JPS61213670A - Method for measuring human alpha2-plasmin inhibitor - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To make exactly and quickly measurement by fixing a monoclonal antibody which conjugates specifically with a human alpha2-plasmin inhibitor and a labeling antibody to an insoluble carrier as an immunological measurement reagent by a sandwich method. CONSTITUTION:The monoclonal antibody which can conjugate specifically with the position of the human alpha2-plasmin inhibitor where the fibrinolysis of plasmin is to be inhibited is fixed to the insoluble carrier (plastic, etc.). The monoclonal antibody is cultured from hybridoma cells. A specimen sample (human blood-plasma, etc.) and the labeling antibody are then brought into contact with the insoluble carrier. The human alpha2-plasmin inhibitor in the sample is conjugated with the monoclonal fixed to the carrier and further the labeling antibody is conjugated thereto. The labeled material is measured and the human alpha2-plasmin inhibitor is detected. Since the monoclonal antibody conjugating specifically therewith is used, the exact measurement is made possible without receiving the influence of extraneous materials.

Description

【発明の詳細な説明】[Detailed description of the invention]

１、産業上の利用分野 本発明は、溶液状態にある、さらにはヒト血漿中のヒト
ループラスミンインヒビタ−（ａ、　−ｐｌａｓ−ｍｉ
ｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ　、　ａ、　−ａｎｔｉｐｌａ
ｍｍｉｎ　）を免疫学的に６１１定する方法に関する。 ヒト−−プラスミンインしビターのそれぞれ異なる抗原
決定部位をＩ！＃異的に認識して結合する２種類のモノ
クローナル抗体を用い、そのうちの１種類は、ヒトα２
−プラスミンインヒビターにおけるプラスミンの線維素
溶解作用の阻止部位を特異的Ｋ１１ａ！識して結合し得
るモノクローナル抗体を用いるサンドインチ法によるヒ
トへ一プラスミンインヒビターの免疫学的測定方法に関
する。 更に詳しくは、前記いずれか一方の抗体を不溶性担体に
結合せしめ、標識抗体とヒトα。 −プラスミンインしビターを含む試料とを同時に接触さ
せることによるヒトαオープラスミンインヒビタ−の免
疫学的測定方法に関する。 ｂ、従来技術 ヒトの央−プラスミンインヒビタ−は、背水と饋井によ
って鍛初に檗離・精製され、線維巣溶解酵素のプラスミ
ン（ｐｌａｓ＋ｎｉｎ　）のエステラーゼ活性を瞬間的
に阻害する強力なプラスミンインヒビタ−であり、１１
．７％の糖を含む分子量約６７，０００の１本鎖の＄１
！白質であることが知うわているＣ　Ｍｏｒｏｉ　＆　
Ａｏｋｉ　；Ｔｈ＠Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌ　Ｃｈ＠ｍ１ｓｔｒｙ　＋２５１．５９５６
−５９６５（１９７６）参照〕。 一方ヒトの〜−プラスミンインしビターには３槽−の活
性部位があることが知られている。第１はプラスミンの
１Ｉｌｉ！＃１索溶解作用を阻止する部位（以下これを
１リアクテイグサイド′ということがある）　（Ｂ、Ｗ
ｉｍａｎ　＆　Ｄ、Ｃｏ−１１＊ｎ　；　Ｔｈ＠Ｊｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈａｍｌ−
ｓｔｒｙ　　＋　　２５４．９２９１〜９２９７　（１
９７９）＃照〕であり、ＩＲ２はカルボキシル基末端側
のプラスミン結合部位（Ｂ、Ｗｉｍａｎ　＆　Ｄ、Ｃｏ
１１ａｎ　；Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＋　８４　＋５７３−５
７８（１９７８）参照〕であり、第３はアミ７基末端の
フィブリン結合部位である［　Ｙ、５ａｋａｔａ＋ｓｔ
　ａｌ、＋　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓ＠ａｒｃｈ
＋１６．２７９〜２８２（１９７９）参照〕。 ヒト−−プラスミンインヒビタ−は、線維素溶解機構に
対して、特異的に制御と調節を行なっており、その機構
に対してＮ４１な作用をしていることが知られている〔
例えば、青木延雄、医学のあゆみ、１２６．１４７−１
５５（１９８３）参照〕。 喝−プラスミンインヒビタ−の低下の臨床的な意義は重
要であり、例えば、央−プラスミンインヒビタ−が著し
く減少すると、生じたプラスミン活性が制御されず、血
管損ｖｋＫよって形成された止血血栓が血管壁の修傷以
前に溶解されてしまい、止血がうまくいかなくなること
が知られている。 α、−プラスミンインヒビタ−が低下する疾患および病
態としては、以下のことが知られている。すなわち、消
費による低下としては、汎発性血管向凝固（ＤＩＣ）、
血栓溶解療法（つａキデーゼ療法等ンが、また、産生の
低下としては、肝実質障害などがあげられる。 特に、非代償期の肝硬変、激症肝炎などの時には、その
血中レベルは、非常に顕著に低ドすることが報告されて
いる〔例えばＮ、Ａｏｋｉ＆　Ｔ、Ｙａｍａｎａｋａ　
、　Ｃ１１ｎ　Ｃｈｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ　８４　、９
９−１０５（１９７８）参照〕。 従って、血液中のヒトａ、−プラスミンインヒビタ−の
量を正確且つ簡便Ｋ　６１１定することができれば、種
々の病気に対しその予防１診断に極めて役立つと考え得
る。 従来知られたヒトαオープラスミンインヒビタ−の測定
方法とし”ＩＥＩの方法は、ヒトα。 −プラスミンインヒビターに対する抗血清を用いる免疫
拡散法であり、第２の方法は検体試料に一定過剰のプラ
スミンを加えヒトーープラスミンインヒビターと結合し
ていない残存プラスミン活性を測定する方法である。 しかし、前者の方法は、動柳抗血清を用いるために一定
の活性を有する抗血清を安定して得ることが極めて困難
であり標準匍質によって活性を補正して使用しなければ
ならないという煩雑さがあった。また免疫拡散に長時間
を要するという欠点があった。さらに後者は、加えたプ
ラスミンの残存量を調べることによりヒトαオープラス
ミンインヒビタ−の童を間接的に測定する方法であり、
検体試料中に存在する椙々のプラスミン活性阻害物質の
影響を受は易（、ヒトループラスミンインしビターの量
を直接測定していないから誤差を避けるのは不可能と云
ってよく、またこの方法では使用するプラスミンの純度
や安定性にも注意を払う必要があった。 Ｃ０発明の構成 本発明者らは、ヒトαオープラスミンインヒビタ−に対
するモノクローナル抗体について研究を重ねたどころ、
ヒトα、−プラ、スミンインヒビターにおけるプラスミ
ンの線維素溶解作用阻止部位なｑ＃異的に認識し、ヒト
−−プラスミンインヒビタ−の線維素溶解阻止作用を抑
制する活性な有するモノクローナル抗体を見出し、また
このモノクローナル抗体を産生ずるハイプリドーマ細胞
を創作し得、既に提案した。 また、さらに、サンドインチ法罠よる免疫学的測定試薬
において、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とは、
ヒトループラスミンインヒビタ−のそれぞれ異なる抗原
決定部位を特異的に認識するものであり且つそのいずれ
か一方の抗体は、ヒトへ一プラスミンインヒビターにお
けるリアクティブサイト（活性部位）を特異的（認識し
て結合し得るモノクローナル抗体であることを％做とす
るヒトーープラスミンインヒビターに対するモノクロー
ナル抗体を用いたヒトら一プラスミンインヒビターの免
疫学的測定試薬及びキットに関して既に提案した。 本発明者は、か〜るサンドイッチ法による免疫学的測定
方法の改良について研究を重ねた結果、本発明に到達し
たものである。すなわち、本発明は不溶性担体ＫＭ合し
た抗体と＊ｍ抗体とは、ヒト央−プラスミンインヒビタ
ーのそれぞれ異なる抗原決定部位を特異的に＆ｌ繊する
ものであり、且つそのいずれか一方の抗体は、ヒトへ一
プラスミンインヒビターにおけるプラスミンの線維素溶
解作用の阻止部位を特異的にｇ處して結合し得る七／り
ａ−ナル抗体であり、＊繊抗体とヒト血漿検体とを同時
に不溶性担体（結合した抗体く接触させることを特徴と
する、ヒト血漿検体中の央−プラスミンインヒビタ−の
測定方法である。 かくして本発明によれば、試薬の品質差がなく、恒常的
に精度よく溶液状癲の（例えば血漿中の）ヒトαオープ
ラスミンインヒビタ−を簡単に測定することが可能とな
る。 また直接ヒトヘープラスミンインヒビターを測定するの
で、他の挟雑物の影響は全く受けず、正ａ［且つ短時間
に測定することができる。 次に本発明によるヒトへ一プラスミンインヒビターの含
有量の測定方法を具体的に説明する。 ヒト−−プラスミンインしビターに対するモノクローナ
ル抗体（第１抗体）を適当な不溶性担体（例えばプラス
チック容器）Ｋ固定化する（以下これを１固定北枕体′
という）。 ついで不溶性担体と測定しようとする試薬又は検体試料
との非特異的結合を避けるために、適当な物質（例えば
牛血清アルブミン）で不溶性担体の表面を植機する。こ
のよう（して得られた第１抗体が固定化された不溶性担
体を、検体試料（例えばヒト血漿ンと適当な標識物質で
標識したヒトα２−プラスミンインヒビターに対するモ
ノクローナル抗体（第２抗体ンとを同時に、好ましくは
両者の混合溶液を一定時間及び一定温度で接触させ反応
させる。ついで適当な洗浄液で洗った後、不溶性担体上
に存在する第２抗体に標識されたａｍ吻質の量を測定す
る。かくしてその値から、検体試料中の一−プラスミン
インヒビターの量を算出することかできる。 か〜る本発明による測定方法（ｏｎｅ　５ｔｅｐりは、
第１抗体が固定化された不溶性担体を検体試料と一定時
間及び一定温度で反応させ、次いで適当な洗浄液で洗っ
た後、４ｓ織した第２抗体と反応させる測定方法（ｔｗ
ｏ　５ｔｅｐ法）Ｋ比べて、短時間で且つ簡便に測定し
得る利点がある。 本発明の測定試薬に使用される不溶性担体とし1. Industrial Application Field The present invention is directed to the treatment of human luplasmin inhibitor (a, -plasmin inhibitor) in solution state and furthermore in human plasma.
n 1nhibitor, a, -antipla
This invention relates to a method for immunologically determining 611 mmin). Human-- Plasmin is inserted into each of the different antigen-determining sites of bitter. #Using two types of monoclonal antibodies that recognize and bind differently, one of which is human α2
- Specific K11a is the site of inhibition of the fibrinolytic action of plasmin in plasmin inhibitors! The present invention relates to a method for immunologically measuring a plasmin inhibitor in humans using a sandwich method using a monoclonal antibody that can recognize and bind to a human plasmin inhibitor. More specifically, one of the antibodies described above is bound to an insoluble carrier, and the labeled antibody and human α are combined. - An immunological method for measuring human α-oplasmin inhibitor by simultaneously contacting a sample containing plasmin and bitter. b. Prior art Human plasmin inhibitor is a strong plasmin inhibitor that is firstly isolated and purified by Sesui and Fukui, and instantly inhibits the esterase activity of plasmin (plasmin + nin), a fibril-dissolving enzyme. , 11
．． Single chain $1 with a molecular weight of approximately 67,000 containing 7% sugar
! C Moroi &
Aoki ;Th@Journal of Biolo
gical Ch@m1stry +251.5956
-5965 (1976)]. On the other hand, human plasmin is known to have three active sites. The first is 1Ili of plasmin! #1 Part that blocks the lytic action (hereinafter this may be referred to as 1 reacting side') (B, W
iman & D, Co-11*n; Th@Jou
rnal of Biological Chaml-
stry + 254.9291~9297 (1
979) and IR2 is the plasmin-binding site on the terminal side of the carboxyl group (B, Woman & D, Co
11an ;European Journal of
Biochemistry +84 +573-5
78 (1978)], and the third is the fibrin binding site at the terminal of the ami7 group [Y, 5akata+st
al, + Thrombosis Res@arch
+16.279-282 (1979)]. Human plasmin inhibitors are known to specifically control and regulate the fibrinolytic mechanism, and to have an N41 effect on that mechanism.
For example, Nobuo Aoki, History of Medicine, 126.147-1
55 (1983)]. The clinical significance of the decrease in plasmin inhibitor is important. For example, when plasmin inhibitor is significantly decreased, the resulting plasmin activity is not controlled, and the hemostatic thrombus formed due to vascular damage VkK is affected by the repair of the vascular wall. It is known that it dissolves before the wound is formed, making it difficult to stop the bleeding. The following diseases and pathological conditions in which α,-plasmin inhibitor is reduced are known. In other words, the decrease due to consumption includes disseminated vascular coagulation (DIC),
Thrombolytic therapy (e.g., thrombolytic therapy, etc.) can also cause decreased production due to hepatic parenchymal damage. Particularly in cases of decompensated liver cirrhosis, severe hepatitis, etc., blood levels can be extremely low. It has been reported that there is a marked decrease in
, C11n Chimica Acta 84, 9
9-105 (1978)]. Therefore, if the amount of human α-plasmin inhibitor in the blood could be determined accurately and easily, it would be extremely useful for the prevention and diagnosis of various diseases. The conventionally known method for measuring human α-plasmin inhibitor is the IEI method, which is an immunodiffusion method using antiserum against human α-plasmin inhibitor, and the second method involves adding a certain excess of plasmin to a specimen sample. This method measures the residual plasmin activity that is not bound to human plasmin inhibitors. However, the former method uses a cardiac antiserum, which makes it extremely difficult to stably obtain an antiserum with a certain level of activity. However, it was complicated to use after correcting the activity using standard plasmin.It also had the disadvantage of requiring a long time for immune diffusion.Furthermore, the latter method required checking the remaining amount of added plasmin. This is a method for indirectly measuring human α-oplasmin inhibitor in children,
It is easy to be affected by plasmin activity inhibitors present in the specimen sample (it is impossible to avoid errors because the amount of human plasmin and bitter is not directly measured, and this In the method, it was necessary to pay attention to the purity and stability of the plasmin used. Composition of the CO Invention The present inventors have conducted extensive research on monoclonal antibodies against human α-oplasmin inhibitor, and found that
We have discovered a monoclonal antibody that uniquely recognizes q#, the site that inhibits the fibrinolytic action of plasmin in human α, -P, sumin inhibitor, and has the activity of inhibiting the fibrinolytic action of human plasmin inhibitor. Hybridoma cells that produce monoclonal antibodies can be created and have already been proposed. Furthermore, in the immunoassay reagent using the sandwich method trap, the antibody bound to the insoluble carrier and the labeled antibody are
Each antibody specifically recognizes a different antigen-determining site of the human plasmin inhibitor, and one of the antibodies specifically recognizes and binds to the reactive site (active site) of the human plasmin inhibitor. The present inventor has already proposed an immunoassay reagent and kit for human plasmin inhibitor using a monoclonal antibody against human plasmin inhibitor, which is a monoclonal antibody that can be obtained. As a result of repeated research on improving immunological measurement methods, the present invention was achieved.That is, the present invention is based on the fact that the insoluble carrier KM antibody and the *m antibody are different antigens of the human central plasmin inhibitor. and one of the antibodies specifically binds to the site for inhibiting the fibrinolytic action of plasmin in human plasmin inhibitors. This is a method for measuring a central plasmin inhibitor in a human plasma sample, which is characterized by simultaneously bringing the human antibody and the human plasma sample into contact with an insoluble carrier (the bound antibody). According to the invention, it becomes possible to easily measure human α-oplasmin inhibitor in solution form (for example, in plasma) with constant precision without any quality differences in reagents. Since the measurement is carried out, it is completely unaffected by other impurities and can be measured in a short time.Next, the method for measuring the content of human plasmin inhibitor according to the present invention will be explained in detail. A monoclonal antibody (first antibody) against human plasmin is immobilized on a suitable insoluble carrier (e.g., a plastic container) (hereinafter referred to as ``1-immobilized north pillow body'').
). Then, in order to avoid non-specific binding between the insoluble carrier and the reagent or specimen sample to be measured, the surface of the insoluble carrier is implanted with an appropriate substance (for example, bovine serum albumin). The insoluble carrier on which the first antibody obtained in this way is immobilized is mixed with a sample sample (e.g., human plasma) and a monoclonal antibody (second antibody) against human α2-plasmin inhibitor labeled with an appropriate labeling substance. At the same time, preferably, the mixed solution of both is brought into contact with each other for a certain period of time and at a certain temperature to react.Then, after washing with an appropriate washing solution, the amount of am proboscis labeled with the second antibody present on the insoluble carrier is measured. Thus, from the value, the amount of mono-plasmin inhibitor in the specimen sample can be calculated.
A measurement method (tw
o 5tep method) Compared to K, this method has the advantage of being able to be measured easily and in a short time. As an insoluble carrier used in the measurement reagent of the present invention

【は、例
えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、
ポリエステル、ポリアクリルニトリル、フッ素樹脂、架
橋デキストラン、ポリサッカライドなどの高分子、その
他紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合せな
どを例示することができる。 また不溶性担体の形状としては、例えばトレイ状２球状
、繊維状、Ｗ状、盤状、容器状。 セル、試験管などの種々の形状であることができる。 また、標識物質としては、放射性物質、＃累又は蛍光物
質を使用するのが有利である。 放射性物質とシテハ、ｌｌＩ［、ＩＵＩ、　１４ｃ　、
　ａＨナトを、酵素としてはアルカリ性７オスフ７ター
ゼ、パーオキシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなと
、また蛍光物質としてはフルオレツセインインチ才シ７
ネート、テトラメチルａ−ダミンイソチオシ７ネートな
どを使用することができるが、これらは例示したものに
限らず、免疫学的測定方法に使用されているものであれ
ば、他のものでも使用できる。 前述したようＫ、本発明の測定方法に使用される抗体の
１つである１α２−プラスミンインヒビターにおけるプ
ラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に１繊し
て結合し得るモノクローナル抗体′は、本発明者らＫよ
って初めて見出され、先に特許出願された（昭和５９年
４月１７日出願：発明の名称１モノクａ−ナル抗体、へ
イプリドーマ細胞及びモノクローナル抗体の製造方法′
　）。 本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造方法につ
いては前記特許出願明細書に詳細に説明されているが、
以下にその内容を簡単に説明する。 抗原に用いるヒト−−プラスミンイン ヒビタ−は、前記宵木と諸井の方法によりヒト血漿中よ
り単離精製された。 朧Ｂａ１ｂ／ａマウスを用いるが、他の系（ｓ　ｔ　ｒ
　ａ　ｉ　Ｉｔ　ｌ　）のマウスを使用することもでき
る。その際、免疫計画及びヒトα２−プラスミンインヒ
ビターの濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリンパ球が
形成されるよう選ばれるべきである。例えばマウスに少
量の＊トａ、−７’ラスミンインヒビターで成る間隔で
腹腔に数回免疫の後、さらに数回静脈に投与した。鍛終
免疫の数日後に融合の為に膵臓細胞を取り出す。 膵臓を無菌的（取り出し、それから単 細胞ａ濁液を調製する。それらの膵臓細胞を適当なライ
ンからのマウス骨髄腫細胞と適当な融合促進剤の使用に
よりａｍ融合させる。膵臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい
比率は約２０：ｌ〜約２：１の範囲である。約１０６個
の膵臓細胞について０．５〜１．５ｄの融合媒体の使用
が適当である。 細胞融合（用いる骨髄雇細胞は多（知 られているが、本発明では、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−　
Ｕｌ　ｍＭ＆　（以下Ｐ３−　Ｕｌ　ト略記するン（Ｙ
ｓｌｔｏｎ＋ＤＪ　＠ｔ　ａｌ、＋　ＣｕｒｒａｎｔＴ
ｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ
　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８１．１（１９７８）参照〕を
用いた。これは８−７ザグアニン耐性の細胞ラインであ
り、酵素ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトラ
ンスフェラーゼ （ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ　　ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎａｆｅｒａｓｓ　）
が欠失し【おり、それゆえにＨＡＴ　（ヒポキサンチン
、７ミノプテリン、チミジン）培地中では生存しない。 また、この細胞ラインはそれ自体抗体を分泌しない、い
わゆる非分泌証である。 好ましい融合促進剤としては、例えば 平均分子量が１０００〜４０００のポリエチレングリコ
ールを有利に使用できるが、この分野で知られている他
の融合促進剤を使用することもできる。 別の容器内（例えばマイクロタイター プレート）で未融合の膵臓細胞、未融合の骨髄鹿細胞お
よび融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄ＰＩＪ１細
胞を支持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死滅
させるのに十分な時間（約１週間ン培養する。培地は薬
物抵抗性（例えば８−７ザグアニン抵抗性〕で未融合の
骨髄腫細胞を支持しないもの（例えば前記ＨＡＴ培地〕
が使用される。この選択培地中では未融合の骨髄腫細胞
は死滅する。また未融合の膵臓細胞は非臓瘍性細胞なの
である一定期間後（約１週間後）死滅する。 これらに対して融合した細胞は骨髄腫の親細胞のＭｌｊ
）性と親膵臓細胞の性質をあわせ持つために選択培地中
で生存できる。 かくしてハイプリドーマが細胞が検出 された後、その培養上清を採取し、ヒト−−プラスミン
インヒビタ−に対する抗体について酵素免疫定量法（Ｅ
ｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏ　５ｏｒｂｅｎ
ｔ　Ａｓ５ａｙ　）によりスクリーニングする。 Ｆ、ｃＥ、−プラスミンインヒビタ−に対するヒトα２
−プラスミンインヒビターに対する抗体を産生じている
ノーイブリドーマ細胞を、無血清培地で培養して得られ
た抗体を含んだ培養上澄液を濃縮し、ヒトα２−プラス
ミンインヒビターと共に一定時間インキユベートした。 ゛さらにこの〜−プラスミンインヒビターに対する抗体
の混合液にプラスミンを加え、フィブリンプレート上に
のせ、フィブリン溶解面積を測定した。このようにし【
、α、−プラスミンインヒビタ−に対する活性を持つ抗
体を産生するＩ−イブリドーマ細胞を選択する。 目的の抗体を産生ずるノ・イブリドーマ細胞を適当な方
法（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２
つの異なった方法で産生される。その第１の方法によれ
ばハイプリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養する
ことによりその培養上澄から、そのハイプリドーマ細胞
の産生ずるモノクローナル抗体を得ることができる。第
２の方法によればハイグリドーマ細胞は同質遺伝子又は
半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することがで芦
る。一定時開成の宿生動物の血液中及び腹水中より、そ
のハイプリドーマ細胞の産出するモノクローナル抗体を
得ることができる。 上記の如（して得られたモノクローナル抗体は、ヒト−
−プラスミンインヒビタ−におけるプラスミンの線維索
溶解作用の阻止部位な％異的Ｋ認識し、その部位に選択
的に結合する。 本発明の測定試薬においては、か〜るモノクローナル抗
体を第１抗体或いは第２抗体のいずれかに使用する。す
なわち、前記モノクローナル抗体は、不溶性担体に結合
させて固定化抗体として使用することもできるし、また
標識１質を付けて標識抗体としても使用することもでき
る。 前記モノクローナル抗体と共に使用される他の抗体とし
ては、−−プラスミンインヒビタ−における線ｍ素溶解
作用阻止部位以外の部位を認識し、結合し得るものであ
れ＋ｔよ〜・。 以上本発明によれば、ヒ１−α２−プラスミンインヒビ
ターを含む検体（例えばヒト血漿）中のそのインヒビタ
ーの童を正確に且つ容易に測定することが可能である。 以下実施例を掲げて本発明を詳述する。 実施例１ 本実施例で使用した第１及び第２抗体＆家、本発明者ら
が先に出願した明細４ｋ（昭和５９年４月１７日付出願
；発明の名称１モ／りａ−す／し抗体、／ヘイグリドー
マ細胞及び七ツクａ−すＩし抗体の製造方法’）Ｋｆ！
戟された方法によって得られた下記のものを使用した。 第１抗体 前記出願明細書の実施例３において得られた抗体者’Ｉ
Ｄｌ０ＣＩ’を使用し、これを下記の如（不溶性担体（
マイクロタイタープレート〕に固定化させて用いた。こ
の抗体は〜−プラスミンインヒビターにおけるプラスミ
ンの線維ｓ溶解作用の阻止部位（リアクティブサイト）
を特異的に認識し得る七／りａ−ナル抗体である。 第２抗体 前記出願明ｍＩｌの実施例３において得られた抗体者’
ｌＢ１０Ｇ１】′を使用した。この抗体はへ一プラスミ
ンインヒビターにおけるり１クチイブサイト以外の部位
を特異的に認識する七／りａ−ナル抗体であり、アルカ
リ性７オス７アターゼで標識化して使用した。 濃度２０μＭ／Ｌｌのヒト−−プラスミンインヒビター
におけるリアクティブサイトを特異的（＆ｉａするモノ
クローナル抗体（ＩＤＩＯＣＩンをマイクロタイタープ
レート上に４℃で一晩放置し、固定化した。これＫ　Ｏ
，５％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝食塩水（以下
ｏ、ｓ　％　ＢＳＡ−ＰＢＳと略する〕を′加え、室温
で２時間放置後、０．５％ＢＳＡ−ＰＢＳで３回況浄し
た。次にリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈したヒト血
漿と、濃度３２９　ｎｌ／ｄのアルカリ性７オス７アタ
ーゼ標ｔｌ＆したモノｌ　ａ−？ルに体（ＩＢＩＯＧＩ
ＩＪｔ＆合したｓｇを加え、室温で２時間反応した。 ０．５９６　ＢＳＡ　−ＰＢＳで洗浄後、アルカリ性）
オスファターゼ基質溶敷を１．０ダ／ｄの濃度で加え、
２０分間室温で反応後、ＩＶＩＩｃＲＯＰＬ、ＡＴＥＰ
ＨＯＴＯＭＥＴＥＲで波長４０５　ｎｍにおける吸光度
を測定した。精裏−−プラスミンインヒビター樟品を用
いて検量線を作成し、その検量線から、患者血漿検体中
の〜−プラスミンインヒビター量（μｇ７ｍ）を算出し
た。添付図面に検量線を示し、患者血漿検体中の一−プ
ラスミンインヒビター量を下記表にまとめて示す。 −−プラスミンインヒビタ−（ｈ−ＰＩ）の濃度と吸光
度との関係は直線性があり、この測定法によれば血漿中
のへ一プラスミンインヒビター量を正確に測定すること
ができる。[For example, polystyrene, polyethylene, polypropylene,
Examples include polymers such as polyester, polyacrylonitrile, fluororesin, crosslinked dextran, and polysaccharide, as well as paper, glass, metal, agarose, and combinations thereof. In addition, the shape of the insoluble carrier is, for example, tray-shaped, bispherical, fibrous, W-shaped, disc-shaped, or container-shaped. It can be in various shapes such as cells, test tubes, etc. Furthermore, it is advantageous to use a radioactive substance, a radioactive substance, or a fluorescent substance as the labeling substance. Radioactive substances and shiteha, llI [, IUI, 14c,
The enzymes are alkaline 7-osphtase, peroxidase, and β-D-galactosidase, and the fluorescent substance is fluorescein.
ate, tetramethyl a-damine isothiocys7ate, etc., but these are not limited to those exemplified, and other substances used in immunoassay methods can also be used. As mentioned above, the monoclonal antibody' that can specifically bind to the site that inhibits the fibrinolytic action of plasmin in 1α2-plasmin inhibitor, which is one of the antibodies used in the measurement method of the present invention, is It was first discovered by the present inventors, K., and a patent application was filed earlier (Application filed on April 17, 1981: Title of the invention 1. Monoclonal antibody, haploidoma cells, and method for producing monoclonal antibody'
). The monoclonal antibody of the present invention and the method for producing the same are explained in detail in the patent application specification,
The contents will be briefly explained below. The human plasmin inhibitor used as the antigen was isolated and purified from human plasma by the method of Yoki and Moroi. Oboro Ba1b/a mice are used, but other strains (s tr
It is also possible to use a mouse. The immunization regimen and the concentration of human α2-plasmin inhibitor should then be chosen so that a sufficient number of antigen-stimulated lymphocytes are formed. For example, mice were immunized intraperitoneally several times at intervals consisting of a small amount of *toa,-7' lasmin inhibitor, followed by intravenous administration several times. A few days after the final immunization, pancreatic cells are removed for fusion. The pancreas is removed aseptically and a single-cell suspension prepared from it. The pancreatic cells are fused with mouse myeloma cells from the appropriate line by the use of an appropriate fusion promoter. Preferred ratios range from about 20:1 to about 2:1.Using 0.5 to 1.5 d of fusion medium for about 106 pancreatic cells is appropriate.Cell fusion (the bone marrow cells used are (Although known, in the present invention, P3-X63-Ag8-
UlmM& (hereinafter abbreviated as P3-Ul)
slton+DJ @tal,+CurrantT
topics in Microbiology and
1 mmunology 81.1 (1978)] was used. This is an 8-7 zaguanine resistant cell line that is resistant to the enzyme hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (hypoxanthine-guanine ph
osphoribosyltranaferass)
is deleted and therefore does not survive in HAT (hypoxanthine, 7-minopterin, thymidine) medium. Furthermore, this cell line itself does not secrete antibodies, and is a so-called non-secretor. As a preferred fusion promoter, for example polyethylene glycol having an average molecular weight of 1000 to 4000 can be advantageously used, but other fusion promoters known in the art can also be used. In a separate container (e.g., a microtiter plate), dilute the mixture of unfused pancreatic cells, unfused bone marrow deer cells, and fused cells with selective medium that does not support unfused bone marrow PIJ1 cells, and remove the unfused cells. Culture for a sufficient period of time (about 1 week) to kill cells. The medium is drug resistant (e.g. 8-7 zaguanine resistant) and does not support unfused myeloma cells (e.g. HAT medium).
is used. Unfused myeloma cells die in this selective medium. In addition, unfused pancreatic cells are non-incer cells and die after a certain period of time (about one week). The cells fused to these are myeloma parent cells Mlj
) and have the properties of parent pancreatic cells, so they can survive in selective media. After hybridoma cells have been detected, the culture supernatant is collected and analyzed for antibodies against human plasmin inhibitors by enzyme immunoassay (E).
nzymeLinked Immuno 5orben
tAs5ay). F,cE,-human α2 to plasmin inhibitor
- Noibridoma cells producing antibodies against plasmin inhibitors were cultured in a serum-free medium, and the resulting culture supernatant containing antibodies was concentrated and incubated with human α2-plasmin inhibitor for a certain period of time. ``Furthermore, plasmin was added to this mixture of antibodies against plasmin inhibitor, placed on a fibrin plate, and the fibrin lysis area was measured. Do it like this [
, α, -Ibridoma cells producing antibodies with activity against the plasmin inhibitor are selected. When hybridoma cells that produce the desired antibody are cloned using an appropriate method (e.g. limited dilution method), the antibody is
produced in two different ways. According to the first method, monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells can be obtained from the culture supernatant by culturing the hybridoma cells in an appropriate medium for a certain period of time. According to a second method, hyglidoma cells can be injected into the peritoneal cavity of isogenic or semi-isogenic mice. Monoclonal antibodies produced by hybridoma cells can be obtained from the blood and ascites of a host animal at a certain time. The monoclonal antibodies obtained as described above are human
- Plasmin inhibitor - recognizes the site of inhibition of plasmin's fibrinolytic action and selectively binds to that site. In the measurement reagent of the present invention, such a monoclonal antibody is used as either the first antibody or the second antibody. That is, the monoclonal antibody can be bound to an insoluble carrier and used as an immobilized antibody, or can be attached with a label and used as a labeled antibody. Other antibodies that can be used in conjunction with the monoclonal antibody include those that can recognize and bind to sites other than the linear lytic action blocking site in the plasmin inhibitor. As described above, according to the present invention, it is possible to accurately and easily measure the concentration of human 1-α2-plasmin inhibitor in a sample containing the inhibitor (for example, human plasma). The present invention will be described in detail below with reference to Examples. Example 1 The first and second antibodies used in this example, Specification 4K (filed on April 17, 1980; title of the invention 1Mo/Risu/ Kf!
The following materials obtained by the method described above were used. First antibody: Antibody 'I' obtained in Example 3 of the above application specification
Dl0CI' was used as described below (insoluble carrier (
microtiter plate]. This antibody is ~ - site for blocking the fibrinolytic action of plasmin in plasmin inhibitor (reactive site)
This is a hepta/oral antibody that can specifically recognize . Second antibody Antibody obtained in Example 3 of the above-mentioned application mIl
lB10G1]' was used. This antibody is a 7/a-nal antibody that specifically recognizes a site other than the 1 cut site in he1 plasmin inhibitor, and was used after being labeled with alkaline 7 male 7 atase. A monoclonal antibody (IDIOCI) specific for reactive sites in human plasmin inhibitor at a concentration of 20 μM/Ll was left on a microtiter plate overnight at 4°C to immobilize it.
, phosphate buffered saline containing 5% bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as o,s% BSA-PBS) was added, and after being left at room temperature for 2 hours, it was washed three times with 0.5% BSA-PBS. Next, human plasma diluted in phosphate-buffered saline (PBS) and alkaline 7 male 7 atase standard tl'
IJt & combined sg were added and reacted at room temperature for 2 hours. 0.596 BSA - After washing with PBS, alkaline)
Add osphatase substrate solution at a concentration of 1.0 da/d,
After reaction at room temperature for 20 minutes, IVIIcROPL, ATEP
Absorbance at a wavelength of 405 nm was measured using HOTOMETER. A calibration curve was created using Seiura--plasmin inhibitor 樟品, and the amount of ~-plasmin inhibitor (μg 7m) in the patient's plasma sample was calculated from the calibration curve. A calibration curve is shown in the attached drawing, and the amount of mono-plasmin inhibitor in patient plasma samples is summarized in the table below. --The relationship between the concentration of plasmin inhibitor (h-PI) and absorbance is linear, and according to this measurement method, the amount of hei-plasmin inhibitor in plasma can be accurately measured.

【図面の簡単な説明】[Brief explanation of the drawing]

添付図面は、検体中のヒト−−プラスミンインヒビタ−
の濃度と吸光度変化との関係を示すものである。The attached drawing shows the human plasmin inhibitor in the sample.
This shows the relationship between the concentration of and the change in absorbance.

Claims (1)

【特許請求の範囲】 １、サンドイッチ法による免疫学的測定方法において、
不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とは、ヒトα＿２
−プラスミンインヒビターのそれぞれ異なる抗原決定部
位を特異的に認識するものであり、且つそのいずれか一
方の抗体は、ヒトα＿２−プラスミンインヒビターにお
けるプラスミンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に
認識して結合し得るモノクローナル抗体であり、標識抗
体とヒト血漿検体とを、不溶性担体に結合した抗体に同
時に接触させることを特徴とする、ヒト血漿検体中のα
＿２−プラスミンインヒビターの測定方法。 ２、該標識抗体が、酵素、放射性同位元素又は蛍光物質
で標識化された抗体である第１項記載のヒトα＿２−プ
ラスミンインヒビターの測定方法。[Claims] 1. In an immunoassay method using a sandwich method,
The antibody bound to the insoluble carrier and the labeled antibody are human α_2
- Each antibody specifically recognizes a different antigen-determining site of the plasmin inhibitor, and one of the antibodies specifically recognizes the site that blocks the fibrinolytic action of plasmin in the human α_2-plasmin inhibitor. α in a human plasma sample, which is a monoclonal antibody that can bind, and is characterized by simultaneously contacting the labeled antibody and the human plasma sample with the antibody bound to an insoluble carrier.
_2-Method for measuring plasmin inhibitor. 2. The method for measuring human α_2-plasmin inhibitor according to item 1, wherein the labeled antibody is an antibody labeled with an enzyme, a radioisotope, or a fluorescent substance.