NL8200631A - REAGENT AND METHOD FOR IMMUNOLOGICAL ANALYSIS. - Google Patents

Description

V i VO 3086V i VO 3086

Reagens en werkwijze voor immunologische analyse.Reagent and method for immunological analysis.

Gedurende de laatste jaren heeft de vooruitgang op het gebied van de immunochemie geleid tot uitgebreide onderzoeken van antilichamen, waarvan in het verleden weinig bekend was, en zijn het controle mechanisme voor antilichamen-produktie en de biochemische structuren en 5 eigenschappen van antilichamen in detail bestudeerd.In recent years, advances in immunochemistry have led to extensive studies of antibodies, of which little was known in the past, and the control mechanism for antibody production and the biochemical structures and properties of antibodies have been studied in detail.

In 1975 is C. Milstein et al. erin geslaagd om een monoclonaal antilichaam te produceren door celfusie van muizen myeloma cellen met antilichaam-producerende cellen uit de milt. Het monoclonale antilichaam zal naar verwachting sterk bijdragen aan de ontwikkeling van fundamentele 10 onderzoeken van de immunologie, en er zijn op dit gebied actief onderzoeken uitgevoerd.In 1975, C. Milstein et al. Succeeded in producing a monoclonal antibody by cell fusion of murine myeloma cells with antibody-producing cells from the spleen. The monoclonal antibody is expected to contribute strongly to the development of fundamental immunology studies, and studies have been actively conducted in this field.

Enzymoimmuno-analyse (EIA) is eerder gebruikt als een zeer gevoelige en kwantitatieve immunologische analyse methode. In het bijzonder wordt vaak de op deze analyse gebaseerde sandwich-methode gebruikt en 15 dan vanwege de eenvoud van de procedure en de hoge gevoeligheid. Omdat de sandwich-methode echter 1 tot 4 dagen voor de reactie nodig heeft, is het gewenst dat de vereiste reactietijd geminimaliseerd wordt.Enzyme immunoassay (EIA) has previously been used as a highly sensitive and quantitative immunological analysis method. In particular, the sandwich method based on this analysis is often used, and then because of the simplicity of the procedure and the high sensitivity. However, since the sandwich method requires 1 to 4 days for the reaction, it is desirable that the required reaction time be minimized.

Verder bestaat in verband met recente vooruitgang in de clinische geneeskunde, behoefte aan een snelle evaluatie van de proefresultaten om 20 de patiënt onmiddellijk te kunnen behandelen. Ook vanuit dit oogpunt is verkorting van de reactietijd dringend gewenst. Volgens de conventionele sandwich-methode leidt echter verkorting van de reactietijd tot een verlaging van de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de analyse zoals onderstaand zal worden toegelicht, zodat een significante verkorting 25 van de reactietijd niet bereikt kan worden.Furthermore, in connection with recent advances in clinical medicine, there is a need for a rapid evaluation of the trial results to be able to treat the patient immediately. Reducing the reaction time is also urgently desirable from this point of view. However, according to the conventional sandwich method, shortening the reaction time results in a decrease in the sensitivity and accuracy of the analysis, as will be explained below, so that a significant shortening of the reaction time cannot be achieved.

Thans zal de conventionele sandwich-methode nader in detail worden beschreven. Hoewel de methode hier voor het gemak wordt toegelicht in relatie tot EIA, kan de uitleg ook worden toegepast op de methode die gebaseerd op FIA (fluoroimmuno-analyse).The conventional sandwich method will now be described in more detail. Although the method is explained here for convenience in relation to EIA, the explanation can also be applied to the method based on FIA (fluoroimmunoassay).

30 De conventionele sandwich-methode wordt in de volgende volgorde uitgevoerd zoals in het schematische diagram in figuur 1 wordt getoond, i) Men laat onoplosbaar gemaakt antilichaam 2’, verkregen door een antilichaam voor een te analyseren antigeen 3 aan een onoplosbare drager (vaste fase) 4 te binden, reageren met het antigeen 3 teneinde het 35 antigeen 3 aan het antilichaam 2' op de vaste fase te binden (eerste reactie).The conventional sandwich method is performed in the following order as shown in the schematic diagram in Figure 1, i) Insolubilized antibody 2 'is obtained by obtaining an antibody for an antigen 3 to be analyzed on an insoluble support (solid phase ) 4, react with the antigen 3 to bind the antigen 3 to the antibody 2 'on the solid phase (first reaction).

8200631 h i -2- ii) De vaste fase 4 wordt gewassen om stoffen die niet gereageerd hebben te verwijderen.8200631 h i -2- ii) The solid phase 4 is washed to remove unreacted substances.

iii) De aldus gewassen vaste fase 4 wordt in reactie gebracht met gelabeld antilichaam 1', verkregen door een enzym 5 te binden aan 5 een antilichaam voor het te analyseren antigeen 3, teneinde het gelabelde antilichaam 11 te binden aan een niet gereageerd hebbende antigenische plaats van het antigeen 3 dat aan de vaste fase 4 is bevestigd (tweede reactie).iii) The solid phase 4 thus washed is reacted with labeled antibody 1 'obtained by binding an enzyme 5 to 5 an antibody for the antigen to be analyzed 3 to bind the labeled antibody 11 to an unreacted antigenic site of the antigen 3 attached to the solid phase 4 (second reaction).

iv) De vaste fase 4 wordt gewassen om de overmaat gelabeld anti- 10 lichaam 1' te verwijderen en daarna wordt een substraat voor het enzym toegevoegd en aan de enzym-reactie onderworpen.iv) The solid phase 4 is washed to remove the excess labeled antibody 1 'and then a substrate for the enzyme is added and subjected to the enzyme reaction.

Omdat antigeen 3 en gelabeld antilichaam 1' aan de vaste fase 4 zijn gebonden, vindt de enzym-reactie in evenredigheid aan de aanwezige hoeveelheid enzym plaats. De hoeveelheid te analyseren anti-15 geen 3 wordt bepaald uit de hoeveelheid verkregen reactieprodukt.Since antigen 3 and labeled antibody 1 'are bound to solid phase 4, the enzyme reaction takes place in proportion to the amount of enzyme present. The amount of anti-15 not 3 to be analyzed is determined from the amount of reaction product obtained.

Omdat de sandwich-methode algemeen gezien wordt als een niet-competitieve analyse , zou men kunnen denken dat daarbij van een competitieve reactie geen sprake is Deze klassificatie brengt echter niet noodzakelijkerwijze de exacte reactietoestanden tot uitdrukking. In 20 feite kan derhalve een evenwichtstoestand bestaan in de sandwich-methode, die schematisch als volgt kan worden aangegeven.Since the sandwich method is generally regarded as a non-competitive analysis, one might think that it does not involve a competitive reaction. However, this classification does not necessarily express the exact reaction states. In fact, therefore, an equilibrium state can exist in the sandwich method, which can be schematically indicated as follows.

Eerste reactie.First comment.

a (@D + CAS)^—p ( |~Ab| - Ag^) a» a’ cl 25 Tweede reactie.a (@D + CAS) ^ - p (| ~ Ab | - Ag ^) a »a´cl 25 Second reaction.

(Ξ-Ag-Ab*](Ξ-Ag-Ab *]

,π. */· X, π. * / X

l -Ab. -Ag J + (Ab*D (Eb]) - (Ag-Ab*] \ Ί1 -Ab. -Ag J + (Ab * D (Eb]) - (Ag-Ab *] \ Ί

(L-AbjJ +(Agj +(Ab*J(L-AbjJ + (Agj + (Ab * J

(In bovenstaande schema stellen fABj het onoplosbaar gemaakte 35 antilichaam voor? Ag het te analyseren antigeen voor; AB* het gelabelde antilichaam voor; a, a’, b, b', c, c', d, d', e en e' evenwichtscon-stanten voor? en betekent - dat het antigeen en het antilichaam aan elkaar gebonden zijn).(In the above scheme, fABj represent the insolubilized antibody? Ag represents the antigen to be analyzed; AB * represents the labeled antibody; a, a ', b, b', c, c ', d, d', e and e "equilibrium constants for" means "that the antigen and the antibody are bound together".

8200631 * ‘+ -3-8200631 * "+ -3-

Wanneer het complex van het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het te analyseren antigeen in de tweede reactie in reactie wordt gebracht met hét gelabelde antilichaam, binden het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam competitief aan het te analyseren 5 antigeen in overeenstemming met hun affiniteitswaarden voor het antigeen (omdat de eigenschappen van het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam vrijwel gelijk zijn, worden hun affiniteitswaarden voor het te analyseren antigeen nagenoeg equivalent geacht), en als gevolg van de competitie dissocieert het door de eerste reactie gevormde 10 onoplosbaar gemaakte antilichaam-antigeencomplex onder vorming van complexen van verschillende combinaties zoals boven is getoond.When the insolubilized antibody complex and the antigen to be analyzed are reacted in the second reaction with the labeled antibody, the insolubilized antibody and the labeled antibody competitively bind to the antigen to be analyzed according to their affinity values for the antigen. (because the properties of the insolubilized antibody and the labeled antibody are almost equal, their affinity values for the antigen to be analyzed are considered substantially equivalent), and as a result of the competition, the insolubilized antibody-antigen complex formed by the first reaction dissociates under formation of complexes of different combinations as shown above.

Dit wendt door het volgende experiment aangetoond.This averts demonstrated by the following experiment.

Een kunststofproefbuis met een anti-HCG-β subeenheid antilichaam daaraan bevestigd, wordt in reactie gebracht met HCG-β dat met peroxi-15 dase gelabeld is, en daarna gewassen. Wanneer het in reactie wordt gebracht met een anti-HCG-β antilichaam dissocieert het met enzym gelabelde HCG-β dat aan de vaste fase is bevestigd, geleidelijk uit de vaste fase en begeeft zich in de vloeistoffase. Figuur 2 toont deze toestand.A plastic test tube with an anti-HCG-β subunit antibody attached thereto is reacted with HCG-β labeled with peroxidase, and then washed. When reacted with an anti-HCG-β antibody, the enzyme-labeled HCG-β attached to the solid phase gradually dissociates from the solid phase and enters the liquid phase. Figure 2 shows this state.

20 Wanneer echter de tijd van de eerste reactie voldoende lang is, wordt de binding vein antigeen en antilichaam gedeeltelijk irreversibel, en ondergaat het antigeen-antilichaam complex niet zo gemakkelijk de dissociatie, zelfs niet wanneer het gelabelde antilichaam daaraan wordt toegevoegd. Anderzijds kan worden gezegd, dat wanneer de tijd van de 25 tweede reactie voldoende lang wordt gemaakt, de reactie voortschrijdt in een richting waarbij een complex wordt gevormd van "het onoplosbaar gemaakte antilichaam, het te analyseren antigeen en het gelabelde antilichaam". Om deze redenen is het in de conventionele sandwich-methode beslist noodzakelijk dat de reactie gedurende een voldoende lange tijd 30 wordt uitgevoerd. Wanneer de sandwich-methode derhalve zonder de eerste reactie wordt uitgevoerd of de tijdsduur van de eerste reactie in extreme mate wordt verkort (bijvoorbeeld wanneer het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam gelijktijdig met het te analyseren antigeen in reactie worden gebracht), moet de tweede reactie worden ver-35 lengd en worden toch de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de analyse verminderd. Wanneer de tijdsduur van de tweede reactie wordt yerkort, worden de gevoeligheid en nauwkeurigheid nog verder verminderd.Om deze redenen was het in de conventionele methode niet mogelijk om de reactie- 8200631 _4_ h * duur te verkorten zonder een vermindering van de gevoeligheid en nauwkeurigheid te veroorzaken. In dit opzicht hebben Ichihara et al.[ The Japanese Journal of Clinical Pathology, 26, 1027 (1978)] vermeld, dat een dergelijke competitieve reactie bestaat en dat alleen wanneer voor 5 het uitvoeren van de reactie voldoende tijd wordt genomen, de reactie gedeeltelijk irreversibel werd.However, when the time of the first reaction is sufficiently long, the binding of antigen and antibody becomes partially irreversible, and the antigen-antibody complex does not so easily dissociate even when the labeled antibody is added thereto. On the other hand, it can be said that when the time of the second reaction is made sufficiently long, the reaction proceeds in a direction complexing "the insolubilized antibody, the antigen to be analyzed and the labeled antibody". For these reasons, in the conventional sandwich method, it is imperative that the reaction be carried out for a sufficiently long time. Therefore, when the sandwich method is performed without the first reaction or the duration of the first reaction is extremely shortened (e.g., when the insolubilized antibody and the labeled antibody are reacted simultaneously with the antigen to be analyzed), the second reaction are extended and yet the sensitivity and accuracy of the analysis are reduced. When the time of the second reaction is shortened, the sensitivity and accuracy are further reduced. For these reasons, it was not possible in the conventional method to shorten the reaction time without decreasing the sensitivity and accuracy. cause. In this regard, Ichihara et al. [The Japanese Journal of Clinical Pathology, 26, 1027 (1978)] have reported that such a competitive response exists and that only when sufficient time is taken to conduct the reaction does the reaction partially became irreversible.

Het reactiesysteem in de conventionele methode is derhalve gecompliceerd en niet efficiënt en vereist een lange reactieduur.The reaction system in the conventional method is therefore complicated and inefficient and requires a long reaction time.

Doel van de onderhavige uitvinding is om een reagens te verschaffen 10 voor immunologische analyse, dat een opmerkelijke verkorting van de vereiste analyseduur mogelijk maakt zonder dat dit gepaard gaat met verlaging van de gevoeligheid en nauwkeurigheid.The object of the present invention is to provide a reagent for immunological analysis, which allows for a remarkable shortening of the required analysis time, without this being accompanied by a decrease in sensitivity and accuracy.

In het bijzonder is een doel van de onderhavige uitvinding om èen reagens te verschaffen voor de sandwich-methode, welk reagens een onoplos-15 baar gemaakt antilichaam en gelabeld antilichaam, bereid uit monoclonale antili chamen, omvat.In particular, an object of the present invention is to provide a reagent for the sandwich method, which reagent comprises an insolubilized antibody and a labeled antibody prepared from monoclonal antibodies.

Een ander doel van de onderhavige uitvinding is om een verbeterde sandwich-methode te verschaffen, welke een opmerkelijke verkorting van de vereiste analyse-duur mogelijk maakt zonder dat dit gepaard gaat met 20 vermindering van de gevoeligheid en nauwkeurigheid.Another object of the present invention is to provide an improved sandwich method, which allows for a marked reduction in the required analysis time without this being accompanied by a reduction in sensitivity and accuracy.

Figuur 1 is een schematisch diagram dat de reactiewijze in een conventionele sandwich-methode toont,Figure 1 is a schematic diagram showing the method of reaction in a conventional sandwich method,

Figuren 2 en 3 zijn grafieken die de aanwezigheid of afwezigheid van de competitie tussen antilichamen tonen, 25 Figuur 4 is een schematisch diagram dat de reactiewijze volgens de uitvinding toont,Figures 2 and 3 are graphs showing the presence or absence of competition between antibodies, Figure 4 is a schematic diagram showing the method of reaction according to the invention,

Figuur 5 is een grafiek die een vergelijking tussen de onderhavige uitvinding en de conventionele methode toont,Figure 5 is a graph showing a comparison between the present invention and the conventional method,

Figuur 6 is een grafiek die de resultaten van voorbeeld I toont, 30 Figuur 7 is een grafiek die de resultaten van voorbeeld II toont, enFigure 6 is a graph showing the results of Example I, Figure 7 is a graph showing the results of Example II, and

Figuur 8 is een grafiek die de resultaten van voorbeeld III toont.Figure 8 is a graph showing the results of Example III.

De bovenstaande doeleinden van de onderhavige uitvinding worden bereikt door gebruik te maken van monoclonale antilichamen voor het bereiden van onoplosbaar antilichaam en gelabeld antilichaam, welke ver-35 schillende antigenische determinanten op het zelfde antigeen onderscheiden, en binden, terwijl in conventionele methoden zogenaamde polyclonale antilichamen (verkregen uit dieren die met hetzelfde antigeen geïmmuniseerd waren) gebruikt werden voor het bereiden van deze twee antilichamen, zodat ze 8200531The above objects of the present invention are achieved by using monoclonal antibodies to prepare insoluble antibody and labeled antibody, which distinguish and bind different antigenic determinants on the same antigen, while in conventional methods so-called polyclonal antibodies ( obtained from animals immunized with the same antigen) were used to prepare these two antibodies to yield 8200531

Jf * -5- voor dezelfde antigenische determinanten van het antigeen in competitie treden.Jf * -5- compete for the same antigenic determinants of the antigen.

De onderhavige uitvinding wordt derhalve gekenmerkt doordat het onoplosbaar gemaakte antilichaam respectievelijk het gelabelde anti-5 lichaam, antilichamen omvatten die in staat zijn om verschillende antigenische determinanten van hetzelfde te analyseren antigeen te herkennen en daaraan te binden, of antilichamen omvatten die de verschillende antigenische determinanten van het antigeen onderscheiden zodat het mogelijk is om de twee respectievelijke antilichamen zich aan verschillende anti-10 genische plaatsen te doen binden die op een voldoende afstand van elkaar op hetzelfde antigeen zijn gelegen dat ze elkanders binding niet verstoren.The present invention is therefore characterized in that the insolubilized antibody and the labeled antibody, respectively, comprise antibodies capable of recognizing and binding to different antigenic determinants of the same antigen to be analyzed, or comprising antibodies comprising the different antigenic determinants of distinguish the antigen so that it is possible for the two respective antibodies to bind to different antigenic sites that are sufficiently spaced from each other on the same antigen that they do not interfere with each other's binding.

Monoclonale antilichamen zijn als dergelijke antilichamen zeer geschikt.Monoclonal antibodies are very suitable as such antibodies.

15 De monoclonale antilichamen worden verkregen door celfusie tussen myeloma cellen en antilichaam-producerende cellen volgens de methode van Milstein et al. [Nature, 256, 495 (1975)].Omdat deze antilichamen geproduceerd worden uit antilichaam-producerende cellen van een enkele kloon, zijn ze volledig homogeen en zijn hun specificiteiten 20 voor antigenische determinanten volledig identiek. Omdat te analyseren antigeen gewoonlijk verschillende antigenische determinanten heeft, zal, wanneer monoclonale antilichamen met het vermogen om verschillende antigenische determinanten van het antigeen te herkennen en daaraan te binden, als onoplosbaar gemaakt antilichaam en als gelabeld antilichaam 25 worden gebruikt, geen competitie tussen deze antilichamen optreden en kan een zeer specifieke analyse van het antigeen worden bereikt. Derhalve kan ook een mengsel -van twee of meer monoclonale antilichamen die aan verschillende antigenische determinanten binden, worden gebruikt als onoplosbaar gemaakt antilichaam en/of als gelabeld antilichaam, mits 30 deze antilichamen niet een dergelijke competitie veroorzaken.The monoclonal antibodies are obtained by cell fusion between myeloma cells and antibody-producing cells according to the method of Milstein et al. [Nature, 256, 495 (1975)] Because these antibodies are produced from single clone antibody-producing cells, they are completely homogeneous and their specificities for antigenic determinants are completely identical. Since antigen to be analyzed usually has different antigenic determinants, when monoclonal antibodies with the ability to recognize and bind to different antigenic determinants of the antigen are used as an insolubilized antibody and as a labeled antibody, competition between these antibodies will not occur and a very specific analysis of the antigen can be achieved. Therefore, a mixture of two or more monoclonal antibodies that bind to different antigenic determinants can also be used as an insolubilized antibody and / or as a labeled antibody, provided these antibodies do not cause such competition.

De analyse volgens de uitvinding kan op dezelfde wijze als volgens de stander- techniek worden uitgevoerd. Benadrukt moet echter worden dat het reactiemechanisme is vereenvoudigd ten opzichte van dat volgens de conventionele methode, omdat het onoplosbaar gemaakte antilichaam 35 zoals onderstaand getoond geen competitie met het gelabelde antilichaam aangaat.The analysis according to the invention can be carried out in the same manner as according to the prior art. However, it should be emphasized that the reaction mechanism is simplified over that of the conventional method, because the insolubilized antibody 35 as shown below does not compete with the labeled antibody.

8200631 i \ -6- f lAbl -Ag) + [Ab*) -// ,¾8200631 i \ -6- f lAbl -Ag) + [Ab *) - //, ¾

5 QAbj) + [Ag) + (Ab*) X® *AS 'Ab*J5 QAbj) + [Ag) + (Ab *) X® * AS 'Ab * J

^ ‘V/.^ "V /.

(|AbQ + (Ag - Ab*) p^> p’, q^> q', r ’ > s^> s1 10 (|ABj , Ag, Ab en - hebben dezelfde betekenissen als boven, en p, p', q, q', r, r', s, s' zijn evenwichtsconstanten).(| AbQ + (Ag - Ab *) p ^> p ', q ^> q', r '> s ^> s1 10 (| ABj, Ag, Ab and - have the same meanings as above, and p, p' , q, q ', r, r', s, s' are equilibrium constants).

Omdat geen competitie bestaat tussen het onoplosbaar gemaakte 15 antilichaam en het gelabelde antilichaam wanneer ze verschillende bin-dingsplaatsen aan een antigeen hebben,schrijdt de reactie voort in een zodanige richting dat de componenten in de reactie-oplossing een"onoplos-baar gemaakt antilichaam-antigeen-gelabeld antilichaam" complex vormen.Since there is no competition between the insolubilized antibody and the labeled antibody when they have different binding sites to an antigen, the reaction proceeds in such a direction that the components in the reaction solution produce an "insoluble antibody antigen. -labeled antibody "complex.

Dit kan met het volgende experiment worden aangetoond: 20 in hetzelfde reactiesysteem als bij de conventionele sandwich-methode, werden twee verschillende monoclonale anti-HCG antilichamen,die in staat waren om verschillende antigenische determinanten van HCG te herkennen, gebruikt als het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam, en hetzelfde experiment werd uitgevoerd. Volgens het resultaat, 25 zoals weergegeven in figuur 3, zal wanneer eenmaal het antigeen aan het onoplosbaar gemaakte antilichaam is gebonden, geen dissociatie meer optreden uit het onoplosbaar gemaakte antilichaam (vaste fase) wanneer een anti-HCG antilichaam, dat overeenkomt met een andere antigeendeterminant, daaraan wordt toegevoegd. Het is dus duidelijk dat competitie tussen de 30 antilichamen voor dezelfde antigenische plaatsen niet optreedt. Volgens de onderhavige uitvinding worden derhalve soortgelijke resultaten verkregen, ongeacht of het onoplosbaar gemaakte antilichaam, het te analyseren antigeen en het gelabelde antilichaam gelijktijdig in reactie worden gebracht, of het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het anti-35 geen eerst worden gemengd en daarna met het gelabelde antilichaam in reactie worden gebracht, of het onoplosbaar gemaakte antilichaam met het 8200631 -7- antigeen in reactie wordt gebracht en na een tijdje het mengsel met het gelabelde antilichaam in reactie wordt gebracht. Er bestaat derhalve geen beperking voor de volgorde van de reacties.This can be demonstrated with the following experiment: In the same reaction system as in the conventional sandwich method, two different monoclonal anti-HCG antibodies, which were able to recognize different HCG antigenic determinants, were used as the insolubilized antibody and the labeled antibody, and the same experiment was performed. According to the result, as shown in Figure 3, once the antigen is bound to the insolubilized antibody, dissociation from the insolubilized antibody (solid phase) will no longer occur when an anti-HCG antibody corresponding to another antigen determinant , is added. Thus, it is clear that competition between the 30 antibodies for the same antigenic sites does not occur. Accordingly, according to the present invention, similar results are obtained whether the insolubilized antibody, the antigen to be analyzed and the labeled antibody are reacted simultaneously, or whether the insolubilized antibody and the anti-35 are first mixed and then with the labeled antibody, or the insolubilized antibody is reacted with the 8200631-7 antigen, and after a while the mixture is reacted with the labeled antibody. Therefore, there is no limitation on the order of the reactions.

De reactie die volgens de uitvinding plaatsvindt, wordt getoond 5 door een schematisch diagram in figuur 4. Omdat het onoplosbaar gemaakte antilichaam 2 en het gelabelde antilichaam 1 niet met elkaar in competitie treden, kan een grotere hoeveelheid gelabeld antilichaam 1 aan het antigeen 3 worden gebonden binnen een kortere tijdsperiode, en is het niet alleen mogelijk om de analysetijd te verkorten, maar ook om 10 de nauwkeurigheid en gevoeligheid van de analyse te verhogen.The reaction that takes place according to the invention is shown 5 by a schematic diagram in figure 4. Since the insolubilized antibody 2 and the labeled antibody 1 do not compete, a larger amount of labeled antibody 1 can be bound to the antigen 3 within a shorter period of time, and it is possible not only to shorten the analysis time, but also to increase the accuracy and sensitivity of the analysis.

Tabel A vat de voordelen van de werkwijze volgens de uitvinding boven de conventionele werkwijze samen bij gebruik van polyclonale antilichamen in de analyse van α-fetoproteïne (AFP). üit de tabel is duidelijk dat vele voordelen zoals een uitgesproken verkorting van de 15 analyseduur, een vereenvoudiging van de analyse-procedure en een vergroting van de analyse-nauwkeurigheid en -gevoeligheid, kunnen worden verkregen.Table A summarizes the advantages of the method of the invention over the conventional method using polyclonal antibodies in the analysis of α-fetoprotein (AFP). It is clear from the table that many advantages, such as a marked reduction in the analysis duration, a simplification of the analysis procedure and an increase in the analysis accuracy and sensitivity, can be obtained.

TABEL A.TABLE A.

20 Methode volgens de conventionele methode ..... uitvinding20 Method according to the conventional method ..... invention

Reactie —wassen eerste reactie —> wassen , -> enzvmreactie -$> tweede reactie—s. wassenReaction - washing first reaction -> washing, -> etc reaction - $> second reaction - s. Wash

Procedure _ ' > enzymreactie 25 gebruikte monoclonale anti- polyclonale antilichamen antilichamen lichamen benodigde tijd '30 min. j 270 min.Procedure enzyme reaction 25 used monoclonal anti-polyclonal antibodies antibodies bodies time required 30 min 270 min.

gevoeligheid j 3 ng/ml j 10 ng/ml 30 intraexperi-i j mentele fout . 0 0 c 4 2 C.V. in 10 i l'2 % ! 2,5 % vn k o repxtities . in........ — --j-!...............sensitivity j 3 ng / ml j 10 ng / ml 30 intraexperi-i mental error. 0 0 c 4 2 C.V. in 10 i l'2%! 2.5% un repo s. in ........ - --j -! ...............

•H j ^ interexperx- | S mentele fout ! - 35 I C.V. in 5 3f? % j 5,6 % g repetities j 8200631 -8-• H j ^ interexperx- | Mental error! - 35 I C.V. in 5 3f? % j 5.6% g rehearsals j 8200631 -8-

De analyse werd uitgeveerd onder toepassing van een fluorofoto-meter met het serum van een zwangere vrouw als analysemonster, een polystyreen proefbuis als vaste fase, mierikswortel peroxidase als labelend enzym en floretinezuur als substraat.The analysis was performed using a fluorophotometer with a pregnant woman's serum as the assay sample, a polystyrene test tube as a solid phase, horseradish peroxidase as a labeling enzyme and phloretic acid as a substrate.

5 Het is ook mogelijk dat alleen het onoplosbaar gemaakte anti- lichaam of het gelabelde antilichaam uit monoclonale antilicharaen wordt bereid en het andere uit gewone polyclonale antilichamen wordt bereid. In dit geval treedt echter competitie op bij een antigenischedeterminant die gemeenschappelijk is aan het monoclonale en polyclonale anti- 10 lichaam en soms is de affiniteit van de antigenische determinant voor het polyclonale antilichaam sterker, hetwelk een lagere nauwkeurigheid en gevoeligheid van de analyse veroorzaakt zelfs in vergelijking tot de conventionele methode, dus niet alleen de methode waarin beide antilichamen monoclonaal zijn.It is also possible that only the insolubilized antibody or the labeled antibody is prepared from monoclonal antibodies and the other is prepared from ordinary polyclonal antibodies. In this case, however, competition occurs with an antigenic determinant common to the monoclonal and polyclonal antibody, and sometimes the affinity of the antigenic determinant to the polyclonal antibody is stronger, which causes a lower accuracy and sensitivity of the assay even in comparison. to the conventional method, not just the method in which both antibodies are monoclonal.

15 Figuur 5 toont standaardkrommen in de analyse van CEA (carcino- embryonisch antigeen) wanneer het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam worden gecombineerd zoals getoond in tabel B. Het is duidelijk dat het analyse-systeem dat gebaseerd is op de combinatie volgens de uitvinding de beste resultaten geeft.Figure 5 shows standard curves in the analysis of CEA (carcino-embryonic antigen) when the insolubilized antibody and the labeled antibody are combined as shown in Table B. It is clear that the analysis system based on the combination of the invention gives the best results.

20 TABEL B.20 TABLE B.

onoplosbaar gemaakt gelabeld antilichaam antilichaam 25 methode volgens uitvinding monoclonaal monoclonaal vergelijkingsmethode 1 monoclonaal polyclonaal vergelijkingsmethode 2 polyclonaal monoclonaal conventionele methode polyclonaal polyclonaal 30 De gebruikte monoclonale antilichamen werden verkregen door de celfusietechniek waarbij muis myeloma cellen werden gebruikt overeenkomstig voorbeeld II en waren afgeleid van klonen die met verschillende antigenische plaatsen correspondeerden. De gebruikte polyclonale antilichamen waren de in de handel verkrijgbare produkten van Dako Company 35 (Denemarken). Polystyreen proefbuizen werden gebruikt als onoplosbare drager; mierikswortel peroxidase werd als enzym gebruikt; en o-fenyleen-diamine werd als substraat toegepast.insolubilized labeled antibody antibody 25 method of the invention monoclonal monoclonal comparison method 1 monoclonal polyclonal comparison method 2 polyclonal monoclonal conventional method polyclonal polyclonal 30 The monoclonal antibodies used were obtained by the cell fusion technique using mouse myeloma cells and derived from clones containing different antigenic sites corresponded. The polyclonal antibodies used were the commercially available products from Dako Company 35 (Denmark). Polystyrene test tubes were used as an insoluble support; horseradish peroxidase was used as an enzyme; and o-phenylene diamine was used as the substrate.

8200631 -9-8200631 -9-

Elke gewenste combinatie van myeloma cellen en antilichaam-pro-ducerende cellen kan worden gebruikt voor het verkrijgen van monoclonale anti lichamen en de aard vein het dier waarvan de cellen zijn afgeleid, is niet beperkt, zolang beide cellen in de combinatie samen hybridoma 5 kunnen vormen en bij het groeien een antilichaam produceren.Any desired combination of myeloma cells and antibody-producing cells can be used to obtain monoclonal antibodies and the nature of the animal from which the cells are derived is not limited, as long as both cells in the combination can form hybridoma together and produce an antibody as it grows.

Alle in conventionele immuno-analyses toegepaste onoplosbare dragers kunnen in de uitvinding worden gebruikt. Voorbeelden van dergelijke onoplosbare dragers zijn polystyreen, polyetheen , acrylharsen, polytetrafluoroetheen (Teflon^ papier, glas, an Agarose. De onoplosbare 10 drager kan de vorm hebben van een Rollet,(tandwielvormige korrel), korrel, staaf, schijf of cuvet. Het kan bijvoorbeeld een optische cel, een proefbuis enz. zijn. Hij kan ook een andere vorm hebben.Any insoluble carriers used in conventional immunoassays can be used in the invention. Examples of such insoluble carriers are polystyrene, polyethylene, acrylic resins, polytetrafluoroethylene (Teflon® paper, glass, an Agarose. The insoluble carrier can be in the form of a Rollet, (gear-shaped grain), grain, rod, disc or cuvette. It can be for example an optical cell, a test tube, etc. It may also have a different shape.

De normaliter toegepaste middelen voor het labelen omvatten bijvoorbeeld peroxidase, β-D-galactosidase en basische fosfatase voor 15 EIA en fluoresceïne-isothiocyanaat voor FIA.For example, the commonly used labeling agents include peroxidase, β-D-galactosidase and basic phosphatase for EIA and fluorescein isothiocyanate for FIA.

Wanneer het middel voor het labelen een enzym is, is een substraat vereist om zijn activiteit te meten. Het substraat kan zodanig zijn, dat wanneer het in reactie wordt gebracht met het overeenkomstige enzym, de hoeveelheid van het verkregen produkt of de hoeveelheid van 20 het verminderde of overblijvende substraat gemakkelijk kan worden gemeten. Bijvoorbeeld kunnen S-aminosalicylzuur-H^O^, o-fenyleendiamine-, floretinezuur-H£, enz. als substraten voor peroxidase worden genoemd.When the labeling agent is an enzyme, a substrate is required to measure its activity. The substrate can be such that when it is reacted with the corresponding enzyme, the amount of the product obtained or the amount of the reduced or residual substrate can be easily measured. For example, S-aminosalicylic acid H 2 O 2, o-phenylenediamine, phloretic acid H 2, etc. can be mentioned as substrates for peroxidase.

Als substraten voor β-D-galactosidase kunnen bijvoorbeeld 25 worden genoemd fluorescelne-di-(β-D-galactopyranoside)r o-nitrofenol-β-D-galactopyranoside), 4-methyl-umbelliferyl^-D-galactoside enz.As substrates for β-D-galactosidase, there may be mentioned, for example, fluorescene di- (β-D-galactopyranoside (r-nitrophenol-β-D-galactopyranoside), 4-methyl-umbelliferyl-D-galactoside, etc.

Stoffen die met het reagens volgens de uitvinding kunnen worden geanalyseerd, dienen tenminste twee antigenische determinanten in het molecuul te hebben. Omdat stoffen die met de sandwich-methode geanaly-30 seerd zijn twee of meer antigenische determinanten hebben, kunnen vrijwel alle stoffen die met de conventionele methode kunnen worden geanalyseerd, volgens de onderhavige uitvinding worden geanalyseerd. Voorbeelden van dergelijke stoffen zijn enzymen zoals γ-glutamyl transpetidase (γ-GTP), basisch fosfatase en transglycosidase; proteïne hormonen zoals thyrolde-35 stimulerend hormoon (TSH), luteinisatie-hormoon (LH), menselijk chorion gonadotropine (HCG), insuline, secretine en groeihormoon (GH); plasma proteïnes, zoals fibrine degradatie produkt (FDP), C-reactieve proteïne (CRP), α -acidisch glycoproteïne (α^-AG), a^-antitrypsine (a^-AT), 8200631 -10- a^-plasmine inhibitor (α^-ΡΙ) t p^-microglobuline ^-MG) en immunoglobu-line; carcinoembryonische proteïnen zoals α-fetoproteïne (AFP), carcino-embryonisch antigeen (CEA) en embryonisch ferritine; en lymfocyten en bacterie-cellen, celoppervlak antigenen, celfracties enz.Substances that can be analyzed with the reagent according to the invention must have at least two antigenic determinants in the molecule. Since substances analyzed by the sandwich method have two or more antigenic determinants, virtually all substances that can be analyzed by the conventional method can be analyzed according to the present invention. Examples of such substances are enzymes such as γ-glutamyl transpetidase (γ-GTP), basic phosphatase and transglycosidase; protein hormones such as thyrolde-35 stimulating hormone (TSH), luteinization hormone (LH), human chorion gonadotropin (HCG), insulin, secretin and growth hormone (GH); plasma proteins, such as fibrin degradation product (FDP), C-reactive protein (CRP), α-acidic glycoprotein (α ^ -AG), a ^ -antitrypsin (a ^ -AT), 8200631 -10-a ^ -plasmine inhibitor (α ^ -ΡΙ) tp ^ microglobulin (-MG) and immunoglobulin; carcinoembryonic proteins such as α-fetoprotein (AFP), carcinoembryonic antigen (CEA) and embryonic ferritin; and lymphocytes and bacterial cells, cell surface antigens, cell fractions, etc.

5 Omdat met het reagens volgens de uitvinding de volgorde van de reacties tussen het onoplosbaar gemaakte antilichaam, het te analyseren antigeen en het gelabelde antilichaam in het geheel niet beperkt is, is het ook mogelijk om het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam vooraf te mengen. Meer in het bijzonder is het mo-10 gelijk dat onoplosbaar gemaakt antilichaam, gebonden aan een drager, bijvoorbeeld kunststofkorrels enz., en gelabeld antilichaam zich in hetzelfde vat bevinden, bijvoorbeeld een proefbuis, of is het ook mogelijk om antilichaam te binden aan de binnenwand van een geschikt vat, bijvoorbeeld een proefbuis, die zelf dient als onoplosbare drager en 15 waarbij zich dan gelabeld antilichaam daarin bevindt. Het gelabeld antilichaam kan de vorm van een oplossing of een gelyofiliseerd produkt van de oplossing alsook de vorm van tabletten, granules of poeders hebben.Since with the reagent according to the invention the order of the reactions between the insolubilized antibody, the antigen to be analyzed and the labeled antibody is not limited at all, it is also possible to premix the insolubilized antibody and the labeled antibody . More specifically, insolubilized antibody bound to a support, for example, plastic beads, etc., and labeled antibody may be in the same vessel, for example, a test tube, or it is also possible to bind antibody to the inner wall of a suitable vessel, for example a test tube, which itself serves as an insoluble carrier and in which there is then labeled antibody. The labeled antibody may be in the form of a solution or a lyophilized product of the solution as well as in the form of tablets, granules or powders.

Behalve het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam, kan het reagens volgens de uitvinding verschillende hulpstoffen 20 bevatten om zijn bruikbaarheid te verhogen. Dit kunnen bijvoorbeeld een middel voor het oplossen van het gelabelde antilichaam (wanneer het als gelyofiliseerd produkt wordt toegepast), een wasvloeistof voor het wassen van de vaste fase na de reactie van het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het te analyseren antigeen en na verdere reactie van 25 het gelabelde antilichaam, een substraat voor het meten van de enzymatische activiteit van het middel voor het labelen (wanneer dit een enzym is), en een reactiestopper voor de enzymatische reactie zijn.In addition to the insolubilized antibody and the labeled antibody, the reagent of the invention may contain various auxiliaries to enhance its utility. These may be, for example, an agent for dissolving the labeled antibody (when used as a lyophilized product), a washing liquid for washing the solid phase after the reaction of the insolubilized antibody and the antigen to be analyzed and after further reaction of 25. the labeled antibody, a substrate for measuring the enzymatic activity of the labeling agent (when it is an enzyme), and a reaction stopper for the enzymatic reaction.

De uitvinding zal thans aan de hand van uitvoeringsvoorbeelden van de uitvinding nader worden toegelicht.The invention will now be further elucidated on the basis of exemplary embodiments of the invention.

30 Voorbeeld I.Example I.

Een reagens voor AFP analyse, a) Bereiding van gezuiverd AFP.A reagent for AFP analysis, a) Preparation of purified AFP.

Men verkreeg 16,2 g ruw AFP extract uit 5 liter ascites van hepatoma patiënten door uitzouten met ammonium sulfaat (fractie tussen 45 %16.2 g of crude AFP extract was obtained from 5 liters of ascites of hepatoma patients by salting out with ammonium sulfate (fraction between 45%

35 en 70 % verzadiging werd verzameld). Het ruwe extract werd gezuiverd door affiniteit chromatografie onder toepassing van 50 ml sefarose 4 B35 and 70% saturation was collected). The crude extract was purified by affinity chromatography using 50 ml Sepharose 4B

8200531 -11- waaraan konijnen anti-AFP antilichamen waren gefixeerd (1 mg/ml sefarose) teneinde 924 mg gezuiverd AFP te verkrijgen.8200531-11 to which rabbit anti-AFP antibodies were fixed (1 mg / ml sepharose) to obtain 924 mg of purified AFP.

b) Bereiding van monoclonale anti-AFP antilichamen.b) Preparation of anti-AFP monoclonal antibodies.

5 Men immuniseerde een vrouwtjes BALB/C muis door subcutane injectie van SU yg van het onder a) verkregen gezuiverde AFP tezamen met compleet Freund's adjuvans. De immunisatie werd vier maal met tussenpozen van een week herhaald. De milt werd op de vierde dag na de laatste immunisatie verwijderd, en miltcellen werden verzameld. De milt- 10 cellen werden gewassen met Dulbecco's gemodificeerd MEM cultuurmedium 0 verder afgekort als D-MEM). Men telde 1 x 10 van deze cellen en mengde 7 met 1 x 10 muizen myeloma cellen (P3-NSI/l-Ag 4.1). Ze werden gedurende 1 minuut bij 37 C in 1 ml D—MEM dat 42,5 % polyethyleenglycol 77^ 1540 en 7,5 % dimethylsulfoxyde bevatten, aan celfusie onderworpen. Aan cfealdus 15 aan celfusie onderworpen cellen werd 20 ml HAT-medium toegevoegd (RPMI-1640 medium dat hypoxanthine,aminopterine, thymidine, en 10% foetal runderserum bevatte). Nadat 0,2 ml porties van het celmengsel waren gebracht in een microplaat met 96 putten en gedurende twee weken waren gekweekt, werden de antilichaamtiters van de bovendrijvende vloeistoffen 20 in de putten bepaald.A female BALB / C mouse was immunized by subcutaneous injection of SU yg of the purified AFP obtained under a) together with complete Freund's adjuvant. Immunization was repeated four times at weekly intervals. The spleen was removed on the fourth day after the last immunization, and spleen cells were collected. The spleen cells were washed with Dulbecco's modified MEM culture medium (further abbreviated as D-MEM). 1 x 10 of these cells were counted and 7 mixed with 1 x 10 mouse myeloma cells (P3-NSI / 1-Ag 4.1). They were cell fused for 1 minute at 37 ° C in 1 ml D-MEM containing 42.5% polyethylene glycol 775-1540 and 7.5% dimethyl sulfoxide. Cells fused to cells 15 ml of HAT medium was added (RPMI-1640 medium containing hypoxanthine, aminopterin, thymidine, and 10% fetal bovine serum). After 0.2 ml aliquots of the cell mixture were placed in a 96-well microplate and cultured for two weeks, the antibody titers of the supernatants in the wells were determined.

Daarna werden de cellen in de putten waarin de antilichamen werden waargenomen, respectievelijk toegevoegd aan 40 ml RPMI-1640 medium, bevattende 10 % foetal runderserum en thymocytes van BALB/c muizen. Porties van de verkregen celuspensie werden in twee microplaten met 25 96 putten gebracht en gedurende een week gekweekt om 9 klonen van anti-AFP antilichaam-producerende hybridoma te verkrijgen. Ze werden overgebracht in grootschalige culturen en telkens 10 liter van de verkregen bo/endri jvende vloeistoffen werd aan affiniteit chromatografie onderworpen onder toepassing van 50 ml sefarose 4 B, gefixeerd met ge-30 zuiverd AFP (0,5 mg AFP/ml sefarose). Als resultaat werden 4,2 tot 11,6 mg monoclonale antilichamen verkregen die aangeduid werden als series No's 1 tot 9.Then, the cells in the wells in which the antibodies were observed were added to 40 ml RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum and thymocytes from BALB / c mice, respectively. Portions of the resulting cell suspension were placed in two 96-well microplates and grown for one week to obtain 9 clones of anti-AFP antibody-producing hybridoma. They were transferred to large scale cultures and each 10 liters of the resulting supernatants were affinity chromatographed using 50 ml Sepharose 4 B fixed with purified AFP (0.5 mg AFP / ml Sepharose). As a result, 4.2 to 11.6 mg of monoclonal antibodies were designated as Series Nos. 1 to 9.

c) Identificatie van antigeen-herkennende plaatsen.c) Identification of antigen-recognizing sites.

i) Bereiding van anti-AFP antilichaam-gesensibiliseerde proefbuizen.i) Preparation of anti-AFP antibody-sensitized test tubes.

35 Fysiologische zoutoplossingen, die gebufferd waren met 0,05M35 physiological saline solutions buffered with 0.05M

fosfaat (pB 6,4; verder afgekort als PBS) die respectievelijk 0,2 mg van de monoclonale anti-AFP antilichamen Series No's 1 tot 9 bevatten, 8200631 -12- werden in een hoeveelheid van 2 ml toegevoegd aan polystyreen proefbuizen die met PBS waren gewassen. Daarna werden de buizen gedurende 20 minuten bij 56°C geincubeerd en met PBS gewassen om gesensibiliseerde proefbuizen te verkrijgen.phosphate (pB 6.4; further abbreviated as PBS) containing 0.2 mg of the monoclonal anti-AFP antibodies Series Nos 1 to 9, respectively, 8200631 -12- in an amount of 2 ml were added to polystyrene test tubes containing PBS were washed. The tubes were then incubated at 56 ° C for 20 minutes and washed with PBS to obtain sensitized test tubes.

5 ii) Bereiding van enzym-gelabelde anti-AFP antilichamen.Ii) Preparation of enzyme-labeled anti-AFP antibodies.

Men loste 5 mg mierikswortel peroxidase (kwaliteit 1 van Boehringer Mannheim GMBH; verder afgekort als HRPO) op in 1,0 ml 0,3M natriumbicarbonaat buffer en aan deze oplossing voegde men 0,1 ml 1 % ethanoloplossing van l-fluoro-2, 4-dinitrobenzeen toe en het mengsel 10 liet men gedurende 1 uur reageren.5 mg of horseradish peroxidase (grade 1 from Boehringer Mannheim GMBH; further abbreviated as HRPO) was dissolved in 1.0 ml of 0.3M sodium bicarbonate buffer and 0.1 ml of 1% ethanol solution of 1-fluoro-2 was added to this solution. Add 4-dinitrobenzene and the mixture was allowed to react for 1 hour.

Vervolgens werd 1,0 ml 0,06M natriumperiodaat-oplossing toegevoegd en liet men gedurende 30 minuten reageren. Daarna werd 1,0 ml 0,16M ethyleenglycol oplossing toegevoegd en werd de reactie gedurende 1 uur uitgevoerd. Het reactiemengsel werd gedialyseerd tegen 0,01M 15 natriumcarbonaat oplossing bij een pH 9,5. Aan de verkregen oplossing werden elk van de negen onder b) verkregen series van anti-AFP lichamen toegevoegd in een hoeveelheid van 5 mg en men liet het mengsel gedurende 3 uur bij kamertemperatuur reageren. Daarna werd 5 mg natrium borohydride toegevoegd, en werd de reactie gedurende een nacht 20 uitgevoerd. De reactiemengsels werden respectievelijk gedialyseerd tegen 0,0lM PBS bij een pH 7,2 om HRPO-gelabelde anti-AFP antilichamen te verkrijgen.Then 1.0 ml of 0.06M sodium periodate solution was added and allowed to react for 30 minutes. Then 1.0 ml of 0.16M ethylene glycol solution was added and the reaction was carried out for 1 hour. The reaction mixture was dialyzed against 0.01M sodium carbonate solution at pH 9.5. To the resulting solution, each of the nine series of anti-AFP bodies obtained under b) was added in an amount of 5 mg and the mixture was allowed to react at room temperature for 3 hours. Then 5 mg of sodium borohydride was added, and the reaction was carried out overnight. The reaction mixtures were dialyzed against 0.01M PBS at pH 7.2, respectively, to obtain HRPO-labeled anti-AFP antibodies.

iii) Identificatie van de antigeen-herkennende plaatsen.iii) Identification of the antigen recognizing sites.

Aan elk van de anti-AFP antilichamen-gesensibiliseerde proef-25 buizen, verkregen onder i) voegde men toe 1,5 ml PBS, 0,1 ml standaardoplossing van het onder a) verkregen AFP welke verdund was met PBS tot 100 ng/ml en 0,4 ml HRPO-gelabelde anti-AFP antilichamen/verkregen onder ii) en 100-voudig verdund, en men liet het mengsel gedurende 30 minuten reageren. Na de reactie werd de proefbuis met wasvloeistof ge-30 wassen, en werd 3 ml substraatoplossing die 100 mg/dl o-fenyleendiamine en 0,01 % waterstofperoxyde bevatte toegevoegd. De enzymreactie werd gedurende 30 minuten uitgevoerd,en daarna werd 0,05 ml 4M zwavelzuur toegevoegd om de enzymreactie te stoppen. De absorbantie van het reactiemengsel bij 450 nm werd gemeten. In tabel C zijn de combinaties die een 35 positieve reactie indiceerden, aangegeven met +, en die welke geen reactie indiceerden aangegeven met -.1.5 ml PBS, 0.1 ml standard solution of the AFP obtained under a) diluted with PBS to 100 ng / ml, were added to each of the anti-AFP antibody-sensitized test tubes obtained under i). and 0.4 ml HRPO-labeled anti-AFP antibodies / obtained under ii) and diluted 100-fold, and the mixture was allowed to react for 30 minutes. After the reaction, the test tube was washed with washing liquid, and 3 ml of substrate solution containing 100 mg / dl o-phenylenediamine and 0.01% hydrogen peroxide was added. The enzyme reaction was run for 30 minutes, then 0.05 ml of 4M sulfuric acid was added to stop the enzyme reaction. The absorbance of the reaction mixture at 450 nm was measured. In Table C, the combinations indicating a positive reaction are indicated by +, and those indicating no reaction are indicated by -.

8200631 i -13- TABEL C.8200631 i -13- TABLE C.

| HRPQ-gelabeld antilichaam 5 i ________ ; 1 2. 3 -4 '5 6 7 :8 9 11--- + -4-- + + 10 121--- + - + - + + iö l (ΰ * % \ 3 \ - - - + - + - + + -H ! üj ‘ 4J 4·!+ + + — + + + — — c i tö | jj 51--- + - + - + + _ ^ i 15 ε 6 + + + + + - + + + £ :| HRPQ-labeled antibody 5 i ________; 1 2. 3 -4 '5 6 7: 8 9 11 --- + -4-- + + 10 121 --- + - + - + + iö l (ΰ *% \ 3 \ - - - + - + - + + -H! Üj '4J 4!! + + + - + + + - - ci tö | yy 51 --- + - + - + + _ ^ i 15 ε 6 + + + + + - + + + £:

Di j m 71- -- + - + - + + rö ; (ö i 8 i + + + — + + + — — t o ï ί o 9 + + + — + + + — — 20 i oThis is 71- - + - + - + + rö; (ö i 8 i + + + - + + + - - t o ï ί o 9 + + + - + + + - - 20 i o

Door de verschillen in antigeen-herkennende plaatsen, kunnen de 9 series monoclonale anti-AFP antilichamen die onder b) zijn verkregen, 25 in drie groepen worden ingedeeld, namelijk de eerste groep bestaande uit de series No's 1, 2, 3, 5 en 7, de tweede groep, bestaande uit serie No.Due to the differences in antigen-recognizing sites, the 9 series of monoclonal anti-AFP antibodies obtained under b) can be divided into three groups, namely the first group consisting of series Nos 1, 2, 3, 5 and 7 , the second group, consisting of series No.

6 en de derde groep bestaande uit series No’s 4, 8 en 9. Deze antilichamen groepen werden respectievelijk aangeduid als anti-AFP antilichamen [A], [B] en [C].6 and the third group consisting of series Nos. 4, 8 and 9. These antibody groups were designated as anti-AFP antibodies [A], [B] and [C], respectively.

30 d) Bereiding van een reagens voor AFP analyse.D) Preparation of a reagent for AFP analysis.

Anti-AFP antilichaam-gesensibiliseerde proefbuizen werden gemaakt met de methode volgens c-i) onder toepassing van het monoclonale antilichaam [A].Anti-AFP antibody-sensitized test tubes were made by the method of c-i) using the monoclonal antibody [A].

Het monoclonale antilichaam [C] werd gelabeld met HRPO met de me-35 thode volgens c-ii) , en met PBS tot 1 : 10 verdund. Twee ml van het verdunde gelabelde antilichaam werd in de gesensibiliseerde proefbuis gebracht. Nadat de inhoud van de proefbuis was gelyofiliseerd, werd hij afgedicht om een reagens voor AFP analyse te verkrijgen.The monoclonal antibody [C] was labeled with HRPO by the method of c-ii), and diluted to 1:10 with PBS. Two ml of the diluted labeled antibody was placed in the sensitized test tube. After the contents of the test tube were lyophilized, it was sealed to obtain a reagent for AFP analysis.

8200531 -14- * > e) Analyse van AFP.8200531 -14- *> e) Analysis of AFP.

Men voegde 1,8 ml PBS toe aan de onder d) verkregen anti-AFP-antilichaam-gesensibiliseerde proefbuis,en daarna werd 0,1 ml van de standaardoplossing van AFP verkregen onder a) en verdund tot een con-5 centratie van 1000, 100, 10, 1 en 0 ng/ml met het serum van een gezonde persoon, toegevoegd, gevolgd door een verdere toevoeging van 0,1 ml van een oplossing van het HRPO-gelabelde anti-AFP antilichaam,verkregen onder d), in 2 ml gedistilleerd water. De reactie werd gedurende 20 minuten uitgevoerd. Na de reactie werd de proefbuis gewassen met 10 fysiologische zoutoplossing die 0,005 % Tween 20 bevatte (verder aangeduid als wasmiddel). Daarna werd 3 ml enzymsubstraatoplossing die 5 mg/ml o-fenyleendiamine en 0,01 % waterstofperoxyde bevatte, toegevoegd en werd gedurende 10 minuten gereageerd. Men voegde 0,05 ml 4N zwavelzuur aan het reactiemengsel toe om de enzymreactie te stoppen.1.8 ml of PBS was added to the anti-AFP antibody-sensitized test tube obtained under d), and then 0.1 ml of the standard solution of AFP obtained under a) was diluted to a concentration of 1000, 100, 10, 1 and 0 ng / ml with the serum of a healthy subject, added, followed by a further addition of 0.1 ml of a solution of the HRPO-labeled anti-AFP antibody, obtained under d), in 2 ml of distilled water. The reaction was run for 20 minutes. After the reaction, the test tube was washed with physiological saline containing 0.005% Tween 20 (further referred to as detergent). Then 3 ml of enzyme substrate solution containing 5 mg / ml o-phenylenediamine and 0.01% hydrogen peroxide was added and reacted for 10 minutes. 0.05 ml of 4N sulfuric acid was added to the reaction mixture to stop the enzyme reaction.

15 De absorbantie bij 450 nm van het reactiemengsel werd met een fotometer gemeten. De resulterende standaardkromme is in figuur 6 getoond. Voorbeeld II.The absorbance at 450 nm of the reaction mixture was measured with a photometer. The resulting standard curve is shown in Figure 6. Example II.

Een reagens voor CEA analyse.A reagent for CEA analysis.

a) Bereiding van gezuiverd CEA.a) Preparation of purified CEA.

20 Men homogeniseerde 40 g kankerweefsels van de dikke darm met een homogenisator na toevoeging van 100 ml gedistilleerd water. Dezelfde hoeveelheid van 1,2M perchloorzuur werd aan het homogenisaat toegevoegd, en hij werd gedurende 30 minuten onder roeren geëxtraheerd. De gecentrifugeerde bovendrijvende vloeistof werd gedialyseerd tegen gedistilleerd 25 water waarbij een ruw CEA extract werd verkregen.40 g of colon cancer tissues were homogenized with a homogenizer after addition of 100 ml of distilled water. The same amount of 1.2M perchloric acid was added to the homogenizate and extracted with stirring for 30 minutes. The centrifuged supernatant was dialyzed against distilled water to obtain a crude CEA extract.

• Het ruwe extract werd tot 10 ml geconcentreerd en aan gelfil- tratie onderworpen onder toepassing van sefarose 4B, geëquilibreerd met fysiologische zoutoplossing en de eerste fractie werd verzameld. Deze werd opnieuw aan geifiltratie over sefadex G-200 dat op dezelfde wijze 30 geëquilibreerd was, onderworpen en de tweede fractie werd verzameld.The crude extract was concentrated to 10 ml and gel-filtered using Sepharose 4B, equilibrated with physiological saline and the first fraction was collected. This was again filtrated over sefadex G-200 equilibrated in the same manner and the second fraction was collected.

Deze werd geconcentreerd door 2 ml waarin 135 yg gezuiverd CEA werd verkregen.This was concentrated by 2 ml to obtain 135 µg of purified CEA.

b) Bereiding van monoclonale anti-CEA antilichamen.b) Preparation of monoclonal anti-CEA antibodies.

Men verkreeg 8 klonen van anti-CEA antilichaam-producerende 35 hypridoma door het onder a) verkregen gezuiverde CEA te gebruiken op een soortgelijke wijze als in voorbeeld I b).8 clones of anti-CEA antibody-producing hypridoma were obtained by using the purified CEA obtained under a) in a similar manner as in Example 1 b).

Muizen werden geïmmuniseerd mt 30 yg gezuiverd CEA in elke im-Mice were immunized with 30 µg purified CEA in each im

QQ

munisatie. Intraperitoneaal werden 1 x 10 hybridoma geënt in een 8200631 -15- vrouwtjes BALB/c muis waaraan intraperitoneaal 0,5 ml pristaan (2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecaan; een produkt van Wako Pure Chemicals, Co. Ltd.) was toegediend. Twee weken later werd de ascites verzameld. De ascites werd aan chromatografie over DEAE-cellulose, geëquilibreerd met 5 0,01M fosfaatbuffer bij een pH 7,0 onderworpen,en men verkreeg een niet geadsorbeerde fractie als monoclonaal anti-CEA antilichaam.munization. Intraperitoneally, 1 x 10 hybridoma were inoculated into an 8200631-15 female BALB / c mouse administered intraperitoneally 0.5 ml pristane (2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecane; a product of Wako Pure Chemicals, Co. Ltd.) . The ascites was collected two weeks later. The ascites were subjected to chromatography on DEAE cellulose, equilibrated with 0.01M phosphate buffer at a pH 7.0, and an unadsorbed fraction was obtained as anti-CEA monoclonal antibody.

Door een proef voor het identificeren van antigeen-herkennende plaatsen, welke vrijwel overeenstemde met die van I-c), konden de verkregen antilichamen worden ingedeeld in drie groepen van 5 series, 2 10 series en 1 serie, die respectievelijk aangeduid werden als anti-CEA antilichamen [A], [B] en [C].By an assay for identifying antigen-recognizing sites, which was almost similar to that of Ic), the antibodies obtained were classified into three groups of 5 series, 2 series and 1 series, which were respectively designated as anti-CEA antibodies [A], [B] and [C].

c) Bereiding vein anti-CEA antilichaam-gesensibiliseerde proefbuizen.c) Preparation of anti-CEA antibody-sensitized test tubes.

Polystyreen proefbuizen werden elk gewassen met PBS, en 2 ml van het anti-CEA antilichaam [A] (1 mg/ml), verkregen onder b) werd 15 daarin gebracht en gedurende 20 minuten bij 56°C gereageerd. Na de reactie werd de proefbuis gewassen met PBS om een anti-CEA antilichaam [A]-gesensibiliseerde proefbuis te verkrijgen.Polystyrene test tubes were each washed with PBS, and 2 ml of the anti-CEA antibody [A] (1 mg / ml) obtained under b) was placed therein and reacted at 56 ° C for 20 minutes. After the reaction, the test tube was washed with PBS to obtain an anti-CEA antibody [A] -sensitized test tube.

d) Bereiding van een reagens voor CEA analyse.d) Preparation of a reagent for CEA analysis.

Men verkreeg HRPO-gelabeld anti-CEA antilichaam [B] door het 20 onder b) verkregen anti-CEA antilichaam [B] te gebruiken overeenkomstig voorbeeld I-c-ii). Het gelabelde antilichaam werd met fysiologische zoutoplossing tot 1:50 verdund; en 0,2 nlvan het verdunde antilichaam werd in elk van de onder c) verkregen anti-CEA antilichaam- [A]-gesenataLi-seerde proefbuizen gebracht en gelyofiliseerd om een reagens voor 25 de CEA-analyse reagens te vormen.HRPO-labeled anti-CEA antibody [B] was obtained by using the anti-CEA antibody [B] obtained under b) according to example I-c-ii). The labeled antibody was diluted to 1:50 with physiological saline; and 0.2 µl of the diluted antibody was placed into each of the anti-CEA antibody [A] -senatized test tubes obtained under c) and lyophilized to form a reagent for the CEA analysis reagent.

e) Analyse van CEA.e) Analysis of CEA.

Het onder a) verkregen gezuiverde CEA werd verdund met het serum van een gezonde persoon tot een concentratie van respectievelijk 100, 30, 10, 3 en 1 ng/ml. Men voegde 0,2 ml van elk van het verdunde CEA 30 en 0,8 ml gedistilleerd water gelijktijdig toe aan het onder d) verkregen CEA analyse reagens en reageerde gedurende 20 minuten onder roeren. Na de reactie werd de proefbuis gewassen met het wasmiddel en daarna werd 3 ml van een substraatoplossing die 300 mg/dl floretinezuur en 0,01 % waterstofperoxyde bevatte, toegevoegd. De reactie werd gedu-35 rende 10 minuten uitgevoerd en daarna werd 0,1 ml 5 % natriumsulfiet toegevoegd om de enzymreactie te stoppen. Vervolgens werd de fkiorescen-tie-intensiteit gemeten bij een excitatie golflengte van 323 nm en een fluorescentie golflengte van 420 nm met behulp van een fluorofotometer.The purified CEA obtained under a) was diluted with the serum of a healthy subject to a concentration of 100, 30, 10, 3 and 1 ng / ml, respectively. 0.2 ml of each of the diluted CEA 30 and 0.8 ml of distilled water were added simultaneously to the CEA analysis reagent obtained under d) and reacted with stirring for 20 minutes. After the reaction, the test tube was washed with the detergent and then 3 ml of a substrate solution containing 300 mg / dl phloretic acid and 0.01% hydrogen peroxide was added. The reaction was run for 10 minutes and then 0.1 ml of 5% sodium sulfite was added to stop the enzyme reaction. Subsequently, the fluorescence intensity was measured at an excitation wavelength of 323 nm and a fluorescence wavelength of 420 nm using a fluorophotometer.

8200631 -16-8200631 -16-

De resulterende standaardkromme is in figuur 7 getoond.The resulting standard curve is shown in Figure 7.

Voorbeeld III.Example III.

Een reagens voor HCG-p-analyse.A reagent for HCG-p analysis.

a) Bereiding van HCG-β subeenheid.a) Preparation of HCG-β subunit.

5 Men loste 1 g HCG (2000 iu/mg) op in 2 ml 0,025M fosfaatbuffer (pH 5,6), en de oplossing werd door chromatografie over DEAE-sefadex A-50 (3 g), welke tevoren met dezelfde buffer geëquilibreerd was, ge-fractioneerd. Een met 0,05M fosfaatbuffer (pH 5,6) geëlueerde fractie werd verzameld en gedialyseerd tegen gedistilleerd water, waarbij een 10 oplossing werd verkregen die 308 mg gezuiverd HCG bevatte dat daarna gelyofiliseerd werd. Men loste 300 mg van het gelyofiliseerde HCG op in 10 ml 10M ureum (pH 4,5) en reageerde gedurende 1 uur bij 40°C. Het reactiemengsel werd door chromatografie DEAE-sefadex A-50 (2 g), dat vooraf geëquilibreerd was met een oplossing die 0,03M glycine en 10M 15 ureum bevatte, gefractioneerd. Een fractie die geëlueerd was met een oplossing die 0,2M glycine, lM NaCl en 8M ureum bevatte, werd gedialyseerd tegen een fysiologische zoutoplossing waarbij 147 mg HCG-β subeenheid werd verkregen.5 g of HCG (2000 iu / mg) were dissolved in 2 ml of 0.025M phosphate buffer (pH 5.6), and the solution was chromatographed on DEAE-sefadex A-50 (3 g) which had been equilibrated with the same buffer fractionated. A fraction eluted with 0.05M phosphate buffer (pH 5.6) was collected and dialyzed against distilled water to give a solution containing 308 mg of purified HCG which was then lyophilized. 300 mg of the lyophilized HCG were dissolved in 10 ml of 10M urea (pH 4.5) and reacted at 40 ° C for 1 hour. The reaction mixture was fractionated by chromatography DEAE-sefadex A-50 (2 g) pre-equilibrated with a solution containing 0.03M glycine and 10M urea. A fraction eluted with a solution containing 0.2M glycine, 1M NaCl and 8M urea was dialyzed against physiological saline to yield 147 mg of HCG-β subunit.

b) Bereiding van anti-HCG-β antilichamen.b) Preparation of anti-HCG-β antibodies.

20 Er werden elf series anti-HCG-β antilichamen geproduceerd vol gens de methode van Voorbeeld Il-b), behalve dat Wistar-stam ratten werden gebruikt als dieren voor toediening van het antigeen in plaats van de BALB/c muizen. De antigeen-herkenningsplaatsen van deze antilichamen werden nagenoeg overeenkomstig de methode van Voorbeeld I-c) 25 geïdentificeerd. De resulterende antilichamen werden in twee groepen ingedeeld, namelijk een groep bestaande uit acht series anti-HCG-β antilichamen [A] en de andere groep bestaande uit drie series anti-HCG-β antilichamen [B].Eleven series of anti-HCG-β antibodies were produced according to the method of Example Il-b), except that Wistar strain rats were used as animals to administer the antigen instead of the BALB / c mice. The antigen recognition sites of these antibodies were identified substantially according to the method of Example I-c). The resulting antibodies were divided into two groups, one consisting of eight series of anti-HCG-β antibodies [A] and the other group consisting of three series of anti-HCG-β antibodies [B].

c) Bereiding van anti-HCG^-antilichamen-gesensibiliseerde korrels 30 (onoplosbare drager)c) Preparation of anti-HCG-antibodies-sensitized granules (insoluble carrier)

Men voegde 100 polyetheen korrels toe aan 100 ml PBS dat 50 mg van het onder b) geproduceerde anti-HCG^-antilichaam [A] bevatte, en liet gedurende 20 minuten bij 56°C reageren. Daarna werden de polyetheenkorrels gewassen om anti-HCG-β antilichaam [A]-gesensibili-35 seerde korrels te verkrijgen.100 polyethylene beads were added to 100 ml PBS containing 50 mg of the anti-HCG1 antibody [A] produced under b) and reacted at 56 ° C for 20 minutes. The polyethylene beads were then washed to obtain anti-HCG-β antibody [A] -sensitized beads.

d) Bereiding van enzym-gelabelöë anti-HCG-β antilichamen.d) Preparation of Enzyme Gelabelo Anti-HCG-β Antibodies.

Men herhaalde dezelfde methode als in Voorbeeld I-c-ii), onder toepassing van de onder b) geproduceerde anti-HCG-β antilichamen [B·].The same method as in Example I-c-ii) was repeated, using the anti-HCG-β antibodies [B ·] produced under b).

8200631 -17-8200631 -17-

Na verdunning tot 200 maal het volume met PBS, werden HRPO-gelabelde. anti-HCG-β antilichamen [B] verkregen.After dilution to 200 times the volume with PBS, HRPO-labeled. anti-HCG-β antibodies [B] obtained.

e) Bereiding van wasmiddel.e) Preparation of detergent.

Men woog precies 9 g NaCl en 50 ml Tween 20 af, en loste op in 5 gedeioniseerd water om 100 ml van een oplossing te vormen. De oplossing werd in een flesje gebracht dat vervolgens met een stop werd afgedacht. Aldus werd een wasmiddel verkregen.Exactly 9 g of NaCl and 50 ml of Tween 20 were weighed out and dissolved in 5 deionized water to form 100 ml of a solution. The solution was placed in a vial which was then plugged. A detergent was thus obtained.

f) Bereiding van enzymsubstraat.f) Preparation of enzyme substrate.

Men mengde en verpoederde in een mortier 25,40 g 5-aminosalicyΙ-ΙΟ zuur, 54,34 g monokaliumfosfaat en 5,72 g dinatriumfosfaat. Men woog precies 550 mg van het mengsel af, en bracht dit in een flesje. Men verdunde 1,5 ml waterstofperoxyde (30 % oplossing) met gedeioniseerd water tot 100 ml. Men bracht 1 ml van de oplossing in een ampul die daarna door smelten werd afgedicht. Aldus werd een enzymsubstraat be-15 reid.25.40 g of 5-amino salicylic acid, 54.34 g of monopotassium phosphate and 5.72 g of disodium phosphate were mixed and powdered in a mortar. Exactly 550 mg of the mixture was weighed out and placed in a bottle. 1.5 ml of hydrogen peroxide (30% solution) were diluted with deionized water to 100 ml. 1 ml of the solution was placed in an ampoule, which was then sealed by melting. An enzyme substrate was thus prepared.

g) Bereiding van een stopper voor de enzymreactie.g) Preparation of an enzyme reaction stopper.

Men woog precies 2 g natriumazide af en loste dit op in 100 ml gedistilleerd water. Men bracht 2 ml van de oplossing in een ampul, die daarna door smelten werd afgedicht om een stopper voor de enzym-20 reactie te verkrijgen.Exactly 2 g of sodium azide were weighed out and dissolved in 100 ml of distilled water. 2 ml of the solution was placed in an ampoule, which was then sealed by melting to obtain an enzyme reaction stopper.

h) Bereiding van een analysereagens voor HCG.h) Preparation of an analysis reagent for HCG.

Een analysereagens voor HCG werd bereid door de onder c) tot g) geproduceerde materialen op de volgende wijze te gecomboneren.An analysis reagent for HCG was prepared by combining the materials produced under c) to g) in the following manner.

1. Anti-HCG-β antilichaam [A]-gesensibiliseerde korrels 25 2. HRPO-gelabeld anti-HCG-β antilichaam [B] 3. Wasmiddel (tienvoudig geconcentreerde oplossing) 4. Enzymsubstraat (5-aminosalicylzuur-waterstofperoxyde) 5. Stopper voor de enzymreactie i) Analyse van HCG.1. Anti-HCG-β antibody [A] -sensitized beads 25 2. HRPO-labeled anti-HCG-β antibody [B] 3. Detergent (tenfold concentrated solution) 4. Enzyme substrate (5-aminosalicylic hydrogen peroxide) 5. Stopper for the enzyme reaction i) Analysis of HCG.

30 De volgende analyse werd uitgevoerd onder toepassing van het onder h) verkregen reagens voor HCG-analyse. Men nam 0,4 ml van het HRPO-gelabelde anti-HCG-β antilichaam [B] in een proefbuis, en voegde een anti-HCG-β antilichaam [A]-gesensibiliseerde korrel toe. Daarna werd 0,1 ml van een standaardoplossing toegevoegd, verkregen door HCG be-35 schreven in de Japanse Pharmacopoeia te verdunnen met het serum van een gezonde persoon tot een concentratie van respectievelijk 10.000, 1.000, 100, 10 en 1 miu/ml, en reageerde gedurende 15 minuten .Na de reactê werd·, het wasmiddel verdund tot 10 x zijn volume met gedestilleerd water ,en verd 3200631 -18- de korrel gewassen met het verdunde wasmiddel. Daarna werd 3 ml van de substraatoplossing, bereid door alle enzymsubstraat op te lossen in 150 ml gedistilleerd water, toegevoegd en werd de reactie gedurende 30 minuten uitgevoerd. Vervolgens werd 0,025 ml van de stopper toegevoegd 5 om de reactie te stoppen, en werd de absorbantie van het reactiemengsel bij 500 nm gemeten. De resulterende standaardkromme word;in figuur 8 getoond.The following analysis was performed using the reagent for HCG analysis obtained under h). 0.4 ml of the HRPO-labeled anti-HCG-β antibody [B] was taken in a test tube, and an anti-HCG-β antibody [A] -sensitized bead was added. Then, 0.1 ml of a standard solution was obtained, obtained by diluting HCG described in the Japanese Pharmacopoeia with the serum of a healthy person to a concentration of 10,000, 1,000, 100, 10 and 1 ml / ml, respectively, and reacted for 15 minutes. After the reaction, the detergent was diluted to 10 times its volume with distilled water, and the grain was washed with the diluted detergent. Then, 3 ml of the substrate solution, prepared by dissolving all the enzyme substrate in 150 ml of distilled water, was added and the reaction was carried out for 30 minutes. Then 0.025 ml of the stopper was added to stop the reaction, and the absorbance of the reaction mixture at 500 nm was measured. The resulting standard curve is shown in Figure 8.

8200631 .........................8200631 .........................

Claims (9)

1. Reagens voor immunologische analyse van antigenen, gebaseerd op de sandwich-methode, met het kenmerk, dat het onoplosbaar gemaakt monoclo-naal antilichaam en gelabeld monoclonaal antilichaam omvat, waarbij de monoclonale antilichamen respectievelijk in staat zijn om verschillende 5 antigeen determinanten van een te analyseren antigeen te onderscheiden en daaraan te binden.1. Reagent for immunological analysis of antigens, based on the sandwich method, characterized in that it comprises the insolubilized monoclonal antibody and labeled monoclonal antibody, the monoclonal antibodies being able to detect different antigenic determinants of one, respectively. analyze antigen to distinguish and bind to it. 2. Reagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat korrels of een vat van kunststof of glas gebruikt worden als drager van het onoplosbaar gemaakte antilichaam.Reagent according to claim 1, characterized in that granules or a vessel of plastic or glass are used as a carrier of the insolubilized antibody. 3. Reagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat een enzym gebruikt wordt als middel voor het labelen bij het produceren van het gelabelde antilichaam.Reagent according to claim 1, characterized in that an enzyme is used as a means of labeling in producing the labeled antibody. 4. Reagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat een fluorescerend materiaal gebruikt wordt als middel voor het labelen bij het produ- 15 ceren van het gelabelde antilichaam.Reagent according to claim 1, characterized in that a fluorescent material is used as a means for labeling in the production of the labeled antibody. 5. Reagens volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het gelabelde antilichaam en het onoplosbaar gemaakte antilichaam zich in een vat bevinden.Reagent according to claim 1, characterized in that the labeled antibody and the insolubilized antibody are in a vessel. 6. Reagens volgens conclusies 1 of 5, met het kenmerk, dat het ge- 20 labelde antilichaam zich bevindt in een kunststof- of glazen vat dat als drager van het onoplosbaar gemaakte antilichaam wordt gebruikt.Reagent according to claims 1 or 5, characterized in that the labeled antibody is contained in a plastic or glass vessel used as a carrier of the insolubilized antibody. 7. Reagens volgens conclusies 1, 5 of 6, met het kenmerk, dat het gelabelde antilichaam gelyofiliseerd is.Reagent according to claims 1, 5 or 6, characterized in that the labeled antibody is lyophilized. 8. Reagens voor immunologische analyse van antigenen, gebaseerd op 25 de sandwich-methode, met het kenmerk, dat het onoplosbaar gemaakt monoclonaal antilichaam en gelabeld monoclonaal antilichaam omvat, welke monoclonale antilichamen respectievelijk in staat zijn om verschillende antigeen determinanten van een te analyseren antigeen te onderscheiden en daaraan te binden, alsmede 1 tot 4 hulpmiddelen, gekozen uit de groep 30 oplosmiddel, wasmiddel, substraat en reactiestopper, omvat.8. Reagent for immunological analysis of antigens, based on the sandwich method, characterized in that it comprises the insolubilized monoclonal antibody and labeled monoclonal antibody, which monoclonal antibodies are respectively able to analyze different antigen determinants of an antigen to be analyzed. distinguishing and binding thereto, as well as comprising from 1 to 4 auxiliaries selected from the group 30 of solvent, detergent, substrate and reaction stopper. 9. Verbeterde sandwich-methode voor immunologische analyse van antigenen, met het kenmerk, dat onoplosbaar gemaakt antilichaam en gelabeld antilichaam gelijktijdig met een te analyseren antigeen reageren, waarbij 82 0 0 6 3 1 “..........................‘ -20- het onoplosbaar gemaakte antilichaam en het gelabelde antilichaam mono-clonale antilichamen omvatten die in staat zijn om verschillende antigeen determinanten van het antigeen te onderscheiden en respectievelijk aan verschillende antigeen determinanten te binden. 8200631 --.....—9. Improved sandwich method for immunological analysis of antigens, characterized in that insoluble antibody and labeled antibody react simultaneously with an antigen to be analyzed, whereby 82 0 0 6 3 1 “........... ................ -20- the insolubilized antibody and the labeled antibody comprise monoclonal antibodies capable of distinguishing different antigen determinants from the antigen and different antigen, respectively. bind determinants. 8200631 --.....—