NL1029828C2 - Conjugates of glycerol-branched polyethylene glycol and human growth hormone, methods for their preparation and methods for their use. - Google Patents
Conjugates of glycerol-branched polyethylene glycol and human growth hormone, methods for their preparation and methods for their use. Download PDFInfo
- Publication number
- NL1029828C2 NL1029828C2 NL1029828A NL1029828A NL1029828C2 NL 1029828 C2 NL1029828 C2 NL 1029828C2 NL 1029828 A NL1029828 A NL 1029828A NL 1029828 A NL1029828 A NL 1029828A NL 1029828 C2 NL1029828 C2 NL 1029828C2
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- hgh
- peg
- growth hormone
- glycerol
- growth
- Prior art date
Links
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 title claims description 221
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 title claims description 220
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 title claims description 210
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 title claims description 133
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 title claims description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 29
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 30
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 21
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 19
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 claims description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 9
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 9
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 claims description 8
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 7
- 208000037824 growth disorder Diseases 0.000 claims description 5
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 claims description 4
- 208000026928 Turner syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 claims description 4
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 206010029748 Noonan syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 208000030886 Traumatic Brain injury Diseases 0.000 claims description 3
- 201000000690 abdominal obesity-metabolic syndrome Diseases 0.000 claims description 3
- 208000018773 low birth weight Diseases 0.000 claims description 3
- 231100000533 low birth weight Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000009529 traumatic brain injury Effects 0.000 claims description 3
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 claims description 2
- 208000010228 Erectile Dysfunction Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001640 Fibromyalgia Diseases 0.000 claims description 2
- 206010049287 Lipodystrophy acquired Diseases 0.000 claims description 2
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000021642 Muscular disease Diseases 0.000 claims description 2
- 201000009623 Myopathy Diseases 0.000 claims description 2
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 claims description 2
- 206010072610 Skeletal dysplasia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000032851 Subarachnoid Hemorrhage Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000000523 end stage renal failure Diseases 0.000 claims description 2
- 201000001881 impotence Diseases 0.000 claims description 2
- 208000006132 lipodystrophy Diseases 0.000 claims description 2
- 230000002028 premature Effects 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 206010023435 Kidney small Diseases 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 101150009274 nhr-1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 claims 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 43
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol group Chemical group OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 34
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 28
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 28
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 28
- 241000894007 species Species 0.000 description 28
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 27
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 20
- -1 succinimidyl ester Chemical class 0.000 description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 15
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 14
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 13
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 12
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 12
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 10
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 9
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 6
- 230000001270 agonistic effect Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 6
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 201000010769 Prader-Willi syndrome Diseases 0.000 description 5
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- HYAFETHFCAUJAY-UHFFFAOYSA-N pioglitazone Chemical compound N1=CC(CC)=CC=C1CCOC(C=C1)=CC=C1CC1C(=O)NC(=O)S1 HYAFETHFCAUJAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229920000233 poly(alkylene oxides) Polymers 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 4
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 4
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 4
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 4
- NAVMQTYZDKMPEU-UHFFFAOYSA-N Targretin Chemical compound CC1=CC(C(CCC2(C)C)(C)C)=C2C=C1C(=C)C1=CC=C(C(O)=O)C=C1 NAVMQTYZDKMPEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- ZOBPZXTWZATXDG-UHFFFAOYSA-N 1,3-thiazolidine-2,4-dione Chemical compound O=C1CSC(=O)N1 ZOBPZXTWZATXDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N Butyraldehyde Chemical compound CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N Rosiglitazone Chemical compound C=1C=CC=NC=1N(C)CCOC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O YASAKCUCGLMORW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 3
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N inositol Chemical compound OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 3
- 229920001427 mPEG Polymers 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 3
- PKWDZWYVIHVNKS-UHFFFAOYSA-N netoglitazone Chemical compound FC1=CC=CC=C1COC1=CC=C(C=C(CC2C(NC(=O)S2)=O)C=C2)C2=C1 PKWDZWYVIHVNKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 3
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 3
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 150000003335 secondary amines Chemical group 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 3
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QBQLYIISSRXYKL-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-[2-(5-methyl-2-phenyl-1,3-oxazol-4-yl)ethoxy]phenyl]methyl]-1,2-oxazolidine-3,5-dione Chemical compound CC=1OC(C=2C=CC=CC=2)=NC=1CCOC(C=C1)=CC=C1CC1C(=O)NOC1=O QBQLYIISSRXYKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 2
- 102100031939 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 102100027842 Fibroblast growth factor receptor 3 Human genes 0.000 description 2
- 101710182396 Fibroblast growth factor receptor 3 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 108090000965 Insulin-like growth factor binding protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100022708 Insulin-like growth factor-binding protein 3 Human genes 0.000 description 2
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- GHUUBYQTCDQWRA-UHFFFAOYSA-N Pioglitazone hydrochloride Chemical compound Cl.N1=CC(CC)=CC=C1CCOC(C=C1)=CC=C1CC1C(=O)NC(=O)S1 GHUUBYQTCDQWRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002938 bexarotene Drugs 0.000 description 2
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 2
- NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N boron;pyridine Chemical compound [B].C1=CC=NC=C1 NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 108010005905 delta-hGHR Proteins 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000001904 diabetogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 206010016165 failure to thrive Diseases 0.000 description 2
- 229940063135 genotropin Drugs 0.000 description 2
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000002608 insulinlike Effects 0.000 description 2
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 2
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 125000004805 propylene group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- SUFUKZSWUHZXAV-BTJKTKAUSA-N rosiglitazone maleate Chemical compound [H+].[H+].[O-]C(=O)\C=C/C([O-])=O.C=1C=CC=NC=1N(C)CCOC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O SUFUKZSWUHZXAV-BTJKTKAUSA-N 0.000 description 2
- 230000000580 secretagogue effect Effects 0.000 description 2
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000013223 sprague-dawley female rat Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000383 tetramethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 2
- GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N troglitazone Chemical compound C1CC=2C(C)=C(O)C(C)=C(C)C=2OC1(C)COC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001641 troglitazone Drugs 0.000 description 2
- GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N troglitazone Natural products C([C@@]1(OC=2C(C)=C(C(=C(C)C=2CC1)O)C)C)OC(C=C1)=CC=C1C[C@H]1SC(=O)NC1=O GXPHKUHSUJUWKP-NTKDMRAZSA-N 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- XMAYWYJOQHXEEK-OZXSUGGESA-N (2R,4S)-ketoconazole Chemical compound C1CN(C(=O)C)CCN1C(C=C1)=CC=C1OC[C@@H]1O[C@@](CN2C=NC=C2)(C=2C(=CC(Cl)=CC=2)Cl)OC1 XMAYWYJOQHXEEK-OZXSUGGESA-N 0.000 description 1
- RDGUFKZGMLPVHL-QFIPXVFZSA-N (2s)-3-[4-[2-(5-methyl-2-phenyl-1,3-oxazol-4-yl)ethoxy]phenyl]-2-(propylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC(C[C@H](NCCC)C(O)=O)=CC=C1OCCC1=C(C)OC(C=2C=CC=CC=2)=N1 RDGUFKZGMLPVHL-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- NWQWNCILOXTTHF-HLCSKTDOSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-naphthalen-2-ylpropanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]hexanamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@H](CC=1C=C2C=CC=CC2=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CNC=N1 NWQWNCILOXTTHF-HLCSKTDOSA-N 0.000 description 1
- WZHKXNSOCOQYQX-FUAFALNISA-N (2s)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]hexanamide Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CN=CN1 WZHKXNSOCOQYQX-FUAFALNISA-N 0.000 description 1
- RVWNMGKSNGWLOL-GIIHNPQRSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(2-methyl-1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]hexanamide Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CN=CN1 RVWNMGKSNGWLOL-GIIHNPQRSA-N 0.000 description 1
- HRNLPPBUBKMZMT-SSSXJSFTSA-N (2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-aminopropanoyl]amino]-3-naphthalen-2-ylpropanoyl]amino]propanoyl]amino]-3-(1h-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]hexanamide Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](CC=1C=C2C=CC=CC2=CC=1)NC(=O)[C@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 HRNLPPBUBKMZMT-SSSXJSFTSA-N 0.000 description 1
- FQERLIOIVXPZKH-UHFFFAOYSA-N 1,2,4-trioxane Chemical compound C1COOCO1 FQERLIOIVXPZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KVGOXGQSTGQXDD-UHFFFAOYSA-N 1-decane-sulfonic-acid Chemical compound CCCCCCCCCCS(O)(=O)=O KVGOXGQSTGQXDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEZWWPYKPKIXLL-UHFFFAOYSA-N 1-{2-(4-chlorobenzyloxy)-2-(2,4-dichlorophenyl)ethyl}imidazole Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1COC(C=1C(=CC(Cl)=CC=1)Cl)CN1C=NC=C1 LEZWWPYKPKIXLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-LKPKBOIGSA-N 1D-chiro-inositol Chemical compound O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-LKPKBOIGSA-N 0.000 description 1
- KCEFVYIWOQSJCH-LMOVPXPDSA-N 2-[4-[2-[[(2r)-2-hydroxy-2-phenylethyl]amino]ethoxy]phenyl]acetic acid;hydrochloride Chemical compound Cl.C([C@H](O)C=1C=CC=CC=1)NCCOC1=CC=C(CC(O)=O)C=C1 KCEFVYIWOQSJCH-LMOVPXPDSA-N 0.000 description 1
- CCTREOMTIFSZAU-OGFXRTJISA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;5-[(3r)-dithiolan-3-yl]pentanoic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CCCC[C@@H]1CCSS1 CCTREOMTIFSZAU-OGFXRTJISA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILPUOPPYSQEBNJ-UHFFFAOYSA-N 2-methyl-2-phenoxypropanoic acid Chemical class OC(=O)C(C)(C)OC1=CC=CC=C1 ILPUOPPYSQEBNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CLPFFLWZZBQMAO-UHFFFAOYSA-N 4-(5,6,7,8-tetrahydroimidazo[1,5-a]pyridin-5-yl)benzonitrile Chemical compound C1=CC(C#N)=CC=C1C1N2C=NC=C2CCC1 CLPFFLWZZBQMAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCAZCAZVHLGDBA-UHFFFAOYSA-N 5-[[4-(2-indol-1-ylethoxy)phenyl]methyl]-1,3-thiazolidine-2,4-dione Chemical compound S1C(=O)NC(=O)C1CC(C=C1)=CC=C1OCCN1C2=CC=CC=C2C=C1 PCAZCAZVHLGDBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IETKPTYAGKZLKY-UHFFFAOYSA-N 5-[[4-[(3-methyl-4-oxoquinazolin-2-yl)methoxy]phenyl]methyl]-1,3-thiazolidine-2,4-dione Chemical compound N=1C2=CC=CC=C2C(=O)N(C)C=1COC(C=C1)=CC=C1CC1SC(=O)NC1=O IETKPTYAGKZLKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLUWVRIZBDJIOF-UHFFFAOYSA-N 5-[[4-[[4-[(2,4-dioxo-1,3-thiazolidin-5-yl)methyl]phenyl]methyl]phenyl]methyl]-1,3-thiazolidine-2,4-dione Chemical compound S1C(=O)NC(=O)C1CC(C=C1)=CC=C1CC(C=C1)=CC=C1CC1C(=O)NC(=O)S1 ZLUWVRIZBDJIOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DHSSDEDRBUKTQY-UHFFFAOYSA-N 6-prop-2-enyl-4,5,7,8-tetrahydrothiazolo[4,5-d]azepin-2-amine Chemical compound C1CN(CC=C)CCC2=C1N=C(N)S2 DHSSDEDRBUKTQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DJQOOSBJCLSSEY-UHFFFAOYSA-N Acipimox Chemical compound CC1=CN=C(C(O)=O)C=[N+]1[O-] DJQOOSBJCLSSEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033367 Appetite-regulating hormone Human genes 0.000 description 1
- BFYIZQONLCFLEV-DAELLWKTSA-N Aromasine Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)(C(CC4)=O)[C@@H]4[C@@H]3CC(=C)C2=C1 BFYIZQONLCFLEV-DAELLWKTSA-N 0.000 description 1
- 239000007992 BES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 229940123208 Biguanide Drugs 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005635 Caprylic acid (CAS 124-07-2) Substances 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- KPSRODZRAIWAKH-JTQLQIEISA-N Ciprofibrate Natural products C1=CC(OC(C)(C)C(O)=O)=CC=C1[C@H]1C(Cl)(Cl)C1 KPSRODZRAIWAKH-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N Clonidine Chemical compound ClC1=CC=CC(Cl)=C1NC1=NCCN1 GJSURZIOUXUGAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- 229940124213 Dipeptidyl peptidase 4 (DPP IV) inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102000003779 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000194 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001061260 Emmelichthys struhsakeri Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- HEMJJKBWTPKOJG-UHFFFAOYSA-N Gemfibrozil Chemical compound CC1=CC=C(C)C(OCCCC(C)(C)C(O)=O)=C1 HEMJJKBWTPKOJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033299 Glia-derived nexin Human genes 0.000 description 1
- 101710183811 Glia-derived nexin Proteins 0.000 description 1
- 239000000579 Gonadotropin-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 1
- 101710119601 Growth hormone-releasing peptides Proteins 0.000 description 1
- 101001075374 Homo sapiens Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101001123448 Homo sapiens Prolactin receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N Isobutene Chemical group CC(C)=C VQTUBCCKSQIDNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BYBLEWFAAKGYCD-UHFFFAOYSA-N Miconazole Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1COC(C=1C(=CC(Cl)=CC=1)Cl)CN1C=NC=C1 BYBLEWFAAKGYCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004472 Myostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056852 Myostatin Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 229910020889 NaBH3 Inorganic materials 0.000 description 1
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical class OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007399 Nuclear hormone receptor Human genes 0.000 description 1
- 108020005497 Nuclear hormone receptor Proteins 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003728 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000029 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PIJVFDBKTWXHHD-UHFFFAOYSA-N Physostigmine Natural products C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)C2C1(C)CCN2C PIJVFDBKTWXHHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002519 Prolactin Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100029000 Prolactin receptor Human genes 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- RVOLLAQWKVFTGE-UHFFFAOYSA-N Pyridostigmine Chemical compound CN(C)C(=O)OC1=CC=C[N+](C)=C1 RVOLLAQWKVFTGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000611607 Rattus norvegicus Prolactin receptor Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 101000857870 Squalus acanthias Gonadoliberin Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N Taurocholic acid Natural products OC1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)C1(C)C(O)C2 WBWWGRHZICKQGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229960003526 acipimox Drugs 0.000 description 1
- 229940062328 actos Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000048 adrenergic agonist Substances 0.000 description 1
- 108010083553 alanyl-histidyl-(2-naphthyl)alanyl-tryptophyl-phenylalanyl-lysinamide Proteins 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940124325 anabolic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003263 anabolic agent Substances 0.000 description 1
- 229960002932 anastrozole Drugs 0.000 description 1
- YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N anastrozole Chemical compound N#CC(C)(C)C1=CC(C(C)(C#N)C)=CC(CN2N=CN=C2)=C1 YBBLVLTVTVSKRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000003886 aromatase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940046844 aromatase inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229950004810 atamestane Drugs 0.000 description 1
- PEPMWUSGRKINHX-TXTPUJOMSA-N atamestane Chemical compound C1C[C@@H]2[C@@]3(C)C(C)=CC(=O)C=C3CC[C@H]2[C@@H]2CCC(=O)[C@]21C PEPMWUSGRKINHX-TXTPUJOMSA-N 0.000 description 1
- 229940062310 avandia Drugs 0.000 description 1
- 235000021053 average weight gain Nutrition 0.000 description 1
- ZSIQJIWKELUFRJ-UHFFFAOYSA-N azepane Chemical class C1CCCNCC1 ZSIQJIWKELUFRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001556 benzimidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 229960000516 bezafibrate Drugs 0.000 description 1
- IIBYAHWJQTYFKB-UHFFFAOYSA-N bezafibrate Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C(O)=O)=CC=C1CCNC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 IIBYAHWJQTYFKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004283 biguanides Chemical class 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- KVLLHLWBPNCVNR-SKCUWOTOSA-N capromorelin Chemical compound C([C@@]12CN(CCC1=NN(C2=O)C)C(=O)[C@@H](COCC=1C=CC=CC=1)NC(=O)C(C)(C)N)C1=CC=CC=C1 KVLLHLWBPNCVNR-SKCUWOTOSA-N 0.000 description 1
- 229950004826 capromorelin Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000004706 cardiovascular dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 229960002174 ciprofibrate Drugs 0.000 description 1
- KPSRODZRAIWAKH-UHFFFAOYSA-N ciprofibrate Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C(O)=O)=CC=C1C1C(Cl)(Cl)C1 KPSRODZRAIWAKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001214 clofibrate Drugs 0.000 description 1
- KNHUKKLJHYUCFP-UHFFFAOYSA-N clofibrate Chemical compound CCOC(=O)C(C)(C)OC1=CC=C(Cl)C=C1 KNHUKKLJHYUCFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002896 clonidine Drugs 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- JXMXDKHEZLKQPB-UHFFFAOYSA-N detomidine Chemical compound CC1=CC=CC(CC=2[N]C=NC=2)=C1C JXMXDKHEZLKQPB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001894 detomidine Drugs 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003603 dipeptidyl peptidase IV inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 229960003913 econazole Drugs 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- RZHPAMYZYVFWLR-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-[2-[(5,6-dimethyl-1h-benzimidazol-2-yl)amino]-6-methyl-4-oxo-1h-pyrimidin-5-yl]acetate Chemical compound O=C1C(CC(=O)OCC)=C(C)NC(NC=2NC3=CC(C)=C(C)C=C3N=2)=N1 RZHPAMYZYVFWLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000000816 ethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 229960000255 exemestane Drugs 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229950011548 fadrozole Drugs 0.000 description 1
- 229960002297 fenofibrate Drugs 0.000 description 1
- YMTINGFKWWXKFG-UHFFFAOYSA-N fenofibrate Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C(=O)OC(C)C)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 YMTINGFKWWXKFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940125753 fibrate Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960003627 gemfibrozil Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N gonadorelin Chemical compound C([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C1=CC=C(O)C=C1 XLXSAKCOAKORKW-AQJXLSMYSA-N 0.000 description 1
- 229940035638 gonadotropin-releasing hormone Drugs 0.000 description 1
- 108010015153 growth hormone releasing hexapeptide Proteins 0.000 description 1
- 239000003324 growth hormone secretagogue Substances 0.000 description 1
- 108010085742 growth hormone-releasing peptide-2 Proteins 0.000 description 1
- 210000004349 growth plate Anatomy 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 125000004836 hexamethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 108010070965 hexarelin Proteins 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 239000000960 hypophysis hormone Substances 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000002563 ionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 229960004125 ketoconazole Drugs 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 229960003881 letrozole Drugs 0.000 description 1
- HPJKCIUCZWXJDR-UHFFFAOYSA-N letrozole Chemical compound C1=CC(C#N)=CC=C1C(N1N=CN=C1)C1=CC=C(C#N)C=C1 HPJKCIUCZWXJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 description 1
- YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M lithium;dodecyl sulfate Chemical compound [Li+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011866 long-term treatment Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 108010000594 mecasermin Proteins 0.000 description 1
- 229960001311 mecasermin Drugs 0.000 description 1
- HRLIOXLXPOHXTA-UHFFFAOYSA-N medetomidine Chemical compound C=1C=CC(C)=C(C)C=1C(C)C1=CN=C[N]1 HRLIOXLXPOHXTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002140 medetomidine Drugs 0.000 description 1
- 230000006371 metabolic abnormality Effects 0.000 description 1
- XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N metformin Chemical compound CN(C)C(=N)NC(N)=N XZWYZXLIPXDOLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003105 metformin Drugs 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 1
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 229960002509 miconazole Drugs 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229950001628 netoglitazone Drugs 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940063149 nutropin Drugs 0.000 description 1
- 229960002446 octanoic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000004789 organ system Anatomy 0.000 description 1
- 125000002971 oxazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 125000004817 pentamethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000006461 physiological response Effects 0.000 description 1
- PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N physostigmine Chemical compound C12=CC(OC(=O)NC)=CC=C2N(C)[C@@H]2[C@@]1(C)CCN2C PIJVFDBKTWXHHD-HIFRSBDPSA-N 0.000 description 1
- 229960001697 physostigmine Drugs 0.000 description 1
- 229960005095 pioglitazone Drugs 0.000 description 1
- 150000003053 piperidines Chemical class 0.000 description 1
- 208000003068 pituitary dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920003196 poly(1,3-dioxolane) Polymers 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000004362 positive regulation of skeletal muscle tissue growth Effects 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000208 pralmorelin Drugs 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 229960002290 pyridostigmine Drugs 0.000 description 1
- 150000003235 pyrrolidines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003856 quaternary ammonium compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000001525 receptor binding assay Methods 0.000 description 1
- 229950005713 reglitazar Drugs 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229960004586 rosiglitazone Drugs 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000002356 skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000003093 somatogenic effect Effects 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 108010033419 somatotropin-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108700031632 somatrem Proteins 0.000 description 1
- 229960003259 somatrem Drugs 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229940099419 targretin Drugs 0.000 description 1
- WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N taurocholic acid Chemical compound C([C@@H]1C[C@H]2O)[C@@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@@H]([C@@H](CCC(=O)NCCS(O)(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@H](O)C1 WBWWGRHZICKQGZ-GIHLXUJPSA-N 0.000 description 1
- 125000004149 thio group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 125000003258 trimethylene group Chemical group [H]C([H])([*:2])C([H])([H])C([H])([H])[*:1] 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N valeric aldehyde Natural products CCCCC=O HGBOYTHUEUWSSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229960001771 vorozole Drugs 0.000 description 1
- XLMPPFTZALNBFS-INIZCTEOSA-N vorozole Chemical compound C1([C@@H](C2=CC=C3N=NN(C3=C2)C)N2N=CN=C2)=CC=C(Cl)C=C1 XLMPPFTZALNBFS-INIZCTEOSA-N 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/27—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
- A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/06—Drugs for disorders of the endocrine system of the anterior pituitary hormones, e.g. TSH, ACTH, FSH, LH, PRL, GH
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
• .'•. '
CONJUGATEN VAN GLYCEROL-VERTAKT POLYETHYLEENGLYCOL EN 5 MENSELIJK GROEIHORMOON, WERKWIJZEN VOOR DE BEREIDING DAARVAN EN WERKWIJZEN VOOR GEBRUIK DAARVANGLYCEROL-BRANCHED POLYETHYLENE GLYCOL CONJUGATES AND 5 HUMAN GROWTH HORMON, METHODS FOR PREPARATION THEREOF, AND METHODS FOR USE THEREOF
De onderhavige aanvrage roept de voorrang in van de Ameri-10 kaanse aanvrage 60/605.945, die werd ingediend op 31 augustus 2004 en die hierin in zijn geheel wordt opgenomen als referentie.The present application claims priority to U.S. Application No. 60 / 605,945, filed August 31, 2004, which is incorporated herein by reference in its entirety.
GEBIED VAN DE UITVINDINGFIELD OF THE INVENTION
1515
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op de PEG-ylering van menselijk groeihormoon (hGH), waardoor de chemische en/of fysiologische eigenschappen van hGH veranderd kunnen worden. Het gePEG-yleerde hGH-conjugaat kan een 20 verhoogde plasmaverblijftijd, een verlaagde klaringssnel-heid, verbeterde stabiliteit, verlaagde antigeniteit, verlaagde heterogeniteit in PEG-ylering of een combinatie daarvan hebben. De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op werkwijzen voor de modificatie van hGH. Daarnaast 25 heeft de onderhavige uitvinding betrekking op farmaceutische preparaten die het gemodificeerde hGH bevatten. Een verdere uitvoeringsvorm is het gebruik van het gemodificeerde hGH voor de behandeling van groei- en ontwikkelingsstoornissen.The present invention relates to PEGylation of human growth hormone (hGH), whereby the chemical and / or physiological properties of hGH can be changed. The PEGylated hGH conjugate can have an increased plasma residence time, a reduced clearance rate, improved stability, decreased antigenicity, reduced heterogeneity in PEGylation or a combination thereof. The present invention also relates to methods for the modification of hGH. In addition, the present invention relates to pharmaceutical compositions containing the modified hGH. A further embodiment is the use of the modified hGH for the treatment of growth and developmental disorders.
3030
ACHTERGROND VAN DE UITVINDINGBACKGROUND OF THE INVENTION
Natief menselijk groeihormoon (hGH) is een eiwit dat bestaat uit een enkele keten van 191 aminozuren die 35 door twee disulfidebruggen verknoopt zijn, en de monomere vorm heeft een molecuulgewicht van 22 kDa. Menselijk GH | wordt afgescheiden door de hypofyse en kan ook worden i i? ° <5 8 2 8 2 geproduceerd door middel van genetische manipulatie. hGH zal groei veroorzaken in alle lichaamsweefsels die in staat zijn tot groei. hGH speelt een belangrijke rol niet alleen bij het bevorderen van groei in de groeifase van menselijke 5 wezens, maar ook bij het behouden van de normale lichaams-samenstelling, anabolisme en lipidemetabolisme (K. Barneis en U. Keiler, Baillieres Clin. Endocrinol. Metab. 10: 337 (1996) ) .Native human growth hormone (hGH) is a protein consisting of a single chain of 191 amino acids that are cross-linked by two disulfide bridges, and the monomeric form has a molecular weight of 22 kDa. Human GH | is secreted by the pituitary gland and can also be i i? ° <5 8 2 8 2 produced by genetic engineering. hGH will cause growth in all body tissues that are capable of growth. hGH plays an important role not only in promoting growth in the growth phase of human beings, but also in maintaining normal body composition, anabolism and lipid metabolism (K. Barneis and U. Keiler, Baillieres Clin. Endocrinol. Metab 10: 337 (1996)).
Recombinant hGH is al enkele jaren commercieel 10 verkrijgbaar. Er zijn twee typen van therapeutisch bruikbare recombinante hGH-preparaten op de markt aanwezig: het authentieke, bijv. Genotropin™ of Nutropin™, en een analo-gon met een additionele methioninerest aan het N-terminale uiteinde, bijv. Somatonorm™. hGH wordt gebruikt om de 15 lengtegroei te stimuleren in patiënten met hypo-hypofysaire dwerggroei, ook wel Groeihormoondeficiëntie (GHD) of het syndroom van Turner genoemd, maar er zijn ook andere indicaties gesuggereerd, waaronder langdurige behandeling van groeifalen in kinderen die te klein waren voor hun 20 zwangerschapsduur (SGA), voor de behandeling van patiënten met het syndroom van Prader-Willi (PWS), chronische nierin-sufficiëntie (CRI), uitputting door AIDS en veroudering. Volwassen patiënten met GH-deficiëntie (aGHD) hebben diverse problemen, zoals kenmerkende veranderingen in 25 lichaamssamenstelling, waaronder een toename in vetmassa, een afname in magere vetmassa en extracellulaire vloeistof, en vermindering in minerale botdichtheid, metabole afwij-kingen in lipiden en cardiovasculaire disfunctie. Veel van deze problemen worden verbeterd door hGH-vervangingsthera-30 pie (J. Verhelst, J. en R. Abs., Drugs; 62: 2399 (2002).Recombinant hGH has been commercially available for several years. Two types of therapeutically useful recombinant hGH preparations are present on the market: the authentic, e.g., Genotropin ™ or Nutropin ™, and an analogue with an additional methionine residue at the N-terminal end, e.g., Somatonorm ™. hGH is used to stimulate height growth in patients with hypo-pituitary dwarfism, also called Growth Hormone Deficiency (GHD) or Turner's syndrome, but other indications have also been suggested, including long-term treatment of growth failure in children who were too small for their gestational age (SGA), for the treatment of patients with Prader-Willi syndrome (PWS), chronic renal insufficiency (CRI), exhaustion by AIDS and aging. Adult patients with GH deficiency (aGHD) have various problems, such as characteristic changes in body composition, including an increase in fat mass, a decrease in lean fat mass and extracellular fluid, and reduction in mineral bone density, metabolic abnormalities in lipids and cardiovascular dysfunction . Many of these problems are corrected by hGH replacement therapy (J. Verhelst, J. and R. Abs., Drugs; 62: 2399 (2002).
Een belangrijk biologisch effect van groeihormoon (GH) is om groei in jonge zoogdieren en onderhoud van weefsels in oudere zoogdieren te bevorderen. De orgaansys-temen die beïnvloed worden, omvatten het skelet, bindweef-35 sel, spieren en zachte weefsels zoals lever, darmen en nieren. Groeihormonen oefenen hun effect uit door middel van interactie met specifieke receptoren op het membraan 3 van de doelcel. hGH is een lid van een familie van homologe hormonen, die lactogenen uit de placenta, prolactinen en andere genetische en soortvarianten van groeihormoon omvatten (Nicoli, C.S. et al. (1986) Endocrine Reviews 7: 5 169) . hGH is hiervan ongewoon, omdat het een brede soort- specificiteit vertoont en bindt aan ofwel de gekloneerde j somatogene (Leung, D.W. et al. [1987] Nature 330/ 537) of prolactinereceptor (Boutin, J.M. et al. [1988] Cell; 53: 69) . Het gekloneerde gen voor hGH is tot expressie gebracht 10 in een afgescheiden vorm in Escherichia coli (Chang, C.N. et al. [1987] Gene 55: 189) en zijn DNA- en aminozuurse-quentie is beschreven (Goeddel et al. [1979] Nature 281: 544; Gray et al. [1985] Gene 39: 247).An important biological effect of growth hormone (GH) is to promote growth in young mammals and maintenance of tissues in older mammals. The organ systems that are affected include the skeleton, connective tissue, muscles, and soft tissues such as liver, intestines, and kidneys. Growth hormones exert their effect through interaction with specific receptors on the membrane 3 of the target cell. hGH is a member of a family of homologous hormones, which include placental lactogens, prolactins, and other genetic and species variants of growth hormone (Nicoli, C. S. et al. (1986) Endocrine Reviews 7: 5 169). hGH is unusual in that it exhibits a broad species specificity and binds to either the cloned somatogenic (Leung, DW et al. [1987] Nature 330/537) or prolactin receptor (Boutin, JM et al. [1988] Cell; 53: 69). The cloned gene for hGH has been expressed in a secreted form in Escherichia coli (Chang, CN et al. [1987] Gene 55: 189) and its DNA and amino acid sequence has been described (Goeddel et al. [1979] Nature 281: 544; Gray et al. [1985] Gene 39: 247).
Menselijk groeihormoon (hGH) neemt deel aan een 15 groot deel van de regulatie van normale menselijke groei en ontwikkeling. Dit hypofysehormoon vertoont een groot aantal biologische effecten, waaronder lengtegroei (somatogenese), lactatie, activering van macrofagen, insuline-achtige en diabetogene effecten en andere (Chawla, R.K. (1983) Ann.Human growth hormone (hGH) participates in a large part of the regulation of normal human growth and development. This pituitary hormone exhibits a large number of biological effects, including length growth (somatogenesis), lactation, activation of macrophages, insulin-like and diabetogenic effects and others (Chawla, R.K. (1983) Ann.
20 Rev. Med. 34, 519; Edwards, C.K. et al. (1988) Science 239, 769; Thomer, M.0. et al. (1988) J. Clin. Invest. 81: 745). Groeihormoondeficiëntie in kinderen leidt tot dwerggroei, die gedurende meer dan tien jaar succesvol behandeld is door exogene toediening van hGH.20 Rev. Med. 34, 519; Edwards, C.K. et al. (1988) Science 239, 769; Thomer, M.0. et al. (1988) J. Clin. Invest. 81: 745). Growth hormone deficiency in children leads to dwarfism, which has been successfully treated for more than ten years by exogenous administration of hGH.
25 In volwassenen alsook in kinderen behoudt hGH een normale lichaamssamenstelling door verhoging van stikstof-retentie en stimulatie van skeletspiergroei en door de mobilisatie van lichaamsvet. Zacht vetweefsel reageert in het bijzonder op hGH. Naast verhoogde lipolyse verlaagt hGH 30 de opname van triglyceriden in opslagplaatsen van lichaamsvet. Serumconcentraties van IGF-I (insuline-achtige groeifactor) en IGFBP3 (insuline-achtige groeifactorbindend eiwit 3) worden verhoogd door hGH.In adults as well as in children, hGH maintains a normal body composition by increasing nitrogen retention and stimulation of skeletal muscle growth and by mobilizing body fat. Soft fatty tissue responds in particular to hGH. In addition to increased lipolysis, hGH 30 lowers the absorption of triglycerides in stores of body fat. Serum concentrations of IGF-I (insulin-like growth factor) and IGFBP3 (insulin-like growth factor binding protein 3) are increased by hGH.
hGH is een krachtig anabool middel, vooral als 35 gevolg van de retentie van stikstof, fosfor, kalium en calcium. Behandeling van ratten na hypofysectomie met GH kan ten minste een gedeelte van de groeisnelheid van de f 4 ratten herstellen. Moore et al., Endocrinology 122: 2920-2926 (1988). Eén van de meest opvallende effecten in hypo-hypofysaire (GH-deficiënte) patiënten is een versnelde lengtegroei van botgroeiplaatkraakbeen, hetgeen resulteert 5 in een toegenomen lengte. Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C.hGH is a powerful anabolic agent, especially as a result of the retention of nitrogen, phosphorus, potassium and calcium. Treatment of rats after hypophysectomy with GH can restore at least a portion of the growth rate of the f 4 rats. Moore et al., Endocrinology 122: 2920-2926 (1988). One of the most striking effects in hypo-pituitary (GH-deficient) patients is an accelerated length growth of bone growth plate cartilage, which results in an increased length. Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C.
Thomas, 1964) .Thomas, 1964).
hGH veroorzaakt een verscheidenheid aan fysiologische en metabole effecten in diverse diermodellen, waaron-10 der lengtegroei, lactatie, activering van macrofagen, insuline-achtige en diabetogene effecten en andere (R.K. Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34: 519 (1983); O.G.P. Isaksson et al., Annu. Rev. Physiol. 47, 483 (1985); C.K. Edwards et al., Science 239, 769 (1988); M.O. Thomer en 15 M.L. Vance, J. Clin. Invest. 82: 745 (1988); J.P. Hughes en H.G. Friesen, Ann. Rev. Physiol. 47: 469 (1985)). Er is beschreven dat, vooral in vrouwen na de menopauze, GH-afscheiding afneemt met de leeftijd. Millard et al., Neurobiol. Aging, 11: 229-235 (1990); Takahashi et al., 20 Neuroendocrinology M, L6; 137-142 (1987). Zie ook Rudman et al., J. Clin. Invest., 67: 1361-1369 (1981) en Blackman,hGH causes a variety of physiological and metabolic effects in various animal models, including length growth, lactation, activation of macrophages, insulin-like and diabetogenic effects and others (RK Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34: 519 ( 1983); OGP Isaksson et al., Annu. Rev. Physiol. 47, 483 (1985); CK Edwards et al., Science 239, 769 (1988); MO Thomer and 15 ML Vance, J. Clin. Invest. 82 : 745 (1988); JP Hughes and HG Friesen, Ann. Rev. Physiol. 47: 469 (1985)). It has been described that, especially in postmenopausal women, GH secretion decreases with age. Millard et al., Neurobiol. Aging, 11: 229-235 (1990); Takahashi et al., Neuroendocrinology M, L6; 137-142 (1987). See also Rudman et al., J. Clin. Invest., 67: 1361-1369 (1981) and Blackman,
Endocrinology and Aging, 16: 981 (1987). Bovendien bestaat er een artikel dat sommige van de verschijnselen van veroudering, waaronder een afname in magere lichaamsmassa, 25 uitbreiding van vetweefselmassa en dunner worden van de huid, verminderd kunnen worden door GH-behandeling drie keer per week. Zie bijv. Rudman et al., N. Eng. J. Med., 323: 1-6 (1990) en het begeleidende artikel in hetzelfde nummer van het tijdschrift door Dr. Vance (pg. 52-54). Deze 30 biologische effecten ontstaan uit de interactie tussen hGH en specifieke cellulaire receptoren. Twee verschillende menselijke receptoren zijn gekloneerd, de hGH-receptor uit de lever (D.W. Leung et al., Nature 330: 537 (1987)) en de menselijke prolactinereceptor (J.M. Boutin et al., Mol. 35 Endocrinology, 3: 1455 (1989)). Er zullen echter waar schijnlijk andere zijn, waaronder de lactogeenreceptor uit menselijke placenta (M. Freemark, M. Corner, G. Komer en S.Endocrinology and Aging, 16: 981 (1987). Moreover, there exists an article that some of the signs of aging, including a decrease in lean body mass, expansion of fat tissue mass and skin thinning, can be reduced by GH treatment three times a week. See, e.g., Rudman et al., N. Eng. J. Med., 323: 1-6 (1990) and the accompanying article in the same issue of the journal by Dr. med. Vance (pp. 52-54). These biological effects arise from the interaction between hGH and specific cellular receptors. Two different human receptors have been cloned, the hGH receptor from the liver (DW Leung et al., Nature 330: 537 (1987)) and the human prolactin receptor (JM Boutin et al., Mol. 35 Endocrinology, 3: 1455 (1989 )). However, there will probably be others, including the human placenta lactogen receptor (M. Freemark, M. Corner, G. Komer and S.
« 5"5
Handwerger, Endocrinol. 120: 1865 (1987)). Deze homologe receptoren bevatten een geglycosyleerd extracellulair hormoonbindend domein, een enkel transmembraandomein en een cytoplasmatisch domein, dat aanzienlijk verschilt in 5 sequentie en omvang. Vermoedelijk spelen één of meer receptoren een bepalende rol in de fysiologische reactie op hGH.Hand thrower, Endocrinol. 120: 1865 (1987)). These homologous receptors contain a glycosylated extracellular hormone binding domain, a single transmembrane domain and a cytoplasmic domain, which differs considerably in sequence and size. Presumably one or more receptors play a determining role in the physiological response to hGH.
In het algemeen wordt gezien dat fysiologisch actieve eiwitten die aan een lichaam worden toegediend, hun 10 farmacologische activiteit slechts een korte periode kunnen vertonen als gevolg van hun hoge klaringssnelheid in het lichaam. Verder kan de relatieve hydrofobiteit van deze eiwitten hun stabiliteit en/of oplosbaarheid beperken.In general, it is seen that physiologically active proteins that are administered to a body can only show their pharmacological activity for a short period of time due to their high clearance rate in the body. Furthermore, the relative hydrophobicity of these proteins can limit their stability and / or solubility.
Om de klaringssnelheid te verlagen, stabiliteit te 15 verbeteren of de antigeniteit van therapeutische eiwitten te verwijderen, zijn enkele werkwijzen voorgesteld waarbij de eiwitten worden gemodificeerd met wateroplosbare polymeren. Chemische modificatie van dit type kan een proteoly-tisch enzym effectief blokkeren tegen fysiek contact met 20 het eiwitskelet zelf, waardoor dan afbraak voorkomen wordt. Chemische hechting van bepaalde wateroplosbare polymeren kan effectief de klaring door de nier verlagen als gevolg van een verhoogd hydrodynamisch volume van het molecuul. Additionele voordelen omvatten, onder bepaalde omstandighe-25 den, het verhogen van de stabiliteit en circulatietijd van het therapeutische eiwit, het verhogen van de oplosbaarheid en het verlagen van de immunogeniteit._Poly(alkyleenoxide), met name poly(ethyleenglycol) (PEG), is zo'n chemische rest die gebruikt is bij de bereiding van therapeutische eiwit-30 producten (de uitdrukking "PEG-yleren" betekent het hechten van ten minste één PEG-molecuul) . Aangetoond is dat de hechting van poly(ethyleenglycol) beschermt tegen proteoly-se. Sada et al., J. Fennentation Bioengineering 71: 137-139 (1991) en werkwijzen voor de hechting van bepaalde poly(e-35 thyleenglycol)-resten zijn beschikbaar. Zie Amerikaans Octrooischrift 4.179.337, Davis et al., Non-Immunogenic Polypeptides, uitgegeven op 18 december 1979; en Amerikaans 6In order to reduce the clearance rate, improve stability or remove the antigenicity of therapeutic proteins, some methods have been proposed in which the proteins are modified with water-soluble polymers. Chemical modification of this type can effectively block a proteolytic enzyme from physical contact with the protein skeleton itself, thereby preventing degradation. Chemical adhesion of certain water-soluble polymers can effectively reduce kidney clearance due to an increased hydrodynamic volume of the molecule. Additional benefits include, under certain conditions, increasing the stability and circulation time of the therapeutic protein, increasing solubility and decreasing immunogenicity. Poly (alkylene oxide), in particular poly (ethylene glycol) (PEG), is such a chemical moiety used in the preparation of therapeutic protein products (the term "PEGylation" means the attachment of at least one PEG molecule). The adhesion of poly (ethylene glycol) has been shown to protect against proteolysis. Sada et al., J. Fennentation Bioengineering 71: 137-139 (1991) and methods for the adhesion of certain poly (e-thylene glycol) residues are available. See U.S. Patent No. 4,179,337, Davis et al., Non-Immunogenic Polypeptides, issued December 18, 1979; and American 6
Octrooischrift 4.002.531, Rover, Modifying Enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby, uitgegeven op 11 januari 1977. Voor een overzichtsartikel zie Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs (J.S. Holcerberg en 5 J. Roberts, red., 367-383 (1981)).Patent 4,002,531, Rover, Modifying Enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby, issued January 11, 1977. For an overview article see Abuchowski et al., In Enzymes as Drugs (JS Holcerberg and 5 J. Roberts, ed., 367- 383 (1981)).
Er zijn andere wateroplosbare polymeren gebruikt, zoals copolymeren van ethyleenglycol/propyleenglycol, carboxymethylcellulose, dextraan, poly(vinylalcohol), poly(vinylpyrrolidon), poly(1,3-dioxolaan), poly(l,3,6- 10 trioxaan), ethyleen/maleïnezuuranhydride-copolymeer, polyaminozuren (ofwel homopolymeren of willekeurige copolymeren) .Other water-soluble polymers have been used, such as copolymers of ethylene glycol / propylene glycol, carboxymethyl cellulose, dextran, poly (vinyl alcohol), poly (vinyl pyrrolidone), poly (1,3-dioxolane), poly (1,3,6-trioxane), ethylene maleic anhydride copolymer, polyamino acids (either homopolymers or random copolymers).
Voor poly(ethyleenglycol) is een verscheidenheid aan middelen gebruikt om de poly(ethyleenglycol)-moleculen 15 aan het eiwit te hechten. In het algemeen worden poly(ethyleenglycol) -moleculen aan het eiwit gebonden via een reactieve groep die op het eiwit gevonden wordt. Aminogroe-pen, zoals die op lysineresten of aan het N-uiteinde, zijn geschikt voor een dergelijke hechting. Bijvoorbeeld Royer 20 (Amerikaans Octrooischrift 4.002.531, hierboven genoemd) beweert dat reductieve alkylering werd gebruikt voor de hechting van poly(ethyleenglycol)-moleculen aan een enzym. Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994) be schrijven de modificatie van het immuunadhesine CD4 met 25 monomethoxypoly (ethyleenglycol) aldehyde via reductieve alkylering. Amerikaans Octrooischrift 5.824.784 toont de PEG-ylering van G-CSF, waaronder aan het N-uiteinde, onder reductieve alkyleringsomstandigheden.For poly (ethylene glycol), a variety of means have been used to attach the poly (ethylene glycol) molecules to the protein. In general, poly (ethylene glycol) molecules are bound to the protein via a reactive group found on the protein. Amino groups, such as those on lysine residues or at the N-terminus, are suitable for such an adhesion. For example, Royer 20 (U.S. Patent No. 4,002,531, cited above) claims that reductive alkylation was used for the attachment of poly (ethylene glycol) molecules to an enzyme. Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994) describe the modification of the immunadhesin CD4 with monomethoxy poly (ethylene glycol) aldehyde via reductive alkylation. U.S. Patent 5,824,784 shows the PEGylation of G-CSF, including at the N-terminus, under reductive alkylation conditions.
WO 93/00109 heeft betrekking op een werkwijze voor 30 het stimuleren van op GH reagerende weefsels van zoogdieren en vogels, waarbij een continue, effectieve GH-concentratie in plasma gedurende een periode van 3 of meer dagen werd aangehouden. Eén manier om een dergelijke plasmaconcentra-tie te bereiken, is naar men beweert het gebruik van GH 35 gekoppeld aan macromoleculaire stoffen zoals PEG (polyethy-leenglycol). De koppeling aan een macromoleculaire stof resulteert, naar men beweert, in een verbeterde halfwaarde- a ι 7 tijd. GePEG-yleerd menselijk groeihormoon is beschreven in WO 93/00109, waarbij gebruik werd gemaakt van mPEG-aldehyde 5000 en mPEG-N-hydroxysuccinimidylester (mPEG-NHS-5000) om een hydrodynamisch volume groter dan de grenswaarde voor de 5 nierfiltratie van 70K molecuulgewicht zoals beschreven te bereiken (Knauf, M.J. et al., J. Biol. Chem. 263: 15064- 15070, 1988). Het gebruik van mPEG-NHS resulteerde in heterogene mengsels van meerdere gePEG-yleerde vormen van hGH. WO 93/00109 beschrijft ook het gebruik van mPEG-10 maleimide om cysteïne-varianten van hGH te PEG-yleren.WO 93/00109 relates to a method for stimulating GH-responsive tissues from mammals and birds, wherein a continuous, effective GH concentration in plasma was maintained for a period of 3 or more days. One way to achieve such a plasma concentration is said to be the use of GH coupled to macromolecular substances such as PEG (polyethylene glycol). The coupling to a macromolecular substance results, it is claimed, in an improved half-life. PEGylated human growth hormone is described in WO 93/00109, using mPEG aldehyde 5000 and mPEG-N-hydroxysuccinimidyl ester (mPEG-NHS-5000) to a hydrodynamic volume greater than the limit value for kidney filtration of 70K molecular weight as described (Knauf, MJ et al., J. Biol. Chem. 263: 15064-15070, 1988). The use of mPEG-NHS resulted in heterogeneous mixtures of multiple PEGylated forms of hGH. WO 93/00109 also describes the use of mPEG-10 maleimide to PEGylate cysteine variants of hGH.
WO 99/03887 beschrijft een cysteine-variant groeihormoon dat gePEG-yleerd is. Er wordt beweerd dat dit conjugaat, aangeduid met BT-005, effectiever is bij het stimuleren van gewichtstoename in groeihormoondeficiënte 15 ratten en dat het een langere halfwaardetijd heeft dan hGH.WO 99/03887 describes a cysteine variant growth hormone that is PEGylated. It is claimed that this conjugate, designated BT-005, is more effective at stimulating weight gain in growth hormone deficient rats and that it has a longer half-life than hGH.
GePEG-yleerd menselijk groeihormoon is ook beschreven door Clark et al., die gebruikt maakten van de succinimidylester van gecarboxymethyleerd PEG (Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996). Clark et al. 20 beschrijven derivaten van hGH van toenemende grootte met behulp van mPEG-NHS-5000, dat selectief conjugeert aan primaire aminen. Modificatie met toenemende hoeveelheden PEG verlaagde de affiniteit voor zijn receptor en verhoogde de EC50 in een celgebaseerde bepaling tot 1500 keer. Olson 25 et al., Polymer Preprints 38: 568-569, 1997, beschrijven het gebruik van N-hydroxysuccinimide- (NHS-) PEG en succi-nimidylpropionaat- (SPA-) PEG om een groot aantal gePEG-yleerde hGH-soorten te verkrijgen.PEGylated human growth hormone has also been described by Clark et al., Who used the succinimidyl ester of carboxymethylated PEG (Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996). Clark et al. 20 describe derivatives of increasing hGH using mPEG-NHS-5000, which selectively conjugates to primary amines. Modification with increasing amounts of PEG reduced the affinity for its receptor and increased the EC50 in a cell-based assay to 1500 times. Olson 25 et al., Polymer Preprints 38: 568-569, 1997, disclose the use of N-hydroxysuccinimide (NHS) PEG and succinimidyl propionate (SPA) PEG to produce a large number of PEGylated hGH species to gain.
WO 94/20069 beschrijft profetisch gePEG-yleerd hGH 30 als deel van een formulering voor afgifte aan de long.WO 94/20069 describes prophetically pEGylated hGH 30 as part of a formulation for delivery to the lung.
US 4.179.337 beschrijft werkwijzen voor de PEG-ylering van enzymen en hormonen om fysiologisch actieve, niet-immunogene, wateroplosbare polypeptideconjugaten te verkrijgen. GH wordt genoemd als één voorbeeld van een 35 hormoon om te PEG-yleren.US 4,179,337 describes methods for the PEGylation of enzymes and hormones to obtain physiologically active, non-immunogenic, water-soluble polypeptide conjugates. GH is mentioned as one example of a hormone to PEG-ylate.
EP 458064 A2 beschrijft de PEG-ylering van ingebrachte of van nature aanwezige cysteïneresten in somatot- 8 ropine. EP 458064 A2 vermeldt verder de inbouw van twee cysteineresten in een lus genaamd de omegalus, die naar beweerd gelocaliseerd is op de resten 102-112 in wild-type somatotropine van het rund en meer specifiek beschrijft EP 5 458064 A2 de substitutie van de resten met nummer 102 en 112 van somatotropine van het rund van respectievelijk Ser in Cys en Tyr in Cys.EP 458064 A2 describes the PEGylation of introduced or naturally occurring cysteine residues in somatotropin. EP 458064 A2 further mentions the incorporation of two cysteine residues in a loop called the omegalus, which is said to be located on residues 102-112 in bovine wild-type somatotropin and more specifically EP 5 458064 A2 describes the substitution of the residues with numbers 102 and 112 of bovine somatotropin from Ser in Cys and Tyr in Cys, respectively.
WO 95/11987 suggereert de hechting van PEG aan de thiogroep van een cysteïnerest, die ofwel aanwezig is in 10 het moedermolecuul of ingebracht door middel van plaatsge-richte mutagenese. WO 95/11987 heeft betrekking op de PEG-ylering van protease nexine-1, maar PEG-ylering in het algemeen van hGH en andere eiwitten wordt eveneens gesuggereerd.WO 95/11987 suggests the attachment of PEG to the thio group of a cysteine residue, which is either present in the parent molecule or introduced by site-directed mutagenesis. WO 95/11987 relates to the PEGylation of protease nexin-1, but PEGylation in general of hGH and other proteins is also suggested.
15 WO 99/03887 beschrijft bijv. groeihormoon gemodi ficeerd door vervanging van serine op positie 25 door een cysteïnerest en de hechting van PEG aan de ingebrachte cysteïnerest.WO 99/03887 describes, for example, growth hormone modified by replacement of serine at position 25 with a cysteine residue and the adhesion of PEG to the introduced cysteine residue.
WO 00/42175 heeft betrekking op een werkwijze voor 20 het maken van eiwitten die vrije cysteineresten bevatten voor de hechting van PEG. WO 00/42175 beschrijft de volgende muteïnen van hGH: T3C, S144C en T148C en de cysteïne-PEG-ylering daarvan.WO 00/42175 relates to a method for making proteins containing free cysteine residues for the adhesion of PEG. WO 00/42175 describes the following hGH muteins: T3C, S144C and T148C and the cysteine PEGylation thereof.
WO 97/11178 (evenals US 5849535, US 6004931 en US 25 6022711) heeft betrekking op het gebruik van GH-varianten als agonisten of antagonisten van hGH. WO 97/11178 beschrijft ook PEG-ylering van hGH, inclusief lysine-PEG-ylering en het inbrengen of vervangen van lysine (bijv. K168A en K172R). WO 97/11178 beschrijft ook de substitutie 30 G120K.WO 97/11178 (as well as US 5849535, US 6004931 and US 25 6022711) relates to the use of GH variants as agonists or antagonists of hGH. WO 97/11178 also describes PEGylation of hGH, including lysine PEGylation and the introduction or replacement of lysine (e.g., K168A and K172R). WO 97/11178 also describes the G120K substitution.
WO 03/044056 beschrijft een verscheidenheid aan gePEG-yleerde hGH-soorten, waaronder een op lysine vertakt 40K PEG-aldehyde-hGH-conjugaat.WO 03/044056 describes a variety of PEGylated hGH species, including a lysine branched 40K PEG aldehyde hGH conjugate.
US 2004/0127417 beschrijft op lysine vertakte PEG-35 butyraldehyde-hGH-conjugaten.US 2004/0127417 describes lysine branched PEG-35 butyraldehyde hGH conjugates.
WO 04/46222, US 205/0058620, JP 08-059818, JP 11-228685 en JP 2000-001541 beschrijven polyalkyleenglycolde- 9 rivaten met een reactieve groep op het eerste koolstofatoom op de 1-positie van een glycerolskelet en met polyalkyleen-glycolketens op de 2- en 3-posities.WO 04/46222, US 205/0058620, JP 08-059818, JP 11-228685 and JP 2000-001541 describe polyalkylene glycol derivatives with a reactive group on the first carbon atom at the 1-position of a glycerol skeleton and with polyalkylene glycol chains in the 2 and 3 positions.
US 2004/0142870 heeft betrekking op een chemisch 5 gemodificeerd hGH dat bereid wordt door een polyethyleen-glycolbutyraldehyderest te hechten aan het N-terminale fenylalanine van het eiwit. Dit gemodificeerde hGH heeft een langer durende hGH-activiteit dan het niet-gemodificeerde hGH, waardoor het mogelijk wordt de doses te vermin-10 deren.US 2004/0142870 relates to a chemically modified hGH prepared by attaching a polyethylene glycol butyraldehyde residue to the N-terminal phenylalanine of the protein. This modified hGH has a longer lasting hGH activity than the unmodified hGH, making it possible to reduce the doses.
WO 02/055532 heeft betrekking op conjugaten die GH-activiteit vertonen en die ten minste één niet-polypep-tiderest omvatten welke covalent gebonden is aan een GH-polypeptide, waarvan de aminozuursequentie verschilt van 15 wild-type hGH in ten minste één geïntroduceerde en ten minst één verwijderde aminozuurrest die een aanhechtings-groep voor de niet-polypeptiderest omvat. De niet-polypep-tiderest kan bijvoorbeeld een PEG-rest zijn. Voor een dergelijk PEG-molecuul wordt een MW van 20 kDA genoemd.WO 02/055532 relates to conjugates that exhibit GH activity and that comprise at least one non-polypeptide residue covalently linked to a GH polypeptide, the amino acid sequence of which differs from wild-type hGH in at least one introduced and at least one deleted amino acid residue comprising an attachment group for the non-polypeptide residue. The non-polypeptide residue may, for example, be a PEG residue. A MW of 20 kDA is mentioned for such a PEG molecule.
20 WO 2005/075021 heeft betrekking op chemisch gemodificeerde hGH receptor antagonisten die bereid worden door een enkele polyethyleenglycolrest aan het N-uiteinde te hechten, in het bijzonder aan fenylalanine. Het gemodificeerde hGH heeft een verminderde PEG-ylering heterogeni-25 teit en mogelijk een verhoogde bindingsaffiniteit.WO 2005/075021 relates to chemically modified hGH receptor antagonists prepared by attaching a single polyethylene glycol moiety to the N-terminus, in particular to phenylalanine. The modified hGH has a reduced PEGylation heterogeneity and possibly an increased binding affinity.
EP 1.333.036 heeft betrekking op een polyethyleen-glycol-geconjugeerd erythropoietine (PEG-geconjugeerd EPO) dat bereid wordt door (mono)-PEG-conjugatie aan de lysine-rest op positie 52 van natief EPO.EP 1,333,036 relates to a polyethylene glycol-conjugated erythropoietin (PEG-conjugated EPO) prepared by (mono) PEG conjugation to the lysine moiety at position 52 of native EPO.
30 Momenteel gebeurt toediening van rhGH dagelijks over een lange periode en daarom zou een minder frequente toediening hoogst gewenst zijn. Een hGH-molecuul met een langere halfwaardetijd in de circulatie zou het aantal noodzakelijke toedieningen verlagen en mogelijk meer 35 optimale therapeutische hGH-concentraties verschaffen met tegelijkertijd een verhoogd therapeutisch effect.Currently, rhGH is administered daily over a long period of time, and therefore a less frequent administration would be highly desirable. An hGH molecule with a longer half-life in the circulation would reduce the number of necessary administrations and possibly provide more optimal therapeutic hGH concentrations with at the same time an increased therapeutic effect.
1010
Ondanks een aantal pogingen om een langlevende vorm van hGH te ontwikkelen, waaronder gePEG-yleerd, is er nog steeds een ongestilde behoefte aan een gePEG-yleerd hGH-molecuul met geschikte eigenschappen om een levensvat-5 baar commercieel product te zijn. De onderhavige uitvinding verschaft PEG-hGH-conjugaten met een enkel PEG voornamelijk gehecht aan het N-terminale fenylalanine van hGH, wat voordelen ten opzichte van andere PEG-hGH-conjugaten verschaft. De hechting van meerdere laag-moleculaire (5 kD) 10 PEG's op a- of e-aminoplaatsen (N-uiteinde en negen lysinen in hGH) met behulp van mPEG-aldehyde-5000 of mPEG-N-hy-droxysuccinimidylester (mPEG-NHS-5000) is beschreven in WO 93/00109, door Clark et al. (Journal of Biological Chemis-try 271: 21969-21977, 1996) en door Olson et al. (Polymer 15 Preprints 38: 568-569, 1997). Dit resulteert in een heterogene populatie. Ter illustratie kan hGH met negen lysinen sommige moleculen met tien PEG's gehecht, sommige met negen, sommige met acht, sommige met zeven, sommige met zes, sommige met vijf, sommige met vier, sommige drie, 2 0 sommige met twee, sommige met één en sommige met nul hebben. En van de moleculen met meerdere kan het PEG niet gehecht zijn op dezelfde locatie op verschillende moleculen. Deze resulterende heterogeniteit is een nadeel wanneer een therapeutisch product wordt ontwikkeld, omdat dit 25 conjugatie, zuivering en karakterisering moeilijk, kostbaar en zeer onreproduceerbaar maakt. Een andere benadering (WO 00/42175) was om hGH-varianten met vrije cysteïneresten te gebruiken voor de hechting van PEG. Deze benadering resulteert echter in een onnatuurlijke hGH-variant en kan ook 30 leiden tot incorrect gevouwen eiwit met incorrect gepaarde disulfidebindingen, hetgeen resulteert in een heterogeen gePEG-yleerd product dat het PEG gehecht heeft op sommige of alle cysteïnen. Meerdere PEG's gehecht aan meerdere plaatsen kan leiden tot moleculen die minder stabiele 35 bindingen hebben tussen het PEG en de verschillende plaatsen die met verschillende snelheden gedissocieerd kunnen raken. Dit maakt het moeilijk om nauwkeurig de farmacokine- 11 tiek van het product te voorspellen, hetgeen resulteert in een onnauwkeurige dosering. Een heterogeen product zorgt ook voor ongewenste problemen bij het verkrijgen van regulatoire goedkeuring voor het therapeutische product.Despite a number of attempts to develop a long-lived form of hGH, including PEGylated, there is still an unmet need for a PEGylated hGH molecule with suitable properties to be a viable commercial product. The present invention provides PEG-hGH conjugates with a single PEG primarily attached to the N-terminal phenylalanine of hGH, which provides benefits over other PEG-hGH conjugates. The adhesion of multiple low molecular weight (5 kD) 10 PEGs to α or ε-amino sites (N-terminus and nine lysines in hGH) using mPEG-aldehyde-5000 or mPEG-N-hydroxysuccinimidyl ester (mPEG-NHS -5000) is described in WO 93/00109, by Clark et al. (Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996) and by Olson et al. (Polymer Preprints 38: 568-569, 1997). This results in a heterogeneous population. For example, hGH with nine lysines can have some molecules attached with ten PEGs, some with nine, some with eight, some with seven, some with six, some with five, some with four, some three, 2 0 some with two, some with one and some with zero. And of the multiple molecules, the PEG cannot be attached at the same location on different molecules. This resulting heterogeneity is a disadvantage when a therapeutic product is developed because it makes conjugation, purification, and characterization difficult, expensive, and very un-reproducible. Another approach (WO 00/42175) was to use hGH variants with free cysteine residues for the adhesion of PEG. However, this approach results in an unnatural hGH variant and can also lead to incorrectly folded protein with incorrectly paired disulfide bonds, resulting in a heterogeneous PEGylated product that the PEG has attached to some or all of the cysteines. Multiple PEGs attached to multiple sites can lead to molecules that have less stable bonds between the PEG and the different sites that can dissociate at different rates. This makes it difficult to accurately predict the pharmacokinetic of the product, resulting in an inaccurate dosage. A heterogeneous product also causes undesirable problems in obtaining regulatory approval for the therapeutic product.
5 Het zou daarom gewenst zijn om een gePEG-yleerd hGH-molecuul te hebben dat een enkel PEG gehecht heeft op een enkele plaats. De onderhavige uitvinding richt zich op deze behoefte op een aantal manieren.It would therefore be desirable to have a PEGylated hGH molecule that has a single PEG attached at a single site. The present invention addresses this need in a number of ways.
10 SAMENVATTING VAN DE UITVINDINGSUMMARY OF THE INVENTION
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op gePEG-yleerd hGH, waarvoor gebruik wordt gemaakt van een glycerol-vertakte poly(ethyleenglycol)-rest, dat ten minste 15 één verbeterde chemische of fysiologische eigenschap heeft die gekozen wordt uit, maar niet beperkt tot: verlaagde klaringssnelheid, verhoogde plasmaverblijfduur, verhoogde stabiliteit, verbeterde oplosbaarheid en verlaagde antige-niteit. Zoals hieronder in meer detail beschreven, heeft de 20 onderhavige uitvinding dus een aantal aspecten met betrekking tot het chemisch modificeren van hGH met behulp van een glycerol-vertakte poly(ethyleenglycol)-rest.The present invention relates to PEGylated hGH using a glycerol-branched poly (ethylene glycol) moiety that has at least one improved chemical or physiological property selected from, but not limited to: reduced clearance rate , increased plasma residence time, increased stability, improved solubility and reduced antigenicity. Thus, as described in more detail below, the present invention has a number of aspects with regard to chemically modifying hGH using a glycerol-branched poly (ethylene glycol) moiety.
De onderhavige uitvinding kan ook één of meer verbeterde eigenschappen hebben in vergelijking met conju-25 gaten van op lysine gebaseerd vertakt PEG/menselijk groeihormoon, waaronder, maar niet beperkt tot: a) verhoogde stabiliteit van het glycerolskelet, b) verhoogde receptor-binding, c) verlaagde kosten, d) verhoogde N-terminale selectiviteit van hechting, e) verhoogde oplosbaarheid, f) 3 0 verlaagde immunogeniteit, g) verhoogde stabiliteit van het conjugaat, h) verhoogde produceerbaarheid en i) verlaagde proteolyse.The present invention may also have one or more improved properties compared to conjugates of lysine-based branched PEG / human growth hormone, including, but not limited to: a) increased stability of the glycerol skeleton, b) increased receptor binding, c) reduced costs, d) increased N-terminal selectivity of adhesion, e) increased solubility, f) reduced immunogenicity, g) increased stability of the conjugate, h) increased producibility and i) decreased proteolysis.
De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op werkwijzen voor het produceren van gePEG-yleerd hGH. In het 35 bijzonder heeft de onderhavige uitvinding betrekking op een werkwijze voor het produceren van een gePEG-yleerd hGH met behulp van een glycerol-vertakt PEG.The present invention also relates to methods for producing PEGylated hGH. In particular, the present invention relates to a method for producing a PEGylated hGH using a glycerol-branched PEG.
β 12β 12
De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op preparaten die het gePEG-yleerde hGH alleen bevatten of in combinatie met een ander therapeutisch middel. De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op het gebruik van het 5 gePEG-yleerde hGH van de onderhavige uitvinding, alleen of in combinatie met een ander therapeutisch middel, bij de voorkoming en/of behandeling van stoornissen en/of ziekten waarbij behandeling met GH nuttig is.The present invention also relates to compositions containing the PEGylated hGH alone or in combination with another therapeutic agent. The present invention also relates to the use of the PEGylated hGH of the present invention, alone or in combination with another therapeutic agent, in the prevention and / or treatment of disorders and / or diseases where treatment with GH is useful .
10 KORTE BESCHRIJVING VAN DE TEKENINGEN10 BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Figuur 1 is een afbeelding van op grootte scheidende HPLC, waarin het elutieprofiel van het gezuiverde enkelvoudig gePEG-yleerde glycerol-vertakt 43K PEG-aldehy-15 de-hGH-reactieproduct op een TSK G4000PWXL-kolom wordt getoond.Figure 1 is an image of size-separating HPLC showing the elution profile of the purified single PEGylated glycerol branched 43K PEG aldehyde de hGH reaction product on a TSK G4000PWXL column.
Figuur 2 is een HPLC-afbeelding van de tryptische kaartanalyse van hGH en glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH. De bovenste deelfiguur is de tryptische kaart van hGH. 20 De onderste deelfiguur is de tryptische kaart van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH. Tl is het N-terminale tryptische fragment.Figure 2 is an HPLC image of the tryptic map analysis of hGH and glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH. The upper part is the tryptic map of hGH. The lower part figure is the tryptic map of glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH. T1 is the N-terminal tryptic fragment.
Figuur 3 toont de aminozuursequentie van menselijk groeihormoon (SEQ ID Nr. 1).Figure 3 shows the amino acid sequence of human growth hormone (SEQ ID NO: 1).
25 Figuur 4 toont de werkzaamheid van glycerol-verFigure 4 shows the efficacy of glycerol far
takt 43K PEG-aldehyde-hGH in een elf dagen durende bepaling van gewichtstoename in de rat. Vrouwelijke Sprague-Dawley ratten met hypofysectomie werden op een leeftijd van 4-5 weken (85 - 110 g) betrokken van Harlan Labs. Na binnen-30 komst in de dierenverblijven werden de dieren bij een constante kamertemperatuur van 80°F gehouden. Na 3 dagen acclimatisering werden de ratten dagelijks gewogen gedurende 4 - 10 dagen om basale groeisnelheden vast te stellen. Beginnend op dag 0 ontvingen ratten (-100 g) in controle-35 groepen dan één dagelijkse subcutane injectie van -0,3 mg/kg hGH (a) of PBS als drager (·) gedurende elf achtereenvolgende dagen. De testgroep met glycerol-vertakt 43K43K PEG-aldehyde-hGH branches in an eleven-day assay of weight gain in the rat. Female Sprague-Dawley rats with hypophysectomy were obtained from Harlan Labs at the age of 4-5 weeks (85 - 110 g). After entering the animal enclosures, the animals were kept at a constant room temperature of 80 ° F. After 3 days of acclimation, the rats were weighed daily for 4 - 10 days to determine basal growth rates. Starting on day 0, rats (-100 g) in control-35 groups then received one daily subcutaneous injection of -0.3 mg / kg hGH (a) or PBS as carrier (·) for eleven consecutive days. The glycerol branched 43K test group
13 PEG-aldehyde-hGH () ontving enkele doses van 1,8 mg/kg glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH op dag 0 en 6. Er waren 6 dieren per groep. Uitgezette waarden staan voor gemiddelde gewichtstoename ± SEM.13 PEG aldehyde hGH () received single doses of 1.8 mg / kg glycerol branched 43K PEG aldehyde hGH on days 0 and 6. There were 6 animals per group. Plotted values represent average weight gain ± SEM.
5 Figuur 5 toont de groei van het scheenbeen over elf dagen als reactie op glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH. De dieren waren die welke behandeld werden in Figuur 4. De dieren werden gedood na het opnemen van het gewicht op dag 11, er werden röntgenopnames van de linker scheenbe-10 nen gemaakt en de bot lengte werd gemeten met behulp van een schuifmaat. De gemiddelde lengte ± SEM is uitgezet. Sterretjes duiden op significante verschillen ten opzichte van de controlegroep (P < 0,05). Er waren 6 dieren per groep.Figure 5 shows the tibial growth over eleven days in response to glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH. The animals were those treated in Figure 4. The animals were killed after taking the weight on day 11, X-rays of the left shins were made and the bone length was measured using a caliper. The average length ± SEM is plotted. Asterisks indicate significant differences from the control group (P <0.05). There were 6 animals per group.
Figuur 6 toont ureumstikstofconcentraties in bloed 15 op dag 11 als reactie op glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH. Bloedmonsters werden genomen van de dieren die behandeld werden zoals voor Figuur 4. Serum werd bereid en ureumstikstofconcentraties werden gemeten. Het gemiddelde ± SEM is uitgezet (6 dieren per groep). Sterretjes duiden op 20 significante verschillen ten opzichte van de controlegroep (P < 0,05).Figure 6 shows urea nitrogen concentrations in blood 15 on day 11 in response to glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH. Blood samples were taken from the animals treated as for Figure 4. Serum was prepared and urea nitrogen concentrations were measured. The mean ± SEM is plotted (6 animals per group). Asterisks indicate 20 significant differences from the control group (P <0.05).
Figuur 7 toont een studie naar de werkzaamheid van een zes dagen durende oplopende dosering van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH. Deze groeistudie werd uitgevoerd 25 op een manier vergelijkbaar met die welke beschreven is voor Figuur 4, behalve dat alleen op dag 0 variërende enkele doses van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde/hGH werden toegediend en de studie over 6 dagen werd gedaan. Controlegroepen ontvingen eenmaal per dag subcutane injec-30 ties van ofwel 0,3 mg/kg hGH (♦) of PBS als drager (o) gedurende zes achtereenvolgende dagen. De testgroep met glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH ontving een enkele dosis van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH op dag 0. De doses van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH waren 35 1,8 mg/kg () , 0,6 mg/kg (X), 0,2 mg/kg ( + ) , 0,067 mg/kg (a). Er waren 6 dieren per groep.Figure 7 shows a study of the efficacy of a six-day ascending dose of glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH. This growth study was performed in a manner similar to that described for Figure 4, except that single doses of glycerol-branched 43K PEG aldehyde / hGH varying only on day 0 and the 6-day study was done. Control groups received subcutaneous injections of either 0.3 mg / kg hGH (♦) or PBS as carrier (o) once a day for six consecutive days. The glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH test group received a single dose of glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH on day 0. The doses of glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH were 1.8 mg / kg (), 0.6 mg / kg (X), 0.2 mg / kg (+), 0.067 mg / kg (a). There were 6 animals per group.
1414
Figuur 8 toont IGF-1-concentraties in serum voor een zes dagen durende studie naar werkzaamheid. De dieren werden behandeld zoals beschreven voor Figuur 7. Bloedmonsters werden genomen op de diverse tijdstippen die uitgezet 5 zijn, en de IGF-1-concentraties in serum werden bepaald met ELISA. Gemiddelden van de groepen (n=6) werden gebruikt om de IGF-1-reactie te berekenen met behulp van de éénwegs variantieanalyse op de gemiddelde waarden en de waarden voor de AUC dO-6 (ng/ml * 24 uur) van 37.839, 28.1292, 10 22.958 en 20.040 werden bepaald voor de cohorten met een dosering van respectievelijk 1,8, 0,6, 0,2 en 0,067 mg/kg.Figure 8 shows IGF-1 concentrations in serum for a six-day efficacy study. The animals were treated as described for Figure 7. Blood samples were taken at the various time points plotted, and the IGF-1 concentrations in serum were determined by ELISA. Averages of the groups (n = 6) were used to calculate the IGF-1 response using the one-way variance analysis on the mean values and the values for the AUC dO-6 (ng / ml * 24 hours) of 37,839, 28,1292, 10 22,958 and 20,040 were determined for the cohorts with a dose of 1.8, 0.6, 0.2 and 0.067 mg / kg, respectively.
Figuur 9 toont de bepaling van PK/PD na toediening van een enkele dosis van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH aan vrouwelijke ratten na hypofysectomie. Het effect 15 van de toediening van een enkele SC dosis van 1,8 mg/kg van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH op de plasmaconcen-tratie van het geneesmiddel (a) of de reactie van IGF-1 in plasma (b).Figure 9 shows the determination of PK / PD after single dose administration of glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH to female rats after hypophysectomy. The effect of the administration of a single SC dose of 1.8 mg / kg of glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH on the plasma concentration of the drug (a) or the reaction of IGF-1 in plasma (b ).
2 0 GEDETAILLEERDE BESCHRIJVING VAN DE UITVINDING2 0 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op conjugaten van glycerol-vertakt polyethyleenglycol-menselijk groeihormoon. In een specifieke uitvoeringsvorm heeft 25 het glycerol-vertakt polyethyleenglycolderivaat een reac-tieve aldehydegroep en eventueel een linker tussen het polyethyleenglycol en de reactieve functionele groep op het eerst koolstofatoom op de 1-positie van een glycerolskelet en met polyalkyleenglycolketens op de 2- en 3-posities, 30 zoals beschreven in WO 04/46222 of US 2005/0058620 (hierin opgenomen als referentie) om hGH-conjugaten te maken. De linker is niet in het bijzonder beperkt, zolang als het maar een covalente binding is, maar hij omvat bij voorkeur een alkyleengroep en een alkyleengroep met een esterbin-35 ding, een urethaanbinding, een amidebinding, een etherbin-ding, een carbonaatbinding, of een secundaire aminegroep. Bij voorkeur omvat de alkyleengroep een methyleengroep, een 15 ! ethyleengroep, een trimethyleengroep, een propyleengroep, ! een isopropyleengroep, een tetramethyleengroep, een buty- leengroep, een isobutyleengroep, een pentamethyleengroep en een hexamethyleengroep.The present invention relates to glycerol-branched polyethylene glycol-human growth hormone conjugates. In a specific embodiment, the glycerol-branched polyethylene glycol derivative has a reactive aldehyde group and optionally a linker between the polyethylene glycol and the reactive functional group on the first carbon atom at the 1-position of a glycerol skeleton and with polyalkylene glycol chains on the 2- and 3- positions as described in WO 04/46222 or US 2005/0058620 (incorporated herein by reference) to make hGH conjugates. The linker is not particularly limited so long as it is a covalent bond, but it preferably comprises an alkylene group and an alkylene group with an ester bond, a urethane bond, an amide bond, an ether bond, a carbonate bond, or a secondary amine group. The alkylene group preferably comprises a methylene group, a ethylene group, a trimethylene group, a propylene group,! an isopropylene group, a tetramethylene group, a butylene group, an isobutylene group, a pentamethylene group and a hexamethylene group.
5 Een specifieke uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is een menselijk groeihormoon-PEG-conjugaat met de structuur met de Formule:A specific embodiment of the present invention is a human growth hormone-PEG conjugate with the structure of the Formula:
H2C-0(CH2CH20)nCH2CH2CH2NHRH 2 C-O (CH 2 CH 2 O) n CH 2 CH 2 CH 2 NHR
10 CH-0(CH2CH20)mCH3 15 H2C-OCCHsCHsOj^CHs waarin n een geheel getal tussen 60 en 75 is; m een geheel getal tussen 450 en 460 is; 20 R een menselijk groeihormoonpeptide is.CH-O (CH 2 CH 2 O) mCH 3 H 2 C-OCCH 3 CH 3 O 4 CH 3 wherein n is an integer between 60 and 75; m is an integer between 450 and 460; R is a human growth hormone peptide.
In een bijzondere uitvoeringsvorm ligt n tussen ongeveer 64 en ongeveer 72.In a particular embodiment, n is between about 64 and about 72.
In een speciale uitvoeringsvorm heeft de rest 25 (CH2CH20)n een gemiddeld molecuulgewicht tussen ongeveer 2,6 en ongeveer 3,5 Kd en in het bij zonder is het gemiddelde molecuulgewicht ongeveer 3 Kd.In a special embodiment, the residue (CH 2 CH 2 O) n has an average molecular weight between about 2.6 and about 3.5 Kd and in particular the average molecular weight is about 3 Kd.
In een speciale uitvoeringsvorm heeft elke rest (CH2CH20)m een gemiddeld molecuulgewicht tussen ongeveer 30 17,6 en ongeveer 22 Kd en in het bijzonder is het gemid delde molecuulgewicht ongeveer 20 Kd.In a special embodiment, each residue (CH 2 CH 2 O) m has an average molecular weight between about 17.6 and about 22 Kd and, in particular, the average molecular weight is about 20 Kd.
In een specifieke uitvoeringsvorm heeft de rest (CH2CH20)n een gemiddeld molecuulgewicht van ongeveer 3 Kd en elke rest (CH2CH20)m heeft een gemiddeld molecuulgewicht 35 van ongeveer 20 Kd.In a specific embodiment, the residue (CH 2 CH 2 O) n has an average molecular weight of about 3 Kd and each residue (CH 2 CH 2 O) m has an average molecular weight of about 20 Kd.
De term "ongeveer" indien gebruikt in verband met het molecuulgewicht van een PEG-rest betekent dat in 16 preparaten van polyethyleenglycol sommige moleculen meer zullen wegen, sommige minder dan het aangegeven molecuulge-wicht en het aangegeven molecuulgewicht verwijst naar het gemiddelde molecuulgewicht. Het zal duidelijk zijn dat er 5 enige graad van polydispersiteit geassocieerd is met polymeren zoals poly(ethyleenglycol). Het heeft de voorkeur om PEG's met lage polydispersiteit te gebruiken. In een specifieke uitvoeringsvorm is één van de eindstandige hydroxylgroepen van het polymeer omgezet in of bedekt met 10 een methylgroep. Zoals hierin gebruikt, verwijst de term "mPEG" naar een PEG dat aan één uiteinde bedekt is met een methylgroep. Het mPEG kan structureel worden voorgesteld alsThe term "about" when used in connection with the molecular weight of a PEG moiety means that in 16 polyethylene glycol preparations some molecules will weigh more, some less than the indicated molecular weight and the indicated molecular weight refers to the average molecular weight. It will be appreciated that there is some degree of polydispersity associated with polymers such as poly (ethylene glycol). It is preferred to use low polydispersity PEGs. In a specific embodiment, one of the terminal hydroxyl groups of the polymer is converted to or covered with a methyl group. As used herein, the term "mPEG" refers to a PEG that is covered at one end with a methyl group. The mPEG can be structurally represented as
15 CH30-(CH2CH20)n-HCH 3 O- (CH 2 CH 2 O) n -H
De term "menselijk groeihormoon", "hGH-polypepti-de" of "hGH-eiwit", indien hierin gebruikt, omvat alle hGH-polypeptiden die worden gekenmerkt doordat ze groei bevor-2 0 deren in de groeifase en bij het behouden van de normale lichaamssamenstelling, anabolisme en lipidemetabolisme. Bij voorkeur verwijst de term "hGH-polypeptide" naar het hGH-polypeptide van SEQ ID Nr. 1.The term "human growth hormone", "hGH polypeptide" or "hGH protein", when used herein, includes all hGH polypeptides characterized in that they promote growth in the growth phase and in maintaining the normal body composition, anabolism and lipid metabolism. Preferably, the term "hGH polypeptide" refers to the hGH polypeptide of SEQ ID NO. 1.
De hGH-polypeptiden van de onderhavige uitvinding 25 kunnen op elke geschikte manier worden bereid. Dergelijke hGH-polypeptiden en fragmenten daarvan kunnen worden gezuiverd uit natuurlijke bronnen,, chemisch worden gesynthetiseerd, geproduceerd met recombinante technieken, waaronder in vitro translatietechnieken of expressie in een 30 recombinante cel die in staat is hGH-cDNA tot expressie te brengen, of een combinatie van deze werkwijzen met behulp van technieken die bekend zijn bij de deskundigen in het vak (zie bijvoorbeeld "Methods in Enzymology, Academie Press, 1993" voor een verscheidenheid aan werkwijzen voor 35 het zuiveren van eiwitten; Creighton (1983), Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., 2de editie, T.E., New York; en Hunkapiller et al. (1984) 17The hGH polypeptides of the present invention can be prepared in any suitable manner. Such hGH polypeptides and fragments thereof can be purified from natural sources, chemically synthesized, produced by recombinant techniques, including in vitro translation techniques or expression in a recombinant cell capable of expressing hGH cDNA, or a combination of these methods using techniques known to those skilled in the art (see, for example, "Methods in Enzymology, Academic Press, 1993" for a variety of methods for purifying proteins; Creighton (1983), Proteins: Structures and Molecular Principles, WH Freeman & Co., 2nd edition, TE, New York; and Hunkapiller et al. (1984) 17
Nature, 310 (5973) : 105-11 voor de chemische synthese van eiwitten, en Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, red., Elsevier Press, NY, voor recombinante technieken, welke beschrijvingen in hun geheel worden opgenomen 5 als referentie) . De polypeptiden van de onderhavige uitvinding worden bij voorkeur verschaft in geïsoleerde vorm en ze kunnen gedeeltelijk of bij voorkeur in grote mate gezuiverd zijn.Nature, 310 (5973): 105-11 for the chemical synthesis of proteins, and Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, ed., Elsevier Press, NY, for recombinant techniques, which descriptions are incorporated in their entirety 5 as a reference). The polypeptides of the present invention are preferably provided in isolated form and may be partially or preferably highly purified.
Een specifieke uitvoeringsvorm van de onderhavige 10 uitvinding is een menselijk groeihormoon-PEG-conjugaat, waarin meer dan 80%, met meer voorkeur 81%, met meer voorkeur 82%, met meer voorkeur 83%, met meer voorkeur 84%, met meer voorkeur 85%, met meer voorkeur 86%, met meer voorkeur 87%, met meer voorkeur 88%, met meer voorkeur 89%, 15 met meer voorkeur 90%, met meer voorkeur 91%, met meer voorkeur 92%, met meer voorkeur 93%, met meer voorkeur 94%, met meer voorkeur 95%, met meer voorkeur 96%, met meer voorkeur 97% en met meer voorkeur 98% van het polyethy-leenglycol geconjugeerd is aan het aminoterminale fenylala-20 nine van het menselijke groeihormoon met SEQ ID Nr. 1.A specific embodiment of the present invention is a human growth hormone-PEG conjugate in which more than 80%, more preferably 81%, more preferably 82%, more preferably 83%, more preferably 84%, more preferably 85%, more preferably 86%, more preferably 87%, more preferably 88%, more preferably 89%, more preferably 90%, more preferably 91%, more preferably 92%, more preferably 93 %, more preferably 94%, more preferably 95%, more preferably 96%, more preferably 97% and more preferably 98% of the polyethylene glycol is conjugated to the amino-terminal phenylalanine of the human growth hormone with SEQ ID NO. 1.
Een andere uitvoeringsvorm van de onderhavige uitvinding is een hoofdzakelijk homogeen preparaat van N-terminaal gePEG-yleerd hGH, eventueel in een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel, drager of adjuvans, waarbij 25 dit preparaat in wezen vrij is van hGH dat gePEG-yleerd is op plaatsen anders dan het N-uiteinde. De term "hoofdzakelijk homogeen preparaat" betekent een preparaat waarin meer dan 80%, met meer voorkeur 81%, met meer voorkeur 82%, met meer voorkeur 83%, met meer voorkeur 84%, met meer voorkeur 30 85%, met meer voorkeur 86%, met meer voorkeur 87%, met meer voorkeur 88%, met meer voorkeur 89%, met meer voorkeur 90%, met meer voorkeur 91%, met meer voorkeur 92%, met meer voorkeur 93%, met meer voorkeur 94%, met meer voorkeur 95%, met meer voorkeur 96%, met meer voorkeur 97% en met meer 35 voorkeur 98% enkelvoudig gePEG-yleerd is.Another embodiment of the present invention is a substantially homogeneous preparation of N-terminally PEGylated hGH, optionally in a pharmaceutically acceptable diluent, carrier or adjuvant, wherein this preparation is essentially free of hGH that is PEGylated at sites otherwise then the N-terminus. The term "substantially homogeneous composition" means a composition wherein more than 80%, more preferably 81%, more preferably 82%, more preferably 83%, more preferably 84%, more preferably 85%, more preferably 86%, more preferably 87%, more preferably 88%, more preferably 89%, more preferably 90%, more preferably 91%, more preferably 92%, more preferably 93%, more preferably 94% , more preferably 95%, more preferably 96%, more preferably 97% and more preferably 98% singly PEGylated.
In één uitvoeringsvorm van de uitvinding worden secundaire aminekoppelingen gevormd tussen de N-terminale i , 18 primaire α-aminogroep van een hGH-polypeptide en een ' glycerol-vertakte PEG-keten-aldehyde door middel van reductieve alkylering zoals beschreven door Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994), Amerikaans Octrooi - 5 schrift 4.002.531, WO 90/05534 en Amerikaans Octrooischrift 5.824.784 met een geschikt reducerend zoals NaCNBH3, NaBH3, pyridine-boraan enz. Het glycerol-vertakt PEG-aldehyde wordt geincubeerd met een hGH-polypeptide, hetgeen resulteert in de toevoeging van de PEG-rest aan aminogroepen via 10 de vorming van een Schiffse base. Deze koppelingen worden omgezet in stabiele secundaire aminen door reductie met een reducerend middel. Het proces van reductieve alkylering is afgebeeld in het schema hieronder (uit Chamow et al.).In one embodiment of the invention, secondary amine linkages are formed between the N-terminal primary amino group of an hGH polypeptide and a glycerol-branched PEG chain aldehyde by reductive alkylation as described by Chamow et al. , Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994), U.S. Patent No. 5,002,531, WO 90/05534 and U.S. Patent No. 5,824,784 with a suitable reducing agent such as NaCNBH3, NaBH3, pyridine-borane, etc. The glycerol-branched PEG aldehyde is incubated with an hGH polypeptide, resulting in the addition of the PEG moiety to amino groups via the formation of a Schiff base. These linkages are converted to stable secondary amines by reduction with a reducing agent. The process of reductive alkylation is depicted in the scheme below (from Chamow et al.).
1 · 19 VHz Qn1 · 19 VHz Qn
+ JC-CHg-OR+ JC-CH 3 OR
5 Araine- COOH5 Araine COOH
bevattend ' pH 5-9 eiwit t nh2 (^^yN^jcH-CHg-OR |containing pH 5-9 protein t nh 2 (^^ yN ^ jcH-CH 3 OR)
10 COOHCOOH
I NaCNBH3 NH2 NHjcHg-CHg-ORlI NaCNBH 3 NH 2 NH 3 H 8 CH 3 OR 1
COOHCOOH
Conjugatiereacties, "PEG-yleringsreacties" genoemd, werden in het verleden uitgevoerd in oplossing met 20 een molaire overmaat aan polymeer en ongeacht waar het polymeer zal hechten aan het eiwit. Dergelijke algemene technieken zijn echter in het algemeen inadequaat gebleken voor het conjugeren van biologisch actieve eiwitten aan niet-antigene polymeren, terwijl ze voldoende biologische 25 activiteit behouden. Eén manier om de biologische activiteit van hGH te behouden, is om hoofdzakelijk conjugatie van die reactieve groepen van hGH te vermijden die geassocieerd zijn met de receptorbindende plaats (en) in de werkwijze voor polymeerkoppeling. Een ander aspect van de 30 onderhavige uitvinding is om een werkwijze te verschaffen voor het conjugeren van poly(ethyleenglycol) aan hGH, waarbij hoge niveaus van behouden activiteit behouden blij ven.Conjugation reactions, called "PEG yelling reactions", have been performed in the past in solution with a molar excess of polymer and regardless of where the polymer will adhere to the protein. However, such general techniques have generally been found to be inadequate for conjugating biologically active proteins to non-antigenic polymers while retaining sufficient biological activity. One way to maintain the biological activity of hGH is to substantially avoid conjugation of those reactive groups of hGH that are associated with the receptor binding site (s) in the polymer coupling method. Another aspect of the present invention is to provide a method for conjugating poly (ethylene glycol) to hGH, while maintaining high levels of retained activity.
De chemische modificatie via een covalente binding 35 kan worden uitgevoerd onder alle geschikte omstandigheden die overgenomen worden in een reactie van een biologisch actieve stof met het geactiveerde poly(ethyleenglycol). De i 20 conjugatiereactie wordt uitgevoerd onder relatief milde omstandigheden om inactivering van het hGH te vermijden.The chemical modification via a covalent bond can be carried out under any suitable conditions that are taken over in a reaction of a biologically active substance with the activated poly (ethylene glycol). The conjugation reaction is carried out under relatively mild conditions to avoid inactivation of the hGH.
Milde omstandigheden omvatten het behouden van de pH van de reactieoplossing in het traject van 3 - 10 en de reactie-5 temperaturen binnen het traject van ongeveer 0° - 37°C. In de gevallen dat de reactieve aminozuurresten in hGH vrije j aminogroepen hebben, wordt de bovengenoemde modificatie bij voorkeur uitgevoerd in een niet-beperkende reeks van geschikte buffers (pH 4 - 10) , waaronder fosfaat, MES,Mild conditions include maintaining the pH of the reaction solution in the range of 3 - 10 and the reaction temperatures in the range of about 0 ° - 37 ° C. In the cases where the reactive amino acid residues in hGH have free amino groups, the above modification is preferably carried out in a non-limiting series of suitable buffers (pH 4 - 10), including phosphate, MES,
10 citraat, acetaat, succinaat of HEPES, gedurende 1-48 uur bij 4° - 37°C. Bij het richten naar N-terminale aminogroepen met reagentia zoals PEG-aldehyden wordt bij voorkeur pHCitrate, acetate, succinate or HEPES, for 1-48 hours at 4 ° - 37 ° C. When targeting to N-terminal amino groups with reagents such as PEG aldehydes, pH preferably becomes
4-8 aangehouden. Het geactiveerde poly(ethyleenglycol) kan worden gebruikt in ongeveer 0,01 - 100 keer, bij 15 voorkeur ongeveer 0,01 - 2,5 keer de molaire hoeveelheid van het aantal vrije aminogroepen van hGH.4-8 held. The activated poly (ethylene glycol) can be used in about 0.01-100 times, preferably about 0.01-2.5 times the molar amount of the number of free amino groups of hGH.
Hoewel de hierin beschreven reactieomstandigheden kunnen resulteren in aanzienlijke hoeveelheden ongemodificeerd hGH, kan het ongemodificeerde hGH gemakkelijk worden 20 gerecycleerd in latere partijen voor additionele conjuga-tiereacties. Met de werkwijzen van de onderhavige uitvinding wordt verrassenderwijs zeer weinig, d.w.z. minder dan ongeveer 20% en met meer voorkeur minder dan ongeveer 10% aan hoog-moleculaire soorten en soorten met meer dan één 25 polymeerstreng per hGH geproduceerd. Deze reactieomstandig heden staan in tegenstelling tot die welke in het algemeen worden gebruikt voor polymere conjugatiereacties, waarbij het geactiveerde polymeer in enkele keren molaire overmaat aanwezig is ten opzichte van het doelwit.Although the reaction conditions described herein can result in significant amounts of unmodified hGH, the unmodified hGH can be easily recycled in later batches for additional conjugation reactions. With the methods of the present invention, surprisingly, very little, i.e., less than about 20% and more preferably less than about 10%, of high-molecular species and species with more than one polymer strand per hGH is produced. These reaction conditions are in contrast to those generally used for polymeric conjugation reactions, in which the activated polymer is present in a few times molar excess relative to the target.
30 De conjugatiereacties van de onderhavige uitvinding verschaffen in eerste instantie een reactiemengsel of i pool, die mono-PEG-hGH-conjugaten, ongereageerd hGH, ongereageerd polymeer en minder dan ongeveer 20% hoog-moleculaire soorten bevat. De hoog-moleculaire soorten 35 omvatten conjugaten met meer dan één polymeerstreng en/of gepolymeriseerde PEG-hGH-soort. Nadat de ongereageerde soorten en hoog-moleculaire soorten verwijderd zijn, worden • , 21 preparaten met voornamelijk enkelvoudig gePEG-yleerde hGH-conjugaten teruggewonnen. Gezien het feit dat de conjugaten voor het grootste gedeelte een enkele polymeerstreng omvatten, zijn de conjugaten in grote mate homogeen. Deze 5 gemodificeerde hGH's hebben ten minste ongeveer 0,1% van de in vitro biologische activiteit die geassocieerd is met het natieve of ongemodificeerde hGH, wat gemeten wordt met behulp van standaard PDC-Pl-celproliferatiebepalingen (Clark et al., Journal of Biological Chemistry 271: 21969-10 21977, 1996), receptorbindingsbepaling (US 5.057.417) of de groei van ratten na hypofysectomie (Clark et al., Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996). In voor keursaspecten van de uitvinding heeft het gemodificeerde hGH echter ongeveer 25% van de in vitro biologische activi-15 teit, met meer voorkeur heeft het gemodificeerde hGH ongeveer 50% van de in vitro biologische activiteit, met meer voorkeur heeft het gemodificeerde hGH ongeveer 75% van de in vitro biologische activiteit en met de meeste voorkeur heeft het gemodificeerde hGH equivalente of verbeterde 20 in vitro biologische activiteit.The conjugation reactions of the present invention initially provide a reaction mixture or pool containing mono-PEG hGH conjugates, unreacted hGH, unreacted polymer, and less than about 20% high molecular species. The high molecular species include conjugates with more than one polymer strand and / or polymerized PEG hGH species. After the unreacted species and high-molecular species have been removed, 21 preparations with mainly single PEGylated hGH conjugates are recovered. Given that the conjugates for the most part comprise a single polymer strand, the conjugates are largely homogeneous. These modified hGHs have at least about 0.1% of the in vitro biological activity associated with the native or unmodified hGH, which is measured using standard PDC-P1 cell proliferation assays (Clark et al., Journal of Biological Chemistry 271: 21969-10 21977, 1996), receptor binding assay (US 5,057,417) or the growth of rats after hypophysectomy (Clark et al., Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996). However, in preferred aspects of the invention, the modified hGH has about 25% of the in vitro biological activity, more preferably the modified hGH has about 50% of the in vitro biological activity, more preferably the modified hGH has about 75 % of the in vitro biological activity and most preferably the modified hGH has equivalent or improved in vitro biological activity.
De werkwijzen van de onderhavige uitvinding omvatten bij voorkeur tamelijk beperkte verhoudingen van polymeer tot hGH. De hGH-conjugaten zijn dus voornamelijk beperkt gebleken tot soorten die slechts één polymeerstreng 2 5 bevatten. Verder is de hechting van het polymeer aan de reactieve groep van het hGH in grote mate minder willekeurig dan wanneer een hoge molaire overmaat van polymeerlin-ker wordt gebruikt. Het ongemodificeerde hGH dat aanwezig is in de reactiepool, nadat de conjugatiereactie geschrok-30 ken is, kan worden gerecycleerd in latere reacties, waarvoor ionenuitwisselingschromatografie of op grootte scheidende chromatografie of vergelijkbare scheidingstechnieken worden gebruikt.The methods of the present invention preferably comprise fairly limited ratios of polymer to hGH. The hGH conjugates have therefore been found to be mainly limited to species that contain only one polymer strand. Furthermore, the adhesion of the polymer to the reactive group of the hGH is to a large extent less random than when a high molar excess of polymer linker is used. The unmodified hGH that is present in the reaction pool after the conjugation reaction has commenced can be recycled into subsequent reactions using ion exchange chromatography or size separating chromatography or similar separation techniques.
Een met poly(ethyleenglycol) gemodificeerd hGH kan 35 uit een reactiemengsel worden gezuiverd met gebruikelijke werkwijzen die worden gebruikt voor de zuivering van eiwitten, zoals dialyse, uitzouten, ultrafiltratie, ionen- j 22 uitwisselingschromatografie, hydrofobe interactiechromato-grafie (HIC), gelchromatografie en elektroforese. Ionenuit-wisselingschromatografie is bijzonder effectief voor het verwijderen van ongereageerd poly(ethyleenglycol) en hGH.A poly (ethylene glycol) modified hGH can be purified from a reaction mixture by conventional methods used for the purification of proteins, such as dialysis, salting out, ultrafiltration, ion exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography (HIC), gel chromatography and electrophoresis. Ion exchange chromatography is particularly effective for removing unreacted poly (ethylene glycol) and hGH.
5 In een verdere uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt de enkelvoudig gePEG-yleerde hGH-soort uit het reactiemengsel geïsoleerd om hoog-moleculaire soorten en ongemodificeerd hGH te verwijderen. Scheiding wordt bewerkstelligd door de gemengde soorten in een bufferoplossing met ongeveer 0,5 -10 10 mg/ml van de hGH-polymeerconjugaten te plaatsen. Ge schikte oplossingen hebben een pH van ongeveer 4 tot ongeveer 10. De oplossingen bevatten bij voorkeur één of meer buf f er zout en, die gekozen wordt uit KCl, NaCl, K2HP04, KH2P04, Na2HP04, NaH2P04, NaHC03, NaB04, CH3C02H en NaOH.In a further embodiment of the invention, the single PEGylated hGH species is isolated from the reaction mixture to remove high molecular species and unmodified hGH. Separation is accomplished by placing the mixed species in a buffer solution with about 0.5-10 mg / ml of the hGH polymer conjugates. Suitable solutions have a pH of about 4 to about 10. The solutions preferably contain one or more buffer salt and selected from KCl, NaCl, K 2 HPO 4, KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, NaBO 4, CH 3 CO 2 H and NaOH .
15 Afhankelijk van de reactiebuffer kan het zijn dat de buffer met het hGH-polymeerconjugaat eerst uitwisse-ling/ultrafiltratie moet ondergaan om alle ongereageerd polymeer te verwijderen. De oplossing met het PEG-hGH-conjugaat kan bijvoorbeeld worden ge-ultrafiltreerd over 20 een membraan met een lage grenswaarde voor molecuulgewicht (10.000 - 30.000 Dalton) om het grootste gedeelte van de ongewenste materialen te verwijderen, zoals ongereageerd polymeer, oppervlakteactieve stoffen, indien aanwezig, en dergelijke.Depending on the reaction buffer, the buffer with the hGH polymer conjugate may first have to undergo exchange / ultrafiltration to remove all unreacted polymer. For example, the solution with the PEG-hGH conjugate can be ultrafiltered through a low molecular weight membrane (10,000-30,000 Daltons) to remove most of the unwanted materials, such as unreacted polymer, surfactants, if present and the like.
25 De fractionering van de conjugaten in een pool met de gewenste soort wordt bij voorkeur uitgevoerd met behulp van een medium voor ionenuitwisselingschromatografie. Dergelijke media zijn in staat tot selectieve binding van PEG-hGH-conjugaten via verschillen in lading, die op 30 enigszins voorspelbare manier varieert. De oppervlaktela-ding van hGH wordt bijvoorbeeld bepaald door het aantal beschikbare geladen groepen op het oppervlak van het eiwit. Deze geladen groepen dienen in het algemeen als het punt van potentiële hechting van poly(alkyleenoxide)-polymeren. 35 Daarom zullen hGH-conjugaten een lading hebben verschillend van de andere soorten, hetgeen selectieve isolatie mogelijk maakt.The fractionation of the conjugates in a pool of the desired kind is preferably carried out using an ion exchange chromatography medium. Such media are capable of selective binding of PEG-hGH conjugates via differences in charge, which varies in a somewhat predictable manner. The surface charge of hGH is determined, for example, by the number of available charged groups on the surface of the protein. These charged groups generally serve as the point of potential adhesion of poly (alkylene oxide) polymers. Therefore, hGH conjugates will have a charge different from the other species, allowing for selective isolation.
*02 98 28 .* 02 98 28.
2323
Sterk polaire anionen- of kationenuitwisselings-harsen zoals respectievelijk quaternaire amine- of sulfo-propylharsen worden gebruikt voor de werkwijze van de onderhavige uitvinding. Anionenuitwisselingsharsen hebben 5 vooral de voorkeur. Een niet-beperkende lijst van daartoe behorende commercieel verkrijgbare kationenuitwisselings-harsen die geschikt zijn voor gebruik met de onderhavige uitvinding, zijn SP-hitrap®, SP Sepharose HP® en SP Sepha-rose ® Fast Flow. Andere geschikte anionenuitwisselings-10 harsen, bijv. S- en CM-harsen, kunnen ook gebruikt worden. Een niet-beperkende lijst van anionenuitwisselingsharsen, inclusief commercieel verkrijgbare anionenuitwisselingsharsen die geschikt zijn voor gebruik met de onderhavige uitvinding, zijn Q-hitrap®, Q Sepharose HP® en Q Sepharose® 15 Fast Flow. Andere geschikte anionenuitwisselingsharsen, bijv. DEAE-harsen, kunnen ook gebruikt worden.Highly polar anion or cation exchange resins such as quaternary amine or sulfopropyl resins, respectively, are used for the process of the present invention. Anion exchange resins are especially preferred. A non-limiting list of related commercially available cation exchange resins suitable for use with the present invention are SP-hitrap®, SP Sepharose HP® and SP Sephaose® Fast Flow. Other suitable anion exchange resins, e.g. S and CM resins, can also be used. A non-limiting list of anion exchange resins, including commercially available anion exchange resins suitable for use with the present invention, are Q-hitrap®, Q Sepharose HP® and Q Sepharose® Fast Flow. Other suitable anion exchange resins, e.g. DEAE resins, can also be used.
De anionen- of kationenuitwisselingshars wordt bijvoorbeeld bij voorkeur gepakt in een kolom en geëquili-breerd met gebruikelijke middelen. Een buffer met dezelfde 20 pH en osmolaliteit als de oplossing met het met polymeer geconjugeerde hGH wordt gebruikt. De elutiebuffer bevat bij voorkeur één of meer zouten, die gekozen worden uit KC1, NaCl, K2HP04, KH2P04, Na2HP04, NaH2P04, NaHC03, NaB04 en (NH4)2C03. De conjugaatbevattende oplossing wordt dan op de 25 kolom geadsorbeerd, waarbij ongereageerd polymeer en sommige hoog-moleculaire soorten niet worden vastgehouden. Na voltooiing van de belading wordt een gradiëntstroom van een elutiebuffer met oplopende zoutconcentraties op de kolom gebracht om de gewenste fractie van hGH met geconju-30 geerd polyalkyleenoxide te elueren. De geëlueerde samengevoegde fracties zijn bij voorkeur beperkt tot gelijkvormige polymeerconjugaten na de scheidingsstap met kationen- of anionenuitwisseling. Alle ongeconjugeerde hGH-soorten kunnen daarna van de kolom terug gewassen worden met 35 gebruikelijke technieken. Indien gewenst, kunnen enkelvoudig en meervoudig gePEG-yleerde hGH-soorten verder van elkaar gescheiden worden via additionele ionenuitwisse- « * 24 lingschromatografie of op grootte scheidende chromatogra-f ie.For example, the anion or cation exchange resin is preferably packed in a column and equilibrated by conventional means. A buffer with the same pH and osmolality as the solution with the polymer-conjugated hGH is used. The elution buffer preferably contains one or more salts selected from KCl, NaCl, K 2 HPO 4, KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4, NaH 2 PO 4, NaHCO 3, NaBO 4 and (NH 4) 2 CO 3. The conjugate-containing solution is then adsorbed on the column, with unreacted polymer and some high-molecular species not being retained. After completion of the loading, a gradient stream of an elution buffer with increasing salt concentrations is applied to the column to elute the desired fraction of hGH with conjugated polyalkylene oxide. The eluted pooled fractions are preferably limited to uniform polymer conjugates after the cation or anion exchange separation step. All unconjugated hGH species can then be washed back from the column by conventional techniques. If desired, single and multiple PEGylated hGH species can be further separated from each other via additional ion exchange chromatography or size separating chromatography.
Er kunnen ook technieken gebruikt worden waarbij meerdere isocratische stappen van oplopende zoutconcentra-5 tie of pH gebruikt worden. Meerdere isocratische elutie-stappen met oplopende concentratie zullen resulteren in de achtereenvolgende elutie van di- en daarna mono-hGH-poly-meerconj ugaten.Techniques can also be used in which multiple isocratic steps of ascending salt concentration or pH are used. Multiple isocratic elution steps with increasing concentration will result in the successive elution of di and then mono-hGH polymer conjugates.
Het temperatuurtrajeet voor elutie ligt tussen 10 ongeveer 4°C en ongeveer 25°C. Bij voorkeur wordt elutie uitgevoerd bij een temperatuur van ongeveer 4°C tot ongeveer 22°C. De elutie van de PEG-hGH-fractie wordt bijvoorbeeld gedetecteerd aan de hand van de UV-absorptie bij 280 nm. Fractieverzameling kan worden bereikt door middel van 15 eenvoudige tijd-elutie-profielen.The temperature range for elution is between about 4 ° C and about 25 ° C. Preferably, elution is carried out at a temperature of about 4 ° C to about 22 ° C. The elution of the PEG-hGH fraction is detected, for example, by the UV absorption at 280 nm. Fraction collection can be achieved through simple time elution profiles.
Er kan een oppervlakteactieve stof worden gebruikt in de werkwijzen voor het conjugeren van het poly(ethyleen-glycol)-polymeer met de hGH-rest. Geschikte oppervlakteactieve stoffen omvatten middelen van het ionische type zoals 20 natriumdodecylsulfaat (SDS) . Andere ionische oppervlakteactieve stoffen zoals lithiumdodecylsulfaat, quaternaire ammoniumverbindingen, taurocholinezuur, caprylzuur, decaan-sulfonzuur enz. kunnen ook gebruikt worden. Niet-ionische oppervlakteactieve stoffen kunnen ook gebruikt worden. Er 25 kunnen bijvoorbeeld materialen zoals poly(oxyethyleen)sor-bitans (Tweens), poly(oxyethyleen)ethers (Tritons) gebruikt worden. Zie ook Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem Corp. De enige beperkingen op de oppervlakteac-30 tieve stoffen die gebruikt worden in de werkwijzen van de uitvinding, is dat ze gebruikt worden onder omstandigheden en in concentraties die geen aanzienlijke irreversibele denaturatie van het hGH veroorzaken en die niet compleet polymeerconjugatie remmen. De oppervlakteactieve stoffen 35 zijn aanwezig in de reactiemengsels in hoeveelheden van ongeveer 0,01 - 0,5%; bij voorkeur van 0,05 - 0,5%; en met 25 de meeste voorkeur van ongeveer 0,075 - 0,25%. Mengsels van de oppervlakteactieve stoffen worden ook overwogen.A surfactant can be used in the methods for conjugating the poly (ethylene glycol) polymer with the hGH moiety. Suitable surfactants include ionic type agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS). Other ionic surfactants such as lithium dodecyl sulfate, quaternary ammonium compounds, taurocholic acid, caprylic acid, decane sulfonic acid, etc. can also be used. Non-ionic surfactants can also be used. For example, materials such as poly (oxyethylene) sorbitans (Tweens), poly (oxyethylene) ethers (Tritons) can be used. See also Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem Corp. The only limitations on the surfactants used in the methods of the invention are that they are used under conditions and in concentrations that do not cause significant irreversible denaturation of the hGH and that do not inhibit complete polymer conjugation. The surfactants are present in the reaction mixtures in amounts of about 0.01 - 0.5%; preferably from 0.05 to 0.5%; and most preferably from about 0.075 - 0.25%. Mixtures of the surfactants are also contemplated.
Men denkt dat de oppervlakteactieve stoffen een tijdelijk, reversibel beschermend systeem verschaffen 5 tijdens de polymeerconjugatiewerkwijze. Er is aangetoond dat de oppervlakteactieve stoffen effectief zijn bij het ontmoedigen van polymeerconjugatie, terwijl toegestaan wordt dat op lysine gebaseerde of op amino-uiteinde gebaseerde conjugatie verloopt.The surfactants are thought to provide a temporary, reversible protective system during the polymer conjugation process. The surfactants have been shown to be effective in discouraging polymer conjugation, while allowing lysine-based or amino-end-based conjugation to proceed.
10 Het onderhavige met poly(ethyleenglycol) gemodifi ceerde hGH heeft een langduriger farmacologisch effect, dat mogelijk toegekend kan worden aan zijn langere halfwaarde-tijd in vivo.The present poly (ethylene glycol) modified hGH has a longer-lasting pharmacological effect that may possibly be attributed to its longer half-life in vivo.
Een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding heeft 15 betrekking op werkwijzen voor de voorkoming en/of behandeling van een ziekte of stoornis waarbij het gebruik van GH, bij voorkeur hGH, heilzaam is, die omvatten het aan een patiënt die dat behoeft, toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een met poly(ethyleenglycol) 2 0 gemodificeerd hGH van de uitvinding of een agonistische variant daarvan, alleen of in combinatie met een ander therapeutisch middel. De uitvinding heeft ook betrekking op het gebruik van een met poly(ethyleenglycol) gemodificeerd hGH van de uitvinding of een agonistische variant daarvan 25 bij de productie van een geneesmiddel voor de voorkoming en/of behandeling van een ziekte of stoornis waarbij het gebruik van GH, bij voorkeur hGH, heilzaam is. Daarnaast heeft de uitvinding ook betrekking op een farmaceutisch preparaat dat een met poly(ethyleenglycol) gemodificeerd 30 hGH van de uitvinding of een agonistische variant daarvan bevat, voor de voorkoming en/of behandeling van een ziekte of stoornis waarbij het gebruik van GH, bij voorkeur hGH, heilzaam is.Another embodiment of the invention relates to methods for the prevention and / or treatment of a disease or disorder in which the use of GH, preferably hGH, is beneficial, which include administering a therapeutic to a patient in need. effective amount of a poly (ethylene glycol) modified hGH of the invention or an agonistic variant thereof, alone or in combination with another therapeutic agent. The invention also relates to the use of a poly (ethylene glycol) modified hGH of the invention or an agonistic variant thereof in the production of a medicament for the prevention and / or treatment of a disease or disorder in which the use of GH, preferably hGH is beneficial. In addition, the invention also relates to a pharmaceutical preparation containing a poly (ethylene glycol) modified hGH of the invention or an agonistic variant thereof, for the prevention and / or treatment of a disease or disorder in which the use of GH, preferably hGH is beneficial.
Ziekten en stoornissen waarbij het gebruik van GH 35 heilzaam is, omvatten, maar zijn niet beperkt tot, groei-hormoondeficiëntie (GHD), volwassen groeihormoondeficiëntie (aGHD), het syndroom van Turner, groeifalen in kinderen die 26 klein voor hun zwangerschapsduur geboren werden (SGA), het syndroom van Prader-Willi (PWS), chronische nierinsuf-ficiëntie (CRI), uitputting door AIDS, veroudering, nier-insufficiëntie in het eindstadium, cystische fibrose, 5 erectiel disfunctioneren, lipodystrofie door HIV, fibromy-algie, osteoporose, geheugenstoornissen, depressie, de ziekte van Crohn, dysplasieën van het skelet, traumatisch hersenletsel, subarachnoïde bloeding, het syndroom van Noonan, het syndroom van Down, idiopathische korte li-10 chaamslengte (ISS), nierziekte in het eindstadium (ESRD), een zeer laag geboortegewicht (VLBW), het redden van stamcellen uit beenmerg, metabool syndroom, glucocortico-idmyopathie, een korte lengte als gevolg van glucocorti-coidbehandeling in kinderen en falen van groeiherstel voor 15 kleine premature kinderen.Diseases and disorders in which the use of GH 35 is beneficial include, but are not limited to, growth hormone deficiency (GHD), adult growth hormone deficiency (aGHD), Turner syndrome, growth failures in children born 26 short of gestational age ( SGA), Prader-Willi syndrome (PWS), chronic renal insufficiency (CRI), AIDS exhaustion, aging, end-stage renal insufficiency, cystic fibrosis, erectile dysfunction, HIV lipodystrophy, fibromyalgia, osteoporosis , memory disorders, depression, Crohn's disease, skeletal dysplasia, traumatic brain injury, subarachnoid haemorrhage, Noonan syndrome, Down syndrome, idiopathic short body length (ISS), end-stage renal disease (ESRD), a very low birth weight (VLBW), rescue of bone marrow stem cells, metabolic syndrome, glucocorticoid myopathy, short length due to glucocorticoid treatment in children and failure of growth recovery for 15 small premature children.
In een meer specifieke uitvoeringsvorm van de uitvinding worden het met poly(ethyleenglycol) gemodificeerde hGH van de uitvinding of agonistische varianten daarvan gebruikt bij de voorkoming en/of behandeling van 20 stoornissen of ziekten die gekozen worden uit de groep die bestaat uit GHD, aGHD, SGA, PWS, het syndroom van Turner en CRI .In a more specific embodiment of the invention, the poly (ethylene glycol) modified hGH of the invention or agonistic variants thereof are used in the prevention and / or treatment of disorders or diseases selected from the group consisting of GHD, aGHD, SGA, PWS, Turner syndrome and CRI.
In een andere meer specifieke uitvoeringsvorm van de uitvinding worden het met poly(ethyleenglycol) gemodifi-25 ceerde hGH van de uitvinding of agonistische varianten daarvan gebruikt bij de voorkomen en/of behandeling van stoornissen of ziekten die gekozen worden uit de groep die bestaat uit idiopathische korte lichaamslengte, een zeer laag geboortegewicht, traumatisch hersenletsel, metabool 30 syndroom en het syndroom van Noonan.In another more specific embodiment of the invention, the poly (ethylene glycol) modified hGH of the invention or agonistic variants thereof are used in the prevention and / or treatment of disorders or diseases selected from the group consisting of idiopathic short body length, very low birth weight, traumatic brain injury, metabolic syndrome and Noonan syndrome.
Een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding heeft betrekking op farmaceutische preparaten die een met poly(e-thyleenglycol) gemodificeerd hGH van de uitvinding alleen of in combinatie met een ander therapeutisch middel en ten 35 minste één farmaceutisch aanvaardbare hulpstof of drager omvatten. Het onderhavige met poly (ethyleenglycol) gemodificeerde hGH kan dan worden geformuleerd tot farmaceutica 27 die ook een farmaceutisch aanvaardbaar verdunningsmiddel, een middel voor het bereiden van een isotone oplossing, een pH-stellend middel en dergelijke bevatten om ze toe te dienen aan een patiënt.Another embodiment of the invention relates to pharmaceutical compositions comprising a poly (ethylene glycol) modified hGH of the invention alone or in combination with another therapeutic agent and at least one pharmaceutically acceptable excipient or carrier. The present poly (ethylene glycol) modified hGH can then be formulated into pharmaceuticals 27 which also contain a pharmaceutically acceptable diluent, an isotonic solution preparation agent, a pH adjusting agent, and the like for administration to a patient.
5 De bovengenoemde farmaceutica kunnen subcutaan, intramusculair, intraveneus, pulmonaal, intradermaal of oraal worden toegediend, afhankelijk van het doel van de behandeling. Een dosis kan ook gebaseerd zijn op de soort en toestand van de stoornis van een te behandelen patiënt, 10 waarbij deze normaal ligt tussen 0,1 mg en 5 mg voor een injectie en tussen 0,1 mg en 50 mg voor een orale toediening voor een volwassene.The aforementioned pharmaceuticals can be administered subcutaneously, intramuscularly, intravenously, pulmonally, intradermally or orally, depending on the purpose of the treatment. A dose may also be based on the type and condition of the disorder of a patient to be treated, normally between 0.1 mg and 5 mg for an injection and between 0.1 mg and 50 mg for an oral administration for an adult.
Zoals hierin gebruikt, kunnen het met poly(ethy-leenglycol) gemodificeerde hGH of agonistische varianten 15 daarvan van de onderhavige uitvinding worden gebruikt in combinatie met een ander therapeutisch middel. Zoals hierin gebruikt, zijn de termen "gelijktijdige toediening", "gelijktijdig toegediend" en "in combinatie met", wanneer verwezen wordt naar de verbindingen A en één of meer andere 20 therapeutische middelen, bedoeld in de betekenis van, om te verwijzen naar en omvattend het volgende: O gelijktijdige toediening van een dergelijke combinatie van A en therapeutisch (e) mid-25 del (en) aan een patiënt die behandeling be hoeft, wanneer dergelijke componenten samen geformuleerd zijn in een enkele doseringsvorm die deze componenten op praktisch hetzelfde tijdstip aan de patiënt afgeeft; 30 O in grote mate gelijktijdige toediening van een dergelijke combinatie van A en therapeutisch (e) middel(en) aan een patiënt die behandeling behoeft, wanneer dergelijke componenten apart van elkaar geformuleerd zijn in afzon-35 derlijke doseringsvormen, die op praktisch hetzelfde tijdstip door de patiënt worden genomen, waarna deze componenten op praktisch 28 hetzelfde tijdstip aan de patiënt worden afgegeven ; O achtereenvolgende toediening van een dergelijke combinatie van A en therapeutisch(e) mid-5 del(en) aan een patiënt die behandeling be hoeft, wanneer dergelijke componenten apart van elkaar geformuleerd zijn in afzonderlijke doseringsvormen, die op achtereenvolgende tijdstippen door de patiënt worden genomen met 10 een aanzienlijk tijdsinterval tussen elke toediening, waardoor deze componenten op aanzienlijk verschillende tijdstippen aan de patiënt worden afgegeven; en O achtereenvolgende toediening van een dergelij-15 ke combinatie van A en therapeutisch (e) middel (en) aan een patiënt die behandeling be- j hoeft, wanneer dergelijke componenten samen in een enkele doseringsvorm geformuleerd zijn, waaruit deze componenten worden afgegeven op 20 een gecontroleerde manier, waardoor ze gelijk tijdig, achtereenvolgend en/of overlappend op dezelfde en/of verschillende tijdstippen aan de patiënt worden afgegeven.As used herein, the poly (ethylene glycol) modified hGH or agonistic variants thereof of the present invention can be used in combination with another therapeutic agent. As used herein, the terms "co-administration", "co-administration" and "in combination with" when referring to compounds A and one or more other therapeutic agents, are intended to refer to and comprising the following: O simultaneous administration of such a combination of A and therapeutic agent (s) to a patient in need of treatment, when such components are formulated together in a single dosage form containing these components at practically the same time to the patient; O substantially co-administration of such a combination of A and therapeutic agent (s) to a patient in need of treatment when such components are formulated separately from each other in separate dosage forms which are administered at substantially the same time by the patient is taken, whereafter these components are delivered to the patient at practically the same time; Successive administration of such a combination of A and therapeutic agent (s) to a patient in need of treatment when such components are formulated separately from each other in separate dosage forms, which are taken by the patient at successive times with a considerable time interval between each administration, whereby these components are delivered to the patient at considerably different times; and O consecutive administration of such a combination of A and therapeutic agent (s) to a patient in need of treatment when such components are formulated together in a single dosage form, from which these components are delivered on 20 in a controlled manner, whereby they are delivered to the patient at the same time, sequentially and / or overlapping at the same and / or different times.
Geschikte voorbeelden van andere therapeutische 25 middelen die gebruikt kunnen worden in combinatie met A, hun farmaceutisch aanvaardbare zouten en/of hun afgeleide vormen, omvatten, maar zijn op geen enkele manier beperkt tot: aromataseremmerns zoals exemestaan, formestaan, atamestaan, fadrozool, letrozool, vorozool en anastrozool; 30 middelen die vrije vetzuren regelen, waaronder fibrinezuur-derivaten (zoals fenofibraat, clofibraat, gemfibrozil, bezafibraat en ciprofibraat) en nicotinezuurderivaten zoals acipimox; insuline-sensibiliserende middelen, waaronder, maar niet beperkt tot biguaniden zoals metformine, PPAR-35 gamma-insuline-sensibiliserende middelen en thiazolodeni-onen zoals troglitazon en rosiglutazon, Troglitazon, 5- [ [4 -[3,4-dihydro-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-2H-]-benzopyran- 29 2-yl)methoxy]fenyl]methyl-3-2,4-thiazolidinedion V411 (DIA-BII, Glaucanin), Pioglitazon (ACTOS, AD 4833, U 72107, U 72107A, U 72107E, ZACTOS), chemische naam: 2,4-thiazolidi-nedion, 5-[[4-[2-(5-ethyl-2-pyridinyl)ethoxy]fenyl]methyl]-5 monohydrochloride, (a/-); Rosiglitazon (Avandia, BRL 49653, BRL 49653C), chemische naam: 2,4-thiazolidinedion, 5- [ [4- [2- (methyl-2-pyridinylamino)ethoxy]fenyl]methyl] ; 25Suitable examples of other therapeutic agents that can be used in combination with A, their pharmaceutically acceptable salts and / or their derived forms include, but are in no way limited to: aromatase inhibitors such as exemestane, formestate, atamestane, fadrozole, letrozole, vorozole and anastrozole; Agents that control free fatty acids, including fibric acid derivatives (such as fenofibrate, clofibrate, gemfibrozil, bezafibrate and ciprofibrate) and nicotinic acid derivatives such as acipimox; insulin sensitizing agents, including but not limited to biguanides such as metformin, PPAR-35 gamma insulin sensitizing agents, and thiazolodeninones such as troglitazone and rosiglutazone, Troglitazone, 5- [[4 - [3,4-dihydro-6- hydroxy-2,5,7,8-tetramethyl-2H -] - benzopyran-2-yl) methoxy] phenyl] methyl 3-2,4-thiazolidinedione V411 (DIA-BII, Glaucanin), Pioglitazone (ACTOS, AD 4833, U 72107, U 72107A, U 72107E, ZACTOS), chemical name: 2,4-thiazolidinedione, 5 - [[4- [2- (5-ethyl-2-pyridinyl) ethoxy] phenyl] methyl] - Monohydrochloride, (a / -); Rosiglitazone (Avandia, BRL 49653, BRL 49653C), chemical name: 2,4-thiazolidinedione, 5- [[4- [2- (methyl-2-pyridinylamino) ethoxy] phenyl] methyl]; 25
Bexaroteen-oraal (LGD 1069 oraal, Targretine oraal, Targre-tine oraal, Targexine oraal), chemische naam: 4-[Ι- ΙΟ (3,5,5,8,8-pentamethyl-5,6,7,8-tetrahydro-2-naftyl)ethe- nyl]benzoëzuur; ZD 2079 (ICI D2079) (chemische naam: (R)-N- [2,4-carboxymethyl)-30-fenoxy]ethyl)-N-(2-hydroxy-2-fene-thyl)-ammoniumchloride: Netoglitazon (Isaglitazon, MCC 555, RWJ 241947) (chemische naam: 5-[6-(2-fluorbenzyloxy)naftal-15 een-2-ylmethyl]thiazolidine-2,4-dion); INS (D-chiro-inosi-tol) (chemische naam: D-l,2,3,4,5,6-hexahydroxycyclo- hexaan), ON 2344 (DRF 2593) ; Dexlipotam, chemische naam: 5 (R) - (1,2-dithiolan-3-yl)-pentaan-35-zuur; HQL 975, chemische naam: 3-[4-[2-(5-methyl-2-fenyloxazool-4-yl)ethoxy]fe-20 nyl]-2(S)-(propylamino)propionzuur; YM 268, chemische naam: 5,5' -methyleen-bis(1,4-fenyleen)bismethyleenbis(thiazolidine-2,4-dion) . I PPAR-agonisten in ontwikkeling omvatten: Reglitazar (JTT 501, PNU 182716, PNU 716) (chemische naam: isoxazolidieen-3,5-dion, i 4-[[4-(2-fenyl-5-methyl)-1,3-25 oxazolyl]ethoxyfenyl-4]methyl-, (4RS)); I (RP 297, chemische naam: 10 5-(2,4-dioxothiazolidine-5-ylmethyl)-2- methoxy-N-[4-(trifluormethyl)benzylbenzamide; R 119702 (Cl 1037, CS 011), chemische naam: (I-)-5-[4-(5-methoxy-lH- benzimidazool - 2 - ylmethoxy) benzyl ] thiazoline-2,4-dion,-30 hydrochloride; 15 DRF 2189, chemische naam: 5-[[4- [2-(1- indolyl)ethoxy]fenyl]methyl]thiazolidine-2,4-dion; corti-solsyntheseremmers zoals ketoconazool, econazool of micona-zool; groeihormonen zoals somatotropine of somatonorm en hun derivaten zoals fusie-eiwitten van menselijk groei-35 hormoon zoals ALBUTROPIN; polyethyleen-groeihormonen zoals het cysteine-gePEG-yleerde groeihormoon, BT 005 (Bolder BioTechnology Ine.); groeihormoonsecretagogen zoals bij- ; 3o voorbeeld SM 130686 (Sumitomo), capromoreline (Pfizer), mecasermin (Fujisawa), sermoreline (Salk Institute, Bio-Technology General), somatrem, somatomedine (C Llorente; Pharmacia Corporation), examoreline, tabimoreline; CP 5 464709 (Pfizer), LY 426410 en LY 44471 (Lilly); 8-(aminoal- koxyimino) -8H-dibenzo [a, e] triazolo [4,5-c] cycloheptenen zoals beschreven in WO 2002057241, 2-gesubstitueerde dibenzo[a,e]1,2,3-triazolo [4,5-c] [7]annuleen-8-onen zoals beschreven in WO 2002056873, groeihormoonafgevende peptiden 10 GHRP-6 en GHRP-1 zoals beschreven in Amerikaans Octrooi-schrift 4.411.890 en de publicaties WO 89/07110, WO 89/-07111, B-HT920, hexareline en GHRP-2 zoals beschreven in WO 93/04081, of groeihormoonafgevend hormoon (GHRH, ook wel GRF genoemd) en analoga daarvan, somatomedinen waaronder 15 IGF-1 en IGF-2 en derivaten daarvan zoals SomatoKine - een recombinante fusie van insuline-achtige groeifactor-1 en zijn bindingseiwit, BP-3, alfa-2-adrenerge agonisten zoals clonidine, xylazine, detomidine en medetomidine, of serotonine- 5HTID-agonisten zoals sumitriptan, of middelen die 20 somatostatine of zijn afgifte remmen, zoals physostigmine en pyridostigmine, ThGRF 1-44 (Theratechnologies); L 165166 (Merck & Company); dipeptidederivaten zoals beschreven in WO 9858947, remmers van dipeptidylpeptidase IV zoals amino-acylpyrrolidinenitril zoals beschreven in US 6521644, WO 25 95/15309 en WO 98/19998; beta-amino-heterocyclische dipep- tidylpeptidaseremmers zoals die welke beschreven zijn in US 20030100563 en WO 2003082817; groeihormoonafgevende verbindingen zoals beschreven in US 20030055261, US 20030040483, EP 18 072, EP 83 864, WO 89/01711, WO 89/10933, WO 88/9780, 30 WO 83/02272, WO 91/18016, WO 92/01711, WO 93/04081, de Amerikaanse Octrooischriften 5.206.235, 5.283.241, 5.284.841, 5.310.737, 5.317.017, 5.374.721, 5.430.144, 5.434.261, 5.438.136, 5.494.919, 5.494.920, 5.492.916, 5.536.716 en 5.578.593, WO 94/13696, WO 94/19367, WO 35 95/03289, WO 95/03290, WO 95/09633, WO 95/11029, WO 95/- 12598, WO 95/13069, WO 95/14666, WO 95/16675, WO 95/16692, WO 95/17422, WO 95/ 17423, WO 95/34311 en WO 96/02530; 31 piperidinen, pyrrolidinen en hexahydro-lH-azepinen zoals beschreven in US 5804578, US 5783582, WO 2004007468, AMIDO SPIROPIPERIDINEN zoals beschreven in WO 0104119, 2-amino-5-pyrimidineazijnzuurverbindingen, waaronder 2-[(5,6-dime- 5 thyl-2-benzoimidazolyl)amino] -4-hydroxy-6-methyl-5-pyrimi-dineazijnzuur (2) en 2-[(5,6-dimethyl-2-benzoimidazolyl)-amino]-4-hydroxy-6-methyl-5-pyrimidineazijnzuur, ethylester zoals beschreven in US 6329383, benzimidazolen zoals beschreven in EP 1155014, analoge peptidylverbindingen 10 gerelateerd aan GRF en de peptiden van Amerikaans Octrooi -schrift 4.411.890, antagonisten van gonadotropine-afgevend hormoon zoals die welke beschreven zijn in WO 0170228, WO 0170227, WO 0170228, WO 0069433, WO 0004013, WO 09951595, WO 9951231-4, W09941251-2, WO 9921557, WO 9921553 en 6- 15 AZAINDOOLVERBINDINGEN zoals beschreven in WO 0053602, WO 0053185, WO 0053181, WO 0053180, WO 0053178, US 6288078; IGF-1-secretagogen; insuline-actige groeifactor-2 (IGF-2 of somatomedine A) en IGF-2-secretagogen; myostatine-antago-nisten en verbindingen die fibroblastengroeifactorreceptor-20 3 (FGFR-3) -tyrosinekinase remmen.Bexarotene oral (LGD 1069 oral, Targretin oral, Targretine oral, Targexin oral), chemical name: 4- [Ι- ΙΟ (3,5,5,8,8-pentamethyl-5,6,7,8-) tetrahydro-2-naphthyl) ethenyl] benzoic acid; ZD 2079 (ICI D2079) (chemical name: (R) -N- [2,4-carboxymethyl) -30-phenoxy] ethyl) -N- (2-hydroxy-2-phenyl) -ammonium chloride: Netoglitazone (Isaglitazone , MCC 555, RWJ 241947) (chemical name: 5- [6- (2-fluorobenzyloxy) naphthal-1-2-ylmethyl] thiazolidine-2,4-dione); INS (D-chiro-inosi-tol) (chemical name: D-1,2,3,4,5,6-hexahydroxycyclohexane), ON 2344 (DRF 2593); Dexlipotam, chemical name: 5 (R) - (1,2-dithiolan-3-yl) -pentane-35-acid; HQL 975, chemical name: 3- [4- [2- (5-methyl-2-phenyloxazol-4-yl) ethoxy] phenyl] -2 (S) - (propylamino) propionic acid; YM 268, chemical name: 5,5'-methylenebis (1,4-phenylene) bismethylenebis (thiazolidine-2,4-dione). PPAR agonists in development include: Reglitazar (JTT 501, PNU 182716, PNU 716) (chemical name: isoxazolidiene-3,5-dione, 1-4 - [[4- (2-phenyl-5-methyl) -1, 3-25 oxazolyl] ethoxyphenyl-4] methyl ((4RS)); I (RP 297, chemical name: 5- (2,4-dioxothiazolidin-5-ylmethyl) -2-methoxy-N- [4- (trifluoromethyl) benzyl benzamide; R 119702 (Cl 1037, CS 011), chemical name: (1-) 5- [4- (5-methoxy-1H-benzimidazole-2-ylmethoxy) benzyl] thiazoline-2,4-dione, -30 hydrochloride; DRF 2189, chemical name: 5 - [[4- [2- (1-indolyl) ethoxy] phenyl] methyl] thiazolidine-2,4-dione; cortisol synthesis inhibitors such as ketoconazole, econazole or miconazole; growth hormones such as somatotropin or somatonorm and their derivatives such as fusion proteins of human growth- Hormone such as ALBUTROPIN; polyethylene growth hormones such as cysteine-PEGylated growth hormone, BT 005 (Bolder BioTechnology Ine.); Growth hormone secretagogues such as; for example, SM 130686 (Sumitomo), capromorelin (Pfizer), mecasermin (Fujiseline) sermon (Fujiseline) (Salk Institute, Bio-Technology General), somatrem, somatomedine (C Llorente; Pharmacia Corporation), examoreline, tabimoreline; CP 5 464709 (Pfizer), LY 426410 and LY 44471 (Lilly); 8- (aminoal-) koxyimino) -8H-dibenzo [a, e] triazolo [4,5-c] cycloheptes as described in WO 2002057241, 2-substituted dibenzo [a, e] 1,2,3-triazolo [4,5-c] [ 7] cancel-8-ones as described in WO 2002056873, growth hormone releasing peptides GHRP-6 and GHRP-1 as described in U.S. Patent 4,411,890 and publications WO 89/07110, WO 89 / -07111, B-HT920 , hexarelin and GHRP-2 as described in WO 93/04081, or growth hormone releasing hormone (GHRH, also called GRF) and analogs thereof, somatomedines including IGF-1 and IGF-2 and derivatives thereof such as SomatoKine - a recombinant fusion of insulin -like growth factor-1 and its binding protein, BP-3, alpha-2-adrenergic agonists such as clonidine, xylazine, detomidine and medetomidine, or serotonin 5HTID agonists such as sumitriptan, or agents that inhibit somatostatin or its release, such as physostigmine and pyridostigmine, ThGRF 1-44 (Theratechnologies); L 165166 (Merck &Company); dipeptide derivatives as described in WO 9858947, dipeptidyl peptidase IV inhibitors such as amino acyl pyrrolidinesitrile as described in US 6521644, WO 95/15309 and WO 98/19998; beta-amino-heterocyclic dipeptidyl peptidase inhibitors such as those described in US 20030100563 and WO 2003082817; growth hormone-releasing compounds as described in US 20030055261, US 20030040483, EP 18 072, EP 83 864, WO 89/01711, WO 89/10933, WO 88/9780, WO 83/02272, WO 91/18016, WO 92/01711, WO 93/04081, U.S. Patent Nos. 5,206,235, 5,283,241, 5,284,841, 5,310,737, 5,317,017, 5,374,721, 5,430,144, 5,434,261, 5,438,136, 5,494,919, 5,494. 920, 5,492,916, 5,536,716 and 5,578,593, WO 94/13696, WO 94/19367, WO 35/0/03289, WO 95/03290, WO 95/09633, WO 95/11029, WO 95 / - 12598 WO 95/13069, WO 95/14666, WO 95/16675, WO 95/16692, WO 95/17422, WO 95/ 17423, WO 95/34311 and WO 96/02530; 31 piperidines, pyrrolidines and hexahydro-1H-azepines as described in US 5804578, US 5783582, WO 2004007468, AMIDO SPIROPIPERIDINES as described in WO 0104119, 2-amino-5-pyrimidinetic acid compounds, including 2 - [(5,6-dime-5 thyl-2-benzoimidazolyl) amino] -4-hydroxy-6-methyl-5-pyrimidinetic acid (2) and 2 - [(5,6-dimethyl-2-benzoimidazolyl) -amino] -4-hydroxy-6- methyl 5-pyrimidine acetic acid, ethyl ester as described in US 6329383, benzimidazoles as described in EP 1155014, analogous peptidyl compounds related to GRF and the peptides of U.S. Patent 4,411,890, antagonists of gonadotropin-releasing hormone such as those described in WO 0170228, WO 0170227, WO 0170228, WO 0069433, WO 0004013, WO 09951595, WO 9951231-4, WO 9921557, WO 9921553 and 6 AZAINDOOL COMPOUNDS as described in WO 0053602, WO 0053185, WO 0053181, WO 0053181, 0053180, WO 0053178, US 6288078; IGF-1 secretagogues; insulin-active growth factor-2 (IGF-2 or somatomedin A) and IGF-2 secretagogues; myostatin antagonists and compounds that inhibit fibroblast growth factor receptor-3 (FGFR-3) tyrosine kinase.
De polymere stoffen die omvat worden, zijn ook bij voorkeur wateroplosbaar bij kamertemperatuur. Een niet-beperkende lijst van dergelijke polymeren omvat poly(alky-leenoxide)-homopolymeren zoals poly(ethyleenglycol) of 25 poly(propyleenglycol) , poly(geoxyethyleneerde polyolen), copolymeren daarvan en blokcopolymeren daarvan, op voor-waarde dat de wateroplosbaarheid van de blokcopolymeren behouden blijft.The polymeric substances that are included are also preferably water-soluble at room temperature. A non-limiting list of such polymers includes poly (alkylene oxide) homopolymers such as poly (ethylene glycol) or poly (propylene glycol), poly (oxyethylenated polyols), copolymers thereof, and block copolymers thereof, provided that the water solubility of the block copolymers is retained.
Als een alternatief voor op PEG gebaseerde polyme-30 ren kunnen effectief niet-antigene materialen zoals dex-traan, poly(vinylpyrrolidonen), poly(acrylamiden), poly(vi-nylalcoholen), koolhydraat-gebaseerde polymeren en dergelijke gebruikt worden. Inderdaad kan de activering van oren e-terminale groepen van deze polymere stoffen bewerk-35 stelligd worden op manieren vergelijkbaar met die welke gebruikt worden om poly(alkyleenoxiden) om te zetten en deze zullen dus duidelijk zijn voor deskundigen in het vak.As an alternative to PEG-based polymers, non-antigenic materials such as dextran, poly (vinyl pyrrolidones), poly (acrylamides), poly (vinyl alcohols), carbohydrate-based polymers and the like can be used effectively. Indeed, the activation of e-terminal groups of these polymeric substances can be effected in ways similar to those used to convert poly (alkylene oxides) and will thus be apparent to those skilled in the art.
• , 32•, 32
Gewoon deskundigen in het vak zullen weten dat de voorgaande lijst enkel illustratief is en dat alle polymeermateria-len met de hierin beschreven kwaliteiten in aanmerking j komen. Voor doeleinden van de onderhavige uitvinding | 5 betekent "effectief niet-antigeen" alle materialen waarvan in het vakgebied bekend is dat ze niet-toxisch zijn en geen merkbare immunogene reactie in zoogdieren opwekken.Those of ordinary skill in the art will know that the foregoing list is merely illustrative and that all polymeric materials with the qualities described herein are eligible. For purposes of the present invention 5, "effective non-antigen" means all materials that are known in the art to be non-toxic and do not elicit a noticeable immunogenic response in mammals.
Definities 10Definitions 10
Hieronder volgt een lijst met afkortingen en de overeenkomstige betekenissen zoals onderling uitwisselbaar hierin gebruikt: 15 g gram mg milligram ml milliliter KT kamertemperatuur PEG poly(ethyleenglycol) 20Below is a list of abbreviations and corresponding meanings as used interchangeably herein: 15 g grams mg milligram ml milliliters KT room temperature PEG poly (ethylene glycol) 20
De complete inhoud van alle publicaties, octrooi-schriften en octrooiaanvragen die in deze beschrijving geciteerd worden, worden hierin opgenomen als referentie als aangegeven wordt dat elke individuele publicatie, 25 octrooischrift of octrooiaanvrage specifiek en individueel opgenomen moet worden als referentie.The complete content of all publications, patents and patent applications cited in this description are incorporated herein by reference if it is indicated that each individual publication, patent or patent application must be specifically and individually incorporated as a reference.
Hoewel de bovengenoemde uitvinding in enig detail beschreven is ter illustratie en als voorbeeld voor helderheid van begrip, zal het voor een deskundige in het vak in 30 het licht van het geleerde van deze uitvinding snel duidelijk zijn dat er veranderingen en modificaties aangebracht kunnen worden zonder af te wijken van de geest en het kader van de onderhavige uitvinding. De volgende voorbeelden worden verschaft enkel als voorbeeld en ze zijn niet 35 bedoeld om het kader van de uitvinding, die in brede termen hierboven beschreven is, te beperken.Although the above invention has been described in some detail by way of illustration and as an example for clarity of understanding, it will be readily apparent to one skilled in the art in light of the teachings of this invention that changes and modifications may be made without departing from the foregoing. to depart from the spirit and scope of the present invention. The following examples are provided for exemplary purposes only and are not intended to limit the scope of the invention described in broad terms above.
3333
In de volgende voorbeelden is het hGH dat van SEQ ID Nr. 1. Het moet duidelijk zijn dat andere hGH-polypepti-den ook gePEG-yleerd kunnen worden op een manier vergelijkbaar met die welke in de volgende voorbeelden als voorbeeld 5 wordt gegeven.In the following examples, the hGH is that of SEQ ID NO. 1. It should be understood that other hGH polypeptides can also be PEGylated in a manner similar to that given in Example 5 in the following examples.
VOORBEELD 1EXAMPLE 1
Glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGHGlycerol branched 43K PEG aldehyde hGH
00
10 IIII
H2C-0(CH2CH20)nCH2CH2CHH 2 C-O (CH 2 CH 2 O) n CH 2 CH 2 CH
CH-0(CH2CH20)mCH3 15 H2C-0(CH2CH20)mCH3 20 waarin (CH2CH20)n een gemiddeld molecuulgewicht heeft van ongeveer 3Kd en elke (CH2CH20)m een gemiddeld molecuulgewicht heeft van ongeveer 20 Kd (GL3-400AL2) .CH-O (CH 2 CH 2 O) mCH 3 H 2 C-O (CH 2 CH 2 O) m CH 3 wherein (CH 2 CH 2 O) n has an average molecular weight of about 3 Kd and each (CH 2 CH 2 O) m has an average molecular weight of about 20 Kd (GL 3 -400 Al 2).
25 Dit voorbeeld toont de productie van N-terminaal enkelvoudig gePEG-yleerd hGH door middel van reductieve alkylering. Het glycerol-vertakt PEG-aldehydereagens van ongeveer 43.000 MW (GL3-400AL2, NOF Corporation) werd via reductieve alkylering gekoppeld aan het N-uiteinde van hGH 30 door voordeel te trekken van het verschil in relatieve pK,,-waarde van de primaire aminegroep aan het N-uiteinde versus de pKa-waarden van primaire aminen op de e-aminopositie van lysineresten. hGH-eiwit opgelost in een concentratie van 4, 7 of 10 mg/ml in 25 mM MES (Sigma Chemical, St. Louis, MO) 35 van pH 5,8 of 2 0 mM HEPES van pH 7,0 liet men reageren met glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde door toevoeging van het reagens tot een relatieve molaire verhouding PEG:hGH van 34 1,5:1, 2:1, 3,4:1, 4:1 of 5:1. De reacties werden gekatalyseerd door de toevoeging van pyridineboraan (Sigma Chemical, St. Louis, MO) tot een eindconcentratie van 10 mM. De reacties werden uitgevoerd in het donker bij 4 graden C 5 gedurende 16 - 87 uur. De reacties werden gestopt door verdunning in geschikte buffer voor zuivering.This example shows the production of N-terminal single PEGylated hGH by means of reductive alkylation. The glycerol-branched PEG aldehyde reagent of about 43,000 MW (GL3-400AL2, NOF Corporation) was linked via reductive alkylation to the N-terminus of hGH 30 by taking advantage of the difference in relative pK1 value of the primary amine group at the N-terminus versus the pKa values of primary amines at the ε-amino position of lysine residues. hGH protein dissolved in a concentration of 4, 7 or 10 mg / ml in 25 mM MES (Sigma Chemical, St. Louis, MO) 35 of pH 5.8 or 20 mM HEPES of pH 7.0 was reacted with glycerol-branched 43K PEG aldehyde by adding the reagent to a relative molar PEG: hGH ratio of 34 1.5: 1, 2: 1, 3.4: 1, 4: 1 or 5: 1. The reactions were catalyzed by the addition of pyridine borane (Sigma Chemical, St. Louis, MO) to a final concentration of 10 mM. The reactions were performed in the dark at 4 degrees C 5 for 16 - 87 hours. The reactions were stopped by dilution in suitable buffer for purification.
Tabel 1 toont het percentage meervoudig gePEG-yleerde soorten, enkelvoudig gePEG-yleerd conjugaat, ongereageerd hGH en de uiteindelijke zuiveringsopbrengst 10 voor glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH, dat gedurende 63 uur gereageerd had bij een pH van 5,8 en een molaire verhouding van 1,5:1:1.Table 1 shows the percentage of multiple PEGylated species, single PEGylated conjugate, unreacted hGH and the final purification yield for glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH that had reacted for 63 hours at a pH of 5.8 and a molar ratio of 1.5: 1: 1.
Tabel 1 15 Glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH-conjugaat. Synthese-en zuiveringswerkwijzeTable 1 Glycerol branched 43K PEG aldehyde-hGH conjugate. Synthesis and purification method
Synthese en zuivering, opbrengsten voor glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGHSynthesis and purification, yields for glycerol branched 43K PEG aldehyde hGH
20 Soorten in de reactiemix:20 Types in the reaction mix:
glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGHglycerol branched 43K PEG aldehyde hGH
multi-PEG-product 4% mono-PEG-product 68% 25 ongereageerd hGH 28%multi-PEG product 4% mono-PEG product 68% 25 unreacted hGH 28%
Zuiveringsopbrengst 35% 35 VOORBEELD 2Purification yield 35% 35 EXAMPLE 2
Zuivering van gePEG-yleerd hGHPurification of PEGylated hGH
GePEG-yleerde hGH-soorten werden uit het reactie-mengsel gezuiverd tot >95% (SEC-analyse, Figuur 1) met 5 behulp van een enkele ionenuitwisselingschromatografiestap.PEGylated hGH species were purified from the reaction mixture to> 95% (SEC analysis, Figure 1) using a single ion exchange chromatography step.
Anionenuitwisselingschromatografie DE PEG-hGH-soorten werden uit het reactiemengsel gezuiverd tot > 95% (SEC-analyse, Figuur 1) met behulp van 10 een enkele anionenuitwisselingschromatografiestap. Enkelvoudig gePEG-yleerd hGH werd van ongemodificeerd hGH en meervoudig gePEG-yleerde hGH-soorten gezuiverd door middel van anionenuitwisselingschromatografie. Een kenmerkend reactiemengsel met glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH 15 (80 of 1500 mg eiwit) , zoals hierboven beschreven, werd gezuiverd op een Q-Sepharose Hitrap kolom (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) of een Q-Sepharose kolom (26/20, 70 ml bedvolume) (Amersham Pharmacia Biotech,Anion exchange chromatography The PEG hGH species were purified from the reaction mixture to> 95% (SEC analysis, Figure 1) using a single anion exchange chromatography step. Single PEGylated hGH was purified from unmodified hGH and multiple PEGylated hGH species by anion exchange chromatography. A typical reaction mixture with glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH (80 or 1500 mg protein), as described above, was purified on a Q-Sepharose Hitrap column (5 ml) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) or a Q-Sepharose column (26/20, 70 ml bed volume) (Amersham Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ) , die geëquilibreerd was in 25 mM HEPES, pH 20 7,3 (Buffer A) . Het reactiemengsel werd 7x verdund met buffer A en op de kolom geladen bij een stroomsnelheid van 2,5 ml/minuut. De kolom werd gewassen met 3-10 kolomvolu-mina buffer A. Vervolgens werden de diverse hGH-soorten van de kolom geëlueerd in 20 kolomvolumina Buffer A en een 25 lineaire NaCl-gradiënt van 0 - 100 mM. De elutiefractie werd gevolgd aan de hand van de absorptie bij 280 nm (A280) en er werd fracties van geschikte grootte verzameld. De fracties werden samengevoegd naar de mate van PEG-ylering, bijv. mono, di, tri enz. (zoals vastgesteld in voorbeeld 30 3). De pool werd daarna geconcentreerd tot 0,5-5 mg/ml in een Centriprep YM10 concentrator (Amicon, Technology Corporation, Northborough, MA) of door middel van diafil-tratie. De eiwitconcentratie van de pool werd bepaald aan de hand van de A2B0 en een extinctiecoëfficiënt van 0,78.Piscataway, NJ) equilibrated in 25 mM HEPES, pH 7.3 (Buffer A). The reaction mixture was diluted 7x with buffer A and loaded onto the column at a flow rate of 2.5 ml / minute. The column was washed with 3-10 column volumes of buffer A. Subsequently, the various hGH species were eluted from the column in 20 column volumes of Buffer A and a linear NaCl gradient of 0 - 100 mM. The elution fraction was monitored by the absorbance at 280 nm (A280) and fractions of suitable size were collected. The fractions were pooled to the extent of PEGylation, e.g., mono, di, tri, etc. (as determined in Example 3). The pool was then concentrated to 0.5-5 mg / ml in a Centriprep YM10 concentrator (Amicon, Technology Corporation, Northborough, MA) or by diafiltration. The protein concentration of the pool was determined on the basis of the A2B0 and an extinction coefficient of 0.78.
35 36 VOORBEELD 335 36 EXAMPLE 3
Biochemische karakteriseringBiochemical characterization
De pools met gezuiverd gePEG-yleerd hGH werden 5 gekarakteriseerd met niet-reducerende SDS-PAGE, niet-denaturerende op grootte scheidende chromatografie en in kaart brengen van peptiden.The pools of purified PEGylated hGH were characterized by non-reducing SDS-PAGE, non-denaturing size-separating chromatography and mapping of peptides.
Op grootte scheidende hoge prestatie-vloeistofchromatogra-10 fie (SEC-HPLC)Size separating high performance liquid chromatography (SEC-HPLC)
Het reactiemengsel van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde met hGH, met anionenuitwisseling gezuiverde pools en gezuiverde eindproducten werd bepaald met behulp van niet-denaturerende SEC-HPLC. Analytische niet-denaturerende 15 SEC-HPLC werd uitgevoerd met behulp van een kolom, TSK G4000PWXL (Tosohaas) of Shodex KW-804 (Waters Corp.) in 2 0 mM fosfaat, pH 7,2, 150 mM NaCl bij een stroomsnelheid van 0,5 ml/minuut (eventueel Superdex 200, 7,8 mm x 30 cm, Amersham Bioscience, Piscataway, NJ). PEG-ylering verhoogde 20 sterk het hydrodynamische volume van het eiwit, hetgeen resulteerde in een verschuiving naar een vroegere retentie-tijd. Er werden nieuwe soorten waargenomen in de PEG-aldehyde-hGH-reactiemengsels samen met ongemodificeerd hGH. Deze gePEG-yleerde en ongePEG-yleerde soorten werden 25 gescheiden door chromatografie op Q-Sepharose en er werd aangetoond dat de resulterende gezuiverde mono-PEG-aldehy-de-hGH-soorten vervolgens elueerden als een enkele piek op niet-denaturerende SEC (>95% zuiverheid, Figuur 1). De stap van chromatografie over Q-Sepharose verwijderde effectief 30 vrij PEG en meervoudig gePEG-yleerde hGH-soorten uit het enkelvoudig gePEG-yleerd hGH.The reaction mixture of glycerol-branched 43K PEG aldehyde with hGH, pools purified with anion exchange and purified end products was determined by non-denaturing SEC-HPLC. Analytical non-denaturing SEC-HPLC was performed using a column, TSK G4000PWXL (Tosohaas) or Shodex KW-804 (Waters Corp.) in 20 mM phosphate, pH 7.2, 150 mM NaCl at a flow rate of 0 , 5 ml / minute (optionally Superdex 200, 7.8 mm x 30 cm, Amersham Bioscience, Piscataway, NJ). PEGylation greatly increased the hydrodynamic volume of the protein, resulting in a shift to an earlier retention time. New species were observed in the PEG aldehyde hGH reaction mixtures together with unmodified hGH. These PEGylated and unPEGylated species were separated by chromatography on Q-Sepharose and it was shown that the resulting purified mono-PEG aldehyde-hGH species then eluted as a single peak on non-denaturing SEC (> 95% purity, Figure 1). The step of chromatography on Q-Sepharose effectively removed free PEG and multiple PEGylated hGH species from the single PEGylated hGH.
SDS-PAGESDS PAGE
SDS-PAGE werd gebruikt om de reactie van glycerol-35 vertakt 43K PEG-aldehyde met hGH en de gezuiverde eindproducten vast te stellen. SDS-PAGE werd uitgevoerd op 1 mm dikke 10-NuPAGE-gels (Invitrogen, Carlsbad, CA) onder 37 reducerende en niet-reducerende omstandigheden en gekleurd met behulp van een Novex Colloidal Coomassie™ G-250 kleu-ringskit (Invitrogen, Carlsbad, CA.SDS-PAGE was used to assess the reaction of glycerol-branched 43K PEG aldehyde with hGH and the purified end products. SDS-PAGE was performed on 1-mm-thick 10-NuPAGE gels (Invitrogen, Carlsbad, CA) under 37 reducing and non-reducing conditions and stained using a Novex Colloidal Coomassie ™ G-250 coloring kit (Invitrogen, Carlsbad, CA.
5 N-terminale sequentie5 N-terminal sequence
Geautomatiseerde Edman-degradatiechemie wordt gebruikt om de N-terminale eiwitsequentie te bepalen. Een Applied Biosystems Model 494 Procise sequencer (Perkin Elmer, Wellesley, MA) wordt gebruikt voor de degradatie. De 10 respectievelijke PTH-AZ-derivaten worden geïdentificeerd door middel van RP-HPLC-analyse op een on-line manier met behulp van een Applied Biosystems Model 140C PTH analysator voorzien van een Perkin Elmer/Brownlee 2,1 mm i.d. PTH-C18-kolom.Automated Edman degradation chemistry is used to determine the N-terminal protein sequence. An Applied Biosystems Model 494 Procise sequencer (Perkin Elmer, Wellesley, MA) is used for the degradation. The 10 respective PTH-AZ derivatives are identified by RP-HPLC analysis in an on-line manner using an Applied Biosystems Model 140C PTH analyzer equipped with a Perkin Elmer / Brownlee 2.1 mm i.d. PTH-C18 column.
1515
In kaart brengen van peptidenMapping peptides
Tryptische digesties werden uitgevoerd bij een concentratie van 1 mg/ml en in het algemeen werd 25 /ig materiaal per digestie gebruikt. Trypsine werd zodanig 20 toegevoegd dat de verhouding van trypsine tot PEG-hGH 1:30 | (w/w) was. Tris-buffer was aanwezig in een concentratie van 30 mM, pH 7,5. Monsters werden 16 ± 0,5 uur geïncubeerd bij kamertemperatuur. De reacties werden geschrokken door de toevoeging van 50 μΐ IN HC1 per ml digestieoplossing. De 25 monsters werden verdund, voordat de monsters in de autosam-pler geplaatst werden, tot een eindconcentratie van 0,25 mg/ml in 6,25% acetonitril. Eerst werd acetonitril toegevoegd (tot 19,8% acetonitril), rustig gemengd, en daarna werd water toegevoegd tot een eindvolume van vier keer het 30 uitgangsvolume. Extra digestieoplossing kan worden verwijderd en gedurende maximaal een week worden bewaard bij -20°C.Tryptic digestions were carried out at a concentration of 1 mg / ml and generally 25 µg of material was used per digestion. Trypsin was added such that the ratio of trypsin to PEG-hGH 1:30 | (w / w). Tris buffer was present in a concentration of 30 mM, pH 7.5. Samples were incubated for 16 ± 0.5 hours at room temperature. The reactions were shocked by the addition of 50 μΐ IN HCl per ml digestion solution. The samples were diluted before the samples were placed in the autosampler to a final concentration of 0.25 mg / ml in 6.25% acetonitrile. First acetonitrile was added (up to 19.8% acetonitrile), gently mixed, and then water was added to a final volume of four times the starting volume. Additional digestion solution can be removed and stored at -20 ° C for up to a week.
Een Waters Alliance 2695 HPLC-systeem werd gebruikt voor de analyse, maar andere systemen zouden verge-35 lijkbare resultaten moeten produceren. Een Astec C-4 polymere kolom van 25 cm x 4,6 mm met 5 μιη deeltjes werd gebruikt. Experimenten werden uitgevoerd bij omgevingstem- 38 peratuur bij gewoonlijk een belading van 50 μg eiwit per monster. Buffer A is 0,1% trifluorazijnzuur in water; buffer B was 0,085% trifluorazijnzuur in acetonitril. De monsters werden geélueerd met een lineaire gradiënt van 0 -5 45% B over 90 minuten.A Waters Alliance 2695 HPLC system was used for the analysis, but other systems should produce comparable results. An Astec C-4 polymer column of 25 cm x 4.6 mm with 5 μιη particles was used. Experiments were performed at ambient temperature, usually with a loading of 50 μg of protein per sample. Buffer A is 0.1% trifluoroacetic acid in water; buffer B was 0.085% trifluoroacetic acid in acetonitrile. The samples were eluted with a linear gradient of 0-5% 45% over 90 minutes.
Pieken werden gedetecteerd met behulp van een Waters 996 PDA detector, waarbij gegevens werden verzameld tussen 210 en 300 nm. Het eraf getrokken chromatogram bij 214 nm werd gebruikt voor monsteranalyse.Peaks were detected using a Waters 996 PDA detector, with data collected between 210 and 300 nm. The pulled chromatogram at 214 nm was used for sample analysis.
10 Tryptische kaarten werden gemaakt voor hGH en glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-reagens in een molaire verhouding van 2:1 (PEG:hGH) (Figuur 2). Het N-terminale tryptische fragment werd T-l genoemd. Het percentage T-l dat aanwezig was in vergelijking met ongePEG-yleerd hGH, 15 suggereert dat meer dan 99% van de PEG-modificatie zit aan i het N-uiteinde met de rest blijkbaar gekoppeld aan één van verschillende mogelijke lysineresten.Tryptic maps were made for hGH and glycerol-branched 43K PEG aldehyde reagent in a 2: 1 molar ratio (PEG: hGH) (Figure 2). The N-terminal tryptic fragment was called T-1. The percentage of T-1 present in comparison with unPEGylated hGH suggests that more than 99% of the PEG modification is at the N-terminus with the remainder apparently linked to one of several possible lysine residues.
Tabel 2 20 T-l aanwezig vergelijking % T-l aanwezig % T-l aanwezig inTable 2 T-1 present comparison% T-1 present% T-1 present in
vergelijking met ongePEG-yleerd hGHcomparison with unPEGylated hGH
hGH 28,0% 100% glycerol-vertakt Minder dan 1% Minder dan 1%hGH 28.0% 100% glycerol branched Less than 1% Less than 1%
43K PEG-aldehyde/-25 hGH43K PEG aldehyde / -25 hGH
Voorbeeld 4 in vitro biologieExample 4 in vitro biology
Het vermogen van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH om 30 de menselijke receptor te herkennen werd getest met behulp van een Biacore 3000 instrument in een bepaling die opgezet was om de specifieke interacties tussen het conjugaat en de menselijke groeihormoonreceptor (hGHR) (28 kDa extracellu-lair domein) te bepalen. De resultaten van de surface 39 plasmon resonantie (SPR) experimenten worden hierin getoond in Tabel 3.The ability of glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH to recognize the human receptor was tested using a Biacore 3000 instrument in an assay designed to detect the specific interactions between the conjugate and the human growth hormone receptor (hGHR) (28 kDa extracellular domain). The results of the surface 39 plasmon resonance (SPR) experiments are shown in Table 3 herein.
Tabel 3. Resultaten van de Biacore-beoaling 5 Monster Gem. ka x Gem. )¾ (s‘l 1¾ = k^/k,, ΐς, met be- 105 (M^s'1 ± ± std)a mM trekking totTable 3. Results of the Biacore evaluation Sample Av. ka x Avg. ) ¾ (s'l 1¾ = k ^ / k ,, ΐς, with 105 (M ^ s'1 ± ± std) a mM draw up to
std)® hGHstd) ® hGH
hGH (n=9) 3,07+8,20 38,8±3,6 0,13±0,03 1,000 43K PEG-hGH 0,28±0,03 90,0±31,0 3,22±0,10 0,041 (n-3) 10 a ka (aan-snelheid) en kd (uit-snelheid) werden bepaald bij een stroomsnelheid van 50 μΐ/minuut bij 37°C in HEP-BES-buffer (0,01 M Hepes, pH 7,4, plus 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA en 0,005% oppervlakteactieve stof P20), waarbij gebruik werd gemaakt van menselijk groeihormoonbindend eiwit (28 15 kDa, extracellulair domein) gekoppeld op een CM5-chip door middel van amine-koppelingschemie bij ARU = 3000 - 5000. ka, uitgedrukt in M per seconde, kd uitgedrukt per seconde, beide zijn een gemiddelde waarde van ten minste 3 metingen op 1 chip ± standaard afwijking. Er wordt aangenomen dat de 20 gegevens de hGH-binding aan plaats 1 met hoge affiniteit op HGBP in een verhouding van 1:1 meten.hGH (n = 9) 3.07 + 8.20 38.8 ± 3.6 0.13 ± 0.03 1,000 43K PEG-hGH 0.28 ± 0.03 90.0 ± 31.0 3.22 ± 0.10 0.041 (n-3) 10 a ka (on speed) and kd (off speed) were determined at a flow rate of 50 μΐ / minute at 37 ° C in HEP-BES buffer (0.01 M Hepes , pH 7.4, plus 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA and 0.005% surfactant P20), using human growth hormone binding protein (28 kDa, extracellular domain) coupled to a CM5 chip by amine coupling chemistry at ARU = 3000 - 5000. ka, expressed in M per second, kd expressed per second, both are an average value of at least 3 measurements on 1 chip ± standard deviation. It is believed that the data measures the hGH binding at site 1 with high affinity for HGBP in a 1: 1 ratio.
Voorbeeld 5Example 5
Farmacodynamische studies 25Pharmacodynamic studies 25
In vivo potentie - Werkzaamheid in 11 dagen durende rattenbepaling (gewichtstoename, groei scheenbeen, onderdrukking serum-BUNIn vivo potency - Efficacy in rat determination for 11 days (weight gain, shin growth, serum BUN suppression)
30 Gewichtstoename in ratten30 Weight gain in rats
Vrouwelijke Sprague Dawley ratten, na hypofysecto-mie in de Harlan Labs, werden voorgescreend op groeisnel-heid gedurende een periode van 4 - 10 dagen. De ratten werden verdeeld in groepen van zes. Beginnend op dag 0 35 ontvingen controleratten eenmaal dagelijks een injectie van 40 ofwel 0,3 mg/kg hGH of drager, gedurende elf achtereenvolgende dagen. De testgroep ontving een enkele dosis (eenmaal per week) van 1,8 mg/kg glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH op dag 0 en 6. De dieren werden dagelijks gewogen.Female Sprague Dawley rats, after hypophysectemia in the Harlan Labs, were pre-screened for growth rate for a period of 4 - 10 days. The rats were divided into groups of six. Starting on day 0, control rats received an injection of 40 or 0.3 mg / kg hGH or vehicle once daily for eleven consecutive days. The test group received a single dose (once a week) of 1.8 mg / kg of glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH on days 0 and 6. The animals were weighed daily.
5 Figuur 4 toont de effecten van hGH en glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH op de lichaamsgewichtstoename in een representatieve studie.Figure 4 shows the effects of hGH and glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH on body weight gain in a representative study.
Wanneer de gegevens die worden weergegeven door de in Figuur 4 afgeheelde studie, worden gecombineerd met de 10 gegevens van de voorafgaande 11 dagen durende groeistudies voor met hGH (controle) behandeld ratten plus een additionele groeistudie met behulp van het glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH-conjugaat, was de gemiddelde oplopende gewichtstoename voor de dieren die eenmaal per week behan-15 deld werden met 1,8 mg/kg conjugaat, 109% van die welke bereikt na dagelijkse hGH-toediening (cumulatief 3,3 mg/kg).When the data represented by the study discontinued in Figure 4 is combined with the data from the previous 11-day growth studies for hGH (control) treated rats plus an additional growth study using the glycerol-branched 43K PEG aldehyde -hGH conjugate, the average increasing weight gain for the animals treated once a week with 1.8 mg / kg conjugate was 109% of that achieved after daily hGH administration (cumulative 3.3 mg / kg ).
Scheenbeenlengte van de ratten 20 De ratten van de 11 dagen durende studies naar gewichtstoename werden op dag 11 gedood, de linker scheenbeenderen werden verwijderd en er werd een röntgenfoto van gemaakt en de botlengtes werden gemeten met behulp van een schuifmeter. Figuur 5 toont de metingen van de scheenbeen-25 lengtes voor met glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH behandelde dieren.Tibial length of the rats The rats from the 11-day weight gain studies were killed on day 11, the left tibial bones were removed and an X-ray was taken and the bone lengths were measured using a slide meter. Figure 5 shows the shin length measurements for glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH treated animals.
BUN-concentraties in de rattenBUN concentrations in the rats
Als een biomarker voor de metabole effecten na 30 hGH-behandeling werden ureumstikstofconcentraties in het bloed bepaald in bloedmonsters van dag 11. Figuur 6 laat zien dat zowel een behandeling met dagelijks hGH als eenmaal/week glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH resulteert in een significante verlaging in ureumstikstof in het 35 bloed.As a biomarker for the metabolic effects after 30 hGH treatment, blood urea nitrogen concentrations were determined in blood samples from day 11. Figure 6 shows that both daily hGH treatment and once / week glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH results in a significant reduction in urea nitrogen in the blood.
i 4141
Studie naar de gewichtstoename van de ratten na een 6-daagse toename in de dosisStudy of the weight gain of the rats after a 6-day dose increase
Ratten na hypofysectomie werden behandeld met diverse enkele doses van glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-5 hGH of anders dagelijks behandeld met hGH en de gewichts-toename werd gevolgd gedurende 6 dagen. Figuur 7 toont de gewichtstoename die verkregen werd voor de diverse behan-delgroepen. Bloedmonsters werden afgenomen op de aangegeven tijdstippen en de IGF-l-concentraties in het serum werden 10 bepaald met ELISA. Uitgezet zijn de gemiddelden ± SEM. Groepsgemiddelden (n=6) werden gebruikt om de IGF-1-reactie te berekenen met behulp van éénwegs variantieanalyse op de gemeten waarden en de waarden voor de AUCdO-6 (ng*uur/ml) van 20.040, 22.958, 28.129 en 37.839 werden bepaald voor 15 respectievelijk de cohorten met een dosering van 0,067, 0,2, 0,6 en 1,8 mg/kg.Rats after hypophysectomy were treated with several single doses of glycerol-branched 43K PEG aldehyde-5 hGH or alternatively treated daily with hGH and the weight gain was monitored for 6 days. Figure 7 shows the weight gain obtained for the various treatment groups. Blood samples were taken at the indicated time points and serum IGF-1 concentrations were determined by ELISA. Plotted are the means ± SEM. Group averages (n = 6) were used to calculate the IGF-1 response using one-way analysis of variance on the measured values and the values for the AUCdO-6 (ng * hr / ml) of 20,040, 22,958, 28,129 and 37,839 were determined for cohorts with a dose of 0.067, 0.2, 0.6 and 1.8 mg / kg respectively.
Studie naar de gewichtstoename van de ratten na een 11-daagse toename in de dosis 20 In een tweede studie werden dieren behandeld met ofwel 1,8 mg/kg of met een hogere dosis, d.w.z. 5,1 mg/kg van het glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH-conjugaat, op dag 0 en opnieuw op dag 6. Tabel 4 toont de dosisgerela-teerde gewichtstoename na 6 dagen en 11 dagen in vergelij-25 king met die welke bereikt werd na de dagelijkse (QD 11) toediening van ofwel drager of dagelijks hGH (0,3 mg/kg/d).Study of the weight gain of the rats after an 11-day increase in the dose. In a second study, animals were treated with either 1.8 mg / kg or with a higher dose, ie 5.1 mg / kg of the glycerol branched 43K PEG-aldehyde-hGH conjugate, on day 0 and again on day 6. Table 4 shows the dose-related weight gain after 6 days and 11 days compared to that achieved after daily (QD 11) administration of either carrier or daily hGH (0.3 mg / kg / d).
> |··| I I ~ II c> | ·· | I I ~ II c
CUCU
X) ·*- <u _ * _ * * ε ® C \D ^ o — ^ * <u £ - S - t- ° co - ~ cn CQ N η H * η ‘ H .X) · * - <u _ * _ * * ε ® C \ D ^ o - ^ * <u £ - S - t- ° co - ~ cn CQ N η H * η "H.
° O H O . _ <—I -—- "H j_, -H ,. +1 ΓΤ) h cn Ή +i +l +i S’ ^ t- r- ^ cn +l σι ' m ' m . ^ ^ <u <0 VO ^ VD - _ » CN \ I s° O H O. _ <—I -—- "H j_, -H,. +1 ΓΤ) h cn Ή + i + 1 + i S '^ t- r- ^ cn + 1 σι' m 'm. ^ ^ <U < 0 VO ^ VD - CNs
p O COC-^VD^ § Wp O COC ^ VD ^ § W
^ ™ H S ^ £ C w — m o . +> m £ Φ -----O x5 ^ 2 rrj -π u <u o „ * _ * _ +“ _ 3 O T3 T3 as ® ^ * “I H. ^ n o ft 5 Φ e CQ "OrHOHO^rH φ Π ^ “> 5 ^+1 +l * +* +l -Η +l ξ Se fi^ ™ H S ^ £ C w - m o. +> m £ Φ ----- O x5 ^ 2 rrj -π u <uo "* _ * _ +" _ 3 O T3 T3 axis ® ^ * "I H. ^ no ft 5 C th CQ" OrHOHO ^ rH φ Π ^ “> 5 ^ + 1 + 1 * + * + 1 -Η + 1 ξ Se fi
01 Ν t" rH O) VO 00 _. O φ .. ^ ‘H01 "t" rH O) VO 00 _. O φ .. ^ "H
(0 'O * - ‘ - S ' O. Γ* 01 0 p g - ro n on h O .[? ,, °(0 'O * - "- S' O. Γ * 01 0 p g - ro n on h O. [? ,, °
Ss 5j d 2 ί £ S ^^ωσι i—I ^ H ΓΗ CU .β (0Ss 5y d 2 ί £ S ^^ ωσι i — I ^ H ΓΗ CU .β (0
rH u CQ QrH u CQ Q
ΛΙ C CΛΙ C C
β J J) IJ Ή CU-----S ε > rö fll ^ U> ,¾ * 4J iö S K 3 > cn ^ o o CN rW «*» m ^ * Ë-S^g1β J J) IJ Ή CU ----- S ε> rö fll ^ U>, ¾ * 4J iö S K 3> cn ^ o o CN rW «*» m ^ * Ë-S ^ g1
* g N «-ί Η rH* ® - Ό -H* g N «-ί Η rH * ® - Ό -H
(¾ m σι jj μ ^ O _ r-, -H +1 +1 +1 -C (0 0) σι m ü « -g <D w, CN CN CO H « Ή Ό β ε 21 ' ' - ~ *2 £ β «o tO(ÜC VD cn VD VO ^ 0) (Ö ^ β c-c o o o o cn 4-> a> O rH rH rH rH * 01 01 ^ o 5 e(¾ m σι yy μ ^ O _ r-, -H +1 +1 +1 -C (0 0) σι m ü «-g <D w, CN CN CO H« Ή Ό β ε 21 '' - ~ * 2 £ β «o tO (ÜC VD and VD VO ^ 0) (Ö ^ β cc oooo cn 4-> a> O rH rH rH rH * 01 01 ^ o 5 e
xj > rö CUxj> rö CU
CD (0 2 T3 xj ιη ,α ωCD (0 2 T3 xj ιη, α ω
jC-----o o cq HjC ----- o o or H
O - ·Η OO - · Η O
-H m ' O rH +1 O-H m 'O r H + 10 O
3 CU <D J> dj Ό Ό v - 0) cn j ^ d r^· - ό c (ÖVO (0 U> Q. xJ 1—1(0 CD ' - ' ~ 4^0)(0 Ό Üo O o -i-CnOx) u — ω p pap h o m3 CU <DJ> dj Ό Ό v - 0) cn j ^ dr ^ · - ό c (ÖVO (0 U> Q. xJ 1—1 (0 CD '-' ~ 4 ^ 0) (0 Ό Üo O o -i-CnOx) u - pap p pap hom
d) rH ft ft-" d)-Hd) rH ft ft - "d) -H
2 q * ~ * - s 3 I s2 q * ~ * - s 3 I s
2 ~ s g s ) ΐί S S2 ~ s g s) Sί S S
<U ~ Ό "" O £1 Γη ^ cn (0 (0 s CQ ^ XJO0XJH * Ï2 β η h \ ï? m β <u<U ~ Ό "" O £ 1 Γη ^ cn (0 (0 s CQ ^ XJO0XJH * Ï2 β η h \ ï? M β <u
CD „ σι D) rH d) in > (0 CDCD "σι D) r H d) in> (0 CD
o Q, c O (0 CDQ, c O (0 CD
P Ö II CQ XJ rjP II II CQ XJ rj
-" co rHpdrHpi ° Cn CD XJ"co rHpdrHpi ° Cn CD XJ
o o o o - m έγ Μ o ίΗ^βΜΛ ο,0ββo o o o - m έγ Μ o ίΗ ^ βΜΛ ο, 0ββ
φ -" d) I 0) I d) CUφ - "d) I 0) I d) CU
rH cn UdJOd) v 4_I TH ΌrH cn UdJOd) v 4_I TH Ό
(U (0 X S'OS'Ö io^S(U (0 X S'OS'Ö io ^ S
JQ ,¾ S2 ^ H >1 ft β (0 (0 (0 Q C) £1 Ü Λ (0(0(0JQ, ¾ S2 ^ H> 1 ft β (0 (0 (0 Q C)) £ 1 Ü (0 (0 (0 (0 (0) 0)
Η 11 1 1 1 1 11 * > S SΗ 11 1 1 1 1 11 *> S S
cn o incn o
H rHH rH
% 43 IGF-1-studies% 43 IGF-1 studies
Dieren uit de zesdaagse studies naar gewichtstoe-name werden gebruikt. Bloedmonsters werden afgenomen op de diverse tijdstippen tijdens de studie en de IGF-l-concen-5 traties in het serum werden bepaald met ELISA, zoals getoond in Figuur 8. De IGF-l-concentraties in de ratten werden gevolgd met een immunoassaykit (Diagnostic System Laboratories).Animals from the six-day weight gain studies were used. Blood samples were taken at various time points during the study and serum IGF-1 concentrations were determined by ELISA as shown in Figure 8. IGF-1 concentrations in the rats were monitored with an immunoassay kit (Diagnostic System Laboratories).
10 Voorbeeld 6Example 6
Farmacokinetische studiesPharmacokinetic studies
Farmacokinetische studies werden uitgevoerd in normale mannelijke Sprague-Dawley ratten, waarin een canule ingebracht was. Injecties werden gegeven als een enkele 15 intraveneuze dosis van 1,0 mg/kg of een enkele subcutane bolus van 1,8 mg/kg hGH of glycerol-vertakt 43K PEG-aldehy-de-hGH met zes ratten per groep. Bloedmonsters werden afgenomen over één tot vijf dagen naar geschikt voor de vaststelling van relevante PK parameters. Bloedoncentraties 20 van hGH en glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH worden gemeten na elke bemonstering met behulp van immunoassay. Tabel 4 toont de PK parameters van de ratten voor glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH. Het effect van PEG-ylering is duidelijke zien in de waargenomen halfwaardetijd voor 25 verwijdering, omdat deze parameter groter was dan 6 uur voor het conjugaat, terwijl de waarde die vermeld is voor hGH in vergelijkbare studies, wordt vermeld als 1,35 ± 0,2 (Clark, ibid.), 0,77 ± 1,7 (Jorgensen et al., "Polyethyleen glycol-conjugated proteins", PSTT 1 (8), november 1998) of 30 1 uur (Genotropin® (PNU-180307) Investigator Brochure).Pharmacokinetic studies were conducted in normal male Sprague-Dawley rats, into which a cannula was inserted. Injections were given as a single intravenous dose of 1.0 mg / kg or a single subcutaneous bolus of 1.8 mg / kg hGH or glycerol-branched 43K PEG-aldehyde-hGH with six rats per group. Blood samples were taken over one to five days to be suitable for the determination of relevant PK parameters. Blood concentrations of hGH and glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH are measured after each immunoassay sampling. Table 4 shows the PK parameters of the rats for glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH. The effect of PEG-ylation is evident in the observed half-life for removal because this parameter was greater than 6 hours for the conjugate, while the value reported for hGH in comparable studies is reported as 1.35 ± 0, 2 (Clark, ibid.), 0.77 ± 1.7 (Jorgensen et al., "Polyethylene glycol-conjugated proteins", PSTT 1 (8), November 1998) or 30 hours (Genotropin® (PNU-180307) Investigator Brochure).
hGH-immunoassayhGH immunoassay
Concentratieniveaus van hGH en glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH in rattenplasma werden bepaald met 35 behulp van de hGH AutoDELPFIA fluorescente immunoassaykit (Perkin-Elmer).Concentration levels of hGH and glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH in rat plasma were determined using the hGH AutoDELPFIA fluorescent immunoassay kit (Perkin-Elmer).
i -% 44i -% 44
Tabel 5.Table 5.
glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGHglycerol branched 43K PEG aldehyde hGH
Route iv/scRoute iv / sc
Dosis mg/kg 1,0 / 1,8 5 Tl/2 uur 6,44 + 2,38 AUC O-oo, iv /ig*uur/ml 489 ± 16 AUC O-oo, sc /xg*uur/ml 97,7 ± 2,1 CL totaal ml/uur/kg 2,05 ± 0,07Dose mg / kg 1.0 / 1.8 Tl / 2 hours 6.44 + 2.38 AUC O-oo, iv / ig * hours / ml 489 ± 16 AUC O-oo, sc / xg * hours / ml 97.7 ± 2.1 CL total ml / hour / kg 2.05 ± 0.07
Vss ml/kg 27,2 ± 2,8 10 Tmax uur 12 ± 0Vss ml / kg 27.2 ± 2.8 10 Tmax hours 12 ± 0
Cmax Mg/ml 1,96 ± 0,05 F % 11,1 ± 0,2 * AUC 0-oo, sc normaliseren voor 15 1,8 mpkCmax Mg / ml 1.96 ± 0.05 F% 11.1 ± 0.2 * AUC 0-oo, sc normalize for 1.8 mpk
De relatie tussen geneesmiddelconcentraties in plasma en de IGF-l-reactie werd ook direct bepaald in een uitvoerige studieopzet na de subcutane toediening van een enkele dosis 20 van het glycerol-vertakt 43K PEG-aldehyde-hGH (1,8 mg/kg) aan vrouwelijke knaagdieren na hypofysectomie.The relationship between plasma drug concentrations and the IGF-1 response was also directly determined in a comprehensive study design following the subcutaneous administration of a single dose of the glycerol-branched 43K PEG aldehyde hGH (1.8 mg / kg) to female rodents after hypophysectomy.
(029828(029828
Claims (12)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US60594504P | 2004-08-31 | 2004-08-31 | |
US60594504 | 2004-08-31 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NL1029828A1 NL1029828A1 (en) | 2006-03-01 |
NL1029828C2 true NL1029828C2 (en) | 2006-10-20 |
Family
ID=35708806
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NL1029828A NL1029828C2 (en) | 2004-08-31 | 2005-08-30 | Conjugates of glycerol-branched polyethylene glycol and human growth hormone, methods for their preparation and methods for their use. |
Country Status (24)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP1789092A2 (en) |
JP (1) | JP2008511610A (en) |
KR (1) | KR20070042567A (en) |
CN (1) | CN101010105A (en) |
AP (1) | AP2007003919A0 (en) |
AR (1) | AR050851A1 (en) |
AU (1) | AU2005278903A1 (en) |
BR (1) | BRPI0515118A (en) |
CA (1) | CA2577999A1 (en) |
CR (1) | CR8942A (en) |
EA (1) | EA200700380A1 (en) |
EC (1) | ECSP077281A (en) |
GT (1) | GT200500235A (en) |
IL (1) | IL181085A0 (en) |
MA (1) | MA28908B1 (en) |
MX (1) | MX2007002441A (en) |
NL (1) | NL1029828C2 (en) |
NO (1) | NO20071322L (en) |
PE (1) | PE20060654A1 (en) |
TN (1) | TNSN07078A1 (en) |
TW (1) | TW200621291A (en) |
UY (1) | UY29088A1 (en) |
WO (1) | WO2006024953A2 (en) |
ZA (1) | ZA200701802B (en) |
Families Citing this family (28)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7495087B2 (en) | 1997-07-14 | 2009-02-24 | Bolder Biotechnology, Inc. | Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11 |
BR9812267B1 (en) | 1997-07-14 | 2013-11-26 | Recombinant Growth Hormone. | |
EP1144613B2 (en) | 1999-01-14 | 2020-05-06 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
US7855279B2 (en) | 2005-09-27 | 2010-12-21 | Amunix Operating, Inc. | Unstructured recombinant polymers and uses thereof |
EP1834963A1 (en) * | 2006-03-13 | 2007-09-19 | Siegfried Ltd. | Di-polymer protein conjugates and processes for their preparation |
MX2008014358A (en) * | 2006-05-12 | 2008-11-24 | Dong A Pharm Co Ltd | Polyethylene glycol-interferon alpha conjugate. |
JP2008069073A (en) * | 2006-09-12 | 2008-03-27 | Yokohama Tlo Co Ltd | Lactoferrin conjugate and its manufacturing method |
KR101079993B1 (en) | 2006-11-17 | 2011-11-04 | 동아제약주식회사 | Polyethylene glycol-G-CSF conjugate |
CL2008002399A1 (en) | 2007-08-16 | 2009-01-02 | Pharmaessentia Corp | Substantially pure conjugate having a polymeric portion, a protein portion (interferon alpha 2b) and an aliphatic binder of 1 to 10 carbon atoms, useful in the treatment of hepatitis b or c. |
WO2010011096A2 (en) * | 2008-07-23 | 2010-01-28 | Hanmi Pharmaceutical Co., Ltd. | A polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends |
AU2009276458B2 (en) | 2008-07-31 | 2014-06-19 | Pharmaessentia Corp. | Peptide-polymer conjugates |
US8535655B2 (en) | 2008-10-10 | 2013-09-17 | Polyactiva Pty Ltd. | Biodegradable polymer—bioactive moiety conjugates |
PT2355853T (en) * | 2008-10-10 | 2017-03-15 | Polyactiva Pty Ltd | Biodegradable polymer - bioactive moiety conjugates |
SI2340271T1 (en) | 2008-10-10 | 2019-08-30 | Polyactiva Pty Ltd. | Polymer-bioactive agent conjugates |
US8703717B2 (en) | 2009-02-03 | 2014-04-22 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
WO2010091122A1 (en) | 2009-02-03 | 2010-08-12 | Amunix, Inc. | Extended recombinant polypeptides and compositions comprising same |
US8680050B2 (en) | 2009-02-03 | 2014-03-25 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides fused to extended recombinant polypeptides and methods of making and using same |
US9849188B2 (en) | 2009-06-08 | 2017-12-26 | Amunix Operating Inc. | Growth hormone polypeptides and methods of making and using same |
JP6086528B2 (en) | 2009-08-06 | 2017-03-01 | ノヴォ・ノルディスク・ヘルス・ケア・アーゲー | Growth hormone with long-term in vivo efficacy |
CN101831067A (en) * | 2010-05-31 | 2010-09-15 | 王二新 | Polyethylene glycol ester conjugate and application thereof in medicine preparation |
EP2446898A1 (en) | 2010-09-30 | 2012-05-02 | Laboratorios Del. Dr. Esteve, S.A. | Use of growth hormone to enhance the immune response in immunosuppressed patients |
CN102367290B (en) * | 2011-04-26 | 2013-05-08 | 厦门赛诺邦格生物科技有限公司 | Chain-functionalized multi-level branched polyethylene glycol and synthesis method thereof |
WO2014110867A1 (en) * | 2013-01-17 | 2014-07-24 | 厦门赛诺邦格生物科技有限公司 | Monofunctional branched polyethyleneglycol and bio-related substance modified by same |
CN104877127B (en) | 2015-06-23 | 2017-11-10 | 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 | A kind of eight arms polyethyleneglycol derivative, preparation method and its bio-related substance of modification |
SI3215193T1 (en) | 2014-11-06 | 2024-02-29 | Pharmaessentia Corporation | Dosage regimen for pegylated interferon |
JP7227633B2 (en) * | 2017-12-29 | 2023-02-22 | エフ. ホフマン-ラ ロシュ エージー. | Methods for providing PEGylated protein compositions |
EP3731872B1 (en) | 2017-12-29 | 2021-11-24 | F. Hoffmann-La Roche AG | Process for providing pegylated protein composition |
JP7137625B2 (en) * | 2017-12-29 | 2022-09-14 | エフ.ホフマン-ラ ロシュ アーゲー | Methods for providing PEGylated protein compositions |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2147192A (en) * | 1991-06-28 | 1993-01-25 | Genentech Inc. | Method of stimulating immune response using growth hormone |
JP3092531B2 (en) * | 1996-11-05 | 2000-09-25 | 日本油脂株式会社 | Method for producing imidyl succinate-substituted polyoxyalkylene derivative |
BR9812267B1 (en) * | 1997-07-14 | 2013-11-26 | Recombinant Growth Hormone. | |
JP3921781B2 (en) * | 1998-02-12 | 2007-05-30 | 日本油脂株式会社 | Carboxyl group-containing polyoxyalkylene compound |
EP1144613B2 (en) * | 1999-01-14 | 2020-05-06 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
IL162031A0 (en) * | 2001-11-20 | 2005-11-20 | Pharmacia Corp | Chemically-modified human growth hormone conjugates |
AP2005003246A0 (en) * | 2002-09-09 | 2005-03-31 | Nektar Therapeutics Al Corp | Water-soluble polymer alkanals |
JP4412461B2 (en) * | 2002-11-20 | 2010-02-10 | 日油株式会社 | Modified bio-related substance, production method thereof and intermediate |
WO2004060406A2 (en) * | 2002-12-31 | 2004-07-22 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Polymeric reagents comprising a ketone or a related functional group |
TR201907313T4 (en) * | 2003-05-23 | 2019-06-21 | Nektar Therapeutics | PEG derivatives containing two PEG chains. |
-
2005
- 2005-08-25 EA EA200700380A patent/EA200700380A1/en unknown
- 2005-08-25 CA CA002577999A patent/CA2577999A1/en not_active Abandoned
- 2005-08-25 AU AU2005278903A patent/AU2005278903A1/en not_active Abandoned
- 2005-08-25 CN CNA2005800291171A patent/CN101010105A/en active Pending
- 2005-08-25 MX MX2007002441A patent/MX2007002441A/en unknown
- 2005-08-25 BR BRPI0515118-0A patent/BRPI0515118A/en not_active IP Right Cessation
- 2005-08-25 AP AP2007003919A patent/AP2007003919A0/en unknown
- 2005-08-25 EP EP05784225A patent/EP1789092A2/en not_active Withdrawn
- 2005-08-25 WO PCT/IB2005/002939 patent/WO2006024953A2/en active Application Filing
- 2005-08-25 KR KR1020077004912A patent/KR20070042567A/en not_active Application Discontinuation
- 2005-08-25 JP JP2007529040A patent/JP2008511610A/en active Pending
- 2005-08-26 PE PE2005000991A patent/PE20060654A1/en not_active Application Discontinuation
- 2005-08-29 AR ARP050103612A patent/AR050851A1/en unknown
- 2005-08-29 UY UY29088A patent/UY29088A1/en not_active Application Discontinuation
- 2005-08-30 NL NL1029828A patent/NL1029828C2/en not_active IP Right Cessation
- 2005-08-30 TW TW094129583A patent/TW200621291A/en unknown
- 2005-08-30 GT GT200500235A patent/GT200500235A/en unknown
-
2007
- 2007-01-31 IL IL181085A patent/IL181085A0/en unknown
- 2007-02-26 CR CR8942A patent/CR8942A/en not_active Application Discontinuation
- 2007-02-27 TN TNP2007000078A patent/TNSN07078A1/en unknown
- 2007-02-27 EC EC2007007281A patent/ECSP077281A/en unknown
- 2007-02-28 MA MA29724A patent/MA28908B1/en unknown
- 2007-02-28 ZA ZA200701802A patent/ZA200701802B/en unknown
- 2007-03-09 NO NO20071322A patent/NO20071322L/en not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ECSP077281A (en) | 2007-03-29 |
MX2007002441A (en) | 2007-05-04 |
IL181085A0 (en) | 2007-07-04 |
EA200700380A1 (en) | 2007-10-26 |
GT200500235A (en) | 2006-03-21 |
ZA200701802B (en) | 2008-08-27 |
NL1029828A1 (en) | 2006-03-01 |
WO2006024953A3 (en) | 2007-01-18 |
JP2008511610A (en) | 2008-04-17 |
CA2577999A1 (en) | 2006-03-09 |
NO20071322L (en) | 2007-05-29 |
KR20070042567A (en) | 2007-04-23 |
EP1789092A2 (en) | 2007-05-30 |
PE20060654A1 (en) | 2006-08-12 |
MA28908B1 (en) | 2007-10-01 |
BRPI0515118A (en) | 2008-07-01 |
CR8942A (en) | 2007-08-16 |
AP2007003919A0 (en) | 2007-02-28 |
AU2005278903A1 (en) | 2006-03-09 |
TW200621291A (en) | 2006-07-01 |
CN101010105A (en) | 2007-08-01 |
WO2006024953A2 (en) | 2006-03-09 |
AR050851A1 (en) | 2006-11-29 |
UY29088A1 (en) | 2006-03-31 |
TNSN07078A1 (en) | 2008-06-02 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NL1029828C2 (en) | Conjugates of glycerol-branched polyethylene glycol and human growth hormone, methods for their preparation and methods for their use. | |
EP1715887B1 (en) | N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and use thereof | |
NL1032282C2 (en) | N-terminal mono-pegylated human growth hormone conjugates and process for their preparation. | |
EP2279007B1 (en) | Pegylated recombinant human growth hormone compounds | |
AU2002356990A1 (en) | Chemically-modified human growth hormone conjugates | |
US20030171285A1 (en) | Chemically-modified human growth hormone conjugates | |
US20040038892A1 (en) | Chemically-modified human growth hormone conjugates | |
Finn | PEGylation of human growth hormone: strategies and properties | |
MXPA06008888A (en) | N-terminally monopegylated human growth hormone conjugates, process for their preparation, and methods of use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
AD1A | A request for search or an international type search has been filed | ||
RD2N | Patents in respect of which a decision has been taken or a report has been made (novelty report) |
Effective date: 20060616 |
|
PD2B | A search report has been drawn up | ||
VD1 | Lapsed due to non-payment of the annual fee |
Effective date: 20090301 |