NL8802604A - Isopolypeptiden en werkwijze voor de bereiding ervan. - Google Patents

Description

NL 35.440-Fa/vD/ab i* ft

Isopolypeptiden en werkwijze voor de bereiding daarvan.

De uitvinding heeft betrekking op isopolypeptiden van diaminomonocarbonburen, hun zouten, optische isoraeren en racematen. Verder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor de bereiding van deze verbindingen.

5 Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrek king op nieuwe isopolypeptiden van diaminomonocarbonzuren, met de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin R4, R5.

R6, R7, R8, R9 en R10 onafhankelijk van elkaar staan voor waterstof of een c^-4 alkyl (in het vervolg: lager alkyl) 10 groep, r een gemiddelde waarde is tussen 10 en 400, m een geheel getal is van 0 tot 10 en n een geheel getal is van 0 tot 10.

De betekenis van de overeenkomstige substituenten binnen de individuele leden kan identiek of verschillend 15 zijn.

Het is bekend dat de isopeptiden van diamino-mono-carbonzuren slechts zeldzaam in de natuur voorkomen: in sommige peptiden antibiotica, in de celwand van bacteriën, in de verknopingen van verschillende proteïnen en in de clavice-20 paminen. Sommige van hen tonen een biologisch effect en kunnen ook worden geproduceerd met microbiologische methoden.

Volgens Japanse onderzoekingen wordt een L-lysine-polymeer bestaande uit 25-30 monomere eenheden, met elkaar gekoppeld door isopeptidebindingen, geproduceerd door 25 Streptomyces albulus [Shima en Sakai: Agric. Biol. Chem. 45, 2503 (1981)]. Dit poly-e-L-lysine inactiveert verschillende bacteriofagen [Shima en medewerkers: Agric. Biol. Chem. 46, 1917 (1982)], en een biosynthetische weg werd toegepast voor zijn produktie [Sima en medewerkers: Nippon Nogekagaku Kaishi 30 57, 221-226 (1983)].

De clavicepaminen zijn lysine-rijke basische proteïnen geïsoleerd uit een saprofytische cultuur van ergot (Claviceps purpurea), met menselijk farmacologisch belang.

Deze proteïnen konden worden gefractioneerd tot verbindingen 35 van MW 2000-17.000 D met hoog lysinegehalte tussen 30-95 mol %. Hun biologische onderzoekingen toonden een cel-prolifera- .8802604 11 - 2 - tie-vertragend effect, zodat ze de groei van dierlijke tumoren inhiberen, praktisch zonder toxische neveneffecten (Tyihak: Dissertation, 1978).

Gebaseerd op structuurbepalingen werd aangetoond, 5 dat de ε-lysine(poly)peptiden de fundamentele structuureenheden zijn van clavicepaminen [Szókan, Kelemen en Török: J. Chromatogr. 366, 283 (1986)]. Tot op heden is de rol van de structurele polyisolysine-eenheden in het veelbelovende biologische effect van clavicepaminen niet bekend.

10 De antivirale activiteit van synthetische poly-L- isolysinen, van hun geacyleerde derivaten met aminozuren en van poly-6~L-a,3-diaminopropionzuur werd gemeten door Indiase onderzoekers. Gevonden werd dat de antivirale activiteit van deze polypeptiden is verbonden met hun vermogen 15 interferon-achtige antivirale faktoren te induceren in CAM-culturen (Indian J. Exper. Biology 20, 227 (1982); Indian J. Chem. 2IB, 483 (1982)].

Teneinde het verband te bestuderen tussen de chemische structuur en het biologische effect, is het doel van 20 deze uitvinding de produktie van isopeptiden van L-diamino-monocarbonzuren, met een gegeven MW en met lage polydisper-sie, bestaande uit 10-400 eenheden, ook op industriële schaal. Fundamentele vereisten van de aangegeven verbindingen waren hoge zuiverheid, lage polydispersie en ook hoge stereo-25 chemische zuiverheid.

Het is algemeen bekend dat het effect van biopoly-meren sterk is beïnvloed door de distributie van hun moleculair gewicht. De configuratie van aminozuren is zeer belangrijk omdat de verschillende optische isomeren tegengestelde 30 en heel andere biologische effecten kunnen hebben; bijv. wordt het groeien van dierlijke tumoren geïnhibiteerd door D-arginine, en wordt het gestimuleerd door L-arginine [Szende and Tyihak: Lancet 7546, 824 (1968); Szende: Dissertation, 1974]. Racemische mengsels of geracemiseerde polymeren tonen 35 de oorspronkelijke gunstige biologische effecten niet.

Zowel hoge zuiverheid als lage polydispersie waren voor deze polypeptiden vereist. Voor het oplossen van het probleem werd de synthetische methode gekozen. Onder ..880 260 4 - 3 - al toepassing van de methode van Hull [Biopolymers 17, 2427 (1978)] werd a-Z-beschermde active lysine-ester (OPcp), en volgens de werkwijze van Gangopadhyay and Mathur [Indian J.

Chem. 21B, 483 (1982)] α-BOC-beschermde lysine-pentachloor-5 fenylester gepolycondenseerd. Volgens Nishi's methode [Int.

J. Biol. Macromol. 2, 53 (1980)] werd α-Ζ-Lys-OH gepolymeri-seerd met difenylfosforylazide (DPPA). De schrijvers van de bovengenoemde artikelen publiceerden geen enkel gegeven met betrekking tot de M^, M^-distributie en de optische zuiver-10 heid van hun produkten. Onze ervaringen toonden aan dat alleen produkten met laag 1% (max. 2500) en met hoge poly-dispersie werden verkregen bij lage opbrengsten, zonder enig biologisch effect. De synthetische manier van Kushawa en medewerkers [Biopolymers 19, 219 (1980)] en Mathur en mede-15 werkers [Int. J. Peptide Prot. Res. 17, 189 (1981)] scheen het meest toepasbaar te zijn en gaf produkten met lage dispersie. ε-polylysine en δ-poly-ornithine werden ermee gesynthetiseerd. Het principe van de methode was hetzelfde voor beide verbindingen: uitgaande van een beschermde aminozuur-20 methylester met een beschermde actieve ester of azide werd eerst een tripeptide-methylester verkregen. Na alkalische hydrolyse werd het tripeptidezuur geactiveerd in actieve estervorm (het werd omgezet in zijn pentachloorfenylester).

Na verwijdering van de bescherming aan de ω -amino-eindgroep 25 is het tripeptide gereed en actief voor polycondensatie. Tenslotte werden de beschermende α-aminogroepen verwijderd en het isopolypeptide geïsoleerd. In deze werkwijzen worden in α-positie BOC, in ω-positie Z-amino beschermende groepen gebruikt. Hun verwijdering werd uitgevoerd door behandeling met 30 sterk zuur, respectievelijk door katalytische hydrogenering.

In de bovenstaande publikaties zijn de polymeren niet gekenmerkt door Mff, Mfl-distributie of gegevens van optische zuiverheid.

De gebruikte afkortingen als aanbevolen door 35 IUPAC-IUB Commissie Biochemische Nomenclature, J. Biol. Chem.

247, 977 (1972), aangevuld met verdere namen, waarvan sommigen als volgt zijn opgesomd: Z benzyloxycarbonyl .8802604 - 4 - BOC tert.butyloxycarbonyl -ONp p-nitrofenyl -OSn N-hydroxy-succinimidyl —OPcp pentachloorfenyl 5 -OPfp pentafluorfenyl -OBt N-hydroxybenzotriazolyl

BuOCO isobutyloxycarbonyl

EtOCO ethyloxycarbonyl N3 azido 10 EEDQ N-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-l,2-dihydroisoquinoline

EtOAC ethylacetaat IIDQ N-isobutoxycarbonyl-2-isobutoxy-l,2-dihydroisoqui- noline THF tetrahydrofuran 15 DMF dimethylformamide HPLC hoge prestatie vloeistofchromatografie OPTLC overdruk dunne laagchromatografie IEF isoëlektrische focusering MS massaspectrometrie 20 NMR kernmagnetische resonantiespectroscopie

Zco2 Z-groep gemeten uit vrijgemaakt CO2 MW moleculair gewicht TLC dunne laagchromatografie

BuOH butanol 25 AcOH azijnzuur

Gedurende de reproductie van deze werkwijzen werden enige nadelen waargenomen en ondervonden: in de bereiding van oligomeren werden hun carboxylgroepen steeds beschermd met methylester, zodat het verkregen oligomeer niet direkt ge-30 schikt is voor polycondensatie. Teneinde een actief tussen-produkt te krijgen moest de carboxylgroep vrijgemaakt worden door alkalische hydrolyse uit de overeenkomstige methylester. Deze stap resulteert in racemisering en in andere nevenreacties, waardoor de opbrengst afneemt. Ongelukkigerwijs ver-35 toonden de gesynthetiseerde polymeren ook een hoge polydis-persie. Verder was de toepassing van benzyloxycarbonyl als beschermende groep voor ω-amino nadelig omdat het moet worden verwijderd door katalytische hydrogenering. Ongelukkigerwijs . 8802604 - 5 - *r waren de polymeren die op deze wijze werden bereid onwerkzaam in onze biologische tests.

De uitvinding beoogt de bovengenoemde nadelen te vermijden door uitwerking van een nieuwe methode, die nooit 5 is toegepast in de produktie van isopeptiden van diaminodi-carbonzuren.

De uitvinding is gebaseerd op het inzicht dat het bovengenoemde doel kan worden bereikt wanneer eerst actieve oligomeren, die direct toepasbaar zijn voor polycondensatie, 10 worden bereid in een werkwijze, waarin de carboxylgroepen worden beschermd door actieve estergroepen en de peptidekop-peling wordt uitgevoerd met een aanzienlijk hogere snelheid dan de aminolyse van de beschermende actieve estergroep. Deze koppelingsmethode verschaft een hogere activiteitsgraad dan 15 de actieve estermethode. We hebben gevonden dat de "backing off" activeringsmethode goed toepasbaar is voor het bereiden van isopeptiden en zouten, bestaande uit diaminocarbonzuren.

Voor een tijdelijke bescherming en gelijktijdige activering van de COOH-groepen is de p-nitrofenylester, voor peptide-20 koppeling de gemengde anhydridemethode het best gevonden. Met BOC-protectie voor de aminogroepen in de latere amidebindingen en de Z-groep voor aminogroepen geen deel uitmakend van de reactie. We hebben beweerd dat op deze wijze homo- of opeenvolgingsisopeptiden van ieder diaminocarbonzuur kunnen 25 worden gesynthetiseerd. Verder hebben we gevonden dat isopoly-peptiden met lage polydispersie kunnen worden geproduceerd op reproduceerbare wijze met MW tussen brede grenzen. De tussen-produkten en eindprodukten zijn goed kristalliseerbare stoffen van hoge zuiverheid en kunnen gemakkelijk worden 30 geïsoleerd.

Voorts is de uitvinding gebaseerd op het inzicht dat de p-nitrofenylesters de meest toepasbare groepen zijn voor tijdelijke bescherming en gelijktijdige activering van carboxylgroepen in het geval van diaminocarbonzuren, waarbij 35 hier de gemengde anhydridemethode optimaal is voor peptide-koppeling, en z- en BOC-groepen kunnen worden gekozen voor bescherming van de anderen.

Tenslotte is de uitvinding gebaseerd op het inzicht . 88 0 2604 4 - 6 - dat homo- of opeenvolgingsisopeptiden van ieder diaminomono-carbonzuur kunnen worden gesynthetiseerd met de bovengenoemde werkwijze zonder racemisering, onder behoud van hun configuratie.

5 Gebaseerd op het bovenstaande heeft de uitvinding betrekking op isopolypeptiden, hun zouten, optische isomeren en racematen met de algemene formule 1, waarin de substitu-enten de bovenbeschreven betekenis hebben.

In overeenstemming met de werkwijze volgens de 10 uitvinding worden de verbindingen met de algemene formule 1 en hun zouten bereid door koppeling van een monomeer of oligomeer met de algemene formule 2 van het formuleblad, waarin q = 1-9, R1 is een amino-beschermende groep (in oli-gomeren zijn alle R1 dezelfde), R3 staat voor een actieve 15 estergroep voor carboxylgroepen geschikt voor bescherming en gelijktijdige activering, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, m, en n zijn als hierboven aangegeven - met een monomeer van de algemene formule 3 van het formuleblad, waarin R2 een aminobeschermende groep verschillend van R1 is, die selectief 20 kan worden verwijderd van naast de R1-groep, X is een carboxyl-activerende groep onder voorwaarde dat de COX-groep reactiever is dan de COOR3-groep, R1, R4, R5, R6, R7, R8, R9, RlO, m en n zijn als hierboven aangegeven. Van de verkregen verbinding met algemene formule 4 van het formuleblad, 25 - waarin de substituenten zijn als boven aangegeven en s staat voor een geheel getal van 2 - 10 - de R2 beschermende groep wordt verwijderd, dan, indien s * 9, wordt deze omgezet met een verbinding van de algemene formule 3 of wordt gepolycondenseerd op een bekende wijze. Dan worden de 30 beschermende R^—groepen verwijderd van de produkten. Indien de verkregen verbinding met de algemene formule 1 in de vrije basevorm is, kan deze worden getransformeerd in een farmaceutisch aanvaardbaar zout, of wanneer het een zout is, kan het worden getransformeerd in een vrije base of in een 35 ander zout.

Optische isomeren kunnen worden verkregen door de corresponderende isomeren te gebruiken als uitgangsstoffen. Wanneer racemishe polymeren moeten worden bereid, moeten de <8802604 - 7 - racematen van de monomeren worden gebruikt als uitgangsstoffen.

In de werkwijze volgens de uitvinding zijn R1 en R2 algemeen in de peptidechemie bekende selectief verwijderbare 5 beschermende groepen. R1 is bij voorkeur een benzyloxycarbo-nylgroep (Z) en R2 staat bij voorkeur voor een tert-butyloxy-carbonylgroep (BOC). De groep -OR3 is een actieve estergroep voor zowel carboxylbescherming als activering, bijvoorbeeld -ONp, -OSn, -OPcp, -OPfp, -OBt; X kan staan voor Bu^-OCO-, 10 EtOCO-, N3, -OSn, -OPcp, -OPfp, afhankelijk van de reactie-omstandigheden en van de betekenis van R3, bijvoorbeeld is het Bu^OCO-, EtOCO-groep.

In de meest voordelige werkwijze volgens de uitvinding wordt het monomeer met de algemene formule 2 15 gebruikt als uitgangsmateriaal waarin R1 is Z, R2 staat voor BOC en R3 is -ONp. De BOC-groep wordt verwijderd door acidolyse, dan wordt het beschermde (R1 = Z, R2 = BOC) diaminocarbonzuur gekoppeld met de gemengde anhydridemethode. Na verwijdering van de beschermende BOC-groep wordt het zo 20 verkregen dipeptide gepolycondenseerd, of wordt het opnieuw gekoppeld met het volgende beschermde aminozuur als boven, waarbij de stappen worden herhaald tot aan het decapeptide.

De beste methode is het herhalen van de koppelingen tot aan het tripeptide en dan het transformeren van het 25 verkregen oligomeer, dat direct geschikt is voor poly-condensatie tot isopolypeptiden met het beoogde aantal aminozuurresiduen. De verwijdering van de beschermende Z-groep (dat is vrijmaken) wordt bij voorkeur uitgevoerd met HBr in azijnzuur, en het eindprodukt wordt geïsoleerd.

30 De condities voor de meest voordelige werkwijze van de gemengde anhydridekoppelingsmethode zijn de volgende; a) oplosmiddel: acetonitril, THF, DMF, dichloor- methaan; b) reagensvormend anhydride: ethylchloorformiaat, 35 isobutyl-chloorformiaat, EEDQ, IIDQ; tertiaire base: triethylamine, diisopropyl- ethylamine, N-methyl-morfoline; 8802604 - 8 - c) tijd van activering en temperatuur

10-30 min, tussen -10eC en -20 °C

d) neutralisatie van aminocomponent zout: 5 met triethylamine of diiso- propyl-ethylamine in het reactiemengsel.

Opbrengst voor zuivere eindprodukten; 60-80%.

Zowel homo- als opeenvolgings-isopolypeptiden 10 kunnen worden bereid met de werkwijze volgens de uitvinding.

Voor het analyseren van de bereide isopeptiden werden moderne scheidingstechnieken als HPLC, OPTLC, IEF en structuurbepalingsmethoden als IR, MS, NMR gebruikt. De studies en controles bewezen de structuren.

15 Voor het onderzoek van de biologische activiteiten werden stoffen gebruikt die gezuiverd waren op de manier als beschreven in de voorbeelden. De zuivering werd uitgevoerd door neerslaan, kolom- en gel-chromatografie.

Op basis van biologisch onderzoek hebben we gevon-20 den dat van onder de poly-L-isolysinen (polymerisatie-graad/p.d./: 10-400) bereid volgens de werkwijze van de uitvinding de polymeren met een p.d. van 40-200 (MW: 5500-20.300 D) een celproliferatie-vertragend effect vertonen, d.w.z. een antitumoractiviteit in vitro en in vivo en 25 dat ze de vorming van tumormetastasen inhiberen. De produkten met MW 10.200-15.400 D (p.d. 80-120) hebben de hoogste activiteit. De andere stoffen die tot nog toe bereid zijn, zijn niet effectief gebleken, hoofdzakelijk wegens de hoge poly-dispersie van de eindprodukten en de racemisatie gedurende de 30 produktie in de methoden van Kushawa of Mathur.

Gevonden werd dat poly-L-isolysinen met een p.d. van 80-120, geproduceerd met de methode van Kushawa of Huil, geen antivirale activiteit vertonen.

De hoofdvoordelen van onze synthese met betrekking 35 tot de bekende werkwijzen zijn als volgt: - produkten met veelbelovende biologische effecten kunnen worden geproduceerd met een hoge reproduceerbaarheid.

- oligomeren, die direkt toepasbaar zijn voor poly- 8802604 - 9 - condensatie kunnen worden verkregen, waarbij de hydrolysetrap die hiervoor is genoemd, geëlimineerd is en de racemisatie, die zeer gevaarlijk is vanuit het oogpunt van biologisch effect, kan worden vermeden.

5 - Produkten met gunstige MW-distributie (d.w.z. met lage polydispersie) kunnen worden geproduceerd tussen brede MW-grenzen, hetgeen ook van voordeel is voor het bereiken van het gewenste biologische effect (bijv. in het geval van polymeer SZTP-14 MW: 12.700+200; polydispersie: 3,7). De opbreng-10 sten zijn hoger, de zuiverheid van de tussenprodukten en eindprodukten is groter. Beide stoffen zijn goed kristalli-seerbaar en ze kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd. De reproductie van de trappen voert niet tot moeilijkheden.

- De stappen van de peptidekoppelingen hebben een 15 kortere reactietijd nodig.

- Het vrijmaken met katalytische hydrogenering kan worden geëlimineerd door onze combinatie van aminobescher-mende groepen. Dit betekent verdere voordelen in de produktie op industriële schaal.

20 - Het meest belangrijke voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding is de toepassing van reactietrappen zonder racemisatie.

Zoals boven aangegeven werden tot nog toe produkten verkregen die in onze biologische proeven onwerkzaam bleken.

25 Anderzijds tonen de polymeren, gesynthetiseerd met onze werkwijze, zeer veel belovende biologische activiteiten.

Onder de verbindingen met algemene formule 1 bereid met de werkwijze volgens de uitvinding, zijn de volgende nieuw: 30 R4, R5, R6, R7 en R10 staan onafhankelijk van elkaar voor waterstof, methyl, ethyl, propyl of butylgroep, R8 en R9 staan voor elk waterstof, r is een geheel getal van 10 tot 400, 35 m is 0, 1, 2 of 3, en n is 0.

In een groep van voordelige verbindingen staan R4, R5, R6, R7 en R10 onafhankelijk van elkaar voor water- 8802604 - 10 - stof, methyl, ethyl, propyl of butyl-groep, R8 en R9 staan elk voor waterstof, r is een geheel getal van 40 tot 200, 5 m is 3 en n is 0.

In een ander groep van voordelige verbindingen staan R4, R5, R6, R7 en R10 elk voor waterstof, 10 R8 en R9 ook elk voor waterstof, is r een geheel getal van 80 tot 120, m is 3 en n is 0.

In een verdere groep van voorkeursverbindingen 15 staan onafhankelijk van elkaar R4, R5, R6, R7 en R10 voor waterstof, methyl, ethyl, propyl of butylgroep, R8 en R9 elk voor waterstof,is r een geheel getal van 10 tot 120, 20 m is 2 en n is 0.

In een andere voordelige groep van verbindingen staan onafhankelijk van elkaar R4, R5, R6, R7 en R18 voor waterstof, methyl, ethyl, propyl 25 of butylgroep, R8 en R9 elk voor waterstof, is r een geheel getal van 10 tot 400, m 1 en is n 0.

30 Verdere voordelige verbindingen zijn verbindingen waarin R4, R5 en R18 onafhankelijk van elkaar staan voor waterstof, methyl, ethyl, propyl of butylgroep, 35 R6, R7, R8 en R9 elk staan voor waterstof, r een geheel getal is van 10 tot 400, m en n de waarde 0 hebben.

De L stereoisomeren van de isopolypeptiden met de ^8802604 - 11- algemene formule 1 en hun zouten bleken zeer effectief te zijn tegen tumoren en virale infecties.

De biologische activiteit van de poly-isolysinen bereid volgens de werkwijze van de uitvinding werd in vitro 5 en in vivo bestudeerd. De veelbelovende activiteiten worden gedemonstreerd in het volgende deel. Het antitumoreffect werd gemeten aan dierlijke tumorkweken, het antivirale effect werd onderzocht tegen plantvirussen.

In onze experimenten waren de isopoly-L-lysinen met 10 een MW van 5500 tot 25.600 verrassend actief en van onder hen waren de verbindingen met een MW van 10.200 tot 15.400 het beste.

In beide metingen was de stof SZTP-14 het meest effectief. Zijn karakterisering: 15 viscositeit van het Z-beschermde polymeer:-2-— 31,92 cm3/g c ZC02 : 16,8% (berekend), 16,3% (gevonden).

Het vrije polymeer was beschikbaar als HBr zout.

Br gehalte: 37,7% (berekend), 36,8% (gevonden).

A254 " 0 (d.w.z. geen ÜV absorptie).

20 Het werd gezuiverd door neerslaan uit alcohol met ether.

[a] = +32,4° (c = 2; water) MW = 12.700 D+200.

Onderzoek van antitumoractiviteit 25 Het effect van verbindingen die de celproliferatie kunnen beïnvloeden, wordt gewoonlijk onderzocht in vitro, waarbij celculturen worden gebruikt, en in vivo, waarin transplanteerbare dierlijke tumoren worden gebruikt. Zo werden onze verbindingen onderzocht op een humane erythroleuke-30 miecellijn (K-562). Karolinska Instituut, Stockholm) en op vier transplanteerbare muistumoren (1*1210 lymfoïde leukemie, P380 van een macrofaag afgeleide tumor, Ehrlich carcinoom, Lewis longtumor). In het geval van L1210 en ^388 tumoren en het Ehrlich carcinoom werd het overleven van de dieren ge-35 bruikt als indicator van het effect. In het geval van LLT werd het aantal en de afmetingen van metastasen bepaald in behandelde en onbehandelde muizen, waargenomen in de long of de lever. De experimenten werden uitgevoerd onder toepassing van de volgende oplossing voor injectie: 50 mg van de ver- '» 8802604 - 12 - binding opgelost in 10 ml fysiologische zoutoplossing»

De onderzochte verbindingen werden als volgt benoemd : SZTP polyso-L-lysinen geproduceerd met de werkwijze vol- 5 gens de uitvinding SZTP-14: polyiso-L-lysine HBr-zout, moleculair gewicht be rekend op vrije bases: 12.700+200, polydispersie: 3,7 (gemiddeld aantal/gemiddeld gewicht) SZTP-15: polyiso-L-lysine HBr-zout, moleculair gewicht 10 berekend op vrije bases: 11.600+200 SZTP-16: polyiso-L-lysine HBr-zout, moleculair gewicht berekend op vrije bases: 13.400+200 SZTP-17: polyiso-L-lysine HBr-zout, moleculair gewicht berekend op vrije bases: 14.500+200 15 SZTO: polyiso-L-ornithine, geproduceerd volgens de werk wijze overeenkomstig de uitvinding SZTO-18: polyiso-L-ornithine HBr-zout, moleculair gewicht berekend op vrije bases: 8.900+200 H-17: polyisolysine geproduceerd volgens Huil en medewer- 20 kers K-17: polyisolysine geproduceerd volgens Kushawa en mede werkers A-3: a-polylysine.

Samenvatting van de experimenten op tumorcelpro-25 liferatie.

De verbindingen geproduceerd volgens de uitvinding verlaagden in vitro afhankelijk van de dosering het aantal tumorcellen wanneer vergeleken werd met de controle. Dit effect bleek uit de stagnering van het aantal cellen in het 30 geval van kleine doses, terwijl hoge doses cellen-dood veroorzaakten. H-17 en K-17 waren onwerkzaam, a-polylysine (A-3) veroorzaakte slechts stagnatie van het celaantal.

Volgens onze in vivo experimenten resulteerde de behandeling met SZTP in een toegenomen overleven van de be-35 handelde dieren. In het geval van Ehrlich-tumor veroorzaakte de behandeling een zeer lange tumorvrije periode en werd de tumorgroei slechts na staken van de behandeling weer waargenomen.

.8802604 - 13 - « SZTP behandeling voorkwam volledig de metastase-vorming in de lever wanneer de tumor werd geïnoculeerd in de mild, en deed het aantal en de afmeting van longmetastasen afnemen wanneer de tumor werd geïnoculeerd in de spier.

5 Dienovereenkomstig bleken de volgens de uitvinding geproduceerde polyisolysinen en polyisoornithinen inhibitoren te zijn van tumorcel proliferatie. Onder de verbindingen toonden de polyisolysinen een verrassend sterk inhibitoor effect. Dit effect kan gemakkelijk worden vergeleken met het 10 effect van de bekende beste cytostatica gebaseerd op het overleven van de dieren. Het onverwacht goede antimetastase effect van onze verbindingen is evident. Een extra voordeel van onze verbindingen is hun geringe toxiciteit, die veel minder is dan die van de tot nog toe toegepaste cytostatica.

15 Onze biologische onderzoekingen toonden bijvoor beeld dat de therapeutische index maximale toegestane dosis maximale effectieve dosis een waarde heeft van meer dan 10, terwijl deze waarde gewoon-20 lijk flink beneden 10 is in het geval van de meeste bekende cytostatica.

Geen verschil werd waargenomen tussen de biologische respons van mannelijke en vrouwelijke dieren in dit opzicht, hetgeen ook een voordeel is.

25 In het volgende geven we gegevens omtrent de toe lichting van het antitumoreffect.

In vitro experimenten

De tabellen la tot lc tonen het effect van polyisolysinen geproduceerd met verschillende werkwijzen, polyiso-30 ornithinen geproduceerd met de werkwijze volgens de uitvinding en van a-polylysine op de proliferatie van K-562 cellen.

De experimentele parameters waren de volgende: cellen: K-562 humane erythroleukemiecellijn (Karolinska Instituut, Stockholm) werd gebruikt.

35 Celaantal: 5xl04/ml, in 5-6 ml medium-bevattende glazen reageerbuizen.

Aantal monsters: 3 reageerbuizen per dosering.

Medium: Parkers M-199 aangevuld met 10% foetaal runderserum . 8802604 - 14 - (Flow Laboratories, Irvine, Schotland).

Temperatuur, atmosfeer: 37'c, 5% CO2 + 95% lucht.

Behandeling: 24 uur na de verdunning van de celculturen. Dosering: 1-10-100 /ug/ml.

5 Evaluering: celtelling 24, 48, 72 en 96 uur na de verdunning van de cultures, onder gebruikmaking van de kamer volgens Buerker.

Aantal proeven: 2/verbinding.

Tabel la toont aan dat SZTP-14, SZTP-15, SZTP-16, 10 SZTP-17 en SZTP-18, maar vooral SZTP-14, behandelingen resulteerde in een significante doseringsafhankelijke inhibering van de celproliferatie. Het is opmerkelijk dat zelfs 1 /ug/ml behandeling een goed gedefinieerd antipro-liferatie-effect veroorzaakte.

15 Tabel lb toont echter dat in tegenstelling daarmede H-17 en K-17 de proliferatie van K-562 cellen niet beïnvloedde.

Tabel lc toont aan dat α-polysine de stagnatie van het aantal cellen veroorzaakte indien vergeleken met de 20 controle, maar dat het geen daling veroorzaakte van het aantal cellen zelfs in hoge dosering (100 /ug/ml).

De in de tabellen aangegeven waarden betekenen het aantal cellen op de gegeven tijdstippen. De cellen werden geteld in drie reageerbuizen per dosering en in drie reageer-25 buizen als controle op elk tijdstip.

Tabel la

Het effect van de verbindingen bereid volgens de uitvinding (SZTP-14-15-16-17-18) op de K-562 cellijn in vitro. Behandeling: 1-10-100 /u/ml, 24 uur na verdunning van de 30 cultuur.

8802604 - 15 -Tabel la

Aantal cellen x 103/ml voedingsvloeistof SZTP-14 48_fi_72^_96^;_ 100 /ug/ml 000 5 __ 10 /Ug/ml 90 90 150 110 80 120 70 80 140 10 1/ug/ml 80 170 180 100 180 190 100 120 150 controle 130 220 260 15 120 230 230 110 220 230 SZTIP-15 100 /ug/ml 40 10 10 20 50 20 10 20 10 20 10 /ug/ml 80 100 160 60 120 110 25 50 100 140 1 /ug/ml 120 150 200 100 140 190 120 120 210 30 ____ controle 140 210 270 120 190 250 150 190 280 * 88 02604 - 16 - (vervolg tabel la) 48h_ 72h_96^_

SZTP

100 /ug/ml 100 160 160 5 120 120 140 100 140 140 10 /UG/ML 120 160 220 120 160 240 10 140 180 240 1 /ug/ml 140 180 260 120 210 280 140 240 250 15 _ controle 140 220 280 130 200 260 140 200 270 20 SZTP-17 100 /U/ml 110 180 200 120 190 210 110 200 200 25 10 /ug/ml 120 200 260 120 200 260 120 190 280 1 /ug/ml 150 260 280 30 130 210 280 130 210 260 controle 140 250 280 150 220 280 35 130 220 260 « 8802604 - 17 - (vervolg tabel la) 48h_72h_96^_ SZTP-18 100 /Ug/ml 100 160 180 5 100 130 180 90 130 160 10 /ug/ml 120 180 220 120 160 230 10 120 190 230 1 /ug/ml 140 200 280 140 210 260 130 220 280 15 _ controle 140 220 280 150 230 280 140 230 270 20 _ - 8802604 - 18 -

Tabel lb

Het effect van H-17 en K-17 behandeling op de proliferatie van K-562 cellen in vitro.

Behandeling: 1-10-100 /ug/ml, 24 uur na verdunning van de 5 cultuur.

Tabel lb

Aantal cellen x 103ml voedingsvloeistof 48h _72^_96^_ 10 H-17 100 /ug/ml 125 230 280 110 210 270 120 210 280 15 10 /ug/ml 120 220 290 130 240 280 125 210 220 1 /ug/ml 130 240 290 20 120 240 290 120 220 270 K-17 100 /ug/ml 120 220 280 25 110 210 290 120 220 270 10 /ug/ml 125 240 290 135 240 290 30 120 210 270 1 /ug/ml 140 240 290 120 220 280 120 230 280 35 ______ controle 120 210 290 130 200 280 _120_ 220_285_ .8802604 - 19 -

Tabel lc

Het effect van A-3 behandeling op de proliferatie van K-562 cellen in vitro.

Behandeling: 1-10-100 /ug/ml, 24 uur na verdunning van de 5 cultuur.

Tabel lc

Aantal cellen x 103/ml voedingsbodem 48h_72^_96^_ 100 yug/ml 110 110 100 10 120 110 100 120 120 110 10 /ug/ml 130 120 120 120 110 110 15 120 120 110 1 /ug/ml 110 110 100 120 110 110 120 120 110 20 _ controle 120 250 300 120 240 290 125 240 290 25 In vivo onderzoekingen a) L1210 tumor, onderzoek van SZTP-14 Oorsprong van tumor: Chester Beatty Institute, Londen. Dierlijke stam: DBA/2 gekweekt, eigen kweek.

Gewicht en sekse van de dieren: 20-23 g, vrouwelijke dieren, 30 5 dieren per groep.

Tumorcelaantal: 105 per dier, intraperitoneaal.

Behandeling: 50 mg/kg, intraperitoneaal, 24 uur na tumor inoculatie, gedurende 8 dagen, éénmaal daags. Controlegroep: fysiologische zoutoplossing, 0,2 ml intraperi-35 toneaal.

Evalutatie: overleven van de dieren.

Resultaten: zoals tabel 2 toont overtrof het overleven van behandelde dieren dat van de controles. Tien .8602604 - 20 - dagen na de inoculatie van de tumor was niet een enkele controlemuis meer in leven. Tegelijkertijd waren alle behandelde dieren wel levend. Het eerste behandelde dier stierf 13 5 dagen, de laatste stierf 15 dagen na de inoculatie van de tumor.

Tabel 2

Het effect van een dagelijkse behandeling met 50 mg/kg op het overleven DBA/2 muizen geïnoculeerd met L1210 10 tumor

Dagen na Levende Levende behandelde inoculatie_controle_muizen_ 9 3 5 10 - 5 15 11 - 5 12 5 13 4 14 - 3 15 20 _____ b) P-388 ascites tumor, behandeling met SZTP-14 Dierlijke stam: BDF/1 hybride, eigen kweek.

Gewicht en sekse van de dieren: 20-23 g, mannelijke dieren, 25 5 muizen per groep

Aantal cellen: 2,8 x 106 cel per dier, intraperitoneaal. Behandeling: 10 mg/kg intraperitoneaal, dagelijks, begonnen 24 uur na de tumorinoculatie.

Controle: 0,2 ml fysiologische zoutoplossing, dagelijks, 30 intraperitoneaal

Evaluatie: overleven van de dieren

Resultaten: tabel 3 toont het aantal overlevende dieren.

Alle behandelde muizen overleefden de controles.

Tabel 3 35 Het effect van 10 mg/kg dagelijks met SZTP-14 behandelen op het overleven van BDF/1 muizen geïnoculeerd met P-388 ascites tumor .8802604 - 21 -

Dagen na Levende Levende behandelde inoculatie_controle_muizen_ 9 4 5 10 5 5 11 - 5 12 5 13 - 5 14 5 15 4 10 16 - 2 17 - 1 18 15 c) Ehrlich ascites tumor, behandeling met SZTP-14.

Dierlijke stam: Zwitsers, geen inteelt, eigen kweek.

Gewicht en sekse van de dieren: 20 g, 5 mannelijke en 5 vrouwelijk per groep.

Tumorcelaantal: 106 per dier.

20 Behandeling: 50 mg/kg en 75 mg/kg intraperitoneaal, dagelijks, begonnen 24 uur na de tumorinoculatie, gedurende 20 dagen.

Controle: 0,2 ml fysiologische zoutoplossing, intraperitoneaal .

25 Evaluatie: meting van het lichaamsgewicht, dagelijks vervolg op overleven. Dieren die leefden na 55 dagen na de tumorinoculatie werden gedood, autopsie uitgevoerd, hoeveelheid ascites gemeten, en registratie van af en toe vaste tumorvorming in 30 de peritoneale ruimte uitgevoerd.

Resultaten: Tabel 4 toont het lichaamsgewicht van de muizen vanaf de 16e dag na de tumorinoculatie. De controledieren stierven tussen de 17e en de 22e dag. Overmaat gewicht duidt op ascites tumor- 35 achtige formatie. In elke behandelde groep waren de dieren in leven (behalve één per groep) 55 dagen na de tumorinoculatie. De dieren werden dan gedood. Tabel 5 toont de hoeveelheid ascites .8802604 - 22 - en de aanwezigheid van vaste tumor in de perito-neale holten. Dit betekent dat geen tumorvrij dier was gevonden, maar uit 20 behandelde muizen waren er 16 in leven 33 dagen na de dood van de 5 laatste controlemuis.

Tabel 4

Het effect van 50 mg/kg en 75 mg/kg SZTP-14 intra-peritoneale behandeling (gedurende 20 dagen) op het lichaamsgewicht en het overleven van mannelijke en vrouwelijke 10 Zwitserse muizen geïnoculeerd met Ehrlich ascites tumor. Lichaamsgewicht voor de tumorinoculatie: 20 g.

0: gestorven wegens de tumor; +: gestorven om andere redenen.

15 Dag na controle * controle ? 75 mg/kg <* tumor 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5.

inoculatie_____ i 16. 43 37 41 46 40 40 34 40 35 41 17 22 24 21 22 20 17. 44 39 42 46 41 40 35 0 35 42 17 23 24 25 22 18. 45 42 43 47 49 42 35 0 35 43 18 23 24 21 24 19. 0 43 43 50 0 0 36 0 0 44 19 23 24 21 24 20. 0 46 0 42 0 0 42 0 0 46 16 21 23 20 21 21. 0 46 0 43 0 0 47 0 0 47 18 23 25 25 22 25 22. 00000 0 0 0 0 51 19 25 26 25 24 24. 00000 00000 19 24 26 24 25 25. 20 24 26 24 26 26. 20 24 27 24 25,5 27. 21 25 28 25 26 30 28. 21 25 28 25 26 29. 21 25 28 25 26 33. 22 25 28 25 26 34. 22 25 28 25 26 42. 23 26 27 25 28 35 50. 24 27 27 25 28 55. 26 29 0 27 32 .8802604 - 23 -

Dag na controle <s controle $ 75 mg/kg ^ tumor 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5. 1. 2. 3. 4. 5.

inoculatie______ 5 16. 28 23 28 25 29 18 19 22 23 + 29 30 31 26 27 17. 28 23 28 24 28 18 19 22 23 + 28 30 31 26 28 18. 29 24 27 25 30 19 20 23 23 + 29 30 32 27 29 19. 29 24 28 26 30 20 20 23 23 + 29 30 32 28 29 20. 27 22 25 24 27 17 18 21 21 + 27 28 30 24 27 10 21. 29 23 27 27 29 18 18 22 22 + 27 30 20 25 27 22. 29 24 28 27 30 20 20 24 22 + 29 30 32 25 29 24. 29 25 29 28 31 20 20 24 23 + 29 30 32 26 30 25. 30 26 30 29 31 21 21 24 24 + 30 30 32 26 31 26. 30 25 30 29 31 22 22 24 25 + 30 31 32 26 31 15 27. 30,5 26 31 30 31 22 22 25 25 + 30 31 32 25 32 28. 31 26 31 30 31 22 22 25 25 + 30 31 31 25 32 29. 31 26 31 30 31 22 22 25 25 + 30 31 32 26 32 33. 30 27 32 31 32 23 22 27 26 + 28 32 30 24 33 34. 30 27 32 31 32 23 22 30 26 + 28 32 30 24 33 20 42. 32 29 33 34 28 24 25 30 31 + 27 33 30 26 35 50. 34 30 35 37 24 24 26 30 36 0 34 30 26 36 55. 33 32 38 0 37 26 28 32 43 + 0 36 31 27 28 25 Tabel 5

Ascites en vaste tumor in de peritoneale holte van Zwiterse muizen geïnoculeerd met Ehrlich ascites tumor, behandeld met 50 mg/kg en 75 mg/kg SZTP-14 en gedood 55 dagen na de tumorinoculatie.

30 Behandeling 75 mg/kg 75 mg/kg 50 mg/kg 50 mg/kg <f $ a 2 ascites ml --0-4 16-0--5240-1-40 35 vaste tumor in

in de buikholte ++0++ + + + 0 + + + + + 0 + + + +Q

0: het dier stierf eerder +ï vaste tumor in de buikholte .8802604 - 24 -

Inhibitie van turnormetastasen met SZTP-14 a) Lewis longtumor (LLT), inoculatie in de milt. Dierlijke stam: Inteelt C57B1,LATI, Gödölló, Hongarije.

Gewicht en sex van de dieren: 20-23 g, vrouwelijke dieren 5 (6 controles en 4 behandelde).

Tumorcelaantal: 5xl06 LLT cellen geïnoculeerd in de mild. Behandeling: 75 mg/kg, gedurende 8 dagen, aangevangen 24 uur na de tumorinoculatie.

Evaluatie: de dieren werden gedood en de levermetastasen wer-10 den geteld op de 9de dag na de tumorinoculatie.

Resultaten: Tabel 6 toont het aantal metastasen. Na de SZTP-14 behandeling werd geen enkele levermetastase gevonden .

Tabel 6 15 Effect van AZTP-14 behandeling (75 mg/kg intraperi- toneaal gedurende 8 dagen) op het aantal levermetastasen van vrouwelijke C57BI muizen geïnoculeerd met LLT in de milt aantal levermetastasen 20 controle 31 20 63 36 38 56 (X 40,66? s = 16,02; n = 6) SZTP-14 0 0 0 0 (n = 4) 25 b) Lewis longtumor (LLT), inoculatie in de rechter dij spier

Dierlijke stam: C57BI inteelt LATI, Gödölló, Hongarije.

Gewicht en sex van de dieren: 20-22 g, vrouwelijke dieren. Aantal dieren: 5 per groep.

30 Tumorcellen: 5xl05 cellen per dier, intramusculair, in de dijspieren van het rechteronderbeen.

Tien dagen na de tumorinoculatie werd het tumorachtige been verwijderd. Na de operatie, tussen de 11de en 17de dag na de tumorinoculatie werd 35 behandeling toegediend als volgt: dagelijks 50 mg/kg SZTP-14 werd intraperitoneaal gegeven. De controles ontvingen 0,2 ml fysiologische zoutoplossing dagelijks, intraperitoneaal.

.8802604 - 25 -

Evaluatie: dieren werden gedood op de 18de dag na de tumor- inoculatie. Het aantal en het gemiddelde volume van de longmetastasen werden bepaald onder een stereo-microscoop.

5 Resultaten: Tabel 7 toont het aantal en het gemiddelde volume vande longmetastasen. SZTP-14 behandeling deed het het aantal en het gemiddelde volume van de longmetastasen significant dalen.

Tabel 7 10 Het effect van SZTP-14 behandeling (50 mg/kg dage lijks, intraperitoneaal, tussen de 11de en 17de dag na de tu-morinoculatie) op de longmetastase qua aantal en gemiddeld volume bij C57BI muizen intramusculair geïnoculeerd met Lewis longtumor.

15 _

Behandeling aantal (gemiddeld) metastase-volume metastasen (mm3) gemiddeld controle 63,13 + 27,53 49,45 + 29,07 20 SZTP-14 26,29 + 18,87 20,10 + 35,38

Demonstratie van het antivirale effect 25 Reductie in de synsthese van tabaksmozaïekvirus

Intakte tabaksplanten (Nicotiana tabacum cv.

Samsun), gevoelig voor de infectie met tabaksmozaïekvirus (TMVj, werden mechanisch geïnoculeerd. Carborundumpoeder (deeltjesafmeting: 500 mesh) werd gebruikt als slijpmiddel.

30 Het inoculum bevatte 200 /ug TM gezuiverd tabaksmozaïekvirus (TMV ül stam) in 0,1 M Sorensen's fosfaatbuffer (pH 7,2). Intakte bladeren werden behandeld met SZTP-14 oplossing als een bladspray 3 uren na de inoculatie. De behandelingen werden herhaald gedurende drie achtereenvolgende dagen. De ernst 35 van de symptomen werd nagegaan twee weken na de inoculatie. Bladmonsters werden ook genomen 14 dagen na de inoculatie van alle bladopeenvolgingen van geïnoculeerde planten, d.w.z. van de bladeren op verschillende hoogten en van verschillende ouderdom.

.8802604 - 26 -

De virusconcentratie werd gemeten aan 1 g bevroren monsters. De bladmonsters werden gehomogeniseerd in 4 ml f os-faatbuffer (pH 7,2), dan gecentrifugeerd in een Eppendorff-centrifuge (ongeveer 10.000 omw/min gedurende 5 min). Van de 5 bovenstaande vloeistof werd 15 /ul gebruikt voor kwantitatieve metingen. Raketimmunoelektrofarese werd gebruikt voor de bepaling van het virusgehalte onder toepassing van specifieke anti-TMV (Ul) sera (1 /ul immunoglobuline/1 cm). Natriumbar-bituraatbuffer (0,2 M, pH 8,6) werd gebruikt als een lopende 10 buffer.

Het virusgehalte werd berekend uit de hoogte van de neerslagpieken, onder toepassing van standaardcalibratiecur-ven.

Tabel 8 15 Voorbeeld voor het schatten van het antivirale effect

Behandeling SZTP-14 Virusgehalte 200 mg/1 11 mg/ml 20 mg/1 24,6 mg/ml 20 2 mg/1 29,3 mg/ml controle 51,3 mg/ml

De isopolypeptiden volgens de uitvinding kunnen zowel in de vorm van de vrije base als van de niet-toxische zouten worden gebruikt in farmaceutische preparaten als werk-25 zame stoffen. Voor dit doel worden ze gemengd met dragers en hulpstoffen die gewoonlijk worden toegepast in de farmaceutische industrie en zo worden ze omgezet in farmaceutische produkten. Voorts kunnen de verbindingen volgens de uitvinding worden gebruikt zowel in de vrije base als in de zout-30 vorm voor het verhogen van de weerstand van planten tegen virusinfectie, door ze te mengen met hulpmiddelen, die gewoonlijk worden gebruikt bij de bescherming van planten.

De zouten, die aanvaardbaar zijn in de farmacie, zijn bijv. zuuradditiezouten zoals hydrochloride, hydrobro-35 mide, hydrojodide, sulfaat, fosfaat, nitraat, oxalaat, fuma-raat, gluconaat, hartraat, maleaat, acetaat, citraat, benzo-aat, ascorbaat, lactaat, alginaat enz.

De farmaceutische produkten die de verbindingen .8802504 - 27 - t volgens de uitvinding bevatten als actieve middelen, kunnen injecteerbare oplossingen, tabletten, dragees, suppositoria, suspensies, drinkbare oplossingen, poedermengsels enz. zijn.

De farmaceutisch werkzame hoeveelheid van de ver-5 binding volgens de uitvinding hangt af van de toedienings-wijze en de toestand van de patiënt. In het algemeen wordt een dosering van 0,02-20 mg/kg lichaamsgewicht per dag toegediend in verdeelde doseringen dagelijks 2-4 maal. De doseringen zijn hoger in het geval van orale toediening.

10 Voordelige medicijnvormen zijn de injectie-oplos- singen, die intraveneus, subcutaan of intramusculair kunnen worden toegediend. Voor het bereiden van injecteerbare oplossingen wordt een isotone NaCl-oplossing desgewenst te zamen met een fosfaatbuffer, een ascorbinezuurstabilisator, enz.

15 gebruikt.

De actieve stoffen kunnen worden toegediend in de vorm van vaste of vloeibare medicijnpreparaten. In het geval van de toepassing van vloeibare vormen kan een zoetstof en/of een smaakmakend middel worden toegevoegd.

20 Voordelige vaste orale toedieningseenheden zijn bijv. tabletten, dragees en capsules. Bij het maken van deze produkten wordt het actieve middel gemengd met gebruikelijke farmaceutische dragermaterialen en wordt het mengsel geperst tot tabletten, getransformeerd in dragees of afgevuld in 25 capsules. De gebruikelijke vulstoffen en toevoegingen worden gebruikt als dragers, bijv. melksuiker, magenesiumstearaat, saccharose, talk,stearinezuur, gelatine, agar-agar, pectine, tragacant, colloïdale silicagel, maïszetmeel, alginezuur, enz.

Voor het maken van suppositoria wordt met voordeel cacaoboter 30 gebruikt.

De behandeling van planten wordt geschikt uitgevoerd door de verbindingen volgens de uitvinding te transformeren met gebruikelijke hulpstoffen zoals bevochtigingsmate-rialen en vaste dragers, bij voorkeur kaolien, in vaste of 35 vloeibare preparaten, bij voorkeur in combinatie met andere actieve stoffen. Van het zo verkregen preparaat wordt een oplossing of suspensie gemaakt die de verbinding volgens de uitvinding bevat in een concentratie van 1 tot 50 dpm en deze .8802604 - 28 - wordt aangebracht op bekende wijze op de planten, bij voorkeur in een hoeveelheid van 0,5 tot 5 g/ha.

De uitvinding wordt verder toegelicht aan de hand van de volgende niet beperkende Voorbeelden.

5 VOORBEELD I

Poly-L-lysine HBr zout a) N-a-benzyloxycarbonyl-L-lysine-p-nitrofenyles-ter.HCl

Van N-a-benzyloxycarbonyl-(Ν-ε-tert.butyloxycarbo-10 nyl)-L-lysine-p-nitrofenylester werd 10 g opgelost in 40 ml trifluorazijnzuur en een equivalente hoeveelheid 2N HC1 werd in EtOAC toegevoegd. Na gedurende één uur staan bij kamertemperatuur werd de oplossing in vacuüm ingedampt tot het halve volume, dan werd ether toegevoegd en de oplossing ge-15 kristalliseerd.

Opbrengst: 8,3 g (96,06%); smeltpunt 83-86°C; TLC Rf = 0,68 (n-butanol-azijnzuur-water 4:1:1).

b) N-a-benzyloxycarbonyl-N-(N'-a-benzyloxycarbo-nyl-N'-ε-tert.butyloxycarbonyl-L-lysil)- 20 L-lysine-p-nitrofenylester

Van N-a-benzyloxycarbonyl-(Ν-ε-tert.butyloxy-carbonyl)-L-lysine werd 7,69 g (20 mmol) opgelost in abs. acetonitril. Daaraan werd 2,8 ml (20 mmol) triethylamine en dan 2,8 ml isobutylchloorformiaat druppelsgewijs toegevoegd 25 onder krachtig roeren. Na activering (20 min) werd 9 g van het zout van trap a) toegevoegd, gevolgd door druppelsgewijze toevoeging van een koude oplossing van 2,8 ml triethylamine in 5 ml acetonitril. Het roeren werd 2 uur voortgezet bij -10 eC. Het mengsel werd verdund met 300ml 0,5 M HC1. Het 30 vaste produkt werd verzameld, gedroogd en herkristalliseerd uit een 1 : 1 mengsel van ethylacetaat en petroleumether. Opbrengst: 12,9 g (89,02%); smeltpunt: 128-131eC. Analyse: -ONP gehalte 99,8%. TLC Rf = 0,64 (EtOAC-cyclohexaan 3:1). Rf =0,91 (n-butanol-azijnzuur-water 4:1:1); HPLC tr. = 35 8,8 min (k' = 2,2); kolom: ODS-hypersil-6 (125x4 mm); eluent: MeOH-CH3CN-0,02 M NaOAc buffer (pH4) 40 : 30 : 30 v/v; stroomsnelheid: 1 ml/min; detectie: UV 254 nm.

c) N-o(-benzyloxycarbonyl-N-t- (N7-tf-benzyloxycarbo-nyl-L-lysine) -L-lysine-p-nitrofenylester-hydro- .&802ê04 - 29 - * chloride

Uit 10,5 g N-a-benzyloxycarbonyl-N-(N'-a-benzyloxy-carbonyl-N#-ε-tert.butyloxycarbonyl-L-lysil)-L-lysine-p-ni-trofenylester werd 10,25 g zout geproduceerd volgens trap a).

5 Smeltpunt: 109-113eC. TLC Rf = 0,70 (n-BuOH-AcOH-H20 4:1:1).

d) Ν-ε-tert.butyloxycarbonyl-tri(N-a-benzyloxycar-bonyl-L-lysine)-p-nitrofenylester

Volgens trap b) werd 5,71 g (15 mmol) N-a-benzyl-10 oxycarbonyl-(N- -tert.butyloxycarbonyl)-L-lysine omgezet in gemengd anhydride met triethylamine, isobutylchloorformiaat in acetonitril. 10,5 g N-ε-benzyloxycarbonyl-N-a- (N' -a-benzyl oxycarbonyl -L-lysil)-L-lysine-p-nitrofenylesterhydrochlo-ride werden toegevoegd in aanwezigheid van triethylamine.

15 Door op te werken als in trap b) werd 13,9 g produkt verkregen (85,4%). Het werd herkristalliseerd uit acetonitril en ether. Smeltpunt: 145-150°C. Analyse: ONP gehalte 99,6%; TLC Rf = 0,98 (n Bu0H-Ac0H-H20 4:1:1); HPLC tr. =18,2 min (k' = 8,1); kolom: ODS-hypersil-6 (125x4 mm); eluent: 20 MeOH-CH3CN-0,02 M NaOAC buffer (pH4) 40 : 30 : 30); stroomsnelheid: 1 ml/min; detectie: UV 254 nm.

e) Tri-(N-a-benzyloxycarbonyl-L-lysine)-p-nitro-fenylester-hydrochloride

Van de ester bereid in stap d) werd 12,2 g behan-25 deld als in stap a). Op deze manier werd 12,1 g (95,4%) van het zout verkregen; smeltpunt: 108-125“C. TLC Rf = 0,71 (n-Bu-OH:AcOH: H20 4:1:1).

f) Poly^-N-ct-benzyloxycarbonyl-L-lysine

Tri-(N-a-benzyloxycarbonyl-L-lysine)-p-nitrofenyl-30 ester-hydrochloride (23 g (24 mmol)) werd gecondenseerd in 60 ml dimethylsulfoxide in aanwezigheid van 4,5 ml triethylamine tot aan gelvorming. Het polymeer werd geïsoleerd door uit te gieten in een waterige 5% Na2C03 oplossing. Opbrengst: 16,8 g (89,6%). Analyse:Ζςο2 : 16,8% (berekend), 16,3% (gevonden); 35 [jsp]/0 * 31,92 cm3/U (c = 4,95 g/1, dichloorazijnzuur).

g) Poly^-L-lysinehydrobromide

Van het beschermde polymeer van trap f) werd 16 g opgelost in 100 ml trifluorazijnzuur en 100 ml 4N HBr/AcOH

.8802604 - 30 - werden toegevoegd. Het eindprodukt werd neergeslagen met ether. Opbrengst: 14,7 g (91,6%). Analyse: Br: 37,7% (berekend), 36,8% (gevonden); A254 nm = 0. Papierchromato-grafie: W1 23x62, eluent: n-BuOH-AcOH-Pyr.-H2O 30:6:24:20.

5 Totale opbrengst: 36,82% (uitgaande van het beschermde mono-meer); 18,85% (uitgaande van vrije lysine). MW = 5500 -20.300 D.

h) Zuivering van het ruwe eindprodukt

Van het in stap g) verkregen polymeer werd 250 g 10 opgelost in water en dan gechromatografeerd op een Sephadex G-50 (fijn) kolom. Eluent: gedestilleerd water, 0,9% NaCl-oplossing of 0,1 N HCl-oplossing. Detectie voor fracties (1 ml) bij UV 220 nm.

i) Zuivering van het ruwe eindprodukt 15 Van het in stap g) bereide poly-£-L-lysinehydro- bromide werd 2 g opgelost in 2 ml water, en dan werden 20 ml ethanol toegevoegd. Het polymeer werd neergeslagen met 80 ml diethylehter. Na 24 uur staan bij 5°c werd het gefiltreerd, gewassen en gedroogd. De opbrengst bedroeg: 1,26 g (83%) 20 (57,7% wanneer berekend vanuit het uitgangsprodukt beschermd peptide).

De zo verkregen stof wordt aangeduid als SZTP-14; MW = 12.700 D; [a]20 = +32,4° (c = 2; H2O); polydispersie = 3,7.

25 De volgende stoffen werden op overeenkomstige wijze bereid: SZTP-15 MW = 11.600+200 [ ]20 = +31,9° SZTP-16 MW = 13.400+200 [ ]20 = +32.6° SZTP-17 MW = 14,500+200 [ ]20 = +32,1°

30 VOORBEELD II

Poly-ε-L-lysinehydrochloride

Een oplossing van 1 g van het polymeer bereid als beschreven in Voorbeeld I in 40 ml 2M NaCl-oplossing werd ge-dialyseerd tegen 2M NaCl-oplossing, gevolgd door water. Na 35 lofilisering werd 0,85 g polymeer verkregen.

VOORBEELD III

Poly-ε-L-lysine (vrije base)

Een ionenuitwisselingskolom (40 ml) werd bereid van- .8802604 4 - 31 - uit Dowez 1-OH anionuitwisselaar hars. De oplossing van 1 g van het polymeer, bereid als beschreven in Voorbeeld I, in 20 ml water werd gechromatografeerd met een stroomsnelheid van 1 cm3/roin. De frakties werden geanalyseerd, verzameld en ge-5 lyofiliseerd. Hierbij werd 0,65 g polymeer geïsoleerd.

VOORBEELD IV

Poly-e-D-lysinehydrobromide

Uitgaande van 10 g N-a-benzyloxycarbonyl-N-c-tert. butyloxycarbonyl-D-lysine-p-nitrofenylester wordt behandeld 10 als beschreven in Voorbeeld I. Op deze wijze werd 1,3 g polymeer verkregen.

MW = 8900? [a]25 = -47,08° (c = 0,92; water).

VOORBEELD V

Poly-ó-L-ornithine 15 Volgens de werkwijze beschreven in Voorbeeld I, werd uitgaande van 10 g N-a-benzyloxycarbonyl-(N-o-tert.-butyloxycarbonil)-L-ornithine-p-nitrofenylester, 7,9 g N-a-benzyloxycarbonyl-L-omithine-p-nitrofenylesterhydro-chloride verkregen. Smeltpunt: 87-90°C. Dit zout werd op de 20 wijze als beschreven in stap lb) gekoppeld met N-a-benzyl-oxycarbonyl- (N-<5 -tert. butyloxycarbonyl) -L-ornithine tot N-a-Z-N-ê-fN'-a-z-N'-S-tert.butyloxycarbonyl-L-ornithyl)-L-ornithine-p-nitrofenylesterdipeptide (12,1 g); smeltpunt: 133-136°C. De stap la) herhalend werd Ν-α-Ζ-Ν-c-(N'-a-Z-L-25 ornithyl)-L-ornithine-p-nitrofenylesterhydrochloride bereid uit het dipeptide (11,99 g; smeltpunt: 115-119"C), waaruit het N-δ-BOC-tri(N-a-z-L-ornithine)-p-nitrofenylester (14,8 g, smeltpunt: 150-153°C) werd verkregen door koppeling volgens de methode van stap lb). Het tri(N-a-z-L-ornithine)-p-nitro-30 fenylesterzout werd bereid volgens de methode van stap le), smeltpunt: 115-130°C. Van dit produkt werd 22 g gepolyconden-seerd als in stap lf), resulterend in 15,4 g 6-poly-N-a-ben-zyloxycarbonyl-L-ornithine (87,6%). Van dit produkt werd 13,1 g (93%) poly-ó-l-ornithine-hydrobromide geïsoleerd met de 35 methode van stap lg).

VOORBEELD VI

Poly-6-D-ornithinehydrobromide

Onder toepassing van de methode als beschreven in .8802604 - 32 -

Voorbeeld V en uitgaande van 1 g N-a-benzyloxycarbonyl-N-ö-tert.butyloxycarbonyl)-D-ornithine-p-nitrofenylester, werd 1,2 g (89%)poly-<5-D-ornithinehydrobromide verkregen.

VOORBEELD VII

5 Poly-Y-L-(a,γ-diaminoboterzuur)

Volgens de werkwijze aangegeven in Voorbeeld I werd 6,9 g N-a-benzyloxycarbonyl-L-a,γ-diaminoboterzuur-p-nitrofe-nylesterhydrochloride verkregen van 9,8 g N-a-benzyloxycarbo-nyl-N-ε-tert.butyloxycarbonyl-L-α,γ-diaminoboterzuur 10 p-nitrofenylester, smeltpunt: 67-70'C. Dit zout werd gekoppeld met N-a-benzyloxycarbonyl-N-Y-tert.-butyloxycarbonyl-L-a,γ-diaminoboterzuur met de methode van stap lb) tot N-a-ZjN-Y-iN'-a-z-N'-Y-tert.butyloxycarbonyl-a, γ-diamino)-boterzuur-p-nitrofenylesterdipeptide (10,8 g, smeltpunt: 15 125-127°C). Herhaling van de werkwijze la) verschafte de synthese van 10,35 g N-a-z-N-Y-(N'-a-z-L-a,γ-diaminobutyryl)-L-α,γ-diaminoboterzuur-nitrofenylesterhydrochloride uit het dipeptide, smeltpunt: 108-112°C. Uit dit zout werd 13,7 g Ν-γ--BOC-tri.(N-a-Z-L-a,γ-diaminoboterzuur)-p-nitrofenylester 20 verkregen door koppeling met de methode van stap lb), smeltpunt: 143-145°C. Uit dit produkt werd 10,5 g tri(N--Z-L-a,γ-diaminoboterzuur)-p-nitrofenylesterzout bereid met de methode van stap le), smeltpunt: 105-110°C. Dit produkt werd gepolycondenseerd in dimethylsulfoxide gevolgd door de 25 procedure van stap lf) waarbij ontstond 7,8 g (86,5 %) póly--N-a-benzyloxycarbonyl-L-a,γ-diaminoboterzuur. Het beschermde polymeer werd behandeld met de methode beschreven in stap lg); er werd 6,2 g (90,5 %) poly-γ-Ε-α,γ-diaminoboter-zuurhydrobromide verkregen.

30 VOORBEELD VIII

Poly-3-L-(a,β-diaminopropionzuur)

Onder gebruikmaking van de werkwijze beschreven in voorbeeld 1 werd 7,1 g N-a-benzyloxycarbonyl-L-a,β-diaminopropionzuur p-nitrofenylesterhydrochloride verkregen uit 9,6 35 g N-a-benzyloxycarbonyl-N-3-tert.-butyloxycarbonyl-L-a/β-diaminopropionzuur p-nitrofenylester, smeltpunt: 65-67eC. Dit zout werd gekoppeld met N-a-benzyloxycarbonyl-N-3-tert,-butyl-oxycarbonyl-L-a,β-diaminopropionzuur met de methode van stap v 8802604 - 33 - lb) tot 11,0 g N-a-Z-N-Y-fN'-a-z-N'-S-tert.butyloxycarbonyl)--a,β-diaminopropionyl)-α,β-diaminopropionzuur-p-nitrofenyl-esterdipeptide, smeltpunt: 119-122°C. Door herhaling van de procedure van stap la), werd 10,85 g Ν-α-Ζ-Ν-β-(Ν'-α-Ζ-Ι-α,β-5 -diaminobutyryl)-L-α,β-diaminopropionzuur-p-nitrofenylester-hydrochloride bereid uit het dipeptide. De opbrengst bedroef 10,85 g, smeltpunf: 102-105*C. Uit dit zout werd 12,6 g N-3--BOC-tri- (N-α -z-L-a, β -diaminopropionzuur) -p-nitrof enylester verkregen door koppeling volgens de methode van stap lb), 10 smeltpunt: 138 tot 140*C. Uit dit produkt werd 12,4 g tri(N-a--Z-L- α, β-diaminopropionzuur)-p-nitrofenylesterzout bereid met de methode van stap le), smeltpunt: 102-106eC. Door poly-condensering van dit produkt in dimehylsulfoxide volgens de procedure van stap lf), werd 8,7 g (90,2 %) poly-B-N-a-benzyl-15 oxycarbonyl-L-a,β-diaminopropionzuur verkregen. Het beschermde polymeer werd behandeld als beschreven in stap lg) en gaf 5,6 g (88,7 %) poly-β-L-α,3-diaminopropionzuurhydro-bromide.

VOORBEELD IX

20 Injectieoplossing

In 10 ml fysiologische NaCl-oplossing werd 500 mg poly-L-lysine.HBr opgelost. Deze injectieoplossing wordt steriel gefiltreerd. De doseringshoeveelheden van 1-100 mg/kg/dag hing af van de conditie van de patiënt.

25 VOORBEELD X

Tabletpreparaat

Tabletten worden gemaakt van de volgende componenten: 10 g polyiso-L-lysine.HCl 30 60 g lactose 16 g saccharose 20 g maïszetmeel 2 g magnesiumstearaat 2 g alginezuur 35 De bovengenoemde materialen worden gehomogeniseerd en uit het mengsel worden 100 tabletten geperst.

VOORBEELD XI

Werkwijze voor het verhogen van de weerstand van -8802604 - 34 - planten tegen virusinfectie Uit 5 g polyiso-L-lysine wordt een waterige oplossing bereid met 100 1 water. De pH van de oplossing wordt ingesteld op 7,0 tot 7,2 door middel van een NaOH-op-5 lossing, waarna 1 ml Tween 20 eraan wordt toegevoegd. Deze oplossing wordt uitgezet op de planten, die beschermd moeten worden in de toestand na het uitkomen voor een oppervlak van 1 ha.

.8802604

Claims (14)

1. Verbindingen met de algemene formule (1) van het formuleblad, waarin R4, R5, R6, R7 en R10 onafhankelijk van elkaar waterstofatomen of Ci_4-alkylgroepen zijn, R8 en R9 5 staan voor elk een waterstofatoom, r een geheel getal van 10 tot 400 is, m 0, l, 2 of 3 is en n 0 is.

2. Verbindingen met de algemene formule (1), waarin R4, R5, R6, R7 en R10 elk waterstofatomen zijn, r de waarde 10 tot 400 heeft, m 0, 1, 2 of 3 is en n 0 is en hun zouten, 10 racematen en optische isomeren.

3. Polyisolysine met een gemiddeld moleculair gewicht van 5500 tot 25.600.

4. Polyisornithine met een gemiddeld moleculair gewicht van 4400 tot 13.500.

5. Farmaceutische preparaten met antitumor en antiviraal effect, met het kenmerk, dat als actief middel een verbinding met de algemene formule (1), waarin R4, R5, R6, R7 en R10 staan voor waterstof, r een geheel getal is van 40 tot 200, m is 0, 1, 2, of 3 en n is 0 20 en de aminogroepen de L-configuratie hebben, gemengd met dragers en/of toevoegingen die gewoonlijk worden gebruikt in de farmaceutische industrie.

6. Farmaceutische preparaten volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het actieve middel een 25 polyisolysine is met een gemiddeld moleculair gewicht van 5500 tot 22.500.

7. Werkwijze voor de bereiding van polyisodiamino-carbonzuren met de algemene formule (1) waarin R4, R5, R6, R7, R8, R9 en R10 gelijk of verschillend zijn en kunnen staan 30 voor waterstofatoom of Ci-4-alkylgroepen, R een geheel getal is van 10 tot 400, m een geheel getal is van 0 tot 10 en n een geheel getal is van 0 tot 10, hun zouten, racematen en optische isomeren, door koppeling van de coressponderende monomeren en polycondensatie van de oligomeren die op deze 35 wijze worden verkregen, met het kenmerk, dat een monomeer of oligomeer met de algemene formule (2), als in het formuleblad, waarin q een geheel getal van 1 tot 9, R1 is een aminobeschermende groep en in de oligomeren alle R1 de- .8802604 - 36 - zelfde zijn, R3 een actieve voor carboxylgroepen beschermende estergroep is, geschikt voor bescherming en tegelijkertijd activering, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, m en n de boven aangegeven betekenissen hebben en in het geval van oligomeren de 5 substituenten dezelfde of verschillend kunnen zijn, wordt gekoppeld met een monomeer met de algemene formule (3) van het formuleblad waarin R2 een aminobeschermende groep is die verschilt van R1, welke selectief kan worden verwijderd van naast de R1-groep, x een carboxylactiverende groep is onder 10 voorbehoud dat de -COX-groep reactiver is dan de COOR3-groep, R1, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, m en n de betekenissen hebben als boven aangegeven - en de R2 beschermende groep wordt verwijderd van de verkregen verbinding met algemene formule (4) van het formuleblad, waarin de substituenten 15 dezelfde zijn als boven en s een geheel getal is van 2 tot 10 -, dan indien s kleiner of gelijk aan 9, de verkregen verbinding wordt omgezet met een monomeer met de algemene formule (3) of wordt gepolycondenseerd op bekende wijze en, indien gewenst, wanneer de verkregen verbinding met de 20 algemene formule (l) in de vrije-basevorm, wordt het getransformeerd in een zout, of indien het een zout is, wordt het getransformeerd in een base of een ander zout.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, voor het produceren van polyisodiaminocarbonzuren met de algemene 25 formule (1) - waarin de waarde van R4, R5, R6, R7, R10 en r is als aangegeven in conclusie 1, m is 3 en n is 0 - en hun zouten, met het kenmerk, dat een monomeer of oligomeer met de algemene formule (2) van het formuleblad, - waarin R1, R3, R4, R5, R6, R7, R10 en q zijn als aan-30 gegeven in conclusie 1, en m en n zijn als aangegeven hierboven - worden omgezet met een monomeer met de algemene formule (3) - waarin de betekenis van R1, R2, R4, R5, R6, R7, R10 en X is als aangegeven in conclusie 1 en m en n zijn als aangegeven hierboven - en van de verkregen verbinding met de 35 algemene formule (4) - waarin de substituenten zijn als aangegeven hierboven en de waarde van s is als aangegeven in conclusie 1 - de R2 beschermende groep wordt verwijderd en indien gewenst wanneer s kleiner of gelijk aan 9 het . 880260 4 - 37 - J verkregen produkt wordt omgezet met een monomeer van de algemene formule (3) of gepolycondenseerd wordt op een bekende wijze.

9. Werkwijze volgens conclusie 7, voor het 5 bereiden van polyisodiaminocarbonzuren met de algemene formule (1) - waarin de betekenis van R1, R3, R4, R5, R6, R7, R10 en g is als aangegeven in conclusie 1, en m en n zijn als aangegeven hierboven - en hun zouten, waarin een monomeer of een oligo- meer met de algemene formule (2) - waarin R1, R3,

10. Werkwijze volgens conclusie 7 voor het bereiden van polyiso-L-lysinen en hun zouten, met het kenmerk, dat N-a-z-L-lysine-p-nitrofenylesterhydrochloride 25 en Ν-α-ζ-Ν-ε-BOC-L-lysine, worden getransformeerd in een gemengd anhydride met isobutylchloorformiaat, en worden gebruikt als uitgangsmateriaal.

10 R4, R5, R6, R7, R10 en g dezelfde betekenis hebben als aangegeven in conclusie 1, en m en n de boven aangegeven betekenis hebben - worden omgezet met een monomeer met de algemene formule (3) - waarin R1, R2, R4, R5, R6, R7, R10 en x zijn als aangegeven in conclusie 1, en m en n zijn als 15 aangegeven hierboven -, dan uit de verkregen verbinding met de algemene formule (4) - waarin de substituenten zijn als aangegeven hierboven en s is als aangegeven in conclusie 1 -de R2-beschermende groep wordt verwijderd en, indien gewenst, het verkregen produkt wordt omgezet, wanneer s kleiner of 20 gelijk aan 9, met een verbinding met de algemene formule (3) of wordt gepolycondenseerd op bekende wijze.

11. Werkwijze volgens conclusie 7 voor het bereiden van polyiso-L-ornithines en hun zouten, met het ken- 30. e r k, dat N-a-z-L-ornithine-p-nitrofenylesterhydrochlo-ride en Ν-α-ζ-Ν-β-BOC-L-ornithine, getransformeerd in een gemengd anhydride met isobutylchloorformiaat, worden gebruikt als uitgangsmaterialen

12. Werkwijze volgens conclusie 7 voor het bereiden 35 van polyiso-D-lysinen en hun zouten, met het kenmerk, dat N-a-Z-D-lysine-p-nitrofenylesterhydrochloride en Ν-α-ζ-Ν-ε-BOC-D-lysine, getransformeerd in een gemengd anhydride met isobutylchloorformiaat, worden gebruikt als .8802604 - 38 - uitgangsmaterialen.

13. Werkwijze volgens conclusie 7, voor het bereiden van polyiso-D-ornithines en hun zouten, met het kenmerk, dat N- -Z-D-ornithine-p-nitrofenylesterhydro- 5 chloride en N- -Z-N- -BOC-D-ornithine, getransformeerd in een gemengd anhydride met isobutylchloorformiaat, worden gebruikt als uitgangsmaterialen.

14. Werkwijze voor de behandeling van kanker in zoogdieren, met het kenmerk, dat een farmaio ceutisch produkt, dat een verbinding als aangegeven in conclusie 1 als actief middel bevat, wordt gebruikt in een effectieve dosering. .8802664