NL8520062A - BACTERIOPHAGES AS RECOGNITION AND IDENTIFIER. - Google Patents
BACTERIOPHAGES AS RECOGNITION AND IDENTIFIER. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8520062A NL8520062A NL8520062A NL8520062A NL8520062A NL 8520062 A NL8520062 A NL 8520062A NL 8520062 A NL8520062 A NL 8520062A NL 8520062 A NL8520062 A NL 8520062A NL 8520062 A NL8520062 A NL 8520062A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- bacteriophage
- bacteria
- molecular
- antibodies
- mutant
- Prior art date
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
- G01N33/586—Liposomes, microcapsules or cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
β 5 2 O O 6 2 ! - Bacteriofageii als herkennings- en identificatiemiddelen - j i ; i ·.β 5 2 O O 6 2! - Bacteriophageii as recognition and identification means - j i; i ·.
i ; | De uitvinding heeft betrekking op het terrein I van de immunologie , verschaft een nieuwe en betrouwbare werkwijze | : voor de identificatie en bepaling van materialen van zowel ; procariotische als eucariotische cellen, en omvat een uitgekozen ^ bacteriofaag die gekoppeld is aan een zichtbaarmakend middel.i; | The invention relates to the field of immunology, provides a new and reliable method : for the identification and determination of materials of both; procariotic and eucariotic cells, and includes a selected bacteriophage linked to a visualizing agent.
Voorts wordt een onderzoekspakket verschaft voor de vlotte bepaling van bacteriën , eucariotische cellen en verschillende i moleculaire materialen.Furthermore, a research package is provided for the smooth determination of bacteria, eucariotic cells and various molecular materials.
I Op dit moment worden bijna uitsluitend anti- i ^ lichamen gebruikt voor het identificeren van moleculaire en i cellulaire structuren die zichzelf niet op andere wijze openbaren.Currently, almost exclusively antibodies are used to identify molecular and cellular structures that do not otherwise reveal themselves.
! Zij worden bijvoorbeeld gebruikt om het ene proteïne van het andere, het ene polysaccharide van het andere , of de ene cel van de andere te onderscheiden. De wisselwerking tussen de anti- I 15 i lichamen en de "geïdentificeerde " structuur kan bepaald worden met een aantal verschillende methoden die erop gericht zijn de aanwezigheid van de antilichamen zichtbaar te maken.! For example, they are used to distinguish one protein from another, one polysaccharide from another, or one cell from another. The interaction between the antibodies and the "identified" structure can be determined by a number of different methods aimed at revealing the presence of the antibodies.
In sommige proeven wordt een antilichaam dat aan de te identificeren structuur, cel of vaste fase gebonden is, j 20 .In some experiments, an antibody bound to the structure, cell, or solid phase to be identified, becomes 20.
| direkt zichtbaar gemaakt. Vaker wordt een tweede antilichaam :| made visible immediately. More often, a second antibody becomes:
i zichtbaar gemaakt en tegen het eerste antilichaam gericht. Boven- Ii visualized and directed against the first antibody. Top I
j dien wordt proteïne A van Staphylococcus aureus , Cowan I-stam, SIn addition, protein A of Staphylococcus aureus, Cowan I strain, S
| zichtbaar gemaakt , waarna dit zich aan het eerste antilichaam bindt. Een andere groep reagentia die gebruikt wordt om het 25 . . ! antilichaam zichtbaar te maken, wordt voorgesteld door biotme ; en avidine die elkaar herkennen en samen met antilichamen gebruikt kunnen worden. Fluorescerend materiaal, enzymen, radioaktieve || visualized, after which it binds to the first antibody. Another group of reagents used to test 25. . ! making antibody visible is represented by biotm; and avidin which recognize each other and can be used together with antibodies. Fluorescent material, enzymes, radioactive
ί II
I materialen, grote deeltjes, zoals erythrocyten , of korrels zijn iI materials, large particles, such as erythrocytes, or granules are i
' gebruikt om het antilichaam direkt of indirekt zichtbaar te Iused to make the antibody visible directly or indirectly
! 30 ! maken. ; 8520062! 30! to make. ; 8520062
VV
JJ
! - 2 - !! - 2 -!
Elk van deze methoden heeft tekortkomingen j en beperkingen welke toegelicht kunnen worden aan de hand van ! het gebruik van fluorescerende materialen voor het zichtbaar jEach of these methods has shortcomings j and limitations which can be explained using! the use of fluorescent materials for visible j
maken van het antilichaam . Als de hoeveelheid door een cel ge- ; 5 bonden antilichaam te klein is , kunnen de fluorescerende Imaking the antibody. If the amount consumed by a cell; 5 bound antibody is too small, the fluorescent I.
I reagentia deze niet detecteren. Dit veroorzaakt analytische j problemen, in het bijzonder wanneer men stroomcytometrie met j dubbele laser of bepalingssystemen met fluorescentie gebruikt. Verder is de fluorescentie die verkregen wordt met een antilichaam-! 10 systeem op weefseldelen niet erg helder. Dit probleem kan overwonnen worden door enzymen te gebruiken die aan het antilichaam gekoppeld worden. Een aantal stappen zijn echter altijd vereist ! i bij het kleurproces.I do not detect reagents. This causes analytical problems, particularly when using dual laser flow cytometry or fluorescence assay systems. Furthermore, the fluorescence obtained with an antibody is! 10 system on tissue parts not very clear. This problem can be overcome by using enzymes that are coupled to the antibody. However, a number of steps are always required! i in the staining process.
| Oplossingen voor het probleem zijn neergekomen !15 op het gebruik van fluorescerende bacteriën of fluorescerende | korrels. De eerstgenoemde kunnen slechts beperkt gebruikt worden bij fluorescentie-analyse door problemen bij het verwijderen van ! niet-gebonden overmaat bacteriën en ook door een belangrijke verandering in het lichtverstrooiende profiel van het celopper-20 vlak, waardoor stroomcytometrie niet geschikt gebruikt kan worden. De fluorescerende korrels hebben de neiging vast te blijven zitten op cellen, zijn moeilijk te produceren of te duur, en zij zijn ook groot genoeg om veranderingen in het lichtverstrooiende profiel van het celoppervlak te veroorzaken. Bovendien j i25 zijn in bepalingssystemen met fluorescentie waarbij filtratie j en wassingen vereist worden, de overmaat deeltjes of bacteriën j moeilijk, zo niet onmogelijk, te verwijderen. Het gebruik van j i j reagentia zoals bacteriën of colloidaal goud voor gekleurde, ; ! . . : gefixeerde celpreparaten is beperkt tot microscopie. Bijgevolg is i 30 er een behoefte ontstaan aan een andere groep reagentia, die ! | de voordelen van antilichamen combineert met die van deeltjes en j die gebruikt kan worden voor stroomcytometrie voor weefseldelen i of voor bepalingen in de vaste fase voor oplosbare materialen.| Solutions to the problem have come down to using fluorescent bacteria or fluorescent bacteria grains. The former can only be used to a limited extent in fluorescence analysis due to problems in removing! unbound excess bacteria and also due to a significant change in the light scattering profile of the cell surface, whereby flow cytometry cannot be used appropriately. The fluorescent beads tend to stick to cells, are difficult to produce or expensive, and they are also large enough to cause changes in the light scattering profile of the cell surface. Moreover, in fluorescence assay systems requiring filtration j and washings, the excess particles or bacteria j are difficult, if not impossible, to remove. The use of reagents such as bacteria or colloidal gold for colored,; ! . . : fixed cell preparations are limited to microscopy. Consequently, a need has arisen for another group of reagents, which! | combines the advantages of antibodies with those of particles and j which can be used for flow cytometry for tissue parts i or for solid phase assays for soluble materials.
i | l i 8520062 'V' ί - 3 - ji | l i 8520062 'V' ί - 3 - j
I II I
j Vaste fasen die gebruikt worden in pakketten voor het bepalen j van antigenen of antilichamen in oplossingen, kunnen hiervoor gebruikt worden, ofwel direkt ofwel in competitieve bepalingen.j Solid phases used in packages for determining antigens or antibodies in solutions can be used for this either directly or in competitive assays.
Het is niet mogelijk gebleken een reagens te hebben dat alle 5 voordelen van antilichamen, zoals penetreerbaarheid en specifici- ; teit , combineerde met die van deeltjes, zoals zichtbaarheid.It has not been found possible to have a reagent that has all 5 advantages of antibodies, such as penetrability and specificity; combined with that of particles, such as visibility.
In feite was er een behoefte aan een reagens dat werkt als een antilichaam, maar veel groter is, hoewel niet zo groot,dat het de te identificeren structuren verbergt. Een dergelijk reagens i 10 moet uit sommige structuren, zoals gefixeerde cellen of weefsels, blijven en overmaat reagens moet gemakkelijk verwijderd worden.In fact, there was a need for a reagent that acts as an antibody, but is much larger, though not so large, as to hide the structures to be identified. Such a reagent must remain from some structures, such as fixed cells or tissues, and excess reagent must be easily removed.
Het is waarschijnlijk, dat men gevonden heeft dat bacteriofagen ofwel te klein zijn om als doelmatige dragers te dienen ofwel op een niet-specifieke wijze vast gaan zitten, 15 in het bijzonder door hun trilharen. Het enige waarvoor men bacteriofagen bij identificatieexperimenten gebruikt heeft, is dat men ze als virussen voor hun bacteriële gastheer gebruikt i ' i heeft of dat men antigenen op hun oppervlak aangebracht heeft, I gewoonlijk door een milde chemische koppelingswerkwijze , en j ; 20 vervolgens antilichamen tegen deze antigenen gebruikt heeft om het vermogen van de bacteriofaag|bactetiën te infecteren in | neutraliseringssystemen voor bacteriofagen , te blokkeren. Zo j werden bacteriofagen slechts als levende virussen gebruikt in j I het Amerikaanse octrooischrift 3.171.705 van Haimovich, et al, I 25 en in Amerikaanse octrooischrift 4.104.126 van Young . De ; bacteriofaag werd niet gebruikt als een drager voor antilichamen | ! als een identificatie- en kleuringsreagens. Het is waarschijnlijk, j | dat een deskundige wegens de boven gegeven redenen afgehouden is j ; | | van het gebruik van de faag voor enige andere bepalingen met j | 30 antilichamen. In het Amerikaanse octrooischrift 4.282.315 stelde j Luderer , et al , voor radioaktief gelabelde dierlijke virussen j te gebruiken om receptoren op materialen te detecteren, die | natuurlijke receptoren van deze virussen zijn of dergelijke recep- j i 8520062 j - 4 - i I toren nabootsen. In wezen werden de dierlijke virussen uitgekozenIt is likely that bacteriophages have been found to be either too small to serve as effective carriers or to trap in a non-specific manner, particularly due to their cilia. The only thing bacteriophages have been used for in identification experiments is that they have been used as viruses for their bacterial host i 'i or antigens have been applied to their surface, i usually by a mild chemical coupling method, and j; 20 subsequently used antibodies against these antigens to infect the ability of the bacteriophage | bactetia in | neutralization systems for bacteriophages. For example, bacteriophages were used as living viruses only in Haimovich U.S. Patent 3,171,705, et al., I 25, and Young U.S. 4,104,126. The; bacteriophage was not used as an antibody support ! as an identification and staining reagent. It is likely, j | that an expert has been detained for the reasons given above j; | | of using the phage for any other determinations with j | 30 antibodies. In U.S. Pat. No. 4,282,315, j Luderer, et al, suggested using radioactively labeled animal viruses j to detect receptors on materials that | natural receptors of these viruses are or mimic such receptors. In essence, the animal viruses were selected
I II I
wegens hun natuurlijke affiniteit voor bepaalde receptormaterialen,j waarna ze verwijderd en vermenigvuldigd werden. Dit werd in ^ wezen opgezet ofwel voor het identificeren van virusreceptoren of- j wel voor heemagglutinatiedoeleinden , dat wil zeggen, dat er een duidelijke overeenkomst was tussen de receptoren voor virus en de geïdentificeerde receptoren. Bacteriofagen , die bacteriële- virussen zijn , zijn niet in deze categorie in aanmerking genomen ^ wegens deze voor de hand liggende redenen. In de eerste plaats worden zij niet gebruikt voor enige bepalingen van de heemaggluti- ; natie of van de remming van heemagglutinatie; deze bepalingen ; zijn gebaseerd op kenmerken van slechts bepaalde dierlijke virussen.because of their natural affinity for certain receptor materials, j after which they were removed and multiplied. This was essentially designed either to identify virus receptors or for hemagglutination purposes, that is, there was a clear correspondence between the virus receptors and the identified receptors. Bacteriophages, which are bacterial viruses, have not been included in this category for these obvious reasons. In the first place, they are not used for any determinations of the hemaggluti-; nation or of the inhibition of heme agglutination; these provisions; are based on characteristics of only certain animal viruses.
| In de tweede plaats is het bekend, dat bacteriofagen gespecialiseerde ^ . structuren hebben, meestal in de vorm van een staart, die gebruikt worden voor de herkenning van de receptor op bacteriën, wat tot infectie leidt. Het is bekend, dat als deze staart zich eenmaal aan zijn receptor bindt, zelfs wanneer het niet op bacteriën maar in oplossing is, het nucleïnezuur uitgedreven wordt en het 20 virus niet-infectieus wordt. Een dergelijke selectiemethode zou onmogelijk in aanmerking hebben kunnen komen volgens de methoden van het octrooischrift van Luderer, et al. Aan de andere kant j zou de bacteriofaag niét voor selectie in aanmerking gekomen zijn : | wat betreft de binding met het proteïne van de kop, aangezien i ' ; | mutaties in de proteïnen van de kop als lethaal voor de bacterio- faag beschouwd worden. Dit kan verklaren , waarom het octrooischrift van Luderer, et al, de bacteriofaag niet als een mogelijk alterna- | tief beschouwde, ondanks het feit, dat bacteriofagen veel goed- | koper te produceren zijn en gemakkelijk in een zeer grote hoeveel- i on heid gevormd worden, bijvoorbeeld orden groter dan dierlijke ! JU j | virussen.| Secondly, bacteriophages are known to be specialized. have structures, usually in the form of a tail, that are used to recognize the receptor on bacteria, leading to infection. It is known that once this tail binds to its receptor, even when it is not on bacteria but in solution, the nucleic acid is expelled and the virus becomes non-infectious. Such a selection method could not possibly have been eligible according to the methods of the Luderer, et al. Patent. On the other hand, the bacteriophage would not have been eligible for selection: | regarding binding to the protein of the head, since i '; | mutations in the proteins of the head are considered lethal to the bacteriophage. This may explain why the Luderer, et al. Patent does not consider the bacteriophage as a possible alternative. , despite the fact that bacteriophages have many benefits can be produced in copper and are easily formed in a very large quantity, for example orders larger than animal ones! JU j | viruses.
i Ii I
; De uitvinding heeft betrekking op een nieuwe werkwijze voor de identificatie en kwantificering van moleculaire ; j en cellulaire materialen van zowel procariotische als eucariotischë 8520062 ! - 5 -; The invention relates to a new method for the identification and quantification of molecular; and cellular materials of both procariotic and eucariotic 8520062! - 5 -
i Ii I
I cellen, waarbij een proefmonster gecombineerd wordt met een geselecteerde bacteriofaag onder bindingsomstandigheden ter i verkrijging van een conjugaatfase in het proefmonster , welk conjugaat de bacteriofaag omvat, gekoppeld aan het molecuul of de cellen die men tracht te identificeren. Een ^zich tb aanhakend middel wordt voor of na de bindingsstap in de bacteriofaag opgenomen om de herkenning van het proefmateriaal in gebruikelijke analytische bepalingsmethoden sterk te verbeteren. Bij het uitvoeren van de uitvinding kan de bacteriofaag zodanig geselec- 10 teerd worden dat hij met de kop of met de staart bindt. In het | laatste geval, wordt dit teweeggebracht door "uitwendige beeld- j : | vorming" waarbij de bacteriofaag zodanig gemodificeerd wordt | dat hij zich als een antilichaam gedraagt.I cells, wherein a test sample is combined with a selected bacteriophage under binding conditions to obtain a conjugate phase in the test sample, which conjugate comprises the bacteriophage coupled to the molecule or cells attempted to be identified. A tb annealing agent is incorporated into the bacteriophage before or after the binding step to greatly improve recognition of the test material in conventional analytical assay methods. In carrying out the invention, the bacteriophage can be selected to bind with the head or tail. In the | last case, this is brought about by "external imaging" where the bacteriophage is modified such | that it behaves like an antibody.
In het algemeen worden mutanten van de bacterio-I15 , . . , | faag gebruikt. De werkwijze van de uitvinding kan geschikt gemaakt worden voor de analyse van proteïnen, koolhydraten , ; lectinen , bacteriën van verschillende typen, pathogenen en gemengde moleculaire of cellulaire materialen die in weefsels, cellen of vloeistoffen aanwezig zijn.In general, mutants of the bacterio-I15,. . , | phage used. The method of the invention can be made suitable for the analysis of proteins, carbohydrates,; lectins, bacteria of different types, pathogens and mixed molecular or cellular materials present in tissues, cells or fluids.
20 '20 '
Voorts is het een oogmerk van de uitvinding ! onderzoekspakketten te verschaffen, die de geselecteerde bacterio faag en geschikte proefmiddelen omvatten ter verschaffing van het proefmateriaal in een vorm welke geschikt is voor gebruik in ! elk uitgekozen analytisch instrument.Furthermore, it is an object of the invention! provide test kits comprising the selected bacteriophage and suitable test agents to provide the test material in a form suitable for use in any chosen analytical tool.
25 !25!
De herkenning van een structuur door eenThe recognition of a structure by a
identificatiemiddel zoals een antilichaam kan onderverdeeld wor- Imeans of identification such as an antibody can be subdivided I
den in twee delen, de "herkenningsplaats" (intelligence), dat ; | wil zeggen de specifieke plaats die een complementaire structuur j bindt, en de "zichtbaarmaker1!1 (visualizer) , dat wil zeggen ! i 30 | de structuur die op de een of andere wijze zichtbaar gemaakt wordt.jden in two parts, the "recognition site" (intelligence), that; | ie the specific place that binds a complementary structure j, and the "visualizer1! 1 (visualizer), that is! i 30 | the structure that is somehow visualized. j
Zo wordt bijvoorbeeld in het geval van fluorescerende bacterie- \ ί ! korrels die met antilichaam bedekt zijn , de "herkenningsplaats" i verschaft door de aanhechtingsplaats van het antilichaammolecuul en de " zichtbaarmaker " . door de rest van het molecuul met de 8520062 t : I - 6 - i j moleculaire aanhangsels (fluorescerend, radioaktief, enz. ).For example, in the case of fluorescent bacteria, \ ί! beads coated with antibody, the "recognition site" i provided by the attachment site of the antibody molecule and the "visualizer". through the rest of the molecule with the 8520062 t: I - 6 - i molecular attachments (fluorescent, radioactive, etc.).
Ter verschaffing van een extra "zichtbaarmaker" volgens de | uitvinding worden de antilichamen gekoppeld aan bacteriofagen.To provide an additional "visualizer" according to the In the invention, the antibodies are coupled to bacteriophages.
Deze koppeling kan covalent zijn, zoals met glutaaraldehyde ^ of bifunctionele reagentia , of niet-covalent, zoals met hybride- : antilichamen . Ook kunnen volgens de uitvinding de bacteriofagen zodanig geselecteerd en geconstrueerd worden , dat ze de "herkenningsplaats" verschaffen, dat wil zeggen dat ze als antilichamen functioneren, en ook de "zichtbaarmaker" ' dragen. : 10 ...This coupling can be covalent, such as with glutaraldehyde or bifunctional reagents, or non-covalent, such as with hybrid antibodies. Also, according to the invention, the bacteriophages can be selected and constructed to provide the "recognition site", that is, to function as antibodies, and also carry the "visualizer". : 10 ...
Bij de identificatie van bacteriën m patholo- | gische vloeistoffen kost het tijd de bacteriën te kweken en | te identificeren en , in vele gevallen , kunnen de bacteriën | niet in cultuur gekweekt worden. Voor deze gevallen worden ! bacteriofagen zichtbaar gemaakt en ofwel met antilichamen bedekt 115 | ofwel op natuurlijke wijze via hun receptor gebonden.In the identification of bacteria m patholo- | gic liquids takes time to culture the bacteria and | to identify and, in many cases, the bacteria not be cultivated in culture. For these cases be! bacteriophages visualized and either coated with antibodies 115 | or bound naturally through their receptor.
| Bij het uitvoeren van de werkwijze van de i uitvinding worden bacteriofagen gebruikt als de zichtbaarmaker, of de drager van de herkenningsplaats, welke door het antilichaam verschaft wordt. Antilichamen kunnen chemisch aan bacteriofagen 20 ....| In carrying out the method of the invention, bacteriophages are used as the visualizer, or carrier of the recognition site, which is provided by the antibody. Antibodies can chemically attack bacteriophages 20 ....
gekoppeld worden, waarbij bifunctionele reagentia, zoals glutaar- ; aldehyd of andere covalente of niet-covalente koppelingsmiddelen ; gebruikt worden. Bacteriofagen worden met avidine of biotine ; | bedekt om aan het antilichaam dat respectievelijk biotine of | avidine heeft , te binden. De binding wordt verkregen via !25 ...coupled with bifunctional reagents such as glutar; aldehyde or other covalent or non-covalent coupling agents; being used. Bacteriophages are taken with avidin or biotin; | coated to the antibody containing biotin or | avidin to bind. The bond is obtained via! 25 ...
| biotme-avidine herkenning. j ] Bacteriofagen dienen als zichtbaarmakers door j i ... . i | aan de te identificeren structuur te binden met behulp van hybride-: ! antilichamen. Deze worden met een aanhechtingsplaats tegen de j bacteriofaag en met de andere tegen een eerste antilichaam of i 30 . . . . . i de te identificeren structuur gericht. De bacteriofaag kan ook aan lectinen of koolhydraten gekoppeld worden voor herkenning van de respectievelijke complementaire structuren, i i .| biotme avidin recognition. j] Bacteriophages serve as visualizers by j i .... i | to bind the structure to be identified using hybrid:! antibodies. These are placed with an attachment site against the bacteriophage and with the other against a first antibody or. . . . . i target the structure to be identified. The bacteriophage can also be linked to lectins or carbohydrates for recognition of the respective complementary structures, i.
De door de bacteriofaag verschafte zichtbaar- : 1 8520062 maker wordt met behulp van fluorescerende kleurstoffen, andere i iThe visible maker provided by the bacteriophage is made using fluorescent dyes, other i.
! - 7 - I! - 7 - I
kleurstoffen, radioaktief isotoop-materiaal, enzymen , of metalen zoals zilver of goud verkregen. De bacteriofaag kan ook ] zodanig gemanipuleerd worden dat hij het geschikte enzym j bevat. | -* Bacteriofagen kunnen zodanig geselecteerd worden; dat ze zowel de herkenningsplaats als de zichtbaarmaker verschaf-j fen door genetische manipulatie, die ze voorziet van een j "aanhechtingsplaats'·':. Na mutatie worden de bacteriofagen vervol- j gens geselecteerd op de eigenschap van de kop aan moleculen j 10 zoals immunoglobulinen of aan glycoproteïnen of proteïnen van ! dierlijke cellen te binden. De mutanten worden bijvoorbeeld verkregen door bestraling met ultraviolet licht van zowel bacteriofaag als bacteriën, gevolgd door de kweek van de bacteriofaag.dyes, radioactive isotope material, enzymes, or metals such as silver or gold. The bacteriophage can also be manipulated to contain the appropriate enzyme. | - * Bacteriophages can be selected such; that they provide both the recognition site and the visualizer by genetic engineering, which provides them with an "attachment site": After mutation, the bacteriophages are then selected for the property of the head on molecules j 10 such as immunoglobulins or to bind to glycoproteins or proteins of animal cells The mutants are obtained, for example, by ultraviolet irradiation of both bacteriophage and bacteria, followed by culture of the bacteriophage.
De bacteriofaag wordt verzameld, gezuiverd en de selectiedruk 15 wordt toegepast, te weten , binding aan celoppervlakken of aan i # # # ' moleculen die aan een vaste fase gekoppeld zijn. De bacteriofaag wordt direkt of nadat de cel bahendeld is met het antilichaam | dat door de bacteriofaag herkend wordt, fluorescerend gemaakt 1 voor identificatie van het celoppervlak. De lethale aard van kop- 20 mutaties wordt vermeden door zeer grote aantallen deeltjes te-.- j gebruiken en temperatuurresistente mutanten te selecteren, ; waarbij derhalve geselecteerd wordt op zeer zeldzame gevallen ! | die nog verenigbaar zijn met het overleven van de bacteriofaag.The bacteriophage is collected, purified and the selection pressure is applied, viz., Binding to cell surfaces or to solid phase-coupled molecules. The bacteriophage becomes immediately or after the cell has been treated with the antibody | recognized by the bacteriophage rendered fluorescent 1 for cell surface identification. The lethal nature of head mutations is avoided by using very large numbers of particles and selecting temperature resistant mutants; whereby selection is therefore made on very rare cases! | which are still compatible with the survival of the bacteriophage.
Een ander stel mutanten kan bereid worden jAnother set of mutants can be prepared j
; 25 door gebruik te maken van de mogelijkheid van de staart om I; 25 by making use of the possibility of the tail to I.
aan een specifieke structuur op het oppervlak van bacteriën te j binden. Door mutatie en selectie worden bacteriofagen geselec- j teerd die met hun staart bepaalde structuren kunnen herkennen. | I Dit wordt gedaan met behulp van "uitwendige beeldvorming" ; ! 20 (external imaging) , een niet voor de hand liggende analogie met ; ; inwendige beeldvorming m 1 het anti-idiotype netwerk van anti- j lichamen, zoals besproken is door Urbain, et al., j | i 8520062 - 8 - : ; j f : j Progress in Immunology, 1980, Academic Press, Vol. I p. 81-92.to bind to a specific structure on the surface of bacteria. Bacteriophages are selected by mutation and selection, which can recognize certain structures with their tail. | I This is done using "external imaging"; ! 20 (external imaging), an unobvious analogy with; ; internal imaging m 1 the anti-idiotype network of antibodies, as discussed by Urbain, et al., j | 8520062-8 -:; j f: j Progress in Immunology, 1980, Academic Press, Vol. I p. 81-92.
| Het te identificeren molecuul MX" wordt geïnjecteerd in een ; dier en antilichamen worden ertegen gemaakt. De gezuiverde anti-"X"-antilichamen worden aan een vaste fase gekoppeld en met een zeer groot aantal bacteriëi behandeld. Deze bacteriën j worden uit een voor bacteriofagen gevoelige ouderstam geselecteerd op resistentie tegen bacteriofaag "Y" . Deze tegen bacteriofagen : resistente bacteriën hebben geen receptoren voor de bacteriofaag. Bacteriën die aan deze antilichamen binden , worden geselec- 10 teerd en gekweekt , zodat ze een structuur hebben die "X" nabootst. De selectie van bacteriën die "X"-achtige structuren | kunnen vertonen, kan getoetst worden door hun vermogen gezuiverd ; anti-"X” te binden. Het is zeer onwaarschijnlijk, dat een derge- ! lijke structuur de receptor voor de bacteriofaag kan zijn.| The molecule of MX "to be identified is injected into an animal and antibodies are made against it. The purified anti-" X "antibodies are coupled to a solid phase and treated with a very large number of bacteria. These bacteria are extracted from a bacteriophage sensitive parent strain selected for resistance to bacteriophage "Y" Those against bacteriophages: resistant bacteria have no receptors for the bacteriophage Bacteria that bind to these antibodies are selected and grown to have a structure that mimics "X". The selection of bacteria that can exhibit "X" -like structures | can be tested by their ability to bind purified anti-"X". It is very unlikely that such a! structure may be the receptor for the bacteriophage.
i 15i 15
Deze bacteriën worden vervolgens m ongeveer gelijke gedeelten gemengd met de voor bacteriofagen gevoelige bacteriën welke met UV bestraald waren en behandeld met gemutageniseerde (bijvoorbeeld met UV bestraalde ) bacteriofaag. De mutant-bacteriofagen die uit gevoelige bacteriën tevoorschijn komen en die de recep- ' 20 . .These bacteria are then mixed approximately equal parts with the bacteriophage sensitive bacteria which had been irradiated with UV and treated with mutagenized (for example UV irradiated) bacteriophage. The mutant bacteriophages that emerge from susceptible bacteria and which infect the receptors. .
tor op de voor bcteriofaag resistente bacteriën kunnen herkennen , groeien in deze bacteriën. Derhalve zal alle samenkomende lyse troebel zijn aangezien slechts de voor bacteriofaag gevoelige bacteriën gelyseerd worden , behalve een paar heldere plekken, waarin beide bacteriën als resultaat van de j 25 mutant gelyseerd worden. De plekken worden verwijderd met een ; absorberend materiaal en de mutanten die "X" herkennen, worden gedetecteerd met een '^"-monster dat zichtbaar , dat wil zeggen radioaktief, fluorescerend, enz. gemaakt is. De mutant-bacterio- ' fagen worden op de plaat opgespoord en op hun nieuwe bacteriele ! 30 j gastheer gekloond. Het vermogen van alle klonen om "X" te; j herkennen, wordt bepaald op een vaste fase door competitieve | proeven met vrij "X" en wat betreft competitie door "X" voor ! de infectie van bacteriën door deze mutant-bacteriofaag. Hoewel j f i 8520062 - 9 - : s de herkenning met de staart van de receptor op bacteriën enige overeenkomst met antigeen-antilichaam interakties kan hebben, heeft het herkenningsproces met de bacteriofaag eigen andere kenmerken, die ze tot een verrassende en onverwachte vervanging 5 voor antilichamen maakt. Het is ook onverwacht , dat de bacteriofagen geselecteerd worden wat betreft de gewenste plaats-herkenning, aangezien bekend is , <ht mutaties van de bacteriofaag wat betreft het gastheerbereik tamelijk frequent zijn. j Met behulp van andere genetische manipulaties brengt men de bacteriofagen ertoe een bepaald antigeen te herkennen. Bacteriën worden gebruikt die bepaalde oppervlaktestructuren hebben welke door plasmiden beheerst worden.can recognize bacteria that are resistant to bacteriophage, grow in these bacteria. Therefore, all the lysis will be cloudy since only the bacteriophage sensitive bacteria are lysed, except for a few clear spots, in which both bacteria are lysed as a result of the mutant. The spots are removed with a; absorbent material and the mutants recognizing "X" are detected with a "^" sample made visible, i.e., radioactive, fluorescent, etc. The mutant bacteriophages are detected on the plate and on their new bacterial host cloned The ability of all clones to recognize "X" is determined on a solid phase by competitive tests with free "X" and competition by "X" for the infection of bacteria by this mutant bacteriophage Although the recognition of the receptor on bacteria by the tail of the receptor may have some similarities with antigen-antibody interactions, the recognition process with the bacteriophage has its own other characteristics, which makes them surprising. and makes unexpected replacement for antibodies 5. It is also unexpected that the bacteriophages are selected for the desired site recognition, as it is known that the mutations of the bacteriophage are host-related gentleman's range are fairly frequent. j Using other genetic manipulations, the bacteriophages are induced to recognize a certain antigen. Bacteria are used that have certain surface structures that are controlled by plasmids.
Zo wordt bijvoorbeeld het gen voor nX" in het plasmide opgenomen. Bacteriën die MXM op hun oppervlak vertonen , worden vervolgens 15 als boven beschreven geselecteerd. Deze oppervlakteproteïnen of glycoproteïnen bevinden zich op structuren die door de bacteriofaag als receptoren gebruikt worden. Door bacteriofagen te selecteren die deze structuren herkennen als hun infectie- | ! receptoren , worden bacteriofagen verkregen die MXM herkennen.For example, the gene for nX "is introduced into the plasmid. Bacteria displaying MXM on their surface are then selected as described above. These surface proteins or glycoproteins are located on structures used by the bacteriophage as receptors. By selecting bacteriophages recognizing these structures as their infection receptors, bacteriophages recognizing MXM are obtained.
20 Bijgevolg wordt een uitwendig beeld van het antigeen op bacteriën 1 verkregen. jConsequently, an external image of the antigen on bacteria 1 is obtained. j
In een andere benadering wordt de staart van j de bacteriofaag gemaakt met dezelfde sequenties als zware ! ! en/of lichte immunoglobulineketens, door recombinatie met immuno- j i 25 globulinegenen in plasmiden. Oorspronkelijke bacteriofagen met j j de normale staartsequenties worden door absorptie met natuurlijke gastheren verwijderd. Deze worden gemuteerd en geselecteerd wat betreft'iherkenning van MX" met de boven beschreven methoden, j Een volledige inrichting met zware en lichte ketens wordt ver-| 50 kregen door bacteriën met "X" . op het oppervlak tegelijkertijd j i te infecteren met twee bacteriofagen, waarvan de één V -genpro- j i <£» ! | dukten en de ander V -genprodukten tot expressie brengt. j I ij [ 8520062 ...... ! ! ... ........... iIn another approach, the tail of the bacteriophage is made with the same sequences as heavy! ! and / or light immunoglobulin chains, by recombination with immunoglobulin genes in plasmids. Original bacteriophages with the normal tail sequences are removed by absorption with natural hosts. These are mutated and selected for recognition of MX by the methods described above. A complete heavy and light chain device is obtained by simultaneously infecting bacteria with "X" on the surface with two bacteriophages. one of which presses V gene gene and the other expresses V gene products. [8520062 ......!! ... ......... .. i
I II I
i - 10 t Ii - 10 t I
| Een middel voor het uitvoeren van de werkwijze van de uitvinding komt neer op het samenstellen van een pakket, j dat een geschikte bacteriofaag omvat , welke gekoppeld I wordt met een zichtbaarmakendimiddel, voor gebruik bij de iden- j : i 5 tificatie van bacteriën, eucariotische cellen en andere j moleculaire materialen. Een aantal porties van de faag kan verschaft worden, elk in een zodanige hoeveelheid dat deze doeltreffend is bij de beoogde proef.| An agent for carrying out the method of the invention is tantamount to assembling a package comprising an appropriate bacteriophage which is coupled with a visualizing agent for use in the identification of bacteria, eucariotic cells and other molecular materials. A number of portions of the phage can be provided, each in an amount such that it is effective in the intended experiment.
De volgende voorbeelden dienen als toelichting, ! 10 zonder dat de werkwijze van de uitvinding hiertoe beperkt wordt .The following examples serve as an explanation,! 10 without limiting the method of the invention to this.
Voorbeeld I~AExample I ~ A
Bacteriofagen worden aan monoklonale of I polyklonale antilichamen gekoppeld, nadat ze fluorescerend of | 15 radioaktief gemaakt , of aan peroxydase gekoppeld zijn, en worden als een kleuringsmiddel , of identificatiemiddel , gebruikt. Voor het bepalen van muizenimmunoglobuline G (MIG) wordt de bacteriofaag bedekt met anti-MIG-antilichamen door een koppelingsmiddel , bijvoorbeeld glutaaraldehyd of een ander i 20 bifunctioneel reagens te gebruiken. De faag wordt fluorescerendBacteriophages are coupled to monoclonal or I polyclonal antibodies after they are fluorescent or 15 have been made radioactive, or coupled to peroxidase, and are used as a colorant, or identifier. To determine murine immunoglobulin G (MIG), the bacteriophage is coated with anti-MIG antibodies by using a coupling agent, for example glutaraldehyde or another bifunctional reagent. The phage becomes fluorescent
gemaakt door koppeling met fluoresceïneisothiocyanaat , rhodamine j of andere fluorescerende kleurstoffen, door behandeling met ethidiumbromide , dat aan het DNA van de faag bindt, of door andere kleurstoffen die aan nucleïnezuren binden. De faag wordt 25 radioaktief gemaakt ofwel door het opnemen van radioaktieve Imade by coupling with fluorescein isothiocyanate, rhodamine j or other fluorescent dyes, by treatment with ethidium bromide, which binds to the DNA of the phage, or by other dyes that bind to nucleic acids. The phage is made radioactive or by incorporating radioactive I.
i I materialen in het proteïne of nucleïnezuur of met gebruikelijke méthoden voor het koppelen van radioaktieve materialen aan \ proteïnen . In het alternatief wordt een metaal zoals zilver aan de faag volgens gebruikelijke methoden toegevoegd. j ; 30 De bacteriofaagsuspensie werd als volgt bereid: ;Materials in the protein or nucleic acid or by conventional methods of coupling radioactive materials to proteins. In the alternative, a metal such as silver is added to the phage by conventional methods. j; The bacteriophage suspension was prepared as follows:;
In een proefvoorbeeld werd bacteriofaag T4 gekweekt in YS57-stam van Escherichia coli (Trp, Pro, His)♦ Bacteriën werden j 8520062 ! - 11 - I gekweekt in tryptische sojabroedvloeistof ( DIFCO) en met faag gemengd voor een groot aantal infecties van 0,5 tot 1. Het ; mengsel van bacteriën en bacteriofaag werd geincubeerd in zachte i agar op een voedingslaag van harde agar. Na incubatie gedurende i ^ de nacht werden de bacteriën volledig door de faag gelyseerd en werd de bovenlaag van zachte agar verzameld en met chloroform ! en met 0,01 M EDTA behandeld om het niet-faagmateriaal te precipiteren.In a test example, bacteriophage T4 was grown in YS57 strain of Escherichia coli (Trp, Pro, His) ♦ Bacteria were grown 8520062! - 11 - I grown in tryptic soy broth (DIFCO) and phage mixed for a wide range of infections from 0.5 to 1. It; mixture of bacteria and bacteriophage was incubated in soft agar on a nutrient layer of hard agar. After overnight incubation, the bacteria were completely lysed by the phage and the top layer of soft agar was collected and with chloroform! and treated with 0.01 M EDTA to precipitate the non-phage material.
I Na 1 uur bij 37°C werd het mengsel bij 5000 G gedurende 10 | minuten gecentrifugeerd en werd de bovenstaande vloeistof verzameld.! '10 . , j ! Ter verwijdering van vrije nucleinezuren werd de bovenstaande jAfter 1 hour at 37 ° C, the mixture was stirred at 5000 G for 10 µl minutes and the supernatant was collected. '10. , j! To remove free nucleic acids, the above j
| vloeistof bij 37°C gedurende 1 uur behandeld met 20 ug/ml I| liquid at 37 ° C for 1 hour treated with 20 µg / ml I.
\ DNAase en 20 ug/ml RNAase . Om de faag te wassen werden NaCl en j I j j polyethyleenglycol (PEG) toegevoegd tot uiteindelijke concentraties j van 0,5 M respectievelijk 6%, en werd het mengsel gedurende | ,15 ^ | 18 uur bij 4°C geincubeerd· Na centrifugeren bij 8000 G gedurende \ I 30 minuten en opnieuw suspenderen in 0,14 M NaCl„, werd een 1 13 uitemdelijke bacteriofaagconcentratie van ongeveer 10 infectieve j eenheden/ml verkregen. Het absorptieprofiel bij verschillende | golflengten was dat van een zuivere faagpopulatie.DNAase and 20 µg / ml RNAase. To wash the phage, NaCl and j I j j polyethylene glycol (PEG) were added to final concentrations j of 0.5 M and 6%, respectively, and the mixture was washed for | , 15 ^ | Incubated at 4 ° C for 18 hours. · After centrifugation at 8000 G for 30 minutes and resuspending in 0.14 M NaCl 2, an ex-bacteriophage concentration of about 10 infectious units / ml was obtained. The absorption profile at different | wavelengths were that of a pure phage population.
I 20 ! Voor het bekleden met antilichamen werd de vol- : ! 'I 20! Before coating with antibodies, the vol. '
| gende werkwijze gebruikt. De faag werd m suspensie in 0,1 M| method. The phage was slurried in 0.1 M
1 i i , , | fosfaatbuffer bij pH 8,5 gemengd met glutaaraldehyd tot een concentratie van 1% en gedurende 1 uur bij 25°C geincubeerd.1 i i,, | phosphate buffer at pH 8.5 mixed with glutaraldehyde to a concentration of 1% and incubated at 25 ° C for 1 hour.
i 25i 25
I Overmaat glutaaraldehyd werd verwijderd door de faag met 0,5 MI Excess glutaraldehyde was removed through the 0.5 M phage
j NaCl en 6% PEG te precipiteren en opnieuw te suspenderen in buffer bij pH 8,5 . Antilichaam, anti-konijn Ig werd toegevoegd ter verkrijging van 1 mg antilichaam/ 1 mg faagproteïne.Precipitate NaCl and 6% PEG and resuspend in buffer at pH 8.5. Antibody, anti-rabbit Ig was added to give 1 mg of antibody / 1 mg of phage protein.
Na 2 uur incubatie bij 4°C met konijnelymfocietan werden de cellen 30 ...After 2 hours incubation at 4 ° C with rabbit lymphocietan, the cells were 30 ...
drie maal gewassen door centrifugeren bij 900 G gedurende 5 minuten.washed three times by centrifugation at 900 G for 5 minutes.
De binding van de fluorescerende faag werd vergeleken met die van de fluorescerende faag welke bedekt was met ofwel normaal IgG in plaats van antilichamen ofwel met fluoresce- 8520062 ; - 12 - rende anti-Ig-antilichamen. De cellen werden onder de fluorescen- tiemicroscoop beoordeeld. De cellen met macrofaagkarakter (dat wil zeggen groot) bevatten 2-5 % faagdeeltjes zowel in normaal Ig- als anti-Ig-antilichaampreparaten. Van het celpreparaat, I 5 dat behandeld was met met anti-Ig-antilichaam bedekte faag had j échter 47% van de cellen fluorescentie aan het oppervlak , | terwijl de cellen die met normale met Ig bedekte faag behandeld I waren , slechts 1-2 % hadden.The binding of the fluorescent phage was compared to that of the fluorescent phage coated with either normal IgG instead of antibodies or fluorescent 8520062; - 12 - ran anti-Ig antibodies. The cells were evaluated under the fluorescence microscope. The macrophage character cells (i.e., large) contain 2-5% phage particles in both normal Ig and anti-Ig antibody preparations. However, of the cell preparation I5 treated with phage coated with anti-Ig antibody, 47% of the cells had surface fluorescence, | while the cells treated with normal Ig-coated phage I had only 1-2%.
De fluorescentie van het oppervlak was intenser i 10 dan die van dezelfde cellen welke met anti-Ig fluorescerendeThe surface fluorescence was more intense than that of the same cells which fluoresced with anti-Ig
I II I
! antilichamen behandeld waren. De met anti-Ig-antilichaam bedekte j fagen vertoonden derhalve bindingsspecificiteit en gaven een j! antibodies were treated. Therefore, the anti-Ig antibody-coated phages showed binding specificity and gave a j
intense fluorescentie. Iintense fluorescence. I
| 15 Voorbeeld I-B j | .............| Example I-B j | .............
| Geconcentreerde, gezuiverde bacteriofaag wordt | met een heterobifunctioneel reagens behandeld. Anti-allotype- j | antilichaam (anti b^) van het konijn wordt gethioleerd en een brug | tussen de twee wordt gevormd, zodat het antilichaam van het konijn | 20 aan de faag gekoppeld wordt. Ter controle wordt de faag vervolgens j i fluorescerend gemaakt. Het faag-antilichaam-complex wordt vervol- j ? j gens met de cellen gemengd, gewassen en met een microscoop of j i een ander geschikt instrument onderzocht. De mate van fluorescentie wordt bepaald door de mate van gebruik van aminogroepen of faag-| 25 proteïnen.| Concentrated, purified bacteriophage is treated with a heterobifunctional reagent. Anti-allotype- j | rabbit antibody (anti b ^) is thiolated and bridged between the two is formed so that the rabbit's antibody | 20 is coupled to the phage. As a control, the phage is then made fluorescent. The phage-antibody complex is then continued. mixed with the cells, washed and examined with a microscope or other suitable instrument. The degree of fluorescence is determined by the amount of use of amino groups or phage 25 proteins.
Voorbeeld I-CExample I-C
De met antilichaam bedekte faag wordt gebruikt voor het behandelen van gefixeerde weefseldelen. Een lymfe-30 knoopsectie wordt behandeld met een fluorescerend faagpreparaat, gewassen en onder UV-licht onderzocht. In een alternatieve methode wordt beklede faag geopenbaard door toevoeging aan het eind 8520062 - 13 - van het substraat volgens standaardmethoden. Deze methode wordt ook gebruikt voor fagen die geselecteerd zijn om spontaan te binden.The antibody-coated phage is used to treat fixed tissue parts. A lymph node section is treated with a fluorescent phage preparation, washed and examined under UV light. In an alternative method, coated phage are disclosed by addition of the substrate at the end 8520062-13 by standard methods. This method is also used for phages selected to bind spontaneously.
5 Voorbeeld I-D5 Example I-D
De faag die geselecteerd is op het herkennen van MIG ofwel met de staart ofwel met de kop, wordt gemengd met een oplossing die MIG-antilichamen , bijvoorbeeld monoklonale antilichamen bevat. Deze faag is fluorescerend of radioaktief.The phage selected to recognize MIG either tail or head is mixed with a solution containing MIG antibodies, e.g. monoclonal antibodies. This phage is fluorescent or radioactive.
10 Na wassen door precipitatie met PEG wordt deze gebruikt voor het vervangen van fagen welke chemisch aan antilichaam gekoppeld zijn. De fagen worden met een geschikte koppelingsmethode zichtbaar gemaakt.After washing by precipitation with PEG, it is used to replace phages chemically coupled to antibody. The phages are visualized by an appropriate coupling method.
15 Voorbeeld IIExample II
Bacteriofagen worden bestemd om te worden gebruikt bij snelle diagnose van pathologische materialen die bacteriën bevatten. Gewrichtsvloeistof of exudaat wordt uitgestreken, gefixeerd , fagen worden toegevoegd, en hun aanwezigheid 20 wordt zichtbaar gemaakt met geschikte instrumenten, zoals UV- licht voor fluorescentie , helder veld voor enzymen, enz. Door geautomatiseerde met een computer verbonden scanners te gebruiken wordt de werkwijze zeer snel gemaakt. De binding van fagen door antifaag-antilichamen wordt vermeden door competitieve verzadiging 25 met vrij faagproteïne of door het monster met formaldehyd te behandelen. Zeer kleine aantallen bacteriën worden, zelfs als ze dood zijn, gemakkelijk geïdentificeerd. Door toevoeging in twee stappen van complexe faagsuspensies tegen een groot aantal mogelijke pathogenen , gevolgd door afzonderlijke suspensies in 30 die produkten die positief blijken, kunnen zeldzame microorganis-men stiel, geïdentificeerd worden.Bacteriophages are intended for use in the rapid diagnosis of pathological materials containing bacteria. Synovial fluid or exudate is streaked, fixed, phages are added, and their presence is visualized with suitable instruments, such as UV light for fluorescence, bright field for enzymes, etc. Using automated computer-connected scanners makes the method very made quickly. Binding of phages by anti-phage antibodies is avoided by competitive saturation with free phage protein or by treating the sample with formaldehyde. Very small numbers of bacteria, even when dead, are easily identified. Rare microorganisms can be identified by adding two-step complex phage suspensions against a wide variety of pathogens, followed by separate suspensions in those products that prove positive.
Om de omstandigheden bij de identificatie van bacteriën in pathologische monsters na te bootsen, werd het volgende 8520062 - 14 - experiment uitgevoerd.To mimic the conditions in the identification of bacteria in pathological samples, the following 8520062-14 experiment was performed.
T4-bacteriofagen werden gekweekt en gezuiverd zoals in voorbeeld I-A. Verschillende hoeveelheden fluoresceine- iT4 bacteriophages were grown and purified as in Example I-A. Different amounts of fluorescein i
isothiocyanaat (FITC) , van 0,5 mg tot 8 mg , werden per 1 mg 5 faagprotelne toegevoegd. De faagsuspensie werd met 0,1 Misothiocyanate (FITC), from 0.5 mg to 8 mg, were added per 1 mg of 5 phage protein. The phage suspension was diluted with 0.1 M
ingesteld op een pH van 9,3 . FITC werd onder roeren bij 4°C toegevoegd , waarna het roeren gedurende 2 uur voortgezet en ! vervolgens bij 4°C gedurende nog een 20 uur geincubeerd werd.adjusted to a pH of 9.3. FITC was added with stirring at 4 ° C, then stirring continued for 2 hours and! then incubated at 4 ° C for another 20 hours.
Overmaat FITC werd verwijderd door de suspensie de dialyseren 10 tegen 0,1 M fosfaatbuffer (pH 8,5 ) gedurende 3 dagen bij 4°C. De uiteindelijke molverhoudingen FITC/proteïne in zeven preparaten waren (1) 3,8, (2) 8,0, (3) 11,3, (4) 18,6, (5) 29,2, (6) 19,3 , en (7) 16,4.Excess FITC was removed by dialyzing the suspension against 0.1 M phosphate buffer (pH 8.5) for 3 days at 4 ° C. The final molar ratios of FITC / protein in seven preparations were (1) 3.8, (2) 8.0, (3) 11.3, (4) 18.6, (5) 29.2, (6) 19, 3, and (7) 16.4.
Ter bepaling van de bindingsspecificiteit en 15 het vermogen de aanwezigheid van een microorganisme in een veld te onthullen , werd de T4-faag die in E.coli stam YS57 gekweekt was, beproefd wat betreft binding aan YS57. Als controles werden E.coli USC 106, die een tegen faagresistente mutant van YS57 is , Bacillus globiggi en Salmonella Schottmulleri gebruikt. 20 Om de binding te beproeven werden fagen gedurende 10 minuten bij 25°C gemengd met bacteriën die met formaldehyd gefixeerd waren, en vervolgens drie maal gewassen ter verwijdering van de niet-gebonden faag.To determine the binding specificity and the ability to reveal the presence of a microorganism in a field, the T4 phage grown in E. coli strain YS57 were tested for binding to YS57. As controls, E.coli USC 106, which is an anti-phage resistant mutant of YS57, Bacillus globiggi and Salmonella Schottmulleri were used. To test the binding, phages were mixed for 10 minutes at 25 ° C with bacteria fixed with formaldehyde, then washed three times to remove the unbound phage.
De voor faag gevoelige E. coli YS57 werd intens 25 fluorescerend, zodat zelfs een microorganisme duidelijk onder de fluorescentiemicroscoop gezien kon worden. Faagpreparaten (1) , (2) en (3) , dat wil zeggen tot aan een molverhouding van FITC/ proteïne van 11,3, werden intens fluorescerend gemaakt , en de mutant USC 106, B. Globiggi en S_. Schottmulleri niet.The phage sensitive E. coli YS57 became intensely fluorescent so that even a microorganism could be clearly seen under the fluorescence microscope. Phage preparations (1), (2) and (3), i.e. up to a molar ratio of FITC / protein of 11.3, were made intensely fluorescent, and the mutant USC 106, B. Globiggi and S_. Schottmulleri not.
30 Derhalve werd de faagspecificiteit gehandhaafd op een molverhouding van 11,3, welke gelijk is aan de als regel voor anti-lichamen gebruikte molverhouding. Aangezien de faagdeeltjes echter ongeveer 500 keer meer proteïne hebben dan antilichamen , verschaf- 8520062 - 15 - fen de faagdeeltjes ook die veel grotere totale fluorescentie.Therefore, the phage specificity was maintained at a molar ratio of 11.3, which is equal to the molar ratio commonly used for antibodies. However, since the phage particles have about 500 times more protein than antibodies, the phage particles also provide that much greater total fluorescence.
Wanneer verse USC 106 en YS57-stammen van E.coli gebruikt werden (dat wil zeggen niet gefixeerd met formal-dehyd ) bond de faag gelijkelijk aan beide bacteriën.When fresh USC 106 and YS57 strains of E. coli were used (i.e., not fixed with formaldehyde), the phage bound equally to both bacteria.
5 Dit was een onverwachte vondst, die aantoonde dat het preparaat eerst met formaldehyde gefixeerd moet worden. Dit geeft het ! voordeel dat antilichamen vernietigd worden, in het bijzonder natuurlijke antilichamen die in te onderzoeken pathologische preparaten aanwezig kunnen zijn en die de faag kunnen binden.5 This was an unexpected finding, showing that the preparation must first be fixed with formaldehyde. This gives it! advantage of destruction of antibodies, in particular natural antibodies, which may be present in pathological preparations to be investigated and which can bind the phage.
1010
Voorbeeld III-AExample III-A
De eerste voorwaarde voor het verkrijgen van mutanten van fagen die moleculen en cellen herkennen , is , dat de faag niet van nature al aan dergelijke cellen of moleculen 15 bindt. Derhalve werden fagen als in voorbeeld I-A bereid en fluorescerend gemaakt tot een molaire verhouding van FITC/faag-proteïne van 11,3 . Deze fagen werden beproefd wat betreft hun vermogen om te binden aan complexe cellen , met monoklonale muizeantilichamen behandelde humane lymfocieten , en konijne-20 lymfocieten . Humane raononucleaire cellen werden gezuiverd uit perifeer bloed met behulp van de Ficoll-hypaque methode, gewassen, en bij 4°C gedurende 1 uur geincubeerd met monoklonale anti-humane-T-cellen van de muis, en opnieuw gewassen.The first condition for obtaining mutants of phages that recognize molecules and cells is that the phage does not already naturally bind to such cells or molecules. Thus, phages as in Example I-A were prepared and fluoresced to a molar ratio of FITC / phage protein of 11.3. These phages were tested for their ability to bind to complex cells, human lymphocytes treated with monoclonal mouse antibodies, and rabbit lymphocytes. Human raononuclear cells were purified from peripheral blood using the Ficoll-hypaque method, washed, and incubated with mouse monoclonal anti-human T cells at 4 ° C for 1 hour, and washed again.
Lymfoïde cellen van het konijn werden verkregen 25 uit milt en lymfeknopen met behulp van gebruikelijke methöden, gemengd en gewassen.Rabbit lymphoid cells were obtained from spleen and lymph nodes using conventional methods, mixed and washed.
gg
Suspensies die 10 cellen/ml (humaan of van de 12 muis) bevatten, werden behandeld met 10 fluorescerende faagdeeltjes, die als in voorbeeld I-A bereid y maar niet 30 met antilichamen bedekt waren. Na incubatie gedurende 1 uur bij 4°C werden de cellen gewassen en onder de microscoop onderzocht.Suspensions containing 10 cells / ml (human or from the 12 mouse) were treated with 10 fluorescent phage particles, which were prepared as in Example I-A but not antibody-coated. After incubation for 1 hour at 4 ° C, the cells were washed and examined under the microscope.
Er werd geen fluorescentie van het oppervlak waargenomen, wat er op duidde , dat T4-bacteriofagen , die fluorescerend gemaakt 8520062 - 16 - zijn , niet aspecifiek vast blijven zitten aan MIG , humane | lymfocieten of konijnelymfocieten. Deze verrassende waarneming verschafte de basis voor het selecteren op bacterio-fagen die binden.No surface fluorescence was observed, indicating that T4 bacteriophages, which are made fluorescent 8520062 - 16 - do not adhere non-specifically to MIG, human | lymphocytes or rabbit lymphocytes. This surprising observation provided the basis for selecting for bacteriophages that bind.
5 De selectie van bacteriofagen die aan andere ! structuren binden dan die ze van nature herkennen, wordt op ! twee manieren uitgevoerd: door verschillende bestaande bacterio- : fagen uit verscheidene verzamelingen aan een vergelijkend onder zoek te onderwerpen en door synthetische manipulaties. Een 10 voorbeeld van een vergelijkend onderzoek is het volgende.5 The selection of phages that other! bind structures than they naturally recognize, is used up! carried out in two ways: by subjecting different existing bacteriophages from different pools to a comparative study and by synthetic manipulations. An example of a comparative study is the following.
Bacteriofaag T4 bindt niet aan verse suspensies van humane of konijne lymfocieten. Om te bepalen of andere structuren van de bloedbestanddelen geïdentificeerd kunnen worden, werden uitstrijkjes bereid van bloedcellen van konijnen en 15 mensen die vervolgens met formaldehyd behandeld werden. Daarna werden de uitstrijkjes gedurende 30 minuten behandeld met een 13 suspensie die 10 T4-faagdeeltjes per ml bevattey. die door behandeling met FITC fluorescerend gemaakt waren. De uitstrijkjes werden gewassen, een dekplaatje werd erop aangebracht, waarna 20 ze on<ler een fluorescentiemicroscoop onderzocht werden.Bacteriophage T4 does not bind to fresh suspensions of human or rabbit lymphocytes. To determine whether other structures of the blood components can be identified, swabs were prepared from rabbit and human blood cells and subsequently treated with formaldehyde. The smears were then treated with a 13 suspension containing 10 T4 phage particles per ml for 30 minutes. made fluorescent by treatment with FITC. The smears were washed, a cover was applied and examined under a fluorescence microscope.
Een zeer intense fluorescentie werd slechts in het cytoplasma van de leucocieten gezien . De kern , de membraan en de rode bloedlichaampjes waren niet fluorescerend . Deze proef laat zien, dat op de een of andere wijze, via een onbekend en niet voor 25 de hand liggend mechanisme , een structuur in het cytoplasma van de witte bloedlichaampjes door de met FITC gelabelde T4-faag herkend wordt.Very intense fluorescence was only seen in the cytoplasm of the leucocytes. The core, membrane and red blood cells were not fluorescent. This test shows that somehow, through an unknown and not obvious mechanism, a structure in the cytoplasm of the white blood cells is recognized by the FITC-labeled T4 phage.
De selectie van bacteriofagen wordt ook door middel van synthetische manipulaties uitgevoerd. Bij de bereiding 30 van bacteriofaagmutanten voor hst herkennen van muizeimmunoglobuline (IgG) , worden Escherichia coli-bacteriën, stam YS57 , in petrischalen , als in voorbeeld I-A , bereid, en met UV-licht 8520062 - 17 - bestraald zodat 50-90% van de bacteriën gedood wordt; deze stap wordt uitgevoerd om de DNA-herstelmechanismen op gang te brengen. Een suspensie van T4-bacteriofaag wordt ook met UV-licht behandeld om ongeveer 80% van de bacteriofagen te doden 5 en mutaties te veroorzaken. Bacteriën worden met de bacteriofaag geïnfecteerd en de bacteriofaag wordt gekweekt, verzameld en met chloroform behandeld. De faagsuspensie wordt vervolgens ; geconcentreerd door precipitatie met polyethyleenglycol of door ultracentrifugeren ter verkrijging van een suspensie met meer 12 10 dan 10 infectieuze eenheden/ml.The selection of bacteriophages is also carried out by synthetic manipulations. In the preparation of bacteriophage mutants for hst recognizing mouse immunoglobulin (IgG), Escherichia coli bacteria, strain YS57, are prepared in petri dishes, as in Example 1A, and irradiated with UV light 8520062-17 - so that 50-90% of the bacteria is killed; this step is performed to initiate the DNA repair mechanisms. A suspension of T4 bacteriophage is also treated with UV light to kill about 80% of the bacteriophages and cause mutations. Bacteria are infected with the bacteriophage and the bacteriophage is grown, collected and treated with chloroform. The phage suspension then becomes; concentrated by precipitation with polyethylene glycol or by ultracentrifugation to obtain a suspension with more than 10 10 infectious units / ml.
De bodem van een plastic petrischaaltje ; wordt met muize-IgG (MIG) bekleed , direkt door incubatie bij 25°C en pH 9,2 gedurende de nacht, of door gebruik van poly-L-lysine als een koppelmiddel. Dit MIG heeft geen antifjaag-15 antilichaamaktiviteit, dat wil zeggen het is ofwel monoklonaal voor een andere specificiteit of het wordt tevoren met faag geabsorbeerd of slechts het Fc-gedeelte wordt gebruikt. De faag wordt aan het schaaltje toegevoegd en gedurende 1 uurbij 37°G geincubeerd. De plaat wordt zorgvuldig gewassen ter verwijdering 20 van niet-gebonden faag. Ter verbetering van de kans de mutanten te verkrijgen , wordt muize-IgG aan deeltjes, erythrocieten, bacteriën of korrels vastgemaakt, ofwel chemisch of door de antilichaamfunctie.The bottom of a plastic petri dish; is coated with mouse IgG (MIG) directly by incubation at 25 ° C and pH 9.2 overnight, or by using poly-L-lysine as a coupling agent. This MIG has no anti-phage antibody activity, ie it is either monoclonal for a different specificity or it is pre-absorbed with phage or only the Fc portion is used. The phage is added to the dish and incubated at 37 ° G for 1 hour. The plate is carefully washed to remove unbound phage. To improve the chance of obtaining the mutants, mouse IgG is attached to particles, erythrocites, bacteria or granules, either chemically or by the antibody function.
De plaat die met faag behandeld en gewassen 25 is, wordt gebruikt om de faag direkt door toevoegen van bacteriën in zachte agar te kweken. De plaat wordt eerst herhaaldelijk gewassen ter verwijdering van de faag die niet specifiek gebonden is. Om de kans te vergroten kopmutaties te verkrijgen die overleven, wordt de faag ook bij hogere temperaturen, bijvoorbeeld 42°C 30 gekweekt. De faagkolonies worden eruit gehaald en in gevoelige bacteriën gekweekt en 2-3 keer opnieuw^ gekloond.The plate which has been phage treated and washed is used to grow the phage directly in bacteria by adding bacteria in soft agar. The plate is first repeatedly washed to remove the non-specifically bound phage. To increase the chance of obtaining head mutations that survive, the phage are also grown at higher temperatures, for example 42 ° C. The phage colonies are removed and grown in susceptible bacteria and cloned again 2-3 times.
Als een vooronderzoek naar faagklonen die MIG herkennen , wordt de volgende methode gebruikt. Platen worden 8520062 - 18 - bekleed met MIG zoals hierboven beschreven, ëe ouderstam van de faag wordt naast de mutanten aan verschillende platen toegevoegd, geincubeerd en gewassen , en tenslotte worden bacteriën toegevoegd. Hoewel de ouderstam slechts zeer weinig plekken geeft , geven de mutanten die aan MIG binden , vele plekken en zelfs samenvloeiende lyse van bacteriën.As a preliminary study for phage clones that recognize MIG, the following method is used. Plates are coated with MIG as described above, one parent strain of the phage is added to several plates in addition to the mutants, incubated and washed, and finally bacteria are added. Although the parent strain gives very few spots, the mutants that bind to MIG give many spots and even confluent lysis of bacteria.
Voorbeeld III-BExample III-B
^ Bij een werkwijze die samenhangt met die van voorbeeld III-A worden de faagkolonies opgenomen op een adsorptie-papier. Radioaktief of fluorescerend MIG wordt toegevoegd, geincubeerd om binding van MIG aan de mutant te bevorderen, waarna het geheel gewassen en vervolgens onderzocht wordt met een scanner voor radioaktiviteit respectievelijk met UV-licht. Van de betreffende mutanten wordt teruggegaan naar de oorspronkelijke gel en deze worden gekloond. Ter verkrijging van extra bewijs worden alle gevormde kolonies verzameld en in bacteriën gekweekt, elke kloon in twee buizen, waarvan één met u gelabelde aminozuren bevat. De fagen worden verzameld, met chloroform behandeld, ver- 20 zameld door precipitatie met polyethyleenglycol of door ultra-centrifugeren , en toegevoegd aan met MIG beklede microputjes.In a method related to that of Example III-A, the phage colonies are recorded on an adsorption paper. Radioactive or fluorescent MIG is added, incubated to promote binding of MIG to the mutant, then washed and then examined with a radioactivity scanner and UV light, respectively. The affected mutants are returned to the original gel and cloned. For additional evidence, all colonies formed are collected and grown in bacteria, each clone in two tubes, one of which contains u-labeled amino acids. The phages are collected, treated with chloroform, collected by precipitation with polyethylene glycol or by ultracentrifugation, and added to MIG-coated microwells.
Na incubatie bij 37°C gedurende een uur worden de putjes gewassen, wordt natriumdedecylsulfaat (SDS)oplossing toegevoegd om ^ gebonden radioaktief materiaal te verwijderen en wordt de c.p.m.After incubation at 37 ° C for one hour, the wells are washed, sodium decyl sulfate (SDS) solution is added to remove bound radioactive material and the ppm.
bepaald. De faagkloon die een grotere telling geeft dan de achtergrond wordt vervolgens gekweekt en opnieuw getoetst op het vermogen aan MIG te binden in hetzelfde systeem als hierboven.determined. The phage clone giving a larger count than the background is then grown and tested again for the ability to bind MIG in the same system as above.
Voorbeeld III-CExample III-C
30 -30 -
De bacteriofaag die binding aan MIG vertoont, wordt zichtbaar gemaakt met behulp van één van de gebruikelijke methoden. De bacteriofaag wordt fluorescerend gemaakt door koppeling met het fluoresceïneisothiocyanaat , rhodamine of andere 8520062 - 19 - fluorescerende kleurstoffen, door behandeling met ethidiumbromide, dat aan het faag-DNA bindt, of door andere kleurstoffen die aan nucleïnezuren binden. De faag wordt radioaktief gemaakt ofwel door opneming van radioaktieve materialen in het proteïne of nucleïne-5 zuur ofwel door gebruikelijke methoden voor het koppelen van radioaktieve materialen aan proteïnen. In een alternatief wordt : een metaal zoals zilver aan de faag volgens gebruikelijke methoden toegevoegd.The bacteriophage that shows binding to MIG is visualized using one of the usual methods. The bacteriophage is rendered fluorescent by coupling with the fluorescein isothiocyanate, rhodamine or other fluorescent dyes, by treatment with ethidium bromide, which binds to the phage DNA, or by other dyes that bind to nucleic acids. The phage is made radioactive either by incorporation of radioactive materials into the protein or nucleic acid or by conventional methods of coupling radioactive materials to proteins. In an alternative, a metal such as silver is added to the phage by conventional methods.
Om de waarde als reagens van deze faag te toetsen 10 worden humane lymfoeieten behandeld met MIG anti-humaan-T-cel monoklonale antilichamen. De cellen worden gewassen en daarna wordt bijvoorbeeld de fluorescerende faag toegevoegd. Ter controle wordt de fluorescerende faag toegevoegd aan humane lymfoeieten die niet met het monoklonale antilichaam behandeld zijn. Nadat de 15 lymfoeieten gedurende 30 minuten behandeld zijn, worden zij gewassen en worden de cellen onder de microscoop met UV-licht onderzocht. De intense fluorescerende kleuring van 80-90% van de humane perifere bloedlymfocieten toont aan , dat de faag muize-IgG op het oppervlak van de lymfociet herkent. Het niet-fluoresceren 20 van cellen die met ouderfaag in plaats van de mutant behandeld waren, of tevoren met normaal MIG in plaats van anti-T-cel-antilichaam behandeld waren, geeft een controle. Een andere controle wordt gegeven door het feit dat aangetoond wordt dat gezuiverde humane B-cellen niet fluorescerend worden wanneer zij als de :2B niet-gescheiden perifere bloedlymfocieten behandeld worden.To test the value as a reagent of this phage, human lymphoeites are treated with MIG anti-human T-cell monoclonal antibodies. The cells are washed and then, for example, the fluorescent phage is added. As a control, the fluorescent phage is added to human lymphoeites that have not been treated with the monoclonal antibody. After the 15 lymphoeites have been treated for 30 minutes, they are washed and the cells are examined under the microscope with UV light. The intense fluorescent staining of 80-90% of the human peripheral blood lymphocytes shows that the phage recognize mouse IgG on the surface of the lymphocyte. Failure to fluoresce cells treated with parental phage instead of the mutant or previously treated with normal MIG instead of anti-T cell antibody gives a control. Another control is given by the fact that purified human B cells do not become fluorescent when treated as the: 2B unseparated peripheral blood lymphocytes.
Voorbeeld IVExample IV
De selectie van mutanten door uitwendige beeldvorming vereist de bereiding van bacteriën die faagreceptoren 30 hebben welke een bepaald te identificeren macromolecuul , bijvoorbeeld muize-IgG (MIG), nabootsen. In dit geval wordt MIG in konijn 8520062 - 20 - nen of ratten geïnjecteerd om anti-MIG-antilichamen te induceren.The selection of mutants by external imaging requires the preparation of bacteria that have phage receptors that mimic a particular identifiable macromolecule, eg mouse IgG (MIG). In this case, MIG is injected into rabbits or rats 8520062-20 to induce anti-MIG antibodies.
De volgende methode heeft tot doel een bacteriofaag precies als een antilichaam te laten werken door zijn staart als een aanhechtingsplaats te gebruiken.The following method aims to make a bacteriophage act exactly like an antibody by using its tail as an attachment site.
5 1) Het anti-MIG-antilichaam wordt met affini- ;1) The anti-MIG antibody is combined with affini-;
teitschromatografie gezuiverd en aan een vaste fase , zoals de bodem van een petrischaal , gekoppeld door middel van poly-L-lysine. _E. coli. die resistent is voor de faag, wordt gekweekt, gewassen, in fysiologische gebufferde zoutoplossing gesuspendeerd, 10 aan de petrischaal toegevoegd en gedurende een uur bij 4°Cpurity chromatography and coupled to a solid phase, such as the bottom of a petri dish, by poly-L-lysine. _E. coli. resistant to the phage are grown, washed, suspended in physiological buffered saline, added to the Petri dish and at 4 ° C for one hour
geincubeerd. De petrischaal wordt zorgvuldig gewassen en cultuur-medium wordt toegevoegd. Bacteriën die groeien, worden 4-5 keer blootgesteld aan dezelfde bindingscyclus , elke keer in aanwezigheid van de faag om het faag-resistente karakter van de bacteriën 15 te handhaven. Bij elke blootstelling worden de bacteriën met mutagenen behandeld om het aantal mutanten te vergroten.incubated. The Petri dish is carefully washed and culture medium is added. Bacteria that grow are exposed to the same binding cycle 4-5 times, each time in the presence of the phage to maintain the phage-resistant character of the bacteria. At each exposure, the bacteria are treated with mutagens to increase the number of mutants.
2) Bacteriën die geselecteerd worden, worden gekloond en elke kloon wordt getoetst op binding door het anti-MIG-antilichaam met gebruikelijke methoden. De bacteriële 20 mutanten groeien in een sterkere mate dan de ouderstam , wanneer toegelaten wordt dat ze zich hechtenuaan de bodem van de platen die met het antilichaam tegen MIG bekleed zijn, waardoor de mutant een selectief voordeel verkrijgt.2) Bacteria selected are cloned and each clone tested for binding by the anti-MIG antibody by conventional methods. The bacterial mutants grow to a greater degree than the parent strain, if they are allowed to attach to the bottom of the plates coated with the anti-MIG antibody, thereby giving the mutant a selective advantage.
3) De voor faag gevoelige bacteriën worden 25 met UV bestraald, de faag wordt met UV bestraald en vervolgens gemengd met voor faag gevoelige bacteriën voor infectie en vorming van mutanten. De fagen en bacteriën kunnen echter ook eerst gemengd en vervolgens met UV bestraald worden. Deze bacteriën worden in gelijke verhoudingen gemengd met faagresistente 30 bacteriën welke door anti-MIG-antilichamen herkehd worden. De faag lyseert alle voor faag gevoelige bacteriën, maar.tast de faag-resistente bacteriën niet aan. Wanneer een mutantfaag verschijnt, die de MIG-achtige structuur op de faagresistente bacteriën 8520062 * - 21 - herkent, wordt een heldere plek gevormd.3) The phage sensitive bacteria are UV irradiated, the phage are UV irradiated and then mixed with phage sensitive bacteria for infection and mutant formation. However, the phages and bacteria can also be mixed first and then irradiated with UV. These bacteria are mixed in equal proportions with phage-resistant bacteria which are recognized by anti-MIG antibodies. The phage lyses all phage-sensitive bacteria, but does not attack phage-resistant bacteria. When a mutant phage, which recognizes the MIG-like structure on the phage-resistant bacteria 8520062 * - 21 -, a bright spot is formed.
4) De heldere plekken worden verzameld, gekweekt in bij stap 2 verkregen bacteriën, en elke kloon wordt getoetst op zijn wisselwerking met MIG met gebruikelijke competitie- of bindingsproeven. De klonen worden getoetst op hun vermogen hun gastheer te infecteren in aanwezigheid van MIG dat geen antilichaamaktiviteit tegen de faag heeft. Wanneer de faag MIG met zijn staart herkent, bindt de faag aan het - MIG en kan hij zich met hechten aan zijn gastheer. ,Als resultaat heeft geen lyse plaats. Door fragmenten van MIG te gebruiken wordt de precieze herkenningsplaats bepaald.4) The clear spots are collected, grown in bacteria obtained in step 2, and each clone is tested for its interaction with MIG with conventional competition or binding assays. The clones are tested for their ability to infect their host in the presence of MIG which has no antibody activity against the phage. When the phage recognizes MIG with its tail, the phage binds to the - MIG and can attach itself to its host. , As a result, no lysis takes place. The precise recognition site is determined by using fragments of MIG.
De binding wordt beproefd op een vaste fase welke bekleed is met MIG, gevolgd door anti-faag antilichaam dat met peroxydase gelabeld is en substraat. De kenmerkende kleur-verandering verschijnt slechts waar de faag gebonden wordt en laat zijn aanwezigheid zien. De faag wordt als in voorbeeld I zichtbaar gemaakt.The binding is tested on a solid phase coated with MIG, followed by anti-phage antibody labeled with peroxidase and substrate. The characteristic color change only appears where the phage is bound and shows its presence. The phage are visualized as in Example I.
Voorbeeld VExample V
Sommige oppervlaktereceptoren of antigenen, op bacteriën worden beheerst door plasmiden. Een voorbeeld is de sexpilus op E.coli. Deze pilus woédt herkend door sexspecifieke fagen, zoals 0X174. Het gen voor het constante gebied van de zware of de lichte keten van MIG wordt in het plasmide dat de sexpilus beheerst , opgenomen. Bacteriën die MIG tot expressie brengen in plaats van of samen met pilusproteïnen , worden geselecteerd door een vaste fase met anti-MIG-antilichamen te gebruiken. Fagen die deze pilus herkennen, worden vervolgens geselecteerd, waarna aangetoond wordt dat ze MIG als hiervoor ^ herkennen. In de eerste stap worden de faagresistente bacteriën geselecteerd door de positieve druk \an het anti-MIG-antilichaam. De faag wordt als in voorbeeld I zichtbaar gemaakt.Some surface receptors, or antigens, on bacteria are controlled by plasmids. An example is the sexpilus on E.coli. This pilus is recognized by sex-specific phages, such as 0X174. The MIG heavy or light chain constant region gene is included in the plasmid controlling the sexpilus. Bacteria that express MIG instead of or in conjunction with pilus proteins are selected using a solid phase with anti-MIG antibodies. Phages that recognize this pilus are then selected and shown to recognize MIG as before. In the first step, the phage-resistant bacteria are selected by the positive pressure of the anti-MIG antibody. The phage are visualized as in Example I.
8520062 - 22 -8520062 - 22 -
Voorbeeld VI-AExample VI-A
Bacteriofagen worden in bacteriën gekweekt die variabele genen voor een tegen MIG gericht antilichaam in plasmiden hebben. Door recombinatie worden fagen gevormd die ;* in het staartgebied van MIG zware en/of lichte ketens tot expressie brengen. Door gebruik van de werkwijze van voorbeeld II : groeit deze faag bij voorkeur in bacteriën die resistent zijn voor de ouderfaag en die geselecteerd zijn omdat ze op het oppervlak de te identificeren structuur, MIG, hebben.Bacteriophages are grown in bacteria that have variable genes for an anti-MIG antibody in plasmids. Phages are formed by recombination which express heavy and / or light chains in the tail region of MIG. Using the method of Example II, this phage preferably grows in bacteria that are resistant to the parental phage and selected because they have the structure to be identified, MIG, on the surface.
Deze structuur komt tot expressie op de pilus zoals in voorbeeld III aangetoond is of op andere oppervlakteproteïnen, die als receptoren bij de infectie gebruikt worden.This structure is expressed on the pilus as shown in Example III or on other surface proteins used as receptors in the infection.
Voorbeeld VI-BExample VI-B
^ E_. coli-bacteriën die V-genen voor L-ketens van anti-MIG-antilichamen bevatten in plasmiden, worden bereid volgens standaardmethoden. Fagen worden in deze bacteriën gekweekt ter verkrijging van recombinant-DNA. Bij sommige fagen komen de V - of L-genen in de trilharen tot expressie, maar JL ?Π^ E_. coli bacteria containing L-chain V genes of anti-MIG antibodies in plasmids are prepared according to standard methods. Phages are grown in these bacteria to obtain recombinant DNA. In some phages, the V or L genes are expressed in the cilia, but JL? Π
dit is onverenigbaar met overleven. Dezelfde methode wordt toegepast voor variabele genen van zware ketens. Om de ouderfagen te elimineren worden antilichamen gemaakt die specifiek zijn voor trilharen, en alle fagen die normale trilharen hebben, .· worden door absorptie en precipitatie met hun gastheerbacteriën J geelimmeerd. Zeldzame fagen blijven over, die ofwel onvolkomen zijn ofwel Z- of L-ketens hebben. Zij worden geconcentreerd door ultracentrifugeren en gebruikt om bacteriën te infecteren die MIG, of MIG-achtige structuren, op hun oppervlak tot expressie brengen, zoals hierboven beschrevenuis. Door aantrekking via ^ niet-covalente krachten infecteren de fagen die Ig-genen tot expressie brengen, hun bacteriën. Het resulterende nageslacht wordt gevormd door ,,hybride"-fagen , faagparen die coinfectie blijven veroorzaken. De specificiteit van dit hybride voor MIGthis is incompatible with survival. The same method is used for heavy chain variable genes. To eliminate the parental phages, antibodies specific for cilia are made, and all phages that have normal cilia are immunized with their host bacteria J by absorption and precipitation. Rare phages remain, which are either imperfect or have Z or L chains. They are concentrated by ultracentrifugation and used to infect bacteria expressing MIG, or MIG-like structures, on their surface, as described above. Attracted via non-covalent forces, the phages expressing Ig genes infect their bacteria. The resulting progeny are "hybrid" phages, phage pairs that continue to cause co-infection. The specificity of this hybrid for MIG
8520062 - 23 - wordt als boven beschreven vastgesteld. De faag wordt als in voorbeeld I zichtbaar gemaakt.8520062-23 is determined as described above. The phage are visualized as in Example I.
Voorbeeld VIIExample VII
5 Koolhydraten, ofwel als mono-, oligo- of poly- sacchariden, worden gekoppeld aan bacteriofagen , die daarna fluorescerend of radioaktief gemaakt worden of aan een enzym gekoppeld worden. Deze monsters worden gebruikt om lectinen in oplossing te identificeren, met behulp van een fluorometer, op 10 vaste fase of op cellen. De fagen worden zichtbaar gemaakt zoals in voorbeeeld I beschreven is.Carbohydrates, either as mono-, oligo- or polysaccharides, are coupled to bacteriophages, which are then rendered fluorescent or radioactive or coupled to an enzyme. These samples are used to identify lectins in solution, using a fluorometer, on solid phase or on cells. The phages are visualized as described in Example I.
Voorbeeld VIIIExample VIII
Lectinen worden gekoppeld aan bacteriofaag, 15 die zichtbaar gemaakt wordt als in voorbeeld I. Deze conjugaat- fase wordt gebruikt om koolhydraten te bepalen waarvoor de lectinen specifiek zijn, ofwel in oplossing, zoals in voorbeeld VII, of cellen, of op vaste fasen.Lectins are coupled to bacteriophage, which is visualized as in example I. This conjugate phase is used to determine carbohydrates for which the lectins are specific, either in solution, as in example VII, or cells, or on solid phases.
2o Voorkeursuitvoeringsvorm2o Preferred embodiment
Bij de bereiding van bacteriofaagmutanten voor de herkenning van muize-immunoglobuline (igG) , wordenIn the preparation of bacteriophage mutants for the recognition of mouse immunoglobulin (igG),
Escherichia coli-bacteriën bereid in petrischaaltjes en bestraald met UV-licht zodat 50-90% van de bacteriën gedood wordt. Een 25 suspensie van T4-bacteriofagen wordt ook behandeld met UV- licht zodat ongeveer 80% van de bacteriofagen gedood wordt en mutaties veroorzaakt worden. Bacteriën worden geïnfecteerd met de bacteriofaag, en de bacteriofaag wordt gekweekt, verzameld en met chloroform behandeld. De faagsuspensie wordt daarna geconcen- 30 treerd , door precipitatie met polyethyleenglycol of door ultra- centrifugeren , ter verkrijging van een suspensie van meer 12..Escherichia coli bacteria prepared in Petri dishes and irradiated with UV light to kill 50-90% of the bacteria. A suspension of T4 bacteriophages is also treated with UV light to kill about 80% of the bacteriophages and cause mutations. Bacteria are infected with the bacteriophage, and the bacteriophage is grown, collected and treated with chloroform. The phage suspension is then concentrated, by precipitation with polyethylene glycol or by ultracentrifugation, to obtain a suspension of more than 12 ..
dan 10 infectieuze eenheden/ml.than 10 infectious units / ml.
De bodem van een plastic petrischaaltje wordt - 24 - bekleed met muize-IgG (MIG) , direkt door incubatie bij 25°C en pH 9,2 gedurende de nacht , of door gebruik van poly-L-lycine als een koppelmiddel. Dit MIG heeft geen antifaag-antilichaamwerking,: dat wil zeggen het is ofwel monoklonaal voor een andere specifici- ^ teit, of het wordt tevoren met faag geabsorbeerd of slechts het ; Fc-gedeelte wordt gebruikt. De faag wordt toegevoegd aan het petrischaaltje en bij 37°C gedurende 1 uur geincubeerd. De plaat wordt zorgvuldig gewassen ter verwijdering van eventueel i 10 aanwezige niet-gebonden faag.The bottom of a plastic Petri dish is coated with mouse IgG (MIG) directly by incubation at 25 ° C and pH 9.2 overnight, or by using poly-L-lycin as a coupling agent. This MIG has no anti-phage antibody activity, ie it is either monoclonal for another specificity, or it is pre-absorbed with phage or only it; FC part is used. The phage is added to the Petri dish and incubated at 37 ° C for 1 hour. The plate is carefully washed to remove any unbound phage present.
De behandelde en gewassen plaat wordt vervolgens gebruikt om de faag direkt te kweken door bacteriën in zachte agar toe te voegen . De plaat wordt eerst herhaaldelijk gewassen ter verwijdering van de faag die niet specifiek gebonden is.The treated and washed plate is then used to grow the phage directly by adding bacteria in soft agar. The plate is first repeatedly washed to remove the non-specifically bound phage.
1515
Om de kans te vergroten kopmutaties te verkiljgen die overleven, wordt de faag bij een hogere temperatuur (42°C) gekweekt en wordt het selectieproces 2-3 keer herhaald.To increase the chance of acquiring head mutations that survive, the phage are grown at a higher temperature (42 ° C) and the selection process is repeated 2-3 times.
Als vooronderzoek naar faagklonen die MIG herkennen, worden platen bekleed met MIG en wordt de ouderstam van de 20 faag tegelijk met de mutanten aan verschillende platen toegevoegd, geincubeerd, gewassen , en worden tenslotte bacteriën toegevoegd.As a preliminary study for phage clones that recognize MIG, plates are coated with MIG and the parent strain of the phage is added to several plates at the same time as the mutants, incubated, washed, and finally bacteria are added.
Hoewel de ouderstam slechts weinig vlekken geeft, geven de mutanten die aan MIG binden vele vlekken en zelfs samenvloeiende lyse van bacteriën.Although the parent strain gives few spots, the mutants that bind to MIG give many spots and even confluent lysis of bacteria.
2525
Bij een ermee samenhangende werkwijze worden faagkolonies op een adsorberend papier opgepakt , en wordtIn a related method, phage colonies are picked up on an adsorbent paper, and made
fluorescerend MIG toegevoegd , geincubeerd om binding van MIGfluorescent MIG added, incubated to bind MIG
aan de mutant te bevorderen, gewassen en met een scanner met UV- licht beoordeeld. De betreffende mutanten worden in de originele 30 gel teruggezocht en gekloond. De fagen worden verzameld, met chloroform behandeld, door precipitatie met polyethyleenglycol of door ultracentrifugeren verzameld , en aan microputjes die met MIG bekleed zijn, toegevoegd. Na incubatie bij 37°C gedurende een uur wordt de fluorescentie bepaald en wordt de faag- 0520062 - 25 - kloon die de grootste fluorescentie vertoont , vervolgens gekweekt en opnieuw beproefd op zijn vermogen aan MIG in hetzelfde systeem als hiervoor te binden.to promote the mutant, washed and assessed with a UV light scanner. The affected mutants are retrieved and cloned in the original gel. The phages are collected, treated with chloroform, collected by precipitation with polyethylene glycol or by ultracentrifugation, and added to micropiglets coated with MIG. After incubation at 37 ° C for one hour, the fluorescence is determined and the phage clone exhibiting the greatest fluorescence is then grown and retested for its ability to bind MIG in the same system as before.
::
De bacteriofaag die binding aan MIG vertoont, i i ·: 5 wordt zichtbaar gemaakt door koppeling met fluoresceïneisothio- cyanaat.The bacteriophage that shows binding to MIG, i: 5 is visualized by coupling with fluorescein isothiocyanate.
ii
Om de waarde als reagens van de faag te toetsen, worden humane lymfocieten behandeld met MIG-anti-humaan-T-cel monoklonale antilichamen. De cellen worden gewassen en de fluoresce-10 rende faag wordt toegevoegd. Ter controle wordt de fluorescerende faag toegevoegd aan humane lymfocieten die niet met het monoklonale antilichaam behandeld zijn. Na behandeling gedurende 30 minuten worden de lymfocieten gewassen en worden de cellen onderzocht onder de microscoop met UV-licht. De intense fluorescerende 15' kleuring kan 80-90% van de humane perifere bloedlymfoeieten duidt op herkenning door de faag van muizerlgG op het lymfocietoppervlak.To test the value as a phage reagent, human lymphocytes are treated with MIG anti-human T-cell monoclonal antibodies. The cells are washed and the fluorescent phage added. For control, the fluorescent phage is added to human lymphocytes that have not been treated with the monoclonal antibody. After treatment for 30 minutes, the lymphocytes are washed and the cells are examined under the microscope with UV light. The intense fluorescent 15 'staining can indicate 80-90% of human peripheral blood lymph nodes by phage recognition of mouse IgG on the lymphocyte surface.
Technische toepasbaarheidTechnical applicability
De methode volgens de uitvinding is in het 20 bijzonder geschikt voor het verkrijgen van een doeltreffende klinische proefmethode en voor een onderzoekspakket dat doeltreffende hoeveelheden van een geselecteerde bacteriofaag, gekoppeld met een zichthaarmakend middel , omvat. Een dergelijk pakket is niet duur; bruikbaar in de handen van een geschikt getrainde 25 klinische laboratoriumassistent ; en zeer geschikt voor klinisch gebruik , waarbij vele proeven gebruikelijk in een betrekkelijk korte tijdsduur uitgevoerd worden.The method according to the invention is particularly suitable for obtaining an effective clinical trial method and for a research package comprising effective amounts of a selected bacteriophage coupled with a facial hair-making agent. Such a package is inexpensive; usable in the hands of an appropriately trained clinical laboratory assistant; and very suitable for clinical use, with many tests usually carried out in a relatively short period of time.
; 30 8520062; 30 8520062
Claims (22)
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US59113684A | 1984-03-19 | 1984-03-19 | |
US59113684 | 1984-03-19 | ||
US8500438 | 1985-03-15 | ||
PCT/US1985/000438 WO1985004189A1 (en) | 1984-03-19 | 1985-03-15 | Bacteriophages as recognition and identification agents |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NL8520062A true NL8520062A (en) | 1986-02-03 |
Family
ID=24365204
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NL8520062A NL8520062A (en) | 1984-03-19 | 1985-03-15 | BACTERIOPHAGES AS RECOGNITION AND IDENTIFIER. |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0175761A4 (en) |
JP (1) | JPS61501489A (en) |
DE (1) | DE3590116T1 (en) |
GB (1) | GB2181542A (en) |
NL (1) | NL8520062A (en) |
SE (1) | SE8505458D0 (en) |
WO (1) | WO1985004189A1 (en) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4746604A (en) * | 1985-05-24 | 1988-05-24 | Enzo Biochem, Inc. | Specific binding assays utilizing a viable cell as a label |
CA1313111C (en) * | 1986-12-01 | 1993-01-26 | William J. Hubbard | Method of identifying unknown organisms |
EP0439354A3 (en) * | 1990-01-24 | 1992-06-17 | Amoco Corporation | Signal generating moiety and method for use |
GB9326277D0 (en) * | 1993-12-23 | 1994-02-23 | Marconi Gec Ltd | Labelling |
JP3270722B2 (en) * | 1996-09-27 | 2002-04-02 | オルガノ株式会社 | Bacteria detection method and detection device |
IT1291913B1 (en) | 1997-05-22 | 1999-01-21 | Angeletti P Ist Richerche Bio | METHOD INVOLVING THE USE OF BACTERIOPHAGES FOR THE DETECTION OF THE PRESENCE OF MOLECULES OF INTEREST IN BIOLOGICAL SAMPLES |
CA2333463A1 (en) * | 1998-06-04 | 1999-12-09 | Microsens Biophage Limited | Analytical method using multiple virus labelling |
EP1031630B1 (en) * | 1999-02-22 | 2004-10-20 | Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. | Method for detecting bacteria |
DK1198713T3 (en) * | 1999-07-30 | 2006-05-01 | Profos Ag | Detection and identification of bacterial strains |
US8216780B2 (en) | 2002-04-12 | 2012-07-10 | Microphage (Tm) Incorporated | Method for enhanced sensitivity in bacteriophage-based diagnostic assays |
ES2346424T3 (en) | 2002-04-12 | 2010-10-15 | Colorado School Of Mines | PROCEDURE FOR DETECTION OF LOW CONCENTRATIONS OF A DIANA BACTERIA THAT USES PHAGOS TO INFECT BACTERIAL CELLS DIANA. |
WO2006105504A1 (en) * | 2005-03-31 | 2006-10-05 | Microphage Incorporated | Apparatus and method for detecting microorganisms using flagged bacteriophage |
AU2006292496B2 (en) * | 2005-09-15 | 2011-04-14 | Microphage Incorporated | Method and apparatus for identification of microorganisms using bacteriophage |
US8455186B2 (en) | 2007-06-15 | 2013-06-04 | MicroPhage™ Incorporated | Method of detection of microorganisms with enhanced bacteriophage amplification |
US8697434B2 (en) | 2008-01-11 | 2014-04-15 | Colorado School Of Mines | Detection of phage amplification by SERS nanoparticles |
US9441204B2 (en) | 2008-04-03 | 2016-09-13 | Colorado School Of Mines | Compositions and methods for detecting Yersinia pestis bacteria |
FR2940318B1 (en) * | 2008-12-22 | 2011-05-13 | Centre Nat Rech Scient | NEW BIOTRACTORS AND THEIR USES FOR THE CONTROL OF FILTRATION FACILITIES |
WO2017023721A1 (en) * | 2015-07-31 | 2017-02-09 | University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education | Detection of bacteria using bacteriophage |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3094466A (en) * | 1959-07-15 | 1963-06-18 | Warner Lambert Pharmaceutical | Preparation for typing of staphylococci and process therefor |
US3562384A (en) * | 1960-11-08 | 1971-02-09 | Miles Lab | Immunological indicator and test system |
US3553310A (en) * | 1967-12-28 | 1971-01-05 | Miles Lab | Immunologically reactive particles |
GB1303802A (en) * | 1969-01-16 | 1973-01-24 | ||
US4189466A (en) * | 1975-09-19 | 1980-02-19 | Technical Research Affiliates, Inc. | Detection of rheumatoid factor by antibody sensitized microbial particles |
US4035316A (en) * | 1975-11-24 | 1977-07-12 | California Institute Of Technology | Cell specific, variable density, polymer microspheres |
US4104126A (en) * | 1976-01-29 | 1978-08-01 | Nichols Institute Of Endocrinology, Inc. | Non-isotopic substrate assay employing bacteriolysis products |
US4298689A (en) * | 1978-09-25 | 1981-11-03 | Research Corporation | Gonorrhea diagnostic test |
US4223005A (en) * | 1979-02-15 | 1980-09-16 | University Of Illinois Foundation | Antibody coated bacteria |
DE2930706A1 (en) * | 1979-07-28 | 1981-02-05 | Medac Klinische Spezialpraep | METHOD FOR DETECTING POTENTIAL-SPECIFIC ANTIBODY |
US4282315A (en) * | 1979-09-13 | 1981-08-04 | Corning Glass Works | Preparation of enriched whole virus radioligand |
US4474877A (en) * | 1980-09-19 | 1984-10-02 | Research And Education Institute, Inc. Harbor - Ucla Medical Center | Process for detection and measurement of viral specific immunoglobulins and article of manufacture therefor |
IL63855A (en) * | 1981-09-16 | 1984-10-31 | Teva Pharma | Method and kit for detecting pregnancy |
US4511662A (en) * | 1982-06-18 | 1985-04-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Simultaneous assay for T and B lymphocyte populations and subpopulations |
-
1985
- 1985-03-15 GB GB08527324A patent/GB2181542A/en not_active Withdrawn
- 1985-03-15 EP EP19850901766 patent/EP0175761A4/en not_active Withdrawn
- 1985-03-15 NL NL8520062A patent/NL8520062A/en unknown
- 1985-03-15 JP JP50141285A patent/JPS61501489A/en active Pending
- 1985-03-15 DE DE19853590116 patent/DE3590116T1/de not_active Withdrawn
- 1985-03-15 WO PCT/US1985/000438 patent/WO1985004189A1/en not_active Application Discontinuation
- 1985-11-19 SE SE8505458A patent/SE8505458D0/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB8527324D0 (en) | 1985-12-11 |
EP0175761A1 (en) | 1986-04-02 |
JPS61501489A (en) | 1986-07-24 |
WO1985004189A1 (en) | 1985-09-26 |
SE8505458L (en) | 1985-11-19 |
EP0175761A4 (en) | 1986-09-24 |
GB2181542A (en) | 1987-04-23 |
DE3590116T1 (en) | 1987-02-19 |
SE8505458D0 (en) | 1985-11-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4797363A (en) | Bacteriophages as recognition and identification agents | |
NL8520062A (en) | BACTERIOPHAGES AS RECOGNITION AND IDENTIFIER. | |
US20080135490A1 (en) | Quantum dot biolabeling and immunomagnetic separation for detection of contaminants | |
US20100129836A1 (en) | System for detecting bacteria in blood, blood products, and fluids of tissues | |
JP2000513949A (en) | A method based on the use of bacteriophage for the detection of biological molecules in biological samples | |
JP5777877B2 (en) | Method and kit for immunological detection of bacteria in blood and tissue | |
US5053054A (en) | Methods and reagents for staining intracellular components | |
US6335173B1 (en) | Methods for detecting an analyte of interest using tyramide coating technology | |
EP1086378B1 (en) | Analytical method using multiple virus labelling | |
US20090280472A1 (en) | Method for Detection of Antigens | |
CA2400715C (en) | Internal quality control for microbial enumeration assays | |
DE60125145T2 (en) | METHOD FOR PRODUCING BIOSENSORS AND THEIR USE | |
JP2907473B2 (en) | Cell sorting technology and its use | |
US7098042B2 (en) | Internal quality control | |
AU761549B2 (en) | Internal quality control | |
Chang et al. | Phage display antibodies to allelic determinants of canine blood cells | |
AU2008202582B2 (en) | Method and kit immuno-detecting bacteria in blood and tissues | |
Jagani | Flow Cytometry: Basic Principle and Applications in Biotechnology and Pharmacy Hitesh Jagani, 2 Amit Kumar, Sagar S. Gang, Karteek Hebbar, 3 Sahil Talwar. | |
AU2005201150A1 (en) | Method and kit for immuno-detecting bacteria in blood and tissues |