NL8104832A

NL8104832A - Nieuwe beta-galactosidase-remmer.

Info

Publication number: NL8104832A
Application number: NL8104832A
Authority: NL
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1980-10-27
Filing date: 1981-10-26
Publication date: 1982-05-17
Also published as: GB2086394B; US4497797A; FR2492664A1; NZ198680A; DE3142400A1; FR2492664B1; JPS5774090A; GB2086394A

Description

ν',, 3*

Br/Bl/lh/180

Nieuwe y£-galactosidase-remmer.

Door H.B. Bosmann (Biochem. Biophys. Acts, 264, 339 (1972) is beschreven dat fibroblastcellen van het type 3T3, getransformeerd door RNA tumor virus, een hoge glucosi-dasewerking, in het bijzonder een hoge (5-galactosidase-5 werking hebben. Sindsdien zijn diverse onderzoekingen verricht met het oog op de mogelijkheid dat remmers van |2-galac-tosidase als carcinostatisch middel gebruikt kunnen worden.

Zie bijvoorbeeld de Japanse octrooipublikatie 53-31238, alsmede The Journal of Antibiotics, 28_, 1006 (1975), id. ^2, 10 (3) 212 (1979) en id. 32, (3), 217 (1979).

Bij voortgezet onderzoek is nu het cultuurmedium van een micro-organisme een stof, genaamd GT-2558, gevonden, die als ƒ3-galactosidase-remmer werkt. Deze stof (of componenten of derivaten daarvan) zal toepassing kunnen vinden als 15 carcinostatisch middel, als hulpmiddel bij de diagnose van ^-galactosidase-deficientie, bij het zuiveren van enzymen, bij het onderzoek naar nieuwe vormen van ^-galactosidase, en in dé fermentatie-industrie.

De uitvinding verschaft derhalve in de eerste plaats 20 de nieuwe yi-galactosidase-remmer GT-2558, alsmede componenten, derivaten en farmaceutisch toelaatbare zouten daarvan, en een werkwijze voor het bereiden van de stof.

In de tweede plaats verschaft de uitvinding een geneesmiddel met remmende werking op y^-galactosidase, dat 25 gekenmerkt is doordat het de stof GT-2558, of componenten, derivaten of farmaceutisch toelaatbare zouten daarvan bevat, alsmede een werkwijze voor het bereiden van een dergelijk:', geneesmidde1.

De remmer GT-2558 volgens de uitvinding is een 30 mengsel van componenten A en B en nog kleine hoeveelheden andere componenten. Hij kan op gebruikelijke wijze in de componenten GT-2558-A eri GT-2558-B worden gescheiden.

Bovendien kunnen deze stoffen door acetylering worden ge-s tabiliseerd y 8104832 \ Ί .

! -2-

In het navolgende wordt verwezen naar de tekeningen die de volgende betekenis hebben:

Fig. 1 en Fig. 2 tonen het NMT-spectrum van GT-2558-A, gemeten in zware methanol, resp. d^-pyridine.

5 Fig. 3 geeft het NMR-spectrum van acetyl-GT-2558-B, gemeten in zware methanol.

Fig. 4 geeft het NMR-spectrum van acetyl-GT-2558-A, gemeten in zware methanol.

De eigenschappen van GT-2558-A en GT-2558-B en hun 10 .acetylderivaten blijken uit de volgende opsomming: (1) GT-2558.

a. Aard.

Zwak basis poeder. ·.

b. Oplosbaarheid.

15 Vrijelijk oplosbaar in water, oplosbaar in metha nol, azijnzuur en pyridine, enigszins oplosbaar in ethanol en propanol en onoplosbaar in acetol, ether, ethylacetaat, chloroform en benzeen..

c. Kleurreaktie.

20 Ninhydrien-reaktieproef positief

Zilverspiegelproef positief

Tollens reaktieproef (met floroglucinol en zoutzuur) geel

d. UV

25 Geen karakteristieke absorptie e. DLC aan een kiezelgelplaat R^ = 0,29 (ontwikkeld met acetonitrile: azijnzuur: water =5:1:2).

f. Specifieke ^-galactosidase-inhibitoractiviteit 2q 55.000 IH/mg (IC5Q 0,0045 mcg) .

(2) GT-2558—A.

a. Smeltpunt 106-108°C .

b. Molecuulgewicht (massaspectrum) 35 Maximale massa m/e =302 c. Elementaire analyse

Gevonden: C=4l,34; H=6,l6; N=7,43; 0=45,06.(%)

d. IR

8 1 0 4 8 32 'SS 3400' 2900/l640, 1565, 1505, 1455, 1415, -3- > i j 1360, 1300, 1270, 1160,1110, 1075, 1035, 955, 930, 890, 855, 795 cm"1.

' e. NMR

Fig. 1 en Fig. 2.

5 f. β-galactosidase-inhibitor-activiteit.

ij-----;-1 | Enzym pHvan Herkomst Ic50 ί Taka'P-" ~ 5,0 A§P.ergillus 0,0018 mcg : galact o s ida s e ** orvzae(Sankvo) 10 i----- " *;5 . -”( „ ) 0,0045 ff

Galantase 4,5 » (Tokyo 0,0045

Tanabe) 25 11 *^ ;

Runder β- _ 2 'Runder lever 26.6 galactosidase / (Sigma) f g. Specifieke β-galactosidase-inhibitor-activiteit 136.700 IE/mg (IC5Q 0,0018 xncg) .

2Q (3) Acety 1-GT-2558-A.

a. Aard.

Kleurloze fijne kristallen (herkristalliseerd uit benzeen-methanol) b. Oplosbaarheid.

25 Oplosbaar in methanol, ethanol, chloroform, dioxan en water, enigszins oplosbaar in ethyl-acetaat en onoplosbaar of nauwelijks oplosbaar tetrachloorkoolstof en benzeen.

c. Kleurreaktie.

30 Ninhydrien-reaktieproef positief

Ammoniakale zilvernitraatreaktie- proef positief d. Smeltpunt en ontledingspunt.

Smeltpunt 41°C; ontleding 149-153°C.

e. Specifieke draaiing.

^ JóQ^ + 29,6° (c = 1,0 methanol).

f. Molecuul gewicht (massaspectrum)

Maximale massa m/e =491 (M + 1) g. Elementaire analyse.

8104832 V * t ' ........-..... · ........ . ··· ----- - ....... . 'v -4-

Gevonden: C=5l,30; H=6,27; N=5,65; 0=36,78(%).

h. UV

Geen karakteristieke absorptie.

i. IR

5 1™* 3430, 2920, 1745, 1630, 1435, 1390, 1370, ulclX - 1245, 1090, 1040, 820, 760 cm .

(4) Acetyl-GT-2558-B. .

a. Aard.

Kleurloze fijne kristallen (herkristalliseerd 10 uit ethylacetaat-methanol) b. Oplosbaarheid

Oplosbaar in ethanol, methanol en water, enigszins oplosbaar in ethylacetaat en chloroform en onoplosbaar of nauwelijks oplosbaar in tetrachloor-15 koolstof en benzeen.

c. Kleurreaktie

Ninhydrien-reaktieproef positief

Ammoniakale zilvernitraatreaktiepxoef positief d. Smeltpunt en ontledingspunt 20 Smeltpunt 76-78°C; ontledingspunt 161-163°C.

e. Specifieke draaiing + 13,8° (c = 1,0 methanol) f. Molecuulgewicht (massaspectrum)

Maximale massa m/e = 429 (M + 1) 25 g. Elementaire analyse

Gevonden: C=46,58; H=6,58; N=6,56; 0=38,51(%).

h. UV

Geen karakteristieke absorptie.

i. IR

30 3410/ 2930/ 2735' 2360, 1640, 1550, 1435, 1380, 1245, 1195, 1115, 1090, 1045, 875, 815 cm”1, j . NMR Fig. 3 k. Specifieke ƒ£-galactosidase-inhibitor-activiteit 35 1640 IE/mg (IC50 0,15 mcg)

De f- -galactosidase-inhibitor-activiteit en de specifieke ^-galactosidase-inhibitor-activiteit, die bij de boven vermelde eigenschappen zijn genoemd, werden waarge- 8104832 8104832 -5- nomen door middel van coloriemetrische bepaling van o-nitro-fenol, dat bij de met ^-galactosidase gekatalyseerd hydrolyse van het substraat o-nitro£enyl-y$-D-galactopyranoside vrijkomt. Hierbij wordt aan een oplossing (0,25 ml) yi-galac-5 . tosidase, dat in een 0,1 M azi jnzuurbiiffer (pH = 5,0) is opgelost, een oplossing (0,25 ml) die de te onderzoeken verbindingen bevat, toegevoegd, gedurende 10 minuten bij 30°C bebroed en met 0,01 M substraatoplossing (0,5 ml) van o-nitrofenyl-yS-D-galactopyranoside opgelost in de bovenvermelde 10 buffer gemengd. Het mengsel wordt 15 minuten bij 30°C bebroed, waarna de reaktie wordt beëindigd door toevoeging van 1M natriumcarbonaat (1 ml), waarna het totale volume op 10 ml wordt ingesteld door toevoeging van water (8 ml) hetgeen wordt gevolgd door methyl van de absorptie (A) bij 420 nm.

15 Gelijktijdig wordt de absorptie (B) van de controle, bereid met alleen de buffer zonder de bovenvermelde te onderzoeken verbindingen, gemeten en wordt de remmingswaarde berekend uit (B-A)/B x 100. Daarbij wordt ƒ2-galactosidase gebruikt, dat bereid uit Taka-diastase (merknaam, Sankyo Co.) . Eén 20 eenheid remmingsactiviteit (1 IE) wordt gedefinieerd als de hoeveelheid van een onderzochte verbinding, die vereist is voor een remming van 50% (IC^0) van de y2-galactosidase-activiteit onder de bovenvermelde omstandigheden.

Het GT-2558 schijnt een nieuwe-galactosidase-25 inhibitor te zijn, omdat de eigenschappen verschillen van de bekende^S-galactosidase-inhibitors. Als organisme, dat het GT-2558 produceert, werd een stam van PA-5726 geisoleerd uit een bodemmonster verkregen op Nakadori Island, Minami-Matsuura District, Nagasaki Pref., Japan.

30 Deze stam werd geclassificeerd als een stam van

Streptomyces lydicus, welke stam van PA-5726 is gedeponeerd als Streptomyces lydicus PA-5726, FERM-BP 61 bij de Agency of Industrial Science & Technology; ATCC No. 31975.

De taxonome eigenschappen van deze stam zijn als 35 volgtr a) Morfologische eigenschappen (Bennett agar, 14 dagen gekweekt bij 28°C).

Er wordt geen sporangium, zweepsporen of sclero- 8104832 * » — * .......-6- tium waargenomen en geen splitsing door fragmentatie bij de hyphae van het substraat. Op dit medium vórmen zich overvloedig luchthyphae, die vele spiralen ontwikkelen. De oppervlaktestructuur van de sporen is glad bij waarneming 5 onder het electronenmicroscoop. Bij deze stam wordt het oppervlak van de kolonie in verloop van tijd vochtig om zogenaamd hygroscopisch te worden en zwarte kleur aan te namen.

b) Beeld van cultures op diverse media (gedurende 10 14 dagen gekweekt bij 28°C).

De kleuraanduiding is in overeenstemming met "Guide' to Color Standard” (Japan Color Institute ed.).

!-1-[ • . .. Bvphae {"Kleur vanOplos-..

Medium -Groei Forming Kleur ?ubstraatbaar j_·__Hyphae pigment - _ , .Lichtgeel

Sucrose- Rede- Qeen _ [achtic Geen

Nitrate Agar lijk bruin

Licht-?

Glucose- „ Redelijk bruin- « »«

Asparagine Agar achtig ;_____grijs__.__

Glycerol.!- Goed .Goed ” ” "

Asparagine Agar

Enorganiisch zou·: „ „ ' «· » 'Zetmeel Acar j__ariis^___

Licht- _ . , „ „ bruint 'Geelach-. „ lyrosme Agar schtig ;tig .__;___grijs bruin__

Voedings Agar « Geen - H n --:-------—- 1 Gist extract- -Bruin-

Mput extract n Goed ach tier 11 # ”

Agar grijs^ •Licht

Havermeel Agar « « ** geel.ach-. « 'tig _____.__- bruin__ • Geel— —

Bennett Agar ” ” ”* achtig 11 ! _____ ‘bruin _ 8104832 X.

-7- &

Het oppervlak van de kolonie wordt vochtig en wordt dan zogenaamd hygroscopisch en neemt een zwarte kleur aan.

Groeitemperatuur (Bennett agar, bij elke tempera-5 tuur gedurende twee weken gekweekt. De groei bij 10°C werd eveneens na 3 weken waargenomen.) 10°C: waarneming gedurende 2 weken: nauwelijks groei waarnaming gedurende 3 weken: goede groei, redelijke vorming van lucht Hyphae 10 28°C: Groei, vorming van lucht Hyphae en vorming van sporen zijn alle goed.

37°C: Geen groei 45°C: Geen groei.

c) Fysiologische eigenschappen (gedurende 14 dagen 15 gekweekt bij 28°C)

Vervloeiing van gelatine positief

Produktie van melanoide pigment negatief

Tyrosinase reaktie negatief

Peptonisering van melk positief 20 Coagulatie van melk positief

Hydrolyse van zetmeel positief d) Verbruik van koolstofbronnen.

Veel voor groei vereiste suikers L-arabinose, D-xylose, D-glucose, D-fructose, 25 sucrose, inositol, raffinose en D-mannitol.

Voor de groei weinig belangrijke suiker L-rhamnose.

Uit de bovenbeschreven verschillende eigenschappen is het duidelijk, dat deze stam behoort tot het geslacht 30 Streptomyces . In Wakman's "The Actinomycetes" deel 2 (1961), het rapport van Shirling en Gottlieb "International Strepto-rayces Project" /."International Journal of Systematic Bacteriology" deel 18, blz. 69 en blz. 279 (1968), id. deel 19, blz. 391 (1969), id. deel 22, blz. 265 (19727 "Bergey’s 35 Manual of Determinative Bacteriology" 8ste uitgave (1974) « alsmede andere publikaties met betrekking tot nieuwe actino-mycetes-species werden de het meest met de stam van PA-5726 verwante species gezocht en bleek Streptomyces lydicus 8104832 I · . ·

' ’ ""V

-8- /International Journal of Systematic Bacteriology deel 19, biz. 448 (1969), Bergey*s Manual of Determinative Bacteriology 8ste uitgave, biz. 772 en biz. Ill (1974), en Amerikaans octrooischrift no. 3,160.560 (1964)7 de meest verwante 5 species. Bij vergelijking van de verschillende eigenschappen van de stam PA-5726 met de eigenschappen van Streptomyces lydicus, zoals deze in deze publikaties zijn beschreven, werd een goede overeenkomst gevonden. Er werd daarom vastgesteld, dat de stam PA-5726 een stam was, die behoorde tot 10 dezelfde species als Streptomyces lydicus en werd genoemd Streptomyces lydicus PA-5726.

Bij de uitvinding kunnen niet alleen de stam PA-^5726 en de natuurlijke en kunstmatige varianten daarvan, maar ook alle stammen, die tot Streptomyces lydicus behoren en 15 6T-2558 produceren, worden gebruikt, welke alle binnen het kader van de uitvinding vallen.

De produktie van GT-2558 vindt plaats door een GT-2558 producerende stam te kweken op een voedingsmedium onder aerobe omstandigheden en het GT-2558 uit de cultuur-20 bouillon te winnen na het kweken. Het algemene voorschrift voor de produktie van GT-2558 is onderstaand beschreven.

Met betrekking tot de mediumbestanddelen en de kweekomstandigheden kunnen de gewoonlijk bij de bereiding van antibiotica toegepaste bestanddelen en omstandigheden 25 worden toegepast. Het medium bevat in hoofdzaak koolstof-bronnen, stikstofbronnen, anorganische zouten, enz. Indien noodzakelijk kunnen vitaminen, voorprodukten, enz. worden toegepast. Als koolstofbronnen worden bijvoorbeeld gekozen, zetmeel, dextrine, glycerol, molasse en organisch zuur, 30 hetzij alleen hetzij gemengd gebruikt. Als- stikstofbronnen worden bijvoorbeeld sojameel, maisweekvloeistof, vlees-extract, gistextract, katoenzaadmeel, pepton, tarwekiemen, ammoniumsulfaat en ammoniumnitraat hetzij alleen hétzij gemengd gebruikt- Als anorganische zouten kunnen bijvoor-35 beeld calciumcarbonaat, natriumchloride, kaliumchloride, magnesiumsulfaat, cobalt-II-chloride en diverse fosfaten indien noodzakelijk, aan het medium worden toegevoegd.

Het kweken kan op een gebruikelijke wijze, zoals 8104832 -9- toegepast bij de bereiding van antibiotica, worden uitgevoerd, bij voorkeur in vloeibaar medium of onder submerge beluchte omstandigheden in het geval van de produktie op grote schaal. Indien een verandering van de pH van het medium optreedt 5 kan aan het medium een buffer, zoals calciumcarbonaat, worden toegevoegd. Het kweken wordt bij voorkeur bij 20-40°C en in het bijzonder bij 25-32°C uitgevoerd. De duur van het kweken wordt afhankelijk van de schaal van de fermentatie gewijzigd en zo zijn ongeveer 20-80 uren vereist bij de produktie 10 op grote schaal. Indien een sterke schuimvorraing optreedt tijdens het kweken, kunnen bijvoorbeeld schuimwerende middelen, zoals plantaardige olie, reuzel en polyprcpyleenglyco1 op geschikte wijze voor of tijdens het kweken worden toege-voegt.

15 Na afloop van het kweken kan een gebruikelijke wijze voor het winnen van de fermentatieprodukten worden toegepast om het GT-2558 op juiste wijze uit de cultuur-bouillon te winnen. Zo kunnen bijvoorbeeld filtratie/ scheiding door centrifugeren, adsorptie-desorptiemethoden en 20 chromatograferen onder toepassing van diverse ionenuitwisse-lende harsen en andere adsorptiemiddelen alsmede extractie met diverse organische oplosmiddelen worden toegepast, bij voorkeur in een juiste combinatie. Bovendien kan het acetyl-derivaat van GT-2558 worden afgescheiden als een middel voor 25 de zuivering. Voor het verkrijgen van acetylderivaat wordt ruw GT-2558 in poedervorm in azijnzuur opgelost, wordt hierbij een overmaat azijnzuuranhydride toegevoegd en laat men het mengsel onder roeren bij kamertemperatuur reageren. Het kan daarbij wenselijk worden geacht een geschikt stabiliseer-30 middel bij de scheidingstrap te gebruiken 'om een ontleding van GT-2558 te voorkomen.

* Soms verdient het de voorkeur, dat het GT-2558 omgezet wordt tot zouten voor het gemak bij de scheidings-methode en de medische toediening aan mens en dier. De zuren, 35 die samen met het GT-2558 de zouten'kunnen vormen, zijn anorganische zuren, zoals waterstofchloride, waterstofbromide, waterstofjodide, zwavelzuur, salpeterzuur, fosforzuur en koolzuur, en organische zuren, zoals azijnzuur, fumaarzuur, 8104832 I .

- . . ... . 'N, -10- appelzuur, wijnsteenzuur, maleinezuur, citroenzuur, amandel-zuur, ascorbinezuur en galzuur.

Zoals bovenstaand is vermeld bestaat GT-2558 uit een mengsel van A, B en ondergeschikte hoeveelheden andere 5 bestanddelen en zo kan het GT-2558 desgewenst verder in elk van deze bestanddelen worden gescheiden. Als middelen voor de scheiding worden bijvoorbeeld diverse chromatogra-fische middelen en gelfiltratie toegepast. De acetylering en vorming van zouten, zoals bovenstaand vermeld, kan even-10 eens worden toegepast.

GT-2558, de bestanddelen en acetylderivaten daarvan en de farmaceutisch toelaatbare zouten daarvan kunnen als reagentia worden gebruikt voor het bepalen van de ^-galactosidase-activiteit door als ^-galactosidase-inhibi-15 tors te fungeren. Zoals bovenstaand reeds is vermeld, is het . mogelijk deze verbindingen te gebruiken als carcinostatische middelen en in dat geval kunnen zij oraal of parenteraal aan mens of dier worden toegediend. Deze· verbindingen kunnen te zamen met gebruikelijke typen versnijdingsmiddelen, stabili-20 seermiddelen conserveermiddelen, bevochtigingsmiddelen en oppervlakte-actieve stoffen oraal worden toegediend als tabletten, capsules en poeders, of parenteraal als injecties, smeersels en suppositoriën, waarbij de dosis instelbaar is afhankelijk van het therapeutische doel, de leeftijd en de 25 toestanden van een patient, enz.

De volgende voorbeelden dienen ter toelichting van de methoden voor het bereiden van een groep van de GT-2558 verbindingen maar zijn evenwel niet bedoeld om het kader van de uitvinding te beperken.

30 Voorbeeld I

In elk van een aantal schudkolven van 500 ml wordt 100 ml van het medium (pH = 7,0) gebracht, dat glucose (1,0%), casaminozuur (0,2%), gistextract (0,2%) en vleesextract (0,1%) bevat waarna de media in de kolven gedurende 20 min.

35 bij 120°C worden gesteriliseerd om daarna voor een entcultuur te .worden gebruikt.

Een oog met een platina entnaald van de schuine cultuur, die met een stam van Streptomyces lydicus PA-5726, 8104832 -11- ATCC-Nov 31975 is verkregen, wordt op de bovengenoemde media geent voor het verkrijgen van een entcultuur, waarna onder schudden met 140 cycli/min en een amplitude van 7 cm gedurende twee dagen bij 28°C wordt gekweekt voor het verkrijgen van 5 de entmassa.

Verder wordt reuzel (0,1%) toegevoegd aan een medium (pH = 7,0), dat glycerol (4,0%), vleesextract (1,5%), pepton (1,5%), KOI (0,076%), MgCl2.6H20 (0,042%), FeCl3.6H20 (0,00245%), ZnS04.7H20 (0,00219%) en MnCl2.4H20 (0,00181%) 10 bevat. Dit medium (telkens 80 ml) wordt in schudkolven van 500 ml gebracht en gedurende 20 minuten bij 120°C gesteriliseerd, welk medium wordt gebruikt als het hoofdfermentatie-medium, welk hoofdfermentatiemedium met de op de bovenbeschreven wijze verkregen entmassa wordt geent in een hoe-15 veelheid van 2% en gedurende zes dagen bij 28°C onder schudden met 140 cycli/min en een amplitude van 7 cm wordt gekweekt -

In deze cultuurbouillon hoopt zich de y2-galactosi-dase-inhibitor GT-2558 (48.100 IE/mg, IC^q = 0,0052 mcl) op.

20 Voorbeeld II

Op dezelfde wijze als bij voorbeeld I wordt het hoofdfermentatiemedium (8 1) bij het kweken gebruikt en wordt onmiddellijk na afloop van het kweken het organisme door centrifugeren afgescheiden, waarbij een helder filtraat 25 (6,3 1) wordt verkregen.

Het filtraat wordt door toevoeging van zoutzuur op een pH van 4,5 ingesteld, waarna actieve kool (1,5%, 94,5 g) hieraan wordt toegevoegd, waarop onder roeren in verloop van 30 minuten pigmenten en verontreinigingen worden geabsorbeerd, 30 waarna met behulp van Celite wordt afgefiltreerd, waarbij een helder filtraat (6,9 1) wordt verkregen.

Dit filtraat wordt door 2 1 van een sterk basische anionenuitwisselende hars Dowex -1x8 (OH-type) (merknaam, Dow Chemical Co.) wordt geleid om anionogeenstoffen te ver-35 wijderen. De verkregen oplossing wordt dan door een kolom met 1 1 van een sterk zure kationenuitwisselende hars Dowex-50W x 8 (H-type) geleid, waarop het GT-2558 wordt geabsorbeerd, waarna met voldoende water wordt gewassen en vervolgens met 8104832 -12- .......

0,5 N zoutzuur wordt geelueerd.

De geelueerde frakties met de-galactosidase-inhibitor-activiteit worden opgevangen en onmiddellijk geneutraliseerd door verwijdering van de overmaat Cl-ionen 5 met een zwak basische anionenuitwisselende hars $mberlite IRA-47 (OH-type) (merknaam, Tohm & Haas Co.) waarbij een GT-2558 oplossing (400 ml) wordt verkregen. De ^-galactosi-dase-inhibitor-activiteit van deze oplossing bedraagt 454.500 IE/ml (IC50 - 0,00055 mcl).

10 . Voorbeeld lil

De bij voorbeeld II verkregen GT-2558 oplossing wordt door lyofilisering geconcentreerd, waarbij een geelachtig bruin oüeachtige stof wordt verkregen, die in een kleine hoeveelheid 80% methanol wordt opgelost. Het residu 15 wordt afgefiltreerd, waarna aceton (10 maal het volume) bij het filtraat wordt toegevoegd, onder vorming van een neerslag, waarvan de bovenstaande acetonoplossing wordt verwijderd door centrifugeren.

Het neerslag wordt weer in een kleine hoeveelheid 20 methanol opgelost, waarna hierbij geleidelijk ethylacetaat (5-10 maal het volume) wordt gevoegd onder vorming van een neerslag, dat door filtratie wordt verzameld en gedroogd, waarbij ruw GT-2558 in de vorm van een lichtgeel poeder (8090 mg) wordt verkregen. Deβ-galactosidase-inhibitor-25 activiteit van dit ruwe poeder bedraagt 20.000 IE/mg (IC^q = 0,013 mcg), zodat deze stof bij het bovenstaande voorschrift wordt verkregen in een opbrengst van meer dan 50%.

Voorbeeld IV

Het bij voorbeeld III verkregen ruwe poeder (800 mg) 30 wordt in een kleine hoeveelheid 80%'s methanol opgelost en aangebracht op een kolom (2,60 x 100 cm) van een zwak basische anionenuitwisselende hars Amberlite IRA-47 (OH-type) in 80%'s methanol en met hetzelfde 80%‘s methanol als ontwikkelaar geelueerd. Het eluaat wordt opgevangen in frakties van elk 35 6 g, waarbij de ^-galactosidase-inhibitor-activiteit in de frakties Nos 53-90 wordt vastgesteld, welke actieve frakties worden verenigd en onder genoemde druk geconcentreerd, waarbij een lichtgeel poeder (262 mg) wordt verkregen. De inhibi- 8104832 "v -13- tor-activiteit van dit ruwe poeder bedraagt 35.600 IE/mg (ICj-q = 0,007 mcg) terwijl de opbrengst 58,3% bedraagt.

Voorbeeld V

Het bij voorbeeld IV verkregen ruwe poeder (400 mg) 5 wordt weer in een kleine hoeveelheid 80%'s methanol opgelost en aangebracht op een kolom (3,10 x 130 cm) met Sephadex LH-20 (merknaam, Pharmacia Fine Chemical Co.) dat met 80% methanol in evenwicht is gebracht, waarna met hetzelfde 80%*:s methanol als ontwikkelaar wordt geélueerd. Het eluaat wordt 10 in frakties van elk 4 g opgevangen, waarbij de ^-galactosi-dase-inhibitor-activiteit vastgesteld wordt in frakties Nos. 125-135. De actieve frakties worden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd, waarbij een kleurloos poeder (215 mg) wordt verkregen. De inhibitor-activiteit van dit 15 ruwe poeder bedraagt 55.000 IE/mg (IC^q = 0,0045 mcg), terwijl de opbrengst 82,7% bedraagt.

Voorbeeld VI

Het bij voorbeeld V verkregen ruwe poeder (135 mg) wordt in een kleine hoeveelheid van een 0,2 N pyridine-20 azijnzuurbufferoplossing opgelost, op een kolom (20 x 72 cm) van een sterk zure kationenuitwisselende hars Dowex-50W x 8 aangebracht, die in voldoende mate met dezelfde bufferoplos-sing in evenwicht is gebracht en met dezelfde bufferoplossing als ontwikkelaar geelueerd. Het eluaat wordt in frakties van 25 elk 7 g opgevangen, waarbij de ^-galactosidase-inhibitor-activiteit waargenomen wordt in de frakties Nos. 122-138, resp. frakties Nos. 141-160. In de volgorde van eluering aangeduid als GT-2558-A en B zijn de opbrengsten 37,2%

(A) en 18,3% (B)- De frakties worden onder verminderde druk 30 afzonderlijk geconcentreerd, waarbij een lichtgeel poeder (37 mg) van het GT-2558-A, waarvan de inhibitor-activiteit 73.500 IE/mg (IC^g - 0,0034 mcg) bedraagt, en een bruin poeder (54 mg) van het GT-2558-B worden verkregen, waarvan de inhibitor-activiteit 24.500 IE/mg (IC^-g = 0,010 mcg) bedraagt. 35 Voorbeeld VII

Het bij voorbeeld VI verkregen GT-2558-A poeder (57 mg) wordt in een kleine hoeveelheid 70%'s ethanol opgelost en op een kolom (2,60 x 95 cm) met Cephadex LH-20 aan- 8104832 ........ -- - - ---..... ...... . \ ' -14- - gebracht, die met 70%1 s ethanol in evenwicht is gebracht en met hetzelfde 70%’s ethanol als ontwikkelaar geelueerd.

Het eluaat wordt in frakties van elk 3 g opgevangen, waarbij de ^-galactosidase-inhibitor-activiteit waargenomen 5 wordt in de frakties'Nos. 80-95. De actieve frakties worden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd, waarbij een kleurloos poeder (32,6 mg) wordt verkregen, waarvan de inhibitor-activiteit 117.800 IE/mg (IC,-0 = 0,0021 mcg) bedraagt. Dit kleurloze poeder wordt herhaalde malen uit een 10 kleine hoeveelheid van een oplosmiddel een. mengsel (isopro-panol-ethanolj herkristalliseerd, waarbij kleurloze fijne kristallen (19,4 mg) van het GT-2558-A worden verkregen. De inhibitor-activiteit van dit produkt bedraagt 136.700 IE/mg (IC5Q = 0,0018 mcg).

15 Voorbeeld VIII

Het bij voorbeeld IV verkregen ruwe poeder (500 mg) GT-2558 (iC5Q = 0,007 mcg) wordt onder afkoeling met ijs in azijnzuur (10 ml) opgelost, waarna men de oplossing na toevoeging van azijnzuuranhydride (10 ml) onder roeren laat 20 opwarmen tot kamertemperatuur en door verdere toevoeging van azijnzuuranhydride (10 ml) acetyleert. De reaktie wordt gedurende 2 uren bij kamertemperatuur uitgevoerd en beëindigd door toevoeging van alcohol. Het mengsel wordt bij aanwezigheid van tolueen onder verminderde druk geconcentreerd, 25 waarbij het acetyl-GT-2558 als een gele olieachtige stof wordt verkfcegen. Deze stof wordt door middel van dunne-laag-chromatografie op een kiezelgelplaat gecontroleerd met hexaan-chloroform-methanol (30:30:12) als oplosmiddelsysteem, waarbij het acetyl-GT-2558-A bij een R^-waarde van 0,40 en 30 het acetyl-GT-2558-B bij een -waarde van 0,05 worden herkend.

Voorbeeld IX

De bij voorbeeld VIII verkregen gele olieachtige stof van het acetyl-GT-2558 wordt in een kleine hoeveelheid 35 methanol opgelost, op een kolom (1,70Ίχ 40 cm) met kiezelgel (50 <j) aangebracht, die met hexaan-chloroform-methanol (30:30:15) als oplosmiddelsysteem in evenwicht is gebracht, en met hetzelfde oplosmiddelsysteem (40 ml) en vervolgens 8 1 0 4 8 3 2 -15- met het oplosmiddelsysteem hexaan-chloroform-methanol (30:30: 20) geelueerd. Het eluaat wordt in frakties van elk 5 g opge-Vangen en door dunne-laag-chromatografie op een kiezelgel-plaat gecontroleerd/ waarbij het blijkt, dat het acetyl-GT-5 2558-A geelueerd wordt in de frakties Nos. 30-42 en het acetyl-GT-2558-B in de frakties Nos. 115-210. Deze respectieve frakties worden verenigd en onder verminderde druk geconcentreerd, waarbij het acetyl-GT-2558-A, resp. B als gele olieachtige stoffen worden verkregen.

10 Voorbeeld X

De bij voorbeeld IX verkregen gele olieachtige stof van het acetyl-GT-2558-A wordt voor het zuiveren herhaalde malen aan een kiezelgelkolom gechromatografeerd, waarbij het oplosmiddelsysteem hexaan-chloroform-methanol 15 (30:30:6) wordt gebruikt, waarbij een doorschijnende kleur loze olieachtige stof wordt verkregen. De op deze wijze verkregen stof wordt in een kleine hoeveelheid methanol opgelost en uit een mengsel van benzeen en methanol herkristalli-seerd, waarbij kleurloze fijne kristallen van het acetyl-GT-20 2558-A (50,8 mg) worden verkregen. De y&-galactosidase-inhi- bitor-activiteit van dit produkt bedraagt 0,5 IE/mg (ICj-q = 5 mcg) .

Voorbeeld XI

De bij voorbeeld IX verkregen gele olieachtige· 25 stof van het acetyl-GT-2558-B wordt voor het zuiveren herhaalde malen gechromatografeerd en een kiezelgelkolom, waarbij het oplosmiddelsysteem hexaan-chloroform-mèthanol (30:30:20) wordt gebruikt en uit een mengsel van ethylacetaat en methanol herkristalliseerd, waarbij kleurloze fijne kristallen 30 (12,7 mg) worden verkregen. De ^-galactosidase-inhibitor- activiteit van dit produkt bedraagt 16,40 IE/mg (IC,-q =0,15 mcg) .

Fractionele enzymproeven mety^-galactosidase 35 (Voorbeelden XII-XVIII)

Voorbeeld XII

Enzymoplossingen worden bereid als een mengsel van een runderlever ^-galactosidase-oplossing (A) met een 8104832 ψ ·\

............. - 'V

-16-

Aspergillus oryzae yS-qalactosidase-oplossing (B) in een verhouding van 4:0, 3:1, 2:2, 1:3, resp. 0:4 (V/V) ;· s

Bij het substraat 0,01 M o-nitrofenylyS-D-galacto-pyranoside (ONPG) oplossing (0,5 ml), die in een McXlvaine 5 buffer (pH =4,5) is'opgelost, worden de GT-2558-A oplossing (0,25 ml), opgelost in dezelfde buffer, en de bovenbeschreven enzymoplossing (0,25 ml) gevoegd, waarna de enzymreaktie gedurende 15 min. bij 37°C wordt uitgevoerd. De concentratie -4· van GT-2558-A bedraagt daarbij 1,9 x 10 M. De reaktie 10 wordt beëindigd door toevoeging van 1 M natriumcarbonaat (1 ml) , waarna het totale volume op 10 ml wordt ingesteld door toevoeging van water (8 ml) , waarna de enzymactiviteit (a) wordt bepaald door meting van de absorptie bij 420 nm. Tevens wordt dezelfde buffer, die geen GT-2553-A bevat, toe-15 gevoegd en wordt de enzymreaktie uit gevoerd, waarna de absorptie wordt gemeten en de enzymactiviteit (t) wordt bepaald. Het verschil tussen de waarde t en a is daarbij de hoeveelheid yS-galactosidase-activiteit, die door het GT-2558-A wordt geremd (b = t - a) . Met betrekking tot de term' 20 activiteit wordt een activiteit van één eenheid (IE) gedefinieerd als de activiteit van het enzym, dat 1 pmol ONPG per minuut hydrolyseert en o-nitrofenol vrijmaakt. Op deze wijze worden de hoeveelheden runderlever -galactosidase-activiteit (a) en Aspergillus oryzae ^2-galactosidase-activi-25 teit (b) fraktioneel bepaald.

De resultaten in tabel A vertonen een goede overeenkomst tussen.de in de praktijk bij de enzymatische proef bepaalde waarden en de theoretische waarden, die door berekening worden bepaald.

30 Voorbeeld XIII

Enzym A : Runderlever/S -galactosidase Enzym B : Rattelever yï-galactosidase Substraat : 0,01 M ONPG Inhibitor : 1,9 x ΙΟ-5 M GT-2558-A 35 Omstandigheden (toegepast bij de reaktie: Mcllvaine buffer (pH = 4,5), 37°C, 15 minuten.

De methode en het overige zijn dezelfde als beschreven in voorbeeld XII. De resultaten blijken uit tabel B.

8104832 -17-

N

Voorbeeld XIV

Enzym A : runderlever y^-galactosidase

Enzym B : Rattenier ƒ2-galactosidase

Substraat H 0,01 M ONPG

5 Inhibitor : 1,9 x ΙΟ-4 M GT-2558-A

Omstandigheden: Mcllvaine buffer (pH = 4,5), 37°C, 15 minuten.

De methode en de rest zijn zoals beschreven in voorbeeld XII. De resultaten blijken uit tabel C.

10 Voorbeeld XV

Enzym A : runderlever -galactosidase

Enzym B : rattemild ^-galactosidase

Substraat : 0,01 M ONPG

Inhibitor : 1,9 x 10~5 M GT-2558-A

15 Omstandigheden: Mcllvaine buffer (pH = 4,5), 37°C, 15 minuten.

De methode en het overige zijn dezelfde als beschreven in voorbeeld XII.

De resultaten blijken uit tabel D.

20 Voorbeeld XVI

Enzym A : runderlever^-galactosidase

Enzym B : Aspergillus oryzae ^-galactosidase

Substraat : 0,01 M ONPG

Inhibitor : 1,9 x 1θ“5 M GT-2558-A

25 Omstandigheden: Mcllvaine (pH = 7,2), 37°C, 15 min.

De methode en het overige zijn hetzelfde als beschreven in voorbeeld XII. De resultaten blijken uit tabel E. Voorbeeld XVII

Enzym A : Rattenier ^-galactosidase 30 Enzym B : Aspergillus oryzae ^„galactosidase

Substraat : 0,01 M ONPG

Inhibitor : 1,9 x 10-6 M GT-2558-A

Omstandigheden: Mcllvaine buffer (pH = 7,2), 37°C, 15 minuten.

35 De methode en het overige zijn hetzelfde als be

schreven in voorbeeld XII. De resultaten blijken uit tabel F. Voorbeeld XVIII

Enzym A : runderlever &-galactosidase 8104832 ' ..... ' ............ · - · .· , -18-

Enzym B : E. coli ^-galactosidase Substraat : 0/01 M ONPG Inhibitor : 4f8 x 1θ“5 M GT-2558-A Omstandigheden: Mcllvaine buffer (pH = 1,2), 37°C, 5 15 minuten;

De methode en het overige zijn hetzelfde als beschreven in voorbeeld XII. De resultaten blijken uit tabel G.

8104832 r

-19- N

i I boncen- | boven; bij proef gevon- j

Herkomst van tratie Snzyra L A ' 5rn wafföe . - J , φ^λ-ι ___traxie ^nzym pnder; Theoretxsche waarde

Tanej gemengd - ph - van GT- a.ctiv- F-— galactosidas€ n 2558-A iteit 4/0* 3/l .:2/2:/1/3/-0/4 (M) ($&j) (¾¼) (#al) (3¾ . Ο.32 0-28 0.25 0-22 0-19 Λ .Runderlever* 0-32 0.28 0.25 0-22 0-19 5 Aspergillus h ς . Q 10-4 ' olQÖ 0.04 0-08 0.l4 0.19 A oryzae ° y 0.00 0.05 0.09 0.l4 0-19- |o.32 0.24 O.I7 0.08 0.00 b.32 0.23 0.l6 0>08 0.00 t [O.ld 0.18 0.20 0.22 0.24 Λ Runderlever p.ló 0.18 0.20 0.22 0.24 - 3 Rattelever h _ . 0 _n-5 e 0.01 0.07 0.13 0.19 0.24 E 4.5 L.9X10 a [0.00 0.06 0.12 0.18 0.24 I0.15 0.11 0.07 o.o4 0.00 D p.16 0.12 0.08 0.04 0.00 . 0-35 Ο.32 0.29 0.26 0.25 ' A Runderlever 0.35 0.33 O.30 0.27 0-25 . 3 Rattenier ,, _ . 0 -n-4 iO.Ol 0.08 0.12 0-18 0-24 C l-9xl° a |o.oo 0.06 0.12 0.19 0.25 - 0.34 0.24 0.17 0.08 0.01 0.35 0.27 0.18 0-08 0.00 t 0,.39 Ο.35 O.3I 0.26 0.24 A Runderléver’ 0.39 0.36 0.32 0.28 0.24 . 3 -Rattemild h B . 0vin-5 0.01 0.07 0-11 0.17 0.24 D 4-5 L.9xl0 a 0.00 0 0£ Q12 q iQ Q'2li Ο.38 0.28 0.20 0.09 0.00 b 0.39 O.3O 0.20 0.10 0.00 t O.3O 0.28 0.27 0.26 0.26 1 Runderlever 0-30 0.29 0-28 0.27 0.26 3 Aspergillus „ ~ . Q _ n-5 0.00 0.06 0.12 0.19 0-25 b oryzae ' ^ 0.00 0.06 0.13 0.20 0.26 0.30 0.22 0.15 0.07 0.01 ° 0.30 0.23 0.15 0.07 0.00 8104832 Λ -20- t 0*33 0*32 0.32 0.31 0.30 A Ra.ttenier ^ 0.33 0*33 0.32 0*31 0*30 F B Aspergillus - g «_10-6 a 0*01 0*09 0*15 0*22 0*29 orvzae ‘ * 0*00 0.08 0*15 0*23 0*30 b 0.32 0.23 0.17 0.09 0*01 0.33 0.25 0*17 0.08 0.00 _ t 0.21 0.23 0*25 0.27 0*29 A Runderlever 0.21 0.23 Ο.25 0.27 0*29 G B 1*. coli n 0 k «Υ·,η-5 α 0*01 0.07 0*l4 0-21 0.29 7 0X10 a 0.000*070*150.220*29 b 0.20 O.I6 0.11 O.O6 O.60 0.21 O.I6 0*10 O.O5 0.00

Opmerkingen) A : het enzym, dat niet volledig wordt geremd door GT-2558-A in de aangegeven concentraties B : het enzym,·‘dat niet volledig wordt geremd door 5 GT-2558-A in de aangegeven concentraties t : de/2-galactosidase-activiteit, dié bij afwezig-* heid van GT-2558-A wordt gemeten (torale activiteit) a : de yl-galactosidase-activiteit, die bij aanwezig-10 heid van GT-2558-A wordt gemeten (de enzym- . activiteit van A) b : b = t - a, het verschil tussen t eri a, de hoeveelheid van de enzymactiviteit, die door GT-2558-A wordt geremd (de enzymactiviteit van B) > 15 & ; B/A, de mengselverhouding van het enzym A en het enzym B.

8104832

Claims

1. De stof GT-2558, gekenmerkt door haar in de beschrijving vermelde eigenschappen, alsmede farmaceutisch toelaatbare zouten daarvan.

2. De stoffen GT-2558-B, en acetylderivaten daarvan, 5 gekenmerkt door hun in de beschrijving vermelde eigenschappen, alsmede farmaceutisch toelaatbare zouten daarvan.

3. Werkwijze voor het bereiden van de stof GT-2558, met het kenmerk, dat men een GT-2558 producerende stam van Streptomyces in een voedingsmedium kweekt, GT-2558 uit het 10 cultuurmedium wint, desgewenst het verkregen GT-2558 scheidt in GT-2558-A en GT-2558-B en desgewenst acetylderivaten daarvan maakt.

4. Geneesmiddel met remmende werking op y3-galacto-sidase, met het kenmerk, dat het een werkzame hoeveelheid 15 van de stof GT-2558 of een farmaceutisch toelaatbaar zout daarvan, bevat.

5. Geneesmiddel met remmende werking op ^-galacto-sidase, met het kenmerk, dat het een werkzame hoeveelheid GT-2558-A, GT-2558-B, of een acetylderivaat daarvan, en/of 20 een farmaceutisch toelaatbaar zout daarvan, bevat.

6. Werkwijze voor het bereiden van een geneesmiddel met remmende werking op^-galactosidase, met het kenmerk, dat men de stof GT-2558 of een farmaceutisch toelaatbaar zout daarvan, in een voor therapeutische toepassing geschikte 25 toedieningsvorm brengt.

7. Werkwijze voor het bereiden van een geneesmiddel met remmende werking op^-galactosidase, met het kenmerk, dat men GT-2558-A, GT-2558-B, een acetylderivaat daarvan, en/of een farmaceutisch toelaatbaar zout daarvan, in een 30 voor therapeutische toepassing geschikte toedieningsvorm brengt. 810*832