide de suppression pSD548. Les bras flanquants à droite et à gauche de la vaccine ont été assemblés séparément en pUC8 comme détaillé ci-après et ceci est représenté schématiquement sur la fig. 14. To suppress beta-galactosidase and the remaining 14L ORF from vP855, the suppressing plasmid pSD548 was constructed. The flanking arms to the right and to the left of the vaccine were assembled separately in pUC8 as detailed below and this is shown diagrammatically in FIG. 14.

Pour construire un plasmide vecteur afin d'accepter le bras flanquant de gauche de la vaccine, pUC8 a été coupé au moyen de BamHI/EcoRI et uni par ligation avec les nucléotides synthétiques hybridés 518A1/518A2 (SEQ ID NO:37/SEQ ID NO:38) To construct a vector plasmid to accept the left flanking arm of the vaccinia, pUC8 was cut using BamHI / EcoRI and ligated with synthetic nucleotides hybridized 518A1 / 518A2 (SEQ ID NO: 37 / SEQ ID NO : 38)

BamHI Rsal BamHI Rsal

518Al 5' GATCCTGAGTACTTTGTAATATAATGATATATATTTTCACTTTATCTCAT 518A2 3' GACTCATGAAACATTATATTACTATATATAAAAGTGAAATAGAGTA 518Al 5 'GATCCTGAGTACTTTGTAATATAATGATATATATTTTCACTTTATCTCAT 518A2 3' GACTCATGAAACATTATATTACTATATATAAAAGTGAAATAGAGTA

Balli EcoRI TTGAGAATAAAAAGATCTTAGG 3' 518A1 Balli EcoRI TTGAGAATAAAAAGATCTTAGG 3 '518A1

AACTCTTATTTTTCTAGAATCCTTAA 5' 518A2 AACTCTTATTTTTCTAGAATCCTTAA 5 '518A2

en formant le plasmide pSD531. pSD531 a été coupé au moyen de Rsal (partiel) et BamHI et le fragment de vecteur de 2,7 kb a été isolé. pSD518 a été coupé au moyen de Bgill (pos. 64 459)/Rsal (pos. 64 994) et un fragment de 0,5 kb a été isolé. Les deux fragments ont été unis par ligation entre eux, en formant pSD537, qui contient le bras de flanc complet à gauche des séquences de codage I4L. by forming the plasmid pSD531. pSD531 was cut using Rsal (partial) and BamHI and the 2.7 kb vector fragment was isolated. pSD518 was cut using Bgill (pos. 64,459) / Rsal (pos. 64,994) and a 0.5 kb fragment was isolated. The two fragments were ligated together, forming pSD537, which contains the full flank arm to the left of the I4L coding sequences.

Pour construire un plasmide vecteur pour accepter le bras de flanc de droite de la vaccine, on a coupé pUC8 au moyen de BamHI/EcoRI et on l'a uni par ligation avec les oligonucléotides synthétiques hybridés 518B1/518B2 (SEQ ID NO:39/SEQ ID N0:40) To construct a vector plasmid to accept the right flank arm of the vaccinia, pUC8 was cut using BamHI / EcoRI and ligated with synthetic oligonucleotides hybridized 518B1 / 518B2 (SEQ ID NO: 39 / SEQ ID N0: 40)

BamHI Balli Smal BamHI Balli Smal

GATCCAGATCTCCCGGGAAAAAAATTATTTAACTTTTCATTAATAGGGATTT GTCTAGAGGGCCCTTTTTTTAATAAATTGAAAAGTAATTATCCCTAAA Rsal EcoRI GACGTATGTAGCGTACTAGG 3' 518B1 GATCCAGATCTCCCGGGAAAAAAATTATTTAACTTTTCATTAATAGGGATTT GTCTAGAGGGCCCTTTTTTTAATAAATTGAAAAGTAATTATCCCTAAA Rsal EcoRI GACGTATGTAGCGTACTAGG 3 '518B1

CTGCATACTACGCATGATCCTTAA 5' 518B2 • CTGCATACTACGCATGATCCTTAA 5 '518B2 •

en formant le plasmide pSD532. pSD532 a été coupé avec Rsal (partieli/EcoRI et un fragment de vecteur de 2,7 kb a été isolé. On a coupé pSD518 au moyen de Rsal dans les séquences de la vaccine (pos. 67 436) et EcoRI a la jonction vaccine/pUC, et on a isolé un fragment de 0,6 kb. Les deux fragments ont été unis par ligation, en formant pSD538, qui contient le bras flanquant complet de la vaccine à droite des séquences de codage I4L. by forming the plasmid pSD532. pSD532 was cut with Rsal (partiali / EcoRI and a 2.7 kb vector fragment was isolated. PSD518 was cut using Rsal in the vaccinia sequences (pos. 67 436) and EcoRI at the vaccinia junction / pUC, and a 0.6 kb fragment was isolated. The two fragments were ligated, forming pSD538, which contains the complete vaccinia flanking arm to the right of the I4L coding sequences.

Le bras flanquant de droite de la vaccine a été isolé en tant que fragment EcoRI/BglII de 0,6 kb de pSD538 et uni par ligation dans le plasmide vecteur pSD537 coupé au moyen d'EcoRI/BglII. Dans le plasmide résultant, pSD539, le I4L ORF (pos. 65 047-67 386) a été remplacé par une région de poly-linker, qui est flanquée par 0,6 kb d'ADN de vaccine à gauche et 0,6 kb d'ADN de vaccine à droite, le tout dans une base pUC. Le site de suppression à l'intérieur des séquences de la vaccine est indiqué par un triangle sur la fig. 14. Pour éviter une recombinaison possible des séquences de béta-galactosidase dans la portion dérivée du pUC de pSD539 avec les séquences de béta-galactosidase dans le virus de vaccine recombinant vP855, la cassette de suppression I4L de ia vaccine a été déplacée de pSD539 à pRCl 1, un dérivé pUC dont toutes les séquences de béta-galactosidase ont été supprimées et remplacées par une région de polylinker (Colinas et Al., 1990). On a coupé pSD539 au moyen de EcoRI/Pstl et isolé le fragment de 1,2 kb. Ce fragment a été uni par ligation dans pRC11 coupé par The right flanking arm of vaccinia was isolated as a 0.6 kb EcoRI / BglII fragment from pSD538 and ligated into the vector plasmid pSD537 cut using EcoRI / BglII. In the resulting plasmid, pSD539, the I4L ORF (pos. 65 047-67 386) was replaced by a poly-linker region, which is flanked by 0.6 kb of vaccinia DNA on the left and 0.6 kb vaccinia DNA on the right, all in a pUC base. The site of suppression within the vaccinia sequences is indicated by a triangle in FIG. 14. To avoid possible recombination of the beta-galactosidase sequences in the pUC-derived portion of pSD539 with the beta-galactosidase sequences in the recombinant vaccinia virus vP855, the I4 suppression cassette of the vaccinia was moved from pSD539 to pRCl 1, a pUC derivative from which all the beta-galactosidase sequences have been deleted and replaced by a polylinker region (Colinas et Al., 1990). PSD539 was cut using EcoRI / Pstl and the 1.2 kb fragment was isolated. This fragment was ligated into pRC11 cut by

518B1 5' 518B2 3' 518B1 5 '518B2 3'

25 25

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

EcoRI/Pstl (2,35 kb), en formant pSD548. La recombinaison entre pSD548 et la béta-galactosidase contenant le recombinant de la vaccine, vP855 a résulté dans le mutant de suppression de la vaccine, vP866, qui a été isolé en tant que plaque claire en présence de X-gai. EcoRI / Pstl (2.35 kb), forming pSD548. Recombination between pSD548 and beta-galactosidase containing the vaccinia recombinant, vP855 resulted in the vaccinia suppression mutant, vP866, which was isolated as a clear plaque in the presence of X-gai.

L'ADN du virus de vaccine recombinant vP866 a été analysé par digestions de restriction suivis d'électrophorèse sur un gel d'agarose. Les formes ou figures de restriction étaient telles qu'attendues. Des réactions en chaîne de polymérase (PCR) (Engelke et Al., 1988) en utilisant vP866 en tant que matrice et les amorces flanquant les six locus de suppression détaillés ci-dessus ont produit des fragments d'ADN ayant les dimensions désirées. L'analyse de séquences des fragments engendrés de PCR autour des zones des jonctions de suppression a confirmé que les jonctions étaient telles qu'attendues. Le virus de vaccine recombinant, vP866, contenant les six suppressions formées, comme décrit ci-dessus, a été désigné souche de vaccin contre la vaccine «NYVAC.» The DNA of the recombinant vaccinia virus vP866 was analyzed by restriction digests followed by electrophoresis on an agarose gel. The restriction shapes or figures were as expected. Polymerase chain reactions (PCR) (Engelke et al., 1988) using vP866 as a template and the primers flanking the six deletion loci detailed above produced DNA fragments of the desired dimensions. Sequence analysis of the PCR generated fragments around the areas of the deletion junctions confirmed that the junctions were as expected. The recombinant vaccinia virus, vP866, containing the six deletions formed, as described above, was designated as the vaccine strain "NYVAC."

Exemple 16 - Construction de NYVAC-MV recombinant exprimant les glycoprotéines de fusion et d'hémagglutinine de la rougeole Example 16 Construction of Recombinant NYVAC-MV Expressing Fusion and Hemagglutinin Glycoproteins of Measles

Des copies de cADN des séquences codant les protéines HA et F du virus MV de la rougeole (souche Edmonston) ont été insérées dans NYVAC pour créer un double recombinant appelé NYVAC-MV (vP913). Le recombinant exprime authentiquement les deux glycoprotéines de la rougeole sur la surface de cellules infectées. Copies of cDNA from the sequences encoding the HA and F proteins of the measles virus MV (Edmonston strain) were inserted into NYVAC to create a double recombinant called NYVAC-MV (vP913). The recombinant authentically expresses the two measles glycoproteins on the surface of infected cells.

Une analyse d'immunoprécipitation a démontré le traitement correct des glycoprotéines tant F que HA. Le recombinant a également montré qu'il induisait la formation de syncyties. An immunoprecipitation analysis demonstrated the correct treatment of both F and HA glycoproteins. The recombinant also showed that it induces the formation of syncytia.

Cellules et Virus Cells and Viruses

Le virus de sauvetage utilisé dans la production de NYVAC-MV était constitué par la souche Copenhagen modifiée du virus de la vaccine désigné par NYVAC. Tous les virus ont été cultivés et titrés sur des monocouches de cellules de Véro. The rescue virus used in the production of NYVAC-MV consisted of the modified Copenhagen strain of the vaccinia virus designated by NYVAC. All the viruses were cultured and titrated on monolayers of Vero cells.

Construction de plasmide Plasmid construction

En se référant maintenant à la fig. 15 et à Taylor et AI. (1991), le plasmide pSPM2LHA contient tout le gène HA de la rougeole uni dans une configuration précise ATG à ATG avec le virus promoteur H6 du virus de la vaccine qui a été précédemment décrit (Taylor et Al., 1988a,b,; Guo et Al., 1989; Perkus et Coll., 1989). Un fragment EcoRV/Smal de 1,8 kpb, contenant les 24 bp les plus 3' du promoteur H6 fusionné en une configuration précise ATG:ATG avec le gène HA ne comportent pas les 26 bp les plus 3', a été isole a partir de pSMP2LHA. Ce fragment a été utilisé pour remplacer le fragment EcoRV/ Smal de 1,8 kbp de pSPMHAH (Taylor et Al., 1991) pour engendrer pRW803. Le plasmide pRW803 contient la totalité du promoteur H6 lié précisément au gène HA entier de la rougeole. Referring now to FIG. 15 and Taylor and AI. (1991), the plasmid pSPM2LHA contains the entire HA gene of measles united in a precise configuration ATG to ATG with the promoter virus H6 of the vaccinia virus which has been previously described (Taylor et al., 1988a, b ,; Guo et al., 1989; Perkus et al., 1989). A 1.8 kbp EcoRV / Smal fragment, containing the most 3 '24 bp of the H6 promoter fused in a precise ATG configuration: ATG with the HA gene does not contain the most 3' 26 bp, was isolated from from pSMP2LHA. This fragment was used to replace the 1.8 kbp EcoRV / Smal fragment of pSPMHAH (Taylor et Al., 1991) to generate pRW803. The plasmid pRW803 contains the entire H6 promoter linked precisely to the entire HA gene of measles.

Le plasmide pSD513CVQ a été dérivé du plasmide pSD460 par l'addition de séquences de polylinker (segment de liaison multisites). Le plasmide pSD460 a été dérivé pour permettre la suppression du gène de thymidine kinase a partir du virus de la vaccine (fig. 9). Plasmid pSD513CVQ was derived from plasmid pSD460 by the addition of polylinker sequences (multisite linker). Plasmid pSD460 was derived to allow suppression of the thymidine kinase gene from the vaccinia virus (Fig. 9).

Pour insérer le gène F du virus de la rougeole dans le plasmide d'insertion HA, on a réalisé des manipulations sur pSPHMF7. Le plasmide pSPHMF7 (Taylor et Al., 1991) contient le gène F de la rougeole juxtaposé en 3' au promoteur H6 du virus de la vaccine décrit précédemment. En vue d'obtenir une configuration parfaite ATG à ATG et éliminer des séquences intermédiaires entre l'extrémité 3' du promoteur et l'ATG du gène F de la rougeole, on a réalisé une mutagénèse dirigée par oligonucléotides en utilisant le nucléotide SPMAD (SEQ ID NO:41). SPMAD: 5'-TATCCGTTAAGTTTGTATCGTAA-TGGGTCTCAAGGTGAACGTCT-3'. Le plasmide résultant a été désigné pSPMF75M20. To insert the measles virus F gene into the HA insertion plasmid, manipulations were performed on pSPHMF7. Plasmid pSPHMF7 (Taylor et Al., 1991) contains the measles F gene juxtaposed 3 ′ to the vaccinia virus H6 promoter described above. In order to obtain a perfect ATG to ATG configuration and to eliminate intermediate sequences between the 3 'end of the promoter and the ATG of the measles F gene, an oligonucleotide-directed mutagenesis was carried out using the nucleotide SPMAD (SEQ ID NO: 41). SPMAD: 5'-TATCCGTTAAGTTTGTATCGTAA-TGGGTCTCAAGGTGAACGTCT-3 '. The resulting plasmid was designated pSPMF75M20.

Le plasmide pSPMF75M20 qui contient le gène F de la rougeole, maintenant lié en une configuration précise ATG à ATG avec le promoteur H6 a été digéré au moyen de Nrul et Eagl. Le fragment de 1,7 kbp à extrémité franche contenant les 27 bp les plus 3' du promoteur H6 et le gène de fusion dans sa totalité ont été isolés et insérés dans le plasmide intermédiaire pRW823 qui a été digéré au moyen de Nrul et Xbal et terminé par une coupure franche. Le plasmide résultant, pRW841, contient le promoteur H6 réuni au gène F de la rougeole dans le plasmide vecteur plBI25 (IBI, New Häven, CT). La cassette H6/F de la rougeole a été excisée à partir de pRW841 par digestion au moyen de Smal et le fragment de 1,8 kb résultant a été inséré dans pRW843 (contenant le gène HA de la rougeole). On a d'abord digéré le plasmide pRW843 au moyen de Noti et on l'a terminé par une coupure franche au moyen du fragment de Klenow d'E. coli ADN polymérase en présence de 2mM dNTPs. Le plasmide résultant, pRW857, contient donc les gènes F et HA du virus de la rougeole liés dans une configuration queue à queue. Les deux gènes sont liés au promoteur H6 du virus de la vaccine. Plasmid pSPMF75M20 which contains the measles F gene, now linked in a precise ATG to ATG configuration with the H6 promoter was digested using Nrul and Eagl. The blunt-ended 1.7 kbp fragment containing the most 3 '27' bp of the H6 promoter and the entire fusion gene were isolated and inserted into the intermediate plasmid pRW823 which was digested using Nrul and Xbal and ended with a clean cut. The resulting plasmid, pRW841, contains the H6 promoter joined to the measles F gene in the vector plasmid plBI25 (IBI, New Häven, CT). The measles H6 / F cassette was excised from pRW841 by digestion with SmaI and the resulting 1.8 kb fragment was inserted into pRW843 (containing the HA gene from measles). Plasmid pRW843 was first digested with Noti and terminated with a blunt cut using the Klenow fragment from E. coli. coli DNA polymerase in the presence of 2mM dNTPs. The resulting plasmid, pRW857, therefore contains the F and HA genes of the measles virus linked in a tail-to-tail configuration. Both genes are linked to the vaccinia virus H6 promoter.

26 26

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

Développement de NYVAC-MV Development of NYVAC-MV

Le plasmide pRW857 a été transfecté en cellule de Véro infectées par NYVAC (vP866) en utilisant la méthode de précipitation par phosphate de calcium précédemment décrite (Panicali et AL, 1982; Piccini et AL, 1987). Des plaques positives ont été choisies sur la base d'hybridation sur plaque in situ pour des sondes spécifiques, marquées radio-activement, de MV F et HA et soumises à 6 étapes séquentielles de purification sur plaque jusqu'à ce qu'on ait obtenu une population pure. Une plaque représentative a été ensuite amplifiée et le recombinant résultant a été appelé NYVAC-MV (vP913). The plasmid pRW857 was transfected into Vero cells infected with NYVAC (vP866) using the method of precipitation with calcium phosphate previously described (Panicali and AL, 1982; Piccini and AL, 1987). Positive plaques were chosen based on in situ plaque hybridization for specific, radioactively labeled, MV F and HA probes and subjected to 6 sequential plaque purification steps until one obtained a pure population. A representative plate was then amplified and the resulting recombinant was named NYVAC-MV (vP913).

I mmunofluorescence I mmunofluorescence

Une immunofluorescence indirecte a été réalisée comme décrit précédemment (Taylor et Ai., 1990). Les réactifs mono-spécifiques utilisés étaient des sérums engendrés par inoculation de lapins au moyen de recombinants du canarypox exprimant soit les gènes F soit les gènes HA de la rougeole. Indirect immunofluorescence was performed as previously described (Taylor and Ai., 1990). The mono-specific reagents used were sera generated by inoculation of rabbits using canarypox recombinants expressing either the F or the HA genes of measles.

Immunoprécipitation Immunoprecipitation

Les réactions d'immunoprécipitation ont été réalisées comme décrit précédemment (Taylor et AL, 1990) en utilisant du sérum anti-rougeole de cochon d'inde (Whittaker M.A. Bioproducts, Walkersville, MD). The immunoprecipitation reactions were carried out as described previously (Taylor and AL, 1990) using guinea pig anti-measles serum (Whittaker M.A. Bioproducts, Walkersville, MD).

Expérience de fusion de cellules Cell fusion experiment

Des monocouches de cellules de Véro dans des boîtes de 60 mm ont été inoculées avec une multiplicité de 1 pfu par cellule au moyen des virus parents et recombinants. Après une heure d'absorption à 37°C, on a enlevé l'inoculum, remplacé le milieu de recouvrement et inoculé les boîtes pendant la nuit à 37°C. 20 heures après l'injection on a examiné les boîtes. Monolayers of Vero cells in 60 mm dishes were inoculated with a multiplicity of 1 pfu per cell using parent and recombinant viruses. After one hour of absorption at 37 ° C, the inoculum was removed, the cover medium replaced and the dishes inoculated overnight at 37 ° C. 20 hours after the injection, the boxes were examined.

En vue de déterminer que les produits d'expression tant du gène F que du gène HA du virus de la rougeole étaient présents sur la surface cellulaire infectée, une analyse d'immunofluorescence indirecte a été réalisée en utilisant des sérums monospécifiques engendrés chez des lapins contre des canarypox recombinants exprimant soit les gènes F soit les gènes HA de la rougeole. Les résultats ont indiqué que les produits de gènes F aussi bien que HA étaient exprimés sur la surface cellulaire infectée, comme démontré par une fluorescence de surface importante avec les deux sérums monospécifiques. Aucune tache d'arrière-plan n'était évidente avec aucun des deux sérums sur des cellules inoculées au moyen de la souche NYVAC parente, et il n'y avait pas de tache de réaction croisée lorsque les sérums monospécifiques étaient essayés contre les recombinants individuels de la vaccine exprimant soit le gène HA soit le gène F. In order to determine that the expression products of both the F gene and the HA gene of the measles virus were present on the infected cell surface, an indirect immunofluorescence analysis was carried out using monospecific sera generated in rabbits against recombinant canarypox expressing either the F or the HA genes of measles. The results indicated that both F and HA gene products were expressed on the infected cell surface, as demonstrated by significant surface fluorescence with the two monospecific sera. No background spot was evident with either of the two sera on cells inoculated with the parent NYVAC strain, and there was no cross-reaction spot when the monospecific sera were tested against the individual recombinants vaccinia expressing either the HA gene or the F gene

Pour démontrer que les protéines exprimées par NYVAC-MV étaient immuno-réactives vis-à-vis des sérums spécifiques du virus de la rougeole et étaient traités authentiquement dans les cellules infectées, une analyse d'immunoprécipitation a été réalisée. Des monocouches de cellules de Véro ont été inoculées au moyen d'une multiplicité de 10 pfu par cellule de virus parent ou recombinant en présence de 35S-méthionine. L'analyse d'immunoprécipitation a révélé une glycoprotéine HA d'approximativement 76 kDa et les produits de fusion coupés Fi et F2 avec des poids moléculaires de 44 kDA et 23 kDa, respectivement. On n'a pas détecté de produits spécifiques de la rougeole dans les cellules de Véro non infectées ou les cellules de Véro infectées avec le virus NYVAC parent. To demonstrate that the proteins expressed by NYVAC-MV were immunoreactive towards specific sera from the measles virus and were authentically treated in the infected cells, an immunoprecipitation analysis was carried out. Vero cell monolayers were inoculated using a multiplicity of 10 pfu per parent or recombinant virus cell in the presence of 35S-methionine. The immunoprecipitation analysis revealed an HA glycoprotein of approximately 76 kDa and the cut fusion products Fi and F2 with molecular weights of 44 kDA and 23 kDa, respectively. Measles-specific products were not detected in uninfected Vero cells or Vero cells infected with the parent NYVAC virus.

Une caractéristique de la cytopathologie MV est la formation de syncyties qui se produit par fusion de cellules infectées avec les cellules environnantes, infectées ou non infectées, suivie par la migration des noyaux vers le centre du syncytium (Norrby et AL, 1982). On a montré que ceci était une méthode importante de prolifération du virus qui, pour les Paramyxovirus, peut se produire en présence d'anticorps neutralisant les virus HA 25 spécifiques (Merz et AL, 1980). En vue de déterminer que les protéines de MV exprimées dans le virus de la vaccine étaient fonctionnellement actives, les mono-couches de cellules de Véro ont été inoculées au moyen de NYVAC et NYVAC-MV et observées pour des effets cytopathiques. Une activité de fusion de cellules importante a été mise en évidence dans les cellules de Véro infectées par NYVAC-MV approximativement 18 heures après infection. Aucune activité de fusion de cellules n'a été mise en évidence dans les cellules infectées avec NYVAC parent. A feature of MV cytopathology is the formation of syncytia which occurs by fusion of infected cells with surrounding cells, infected or uninfected, followed by migration of nuclei to the center of the syncytium (Norrby et AL, 1982). This has been shown to be an important method of virus proliferation which, for Paramyxoviruses, can occur in the presence of antibodies neutralizing specific HA viruses (Merz et al, 1980). In order to determine that the MV proteins expressed in the vaccinia virus were functionally active, the mono-layers of Vero cells were inoculated using NYVAC and NYVAC-MV and observed for cytopathic effects. Significant cell fusion activity was demonstrated in Vero cells infected with NYVAC-MV approximately 18 hours after infection. No cell fusion activity was demonstrated in cells infected with parent NYVAC.

Résultats d'analyse sérologique de sérums de lapin inoculés au moven des NYVAC-MV (vP913i Results of serological analysis of rabbit sera inoculated with NYVAC-MV (vP913i)

Dans cette étude, deux lapins ont été inoculés au moyen de 1 x 108 pfu de NYVAC-MV (vP913) par voie sous-cutanée. Apres 28 jours, les animaux ont reçu une inoculation de rappel au moyen d'une dose équivalente. Des saignées en série ont été analysées au point de vue activité de neutralisation de MV en utilisant la méthode de réduction sur plaque. Les résultats sont montrés dans le tableau 13. Ces résultats indiquent qu'aucun des lapins n'a répondu à l'inoculation initiale de NYVAC-MV. Cependant, la réponse fortement accrue après la seconde inoculation indique que les animaux étaient «amorcés» ou «initiés». Deux animaux ont obtenus des titres d'anti-corps neutralisant dans le domaine de protection. In this study, two rabbits were inoculated with 1 x 108 pfu of NYVAC-MV (vP913) subcutaneously. After 28 days, the animals received a booster inoculation with an equivalent dose. Serial bleeds were analyzed from the standpoint of MV neutralization activity using the plate reduction method. The results are shown in Table 13. These results indicate that none of the rabbits responded to the initial inoculation of NYVAC-MV. However, the greatly increased response after the second inoculation indicates that the animals were "primed" or "initiated". Two animals obtained neutralizing antibodies in the protection domain.

27 27

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

L'analyse in vivo de i'immunogénicité de ALVAC-MV (vCP82), montrée dans l'exemple 14, indique que, lors de l'inoculation d'une gamme d'espèces, le recombinant est capable d'induire une réponse sérologique qui est mesurable par des tests sérologiques classiques. Les titres obtenus sont dans le domaine exigé pour la protection vis-à-vis de la maladie. L'inoculation de NYVAC-MV (vP913) à des lapins induit de manière semblable un niveau d'anti-corps neutralisant le virus de la rougeole qui constitue une protection. The in vivo analysis of the immunogenicity of ALVAC-MV (vCP82), shown in Example 14, indicates that, during the inoculation of a range of species, the recombinant is capable of inducing a serological response which is measurable by standard serological tests. The titles obtained are in the area required for protection against the disease. Inoculation of NYVAC-MV (vP913) to rabbits similarly induces a protective level of the measles virus-neutralizing antibody.

TABLEAU 13 TABLE 13

Titres (logio) d'anti-corps neutralisant anti-rougeole dans des sérums de lapins inoculés au moyen de NYVAC-MV (vP913) Titres (logio) of neutralizing anti-measles antibodies in rabbit sera inoculated with NYVAC-MV (vP913)

Titre au bout de semaines après inoculation Title after weeks after inoculation

Animal Animal

WO WO

W2 W2

W4C W4C

W5 W5

W6 W6

W7 W7

Lapin3 Rabbit3

A116 A116

< 1 <1

< 1 <1

< 1 <1

2,8b 2.8b

2,2 2.2

2,2 2.2

A117 A117

< 1 <1

< 1 <1

< 1 <1

1,9 1.9

1,9 1.9

1,9 1.9

a> Les lapins ont reçu 8,0 logio pfu de NYVAC-MV (vP913) par la voie sous-cutanée. a> The rabbits received 8.0 log pfu of NYVAC-MV (vP913) by the subcutaneous route.

b) Titre exprimé en tant que logio de l'inverse de la dernière dilution montrant une réduction de 50% dans le nombre sur plaque tel que comparé au sérum avant inoculation. b) Title expressed as the log of the inverse of the last dilution showing a reduction of 50% in the number on plate as compared to the serum before inoculation.

c) Les animaux ont reçu une nouvelle inoculation au bout de 28 jours. c) The animals received a new inoculation after 28 days.

L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation décrits, mais elle en comprend les modifications et variantes à la portée de l'homme de l'art, la portée de l'invention n'étant limitée que par les revendications ci-après. The invention is not limited to the embodiments described, but it includes the modifications and variants within the reach of those skilled in the art, the scope of the invention being limited only by the claims below. after.

REFERENCES REFERENCES

1. Adams, J. M., and D. T. Imagawa, Proc. Soc. Exper. Biol. Med. SS, 240-244 (1957). 1. Adams, J. M., and D. T. Imagawa, Proc. Soc. Exper. Biol. Med. SS, 240-244 (1957).

2. Albrecht, P., K. Herrman, and G. R. Burns, J. Virol. Methods â, 251-260 (1981). 2. Albrecht, P., K. Herrman, and G. R. Burns, J. Virol. Methods â, 251-260 (1981).

3. Alkhatib, G., and D. Briedis, Virology 150. 479-490 (1986). 3. Alkhatib, G., and D. Briedis, Virology 150, 479-490 (1986).

4. Alkhatib, G., C. Richardson, and S-H. Shen, Virology 175. 262-270 (1990). 4. Alkhatib, G., C. Richardson, and S-H. Shen, Virology 175, 262-270 (1990).

5. Appel, M. J. G., and O. R. Jones, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 126. 571-574 (1967). 5. Appeal, M. J. G., and O. R. Jones, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 126. 571-574 (1967).

6. Appel, M. J. G., and D. S. Robson, Am. J-. Vet. Res. 24, 1459-1463 (1973). 6. Appel, M. J. G., and D. S. Robson, Am. J-. Vet. Res. 24, 1459-1463 (1973).

7. Avery, R. J., and J. Niven, Infect. Immun. 2Ü, 795-801 (1979). 7. Avery, R. J., and J. Niven, Infect. Immun. 2Ü, 795-801 (1979).

8. Baker, J. A., B. E. Sheffy, D. S. Robson, J. Gilmartin, Cornell Vet (USA) 56, 588-594 (1966). 8. Baker, J. A., B. E. Sheffy, D. S. Robson, J. Gilmartin, Cornell Vet (USA) 56, 588-594 (1966).

9. Bertholet, C., R. Drillien, and R. Wittek, Proc. Nati. Acad. Sci. USA S2, 2096-2100 (1985). 9. Bertholet, C., R. Drillien, and R. Wittek, Proc. Nati. Acad. Sci. USA S2, 2096-2100 (1985).

10. Bestetti, G., R. Fatzer, and R. Frankhauser, Acta Neuropathol. 42, 69-75 (1978). 10. Bestetti, G., R. Fatzer, and R. Frankhauser, Acta Neuropathol. 42, 69-75 (1978).

11. Black, F. L., L. L. Berman, M. Libel, C. A. Reichelt, F. de P. Pinheiro, A. T. da Rosa, F. Figuera, and E. S. Gonzales, Bull, W. H. O. S2, 315-319 (1984). 11. Black, F. L., L. L. Berman, M. Libel, C. A. Reichelt, F. de P. Pinheiro, A. T. da Rosa, F. Figuera, and E. S. Gonzales, Bull, W. H. O. S2, 315-319 (1984).

12. Bush, M., R. J. Montali, D. Brownstein, A. E. James, Jr., and M. J. G. Appel, J. Am. Vet. Med. Assoc. m 959-960 (1976). 12. Bush, M., R. J. Montali, D. Brownstein, A. E. James, Jr., and M. J. G. Appel, J. Am. Vet. Med. Assoc. m 959-960 (1976).

13. Carpenter, J. W., M. J. G. Appel, R. C. Erickson, and M. N. Novilla, J. Am. Vet. Med. Assoc. 169. 961-964 (1976). 13. Carpenter, J. W., M. J. G. Appel, R. C. Erickson, and M. N. Novilla, J. Am. Vet. Med. Assoc. 169. 961-964 (1976).

14. Choppin, P. W., C. D. Richardson, D. C. Merz, W. W. Hall, and A. Scheid, J. Infect. Dis. 143. 352-363 (1981). 14. Choppin, P. W., C. D. Richardson, D. C. Merz, W. W. Hall, and A. Scheid, J. Infect. Say. 143. 352-363 (1981).

15. Clewell, D. B., J. Bacteriol. Ilfì, 667-676 (1972). 15. Clewell, D. B., J. Bacteriol. Ilfì, 667-676 (1972).

16. Clewell, D. B., and D. R. Helinski, Proc. Nati. Acad. Sci. USA £2, 1159-1166 (1969). 16. Clewell, D. B., and D. R. Helinski, Proc. Nati. Acad. Sci. USA £ 2, 1159-1166 (1969).

17. Colinas, R. J., R. C. Condit, and E. Paoletti, Virus Research 1£, 49-70 (1990). 17. Colinas, R. J., R. C. Condit, and E. Paoletti, Virus Research 1 £, 49-70 (1990).

18. DeLay, P. D., S. S. Stone, D. T. Karzon, S. Katz, and J. Enders, Am. J. Vet. Res. 2Ü, 1359-1373 (1965). 18. DeLay, P.D., S. S. Stone, D. T. Karzon, S. Katz, and J. Enders, Am. J. Vet. Res. 2Ü, 1359-1373 (1965).

19. Diallo, A., Vet. Micro. 2â, 155-163 (1990). 19. Diallo, A., Vet. Microphone. 2a, 155-163 (1990).

20. Dowling, P. C., B. M. Blumberg, J. Menonna, J. E. Adamus, P. Cook, J. C. Crowley, D. Kolakofs-ky, and S. D. Cook, J. Gen. Virol. §7, 1987-1992 (1986). 20. Dowling, P. C., B. M. Blumberg, J. Menonna, J. E. Adamus, P. Cook, J. C. Crowley, D. Kolakofs-ky, and S. D. Cook, J. Gen. Virol. §7, 1987-1992 (1986).

21. Drillien, R., D. Spehner, A. Kirn, P. Giraudon, R. Buckland, F. Wild, and J. P. Lecocq, Proc. Nati. Acad. Sci. USA S5, 1252-1256 (1988). 21. Drillien, R., D. Spehner, A. Kirn, P. Giraudon, R. Buckland, F. Wild, and J. P. Lecocq, Proc. Nati. Acad. Sci. USA S5, 1252-1256 (1988).

22. Engelke, D. R., P. A. Hoener, and F. S. Collins, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 544-548 (1988). 22. Engelke, D. R., P. A. Hoener, and F. S. Collins, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85, 544-548 (1988).

23. Fenner, F., P. A. Bachmann, E. P. J. Gibbs, F. A. Murphy, M. J. Studdert, and D. O. White, In Veterinary Virology, ed. F. Fenner, (Academic Press, Inc., New York) pp. 485-503 (1987). 23. Fenner, F., P. A. Bachmann, E. P. J. Gibbs, F. A. Murphy, M. J. Studdert, and D. O. White, In Veterinary Virology, ed. F. Fenner, (Academic Press, Inc., New York) pp. 485-503 (1987).

24. Gillespie, J. H., and D. T. Karzon, Proc. Soc. Exp. Biol Med. 105. 547-551 (1960). 24. Gillespie, J. H., and D. T. Karzon, Proc. Soc. Exp. Biol Med. 105, 547-551 (1960).

25. Giraudon, P., Ch. Gerald, and T. F. Wild, Intervirology 21, 110-120 (1984). 25. Giraudon, P., Ch. Gerald, and T. F. Wild, Intervirology 21, 110-120 (1984).

26. Goebel, S. J., G. P. Johnson, M. E. Perkus, S. W. Davis, J. P. Winslow, and E. Paoletti, Virology 179. 247-266 (1990a). 26. Goebel, S. J., G. P. Johnson, M. E. Perkus, S. W. Davis, J. P. Winslow, and E. Paoletti, Virology 179. 247-266 (1990a).

27. Goebel, S. J., G. P. Johnson, M. E. Perkus, S. W. Davis, J. P. Winslow, and E. Paoletti, Virology 179. 517-563 (1990b). 27. Goebel, S. J., G. P. Johnson, M. E. Perkus, S. W. Davis, J. P. Winslow, and E. Paoletti, Virology 179. 517-563 (1990b).

28 28

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

28. Graves, M. C., S. M. Silver, and P. W. Choppin, Virology gfi, 254-263 (1978). 28. Graves, M. C., S. M. Silver, and P. W. Choppin, Virology gfi, 254-263 (1978).

29. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M. E. Perkus, B. Languet, P. Desmettre, G. Allen, and E. Paoletti, J. Virol. fiS, 4189-4198 (1989). 29. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M. E. Perkus, B. Languet, P. Desmettre, G. Allen, and E. Paoletti, J. Virol. fiS, 4189-4198 (1989).

30. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M. E. Perkus, J. Taylor, E. Norton, G. Allen, B. Languet, P. Desmettre, and E. Paoletti, J. Virol. fi4, 2399-2406 (1990). 30. Guo, P., S. Goebel, S. Davis, M. E. Perkus, J. Taylor, E. Norton, G. Allen, B. Languet, P. Desmettre, and E. Paoletti, J. Virol. fi4, 2399-2406 (1990).

31. Hall, W. W., R. A. Lamb, and P. W. Choppin, Virology 100. 433-449 (1980). 31. Hall, W. W., R. A. Lamb, and P. W. Choppin, Virology 100. 433-449 (1980).

32. Hartley, W. J., Vet. Path. il, 301-312 (1974). 32. Hartley, W. J., Vet. Path. il, 301-312 (1974).

33. Imagawa, D. T., P. Goret, and J. M. Adams, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 4fi, 1119-1123 (1960). 33. Imagawa, D. T., P. Goret, and J. M. Adams, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 4fi, 1119-1123 (1960).

34. Karzon, D. T., Pediatrics Ifi, 809-818 (1955). 34. Karzon, D. T., Pediatrics Ifi, 809-818 (1955).

35. Karzon, D. T., Annals of the N.Y. Academy of Sci. 1Q1, 527-539 (1962). 35. Karzon, D. T., Annals of the N.Y. Academy of Sci. 1Q1, 527-539 (1962).

36. Kazacos, K. R., H. L. Thacker, H. L. Shivaprasad, and P. P. Burger, J. Am. Vet. Med. Assoc. 179. 1166-1169 (1981). 36. Kazacos, K. R., H. L. Thacker, H. L. Shivaprasad, and P. P. Burger, J. Am. Vet. Med. Assoc. 179. 1166-1169 (1981).

37. Kingsbury, D. W., M. A. Bratt, P. W. Choppin, R. P. Hanson, T. Hosaka, V. ter Meulen, E. Norrby, W. Plowright, R. Rott, and W. H. Wunner, Intervirology 1Q, 137-152 (1978). 37. Kingsbury, D. W., M. A. Bratt, P. W. Choppin, R. P. Hanson, T. Hosaka, V. ter Meulen, E. Norrby, W. Plowright, R. Rott, and W. H. Wunner, Intervirology 1Q, 137-152 (1978).

38. Kunkel, T. A., Proc. Nati. Acad. Sci. USA S2, 488-492 (1985). 38. Kunkel, T. A., Proc. Nati. Acad. Sci. USA S2, 488-492 (1985).

39. Lennon, J. L., and F. L. Black, J. Ped. 108. 671-676 (1986). 39. Lennon, J. L., and F. L. Black, J. Ped. 108, 671-676 (1986).

40. Mandecki, W., Proc. Nati. Acad. Sci. USA SS, 7177-7181 (1982). 40. Mandecki, W., Proc. Nati. Acad. Sci. USA SS, 7177-7181 (1982).

41. Mandecki, W., Proc. Nati. Acad. Sci. USA SS, 7177-7181 (1986). 41. Mandecki, W., Proc. Nati. Acad. Sci. USA SS, 7177-7181 (1986).

42. Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, NY 545 pages (1982). 42. Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, NY 545 pages (1982).

43. Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, NY 545 pages (1986). 43. Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, NY 545 pages (1986).

44. Merz, D. C., A. Schied, and P. Choppin, J. Exp. Med. 151. 275-288 (1980). 44. Merz, D. C., A. Schied, and P. Choppin, J. Exp. Med. 151. 275-288 (1980).

45. Moura, R. A., and J. Warren, J. Bact. 22, 702-705 (1961). 45. Moura, R. A., and J. Warren, J. Bact. 22, 702-705 (1961).

46. Norrby, E., and Y. Gollmar, Infect. Immun. H, 231-239 (1975). 46. Norrby, E., and Y. Gollmar, Infect. Immun. H, 231-239 (1975).

47. Norrby, E., G. Enders-Ruckle, and V. ter Meulen, J. Infect. Dis. 132. 262-269 (1975). 47. Norrby, E., G. Enders-Ruckle, and V. ter Meulen, J. Infect. Say. 132, 262-269 (1975).

48. Norrby, E., S. N. Chen, T. Togashi, H. Shesberadaran, and K. P. Johnson, Archives of Virology ZI, 1-11 (1982). 48. Norrby, E., S. N. Chen, T. Togashi, H. Shesberadaran, and K. P. Johnson, Archives of Virology ZI, 1-11 (1982).

49. Norrby, E., and M. N. Oxman, in Fields Virology 2nd Ed., B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. (Raven Press, NY) pp. 1013-1044 (1990). 49. Norrby, E., and M. N. Oxman, in Fields Virology 2nd Ed., B. N. Fields and D. M. Knipe, eds. (Raven Press, NY) pp. 1013-1044 (1990).

50. Novick, S. L. and D. Hoekstra, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 25, 7433-7437 (1988). 50. Novick, S. L. and D. Hoekstra, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 25, 7433-7437 (1988).

51. Orvell, C., and E. Norrby, J. Gen. Virol. 5Q, 231-245 (1980). 51. Orvell, C., and E. Norrby, J. Gen. Virol. 5Q, 231-245 (1980).

52. Panicali, D., and E. Paoletti, Proc. Nati. Acad. Sci. USA Z2, 4927-4931 (1982). 52. Panicali, D., and E. Paoletti, Proc. Nati. Acad. Sci. USA Z2, 4927-4931 (1982).

53. Paterson, R. G., and R. A. Lamb, Cell 4g, 441-452 (1987). 53. Paterson, R. G., and R. A. Lamb, Cell 4g, 441-452 (1987).

54. Perkus, M. E., A. Piccini, B. R. Lipinskas, and E. Paoletti, Science 229. 981-984 (1985). 54. Perkus, M. E., A. Piccini, B. R. Lipinskas, and E. Paoletti, Science 229. 981-984 (1985).

55. Perkus, M. E., K. Limbach, and E. Paoletti, J. Virol. fiS, 3829-3836 (1989). 55. Perkus, M. E., K. Limbach, and E. Paoletti, J. Virol. fiS, 3829-3836 (1989).

56. Perkus, M. E., S. J. Goebel, S. W. Davis, G. P. Johnson, K. Limbach, E. K. Norton, and E. Paoletti, Virology 1Z2, 276-286 (1990). 56. Perkus, M. E., S. J. Goebel, S. W. Davis, G. P. Johnson, K. Limbach, E. K. Norton, and E. Paoletti, Virology 1Z2, 276-286 (1990).

57. Phillips, T. R., J. L. Jensen, M. J. Rubino, W. C. Yang, and R. D. Schultz, Can. J. Vet. Res. 53. 154-160 (1989). 57. Phillips, T. R., J. L. Jensen, M. J. Rubino, W. C. Yang, and R. D. Schultz, Can. J. Vet. Res. 53, 154-160 (1989).

58. Piccini, A., M. E. Perkus, and E. Paoletti, in Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R., and Grossman, L., (Academic Press) pp. 545-563 (1987). 58. Piccini, A., M. E. Perkus, and E. Paoletti, in Methods in Enzymology, Vol. 153, eds. Wu, R., and Grossman, L., (Academic Press) pp. 545-563 (1987).

59. Preblud, S. R., and S. L. Katz, in Vaccines, eds. S. A. Plotkin and E. A. Mortimer, (W. B. Saun-ders Co.) pp. 182-222 (1988). 59. Preblud, S. R., and S. L. Katz, in Vaccines, eds. S. A. Plotkin and E. A. Mortimer, (W. B. Saun-ders Co.) pp. 182-222 (1988).

60. Richardson, C. D., A. Berkovich, S. Rozenblatt, and W. Bellini, J. Virol. M. 186-193 (1985). 60. Richardson, C. D., A. Berkovich, S. Rozenblatt, and W. Bellini, J. Virol. M. 186-193 (1985).

61. Richardson, C., D. Hull, P. Greer, K. Hasel, A. Berkovich, G. Englund, W. Bellini, B. Rima, and R. Lazzarini, Virology 155. 508-523 (1986). 61. Richardson, C., D. Hull, P. Greer, K. Hasel, A. Berkovich, G. Englund, W. Bellini, B. Rima, and R. Lazzarini, Virology 155. 508-523 (1986).

62. Roberts, J. A., J. Immunol. 24, 622-628 (1965). 62. Roberts, J. A., J. Immunol. 24, 622-628 (1965).

63. Rosei, J. L., P. L. Earl, J. P. Weir, and B. Moss, J. Virol. fiQ, 436-449 (1986). 63. Rosei, J. L., P. L. Earl, J. P. Weir, and B. Moss, J. Virol. fiQ, 436-449 (1986).

64. Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson, Proc. Nati. Acad. Sei. USA Z4, 5463-5467 (1977). 64. Sanger, F., S. Nicklen, and A. R. Coulson, Proc. Nati. Acad. Sei. USA Z4, 5463-5467 (1977).

65. Shapira, S. K., J. Chou, F. V. Richaud, and M. J. Casadaban, Gene 25, 71-82 (1983). 65. Shapira, S. K., J. Chou, F. V. Richaud, and M. J. Casadaban, Gene 25, 71-82 (1983).

66. Spehner, D., R. Drillien, and J. P. Lecocq, J. Virol. fi4, 527-533 (1990). 66. Spehner, D., R. Drillien, and J. P. Lecocq, J. Virol. fi4, 527-533 (1990).

67. Stephenson, J. R. and V. ter Meulen, Proc. Nat. Acad. Sci. USA ZÊ, 6601-6605 (1979). 67. Stephenson, J. R. and V. ter Meulen, Proc. Nat. Acad. Sci. USA ZÊ, 6601-6605 (1979).

68. Tabor, S., and C. C. Richardson, Proc. Nati. Acad. Sci. USA M, 4767-4771 (1987). 68. Tabor, S., and C. C. Richardson, Proc. Nati. Acad. Sci. USA M, 4767-4771 (1987).

69. Taylor, J., R. Weinberg, Y. Kawaoka, R. G. Webster, and E. Paoletti, Vaccine fi, 504-508 (1988a). 69. Taylor, J., R. Weinberg, Y. Kawaoka, R. G. Webster, and E. Paoletti, Vaccine fi, 504-508 (1988a).

70. Taylor, J., R. Weinberg, B. Languet, P. Desmettre, and E. Paoletti, Vaccine fi, 497-503 (1988b). 70. Taylor, J., R. Weinberg, B. Languet, P. Desmettre, and E. Paoletti, Vaccine fi, 497-503 (1988b).

71. Taylor, J., C. Edbauer, A. Rey-Senelonge, J. F. Bouquet, E. Norton, S. Goebel, P. Desmettre, and E. Paoletti, J. Virol. fil, 1441-1450 (1990). 71. Taylor, J., C. Edbauer, A. Rey-Senelonge, J. F. Bouquet, E. Norton, S. Goebel, P. Desmettre, and E. Paoletti, J. Virol. thread, 1441-1450 (1990).

72. Taylor, J., S. Pincus, J. Tartaglia, C. Richardson, G. Alkhatib, D. Briedis, M. Appel, E. Norton, and E. Paoletti, J. Virol. 25, 4263-4272 (1991). 72. Taylor, J., S. Pincus, J. Tartaglia, C. Richardson, G. Alkhatib, D. Briedis, M. Appel, E. Norton, and E. Paoletti, J. Virol. 25, 4263-4272 (1991).

73. Tizard, I., J. Am. Vet. Med. Assoc. ISfi, 1851-1858 (1990). 73. Tizard, I., J. Am. Vet. Med. Assoc. ISfi, 1851-1858 (1990).

74. Vialard, J., M. Lalumiere, T. Vernet, D. Briedis, G. Alkhatib, D. Henning, D. Levin, and C. Richardson, J. Virol. fi4, 37-50 (1990). 74. Vialard, J., M. Lalumiere, T. Vernet, D. Briedis, G. Alkhatib, D. Henning, D. Levin, and C. Richardson, J. Virol. fi4, 37-50 (1990).

75. Warren, J., M. K. Nadel, E. Slater, and S. J. Millian, Amer. J. Vet. Res. 21, 111-119 (1960). 75. Warren, J., M. K. Nadel, E. Slater, and S. J. Millian, Amer. J. Vet. Res. 21, 111-119 (1960).

29 29

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 683 921 A5 CH 683 921 A5

76. Wild, T. F., E. Malvoisin, and R. Buckland, J. Gen. Virol. Z2, 439-442 (1991). 76. Wild, T. F., E. Malvoisin, and R. Buckland, J. Gen. Virol. Z2, 439-442 (1991).

77. Wild, F., P. Giraudon, D. Spehner, R. Drillien, and J. P. Lecocq, Vaccine £, 441-442 (1990). 77. Wild, F., P. Giraudon, D. Spehner, R. Drillien, and J. P. Lecocq, Vaccine £, 441-442 (1990).

78. Yuen, L„ and B. Moss, Proc. Nati. Acad. Sei. USA M, 6417-6421 (1987). 78. Yuen, L „and B. Moss, Proc. Nati. Acad. Sei. USA M, 6417-6421 (1987).

Claims (8)

RevendicationsClaims 1. Poxvirus recombinant, caractérisé en ce qu'il contient de l'ADN provenant de Morbillivirus en une région non essentielle du génome du poxvirus.1. Recombinant poxvirus, characterized in that it contains DNA from Morbillivirus in a nonessential region of the poxvirus genome. 2. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit Morbillivirus est le virus de la rougeole.2. Recombinant poxvirus according to claim 1, characterized in that said Morbillivirus is the measles virus. 3. Poxvirus recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit ADN code la glycoprotéine d'hémagglutinine du virus de la rougeole et/ou la glycoprotéine de fusion du virus de la rougeole.3. Recombinant poxvirus according to claim 2, characterized in that said DNA codes the hemagglutinin glycoprotein of the measles virus and / or the fusion glycoprotein of the measles virus. 4. Poxvirus recombinant selon la revendication 2, caractérisé en ce que iedit ADN est capable en présence d'un hôte d'exprimer la glycoprotéine d'hémagglutinine du virus de la rougeole et/ou de la glycoprotéine de fusion du virus de la rougeole.4. Recombinant poxvirus according to claim 2, characterized in that iedit DNA is capable in the presence of a host of expressing the hemagglutinin glycoprotein of the measles virus and / or the fusion glycoprotein of the measles virus. 5. Poxvirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que ledit poxvirus est un virus de la vaccine ou un virus d'avipox, plus particulièrement un virus de canarypox.5. Recombinant poxvirus according to one of claims 1 to 4, characterized in that said poxvirus is a vaccinia virus or an avipox virus, more particularly a canarypox virus. 6. Poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il contient de l'ADN provenant de Morbillivirus et un promoteur pour exprimer ledit ADN.6. Recombinant poxvirus according to claim 1, characterized in that it contains DNA from Morbillivirus and a promoter for expressing said DNA. 7. Procédé de préparation du poxvirus recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit ADN est introduit dans ledit poxvirus par recombinaison.7. A method of preparing the recombinant poxvirus according to claim 1, characterized in that said DNA is introduced into said poxvirus by recombination. 8. Vaccin pour induire une réponse immunologique chez un animal hôte inoculé avec ledit vaccin, caractérisé en ce que ledit vaccin comprend un véhicule et un poxvirus recombinant selon l'une des revendications 1 à 6.8. Vaccine for inducing an immunological response in a host animal inoculated with said vaccine, characterized in that said vaccine comprises a vehicle and a recombinant poxvirus according to one of claims 1 to 6. 3030