KR20070042567A - 글리세롤 분지쇄 폴리에틸렌 글리콜 인간 성장 호르몬공액체, 이의 제조 방법 및 이의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 글리세롤 분지쇄 PEG를 사용한 인간 성장 호르몬(hGH)의 PEG화에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 hGH의 PEG화 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 PEG화 hGH를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 추가 실시양태는 성장 또는 발달 장애의 치료를 위한 PEG화 hGH의 용도이다.
Description
본 발명은 인간 성장 호르몬(hGH)의 PEG화에 관한 것으로, 이 PEG화에 의해 hGH의 화학적 및/또는 생리적 성질이 변화될 수 있다. PEG화 hGH 공액체(conjugate)는 증가된 혈장 잔류 시간, 감소된 제거율(clearance rate), 개선된 안정성, 감소된 항원성, 감소된 PEG화 불균질도 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 또한, 본 발명은 hGH를 변형시키는 방법에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 변형된 hGH를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 추가 실시양태는 성장 및 발달 장애의 치료를 위한 변형된 hGH의 용도이다.
본원은 2004년 8월 31일에 출원된 미국 가출원 제60/605,945호에 대한 우선권을 미국 특허법 제119조 하에 주장하며, 상기 가출원은 이것이 본원에 기재된 것처럼 그 전체가 참고로 본원에 도입되어 있다.
천연 hGH는 2개의 이황화 가교에 의해 가교-결합된 191개의 아미노산으로 구성된 단일쇄를 포함하는 단백질이고, 단량체 형태는 22 kDa의 분자량을 가진다. 인간 GH는 뇌하수체에 의해 분비되고 재조합 유전공학 기술에 의해서도 제조될 수 있다. hGH는 성장할 수 있는 모든 신체 조직에서 성장을 일으킬 것이다. hGH는 인간에서 성장기에서의 성장을 촉진하는 데 있어서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라, 정상적인 신체 조성, 동화작용 및 지질 대사의 유지에 있어서도 중요한 역할을 한다(K. Barneis. And U. Keller, Baillieres Clin. Endocrinlo. Metab. 10: 337 (1996)).
재조합 hGH는 수년 동안 시판되고 있다. 치료적으로 유용한 재조합 hGH 제제의 2가지 유형 즉, 정품 예를 들면, 제노트로핀(GenotropinTM) 또는 뉴트로핀(NutropinTM), 및 N-말단에 추가 메티오닌 잔기를 가진 동족체 예를 들면, 소마토노름(SomatonormTM)이 시판되고 있다. hGH는 성장 호르몬 결핍증(GHD) 또는 터너 증후군(Turner's syndrome)으로도 불리는 뇌하수체기능저하성 소인증(hypopituitary dwarfism)을 앓는 환자에서 직선형 성장을 자극하는 데 사용되지만, 임신기간 동안 작게 태어난 어린이에서의 성장 부전의 장기간 치료, 및 프라더-윌리(Prader-Willi) 증후군(PWS), 만성 신부전증(CRI), AIDS 소모 또는 노화를 앓는 환자의 치료를 비롯한 다른 용도도 제안된 바 있다. 성인 성장 호르몬 결핍증(aGHD) 환자는 다양한 문제점 예를 들면, 지방 질량의 증가, 탈지방체중(lean body mass) 및 세포외 체액의 감소, 골 광물 밀도의 감소, 지질의 대사적 이상, 및 심혈관 기능장애를 비롯한 신체 조성의 특징적 변화를 가진다. 이들 문제점 중 다수가 hGH 대체 요법에 의해 개선된다(J. Verhelst J and R. Abs. Drugs.; 62: 2399 (2002)).
성장 호르몬(GH)의 주요 생물학적 효과는 젊은 포유동물에서 성장을 촉진하고 나이 든 포유동물에서 조직의 유지를 촉진한다는 것이다. 영향을 받는 기관계에는 골격, 결합 조직, 근육, 및 내장 예를 들면, 간, 장 및 신장이 포함된다. GH는 표적 세포막 상의 특정 수용체와의 상호작용을 통해 그의 효과를 발휘한다. hGH는 태반 락토겐, 프로락틴, 및 GH의 다른 유전적 변이체 및 종 변이체를 포함하는 동족 호르몬 부류의 일원이다(Nicoll, C. S., et al. (1986) Endocrine Reviews 7: 169). hGH는 광범위한 종 특이성을 나타내고 클로닝된 소마토겐성 수용체(Leung, D. W., et al. [1987] Nature 330; 537) 또는 프로락틴 수용체(Boutin, J. M., et al. [1988] Cell; 53: 69)에 결합한다는 점에서 이들 호르몬 부류 내의 다른 호르몬들과 구별된다. hGH에 대한 클로닝된 유전자는 대장균(Escherichia coli)에서 분비 형태로 발현되고(Chang, C. N., et al. (1987) Gene 55: 189), 이의 DNA 및 아미노산 서열은 보고되어 있다(Goeddel, et al. (1979) Nature 281: 544; Gray, et al. (1985) Gene 39: 247).
hGH는 정상적인 인간 성장 및 발달 조절의 대부분에 참여한다. 이 뇌하수체 호르몬은 직선형 성장(신체발달(somatogenesis)), 젖분비, 대식세포의 활성화, 특히 인슐린-유사 및 당뇨병유발 효과를 비롯한 다수의 생물학적 효과를 나타낸다(Chawla, R, K. (1983) Ann. Rev. Med. 34, 519; Edwards, C. K. et al. (1988) Science 239, 769; Thomer, M. 0., et al. (1988) J. CHn. Invest. 81: 745). 어린이에서의 GH 결핍은 소인증을 초래하고, 이 소인증은 hGH의 외부 투여에 의해 10년 이상의 기간 동안 성공적으로 치료되고 있다.
어린이뿐만 아니라 성인에서도, hGH는 질소 보유량의 증가, 골격근 성장의 자극, 및 체지방의 유동화(mobilization)를 통해 정상 신체 조성을 유지한다. 내장 지방 조직은 특히 hGH에 대해 반응한다. 증강된 지질분해 외에, hGH는 트리글리세라이드가 체지방 축적물 내로 들어가는 것을 감소시킨다. IGF-1(인슐린-유사 성장 인자-1) 및 IGFBP3(인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 3)의 혈청 농도는 hGH에 의해 증가된다.
hGH는 특히 질소, 인, 칼륨 및 칼슘을 보유하기 때문에 강력한 동화작용제(anabolic agent)이다. GH를 사용한 뇌하수체절제 래트의 치료는 이 래트의 성장 속도의 적어도 일부를 회복시킬 수 있다(Moore et al., Endocrinology 122: 2920-2926 (1988)). 뇌하수체기능저하(GH-결핍) 환자에서의 GH의 효과 중에서 가장 놀라운 효과는 신장을 증가시키는 골-성장-판-연골의 가속화된 직선형 성장이다(Kaplan, Growth Disorders in Children and Adolescents (Springfield, IL: Charles C. Thomas, 1964)).
hGH는 다양한 동물 모델에서 직선형 골 성장, 젖분비, 대식세포의 활성화, 인슐린-유사 및 당뇨병유발 효과 등을 비롯한 다양한 생리학적 및 대사적 효과를 나타낸다(R. K. Chawla et al., Annu. Rev. Med. 34: 519 (1983); 0. G. P. lsaksson et al., Annu. Rev. Physiol. 47, 483 (1985); C. K. Edwards et al., Science 239, 769 (1988); M. 0. Thomer and M. L. Vance, J. Clin. Invest. 82: 745 (1988); J. P. Hughes and H. G. Friesen, Ann. Rev. Physiol. 47: 469 (1985)). 특히 폐경기 후의 여성에서 GH 분비가 연령에 따라 감소된다는 보고가 있다(Millard et al., Neurobiol. Aging, 11: 229-235 (1990); Takahashi et al., NeuroendocrinologyM, L6-137-142 (1987)). 또한, 문헌(Rudman et al., J. Clin. Invest., 67: 1361-1369 (1981) and Blackman, Endocrinology and Aging, 16: 981 (1987))도 참조한다. 더욱이, 감소된 탈지방체중, 지방 조직 중량의 증가 및 피부의 박막화를 비롯한 노화 징후 중 여러 징후가 주 당 3회의 GH 치료에 의해 경감될 수 있다는 보고가 있다. 예를 들면, 문헌(Rudman et al., N. Eng. J. Med, 323: 1-6 (1990)) 및 반스(Vance) 박사에 의한 동일 저널 간행물에 개재된 논문(pp. 52-54)을 참조한다. 이 생물학적 효과는 hGH와 특정한 세포 수용체 사이의 상호작용으로부터 유도된다. 두 가지 상이한 인간 수용체 즉, hGH 간 수용체(D. W. Leung et al., Nature 330: 537(1987)) 및 인간 프로락틴 수용체(J. M. Boutin et al., Mol. Endocrinology. 3: 1455 (1989))가 클로닝되어 있다. 그러나, 인간 태반 락토겐 수용체를 비롯한 다른 수용체들도 가능하다(M. Freemark, M. Comer, G. Komer, and S. Handwerger, Endocrinol. 120: 1865 (1987)). 이들 동족 수용체들은 서열 및 크기에서 상당히 상이한 글리코실화된 세포외 호르몬 결합 도메인, 단일 경막 도메인 및 세포질 도메인을 보유한다. 1종 이상의 수용체가 hGH에 대한 생리학적 반응에서 결정적인 역할을 하는 것으로 추정된다.
일반적으로, 체 내로 투여된 생리학적 활성 단백질은 체 내에서의 이들의 높 은 제거율 때문에 단기간 동안에만 이들의 약리학적 활성을 나타낼 수 있는 것으로 관찰된다. 게다가, 이들 단백질의 상대적 소수성은 이들의 안정성 및/또는 가용성을 제한할 수 있다.
치료적 단백질의 제거율을 감소시키거나 안정성을 개선시키거나, 또는 항원성을 없애기 위해, 단백질을 수용성 중합체로 화학적으로 변형시키는 몇몇 방법들이 제안된 바 있다. 이러한 유형의 화학적 변형은 단백질분해 효소가 단백질 골격 그 자체와 물리적으로 접촉하는 것을 효과적으로 차단함으로써 분해를 방지할 수 있다. 일부 수용성 중합체의 화학적 결합은 분자의 증가된 유체역학적 부피로 인해 신장에 의한 제거를 효과적으로 감소시킬 수 있다. 특정한 경우에서의 추가 이점에는 치료적 단백질의 증가된 안정성 및 순환 시간, 증가된 가용성 및 감소된 면역원성이 포함된다. 폴리(알킬렌 옥사이드) 특히, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)이 치료적 단백질 생성물의 제조에 사용되는 화학적 잔기이다(동사 "PEG화시킨다"는 1개 이상의 PEG 분자를 결합시키는 것을 의미함). 폴리(에틸렌 글리콜)의 결합은 단백질분해로부터 보호하는 것으로 밝혀졌고(Sada, et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139 (1991)), 특정 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 결합시키는 방법이 이용가능하다. 1979년 12월 18일자 허여된 미국 특허 제4,179,337호(Davis et al., Non-lmmunogenic Polypeptides); 및 1977년 1월 11일자 허여된 미국 특허 제4,002,531호(Royer, Modifying Enzymes with Polyethylene Glycol and Product Produced Thereby)를 참조한다. 검토를 위해 문헌(Abuchowski et al., in Enzymes as Drugs. (J. S. Holcerberg and J. Roberts, eds. pp. 367-383 (1981))) 을 참조한다.
다른 수용성 중합체 예컨대, 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리(비닐 알코올), 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(-1,3-디옥솔란), 폴리(-1,3,6-트리옥산), 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리-아미노산(단일중합체 또는 랜덤 공중합체)이 사용되고 있다.
폴리(에틸렌 글리콜)의 경우, 다양한 수단을 이용하여 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를 단백질에 결합시킨다. 일반적으로, 폴리(에틸렌 글리콜) 분자는 단백질 상에서 발견된 반응성 기를 통해 단백질에 결합된다. 아미노기 예컨대, 라이신 잔기 상의 아미노기 또는 N-말단에 있는 아미노기가 이러한 결합에 편리하다. 예를 들면, 로이어(Royer)(상기 미국 특허 제4,002,531호)는 환원성 알킬화가 폴리(에틸렌 글리콜) 분자를 효소에 결합시키는 데 이용되었다고 기술하고 있다. 문헌(Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994))에는 환원성 알킬화를 통해 CD4 면역접합체(immunoadhesin)를 모노메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 알데히드로 변형시키는 것이 보고되어 있다. 미국 특허 제5,824,784호는 환원성 알킬화 조건 하에 N-말단에서의 PEG화를 비롯한 G-CSF의 PEG화를 입증한다.
국제특허출원 공개 제WO 93/00109호는 3일 이상의 기간 동안 연속적이고 효과적인 혈장 GH 농도를 유지시키는 단계를 포함하는, 포유동물 또는 조류의 GH 반응 조직을 자극시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 혈장 농도를 달성하는 한 방법이 PEG(폴리에틸렌 글리콜)와 같은 거대분자 물질에 커플링된 GH를 사용하는 것이라고 기술되어 있다. 거대분자 물질과의 커플링은 반감기를 개선시킨다고 기술되 어 있다. 공지된 바와 같이(Knauf, M.J. et al, J. Biol. Chem. 263: 15064-15070, 1988) 신장 여과의 70K 분자량 컷-오프를 초과하는 유체역학적 부피를 달성하기 위해 mPEG 알데히드-5000 및 mPEG N-히드록시숙신이미딜 에스테르(mPEG-NHS-5000)가 사용된 PEG화 hGH는 국제특허출원 공개 제WO 93/00109호에 보고되어 있다. mPEG-NHS의 사용은 hGH의 다수의 PEG화 형태로 구성된 불균질한 혼합물을 초래한다. 또한, 국제특허출원 공개 제WO 93/00109호는 시스테인 hGH 변이체를 PEG화하기 위한 mPEG-말레이미드의 사용을 개시한다.
국제특허출원 공개 제WO 99/03887호는 PEG화되어 있는 시스테인 변이체 GH를 개시한다. BT-005로서 지칭되는 이 공액체는 GH 결핍 래트에서 체중 증가를 자극하는 데 보다 효과적이며 hGH보다 더 긴 수명을 가진 것으로 보고되어 있다.
카르복시메틸화 PEG의 숙신이미딜 에스테르를 사용하여 PEG화시킨 hGH는 문헌(Clark et al., Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996)에도 보고되어 있다. 이 문헌은 일차 아민에 선별적으로 공액첨가되는 mPEG-NHS-5000을 사용하여 크기를 증가시킨 hGH 유도체를 기술하고 있다. PEG 변형 수준의 증가는 그의 수용체에 대한 친화성을 감소시키고 세포-기재 분석에서 EC50을 1500배까지 증가시켰다. 문헌(Olson et al., Polymer Preprints 38: 568-569, 1997)은 다수의 PEG화 hGH 종을 달성하기 위한 N-히드록시숙신이미드(NHS) PEG 및 숙신이미딜 프로피오네이트(SPA) PEG의 사용을 개시한다.
국제특허출원 공개 제WO 94/20069호는 폐 전달 위한 제제의 일부로서의 PEG 화 hGH를 예상하고 있다고 개시한다.
미국 특허 제4,179,337호는 생리학적 활성 및 비-면역원성을 가진 수용성 폴리펩티드 공액체를 수득하기 위해 효소 및 호르몬을 PEG화시키는 방법을 개시한다. GH는 PEG화되는 호르몬의 한 예로서 언급되어 있다.
유럽 특허 제458064 A2호는 소마토트로핀에 도입된 또는 천연적으로 존재하는 시스테인 잔기의 PEG화를 개시한다. 유럽 특허 제458064 A2호는 야생형 소 소마토트로핀의 잔기 102-112에 위치하는 것으로 기재되어 있는 오메가 루프로 불리는 루프 내에 2개의 시스테인 잔기를 도입하는 것을 추가로 언급하며, 보다 구체적으로 유럽 특허 제458064 A2호는 소 소마토트로핀의 102번 및 112번 잔기를 각각 Ser에서 Cys으로, Tyr에서 Cys으로 치환시키는 것을 개시한다.
국제특허출원 공개 제WO 95/11987호는 모분자에 존재하거나 부위 지정 돌연변이유발에 의해 도입된 시스테인 잔기의 티올기에 PEG를 결합시키는 것을 제안한다. 국제특허출원 공개 제WO 95/11987호는 프로테아제 넥신-1의 PEG화에 관한 것이지만, hGH 및 다른 단백질의 일반적 PEG화 또한 제안되어 있다.
국제특허출원 공개 제WO 99/03887호는 예를 들면, 25번 위치에 있는 세린을 시스테인 잔기로 치환시키고 도입된 시스테인 잔기에 PEG를 결합시킴으로써 변형시킨 GH를 개시한다.
국제특허출원 공개 제WO 00/42175호는 PEG의 결합을 위한 유리 시스테인 잔기를 보유하는 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 국제특허출원 공개 제WO 00/42175호는 hGH의 뮤테인인 T3C, S144C 및 T148C, 및 이들의 시스테인 PEG화를 개시한다.
국제특허출원 공개 제WO 97/11178호(및 미국 특허 제5849535호, 제6004931호 및 제6022711호)는 hGH의 작용제 또는 길항제로서의 GH 변이체의 용도에 관한 것이다. 또한, 국제특허출원 공개 제WO 97/11178호는 라이신 PEG화 및 라이신의 도입 또는 치환(예를 들면, K168A 및 K172R)을 비롯한 hGH의 PEG화를 개시한다. 또한, 국제특허출원 공개 제WO 9711178호는 치환 G120K를 개시한다.
국제특허출원 공개 제WO 03/044056호는 라이신 분지쇄 40K PEG 알데히드 hGH 공액체를 비롯한 다양한 PEG화 hGH 종을 개시한다.
미국 특허출원 제2004/0127417호는 라이신 분지쇄 PEG 부티르알데히드 hGH 공액체를 개시한다.
국제특허출원 공개 제WO 04/46222호, 미국 특허출원 제2005/0058620호, 일본 특허출원 제08-059818호, 일본 특허출원 제11-228685호 및 일본 특허출원 제2000-001541호는 글리세롤 골격의 1번 위치에 있는 일차 탄소에서 반응성 기를 기지며 2번 및 3번 위치에서 폴리알킬렌 글리콜 쇄를 가진 폴리알킬렌 글리콜 유도체를 개시한다.
현재 rhGH는 장기간 동안 매일 투여되므로, 투여 빈도를 보다 낮추는 것이 매우 바람직할 것이다. 순환 반감기가 보다 더 긴 hGH 분자는 필요한 투여 횟수를 감소시키고 증강된 치료 효과를 수반하면서 보다 최적의 치료적 hGH 수준을 제공할 수 있다.
hGH의 PEG화를 비롯하여 오래 지속되는 형태의 hGH를 개발하기 위한 다수의 시도에도 불구하고, 실용적인 상품이 되기에 적합한 성질을 가진 PEG화 hGH 분자가 여전히 필요하다. 본 발명은 hGH의 N-말단 페닐알라닌에 주로 결합된 단일 PEG를 가진 PEG-hGH 공액체를 제공하는데, 이 공액체는 다른 PEG-hGH 공액체에 비해 이점을 제공한다. mPEG 알데히드-5000 또는 mPEG N-히드록시숙신이미딜 에스테르(mPEG-NHS-5000)를 사용하여 α-아미노 부위 또는 ε-아미노 부위(hGH에서의 N-말단 및 9개의 라이신)에서 다수의 저분자량(5 Kd) PEG를 결합시키는 방법이 국제특허출원 공개 제WO 93/00109호, 문헌(Clark et al., Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996), 및 문헌(Olson et al., Polymer Preprints 38: 568-569, 1997)에 기재되어 있다. 이 방법은 불균질한 집단을 초래한다. 예를 들면, 9개의 라이신을 가진 hGH는 10개의 PEG가 결합된 몇몇 분자, 9개의 PEG가 결합된 몇몇 분자, 8개의 PEG가 결합된 몇몇 분자, 7개의 PEG가 결합된 몇몇 분자, 6개의 PEG가 결합된 몇몇 분자, 5개의 PEG가 결합된 몇몇 분자, 4개의 PEG가 결합된 몇몇 분자, 3개의 PEG가 결합된 몇몇 분자, 2개의 PEG가 결합된 몇몇 분자, 1개의 PEG가 결합된 몇몇 분자 및 PEG가 결합되지 않은 몇몇 분자를 가질 수 있다. 여러 개의 PEG를 가진 분자들 중에서, PEG는 상이한 분자들 상의 동일한 위치에서 결합되어 있지 않을 수 있다. 불균질함을 초래하는 상기 방법은 치료제를 개발할 때 공액첨가, 정제 및 특징규명을 어렵고 비싸고 고도로 재현불가능하게 하는 단점이 된다. 또 다른 방법(국제특허출원 공개 제WO 00/42175호)은 PEG의 결합을 위한 유리 시스테인 잔기를 보유하는 hGH 변이체를 사용하는 것이다. 그러나, 이 방법은 비천연적 hGH 변이체를 초래하고, 일부 시스테인 또는 모든 시스테인에서 결합 된 PEG를 가진 불균질한 PEG화 생성물을 초래하는, 부정확하게 쌍을 이루는 이황화 결합을 가진 부정확하게 폴딩된 단백질을 생성시킬 수도 있다. 다수의 부위에서 결합된 다수의 PEG를 가진다는 것은 상이한 속도로 해리될 수 있는, PEG와 다양한 부위 사이의 보다 불안정한 결합을 가진 분자를 초래할 수 있다. 이는 생성물의 약동학을 정확하게 예측하기 어렵게 하여 부정확한 투약을 초래한다. 불균질한 생성물은 치료제에 대한 규제 승인을 얻는 데 있어서 원치않은 문제점을 부가하기도 한다.
따라서, 단일 부위에서 결합된 단일 PEG를 가진 PEG화 hGH 분자를 가지는 것이 바람직할 것이다. 본 발명은 다수의 방법으로 이 필요성을 해결한다.
도 1은 TSK G4000PWXL 컬럼 상에서의 정제된 단일-PEG화 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH 반응 생성물의 용출 프로필을 보여주는 크기 배제 HPLC 기록이다.
도 2는 hGH 및 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH의 트립신처리 맵(map) 분석의 HPLC 기록이다. 상부 패널은 hGH의 트립신처리 맵이다. 하부 패널은 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH의 트립신처리 맵이다. T1은 N-말단 트립신처리 단편이다.
도 3은 hGH(서열 번호 1)의 아미노산 서열을 보여준다.
도 4는 11일간의 래트 체중 증가 분석에서의 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데 히드 hGH의 효능을 보여준다. 4주 내지 5주 연령의 뇌하수체절제 암컷 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 래트를 할란 랩(Harlan Labs)으로부터 구입하였다. 동물 시설에 수용할 때, 상기 동물을 80℉의 일정한 실온에서 유지시켰다. 3일 동안의 환경적응 후, 상기 래트를 4일 내지 10일 동안 매일 체중을 측정하여 기초 성장 속도를 확립하였다. 그 다음, 0일부터 시작하여, 대조군 내의 래트(약 100 g)에게는 약 0.3 mg/kg hGH(▲) 또는 PBS 비히클(●)을 연속하여 11일 동안 매일 1회씩 피하 주사하였다. 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH 시험군(■)에게는 0일 및 6일에 1.8 mg/kg 단회 투여량의 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH를 투여하였다. 군당 6 마리 동물이 있었다. 작도된 값은 평균 체중 증가 ± SEM을 나타낸다.
도 5는 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH에 반응한 11일간의 경골 성장을 보여준다. 동물은 도 4에서 처리된 동물이었다. 11일이 되는 날 체중을 측정한 후 동물을 희생시키고, 좌측 경골에 대해 X-선 촬영을 하였으며, 칼리퍼(caliper)를 이용하여 골 길이를 측정하였다. 평균 길이 +/- SEM을 작도하였다. 별표는 대조군과의 유의한 차이를 표시한다(P<0.05). 군 당 6 마리의 동물이 있었다.
도 6은 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH에 대해 반응한 7일간의 혈중 우레아 질소 수준을 보여준다. 도 4에서 처리된 동물로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 혈청을 준비하고 우레아 질소 수준을 측정하였다. 평균 ± SEM을 작도하였다(군 당 6 마리의 동물). 별표는 대조군과의 유의한 차이를 표시한다(P<0.05).
도 7은 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH에 대한 6일간의 투여량 상승 효능 연구를 보여준다. 이 성장 연구는 다양한 단회 투여량의 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH가 0일에만 투여되었고 연구가 6일 동안 진행되었다는 점을 제외하고 도 4에 기재된 방식과 유사한 방식으로 수행하였다. 대조군에게는 연속하여 6일 동안 0.3 mg/kg hGH(◆) 또는 PBS 비히클(○)을 매일 1회씩 피하 주사하였다. 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH 시험군에게는 0일에 단회 투여량의 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH를 투여하였다. 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH 투여량은 1.8 mg/kg(■), 0.6 mg/kg(×), 0.2 mg/kg(+) 및 0.067 mg/kg(▲)이었다. 군 당 6 마리의 동물이 있었다.
도 8은 6일간의 효능 연구에 대한 혈청 IGF-1 수준을 보여준다. 동물은 도 7에 기재된 바와 같이 처리하였다. 혈액 샘플을 작도된 다양한 시점에서 채취하고 혈청 IGF-1 수준을 ELISA로 측정하였다. 군(n=6) 평균은 측정된 값에 대한 편차의 일원(one-way) 분석을 이용하여 IGF-1 반응을 산출하는 데 이용하였고, 일련의 1.8 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.2 mg/kg, 및 0.067 mg/kg 투약 각각에 대해 37,839, 28,1292, 22,958 및 20,040의 AUCdO-6(ng/㎖*24h) 값이 측정되었다.
도 9는 단회 투여량의 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH를 뇌하수체절제 래트에게 투여한 후의 PK/PD 평가치를 보여준다. 혈장 약물 수준(a) 또는 혈장 IGF-1 반응(b)에 대한 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH의 단회 1.8 mg/kg 피하 투여의 효과가 표시되어 있다.
본 발명은 감소된 제거율, 증가된 혈장 잔류 시간, 증가된 안정성, 개선된 가용성 및 감소된 항원성으로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는 1종 이상의 개선된 화학적 또는 생리학적 성질을 가질 수 있는, 글리세롤 분지쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기가 사용된 PEG화 hGH에 관한 것이다. 따라서, 보다 상세히 후술되는 바와 같이, 본 발명은 글리세롤 분지쇄 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기를 사용하여 hGH를 화학적으로 변형시키는 것에 관한 다수의 양태를 가진다.
또한, 본 발명은 a) 글리세롤 골격의 증가된 안정성, b) 증가된 수용체 결합, c) 감소된 비용, d) 결합의 증가된 N-말단 선별성, e) 증가된 가용성, f) 감소된 항원성, g) 공액체의 증가된 안정성, h) 증가된 제조용이성, 및 i) 감소된 단백질분해를 포함하나 이에 한정되지 않는, 라이신 기재의 분지쇄 PEG-hGH 공액체에 비해 1종 이상의 개선된 성질을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 PEG화 hGH를 제조하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 글리세롤 분지쇄 PEG를 사용하여 PEG화 hGH를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 PEG화 hGH를 단독으로 또는 또 다른 치료제와 함께 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 GH 치료가 유용한 장애 및/또는 질환의 예방 및/또는 치료에 있어서 단독으로 또는 또 다른 치료제와 함께 사용되는 본 발명의 PEG화 hGH의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 글리세롤 분지쇄 PEG-hGH 공액체에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 글리세롤 분지쇄 PEG 유도체는 알데히드 반응성 기, 및 경우에 따라 글리세롤 골격의 1번 위치에 있는 일차 탄소에 위치한 반응성 작용기와 PEG 사이의 링커(linker)를 가지며, 국제특허출원 공개 제WO 04/46222호 또는 미국 특허출원 제2005/0058620호에 기재된 바와 같이 hGH 공액체를 생성시키기 위해 2번 및 3번 위치에서 폴리알킬렌 글리콜 쇄를 가진다. 링커는 공유결합인 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 링커에는 알킬렌기; 및 에스터 결합, 우레탄 결합, 아미드 결합, 에테르 결합, 카르보네이트 결합 또는 4차 아미노기를 보유하는 알킬렌기가 포함된다. 바람직한 알킬렌기에는 메틸렌기, 에틸렌기, 트리메틸렌기, 프로필렌기, 이소프로필렌기, 테트라메틸렌기, 부틸렌기, 이소부틸렌기, 펜타메틸렌기 및 헥사메틸렌기가 포함된다.
본 발명의 특정 실시양태는 하기 화학식 I로 표시되는 PEG-hGH 공액체이다:
상기 식에서,
n은 60과 75 사이의 정수이고;
m은 450과 460 사이의 정수이며;
R은 hGH 폴리펩티드이다.
특정 실시양태에서, n은 약 64와 약 72 사이의 정수이다.
구체적 실시양태에서, (CH2CH2O)n 잔기는 약 2.6 Kd 내지 약 3.5 Kd의 평균 분자량을 가지며, 구체적으로 평균 분자량은 약 3 Kd이다.
구체적 실시양태에서, (CH2CH2O)m 잔기는 각각 약 17.6 Kd 내지 약 22 Kd의 평균 분자량을 가지며, 구체적으로 평균 분자량은 약 20 Kd이다.
특정 실시양태에서, (CH2CH2O)n 잔기는 약 3 Kd의 평균 분자량을 가지며, (CH2CH2O)m 잔기는 각각 약 20 Kd의 평균 분자량을 가진다.
PEG 잔기의 분자량과 관련되어 사용된 용어 "약"은 PEG의 제조에 있어서 일부 분자가 기재된 분자량보다 다소 더 많은 또는 다소 더 적은 분자량을 가질 것이고 기재된 분자량은 평균 분자량을 말하는 것임을 의미한다. 폴리(에틸렌 글리콜)과 같은 중합체와 관련된 약간의 다분산도가 있다는 것을 이해해야 한다. 다분산도가 낮은 PEG를 사용하는 것이 바람직하다. 특정 실시양태에서, 말단 중합체 히드록실 말단-기 중 하나가 전환되거나 메틸기로 캡핑된다. 본원에 사용된 용어 "mPEG"는 한 말단에서 메틸기에 의해 캡핑된 PEG를 말한다. mPEG는 화학식 CH3O-(CH2CH2O)n-H로서 표시될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인간 성장 호르몬 폴리펩티드", "hGH 폴리펩티드" 또는 "hGH 단백질"은 성장기에서 성장을 촉진하고 정상적 신체 조성, 동화작용 및 지질 대사를 유지함을 특징으로 하는 모든 hGH 폴리펩티드를 포괄한다. 바람직하게는, 용어 "hGH 폴리펩티드"는 서열 번호 1의 hGH 폴리펩티드를 말한다.
본 발명의 hGH 폴리펩티드는 임의의 적절한 방식으로 제조할 수 있다. 이러한 hGH 폴리펩티드 및 이의 단편은 당업자에게 공지된 기술을 이용하여 천연 공급원으로부터 정제하거나, 화학적으로 합성하거나, 시험관내 번역 기술 또는 hGH cDNA를 발현할 수 있는 재조합 세포에서의 발현을 비롯한 재조합 기술로 제조하거나, 또는 이들 방법을 병용하여 제조할 수 있다[예를 들면, 다양한 단백질 정제 방법에 대해서는 문헌(Methods in Enzymology, Academic Press, 1993)을; 단백질의 화학적 합성에 대해서는 문헌(Creighton, (1983) Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co. 2nd Ed., T. E., New York; and Hunkapiller et al., (1984) Nature. 310(5973): 105-11)을; 재조합 기술에 대해서는 문헌(Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, ed., Elsevier Press, NY)을 참조하고, 이들 문헌은 그 전체가 참고로 본원에 도입되어 있음]. 본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게는 단리된 형태로 제공되며, 부분적으로 또는 바람직하게는 실질적으로 정제될 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태는 PEG-hGH 공액체이고, 이때 80% 초과, 보다 바람직하게는 81%, 보다 바람직하게는 82%, 보다 바람직하게는 83%, 보다 바람직하게는 84%, 보다 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 86%, 보다 바람직하게는 87%, 보다 바람직하게는 88%, 보다 바람직하게는 89%, 보다 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 91%, 보다 바람직하게는 92%, 보다 바람직하게는 93%, 보다 바람직하게는 94%, 보다 바람직하게는 95%, 보다 바람직하게는 96%, 보다 바람직하게는 97%, 보다 바람직하게는 98%의 PEG가 서열 번호 1의 hGH의 아미노-말단 페닐알라닌에 공액 첨가되어 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 경우에 따라 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체 또는 보조제와 함께 N-말단 PEG화 hGH를 포함하는, 실질적으로 균질한 제제이고, 이 제제는 N-말단 외의 부위에서 PEG화되어 있는 hGH를 본질적으로 포함하지 않는다. 용어 "실질적으로 균질한 제제"는 80% 초과, 보다 바람직하게는 81%, 보다 바람직하게는 82%, 보다 바람직하게는 83%, 보다 바람직하게는 84%, 보다 바람직하게는 85%, 보다 바람직하게는 86%, 보다 바람직하게는 87%, 보다 바람직하게는 88%, 보다 바람직하게는 89%, 보다 바람직하게는 90%, 보다 바람직하게는 91%, 보다 바람직하게는 92%, 보다 바람직하게는 93%, 보다 바람직하게는 94%, 보다 바람직하게는 95%, 보다 바람직하게는 96%, 보다 바람직하게는 97%, 보다 바람직하게는 98%의 hGH가 단일-PEG화되어 있는 제제를 의미한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 문헌(Chamow et al., Bioconjugate Chem. 5: 133-140 (1994)), 미국 특허 제4,002,531호, 국제특허출원 공개 제WO 90/05534호 및 미국 특허 제5,824,784호에 기재된 바와 같이, 적절한 환원제 예를 들면, NaCNBH3, NaBH3, 피리딘 보란 등이 사용된 환원성 알킬화에 의해 hGH 폴리펩티드의 N-말단 일차 α-아미노기와 글리세롤 분지쇄 PEG 알데히드 사이에 2차 아민 결합이 형성된다. 글리세롤 분지쇄 PEG 알데히드를 hGH 폴리펩티드와 인큐베이션함으로써 쉬프(Schiff) 염기 형성을 통해 PEG 잔기가 아미노기에 부가되게 한다. 이 결합은 환원제가 사용된 환원에 의해 안정한 2차 아민으로 전환된다. 환원성 알킬화 공정 은 하기 반응식에 도시되어 있다[문헌(Chamow et al.) 출처].
"PEG화 반응"으로 불리는 공액첨가 반응은 중합체가 단백질에 부착되는 위치와 관계없이 몰 과다량의 중합체를 포함하는 용액 중에서 수행하여 왔다. 그러나, 이 일반적인 기술은 충분한 생물활성을 보유하면서 생물활성 단백질을 비-항원성 중합체에 공액첨가시키는 데 부적합한 것으로 입증되어 있다. hGH 생물활성을 유지하는 한 방법은 중합체 커플링 공정에서 수용체 결합 부위(들)와 관련된 hGH 반응성 기의 공액첨가를 실질적으로 피하는 것이다. 본 발명의 또 다른 양태는 보유된 활성을 고도로 유지하면서 폴리(에틸렌 글리콜)을 hGH에 공액첨가시키는 방법을 제공하는 것이다.
공유 결합을 통한 화학적 변형은 생물학적 활성 물질과 활성화된 폴리(에틸렌 글리콜)의 반응에서 일반적으로 이용되는 임의의 적합한 조건 하에서 수행될 수 있다. 공액첨가 반응을 비교적 순한 조건 하에 수행하여 hGH의 불활성화를 피한다. 순한 조건은 반응 용액의 pH를 3 내지 10으로 유지하고 반응 온도를 약 0℃ 내지 37℃ 내로 유지하는 것을 포함한다. hGH 내의 반응성 아미노산 잔기가 유리 아미노기를 가진 경우, 바람직하게는 상기 변형은 4℃ 내지 37℃에서 인산염, MES, 구연산염, 아세트산염, 숙신산염 또는 HEPES를 비롯한 적절한 완충제(pH 4 내지 10)의 비-제한적 목록 중에서 1-48시간 동안 수행된다. PEG 알데히드와 같은 시약으로 N-말단 아미노기를 표적화하는 데 있어서, 바람직하게는 pH 4 내지 8을 유지한다. 활성화된 폴리(에틸렌 글리콜)은 hGH의 유리 아미노기 수의 몰량의 약 0.01배 내지 100배, 바람직하게는 약 0.01배 내지 2.5배로 사용될 수 있다.
본원에 기재된 반응 조건이 상당량의 비변형 hGH를 초래할 수 있다 하더라도, 비변형 hGH는 추가 공액첨가 반응을 위한 장래의 회분(batch)에서 용이하게 재활용될 수 있다. 본 발명의 방법은 놀라울 정도로 매우 적은 즉, 약 20% 미만, 보다 바람직하게는 약 10% 미만의 고분자량 종, 및 hGH 당 1개 초과의 중합체 가닥을 보유하는 종을 생성시킨다. 이 반응 조건은 활성화된 중합체가 표적에 대해 수배 몰 초과량으로 존재하는 중합체 공액첨가 반응에 전형적으로 사용되는 반응 조건과 대조된다.
본 발명의 공액첨가 반응은 초기에는 단일-PEG화 hGH 공액체, 미반응 hGH, 미반응 중합체 및 약 20% 미만의 고분자량 종을 함유하는 반응 혼합물 또는 풀(pool)을 제공한다. 고분자량 종에는 1개 초과의 중합체 가닥 및/또는 중합된 PEG-hGH 종을 보유하는 공액체가 포함된다. 미반응 종 및 고분자량 종이 제거된 후, 주로 단일-PEG화 hGH 공액체를 함유하는 조성물이 회수된다. 대부분의 공액체가 단일 중합체 가닥을 포함한다고 가정하면, 공액체는 실질적으로 균질하다. 이 변형 hGH는 표준 FDC-P1 세포 증식 분석(Clark et al. Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996), 수용체 결합 분석(미국 특허 제5,057,417호) 또는 뇌하수체가 절제된 래트 성장(Clark et al. Journal of Biological Chemistry 271: 21969-21977, 1996)을 이용하여 측정한 바와 같이 천연 또는 비변형 hGH와 관련된 시험관내 생물학적 활성을 약 0.1% 이상 가진다. 그러나, 본 발명의 바람직한 양태에서, 변형 hGH는 약 25%의 시험관내 생물학적 활성을 가지며, 보다 바람직하게는 변형 hGH는 약 50%의 시험관내 생물학적 활성을 가지고, 보다 바람직하게는 변형 hGH는 약 75%의 시험관내 생물학적 활성을 가지며, 가장 바람직하게는 변형 hGH는 동등한 또는 개선된 시험관내 생물학적 활성을 가진다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 다소 한정된 비율의 중합체 대 hGH를 포함한다. 따라서, hGH 공액체는 한 가닥의 중합체만을 보유하는 종으로만 주로 한정된다는 것이 밝혀졌다. 더욱이, 중합체 대 hGH 반응성 기의 결합은 보다 높은 몰 초과량의 중합체 링커가 사용된 경우보다 실질적으로 덜 무작위적이다. 공액첨가 반응이 켄칭된 후, 반응 풀에 존재하는 비변형 hGH는 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 또는 유사한 분리 기술을 이용하여 장래 반응에서 재활용할 수 있다.
폴리(에틸렌 글리콜)-변형 hGH는 단백질의 정제를 위해 이용되는 통상의 방법 예컨대, 투석, 염석(salting-out), 한외여과, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC), 겔 크로마토그래피 또는 전기영동으로 반응 혼합물로부터 정제할 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피는 미반응 폴리(에틸렌 글리콜) 및 hGH를 제거하는 데 특히 효과적이다. 본 발명의 추가 실시양태에서, 모 노-PEG화 hGH 종을 반응 혼합물로부터 단리하여 고분자량 종 및 비변형 hGH를 제거한다. 분리는 약 0.5-10 mg/㎖의 중합체-hGH 공액체를 함유하는 완충제 용액 중에 혼합된 종을 배치함으로써 수행한다. 적합한 완충제 용액의 pH는 약 4 내지 약 10이다. 상기 용액은 바람직하게는 KCl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4, CH3CO2H 및 NaOH로부터 선택된 1종 이상의 완충제 염을 함유한다.
반응 완충제에 따라, 중합체-hGH 공액체 용액을 먼저 완충제 교환/한외여과로 처리하여 임의의 미반응 중합체를 제거해야 할 수 있다. 예를 들면, PEG-hGH 공액체 용액을 저분자량 컷-오프(10,000 달톤 내지 30,000 달톤) 막을 통해 한외여과시켜, 존재하는 경우 대부분의 원치않는 물질 예컨대, 미반응 중합체, 계면활성제 등을 제거할 수 있다.
원하는 종을 함유하는 풀 내로 공액체를 분획화는 것은 바람직하게는 이온 교환 크로마토그래피 매질을 사용하여 수행한다. 이러한 매질은 다소 예측가능한 방식으로 변화되는 전하의 차이를 통해 PEG-hGH 공액체에 선별적으로 결합할 수 있다. 예를 들면, hGH의 표면 전하는 단백질의 표면 상의 이용가능한 하전된 기의 수에 의해 결정된다. 이 하전된 기는 전형적으로 폴리(알킬렌 옥사이드) 중합체의 잠재적 결합 지점으로서 작용한다. 그러므로, hGH 공액체는 다른 종과는 상이한 전하를 가져 선별적인 분리를 허용할 것이다.
강한 극성의 음이온 또는 양이온 교환 수지 예컨대, 4차 아민 또는 술포프로필 수지 각각을 본 발명의 방법에 사용할 수 있다. 음이온 교환 수지가 특히 바람 직하다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 시판되는 양이온 교환 수지를 포함하는 비-제한적 목록은 SP-히트랩(hitrap)®, SP 세파로스(Sepharose) HP® 및 SP 세파로스® 패스트 플로우(fast flow)이다. 다른 적합한 양이온 교환 수지 예를 들면, S 및 CM 수지도 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 시판되는 음이온 교환 수지를 포함하는 음이온 교환 수지의 비-제한적 목록은 Q-히트랩®, Q 세파로스 HP® 및 Q 세파로스® 패스트 플로우이다. 다른 적합한 음이온 교환 수지 예를 들면, DEAE 수지도 사용할 수 있다.
예를 들면, 음이온 또는 양이온 교환 수지를 컬럼 내에 팩킹하고 바람직하게는 통상의 수단으로 평형화시킨다. 중합체와 공액첨가된 hGH 함유 용액과 동일한 pH 및 삼투압을 가진 완충제를 사용한다. 용출 완충제는 바람직하게는 KCl, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3, NaBO4 및 (NH4)2CO3으로부터 선택된 1종 이상의 염을 함유한다. 그 다음, 공액체-함유 용액을 미반응 중합체 및 일부 고분자량 종을 보유하지 않은 컬럼 상에 흡착시킨다. 로딩(loading)을 완료한 후, 증가하는 염 농도를 가진 용출 완충제의 구배 흐름을 상기 컬럼에 적용하여, 폴리알킬렌 옥사이드와 공액첨가된 hGH를 함유하는 원하는 분획을 용출한다. 양이온 또는 음이온 교환 분리 단계 후, 모아진 용출된 분획은 바람직하게는 균일한 중합체 공액체로 한정된다. 그 후, 공액첨가되지 않은 임의의 hGH 종을 통상의 기술로 컬럼으로부터 다시 세척해낼 수 있다. 필요하다면, 추가 이온 교환 크로마토그래피 또 는 크기 배제 크로마토그래피를 통해 단일-PEG화 hGH 종과 다중-PEG화 hGH 종을 서로로부터 더 분리할 수 있다.
염 농도 또는 pH가 증가되는 다수의 등용매 단계를 이용하는 기법 또한 이용할 수 있다. 농도가 증가되는 다수의 등용매 용출 단계는 이-hGH-중합체 공액체에 이어서 단일-hGH-중합체 공액체를 순차적으로 용출시킬 것이다.
용출을 위한 온도 범위는 약 4℃ 내지 약 25℃이다. 바람직하게는, 용출은 약 4℃ 내지 약 22℃의 온도에서 수행한다. 예를 들면, PEG-hGH 분획의 용출은 280 nm에서의 UV 흡광도로 검출한다. 분획 수거는 단순한 시간 용출 프로필을 통해 달성할 수 있다.
폴리(에틸렌 글리콜) 중합체를 hGH 잔기에 공액첨가시키는 공정에서 계면활성제를 사용할 수 있다. 적합한 계면활성제에는 소듐 도데실 술페이트(SDS)와 같은 이온성-유형 물질이 포함된다. 리튬 도데실 술페이트, 4차 암모늄 화합물, 타우로콜산, 카프릴산, 데칸 술폰산 등과 같은 다른 이온성 계면활성제 또한 사용할 수 있다. 비-이온성 계면활성제도 사용할 수 있다. 예를 들면, 폴리(옥시에틸렌) 소르비탄(트윈), 폴리(옥시에틸렌) 에테르(트리톤)와 같은 물질을 사용할 수 있다. 문헌(Neugebauer, A Guide to the Properties and Uses of Detergents in Biology and Biochemistry (1992) Calbiochem Corp.) 또한 참조할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 계면활성제에 대한 유일한 제한은 이들이 hGH의 실질적인 비가역적 변성을 초래하지 않고 중합체 공액첨가를 완전히 억제하지 않는 조건 및 농도 하에서 사용되어야 한다는 점이다. 계면활성제는 약 0.01% 내지 0.5%, 바람직하게는 0.05% 내지 0.5%, 가장 바람직하게는 약 0.075% 내지 0.25%의 양으로 반응 혼합물에 존재한다. 계면활성제의 혼합물 또한 고려된다.
계면활성제가 중합체 공액첨가 공정 동안 일시적이고 가역적인 보호 시스템을 제공하는 것으로 생각된다. 계면활성제는 라이신-기재 또는 아미노 말단-기재의 공액첨가가 진행되게 하면서 중합체 공액첨가를 선별적으로 방해하는 데 효과적인 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 폴리(에틸렌 글리콜)-변형 hGH는 이의 연장된 생체내 반감기에 기인할 수 있는 더 오래 지속되는 약리학적 효과를 가진다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 치료 유효량의 본 발명의 폴리(에틸렌 글리콜)-변형 hGH 또는 이의 작용제 변이체를 단독으로 또는 또 다른 치료제와 함께 GH, 바람직하게는 hGH의 사용이 유리한 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료가 필요한 환자에게 투여함을 포함하는, 상기 질환 또는 장애를 예방하고/하거나 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 GH, 바람직하게는 hGH의 사용이 유리한 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 폴리(에틸렌 글리콜)-변형 hGH 또는 이의 작용제 변이체의 용도에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 GH, 바람직하게는 hGH의 사용이 유리한 질환 또는 장애의 예방 및/또는 치료를 위한, 본 발명의 폴리(에틸렌 글리콜)-변형 hGH 또는 이의 작용제 변이체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이기도 하다.
GH의 사용이 유리한 질환 또는 장애에는 성장 호르몬 결핍증(GHD), 성인 성장 호르몬 결핍증(aGHD), 터너 증후군, 임신기간 동안 작게 태어난 어린이에서의 성장 부전, 프라더-윌리 증후군(PWS), 만성 신부전증(CRI), AIDS 소모, 노화, 말기 신부전증, 낭성 섬유증, 발기부전, HIV 지방이상증, 섬유근육통, 골다공증, 기억 장애, 우울증, 크론병, 골격 형성이상, 외상성 뇌손상, 거미막하 출혈, 누난 증후군(Noonan's syndrome), 다운 증후군, 특발성 단신(ISS), 말기 신질환(ESRD), 초저체중출생(VLBW), 골수 줄기세포 구조(Bone marrow stem cell rescue), 대사 증후군, 글루코코르티코이드 근육병증, 어린이에서의 글루코코르티코이드 치료로 인한 단신, 및 단신 미성숙 어린이를 위한 성장 따라잡기의 실패가 포함되나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 보다 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 폴리(에틸렌 글리콜)-변형 hGH 또는 이의 작용제 변이체는 GHD, aGHD, SGA, PWS, 터너 증후군 및 CRI로 구성된 군으로부터 선택된 장애 또는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용된다.
본 발명의 또 다른 보다 구체적인 실시양태에서, 본 발명의 폴리(에틸렌 글리콜)-변형 hGH 또는 이의 작용제 변이체는 특발성 단신, 초저체중출생, 외상성 뇌손상, 대사 증후군 및 누난 증후군으로 구성된 군으로부터 선택된 장애 또는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용된다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 단독으로 또는 또 다른 치료제와 함께 본 발명의 폴리(에틸렌 글리콜)-변형 hGH 및 1종 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 그 다음, 본 발명의 폴리(에틸렌 글리콜)-변형 hGH는 약학적으로 허용가능한 희석제, 등장액의 제조를 위한 물질, pH-조절제 등 또한 함유하는 약제로 제제화되어 환자에게 투여될 수 있다.
상기 약제는 치료 목적에 따라 피하, 근육내, 정맥내, 폐, 피내 또는 경구 투여될 수 있다. 투여량은 치료할 환자의 장애의 종류 및 상태를 기초로 할 수도 있고, 주사 투여하는 경우에는 정상적으로 0.1 mg 내지 5 mg이고, 성인에게 경구 투여하는 경우에는 0.1 mg 내지 50 mg이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 폴리(에틸렌 글리콜)-변형 hGH 또는 작용제 변이체는 또 다른 치료제와 함께 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 화합물 A 및 1종 이상의 다른 치료제를 언급하면서 사용되는 용어 "동시-투여", "동시-투여된" 및 "함께"는 하기와 같이 투여함을 의미하고 언급하며 포함한다:
○ 화합물 A 및 치료제(들)가 치료를 필요로 하는 환자에게 실질적으로 동시에 방출되는 단일 투약형으로 함께 제제화한 경우, 화합물 A와 치료제(들)의 조합물을 치료를 필요로 하는 환자에게 동시 투여함;
○ 화합물 A 및 치료제(들)가 치료를 필요로 하는 환자에 의해 실질적으로 동시에 섭취되는 별도의 투약형으로 서로 분리되어 제제화됨으로써 치료를 필요로 하는 환자에게 실질적으로 동시에 방출되는 경우, 화합물 A와 치료제(들)의 조합물을 치료를 필요로 하는 환자에게 실질적으로 동시에 투여함;
○ 화합물 A 및 치료제(들)가 치료를 필요로 하는 환자에 의해 각 투여 사이의 상당한 시간 간격을 두고 연속적으로 섭취되는 별도의 투약형으로 서로 분리되어 제제화됨으로써 치료를 필요로 하는 환자에게 실질적으로 상이한 시간에 방출되는 경우, 화합물 A와 치료제(들)의 조합물을 치료를 필요로 하는 환자에게 연속 적으로 투여함; 및
○ 화합물 A 및 치료제(들)가 조절된 방식으로 방출되는 단일 투약형으로 함께 제제화됨으로써 치료를 필요로 하는 환자에 의해 동시에 및/또는 상이한 시점에 동시적으로, 연속적으로 및/또는 중첩적으로 투여되는 경우, 화합물 A와 치료제(들)의 조합물을 치료를 필요로 하는 환자에게 순차적으로 투여함.
화합물 A, 이의 약학적으로 허용가능한 염 및/또는 이의 유도체와 함께 사용될 수 있는 다른 치료제의 적합한 예에는 아로마타제 억제제 예컨대, 엑세메스탄, 포르메스탄, 아타메스탄, 파드로졸, 레트로졸, 보로졸 및 아나스트로졸; 피브린산 유도체(예컨대, 페노피브레이트, 클로피브레이트, 젬피브로질, 벤자피브레이트 및 시프로피브레이트) 및 니코틴산 유도체 예컨대, 아시피목스를 비롯한 유리 지방산 조절제; 메트포민과 같은 비구아나이드, PPAR 감마 인슐린 감작제, 및 티아졸로데니온 예컨대, 트로글리타존 및 로시글리타존, 트로글리타존, 5-[[4-[3,4-디히드로-6-히드록시-2,5,7,8-테트라메틸-2H-]-벤조피란-2-일)메톡시]페닐]메틸3-2,4-티아졸리딘디온 V411(DIABII, 글로우카닌) 피오글리타존(ACTOS, AD 4833, U 72107, U 72107A, U 72107E, ZACTOS) 화학명: 2,4-티아졸리딘디온, 5-[[4-[2-(5-에틸-2-피리디닐)에톡시]페닐]메틸]-, 모노히드로클로라이드, (a/-)를 포함하나 이에 한정되지 않는 인슐린 감작제; 로시글리타존(Avandia, BRL 49653, BRL 49653C) 화학명: 2,4-티아졸리딘디온, 5-[[4-[2-(메틸-2-피리디닐아르니노)에톡시]페닐]메틸]; 25 벡사로텐-경구(LGD 1069 경구, 타르그레틴(Targretine) 경구, 타르그레틴, 타르그레틴(Targretyn) 경구, 타르그렉신(targrexine) 경구) 화학명: 4-[1-(3,5,5,8,8-펜타 메틸-5,6,7,8-테트라히드로-2-나프틸)에테닐]벤조산; ZD 2079, (ICI D 2079)(화학명: R)-N-[2-4-(카르복시메틸) 30 페녹시]에틸)-N-(2-히드록시-2-페네틸) 암모늄 클로라이드: 네토글리타존, (이사글리타존, MCC 555, RWJ 241947)(화학명: 5-[6-(2-플루오로벤질옥시)나프탈렌-2-일메틸]티아졸리딘-2,4-디온); INS (D-키로-이노시톨)(화학명: D-1,2,3,4,5,6-헥사히드록시시클로헥산), ON 2344(DRF 2593); 덱슬리포탐, 화학명: 5(R)-(1,2-디티올란-3-일) 펜탈로 35 산; HQL 975, 화학명: 3-[4-[2-(5-메틸-2-페닐옥사졸-4-일)에톡시]페닐]-2(S)-(프로필아미노)프로피온산; YM 268, 화학명: 5,5'-메틸렌-비스(1,4-페닐렌)비스메틸렌비스(티아졸리딘-2,4-디온)이 포함되나 결코 이에 한정되지 않는다. 개발 중인 I PPAR 작용제에는 레글리타자(JTT 501 , PNU 182716, PNU 716)(화학명: 이속사졸리디엔-3,5-디온, 1,4-[[4-(2-페닐-5-메틸-1,3-옥사졸릴]에톡시페닐-4-]메틸-, (4RS)); I(RP 297, 화학명: 10,5-(2,4-디옥소티아졸리딘-5-일메틸)-2-메톡시-N-[4-(트리플루오로메틸)벤질벤즈아미드; R 119702(Cl 1037, CS 011) 화학명: (/-)-5-[4-(5-메톡시-1H-벤즈이미다졸-2-일메톡시)벤질]티아졸린-2,4-디온 히드로클로라이드; 15 DRF 2189, 화학명: 5-[[4-[2-(1-인돌릴)에톡시]페닐]메틸]티아졸리딘-2,4-디온; 코르티졸 합성 억제제 예컨대, 케토코나졸, 에코나졸 및 마이코나졸; GH 예컨대, 소마트로핀 또는 소마토노름 및 이의 유도체 예컨대, hGH 융합 단백질 예들 들면, ALBUTROPIN; PEG-GH 예컨대, 시스테인-PEG화 GH, BT 005(Bolder BioTechnology Inc.); GH 분비촉진제 예를 들면, SM 130686(Sumitomo), 카프로모렐린(Pfizer), 메카세르민(Fujisawa), 세르모렐린(Salk Institute, Bio-Technology General), 소마트렘, 소마토메딘(C Llorente; Pharmacia Corporation), 엑사모렐린, 타비모렐린; CP 464709(Pfizer), LY 426410 및 LY 444711(Lilly); 국제특허출원 공개 제WO 2002/057241호에 개시된 8-(아미노알콕시이미노)-8H-디벤조[a,e]트리아졸로[4.5-c]시클로헵텐, 국제특허출원 공개 제WO 2002/056873호에 개시된 2-치환 디벤조[a,e]1,2,3-트리아졸로[4,5-c][7]애눌렌-8-온; 미국 특허 제4,411,890호, 및 국제특허출원 공개 제WO 89/07110호 및 제WO 89/07111호에 개시된 GH 방출 펩티드 GHRP-6 및 GHRP-1; 국제특허출원 공개 제WO 93/04081호에 개시된 B-HT920, 헥사렐린 및 GHRP-2 또는 GH 방출 호르몬(GHRH, GRF로도 지칭됨) 및 이의 동족체; IGF-1 및 IGF-2를 비롯한 소마토메딘 및 이들의 유도체 예컨대, 소마토킨 - 인슐린-유사 성장 인자-1과 이의 결합 단백질의 재조합 융합체, BP-3, 알파-2-아드레날린성 작용제 예컨대, 클로니딘, 크실라진, 데토미딘 및 메토토미딘 또는 세로토닌 5HTID 작용제 예컨대, 소르니트립탄, 또는 소마토스타틴을 억제하거나 이의 방출을 억제하는 물질 예컨대, 피소스티그민 및 피리도스티그민, ThGRF 1-44 (Theratechnologies); L 165166(Merck & Company); 국제특허출원 공개 제WO 98/58947호에 개시된 디펩티드 유도체; 미국 특허 제652164호, 및 국제특허출원 공개 제WO 95/15309호 및 제WO 98/19998호에 개시된 아미노-아실피롤리딘 니트릴과 같은 디펩티딜 펩티다제 IV의 억제제; 미국 특허출원 제20030100563호 및 국제특허출원 공개 제WO 2003/082817호에 개시된 것과 같은 베타-아미노 헤테로환 디펩티딜 펩티다제 억제제, 미국 특허출원 제20030055261호 및 제20030040483호, 유럽 특허 제18072호 및 제83864호, 국제특허출원 공개 제WO 89/07110호, 제WO 89/01711호, 제WO 89/10933호, 제WO 88/9780호, 제WO 83/02272 호, 제WO 91/18016호, 제WO 92/01711호, 제WO 93/04081호 및 제WO 9514666호, 유럽 특허 제0923539호, 미국 특허 제5,206,235호, 제5,283,241호, 제5,284,841호, 제5,310,737호, 제5,317,017호, 제5,374,721호, 제5,430,144호, 제5,434,261호, 제5,438,136호, 제5,494,919호, 제5,494,920호, 제5,492,916호, 제5,536,716호 및 제5,578,593호, 및 국제특허출원 제WO 94/13696호, 제WO 94/19367호, 제WO 95/03289호, 제WO 95/03290호, 제WO 95/09633호, 제WO 95/11029호, 제WO 95/12598호, 제WO 95/13069호, 제WO 95/14666호, 제WO 95/16675호, 제WO 95/16692호, 제WO 95/17422호, 제WO 95/17423호, 제WO 95/34311호 및 제WO 96/02530호에 개시된 GH 방출 화합물; 미국 특허 제5804578호 및 제5783582호, 및 국제특허출원 공개 제WO 04/007468호에 개시된 피페리딘, 피롤리딘 및 헥사히드로-1H-아제핀; 국제특허출원 공개 제WO 01/04119호에 개시된 것과 같은 아미도 스피로피페리딘; 미국 특허 제6329383호 개시된 2-[(5,6-디메틸-2-벤조이미다졸릴)아미노]-4-히드록시-6-메틸-5-피리미딘 아세트산(2) 및 2-[(5,6-디메틸-2-벤조이미다졸릴)아미노]-4-히드록시-6-메틸-5-피리미딘 아세트산, 에틸 에스테르를 포함하는 2-아미노-5-피리미딘 아세트산 화합물; 유럽 특허 제1155014호에 개시된 벤즈이미다졸; 미국 특허 제4,411,890호의 GRF 및 펩티드와 관련된 동족 펩티드 화합물; 국제특허출원 공개 제WO 01/70228호, 제WO 01/70227호, 제WO 01/70228호, 제WO 00/69433호, 제WO 00/04013호, 제W0 99/5156호, 제WO 99/51595호, 제WO 99/51231-4호, 제WO 99/41251-2호, 제WO 99/21557호 및 제WO 99/21553호에 개시된 것과 같은 고나도트로핀 방출 호르몬의 길항제; 및 국제특허출원 공개 제WO 00/53602호, 제WO 00/53185호, 제WO 00/53181 호, 제WO 00/53180호, 제WO 00/53179호, 제WO 00/53178호 및 미국 특허 제6288078호에 개된 6-아자인돌 화합물; IGF-1 분비촉진제; 인슐린-유사 성장 인자-2-(IGF-2 또는 소마토메딘 A) 및 IGF-2 분비촉진제; 미요스타틴 길항제; 및 섬유아세포 성장 인자 수용체-3(FGFR-3) 티로신 키나제를 억제하는 화합물이 포함된다.
포함되는 중합체 물질 또한 바람직하게는 실온에서 수용성을 나타낸다. 이러한 중합체의 비-제한적 목록에는 폴리(알킬렌 옥사이드) 단일중합체 예컨대, 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 폴리(프로필렌 글리콜), 폴리(옥시에틸렌화 폴리올), 이의 공중합체 및 블록 공중합체가 포함되되, 블록 공중합체의 수용성은 유지되어야 한다.
PEG-기재 중합체에 대한 대안으로서, 효과적으로 비-항원성을 나타내는 물질 예컨대, 덱스트란, 폴리(비닐 피롤리돈), 폴리(아크릴아미드), 폴리(비닐 알코올), 탄수화물-기재 중합체 등을 사용할 수 있다. 실제로, 이들 중합체 물질들의 α-말단기 및 ε-말단기의 활성화는 폴리(알킬렌 옥사이드)를 전환시키는 데 이용되는 방식과 유사한 방식으로 수행할 수 있고, 따라서 통상의 기술을 가진 자에게 자명할 것이다. 당업자는 상기 목록이 단지 예시적이며 본원에 기재된 질을 가진 모든 중합체 물질이 고려될 수 있음을 인식할 것이다. 본 발명의 목적을 위해, "효과적으로 비-항원성을 나타내는 물질"은 포유동물에서 무독성이면서 감지가능한 면역원성 반응을 이끌어내지 않는 것으로서 당분야에 인식되어 있는 모든 물질을 의미한다.
정의
하기 정의는 본원에서 상호교환가능하게 사용된 약어 및 상응하는 의미의 목록이다:
- g 그램
- mg 밀리그램
- ㎖ 또는 mL 밀리리터
- RT 실온
- PEG 폴리(에틸렌 글리콜)
본원에서 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원의 전체 내용은 각 개별 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 도입되어 있는 것으로 기재된 것처럼 본원에 참고로 도입되어 있다.
상기 본 발명은 명확한 이해를 위해 설명 및 예시의 방법으로 다소 상세하게 기재되어 있다 하더라도, 본 발명의 기술적 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경 및 변형을 가할 수 있다는 것은 본 발명의 교시에 비추어 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 하기 실시예는 단지 예시적 목적으로 제공된 것이지 상기 넓은 의미의 용어로 기재된 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
하기 실시예에서, hGH는 서열 번호 1의 hGH이다. 다른 hGH 폴리펩티드가 후술된 실시예에서 예시된 바와 유사한 방식으로 PEG화될 수도 있음을 이해할 것이다.
실시예
1
글리세롤
분지쇄
43K
PEG
알데히드
hGH
상기 식에서,
(CH2CH2O)n은 약 3 Kd의 평균 분자량을 가지며, (CH2CH2O)m은 각각 약 20 Kd의 평균 분자량을 가진다(GL3-400AL2).
본 실시예는 환원성 알킬화에 의한 N-말단 모노-PEG화 hGH의 생성을 입증한다. N-말단에 있는 일차 아민의 상대적 pKa 값 대 라이신 잔기의 ε-아미노 위치에 있는 일차 아민의 상대적 pKa 값의 차이점을 이용함으로써 환원성 알킬화를 통해 약 43,000 MW의 글리세롤 분지쇄 PEG 알데히드 시약(GL3-400AL2, NOF corporation)을 hGH의 N-말단에 커플링시켰다. 상대적 PEG:hGH 몰비가 1.5:1, 2:1, 3.4:1, 4:1 또는 5:1이 되도록 상기 시약을 첨가함으로써 pH 5.8의 25 mM MES(Sigma Chemical, St. Louis, MO) 또는 pH 7.0의 20 mM HEPES에 4 mg/㎖, 7 mg/㎖ 또는 10 mg/㎖의 양으로 용해된 hGH 단백질을 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드와 반응시켰다. 피리딘 보란(Sigma Chemical, St. Louis, MO)을 10 mM의 최종 농도까지 첨가하여 반 응을 촉진시켰다. 반응은 4℃에서 16시간 내지 87시간 동안 암실에서 수행하였다. 정제에 적절한 완충제로 희석함으로써 반응을 중지시켰다.
표 1은 다중-PEG화 종, 단일-PEG화 공액체 및 미반응 hGH의 비율, 및 5.8의 pH 및 1.5:1:1 몰비에서 63시간 동안 반응시킨 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH에 대한 최종 정제 수율을 보여준다.
실시예
2
PEG
화
hGH
의 정제
단일 이온 교환 크로마토그래피 단계를 이용하여 반응 혼합물로부터 PEG화 hGH 종을 95%를 초과하는 정도까지 정제하였다(SEC 분석, 도 1).
음이온 교환 크로마토그래피
단일 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 이용하여 반응 혼합물로부터 PEG화 hGH 종을 95%를 초과하는 정도까지 정제하였다(SEC 분석, 도 1). 음이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 단일-PEG화 hGH를 비변형 hGH 및 다중-PEG화 hGH 종으로부터 정제하였다. 상술한 바와 같이 전형적인 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH 반응 혼합물(80 mg 또는 1500 mg의 단백질)은 pH 7.3의 25 mM HEPES(완충제 A)로 평형화시킨 Q-세파로스 히트랩 컬럼(5 ㎖)(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 또는 Q-세파로스 컬럼(26/20, 70 ㎖ 층 부피)(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) 상에서 정제하였다. 반응 혼합물을 완충제 A로 7X 희석하고 2.5 ㎖/분의 유속으로 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 3 컬럼 부피 내지 10 컬럼 부피의 완충제 A로 세척하였다. 그 후, 20 컬럼 부피의 완충제 A 및 0 mM 내지 100 mM의 직선형 NaCl 구배를 사용하여 컬럼으로부터 다양한 hGH 종을 용출하였다. 용출물을 280 nm에서의 흡광도(A280)로 모니터링하고 적절한 크기의 분획을 모았다. PEG화의 정도 예를 들면, 단일-PEG화, 이-PEG화, 삼-PEG화 등에 대해 분획을 모았다(실시예 3에서 평가됨). 그 다음, 풀을 센트리프렙(Centriprep) YM10 농축기(Amicon, Technology Corporation, Northborough, MA)에서 또는 정용여과로 0.5 mg/㎖ 내지 5 mg/㎖까지 농축시켰다. 풀의 단백질 농도는 0.78의 소광 계수를 이용하여 A280으로 측정하였다.
실시예
3
생화학적 특징규명
정제된 PEG화 hGH 풀을 비-환원 SDS-PAGE, 비-변성 크기 배제 크로마토그래피, 및 펩티드 맵핑으로 특징규명하였다.
크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(
SEC
-
HPLC
)
글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드와 hGH의 반응 혼합물을, 음이온 교환 정제 풀 및 최종 정제 생성물을 비-변성 SEC-HPLC로 평가하였다. 분석적 비-변성 SEC-HPLC는 0.5 ㎖/분 유속의 20 mM 인산염 pH 7.2, 150 mM NaCl 중의 컬럼 TSK G4000PWXL(Tosohaas) 또는 쇼덱스(Shodex) KW-804(Waters Corp)(경우에 따라 수퍼덱스(Superdex) 200 7.8 mm X 30 cm(Amersham Bioscience, Piscataway, NJ))를 사용하여 수행하였다. PEG화는 단백질의 유체역학적 부피를 상당히 증가시켜 체류 시간을 보다 짧게 한다. 비변형 hGH와 함께 PEG 알데히드 hGH 반응 혼합물 중에서 신규 종이 관찰되었다. 이 PEG화 종과 비-PEG화 종을 Q-세파로스 크로마토그래피 상에서 분리하였고, 정제된 최종 단일-PEG화-알데히드 hGH 종은 추후에 비-변성 SEC 상에서 단일 피크로서 용출되는 것으로 밝혀졌다(95% 초과의 순도, 도 1). Q-세파로스 크로마토그래피 단계는 단일-PEG화 hGH로부터 유리 PEG, hGH 및 다중-PEG화 hGH 종을 효과적으로 제거하였다.
SDS
-
PAGE
SDS-PAGE를 이용하여, 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드와 hGH의 반응 및 정제된 최종 생성물을 평가하였다. SDS-PAGE는 환원 및 비-환원 조건 하에 1 mm 두께의 10-NuPAGE 겔(Invitrogen, Carlsbad, CA) 상에서 수행하였고, 노벡스 콜로이달 코마시에(Novex Colloidal CoomassieTM) G-250 염색 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 염색하였다.
N-말단 서열
자동화된 에드만 분해 화학기술을 이용하여 NH2-말단 단백질 서열을 결정하였다. 분해를 위해 어플라이드 바이오시스템 모델 494 프로사이스 시퀀서(Applied Biosystems Model 494 Procise sequencer)(Perkin Elmer, Wellesley, MA)를 이용하였다. 퍼킨 엘머(Perkin Elmer)/브론리(Brownlee) 2.1 mm 내경 PTH-C18 컬럼이 장착된 어플라이드 바이오시스템 모델 140C PTH 분석기를 이용한 온라인 방식의 RP-HPLC 분석을 통해 각 PTH-AA 유도체를 확인하였다.
펩티드
맵핑
트립신처리 분해를 1 mg/㎖의 농도로 수행하였고, 전형적으로 분해 당 25 ㎍의 물질을 사용하였다. 트립신 대 PEG-hGH 비가 1:30(중량/중량)이 되도록 트립신을 첨가하였다. 트리스 완충제가 30 mM, pH 7.5로 존재하였다. 샘플을 실온에서 16 ± 0.5시간 동안 인큐베이션하였다. 분해 용액 1 ㎖ 당 1 N HCl 50 ㎕를 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 샘플을 6.25% 아세토니트릴 중의 0.25 mg/㎖의 최종 농도까지 희석한 후 샘플을 자동샘플러 내에 배치하였다. (19.8% 아세토니트릴까지) 아세토니트릴을 먼저 첨가하고, 약하게 혼합한 후, 물을 최종 부피(출발 부피의 4배)까지 첨가하였다. 과량의 분해 용액을 제거하고 -20℃에서 1주일까지 저장할 수 있다.
분석을 위해 워터스 알리언스(Waters Alliance) 2695 HPLC 시스템을 이용하였지만, 다른 시스템으로도 유사한 결과를 얻을 수 있다. 5 μm 입자를 보유하는 아스텍(Astec) C-4 중합체 25 cm x 4.6 mm 컬럼을 사용하였다. 전형적으로 샘플 당 단백질 50 ㎍을 로딩하고 주위 온도에서 실험을 수행하였다. 완충제 A는 물 중의 0.1% 트리플루오로아세트산이고, 완충제 B는 아세토니트릴 중의 0.085% 트리플루오로아세트산이었다. 샘플을 90분에 걸쳐 완충제 B 0% 내지 45%의 직선형 구배로 용출하였다.
210 nm와 300 nm 사이에서 데이타를 모으는 워터스 996 PDA 검출기를 이용하여 피크를 검출하였다. 214 nm에서의 추출된 크로마토그램을 이용하여 샘플을 분석하였다.
2:1(PEG:hGH)의 몰비에서 반응된 hGH 및 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드에 대해 트립신처리 맵을 수행하였다(도 2). N-말단 트립신처리 단편은 T-1로서 지칭하였다. 비-PEG화 hGH와 비교한 경우 존재하는 T-1의 비율은 PEG 변형의 99% 이상이 N-말단에 위치하고 나머지 변형이 여러 가능한 라이신 잔기들 중 하나에 명백히 결합되어 있다는 것을 암시한다.
실시예
4
시험관내
생물학적 분석
공액체와 hGH 수용체(hGHR)(28kDa 세포외 도메인) 사이의 특이적 상호작용을 평가하도록 구성된 분석에서 비아코어(Biacore) 3000 장치를 이용하여, 인간 수용체를 인식하는 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH의 능력을 시험하였다. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 실험으로부터 얻은 결과는 하기 표 3에 기재되어 있다.
ka(결합-속도) 및 kd(해리-속도)는 ΔRU=3000-5000에서의 아민 커플링 화학기술을 통해 CM5 칩 상에 표지된 hGH 결합 단백질(28 kDa, 세포외 도메인)을 사용하여 HEP-BES 완충제(0.01 M Hepes, pH 7.4, plus 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA 및 0.005% 계면활성제 P20) 중에서 37℃에서 50 ㎕/분의 유속으로 측정하였다. M-1s(초)- 1으로서 표시된 ka 및 s- 1으로서 표시된 kd는 둘 다 1 칩 ± 표준 편차에 대한 3회 이상의 측정의 평균 값이다. 데이타를 평가하여 1:1 비에서 GHBP에 대한 높은 결합 부위 1에 대한 hGH 결합을 측정하였다.
실시예
5
약동학적 연구
생체내
효능 - 11일간의
래트
분석에서의 효능(체중 증가, 경골 성장, 혈청
BUN
강하)
래트
체중 증가
할란 랩으로부터 구입한 뇌하수체절제 암컷 스프라그 돌리 래트를 4일 내지 10일 동안 성장 속도에 대해 미리 스크리닝하였다. 래트를 6마리로 구성된 군으로 나누었다. 0일부터 시작하여, 대조군 래트에게는 연속적으로 11일 동안 0.3 mg/kg의 hGH 또는 비히클을 매일 1회씩 피하 주사하였다. 시험군에게는 0일 및 6일에 1.8 mg/kg 단회(주당 1회) 투여량의 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH를 투여하였다. 동물의 체중을 매일 측정하였다. 도 4는 대표적 연구에서 체중 증가에 대한 hGH 및 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH의 효과를 보여준다.
도 4에 도시된 연구에 의해 얻어진 데이타를, hGH(대조군) 처리 래트에 대한 11일간의 성장 연구와 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH 공액체를 사용한 추가 성장 연구로부터 얻은 데이타를 조합하였을 때, 1.8 mg/kg의 공액체로 주 당 1회 처리한 동물에 대한 평균 체중 증가는 매일 hGH 투여(총 3.3 mg/kg) 후 달성된 평균 체중 증가의 109%이었다.
래트
경골 성장
11일간의 체중 증가 연구에서 동물을 11일째 날에 희생시키고, 좌측 경골을 떼어내어 X-선 촬영을 한 다음, 칼리퍼를 이용하여 골 길이를 측정하였다. 도 5는 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH로 처리한 동물에 대한 경골 길이 측정치를 보여준다.
래트
BUN
수준
hGH-처리 후의 대사 효과에 대한 생체마커로서, 혈중 우레아 질소 수준을 11일간의 혈액 샘플들로부터 측정하였다. 도 6은 매일 hGH를 처리하였을 경우 및 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH를 주당 1회 처리하였을 경우 모두에서 혈중 우레아 질소가 상당히 감소되었음을 보여준다.
6일간의 투여량 상승 연구에서의
래트
체중 증가
뇌하수체절제 래트를 다양한 단회 투여량의 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH로 처리하거나 또는 hGH로 매일 처리하고, 체중 증가를 6일 동안 모니터링하였다. 도 7은 다양한 처리군에 대해 얻은 체중 증가를 보여준다. 혈액 샘플을 표시된 시점에서 취하고, 혈청 IGF-1 수준을 ELISA로 측정하였다. 평균 +/- SEM을 작도하였다. 측정된 값에 대한 편차의 일원 분석을 이용하여 IGF-1 반응을 계산하기 위해 군(n=6) 평균을 이용하였고, 일련의 0.067 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.6 mg/kg 및 1.8 mg/kg 투약 각각에 대해 AUCdO-6(ng-hr/㎖) 값 20,040, 22,958, 28,129 및 37,839가 측정되었다.
11일간의 투여량 상승 연구에서의
래트
체중 증가
제 2 연구에서, 0일 및 6일에서 동물을 1.8 mg/kg 또는 이보다 높은 투여량 즉, 5.1 mg/kg의 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH 공액체로 처리하였다. 표 4는 비히클 또는 hGH(0.3 mg/kg/d)의 매일(QD 11) 투여 후 달성된 투여량-관련 체중 증가와 비교한 경우, 6일 및 11일에서의 투여량-관련 체중 증가를 보여준다.
* 비히클에 대한 p<0.05, † hGH에 대한 p<0.05; 0일부터 측정된 평균 체중 증가(g) BW, 체중; hGH, 인간 성장 호르몬.
값은 평균 ± SEM(평균 표준 오차)를 나타낸다.
괄호 안의 값은 0일부터의 변화를 평균 ± SEM으로 나타낸다.
IGF
-1 연구
6일간의 체중 증가 연구에서 이용된 동물을 이용하였다. 연구기간 동안 다양한 시점에서 혈액 샘플을 채취하고 혈청 IGF-1 수준을 도 8에 나타낸 바와 같이 ELISA로 측정하였다. 래트 IGF-1 수준을 면역분석 키트(Diagnostic System Laboratories)로 모니터링하였다.
실시예
6
약동학적 연구
캐뉼라를 꽂은 정상 스프라그-돌리 수컷 래트에서 약동학적 연구를 수행하였다. 군 당 6마리의 래트를 사용하여 hGH 또는 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH를 1.0 mg/kg 단회 정맥내 투여량 또는 1.8 mg/kg 단회 피하 볼루스로서 주사하였다. 혈액 샘플을 관련 PK 파라미터의 평가에 적정한 만큼 1일 내지 5일에 걸쳐 채취하였다. 면역분석을 이용하여 각 샘플링에서 hGH 및 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH 혈액 수준을 모니터링하였다. 표 4는 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH에 대한 래트 PK 파라미터를 보여준다. PEG화의 효과는 제거에 대해 관찰된 반감기에서 명백한데, 이는 상기 파라미터가 공액체의 경우에는 6시간을 초과하지만 유사한 연구로부터 hGH에 대해 보고된 데이타는 1.35±0.2 시간(Clark ibid), 0.77-1.7시간(Jorgensen et. al., "Polyethylene glycol-conjugated proteins", PSTT 1 (8), November 1998), 또는 1시간(Genotropin® (PNU-180307) Investigator Brochure)으로서 보고되어 있기 때문이다.
hGH
면역분석
hGH AutoDELFIA 키트 형광 면역분석(Perkin-Elmer)을 사용하여 래트 혈장에서의 hGH 및 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH 단백질 농도 수준을 측정하였다.
단회 투여량의 글리세롤 분지쇄 43K PEG 알데히드 hGH(1.8 mg/kg)를 뇌하수체절제 암컷 설치류에게 피하 투여한 후의 포괄적인 연구 설계에서 혈장 약물 수준과 IGF-1 반응 사이의 관계도 직접 확인하였다.
Claims (12)
- 제 1 항에 있어서,(CH2CH2O)n 잔기가 약 3 Kd의 평균 분자량을 가지며, (CH2CH2O)m 잔기는 각각 약 20 Kd의 평균 분자량을 가지는 PEG-hGH 공액체.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,hGH가 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 PEG-hGH 공액체.
- 제 3 항에 있어서,PEG가 서열 번호 1의 N-말단 페닐알라닌에 공액첨가되어 있는 PEG-hGH 공액체.
- 제 4 항에 있어서,단일-PEG화된 PEG-hGH 공액체.
- 제 4 항에 있어서,PEG의 80% 이상이 서열 번호 1의 N-말단 페닐알라닌의 알파 아미노기에 공액첨가된 PEG-hGH 공액체.
- 제 5 항에 있어서,PEG의 90% 이상이 서열 번호 1의 N-말단 페닐알라닌의 알파 아미노기에 공액첨가된 PEG-hGH 공액체.
- 제 5 항에 있어서,PEG의 95% 이상이 서열 번호 1의 N-말단 페닐알라닌의 알파 아미노기에 공액첨가된 PEG-hGH 공액체.
- 제 5 항에 있어서,PEG의 98% 이상이 서열 번호 1의 N-말단 페닐알라닌에 공액첨가된 PEG-hGH 공액체.
- 치료적 유효량의 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항의 PEG-hGH 공액체를 성장 또는 발달 장애를 가진 환자에게 투여함을 포함하는, 성장 또는 발달 장애를 가진 환자를 치료하는 방법.
- 제 10 항에 있어서,성장 또는 발달 장애가 성장 호르몬 결핍증(GHD), 터너 증후군(Turner's syndrome), 만성 신부전증 및 임신기간의 단신(SGA)으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 11 항에 있어서,성장 또는 발달 장애가 발기부전, HIV 지방이상증, 섬유근육통, 골다공증, 기억 장애, 우울증, 크론병, 골격 형성이상, 외상성 뇌손상, 거미막하 출혈, 누난 증후군(Noonan's syndrome), 다운 증후군, 특발성 단신(ISS), 말기 신질환(ESRD), 초저체중출생(VLBW), 골수 줄기세포 구조(Bone marrow stem cell rescue), 대사 증후군, 글루코코르티코이드 근육병증, 어린이에서의 글루코코르티코이드 치료로 인한 단신, 및 단신 미성숙 어린이를 위한 성장 따라잡기의 실패로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
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