NL1029828C2 - Conjugaten van glycerol-vertakt polyethyleenglycol en menselijk groeihormoon, werkwijzen voor de bereiding daarvan en werkwijzen voor gebruik daarvan. - Google Patents

Description

• .'

CONJUGATEN VAN GLYCEROL-VERTAKT POLYETHYLEENGLYCOL EN 5 MENSELIJK GROEIHORMOON, WERKWIJZEN VOOR DE BEREIDING DAARVAN EN WERKWIJZEN VOOR GEBRUIK DAARVAN

De onderhavige aanvrage roept de voorrang in van de Ameri-10 kaanse aanvrage 60/605.945, die werd ingediend op 31 augustus 2004 en die hierin in zijn geheel wordt opgenomen als referentie.

GEBIED VAN DE UITVINDING

15

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op de PEG-ylering van menselijk groeihormoon (hGH), waardoor de chemische en/of fysiologische eigenschappen van hGH veranderd kunnen worden. Het gePEG-yleerde hGH-conjugaat kan een 20 verhoogde plasmaverblijftijd, een verlaagde klaringssnel-heid, verbeterde stabiliteit, verlaagde antigeniteit, verlaagde heterogeniteit in PEG-ylering of een combinatie daarvan hebben. De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op werkwijzen voor de modificatie van hGH. Daarnaast 25 heeft de onderhavige uitvinding betrekking op farmaceutische preparaten die het gemodificeerde hGH bevatten. Een verdere uitvoeringsvorm is het gebruik van het gemodificeerde hGH voor de behandeling van groei- en ontwikkelingsstoornissen.

30

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING

Natief menselijk groeihormoon (hGH) is een eiwit dat bestaat uit een enkele keten van 191 aminozuren die 35 door twee disulfidebruggen verknoopt zijn, en de monomere vorm heeft een molecuulgewicht van 22 kDa. Menselijk GH | wordt afgescheiden door de hypofyse en kan ook worden i i? ° <5 8 2 8 2 geproduceerd door middel van genetische manipulatie. hGH zal groei veroorzaken in alle lichaamsweefsels die in staat zijn tot groei. hGH speelt een belangrijke rol niet alleen bij het bevorderen van groei in de groeifase van menselijke 5 wezens, maar ook bij het behouden van de normale lichaams-samenstelling, anabolisme en lipidemetabolisme (K. Barneis en U. Keiler, Baillieres Clin. Endocrinol. Metab. 10: 337 (1996) ) .

Recombinant hGH is al enkele jaren commercieel 10 verkrijgbaar. Er zijn twee typen van therapeutisch bruikbare recombinante hGH-preparaten op de markt aanwezig: het authentieke, bijv. Genotropin™ of Nutropin™, en een analo-gon met een additionele methioninerest aan het N-terminale uiteinde, bijv. Somatonorm™. hGH wordt gebruikt om de 15 lengtegroei te stimuleren in patiënten met hypo-hypofysaire dwerggroei, ook wel Groeihormoondeficiëntie (GHD) of het syndroom van Turner genoemd, maar er zijn ook andere indicaties gesuggereerd, waaronder langdurige behandeling van groeifalen in kinderen die te klein waren voor hun 20 zwangerschapsduur (SGA), voor de behandeling van patiënten met het syndroom van Prader-Willi (PWS), chronische nierin-sufficiëntie (CRI), uitputting door AIDS en veroudering. Volwassen patiënten met GH-deficiëntie (aGHD) hebben diverse problemen, zoals kenmerkende veranderingen in 25 lichaamssamenstelling, waaronder een toename in vetmassa, een afname in magere vetmassa en extracellulaire vloeistof, en vermindering in minerale botdichtheid, metabole afwij-kingen in lipiden en cardiovasculaire disfunctie. Veel van deze problemen worden verbeterd door hGH-vervangingsthera-30 pie (J. Verhelst, J. en R. Abs., Drugs; 62: 2399 (2002).

Een belangrijk biologisch effect van groeihormoon (GH) is om groei in jonge zoogdieren en onderhoud van weefsels in oudere zoogdieren te bevorderen. De orgaansys-temen die beïnvloed worden, omvatten het skelet, bindweef-35 sel, spieren en zachte weefsels zoals lever, darmen en nieren. Groeihormonen oefenen hun effect uit door middel van interactie met specifieke receptoren op het membraan 3 van de doelcel. hGH is een lid van een familie van homologe hormonen, die lactogenen uit de placenta, prolactinen en andere genetische en soortvarianten van groeihormoon omvatten (Nicoli, C.S. et al. (1986) Endocrine Reviews 7: 5 169) . hGH is hiervan ongewoon, omdat het een brede soort- specificiteit vertoont en bindt aan ofwel de gekloneerde j somatogene (Leung, D.W. et al. [1987] Nature 330/ 537) of prolactinereceptor (Boutin, J.M. et al. [1988] Cell; 53: 69) . Het gekloneerde gen voor hGH is tot expressie gebracht 10 in een afgescheiden vorm in Escherichia coli (Chang, C.N. et al. [1987] Gene 55: 189) en zijn DNA- en aminozuurse-quentie is beschreven (Goeddel et al. [1979] Nature 281: 544; Gray et al. [1985] Gene 39: 247).

Menselijk groeihormoon (hGH) neemt deel aan een 15 groot deel van de regulatie van normale menselijke groei en ontwikkeling. Dit hypofysehormoon vertoont een groot aantal biologische effecten, waaronder lengtegroei (somatogenese), lactatie, activering van macrofagen, insuline-achtige en diabetogene effecten en andere (Chawla, R.K. (1983) Ann.

20 Rev. Med. 34, 519; Edwards, C.K. et al. (1988) Science 239, 769; Thomer, M.0. et al. (1988) J. Clin. Invest. 81: 745). Groeihormoondeficiëntie in kinderen leidt tot dwerggroei, die gedurende meer dan tien jaar succesvol behandeld is door exogene toediening van hGH.

25 In volwassenen alsook in kinderen behoudt hGH een normale lichaamssamenstelling door verhoging van stikstof-retentie en stimulatie van skeletspiergroei en door de mobilisatie van lichaamsvet. Zacht vetweefsel reageert in het bijzonder op hGH. Naast verhoogde lipolyse verlaagt hGH 30 de opname van triglyceriden in opslagplaatsen van lichaamsvet. Serumconcentraties van IGF-I (insuline-achtige groeifactor) en IGFBP3 (insuline-achtige groeifactorbindend eiwit 3) worden verhoogd door hGH.

hGH is een krachtig anabool middel, vooral als 35 gevolg van de retentie van stikstof, fosfor, kalium en calcium. Behandeling van ratten na hypofysectomie met GH kan ten minste een gedeelte van de groeisnelheid van de f 4 ratten herstellen. Moore et al., Endocrinology 122: 2920-2926 (1988). Eén van de meest opvallende effecten in hypo-hypofysaire (GH-deficiënte) patiënten is een versnelde lengtegroei van botgroeiplaatkraakbeen, hetgeen resulteert 5 in een toegenomen lengte. Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C.

Thomas, 1964) .

hGH veroorzaakt een verscheidenheid aan fysiologische en metabole effecten in diverse diermodellen, waaron-10 der lengtegroei, lactatie, activering van macrofagen, insuline-achtige en diabetogene effecten en andere (R.K. Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34: 519 (1983); O.G.P. Isaksson et al., Annu. Rev. Physiol. 47, 483 (1985); C.K. Edwards et al., Science 239, 769 (1988); M.O. Thomer en 15 M.L. Vance, J. Clin. Invest. 82: 745 (1988); J.P. Hughes en H.G. Friesen, Ann. Rev. Physiol. 47: 469 (1985)). Er is beschreven dat, vooral in vrouwen na de menopauze, GH-afscheiding afneemt met de leeftijd. Millard et al., Neurobiol. Aging, 11: 229-235 (1990); Takahashi et al., 20 Neuroendocrinology M, L6; 137-142 (1987). Zie ook Rudman et al., J. Clin. Invest., 67: 1361-1369 (1981) en Blackman,

Endocrinology and Aging, 16: 981 (1987). Bovendien bestaat er een artikel dat sommige van de verschijnselen van veroudering, waaronder een afname in magere lichaamsmassa, 25 uitbreiding van vetweefselmassa en dunner worden van de huid, verminderd kunnen worden door GH-behandeling drie keer per week. Zie bijv. Rudman et al., N. Eng. J. Med., 323: 1-6 (1990) en het begeleidende artikel in hetzelfde nummer van het tijdschrift door Dr. Vance (pg. 52-54). Deze 30 biologische effecten ontstaan uit de interactie tussen hGH en specifieke cellulaire receptoren. Twee verschillende menselijke receptoren zijn gekloneerd, de hGH-receptor uit de lever (D.W. Leung et al., Nature 330: 537 (1987)) en de menselijke prolactinereceptor (J.M. Boutin et al., Mol. 35 Endocrinology, 3: 1455 (1989)). Er zullen echter waar schijnlijk andere zijn, waaronder de lactogeenreceptor uit menselijke placenta (M. Freemark, M. Corner, G. Komer en S.

« 5

Handwerger, Endocrinol. 120: 1865 (1987)). Deze homologe receptoren bevatten een geglycosyleerd extracellulair hormoonbindend domein, een enkel transmembraandomein en een cytoplasmatisch domein, dat aanzienlijk verschilt in 5 sequentie en omvang. Vermoedelijk spelen één of meer receptoren een bepalende rol in de fysiologische reactie op hGH.

In het algemeen wordt gezien dat fysiologisch actieve eiwitten die aan een lichaam worden toegediend, hun 10 farmacologische activiteit slechts een korte periode kunnen vertonen als gevolg van hun hoge klaringssnelheid in het lichaam. Verder kan de relatieve hydrofobiteit van deze eiwitten hun stabiliteit en/of oplosbaarheid beperken.

Om de klaringssnelheid te verlagen, stabiliteit te 15 verbeteren of de antigeniteit van therapeutische eiwitten te verwijderen, zijn enkele werkwijzen voorgesteld waarbij de eiwitten worden gemodificeerd met wateroplosbare polymeren. Chemische modificatie van dit type kan een proteoly-tisch enzym effectief blokkeren tegen fysiek contact met 20 het eiwitskelet zelf, waardoor dan afbraak voorkomen wordt. Chemische hechting van bepaalde wateroplosbare polymeren kan effectief de klaring door de nier verlagen als gevolg van een verhoogd hydrodynamisch volume van het molecuul. Additionele voordelen omvatten, onder bepaalde omstandighe-25 den, het verhogen van de stabiliteit en circulatietijd van het therapeutische eiwit, het verhogen van de oplosbaarheid en het verlagen van de immunogeniteit._Poly(alkyleenoxide), met name poly(ethyleenglycol) (PEG), is zo'n chemische rest die gebruikt is bij de bereiding van therapeutische eiwit-30 producten (de uitdrukking "PEG-yleren" betekent het hechten van ten minste één PEG-molecuul) . Aangetoond is dat de hechting van poly(ethyleenglycol) beschermt tegen proteoly-se. Sada et al., J. Fennentation Bioengineering 71: 137-139 (1991) en werkwijzen voor de hechting van bepaalde poly(e-35 thyleenglycol)-resten zijn beschikbaar. Zie Amerikaans Octrooischrift 4.179.337, Davis et al., Non-Immunogenic Polypeptides, uitgegeven op 18 december 1979; en Amerikaans 6

Octrooischrift 4.002.531, Rover, Modifying Enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby, uitgegeven op 11 januari 1977. Voor een overzichtsartikel zie Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs (J.S. Holcerberg en 5 J. Roberts, red., 367-383 (1981)).

Er zijn andere wateroplosbare polymeren gebruikt, zoals copolymeren van ethyleenglycol/propyleenglycol, carboxymethylcellulose, dextraan, poly(vinylalcohol), poly(vinylpyrrolidon), poly(1,3-dioxolaan), poly(l,3,6- 10 trioxaan), ethyleen/maleïnezuuranhydride-copolymeer, polyaminozuren (ofwel homopolymeren of willekeurige copolymeren) .

Voor poly(ethyleenglycol) is een verscheidenheid aan middelen gebruikt om de poly(ethyleenglycol)-moleculen 15 aan het eiwit te hechten. In het algemeen worden poly(ethyleenglycol) -moleculen aan het eiwit gebonden via een reactieve groep die op het eiwit gevonden wordt. Aminogroe-pen, zoals die op lysineresten of aan het N-uiteinde, zijn geschikt voor een dergelijke hechting. Bijvoorbeeld Royer 20 (Amerikaans Octrooischrift 4.002.531, hierboven genoemd) beweert dat reductieve alkylering werd gebruikt voor de hechting van poly(ethyleenglycol)-moleculen aan een enzym. Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994) be schrijven de modificatie van het immuunadhesine CD4 met 25 monomethoxypoly (ethyleenglycol) aldehyde via reductieve alkylering. Amerikaans Octrooischrift 5.824.784 toont de PEG-ylering van G-CSF, waaronder aan het N-uiteinde, onder reductieve alkyleringsomstandigheden.

WO 93/00109 heeft betrekking op een werkwijze voor 30 het stimuleren van op GH reagerende weefsels van zoogdieren en vogels, waarbij een continue, effectieve GH-concentratie in plasma gedurende een periode van 3 of meer dagen werd aangehouden. Eén manier om een dergelijke plasmaconcentra-tie te bereiken, is naar men beweert het gebruik van GH 35 gekoppeld aan macromoleculaire stoffen zoals PEG (polyethy-leenglycol). De koppeling aan een macromoleculaire stof resulteert, naar men beweert, in een verbeterde halfwaarde- a ι 7 tijd. GePEG-yleerd menselijk groeihormoon is beschreven in WO 93/00109, waarbij gebruik werd gemaakt van mPEG-aldehyde 5000 en mPEG-N-hydroxysuccinimidylester (mPEG-NHS-5000) om een hydrodynamisch volume groter dan de grenswaarde voor de 5 nierfiltratie van 70K molecuulgewicht zoals beschreven te bereiken (Knauf, M.J. et al., J. Biol. Chem. 263: 15064- 15070, 1988). Het gebruik van mPEG-NHS resulteerde in heterogene mengsels van meerdere gePEG-yleerde vormen van hGH. WO 93/00109 beschrijft ook het gebruik van mPEG-10 maleimide om cysteïne-varianten van hGH te PEG-yleren.

WO 99/03887 beschrijft een cysteine-variant groeihormoon dat gePEG-yleerd is. Er wordt beweerd dat dit conjugaat, aangeduid met BT-005, effectiever is bij het stimuleren van gewichtstoename in groeihormoondeficiënte 15 ratten en dat het een langere halfwaardetijd heeft dan hGH.

GePEG-yleerd menselijk groeihormoon is ook beschreven door Clark et al., die gebruikt maakten van de succinimidylester van gecarboxymethyleerd PEG (Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996). Clark et al. 20 beschrijven derivaten van hGH van toenemende grootte met behulp van mPEG-NHS-5000, dat selectief conjugeert aan primaire aminen. Modificatie met toenemende hoeveelheden PEG verlaagde de affiniteit voor zijn receptor en verhoogde de EC50 in een celgebaseerde bepaling tot 1500 keer. Olson 25 et al., Polymer Preprints 38: 568-569, 1997, beschrijven het gebruik van N-hydroxysuccinimide- (NHS-) PEG en succi-nimidylpropionaat- (SPA-) PEG om een groot aantal gePEG-yleerde hGH-soorten te verkrijgen.

WO 94/20069 beschrijft profetisch gePEG-yleerd hGH 30 als deel van een formulering voor afgifte aan de long.

US 4.179.337 beschrijft werkwijzen voor de PEG-ylering van enzymen en hormonen om fysiologisch actieve, niet-immunogene, wateroplosbare polypeptideconjugaten te verkrijgen. GH wordt genoemd als één voorbeeld van een 35 hormoon om te PEG-yleren.

EP 458064 A2 beschrijft de PEG-ylering van ingebrachte of van nature aanwezige cysteïneresten in somatot- 8 ropine. EP 458064 A2 vermeldt verder de inbouw van twee cysteineresten in een lus genaamd de omegalus, die naar beweerd gelocaliseerd is op de resten 102-112 in wild-type somatotropine van het rund en meer specifiek beschrijft EP 5 458064 A2 de substitutie van de resten met nummer 102 en 112 van somatotropine van het rund van respectievelijk Ser in Cys en Tyr in Cys.

WO 95/11987 suggereert de hechting van PEG aan de thiogroep van een cysteïnerest, die ofwel aanwezig is in 10 het moedermolecuul of ingebracht door middel van plaatsge-richte mutagenese. WO 95/11987 heeft betrekking op de PEG-ylering van protease nexine-1, maar PEG-ylering in het algemeen van hGH en andere eiwitten wordt eveneens gesuggereerd.

15 WO 99/03887 beschrijft bijv. groeihormoon gemodi ficeerd door vervanging van serine op positie 25 door een cysteïnerest en de hechting van PEG aan de ingebrachte cysteïnerest.

WO 00/42175 heeft betrekking op een werkwijze voor 20 het maken van eiwitten die vrije cysteineresten bevatten voor de hechting van PEG. WO 00/42175 beschrijft de volgende muteïnen van hGH: T3C, S144C en T148C en de cysteïne-PEG-ylering daarvan.

WO 97/11178 (evenals US 5849535, US 6004931 en US 25 6022711) heeft betrekking op het gebruik van GH-varianten als agonisten of antagonisten van hGH. WO 97/11178 beschrijft ook PEG-ylering van hGH, inclusief lysine-PEG-ylering en het inbrengen of vervangen van lysine (bijv. K168A en K172R). WO 97/11178 beschrijft ook de substitutie 30 G120K.

WO 03/044056 beschrijft een verscheidenheid aan gePEG-yleerde hGH-soorten, waaronder een op lysine vertakt 40K PEG-aldehyde-hGH-conjugaat.

US 2004/0127417 beschrijft op lysine vertakte PEG-35 butyraldehyde-hGH-conjugaten.

WO 04/46222, US 205/0058620, JP 08-059818, JP 11-228685 en JP 2000-001541 beschrijven polyalkyleenglycolde- 9 rivaten met een reactieve groep op het eerste koolstofatoom op de 1-positie van een glycerolskelet en met polyalkyleen-glycolketens op de 2- en 3-posities.

US 2004/0142870 heeft betrekking op een chemisch 5 gemodificeerd hGH dat bereid wordt door een polyethyleen-glycolbutyraldehyderest te hechten aan het N-terminale fenylalanine van het eiwit. Dit gemodificeerde hGH heeft een langer durende hGH-activiteit dan het niet-gemodificeerde hGH, waardoor het mogelijk wordt de doses te vermin-10 deren.

WO 02/055532 heeft betrekking op conjugaten die GH-activiteit vertonen en die ten minste één niet-polypep-tiderest omvatten welke covalent gebonden is aan een GH-polypeptide, waarvan de aminozuursequentie verschilt van 15 wild-type hGH in ten minste één geïntroduceerde en ten minst één verwijderde aminozuurrest die een aanhechtings-groep voor de niet-polypeptiderest omvat. De niet-polypep-tiderest kan bijvoorbeeld een PEG-rest zijn. Voor een dergelijk PEG-molecuul wordt een MW van 20 kDA genoemd.

20 WO 2005/075021 heeft betrekking op chemisch gemodificeerde hGH receptor antagonisten die bereid worden door een enkele polyethyleenglycolrest aan het N-uiteinde te hechten, in het bijzonder aan fenylalanine. Het gemodificeerde hGH heeft een verminderde PEG-ylering heterogeni-25 teit en mogelijk een verhoogde bindingsaffiniteit.

EP 1.333.036 heeft betrekking op een polyethyleen-glycol-geconjugeerd erythropoietine (PEG-geconjugeerd EPO) dat bereid wordt door (mono)-PEG-conjugatie aan de lysine-rest op positie 52 van natief EPO.

30 Momenteel gebeurt toediening van rhGH dagelijks over een lange periode en daarom zou een minder frequente toediening hoogst gewenst zijn. Een hGH-molecuul met een langere halfwaardetijd in de circulatie zou het aantal noodzakelijke toedieningen verlagen en mogelijk meer 35 optimale therapeutische hGH-concentraties verschaffen met tegelijkertijd een verhoogd therapeutisch effect.

10

Ondanks een aantal pogingen om een langlevende vorm van hGH te ontwikkelen, waaronder gePEG-yleerd, is er nog steeds een ongestilde behoefte aan een gePEG-yleerd hGH-molecuul met geschikte eigenschappen om een levensvat-5 baar commercieel product te zijn. De onderhavige uitvinding verschaft PEG-hGH-conjugaten met een enkel PEG voornamelijk gehecht aan het N-terminale fenylalanine van hGH, wat voordelen ten opzichte van andere PEG-hGH-conjugaten verschaft. De hechting van meerdere laag-moleculaire (5 kD) 10 PEG's op a- of e-aminoplaatsen (N-uiteinde en negen lysinen in hGH) met behulp van mPEG-aldehyde-5000 of mPEG-N-hy-droxysuccinimidylester (mPEG-NHS-5000) is beschreven in WO 93/00109, door Clark et al. (Journal of Biological Chemis-try 271: 21969-21977, 1996) en door Olson et al. (Polymer 15 Preprints 38: 568-569, 1997). Dit resulteert in een heterogene populatie. Ter illustratie kan hGH met negen lysinen sommige moleculen met tien PEG's gehecht, sommige met negen, sommige met acht, sommige met zeven, sommige met zes, sommige met vijf, sommige met vier, sommige drie, 2 0 sommige met twee, sommige met één en sommige met nul hebben. En van de moleculen met meerdere kan het PEG niet gehecht zijn op dezelfde locatie op verschillende moleculen. Deze resulterende heterogeniteit is een nadeel wanneer een therapeutisch product wordt ontwikkeld, omdat dit 25 conjugatie, zuivering en karakterisering moeilijk, kostbaar en zeer onreproduceerbaar maakt. Een andere benadering (WO 00/42175) was om hGH-varianten met vrije cysteïneresten te gebruiken voor de hechting van PEG. Deze benadering resulteert echter in een onnatuurlijke hGH-variant en kan ook 30 leiden tot incorrect gevouwen eiwit met incorrect gepaarde disulfidebindingen, hetgeen resulteert in een heterogeen gePEG-yleerd product dat het PEG gehecht heeft op sommige of alle cysteïnen. Meerdere PEG's gehecht aan meerdere plaatsen kan leiden tot moleculen die minder stabiele 35 bindingen hebben tussen het PEG en de verschillende plaatsen die met verschillende snelheden gedissocieerd kunnen raken. Dit maakt het moeilijk om nauwkeurig de farmacokine- 11 tiek van het product te voorspellen, hetgeen resulteert in een onnauwkeurige dosering. Een heterogeen product zorgt ook voor ongewenste problemen bij het verkrijgen van regulatoire goedkeuring voor het therapeutische product.

5 Het zou daarom gewenst zijn om een gePEG-yleerd hGH-molecuul te hebben dat een enkel PEG gehecht heeft op een enkele plaats. De onderhavige uitvinding richt zich op deze behoefte op een aantal manieren.

10 SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op gePEG-yleerd hGH, waarvoor gebruik wordt gemaakt van een glycerol-vertakte poly(ethyleenglycol)-rest, dat ten minste 15 één verbeterde chemische of fysiologische eigenschap heeft die gekozen wordt uit, maar niet beperkt tot: verlaagde klaringssnelheid, verhoogde plasmaverblijfduur, verhoogde stabiliteit, verbeterde oplosbaarheid en verlaagde antige-niteit. Zoals hieronder in meer detail beschreven, heeft de 20 onderhavige uitvinding dus een aantal aspecten met betrekking tot het chemisch modificeren van hGH met behulp van een glycerol-vertakte poly(ethyleenglycol)-rest.

De onderhavige uitvinding kan ook één of meer verbeterde eigenschappen hebben in vergelijking met conju-25 gaten van op lysine gebaseerd vertakt PEG/menselijk groeihormoon, waaronder, maar niet beperkt tot: a) verhoogde stabiliteit van het glycerolskelet, b) verhoogde receptor-binding, c) verlaagde kosten, d) verhoogde N-terminale selectiviteit van hechting, e) verhoogde oplosbaarheid, f) 3 0 verlaagde immunogeniteit, g) verhoogde stabiliteit van het conjugaat, h) verhoogde produceerbaarheid en i) verlaagde proteolyse.

De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op werkwijzen voor het produceren van gePEG-yleerd hGH. In het 35 bijzonder heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een werkwijze voor het produceren van een gePEG-yleerd hGH met behulp van een glycerol-vertakt PEG.

β 12

De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op preparaten die het gePEG-yleerde hGH alleen bevatten of in combinatie met een ander therapeutisch middel. De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op het gebruik van het 5 gePEG-yleerde hGH van de onderhavige uitvinding, alleen of in combinatie met een ander therapeutisch middel, bij de voorkoming en/of behandeling van stoornissen en/of ziekten waarbij behandeling met GH nuttig is.

10 KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN

Figuur 1 is een afbeelding van op grootte scheidende HPLC, waarin het elutieprofiel van het gezuiverde enkelvoudig gePEG-yleerde glycerol-vertakt 43K PEG-aldehy-15 de-hGH-reactieproduct op een TSK G4000PWXL-kolom wordt getoond.

Figuur 2 is een HPLC-afbeelding van de tryptische kaartanalyse van hGH en glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH. De bovenste deelfiguur is de tryptische kaart van hGH. 20 De onderste deelfiguur is de tryptische kaart van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH. Tl is het N-terminale tryptische fragment.

Figuur 3 toont de aminozuursequentie van menselijk groeihormoon (SEQ ID Nr. 1).

25 Figuur 4 toont de werkzaamheid van glycerol-ver

takt 43K PEG-aldehyde-hGH in een elf dagen durende bepaling van gewichtstoename in de rat. Vrouwelijke Sprague-Dawley ratten met hypofysectomie werden op een leeftijd van 4-5 weken (85 - 110 g) betrokken van Harlan Labs. Na binnen-30 komst in de dierenverblijven werden de dieren bij een constante kamertemperatuur van 80°F gehouden. Na 3 dagen acclimatisering werden de ratten dagelijks gewogen gedurende 4 - 10 dagen om basale groeisnelheden vast te stellen. Beginnend op dag 0 ontvingen ratten (-100 g) in controle-35 groepen dan één dagelijkse subcutane injectie van -0,3 mg/kg hGH (a) of PBS als drager (·) gedurende elf achtereenvolgende dagen. De testgroep met glycerol-vertakt 43K

13 PEG-aldehyde-hGH () ontving enkele doses van 1,8 mg/kg glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH op dag 0 en 6. Er waren 6 dieren per groep. Uitgezette waarden staan voor gemiddelde gewichtstoename ± SEM.

5 Figuur 5 toont de groei van het scheenbeen over elf dagen als reactie op glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH. De dieren waren die welke behandeld werden in Figuur 4. De dieren werden gedood na het opnemen van het gewicht op dag 11, er werden röntgenopnames van de linker scheenbe-10 nen gemaakt en de bot lengte werd gemeten met behulp van een schuifmaat. De gemiddelde lengte ± SEM is uitgezet. Sterretjes duiden op significante verschillen ten opzichte van de controlegroep (P < 0,05). Er waren 6 dieren per groep.

Figuur 6 toont ureumstikstofconcentraties in bloed 15 op dag 11 als reactie op glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH. Bloedmonsters werden genomen van de dieren die behandeld werden zoals voor Figuur 4. Serum werd bereid en ureumstikstofconcentraties werden gemeten. Het gemiddelde ± SEM is uitgezet (6 dieren per groep). Sterretjes duiden op 20 significante verschillen ten opzichte van de controlegroep (P < 0,05).

Figuur 7 toont een studie naar de werkzaamheid van een zes dagen durende oplopende dosering van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH. Deze groeistudie werd uitgevoerd 25 op een manier vergelijkbaar met die welke beschreven is voor Figuur 4, behalve dat alleen op dag 0 variërende enkele doses van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde/hGH werden toegediend en de studie over 6 dagen werd gedaan. Controlegroepen ontvingen eenmaal per dag subcutane injec-30 ties van ofwel 0,3 mg/kg hGH (♦) of PBS als drager (o) gedurende zes achtereenvolgende dagen. De testgroep met glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH ontving een enkele dosis van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH op dag 0. De doses van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH waren 35 1,8 mg/kg () , 0,6 mg/kg (X), 0,2 mg/kg ( + ) , 0,067 mg/kg (a). Er waren 6 dieren per groep.

14

Figuur 8 toont IGF-1-concentraties in serum voor een zes dagen durende studie naar werkzaamheid. De dieren werden behandeld zoals beschreven voor Figuur 7. Bloedmonsters werden genomen op de diverse tijdstippen die uitgezet 5 zijn, en de IGF-1-concentraties in serum werden bepaald met ELISA. Gemiddelden van de groepen (n=6) werden gebruikt om de IGF-1-reactie te berekenen met behulp van de éénwegs variantieanalyse op de gemiddelde waarden en de waarden voor de AUC dO-6 (ng/ml * 24 uur) van 37.839, 28.1292, 10 22.958 en 20.040 werden bepaald voor de cohorten met een dosering van respectievelijk 1,8, 0,6, 0,2 en 0,067 mg/kg.

Figuur 9 toont de bepaling van PK/PD na toediening van een enkele dosis van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH aan vrouwelijke ratten na hypofysectomie. Het effect 15 van de toediening van een enkele SC dosis van 1,8 mg/kg van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH op de plasmaconcen-tratie van het geneesmiddel (a) of de reactie van IGF-1 in plasma (b).

2 0 GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op conjugaten van glycerol-vertakt polyethyleenglycol-menselijk groeihormoon. In een specifieke uitvoeringsvorm heeft 25 het glycerol-vertakt polyethyleenglycolderivaat een reac-tieve aldehydegroep en eventueel een linker tussen het polyethyleenglycol en de reactieve functionele groep op het eerst koolstofatoom op de 1-positie van een glycerolskelet en met polyalkyleenglycolketens op de 2- en 3-posities, 30 zoals beschreven in WO 04/46222 of US 2005/0058620 (hierin opgenomen als referentie) om hGH-conjugaten te maken. De linker is niet in het bijzonder beperkt, zolang als het maar een covalente binding is, maar hij omvat bij voorkeur een alkyleengroep en een alkyleengroep met een esterbin-35 ding, een urethaanbinding, een amidebinding, een etherbin-ding, een carbonaatbinding, of een secundaire aminegroep. Bij voorkeur omvat de alkyleengroep een methyleengroep, een 15 ! ethyleengroep, een trimethyleengroep, een propyleengroep, ! een isopropyleengroep, een tetramethyleengroep, een buty- leengroep, een isobutyleengroep, een pentamethyleengroep en een hexamethyleengroep.

5 Een specifieke uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is een menselijk groeihormoon-PEG-conjugaat met de structuur met de Formule:

H2C-0(CH2CH20)nCH2CH2CH2NHR

10 CH-0(CH2CH20)mCH3 15 H2C-OCCHsCHsOj^CHs waarin n een geheel getal tussen 60 en 75 is; m een geheel getal tussen 450 en 460 is; 20 R een menselijk groeihormoonpeptide is.

In een bijzondere uitvoeringsvorm ligt n tussen ongeveer 64 en ongeveer 72.

In een speciale uitvoeringsvorm heeft de rest 25 (CH2CH20)n een gemiddeld molecuulgewicht tussen ongeveer 2,6 en ongeveer 3,5 Kd en in het bij zonder is het gemiddelde molecuulgewicht ongeveer 3 Kd.

In een speciale uitvoeringsvorm heeft elke rest (CH2CH20)m een gemiddeld molecuulgewicht tussen ongeveer 30 17,6 en ongeveer 22 Kd en in het bijzonder is het gemid delde molecuulgewicht ongeveer 20 Kd.

In een specifieke uitvoeringsvorm heeft de rest (CH2CH20)n een gemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 3 Kd en elke rest (CH2CH20)m heeft een gemiddeld molecuulgewicht 35 van ongeveer 20 Kd.

De term "ongeveer" indien gebruikt in verband met het molecuulgewicht van een PEG-rest betekent dat in 16 preparaten van polyethyleenglycol sommige moleculen meer zullen wegen, sommige minder dan het aangegeven molecuulge-wicht en het aangegeven molecuulgewicht verwijst naar het gemiddelde molecuulgewicht. Het zal duidelijk zijn dat er 5 enige graad van polydispersiteit geassocieerd is met polymeren zoals poly(ethyleenglycol). Het heeft de voorkeur om PEG's met lage polydispersiteit te gebruiken. In een specifieke uitvoeringsvorm is één van de eindstandige hydroxylgroepen van het polymeer omgezet in of bedekt met 10 een methylgroep. Zoals hierin gebruikt, verwijst de term "mPEG" naar een PEG dat aan één uiteinde bedekt is met een methylgroep. Het mPEG kan structureel worden voorgesteld als

15 CH30-(CH2CH20)n-H

De term "menselijk groeihormoon", "hGH-polypepti-de" of "hGH-eiwit", indien hierin gebruikt, omvat alle hGH-polypeptiden die worden gekenmerkt doordat ze groei bevor-2 0 deren in de groeifase en bij het behouden van de normale lichaamssamenstelling, anabolisme en lipidemetabolisme. Bij voorkeur verwijst de term "hGH-polypeptide" naar het hGH-polypeptide van SEQ ID Nr. 1.

De hGH-polypeptiden van de onderhavige uitvinding 25 kunnen op elke geschikte manier worden bereid. Dergelijke hGH-polypeptiden en fragmenten daarvan kunnen worden gezuiverd uit natuurlijke bronnen,, chemisch worden gesynthetiseerd, geproduceerd met recombinante technieken, waaronder in vitro translatietechnieken of expressie in een 30 recombinante cel die in staat is hGH-cDNA tot expressie te brengen, of een combinatie van deze werkwijzen met behulp van technieken die bekend zijn bij de deskundigen in het vak (zie bijvoorbeeld "Methods in Enzymology, Academie Press, 1993" voor een verscheidenheid aan werkwijzen voor 35 het zuiveren van eiwitten; Creighton (1983), Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., 2de editie, T.E., New York; en Hunkapiller et al. (1984) 17

Nature, 310 (5973) : 105-11 voor de chemische synthese van eiwitten, en Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, red., Elsevier Press, NY, voor recombinante technieken, welke beschrijvingen in hun geheel worden opgenomen 5 als referentie) . De polypeptiden van de onderhavige uitvinding worden bij voorkeur verschaft in geïsoleerde vorm en ze kunnen gedeeltelijk of bij voorkeur in grote mate gezuiverd zijn.

Een specifieke uitvoeringsvorm van de onderhavige 10 uitvinding is een menselijk groeihormoon-PEG-conjugaat, waarin meer dan 80%, met meer voorkeur 81%, met meer voorkeur 82%, met meer voorkeur 83%, met meer voorkeur 84%, met meer voorkeur 85%, met meer voorkeur 86%, met meer voorkeur 87%, met meer voorkeur 88%, met meer voorkeur 89%, 15 met meer voorkeur 90%, met meer voorkeur 91%, met meer voorkeur 92%, met meer voorkeur 93%, met meer voorkeur 94%, met meer voorkeur 95%, met meer voorkeur 96%, met meer voorkeur 97% en met meer voorkeur 98% van het polyethy-leenglycol geconjugeerd is aan het aminoterminale fenylala-20 nine van het menselijke groeihormoon met SEQ ID Nr. 1.

Een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is een hoofdzakelijk homogeen preparaat van N-terminaal gePEG-yleerd hGH, eventueel in een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel, drager of adjuvans, waarbij 25 dit preparaat in wezen vrij is van hGH dat gePEG-yleerd is op plaatsen anders dan het N-uiteinde. De term "hoofdzakelijk homogeen preparaat" betekent een preparaat waarin meer dan 80%, met meer voorkeur 81%, met meer voorkeur 82%, met meer voorkeur 83%, met meer voorkeur 84%, met meer voorkeur 30 85%, met meer voorkeur 86%, met meer voorkeur 87%, met meer voorkeur 88%, met meer voorkeur 89%, met meer voorkeur 90%, met meer voorkeur 91%, met meer voorkeur 92%, met meer voorkeur 93%, met meer voorkeur 94%, met meer voorkeur 95%, met meer voorkeur 96%, met meer voorkeur 97% en met meer 35 voorkeur 98% enkelvoudig gePEG-yleerd is.

In één uitvoeringsvorm van de uitvinding worden secundaire aminekoppelingen gevormd tussen de N-terminale i , 18 primaire α-aminogroep van een hGH-polypeptide en een ' glycerol-vertakte PEG-keten-aldehyde door middel van reductieve alkylering zoals beschreven door Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994), Amerikaans Octrooi - 5 schrift 4.002.531, WO 90/05534 en Amerikaans Octrooischrift 5.824.784 met een geschikt reducerend zoals NaCNBH3, NaBH3, pyridine-boraan enz. Het glycerol-vertakt PEG-aldehyde wordt geincubeerd met een hGH-polypeptide, hetgeen resulteert in de toevoeging van de PEG-rest aan aminogroepen via 10 de vorming van een Schiffse base. Deze koppelingen worden omgezet in stabiele secundaire aminen door reductie met een reducerend middel. Het proces van reductieve alkylering is afgebeeld in het schema hieronder (uit Chamow et al.).

1 · 19 VHz Qn

+ JC-CHg-OR

5 Araine- COOH

bevattend ' pH 5-9 eiwit t nh2 (^^yN^jcH-CHg-OR |

10 COOH

I NaCNBH3 NH2 NHjcHg-CHg-ORl

COOH

Conjugatiereacties, "PEG-yleringsreacties" genoemd, werden in het verleden uitgevoerd in oplossing met 20 een molaire overmaat aan polymeer en ongeacht waar het polymeer zal hechten aan het eiwit. Dergelijke algemene technieken zijn echter in het algemeen inadequaat gebleken voor het conjugeren van biologisch actieve eiwitten aan niet-antigene polymeren, terwijl ze voldoende biologische 25 activiteit behouden. Eén manier om de biologische activiteit van hGH te behouden, is om hoofdzakelijk conjugatie van die reactieve groepen van hGH te vermijden die geassocieerd zijn met de receptorbindende plaats (en) in de werkwijze voor polymeerkoppeling. Een ander aspect van de 30 onderhavige uitvinding is om een werkwijze te verschaffen voor het conjugeren van poly(ethyleenglycol) aan hGH, waarbij hoge niveaus van behouden activiteit behouden blij ven.

De chemische modificatie via een covalente binding 35 kan worden uitgevoerd onder alle geschikte omstandigheden die overgenomen worden in een reactie van een biologisch actieve stof met het geactiveerde poly(ethyleenglycol). De i 20 conjugatiereactie wordt uitgevoerd onder relatief milde omstandigheden om inactivering van het hGH te vermijden.

Milde omstandigheden omvatten het behouden van de pH van de reactieoplossing in het traject van 3 - 10 en de reactie-5 temperaturen binnen het traject van ongeveer 0° - 37°C. In de gevallen dat de reactieve aminozuurresten in hGH vrije j aminogroepen hebben, wordt de bovengenoemde modificatie bij voorkeur uitgevoerd in een niet-beperkende reeks van geschikte buffers (pH 4 - 10) , waaronder fosfaat, MES,

10 citraat, acetaat, succinaat of HEPES, gedurende 1-48 uur bij 4° - 37°C. Bij het richten naar N-terminale aminogroepen met reagentia zoals PEG-aldehyden wordt bij voorkeur pH

4-8 aangehouden. Het geactiveerde poly(ethyleenglycol) kan worden gebruikt in ongeveer 0,01 - 100 keer, bij 15 voorkeur ongeveer 0,01 - 2,5 keer de molaire hoeveelheid van het aantal vrije aminogroepen van hGH.

Hoewel de hierin beschreven reactieomstandigheden kunnen resulteren in aanzienlijke hoeveelheden ongemodificeerd hGH, kan het ongemodificeerde hGH gemakkelijk worden 20 gerecycleerd in latere partijen voor additionele conjuga-tiereacties. Met de werkwijzen van de onderhavige uitvinding wordt verrassenderwijs zeer weinig, d.w.z. minder dan ongeveer 20% en met meer voorkeur minder dan ongeveer 10% aan hoog-moleculaire soorten en soorten met meer dan één 25 polymeerstreng per hGH geproduceerd. Deze reactieomstandig heden staan in tegenstelling tot die welke in het algemeen worden gebruikt voor polymere conjugatiereacties, waarbij het geactiveerde polymeer in enkele keren molaire overmaat aanwezig is ten opzichte van het doelwit.

30 De conjugatiereacties van de onderhavige uitvinding verschaffen in eerste instantie een reactiemengsel of i pool, die mono-PEG-hGH-conjugaten, ongereageerd hGH, ongereageerd polymeer en minder dan ongeveer 20% hoog-moleculaire soorten bevat. De hoog-moleculaire soorten 35 omvatten conjugaten met meer dan één polymeerstreng en/of gepolymeriseerde PEG-hGH-soort. Nadat de ongereageerde soorten en hoog-moleculaire soorten verwijderd zijn, worden • , 21 preparaten met voornamelijk enkelvoudig gePEG-yleerde hGH-conjugaten teruggewonnen. Gezien het feit dat de conjugaten voor het grootste gedeelte een enkele polymeerstreng omvatten, zijn de conjugaten in grote mate homogeen. Deze 5 gemodificeerde hGH's hebben ten minste ongeveer 0,1% van de in vitro biologische activiteit die geassocieerd is met het natieve of ongemodificeerde hGH, wat gemeten wordt met behulp van standaard PDC-Pl-celproliferatiebepalingen (Clark et al., Journal of Biological Chemistry 271: 21969-10 21977, 1996), receptorbindingsbepaling (US 5.057.417) of de groei van ratten na hypofysectomie (Clark et al., Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996). In voor keursaspecten van de uitvinding heeft het gemodificeerde hGH echter ongeveer 25% van de in vitro biologische activi-15 teit, met meer voorkeur heeft het gemodificeerde hGH ongeveer 50% van de in vitro biologische activiteit, met meer voorkeur heeft het gemodificeerde hGH ongeveer 75% van de in vitro biologische activiteit en met de meeste voorkeur heeft het gemodificeerde hGH equivalente of verbeterde 20 in vitro biologische activiteit.

De werkwijzen van de onderhavige uitvinding omvatten bij voorkeur tamelijk beperkte verhoudingen van polymeer tot hGH. De hGH-conjugaten zijn dus voornamelijk beperkt gebleken tot soorten die slechts één polymeerstreng 2 5 bevatten. Verder is de hechting van het polymeer aan de reactieve groep van het hGH in grote mate minder willekeurig dan wanneer een hoge molaire overmaat van polymeerlin-ker wordt gebruikt. Het ongemodificeerde hGH dat aanwezig is in de reactiepool, nadat de conjugatiereactie geschrok-30 ken is, kan worden gerecycleerd in latere reacties, waarvoor ionenuitwisselingschromatografie of op grootte scheidende chromatografie of vergelijkbare scheidingstechnieken worden gebruikt.

Een met poly(ethyleenglycol) gemodificeerd hGH kan 35 uit een reactiemengsel worden gezuiverd met gebruikelijke werkwijzen die worden gebruikt voor de zuivering van eiwitten, zoals dialyse, uitzouten, ultrafiltratie, ionen- j 22 uitwisselingschromatografie, hydrofobe interactiechromato-grafie (HIC), gelchromatografie en elektroforese. Ionenuit-wisselingschromatografie is bijzonder effectief voor het verwijderen van ongereageerd poly(ethyleenglycol) en hGH.

5 In een verdere uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt de enkelvoudig gePEG-yleerde hGH-soort uit het reactiemengsel geïsoleerd om hoog-moleculaire soorten en ongemodificeerd hGH te verwijderen. Scheiding wordt bewerkstelligd door de gemengde soorten in een bufferoplossing met ongeveer 0,5 -10 10 mg/ml van de hGH-polymeerconjugaten te plaatsen. Ge schikte oplossingen hebben een pH van ongeveer 4 tot ongeveer 10. De oplossingen bevatten bij voorkeur één of meer buf f er zout en, die gekozen wordt uit KCl, NaCl, K2HP04, KH2P04, Na2HP04, NaH2P04, NaHC03, NaB04, CH3C02H en NaOH.

15 Afhankelijk van de reactiebuffer kan het zijn dat de buffer met het hGH-polymeerconjugaat eerst uitwisse-ling/ultrafiltratie moet ondergaan om alle ongereageerd polymeer te verwijderen. De oplossing met het PEG-hGH-conjugaat kan bijvoorbeeld worden ge-ultrafiltreerd over 20 een membraan met een lage grenswaarde voor molecuulgewicht (10.000 - 30.000 Dalton) om het grootste gedeelte van de ongewenste materialen te verwijderen, zoals ongereageerd polymeer, oppervlakteactieve stoffen, indien aanwezig, en dergelijke.

25 De fractionering van de conjugaten in een pool met de gewenste soort wordt bij voorkeur uitgevoerd met behulp van een medium voor ionenuitwisselingschromatografie. Dergelijke media zijn in staat tot selectieve binding van PEG-hGH-conjugaten via verschillen in lading, die op 30 enigszins voorspelbare manier varieert. De oppervlaktela-ding van hGH wordt bijvoorbeeld bepaald door het aantal beschikbare geladen groepen op het oppervlak van het eiwit. Deze geladen groepen dienen in het algemeen als het punt van potentiële hechting van poly(alkyleenoxide)-polymeren. 35 Daarom zullen hGH-conjugaten een lading hebben verschillend van de andere soorten, hetgeen selectieve isolatie mogelijk maakt.

*02 98 28 .

23

Sterk polaire anionen- of kationenuitwisselings-harsen zoals respectievelijk quaternaire amine- of sulfo-propylharsen worden gebruikt voor de werkwijze van de onderhavige uitvinding. Anionenuitwisselingsharsen hebben 5 vooral de voorkeur. Een niet-beperkende lijst van daartoe behorende commercieel verkrijgbare kationenuitwisselings-harsen die geschikt zijn voor gebruik met de onderhavige uitvinding, zijn SP-hitrap®, SP Sepharose HP® en SP Sepha-rose ® Fast Flow. Andere geschikte anionenuitwisselings-10 harsen, bijv. S- en CM-harsen, kunnen ook gebruikt worden. Een niet-beperkende lijst van anionenuitwisselingsharsen, inclusief commercieel verkrijgbare anionenuitwisselingsharsen die geschikt zijn voor gebruik met de onderhavige uitvinding, zijn Q-hitrap®, Q Sepharose HP® en Q Sepharose® 15 Fast Flow. Andere geschikte anionenuitwisselingsharsen, bijv. DEAE-harsen, kunnen ook gebruikt worden.

De anionen- of kationenuitwisselingshars wordt bijvoorbeeld bij voorkeur gepakt in een kolom en geëquili-breerd met gebruikelijke middelen. Een buffer met dezelfde 20 pH en osmolaliteit als de oplossing met het met polymeer geconjugeerde hGH wordt gebruikt. De elutiebuffer bevat bij voorkeur één of meer zouten, die gekozen worden uit KC1, NaCl, K2HP04, KH2P04, Na2HP04, NaH2P04, NaHC03, NaB04 en (NH4)2C03. De conjugaatbevattende oplossing wordt dan op de 25 kolom geadsorbeerd, waarbij ongereageerd polymeer en sommige hoog-moleculaire soorten niet worden vastgehouden. Na voltooiing van de belading wordt een gradiëntstroom van een elutiebuffer met oplopende zoutconcentraties op de kolom gebracht om de gewenste fractie van hGH met geconju-30 geerd polyalkyleenoxide te elueren. De geëlueerde samengevoegde fracties zijn bij voorkeur beperkt tot gelijkvormige polymeerconjugaten na de scheidingsstap met kationen- of anionenuitwisseling. Alle ongeconjugeerde hGH-soorten kunnen daarna van de kolom terug gewassen worden met 35 gebruikelijke technieken. Indien gewenst, kunnen enkelvoudig en meervoudig gePEG-yleerde hGH-soorten verder van elkaar gescheiden worden via additionele ionenuitwisse- « * 24 lingschromatografie of op grootte scheidende chromatogra-f ie.

Er kunnen ook technieken gebruikt worden waarbij meerdere isocratische stappen van oplopende zoutconcentra-5 tie of pH gebruikt worden. Meerdere isocratische elutie-stappen met oplopende concentratie zullen resulteren in de achtereenvolgende elutie van di- en daarna mono-hGH-poly-meerconj ugaten.

Het temperatuurtrajeet voor elutie ligt tussen 10 ongeveer 4°C en ongeveer 25°C. Bij voorkeur wordt elutie uitgevoerd bij een temperatuur van ongeveer 4°C tot ongeveer 22°C. De elutie van de PEG-hGH-fractie wordt bijvoorbeeld gedetecteerd aan de hand van de UV-absorptie bij 280 nm. Fractieverzameling kan worden bereikt door middel van 15 eenvoudige tijd-elutie-profielen.

Er kan een oppervlakteactieve stof worden gebruikt in de werkwijzen voor het conjugeren van het poly(ethyleen-glycol)-polymeer met de hGH-rest. Geschikte oppervlakteactieve stoffen omvatten middelen van het ionische type zoals 20 natriumdodecylsulfaat (SDS) . Andere ionische oppervlakteactieve stoffen zoals lithiumdodecylsulfaat, quaternaire ammoniumverbindingen, taurocholinezuur, caprylzuur, decaan-sulfonzuur enz. kunnen ook gebruikt worden. Niet-ionische oppervlakteactieve stoffen kunnen ook gebruikt worden. Er 25 kunnen bijvoorbeeld materialen zoals poly(oxyethyleen)sor-bitans (Tweens), poly(oxyethyleen)ethers (Tritons) gebruikt worden. Zie ook Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem Corp. De enige beperkingen op de oppervlakteac-30 tieve stoffen die gebruikt worden in de werkwijzen van de uitvinding, is dat ze gebruikt worden onder omstandigheden en in concentraties die geen aanzienlijke irreversibele denaturatie van het hGH veroorzaken en die niet compleet polymeerconjugatie remmen. De oppervlakteactieve stoffen 35 zijn aanwezig in de reactiemengsels in hoeveelheden van ongeveer 0,01 - 0,5%; bij voorkeur van 0,05 - 0,5%; en met 25 de meeste voorkeur van ongeveer 0,075 - 0,25%. Mengsels van de oppervlakteactieve stoffen worden ook overwogen.

Men denkt dat de oppervlakteactieve stoffen een tijdelijk, reversibel beschermend systeem verschaffen 5 tijdens de polymeerconjugatiewerkwijze. Er is aangetoond dat de oppervlakteactieve stoffen effectief zijn bij het ontmoedigen van polymeerconjugatie, terwijl toegestaan wordt dat op lysine gebaseerde of op amino-uiteinde gebaseerde conjugatie verloopt.

10 Het onderhavige met poly(ethyleenglycol) gemodifi ceerde hGH heeft een langduriger farmacologisch effect, dat mogelijk toegekend kan worden aan zijn langere halfwaarde-tijd in vivo.

Een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding heeft 15 betrekking op werkwijzen voor de voorkoming en/of behandeling van een ziekte of stoornis waarbij het gebruik van GH, bij voorkeur hGH, heilzaam is, die omvatten het aan een patiënt die dat behoeft, toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een met poly(ethyleenglycol) 2 0 gemodificeerd hGH van de uitvinding of een agonistische variant daarvan, alleen of in combinatie met een ander therapeutisch middel. De uitvinding heeft ook betrekking op het gebruik van een met poly(ethyleenglycol) gemodificeerd hGH van de uitvinding of een agonistische variant daarvan 25 bij de productie van een geneesmiddel voor de voorkoming en/of behandeling van een ziekte of stoornis waarbij het gebruik van GH, bij voorkeur hGH, heilzaam is. Daarnaast heeft de uitvinding ook betrekking op een farmaceutisch preparaat dat een met poly(ethyleenglycol) gemodificeerd 30 hGH van de uitvinding of een agonistische variant daarvan bevat, voor de voorkoming en/of behandeling van een ziekte of stoornis waarbij het gebruik van GH, bij voorkeur hGH, heilzaam is.

Ziekten en stoornissen waarbij het gebruik van GH 35 heilzaam is, omvatten, maar zijn niet beperkt tot, groei-hormoondeficiëntie (GHD), volwassen groeihormoondeficiëntie (aGHD), het syndroom van Turner, groeifalen in kinderen die 26 klein voor hun zwangerschapsduur geboren werden (SGA), het syndroom van Prader-Willi (PWS), chronische nierinsuf-ficiëntie (CRI), uitputting door AIDS, veroudering, nier-insufficiëntie in het eindstadium, cystische fibrose, 5 erectiel disfunctioneren, lipodystrofie door HIV, fibromy-algie, osteoporose, geheugenstoornissen, depressie, de ziekte van Crohn, dysplasieën van het skelet, traumatisch hersenletsel, subarachnoïde bloeding, het syndroom van Noonan, het syndroom van Down, idiopathische korte li-10 chaamslengte (ISS), nierziekte in het eindstadium (ESRD), een zeer laag geboortegewicht (VLBW), het redden van stamcellen uit beenmerg, metabool syndroom, glucocortico-idmyopathie, een korte lengte als gevolg van glucocorti-coidbehandeling in kinderen en falen van groeiherstel voor 15 kleine premature kinderen.

In een meer specifieke uitvoeringsvorm van de uitvinding worden het met poly(ethyleenglycol) gemodificeerde hGH van de uitvinding of agonistische varianten daarvan gebruikt bij de voorkoming en/of behandeling van 20 stoornissen of ziekten die gekozen worden uit de groep die bestaat uit GHD, aGHD, SGA, PWS, het syndroom van Turner en CRI .

In een andere meer specifieke uitvoeringsvorm van de uitvinding worden het met poly(ethyleenglycol) gemodifi-25 ceerde hGH van de uitvinding of agonistische varianten daarvan gebruikt bij de voorkomen en/of behandeling van stoornissen of ziekten die gekozen worden uit de groep die bestaat uit idiopathische korte lichaamslengte, een zeer laag geboortegewicht, traumatisch hersenletsel, metabool 30 syndroom en het syndroom van Noonan.

Een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding heeft betrekking op farmaceutische preparaten die een met poly(e-thyleenglycol) gemodificeerd hGH van de uitvinding alleen of in combinatie met een ander therapeutisch middel en ten 35 minste één farmaceutisch aanvaardbare hulpstof of drager omvatten. Het onderhavige met poly (ethyleenglycol) gemodificeerde hGH kan dan worden geformuleerd tot farmaceutica 27 die ook een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel, een middel voor het bereiden van een isotone oplossing, een pH-stellend middel en dergelijke bevatten om ze toe te dienen aan een patiënt.

5 De bovengenoemde farmaceutica kunnen subcutaan, intramusculair, intraveneus, pulmonaal, intradermaal of oraal worden toegediend, afhankelijk van het doel van de behandeling. Een dosis kan ook gebaseerd zijn op de soort en toestand van de stoornis van een te behandelen patiënt, 10 waarbij deze normaal ligt tussen 0,1 mg en 5 mg voor een injectie en tussen 0,1 mg en 50 mg voor een orale toediening voor een volwassene.

Zoals hierin gebruikt, kunnen het met poly(ethy-leenglycol) gemodificeerde hGH of agonistische varianten 15 daarvan van de onderhavige uitvinding worden gebruikt in combinatie met een ander therapeutisch middel. Zoals hierin gebruikt, zijn de termen "gelijktijdige toediening", "gelijktijdig toegediend" en "in combinatie met", wanneer verwezen wordt naar de verbindingen A en één of meer andere 20 therapeutische middelen, bedoeld in de betekenis van, om te verwijzen naar en omvattend het volgende: O gelijktijdige toediening van een dergelijke combinatie van A en therapeutisch (e) mid-25 del (en) aan een patiënt die behandeling be hoeft, wanneer dergelijke componenten samen geformuleerd zijn in een enkele doseringsvorm die deze componenten op praktisch hetzelfde tijdstip aan de patiënt afgeeft; 30 O in grote mate gelijktijdige toediening van een dergelijke combinatie van A en therapeutisch (e) middel(en) aan een patiënt die behandeling behoeft, wanneer dergelijke componenten apart van elkaar geformuleerd zijn in afzon-35 derlijke doseringsvormen, die op praktisch hetzelfde tijdstip door de patiënt worden genomen, waarna deze componenten op praktisch 28 hetzelfde tijdstip aan de patiënt worden afgegeven ; O achtereenvolgende toediening van een dergelijke combinatie van A en therapeutisch(e) mid-5 del(en) aan een patiënt die behandeling be hoeft, wanneer dergelijke componenten apart van elkaar geformuleerd zijn in afzonderlijke doseringsvormen, die op achtereenvolgende tijdstippen door de patiënt worden genomen met 10 een aanzienlijk tijdsinterval tussen elke toediening, waardoor deze componenten op aanzienlijk verschillende tijdstippen aan de patiënt worden afgegeven; en O achtereenvolgende toediening van een dergelij-15 ke combinatie van A en therapeutisch (e) middel (en) aan een patiënt die behandeling be- j hoeft, wanneer dergelijke componenten samen in een enkele doseringsvorm geformuleerd zijn, waaruit deze componenten worden afgegeven op 20 een gecontroleerde manier, waardoor ze gelijk tijdig, achtereenvolgend en/of overlappend op dezelfde en/of verschillende tijdstippen aan de patiënt worden afgegeven.

Geschikte voorbeelden van andere therapeutische 25 middelen die gebruikt kunnen worden in combinatie met A, hun farmaceutisch aanvaardbare zouten en/of hun afgeleide vormen, omvatten, maar zijn op geen enkele manier beperkt tot: aromataseremmerns zoals exemestaan, formestaan, atamestaan, fadrozool, letrozool, vorozool en anastrozool; 30 middelen die vrije vetzuren regelen, waaronder fibrinezuur-derivaten (zoals fenofibraat, clofibraat, gemfibrozil, bezafibraat en ciprofibraat) en nicotinezuurderivaten zoals acipimox; insuline-sensibiliserende middelen, waaronder, maar niet beperkt tot biguaniden zoals metformine, PPAR-35 gamma-insuline-sensibiliserende middelen en thiazolodeni-onen zoals troglitazon en rosiglutazon, Troglitazon, 5- [ [4 -[3,4-dihydro-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-2H-]-benzopyran- 29 2-yl)methoxy]fenyl]methyl-3-2,4-thiazolidinedion V411 (DIA-BII, Glaucanin), Pioglitazon (ACTOS, AD 4833, U 72107, U 72107A, U 72107E, ZACTOS), chemische naam: 2,4-thiazolidi-nedion, 5-[[4-[2-(5-ethyl-2-pyridinyl)ethoxy]fenyl]methyl]-5 monohydrochloride, (a/-); Rosiglitazon (Avandia, BRL 49653, BRL 49653C), chemische naam: 2,4-thiazolidinedion, 5- [ [4- [2- (methyl-2-pyridinylamino)ethoxy]fenyl]methyl] ; 25

Bexaroteen-oraal (LGD 1069 oraal, Targretine oraal, Targre-tine oraal, Targexine oraal), chemische naam: 4-[Ι- ΙΟ (3,5,5,8,8-pentamethyl-5,6,7,8-tetrahydro-2-naftyl)ethe- nyl]benzoëzuur; ZD 2079 (ICI D2079) (chemische naam: (R)-N- [2,4-carboxymethyl)-30-fenoxy]ethyl)-N-(2-hydroxy-2-fene-thyl)-ammoniumchloride: Netoglitazon (Isaglitazon, MCC 555, RWJ 241947) (chemische naam: 5-[6-(2-fluorbenzyloxy)naftal-15 een-2-ylmethyl]thiazolidine-2,4-dion); INS (D-chiro-inosi-tol) (chemische naam: D-l,2,3,4,5,6-hexahydroxycyclo- hexaan), ON 2344 (DRF 2593) ; Dexlipotam, chemische naam: 5 (R) - (1,2-dithiolan-3-yl)-pentaan-35-zuur; HQL 975, chemische naam: 3-[4-[2-(5-methyl-2-fenyloxazool-4-yl)ethoxy]fe-20 nyl]-2(S)-(propylamino)propionzuur; YM 268, chemische naam: 5,5' -methyleen-bis(1,4-fenyleen)bismethyleenbis(thiazolidine-2,4-dion) . I PPAR-agonisten in ontwikkeling omvatten: Reglitazar (JTT 501, PNU 182716, PNU 716) (chemische naam: isoxazolidieen-3,5-dion, i 4-[[4-(2-fenyl-5-methyl)-1,3-25 oxazolyl]ethoxyfenyl-4]methyl-, (4RS)); I (RP 297, chemische naam: 10 5-(2,4-dioxothiazolidine-5-ylmethyl)-2- methoxy-N-[4-(trifluormethyl)benzylbenzamide; R 119702 (Cl 1037, CS 011), chemische naam: (I-)-5-[4-(5-methoxy-lH- benzimidazool - 2 - ylmethoxy) benzyl ] thiazoline-2,4-dion,-30 hydrochloride; 15 DRF 2189, chemische naam: 5-[[4- [2-(1- indolyl)ethoxy]fenyl]methyl]thiazolidine-2,4-dion; corti-solsyntheseremmers zoals ketoconazool, econazool of micona-zool; groeihormonen zoals somatotropine of somatonorm en hun derivaten zoals fusie-eiwitten van menselijk groei-35 hormoon zoals ALBUTROPIN; polyethyleen-groeihormonen zoals het cysteine-gePEG-yleerde groeihormoon, BT 005 (Bolder BioTechnology Ine.); groeihormoonsecretagogen zoals bij- ; 3o voorbeeld SM 130686 (Sumitomo), capromoreline (Pfizer), mecasermin (Fujisawa), sermoreline (Salk Institute, Bio-Technology General), somatrem, somatomedine (C Llorente; Pharmacia Corporation), examoreline, tabimoreline; CP 5 464709 (Pfizer), LY 426410 en LY 44471 (Lilly); 8-(aminoal- koxyimino) -8H-dibenzo [a, e] triazolo [4,5-c] cycloheptenen zoals beschreven in WO 2002057241, 2-gesubstitueerde dibenzo[a,e]1,2,3-triazolo [4,5-c] [7]annuleen-8-onen zoals beschreven in WO 2002056873, groeihormoonafgevende peptiden 10 GHRP-6 en GHRP-1 zoals beschreven in Amerikaans Octrooi-schrift 4.411.890 en de publicaties WO 89/07110, WO 89/-07111, B-HT920, hexareline en GHRP-2 zoals beschreven in WO 93/04081, of groeihormoonafgevend hormoon (GHRH, ook wel GRF genoemd) en analoga daarvan, somatomedinen waaronder 15 IGF-1 en IGF-2 en derivaten daarvan zoals SomatoKine - een recombinante fusie van insuline-achtige groeifactor-1 en zijn bindingseiwit, BP-3, alfa-2-adrenerge agonisten zoals clonidine, xylazine, detomidine en medetomidine, of serotonine- 5HTID-agonisten zoals sumitriptan, of middelen die 20 somatostatine of zijn afgifte remmen, zoals physostigmine en pyridostigmine, ThGRF 1-44 (Theratechnologies); L 165166 (Merck & Company); dipeptidederivaten zoals beschreven in WO 9858947, remmers van dipeptidylpeptidase IV zoals amino-acylpyrrolidinenitril zoals beschreven in US 6521644, WO 25 95/15309 en WO 98/19998; beta-amino-heterocyclische dipep- tidylpeptidaseremmers zoals die welke beschreven zijn in US 20030100563 en WO 2003082817; groeihormoonafgevende verbindingen zoals beschreven in US 20030055261, US 20030040483, EP 18 072, EP 83 864, WO 89/01711, WO 89/10933, WO 88/9780, 30 WO 83/02272, WO 91/18016, WO 92/01711, WO 93/04081, de Amerikaanse Octrooischriften 5.206.235, 5.283.241, 5.284.841, 5.310.737, 5.317.017, 5.374.721, 5.430.144, 5.434.261, 5.438.136, 5.494.919, 5.494.920, 5.492.916, 5.536.716 en 5.578.593, WO 94/13696, WO 94/19367, WO 35 95/03289, WO 95/03290, WO 95/09633, WO 95/11029, WO 95/- 12598, WO 95/13069, WO 95/14666, WO 95/16675, WO 95/16692, WO 95/17422, WO 95/ 17423, WO 95/34311 en WO 96/02530; 31 piperidinen, pyrrolidinen en hexahydro-lH-azepinen zoals beschreven in US 5804578, US 5783582, WO 2004007468, AMIDO SPIROPIPERIDINEN zoals beschreven in WO 0104119, 2-amino-5-pyrimidineazijnzuurverbindingen, waaronder 2-[(5,6-dime- 5 thyl-2-benzoimidazolyl)amino] -4-hydroxy-6-methyl-5-pyrimi-dineazijnzuur (2) en 2-[(5,6-dimethyl-2-benzoimidazolyl)-amino]-4-hydroxy-6-methyl-5-pyrimidineazijnzuur, ethylester zoals beschreven in US 6329383, benzimidazolen zoals beschreven in EP 1155014, analoge peptidylverbindingen 10 gerelateerd aan GRF en de peptiden van Amerikaans Octrooi -schrift 4.411.890, antagonisten van gonadotropine-afgevend hormoon zoals die welke beschreven zijn in WO 0170228, WO 0170227, WO 0170228, WO 0069433, WO 0004013, WO 09951595, WO 9951231-4, W09941251-2, WO 9921557, WO 9921553 en 6- 15 AZAINDOOLVERBINDINGEN zoals beschreven in WO 0053602, WO 0053185, WO 0053181, WO 0053180, WO 0053178, US 6288078; IGF-1-secretagogen; insuline-actige groeifactor-2 (IGF-2 of somatomedine A) en IGF-2-secretagogen; myostatine-antago-nisten en verbindingen die fibroblastengroeifactorreceptor-20 3 (FGFR-3) -tyrosinekinase remmen.

De polymere stoffen die omvat worden, zijn ook bij voorkeur wateroplosbaar bij kamertemperatuur. Een niet-beperkende lijst van dergelijke polymeren omvat poly(alky-leenoxide)-homopolymeren zoals poly(ethyleenglycol) of 25 poly(propyleenglycol) , poly(geoxyethyleneerde polyolen), copolymeren daarvan en blokcopolymeren daarvan, op voor-waarde dat de wateroplosbaarheid van de blokcopolymeren behouden blijft.

Als een alternatief voor op PEG gebaseerde polyme-30 ren kunnen effectief niet-antigene materialen zoals dex-traan, poly(vinylpyrrolidonen), poly(acrylamiden), poly(vi-nylalcoholen), koolhydraat-gebaseerde polymeren en dergelijke gebruikt worden. Inderdaad kan de activering van oren e-terminale groepen van deze polymere stoffen bewerk-35 stelligd worden op manieren vergelijkbaar met die welke gebruikt worden om poly(alkyleenoxiden) om te zetten en deze zullen dus duidelijk zijn voor deskundigen in het vak.

• , 32

Gewoon deskundigen in het vak zullen weten dat de voorgaande lijst enkel illustratief is en dat alle polymeermateria-len met de hierin beschreven kwaliteiten in aanmerking j komen. Voor doeleinden van de onderhavige uitvinding | 5 betekent "effectief niet-antigeen" alle materialen waarvan in het vakgebied bekend is dat ze niet-toxisch zijn en geen merkbare immunogene reactie in zoogdieren opwekken.

Definities 10

Hieronder volgt een lijst met afkortingen en de overeenkomstige betekenissen zoals onderling uitwisselbaar hierin gebruikt: 15 g gram mg milligram ml milliliter KT kamertemperatuur PEG poly(ethyleenglycol) 20

De complete inhoud van alle publicaties, octrooi-schriften en octrooiaanvragen die in deze beschrijving geciteerd worden, worden hierin opgenomen als referentie als aangegeven wordt dat elke individuele publicatie, 25 octrooischrift of octrooiaanvrage specifiek en individueel opgenomen moet worden als referentie.

Hoewel de bovengenoemde uitvinding in enig detail beschreven is ter illustratie en als voorbeeld voor helderheid van begrip, zal het voor een deskundige in het vak in 30 het licht van het geleerde van deze uitvinding snel duidelijk zijn dat er veranderingen en modificaties aangebracht kunnen worden zonder af te wijken van de geest en het kader van de onderhavige uitvinding. De volgende voorbeelden worden verschaft enkel als voorbeeld en ze zijn niet 35 bedoeld om het kader van de uitvinding, die in brede termen hierboven beschreven is, te beperken.

33

In de volgende voorbeelden is het hGH dat van SEQ ID Nr. 1. Het moet duidelijk zijn dat andere hGH-polypepti-den ook gePEG-yleerd kunnen worden op een manier vergelijkbaar met die welke in de volgende voorbeelden als voorbeeld 5 wordt gegeven.

VOORBEELD 1

Glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH

0

10 II

H2C-0(CH2CH20)nCH2CH2CH

CH-0(CH2CH20)mCH3 15 H2C-0(CH2CH20)mCH3 20 waarin (CH2CH20)n een gemiddeld molecuulgewicht heeft van ongeveer 3Kd en elke (CH2CH20)m een gemiddeld molecuulgewicht heeft van ongeveer 20 Kd (GL3-400AL2) .

25 Dit voorbeeld toont de productie van N-terminaal enkelvoudig gePEG-yleerd hGH door middel van reductieve alkylering. Het glycerol-vertakt PEG-aldehydereagens van ongeveer 43.000 MW (GL3-400AL2, NOF Corporation) werd via reductieve alkylering gekoppeld aan het N-uiteinde van hGH 30 door voordeel te trekken van het verschil in relatieve pK,,-waarde van de primaire aminegroep aan het N-uiteinde versus de pKa-waarden van primaire aminen op de e-aminopositie van lysineresten. hGH-eiwit opgelost in een concentratie van 4, 7 of 10 mg/ml in 25 mM MES (Sigma Chemical, St. Louis, MO) 35 van pH 5,8 of 2 0 mM HEPES van pH 7,0 liet men reageren met glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde door toevoeging van het reagens tot een relatieve molaire verhouding PEG:hGH van 34 1,5:1, 2:1, 3,4:1, 4:1 of 5:1. De reacties werden gekatalyseerd door de toevoeging van pyridineboraan (Sigma Chemical, St. Louis, MO) tot een eindconcentratie van 10 mM. De reacties werden uitgevoerd in het donker bij 4 graden C 5 gedurende 16 - 87 uur. De reacties werden gestopt door verdunning in geschikte buffer voor zuivering.

Tabel 1 toont het percentage meervoudig gePEG-yleerde soorten, enkelvoudig gePEG-yleerd conjugaat, ongereageerd hGH en de uiteindelijke zuiveringsopbrengst 10 voor glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH, dat gedurende 63 uur gereageerd had bij een pH van 5,8 en een molaire verhouding van 1,5:1:1.

Tabel 1 15 Glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH-conjugaat. Synthese-en zuiveringswerkwijze

Synthese en zuivering, opbrengsten voor glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH

20 Soorten in de reactiemix:

glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH

multi-PEG-product 4% mono-PEG-product 68% 25 ongereageerd hGH 28%

Zuiveringsopbrengst 35% 35 VOORBEELD 2

Zuivering van gePEG-yleerd hGH

GePEG-yleerde hGH-soorten werden uit het reactie-mengsel gezuiverd tot >95% (SEC-analyse, Figuur 1) met 5 behulp van een enkele ionenuitwisselingschromatografiestap.

Anionenuitwisselingschromatografie DE PEG-hGH-soorten werden uit het reactiemengsel gezuiverd tot > 95% (SEC-analyse, Figuur 1) met behulp van 10 een enkele anionenuitwisselingschromatografiestap. Enkelvoudig gePEG-yleerd hGH werd van ongemodificeerd hGH en meervoudig gePEG-yleerde hGH-soorten gezuiverd door middel van anionenuitwisselingschromatografie. Een kenmerkend reactiemengsel met glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH 15 (80 of 1500 mg eiwit) , zoals hierboven beschreven, werd gezuiverd op een Q-Sepharose Hitrap kolom (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) of een Q-Sepharose kolom (26/20, 70 ml bedvolume) (Amersham Pharmacia Biotech,

Piscataway, NJ) , die geëquilibreerd was in 25 mM HEPES, pH 20 7,3 (Buffer A) . Het reactiemengsel werd 7x verdund met buffer A en op de kolom geladen bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/minuut. De kolom werd gewassen met 3-10 kolomvolu-mina buffer A. Vervolgens werden de diverse hGH-soorten van de kolom geëlueerd in 20 kolomvolumina Buffer A en een 25 lineaire NaCl-gradiënt van 0 - 100 mM. De elutiefractie werd gevolgd aan de hand van de absorptie bij 280 nm (A280) en er werd fracties van geschikte grootte verzameld. De fracties werden samengevoegd naar de mate van PEG-ylering, bijv. mono, di, tri enz. (zoals vastgesteld in voorbeeld 30 3). De pool werd daarna geconcentreerd tot 0,5-5 mg/ml in een Centriprep YM10 concentrator (Amicon, Technology Corporation, Northborough, MA) of door middel van diafil-tratie. De eiwitconcentratie van de pool werd bepaald aan de hand van de A2B0 en een extinctiecoëfficiënt van 0,78.

35 36 VOORBEELD 3

Biochemische karakterisering

De pools met gezuiverd gePEG-yleerd hGH werden 5 gekarakteriseerd met niet-reducerende SDS-PAGE, niet-denaturerende op grootte scheidende chromatografie en in kaart brengen van peptiden.

Op grootte scheidende hoge prestatie-vloeistofchromatogra-10 fie (SEC-HPLC)

Het reactiemengsel van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde met hGH, met anionenuitwisseling gezuiverde pools en gezuiverde eindproducten werd bepaald met behulp van niet-denaturerende SEC-HPLC. Analytische niet-denaturerende 15 SEC-HPLC werd uitgevoerd met behulp van een kolom, TSK G4000PWXL (Tosohaas) of Shodex KW-804 (Waters Corp.) in 2 0 mM fosfaat, pH 7,2, 150 mM NaCl bij een stroomsnelheid van 0,5 ml/minuut (eventueel Superdex 200, 7,8 mm x 30 cm, Amersham Bioscience, Piscataway, NJ). PEG-ylering verhoogde 20 sterk het hydrodynamische volume van het eiwit, hetgeen resulteerde in een verschuiving naar een vroegere retentie-tijd. Er werden nieuwe soorten waargenomen in de PEG-aldehyde-hGH-reactiemengsels samen met ongemodificeerd hGH. Deze gePEG-yleerde en ongePEG-yleerde soorten werden 25 gescheiden door chromatografie op Q-Sepharose en er werd aangetoond dat de resulterende gezuiverde mono-PEG-aldehy-de-hGH-soorten vervolgens elueerden als een enkele piek op niet-denaturerende SEC (>95% zuiverheid, Figuur 1). De stap van chromatografie over Q-Sepharose verwijderde effectief 30 vrij PEG en meervoudig gePEG-yleerde hGH-soorten uit het enkelvoudig gePEG-yleerd hGH.

SDS-PAGE

SDS-PAGE werd gebruikt om de reactie van glycerol-35 vertakt 43K PEG-aldehyde met hGH en de gezuiverde eindproducten vast te stellen. SDS-PAGE werd uitgevoerd op 1 mm dikke 10-NuPAGE-gels (Invitrogen, Carlsbad, CA) onder 37 reducerende en niet-reducerende omstandigheden en gekleurd met behulp van een Novex Colloidal Coomassie™ G-250 kleu-ringskit (Invitrogen, Carlsbad, CA.

5 N-terminale sequentie

Geautomatiseerde Edman-degradatiechemie wordt gebruikt om de N-terminale eiwitsequentie te bepalen. Een Applied Biosystems Model 494 Procise sequencer (Perkin Elmer, Wellesley, MA) wordt gebruikt voor de degradatie. De 10 respectievelijke PTH-AZ-derivaten worden geïdentificeerd door middel van RP-HPLC-analyse op een on-line manier met behulp van een Applied Biosystems Model 140C PTH analysator voorzien van een Perkin Elmer/Brownlee 2,1 mm i.d. PTH-C18-kolom.

15

In kaart brengen van peptiden

Tryptische digesties werden uitgevoerd bij een concentratie van 1 mg/ml en in het algemeen werd 25 /ig materiaal per digestie gebruikt. Trypsine werd zodanig 20 toegevoegd dat de verhouding van trypsine tot PEG-hGH 1:30 | (w/w) was. Tris-buffer was aanwezig in een concentratie van 30 mM, pH 7,5. Monsters werden 16 ± 0,5 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur. De reacties werden geschrokken door de toevoeging van 50 μΐ IN HC1 per ml digestieoplossing. De 25 monsters werden verdund, voordat de monsters in de autosam-pler geplaatst werden, tot een eindconcentratie van 0,25 mg/ml in 6,25% acetonitril. Eerst werd acetonitril toegevoegd (tot 19,8% acetonitril), rustig gemengd, en daarna werd water toegevoegd tot een eindvolume van vier keer het 30 uitgangsvolume. Extra digestieoplossing kan worden verwijderd en gedurende maximaal een week worden bewaard bij -20°C.

Een Waters Alliance 2695 HPLC-systeem werd gebruikt voor de analyse, maar andere systemen zouden verge-35 lijkbare resultaten moeten produceren. Een Astec C-4 polymere kolom van 25 cm x 4,6 mm met 5 μιη deeltjes werd gebruikt. Experimenten werden uitgevoerd bij omgevingstem- 38 peratuur bij gewoonlijk een belading van 50 μg eiwit per monster. Buffer A is 0,1% trifluorazijnzuur in water; buffer B was 0,085% trifluorazijnzuur in acetonitril. De monsters werden geélueerd met een lineaire gradiënt van 0 -5 45% B over 90 minuten.

Pieken werden gedetecteerd met behulp van een Waters 996 PDA detector, waarbij gegevens werden verzameld tussen 210 en 300 nm. Het eraf getrokken chromatogram bij 214 nm werd gebruikt voor monsteranalyse.

10 Tryptische kaarten werden gemaakt voor hGH en glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-reagens in een molaire verhouding van 2:1 (PEG:hGH) (Figuur 2). Het N-terminale tryptische fragment werd T-l genoemd. Het percentage T-l dat aanwezig was in vergelijking met ongePEG-yleerd hGH, 15 suggereert dat meer dan 99% van de PEG-modificatie zit aan i het N-uiteinde met de rest blijkbaar gekoppeld aan één van verschillende mogelijke lysineresten.

Tabel 2 20 T-l aanwezig vergelijking % T-l aanwezig % T-l aanwezig in

vergelijking met ongePEG-yleerd hGH

hGH 28,0% 100% glycerol-vertakt Minder dan 1% Minder dan 1%

43K PEG-aldehyde/-25 hGH

Voorbeeld 4 in vitro biologie

Het vermogen van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH om 30 de menselijke receptor te herkennen werd getest met behulp van een Biacore 3000 instrument in een bepaling die opgezet was om de specifieke interacties tussen het conjugaat en de menselijke groeihormoonreceptor (hGHR) (28 kDa extracellu-lair domein) te bepalen. De resultaten van de surface 39 plasmon resonantie (SPR) experimenten worden hierin getoond in Tabel 3.

Tabel 3. Resultaten van de Biacore-beoaling 5 Monster Gem. ka x Gem. )¾ (s‘l 1¾ = k^/k,, ΐς, met be- 105 (M^s'1 ± ± std)a mM trekking tot

std)® hGH

hGH (n=9) 3,07+8,20 38,8±3,6 0,13±0,03 1,000 43K PEG-hGH 0,28±0,03 90,0±31,0 3,22±0,10 0,041 (n-3) 10 a ka (aan-snelheid) en kd (uit-snelheid) werden bepaald bij een stroomsnelheid van 50 μΐ/minuut bij 37°C in HEP-BES-buffer (0,01 M Hepes, pH 7,4, plus 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA en 0,005% oppervlakteactieve stof P20), waarbij gebruik werd gemaakt van menselijk groeihormoonbindend eiwit (28 15 kDa, extracellulair domein) gekoppeld op een CM5-chip door middel van amine-koppelingschemie bij ARU = 3000 - 5000. ka, uitgedrukt in M per seconde, kd uitgedrukt per seconde, beide zijn een gemiddelde waarde van ten minste 3 metingen op 1 chip ± standaard afwijking. Er wordt aangenomen dat de 20 gegevens de hGH-binding aan plaats 1 met hoge affiniteit op HGBP in een verhouding van 1:1 meten.

Voorbeeld 5

Farmacodynamische studies 25

In vivo potentie - Werkzaamheid in 11 dagen durende rattenbepaling (gewichtstoename, groei scheenbeen, onderdrukking serum-BUN

30 Gewichtstoename in ratten

Vrouwelijke Sprague Dawley ratten, na hypofysecto-mie in de Harlan Labs, werden voorgescreend op groeisnel-heid gedurende een periode van 4 - 10 dagen. De ratten werden verdeeld in groepen van zes. Beginnend op dag 0 35 ontvingen controleratten eenmaal dagelijks een injectie van 40 ofwel 0,3 mg/kg hGH of drager, gedurende elf achtereenvolgende dagen. De testgroep ontving een enkele dosis (eenmaal per week) van 1,8 mg/kg glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH op dag 0 en 6. De dieren werden dagelijks gewogen.

5 Figuur 4 toont de effecten van hGH en glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH op de lichaamsgewichtstoename in een representatieve studie.

Wanneer de gegevens die worden weergegeven door de in Figuur 4 afgeheelde studie, worden gecombineerd met de 10 gegevens van de voorafgaande 11 dagen durende groeistudies voor met hGH (controle) behandeld ratten plus een additionele groeistudie met behulp van het glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH-conjugaat, was de gemiddelde oplopende gewichtstoename voor de dieren die eenmaal per week behan-15 deld werden met 1,8 mg/kg conjugaat, 109% van die welke bereikt na dagelijkse hGH-toediening (cumulatief 3,3 mg/kg).

Scheenbeenlengte van de ratten 20 De ratten van de 11 dagen durende studies naar gewichtstoename werden op dag 11 gedood, de linker scheenbeenderen werden verwijderd en er werd een röntgenfoto van gemaakt en de botlengtes werden gemeten met behulp van een schuifmeter. Figuur 5 toont de metingen van de scheenbeen-25 lengtes voor met glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH behandelde dieren.

BUN-concentraties in de ratten

Als een biomarker voor de metabole effecten na 30 hGH-behandeling werden ureumstikstofconcentraties in het bloed bepaald in bloedmonsters van dag 11. Figuur 6 laat zien dat zowel een behandeling met dagelijks hGH als eenmaal/week glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH resulteert in een significante verlaging in ureumstikstof in het 35 bloed.

i 41

Studie naar de gewichtstoename van de ratten na een 6-daagse toename in de dosis

Ratten na hypofysectomie werden behandeld met diverse enkele doses van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-5 hGH of anders dagelijks behandeld met hGH en de gewichts-toename werd gevolgd gedurende 6 dagen. Figuur 7 toont de gewichtstoename die verkregen werd voor de diverse behan-delgroepen. Bloedmonsters werden afgenomen op de aangegeven tijdstippen en de IGF-l-concentraties in het serum werden 10 bepaald met ELISA. Uitgezet zijn de gemiddelden ± SEM. Groepsgemiddelden (n=6) werden gebruikt om de IGF-1-reactie te berekenen met behulp van éénwegs variantieanalyse op de gemeten waarden en de waarden voor de AUCdO-6 (ng*uur/ml) van 20.040, 22.958, 28.129 en 37.839 werden bepaald voor 15 respectievelijk de cohorten met een dosering van 0,067, 0,2, 0,6 en 1,8 mg/kg.

Studie naar de gewichtstoename van de ratten na een 11-daagse toename in de dosis 20 In een tweede studie werden dieren behandeld met ofwel 1,8 mg/kg of met een hogere dosis, d.w.z. 5,1 mg/kg van het glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH-conjugaat, op dag 0 en opnieuw op dag 6. Tabel 4 toont de dosisgerela-teerde gewichtstoename na 6 dagen en 11 dagen in vergelij-25 king met die welke bereikt werd na de dagelijkse (QD 11) toediening van ofwel drager of dagelijks hGH (0,3 mg/kg/d).

> |··| I I ~ II c

CU

X) ·*- <u _ * _ * * ε ® C \D ^ o — ^ * <u £ - S - t- ° co - ~ cn CQ N η H * η ‘ H .

° O H O . _ <—I -—- "H j_, -H ,. +1 ΓΤ) h cn Ή +i +l +i S’ ^ t- r- ^ cn +l σι ' m ' m . ^ ^ <u <0 VO ^ VD - _ » CN \ I s

p O COC-^VD^ § W

^ ™ H S ^ £ C w — m o . +> m £ Φ -----O x5 ^ 2 rrj -π u <u o „ * _ * _ +“ _ 3 O T3 T3 as ® ^ * “I H. ^ n o ft 5 Φ e CQ "OrHOHO^rH φ Π ^ “> 5 ^+1 +l * +* +l -Η +l ξ Se fi

01 Ν t" rH O) VO 00 _. O φ .. ^ ‘H

(0 'O * - ‘ - S ' O. Γ* 01 0 p g - ro n on h O .[? ,, °

Ss 5j d 2 ί £ S ^^ωσι i—I ^ H ΓΗ CU .β (0

rH u CQ Q

ΛΙ C C

β J J) IJ Ή CU-----S ε > rö fll ^ U> ,¾ * 4J iö S K 3 > cn ^ o o CN rW «*» m ^ * Ë-S^g1

* g N «-ί Η rH* ® - Ό -H

(¾ m σι jj μ ^ O _ r-, -H +1 +1 +1 -C (0 0) σι m ü « -g <D w, CN CN CO H « Ή Ό β ε 21 ' ' - ~ *2 £ β «o tO(ÜC VD cn VD VO ^ 0) (Ö ^ β c-c o o o o cn 4-> a> O rH rH rH rH * 01 01 ^ o 5 e

xj > rö CU

CD (0 2 T3 xj ιη ,α ω

jC-----o o cq H

O - ·Η O

-H m ' O rH +1 O

3 CU <D J> dj Ό Ό v - 0) cn j ^ d r^· - ό c (ÖVO (0 U> Q. xJ 1—1(0 CD ' - ' ~ 4^0)(0 Ό Üo O o -i-CnOx) u — ω p pap h o m

d) rH ft ft-" d)-H

2 q * ~ * - s 3 I s

2 ~ s g s ) ΐί S S

<U ~ Ό "" O £1 Γη ^ cn (0 (0 s CQ ^ XJO0XJH * Ï2 β η h \ ï? m β <u

CD „ σι D) rH d) in > (0 CD

o Q, c O (0 CD

P Ö II CQ XJ rj

-" co rHpdrHpi ° Cn CD XJ

o o o o - m έγ Μ o ίΗ^βΜΛ ο,0ββ

φ -" d) I 0) I d) CU

rH cn UdJOd) v 4_I TH Ό

(U (0 X S'OS'Ö io^S

JQ ,¾ S2 ^ H >1 ft β (0 (0 (0 Q C) £1 Ü Λ (0(0(0

Η 11 1 1 1 1 11 * > S S

cn o in

H rH

% 43 IGF-1-studies

Dieren uit de zesdaagse studies naar gewichtstoe-name werden gebruikt. Bloedmonsters werden afgenomen op de diverse tijdstippen tijdens de studie en de IGF-l-concen-5 traties in het serum werden bepaald met ELISA, zoals getoond in Figuur 8. De IGF-l-concentraties in de ratten werden gevolgd met een immunoassaykit (Diagnostic System Laboratories).

10 Voorbeeld 6

Farmacokinetische studies

Farmacokinetische studies werden uitgevoerd in normale mannelijke Sprague-Dawley ratten, waarin een canule ingebracht was. Injecties werden gegeven als een enkele 15 intraveneuze dosis van 1,0 mg/kg of een enkele subcutane bolus van 1,8 mg/kg hGH of glycerol-vertakt 43K PEG-aldehy-de-hGH met zes ratten per groep. Bloedmonsters werden afgenomen over één tot vijf dagen naar geschikt voor de vaststelling van relevante PK parameters. Bloedoncentraties 20 van hGH en glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH worden gemeten na elke bemonstering met behulp van immunoassay. Tabel 4 toont de PK parameters van de ratten voor glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH. Het effect van PEG-ylering is duidelijke zien in de waargenomen halfwaardetijd voor 25 verwijdering, omdat deze parameter groter was dan 6 uur voor het conjugaat, terwijl de waarde die vermeld is voor hGH in vergelijkbare studies, wordt vermeld als 1,35 ± 0,2 (Clark, ibid.), 0,77 ± 1,7 (Jorgensen et al., "Polyethyleen glycol-conjugated proteins", PSTT 1 (8), november 1998) of 30 1 uur (Genotropin® (PNU-180307) Investigator Brochure).

hGH-immunoassay

Concentratieniveaus van hGH en glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH in rattenplasma werden bepaald met 35 behulp van de hGH AutoDELPFIA fluorescente immunoassaykit (Perkin-Elmer).

i -% 44

Tabel 5.

glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH

Route iv/sc

Dosis mg/kg 1,0 / 1,8 5 Tl/2 uur 6,44 + 2,38 AUC O-oo, iv /ig*uur/ml 489 ± 16 AUC O-oo, sc /xg*uur/ml 97,7 ± 2,1 CL totaal ml/uur/kg 2,05 ± 0,07

Vss ml/kg 27,2 ± 2,8 10 Tmax uur 12 ± 0

Cmax Mg/ml 1,96 ± 0,05 F % 11,1 ± 0,2 * AUC 0-oo, sc normaliseren voor 15 1,8 mpk

De relatie tussen geneesmiddelconcentraties in plasma en de IGF-l-reactie werd ook direct bepaald in een uitvoerige studieopzet na de subcutane toediening van een enkele dosis 20 van het glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH (1,8 mg/kg) aan vrouwelijke knaagdieren na hypofysectomie.

(029828

Claims (12)

1. Conjugaat van polyethyleenglycol en menselijk groeihormoon (PEG-hGH-conjugaat) met de structuur: H2C-0(CH2CH2O)nCH2CH2CH2NHR 1Q CH-0(CH2CH20)mCH3 H2C-0(CH2CH20)mCH3 15 waarin n een geheel getal tussen 60 en 75 is; m een geheel getal tussen 450 en 460 is; en R een menselijk groeihormoon is.

2. PEG-hGH-conjugaat volgens conclusie 1, waarbij de rest (CH2CH20)n een gemiddeld molecuulgewicht heeft van ongeveer 3 Kd en elke rest (CH2CH20)m een gemiddeld molecuulgewicht heeft van ongeveer 20 Kd.

3. PEG-hGH-conjugaat volgens conclusie 1 of 2, waarbij het menselijk groeihormoon een aminozuursequentie van SEQ ID Nr. 1 omvat.

4. PEG-hGH-conjugaat volgens conclusie 3, waarbij ! 30 het PEG geconjugeerd is aan het N-terminale fenylalanine van SEQ ID Nr. 1.

5. PEG-hGH-conjugaat volgens conclusie 4, waarbij het conjugaat enkelvoudig gePEG-yleerd is. 35

5 >

6. PEG-hGH-conjugaat volgens conclusie 4, waarbij ten minste 80% van het PEG geconjugeerd is aan de alfa- 1029828 > ! aminogroep van het N-terminale fenylalanine van SEQ ID Nr. 1.

7. PEG-hGH-conjugaat volgens conclusie 5, waarbij 5 ten minste 90% van het PEG geconjugeerd is aan de alfa- aminogroep van het N-terminale fenylalanine van SEQ ID Nr. 1.

8. PEG-hGH-conjugaat volgens conclusie 5, waarbij 10 ten minste 95% van het PEG geconjugeerd is aan de alfa- aminogroep van het N-terminale fenylalanine van SEQ ID Nr. 1.

9. PEG-hGH-conjugaat volgens conclusie 5, waarbij 15 ten minste 98% van het PEG geconjugeerd is aan het N- ! terminale fenylalanine van SEQ ID Nr. 1.

10. Gebruik van een menselijk-groeihormoon-PEG-conjugaat volgens een van de conclusies 1-9 voor de berei- 2. ding van een geneesmiddel voor het behandelen van een patiënt met een groei- of ontwikkelingsstoornis.

11. Gebruik volgens conclusie 10, waarbij de groei- of ontwikkelingsstoornis wordt gekozen uit de groep 25 die bestaat uit Groeihormoondeficiëntie (GHD), het syndroom van Turner, Chronische nierinsufficiëntie en klein voor zwangerschapsduur (SGA). '

12. Gebruik volgens conclusie 11, waarbij de 30 groei- of ontwikkelingsstoornis wordt gekozen uit de groep die bestaat uit Erectiele disfunctie, lipodystrofie door HIV, Fibromyalgie, Osteoporose, Geheugenstoornissen, Depressie, de ziekte van Crohn, Skeletdysplasieën, Traumatisch hersenletsel, subarachnoïde bloeding, het syndroom 35 van Noonan, het syndroom van Down, Idiopathische korte lichaamslengte (ISS), nierziekte in het eindstadium (ESRD), zeer laag geboortegewicht (VLBW), redding van beenmergstam- . Ν cellen, Metabool syndroom, Glucocorticoïdmyopathie, korte lichaamslengte als gevolg van glucocorticoïdbehandeling bij kinderen, en falen van groeiherstel voor kleine premature kinderen. 5 -o-o-o- 1029828