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Procédé de préparation d'une souche de Bordetella bronchiseptica mutante améliorée intéressante comme vaccin vivant attenue conférant une protection contre les infections par B. bronchiseptica et vaccin RA vivant atténué que l'on en obtient Arriere-plan de l'invention
L'invention concerne un procédé de preparation d'une souche de Bordetella bronchiseptica mutante améliorée possedant une puissante immunogénicité et une faible virulence, qui est préférable pour la preparation d'un vaccin vivant atténué de B. bronchiseptica.
La presente invention concerne aussi un vaccin vivant préparé ä partir de B. bronchiseptica.
On sait que Bordetella bronchiseptica provoque une maladie respiratoire chez divers animaux, comme les porcs, les chiens, les lapins, les cobayes et les souris. L'infection des organismes de porcs nouveaux nes engendre la rhinite atrophique du porc (que l'on appellera dans la suite du present mémoire RA) qui induit une atrophie des cornets des fosses nasales et se traduit par un retard de croissance et une diminution du taux de consommation d'aliments. Ceci pose un sérieux probleme ä l'industrie du betail. On a mis dans le
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commerce un vaccin de la RA mort, en vue de la prophylaxie de la RA porcine, cependant, l'efficacité du vaccin demeure encore limitée. Tout récemment, on a mis au point un vaccin de la RA vivant atténué et ce fait a été rapport6 par Shimizu et coll. (brevet U. S.
4, 456, 588).
Cependant, les organismes qui interviennent dans la
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confection du vaccin vivant ont pour propriété de ne pouvoir croitre qu'a 34-37OC seulement. De même, les organismes en question donnent lieu ä une formation de colonie tardive sur un milieu solide et ne manifestent qu'une mediocre colonisation sur la muqueuse nasale des porcs et, inoculés A des porcs, ils ne manifestent pas de production d'anticorps seriques.
Au moins 10 ä 14 jours sont nécessaires pour obtenir un effet immunologique du vaccin de la RA tué apres administration. Par conséquent, on recherche depuis longtemps un vaccin A forte immunit6 à tres bas Age. On sait que, de manière generale, H. bronchiseptica crolt ä une température de 32 b 37 C "Atrophic rhinitis of swine Bordetella infectious disease", Ed. M. Ogata, Buneido Pub. C ., 1979). On connalt également le fait que des bactéries pathogenes perdent leur virulence lorsqu'on les soumet b culture ä haute temperature.
En vue d'obtenir des souches de B. bronchiseptica mutantes en vue de la production d'un vaccin de la RA vivant, nous avons pris en consideration les phénomènes susmentionnés et nous avons achevé la presente invention qui comprend un procédé de préparation d'une souche de B. bronchiseptica mutante améliorée possédant une puissante immunité et une faible virulence, ainsi qu'un vaccin de la RA atténué vivant préparé au départ de cette souche.
Objets de l'invention
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L'un des objets de la présente invention réside dans un procédé de préparation d'une souche de B. bronchiseptica mutante ameliorate possédant une forte immunogénicité et une faible virulence, qui est preferable pour la préparation d'un vaccin de la RA
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atténué vivant.
Un autre objet de la presente invention réside dans une souche mutante de B. bronchiseptica possedant des marqueurs génétiques chromosomiques portant des marqueurs au moins sensibles ä la temperature (culture a 42 C ), resistant à 1'acide nalidixique et d'aptitude negative (que l'on designera dans la suite du présent memoire par DNT negative) de production de toxines dermonécrotiques (que 110n désignera dans la suite du présent memoire par DNT).
L'invention a également pour objet un procédé de préparation d'une souche mutante de B. bronchiseptica, caractérisé en ce que l'on soumet une souche de B. bronchiseptica à une mutation induite, on isole une mutante possedant les marqueurs génétiques d'être au moins sensible a la temperature (élevée à 42 C) resistant ä l'acide nalidixique et DNT negative, on cultive la souche de 8.
bronchiseptica sur une plaque de gelose de Bordet-Gengou (que 1100 désignera dans la suite du present mémoire par BG) contenant de l'acide nalidixique, ä 42 ), puis on prélève un organisme ressemblant morphologiquement ä la phase-I, on répète les procedes de culture sur la plaque de geloste BG et de prélèvement d'organismes de phase-I et on convertit les organismes en organisme de phase-I DNT negative comportant un antigene capsulaire complet.
Un autre objet de la presente invention reside dans un vaccin de la RA atténué vivant comprenant un organisme de phase-1 B. bronchiseptica possedant au moins des marqueurs génétiques de marqueurs sensibles ä
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la temperature (culture ä 42"C), resistant a l'acide nalidixique et DNT nbgative.
Suivant la présente invention, on peut obtenir une souche mutante de B. bronchiseptica en inoculant la souche sauvage ou virulente de B. bronchiseptica parente, naturellement isolee, ä une plaque de gelose BG contenant 200 pg/ml d'acide nalidixique, en cultivant la plaque à 42OC, en prélevant les colonies qui ont crû, en subcultivant les colonies prélevées sur la même plaque et en répétant le processus de prélèvement des colonies et de leur sub-culture dans les mêmes conditions que celles précédemment defines.
Dans le procédé ci-dessus, lorsque l'on observe une bonne croissance sur la plaque de gelose BG contenant de
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l'acide nalidixique ä 42OC, la souche mutante peut être choisie en examinant l'aptitude de production de DNT des colonies qui ont crt sur la plaque en utilisant un test sur peau de cobaye, en prélevant les colonies manifestant une caractéristique DNT negative, en subcultivant ces colonies, en répétant le procédé ci-dessus dans les mêmes conditions que celles précédemment indiquées.
A titre d'exemple de la souche de depart utilisée aux fins de la presente invention, on peut citer une souche sauvage de B. bronchiseptica, comme la souche B- - 001 definie ci-dessous ou une culture de reserve de laboratoire, comme la souche L3.
On obtient une souche B-001 par la culture d'un echantillon de tampon de coton recueilli de la cavite nasale d'un porc affecte de RA, culture aux fins de laquelle l'échantillon est étalé sur une plaque de gélose BG et cultive ä 370C pendant 2 jours et les colonies de B. bronchiseptica ainsi obtenues sont choisies en vérifiant les propriétés qui ont été
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précédemment decrites.
La souche mutante de la presente invention qui
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possede les marqueurs genetiques d'être sensible b la température (élevée a 42OC) resistant a l'acide nalidixique, DNT negative, peut entre produite par un procédé de classique de mutation induite. A savoir, on inocule une souche B-001 ä une plaque de gelose BG contenant 200
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g/m1 d'acide nalidixique et on procede a la culture a 42'C pendant 7 jours. Les colonies qui ont crü sur la plaque de gelose, et qui sont morphologiquement ressemblantes a l'organisme de la phase-1, sont prélevées, inoculées à une nouvelle plaque de gélose BG contenant de l'acide nalidixique et cultivées à 42*C pendant 3 à 5 jours.
Après repetition du procédé de prélèvement des organismes, de culture de ceux-ci et de choix des colonies se révélant être DNT negatives selon un test sur peau de cobaye, on peut isoler la souche
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mutante qui est DNT negative et sensible a la temperature (cultivée a 42*C). On désigne cette souche par l'appellation souche B-42 et c'est cette souche qui est preferable pour la production d'un vaccin de la RA atténué vivant en vue de la prophylaxie de l'infection du porc par B. bronchiseptica.
On a déposé cette souche mutante B-42 de B. bronchiseptica ä la collection des cultures permanenetes de l'institut suivant : The Fermentation Research Institute où on lui a attribue la désignation FERM P-9038. La souche en question possede des marqueurs genetiques chromosomiques possédant les propriétés de sensiblité ä la température (culture ä 42 C), de resistance ä l'acide nalidixique et de DNT négativit et, au surplus, la souche possède une quantité suffisante d'antigene capsulaire qui est essentielle pour un vaccin de la RA atténué vivant et une notable faible virulence et une puissante immunogénicite.
Par conséquent, la souche B-42 est particulièrement interessante pour la production d'un vaccin de la RA
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atténué vivant en vue de prevenir une infection du porc par B. bronchiseptica.
La souche B-42 utilisée aux fins de la présente invention possede les propriétés et caractéristiques specifiques qui suivent.
Les propriétés biologiques de la souche B-42, de la souche B-001 (souche sauvage du porc affecte de RA porcine), de la souche L3 pour la production du vaccin de la RA tu (culture de réserve) et de la souche ATCC 4617 (culture de réserve) ont été examinees suivant les procédés decrits par Cowan et coll. (Cowan, S. T. et Steel, K. J. : Manual for the Identification of Medical Bacteria, 2de éd., Cambridge Univ.
Press., Angleterre, 1974) et les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 duquel ressort que la souche B-42 possède les mêmes propriétés que la souche B-001, la souche L3 et la souche ATCC 4617, l'exception de l'adaptabilité aux temperatures elevees et a l'activait hemolytique.
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<tb>
<tb>
Souche
<tb> Propriétés
<tb> B-42 <SEP> B-001 <SEP> L3 <SEP> ATCC <SEP> 4617
<tb> Gram-coloration <SEP> Négative <SEP> Négative <SEP> Négative <SEP> Négative
<tb> Motilite <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Fermentation <SEP> de <SEP> glucose
<tb> Production <SEP> d'indole <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Test <SEP> au <SEP> rouge <SEP> de <SEP> méthyle <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> Test <SEP> vs
<tb> Utilisation <SEP> de <SEP> citrate <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Réduction <SEP> de <SEP> nitrate <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Hydrolyse <SEP> d'urée <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Réduction <SEP> d'oxydase <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Test <SEP> KCM <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Test <SEP> de <SEP> décarboxylation
<tb> de <SEP> lysin
<tb> Réductiond <SEP> e <SEP> catalase <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Hémolyse <SEP>
(hématies
<tb> équines)
<tb> 2 <SEP> 0% <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 5% <SEP> (¯)' <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Croissance <SEP> sur
<tb>
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<tb>
<tb> plaques <SEP> de <SEP> gélose <SEP> BG
<tb> 37 C <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> 42 C <SEP> + <SEP> (¯) <SEP> b) <SEP> (¯)' <SEP> (¯)'
<tb> Croissance <SEP> sur <SEP> plaque <SEP> de
<tb> ga-lose <SEP> GB <SEP> contenant <SEP> de
<tb> l'acide <SEP> nalidixique
<tb> (200 <SEP> g/m#) <SEP> a
<tb> 3 <SEP> 7'C <SEP> +
<tb> 4 <SEP> 2 <SEP> C <SEP> +
<tb>
a) Hémolyse faible b) Médiocre croissance (petite formation de colonie)
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(1) propriétés biologiques :
Sensibilité A la temperature :
Une souche B-43 (souche mutante) manifeste une croissance maximale pendant 2 à 3 jours ä 370C et pendant 4 ä 5 jours ä 42OC, alors que les souches B-001, L3 et ATCC 4617 (souches virulentes) font preuve d'une croissance maximale pendant 2 jours ä 37 C, cependant, de très petites colonies (moins de 1 mm en diametre) se forment pendant 7 jours ä 42 C. La condition de croissance ä 42 C peut être un märqueur pour la differenciation d'une souche mutante B-42 de souches sauvages et de réserve. hémolyse
Une souche B-42 manque d'activité sur des hématies équines ou possède une faible activité en fonction de la concentration des hematies contenues dans une plaque de gélose BG.
D'autre part, les souches 8-001, L3 et ATCC 4617 manifestent une forte activité hémolytique, ce qui peut constituer un marqueur pour la differenciation de la souche B-42 de souches sauvages et de rbserve.
3 Sensibilité b l'acide nalidixique :
Une souche B-42 manifeste une bonne croissance sur une plaque de gélose BG contenant de l'acide nalidixique ä 370C et ä 42 C, tandis que les souches B-001, L3 et ATCC 4617 sont sensibles A l'acide nalidixique.
La concentration inhibitrice de croissance minimale de l'acide nalidixique vis-à-vis d'une souche B-42 est superieure à 200 pg/ml et, étant donné qu'en general, les souches sauvages et de reserve de B. bronchiseptica resistant ä l'acide nalidixique sont tres faibles (se référer ä l'écrit d'Ogata susmentionné), la resistance ä l'acide nalidixique peut être un bon marqueur pour la différenciation d'une souche mutante B-42 de souches sauvages et de rdserve. La culture sur une plaque de gelose BG contenant de l'acide nalidixique ä 42 C rend
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la difference plus fiable.
# Aptitude de production de DNT :
Les organismes de phase-I de B. bronchiseptica ont produit de la DNT et on sait que la DNT est un facteur virulent de cet organisme. Ladite toxine participe ä l'atrophie des cornets nasaux chez de jeunes porcs et de jeunes souris infectées par la bactérie.
(Hanada, M., Shimoda, K., Tomita, S., Nakase, Y. et Nishiyama, Y., Production of lesions similar to
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.. naturally occuring swine atrophic rhinitis by cell-free sonicated extract of Bordetella bronchiseptica of pig origin, Jpn. J. Vet. Sci., 41 : 1 - 8, 1979). Par consequent', une souche dépourvue d'aptitude de production de DNT est essentielle pour la production d'un vaccin de la RA atténué vivant.
L'aptitude de production de DNT dtune souche mutante B-42 est comparée ä celle de la souche sauvage (B-001) et de la souche de vaccin (L3). La suspension bactérienne de chaque souche (5 x 1011 cellules/ml) est soumise ä un traitement par ultrasons ä 10 KHz pendant 10 minutes (Sonicator, Ohtake Works, Tokyo, 150W) dans un bain d'eau froide et on centrifuge le produit ayant subi le traitement par les ultrasons a 10 000 9 pendant 60 minutes et on le filtre ensuite ä travers un filtre Millipore 0, 22 m pour préparer des echantillons d'essai. Des dilutions serielles doublées des échantillons d'essai sont préparées ä l'aide d'eau distillée.
On injecte des fractions (0, 1 ml) des dilutions doublées par la voie intradermique & des cobayes de Hartley pesant environ 300 g. Les titres de l'échantillon etaient l'inverse de la dilution la plus élevée manifestant une. 1ésion nêcrotique positive d'un diamètre de plus de 5 mm, l'observation s'effectuant 48 heures après l'injection.
Les resultats sont présentés dans le tableau 2.
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Tableau 2 Activité dermonécrotique
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<tb>
<tb> Souches <SEP> Titre <SEP> dermonécrotique
<tb> B <SEP> - <SEP> 42 <SEP> (mutante) <SEP> 2
<tb> B-001 <SEP> (sauvage) <SEP> 8. <SEP> 192
<tb> L3 <SEP> (vaccin) <SEP> 8.192
<tb>
Ainsi que le tableau 2 le revele, la souche B-42 est totalement dépourvue d'aptitude de production de DNT, laquelle propriété est confirmée comme étant stable lorsque la souche est soumise à une sub-culture sur des plaques de gelose BG ou qu'elle est soumise ä plus de 40 passage à travers des souris (tableau 3).
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Tableau 3 Effet de passage sur le titre dermon & crotique de la souche B-42
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<tb>
<tb> Titre <SEP> dermonécrotique
<tb> Passages <SEP> Sub-culture <SEP> sur <SEP> Passages
<tb> plaques <SEP> de <SEP> gélose <SEP> BG <SEP> a <SEP> travel <SEP> saxos
<tb> Souche <SEP> d'origine <SEP> < <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 2
<tb> 10 <SEP> passages <SEP> < <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 2
<tb> 20 <SEP> passages <SEP> < <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 2
<tb> 30 <SEP> passages <SEP> < <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 2
<tb> 40 <SEP> passages <SEP> < <SEP> 2 <SEP> < <SEP> 2
<tb>
EMI12.2
Toxicité mortel1e pour la souris : B. bronchiseptica montre une forte toxicité mortelle pour la souris (se rapprter à l'ouvrage d'Ogata susmentionné). On compare la toxicité mortelle de la souche 8-42 à celle da 1a souche de vaccin L-3.
On a inoculé par la voie intrapéritonéale la souche
EMI12.3
B-42 ou la souche L3 (1 x 10 ä l x 10 cellulesjsouris) ä des souris exemptes de germes pathogènes spécifiques (que l'on désignera dans la suite du présent mémoire par l'abrévation SPF) (20 souris dans un groupe), âgées de 3 semaines et on les a observées pendant une semaine. On a proced6 à l'autopsie des souris mortes immédiatement aprés leur mort et on a
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macroscopiquement observé leurs poumons et on a récupéré les bacteries inoculées des tissus pulmonaires. On a tué les souris survivantes dans un esprit euthanasique, une semaine après l'inoculation, on a observe leurs poumons et on a récupéré les bacteries inoculées des tissus pulmonaires.
Comme le tableau 4 le revel, la souche B-42 est dépourvue de toxicité mortelle pour la souris. Cette propriété ne change pas aprés 40 passages de la souche
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.. B-42 ä travers des souris en comparaison de celle de la souche d'origine. Ceci prouve la nature stable de la souche B-42. Les souris mortes souffraient d'un état sceptique et on n'a pas observé de changements
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macroscopiques dans les souris survivantes et on nla pas pu récupérer les bactéries inoculées.
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Tableau 4 Toxicité mortelle pour la souris
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<tb>
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> bactries/souris <SEP> Souche <SEP> B-42 <SEP> Souche <SEP> L3
<tb> 1x1010 <SEP> 0/20* <SEP> 20/20*
<tb> 1x109 <SEP> 0/20 <SEP> 20/20
<tb> 1x10a <SEP> 0/20 <SEP> 20/20
<tb> 1si0'0/20 <SEP> 12/20
<tb> IXI06 <SEP> 0/20 <SEP> 4/2 <SEP> 0
<tb> 1x105 <SEP> 0/20 <SEP> 0/20
<tb>
* Nombre de souris mortes/nombre de souris ayant subi l'inoculation
Les résultats ci-dessus indiquent que la souche B- 42 est très sure ä titre de vaccin de la RA vivant.
(2) propriétés serologiques :
On soumet des sérums anti-B-42, anti-L3 et anti-B- - 001 de lapins hyperimmuns ou des serums anti-B-42, anti-L3 et anti-B-001 de porcs hyperimmuns, qui sont préparés en immunisant fortement des lapins ou des porcs avec des organismes de phase-I des souches B-42, L3 et B-001 respectivement, ä un test d'agglutination en utilisant,. à titre d'antigene, des organismes de la phase-I de la souche B-42, des organismes de la phase-I de la souche B-001, des organismes de la phase-I de la souche L3 et un antigene de RA disponible dans le
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commerce (antigène RA "Kitasato"). (voir l'ouvrage d'Ogata susmentionn6).
Les résultats obtenus apparaissent dans le tableau
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5.
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<tb>
<tb>
Tableau <SEP> 5 <SEP> Agglutinabilité <SEP> des <SEP> souches <SEP> B-42, <SEP> B-001 <SEP> et <SEP> L3 <SEP> vis-à-vis <SEP> de <SEP> sérums <SEP> hyperimmuns <SEP> préparés <SEP> avec <SEP> des <SEP> souches
<tb> homoloques
<tb> Sérum <SEP> hyperimmun
<tb> Antigen <SEP> e
<tb> (organismes <SEP> de
<tb> phase <SEP> I) <SEP> souche <SEP> B-42 <SEP> souche <SEP> L <SEP> 3 <SEP> souche <SEP> B-001
<tb> lapin <SEP> porc <SEP> lapin <SEP> porc <SEP> lapin <SEP> porc
<tb> souche <SEP> B-42 <SEP> 20.480 <SEP> 10.240 <SEP> 20.480 <SEP> 10.240 <SEP> 20.480 <SEP> 10.240
<tb> souche <SEP> B-001 <SEP> 20.480 <SEP> 10.240 <SEP> 20.480 <SEP> 10.240 <SEP> 20.480 <SEP> 10.240
<tb> souche <SEP> L <SEP> 3 <SEP> 2 <SEP> O. <SEP> 480 <SEP> 10. <SEP> 240 <SEP> 20.480 <SEP> 10.240 <SEP> 20.240 <SEP> 10.240
<tb> antigène-RA <SEP> 20.480 <SEP> 10.240 <SEP> 20.480 <SEP> 10.
<SEP> 240 <SEP> 20.480 <SEP> 10.240
<tb> (Kitasato)
<tb>
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Comme cela ressort clairement des résultats cidessus, la souche B-42 possède la même antigénicité que la souche B-001 et la souche L3. En outre, l'agglutinabilié de la souche B-42 sob-cultivée sur une plaque de gélose BG n'a pas variä après 40 passages, en comparaison de celle d'une souche d'origine. Les résultats montrent la nature stable de la souche B-42.
(3) Essai de protection et évaluation de la sércurité du vaccin atténué vivant prepare ê partie de la souche B-42 :
On teste la valeur de protection d'un vaccin de la RA vivant prepare A partir de la souche B-42, comme suit.
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On répartit des souris SPF âgées de 3 semaines, en groupes immunises et groupes témoins.
On met la souche B-42, cultivée sur plaque de gélose BG à 370C pendant 3 jours, en suspension dans une solution saline tamponnee au phosphate (pH 7, 0), de maniere ä obtenir des suspensions de cellules illustrees dans le tableau 6. On incocule la suspension de cellules (chaque fois 0, 1 ml) par la voie intraperitoneale ä des souris, ä raison de 30 souris par groupe. 3 semaines apres l'inoculation.
on procède ä une administration d'excitation par la voie intraperitoneale d'une suspension de cellules (0, 1 ml) d'organismes de la phase-I de la souche L3 en solution saline tamponnée au phosphate (pH 7, 0) la culture s'étant effectuée sur une plaque de geloste BG ä 370C pendant 2 jours, ä des souris, ä raison de 20 souris dans chaque groupe constituant des groupes immuns et témoins. On observe les animaux 2 semaines apyres l'excitation. Au moment de l'excitation, on tue 10 souris dans chaque groupe et on mesure les titres en agglutinatine des serums en utilisant l'antigene-RA"Kitasato".
Les résultats sont présentés dans le tableau 6.
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Ainsi que le tableau 6 le revel, dans les groupes immunises auxquels on avait inocule la souche B-42 ä raison de plus de 107 cellules/souris, tous les animaux survécurent sans manifester de symptômes cliniques et on n'a pas pu constater de modifications macroscopiques par autopsie pratiquée 2 semaines après l'excitation. Dans les groupes auxquels on avait inoculé 106 et 105 cellules/souris, on a tue 4 et 5 souris respectivement après l'excitation et les animaux résiduels survécurent tous. Le test de recuperation bactérienne est resté négatif dans le cas des souris survivantes.
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Tableau 6 Test de protection sur la souris
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<tb>
<tb> .. <SEP> Dose <SEP> de <SEP> souche <SEP> B-42 <SEP> Dose <SEP> d'exposition <SEP> a <SEP> la <SEP> N <SEP> de <SEP> souris <SEP> / <SEP> N <SEP> de <SEP> souris <SEP> Moyenne <SEP> des <SEP> titres
<tb> Souris <SEP> immunisante <SEP> souche <SEP> L3 <SEP> excitatrice <SEP> mortes <SEP> testées <SEP> d'agglutination <SEP> de
<tb> Cell./0, <SEP> 1 <SEP> ml/souris <SEP> Cell./0,
1 <SEP> ml/souris
<tb> chaque <SEP> groupe
<tb> 1 <SEP> x <SEP> 1010 <SEP> 0/20 <SEP> 1 <SEP> 664
<tb> groupe <SEP> 1 <SEP> x <SEP> 109 <SEP> 0/20 <SEP> 1 <SEP> 216
<tb> imnunise
<tb> 1 <SEP> x <SEP> 108 <SEP> 1 <SEP> x <SEP> 10a <SEP> 0/20 <SEP> 448
<tb> 1 <SEP> x <SEP> 107 <SEP> 0/20 <SEP> 40
<tb> 1 <SEP> x <SEP> 104 <SEP> 4/20 <SEP> 10
<tb> 1 <SEP> x <SEP> 10 <SEP> 5/20 <SEP> 5
<tb> Groupe <SEP> témoin <SEP> - <SEP> 1 <SEP> x <SEP> 10n <SEP> 20/20 <SEP> < <SEP> 5
<tb>
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Les titres d'agglutination augmentent en fonction des doses immunisantes. Dans le groupe témoin, les 20 animaux sont tous tués par un état septique et d'importants nombres d'organismes d'excitation se retrouvent dans divers organes de toutes les souris.
Comme cela est illustre ci-dessus, la souche B-42 de la presente invention confère une immunité supérieure vis-ä-vis d'une infection de JB. bronchiseptica dans des souris avec une sécurité élevée.
La souche B-42 suivant l'invention possède des marqueurs genetiques chromosomiques spécifiques et est superieure du point de vue de l'immunogenicite et de la sécurité élevée qu'elle présente et elle convient par conséquent pour la production d'un vaccin de la RA atténué vivant en vue de la prophylaxie des infections à B. bronchiseptica chez les porcs.
Le vaccin de la RA atténué vivant pour la prophylaxie des infections ä B. bronchiseptica chez les porcs peut être produit suivant un procédé classique de fabrication d'un vaccin atténué vivant, en utilisant la souche B-42. A savoir, on inocule la souche B-42 cultivee sur plaque de gélose BG ä 37*C à un milieu liquide pour la production du vaccin et on opere la culture ä 37 C.
On recueille les cellules cultivées par centrifugation, on les melange ä un agent de séchage-protection usuel, comme 10 % de lait écrémé et 5 % de peptone (la suspension de cellules : agent de protection = l : l v/v) et on les repartit dans des fioles et on les lyophilise de façon ä obtenir la preparation de vaccin vivant. On dissout le produit avec un diluant annexé en vue de son utilisation et on administre la solution par la voie nasale ou par administration intramusculaire ä des animaux.
Les exemples qui suivent illustrent la présente
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invention sans pour autant la limiter.
Exemple 1 Preparation de la souche mutante :
On a cultivé la souche B-001 de Bordetella bronchiseptica, inoculée à une plaque de gélose BG contenant
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200 pg/ml d'acide nalidixique, ä 420C et on a choisi la colonie ayant crQ sur la plaque et on l'a subcultivée sur la même plaque. On a répété ce procédé dans les mêmes conditions. On a choisi les organismes DNT négatifs par essai sur peau de cobaye de façon A obtenir la souche mutante appelée souche B-42 parmi les colonies analogues ä la phase-I ayant l'aptitude de croltre a
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42OC.
Exemple 2
Lors de la mise en oeuvre du procédé suivant l'exemple 1, on a remplacé la souche B-001 par des souches sauvages de façon ä obtenir la souche mutante de B. bronchiseptica pour la préparation d'un vaccin de la RA atténué vivant.
Exemple 3
On a inoculé la souche B-42 préparée de la façon decrite ä l'exemple 1 ä une plaque de gélose BG et on l'a soumise ä une culture ä 370C pendant 2 jours. On a inocule cette culture semence ä un milieu liquide, on a procédé ä la culture ä 37 C, on a recueilli les cellules cultivées et on les a mises en suspension dans une solution saline tamponnee au phosphate (pH 7, 0), stérilisée, en vue de préparer une suspension
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bacterienne (4, 0 x 1010 cellules/ml).
On a convenable- ment mélangé la suspension de cellules ä une meme quantité d'agent sechant-protecteur (un melange d'une solution ä 10 % de lait écrémé et ä 5 % de peptone que
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l'on avait stérilisé A 110 C pendant 10 minutes), de façon ä obtenir un produit en vrac final. On a introduit chaque fois 2 ml de ce produit dans des fioles, puis on a procédé à 1a lyophilisation des fioles et ä leur scellage sous vide de façon à obtenir un vaccin vivant sec.
Les propriétés de ce produit furent conservées de maniere tres stable en gardant le produit au noir dans des conditions de refroidissement à 2-5"C. Ce produit pouvait être aisément dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,0), sterile et manifestait des propriétés homogenes. Lorsque l'on a dissous le produit dans 20 ml de véhicule, la solution contenait
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des bactéries vivantes présentant un compte viable de 8 plus de 1 x 10 cellules/ml.
Les exemples d'essai qui suivent illustrent l'effet du vaccin de la RA atténué'vivant suivant l'invention.
Exemple d'essai 1
On a procédé â une evaluation de securite de la souche B-42 obtenue ä l'exemple 1 en utilisant des porcs SPF, repartis en 3 groupes, le vaccin de la RA atténué vivant etant administré (chaque fois 1, 0 ml) par la voie intranasale aux animaux de deux groupes, en une quantité
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in de 1 x 10 cellules et de 1 x 108 cellules respective- ment, aucune bacterie n'étant administrée ä l'autre groupe d'animaux témoins (chaque groupe : 2 animaux). 15 jours après l'inoculation, on a procédé ä l'autopsie de tous les animaux.
Au cours de la periode d'observation, on n'a constaté aucun signe clinique anormal chez aucun des animaux et, de même, on n'a pas observe de symptômes anormaux que ce soit macroscopiquement ou histologiquement dans les divers organes de ces animaux. En conclusion, on peut affirmer que la souche B-42 n'est pas toxique pour les porcs.
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Exemple d'essai 2
On a dissous un vaccin de la RA vivant dans une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7, 0), sterile et on a davantage dilue le produit avec la même solution en une serie de dilutions décuples. On a teste l'immunogenicit6 du vaccin en une concentration de 104 cel-
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6 8 lules/ml, de 10 cellules/ml et de 10 cellules/ml en utilisant des porcs SFP.
On a réparti 12 porcs SFP nouveaux-nes, ages de 3 jours, qui étaient négatifs pour les anticorps contre B. bronchiseptica, en 4 groupes (3 groupes immunisés et un groupe témoin), à raison de 3 animaux dans chaque groupe, le vaccin étant administré (chaque fois 1 ml par animal) aux animaux de 3 groupes, les animaux du quatrième groupe ne recevant pas de vaccin. 3 semaines après l'inoculation, on a procédé ä l'excitation ou stimulation de tous les animaux avec B. bronchiseptica, souche L3 (souche'virulente), à raison de 1 x 107 cellules/ml/porc, par la voie nasale. 10 semaines apyres l'excitation ou la stimulation, on a soumis tous les animaux ä une autopsie.
Au cours de la période experimentale, aucun des animaux des groupes vaccines ne manifesta de symptoms cliniques anormaux et les cornets osseux nasaux de tous les animaux étaient normaux, ä l'exception de ceux de 2 porcs d'un groupe immunise avec 1 x 104 cellules/porc qui manifestaient une legere atrophie des cornets. Dans le cas des animaux non vaccines du groupe témoin, tous les animaux manifestaient des symptömes cliniques, tels que des éternuements et une atteinte ophtalmique et on a observé un retard de croissance. On a constaté une grave atrophie des cornets osseux chez tous les animaux lors de l'autopsie. Ceci a confirma que le vaccin confere une protection efficace aux porcs contre B. bronchiseptica.
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Exemple d'essai 3 On a testé la souche B-42 en utilisant des porcs SPF négatifs pour les anticorps contre B. bronchiseptica, oü la virulence etait inversee. A des porcs nouveaux-nes SPF, ages de 3 jours on a inoculé par la voie intranasale le vaccin de la RA vivant (1 ml/porc, 1 x 10 cellules/ml). Après observation pendant une semaine, on a frott6 les cavités nasales des porcs avec des tampons ou écouvillons de coton steriles que l'on a plonges dans 1, 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate, sterile, de façon à préparer une suspension de bacteries obtenues par frottis. On a inocple 1 millilitre de la suspension aux 2 autres porcs nouveaux-nés et on a utilise 0, 5 ml supplementaire de cette suspension pour verifier les données taxonomiques des microbes et compter les nombres de cellules.
On a répété 3 fois ce mode operatoire (on a utilisé 2 porcs pour chaque procede).
L'observation n'a pas permis de constater des symptômes cliniques anormaux et l'autopsie n'a, elle non plus, pas reverie d'anomalie. On a constaté que les bactéries inocules avaient parfaitement crO dans les cavités nasales des animaux.
Ainsi que cela est illustré ci-dessus, la souche B- - 42 n'a pas donne de microbes virulents par inversion et ces propriétés de stabilité ont ainsi été confirmées.