JP2537042B2 - ボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワクチン用原株の製造法および生菌ワクチン - Google Patents
ボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワクチン用原株の製造法および生菌ワクチンInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、高い免疫原性を有し、かつ安全性の優れた
ボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワクチンの製
造に適した性質を有するボルデテラ・ブロンキセプチカ
感染症生菌ワクチン用原株Ｉ相菌の製造法ならびにその
生菌ワクチンにかんする。
ボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワクチンの製
造に適した性質を有するボルデテラ・ブロンキセプチカ
感染症生菌ワクチン用原株Ｉ相菌の製造法ならびにその
生菌ワクチンにかんする。
ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Bordetella bronchi
septica）は、豚、犬、兎、モルモット、マウス等の各
種動物に感染して呼吸器疾患を惹起することが知られて
いる。とくに、豚の幼令期において本菌が感染した場
合、豚萎縮性鼻炎（atrophic rhinitis、以下ARと称す
る）と呼ばれる鼻甲介骨の萎縮を来たし、発育の遅延や
飼料効率の低下などをもたらすため、畜産経営上大きな
問題をもたらすことが知られている。本感染症を予防す
るために、豚AR死菌ワクチンがすでに市販され、ある程
度の効果をあげている。なお、ボルデテラ・ブロンキセ
プチカ感染症生菌ワクチンは、清水らによって報告され
ているが、本生菌ワクチンは、34℃以上では増殖しない
こと、豚の鼻粘膜の定着性が弱いこと、および抗体産生
が良好でないことが知られている。
septica）は、豚、犬、兎、モルモット、マウス等の各
種動物に感染して呼吸器疾患を惹起することが知られて
いる。とくに、豚の幼令期において本菌が感染した場
合、豚萎縮性鼻炎（atrophic rhinitis、以下ARと称す
る）と呼ばれる鼻甲介骨の萎縮を来たし、発育の遅延や
飼料効率の低下などをもたらすため、畜産経営上大きな
問題をもたらすことが知られている。本感染症を予防す
るために、豚AR死菌ワクチンがすでに市販され、ある程
度の効果をあげている。なお、ボルデテラ・ブロンキセ
プチカ感染症生菌ワクチンは、清水らによって報告され
ているが、本生菌ワクチンは、34℃以上では増殖しない
こと、豚の鼻粘膜の定着性が弱いこと、および抗体産生
が良好でないことが知られている。
しかしながら、本死菌ワクチンの免疫効果が発現する
ためには、少なくとも注射後10〜14日を要するため、生
後早期においての感染防御効果のさらに高いワクチンの
開発が待望されていた。そこで、本発明者らはボルデテ
ラ・ブロンキセプチカ感染症に対する生菌ワクチンを製
造する基となる原株を得るめに、ボルデテラ・ブロンキ
セプチカが通常32〜37℃で発育することが知られている
こと（尾形学監修：豚の萎縮性鼻膜−ボルデテラ感染症
−文永堂、1979）、病原菌の病原性を除く一方法として
高温で培養することが知られていることに着目し、鋭意
追求の結果、高い免疫病原性を有し、かつ病原性を欠く
ボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワクチン原株
の製造法を見出し、本発明を完成したものである。
ためには、少なくとも注射後10〜14日を要するため、生
後早期においての感染防御効果のさらに高いワクチンの
開発が待望されていた。そこで、本発明者らはボルデテ
ラ・ブロンキセプチカ感染症に対する生菌ワクチンを製
造する基となる原株を得るめに、ボルデテラ・ブロンキ
セプチカが通常32〜37℃で発育することが知られている
こと（尾形学監修：豚の萎縮性鼻膜−ボルデテラ感染症
−文永堂、1979）、病原菌の病原性を除く一方法として
高温で培養することが知られていることに着目し、鋭意
追求の結果、高い免疫病原性を有し、かつ病原性を欠く
ボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワクチン原株
の製造法を見出し、本発明を完成したものである。
すなわち、本発明はボルデテラ・ブロンキセプチカ菌
株に変異誘起方法を適用して、少なくとも温度感受性
（42℃で発育する）、ナリジクス酸耐性、および易熱性
毒素（heat−labile dermonecrotic toxin,以下DNTと称
する）産生能陰性の遺伝標識を有する変異株を分離し、
次いでこれをナリジクス酸含有ホーデット・ジャング寒
天培地にて42℃で培養して形態学的にＩ相菌に類似する
ものを釣菌し、このナリジクス酸含有ボーデット・ジャ
ング（Bordet−gengou,以下BGと称する）寒天培地に培
養およびＩ相菌の釣菌の操作を繰り返すことにより、莢
膜抗原を完備した易熱性毒素産生能陰性のＩ相菌に導く
ことを特徴とする、少なくとも温度感受性、ナリジクス
酸耐性、および易熱性毒素産生能陰性の染色体性遺伝標
識を兼備したボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌
ワクチン用原株の製造法を提供するにある。
株に変異誘起方法を適用して、少なくとも温度感受性
（42℃で発育する）、ナリジクス酸耐性、および易熱性
毒素（heat−labile dermonecrotic toxin,以下DNTと称
する）産生能陰性の遺伝標識を有する変異株を分離し、
次いでこれをナリジクス酸含有ホーデット・ジャング寒
天培地にて42℃で培養して形態学的にＩ相菌に類似する
ものを釣菌し、このナリジクス酸含有ボーデット・ジャ
ング（Bordet−gengou,以下BGと称する）寒天培地に培
養およびＩ相菌の釣菌の操作を繰り返すことにより、莢
膜抗原を完備した易熱性毒素産生能陰性のＩ相菌に導く
ことを特徴とする、少なくとも温度感受性、ナリジクス
酸耐性、および易熱性毒素産生能陰性の染色体性遺伝標
識を兼備したボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌
ワクチン用原株の製造法を提供するにある。
更に本発明は、少なくとも温度感受性（42℃で発育す
る）、ナリジクス酸耐性、および易熱性毒素産生能陰性
の染色体性遺伝標識を兼備したボルデテラ・ブロンキセ
プチカＢ−42株Ｉ相菌からなるボルデテラ・ブロンキセ
プチカ感染症生菌ワクチンを提供するにある。
る）、ナリジクス酸耐性、および易熱性毒素産生能陰性
の染色体性遺伝標識を兼備したボルデテラ・ブロンキセ
プチカＢ−42株Ｉ相菌からなるボルデテラ・ブロンキセ
プチカ感染症生菌ワクチンを提供するにある。
本発明によるボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生
菌ワクチン原株の製造方法は、出発菌株のボルデテラ・
ブロンキセプチカを1ml当たり200μｇの割合にナリジク
ス酸を加えて調製したBG寒天培地上に塗抹後、本培地を
42℃で培養し、その発育集落を釣菌して上記の条件下で
継代を重ねることにより得られる。
菌ワクチン原株の製造方法は、出発菌株のボルデテラ・
ブロンキセプチカを1ml当たり200μｇの割合にナリジク
ス酸を加えて調製したBG寒天培地上に塗抹後、本培地を
42℃で培養し、その発育集落を釣菌して上記の条件下で
継代を重ねることにより得られる。
上記の方法においては、ナリジクス酸含有BG寒天培地
上で42℃で良好な発育が得られるようになった時点で、
本培地に発育した集落のDNT産生能をモルモットの皮内
反応で検査し、DNT産生能が陰性である集落を釣菌し、
上記条件下で継代を重ねることにより、DNT産生能陰
性、ナリジクス酸耐性で、かつ高温順化能（42℃で発育
する）を有する温度感受性変異株が選出される。
上で42℃で良好な発育が得られるようになった時点で、
本培地に発育した集落のDNT産生能をモルモットの皮内
反応で検査し、DNT産生能が陰性である集落を釣菌し、
上記条件下で継代を重ねることにより、DNT産生能陰
性、ナリジクス酸耐性で、かつ高温順化能（42℃で発育
する）を有する温度感受性変異株が選出される。
本発明の方法で用いられる出発菌株としては、ボルデ
テラ・ブロンキセプチカの野外株たとえば後で説明する
Ｂ−001株あるいは実験室内の保存菌株であるL3株等が
あげられる。
テラ・ブロンキセプチカの野外株たとえば後で説明する
Ｂ−001株あるいは実験室内の保存菌株であるL3株等が
あげられる。
Ｂ−001株は、AR罹患豚の鼻腔内から滅菌綿棒で鼻汁
を採取し、これをBG寒天培地上に塗抹後、37℃で２日間
培養し、得られた細菌集落についてボルデテラ・ブロン
キセプチカの性状検査を実施して得た菌株である。
を採取し、これをBG寒天培地上に塗抹後、37℃で２日間
培養し、得られた細菌集落についてボルデテラ・ブロン
キセプチカの性状検査を実施して得た菌株である。
上記出発菌株を変異株誘起方法を適用して、少なくと
も温度感受性（42℃で発育する）、ナリジクス酸耐性、
およびDNT産生能陰性の遺伝標識を有する変異菌株を分
離するには、先ずＢ−001株を1ml当たり200μｇの割合
にナリジクス酸を加えて調製したBG寒天培地に塗抹し、
42℃で７日間培養する。本培地上に発育した集落のう
ち、形態学的にＩ相菌に類似する集落を釣菌し、これを
上記ナリジクス酸添加BG寒天培地上に塗抹して42℃で72
〜120時間培養し、その発育集落について継代を繰り返
した後、各集落のDNT産生能をモルモットの皮内反応で
検査し、DNT産生能が陰性で、かつ42℃で発育する温度
感受性変異株を分離することにより得られる。
も温度感受性（42℃で発育する）、ナリジクス酸耐性、
およびDNT産生能陰性の遺伝標識を有する変異菌株を分
離するには、先ずＢ−001株を1ml当たり200μｇの割合
にナリジクス酸を加えて調製したBG寒天培地に塗抹し、
42℃で７日間培養する。本培地上に発育した集落のう
ち、形態学的にＩ相菌に類似する集落を釣菌し、これを
上記ナリジクス酸添加BG寒天培地上に塗抹して42℃で72
〜120時間培養し、その発育集落について継代を繰り返
した後、各集落のDNT産生能をモルモットの皮内反応で
検査し、DNT産生能が陰性で、かつ42℃で発育する温度
感受性変異株を分離することにより得られる。
さらにこの分離菌を上記条件下で培養し、釣菌、培養
する操作を繰り返すことにより、ボルデテラ・ブロンキ
セプチカ感染症生菌ワクチン製造用に適したＢ−42株と
命名された菌株を得ることができる。このようにして得
られる（Bordetella bronchiseptica）Ｂ−42株Ｉ相菌
（微工研菌寄第9038号、FERM Ｐ−9038）は、後記の通
り、温度感受性、ナリジクス酸耐性、およびDNT産生能
陰性等の染色体性遺伝標識を備え、しかも生菌ワクチン
原株として必須な莢膜抗原を完備し、安全で、かつ高い
免疫原性を有するため、ボルデテラ・ブロンキセプチカ
感染症生菌ワクチンの製造に適している。
する操作を繰り返すことにより、ボルデテラ・ブロンキ
セプチカ感染症生菌ワクチン製造用に適したＢ−42株と
命名された菌株を得ることができる。このようにして得
られる（Bordetella bronchiseptica）Ｂ−42株Ｉ相菌
（微工研菌寄第9038号、FERM Ｐ−9038）は、後記の通
り、温度感受性、ナリジクス酸耐性、およびDNT産生能
陰性等の染色体性遺伝標識を備え、しかも生菌ワクチン
原株として必須な莢膜抗原を完備し、安全で、かつ高い
免疫原性を有するため、ボルデテラ・ブロンキセプチカ
感染症生菌ワクチンの製造に適している。
本発明で得られるＢ−42株Ｉ相菌は、次のような種々
の特徴あるいは性状を有する。
の特徴あるいは性状を有する。
Ｂ−42株と豚AR由来のＢ−001株、AR不活化ワクチン
製造用菌株であるL3株、およびATCC4617株との生物学的
性状をCowanらの方法（Cowan,S.T.,and Steel,K.J.:Man
ual for the identification of medical bacteria、2n
d et、Cambridge Univ.Press、England、1974）に基づ
き検査したところ、その成績は第１表に示す通りであ
り、Ｂ−42株の性状は高温順化能および溶血性の点を除
いては野性株（Ｂ−001株）、およびワクチン株（L3
株）、およびATCC4617株の性状と同一であった。
製造用菌株であるL3株、およびATCC4617株との生物学的
性状をCowanらの方法（Cowan,S.T.,and Steel,K.J.:Man
ual for the identification of medical bacteria、2n
d et、Cambridge Univ.Press、England、1974）に基づ
き検査したところ、その成績は第１表に示す通りであ
り、Ｂ−42株の性状は高温順化能および溶血性の点を除
いては野性株（Ｂ−001株）、およびワクチン株（L3
株）、およびATCC4617株の性状と同一であった。
（１）生物学的性状 温度感受性 Ｂ−42株は37℃では２〜３日目、そして42℃では４〜
５日目で良好な発育を見る。一方、Ｂ−001株、L3株、
およびATCC4617株は37℃では２日目までに良好な発育を
見るが、42℃では７日目においてもわずかな集落の発育
をみるにとどまる。42℃での発育状況はＢ−42株を野外
株と区別するマーカーとなり得る。
５日目で良好な発育を見る。一方、Ｂ−001株、L3株、
およびATCC4617株は37℃では２日目までに良好な発育を
見るが、42℃では７日目においてもわずかな集落の発育
をみるにとどまる。42℃での発育状況はＢ−42株を野外
株と区別するマーカーとなり得る。
溶血性 Ｂ−42株は馬血球に対して溶血能を欠くか、または血
球濃度によっては弱溶血性を呈する。一方、Ｂ−001
株、L3株、ATCC4617株は強溶血性を呈するので、本性状
もＢ−42株を野外株と区別するマーカーとなり得る。
球濃度によっては弱溶血性を呈する。一方、Ｂ−001
株、L3株、ATCC4617株は強溶血性を呈するので、本性状
もＢ−42株を野外株と区別するマーカーとなり得る。
ナリジクス酸耐性能 Ｂ−42株は、37℃および42℃でナリジクス酸加BG寒天
培地上で良好な発育を呈するが、B001株、L3株、および
ATCC4617株はナリジクス酸に感受性を呈する。
培地上で良好な発育を呈するが、B001株、L3株、および
ATCC4617株はナリジクス酸に感受性を呈する。
Ｂ−42株に対するナリジクス酸の最小発育阻止濃度は
200μg/ml以上であるが、通常、ボルデテラ・ブロンキ
セプチカの野外株がナリジクス酸に対する耐性を有する
ひん度は極めて低いので（尾形学監修：豚の萎縮性鼻膜
−ボルデテラ感染症−文永堂、1979）、ナリジクス酸耐
性能は野外株との有効な鑑別点となる。その場合、ナリ
ジクス酸加BG寒天培地を用い、42℃で培養するとより確
実である。
200μg/ml以上であるが、通常、ボルデテラ・ブロンキ
セプチカの野外株がナリジクス酸に対する耐性を有する
ひん度は極めて低いので（尾形学監修：豚の萎縮性鼻膜
−ボルデテラ感染症−文永堂、1979）、ナリジクス酸耐
性能は野外株との有効な鑑別点となる。その場合、ナリ
ジクス酸加BG寒天培地を用い、42℃で培養するとより確
実である。
DNT産生能 ボルデテラ・ブロンキセプチカの産生するDNTは本菌
の病原性因子の一つとして知られ、本菌が豚ならびにマ
ウスに感染した場合、DNTは鼻甲介萎縮に関与すると考
えられている（Hanada,M.,shimoda,K.,Tomita,S.,Nakas
e,Y.,and Nishiyama,Y.Production of lesions similar
to naturally occuring swuire atrophic rhinitis by
cell−free sonicated extract of Bordettela bronch
iseptica、Jpn.J.Vet.Sci.,41:1−8,1979、Sawata,A.,a
nd Kume,K.:Nasal turbinate atrophy in young mice i
noculated with Bordetella bronchiseptica of pig or
igin,Am、J.Vet.Res.,43:1845−1847,1982）。したがっ
て、AR生菌ワクチンの原株はDNT産生能を欠くことが必
須条件となる。
の病原性因子の一つとして知られ、本菌が豚ならびにマ
ウスに感染した場合、DNTは鼻甲介萎縮に関与すると考
えられている（Hanada,M.,shimoda,K.,Tomita,S.,Nakas
e,Y.,and Nishiyama,Y.Production of lesions similar
to naturally occuring swuire atrophic rhinitis by
cell−free sonicated extract of Bordettela bronch
iseptica、Jpn.J.Vet.Sci.,41:1−8,1979、Sawata,A.,a
nd Kume,K.:Nasal turbinate atrophy in young mice i
noculated with Bordetella bronchiseptica of pig or
igin,Am、J.Vet.Res.,43:1845−1847,1982）。したがっ
て、AR生菌ワクチンの原株はDNT産生能を欠くことが必
須条件となる。
そこで、本発明のＢ−42株原株Ｉ相菌におけるDNT産
生能を野外株（Ｂ−001株）ならびにワクチン株（L3
株）との比較で調べて見た。各試験菌株を５×1011/ml
の菌液に調整し、冷水中で10キロサイクル、10分間音波
処理（音波破砕機、大缶製作所、150型）後、10,000gで
60分間遠心した。遠心上清を0.22nmミリポアフィルター
で濾過して得た上清を試験品とした。試験品を蒸溜水で
倍数希釈し、その各0.1mlを体重約300gのハートレイ系
モルモットの皮内に接種し、２日目に直径5mm以上の壊
死病変を形成する最大希釈倍数を測定した。その結果を
第２表に示す。
生能を野外株（Ｂ−001株）ならびにワクチン株（L3
株）との比較で調べて見た。各試験菌株を５×1011/ml
の菌液に調整し、冷水中で10キロサイクル、10分間音波
処理（音波破砕機、大缶製作所、150型）後、10,000gで
60分間遠心した。遠心上清を0.22nmミリポアフィルター
で濾過して得た上清を試験品とした。試験品を蒸溜水で
倍数希釈し、その各0.1mlを体重約300gのハートレイ系
モルモットの皮内に接種し、２日目に直径5mm以上の壊
死病変を形成する最大希釈倍数を測定した。その結果を
第２表に示す。
上記の結果から明らかなように、本発明のＢ−42株原
株Ｉ相菌はDNT産生能を欠く。なお、下記に示す第３表
から明らかなように、Ｂ−42株のDNT産生能を欠く性質
はBG寒天培地またはマウスで40代目まで継代したもので
も変わらず、本性質の安定性が確認された。
株Ｉ相菌はDNT産生能を欠く。なお、下記に示す第３表
から明らかなように、Ｂ−42株のDNT産生能を欠く性質
はBG寒天培地またはマウスで40代目まで継代したもので
も変わらず、本性質の安定性が確認された。
マウスに対する致死毒性 ボルデテラ・ブロンキセプチカはマウスに対して高い
致死毒性を有する（尾形学監修：豚の萎縮性鼻膜−ボル
デテラ感染症−文永堂、1979）。そこで、Ｂ−42株原株
を、マウスに接種し、ワクチン株のL3株との比較で致死
毒性を調べてみた。
致死毒性を有する（尾形学監修：豚の萎縮性鼻膜−ボル
デテラ感染症−文永堂、1979）。そこで、Ｂ−42株原株
を、マウスに接種し、ワクチン株のL3株との比較で致死
毒性を調べてみた。
１群20匹の３週令SPFマウスを用い、Ｂ−42株およびL
3株Ｉ相菌の各々１×109個をそれぞれ腹腔内に接種し、
接種後１週間にわたり観察した。死亡マウスについては
死亡時に剖検し、病変の有無と肺からの菌回収を行っ
た。生残例については接種後１週目に殺処分し、病変の
有無を調べると同時に肺を含む主要臓器からの菌回収を
行った。
3株Ｉ相菌の各々１×109個をそれぞれ腹腔内に接種し、
接種後１週間にわたり観察した。死亡マウスについては
死亡時に剖検し、病変の有無と肺からの菌回収を行っ
た。生残例については接種後１週目に殺処分し、病変の
有無を調べると同時に肺を含む主要臓器からの菌回収を
行った。
第４表から明らかなように、Ｂ−42株Ｉ相菌はマウス
に対する致死毒性を欠いた。本性質はＢ−42株をマウス
で40代まで継代した菌株において原株のそれと変わら
ず、本成績はＢ−42株の安定生を示すものである。死亡
マウスにおいては全例が敗血症を起こし、肺病変の形成
が認められた。一方、生残マウスでは肉眼的な病理変化
は全く認められず、菌も回収されなかった。
に対する致死毒性を欠いた。本性質はＢ−42株をマウス
で40代まで継代した菌株において原株のそれと変わら
ず、本成績はＢ−42株の安定生を示すものである。死亡
マウスにおいては全例が敗血症を起こし、肺病変の形成
が認められた。一方、生残マウスでは肉眼的な病理変化
は全く認められず、菌も回収されなかった。
以上の成績はＢ−42株Ｉ相菌の生菌ワクチンとしての
安全性の指標となる。
安全性の指標となる。
（２）血清学的性状 Ｂ−42株Ｉ相菌およびL3株Ｉ相菌を用いてそれぞれ高
度免疫して得た家兎血清および豚血清に対して、Ｂ−42
株Ｉ相菌、Ｂ−001株Ｉ相菌、L3株Ｉ相菌および市販のA
R抗原（AR抗原「北研」）をそれぞれ抗原として試験管
内凝集反応を行なった（尾形学監修：豚の萎縮性鼻膜−
ボルデテラ感染症−文永堂、1979）。その結果を第５表
に示す。
度免疫して得た家兎血清および豚血清に対して、Ｂ−42
株Ｉ相菌、Ｂ−001株Ｉ相菌、L3株Ｉ相菌および市販のA
R抗原（AR抗原「北研」）をそれぞれ抗原として試験管
内凝集反応を行なった（尾形学監修：豚の萎縮性鼻膜−
ボルデテラ感染症−文永堂、1979）。その結果を第５表
に示す。
以上の結果から明らかなように、Ｂ−42株Ｉ相菌は野
外株のＢ−001株およびワクチン株のL3株Ｉ相菌と抗原
的特性が全く同一である。なお、Ｂ−42株の被凝集性は
BG寒天培地で40代まで継代した菌株においても原株のそ
れと変わらず、本成績はＢ−42株の安定性を示すもので
ある。
外株のＢ−001株およびワクチン株のL3株Ｉ相菌と抗原
的特性が全く同一である。なお、Ｂ−42株の被凝集性は
BG寒天培地で40代まで継代した菌株においても原株のそ
れと変わらず、本成績はＢ−42株の安定性を示すもので
ある。
（３）Ｂ−42株Ｉ相菌生菌ワクチンの感染防御能および
安全性の検定 Ｂ−42株Ｉ相菌生菌ワクチンのマウスにおける防御能
を下記の方法で実験した。
安全性の検定 Ｂ−42株Ｉ相菌生菌ワクチンのマウスにおける防御能
を下記の方法で実験した。
３週令SPFマウスを免疫群と対照群とに分けた。
Ｂ−42株Ｉ相菌をBG寒天培地にて37℃で３日間培養
し、リン酸緩衝食塩水（pH7.0）にかき取って第６表に
示した菌数の浮遊菌液を調整し、各菌液の0.1mlを各群3
0匹のマウス腹腔内に接種した。接種後３週目にボルデ
テラ・ブロンキセプチカL3株Ｉ相菌のBG寒天培地上37℃
で２日培養菌のリン酸緩衝食塩水（pH7.0）浮遊菌液0.1
mlを、免疫群および対照群の各群20匹のマウス腹腔内に
接種して攻撃後２週間観察した。また、攻撃時に各群10
匹のマウスを殺処分し、採取した血清について凝集価を
AR抗原「北研」を用いて測定した。その結果を第６表に
示す。
し、リン酸緩衝食塩水（pH7.0）にかき取って第６表に
示した菌数の浮遊菌液を調整し、各菌液の0.1mlを各群3
0匹のマウス腹腔内に接種した。接種後３週目にボルデ
テラ・ブロンキセプチカL3株Ｉ相菌のBG寒天培地上37℃
で２日培養菌のリン酸緩衝食塩水（pH7.0）浮遊菌液0.1
mlを、免疫群および対照群の各群20匹のマウス腹腔内に
接種して攻撃後２週間観察した。また、攻撃時に各群10
匹のマウスを殺処分し、採取した血清について凝集価を
AR抗原「北研」を用いて測定した。その結果を第６表に
示す。
上記の結果から明らかな通り、Ｂ−42株Ｉ相菌をマウ
ス当たり107個以上接種した免疫群では全例が臨床症状
を全く示さず生残し、攻撃後２週目の剖検時において肉
眼的な病理変化は全く認められなかった。また、106個
および105個接種群では攻撃後４および５匹のマウスが
死亡したが、他は全て生き残った。攻撃菌は生残マウス
からはまったく回収されなかった。なお、免疫マウスで
は、免疫量に応じて有意な凝集抗体の産生が認められ
た。一方、対照群では供試20匹での全例が敗血症で死亡
し、多数の攻撃菌が各種臓器から回収された。
ス当たり107個以上接種した免疫群では全例が臨床症状
を全く示さず生残し、攻撃後２週目の剖検時において肉
眼的な病理変化は全く認められなかった。また、106個
および105個接種群では攻撃後４および５匹のマウスが
死亡したが、他は全て生き残った。攻撃菌は生残マウス
からはまったく回収されなかった。なお、免疫マウスで
は、免疫量に応じて有意な凝集抗体の産生が認められ
た。一方、対照群では供試20匹での全例が敗血症で死亡
し、多数の攻撃菌が各種臓器から回収された。
このように、本発明のＢ−42株Ｉ相菌はボルデテラ・
ブロンキセプチカ感染症に対して、優れた免疫原性を有
し、しかも高い安全性を有する。
ブロンキセプチカ感染症に対して、優れた免疫原性を有
し、しかも高い安全性を有する。
以上説明した通り、本発明のＢ−42株Ｉ相菌は特異的
な染色体性遺伝標識を有し、免疫原性において優れ、一
方、きわめて高い安全生を有するので、ボルデテラ・ブ
ロンキセプチカ感染症に対する生菌ワクチン製造用原株
として有用である。
な染色体性遺伝標識を有し、免疫原性において優れ、一
方、きわめて高い安全生を有するので、ボルデテラ・ブ
ロンキセプチカ感染症に対する生菌ワクチン製造用原株
として有用である。
本発明のＢ−42株Ｉ相菌を用いてボルデテラ・ブロン
キセプチカ感染症用生菌ワクチンを製造する場合、常法
により行われる。すなわち、Ｂ−42株Ｉ相菌のBG寒天培
地にて37℃で培養して増殖させ、これを種菌として製造
用液状培地に移し、37℃で培養跡遠心にて集菌し、これ
に通常の乾燥保護剤、例えば10％スキムミルクと５％ペ
プトンなどを混合し（浮遊液：保護剤＝1:1容量比）、
それをバイアルに小分けした後、凍結乾燥して製品とす
る。製品は使用時に添付する希釈液で復元し、動物の鼻
腔内に注入、噴霧投入、又は筋肉内注射して用いる。
キセプチカ感染症用生菌ワクチンを製造する場合、常法
により行われる。すなわち、Ｂ−42株Ｉ相菌のBG寒天培
地にて37℃で培養して増殖させ、これを種菌として製造
用液状培地に移し、37℃で培養跡遠心にて集菌し、これ
に通常の乾燥保護剤、例えば10％スキムミルクと５％ペ
プトンなどを混合し（浮遊液：保護剤＝1:1容量比）、
それをバイアルに小分けした後、凍結乾燥して製品とす
る。製品は使用時に添付する希釈液で復元し、動物の鼻
腔内に注入、噴霧投入、又は筋肉内注射して用いる。
次に実施例を挙げて本発明のＢ−42株Ｉ相菌の製造法
を具体的に説明する。
を具体的に説明する。
実施例１ Ｂ−42株Ｉ相菌の作出 ボルデテラ・ブロンキセプチカＢ−001株を1ml当たり
200μｇの割合にナリジクス酸を加えて調整したBG寒天
培地上に塗抹後、本培地を42℃で培養し、その発育集落
を釣菌して上記条件下で継代を重ねる。本培地上で42℃
での発育が良好になった時点で、Ｉ相菌の形態を呈する
発育集落について、モルモットの皮内反応でDNT産生能
陰性の菌株を選択し、Ｂ−42株Ｉ相菌を得た。
200μｇの割合にナリジクス酸を加えて調整したBG寒天
培地上に塗抹後、本培地を42℃で培養し、その発育集落
を釣菌して上記条件下で継代を重ねる。本培地上で42℃
での発育が良好になった時点で、Ｉ相菌の形態を呈する
発育集落について、モルモットの皮内反応でDNT産生能
陰性の菌株を選択し、Ｂ−42株Ｉ相菌を得た。
実施例２ 実施例１方法において、Ｂ−001株の代わりに出発菌
株が野外株以外は実施例１と同様な方法でボルデテラ・
ブロンキセプチカ生菌ワクチン用原株を得る。
株が野外株以外は実施例１と同様な方法でボルデテラ・
ブロンキセプチカ生菌ワクチン用原株を得る。
実施例３ 実施例１の方法によって得られたＢ−42株Ｉ相菌をBG
寒天培地（pH6.9、20％馬脱繊血加）に接種し、37℃で
２日間培養した。これを製造用液状培地に移植し、37℃
で培養後、集菌して滅菌リン酸緩衝液食塩水（pH7.0）
に4.0×109個/mlになるように浮遊し、等量の乾燥保護
剤（10％スキムミルク、５％ペプトン含有液、110℃で1
0分間滅菌）とよく混和したものを最終バルクとした。
これを20ml用バイアルに2mlづつ分注し、凍結乾燥して
減圧下で封じ、生菌ワクチン（乾燥品）を得た。本発明
品は２〜５℃の冷暗所保存で安定した性状を保有してい
た。本発明品は、溶解用液、例えば滅菌リン酸緩衝食塩
水（pH7.0）に容易に溶解し、かつ均一な性状を示し
た。なお、本発明品は溶解用液の20mlに溶解した場合、
含有生菌数は１×108個/ml以上であった。
寒天培地（pH6.9、20％馬脱繊血加）に接種し、37℃で
２日間培養した。これを製造用液状培地に移植し、37℃
で培養後、集菌して滅菌リン酸緩衝液食塩水（pH7.0）
に4.0×109個/mlになるように浮遊し、等量の乾燥保護
剤（10％スキムミルク、５％ペプトン含有液、110℃で1
0分間滅菌）とよく混和したものを最終バルクとした。
これを20ml用バイアルに2mlづつ分注し、凍結乾燥して
減圧下で封じ、生菌ワクチン（乾燥品）を得た。本発明
品は２〜５℃の冷暗所保存で安定した性状を保有してい
た。本発明品は、溶解用液、例えば滅菌リン酸緩衝食塩
水（pH7.0）に容易に溶解し、かつ均一な性状を示し
た。なお、本発明品は溶解用液の20mlに溶解した場合、
含有生菌数は１×108個/ml以上であった。
次に、本発明の生菌ワクチンの試験例について説明す
る。
る。
試験例１ 実施例により得られたＢ−42株Ｉ相菌についてボルデ
テラ・ブロンキセプチカ抗体陰性のSPF豚を用いて安全
試験を行った。
テラ・ブロンキセプチカ抗体陰性のSPF豚を用いて安全
試験を行った。
生後３日齢のSPF仔豚８頭（１×1010個接種、１×109
個接種、１×108個接種、未接種の各群２頭）に１頭当
たり前記の菌量を1.0ml宛鼻腔内に接種し、接種後15日
目に剖検した。全頭の豚はいずれも試験期間中、元気、
食欲、発熱等になんら異常な臨床症状を呈さず、また剖
検時において肉眼的および病理組織学的所見においても
異常は認められなかった。従って、Ｂ−42株は豚に対し
て安全であることが確認された。
個接種、１×108個接種、未接種の各群２頭）に１頭当
たり前記の菌量を1.0ml宛鼻腔内に接種し、接種後15日
目に剖検した。全頭の豚はいずれも試験期間中、元気、
食欲、発熱等になんら異常な臨床症状を呈さず、また剖
検時において肉眼的および病理組織学的所見においても
異常は認められなかった。従って、Ｂ−42株は豚に対し
て安全であることが確認された。
試験例２ 実施例３により得られたワクチンを滅菌リン酸緩衝食
塩水（pH7.0）で溶解し、さらに10倍希釈剤をつくり、1
04個/ml、106個/ml、108個/mlの各濃度のワクチンにつ
いてSPF豚を用い免疫原性試験を行った。
塩水（pH7.0）で溶解し、さらに10倍希釈剤をつくり、1
04個/ml、106個/ml、108個/mlの各濃度のワクチンにつ
いてSPF豚を用い免疫原性試験を行った。
ボルデテラ・ブロンキセプチカ抗体陰性の生後３日齢
のSPF仔豚12頭（接種３群と対照群、各群３頭）に１頭
当たり前記に菌量を1ml宛鼻腔内に接種し、接種後３週
目にボルデテラ・ブロンキセプチカL3株（強毒株）で１
頭当たり、１×107個/mlあて全頭経鼻攻撃し、攻撃後10
週目に剖検した。
のSPF仔豚12頭（接種３群と対照群、各群３頭）に１頭
当たり前記に菌量を1ml宛鼻腔内に接種し、接種後３週
目にボルデテラ・ブロンキセプチカL3株（強毒株）で１
頭当たり、１×107個/mlあて全頭経鼻攻撃し、攻撃後10
週目に剖検した。
ワクチン接種群の豚は全試験期間中臨床症状に何ら異
常を認めず、剖検時に軽度な鼻甲介萎縮が認められた１
×104個接種群の豚を除き、全例の鼻甲介は正常であっ
た。一方、対照群の豚では、攻撃後、アイパッチ、くし
ゃみなどの臨床症状を呈し、発育の遅延を来たした。剖
検時には、重度な鼻甲介萎縮が全例の豚で観察された。
本成績によりＢ−42株ワクチンの有効性が確認された。
常を認めず、剖検時に軽度な鼻甲介萎縮が認められた１
×104個接種群の豚を除き、全例の鼻甲介は正常であっ
た。一方、対照群の豚では、攻撃後、アイパッチ、くし
ゃみなどの臨床症状を呈し、発育の遅延を来たした。剖
検時には、重度な鼻甲介萎縮が全例の豚で観察された。
本成績によりＢ−42株ワクチンの有効性が確認された。
試験例３ Ｂ−42株Ｉ相菌についてボルデテラ・ブロンキセプチ
カ抗体陰性のSPF豚を用い、病原性復帰否定試験を行っ
た。生後３日齢のSPF仔豚の鼻腔内に１×1010個/mlの生
菌を1ml接種し、１週間観察した後、滅菌線棒で鼻腔内
をスワップし、1.5mlの滅菌リン酸緩衝食塩水を用いて
スワップ浮遊液を作成し、その1mlを次の仔豚に継代
し、他の0.5mlについては回収菌の同定、性状のチェッ
ク、ならびに回収菌数の測定を行った。以上の如く、１
継代ごとに各２頭を３代継代した結果、観察期間中いず
れの接種豚でも臨床症状に異変を認めず、かつ剖検時に
おいても何ら異常を認めなかった。なお、接種菌は接種
豚の鼻腔内でよく増殖していることが菌回収試験で確認
されている。
カ抗体陰性のSPF豚を用い、病原性復帰否定試験を行っ
た。生後３日齢のSPF仔豚の鼻腔内に１×1010個/mlの生
菌を1ml接種し、１週間観察した後、滅菌線棒で鼻腔内
をスワップし、1.5mlの滅菌リン酸緩衝食塩水を用いて
スワップ浮遊液を作成し、その1mlを次の仔豚に継代
し、他の0.5mlについては回収菌の同定、性状のチェッ
ク、ならびに回収菌数の測定を行った。以上の如く、１
継代ごとに各２頭を３代継代した結果、観察期間中いず
れの接種豚でも臨床症状に異変を認めず、かつ剖検時に
おいても何ら異常を認めなかった。なお、接種菌は接種
豚の鼻腔内でよく増殖していることが菌回収試験で確認
されている。
以上の成績から、Ｂ−42株は豚での継代においても病
原性が復帰せず、その性状はきわめて安定していること
が判った。
原性が復帰せず、その性状はきわめて安定していること
が判った。
Claims (6)
- 【請求項１】ボルデテラ・ブロンキセプチカ菌株に変異
誘起方法を適用して、少なくとも温度感受性（42℃で発
育する）ナリジクス酸耐性、および易熱性毒素産生能陰
性の遺伝標識を有する変異株を分離し、次いでこれをナ
リジクス酸含有ボーデット・ジャング寒天培地にて42℃
で培養して形態学的にＩ相菌に類似したものを釣菌し、
このナリジクス酸含有ボーデット・ジャング寒天培地に
培養およびＩ相菌の釣菌の操作を繰り返すことにより、
莢膜抗原を完備した易熱性毒素産生能陰性のＩ相菌に導
くことを特徴とする、少なくとも温度感受性、ナリジク
ス酸耐性、および易熱性毒素産生能陰性の染色体性遺伝
標識を兼備したボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生
菌ワクチン用原株の製造法。 - 【請求項２】変異誘起方法が高温処理（42℃）およびナ
リジクス酸処理の組み合わせからなる特許請求の範囲第
１項記載のボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワ
クチン用原株の製造法。 - 【請求項３】ナリジクス酸含有ボーデット・ジャング寒
天培地培養およびＩ相菌に類似する集落の釣菌の操作を
２回以上繰り返すことからなる特許請求の範囲第１項記
載のボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワクチン
用原株の製造法。 - 【請求項４】出発菌株のボルデテラ・ブロンキセプチカ
菌株が、温度感受性（42℃で発育する）、ナリジクス酸
耐性、および易熱性毒素産生能陰性を有する特許請求の
範囲第１項記載のボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症
生菌ワクチン用原株の製造法。 - 【請求項５】出発菌株のボルデテラ・ブロンキセプチカ
菌株が、野外株である特許請求の範囲第１項記載のボル
デテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワクチン用原株の
製造法。 - 【請求項６】少なくとも温度感受性（42℃で発育す
る）、ナリジクス酸耐性、および易熱性毒素産生能陰性
の染色体性遺伝標識を兼備したボルデテラ・ブロンキセ
プチカＢ−42株Ｉ相菌からなるボルデテラ・ブロンキセ
プチカ感染症生菌ワクチン。
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61280890A JP2537042B2 (ja) | 1986-11-27 | 1986-11-27 | ボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワクチン用原株の製造法および生菌ワクチン |
| IL84258A IL84258A (en) | 1986-11-27 | 1987-10-23 | Preparation of a mutant strain of bordetella bronchiseptica and live attenuated vaccine produced therefrom |
| CA000550904A CA1315226C (en) | 1986-11-27 | 1987-11-03 | Process for preparation of improved mutant strain of bordetella bronchiseptica useful for live attenuated vaccine for protection of b. bronchiseptica infection and live attenuatedar vaccine produced therefrom |
| US07/119,075 US4770875A (en) | 1986-11-27 | 1987-11-10 | Process for preparation of improved mutant strain of Bordetella bronchiseptica useful for live attenuated vaccine for protection of B. bronchiseptica infection and live attenuated AR vaccine produced therefrom |
| BR8706053A BR8706053A (pt) | 1986-11-27 | 1987-11-10 | Processo para a preparacao de cepa mutante aperfeicoada de bordetella bronchiseptica,e vacina de germe atenuado ar produzida da mesma |
| ES8703251A ES2005447A6 (es) | 1986-11-27 | 1987-11-13 | Procedimiento de preparacion de una perfeccionada raza mutante de "bordetella bronchiseptica", util para una vacuna atenuada viva destinada a la proteccion contra infeccion de la "b.bronchiseptica". |
| NL8702728A NL194960C (nl) | 1986-11-27 | 1987-11-16 | Werkwijze voor het bereiden van mutantstammen van Bordetella bronchiseptica en daarop gebaseerd levend verzwakt vaccin. |
| BE8701336A BE1000255A4 (fr) | 1986-11-27 | 1987-11-25 | Procede de preparation d'une souche de bordetella bronchiseptica mutante amelioree interessante comme vaccin vivant attenue conferant une protection contre les infections par b. bronchiseptica et vaccin ra vivant attenue que l'on en obtient. |
| FR878716336A FR2607392B1 (fr) | 1986-11-27 | 1987-11-25 | Procede pour la preparation d'une souche mutante de bordetella bronchiseptica utile pour la preparation d'un vaccin vivant attenue pour la prophylaxie des infections a b. bronchiseptica et vaccin vivant attenue contre la rhinite atrophique ainsi prepare |
| DK620087A DK620087A (da) | 1986-11-27 | 1987-11-26 | Fremgangsmaade til fremstilling af en mutantstamme af bordetella bronchiseptica samt viccine fremstillet deraf |
| DE3740182A DE3740182C2 (de) | 1986-11-27 | 1987-11-26 | Verfahren zur Herstellung eines Mutantenstamms von Bordetella bronchiseptica, der für einen Impfstoff für den Schutz von B. bronchiseptica-Infektionen nützlich ist, und daraus hergestellter AR-Impfstoff |
| GB8727820A GB2200844B (en) | 1986-11-27 | 1987-11-27 | Preparation of bordetella bronchiseptica strains useful as vaccines |
| IT22791/87A IT1223171B (it) | 1986-11-27 | 1987-11-27 | Procedimento per la preparazione di un ceppo mutante migliorato di bordetella bronchiseptica utile per un vaccino attenuato vivo per la protezione da infezioni di b. bronchiseptica e vaccino ar vivo attenuato cosi' ottenuto |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61280890A JP2537042B2 (ja) | 1986-11-27 | 1986-11-27 | ボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワクチン用原株の製造法および生菌ワクチン |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63135335A JPS63135335A (ja) | 1988-06-07 |
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ID=17631367
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|---|---|---|---|
| JP61280890A Expired - Fee Related JP2537042B2 (ja) | 1986-11-27 | 1986-11-27 | ボルデテラ・ブロンキセプチカ感染症生菌ワクチン用原株の製造法および生菌ワクチン |
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| Country | Link |
|---|---|
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| CA (1) | CA1315226C (ja) |
| DE (1) | DE3740182C2 (ja) |
| DK (1) | DK620087A (ja) |
| ES (1) | ES2005447A6 (ja) |
| FR (1) | FR2607392B1 (ja) |
| GB (1) | GB2200844B (ja) |
| IL (1) | IL84258A (ja) |
| IT (1) | IT1223171B (ja) |
| NL (1) | NL194960C (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| IT1236971B (it) * | 1989-11-03 | 1993-05-07 | Eniricerche Spa | Regione promotore dei geni codificanti le subunita' piliniche fim2, fm3 e fimx di bordetella pertussis e loro impiego per l'espressione di geni che codificano una proteina di interesse. |
| JPH08508240A (ja) * | 1993-01-12 | 1996-09-03 | ジョージ グリスティーナ，アンソニー | 受動免疫の直接的濃厚伝達のための方法および組成物 |
| CA2512812A1 (en) * | 2003-01-09 | 2004-07-29 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions, methods and kits for enhancing the immunogenicity of a bacterial vaccine vector |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4016253A (en) * | 1975-04-02 | 1977-04-05 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Vaccine for immunization of swine against Bordetella bronchiseptica infection and method of use |
| DE2960853D1 (en) * | 1978-12-07 | 1981-12-03 | Univ Iowa State Res Found Inc | Intra-respiratory vaccine, modified bacteria strain used in it, vaccine dose form and process for preparing it |
| US4530832A (en) * | 1978-12-07 | 1985-07-23 | Schering Corporation | Method of vaccination for prevention of Bordetella bronchiseptica infection |
| US4225583A (en) * | 1978-12-07 | 1980-09-30 | Iowa State University Research Foundation, Inc. | Intra-respiratory vaccine for prevention of Bordetella bronchiseptica infection and method of use |
| JPS5953828B2 (ja) * | 1981-08-10 | 1984-12-27 | 健 清水 | ボルデテラ・プロンヒセブティカ感染症生菌ワクチン用改良原株の作出法および生菌ワクチン |
| FR2578424B1 (fr) * | 1985-03-08 | 1988-07-08 | Agronomique Inst Nat Rech | Souches mutantes, vaccinantes de bacteries, leur procede d'obtention, et preparations vaccinales les contenant |
-
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- 1986-11-27 JP JP61280890A patent/JP2537042B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
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- 1987-10-23 IL IL84258A patent/IL84258A/xx not_active IP Right Cessation
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