NL8702728A - Werkwijze voor het bereiden van verbeterde mutantstammen van bordetella bronchiseptica die bruikbaar zijn voor levende verzwakte vaccins voor het geven van bescherming tegen b. bronchiseptica infecties en daaruit verkregen levende verzwakte ar vaccins. - Google Patents

Description

4 VO 9390

Werkwijze voor het bereiden van verbeterde mutantstammen van Bordetella bronchiseptica die bruikbaar zijn voor levende verzwakte vaccins voor het geven van bescherming tegen B. bronchiseptica infecties en daaruit verkregen levende verzwakte AR vaccins.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van verbeterde mutantstammen van Bordetella bronchiseptica met sterke immunogeniciteit en geringe virulentie, hetgeen voorkeur verdient voor de bereiding van 5 levende verzwakte B. bronchiseptica vaccins. De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op levende vaccins die uit B. bronchiseptica zijn bereid.

Bordetella bronchiseptica staat bekend als veroorzaker van ademhalingsziekten in verscheidene dieren zoals 10 varkens, honden, konijnen, cavia's en muizen. Infecties van de organismen in neonatale varkens veroorzaken atrofische rhinistis van varkens (verder aangeduid als AR) welke neus-schelpatrofie induceert en resulteert in groeivertraging en afname van de voedselverbruikverhouding. Dit vormt een 15 ernstig probleem voor de veeteelt. Een gedood AR vaccin is in de handel voor profylaxe van varkens AR, maar de effectiviteit van het vaccin is nogal beperkt. Onlangs is een levend verzwakt Ar vaccin ontwikkeld en beschreven door Shimizu et al. (Amerikaans octrooischrift 4.456.588).

20 Het is echter bekend dat de in het levende vaccin aanwezige organismen de eigenschap bezitten dat ze slechts bij 34-37°C kunnen groeien. Ook bestaan genoemde organismen uit een late kolonievorming op een vast medium en vertonen ze een slechte kolonisatie op de neusslijmvliezen van var-25 kens, en geen serumantilichaamproduktie bij inenting in varkens.

Na de toediening zijn ten minste 10-14 dagen nodig om een immunologisch effect van gedode AR vaccins te verkrijgen. Daarom bestaat reeds lang behoefte aan een vaccin 30 met een sterke immuniteit in een vroeg kinderstadium. In het algemeen is bekend dat B. bronchiseptica groeit bij 32 a 37°C ("Atrophic rhinitis of swine Bordetella infectious disease", Ed. M. Ogata, Buneido Pub. Co., 1979). Ook is 67 0 1 1 2 8

Ik -2- bekend dat pathogene bacteriën hun virulentie verliezen wanneer ze bij hoge temperaturen worden gekweekt.

Om mutantstammen van B. bronchiseptica voor de pro-duktie van een levend AR vaccin te verkrijgen, hebben wij 5 rekening gehouden met bovenstaande verschijnselen en de onderhavige uitvinding voltooid, welke uitvinding een werkwijze omvat voor het bereiden van verbeterde mutantstammen van B. bronchiseptica met sterke immuniteit en geringe virulentie, en een daaruit bereid levend verzwakt AR vaccin. 10 Doel van de uitvinding is om een werkwijze te ver schaffen voor de bereiding van verbeterde mutantstammen van B. bronchiseptica met sterke immunogeniciteit en geringe virulentie, hetgeen voor de bereiding van een levend verzwakt AR vaccin geprefereerd is.

15 Een ander doel van de onderhavige uitvinding is om mutantstammen van B. bronchiseptica te verschaffen met chromosomale genetische merkers waaronder bij voorkeur tempera-tuurgevoelige (gegroeid bij 42°C), nalidixine-zuurresistente en dermonecrotisch toxine (verder aangeduid als DNT)-produ-20 cerend vermogennegatieve (verder aangeduid als DNT-negatieve) merkers.

Een verder doel van de onderhavige uitvinding is om een werkwijze te verschaffen voor het bereiden van mutant-stammen van B. bronchiseptica, omvattende het onderwerpen van 25 een stam van B. bronchiseptica aan een geïnduceerde mutatie, het isoleren van een mutant met de genetische merkers van tenminste temperatuurgevoelig te zijn (gegroeid bij 42°C), nalidixinezuur-resistent en DNT-negatief te zijn, het kweken van de stam van B. bronchiseptica op Bordet-gengou (verder 30 aangeduid als BG) agar’plaat welke nalidixinezuur bevat bij 42°C, het daarna uitzoeken van een morfologisch op fase-I lijkend organisme, het herhalen van de procedures van kweken op de BG agarplaat en uitzoeken van fase-I organismen, en het omzetten van de organismen in DNT-negatieve fase-I orga-35 nismen met een compleet kapselantigeen.

E 7 G : 7 2 8 % -3-

Weer een ander doel van de onderhavige uitvinding is om een levend verzwakt AR vaccin te verschaffen dat fase-I B. bronchiseptica organisme omvat met tenminste genetische merkers van temperatuurgevoeligheid (gegroeid bij 42°C), 5 nalidixinezuur-resistentie en DNT-negatieve merkers.

Volgens de onderhavige uitvinding kunnen mutantstam-men van B. bronchiseptica worden verkregen door een uit de natuur geïsoleerde voorouder, een wilde of virulente stam van B. bronchiseptica te enten op een BG agarplaat die 10 200 yug/ml nalidixinezuur bevat, de plaat te kweken bij 42°C, de gegroeide kolonies uit te zoeken, subcultures van de uitgezóchte kolonies op dezelfde plaat te maken en de procedure van het uitzoeken van de kolonies en het maken van subcultures daarvan onder dezelfde condities te herhalen.

15 Wanneer in de bovenstaande procedure een goede groei wordt waargenomen op BG agarplaten die nalidixinezuur bevatten bij 42°C, kunnen de mutantstammen worden geselecteerd door het DNT-producerend vermogen van de op de plaat gegroeide kolonies te onderzoeken met behulp van een cavia-20 huidtest, de kolonies uit te zoeken die DNT-negatief blijken te zijn, hiervan subcultures te maken, en de bovenstaand beschreven procedure onder dezelfde condities te herhalen.

Voorbeelden van uitgangsstammen die in de onderhavige uitvinding kunnen worden gebruikt, zijn een wilde stam 25 van B. bronchiseptica zoals stam B-001, waarover hieronder meer of een laboratoriumcultuur zoals stam L3.

De stam B-001 wordt verkregen door kweken van een uit de neusholte van een door AR aangetast varken verzameld monster op een katoenprop, waarbij het monster wordt uitge-30 streken op een BG agarplaat en gedurende 2 dagen bij 37°C wordt gekweekt, en de aldus verkregen kolonies van B. bronchiseptica worden geselecteerd op basis van de hierboven beschreven eigenschappen.

De mutantstammen volgens de onderhavige uitvinding, 35 die de genetische merkers van temperatuurgevoeligheid (gegroeid bij 42°C), nalidixinezuur-resistentie, en negetieve .£/02728 * -4- t DNT bezitten, kunnen met conventionele methoden voor het induceren van mutaties worden verkregen. In het bijzonder kan men een stam B-001 enten op een BG agarplaat die 200 yag/ml nalidixinezuur bevat en gedurende 7 dagen bij 42°C 5 kweken. De op de agarplaat gegroeide kolonies, die morfologisch lijken op fase-I organisme, worden uitgezocht, geënt op een nieuwe BG agarplaat die nalidixinezuur bevat en gedurende 3-5 dagen bij 42°C gekweekt. Na herhaling van de procedure van het uitzoeken van de organismen, het kweken daar-10 van en het selecteren van de kolonies die DNT-negatief blijken te zijn met behulp van een cavia-huidtest, kunnen de mutantstammen worden geïsoleerd die DNT-negatief zijn en temperatuurgevoelig zijn (gegroeid bij 42°C). Een aldus verkregen stam is aangeduid als stam B-42 en wordt geprefe-15 reerd voor de produktie van een levend verzwakt AR vaccin voor profylaxe van B. bronchiseptica infecties in varkens.

Deze mutantstam B-42 van B. bronchiseptica werd gedeponeerd in het Fermentation Research Institute in de permanente cultuurverzameling onder het nummer FERM P-9038.

20 De genoemde stam bezit chromosomale genetische merkers met de eigenschappen van temperatuurgevoeligheid (gegroeid bij 42°C), nalidixinezuur-resistentie en negatieve DNT, en bovendien heeft de stam een voldoende hoeveelheid kapselantigeen hetgeen essentieel is voor een levend verzwakt AR vaccin, 25 alsmede een significant verlaagde virulentie en sterke immunogeniciteit.

De stam B-42 is derhalve bijzonder geschikt voor de produktie van een levend verzwakt AR vaccin voor het verhinderen van B. bronchiseptica infecties in varkens.

30 De in de onderhavige uitvinding gebruikte stam B-42 heeft de volgende specifieke kenmerken en eigenschappen.

De biologische eigenschappen van de stam B-42, de stam B-001 (de wilde stam verkregen uit een door varkens AR-aangetast varken), de stam L3 voor de produktie van een 35 gedood AR vaccin (voorraadcultuur), en de stam ATCC 4617 (voorraadcultuur) worden onderzocht volgens de methoden 57Q 2 7 2 8 -5- beschreven door Cowan et al. (Cowan, S.T. and Steel, K.J,: Manual for the Identification of Medical Bacteria, 2nd Ed., Cambridge Univ. Press. England, 1974) en de resultaten worden getoond in tabel A, waarin de stam B-42 dezelfde eigen-5 schappen heeft als de stam B-001, de stam L3 en de stam ATCC 4617, afgezien van zijn vermogen tot aanpassing aan hoge temperaturen en zijn hemolytische activiteit.

. t .· v ‘l i L 8 -6- 4-1 ΰ « Λ ^4-)+1111+ + + + ++ + ++ +Λ 11 υ « ϋ.

a« S Β +1 Ο) Λ 00 4-1+1 ΙΙΙ+ + + + ++ + ++ + Λ ιι J (ö +ι

Cn w <ΰ S3 7^ cn ö •Η --—-—--- 8 Μ 2 0 3 > Επ +1 _ cn . φ Λ α) ^ *Η 2 4-1+1 I I Ι+ + + + ++ + ++ +~ t 1 Ö ? <d +!. ο is- 2 s * ^ <υ

Hi S

PQ

s a +1 w (D * ^ ‘4j+i I I 1+ + + + ++ + I— ++ ++¾ I (0 +1 p CQ tT> ·~- φ 01 a 0) 4-1

A

-------—- U

0)

4J H

CO to φ Λ +i +) o ns --

co > A

&l + + CD

C Λ (d id Λ 0) -H u (d id

-Η μ PQ Η Η M CD

4J Φ Oh Λ 0« 3 to φ φ φ φ Η Φ M MS >i

4-) -H 4-) Μ -Η ·γ4 >i ·Μ Φ cd cd N ·η H

C4JC0 -Η 4-1 Φ 4-1 X4-1C0 Cn tn Φ -H O

ζ φλ!φ sücoü oum cd id β λ u U E

W t7)4->gS+> M 3 >i 3 Λ 3 O I U U I ·Η o o Φ Οι C-HMO'Ö Λ d H d M'O+JdP Ü o o Ü X — f- CN +3

dl -ΗΦΦΟΟ φ φ O CD ld φ'-'Ο# BMM

< M4JCHS40 ij) Μ Μ M üMCNiri rn rp Ό g Φ ® S-H Oii-I Ό 4-1 Φ Φ Φ Oj 04·Η -- +3

O Φ Η φ 4J + +>i<UcqOcocq O O <—i Cn M

cn ΗΗΦΗΗΙ0Π3ΐΰΧ!ΐ0ΦΦ(ΰ>ι CddL cd Z ^•HOO^i)|il(dÊid'tJt!riH *H *H 3 ?

W S+UOfS+MMSO -HcdO Φ Φ O N

O cd M 3 U 4-> ·Ρ+>Φ>ι2μ+£ O ΟΦΟ

Η ΜΟΗβΦΡΜ-Η-ΗΜΧϋίΜΦΦ U M -jj CN C

W 0S!ÜH2>02i30!iiiJWK O O Ό w Ό - -·" f, .. v, . ^ * -ία) Biologische eigenschappen; a) Temperatuurgevoeligheid:

De stam B-42 (mutantstam) vertoont een maximale groei gedurende 2-3 dagen bij 37°C en gedurende 4-5 dagen bij 42°C, 5 terwijl de stammen B-001, L3 en ATCC 4617 (virulente stammen) een maximale groei gedurende 2 dagen bij 37°C vertonen, terwijl maar zeer kleine kolonies (met een diameter kleiner dan 1 mm) worden gevormd gedurende 7 dagen bij 42°C. De groeitoe-stand bij 42°C kan als merker worden gebruikt voor het onder-10 scheiden tussen de mutantstam B-42 van wilde en voorraad-stammen.

b) Hemolyse:

De stam B-42 mist hemolytische activiteit op erythro-cyten van paarden of heeft een zwakke hemolytische activiteit 15 afhankelijk van de erothrocytenconcentratie die in de BG agar-plaat aanwezig is. Anderzijds vertonen de stammen B-001, L3 en ATCC 4617 een sterke hemolytische activiteit, hetgeen gebruikt kan worden als merker voor het onderscheiden tussen de stam B-42 en wilde en voorraadstammen.

20 c) Nalidixinezuur-gevoeligheid:

De stam B-42 vertoont een goede groei op een BG agar-plaat die nalidixinezuur bevat bij 37°C en bij 42°C, terwijl B-001, L3 en ATCC 4617 stammen gevoelig zijn voor nalidixinezuur .

25 De minimale groei-belemmerende concentratie van nalidixinezuur tegen de stam B-42 ligt boven 200 yug/ml, en aangezien in het algemeen slechts zeer weinig wilde en voorraadstammen van B. bronchi septica resistent zijn tegen nalidixinezuur (zie de eerdergenoemde publikatie van Ogata), kan 30 nalidixinezuur-resistentie een goede merker zijn voor het onderscheiden van de mutantstam B-42 van wilde en voorraadstammen. Het kweken op BG agarplaten die nalidixinezuur bevatten en bij een temperatuur van 42°C, maakt de verschillen nog betrouwbaarder.

r: vn -8- d) Het vermogen tot DNT-produktie;

Fase-I organismen van B. bronchiseptica produceren DNT en DNT staat bekend als een virulente factor van dit organisme. Genoemd toxine heeft deel aan de neusschelp-5 atrofie in jonge varkens en in jonge muizen die met de bacteriën geïnfecteerd zijn. (M. Hanada, K. Shimoda, S. Tomita, Y. Nakase en Y. Nishiyama, Production of lesions similar to naturally occuring swine atrophic rhinitis by cell-free sonicated extract of Bordetella bronchiseptica of pig origin, 10 Jpn. Vet. J. Sci., 41 : 1 - 8, 1979). Daarom is een stam die het DNT-producerend vermogen mist, essentieel voor de bereiding van een levend verzwakt AR vaccin.

Het DNT-producerend vermogen van de mutantstam B-42 wordt vergeleken met die van de wilde stam B-001 en 15 de vaccinstam L3. Een bacteriële suspensie van elke stam 11 (5 x 10 cellen/ml) wordt gedurende 10 minuten aan geluids-trillingen van 10 KHz blootgesteld (Soniator, Ohtake Works, Tokyo, 15OW) in een koud waterbad waarna gedurende 60 minuten met 10.000 g wordt gecentrifugeerd, en vervolgens gefil-20 treerd door een 0,22 yam Millipore filter voor de bereiding van testmonsters. Twee-voudige serieverdunningen van de testmonsters worden met gedestilleerd water bereid. Hartley cavia's met een gewicht van ongeveer 300 g werden intrader-mal geïnjecteerd met 0,1 ml-porties van twee-voudige ver-25 dunningen. Monstertiters waren de reciproce van de hoogste verdunning die een positieve necrotische lesie vertoonde met een diameter van meer dan 5 mm, waargenomen 48 uur na de injectie. De resultaten worden getoond in tabel B.

TABEL B

30 Dermonecrotische activiteit

Stammen Dermonecrotische titer B-42 (mutant) < 2 B-001 (wild) 8,192 L3 (vaccin) 8,192 « c / · - f c -9-

Zoals getoond in tabel B mist stam B-42 volledig het vermogen tot DNT-produktie, welke eigenschap als zijnde stabiel werd bevestigd bij het maken van subcultures van de stam op BG agarplaten of bij meer dan 40 keer passeren door 5 muizen (tabel C).

TABEL C

Effect van passage op dermonecrotische titer van stam B-42

Dermonecrotische titer

Passage

Subculture op Passage 10 BG agarplaten door muizen

Oorspronkelijke stam <2 <2 10 passages <2 <2 20 passages <2 <2 30 passages <2 <2 15 40 passages <2 <2 e) Lethale toxiciteit voor muizen: B. bronchiseptica vertoont een sterke lethale toxiciteit voor muizen (zie het geciteerde artikel van

Ogata). De lethale toxiciteit van de stam B-42 voor muizen 20 wordt vergeleken met die van de vaccinstam L3.

Specifiek-pathogeenvrije (verder aangeduid als SPF) muizen (20 muizen per groep), met een leeftijd van 3 weken, werden intraperitoneaal ingeënt met de stam B-42 of de stam 5 10 L3 (1 x 10 tot 1 x 10 cellen/muis), en gedurende 1 week 25 geobserveerd. Bij dode muizen werd onmiddellijk na de dood autopsie uitgevoerd en werden macroscopisch hun longen bekeken en de ingeënte bacteriën uit longweefsels verzameld. Overlevende muizen werden 1 week na de inenting op een zachte wijze gedood, waarna hun longen werden bekeken en 30 de ingeënte bacteriën uit longweefsels werden verzameld.

. f. - ·: . ' t r -10-

Zoals in tabel D wordt getoond, mist de stam B-42 lethale toxiciteit voor muizen. Deze eigenschap verandert niet bij 40 passages van de stam B-42 door muizen vergeleken met die eigenschap van de oorspronkelijke stam.

5 Dit toont de stabiele aard van de stam B-42. Dode muizen vertonen sepsis en pneumotische lesies. In de overlevende muizen konden geen macroscopische veranderingen worden waargenomen, en de ingeënte bacteriën konden niet worden teruggevonden.

10 TABEL D

Lethale toxiciteit voor muizen

Aantal ingeënte bacteriën/muis Stam B-42 Stam L 3 1 x 1010 0 / 20* 20 / 20* 15 1 x 109 0 / 20 20 / 20 1 x 108 0 / 20 20 / 20 1 x 107 0/20 12 / 20 1 x 106 0 / 20 4 / 20 1 x 105 0 / 20 0 / 20 20 * Aantal dode muizen/aantal ingeënte muizen.

Het bovenstaand getoonde resultaat laat zien dat stam B-42 zeer veilig is als een levend AR vaccin.

(2) Serologische eigenschappen:

Anti-B-42, anti-L3 en anti-B-001 hyperimmuun konijne-25 sera of anti-B-42, anti-L3 en anti-B-001 hyperimmuun varkens sera, die bereid worden door sterke immunisatie van konijnen of varkens met fase-I organismen van stammen B-42, L3 en B-001, worden onderworpen aan een agglutinatietest waarbij een antigeen wordt gebruikt bestaande uit fase-I

. f. / C 2 ' 2 8 -11- organismen van de stam B-42, fase-I organismen van de stam B-001, fase-I organismen van de stam L3 en hun in de handel verkrijgbaar AR antigeen (het AR antigeen "Kitasato").

(Zie de geciteerde publikatie van Ogata).

5 Het resultaat wordt in tabel E getoond.

8*5 f' f v L· -12- G o o o o dj η· ^ h*

CN CN CN CN

M · · * *

HG O O O O

O > H H H rH

O I

PQ

E

<d .p G o o o o CO ·η oo oo 00 •H ·<3< "3* cs »3· G * * * * O o o o o

w CS CN CS CN

co G

PI Φ i G o o o o G g φ 'S' st* *3· ^31

0) Cd g ,¾ CNCNCNCN

•P G G ....

r—I cn G G o o o o

o Q) [> rHI i—iI rHI rHI

0 CL) CQ CO

I CP (G

pq o g

H GS

»0 G G

CS Ë i 4J

<3* o g co G o o o o 1 ,G -Η ·η oo oo oo co pq G ·Η Μ· "βΐ1 ^ <3* -P Φ G · · · - G Φ 0< O oooo

Φ g >1 w CS CS CS CS

1 ffi W E Ό G Ή G +J dl

W tfl G

CQ Φ *q G Λ G oooo

Eh G φ -3< *3* «3· > M cs cs cs cs G G . . . .

G G G O O O O

(1)φ CN> Η Η Η H

W *3*

0 G I

EG CQ

G G

Φ £ E

> £ G

φ -H -P G oooo •HG CO -n oo oo oo oo .p φ ·Η ^ ·3Ρ 'ü'

Ga G ....

G >. O o o o o

H jG 1*5 CS CS CS CS

-P

G G

H Φ-- tji Cr cn a) < +>

G

φ

E

m

•H

G

G

tji GO

G H Φ -P

0 CS O Φ G

G O tTi B)

φ Η I I co -H G

φ I PQ CQ PI -P -P

CT> φ g -h •H W e E E G «

•p G G G G I

G Cm -P -P -P (¾ rfj >— CO CO CO < C m' r·- t\ “? ft rt . ' ' i :: ' ^ 8 -13-

Zoals uit de bovenstaande resultaten duidelijk is, heeft stam B-42 dezelfde antigenisiteit als de stammen B-001 en L3. Verder is het agglutinatievermogen van stam B-42, na het maken van subcultures op BG agarplaten voor 40 passages, 5 niet gewijzigd vergeleken met het agglutinatievermogen van de oorspronkelijke stam. Het resultaat toont de stabiele aard van de stam B-42.

(3) Beschermingstest en veiligheidsonderzoek van levend verzwakt vaccin, bereid uit de stam B-42: 10 De beschermingswaarde van een levend AR vaccin, bereid uit de stam B-42 in muizen, wordt als volgt getest.

3 Weken oude SPF muizen worden verdeeld in een immunisatie- en een controlegroep.

De gedurende 3 dagen bij 37°C op een BG argarplaat 15 gekweekte stam B-42 wordt gesuspendeerd in een fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,0) om celsuspensies te bereiden zoals in tabel F is geïllustreerd. Hoeveelheden van telkens 0,1 ml van de celsuspensie worden intraperitoneaal in muizen ingeënt, met 30 muizen per groep. 3 Weken na de 20 inenting wordt 0,1 ml van een celsuspensie van fase-I organismen van stam L3 in een fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,0), die gedurende 2 dagen bij 37°C op een BG agar-plaat is gekweekt, intraperitoneaal als beproeving in muizen gebracht, en wel 20 muizen van elke groep die uit de immuun-25 en controlegroepen bestaat. De dieren worden gedurende 2 weken na de beproeving geobserveerd. Op dezelfde tijd als de beproeving worden 10 muizen van elke groep gedood en worden agglutinatietiters van sera gemeten onder toepassing van het AR-antigeen MKitasato".

30 De resultaten worden getoond in tabel F.

Zoals getoond in tabel F bleken in de geïmmuniseerde groepen die ingeënt waren met de stam B-42 met meer 7 dan 10 cellen/muis, alle dieren te overleven zonder klinische symptonen te vertonen, terwijl ook geen macroscopische 35 wijzigingen werden waargenomen bij autopsie, 2 weken na de 6 5 beproeving. In de groepen die met 10 resp. 10 cellen/muis C' ‘ r ·. : * ·* i -14- waren ingeënt, gingen 4 resp. 5 muizen na de beproeving dood, terwijl alle overige de beproeving overleefden. Voor de overlevende muizen was de test voor het terugvinden van de bacteriën negatief.

{ :* ' . t i -15- φ -Η CU Ö 3 Φ ε o c n <o i o σι

> φ iH

·Η <ü <· co co o o in in O Φ 4-> G ,¾ VD ιΗ Ί· ή

ΙΙΙΌ lil β)Η |£> CN

rl H C > (1) 54 Φ -H iH r4

4-> Ό 4-1 W G

ÜIO 3 Ih-h

g -HH II

o ε tp+j c

(D 1) CP-H Φ u N

0)

Η -P G

G rö CO CL) φ 4) (LI M _ „ M G 4-> -r4 O o O O O O o

•H (0 (L) G CM CM <N <N CM CM CN

G fö cn ε ^ - g \ \ N. \ X N ^

G

g r4(D ooooM*m o

H Φ Q) N M

Gfl'H 4-i (0 0 3 ra φ ό ε Φ 4-1 ω ra tji -Η G ra ^ •Η Ο ή ε ό ε _ οο G ra ΓΟ » 00 Φ tp J ή ο ο Λ G * «-· ^ ο ·η ε ° Μ ν.

{fl > Φ ^ Λ ” φ φ 4-1 G .

cq Ο ω φ 1-1 ί4 ή ra ο, G 1-i ·Η φ Φ Φ 3 μ > ο ε ra •Η ra Ο CM -Η ό χ4· ε ° ¢) I ι-t σ> οο γ— νο ιπ •HfflH Ο Ο Ο Ο Ο Ο 4J «. γΗ t-4 ιΗ ι-H γΗ τ—1

Pu QJ φ — XX X X X X 1

•Η 4-1 G

J G Μ φ γΗ ι—Ι f—I ι—1 ιΗ t—1 Η 3 1-1 Μ EQ 6 G '-Ι ·Η < g Φ Φ 3 η > ϋ ε Φ Ό Οι Η ® φ Ο φ 54 η £ .η ω ο ^

c 3 _ S

φ ε a ^ ν ε φ ·£

-Η «η ο S

3 Φ 54 ο s ο σ» ο r e' -- - . L ; V ,. , -· * -16-

De Agglutinatietiters stijgen in afhankelijkheid van de immunisatiedoses. In de controlegroep gingen alle 20 dieren dood door sepsis en werden grote aantallen beproe-vingsorganismen in verscheidene organen van alle muizen aan-5 getroffen.

Zoals bovenstaand geïllustreerd, vertoont de stam B-42 volgens de onderhavige uitvinding een superieure immuniteit tegen B. bronchiseptica infectie in muizen met hoge veiligheid.

10 De stam B-42 volgens de onderhavige uitvinding heeft specifieke chromosomale genetische merkers, en is superieur in immunogeniciteit en een hoge veiligheidswaarde, en· is daardoor bruikbaar voor de produktie van een levend verzwakt AR vaccin voor profylaxe van B. bronchiseptica infecties in 15 varkens.

Het levende verzwakte AR vaccin voor profylaxe van B. bronchiseptica infecties in varkens kan worden geproduceerd volgens conventionele methoden voor levende verzwakte vaccins onder toepassing van de stam B-42. In het bijzonder 20 kan stam B-42, bij 37°C gekweekt op een BG agarplaat, worden geënt in een vloeibaar medium voor vaccin-produktie en bij 37°C worden gekweekt.

De gekweekte cellen worden door centrifugeren verzameld, gemengd met een gebruikelijk, tegen drogen bescher-25 mend middel zoals 10% taptemelk en 5% pepton (celsuspen- sie : beschermingsmiddel =1:1 v/v) en worden verdeeld in flesjes en worden gelyofiliseerd teneinde een levend vaccin-preparaat te produceren. Het produkt wordt bij gebruik opgelost in een bijgevoegd verdunningsmiddel en de oplossing 30 wordt via de nasale weg of via intramusculaire injectie in dieren toegediend.

De onderhavige uitvinding wordt aan de hand van de volgende voorbeelden nader toegelicht. De voorbeelden dienen niet als beperkend te worden uitgelegd.

. Ê f v' : : : : 35 -17-

VOORBEELD I

De bereiding van de mutantstam:

De Bordetella bronchiseptica stam B-001, geënt op een BG agarplaat die 200 yug/ml nalidixinezuur bevat, werd 5 bij 42°C gekweekt, de op de plaat gegroeide kolonies werden geselecteerd, en daarvan werden subcultures op dezelfde plaat gemaakt. Deze procedure werd onder dezelfde condities herhaald. DNT-negatieve organismen werden gekozen op basis van een cavia-huidtest waarbij een mutantstam werd verkre-10 gen, aangeduid als de stam B-42, onder de fase-I-achtige kolonies met het vermogen om bij 42°C te groeien.

VOORBEELD II

In de methode volgens voorbeeld I werd de stam B-001 vervangen door wilde stammen waarbij mutantstammen van 15 B. bronchiseptica werden verkregen waarmee een levend verzwakt AR vaccin kon worden bereid.

VOORBEELD III

De volgens voorbeeld I bereide stam B-42 werd ge-ent op een BG agarplaat en gedurende 2 dagen bij 37°C ge-20 kweekt. Deze entcultuur werd in een vloeibaar medium geënt, bij 37°C gekweekt, de gekweekte cellen werden verzameld en gesuspendeerd in een gesteriliseerde fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,0) voor het bereiden van een bacteriesuspen-10 sie (4,0 x 10 cellen/ml). De celsuspensie werd goed ge-25 mengd met een gelijke hoeveelheid van een tegen drogen beschermend middel (een mengsel van 10% taptemelk en 5% pep-tonoplossing, die gedurende 10 minuten bij 110°C werd gesteriliseerd) voor het bereiden van een massa eindprodukt. Porties van elk 2 ml daarvan werden verdeeld in flesjes, 30 gelyofiliseerd en onder vacuümomstandigheden gesloten waarbij een droog levend vaccinprodukt werd verkregen. Wanneer het produkt onder donkere en gekoelde omstandigheden bij 2-5°C werd bewaard, bleven de eigenschappen daarvan zeer stabiel behouden. Het produkt kan gemakkelijk worden opge-35 lost in een steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,0) en vertoont dan homogene eigenschappen. Wanneer het . t ‘ - - * -18- produkt wordt opgelost in 20 ml drager, bevat de oplossing levende bacteriën met een levensvatbaarheidstelling van 1 x 10** cellen/ml.

De volgende testvoorbeelden illustreren het effect van 5 het levende verzwakte AR vaccin volgens de onderhavige uitvinding.

Test Voorbeeld I

Een veiligheidsonderzoek van stam B-42, verkregen in voorbeeld I, werd uitgevoerd onder toepassing van SPF var-10 kens die verdeeld waren in drie groepen, waarbij in twee groepen het levende verzwakte AR vaccin (telkens 1,0 ml) intranasaal werd toegediend in een hoeveelheid van 1 x 10^®

O

cellen resp. 1 x 10 cellen, en in een andere controlegroep geen bacteriën werden toegediend (elke groep bestond uit 15 2 dieren). Na 15 dagen na de inenting werd op alle dieren autopsie uitgevoerd. Tijdens de observeringsperiode werden in geen van de dieren abnormale klinische tekenen waargenomen, en ook werden in verscheidene organen van deze dieren geen abnormale symptomen macroscopisch en histologisch waar-20 genomen. De conclusie was dat stam B-42 voor varkens niet toxisch is.

Test Voorbeeld II

Een levend AR vaccin werd opgelost in een steriele fos-faat-gebufferde zoutoplossing (pH 7,0) en verder verdund met 25 dezelfde oplossing in een tienvoudige verdunningsreeks.

De immunogeniciteit van het vaccin in een concentratie van 4 6 8 10 cellen/ml, 10 cellen/ml en 10 cellen/ml werd getest onder toepassing van SPF varkens.

Twaalf SPF neonatale varkens, met een leeftijd van 30 3 dagen, die negatief waren voor antilichamen tegen B. bron- chiseptica, werden verdeeld in vier groepen (3 geïmmuniseerde groepen en 1 controlegroep), met 3 dieren per groep, waarbij in drie groepen het vaccin (telkens 1 ml per dier) intranasaal werd toegediend en in een andere groep geen vac-35 cin werd toegediend. Drie weken na de inenting werden alle dieren beproefd met de B. bronchiseptica stam L3 (virulente t ;. · : .. ·..

7 » -19- stam), 1 x 10 cellen/ml/varken via de nasale route. Tien weken na de beproeving werden alle dieren aan autopsie onderworpen.

Tijdens de proefperiode vertoonden geen van de dieren 5 van de gevaccineerde groepen abnormale klinische symptomen, en waren de neusschelpbotten van alle dieren normaal, behalve dat twee varkens van een groep die geïmmuniseerd was met 4 1 x 10 cellen/varken, een lichte neusschelpatrofie vertoonden. In de niet-gevaccineerde controlegroep vertoonden alle 10 dieren klinische symptomen zoals ooguitslag en niezen, en werd ook vertraging in groei waargenomen. Ernstige neusschelpatrofie werd in alle dieren waargenomen bij autopsie. Aldus werd bevestigd dat het vaccin een effectieve bescherming verleent in varkens tegen B. bronchiseptica.

15 Test Voorbeeld III

De stam B-42 werd getest onder toepassing van SPF varkens, negatief voor antilichamen tegen B. bronchiseptica, teneinde vast te stellen of de virulentie terugkeerde.

SPF neonatale varkens met een leeftijd van 3 dagen werden 20 intranasale ingeënt met het levende AR vaccin (1 ml/varken, 1 x 1010 cellen/ml). Na ëên week observatie, werden de neusholten van de varkens geveegd met steriele katoenproppen die ondergedompeld waren in 1,5 ml van een steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing, teneinde een suspensie van weg-25 geveegde bacteriën te bereiden. Eén milliliter van de suspensie werd ingeënt in de andere twee neonatale varkens, en een portie van 0,5 ml werd gebruikt om de taxonomische bevindingen van microben en celaantaltellingen te controleren.

De procedure werd drie keer herhaald (in elke procedure 30 werden 2 varkens gebruikt).

Tijdens de observatie werden geen abnormale klinische symptomen gevonden en bij autopsie werden eveneens geen abnormale toestanden waargenomen. De ingeente bacteriën bleken in de neusholten goed te groeien.

35 Zoals door bovenstaand beschreven proef is aangetoond, bleek de stam B-42 geen terugkering naar virulente microben f "· t r -

. t . V. L

-20- te vertonen, en konden zijn stabiele eigenschappen worden bevestigd.

[. 7 " ‘ - - t Vp i· ' * « - . ^

Claims (7)

1. Werkwijze voor het bereiden van mutantstammen van B. bronchiseptica met chromosomale genetische merkers welke tenminste temperatuurgevoelige (gegroeid bij 42°C), nali-dixinezuur-resistente en warmte-labiel dermonecrotisch 5 toxine-producerend vermogennegatieve merkers dragen welke geprefereerd zijn voor de bereiding van levende verzwakte AR vaccins, omvattende het onderwerpen van een stam van B. bronchiseptica aan een geïnduceerde mutatie, het isoleren van een mutant met de genetische merkers van tenminste 10 temperatuurgevoelig te zijn (gegroeid bij 42°C), nalidixine-zuur-resistent te zijn en warmte-labiel dermonecrotisch toxine-negatief te zijn, het kweken van de stam van B. bronchiseptica op een Bordet-gengou agarplaat die nalidixinezuur bevat bij 42 °C, het daarna uitzoeken van een morfologisch 15 op fase-I lijkend organisme, het herhalen van de procedures van kweken op de Bordet-gengou agarplaat en uitzoeken van fase-I organismen, en het omzetten van de organismen in warmte-labiel dermonecrotisch toxine-producerend vermogennegatieve fase-I organismen met een compleet kapselantigeen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de geïnduceerde mutatie een combinatie van een hoge temperatuurbehandeling bij 42°C en een behandeling met nalidixinezuur omvat.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de bewerkingen van het kweken op een Bordet-gengou agarplaat die nalidixine- 25 zuur bevat en van het uitzoeken van een kolonie die op een fase-I organisme lijkt, meerdere malen worden herhaald.

4. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin de uitgangsstam van B. bronchiseptica temperatuurgevoelig (gegroeid bij 42*C), nalidixinezuur-resistent en warmte-labiel dermonecrotisch 30 toxine-producerend vermogennegatief is.

5. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin een voorouderstam van B. bronchiseptica een wilde stam is, geïsoleerd uit de neusholte van varkens die met B. bronchiseptica zijn besmet. . 6: . * - 22-

6. Levend verzwakt AR vaccin voor profylaxe van B. bron-chiseptica infecties, omvattende B. bronchiseptica fase-I organismen van de stam B-42 met chromosomale genetische merkers van temperatuurgevoelig (gegroeid bij 42°C), nali- 5 dixinezuur-resistent en warmte-labiel dermonecrotisch toxine-negatief zijn.

7. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin het levende verzwakte AR vaccin aan de dieren wordt toegediend via de nasale route of via intramusculaire injectie. . 87 ; . ' i: ‘