NL8500351A - CULTURING CELLS USING BURN-IN OF GAS. - Google Patents

Description

* >1*> 1

Kweken van cellen met behulp van inborrelen van gas.Culturing cells using gas bubbling.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het kweken van fragiele cellen, die onderhevig zijn aan proliferatie, en meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het optimaliseren van gasuitwisse-5 ling in cultures van dergelijke cellen. Cellen, die profiteren van de werkwijze volgens de uitvinding zijn dierlijke cellijnen, zoals diverse myelomacellen, cellijnen, die langs natuurlijke of kunstmatige weg zijn getransformeerd uit primaire cultures, samengesmolten cellen zoals hybridoma, malig-10 nante transformanten en andere cellen zonder celwanden, bijvoorbeeld sferoplasten.The invention relates to a method of culturing fragile cells subject to proliferation, and more particularly the invention relates to a method of optimizing gas exchange in cultures of such cells. Cells benefiting from the method of the invention are animal cell lines, such as various myeloma cells, cell lines that have been naturally or artificially transformed from primary cultures, fused cells such as hybridoma, malignant transformants and other cells without cell walls, for example spheroplasts .

Bekend is, dat zuurstof essentieel is bij het kweken van dierlijke cellen en dat de hoeveelheid zuurstof, die beschikbaar is voor de diffusie in een cel belangrijk is met 15 het oog op de levensvatbaarheid van de cel en de groei daarvan. In het algemeen heeft een te geringe hoeveelheid zuurstof tot gevolg, dat een cel doodgaat of in het gunstigste geval zijn groei wordt beperkt. Zo hebben bijvoorbeeld groeiende hybridomacultures tenminste 0,12 millimoles zuur-20 stof/l/h/10 cellen nodig. Indien er minder zuurstof beschikbaar is, worden mitosis en proteïneproductie beperkt.It is known that oxygen is essential in the cultivation of animal cells and that the amount of oxygen available for diffusion into a cell is important in view of the cell's viability and growth. In general, too little oxygen results in a cell dying or, at best, limiting its growth. For example, growing hybridoma cultures require at least 0.12 millimoles of oxygen / l / h / 10 cells. If less oxygen is available, mitosis and protein production are limited.

Te veel zuurstof kan bovendien leiden tot zuurstoftoxiciteit, die een cel kan doden door oxidatie van essentiële proteïnen. De snelheid waarmee door een celcultuur zuurstof wordt opge-25 nomen neemt toe met de groei van de celculture en naarmate de dichtheid van de celculture toeneemt, is het lastiger geschikte hoeveelheden zuurstof uit het cultuuroppervlak naar het inwendige volume van de culture te transporteren.In addition, too much oxygen can lead to oxygen toxicity, which can kill a cell through oxidation of essential proteins. The rate at which oxygen is taken up by a cell culture increases with the growth of the cell culture, and as the density of the cell culture increases, the more difficult it is to transport suitable amounts of oxygen from the culture surface to the internal volume of the culture.

Kooldioxide, die de pH en bicarbonaatconcentratie 30 beïnvloedt, is eveneens nodig voor een blijvende dierlijke celgroei; zijn beheersing is essentieel indien men beoogt grote hoeveelheden cellen te kweken.Carbon dioxide, which affects the pH and bicarbonate concentration, is also required for continued animal cell growth; its control is essential if one intends to culture large amounts of cells.

Gebruikelijke, op laboratoriumschaal mammaliacel-kweektechnieken zijn gebaseerd op het suspenderen van de cel-35 len in een medium, dat zich bevindt in een Petri-schaal.Conventional laboratory scale breast cell culture techniques are based on suspending the cells in a medium contained in a Petri dish.

en kooldioxide diffunderen door het oppervlak van het medium en in de cellen. De diepte van het cultuurmedium 4 - 2 - heeft invloed op de zuurstofsnelheid en kooldioxidediffusie naar de cellen toe. Naarmate de diepte van het medium toeneemt, neemt de verhouding van mediumoppervlak tot het volume van het medium af. Op een zeker punt is de concentratie van 5 zuurstof en kooldioxide in de lucht boven de schaal en/of de snelheid van oplossing in het medium onvoldoende voor het verschaffen van een voldoende gasconcentratie in het volume van het medium, nodig voor de behoefte van de groeiende cellen. Op dit punt is de zuurstofbeschikbaarheid een groeibe-10 perkende factor. Dientengevolge leert de stand der techniek, dat men.de diepte van het medium voor dergelijke statische culturen binnen het millimetertrajeet dient te houden. In het algemeen bedraagt de bovengrens van de celdichtheid voor dergelijke cultures onder gebruikmaking van lucht in de 15 bovenin aanwezige ruimte voor de zuurstofaanvoer ca. 105 cel-len/milliliter culture.and carbon dioxide diffuse through the surface of the medium and into the cells. The depth of culture medium 4 - 2 - influences the oxygen velocity and carbon dioxide diffusion towards the cells. As the depth of the medium increases, the ratio of medium area to the volume of the medium decreases. At some point, the concentration of oxygen and carbon dioxide in the air above the scale and / or the rate of dissolution in the medium is insufficient to provide a sufficient gas concentration in the volume of the medium necessary for the need of the growing cells. At this point, oxygen availability is a growth limiting factor. Consequently, the prior art teaches that the depth of the medium for such static cultures should be kept within the millimeter range. Generally, the upper limit of the cell density for such cultures using air in the oxygen supply space at the top is about 105 cells / milliliter of culture.

Bij het opschalen van celkweektechnieken voor het kweken van mammaliacellen in productiehoeveelheden doen zich problemen voor bij het handhaven van de beschikbaarheid van 20 voldoende hoeveelheden zuurstof, teneinde te voldoen aan de behoefte van de cellen. Zie Glacken et al., Mammalian Cell Culture: Engineering Principles and Scale-up Trends in Biotechnology , Elsevier Science Publications, 0166-9430/83,. biz. 102 (1983). Een oplossing voor dit probleem omvat het 25 verschaffen van verhoogde concentraties zuurstof en kooldioxide in de ruimte boven het mediumoppervlak naarmate de celdichtheid toeneemt. Bij deze benadering kan echter te veel zuurstof aanwezig zijn vlak bij het oppervlak van het medium, waardoor zuurstoftoxiciteit optreedt, met het gevolg, dat 30 kostbare doseerinrichtingen en zuurstofvoelers de concentratie van de zuurstof in het medium continu dienen te onderzoeken en in te stellen teneinde de optimale hoeveelheden van de gassen in het medium te handhaven.Scaling up cell culture techniques for culturing mammalian cells in production amounts presents difficulties in maintaining the availability of sufficient amounts of oxygen to meet the needs of the cells. See Glacken et al., Mammalian Cell Culture: Engineering Principles and Scale-up Trends in Biotechnology, Elsevier Science Publications, 0166-9430 / 83 ,. biz. 102 (1983). A solution to this problem involves providing increased concentrations of oxygen and carbon dioxide in the space above the medium surface as the cell density increases. However, in this approach, too much oxygen may be present near the surface of the medium, causing oxygen toxicity, with the result that expensive dosing devices and oxygen sensors must continuously monitor and adjust the concentration of the oxygen in the medium in order to maintain optimal amounts of the gases in the medium.

Bij het kweken van cellen met celwanden, bijvoor-35 beeld prokaryotische cellen, worden gassen direct ingeborreld door het medium teneinde de cellen te voorzien van de vereiste gasconcentraties. Directe inborreling van de gassen is B/teBHDtTO6ll&A%eschikt voor het kweken van cellen zonder celwand, waarbij zulke cellen zeer fragiel zijn en fysisch worden be-When culturing cells with cell walls, eg prokaryotic cells, gases are bubbled directly through the medium to provide the cells with the required gas concentrations. Direct bubbling of the gases is B / teBHDtTO6ll & A% suitable for culturing cells without a cell wall, such cells being very fragile and physically protected.

-3-. ' * V-3-. * V

schadigd wanneer het gas bij voldoende snelheden wordt ingeborreld voor het verschaffen van de vereiste gasconcentraties in het medium. Bovendien kunnen de proteïnecomponenten in het medium, die vaak vereist zijn in alle dierlijke celcultures, 5 een schuim op het oppervlak van het medium vormen, dat de cellen kan insluiten.. Cellen, die in het schuim zijn opgenomen, sterven snel af. Antischuimmiddelen, die vaak aan het medium kunnen worden toegevoegd ter voorkoming van schuimvor-ming, zijn potentieel toxisch voor de cellen in de culture.damaged when the gas is bubbled in at sufficient rates to provide the required gas concentrations in the medium. In addition, the protein components in the medium, which are often required in all animal cell cultures, can form a foam on the surface of the medium which can trap the cells. Cells contained in the foam quickly die. Anti-foaming agents, which can often be added to the medium to prevent foaming, are potentially toxic to the cells in the culture.

10 Zoals beschreven in het artikel van Glacken worden volgens recente ontwikkelingen in de celkweektechniek cellen ingesloten in capsules met daarin calciumalginaat, teneinde een hoge celdichtheid teweeg te brengen. Het Amerikaanse oc-trooischrift No. 4.352.883, getiteld "Inkapselen van biolo-15 gisch materiaal", beschrijft het inkapselen van cellen teneinde ze te beschermen tegen schadelijke middelen, zoals bacteriën. Het Amerikaanse octrooischrift 4.409.331 beschrijft een werkwijze voor het produceren van dierlijke en andere celproducten door het oogsten van dergelijke producten uit 20 ingekapselde celcultures, waarin de cellen zijn ondergebracht in semipermeabele capsulemembranen.As described in Glacken's article, according to recent advances in the cell culture technique, cells are enclosed in capsules containing calcium alginate to produce a high cell density. U.S. Pat. 4,352,883, entitled "Encapsulation of Biological Material", describes encapsulating cells to protect them from harmful agents such as bacteria. US Patent 4,409,331 describes a method of producing animal and other cell products by harvesting such products from encapsulated cell cultures, in which the cells are housed in semipermeable capsule membranes.

Uit het bovenstaande zal duidelijk zijn, dat het gewenst zou zijn een verbeterde gasuitwisseling te verschaffen bij het kweken van mammalia en andere fragiele cellen.From the above, it will be appreciated that it would be desirable to provide improved gas exchange when culturing mammals and other fragile cells.

25 Dientengevolge is het een doel van de uitvinding het optimaliseren van de gasconcentratie in een medium zonder beschadiging van de cellen of zonder zijn toevlucht te hoeven nemen tot kostbare monitortechnieken. Een ander doel van de uitvinding is het verschaffen van een werkwijze voor het 30 kweken van grote celcultures, bijvoorbeeld 20-30 1 cultures, bij hoge celdichtheden, bijvoorbeeld 1 x 10® cellen/ml. Een ander doel van de uitvinding is het kweken van cellen zonder celwanden, zoals dierlijke cellen of sferoplasten onder gebruikmaking van het doorborrelen van gas teneinde de gasbe-35 hoefte van de cellen tegemoet te komen zonder beschadiging van de cellen. Een ander doel van de uitvinding is het kweken van dierlijke cellen in een culture tot dichtheden vergelijk-ΒΑΌ (NUfittNAfet celdichtheden in een groot aantal normale weefsels.Consequently, it is an object of the invention to optimize the gas concentration in a medium without damaging the cells or without resorting to expensive monitoring techniques. Another object of the invention is to provide a method for growing large cell cultures, eg 20-30 L cultures, at high cell densities, eg 1 x 10® cells / ml. Another object of the invention is to cultivate cells without cell walls, such as animal cells or spheroplasts, using gas bubbling to meet the gas needs of the cells without damaging the cells. Another object of the invention is to culture animal cells in a culture to compare densities (NUfittNAfet cell densities in a large number of normal tissues.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor 40 het efficiënt kweken van fragiele cellen, dat wil zeggen cel- - 4 - • - ! len zonder celwanden, bij hoge dichtheid. De werkwijze omvat de stappen van suspenderen in een medium van bolvormige capsules met daarin een kiemculture van de te kweken cellen. De capsules omvatten semipermeabele membranen, die zodanig zijn, 5 dat zij de cellen beschermen tegen fysische beschadiging en welke membranen voldoende permeabel zijn voor het doorlaten van essentiële voedingsstoffen, vitaminen, ionen, gassen, etc., nodig voor het onderhouden van de groei van de cellen.The invention relates to a method for the efficient cultivation of fragile cells, that is to say cells. without cell walls, at high density. The method comprises the steps of suspending in a medium of spherical capsules containing a seed culture of the cells to be cultured. The capsules comprise semipermeable membranes, which are such that they protect the cells from physical damage and which membranes are sufficiently permeable to pass essential nutrients, vitamins, ions, gases, etc., necessary to maintain the growth of the cells.

Een gas, dat de voor de cellen benodigde componenten bevat, 10 wordt direct ingeborreld in het medium met daarin de gesuspendeerde capsules, hetzij continu, hetzij intermitterend, tijdens de celgroei. De samenstelling van het ingeborrelde gas is zodanig, dat er een praktisch constante zuurstof- en/ of kooldioxideconcentratie in het medium wordt gewaarborgd, 15 welke concentratie voldoende is voor het voorzien van de cellen van zuurstof en/of kooldioxides in hoeveelheden, geschikt voor het onderhouden van celmitosis en metabolisme.A gas containing the components required for the cells is bubbled directly into the medium containing the suspended capsules, either continuously or intermittently, during cell growth. The composition of the bubbled gas is such that a practically constant oxygen and / or carbon dioxide concentration in the medium is ensured, which concentration is sufficient to supply the cells with oxygen and / or carbon dioxide in quantities suitable for maintenance. of cell mitosis and metabolism.

Onder toepassing van gebruikelijke media en deze gasinborrel- techniek is het mogelijk binnen de capsules bij dichtheden 8 20 in de orde van grootte van 5 x 10 cellen/ml bezonken capsules cellen te kweken. Desgewenst kunnen stoffen, die door de cellen worden geproduceerd, worden geoogst, hetzij uit het inwendige van de capsules, hetzij uit het medium.Using conventional media and this gas bubbling technique, it is possible to grow within the capsules at densities of the order of 5 x 10 cells / ml of settled capsules cells. If desired, substances produced by the cells can be harvested either from the interior of the capsules or from the medium.

Bij voorkeursuitvoeringsvormen, wanneer dierlijke 25 cellen worden gekweekt, bevat het ingeborrelde gas kooldioxide en zuurstof in uitgebalanceerde hoeveelheden zodanig, dat zij geschikt zijn voor het teweegbrengen van een gewenst gehalte in het medium. Bij voorkeur is het C^/CC^-gehalte van het medium zodanig, dat de celdichtheid in de capsules 30 een maximale waarde kan hebben om zodoende een optimale celgroei te bevorderen. Dit betekent, dat de zuurstof in het in te borrelen gas aanwezig is in een hoeveelheid van 0,15 tot 450 mm Hg, bij voorkeur ten minste in een hoeveelheid van 0,15 tot 200 mm Hg, terwijl een voor mammaliacellen optimale 35 hoeveelheid 150-170 mm Hg is.In preferred embodiments, when animal cells are grown, the bubbled gas contains carbon dioxide and oxygen in balanced amounts such that they are suitable for producing a desired level in the medium. Preferably, the C 1 / C 2 content of the medium is such that the cell density in the capsules 30 may have a maximum value, thereby promoting optimal cell growth. This means that the oxygen in the gas to be bubbled in is present in an amount of 0.15 to 450 mm Hg, preferably at least in an amount of 0.15 to 200 mm Hg, while an amount of 150 optimal for breast cells -170 mm Hg.

Met voordeel zijn mammaliacellen, die volgens de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden ge-BAOrëêttÖHNAJenetisch gebouwde cellen, myelomacellen en hybridoma en andere samengesmolten cellen.Advantageously are mammalian cells which can be synthesized by the method of the present invention, genetically engineered cells, myeloma cells and hybridoma and other fused cells.

- 5 - . · , · j- 5 -. ·, · J

Een belangrijk voordeel van de onderhavige techniek voor het kweken van mammaliacellen onder gebruikmaking van het inborrelen van gassen voor de gasuitwisseling, is dat de cellen toegang krijgen tot een overvloedige gastoevoer. Dit 5 betekent, dat zelfs dichte en volumineuze cultures van zuurstof en/of kooldioxide kunnen worden voorzien bij concentraties, waarbij gasuitwisseling niet meer een groeibeperkende factor is. Dit is mogelijk, omdat de cellen zijn ingekapseld in membranen en derhalve zijn beschermd tegen fysische be-10 schadiging, die normaliter zou optreden bij het inborrelen van gassen. Het inborrelen is een efficiënte methode voor het voorzien van het medium van optimale concentraties aan zuurstof en kooldioxide, omdat een evenwicht kan worden bereikt bij een drempelinborrelsnelheid tussen de concentratie van 15 de gassen in het ingeborrelde gas en de concentratie van de gassen in het medium. Zuurstof- en kooldioxideconcentraties in het medium kunnen derhalve op een optimaal niveau worden gebracht door beheersing van de concentraties in het gas, dat wordt ingeborreld. De noodzaak van kostbare monitor- en 20 gasdoseerinrichtingen is daarbij vermeden.A major advantage of the present technique for culturing mammary cells using bubbling gases for gas exchange is that the cells access an abundant gas supply. This means that even dense and bulky cultures of oxygen and / or carbon dioxide can be provided at concentrations where gas exchange is no longer a growth limiting factor. This is possible because the cells are encapsulated in membranes and are therefore protected from physical damage that would normally occur when gases are bubbled in. The bubbling is an efficient method of providing the medium with optimal concentrations of oxygen and carbon dioxide, because an equilibrium can be achieved at a threshold bubble rate between the concentration of the gases in the bubbled gas and the concentration of the gases in the medium. Oxygen and carbon dioxide concentrations in the medium can therefore be brought to an optimal level by controlling the concentrations in the gas which is bubbled in. The need for expensive monitor and gas metering devices is thereby avoided.

Andere aspecten, doelen en voordelen van de uitvinding zullen de deskundige duidelijk worden uit het lezen van de hierna volgende conclusies en de gedetailleerde beschrijving tezamen met de tekening.Other aspects, objects and advantages of the invention will become apparent to those skilled in the art from reading the following claims and the detailed description, together with the drawing.

25 Fig. 1 is een schematische weergave van mammalia cellen, opgesloten in een microcapsule, geschikt voor de toepassing volgens de uitvinding;FIG. 1 is a schematic representation of breast cells enclosed in a microcapsule suitable for the use of the invention;

Fig. 2 is een schematische afbeelding van een cel-kweekinrichting, geschikt voor de toepassing in de praktijk 30 volgens de uitvinding;Fig. 2 is a schematic view of a cell culture device suitable for practical use according to the invention;

Fig. 3 toont een grafiek van totaal cellen per milliliter medium versus tijd van diverse chargegewijze gevoede cultures met en zonder gasinborreling;Fig. 3 shows a graph of total cells per milliliter of medium versus time of various batch fed cultures with and without gas bubbling;

Fig. 4 toont een grafiek van cellen/ml bezonken cap-35 sules versus tijd voor een continu gevoede, gas-ingeborrelde ingekapselde culture, waarbij de met de werkwijze volgens de uitvinding te behalen celdichtheden zijn geïllustreerd; en BAD ORIGINAL Fig. 5 is een grafiek, vergelijkbaar met fig. 4, waarbij de groei van een chargegewijze gevoede culture is1 40 afgeheeld.Fig. 4 shows a graph of cells / ml of settled cap-sules versus time for a continuously fed gas-bubbled encapsulated culture illustrating the cell densities to be achieved by the method of the invention; and BAD ORIGINAL FIG. 5 is a graph similar to FIG. 4 showing growth of a batch fed culture.

- 6 -- 6 -

w , Iw, I

De onderhavige uitvinding is gebaseerd op de waarneming, dat cellen zonder celwanden, bijvoorbeeld mammalia-cellen, ingecapsuleerd in semipermeabele membranen praktisch immuun zijn tegen fysische beschadiging en zuurstoftoxici-5 teitsproblemen, veroorzaakt door het inborrelen van gas en dat het inborrelen van gas op efficiënte wijze kan worden toegepast voor het· voorzien van dergelijke cellen van zuurstof en/of kooldioxide. De toepassing van de methode volgens de uitvinding kan de concentratie van zuurstof en kooldioxide 10 zodanig worden uitgebalanceerd, dat er optimale niveaus in een medium worden verkregen, terwijl bovendien verhoogde celproducties kunnen worden bereikt in celkweekvaten op fa-brieksschaal. Omdat de C^- en CO2-concentraties in het medium recht evenredig zijn met hun concentratie in het ingeborrelde 15 gas is de concentratiemonitoring en de daarbij behorende kosten opgeheven.The present invention is based on the observation that cells without cell walls, for example, mammalian cells encapsulated in semipermeable membranes, are practically immune to physical damage and oxygen toxicity problems caused by gas bubbling in and gas bubbling in efficiently can be used to supply such cells with oxygen and / or carbon dioxide. The use of the method according to the invention allows the concentration of oxygen and carbon dioxide to be balanced so that optimum levels in a medium are obtained, while, moreover, increased cell production can be achieved in factory-scale cell culture vessels. Because the C and CO2 concentrations in the medium are directly proportional to their concentration in the bubbled gas, the concentration monitoring and the associated costs have been discontinued.

In fig. 1 kunnen mammaliacellen 11 worden ingekap-seld in bolvormige capsules 13 met behulp van de procedure zoals uiteengezet in het Amerikaanse octrooischrift No.In Figure 1, mammalian cells 11 can be encapsulated in spherical capsules 13 using the procedure set forth in U.S. Pat.

20 4.352.883. De thans de meeste voorkeur verdienende inkapse- lingstechnieken zijn beschreven in de hiermee samenhangende Amerikaanse octrooiaanvrage Serie No. 579.494, ingediend op dezelfde datum als deze aanvrage. Een typische incapsulerings-procedure omvat het vormen van een suspensie met daarin 106 25 cellen/ml in 1% (gew./vol.) natriumalginaat (NaG-Kelco LV).4,352,883. The most preferred encapsulation techniques currently described are described in related U.S. Patent Application Serial No. 579,494 filed on the same date as this application. A typical encapsulation procedure involves forming a suspension containing 10 6 cells / ml in 1% (w / v) sodium alginate (NaG-Kelco LV).

De dichtheid van de cellen in deze suspensie zal het aantal cellen per capsule in de uiteindelijk geproduceerde kiemcul-ture bepalen. De suspensie wordt overgebracht in een straal-kopapparaat, bestaande uit een huis met een bovenste lucht-30 inlaatmondstuk en een langgerekt holle lichaamsfrictie, ondergebracht in een stop. Een spuit, bijvoorbeeld een 10 cc spuit, voorzien van een doseerpomp is bovenop het huis aangebracht, met een naald, bijvoorbeeld een 0,025 cm I.D. Teflon-beklede naald, die de lengte van het huis doorloopt.The density of the cells in this suspension will determine the number of cells per capsule in the final culture culture produced. The slurry is transferred to a jet head apparatus consisting of a housing with an upper air inlet nozzle and an elongated hollow body friction housed in a stopper. A syringe, for example a 10 cc syringe, equipped with a dosing pump is mounted on top of the housing, with a needle, for example a 0.025 cm I.D. Teflon-coated needle, which runs the length of the housing.

35 Het inwendige van het huis is zodanig ontworpen, dat het uiteinde van de naald onderworpen is aan een constante laminaire luchtstroom, die als een luchtmes fungeert. In gebruik wordt 0BIGWlAL9evuld met de oplossing met daarin het in te kapselen materiaal, aangebracht bovenop het huis, terwijl de “ -7-. --1 doseerpomp wordt geactiveerd voor het incrementeel forceren van druppels van de oplossing naar het uiteinde van de naald.The interior of the housing is designed so that the tip of the needle is subject to a constant laminar flow of air, which functions as an air knife. In use, 0BIGWlAL9 is filled with the solution containing the material to be encapsulated, applied on top of the housing, while the -7-. - 1 dosing pump is activated to incrementally force drops from the solution to the tip of the needle.

De luchtstroom "snijdt” elke druppel "af", die dan ca. 2,5- 3,5 cm val maakt in een 1,2% (gew./vol.) calciumchlorideop-5 lossing, onder vorming van gegeleerde massa's, die vervolgens door afzuigen worden verzameld. De gegeleerde massa's worden gelncubeerd in drie aangevulde volumina isotonische zoutoplossing voor gelexpansie gedurende ca. 11 min. Vervolgens wordt rondom de gegeleerde massa's een membraan gevormd door 10 ze in aanraking te brengen met een 750 mg/1 poly-L-lysine (Sigma Chemical Company, 65.000 dalton molecuulgewicht) in een isotonische zoutoplossing. Na 12 min reactie worden de verkregen capsules gedurende 10 min gewassen met 1,4 g/1 oplossing van CHES (2-cyclohexylaminoethaansulfonzuur) buffer .15 (Sigma) met daarin 0,2% (gew./vol.) calciumchloride in zoutoplossing. De capsules worden gedurende ca. 8 min gewassen met 0,3% (gew./vol.) calciumchloride in zoutoplossing, terwijl om de capsules een tweede membraan wordt gevormd door een 10 min durende reactie met 105 mg/1 polyvinylamine (Poly-20 science, 50.000-150.000 dalton molecuulgewicht) in zoutoplossing. De capsules worden opnieuw gewassen met twee volumina isotonische zoutoplossing in verloop van 7 min en vervolgens _2 na-bekleed door gedurende 7 min onderdompelen in 5 x 10 % (gew./vol.) NaG in een zoutoplossing. De capsules worden nog 25 eens gedurende 4 min in een zoutoplossing gewassen, waarna de in te kapselen volumes weer vloeibaar worden gemaakt door ze onder te dompelen in 50 mM natriumcitraat in zoutoplossing, waarbij de eerste keer gedurende 20 min en de tweede keer 6 min. De capsules worden twee keer gewassen in een 30 zoutoplossing en vervolgens een keer gedurende 4 min in een medium. De capsules 13 zijn dan gereed voor incubatie in een kweekmedium 16.The air stream "cuts" each droplet, which then drops about 2.5-3.5 cm in a 1.2% (w / v) calcium chloride solution, forming gelled masses, which then collected by suction The gelled masses are incubated in three supplemented volumes of isotonic saline for gel expansion for approximately 11 min. Then a membrane is formed around the gelled masses by contacting them with a 750 mg / l poly-L -Lysine (Sigma Chemical Company, 65,000 daltons molecular weight) in an isotonic saline solution After 12 min of reaction, the capsules obtained are washed for 10 min with 1.4 g / l solution of CHES (2-cyclohexylaminoethanesulfonic acid) buffer .15 (Sigma) with therein 0.2% (w / v) calcium chloride in saline The capsules are washed with 0.3% (w / v) calcium chloride in saline for about 8 min while a second membrane is formed around the capsules by a 10 min reaction with 105 mg / 1 po lyvinylamine (Poly-20 science, 50,000-150,000 daltons molecular weight) in saline. The capsules are again washed with two volumes of isotonic saline over 7 min and then post-coated by immersion in 5 x 10% (w / v) NaG in saline for 7 min. The capsules are washed for an additional 25 min in saline, after which the volumes to be encapsulated are liquefied again by immersing them in 50 mM sodium citrate in saline, the first time being 20 min and the second time 6 min. The capsules are washed twice in a saline solution and then once in a medium for 4 min. The capsules 13 are then ready for incubation in a culture medium 16.

Capsules, zoals weergegeven in fig. 1, bereid volgens deze inkapselingsprocedure, hebben membranen, die prak-35 tisch impermeabel zijn voor proteïnen met hoog molecuulgewicht, bacteriën en de te kweken cellen.Capsules, as shown in Figure 1, prepared according to this encapsulation procedure, have membranes which are practically impermeable to high molecular weight proteins, bacteria and the cells to be cultured.

Fig. 2 is een schematische afbeelding van een in-BAD QBKKN£J*g voor het kweken van cellen volgens de uitvinding.Fig. 2 is a schematic representation of an in-BAD QBKKN £ J * g for culturing cells of the invention.

De inrichting is voorzien van een 316L roestvrijstalen, Δ Π ol otf roaennl ï . R Π 1 vat· 1Π _ riat· ie vnnr7if>n van ppn — ..1 - 8 - sel 12. Een motor 14 drijft de roerderas 16 aan voor het ronddraaien van de roerderbladen 18 en 20 in de culture 22.The device is equipped with a 316L stainless steel, Δ Π ol otf roaennl ï. R Π 1 vessel · 1Π _ riat · ie vnnr7if> n of ppn -. 1 - 8 - sel 12. A motor 14 drives the agitator shaft 16 for rotating the agitator blades 18 and 20 in culture 22.

Culture 22 omvat een gebruikelijk medium, zoals Eagle's gemodificeerd medium met toegevoegd serum. Alternatief kan het 5 medium een hypertonisch medium zijn met een osmolariteit van ca. 360 milliosmoles van het type, zoals in meer bijzonderheden beschreven in de hiermee samenhangende Amerikaanse octrooiaanvrage Serie No. 479,492, tegelijk met deze aanvrage ingediend. Een groot aantal capsules, zoals afgeheeld in 10 fig. 1, wordt in het medium gesuspendeerd. Gewoonlijk zijn de capsules bolvormig en hebben een diameter in de orde van grootte van minder dan ca. 2 mm. Capsules met een gemiddelde diameter in de orde van grootte van 0,8 mm voldoen goed.Culture 22 includes a conventional medium, such as Eagle's modified medium with added serum. Alternatively, the medium may be a hypertonic medium with an osmolarity of about 360 milliosmoles of the type, as described in greater detail in the associated U.S. Patent Application Serial No. 479,492 filed simultaneously with this application. A large number of capsules, as shown in Figure 1, are suspended in the medium. Usually the capsules are spherical and have a diameter on the order of less than about 2 mm. Capsules with an average diameter of the order of 0.8 mm are satisfactory.

De gasbehoefte van de cellen wordt verzorgd door het 15 doorleiden van zuurstof en kooldioxide bevattend gas via steriel filter 24, luchtbuis 26 en inborrelkop 28. Inborrel-kop 28 kan zijn voorzien van een 2,5 micron microporeus porseleinfilter. Voor het kweken van dierlijke cellen kan het gas 95% lucht en 5% CO2 (per volume) bevatten. Gasbellen 20 passeren vanaf de inborrelkop dwars door het medium met daarin de capsules naar boven toe. De inborrelsnelheid dient zodanig te zijn, dat de pertiële druk van zuurstof in het medium praktisch identiek is aan de partiële druk van de zuurstof in het gas. De zuurstofdruk in het medium kan daar-25 bij zodanig worden afgestemd, dat deze zich bevindt op een niveau bij of enigszins hoger dan het niveau dat nodig is voor een optimale groei van de cellen. Tengevolge van aanwezigheid van de serumcomponenten in het medium kan tengevolge van het inborrelen van het gas schuimvorming optreden 30 in de ruimte 30 van het vat 10. Ofschoon de capsules de cellen tegen dehydratatie beschermen, dienen zij van tijd tot tijd te worden overgebracht in het schuim, terwijl bovendien de cellen tegen mechanische beschadiging worden beschermd.The gas requirement of the cells is provided by passing oxygen and carbon dioxide-containing gas through sterile filter 24, air tube 26 and bubble head 28. Bubble head 28 may be provided with a 2.5 micron microporous porcelain filter. For the cultivation of animal cells, the gas can contain 95% air and 5% CO2 (by volume). Gas bubbles 20 pass from the bubble head straight through the medium containing the capsules upwards. The bubble rate should be such that the pertial pressure of oxygen in the medium is substantially identical to the partial pressure of the oxygen in the gas. The oxygen pressure in the medium can be adjusted to be at or slightly above the level required for optimal growth of the cells. Due to the presence of the serum components in the medium, foaming may occur in the space 30 of the vessel 10 due to the bubbling in of the gas. Although the capsules protect the cells from dehydration, they must be transferred from time to time into the foam while also protecting the cells from mechanical damage.

Zodoende kan het inborrelen van gas in een ingecapsuleerde 35 culture voldoen aan de behoefte aan zuurstof van de toenemende celpopulatie met het gevolg, dat extreem hoge cel-dichtheden kunnen worden verkregen. Gas, dat de culture ver-g^^pjl^g^eert via uitlaatpoort 32 en filter 34. Een typische gasstroomsnelheid voor een 30 1 culture is 0,0056 m3/h.Thus, the bubbling of gas into an encapsulated culture can meet the oxygen demand of the increasing cell population with the result that extremely high cell densities can be obtained. Gas which consumes the culture through outlet port 32 and filter 34. A typical gas flow rate for a 30 1 culture is 0.0056 m 3 / h.

...... · - !...... · -!

Bij toepassing van de uitvinding volgens een charge-gewijze voeding wordt het medium gewoonweg in vat 10 gedoseerd tezamen met microcapsules met daarin de kiemculture, waarna de culture tot een maximale dichtheid wordt gekweekt 5 met behulp van het inborrelen van het gas. Misschien is de beste manier van toepassen van de uitvinding het medium door de culture te laten passeren door introductie van een continue of intermitterende stroom van medium in de toevoer-poort 38 en door het afvoeren van medium via filterelement 10 40. Filterelement 40 kan zijn voorzien van een roestvrije, microporeuze zeef met poriën kleiner dan de diameter van de capsules, bijvoorbeeld 50-100 micron. Het medium kan via afsluiter 42 worden onttrokken. Het niveau van het medium in de culture kan worden waargenomen in de transparante zijbuis 15 44. Een typische mediumstroomsnelheid bij de toevoerpoort 38 en afvoerfilter 40 is 4-12 ml per min.When applying the invention according to a batch feed, the medium is simply dosed into vessel 10 together with microcapsules containing the seed culture, after which the culture is grown to a maximum density by bubbling in the gas. Perhaps the best mode of application of the invention is to pass the medium through the culture by introducing a continuous or intermittent flow of medium into the feed port 38 and by discharging medium through filter element 40. Filter element 40 may be provided from a stainless microporous sieve with pores smaller than the diameter of the capsules, for example 50-100 microns. The medium can be withdrawn via valve 42. The level of the medium in the culture can be observed in the transparent side tube 44. A typical medium flow rate at the inlet port 38 and outlet filter 40 is 4-12 ml per min.

Indien men zijn toevlucht neemt tot het oogsten van proteïne of andere stoffen, geproduceerd door de cellen, zou de toegepaste methode afhangen van de relatie van de effec-20 tieve moleculaire afmetingen van de van belang zijnde stof en de permeabiliteit van de capsulemembranen. Zoals in de bovengenoemde octrooischriften beschreven, kan de permeabiliteit van de capsulemembranen binnen nauwe grenzen worden beheerst. Wanneer de van belang zijnde proteïne te groot is om 25 het membraan te passeren, hoopt de proteïne zich op binnen de microcapsules; maar wanneer de proteïne klein genoeg is om de membranen te passeren, dan kan de proteïne worden verzameld in het extracapsulaire medium.If one resorts to the harvesting of protein or other substances produced by the cells, the method employed would depend on the relationship of the effective molecular dimensions of the substance of interest and the permeability of the capsule membranes. As described in the above patents, the permeability of the capsule membranes can be controlled within narrow limits. When the protein of interest is too large to cross the membrane, the protein accumulates within the microcapsules; but when the protein is small enough to pass through the membranes, the protein can be collected in the extracapsular medium.

Bij toepassing bepaalt de gebruiker van het systeem 30 de gewenste hoeveelheid zuurstof en/of kooldioxide, die in het medium 22 dient te worden opgelost. De geselecteerde gasconcentraties en verhoudingen zijn afhankelijk van het type te kweken cellen, doch is onafhankelijk van de gangbare of beraamde celdichtheid. Voor de meeste dierlijke cellen ligt 35 de gewenste concentratie (partiële druk) van zuurstof tussen 15 en 200 mm Hg. De gekozen zuurstofconcentratie voor een culture cellen is bijvoorbeeld groter dan die voldoende isWhen used, the user of system 30 determines the desired amount of oxygen and / or carbon dioxide to be dissolved in medium 22. The selected gas concentrations and ratios depend on the type of cells to be cultured, but are independent of the current or estimated cell density. For most animal cells, the desired concentration (partial pressure) of oxygen is between 15 and 200 mm Hg. For example, the selected oxygen concentration for a culture cell is greater than it is sufficient

SfMAfcellen te voorzien van 0,12 millimoles/l/h/109 cellen, de eerder vermelde globale minimumvereisten voor krachtigeProvide SfMA cells with 0.12 millimoles / l / h / 109 cells, the previously mentioned global minimum requirements for vigorous

Λ Λ ma 1 rrv*Aa A1 Λ Mon 1 Rrv * Aa A

'l - 10 - !'l - 10 -!

De concentratie van de gassen in het medium is praktisch recht evenredig aan de concentratie van de gassen in het ingeborrelde gas, mits de inborrelsnelheid voldoende hoog is om wijzigingen in de C^/CC^-concentratie, veroorzaakt door 5 celrespiratie-activiteit, te maskeren. Bij een drempelwaarde is de inborrelsnelheid voldoende voor het onderhouden van een evenwicht tussen het gas en de vloeistoffasen in het vat 10.The concentration of the gases in the medium is practically directly proportional to the concentration of the gases in the bubbled gas, provided that the bubble rate is sufficiently high to mask changes in the C 1 / C 2 concentration caused by 5 cell respiration activity. . At a threshold value, the bubble rate is sufficient to maintain an equilibrium between the gas and the liquid phases in the vessel 10.

De systeemgebruiker kan dienovereenkomstig zodanig de inborrelsnelheid bepalen, dat het gewenste mengsel van gassen te-10 rechtkomt in de inborrelkop 28. De inborrelkop 28 verschaft dan het gas aan de culture 22 bij een snelheid, die een praktisch constante concentratie aan zuurstof aan het medium afgeeft. Een dergelijke inborrelsnelheid is 0,0056 m3/h in een 30 1 cultuurvat. De capsules 13 beschermen de cellen 11 in 15 het medium tegen mechanische beschadiging. De capsules beschermen bovendien de cellen, die in het schuim terechtkomen in de ruimte bovenin het vat tegen zuurstofbeschadiging of dehydratatie.Accordingly, the system user can determine the bubble rate so that the desired mixture of gases enters the bubble head 28. The bubble head 28 then supplies the gas to the culture 22 at a rate that delivers a substantially constant concentration of oxygen to the medium. . Such a bubble-in speed is 0.0056 m3 / h in a 30 L culture vessel. The capsules 13 protect the cells 11 in the medium from mechanical damage. In addition, the capsules protect the cells entering the foam in the space at the top of the vessel from oxygen damage or dehydration.

Dientengevolge is het niet nodig de zuurstofconcen-20 tratie in het medium te bewaken, aangezien tussen de concentraties van de in het medium 22 opgeloste gassen en de voorgeselecteerde concentraties van de in te borrelen gassen een evenwichtstoestand komt.As a result, it is not necessary to monitor the oxygen concentration in the medium, since an equilibrium condition occurs between the concentrations of the gases dissolved in the medium 22 and the preselected concentrations of the gases to be bubbled in.

Het inborrelen wordt voortgezet en de cellen 11 in 25 de capsules 13 ondergaan mitosis. Eventueel, wanneer de cel-culture de gewenste celdichtheid heeft bereikt, kunnen de door de cellen geproduceerde stoffen, zoals antilichamen, worden geoogst, hetzij uit het inwendige van de capsules hetzij uit het extracapsulaire medium.Bubbling is continued and cells 11 in capsules 13 undergo mitosis. Optionally, when the cell culture has reached the desired cell density, the substances produced by the cells, such as antibodies, can be harvested either from the interior of the capsules or from the extracapsular medium.

30 Inborrelen in een micro-ingecapsuleerd celculture- systeem, zoals bovenbeschreven, bleek een celdichtheid van 8 8 ca. 5 x 10 cellen/ml bezonken capsules of ca. 1 x 10 cellen/ ml medium te onderhouden. Dit is een verbetering van ca. twee maal ten opzichte van gebruikelijke kweektechnieken. Naast 35 een verbetering van de celproductopbrengst door toename van de celdichtheid maakt de gasinborreling volgens de uitvinding het mogelijk, dat celkweektechnieken kunnen worden opgeschaald tot commerciële productieniveaus.Bubbling into a microencapsulated cell culture system, as described above, was found to maintain a cell density of 8 ca. about 5 x 10 cells / ml of settled capsules or about 1 x 10 cells / ml of medium. This is an improvement of about two times over conventional cultivation techniques. In addition to improving cell product yield by increasing cell density, the gas bubbling of the invention allows cell culture techniques to be scaled up to commercial production levels.

bad original *bad original *

Hieruit volgt, dat inborrelen verbeterde, efficiënte -11-. " ! gasuitwisselingen voor micro-ingecapsuleerde mammaliacellen mogelijk maakt.It follows that bubbling improved, efficient -11-. "! enables gas exchanges for microencapsulated breast cells.

De uitvinding kan verder worden toegelicht aan de hand van de volgende, niet-beperkende voorbeelden.The invention can be further illustrated by the following non-limiting examples.

5 VOORBEELD IEXAMPLE I

55

Ca. 800 ml kiemcapsules met daarin ca. 10 muis-muishybridomacellen per milliliter werden gelijkelijk verdeeld in voldoende medium voor het verkrijgen twee maal 3 1 volumina ingekapselde kiemcultures. Tegelijkertijd werden er T0 twee maal 3 1 volumina medium met daarin vergelijkbare aantallen van dezelfde cellen per eenheidsvolume medium bereid.Approx. 800 ml seed capsules containing approximately 10 mouse mouse hybridoma cells per milliliter were equally divided in sufficient medium to obtain 2 1 volumes of encapsulated seed cultures. Simultaneously, T0 was prepared twice 3 1 volumes of medium containing comparable numbers of the same cells per unit volume of medium.

Het medium was het standaard Eagle's medium aangevuld met 5% foetale runderserum. De vier kiemcultures werden gekweekt onder zacht roeren en zonder aanvulling van het medium ge-15 durende 10 dagen. Een ingekapselde culture en een niet-inge-kapselde culture werden voorzien van gasbellen bij een snelheid van 0,0084 m3/h gedurende 5 dagen, en 0,0028 m3/h daar na. De overige twee kiemcultures werden niet voorzien van gasbellen. Het ingeborrelde gas bestond uit 5% C02 en 95% 20 lucht (per volume). De celdichtheid in de desbetreffende cultures werd gevolgd en de gegevens werden in grafieken uitgezet. De resultaten zijn in fig. 3 afgebeeld.The medium was the standard Eagle's medium supplemented with 5% fetal bovine serum. The four seed cultures were grown under gentle stirring and without medium replenishment for 10 days. An encapsulated culture and an unencapsulated culture were provided with gas bubbles at a rate of 0.0084 m3 / h for 5 days, and 0.0028 m3 / h thereafter. The other two germ cultures were not provided with gas bubbles. The bubble-in gas consisted of 5% CO2 and 95% air (by volume). The cell density in the respective cultures was monitored and the data plotted. The results are shown in Figure 3.

Uit deze gegeven volgt, dat na 6 dagen de niet beluchte ingekapselde culture was aangegroeid tot een celdicht-25 heid van ca. 8x10 cellen/ml culture, terwijl de onbeluchte conventionele celculture was aangegroeid tot een dichtheid 6 van ca. 3 x 10 cellen/ml. De beluchte, niet-ingekapselde en ingekapselde cultures waren aangegroeid tot een dichtheid 6 g van ca. 1,5 x 10 cellen/ml en 1,3 x 10 cellen/ml respectie-30 velijk. Daarna nam de celdichtheid van zowel de onbeluchte als beluchte suspensiecultures snel af, totdat op dag 10 de dichtheid van beide cultures minder was dan 2x10 cellen/ ml. Hieruit volgt, dat de beluchting van niet-ingekapselde cultures geen significante gunstige invloed heeft vergeleken 35 met dezelfde culture onder gebruikmaking van zuurstof opgelost in het medium uit de boven aanwezige ruimte. De onbe-BAD QN£ttNAl> ingekapselde culture bleek slechts een weinig meer succesvol. Zijn celdichtheid bedroeg ca. 7 x 10^ cellen/ml -nam a-F r\r\ dan Q ΓΙβ ï -nrralrancpl i-Ja _ bialnrihtft CUltUlTêFrom this data it follows that after 6 days the non-aerated encapsulated culture had grown to a cell density of about 8x10 cells / ml culture, while the non-aerated conventional cell culture had grown to a density 6 of about 3x10 cells / ml ml. The aerated, unencapsulated and encapsulated cultures had grown to a density of 6 g of about 1.5 x 10 cells / ml and 1.3 x 10 cells / ml, respectively. Thereafter, the cell density of both the aerated and aerated suspension cultures decreased rapidly until day 10 the density of both cultures was less than 2x10 cells / ml. It follows that the aeration of non-encapsulated cultures has no significant beneficial effect compared to the same culture using oxygen dissolved in the medium from the space above. The un-BAD QN t ttNAl encapsulated culture proved only slightly more successful. Its cell density was approximately 7 x 10 ^ cells / ml -nam a-F r \ r \ dan Q ΓΙβ ï -nrralrancpl i-Ja _ bialnrihtft CUltUlTê

\ « ^ II

- 12 - vertoonde in tegenstelling daarmede een constante toename in celdichtheid vanaf de tweede tot en met de negende dag, welke g celdichtheid daarna 3x10 cellen/ml bleef. Dit voorbeeld toont, dat de cellevensvatbaarheid en de celgroei worden be-5 vorderd in gevoelige dierlijke cellen wanneer zij worden gekweekt in een beluchte, ingekapselde culture en dat zowel de inkapseling als de inborrelingsstappen nodig zijn voor het bereiken van dit resultaat.In contrast, it showed a constant increase in cell density from the second through the ninth day, which g cell density thereafter remained at 3x10 cells / ml. This example shows that cell viability and cell growth are promoted in sensitive animal cells when grown in an aerated encapsulated culture and that both encapsulation and encapsulation steps are required to achieve this result.

10 VOORBEELD IIEXAMPLE II

Twee ingekapselde hybridomacelcultures werden bereid en gesuspendeerd in Eagle's medium, dat was aangevuld met 5% foetaal runderserum, 100 keer de normale ferri-ionconcentra-tie en twee keer de normale aminozuurconcentratie. Het medium 15 had een osmotische druk van ca. 360 milliosmoles. Culture nummer 1 had een aanvankelijke celdichtheid van 5 x 10^ cel-len/ral culture, welke culture gedurende 13 dagen werd gevoed door een circulatie van vers medium bij 6 ml/min, en daarna gedurende 5 dagen bij 11 ml/min. Culture nummer 2 (met een 20 aanvankelijke celdichtheid van 1 x 106 cellen/ml) werd continu gevoed bij 4 ml/min gedurende 9 dagen, en vervolgens chargegewijs door vervanging van 10 1 medium per dag op elk van de dagen 9-20. Beide cultures werden belucht tijdens hun groeicyclus bij 0,0056 m3/h. De celdichtheid van elke cul-25 ture werd bepaald. De resultaten werden vastgelegd in de fig.Two encapsulated hybridoma cell cultures were prepared and suspended in Eagle's medium supplemented with 5% fetal bovine serum, 100 times the normal ferric ion concentration and twice the normal amino acid concentration. The medium 15 had an osmotic pressure of about 360 milliosmoles. Culture number 1 had an initial cell density of 5 x 10 6 cells / ral culture, which culture was fed by circulation of fresh medium at 6 ml / min for 13 days, and then at 11 ml / min for 5 days. Culture number 2 (with an initial cell density of 1 x 106 cells / ml) was fed continuously at 4 ml / min for 9 days, then batch by replacement of 10 1 medium per day on each of days 9-20. Both cultures were aerated during their growth cycle at 0.0056 m3 / h. The cell density of each culture was determined. The results were recorded in fig.

4 en 5. Zoals geïllustreerd, bleek de continu gevoede culture (fig. 4) bij en na 17 dagen een celdichtheid te hebben opgeleverd van 1 x 10° cellen/ml bezonken capsules en 5 x 10 cellen/ml bezonken capsules. Aangezien het volume van het 30 medium 5 keer het volume van de capsules was, betekent dit, 7 dat de celdichtheid per ml culture tussen ca. 5 x 10 en o 1 x 10 cellen/ml lag.4 and 5. As illustrated, the continuously fed culture (Fig. 4) was shown to yield a cell density of 1 x 10 ° cells / ml settled capsules and 5 x 10 cells / ml settled capsules at and after 17 days. Since the volume of the medium was 5 times the volume of the capsules, this means that the cell density per ml culture was between about 5 x 10 and 1 x 10 cells / ml.

Zoals in fig. 5 afgebeeld leidde de chargegewijze voeding van de culture tot een dichtheid van groter dan 1 x o 35 10 cellen/ml bezonken capsules.As depicted in Figure 5, the batchwise feeding of the culture resulted in a density greater than 1 x 10 cells / ml of settled capsules.

De deskundige kan andere modificaties of varianten van de procedures en producten, zoals hier beschreven, be-gelijke andere modificaties en varianten worden mede door de volgende conclusies omvat.Those skilled in the art may include other modifications or variants of the procedures and products as described herein, as well as other modifications and variants, which are included in the following claims.

Claims (11)

1. Werkwijze voor het kweken van cellen zonder celwan-den bij een hoge dichtheid, met het kenmerk, dat A. een gas rechtstreeks wordt ingeborreld in een groeimedium onder verschaffing aan dat medium van een prak-5 tisch constante gasconcentratie, die voldoende is voor het handhaven van de levensvatbaarheid van de cellen en voor het ondersteunen van mitosis bij de cellen, welke cellen aanwezig zijn in bolvormige capsules, gesuspendeerd in dat.medium, welke capsules semipermeabele membranen hebben zodanig, dat 10 de cellen worden beschermd tegen fysische beschadiging en voldoende permeabel zijn om het mogelijk te maken, dat componenten, nodig voor het handhaven van de levensvatbaarheid van de cellen en mitosis van de cellen te onderhouden doorgelaten worden; enA method for culturing cells without cell walls at a high density, characterized in that A. a gas is bubbled directly into a growth medium, providing that medium of a practically constant gas concentration sufficient for maintaining cell viability and supporting mitosis in the cells, which cells are present in spherical capsules suspended in that medium, which capsules have semipermeable membranes such that the cells are protected from physical damage and sufficient are permeable to allow passage of components necessary to maintain cell viability and maintain mitosis of the cells; and 15 B. de cellen gaan groeien.15 B. the cells are going to grow. 2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het ken merk, dat stoffen, die door de cellen worden geproduceerd, worden geoogst hetzij uit de capsules dan wel uit het medium.A method according to claim 1, characterized in that substances produced by the cells are harvested either from the capsules or from the medium. 3. Werkwijze volgens conclusie 1,' met het ken- 20 merk, dat de cellen dierlijke cellen zijn en het gas een zuurstof houdend gas is.3. A method according to claim 1, characterized in that the cells are animal cells and the gas is an oxygen-containing gas. 4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken merk, dat het gas verder kooldioxide bevat.Method according to claim 3, characterized in that the gas further contains carbon dioxide. 5. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken- 25 merk, dat de cellen mammaliacellen zijn.5. A method according to claim 3, characterized in that the cells are mammary cells. 6. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken merk, dat het zuurstof houdende gas uitgebalanceerde hoeveelheden zuurstof en kooldioxide bevat voldoende voor het teweegbrengen van een optimale, praktisch constante zuurstof- 30 en kooldioxideconcerttratie in het medium ter ondersteuning van het metabolisme en voor het bevorderen van mitosis van de cellen.6. A method according to claim 3, characterized in that the oxygen-containing gas contains balanced amounts of oxygen and carbon dioxide sufficient to produce an optimum, practically constant oxygen and carbon dioxide concentration in the medium to aid metabolism and promote of mitosis of the cells. 7. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken merk, dat de partiële druk van de zuurstof in het medium 35 zich bevindt in het gebied van 15-200 mm Hg.A method according to claim 3, characterized in that the partial pressure of the oxygen in the medium is in the range of 15-200 mm Hg. 8. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken- BADQfUglKAk, dat de dierlijke cellen samengesmolten cellen zijn.A method according to claim 3, characterized in that the BADQfUglKAk, that the animal cells are fused cells. 9. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken- >" ' -14- ' ‘ ! merk, dat de dierlijke cellen genetisch gebouwde cellen zijn.9. A method according to claim 3, characterized in that the animal cells are genetically engineered cells. 10. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken merk, dat de dierlijke cellen myelomacellen. zijn.Method according to claim 3, characterized in that the animal cells are myeloma cells. to be. 11. Werkwijze volgens conclusie 3, met het ken- m e r k, dat de dierlijke cellen worden gekweekt tot een dichtheid van ten minste 5 x 10® cellen/ml culture. « BAD ORIGINAL O K Λ Λ X R Λ11. A method according to claim 3, characterized in that the animal cells are grown to a density of at least 5 x 10® cells / ml culture. «BAD ORIGINAL O K Λ Λ X R Λ