NL8006730A

NL8006730A - Werkwijze en inrichting voor massa-overdracht bij immuniteitsbeproevingen en andere toepassingen.

Info

Publication number: NL8006730A
Application number: NL8006730A
Authority: NL
Original assignee: Technion Res & Dev Foundation
Priority date: 1979-12-12
Filing date: 1980-12-11
Publication date: 1981-07-16
Also published as: DE3046979C2; FR2471204B1; IL58943A0; CA1158839A; ZA807508B; SE448403B; GB2064357A; GB2064357B; SE8008664L; US4454231A; IT8026541A0; NL189801C; IL58943A; NL189801B; DE3046979A1; JPS56161801A; JPS6228681B2; BE886517A; FR2471204A1; IT1141126B

Description

Ν.Ο. 29637

Werkwijze en inrichting voor massa-overdracht bij immuniteitsbeproevingen en andere toepassingen.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor massa-over-dracht. Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze en inrichting voor het uitvoeren van de overdracht van één of meer componenten van één vloeistoffase af naar een andere vloeistoffa-5 se, welke twee fasen wezenlijk onmengbaar zijn.

Massa-overdrachtsverschijnselen worden overal in de natuur gevonden en zijn belangrijk in alle takken van wetenschap en ontwikkeling. De term "massa-overdracht” heeft betrekking op de beweging van moleculen of fluldum-elementen veroorzaakt door een of andere potentiaal of "aan-10 drijfkracht". Deze omvat moleculaire diffusie, transport door stroming en het eenvoudig mengen. Massa-overdracht wordt erbij betrokken waar een chemische reactie plaatsvindt, hetzij in een industriële reactor, een biologisch systeem of een onderzoeklaboratorium. De reagerende substanties moeten bij elkaar komen, indien de reactie moet voortgaan. In 15 vele gevallen wordt de reactie langzamer of stopt, indien het reactie-produkt (of -produkten) niet wordt (worden) verwijderd. De snelheid van massa-overdracht kan volledig de chemische conversie bepalen, wanneer reactiemiddelen moeten bewegen van één fase af naar een andere opdat de reactie kan optreden. In het geval van een omkeerbare reactie wordt de 20 conversie verbeterd, indien het gewenste produkt voortdurend wordt verwijderd door massa-overdracht naar een tweede fase waarin geen reactie plaatsvindt. Voorts kunnen de relatieve snelheden van massa-overdracht van de diverse reactie- en produktsoorten grotendeels de selectiviteit aantasten, wanneer concurrerende reacties daarbij worden betrokken.

25 In beginsel kunnen massa-overdrachten en -scheidingen optreden tus sen een stationaire onbewogen fase en een bewogen vloeistoffase zoals in ionen-uitwisselingsprocessen of tussen twee vloeibare fasen, zoals in vloeistof-vloeistofextractieprocessen. Het is bekend dat de scheiding tussen de genoemde fasen een van de meest belangrijke en kritische 30 stappen in vele laboratoriumprocessen en industriële processen vormt.

Vloeistof-vloeistoffasebewerkingen waarbij massa-overdracht optreedt, worden in het algemeen uitgevoerd in vaten gebaseerd op het principe dat na een innig mengen of contact van één fase met de andere, de twee fasen kunnen worden gescheiden en respectievelijk verwijderd.

35 Het bekende laboratoriumvat gebruikt voor dit doel, is een scheitrech-ter. Eén van de nadelen van de scheitrechter is de algemeen bekende handbediening vereist bij het scheiden van de twee fasen. Op commercië- q η n a 7 7 n 2 le schaal zijn er twee hoofdtypen van inrichtingen bekend: (1) meng-be-zinkingsbakken en (2) kolommen. Beide inrichtingstypen trachten een groot contactoppervlak tussen de fasen te waarborgen, aangezien de overdrachtssnelheid van de verdeelde component recht evenredig is aan 5 dit oppervlak. Een onderscheid tussen de diverse inrichtingstypen is gebaseerd op de toegepaste methode voor het in contact brengen van de vloeibare fasen. Het mengen van de twee fasen door het onderverdelen en dispergeren van één fase vormt nieuwe oppervlakken met een snelle overdracht van de opgeloste stof over het grote contactoppervlak. Het gemak 10 van het mengen hangt af van de grensvlakspanning tussen de twee fasen, de relatieve dichtheden van de twee fasen en de viscositeit van elke fase. Het scheiden van de twee fasen nadat zij in contact zijn gebracht, kan worden uitgevoerd door de zwaartekracht of door een centri-figuale kracht. Het gemak van de scheiding van de twee fasen hangt pri-15 mair af van het verschil in dichtheid van de twee fasen en hun viscosi-teiten en kan aanmerkelijk worden aangetast door de aanwezigheid van verontreinigingen die emulsies kunnen stabiliseren. Dit is het geval bij meng- en bezinkingsbakken.

Bij een alternatieve werkwijze voor het verkrijgen van een groot 20 contactoppervlak stroomt één fase door de andere, echter zonder een poging om de twee fasen te mengen. De inrichting gebruikt voor het in contact brengen van de twee fasen dient eveneens als scheidingsinrichting en het mengen van de twee fasen is ongewenst. Deze werkwijze hangt af van de vergrote lengte van de stromingsweg om een groot contactop-25 pervlak te verkrijgen en vereist gewoonlijk minder energieverbruik dan wanneer de twee fasen worden gemengd zoals in het hierboven genoemde inrichtingstype. Zulk een vergroot contactoppervlak tussen fasen kan worden bereikt door de twee vloeistoffasen in tegengestelde of gelijke richting te laten stromen in horizontale buizen of leidingen, waarbij 30 de fase met de kleinste dichtheid in het bovenste deel van de buis stroomt, of in verticale buizen of leidingen waarbij de fase met de grootste dichtheid langs de wand van de buis naar beneden stroomt, terwijl de fase met de kleinste dichtheid in bovenwaartse richting door het midden van de buis stroomt. In zowel het horizontale als verticale 35 inrichtingstype wordt het vergrote contactoppervlak bereikt door een voldoende lengte van de inrichting. Dit is het geval bij kolommen. Bei-Beide typen van vloeistof-vloeistofextractie-inrichting lijden aan nadelen. In het geval van meng- en bezinkingsbakken maakt tijdens het roeren, waardoor één van de vloeistoffen in de andere wordt gedisper-40 geerd, het intensief roeren of de turbulente stroom in het algemeen de 8 0 0 6 73 0 s 3 daarop volgende scheiding in de bezinkingsbafc van de vloeibare fase moeilijk dankzij de kleine afmeting en de grote stabiliteit van de druppeltjes van de gedispergeerde fase. Daarom verloopt de scheiding s zeer langzaam en vereist grote vaten. In het geval van kolommen is de 5 capaciteit van de inrichting begrensd door het feit dat de stroomsnelheden van beide fasen laag genoeg moeten zijn om een mengen van de fasen te verhinderen, aangezien zowel het in contact brengen en het scheiden van de fasen in hetzelfde stuk van de inrichting optreedt. Een algemene conclusie die bij het principe van de massa-overdracht kan 10 worden getrokken, is het belang van het grondig mengen van de fasen om een doelmatige overdracht van één of meer componenten van de ene fase naar de andere te bereiken.

Aanvraagster is geen stand van de techniek over de werkwijze van massa-overdracht uitgevoerd volgens de uitvinding bekend. „ 15 Een ampulspuitinrichting omvattende een cilindrisch orgaan met een holle zuiger die in het cilindrische orgaan verplaatsbaar is en aanliggend tegen de binnenwand van de ampul verschuifbaar is, is beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 2.524.362. Wanneer de zuiger in het cilindrische orgaan wordt gedrukt, stroomt de vloeistof door de axiale 20 holle doortocht in de zuiger en deze wordt uitgeworpen door een naald aan het einde van de ampul.

Gebaseerd op hetzelfde principe is in het Amerikaanse octrooischrift 3.52.948 een testbuisfilterinrichting beschreven, waarbij de hierboven beschreven zuiger is vervangen door -een holle plunjer die een 25 poreus bodemdeel heeft dat als filter dienst doet. Een bepaalde toepassing waarbij het principe van de genoemde inrichting wordt gebruikt, is later in een aantal Amerikaanse octrooischriften en Duitse octrooiaanvragen beschreven voor het scheiden van bloedfracties. Als voorbeeld dienen de Duitse octrooischriften 2.514.618 en 2.454.918 (of hun over-30 eenkomstige Amerikaanse octrooischrift 4.021.352 en Britse octrooischrift 1.508.844). Volgens deze octrooischriften worden het gecoagu-leerde bloed dat door neerslag of centrifugeren in de hogere dicht-heidsfractie van de rode bloedcellen wordt gescheiden, en het bloedplasma van lagere dichtheid in een cilindrisch vat geplaatst. Een holle 35 zuiger die aan zijn benedendeel een schijf heeft, zoals uit gesinterd glas, wordt in benedenwaartse richting geduwd tot in het cilindrische vat, totdat deze zich bevindt boven het grensvlak tussen de twee fracties zonder dit grensvlak te bereiken. Teneinde de bloedfractie van lagere dichtheid (plasma) die door de bovenopening van de zuiger stroomt, 40 te kunnen verzamelen, wordt een opneemvat boven het cilindrische vat 8 00 6 73 0 4 aangebracht. De grootste zorgvuldigheid moet worden betracht bij het bedienen van deze inrichting, teneinde te vermijden dat de twee fasen worden gemengd gedurende de benedenwaartse beweging van de zuiger en als gevolg daarvan kan slechts een gedeeltelijke verwijdering van het 5 plasma worden bereikt.

De uitvinding heeft ten doel te voorzien in een werkwijze voor het uitvoeren van massa-overdracht en het fysisch scheiden van twee vloei-stoffasen in hetzelfde deel van de inrichting.

De uitvinding heeft ook ten doel te voorzien in een eenvoudige in-10 richting voor massa-overdracht en het fysisch scheiden van twee vloei-stoffasen die extreem veelzijdig is en die zowel in een laboratorium als indistrieel kan worden toegepast hetzij op kleine schaal bij volumen van microliters, of op grote schaal bij honderden of zelfs duizenden liters.

15 De uitvinding heeft ook nog ten doel te voorzien in een werkwijze voor het op kwantitatieve wijze uitvoeren van de massa-overdracht en het fysisch scheiden van twee vloeistoffasen in hetzelfde stuk van de inrichting.

Aldus kan de uitvinding worden gezien in een nieuwe inrichting voor 20 het uitvoeren van de massa-overdracht van één of meer componenten van êén vloeistoffase naar een andere vloeistoffase, waarmee fysische scheiding van de twee fasen gepaard gaat, waarbij beide bewerkingen in dezelfde inrichting worden uitgevoerd, die bestaat uit een mengreser-voir waarin een meng-scheidingsinrichting nauw past, die voorzien is 25 van ten minste een kanaal dat langs de verticale hartlijn van de mengen scheidingsinrichting verloopt, welke laatstgenoemde aan zijn bovenste einde is uitgevoerd in de vorm van een verzamelhouder waarin de bovenste vloeistoffase uit het mengreservoir wordt verzameld en fysisch wordt overgebracht, aangezogen door het kanaal, wanneer de meng- en 30 scheidingsinrichting wordt geduwd tot in het mengreservoir. Set mengreservoir kan elke geschikte geometrische vorm hebben. Overeenkomstig de vorm van het mengreservoir zal de meng- en scheidingsinrichting een corresponderende vorm hebben.

De nieuwe inrichting volgens de uitvinding heeft een brede veelzij-35 dige eenheid in diverse processen die gepaard gaan met massa-overdracht. De toepasbaarheid daarvan zal hierna worden geïllustreerd voor een oplosmiddelextractie en een immuniteitsproef met de nadruk op de laatstgenoemde, hoewel het duidelijk zal zijn dat deze beschrijving niet als een beperking moet worden beschouwd terwijl geen bedoeling 40 aanwezig is om de toepasbaarheid van de nieuwe inrichting slechts te 8006730 4 .

5 bepalen tot een Immunlteltsproef.

In de hierboven genoemde Amerikaanse octrooiaanvrage S.N. 124.691 is de toepassing van de vloeistof-vloeistofextractiemethode beschreven voor een bepaalde bindingsproef. Volgens de daarin beschreven uitvin-5 ding is gevonden, dat door de toepassing van een geschikt oplosmiddel en onder bepaalde voorwaarden, een algemene methode kan worden bedacht voor het scheiden van de gebonden en vrije liganden bij immuniteitson-derzoeken, zonder hetzij de bindingsmogelijkheid van het bindende proteïne, of het evenwicht van het bindende proteïne en het ligand nadelig 10 te beïnvloeden. Zoals in de genoemde octrooiaanvrage is gesteld, is de werkwijze in het bijzonder geschikt voor een radio-immuniteitsonderzoek voor die gevallen waarin geen fysische scheiding moet worden uitgevoerd, waarbij het tellen van de gammastraling van de isotoop wordt uitgevoerd in de respectievelijke gebonden of vrije fase. Echter is bij 15 elk niet-homogeen immuniteitsonderzoek een scheiding in het algemeen gewenst van een vrij gelabelleerd antigeen van het antigeen dat met een bepaald antilichaam is gebonden. De ideale werkwijze zou niet slechts een zuivere scheiding van deze componenten voortbrengen, maar zou niet worden beïnvloed door biologische fluïdums en andere niet-specifieke 20 substanties in het reactiemengsel. Uit de stand van de techniek zijn de volgende categorieën van scheidingswerkwijzen voor de gebonden en vrije fracties bekend: (1) Elektroforetische en chromato-elektroforetische werkwijzen.

(2) Gelfiltratie.

25 (3) Niet-specifieke neerslag van hormoon-proteïne complexen.

(4) Immuniteitsneerslag van oplosbare hormoon-proteïne complexen.

(5) Vaste-fase absorptie van hormonen, en (6) vaste-fase absorptie van antilichaam.

Alle bovengenoemde werkwijzen hebben diverse ernstige nadelen. De 30 chromato-elektroforesis vereist ruimte en tijd van de technicus. Zuivere scheidingen en de beste resultaten worden bereikt, wanneer de genoemde scheidingen worden uitgevoerd in koude ruimten of grote ijskasten die niet steeds beschikbaar kunnen zijn. Striptellers die in deze werkwijze nodig zijn, zijn onderhevig aan mechanische defecten en de 35 meeste daarvan werken slecht bij jodium 125. Aangezien de meeste papieren een begrensde capaciteit hebben, in het algemeen lager dan 200 /ul, heeft men hoge specifieke acitiviteiten van gelabelleerde hormonen nodig voor een nauwkeurige telling.

Gelfiltratie is niet praktisch, omdat de voorbereiding van afzon-40 derlijke kolommen tijd in beslag neemt en ruimte vereist. Bovendien ö η n fi 77 n 6 vereist het verzamelen van uitlopende vloeistoffen uit de kolommen de aandacht van technici.

Bij niet-specifieke neerslag van hormoon-protelne complexen kunnen aanzienlijke hoeveelheden vrij antigeen worden geoccludeerd in de neer-5 slag en geringe wijzigingen in voorwaarden zullen de mate van scheiding wijzigen. De voor een technicus vereiste tijd zelfs voor verbeterde varianten van deze werkwijze, schijnt groter te zijn dan voor sommige van de andere beschouwde werkwijzen en de gepubliceerde resultaten schijnen niet voldoende verbeterd om de aanvaarding van deze werkwijze te recht-10 vaardigen.

ïmmuniteitsneerslag van antigeen-antilichaam complexen heeft vele nadelen: (i) Deskundigheid en zorg zijn vereist bij het aanzuigen of decanteren van de bovendrijvende oplossing. Nu en dan kan de neerslag in een 15 fibrine vlies bij de meniscus worden gevangen en onbewust worden verwijderd.

(ii) Menselijk serum kan op een aantal wijzen zich mengen in de tweede antilichaam reactie. Enkele tweede antilichamen zullen op voldoenwijze kruiselings reageren met menselijk gamma-globuline, zodat de 20 neerslag van het eerste antilichaam nadelig wordt beïnvloed. Er kunnen ernstige variaties zijn in de mate van Ïmmuniteitsneerslag tussen serum en gehepariniseerd plasma.

Werkwijzen gebaseerd op vaste-fase absorptie van vrij antigeen, bijvoorbeeld de toepassing van houtskool, hars, siliciumdloxide, flori-25 sil enzovoort, lijden aan het feit dat de gebonden antigeen-antilichaam complex eveneens kan worden gebonden op het vaste absorptiemiddel. Een recente elegante werkwijze bij de vaste-fase absorptie van antilichaam is de absorptie van antilichamen in kunststofbuizen. Derhalve worden een aantal van een laag voorziene buizen vooraf voorbereid. De voorbe-30 reiding en opslag van grote aantallen van zulke buizen is een ernstig nadeel naast het feit dat deze buizen gevoelig zijn voor variaties in serum proteïne-inhoud. De nieuwe werkwijze volgens de uitvinding kan eenvoudig worden uitgevoerd met zeer nauwkeurige resultaten. Op grond van de lage prijs van de gehele inrichting kan deze voorts dienen voor 35 een eenmalige toepassing.

De werkwijze volgens de uitvinding is zeer eenvoudig. Bijvoorbeeld wordt een waterige oplossing beschouwd die een opgeloste stof bevat, die oplosbaar is in een organisch oplosmiddel dat niet met water mengbaar is. Deze waterige oplossing wordt zodanig in het mengreservoir 40 aangebracht, dat deze ongeveer éênvierde van het volume van het mengre- 8006730 * »- 7 servoir in beslag neemt. Een geschikt organisch oplosmiddel dat niet met water mengbaar is wordt aan het mengreservoir toegevoegd. De hoeveelheid van toegevoegd organisch oplosmiddel kan indien gewenst worden gevarieerd volgens de volumecapaciteit van het mengreservoir. De soor-5 telijke dichtheid van het oplosmiddel kan groter of kleiner zijn dan die van de waterige oplossing. De twee fasen worden daarna grondig gemengd door het in en uit bewegen van de mengscheider door het mengreservoir. Indien gewenst kan dit mengen eveneens worden bereikt door middel van een vibratormenger of magnetische roerinrichting, of elke 10 andere geschikte menginrichting gedurende een korte tijdsperiode. Na de mengbewerking kan het systeem tot stilstand komen gedurende een geschikte tijdsperiode, waarbij de twee onmengbare fasen - bovenfase en benedenfase - worden bereikt. De meng- en scheidingsinrichting wordt ingedrukt en de bovenste vloeistoffase wordt door het kanaal in de ver-15 zamelhouder ingebracht. De meng- en scheidingsinrichting wordt ingedrukt totdat deze het grensvlak bereikt, waardoor de bovenfase volledig wórdt verwijderd, die de opgeloste stof bevat die vooraf in de waterige fase aanwezig was. De aldus gescheiden bovenste fase kan daarna worden overgebracht naar een geschikte meetinrichting om de hoeveelheid opge-20 loste stof te bepalen, die uit de onderste fase is overgebracht tot in de bovenste fase. Dezelfde meting kan worden uitgevoerd voor de onderste fase die in het mengreservoir blijft. Wanneer de opgeloste stof die oorspronkelijk in de waterige fase aanwezig is, een gamma-uitstralende radio-isotoop is, wordt de bewerking uitgevoerd zoals hierboven is toe-25 gelicht, waarbij het gehele systeem wordt geplaatst in de bron of opening van een gammateller, zodat slechts de straling wordt geteld, die wordt uitgezonden door de fase die in het mengreservoir overblijft.

Aangezien de totaal getelde straling vooraf bekend zou zijn, zal de telling van de overblijvende lagere fase van het mengreservoir de mate 30 van verdeling van de opgeloste gamma-uitstralende radio-isotoop tussen de twee fasen opleveren. Deze analysewerkwijze is in het bijzonder bruikbaar, wanneer toegepast bij de ontwikkeling van immuniteitsonder-zoeken voor de detectie van zeer kleine concentraties van chemische substanties in biologische fluldums. Uit de bekende nomenclatuur van 35 deze chemische substanties kunnen de volgende groepen worden beschouwd voor hun analyse: Λ Λ Λ C 7 7 Λ 8

Alkaloïden, zoals: morfine, codeïne, dihydrocodeïne, heroïne, oxymorfon, metopon, folcodine, enz. Barbituraten, zoals: veronal, luminal, seconal, fenobarbital, 5 barbital, enz.

Steroïden, estrogenen, zoals: β-estradiol, estron, estriol 17a, ethyinyl estradiol enz., androgenten, progestogenen; adrenocorticale hormonen, enz. Cannabinoïden en hun metaboliten.

10 Vitaminen, zoals: caroteen, riboflavine, thiamine, niacine, ascorbinezuur, tocoferol, fytyl - 1,4 -naftochinon, enz.

Aminozuren en polypeptiden.

Suikers, omvattende sacchariden en polysacchariden.

15 Kalmeringsmiddelen, zoals: meprobamaat, valium, oxazepam, fenotia- zinen, enz.

Behalve de hierboven genoemde haptenen kunnen andere verschillende mengsel zoals cocaïne, prostaglandine, antibiotica, zoals penicilline, 20 chloromycetine, actinomycetine en nucleïnezuren en nucleotiden; insecticiden, fungiciden, bactericiden en nematociden, zoals malathion, carbarnaten, enz. eveneens worden onderzocht met de werkwijze volgens de uitvinding. In het algemeen kunnen antigenen, haptenen en hun antili-chamen, hormonen, vitaminen, geneesmiddelen, metaboliten en hun recep-25 toren en bindmaterialen worden bepaald door toepassing van de onderhavige werkwijze.

Onder de te bepalen bijzondere bestanddelen kunnen de volgende worden genoemd:

Gecompenseerd T4: T3 Opname: 30 Cortisol; Insuline;

Digoxine; Triiodothyronine;

Folaat; Thyroxine (Total T4); h G Η; T S H;

De werkwijze volgens de uitvinding is ook in het bijzonder geschikt 35 in het geval wanneer het labelleringsmiddel een fluorescerend label is, waarbij de metingen worden uitgevoerd met een geschikte spectrometer. Wanneer het labelleringsmiddel in het onderzoek een gamma-uitzendende radio-isotoop is, zoals jodium 125 en de bovenste fase een organisch oplosmiddel is, zal de waterige fase aanwezig in het mengreservoir A na 40 de scheiding door de meng- en scheidingsinrichting B, het antilichaam- 8 0 0 6 73 0 i κ 9 antigeen complex bevatten en de gehele Inrichting kan in de opening van de gammateller worden geplaatst, zodat slechts de onderste fase in het instrument zal worden geteld. Hetzelfde geldt wanneer de onderste fase een organisch oplosmiddel is, in welk geval door het plaatsen van de 5 gehele inrichting in de opening of schacht van de gamma-teller het vrije ongebonden ligand zal worden geteld, dat naar het organische oplosmiddel is overgedragen.

De werkwijze is toepasbaar voor elk immuniteitsonderzoek, zoals ra-dio-immuniteitsonderzoek, vrij radikaal onderzoek, fluorescentie-immu-10 niteitsonderzoek, enzym-immuniteitsonderzoek of metallo-immuniteitson-derzoek (zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.205.952).

Het is in het bijzonder zeer nuttig om de inrichting volgens de uitvinding toe te passen in de diverse uitrustingen die voor deze technieken op de markt beschikbaar zijn.

15 Een andere toepassing die voor de inrichting volgens de uitvinding kan worden overwogen, is het scheiden van een vrij antigeen uit een gebonden antigeen-antilichaam complex in het geval van proteïnen, cellen en andere verbindingen van een hoog moleculair gewicht, indien men twee in water oplosbare, maar onderling onverenigbare polymeren gebruikt om 20 het niet mengen in te voeren. Hierdoor ontstaan twee waterige fasen waartussen diverse stoffen kunnen worden verdeeld. Zulk een verschijnsel is beschreven in de literatuur (P.A. Albertson et al, Nature, 184, 1465 1959; G. Johnson et al, Hur. J. Biochem, 2(3, 379, 1973). Er bestaat een groot aantal onverenigbare paren van polymeren (zie bijvoor-25 beeld A Dobry et al, J. Polym.Sci. 2, 90, 1947). De nieuwe inrichting en werkwijze volgens de uitvinding kan dan worden toegepast om de twee onvermengde waterige fasen te scheiden zoals hierboven reeds is beschreven.

De werkwijze en inrichting zijn eveneens zeer goed geschikt voor de 30 toepassing bij atomaire absorptie-spectometrie voor de analyse van merkmetalen. Het is dikwijls noodzakelijk een extractiewerkwijze te gebruiken, waarbij het organische oplosmiddel een chelerend middel bevat voor de extractie van het metaalion uit het waterige medium. De toepassing van de nieuwe inrichting volgens de uitvinding voorziet in een 35 zeer eenvoudige en efficiënte werkwijze voor de extractie en in aansluiting op de scheiding van de organische fase in de verzamelhouder van de inrichting, is het mogelijk deze organische fase direct te gebruiken voor de atomaire absorptiemetingen. Deze inrichting kan gemakkelijk worden opgenomen in automatische systemen voor bemonsteringsin-40 jectie in atomaire absorptie-spectrometers.

n nn « 7x n 10

De nieuwe inrichting en werkwijze volgens de uitvinding is technisch eenvoudig» snel en goedkoop en mnoet worden beschouwd als een ideale werkwijze bij de vloeistof-vloeistofextractie in het algemeen en iimnuniteitsonderzoek in het bijzonder. Teneinde de nadruk te leggen op 5 de lang gevoelde behoefte in de techniek aan de hierboven beschreven inrichting en werkwijze, zal het waardevol zijn te citeren uit een gespecialiseerd boek "Principles of competitive protein-binding assays" (W.D. Odell en W.H. Daughaday, auteurs), J.P. Lipponcott Co., Philadelphia en Toronto, 1971, hoofdstuk XI, pagina 303: "Het feit dat 10 zoveel verschillende scheidingstechnieken zijn voorgesteld is een indicatie dat bestaande werkwijzen enigszins onbevredigend zijn".

Het schijnt dat de nieuwe inrichting en werkwijze volgens de uitvinding het dichtst bij de eisen van de ideale werkwijze komen in vergelijking tot elk van de bestaande bekende werkwijzen.

15 De veelzijdigheid van de inrichting volgens de uitvinding zal hier na meer in detail worden beschreven aan de hand van de tekening.

Hierin toont fig. 1 schematisch één van de uitvoeringsvormen.

De inrichting bestaat uit vier hoofdcomponenten: mengreservoir (Λ), meng- en scheidingsinrichting (B), verzamelhouder (E) en stop (S). De 20 stop (S) kan in een gesloten op open positie zijn.

Fig. la illustreert de inrichting met de twee vloeistoffasen: bovenste (U) en onderste (L) aanwezig voor massa-overdracht.

Fig. 1b illustreert de meng-scheidingsinrichting (B) volledig gedrukt in het mengreservoir (A), waardoor de twee fasen grondig met el-25 kaar worden gemengd. Gedurende de bewegingen in en uit de meng-schei-dingsinrichting (B), bevindt de stop (S) zich in de gesloten positie. Hierdoor kan een vacuüm in het mengreservoir (A) worden gevormd en een verhoogde druk in de verzamelhouder (E). De combinatie van deze twee effecten voorziet in een zeer efficiënte menging en een overeenkomstige 30 zeer efficiënte massa-overdracht. Aan het einde van de mengbewerking kan de meng-scheidingsinrichting (B) in de bovenste positie blijven (zoals in fig. la), de stop (S) in de open stand worden gedraaid om luchtdruk te laten ontsnappen en de gemengde vloeistoffen kunnen zich spontaan scheiden in een bovenste en onderste fase.

35 Fig. lc illustreert de inrichting, waarbij de meng-scheidingsin richting (B) is gedrukt in het mengreservoir (A), nadat de twee vloeistoffasen zijn gescheiden in een bovenste (IJ) en een onderste (L) fase. De meng-scheidingsinrichting (B) kan worden ingedrukt tot een gewenst niveau, zodat weinig of geen bovenste fase in het kanaal (C) over-40 blijft. Met de stop (S) in de open stand kan indien gewenst de bovenste 8 0 0 6 73 0 11 vloeistoffase (Ό) worden uitgeschonken in elke andere houder. Geen van de in het kanaal (C) overblijvende fasen zullen worden uitgeschonken gedurende dit verwijderen van de bovenste fase (U) vanwege het vacuüm dat in het mengreservoir (A) is opgewekt.

5 Fig. 2 toont een variant van de inrichting volgens fig. 1, waarbij het kanaal (C) niet verloopt over de gehele lengte van de meng-schei-dingsinrichting (B). De fig. 2a, 2b en 2c illustreren de werking van de inrichting zoals beschreven voor fig. 1. De in deze fig. geïllustreerde inrichting toont eveneens een afwijkend type van de stop (S).

10 Fig. 3 stelt een andere uitvoeringsvorm van de inrichting volgens de uitvinding voor, waarbij slechts het benedendeel (Bb) van de meng-scheidingsinrichting (B) nauw past in het mengreservoir (A). Bovendien heeft het mengreservoir (A) een schaalverdeling (G) voor volumeme-tingen. Uiteraard kan deze schaalverdeling eveens worden toegepast bij 15 de uitvoeringsvormen geïllustreerd in de andere fig. Het nauw passende deel (Bb) dat één geheel met de meng-scheidingsinrichting (B) vormt, zou eveneens zodanig kunnen worden uitgevoerd, dat deze uitwisselbaar zou zijn hetzij door schroeven of elk ander middel. De werking van de in de fig. 3a en 3c geïllustreerde inrichting komt overeen met die van 20 de fig. la, 2a, lc respectievelijk 2c.

Fig. 4 stelt een andere uitvoeringsvorm van de inrichting volgens de uitvinding voor. In deze uitvoeringsvorm is een extra constructie toegepast met het doel het verder vergemakkelijken van het gelijkmatig glijden van de meng-scheidingsinrichting (B) in het mengreservoir (A). 25 In het bijzonder zal deze uitvoeringsvorm geschikt zijn in die gevallen — waarin de inrichting is vervaardigd uit een materiaal waarbij het glijdende effect niet gemakkelijk kan worden bereikt. Bij de in fig. 4b getoonde uitvoeringsvorm heeft het mengreservoir (Ac) ten minste twee in lengterichting verlopende geleidingssleuven, die aanwezig zijn in de 30 wanden van het mengreservoir (Ac).

Fig. 4c stelt een dwarsdoorsnede van het mengreservoir (Ac) voor, waarbij vier dergelijke in lengterichting verlopende sleuven aanwezig zijn. De meng-scheidingsinrichting (Bc) getoond in fig. 4a, moet een aantal uitsteeksels hebben, waarvan een dwarsdoorsnede in fig. 4d is 35 gegeven. Het aantal uitsteeksels op de meng-scheidingsinrichting 4a) moet overeenkomen met het aantal lengtesleuven aanwezig in het mengreservoir (Ac). Wanneer de meng-scheidingsinrichting (Bc) in het mengreservoir (Ac) wordt gedrukt, wordt dezelfde nauwe passing bereikt zoals in de inrichting geïllustreerd in fig. 1.

40 Fig. 5 illustreert een andere uitvoeringsvorm van de inrichting ft 0 0 6 73 0 12 volgens de uitvinding. De inrichting bestaat weer uit de vier hoofdcom-ponenten: mengreservoir (A); meng-scheidingsinrichting (B); verzamel-houder (E) en stop (S). Twee varianten zijn geïllustreerd voor de meng-scheidingsinrichting (B). Volgens de ene variant maakt de verza-5 melhouder (E) deel uit van de meng-scheidingsinrichting (B), terwijl volgens de andere variant de verzamelhouder (E) uit de meng-scheidingsinrichting (B) kan worden verwijderd. De meng-scheidingsinrichting (B of B’) heeft aan zijn basis een afdichtingselement dat langs de binnenwanden van het mengreservoir (A) kan worden verschoven. Het afdich-10 tingselement heeft ten minste ëên boring die door de dikte daarvan verloopt, welke boring in verbinding staat met het kanaal (C). Diverse varianten kunnen worden toegepast bij het plaatsen en vervaardigen van het afdichtingselement, zonder het kader van de uitvinding te verlaten. Volgens de ene uitvoeringsvorm bestaat het afdichtingselement uit een 15 rubberen 0-ring met een mondstukboring, die langs de binnenwanden van het mengreservoir (A) kan worden verschoven. Door het indrukken van de meng-scheidingsinrichting (B) wordt de bovenste laag vloeistof door de mondstukboring en het kanaal (C) aangezogen en verzameld in de verzamelhouder E. Volgens de andere uitvoeringsvorm is de rubberen 0-ring 20 enigszins boven de basis van de meng-scheidingsinrichting (B) geplaatst, zodat het rubber niet in aanraking zal komen met de onderste vloeistoffase uit het mengreservoir (A). In dit geval is er geen beperking ten aanzien van het type rubber. De stop (S) die passend de verzamelhouder (E) of (Ef) afsluit heeft een binnenste geperforeerd deksel, 25 teneinde de getransporteerde druppeltjes vloeistof terug te brengen in de verzamelhouder E via de gaten van het deksel. Uiteraard kunnen deze gaten elke vorm of afmeting hebben zonder de werking van de inrichting aan te tasten. De werking van de inrichting is gelijk aan die aan de hand van fig. 1 is beschreven.

30 Zoals reeds in de aanhef van de beschrijving is 'gesteld, kan de nieuwe inrichting volgens de uitvinding met succes worden toegepast als een zeer gemakkelijke inrichting op het algemene gebied van vloeistof-vloeistofextractie, hetzij op kleine schaal of op grote schaal. Op kleine schaal kan deze worden gebruikt bij het basisonderzoek van het 35 zeven van oplosmiddelen of bij de bepaling van de grensvoorwaarde van de scheidingscoëfficiënten van een bepaald oplosmiddel. Op grote schaal concurreert deze zeer gunstig hetzij met de standaard meng- en neer-slaginrichtingen, of met de bekende typen van kolommen als gevolg van de bereikte efficiëncy van massa-overdracht.

40 Onder de belangrijkste voordelen van de inrichting volgens de uit- 800 6 73 0 13 vinding wordt de aandacht gevestigd op de volledige afwezigheid van hydraulische communicatie en de scheiding van de mengbewerking van de af-zuigfunctie, zodat elk een onafhankelijk kan worden uitgevoerd volgens zijn eigen eisen» zodat geen gevaar van terugmengen zou kunnen ont-5 staan. Met andere woorden levert de inrichting de hoge efficiency van massa-overdracht, die in het algemeen wordt bereikt wanneer een mengin-richting wordt toegepast, maar tegelijkertijd zal zijn bevrijd van de nadelen die gepaard gaan met een menginrichting. De vorm van de elementen van de nieuwe inrichting kan indien gewenst worden gewijzigd voor 10 elk bepaald geval. De volumen van het mengreservoir A en de verzamel-houder Ξ kunnen indien gewenst worden gevarieerd volgens de volumen van de twee vloeistoffasen behorend bij het bijzondere scheidingsproces.

Het element E kan een verzamelhouder met elke gewenste geometrische vorm en afmeting zijn, vooropgesteld dat bij een bepaalde geschikte 15 hoogte vanaf het bovenste einde van de meng-scheidingsinrichting B, deze breder is dan de buitendiameter van het mengreservoir A, indien het gewenst is een verzameling van een voorafbepaald vloeistofvolume te bereiken.

Volgens de ene uitvoeringsvorm is een ring tussen het bovenste ein-20 de van het mengreservoir A en het verzamelelement E aangebracht, die over de meng-scheidingsinrichting B kan worden verschoven en aldus het niveau van indrukken van de meng-scheidingsinrichting B zal bepalen en derhalve het grensvlak tussen de twee vloeistoffasen, waardoor een volledige verwijdering van de bovenste fase uit het mengreservoir A wordt 25 gewaarborgd. Met hetzelfde principe zouden twee of meer ringen eveneens kunnen worden tussengeplaatst voor verschillende posities van grens-vlakplaatsen. Zulk een ring aangeduid met de letter D is in de fig. 1, 2 en 4 getoond.

Een ander voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding met de 30 nieuwe inrichting is het feit dat deze kan werken met een reeks inrichtingen, die in hoge mate vatbaar zijn voor automatisering, zonder dat gecompliceerde hulpinrichtingen nodig zijn.

De inrichting kan worden vervaardigd uit elk inert materiaal, zoals glas, polyetheen of elk ander geschikt kunststof materiaal en zelfs me-35 taal kan worden overwogen voor enkele speciale toepassingen.

De werkwijze voor het scheiden van twee vloeistoffasen volgens de uitvinding zal hierna worden geïllustreerd aan de hand van een aantal voorbeelden genomen uit het immuniteitsonderzoek, waarbij een zuivere scheiding absoluut vereist is, zonder dat de werkwijze is begrensd tot 40 dit gebied.

800 6 73 0 Η

Gemakheidshalve zal in de volgende voorbeelden de nieuwe schei-dingsinrichting voor vloeistofextractie volgens de uitvinding "Lidex"-separator worden genoemd en de "buis A” van de Lidex-separator betekent het mengreservoir A in deze beschrijving en de figuren en "menger B” 5 van de Lidex-separator betekent het gehele component B in de beschrijving en figuren.

Voorbeeld I

Extractie-efficiency-studies met de Lidex-separator onder toepasing 10 van radio-isotope merken_

Teneinde de geschiktheid van een oplosmiddel of mengsel van oplosmiddelen voor de extractie van een verbinding uit een waterige oplossing te bepalen, levert de volgende procedure zeer snelle en nauwkeuri-15 ge resultaten op. Twaalf buizen A van de Lidex-separator werden genummerd van 1 t/m 12. In elke buis A werden toegevoegd 500 /ul van een EDTA fosfaatbufferoplossing gevolgd door 200/til van een oplossing bevattende een digoxine derivaat gelabelleerd met het radio-lsotoop jodium 125. (Deze oplossing werd bereid door het reconstitueren van een 20 commercieel beschikbaar digoxine-I-125-derivaat (Ames) met 12 ml van de EDTA-fosfaatbuffer, pH 7,4, bevattend 1,2 g dinatriumfosfaat en 0,6 di-natrium EDTA in 100 ml van gedeloniseerd water). De radioactiviteit in buizen Al t/m 12 werd gemeten in een gamma-teller. Elke telling werd tweemaal uitgevoerd, elke keer gedurende 30 seconden. Aan elke buis 25 werd daarna 1,4 ml van oplosmiddelen als volgt toegevoegd: (a) buis 1 en 2, tert-amylalcohol; (b) buis 3 en 4, een mengsel van tert-amylalcohol/methylisobutylketon (MIBK) met een volumeverhouding van 9:1; 30 (c) buizen 5 en 6, tert-amylalcohol/MIBK, 3:1 (volumeverhouding); i (d) buizen 7 en 8, tert-amylalcohol/MIBK, 1:1; (e) buizen 9 en 10, MIBK en (f) buizen 11 en 12, tert-butylether.

(Alle bovengenoemde oplosmiddelen en oplosmengsels zijn vooraf in even-35 wicht gebracht met dezelfde EDTA fosfaatbuffer).

Na de volgende toevoeging van de oplosmiddelen werd een menger-se-parator B van de Lidex-separator als een stop ingestoken in de bovenzijde van elk van de buizen A, 1-12 en elk van deze samengestelde Lidex-separatoren ondergingen een wervelbewerking gedurende 30 secon-40 den. (Door toepassing van een geschikte schotel zouden alle Lidex-sepa- 8 00 6 73 0 15 ratoren tegelijkertijd een wervelbewerking kunnen ondergaan). Na de wervelmenging konden de Lidex-separatoren gedurende 10 minuten in rust komen, waarna een bovenste en een onderste vloeistoffase werden gevormd. Vervolgens werd de menger-separator B van elke Lidex-separator 5 1-12 geleidelijk in de buis A ingedrukt voorzover het kon gaan (de

Lidex-separatoren gebruikt in deze experimenten, werden zodanig geconstrueerd, dat bij een maximale indrukking van de menger-separator B, 0,5 ml van de onderste vloeistoffase in de buis A overbleef, dat 0,2 ml in het kanaal C was en de gehele bovenste fase (1,4 ml) in de verzamel-10 houder E was). Elk van de Lidex-separatoren 1-12 werd daarna in de opening van de gamma-teller geplaatst en de radio-activiteit in de onderste fase (achterblijvend in buis A) werd geteld zoals hierboven is genoemd, tweemaal voor elke buis en elke keer gedurende 30 seconden.

De resultaten zoals samengevat in de volgende tabel A, tonen dat de 15 nauwkeurigheid van de metingen zeer bevredigend is. Experimenten uitgevoerd om de nauwkeurigheid van de metingen te bepalen, geven aan dat als gevolg van instrumentele variaties in de opneemgeometrie van de gamma-tellers er een variatie in nauwkeurigheid van de bepaling van de extractie-efficiency tot aan 1% zou kunnen zijn.

80 0 6 73 0 16 TABEL A Extractie efficiëntie bepaald met Lidex-separatoren

Extractie Buis Totale Tellingen % rest-radio % Extrac- Gemid- oplosmid- No. tel- van waterige activiteit tie-effi- delde delen lingen fase na in waterige cientie (+ SD) _scheiding fase_ tert-amyl 1 26264 1299 ' 4,9 95,1 alcohol/ 1 26131 1360 5,2 94,8 94,8+0,2 2 26770 1403 5,3 94,7 2 26442 1340 5,1 94,9 tert-amyl 3 26165 1670 6,3 93,7 alcohol/ 3 26219 1626 6,2 93,8 94,3+0,6 MIBK 4 26178 1343 5,1 94,9 (9:1) 4 26350 1380 5,2 94,8 tert-amyl 5 26397 1426 5,4 94,6 alcohol/ 5 26631 1461 5,5 94,5 94,6+0,1 MIBK 6 26474 1402 5,3 94,7 (3:1) 6 26073 1388 5,3 94,7 tert-amyl 7 26104 1848 7,0 93,0 alcohol/ 7 26291 1891 7,2 92,8 93,6+0,9 MIBK 8 26215 1458 5,5 94,5 (1:) 8 26797 1528 5,8 94,2 MIBK 9 26123 3332 12,7 87,3 9 26290 3308 12,6 87,4 87,3+0,05 10 26491 3347 12,7 87,3 10 26399 3312 12,6 87,4 tert-butyl 11 26191 2332 8,9 91,1 methyl 11 26592 2201 8,4 91,6 90,9+0,7 ether 12 26032 2435 9,2 90,8 12 26311 2360 10»° 90»° 8 0 0 6 73 0 17

Voorbeeld II

Extractie efficientie-studies met de Lidex-separator onder toepassing van flnoriserende merken.__

Een experiment dat op dat van voorbeeld I lijkt, toonde de mogelijkheid aan van de toepassing van de bovenste fase voor metingen, die in de verzamelhouder E van de Lidex-separator is gescheiden. De voorge-stelde gegevens beschrijven de toepassing van fluoriserende merken om de extractie efficiëntie van oplosmiddelen te bepalen, maar zij gelden duidelijk voor andere bepalingen, zoals bijvoorbeeld niet-isotopische immuniteitsonderzoeken onder toepassing van fluoriserende labels of andere niet-isotopische labelleringsmiddelen, alsmede radio-isotopische labels, indien de vrije ongebonden fractie moet worden gemeten.

Twee standaardoplossingen van 5 x 10-½ Rhodamine B werden bereid, éên in dubbel gedestilleerd water en één in tert-amylalcohol. Deze oplossingen werden gebruikt voor het verdunnen om werkoplossingen van de gewenste concentraties van 5 x 10“^M, 4,5 x 10-¾ 4.0 x 10-5M, 2,5 x 10-5M, 2,25 x 10-5M,

2.0 x 10-5M, 1,0 x 10-5M en 0,5 x 10-5M

te verkrijgen. Calibratiecurven werden met deze oplossingen verkregen door toepassing van een fluorescentie-spectrofotometer van Perkin-Hel-mer model MPF-44B met een excitatiegolflengte van 430 nm en emissie-golflengte van 615 nm.

Zestien buizen A van de Lidex-separator werden genummers van 1 t/m 16. In de buizen 1 en 2 werd als controles 0,7 ml water aangebracht. Daarna werd in de buizen 3 t/m 16 0,7 ml van de hierboven genoemde werkoplossingen van Rhodamine B in water aangebracht, elk van de hierboven genoemde zeven concentraties in duplo. Dit werd gevolgd door de toevoeging van 1,4 ml van tert-amylalcohol (vooraf verzadigd met water) aan elke buis A 1 t/m 16.

Een menger B van de Lidex-separator werd als een stop ingestoken in de bovenzijde van elk van de buizen A en daarna werden gedurende 20 seconden alle 16 samenstellingen van de Lidex-separatoren aan een wervel-behandeling onderworpen. Na gedurende 10 minuten tot rust komen werd de menger B van elke samenstelling 1 t/m 16 geleidelijk ingedrukt in de buizen A, zoals beschreven is in het voorbeeld I. De bovenste fase die naar de verzamelhouder E van elke Lidex-separator bewoog, werd uitge-schonken in een spectrofotometercel en het flucrescentie-signaal werd gemeten. De concentratie van Rhodamine B in elke buis werd bepaald uit η η n R 7 3 n 18 de calibratiecurve door interpolatie van het hierboven verkregen fluorescentiesignaal, waarbij rekening werd gehouden met de verdun-ningsfactor (2:1) gebruikt in het bovengenoemde experiment. Het resultaat gaf aan dat extractie van Rhodamine B in de tert-amylalcoholoplos-5 sing optrad met 90-93% efficiëntie.

Indien gewenst zal het bij het bovengenoemde experiment mogelijk zijn een Lidex-separator zodanig te construeren, dat de verzamelhouder E van de menger B een afzonderlijk deel is dat bijvoorbeeld van kwarts of pyrex of een ander geschikt materiaal voor fluorescentiemetingen is 10 vervaardigd en dat aan de menger-separator B is bevestigd voor de fase-scheidingsstap. Na de fasescheiding, waarbij de bovenste fase zich in de verzamelhouder E bevond, kon de gehele Lidex-samenstelling worden geplaatst in een gemodificeerde celhouder van de fluorescentie-spectro-fotometer. Dit zou de stap van het uitschenken van de bovenste fase in 15 de cel elimineren en de gehele handeling zou gemakkelijk kunnen worden geautomatiseerd. Zoals in de eerste alinea van dit voorbeeld is gesteld, zou dezelfde procedure kunnen worden toegepast, indien bijvoorbeeld een tritium-gelabelleerd materiaal als een merker werd gebruikt. Volgend op de fasescheiding kon de bovenste fase in de verzamelhouder E 20 waarin de tritium-gelabelleerde merker was afgescheiden, worden uitgeschonken in de scintillatievloeistof en worden gebracht naar een scin-tillatieteller voor radioactiviteitsmetingen.

Voorbeeld III

25 Digoxine radio-immuniteitsonderzoek uitgevoerd met de Lidex-separator.

Teneinde de werking, de betrouwbaarheid, de eenvoud, het gemak van bediening en andere voordelen van de Lidex-separator in immuniteitson- i derzoeken te demonstreren werden twee experimenten paralleel uitge-30 voerd: (I) een in de handel verkrijgbare uitrusting voor digoxine radio- (R) immuniteitsonderzoek RIALYZEV ’ (Antes), waarbij gebruik wordt gemaakt van chromatografe buizen als scheidingsstelsel om 35 de vrije en gebonden fracties te scheiden; (ii) gebruikmaking van dezelfde reagensen, echter was het onderzoek-protocol gebaseerd op de toepassing van de Lidex-separator.

Alle componenten van de uitrusting werden gereconstitueerd volgens de gebruiksaanwijzing. Gedupliceerde onderzoekbuizen werden gelabel-40 leerd voor totale tellingen van standaarden A, B, C, D en E. Eveneens 800 6 73 0 19 werden gedupliceerde onderzoekbuizen gelabelleerd I, II en III voor elk DADE-controleserum (TRI-YACV , drie-niveau-radio-immuni-teitsonderzoekcontrole, niveau I, niveau II en niveau III).

Voor het parallelle Lidex-separatorstelsel werden gedupliceerde 5 buizen A van de Lidex-separator gelabelleerd voor totale tellingen, nulstandaard en standaarden A, B, C, D en E. Eveneens werden drie buizen A van de Lidex-separator gelabelleerd voor elk DADE-controleserum I, II en III.Een volume van 100 /ul van het gereconstitueerde 1-125-digoxinereagens werd aan alle onderzoekbuizen toegevoegd. Een buffer 10 (50 /ul) werd toegevoegd aan de onderzoekbuizen van totale telling en nulstandaaard. Aan de op geschikte wijze gelabelleerde standaardbuizen werd 50 /ul van elke standaard toegevoegd en 50 /ul van elk contro-leserum werd toegevoegd aan de buizen gelabelleerd I, II en III.

Een volume van 100 /ul van gereconstitueerd antiserum 'werd aan 15 alle buizen toegevoegd met uitzondering van de buis van totale tellingen, waaraan 100 /ul van de onderzoekbuffer werd toegevoegd. Alle buizen ondergingen een incubatie gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Na de incubatietijd volgden diverse procedures voor elk stel: 20 (i) aan elke testbuis van de RIALYZE-kit werd een chromatografiebuis ingestoken en gedurende 10 minuten in staat gesteld tot rust te komen, waarna 0,8 ml van de buffer aan elke testbuis werd toegevoegd, die gedurende verdere 10 minuten tot rust kon komen. De buizen werden daarna ten aanzien van radioactiviteit in een 25 gamma-teller geteld.

(ii) Aan elke buis A van de Lidex-kit werd 350 /ul buffer toegevoegd (voor volumeinstelling), gevolgd door de toevoeging van 1,4 ml van het extractie-oplossingsmengsel (tert-amyl) alcohol/MIBK in een 30 verhouding van 3:1) dat vooraf met de onderzoekbuffer is verza digd. Een menger B van de Lidex-separator werd als een stop in de bovenzijde van elk van de buizen A Ingestoken en alle Lidex-separator samenstellingen werden gedurende 30 seconden aan een wervelbehandeling onderworpen.

35

De samenstellingen werden in staat gesteld gedurende 10 minuten tot rust te komen (voor vloeistoffasescheiding) en de menger B van elke Lidex-samenstelling werd geleidelijk in de buis A gedrukt voorzover het kon gaan. De Lidex-samenstellingen werden geplaatst in de opening van 40 de gamma-teller om de radioactiviteit van de waterige fase te meten, 800 6 73 0 > 20 die op de bodem van. de buis A overbleef. De resultaten van de radioactieve tellingen werden berekend als " Bound/Total" voor de in de handel verkrijgbare "RIALYZE" kit (zoals beschreven in de instructies daarvan) en als "Bound/Bound zero" voor het Lidex-systeem.

De resultaten voor beide experimenten werden uitgezet op het gra-5 fiekpapier van de kit op "logit"-schaal versus log (digoxineconcentra-tie) en zijn in fig. 6 getoond. Uit deze curven werden de digoxinewaar-den (ng/ml) van de controlesera bepaald. De gemiddelde waarden van alle resultaten en composities van de gevonden waarden voor de controlesera met die van andere, in de handel verkrijgbare kits zijn samengevat in de 10 tabellen B en C. Zoals uit de in fig. 6 getoonde grafiek en de digoxi-neconcentratiewaarde bepaald voor de controlesera, gaf de Lidex-separa-tor volledig aanvaardbare resultaten voor het digoxine-onderzoek.

8 00 6 73 0

Vergelijking tussen jodium-125-digoxine-radio-immuniteitsonderzoek met "Rialyzekit" (Ames) en met de Lidex-separator._ 21

Tabel B

Standaarden Digoxine- RIALYZE KIT LIDEX SEPARATOR

Concentratie gemiddeld % vrij gemiddeld % _(ng/ml)_(F/T)_B/Bo A 0,6 33,6 77,0 ' B 1,0 48,1 67,0 C 2,0 65,8 46,3 D 2,8 75,7 39,3 E 4,6 83,8 27,9

Controle Niveau I 40,5 67,8

Sera Niveau II 61,5 47,6

Niveau III 72,7 37,6

Tabel C

Referentiecontrolewaarden (ng/ml) berekend uit resultaten van Tabel B en fig. 6 en vergelijking met gepubliceerde DADE waarden.___ DADE RIALYZE LIDEX Gebied van waarden . * controle KIT (AMES) SEPARATOR DADE CORNING KALESTA D (3H) DATA-Tope (1-125) Quantitope __Immunofase_ niveau I 0,78 0,92 0,71-1,06 0,64-1,04 0,77-1,37 niveau II 1,65 2,05 1,55-2,17 1,40-2,10 1,48-2,4 niveau III 2,6 3,0 2,64-3,49 2,3 -3,5 2,33-3,52 8006730

Claims

1. Inrichting voor het uitvoeren van massa-overdracht van één of meer componenten van één vloeistoffase naar een andere vloeistoffase, gepaard gaande met een fysiche scheiding van de twee fasen, waarbij 5 beide bewerkingen in dezelfde inrichting worden uitgevoerd, met het kenmerk, dat de inrichting bestaat uit een mengreservoir (A) waarin een meng-scheidingsinrichting (B) nauw past, die is voorzien van ten minste één kanaal (C) verlopend langs de verticale hartlijn van de meng-scheidingsinrichting (B), welke laatstgenoemde aan zijn bovenste einde de 10 vorm heeft van een verzamelhouder (E) waarin de bovenste vloeistoffase uit het mengreservoir (A), dat door het kanaal (C) wordt aangezogen, wordt verzameld en fysisch overgebracht, wanneer de meng-scheidingsinrichting ζΒ) wordt gedrukt in het mengreserevoir (A).

2. Inrichting volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de basis 15 van de meng-scheidingsinrichting (B) een afdichtingselement heeft dat ten minste één mondstukboring bezit die door zijn dikte verloopt, welke boring in verbinding staat met het kanaal (C).

3. Inrichting volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het afdichtingselement verschuifbaar is langs de binnenwanden van het mengreser- 20 voir (A) en in goed contact staat met de genoemde binnenwanden van het mengreservoir (A).

4. Inrichting volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het afdichtingselement bestaat uit een 0-ring van rubber met een mondstukboring die met het kanaal (C) in verbinding staat, welke ring langs de binnen- 25 wanden van het mengreservoir (A) kan worden verschoven.

5. Inrichting volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat slechts het onderste deel van de meng-scheidingsinrichting (B) nauw past in het mengreservoir (A).

6. Inrichting volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het kanaal 30 (C) slechts verloopt door het onderste deel van de verticale hartlijn van de meng-scheidingsinrichting (B).

7. Inrichting volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het mengreservoir (A) ten minste twee lengtesleuven bezit, die in de wanden daarvan zijn aangebracht en overeenkomen met hetzelfde aantal uitsteeksels 35 aanwezig op de meng-scheidingsinrichting (B), waardoor het laten glijden van de meng-scheidingsinrichting (B) in het mengreservoir (A) wordt vergemakkelijkt.

8. Inrichting volgens conclusie 1 t/m 7, met het kenmerk, dat het mengreservoir (A) een cilindrische vorm heeft.

9. Inrichting volgens conclusies 1 t/m 7, met het kenmerk, dat het 8 00 6 73 0 25 mengreservoir (A) is voorzien van een schaal voor volumemetingen.

10. Inrichting volgens conclusies 1 t/m 7, met het kenmerk, dat een ring (D) is geplaatst tussen het boveneinde van het mengreservoir (A) en de verzamelhouder (E), die op de meng-scheidingsinrichting (B) kan 5 worden verschoven en het niveau van het indrukken van de meng-schei-dingsinrichting (B) in het mengreservoir (Δ) bepaalt.

11. Inrichting volgens conclusies 1 t/m 7, met het kenmerk, dat de verzamelhouder (E) wijder is dan de buitendiameter van het mengreservoir (A) op een bepaalde hoogte vanaf het boveneinde van de meng-schei- 10 dingsinrichting (B).

12. Inrichting volgens conclusies 1 t/m 7, met het kenmerk, dat de inrichting is vervaardigd uit een inert materiaal.

13. Inrichting volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat het inert materiaal is gekozen uit de groep omvattende glas, polyetheen of elk 15 ander geschikt kunststofmateriaal en metaal.

14. Werkwijze voor het uitvoeren van massa-overdracht van êén of meer componenten van êên fase naar een andere fase gevolgd door een fysische scheiding van de twee fasen, waarbij de massa-overdracht en fysische scheiding worden uitgevoerd in dezelfde inrichting, gekenmerkt 20 door het inbrengen van de twee met elkaar in contact te brengen vloeistoffen in het mengreservoir (A), het mengen van de componenten, het laten vormen van een grensvlak tussen de twee vloeistoffen en het indrukken van de meng-scheidingsinrichting (B) tot een gewenst niveau, waarbij de bovenste vloeistoffase wordt aangezogen door het kanaal (C) 25 tot in de verzamelhouder (E).

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat deze wordt toegepast voor een immnuniteitsonderzoek.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat het immu-niteitsondserzoek wordt gekozen uit radio-immuniteitsonderzoek, vrij 30 radikaal onderzoek, fluorescentie-immuniteitsonderzoek, enzym-immuni-teitsonderzoek of metaal-immuniteitsonderzoek.

17. Werkwijze volgens conclusies 14 t/m 16, met het kenmerk, dat een kit voor immuniteitsonderzoek wordt toegepast.

18. Werkwijze volgens conclusies 14 t/m 16, met het kenmerk, dat 35 deze automatisch wordt uitgevoerd.

19. Werkwijze volgens de conclusies 14 t/m 18, met het kenmerk, dat deze wordt toegepast op digoxine.

20. Werkwijze volgens conclusies 14 t/m 18, met het kenmerk, dat deze wordt toegepast op estradiol, progesteron, testosteron.

21. Werkwijze volgens conclusies 14 t/m 18, met het kenmerk, dat 800 6 73 0 deze wordt toegepast op T4.

22. Werkwijze volgens conclusies 14 t/m 18, met het kenmerk, dat deze wordt toegepast op T3.

23. Werkwijze volgens conclusies 14 t/m 18, met het kenmerk, dat 5 deze worden toegepast op barbituraten.

24. Werkwijze volgens conclusies 14 tot 18, dat deze wordt toegepast op cannabinoiden.

25. Werkwijze volgens conclusies 14 tot 18, met het kenmerk, dat deze wordt toegepast op morfine.

26. Kit voor radio-immuniteitsonderzoek, vrij radikaal onderzoek, fluorescentie-immuniteitsonderzoek, enzym-lmmuniteitsonderzoek, of me-taal-immuniteitsonderzoek omvattende de inrichting volgens de conclusies 1 t/m 13 voor het uitvoeren van massa-overdracht. SSSS3 8 0 0 6 73 0