JPS6134465A - Immunoassay reagent and kit using monoclonal antibody against human alpha2-plasmin inhibitor - Google Patents
Immunoassay reagent and kit using monoclonal antibody against human alpha2-plasmin inhibitorInfo
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- JPS6134465A JPS6134465A JP15399384A JP15399384A JPS6134465A JP S6134465 A JPS6134465 A JP S6134465A JP 15399384 A JP15399384 A JP 15399384A JP 15399384 A JP15399384 A JP 15399384A JP S6134465 A JPS6134465 A JP S6134465A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
ａ、産業上の利用分野
本発明は、溶液状態にあるプラスミン−ヒトα、−プラ
スミンインヒビター複合体（ｐｌａｓｍｉｎ −ａ、
−ｐｌａｓｍｉｎ １ｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅ
ｘ ＋ ｐｌａｓｍｉｎ−ａ、 −ａｎｔｉｐｌａｓｍ
ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ）を免疫学的に測定する試薬及
びそのキットに関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION a. Industrial Application Field The present invention relates to a plasmin-human α,-plasmin inhibitor complex (plasmin-a,
-plasmin 1nhibitor complete
x + plasmin-a, -antiplasm
The present invention relates to reagents and kits for immunologically measuring (in complex).
更に詳しくは、ヒトα２−プラスミンインヒビターを特
異的に認識して結合するモノクローナル抗体とプラスミ
ン（ｐｌａｓｍｉｎ） ヲｉ！ ｌ＆ して結合し得る
抗体を用いるサンドイッチ法によるプラスミン−ヒトα
２−プラスミンインヒビター複合体の免疫学的測定試薬
及びそのキットに関する。More specifically, monoclonal antibodies that specifically recognize and bind to human α2-plasmin inhibitor and plasmin! Plasmin-human α by sandwich method using antibodies capable of binding
The present invention relates to an immunological assay reagent for 2-plasmin inhibitor complex and a kit thereof.
ｂ、従来技術
ヒトのα、−プラスミンインヒビタ−は、青水と路弁に
よって最初に単離・ＮｊＩｌ！され、線ｍｓ溶解酵素の
プラスミン（ｐｌａｓｍｉｎ ） のエステラーゼ活
性を瞬間的に阻害する強力なプラスミンインヒビタ−で
あり、１１．７Ｎの糖を含む分子量約６７、（１００の
１本鎖の糖蛋白質であることが知られているＣ Ｍｏｒ
ｏｉ ＆Ａｏｋｔ ； ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 、 ２５
１ 、５９５６−５９６５（１９７６）参照〕。b. Prior Art Human α,-plasmin inhibitor was first isolated by Qingui and Ryoben.NjIl! It is a strong plasmin inhibitor that instantly inhibits the esterase activity of plasmin, a cytolytic enzyme, and is a single-chain glycoprotein with a molecular weight of approximately 67 (100) containing 11.7N sugar. is known as C Mor
oi&Aokt ; The Journal of
Biological Chemistry, 25
1, 5956-5965 (1976)].
−１ヒトのα−−プラスミンインヒビタ−には３ａ類の
活性部位があることが知られている。第１はプラスミン
の線維素溶解作用を阻止する部位（以下これを１す７ク
テイブサイド”ということがある） （Ｂ、Ｗｉｍａｎ
＆Ｄ、 Ｃｏ１１ｅｎ ； Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
＋２５４．９２９１〜９２９７（１９７９）参照〕
であり、第２はカルボキシル基末端側のプラスミン結合
部位ＣＢ 、’Ｗｉｍａｎ ＆ Ｄ、 Ｃｏ１１ｅｎ
； ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔ ８４ ＋ ５７３−５７８（１
９７８）参照〕であり、第３はアミ７基末端のフィブリ
ン結合部位である（ Ｙ、５ａｋａｔａ ＋ｅｔａｌ−
＋ ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓＲｅｇｅａｒｃｈ ＋ １６
２７９〜２８２（１９７９）参照〕、。It is known that the -1 human α-plasmin inhibitor has a class 3a active site. The first is a site that blocks the fibrinolytic action of plasmin (hereinafter referred to as the "cutive side") (B, Woman
&D, Co11en; The Journal
of Biological Chemistry
+254.9291-9297 (1979)]
The second is the plasmin binding site CB on the carboxyl group terminal side, 'Woman & D, Co11en
;European Journal of Bioc
hemistry t 84 + 573-578 (1
978)], and the third is the fibrin binding site at the end of the amide 7 group (Y, 5akata + etal-
+ Thrombosis Research + 16
279-282 (1979)].
ヒトα２−プラスミンインヒビタ−は、プラスミン活性
をけとんど瞬間的に阻害し、α、−プラスミンインヒビ
タ−は、プラスミンと１：ｌの割合で結合し複合体を形
成する。Human α2-plasmin inhibitor inhibits plasmin activity almost instantaneously, and α,-plasmin inhibitor binds to plasmin at a ratio of 1:1 to form a complex.
（Ｂ 、Ｗｉｍａｎ ＆ Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ ； Ｔ１
１ｒ； Ｊｏｕｒｎａｋ ｏｆ Ｂ ｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ ｉＣｂｅｍｉａｔｒｙ ＋２６４ ＋ ９
２９１〜９２９７ （１９７９） ＋Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ
ｓ ’ｌ’ｈｒａｍｔ＋ｏｇｉｓ ａｎｄ ）
ｆａｅｒｒ＋ｏａｔａｓｉｒ、 ＋ ４ ３ ＋
７ ７−８９（１９８０）＃）￥１）
汎発性血管内凝固ＣＤＩＣ）やつｐキナーゼＨよる血栓
溶解療法など、プラスミノーゲンの活性化のみられる状
態では、生成したプラスミンとα、−プラスミンインヒ
ビタ−は反応し、複合体を形成する。(B, Woman & D, Co11en; T1
1r; Journak of Biologica
l iCbemiatry +264 + 9
291-9297 (1979) +D, Co11en
s'l'hramt+ogis and)
faerr + oatasir, + 4 3 +
7 7-89 (1980) #) ￥1) In conditions where plasminogen is activated, such as during disseminated intravascular coagulation (CDIC) or thrombolytic therapy using p-kinase H, the generated plasmin and α, -plasmin inhibitor react and form a complex.
最近、血漿中のプラスミン−ａ、−プラスミンインヒビ
タ−複合体の定量は、血栓溶解療法のモニターやＤＩＣ
の診断等圧有効であると考えられている（例えばＮ、Ａ
、Ｂｏｏｔｈ ＆ ＋Ｂ＝Ｂｅｎｎｅｔｔ ：
Ｂｒ１ｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａ
ｔｏｌｏｇｙ ＋ ５０ ＊５３７〜５４１（１９８２
）参照）。Recently, quantification of plasmin-a,-plasmin inhibitor complex in plasma has been used for monitoring thrombolytic therapy and for DIC.
The diagnosis of isobaric is considered valid (e.g. N, A
, Booth & +B=Bennett:
Br1tish Journal of Haema
tology + 50 *537-541 (1982
)reference).
従って、血液中のプラスミン−α、−プラスミンインヒ
ビター複合体の量を正確且つ簡便に測定することができ
れば、種々の病気に対してその予防９診断に＆めて役立
つことである。Therefore, if the amount of plasmin-α,-plasmin inhibitor complex in the blood could be measured accurately and easily, it would be extremely useful for the prevention and diagnosis of various diseases.
従来知られたプラスミン−α、−プラスミンインヒビタ
ー複合体の測定方法として、蕗１の方法は二次元交叉免
疫電気泳動を用いる方法であり、第２の方法は抗血清よ
り得た抗体を固定化し、酵素抗体法を応用したいわゆる
サンドイッチ法によるものである。As conventionally known methods for measuring plasmin-α,-plasmin inhibitor complexes, the method of Fuki 1 uses two-dimensional cross-immunoelectrophoresis, and the second method involves immobilizing antibodies obtained from antiserum. This method is based on the so-called sandwich method, which is an application of the enzyme-antibody method.
しかし、ｌ￥ｆＴ者の方法は感度と定量性が低いという
欠点があった。また、後者の方法はきわめて感度が高（
有効な方法であるが、ヒトα２−プラスミンインヒビタ
ーに対する一定の活性を有する抗血清を安定して得るこ
とが極めて困難という欠点かぁ、つた。However, the method used by I¥fT had the drawback of low sensitivity and low quantitative performance. Additionally, the latter method is extremely sensitive (
Although this is an effective method, it has the disadvantage that it is extremely difficult to stably obtain an antiserum with a certain level of activity against human α2-plasmin inhibitor.
・０発明の構成
そこで本発明者らは、ヒトα２−プラスミンインヒビタ
ーに対するモノクローナル抗体について研究を重ねたと
ころ、ヒトａ、−プラスミンインヒビタ−におけるプラ
スミンの線維素溶解作用阻止部位を特異的に認識し、ヒ
トａ、−プラスミンインヒビタ−の線維素溶解阻止作用
を抑制する活性を有するモノクローナル抗体を見出し、
またこのモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマ
細胞を創作し得。・0 Structure of the Invention Therefore, the present inventors conducted repeated research on monoclonal antibodies against human α2-plasmin inhibitor, and found that they specifically recognized the site that inhibits the fibrinolytic action of plasmin in human α2-plasmin inhibitor. a. Discovering a monoclonal antibody that has the activity of suppressing the fibrinolysis-inhibiting effect of a plasmin inhibitor,
We can also create hybridoma cells that produce this monoclonal antibody.
既に提案した、
本発明者らは、か〜る新しく見出した前記モノクローナ
ル抗体の特異的な作用を利用すれば、溶液状態にあるヒ
トα２−プラスミンインヒビターの量を直接に且つ正確
に測定し得ることを見出し本発明に到達した。As already proposed, the present inventors have proposed that by utilizing the newly discovered specific action of the monoclonal antibody, it is possible to directly and accurately measure the amount of human α2-plasmin inhibitor in a solution state. This discovery led to the present invention.
すなわち、本発明の、サンドイッチ法による免疫学的測
定試薬において、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体
とはヒトα２−プラスミンインヒビターを１＆ｉｉ！識
し結合するモノクローナル抗体及び、ヒトプラスミンを
ｌｌｌｉｇｉｉｉ＊Ｌ、結合する抗プラスミノーグル抗
血情の抗体成分である。That is, in the immunoassay reagent using the sandwich method of the present invention, the antibody bound to the insoluble carrier and the labeled antibody are human α2-plasmin inhibitor 1&ii! A monoclonal antibody that recognizes and binds human plasmin, and an anti-plasminoglu antibody component that binds human plasmin.
一般に抗原の２つの異なった位置に結合した抗体を作っ
て抗原の有無又はその童を測定する方法は、サンドイッ
チ法と呼ばれ１例えばワイド（Ｗｉｄｅ）の「放射線免
疫検定法（Ｒａｄｉｏｍｕｎｏａｇａａｙ Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ） Ｊ １９９−２０６ （１９７０）に記載さ
れている、
かくして本発明によれば、試薬の品質差がなく、恒常的
ＫＭ度よく溶液状態の（例えば血Ｊｔ中の）プラスミン
−ａ、−プラスミンインヒビタ−複合体を測定すること
が可能となる。In general, the method of making antibodies that bind to two different positions on an antigen and measuring the presence or absence of the antigen is called the sandwich method.
ds) J 199-206 (1970). Thus, according to the present invention, there is no difference in the quality of the reagents, and the plasmin-a, -plasmin inhibitor in solution (e.g. in blood Jt) can be used at constant KM. - It becomes possible to measure complexes.
また直接プラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複
合体を測定するので他の挾雑物の影響は全く受けず正確
に且つ短時間に測定することができる。従って１本発明
によれば、プラスミン−α、−プラスミンインヒビター
複合体を正確且つ迅速に測定し得る試薬及びそのキット
が提供される。Furthermore, since the plasmin-α2-plasmin inhibitor complex is directly measured, it is not affected by other impurities and can be measured accurately and in a short time. Therefore, according to the present invention, there are provided a reagent and a kit thereof that can accurately and rapidly measure a plasmin-α,-plasmin inhibitor complex.
次に本発明による測定試薬及びプラスミン−α、−プラ
スミンインヒビター複合体の含有量の測定方法を具体的
に説明する。Next, the method for measuring the content of the measuring reagent and plasmin-α,-plasmin inhibitor complex according to the present invention will be specifically explained.
ヒトα２−プラスミンインヒビタ−に対するモノクロー
ナル抗体（第１抗体）を適当な不溶性担体（例えばプラ
スチック容器）に同定化する（以下これを１向定化抗体
”という）。A monoclonal antibody (first antibody) against human α2-plasmin inhibitor is identified on a suitable insoluble carrier (for example, a plastic container) (hereinafter referred to as "one-directed antibody").
ついで不溶性担体と測定しようとする試薬又・は検体資
料との非特異的結合を避けるために適当な物質（例えば
牛血ｆｆフルブミン）で不溶性担体の表面を被＆する。Next, the surface of the insoluble carrier is coated with a suitable substance (for example, bovine blood ff fulbumin) in order to avoid non-specific binding between the insoluble carrier and the reagent or sample material to be measured.
このようＫして得られた第１抗体が固定化された不溶性
担体な検体資料と一定時間及び温度で接触させ反応させ
る。この間に同定化抗体（ｋｌ抗体）と検体資料中のプ
ラスミン゛−Ｑｔ−プラスミンインヒビタ−複合体が結
合する。ついで適当な洗浄液で洗った後、適当な標識物
質で標識したヒトプラスミノーゲンに対する抗体（第２
抗体）の溶液（例えば水溶液）を、不溶性担体における
固定化抗体に結合したプラスミンαヨープラスミンイン
ヒビタ−複合体と一定時間及び温度で接触させ第２抗体
と反応させる１、これを適当な洗浄液で洗い、次いで不
溶性担体上に存在する第２抗体ＫｔｌＡＩ＆された標識
物質の量を測定する。かくしてその値から検体資料中の
プラスミン−α、−プラスミンインヒビター複合体の量
を算出することができる。The first antibody obtained in this manner is brought into contact with a sample material in the form of an insoluble carrier immobilized thereon for a certain period of time and at a certain temperature to cause a reaction. During this time, the identifying antibody (kl antibody) and the plasmin-Qt-plasmin inhibitor complex in the specimen material bind. After washing with an appropriate washing solution, an antibody against human plasminogen (secondary antibody) labeled with an appropriate labeling substance is added.
A solution (e.g., an aqueous solution) of the antibody) is brought into contact with the plasmin α-ioplasmin inhibitor complex bound to the immobilized antibody on the insoluble carrier at a certain time and temperature to react with the second antibody 1. This is washed with an appropriate washing solution, Next, the amount of the labeled substance labeled with the second antibody KtlAI and present on the insoluble carrier is measured. Thus, the amount of plasmin-α,-plasmin inhibitor complex in the specimen material can be calculated from this value.
か（して本発明の測定試薬は、第、ｌ抗体が不溶性担体
に結合した固定化抗体と標識化された第２抗体とより主
として格成される。この試薬を能率よ（且つ簡便に利用
するために。(Thus, the measurement reagent of the present invention mainly consists of an immobilized antibody in which the first antibody is bound to an insoluble carrier, and a labeled second antibody.This reagent can be used efficiently (and conveniently). To do.
これら抗体以外に種々の補助剤を含めてキットを形成す
ることができる。かへる補助剤としては、例えば固体状
の試薬を溶解させるための溶解剤、不溶化担体な洗浄す
るために使用される洗浄剤、抗体の標識物質として酵素
を使用した場合、酵素活性を測定するための基質、その
反応停止剤などの免疫学的測定試薬のキットとして通常
使用されるものが挙げられる。In addition to these antibodies, the kit can include various auxiliary agents. Examples of auxiliary agents for preservation include solubilizing agents for dissolving solid reagents, detergents used for washing insolubilized carriers, and enzymes used as labeling substances for antibodies to measure enzyme activity. Substrates and reaction terminators commonly used as kits for immunoassay reagents are included.
本発明の測定試薬に使用される不溶性担体としては、例
えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリプルピレン、ポ
リエステル、ポリアクリルニトリル、弗素−・脂、架橋
テキストラン、ポリサッカライドなどの高分子、その他
紙、ガラス、金属、アガロース及びこれらの組合せなど
を例示することができる。Examples of insoluble carriers used in the measurement reagent of the present invention include polymers such as polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, fluorine-fat, crosslinked textran, polysaccharide, other paper, glass, metal, Examples include agarose and combinations thereof.
また不溶性担体の形状としては、例えばトレイ状９球状
、ＩＩｍ、錐状９棒状、盤状、容器状。In addition, the shape of the insoluble carrier is, for example, a tray shape, 9 sphere shape, IIm, cone shape, 9 rod shape, disk shape, or container shape.
セル、試験管などの極々の形状であることができる。It can be in extreme shapes such as cells, test tubes, etc.
また標識物質としては放射性物質、Ｗ素又は螢光物質を
使用するのが有利である。防剤性物質としては１２５１
．１３１１．１４Ｃ，３Ｈなどを、酵素としてはアルカ
リ性フォスファターゼ。Furthermore, it is advantageous to use a radioactive substance, W element, or a fluorescent substance as the labeling substance. 1251 as a drug-preventing substance
．． 1311.14C, 3H, etc., and the enzyme is alkaline phosphatase.
パーオキシターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼなと、ま
た螢光物質としてはフルオレツセインインチオシアネー
ト、テトラメチルローグミンインチオシアネートなどを
使用することかで鎗るが、これらは例示したものに限ら
ず、免疫学的測定方法忙使用し得るものであれば、他の
ものでも使用で？！−る。Peroxidase, β-D-galactosidase, and fluorescent substances such as fluorescein inthiocyanate and tetramethylloguminthiocyanate may be used, but these are not limited to the examples listed above. Is it possible to use other methods as long as it is possible to use it? ! -ru.
本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造方法につ
いては、先に特許出願された（昭和５９年４月１７日出
Ｎｉ：発明の名称１モノクロ一ナル抗体、ハイプリドー
マ細胞及び七ツクｐ−ナル抗体の製造方法°′）。Regarding the monoclonal antibody of the present invention and the method for producing the same, a patent application was previously filed (published on April 17, 1982). Manufacturing method °′).
丁
本発明の前記モノクローナル抗体及びその製造方法につ
いては前記特許出願明細書に詳細に説明されている通り
、ヒトα２−プラスミンインヒビターにおけるプラスミ
ンの線維素溶解作用の阻止部位を特異的に認識して結合
し得るモノクローナル抗体である。以下にその内容を簡
単に説明する。As described in detail in the patent application specification, the monoclonal antibody of the present invention and the method for producing the same specifically recognize and bind to the site that inhibits the fibrinolytic action of plasmin in human α2-plasmin inhibitor. It is a monoclonal antibody that can be used to The contents will be briefly explained below.
抗原に用いるヒトα２−プラスミンインヒビターは、前
記青水と路弁の方法によりしト血漿中より単離精製され
た。Human α2-plasmin inhibitor used as an antigen was isolated and purified from human plasma by the method of Seishi and Roben.
雄Ｂａ１ｂ／ｃマウスを用いるが、他の系（ｓ ｔｒａ
ｉｎｓ ）のマウスを使用することもできる。その際
、免疫計画及びヒトα２−プラスミンインヒビターの濃
度は十分な盟の抗原刺激を受けたリンパ球が形成されろ
よう選ばれるべきである。例えばマウスに少量のヒトα
オープラスミンインヒビタ′ｌ
−で成る間隔で腹腔に数回免疫の振、さらに数回静脈に
投与した１、最終免疫の数日後に融合の為に膵臓細胞を
取り出誓″。Male Ba1b/c mice are used, but other strains (stra
You can also use a mouse (ins). The immunization regimen and concentration of human α2-plasmin inhibitor should then be chosen such that sufficient antigen-stimulated lymphocytes are formed. For example, a small amount of human α in a mouse
After several intraperitoneal immunizations with Oplasmin inhibitor'l- at intervals, and several more intravenous administrations, pancreatic cells were removed for fusion a few days after the final immunization.
Ｃ６細胞融合
膵臓を無菌的に取り出し、それから単
細胞懸濁液を調製する。それらの膵臓細胞を適当なライ
ンからのマウス骨髄鹿細胞と適当な融合促進剤の使用忙
より細胞融合させる。膵臓細胞対骨髄腫細胞の好ましい
比率は約２０＝１〜約２＝１の範囲である。約１０６個
の膵臓細胞について０．５〜１．５１１７の融合媒体の
使用が適当である。The C6 cell-fused pancreas is aseptically removed and a single cell suspension is prepared from it. These pancreatic cells are fused with mouse bone marrow deer cells from an appropriate line using an appropriate fusion promoter. A preferred ratio of pancreatic cells to myeloma cells ranges from about 20=1 to about 2=1. It is appropriate to use 0.5 to 1.5117 fusion media for about 106 pancreatic cells.
細胞融合に用いる骨髄腫細胞は多く知
られているが１本発明では、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ
ｌ細胞（以下Ｐ３−Ｕｌ と略記する） 〔Ｙｅｌｔ
ｏｎ＋ Ｄ、Ｅ ｅｔ ａｌ、＋ ＣｕｒｒｅｎｔＴｏ
ｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８１１Ｉ（１９７８）参照〕を用
いた。これは８−７ザグ７ニン耐性の細胞ラインであり
、Ｉ＃Ｌ素ヒボキサンチン−グアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ
（ｈｙｐｏｍｎｔｈｉｎｅ −ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏ
ｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ）
が欠失しており、それゆえにＨＡＴ （ヒボキサンチ
ン、アミノプテリン、チミジン）培地中では生存しない
。Many myeloma cells used for cell fusion are known, but in the present invention, P3-X63-Ag8-U
l cell (hereinafter abbreviated as P3-Ul) [Yelt
on+ D, E et al, + CurrentTo
pics in Microbiology and
Immunology 811I (1978)] was used. This is an 8-7zag7nin resistant cell line and is an I#L hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (hypomnthine-guanine pho
sporibosyltransferase)
is deleted and therefore does not survive in HAT (hyboxanthin, aminopterin, thymidine) medium.
また、この細胞ラインはそれ自体抗体を分泌しない、い
わゆる非分泌屋である。Furthermore, this cell line itself does not secrete antibodies, and is a so-called non-secretor.
好ましい融合促進剤としては、例え・ば平均分子量が１
０００〜４０００のポリエチレングリフールを有利に使
用できるが、この分野で知られている他の融合促進剤を
使用することもできる。For example, a preferable fusion promoter has an average molecular weight of 1
000-4000 polyethylene glyfur may be advantageously used, although other fusion promoters known in the art may also be used.
Ｄ、融合した細胞の選択：
別の容器内（例えばマイクロタイター
プレート）で未融合の膵臓細胞、未融合の骨髄腫細胞お
よび融合した細胞の混合物を、未融合の骨髄腫細胞を支
持しない選択培地で希釈し、未融合の細胞を死滅させる
のに十分な時間（約１週間）培養する。培地は薬物抵抗
性（例えば８−７ザグアニン抵抗性）で未融合の骨髄腫
細胞を支持しないもの（例えば前記ＨＡＴ培地）が使用
される。この選択培地中では未融合の骨髄腹細胞は死滅
する。筺た未融合の膵臓細胞は非ｓ１ｍ性細胞なのであ
る一定期間後（約１週間後）死滅する。D. Selection of fused cells: A mixture of unfused pancreatic cells, unfused myeloma cells, and fused cells in a separate container (e.g., microtiter plate) in a selective medium that does not support unfused myeloma cells. and culture for a sufficient time (about 1 week) to kill unfused cells. The medium used is one that is drug resistant (eg, 8-7 zaguanine resistant) and does not support unfused myeloma cells (eg, the above-mentioned HAT medium). Unfused bone marrow abdominal cells die in this selective medium. The unfused pancreatic cells in the cage are non-s1m cells and die after a certain period of time (about 1 week).
これらに対して融合した細胞は骨髄腫の親細胞の肺癌性
と領膵臓細胞の性質をあわせ持つために選択培地中に生
存できる。Cells fused to these cells can survive in the selective medium because they have both the lung cancerous properties of myeloma parent cells and the properties of pancreatic cells.
かくしてハイプリドーマが細胞が検出
された後、その培養上清を採取し、ヒトａ、−プラスミ
ンインヒビタ−に対する抗体について酵素免疫定量法（
ＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏ ５ｏｒｂｅ
ｎｔ Ａｓ５ａｙ ） Ｋよりスクリーニングする。After hybridoma cells are detected, the culture supernatant is collected and analyzed for antibodies against human a-plasmin inhibitor by enzyme immunoassay (
EnzymeLinked Immuno 5orbe
nt As5ay ) K.
目的の抗体を産生するハイプリドーマ−細胞を適当な方
法（例えば限定希釈法）でクローン化すると、抗体は２
つの異なつた方法で産生される。その第１の方法によれ
ばハイプリドーマ細胞を一定時間適当な培地で培養する
ことによりその培養上清から、そのハイプリドーマ細胞
の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第
２の方法によれば／−イプリドーマ細胞は同質遺伝子又
は半同質遺伝子を持つマウスの腹腔に注射することがで
きる。一定時間後の宿主動物の血液中及び腹水中より、
その・・イブリドーマ細胞の産生するモノクローナル抗
体を得ることができる。When hybridoma cells that produce the antibody of interest are cloned using an appropriate method (e.g. limited dilution method), the antibody is
produced in two different ways. According to the first method, monoclonal antibodies produced by the hybridoma cells can be obtained from the culture supernatant by culturing the hybridoma cells in an appropriate medium for a certain period of time. According to a second method/- iploidoma cells can be injected into the peritoneal cavity of isogenic or semi-isogenic mice. From the blood and ascites of the host animal after a certain period of time,
It is possible to obtain monoclonal antibodies produced by hybridoma cells.
本発明の測定試薬においては、か〜るモノクー−ナル抗
体を第１抗体或いは第２抗体のいずれかに使用する。す
なわち、前記モノクーーナル抗体は、不溶性担体に結合
させて固定化抗体として使用することもできるし、また
標識物質を付けて椋脆抗体としても使用することもでき
る。In the measurement reagent of the present invention, such a monoclonal antibody is used as either the first antibody or the second antibody. That is, the monoclonal antibody can be bound to an insoluble carrier and used as an immobilized antibody, or it can be attached with a labeling substance and used as a brittle antibody.
前記モノクロ−アル抗体と共に使用される他の抗体とし
ては、ヒトプラスミンをｙ；ｉｔｍシ、結合し得るもの
であればよい。Other antibodies that can be used with the monoclonal antibody may be any antibody that can bind human plasmin.
以上本発明によれば、プラスミン−α、−プラスミンイ
ンヒビター複合体を含む検体（例えばヒト血漿）中のイ
ンヒビターの量を正確に且つ容易Ｋ ＩＩＩ定すること
が可能である。As described above, according to the present invention, it is possible to accurately and easily determine the amount of inhibitor in a sample (for example, human plasma) containing a plasmin-α,-plasmin inhibitor complex.
以下、実施例を掲げて本発明を詳述する。The present invention will be described in detail below with reference to Examples.
実施例１
本実施例で使用したル１及び第２抗体は、本発明者らが
先に出願した明＃＋沓（昭和５９年４月１７日付出願；
発明の名称１モノクロ一ナル抗体、ハイプリドーマ細胞
及びモノクローナル抗体の製造方法”）に記載された方
法によって得られた下記のものを使用した。Example 1 The 1 and 2 antibodies used in this example were obtained from Ming #+Ku (filed on April 17, 1982), which the present inventors had previously applied for;
The following materials obtained by the method described in "Title of the Invention 1: Monoclonal antibodies, hybridoma cells, and methods for producing monoclonal antibodies" were used.
第１抗体
前記出願明細書の実施例３において得られた抗体基”
ＩＢＩＯＧＩＩ”を使用し、これを下記の如く不溶性担
体（マイクロタイタープレート）に固定化させて用いた
。この抗体ハα、−プラスミンインヒビタ−におけるプ
ラスミンの線維素溶解作用の阻止部位（リアクティブサ
イト）以外の部位を特異的Ｋｌｌ臓し得るモノクローナ
ル抗体である。First antibody: Antibody group obtained in Example 3 of the above-mentioned application specification.
IBIOGII" was used and immobilized on an insoluble carrier (microtiter plate) as shown below. This antibody was used in a plasmin inhibitor other than the site (reactive site) that blocks the fibrinolytic action of plasmin. This is a monoclonal antibody that can specifically target the Kll site.
第２抗体
ウサギをヒトプラスミノーゲンで免疫して得たヒトプラ
スミノーゲンに対する抗血清より抗体成分を精製し、ア
ルカリ性フォスファターゼで標識化して使用した。Second antibody An antibody component was purified from an antiserum against human plasminogen obtained by immunizing a rabbit with human plasminogen, labeled with alkaline phosphatase, and used.
濃度２０ ｔｔｔｔ／ｇのヒトα２−プラスミンインヒ
ビターを特異的に認識するモノクローナル抗体（ＩＢＩ
ＯＧＩＩ）をマイクロタイタープレート上に４℃で一晩
放置し固定化した。これに１％牛血清アルブミンを含む
緩衝液（１５ｍＭ Ｎａ、ＣＯａ ｓ ３５ ｍＭ Ｎ
ａＨＣＯ３，３ｍＭ ＮａＮＢ ）を加え室温で４時間
放置した後、１％牛血清アルブミンを含む洗浄液（２０
ｍＭ リン酸緩衝液＋ ０．１３５ Ｍ ＮａＣ１＋２
ｍＭＮａＮ、 ＋ ０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０ ）で
５回洗浄した。次に希釈用溶液（２０ｍＭ ’）ン酸緩
伽液、 ０．１３５ Ｍ Ｎａ（Ｊ ）で種々の濃度と
なるように希釈したプラスミン−α、−プラスミンイン
ヒビター複合体を加え、室温で４時間放置した。A monoclonal antibody (IBI) that specifically recognizes human α2-plasmin inhibitor at a concentration of 20 tttt/g
OGII) was left on a microtiter plate overnight at 4°C to immobilize it. Add to this a buffer containing 1% bovine serum albumin (15mM Na, COa s 35mM N
After adding aHCO3, 3mM NaNB) and leaving it at room temperature for 4 hours, washing solution containing 1% bovine serum albumin (20
mM phosphate buffer + 0.135 M NaC1+2
Washed 5 times with mMNaN, + 0.05% Tween 20 ). Next, plasmin-α,-plasmin inhibitor complexes diluted to various concentrations with a dilution solution (20mM'), 0.135M Na(J), and 0.135M Na(J) were added, and the mixture was left at room temperature for 4 hours. did.
その後帥配洗浄液で５回洗浄し、さらにアルカリ性フォ
ス７７ターゼで５ｗ１ｔシたヒトプラスミノーゲンに対
する抗体を３５０Ｊ／ｉｕの濃度で加え４℃で一晩放置
した。Thereafter, the plate was washed five times with a washing solution, and an antibody against human plasminogen that had been purified with alkaline phos-77ase at a concentration of 350 J/iu was added thereto overnight at 4°C.
曲配洗浄液で洗浄後アルカリ性フォスファターゼ基質溶
液を１９／就の濃度で加え、ＥＬＩＳＡ ＡＮＡＬＹＺ
ＥＲ（東洋側番＠ ＃ ＥＴＹ −９６〕で４０．５ｎ
ｍの波長における１分間当りのＷ！Ｌ−ｙｔ度変化を測
定した。その結果を碓付図面第１図に示した。この図面
からプラスミン−α、−プラスミンインヒビター複合体
の濃度と吸光度゛変化との関係は直線関係になることが
理解できる。従って一−プラスミンインヒビターにおけ
るリアクティブサイト以外の場所を特異的に認識するモ
ノクローナル抗体をサンドイツチ法における一つの抗体
として使用することによつ【、プラスミン−α、−プラ
スミンインヒビター複合体の量を容品に測定することが
できる。After washing with a diluted washing solution, add alkaline phosphatase substrate solution at a concentration of 19% and perform ELISA ANALYZ.
40.5n with ER (Toyo side number @ #ETY-96)
W per minute at a wavelength of m! The change in L-yt degree was measured. The results are shown in Figure 1 of the Usuzuki drawings. From this figure, it can be seen that the relationship between the concentration of the plasmin-α,-plasmin inhibitor complex and the change in absorbance is a linear relationship. Therefore, by using a monoclonal antibody that specifically recognizes a site other than the reactive site in the -plasmin inhibitor as one antibody in the Sand-Deutsch method, the amount of the plasmin-α, -plasmin inhibitor complex can be adjusted to can be measured.
添付図面は、本発明の実施例におけるプラスミン−α２
−プラスミンインヒビタ−複合体の濃度と吸光度変化と
の関係を示すものである。The accompanying drawings show plasmin-α2 in an embodiment of the present invention.
- shows the relationship between the concentration of the plasmin inhibitor complex and the change in absorbance.
Claims (1)
不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とのいずれか一方
が、ヒトα＿２−プラスミンインヒビターを特異的に認
識するモノクローナル抗体であり、他の一方がヒトプラ
スミノーゲンに対する抗体であることを特徴とするヒト
α＿２−プラスミンインヒビターに対するモノクローナ
ル抗体を用いたプラスミン−α＿２−プラスミンインヒ
ビター複合体の免疫学的測定試薬。 ２ 該不溶性担体が、プラスチック容器、プラスチック
ビーズ、ラテックスビーズ、ガラスビーズ又は金属粒子
である第１項記載の測定試薬。 ３、該標識抗体が、酵素、放射性同位元素又は螢光物質
で標識化された抗体である第１項記載の測定試薬。 ４、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体を含み、これ
らの抗体のいずれか一方はヒトα＿２−プラスミンイン
ヒビターを抗原として認識して結合するモノクローナル
抗体であり、他の一方はヒトプラスミノーゲンを抗原と
して認識して結合する抗体であり、これに（ａ）溶解剤
、（ｂ）洗浄剤及び酵素で標識化した抗体を用いる場合
には、（ｃ）酵素活性を測定するための基質及びその反
応停止剤を組合せてなる免疫学的測定のためのキット。[Claims] 1. In an immunoassay reagent using a sandwich method,
One of the antibody bound to the insoluble carrier and the labeled antibody is a monoclonal antibody that specifically recognizes human α_2-plasmin inhibitor, and the other is an antibody against human plasminogen. An immunological assay reagent for plasmin-α_2-plasmin inhibitor complex using a monoclonal antibody against α_2-plasmin inhibitor. 2. The measurement reagent according to item 1, wherein the insoluble carrier is a plastic container, plastic beads, latex beads, glass beads, or metal particles. 3. The measurement reagent according to item 1, wherein the labeled antibody is an antibody labeled with an enzyme, a radioisotope, or a fluorescent substance. 4. Contains an antibody bound to an insoluble carrier and a labeled antibody, one of these antibodies is a monoclonal antibody that recognizes and binds to human α_2-plasmin inhibitor as an antigen, and the other one is a monoclonal antibody that recognizes and binds to human plasminogen as an antigen. When an antibody labeled with (a) a lysing agent, (b) a detergent, and an enzyme is used, (c) a substrate for measuring enzyme activity and its reaction. A kit for immunoassay consisting of a combination of a stopping agent.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15399384A JPS6134465A (en) | 1984-07-26 | 1984-07-26 | Immunoassay reagent and kit using monoclonal antibody against human alpha2-plasmin inhibitor |
| EP19850109227 EP0169549B1 (en) | 1984-07-26 | 1985-07-23 | Immunological determination of human plasmin/alpha2-plasmin inhibitor |
| DE19853586577 DE3586577T2 (en) | 1984-07-26 | 1985-07-23 | IMMUNOLOGICAL DETERMINATION OF HUMAN PLASMIN / ALPHA-2-PLASMIN INHIBITOR. |
| DK339985A DK339985A (en) | 1984-07-26 | 1985-07-25 | HUMAN PLASMIN / ALFA2 PLASMIN INHIBITOR IMMUNOLOGICAL DETERMINATION AND REAGENT SYSTEM FOR USE |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15399384A JPS6134465A (en) | 1984-07-26 | 1984-07-26 | Immunoassay reagent and kit using monoclonal antibody against human alpha2-plasmin inhibitor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6134465A true JPS6134465A (en) | 1986-02-18 |
| JPH0441783B2 JPH0441783B2 (en) | 1992-07-09 |
Family
ID=15574568
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15399384A Granted JPS6134465A (en) | 1984-07-26 | 1984-07-26 | Immunoassay reagent and kit using monoclonal antibody against human alpha2-plasmin inhibitor |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6134465A (en) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS57551A (en) * | 1980-04-30 | 1982-01-05 | Merck Patent Gmbh | Immunologic measuring method and means of enzyme |
| JPS5716355A (en) * | 1980-04-25 | 1982-01-27 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
| JPS5794660A (en) * | 1980-09-30 | 1982-06-12 | Behringwerke Ag | Measurement of inhibitor-enzyme compound |
| JPS57136165A (en) * | 1981-02-18 | 1982-08-23 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | Immunological measuring reagent |
| JPS58148963A (en) * | 1982-03-02 | 1983-09-05 | Maruko Seiyaku Kk | Reagent for measuring bound material of alpha-1- antitrypsin-trypsin in human body fluid by sandwich method |
-
1984
- 1984-07-26 JP JP15399384A patent/JPS6134465A/en active Granted
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5716355A (en) * | 1980-04-25 | 1982-01-27 | Hoffmann La Roche | Immunological method |
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| JPS58148963A (en) * | 1982-03-02 | 1983-09-05 | Maruko Seiyaku Kk | Reagent for measuring bound material of alpha-1- antitrypsin-trypsin in human body fluid by sandwich method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0441783B2 (en) | 1992-07-09 |
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