JPS61501489A - Bacteriophages as recognition and identification agents - Google Patents
Bacteriophages as recognition and identification agentsInfo
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。 (57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】 認識及び同定剤としてのバクテリオファージ光」Ｌ旦」し亘 吸血立国 この発明は免疫学の分野に関し、原核性及び真核性両細胞の材料の同定及び測定 のための新規且つ確実な方法を提供し、そして可視化剤と連結された選択された バクテリオファージを含む。さらに、細菌、真核性細胞、及び種々の分子性材料 の容易な決定のだめのアッセイキットを提供する。[Detailed description of the invention] Bacteriophage light as a recognition and identification agent Vampire nation This invention relates to the field of immunology, and relates to the identification and measurement of both prokaryotic and eukaryotic cellular material. and provide a new and robust method for the visualization of selected Contains bacteriophage. Additionally, bacteria, eukaryotic cells, and various molecular materials Provides an assay kit for easy determination.
皇ｉ探± 現在、他の方法によっては正体を現わさない分子構造及び細胞構造を同定するた めにほとんど抗体のみが使用される。Emperor i search± Currently, efforts are being made to identify molecular and cellular structures that are hidden by other methods. Almost exclusively antibodies are used for this purpose.
例えば、これらはある蛋白質を他方から、あるポリサ・ツカライドを他方から、 又はある細胞を他方から識別するために使用される。抗体と“同定される”構造 との間の相互作用は該抗体の存在を可視化することを目指す種々の方法により測 定され得る。For example, these may include one protein from another, one polysa tucharide from another, or used to distinguish one cell from another. Structure “identified” as an antibody The interaction between can be determined.
幾つかの試験においては、同定されるべき構造、細胞又は固相に結合する抗体は 直接可視化される。一層しばしば、第２抗体が可視化され、そして第１抗体に対 して向けられる。In some tests, antibodies that bind to the structure, cell, or solid phase to be identified are directly visualized. More often, a second antibody is visualized and directed against the first antibody. and directed.
さらに、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａ ｈ Ｉｏｃｏｃｃｕｓａｕ ｒｅｔ＋ｓ） Ｃｏｗａｎ Ｉ株のプロティンＡが可視化され、そしてこれは第 １抗体と結合する。抗体を可視化するために使用される他のクラスの試薬はビオ チン及びアビジンにより代表され、これらは相互に認識しそして抗体と結合わせ て使用することができる。螢光物質、酵素、放射性物質、大粒子、例えば赤血球 又はビ・−ズが抗体を直接的又は間接的に可視するために使用されてきた。Furthermore, Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus) ret+s) Protein A of Cowan I strain was visualized, and this 1 antibody. Other classes of reagents used to visualize antibodies are biochemical typified by tin and avidin, which recognize each other and bind to antibodies can be used. Fluorescent substances, enzymes, radioactive substances, large particles such as red blood cells Or beads have been used to visualize antibodies directly or indirectly.
これらの方法のそれぞれは、抗体を可視化するための螢光物質の使用により例示 される欠点及び限界を有する。細胞により結合される抗体の量が少な過ぎる場合 、螢光試薬はそれを検出することができない。特にダブルレーザーフローサイト メトリー系又はフルオロメトリー系を使用する場合、これは分析的困難さを生じ させる。さらに、組織切片上の抗体系によって得られる螢光は非常に明るくはな い。この困難さは抗体と結合した酵素を用いることにより克服され得る。しかし ながら常に、染色過程に多数の段階が必要である。Each of these methods is exemplified by the use of fluorophores to visualize antibodies. It has disadvantages and limitations. When the amount of antibody bound by cells is too low , fluorescent reagents cannot detect it. Especially the double laser flow sight This creates analytical difficulties when using metric or fluorometric systems. let Furthermore, the fluorescence obtained by antibody systems on tissue sections is not very bright. stomach. This difficulty can be overcome by using enzymes coupled to antibodies. but However, the dyeing process always requires a number of steps.
問題の解決は螢光性細菌又は螢光性ビーズの使用を含んでいた。ＲｉＮ者は、未 結合の過剰の細菌を除去するのが困難なため、そし、てさらにセル表面の光走査 プロフィールの有意な変化がフローサイトメトリーの適切な使用を不可能にする ため、螢光分析における使用が限定される。後者はセルに付着する凶百があり、 製造するのが困難であるか又は高価に過ぎ、そしてそれらもまた、イテル麦面の 光走査フロフィールの変化を生じさせるのに十分大きい。さらに、濾過又は洗浄 を必要どＶるフルオロメトリー系においては、過剰の粒子又は細菌を除去するこ とが不可能ではないにしても困難である。染色され、固定された細胞標品のため の細菌又はコロイド性金のごとき試薬の使用は顕微鏡に限定される。従って、抗 体の利点と、組織切片のためのフローサイトメトリーのために又は溶液材料のた めの固相測定のために使用することができる粒子の利点を合せ持つ他のクラスの 試薬の必要性が存在した。このような固相は、直接に又は競争的測定において溶 液中の抗原又は抗体を測定するだめのキットにおいて使用されるものであること ができる。抗体のすべての利点、例えば侵入性（ｐｅｎｅｔｒａｂｉｌｉｔｙ） 及び特異性と粒子のそれ、例えば可視性とを合わせ持つ試薬を手にすることは不 可能であった。事実、抗体のごとく機能するがしかしサイズが非常に大きく、そ れでいて同定されるべき構造を不明瞭にするほど大きくはない試薬が必要であっ た。このような試薬は、固定された細胞又は組織のごとき幾つかの構造の外に保 持されなければならず、そし、て過剰の試薬は容易に除去されなければならない 。Solutions to the problem included the use of fluorescent bacteria or fluorescent beads. RiN members are not yet Due to the difficulty of removing the excess of bound bacteria, and further optical scanning of the cell surface. Significant changes in profile preclude proper use of flow cytometry Therefore, its use in fluorescence analysis is limited. The latter has a lot of dirt that attaches to the cell, are difficult or too expensive to manufacture, and they also large enough to cause a change in optical scanning flow field. Additionally, filtration or washing In fluorometric systems that require is difficult, if not impossible. For stained and fixed cell preparations The use of reagents such as bacteria or colloidal gold is limited to microscopy. Therefore, anti for flow cytometry for tissue sections or for solution materials Other classes of particles that combine the advantages of being able to be used for solid phase measurements A need existed for reagents. Such solid phases can be dissolved directly or in competitive measurements. Must be used in a kit for measuring antigens or antibodies in liquid. Can be done. All the advantages of antibodies, such as penetrability It is essential to have a reagent that combines specificity with that of particles, e.g. visibility. It was possible. In fact, it functions like an antibody, but it is very large and Reagents that are bulky and not so large as to obscure the structure to be identified are needed. Ta. Such reagents can be stored outside some structures such as fixed cells or tissues. The reagent must be maintained and excess reagent must be easily removed. .
バクテリオファージは効果的な抗体として機能するには小さすぎるか、又は特に それらの尾部ファイバーのために非特異性に接着性であると考えられていた様で ある。同定実験においてバクテリオファージが有していた唯一の用途は、それら の細菌性宿主に対するウィルスとしてそれらを使用すること、又は一般に穏和な 化学的過程のカップリングによりそれらの表面に抗原を置き、そしてこれらの抗 原に対する抗体を用いてバクテリオファージ中和系において細菌に感染するバク テリオファージの能力をブロックすることであった。すなわち、バクテリオファ ージは、Ｈａｉｍｏｖｉｃｈ等、米国特許魚３．＋７１，７ｏｓ及びＹｏｕｎｇ 、米国特許ｉ４．１０４．１２６において生ウィルスとしてのみ使用された。そ れは、同定又は染色試薬としての抗体の担体としでは使用されなかった。上記の 理由により当業＃は、抗体を用いる他の測定のためにファージを使用することぢ ゆ・うちよしていたようである。Bacteriophages are too small to function as effective antibodies, or especially It appears that they were thought to be non-specifically adhesive due to their tail fibers. be. The only use bacteriophages had in identification experiments was to using them as viruses against bacterial hosts, or generally mild Placing antigens on their surface by coupling chemical processes and releasing these antibodies Bacteria that infect bacteria in a bacteriophage neutralization system using antibodies against the origin. The purpose was to block the ability of the theriophage. That is, bacteriophore 3. Haimovich et al. +71,7os and Young , used only as a live virus in US Patent i4.104.126. So It was not used as a carrier for antibodies as an identification or staining reagent. above For reasons of skill in the art, it is difficult to use phages for other assays using antibodies. It seemed like he was having a good time at home.
ｌ、ｕｄｅｒｅｒ等、米国特許Ｎｌ１４，２８２，３１５は、放射性ラベルされ た動物ウィルスを使用して、これらのウィルスの天然レセプターであるかこのよ うなレセプターの模倣である材料上のレセプターを検出することを提案した。こ れは本質的にウィルス１／セプターを同定するためか又は血球凝集目的のために 計画された。すなわち、ウィルスのためのレセプターと同定されるそれらとの間 に明瞭な類似性が存在した。細菌ウィルスであるバクテリオファージは、これら の明瞭な理由のためこのカテゴリーにおいては考慮されていなかった。第１に、 これらはいずれの血球凝集測定又は血球凝集阻害測定のためにも使用されず、こ れらの測定は幾つかの動物ウィルスにのみ基礎を置いている。第２に、バクテリ オファージが細菌上のレセプターを認識して感染を導く尾部の外観により特殊化 された構造を有することが良く知られている。この尾部が一旦そのレセプターに 結合すれば、それが細閏上ではなく溶液中に存在していても、核酸が排出され、 そしてウィルスが非感染性になることが知られている。従って、Ｌｕｄｅｒｅｒ 等の特許の技法に従ってそのような選択方法は不可能であると考えられていた。U.S. Pat. No. 14,282,315 discloses that radioactively labeled The natural receptors for these viruses have been investigated using proposed to detect receptors on materials that are mimics of eel receptors. child This is essentially for virus 1/ceptor identification or for hemagglutination purposes. Planned. i.e., between the receptors for the virus and those identified There were clear similarities. Bacteriophages, which are bacterial viruses, are were not considered in this category for obvious reasons. Firstly, They are not used for any hemagglutination measurements or hemagglutination inhibition measurements; These measurements are based only on some animal viruses. Second, bacteria Phages are specialized by the appearance of their tails that recognize receptors on bacteria and guide infection. It is well known that it has a similar structure. Once this tail becomes that receptor Once bound, the nucleic acid is excreted, even if it is in solution and not on the funnel. And it is known that the virus becomes non-infectious. Therefore, Luderer It was believed that such a selection method was not possible according to the techniques of the patents of et al.
他方、バクテリオファージは、頭部蛋白質とのその結合についての選択について 考慮されなかったようである。On the other hand, bacteriophages are selective about their binding to head proteins. It seems that this was not taken into account.
なぜなら頭部蛋白質の変異はバクテリオファージにとって致命的であると考えら れるからである。このことが、バクテリオファージが製造のために一層安価であ りそして非常に大量に、例えば動物ウィルスに比べて数オーダー多量に容易に生 ずるにもかかわらず、Ｌｕｄｅｒｅｒ等の特許が可能性ある代替物としてバクテ リオファージを考慮しなかった理由を説明するであろう。This is because mutations in the head protein are thought to be fatal to bacteriophages. This is because This makes bacteriophages even cheaper to manufacture. and can easily be produced in very large quantities, for example several orders of magnitude larger than animal viruses. Despite the fraud, the patent of Luderer et al. This would explain why lyophages were not considered.
３」坏８性丞 この発明は、原核性及び真核性の両者の細胞の分子性及び細胞性材料の同定及び 定量のだめの新規な方法に関し、この方法は、試験サンプルを選択されたハタテ リオフ１−ジと結合条件下で一諸にして試験サンプル中に同定されるべき分子又 は細胞と結合されたバクテリオファージを含んで成る複合体相をもたらす。可視 化剖が結合段階の前又は後においてバクテリオファージに導入され、常用の分析 測定技法における試験材料の認識が大幅に改良される。この発明の実施に当って は、バクテリオファージはその頭部又は尾部を介して結合するように選択するこ とができる。後者の場合、これは“外的イメージングにより達成され、これによ りバクテリオファージは抗体のごとく機能するように修飾される。3” Kyo 8 Seijo This invention relates to the identification and identification of molecular and cellular material of both prokaryotic and eukaryotic cells. Regarding the new method of quantitative determination, this method The molecule or molecules to be identified in the test sample together under binding conditions with yields a complex phase comprising bacteriophage associated with cells. visible Chemical dissection is introduced into the bacteriophage before or after the binding step, and routine analysis The recognition of test materials in measurement techniques is greatly improved. In carrying out this invention The bacteriophage can be selected to bind via its head or tail. I can do it. In the latter case, this is achieved through “external imaging; Bacteriophages are modified to function like antibodies.
一般に、バクテリオファージの変異株が使用される。この発明の方法は、蛋白質 、炭水化物、レクチン、種々のタイプの細菌、病原体、及び組織、細胞又は液体 中に存在するその他の分子性又は細胞性材料の分析に適用され得る。Generally, mutant strains of bacteriophage are used. The method of this invention , carbohydrates, lectins, various types of bacteria, pathogens, and tissues, cells or fluids. It can be applied to the analysis of other molecular or cellular materials present in
この発明の他の目的は、選択されたバクテリオファージ及び任意の選択された分 析装置中で使用するのに適する形の試験材料を提供するための適当な試験手段を 含んで成る測定キットを提供することである。Another object of this invention is to provide selected bacteriophage and any selected bacteriophages. suitable test means to provide test material in a form suitable for use in the analysis equipment. An object of the present invention is to provide a measurement kit comprising:
抗体のごとき同定剤による認識の構造は２つの部分、“知能部（ｉｎｔｅｌｌｉ ｇｅｎｃｅ）″すなわち相補的構造を結合する特異的部分、及び可視化部（ν１ ｓｕａｌｉｚｅｒ）、すなわちなんらかの方法で可視化される構造に亜分割され る。例えば、抗体で被覆された螢光ビーズ又は細菌の場合、“知能部”は抗体分 子の結合部位により提供され、そして“可視化部”はその分子付属部（螢光性、 放射性等）を有する分子の残余部により提供される。この発明の追加の“可視化 部”を与えるために、抗体がバクテリオファージに連結される。この連結は、グ ルタルアルデヒド又は二官能剤を用いる場合のように共有結合的であってもよく 、又はバイブリド抗体を用いる場合のように非共有的であってもよい。さらに、 この発明に従えば、“知能部”をもたらすため、すなわち抗体として機能するた めに、そしてさらに“可視化部”を担持するためにバクテリオファージを選択し そして造成することができる。The structure recognized by an identifying agent such as an antibody consists of two parts, the “intelligence part”. gence)'', a specific part that binds complementary structures, and a visualization part (ν1 (sualizer), i.e. subdivided into structures that are visualized in some way. Ru. For example, in the case of fluorescent beads or bacteria coated with antibodies, the "intelligence part" the binding site of the child, and the “visualization moiety” is provided by its molecular appendages (fluorescence, The remainder of the molecule has radioactivity, etc.). Additional “visualization” of this invention The antibody is linked to the bacteriophage to provide the bacteriophage. May be covalent, such as when using rutaraldehyde or a difunctional agent. , or may be non-covalent, such as when using hybrid antibodies. moreover, According to this invention, in order to provide an "intelligence part", i.e. to function as an antibody, bacteriophage to carry the “visualization part” and can be created.
病理学的液体中の細菌の同定において、該細菌を増殖せしめそして同定するのに 時間がかかり、そして多くの場合、細菌は培養において増殖することができない 。このような場合、バクテリオファージが可視化され、そして抗体により被覆さ れるか、又はそれらのレセプターを介して自然に結合される。In identifying bacteria in pathological fluids, for growing and identifying the bacteria, It is time consuming and often bacteria cannot grow in culture. . In such cases, bacteriophages are visualized and coated with antibodies. or naturally bound through their receptors.
この発明の方法の実施においては、バクテリオファージは可視化剤として、又は 抗体により与えられる“知能部”の担体として使用される。抗体は、三官能試薬 、例えばグルタルアルデヒド、又は他の共有もしくは非共有カップリング剤を用 いて、バクテリオファージに化学的に連結され得る。バクテリオファージは、ビ オチン又はアビジンを有する抗体に結合するためにそれぞれアビジン又はビオチ ンにより被覆される。この結合はビオチン−アビジン認識を介して達成される。In carrying out the method of this invention, bacteriophages are used as visualization agents or It is used as a carrier for the “intelligence portion” provided by antibodies. Antibodies are trifunctional reagents , for example using glutaraldehyde or other covalent or non-covalent coupling agents. and can be chemically linked to a bacteriophage. Bacteriophages are avidin or biotin to bind antibodies with otin or avidin, respectively. covered by This binding is achieved via biotin-avidin recognition.
バクテリオファージは、同定されるべき構造にバイブリド抗体の助けにより結合 することにより可視化剤として機能する。これらは、１つの結合部位によりバク テリオファージに対して向けられ、そして他方により第１抗体又は同定されるべ き構造に向けられる。バクテリオファージはさらに、対応する相補的構造の認識 のためにレクチン又は炭水化物と連結され得る。Bacteriophage binds to the structure to be identified with the help of hybrid antibodies It functions as a visualization agent. They have one binding site that allows them to the first antibody or antibody directed against the teriophage and by the other structure. Bacteriophage further recognizes the corresponding complementary structure. can be linked to lectins or carbohydrates for
バクテリオファージにより提供される可視化剤は、螢光染料、他の染料、放射性 アイソトープ材料、酵素、又は銀もしくは金のごとき金属の助けにより得られる 。Visualization agents provided by bacteriophages include fluorescent dyes, other dyes, and radioactive dyes. Obtained with the aid of isotopic materials, enzymes, or metals such as silver or gold .
バクテリオファージは、それらに“結合部位”を与える遺伝的操作により知能部 及び可視化部の両者を有するように選択され得る。変異の後、バクテリオファー ジは、免疫グロブリンのごとき分子に又は動物細胞の糖蛋白質もしくは蛋白質に 結合する頭部の性質について選択される。変異は、例えば、バクテリオファージ 及び細菌の両者の紫外線照射及びこれに続くバクテリオファージの増殖により得 られる。バクテリオファージは収得され、精製されそして選択圧が適用される； すなわち細胞表面に、又は固相に連結された分子に結合する。Bacteriophages are made intelligent through genetic manipulation that gives them “binding sites.” and a visualization part. After mutation, bacteriophore The enzyme is added to molecules such as immunoglobulins or to glycoproteins or proteins in animal cells. Selected based on the nature of the head to be combined. Mutations can occur in bacteriophages, e.g. obtained by UV irradiation of both bacteria and bacteria and subsequent proliferation of bacteriophages. It will be done. Bacteriophages are harvested, purified and selective pressure is applied; That is, it binds to the cell surface or to a molecule linked to a solid phase.
バクテリオファージは、細胞表面の同定のために直接に、又はバクテリオファー ジにより認識される抗体により細胞が処理された後に螢光化される。非常に多数 の粒子を使用することによりそして温度耐性変異体を選択することによって、す なわちバクテリオファージの生存となお適合性の非常に稀な事象を選択すること により、頭部変異の致死性が回避される。Bacteriophage can be used directly for cell surface identification or as a bacteriophage. After cells are treated with antibodies recognized by the dye, they become fluorescent. very large number By using particles of i.e. selecting very rare events of bacteriophage survival and still compatibility. This avoids the lethality of head mutations.
細菌の表面上の特定の構造に結合する尾部の能力を用いることにより他のセント の変異体を調製することができる。変異及び選択により、特定の構造を認識する ことができるそれらの尾部を有するバクテリオファージが選択される。これは、 Ｕｒｂａｉｎ等、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９８０． アカデミツクプレス、Ｖｏｌｌ、 ８１〜９２頁により検討されているような、 抗体の抗イデオタイプネットワーク中の内部イメージングと非自明的類似性を有 する“外部イメージングにより行われる。同定されるべき分子“Ｘ”が動物に注 射され、そしてそれに対する抗体が作られる。精製された抗“Ｘ”抗体が固相に 連結されそして非常に多数の細菌により処理される。これらの細胞が、バクテリ オファージ感受性親株からのバクテリオファージ“Ｙ”に対する耐性について選 択される。これらのバクテリオファージ耐性細菌はバクテリオファージに対する レセプターを欠く。これらの抗体に結合する細菌を選択し、そしてこれらが“Ｘ “を模倣する構造を有するように増殖せしめる。other cents by using the tail's ability to bind to specific structures on the bacterial surface. Variants of can be prepared. Recognize specific structures through mutation and selection Bacteriophages with their tails that can be used are selected. this is, Urban et al., Progress in Immunology, 1980. As discussed by Academic Press, Vol. 81-92, Internal imaging and non-trivial similarities in the anti-idiotype network of antibodies This is done by external imaging. The molecule “X” to be identified is injected into the animal. and antibodies are produced against it. Purified anti-“X” antibody on solid phase connected and processed by a large number of bacteria. These cells become bacteria. Selected for resistance to bacteriophage “Y” from phage-susceptible parent strains. selected. These bacteriophage-resistant bacteria are Lacks receptors. Bacteria that bind to these antibodies are selected and these ``Grow so that it has a structure that mimics it.''
“Ｘ”一様構造を発現することができる細菌の選択は、細菌上の精製された抗“ Ｘ”に結合するそれらの能力により確認され得る。次に、これらの細菌は、およ そ環部で、ＵＶ照射されそして変異原処理された（例えばＵＶ−照射された）バ クテリオファージにより処理されたバクテリオファージ耐性細菌と混合される。Selection of bacteria capable of expressing the “X” uniform structure is based on purified anti- These bacteria can then be identified by their ability to bind to At its annulus, UV-irradiated and mutagen-treated (e.g. UV-irradiated) mixed with bacteriophage-resistant bacteria treated with cterophages.
バクテリオファージ耐性細菌上のレセプターを認識することができる、感受性細 菌から生ずる変異るから、変異の結果として両細菌が細胞溶解される少数の明瞭 なプラークを除き、すべてのコンフルエント細胞溶解は濁るであろう。プラーク が吸着材料に取り出され、そして“Ｘ”を認識する変異体が、可視化される、す なわち放射性、螢光性等である“Ｘ”プローグにより検出される。変異体バクテ リオファージがプレート上で追跡され、そしてそれらの新たな細菌宿主上でクロ ーン化される。“Ｘ”を認識するすべてのクローンの能力が固相上で競争的測定 を介して遊離“Ｘ”により、そしてこの変異体バクテリオファージによる細菌の 感染に対する“Ｘ′による競争について決定される。細菌上のレセプターの尾部 認識は抗原−抗体相互作用と幾つかの類似性を有するが、バクテリオファージ認 識過程は木質的に異る特徴を有し、そしてそれらを抗体のための驚くべき且つ代 替物にする。さらに、バクテリオファージの宿主範囲変異がむしろ頻繁であるこ とが知られているから、バクテリオファージが所望の部位認識について選択され ることは予想外のことである。bacteriophages capable of recognizing receptors on resistant bacteria; Since mutations arise from bacteria, there are a few distinct cases in which both bacteria undergo cell lysis as a result of the mutations. All confluent cell lysis will be cloudy, except for plaques. plaque is taken out on an adsorbent material, and the mutants that recognize “X” are visualized. That is, it is detected by an "X" probe that is radioactive, fluorescent, etc. mutant bacterium Lyophages are tracked on the plate and cloned onto their new bacterial hosts. will be turned into a zone. Competitive determination of the ability of all clones to recognize “X” on solid phase by free “X” and by this mutant bacteriophage. Determined for competition by "X' for infection. Receptor tail on bacteria Although recognition has some similarities to antigen-antibody interactions, bacteriophage recognition The recognition process has woody distinct characteristics and makes them surprising and alternative for antibodies. Make it a replacement. Furthermore, host range variation of bacteriophages is rather frequent. Since it is known that bacteriophages are selected for the desired site recognition, This is unexpected.
バクテリオファージは、他の遺伝的操作により特定の抗原を認識するようにされ る。プラスミドにより制御される幾つかの表面構造を有する細菌が使用される。Bacteriophages are made to recognize specific antigens through other genetic manipulations. Ru. Bacteria with several surface structures controlled by plasmids are used.
例えば“Ｘ”のための遺伝子がプラスミドに導入される。次に、その表面に“Ｘ ”を発現する細菌が上記のようにして選択される。これらの表面蛋白質又は糖蛋 白質はレセプターとしてバクテリオファージにより使用される構造上にある。感 染レセプターとしてこれらの構造を認識するバクテリオファージを選択すること により、“Ｘ”を認識するバクテリオファージが得られる。従って、抗原の外部 イメージが細菌−ヒに得られる。For example, the gene for "X" is introduced into a plasmid. Next, “X” is placed on the surface. Bacteria expressing these surface proteins or glycoproteins are selected as described above. White matter is on structures used by bacteriophages as receptors. Feeling Selecting bacteriophages that recognize these structures as dye receptors A bacteriophage that recognizes "X" is obtained. Therefore, the external Images are obtained of bacteria.
他の方法は、プラスミド中の免疫グロブリンとの組換により、免疫グロブリンの ヘビー鎖及び／又はライト鎖と同一の配列を有するバクテリオファージ尾部を作 ることである。正常な尾部配列を有する親バイ７テリオフアージが天然宿主によ る引引こよって除去される。これらは上記の方法により変異されそしてＸ′の認 識について選択される。表面上に“Ｘ”を有する細菌を２種類のバクテリオファ ージ、すなわち■イ遺伝子生成物を発現する一方とＶ、遺伝子生成物を発現する 他方により同時感染することにより完全なヘビー及びライト鎖配列が得られる。Another method is to make immunoglobulins by recombination with immunoglobulins in plasmids. Generate bacteriophage tails with sequences identical to the heavy and/or light chains. Is Rukoto. The parental bi7teriophage with normal tail sequence was transferred to the natural host. removed by pulling. These were mutated by the method described above and the recognition of Selected for knowledge. Bacteria with “X” on the surface are divided into two types of bacteriophage. A, i.e. A, which expresses the gene product, and V, which expresses the gene product. By co-infecting with the other, complete heavy and light strand sequences are obtained.
この発明の方法の実施においては、１つの手段は、細菌、真核細胞、及び他の分 子性材料の同定において使用するための、可視化剤と連続される適当なバクテリ オファージを含んで成るキットを集成することを含む。ファージの多数の部分が 、それぞれ意図される測定において効果的であるように選択された量において使 用され得る。In practicing the method of this invention, one means is to use bacteria, eukaryotic cells, and other species. a suitable bacterium in series with a visualization agent for use in the identification of biological materials; including assembling a kit comprising the phage. Many parts of the phage , each used in amounts selected to be effective in the intended measurement. can be used.
次の例は、この発明の方法の例示であり限定ではない。The following examples are illustrative and not limiting of the method of the invention.
例 １−Ａ バクテリオファージを、螢光性にされ、放射性にされ、又はパーオキシダーゼと 連結された後のモノクローナル又はポリクローナル抗体に連結し、そして染色又 は同定剤として使用する。マウス免疫グロブリンＧ（ＭＩＧ）を検出するため、 カップリング剤、例えばグルグルアルデヒド又は他の２官能剤を用いてバクテリ オファージを抗−ＭＩＧ抗体により被覆する。ファージを、フルオレフセインイ ンチシアナート、ローダミンもしくは他の螢光染料と連結することにより、ファ ージＤＮＡと結合するエチジウムブロビドで処理することにより、又は核酸と結 合する他の染料により螢光性にする。ファージを、その蛋白質もしくは核酸中に 放射性物質を導入することにより、又は蛋白質に放射性物質を結合せしめる常法 により、放射性にする。他の方法として、常法によりファージに銀のごとき金属 が添加される。Example 1-A Bacteriophage can be made fluorescent, radioactive, or treated with peroxidase. After ligation, the monoclonal or polyclonal antibody is ligated and stained or is used as an identifying agent. To detect mouse immunoglobulin G (MIG), Bacteria can be isolated using coupling agents such as glugulaldehyde or other bifunctional agents. Phage are coated with anti-MIG antibody. The phages were treated with fluorophore By linking with anticyanates, rhodamines or other fluorescent dyes, by treatment with ethidium bromide, which binds to di-DNA, or by treatment with ethidium bromide, which binds to nucleic acids. Make it fluorescent with other compatible dyes. phages into their proteins or nucleic acids. Conventional method of introducing radioactive substances or binding radioactive substances to proteins makes it radioactive. Alternatively, phages can be exposed to metals such as silver using conventional methods. is added.
バクテリオファージ懸濁液は次のようにして調製した。試験サンプルにおいて、 バクテリオファージＴ４をニジエリシャ’コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ ｌｉ）のＹＳ５７株（工ｒＨ，Ｐｒｏ 、 Ｈ４５）中で増殖せしめた。細菌を トリプシン処理した大豆汁（ディフコ）中で増殖せしめ、そして０．５〜１の感 染倍率でファージと混合した。細菌とバクテリオファージとの混合物を、硬寒天 （ハードアガー）の栄養培地層上の軟寒天（ソフトアガー）中でインキュベート した。−夜インキユベートした後、細菌はファージにより完全に溶解され、軟寒 天上層を集め、そしてクロロホルム及び０．０℃ＭＥＤＴＡで処理して非ファー ジ材料を沈澱せしめた。３７℃にて１時間の後、この混合物を５０００Ｇにて１ ０分間遠心分離し、そして上清を集めた。遊離核酸を除去するため、上清を２０ ｐｇ／ｍｌのＤＮＡアーゼ及び２０μｇ ／ ｍ ｌのＲＮＡアーゼにより３７ ℃にて１時間処理した。ファージを洗浄するため、ＮａＣ１及びポリエチレング リコール（ＰＥＧ）をそれぞれ最終濃度が０．５ Ｍ及び６％となるように加え 、そして混合物を４℃にて１８時間インキュベートした。８０００ Ｇにて３０ 分間遠心分離、そして０．１５ＭＮａＣβ２に再懸濁した後、約１０′３感染単 位／ｍｌの最終バクテリオファージ濃度が得られた。異る波長における吸収のプ ロフィールは純粋なファージ集団のそれであった。A bacteriophage suspension was prepared as follows. In the test sample, Bacteriophage T4 was isolated from Escherichia coli (Escherichia coli). li) in the YS57 strain (RH, Pro, H45). bacteria Grown in trypsinized soybean juice (Difco) and It was mixed with phages at the same staining rate. The mixture of bacteria and bacteriophages is added to hard agar. Incubate in soft agar (soft agar) on a nutrient medium layer of (hard agar) did. - After night incubation, bacteria are completely lysed by phages and cooled The top layer was collected and treated with chloroform and 0.0°C MEDTA to The material was precipitated. After 1 hour at 37°C, the mixture was heated at 5000G for 1 hour. Centrifuged for 0 min and collected the supernatant. To remove free nucleic acids, the supernatant was 37 pg/ml DNAse and 20 μg/ml RNAse It was treated at ℃ for 1 hour. To wash the phage, NaCl and polyethylene Add recall (PEG) to final concentrations of 0.5 M and 6%, respectively. , and the mixture was incubated for 18 hours at 4°C. 30 at 8000G After centrifugation for min and resuspension in 0.15M NaCβ2, approximately 10'3 infectious cells A final bacteriophage concentration of 500 mg/ml was obtained. Absorption profiles at different wavelengths Rophile was that of a pure phage population.
抗体を被覆するため、次の方法を用いた。ｐ Ｈ８，５の０．１Ｍリン酸緩衝液 中懸濁状のファージを、グルタルアルデヒドと混合して１％の濃度にし、そして ２５℃にて１時間インキュベートした。０．５ Ｍ ＮａＣｊ２及び６％ＰＥＧ によりファージを沈澱せしめそしてｐ Ｈ８，５の緩衝液に再懸濁することによ り過剰のグルタルアルデヒドを除去した。抗体、抗ラビットＩｇを加えて１■抗 体／１■ファージ蛋白質とした。ラビットリンパ球と４℃にて２時間インキュベ ートした後、そして９００Ｇにて５分間遠心することにより細胞を３回洗浄した 。The following method was used to coat the antibodies. 0.1M phosphate buffer with pH8.5 The phage in medium suspension was mixed with glutaraldehyde to a concentration of 1% and Incubate for 1 hour at 25°C. 0.5 M NaCj2 and 6% PEG The phages were precipitated by Excess glutaraldehyde was removed. Add antibody and anti-rabbit Ig to 1■ anti-rabbit Ig. Body/1 ■ Phage protein. Incubate with rabbit lymphocytes for 2 hours at 4°C. cells were washed three times by centrifugation at 900G for 5 minutes. .
螢光性ファージの結合を、抗体ではなく正常なＩｇＧにより又は螢光性抗１ｇに より被覆された螢光性ファージのそれと比較した。細胞を螢光顕微鏡のもとで試 験した。マクロファージ性を有する（すなわち大きい）細胞は正常なＩｇ及び抗 Ｉｇ抗体標品の両者において２〜５％のファージ粒子を含有していた。しかしな がら１、抗−Ｉｇ抗体で被覆されたファージは表面螢光を有する４７％の細胞を 説明したが、正常なＩｇで被覆されたファージはわずかに１〜２％を有した。Binding of fluorescent phages is carried out by normal IgG rather than antibodies or by fluorescent anti-1g. compared with that of a more coated fluorescent phage. Examine the cells under a fluorescence microscope. I tried it. Cells with macrophage properties (i.e., large) have normal Ig and anti- Both Ig antibody preparations contained 2-5% phage particles. However 1, phages coated with anti-Ig antibodies eliminated 47% of cells with surface fluorescence. As explained, only 1-2% of phages were coated with normal Ig.
表面螢光は、抗−Ｉｇ螢光抗体で処理された同じ細胞のそれよりも強化された。Surface fluorescence was enhanced compared to that of the same cells treated with anti-Ig fluorescent antibodies.
すなわち、抗−Ｉｇ抗体で被覆されたファージは、結合の特異性を示し、そして 強い螢光を与えた。That is, phage coated with anti-Ig antibodies exhibit specificity of binding and It gave off a strong fluorescence.
勇−土二旦 濃縮され、精製されたバクテリオファージをヘテロ２官能試薬により処理する。Isamu - Saturday and Sunday The concentrated and purified bacteriophage is treated with a heterobifunctional reagent.
ラビット抗−アロタイブ抗体（抗ｂｔ）をチオール化し、そして三者間のブリッ ジを形成してラビット抗体がファージに連結されるようにする。対照として、次 にファージを螢光性にする。次にファージ抗体複合体を細胞と混合し、洗浄し、 そして顕微鏡又は他の適当な装置により試験する。螢光の程度はファージ蛋白質 上のアミノ基の使用の程度により制御される。Rabbit anti-allotybe antibody (anti-bt) was thiolated and the three-way bridge phage so that the rabbit antibody is linked to the phage. As a control, make the phage fluorescent. The phage antibody complex is then mixed with cells, washed, and and examined by microscope or other suitable equipment. The degree of fluorescence depends on the phage protein Controlled by the degree of use of the above amino groups.
例 Ｉ−Ｃ 抗体で被覆されたファージを用いて固定された組織切片を処理する。リンパ節の 切片を螢光性ファージ標品で処理し、洗浄し、そしてＵＶ光のもとで試験する。Example I-C Treat fixed tissue sections with antibody-coated phages. lymph node Sections are treated with fluorescent phage preparations, washed, and examined under UV light.
他の方法において、被覆されたファージが標準的方法による基質の最終添加によ り表わされる。この方法はまた、自発的に結合するように選択されたファージに ついても使用される。In other methods, the coated phages are removed by the final addition of substrate by standard methods. is expressed. This method also allows phage that are selected to bind spontaneously to It is also used even if it is attached.
例 １−Ｄ 尾部又は頭部によりＭ Ｉ Ｇを認識するように選択されたファ一・ジを、ＭＴ Ｇ抗体、例えばモノクローナル抗体を含有する溶液と、混合する。このファージ は螢光性又は放射性である。ＰＥＧによる沈澱により洗浄した後、これを用いて 抗体と化学的に結合したファージを取り換える。ファージは適当なカップリング 法により可視化される。Example 1-D The phage selected to recognize the MIG by its tail or head is Mix with a solution containing a G antibody, eg a monoclonal antibody. This phage is fluorescent or radioactive. After washing by precipitation with PEG, this was used to Replace the phage chemically bound to the antibody. Phage is a suitable coupling Visible by law.
例■ 細菌を含む病原性材料の迅速な分析において使用されるようにバクテリオファー ジを設計する。関節液又は滲出液を塗布し、固定し、ファージを加え、そしてそ れらの存在を適当な手段、例えば螢光のためのＵＶ光、酵素のだめの明視野等に より可視化する。抗フアージ抗体によるファージの結合は、遊離のファージ蛍白 質による競争的飽和により、又はサンプルをホルムアルデヒドで処理することに より回避される。非常に少数の細菌が、それらが死んでいる場合でさえ、容易に 同定される。可能性ある種々の病原体に対する複合ファージ懸濁液、及びこれに 続く陽性でありそうな生成物への個々の懸濁液の２重添加が、稀少な生物の迅速 な同定を可能にする。Example■ Bacteriophores for use in rapid analysis of pathogenic materials containing bacteria design. Apply synovial fluid or exudate, fix, add phages, and Their presence can be detected by appropriate means, such as UV light for fluorescence, bright field for enzyme reservoirs, etc. Make it more visible. Binding of phage by anti-phage antibodies results in free phage fluorescence. by competitive saturation by quality or by treating the sample with formaldehyde. more avoided. Very few bacteria, even when they are dead, are easily Identified. complex phage suspensions against various potential pathogens; Subsequent double addition of individual suspensions to likely positive products allows rapid detection of rare organisms. enables accurate identification.
病原性サンプル中の細菌の同定の条件を促進するために次の実験を行った。The following experiments were performed to facilitate conditions for the identification of bacteria in pathogenic samples.
Ｔ４バクテリオファージを増殖せしめそして例１−Ａと同様にして精製した。０ ．５■〜８■の範囲の種々の量のフルオレフセインイソチオシアネート（ＦＩＴ Ｃ）を１■のファージ蛋白質に対して加えた。０、Ｉ Ｍ Ｎａ２ＣＯ３により ファージ懸濁液をｐＨ９，３に調整した。ＦＩＴＣを４℃に攪拌しながら加え、 攪拌を２時間続け、そして次に４℃にてさらに２０時間インキュベートした。こ の懸濁液を０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，５）に対して４℃にて３日間透析 することにより、過剰のＦＩＴＣを除去した。７個の調製物におけるＦｉＴＣ／ 蛋白質の最終モル比は（１）３．８、（２）８．０、＋３１１１゜３、（４１１ ８，６、（５）２９．２、（６１１９，３、及び（７）１６．４であった。T4 bacteriophage was grown and purified as in Example 1-A. 0 ．． Fluorefcein isothiocyanate (FIT) in various amounts ranging from 5 ■ to 8 ■ C) was added to 1 phage protein. 0, IM by Na2CO3 The phage suspension was adjusted to pH 9.3. Add FITC to 4°C with stirring; Stirring was continued for 2 hours and then incubated for a further 20 hours at 4°C. child The suspension was dialyzed against 0.1 M phosphate buffer (pH 8,5) at 4°C for 3 days. Excess FITC was removed by. FiTC/ in 7 preparations The final molar ratio of proteins is (1) 3.8, (2) 8.0, +3111°3, (411 8,6, (5) 29.2, (6119,3, and (7) 16.4.
結合特異性及び視野中の１微生物の存在を明らかにする能力を決定するために、 Ｅ、コリＹＳ５７株中で増殖したＴ４ファージをＹＳ５７への結合について試験 した。対照として、ＹＳ５７のファージ耐性株であるＥ。コリＵＳＣ１０６、バ シルス・クロビギ−（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ［並η■）及びサルモネラ・シ５１７ トムレリ （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｃｈｏｔｔｍｕｌｌｅｒｉ ）を使用し た。結合について試験するため、ファージをホルムアルデヒド固定した細菌と２ ５°Ｃにて１０分間混合し、そして次に３回洗浄して未結合ファージを除去した 。To determine the binding specificity and ability to reveal the presence of one microorganism in the field of view, E. T4 phage grown in coli strain YS57 tested for binding to YS57. did. As a control, E, a phage-resistant strain of YS57. Cori USC106, Ba Bacillus [average η■] and Salmonella ci 517 Using Salmonella schottmuleri Ta. To test for binding, phages were incubated with formaldehyde-fixed bacteria. Mixed for 10 minutes at 5°C and then washed three times to remove unbound phage. .
ファージ感受性Ｅ、コリＹＳ５７は強く螢光性となり、その結果螢光顕微鏡下で １微生物さえ明瞭に見ることができた。Phage-susceptible E. coli YS57 becomes strongly fluorescent, so that it cannot be seen under a fluorescence microscope. Even one microorganism could be clearly seen.
ファージ調製物（１１、（２）及び（３）、すなわち１１．３のＦＩＴＣ／蛋白 質モル比まで、は強く螢光性にされ、他方変異株ＵＳＣ１０６、Ｂ。Phage preparation (FITC/protein of 11, (2) and (3), i.e. 11.3) up to a certain molar ratio, is strongly fluorescent, while the mutant strain USC106,B.
グロビジー及び、Ｓ。ショフトムレリ。すなわち、ファージ特異性は１１．３の モル比において維持され、この比は抗体について日常的に使用されるそれに類似 する。しかしながら、ファージ粒子は抗体に比べて約５００倍多くの蛋白質を有 するので、ファージ粒子もまたその非常に多くの全螢光を与える。Globigi and S. Shoftomleri. That is, the phage specificity is 11.3. molar ratios similar to those routinely used for antibodies. do. However, phage particles contain about 500 times more protein than antibodies. As such, phage particles also contribute a great deal of their total fluorescence.
Ｅ。コリの新鮮なＵＳＣ１０６及びＹＳ５７株が使用された場合（すなわち、ホ ルムアルデヒドで固定されない場合）、ファージは同様に両細菌に結合した。こ れは予想外の発見であり、調製物がまずホルムアルデヒドにより固定されるべき ことを示している。このことは、抗体、特に、試験されるべき病原性標品中に存 在しそしてファージを結合するであろう天然抗体を破壊するという利点をもたら す。E. If fresh strains of E. coli USC106 and YS57 were used (i.e. When not fixed with luminaldehyde), the phages bound similarly to both bacteria. child This is an unexpected finding and suggests that the preparation should first be fixed with formaldehyde. It is shown that. This may be due to the presence of antibodies, especially in the pathogenic preparations to be tested. provides the advantage of destroying natural antibodies that are present and would bind the phage. vinegar.
例ｍ−Ａ 分子又は細胞を認識するファージの変異株を得るため、最初の条件は、ファージ はそのような細胞又は分子に天然に結合すべきでないということである。すなわ ち、ファージは例ｔ−Ａのようにして調製され、そして１１．３のＦＩＴＣ／フ ァージ蛋白質のモル比に螢光化された。これらのファージを、複合体細胞、モノ クローナルマウス抗体により処理されたヒトリンパ球、及びラビットリンパ球に ついて試験した。ヒト単核球はＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐｄｑｕｅ法により末梢血か ら精製し、洗浄し、そしてモノクローナルマウス抗−ヒトＴ細胞と共に１時間イ ンキュベートし、そして再度洗浄した。Example m-A To obtain mutant strains of phage that recognize molecules or cells, the initial conditions are should not naturally bind to such cells or molecules. Sunawa The phage was prepared as in Example t-A and the FITC/phage of 11.3 The molar ratio of phage protein to fluorophore. These phages can be transferred to complex cells, mono Human lymphocytes and rabbit lymphocytes treated with clonal mouse antibodies I tested it. Human mononuclear cells were isolated from peripheral blood using the Ficoll-hypdque method. purified, washed and incubated for 1 hour with monoclonal mouse anti-human T cells. Incubate and wash again.
ラビットリンパ細胞を牌臓及びリンパ腺から日常的方法により得、混合し、そし て洗浄した。Rabbit lymphocytes are routinely obtained from the spleen and lymph glands, mixed, and I washed it.
ｉｏ’ ｍ胞／ｍＡ（ヒト又はマウス）を含有する懸濁液を、例１−Ａのように して調製されたが抗体で被覆されていない１０１ｚの螢光性ファージ粒子を用い て試験した。A suspension containing io'm cells/mA (human or mouse) was prepared as in Example 1-A. using 101z fluorescent phage particles prepared as described above but not coated with antibody. It was tested.
４℃にて１時間のインキュベーションの後、細胞を洗浄し、そして顕微鏡下で試 験した。表面螢光は観察されず、螢光性にされたバクテリオファージはＭ Ｉ Ｇ 、ヒトリンパ球、又はラビットリンパ球に非特異的に結合しないことが示さ れた。After 1 hour incubation at 4°C, cells were washed and examined under the microscope. I tried it. No surface fluorescence was observed, and the bacteriophage made fluorescent was MI. G, shown to not bind nonspecifically to human lymphocytes or rabbit lymphocytes. It was.
この驚くべき観察は結合するバクテリオファージについての選択のための基礎を 与えた。This surprising observation provides the basis for the selection of bacteriophages that bind Gave.
それらが天然に認識する構造以外の構造に結合するバクテリオファージの選択は ２つの方法において、すなわち、種々のコレクションから異なる存在するバクテ リオファージをスクリーニングすることにより、及び合成的操作により、行なわ れる。スクリーニングの例は次の通りである。The selection of bacteriophages that bind to structures other than those they naturally recognize is In two ways, i.e., different existing bacteria from various collections carried out by screening lyophages and by synthetic manipulation. It will be done. Examples of screening are as follows.
バクテリオファージＴ４はヒト又はラビットのリンパ球の新鮮な懸濁液には結合 しない。血液要素の他の構造が同定され得るか否かを決定するため、ラビット及 びヒト血球のプレパラートを調製しそしてホルムアルデヒドで処理した。次に、 このプレパラートをｍ１当り１０１３個の、ＦＩＴＣ処理によって螢光性にされ たＴ４４フアージ子を含有する懸濁液で３０分間処理した。プレパラートを洗浄 し、上にカバースリップを置き、そして螢光顕微鏡の下で試験した。白血球の細 胞質中にのみ非常に強い螢光が見られた。核、膜、及び赤血球細胞は螢光性でな かった。この試験は、ともかく、未知の且つ非自明の機構により白血球の細胞質 中のなんらかの構造がＦＩＴＣ−ラベルされたＴ４ファージにより認識されるこ とを示す。Bacteriophage T4 binds to fresh suspensions of human or rabbit lymphocytes. do not. To determine whether other structures of blood elements can be identified, rabbit and Preparations of human blood cells were prepared and treated with formaldehyde. next, This preparation was made fluorescent by FITC treatment at 1013 pieces per m1. The cells were treated with a suspension containing T44 phage cells for 30 minutes. Clean the preparations a coverslip was placed on top and examined under a fluorescence microscope. white blood cells Very strong fluorescence was observed only in the cytoplasm. The nucleus, membranes, and red blood cells are nonfluorescent. won. In any case, this test shows that the cytoplasm of leukocytes is affected by an unknown and non-obvious mechanism. Some structures within it may be recognized by the FITC-labeled T4 phage. and
バクテリオファージの選択はまた、合成的操作によっても行われる。マウス免疫 グロブリン（ＩｇＧ）を認識するバクテリオファージ変異体の調製において、例 Ｉ−Ａの場合のようにニジエリシャ・コリＹＳ５７株がペトリ皿中に調製され、 そしてＵＶ光を照射して細胞の５０〜９０の殺滅を得る。この段階はＤＮＡ修復 機構を開始するために行われる。Ｔ４ハクテリオファージの懸濁液もＵＶ光によ り処理し、バクテリオファージの嬉約８０％を殺しそして変異を生じさせる。バ クテリオファージにより細菌を感染せしめ、そしてバクテリオファージを増殖さ せ、収得し、そしてクロロホルムで処理する。Bacteriophage selection is also performed by synthetic manipulation. mouse immunity In the preparation of bacteriophage mutants that recognize globulin (IgG), e.g. Elisha coli YS57 strain was prepared in a Petri dish as in I-A; Then irradiate with UV light to obtain 50-90 kills of cells. This step is DNA repair Done to start the mechanism. Suspensions of T4 bacteriophage were also exposed to UV light. bacteriophages, killing approximately 80% of the bacteriophages and causing mutations. Ba Bacteria are infected with bacteriophages, and the bacteriophages are multiplied. collected, and treated with chloroform.
次にファージ懸濁液を、ポリエチレングリコールによる沈澱により又は超遠心分 離により濃縮して１０′２惑染ユニット／ｍ１以上の懸濁液を得る。The phage suspension is then purified by precipitation with polyethylene glycol or by ultracentrifugation. Concentration is carried out by separation to obtain a suspension of more than 10'2 speciation units/ml.
２５℃及びｐ Ｈ９，２において一層インキユベートすることにより、又はカッ プリング剤としてポリーＬ−リジンを使用することにより、プラスチックベトリ 皿の底をマウスＩｇＧ（ＭＩＧ）で直接被覆する。このＭＩＧは抗フアージ抗体 活性を有しない。すなわち８、これは他の特異性についてモノクローナルである か、又はこれはファージによって前吸着され又はＦｃ部分が使用される。ファー ジを皿に加え、そして３７℃にて１時間インキュベートする。プレートを十分に 洗浄して未結合ファージを除去する。変異体を得る機会を改良するために、マウ スＩｇＧを粒子、赤血球、細菌又はビーズに、化学的に又はその抗体機能を通し て付加する。By further incubating at 25°C and pH 9.2 or by cutting. By using poly-L-lysine as a pulling agent, plastic veterinary Coat the bottom of the dish directly with mouse IgG (MIG). This MIG is an anti-phage antibody Has no activity. i.e. 8, which is monoclonal with respect to other specificities Alternatively, it is preadsorbed by phage or the Fc moiety is used. fur Add to the dish and incubate for 1 hour at 37°C. enough plates Wash to remove unbound phage. To improve the chances of obtaining mutants, IgG to particles, red blood cells, bacteria or beads, either chemically or through its antibody function. Add it.
ファージにより処理されそして洗浄されたプレートを用いて、軟寒天中の細菌を 添加することにより直接的にファージを増殖せしめる。まずプレートを繰り返し 洗浄して特異的に結合していないファージを除去する。生存する頭部変異体を得 る機会を改良するため、ファージを高温、例えば４２℃においても増殖せしめる 。ファージコロニーをピンクアップし、そして感受性細菌中で増殖せしめ、そし て２〜３回再クロり：／化する。Plates treated with phage and washed are used to isolate bacteria in soft agar. By adding this, the phages are directly propagated. First repeat the plate Wash to remove non-specifically bound phage. Obtain a surviving head mutant The phages can also be grown at high temperatures, e.g. 42°C, to improve their chances of growth. . Phage colonies are pinked up and grown in susceptible bacteria, and Repeat 2 to 3 times to make /.
ＭＩＧを認識するファージクローンの予備スクリーニングとして次の方法が使用 される。上に示したようにプレートをＭＩＧで被覆し、ファージの親株を変異株 と平行して別々のプレートに加え、インキュベートしそして洗浄し、そして最後 に細菌を加える。親株はまれにのみプラークをもたらすが、ＭＵＧに結合する変 異体プラーク、及び細菌のコンフルエント溶解さえもたらす。The following method was used as a preliminary screen for phage clones that recognize MIG. be done. Coat the plate with MIG as shown above and transfer the parent strain of the phage to the mutant strain. in parallel to separate plates, incubate and wash, and finally Add bacteria to. The parent strain only rarely gives rise to plaques, but mutations that bind to MUG It results in foreign plaques and even confluent lysis of bacteria.
例１１ｕ −Ｂ 例ＩＩＩ −Ａの方法に対応する方法において、ファージコロニーを吸取紙上に 拾い上げる。放射性又は螢光性ＭＩＧを加え、ＭＵＧの変異株への結合を促進す るためにインキュベートし、洗浄し、そして次にそれぞれ放射能についてのスキ ャンナーにより又はＵＶ光により試験する。関連する変異株をもとのゲルに再ト レースし、そしてクローン化する。追加の証明を得るために、形成されたすべて のコロニーを集め、そして細菌中で増殖せしめる。各クローンを２本のチューブ 中で増殖せしめ、一方はＩ４０ブラベルされたアミノ酸を含有する。ファージを 集め、クロロホルムで処理し、ポリエチレングリコールによる沈澱により、又は 超遠心分離により集め、そしてＭＩＧで被覆されたミクロウェルに加える。３７ ℃にて１時間のインキュベーションの後、ウェルを洗浄し、ドデシル硫酸ナトリ ウム（ＳＤＳ）溶解を加えて結合した放射性物質を取り出しそしてそのｃ、ｐ、 ｍを決定する。次に、バックグラウンドにより高いカウントをもたらすファージ クローンを増殖せしめ、そして上記と同じ系においてＭＩＧと結合するその能力 について再試験する。Example 11u -B In a method corresponding to the method of Example III-A, phage colonies are transferred onto blotting paper. pick up. Add radioactive or fluorescent MIG to promote binding of MUG to the mutant strain. incubate for radioactivity, wash, and then screen each for radioactivity. Test by scanner or by UV light. Reload the relevant mutant strains into the original gel. Race and clone. All formed to obtain additional proof Colonies are collected and allowed to grow in bacteria. 2 tubes of each clone one containing the I40 labeled amino acid. Phage by collection, treatment with chloroform, precipitation with polyethylene glycol, or Collected by ultracentrifugation and added to MIG coated microwells. 37 After 1 hour incubation at °C, wells were washed and treated with sodium dodecyl sulfate. The bound radioactive substance is removed by adding um(SDS) dissolution and its c, p, Determine m. Next, phages that lead to higher counts in the background Its ability to propagate clones and bind MIG in the same system as above. will be retested.
例ｍ−ｃ Ｍ Ｉ Ｇへの結合を示すバクテリオファージを通常の方法のいずれかにより可 視化する。フルオレソセインイソチオシアナート、ローダミンもしくは他の螢光 色素とのカップリングにより、ファージＤＮＡに結合するエチジウムプロミドに よる処理により、又は核酸に結合する他の色素による処理により、それを螢光性 にする。ファージを、その蛋白質もしくは核酸に放射性物質を導入することによ り、又は蛍白質に放射性物質をカップリングする常用法により、放射性にする。Example m-c Bacteriophages exhibiting binding to MIG can be isolated by any of the conventional methods. Visualize. Fluorescein isothiocyanate, rhodamine or other fluorescein Coupling with a dye allows ethidium bromide to bind to phage DNA. or by treatment with other dyes that bind to nucleic acids to make them fluorescent. Make it. phages by introducing radioactive substances into their proteins or nucleic acids. or by conventional methods of coupling radioactive substances to fluorescent matter.
他の方法として、常用法により銀のごとき金属をファージに加える。Alternatively, a metal such as silver is added to the phage using conventional methods.
このファージの試薬価値を試験するために、ヒトリンパ球をＭ Ｉ Ｇ抗−ヒト Ｔ細胞モノクローナル抗体で処理する。細胞を洗浄し、そして例えば螢光性ファ ージを加える。対照として、螢光性ファージを、モノクローナル抗体で処理され ていないヒトリンパ球に加える。リンパ球を３０分間処理した後、これらを洗浄 し、そして細胞をＵＶ光を用いて顕微鏡下で試験する。ヒト末梢血リンパ球の８ ０〜９０％の強い螢光染色は、ファージがリンパ球表面上のマウスＩｇＧを認識 することを示す。変異株ではなく親ファージにより処理されたか、又は抗Ｔ細胞 抗体ではなく正常なＭ Ｉ Ｇにより処理された細胞の螢光の不存在が対照を提 供する。他の対照とじ一乙精製されたヒＩ−Ｂ細胞が、非分離末梢血リンパ球と 同様に処理された場合螢光性にならないことが示される。To test the reagent value of this phage, human lymphocytes were incubated with MIG anti-human Treat with T cell monoclonal antibody. Wash the cells and use a fluorescent dye, e.g. Add page. As a control, fluorescent phages were treated with monoclonal antibodies. Add to human lymphocytes that are not present. After treating the lymphocytes for 30 minutes, wash them. and examine the cells under a microscope using UV light. 8 of human peripheral blood lymphocytes Strong fluorescent staining between 0 and 90% indicates that the phage recognizes mouse IgG on the surface of lymphocytes. Show that. treated with the parent phage rather than the mutant strain or anti-T cells The absence of fluorescence in cells treated with normal MIG rather than antibody provides a control. provide In another control, purified human I-B cells were combined with unseparated peripheral blood lymphocytes. It is shown that it does not become fluorescent when treated similarly.
例■ 外部イメージングによる変異株の選択は、同定されるべきある種の巨大分子、例 えばマウスＩｇＣ（ＭＩＧ）に類似するファージレセプターを有する細菌の調製 を必要とする。この場合、Ｍ Ｉ Ｇをラビット又はラットに注射して抗Ｍｌ（ 、抗体を誘導する。結合部位としてその尾部を用いることによりバクテリオファ ージを抗体のごとく働らかせるために次の方法が計画される。Example■ Selection of mutants by external imaging may be useful for certain macromolecules to be identified, e.g. Preparation of bacteria with phage receptors similar to e.g. mouse IgC (MIG) Requires. In this case, anti-Ml ( , induce antibodies. bacteriophage by using its tail as a binding site. The following method is planned to make the target act like an antibody.
１）抗ＭＩＧ抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより精製しそしてポリ ーＬ−リジンを用いて固相、例えばベトリ皿の底に結合せしめる。ファージに耐 性であるＥ、コリを増殖せしめ、洗浄し、生理的緩衝化塩溶液に懸濁し、ペトリ 皿に加え、そして４℃にて１時間インキュベートする。ペトリ皿を注意深く洗浄 し、そして培養液を加える。増殖する細菌を同じ結合サイクルに４〜５回暴露し 、各回ファージの存在下で行い、細菌のファージ耐性を保持する。各暴露におい て細菌を変異源で処理して変異株の数を増す。1) Anti-MIG antibody was purified by affinity chromatography and - Use L-lysine to bind to a solid phase, e.g. the bottom of a vetri dish. phage resistant E. coli, which are sexually active, were grown, washed, suspended in physiologically buffered salt solution, and cultured in petriculture. Add to dish and incubate for 1 hour at 4°C. Clean the petri dish carefully and add culture medium. Expose growing bacteria to the same binding cycle 4-5 times. , each time is performed in the presence of phage to preserve phage resistance of the bacteria. Each exposure odor The number of mutant strains is increased by treating the bacteria with a mutagen.
２）選択される細菌をクローン化し、そし７て各クローンを、常法により抗−Ｍ ＩＣ抗体によって結合について試験する。2) Clone the selected bacteria and 7. inoculate each clone with anti-M Test for binding by IC antibody.
細菌変異株は、ＭＩＧに対する抗体が被覆されるプレートの底に付着することが 許容された場合、親株に比べて一層大幅に増殖し、従って変異株に選択的に利点 をもたらす。Bacterial mutants are able to adhere to the bottom of the plate, which is coated with antibodies against MIG. If tolerated, it grows significantly more than the parent strain, thus giving the mutant a selective advantage. bring about.
３）ファージ感受性細菌をＵ Ｖ照射し、ファージをＵＶ照射し、そして次に感 染及び変異株の発生のためにファージ感受性細菌と混合する。しかしながら、フ ァージ及び細菌をまず混合し、そして次にＵＶ照射することもできる。これらの 細菌をまず、抗−ＭＩＧ抗体により認識されるファージ耐性細菌と同比率で混合 する。ファージはすべてのファージ惑受性細菌を溶解するがしかしファージ耐性 のそれには影響を与えない。ファージ耐性細菌上のＭＩＧ一様構造を認識する変 異ファージが出現する場合、明瞭なプラークが形成される。3) UV irradiation of phage-susceptible bacteria, UV irradiation of phages, and then Mix with phage-susceptible bacteria for infection and generation of mutants. However, It is also possible to first mix the age and bacteria and then UV irradiate. these Bacteria were first mixed in equal proportions with phage-resistant bacteria recognized by anti-MIG antibodies. do. Phages lyse all phage-susceptible bacteria, but phage-resistant does not affect that. Variants that recognize MIG-like structures on phage-resistant bacteria When different phages appear, distinct plaques are formed.
４）明瞭なプラークを集め、段階２において得られた細菌中で増殖せしめ、そし て各クローンを、日常的な競争又は結合測定によりＭＩＧとのその相互作用につ いで試験する。クロ・−ンを、フマージに対する抗体活性を有しないＭＩＧの存 在下でそれらの宿主に感染するそれらの能力について試験する。ファージがその 尾部によってＭＩＧを認識する場合、それはＭ Ｉ Ｇに結合しそしてその宿生 に付着することが許容されないであろう。結果として細胞・溶解が生じない。Ｍ ＩＧの断片を使用することによって、認識の正確な部位が決定される。4) Collect distinct plaques, grow them in the bacteria obtained in step 2, and test each clone for its interaction with MIG by routine competition or binding assays. Test with The clone was isolated from the presence of MIG, which does not have antibody activity against fumage. test for their ability to infect their hosts in the presence of a host. Phage is that If it recognizes MIG by its tail, it binds to MIG and its host It will not be allowed to adhere to the surface. As a result, no cell lysis occurs. M By using fragments of IG, the exact site of recognition is determined.
結合は、ＭＩＧで被覆された固相上で、次にパーオキシダーゼラー・ルされた抗 −ファージ抗体および基質により試験される。ファージが結合される場合にのみ 色の特徴的変化が生じ、そしてその存在を示す。ファージは例１の場合のように して可視化される。Binding is carried out on a solid phase coated with MIG, then peroxidized -Tested with phage antibodies and substrates. Only if the phages are combined A characteristic change in color occurs and indicates its presence. Phage as in example 1 and visualized.
五−竺 細菌上の幾つかの表面レセプター、又は抗原がプラスミドにより制御される。１ 例はＥ。コリ上の性パイラスである。5-jiku Some surface receptors, or antigens, on bacteria are controlled by plasmids. 1 An example is E. It is sexual pirus on stiffness.
この性パイラスは次に性特異的ファージ、例えばＯＸ １７４により認識される 。ＭＩＧのヘビー鎖又はライト鎖の不変領域のための遺伝子を、性パイラスを制 御するプラスミドに導入する。パイラス蛋白質の代りに又はそれと共ＭＩＧを発 現する細菌を、抗−ＭＩＧ抗体を有する固相を用いて選択する。次に、このパイ ラスを認識するファージが選択され、ぞして前のようにＭＩＧを認識することが 示される。第１段階においてファージ耐性細菌が抗Ｍ Ｉ Ｇ抗体の陽圧によっ て選択される。ファージは例Ｉにおけるようにして可視化される。This sex pilus is then recognized by sex-specific phages, e.g. OX174. . The gene for the constant region of the MIG heavy chain or light chain can be used to control sexual pyrus. Introduce it into the control plasmid. Generates MIG instead of or together with Pyrus protein. The bacteria that appear are selected using a solid phase with anti-MIG antibodies. Then this pie A phage that recognizes MIG is selected and is then able to recognize MIG as before. shown. In the first step, phage-resistant bacteria are attacked by positive pressure of anti-MIG antibody. selected. Phage are visualized as in Example I.
例■づ プラスミド中にＭＩＧに対して向けられた抗体の可変遺伝子を有する細菌中でバ クテリオファージを増殖せしめる。組換により、ＭＩＧヘビー及び／又はライト 鎖の尾領域において発現するファージが生ずる。例■の方法を用いることにより 、同定されるべき構造すなわちＭＩＧを表面上に有するように選択された親ファ ージに耐性な細菌中でこのファージは優先的に増殖する。この構造は例■に示さ れるようにパイラスとで、又は感染のレセプターとして使用される他の表面蛋白 質上で発現される。Example The virus is produced in bacteria that carry variable genes for antibodies directed against MIG in the plasmid. Propagate cteriophages. MIG heavy and/or light by recombination A phage is generated that is expressed in the tail region of the chain. By using the method in Example ■ , a parent file selected to have on its surface the structure to be identified, namely MIG. This phage preferentially grows in bacteria that are resistant to the phage. This structure is shown in example pyrus and other surface proteins used as receptors for infection. Expressed on quality.
例Ｖ［−Ｂ プラスミド中に抗−ＭＩＧ抗体のＬ鎖Ｖ遺伝子を含有するＥ、コリを標準的方法 で調製する。これらの細菌中でファージを増殖せしめで組換ＤＮＡを得る。幾つ かのファージは尾部ファイバー中で発現される■、又はＬ遺伝子を有するが、こ の事象は生存と適合しない。ヘビー鎖の可変遺伝子のために同じ手法が適用され る。親ファージを除去するため、抗体を尾部ファイバーに対して特異的にし、そ して正常なファイバーを発現したすべてのファージをそれらの宿主細胞による吸 着及び沈澱により除去する。不完全であるか又は発現されたＨもしくは■鎖を有 するわずかのファージが残る。これらを超遠心により濃縮し、そしてこれらを用 いて、上記のようにその表面上にＭＩＧ又はＭＩＧ一様構造を発現する細菌に感 染せしめる。非共有的力による吸引力により、１ｇ遺伝子を発現するファージは これらの細菌に感染する。生ずる子孫は゛雑種”ファージ、同時感染を惹起し続 けるファージの対である。この雑種のＭＩＧに対する特異性は上記のようにして 決定される。ファージは例Ｉのようにして可視化される。Example V[-B E. coli containing the anti-MIG antibody L chain V gene in a plasmid was prepared using standard methods. Prepare with Phage are grown in these bacteria to obtain recombinant DNA. how many This phage has the ■ or L gene expressed in the tail fiber; The events of are not compatible with survival. The same technique is applied for heavy chain variable genes. Ru. To remove the parent phage, make the antibody specific to the tail fiber and All phages that expressed normal fibers were absorbed by their host cells. Removed by deposition and precipitation. with incomplete or expressed H or Only a few phages remain. Concentrate these by ultracentrifugation and use them. bacteria expressing MIG or MIG-like structures on its surface as described above. dye it. Due to non-covalent attraction, the phage expressing the 1g gene become infected with these bacteria. The resulting progeny are “hybrid” phages that can cause simultaneous infections and continue This is a pair of phages. The specificity of this hybrid against MIG is as described above. It is determined. Phages are visualized as in Example I.
例■ モノ、オリゴ又はポリサッカライドのごとき炭水化物をバクテリオファージに連 結し、次にこれを螢光性にし、放射性にし、又は酵素に結合せしめる。これらの プローブを用いて、螢光計の助けにより溶液中の、固相上の、又は細胞上のレク チンを同定する。ファージを例Ｉに記載したようにして可視レクチンをバクテリ オファージに連結し、これを例Ｉに記載したようにして可視化する。この接合体 相を用いて、例■のように溶液□中で、細胞上で、又は固相上で、それに対して レクチンが特異的である炭水化物を検出する。Example ■ Carbohydrates such as mono-, oligo- or polysaccharides can be linked to bacteriophages. It is then made fluorescent, radioactive, or conjugated to an enzyme. these Using probes to measure radioactivity in solution, on solid phases, or on cells with the aid of a fluorometer. Identify Chin. Visible lectin was transformed into a bacterium using phages as described in Example I. phage and visualized as described in Example I. This zygote phase, in solution □, on cells, or on a solid phase, as in Example ■. Lectins detect specific carbohydrates.
又■圭Ｘ紅るための展１０しｒ済 マウス免疫グロブリン（ｊｇＧ）を認識するバクテリオファージ変異株の調製に おいて、ニジエリシャ・コリをベトリ皿に用意し、そしてＵＶ光を照射して細菌 の５０〜９０％殺滅を得る。Ｔ４バクテリオファージの懸濁液もＵＶ光で照射し て約８０％のバクテリオファージを殺しそして変異を惹起する。Also ■ Kei X exhibition 10 times completed For the preparation of bacteriophage mutants that recognize mouse immunoglobulin (jgG) Prepare Elisha coli in a veterinary dish and expose the bacteria to UV light. Achieving 50-90% killing of A suspension of T4 bacteriophage was also irradiated with UV light. It kills about 80% of bacteriophages and induces mutations.
細菌にバクテリオファージを感染せしめそしてバクテリオファージを増殖せしめ 、収得し、そしてクロロホルムで処理する。次にファージ懸濁液を、ポリエチレ ングリコールを用いる沈澱により又は超遠心分離により濃縮して、１０”感染ユ ニソ） ／ ｍ、 １２以上の懸濁液を得る。Infect bacteria with bacteriophages and allow the bacteriophages to multiply , harvested and treated with chloroform. Next, transfer the phage suspension to a polyethylene Concentrate by precipitation with glycol or by ultracentrifugation to remove 10” infected cells. A suspension of 12 or more is obtained.
２５℃及びｐＨ９，２において一層インキユベーションすることにより直接的に 、又は力・ノブリング剤としてポリーＬ−リジンを使用することにより、プラス チックベトリ皿の底にマウスＩｇＧ（ＭＩＧ）を被覆する。このＭＩＧは抗フア ージ抗体活性を有しない。すなわちこれは他の特異性についてモノクローナルで あるか、又はこれはファージにより前吸着されるか又はＦｃ部分のみが使用され る。この皿にファージを添加し、そして３７℃にて１時間インキュベートする。directly by further incubation at 25°C and pH 9.2. , or by using poly-L-lysine as a strength-knobling agent, plus Coat the bottom of a chicken dish with mouse IgG (MIG). This MIG is anti-fa It has no target antibody activity. i.e. it is monoclonal with respect to other specificities. or this is preadsorbed by the phage or only the Fc portion is used. Ru. Add phage to the dish and incubate for 1 hour at 37°C.
プレートを注意深く洗浄して未結合ファージを除去する。Wash the plate carefully to remove unbound phage.
次に、処理されそして洗浄されたプレートを用いて、軟寒天中の細菌を加えるこ とにより直接ファージを増殖せしめる。Next, using the treated and washed plates, add the bacteria in soft agar. The phages are directly propagated by
まずプレートを繰り返し洗浄して特異的に結合されないファージを除去する。生 存する頭部変異を得る機会を改良するために、ファージを一層高い温度（４２℃ ）で増殖せしめ、そしで選択過程を２〜３回反復する。First, the plate is washed repeatedly to remove non-specifically bound phages. Living To improve the chances of obtaining existing head mutations, the phages were incubated at a higher temperature (42°C). ) and then repeat the selection process 2-3 times.
ＭＵＧを認識するファージクロー・ンを前スクリーニングするため、プレートを Ｍ Ｉ Ｇで被覆し、そしてファージ親株を変異株と平行して別々のプレートに 加え、インキュベートし、洗浄し、そして最後に細菌を加える。親株に稀少なプ ラークのみをもたらすが、ＭＩＧに結合する変異株は多くのプラークをもたらし 、そして細菌のコンフルエント溶解さえもたらす。To prescreen phage clones that recognize MUG, plates were coated with MIG and the phage parent strain parallel to the mutant strain on separate plates. Add, incubate, wash and finally add bacteria. Parent stock has rare Mutants that bind to MIG produce many plaques, whereas mutants that bind to MIG produce only large numbers of plaques. , and even results in confluent lysis of bacteria.
対応する方法において、ファージコロニーを吸取紙上に拾い上げ、そして螢光性 ＭＩＧを添加し、インキュベートして変異株のＭＩＧの結合を促進し、洗浄し、 そしてＵＶ光を用いるスキャンナーにより試験する。関連する変異株をもとのゲ ルに再トレ・−スしそしてクローン化する。ファージを集め、クロロホルムで処 理し、ポリエチレングリコールを用いる沈澱により又は超遠心分離により集め、 そしてＭＩＧで被覆されたミクロウェルに加える。３７℃にて１時間インキュベ ーションの後、螢光の程度を決定し、そして次に最高の螢光を示すファージクロ ーンを増殖せしめ、そして上記と同じ系においてＭＩＧに結合するその能力につ いて再試験する。In the corresponding method, phage colonies are picked up on blotting paper and fluorescent Add MIG, incubate to promote MIG binding of the mutant strain, wash, It is then tested by a scanner using UV light. Related mutant strains to the original game. Retrace and clone the file. Collect the phages and treat with chloroform. and collected by precipitation with polyethylene glycol or by ultracentrifugation, and added to MIG coated microwells. Incubate for 1 hour at 37℃ After lysis, determine the degree of fluorescence and then select the phage clone showing the highest fluorescence. for its ability to propagate the clone and bind to MIG in the same system as above. and then retest.
Ｍ Ｔ Ｇに対する結合を示すバクテリオファージを、フルオレソセインイソチ オシアナートとのカップリングにより可視化する。Bacteriophages showing binding to MTG were treated with fluorescein isothiamine. Visualize by coupling with Oceanato.
ファージの試薬価（ｅａｇｅｎｔ ｖａｌｕｅ）を試験するため、ヒトリンパ球 をＭＩＧ抗−ヒトＴ−細胞モノクローナル抗体で処理する。細胞を洗浄し、そし て螢光性ファージを加える。対照として、モノクローナル抗体により処理されて いないヒト−リンパ球に螢光性ファージを力ｌえる。３０分間処理した後、リン パ球を洗浄し、そして細胞をＵＶ光を用いる顕微鏡の下で試験する。ヒト末梢血 リンパ球の８０〜９０％の協力な螢光染色がリンパ球表面に対するマウスＩｇＧ のファージによる認識を示す。To test the reagent value of phage, human lymphocytes are treated with MIG anti-human T-cell monoclonal antibody. Wash the cells and Add fluorescent phage. As a control, treated with monoclonal antibody Infect human lymphocytes with fluorescent phage. After treatment for 30 minutes, phosphorus The cells are washed and the cells are examined under a microscope using UV light. human peripheral blood 80-90% of lymphocytes are fluorescently stained with mouse IgG on the surface of lymphocytes. shows recognition by phage.
工業的利用性 この発明の方法は、最も特徴的に、有効な臨床試験法の可能性にし、そして可視 化剤と共に選択されたノ〈クテリオファージの効果的な部分を含んで成る測定キ ットに役立つ。このようなキットは高価ではなく；適切に訓練された臨床試験室 の助手の手で扱うことができ；そして比較的短時間に多くの試験が日常的に行わ れる臨床的用途のために最も適当である。Industrial applicability The method of this invention most characteristically makes possible an effective clinical testing method and provides a visible A measurement kit comprising an effective portion of a selected cteriophage together with a curing agent. Helpful for people. Such kits are not expensive; properly trained clinical laboratories can be handled by a single assistant; and many tests can be routinely performed in a relatively short period of time. most suitable for clinical use.
手続補正書 昭和６１年５月１＋ 日 特許庁長官 宇 賀 道 部 殿 １、事件の表示 ＰＯＴ／ＵＳ８５１００４３８ ２、発明の名称 認識及び同定剤としてのバクテリオファージ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 名称 ユニバーシティ オプ イリノイ４、代理人 住所 〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目Ｂ＠１０号５、補正の対象 明細書 ６、補正の内容 （１）明細書第１２頁第９〜１０行目ｒ０．１５ＭＭ（Ｌｏｔ２Ｊを「α１４Ｍ Ｎａ０１Ｊに補正する。Procedural amendment May 1+, 1985 Mr. Michibe Uga, Commissioner of the Patent Office 1.Display of the incident POT/US85100438 2. Name of the invention Bacteriophage 3 as recognition and identification agent, corrector Relationship to the incident: Patent applicant Name University Op Illinois 4, Agent Address: 5, Toranomon-chome, Minato-ku, Tokyo 105 @ No. 10, subject to amendment Specification 6. Contents of amendment (1) Page 12 of the specification, lines 9-10 r0.15MM (Lot2J is “α14M Correct to Na01J.
（２） 同第１５頁第１９行目「シ、ットムレリ。」を「シヨ、トムレリはそう ではなかった。」に補正する。(2) On page 15, line 19 of the same page, change “Shi, Tomreli.” to “Shiyo, Tomreli is so.” It wasn't. ”.
昭和６０年１１月１（？日November 1, 1985 (? day)
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