NL1025842C2 - Zouten van tricyclische remmers van poly (ADP-ribose) polymerasen. - Google Patents

Description

1 .' · ZCültJm_2ian_tricyclische remmare van_polyfADP- riboseï polymeraaen 5

Gebied van de uitvinding

De uitvinding. heeft betrekking op de zouten van 8-fluor-2-(4-methylaminomethyl-fenyl)-1,3,4,5-tetrahydro-10 azepino[5,4,3-cd]indool-6-on, een verbinding die poly(ADP-ribose)polymerasen remt en daarmee het herstel van schade aan DNA-strengen vertraagt, en op werkwijzen voor de bereiding van dergelijke verbindingen. De uitvinding heeft ook betrekking op het gebruik van dergelijke verbindingen 15 in farmaceutische preparaten en therapeutische behandelingen die bruikbaar zijn voor het versterken van antikanker-therapieën en het remmen van neurotoxiciteit als gevolg van beroerte, hóofdletsel en neurodegeneratieve ziekten.

. 20 Achtergrond van de uitvinding

Poly(ADP-ribose)polymerasen (PARP's), nucleaire enzymen die in bijna allé eukaryotischè cellen worden aangetroffen, katalyseren de overdracht van ADP-ribose - eenheden van nicotinamideadeninedinucleotide (NAD*) op nucleaire ac-25 ceptoreiwitten, en zijn verantwoordelijk voor de vorming van eiwitgebonden lineaire en vertakte homo-ADP-ribose-polymeren. Activering van PARP en daaruit voortvloeiende vorming van poly (ADP-ribose) kan worden geïnduceerd door breuken, in DNA-strengen na blootstelling aan chemothera-30 pie, ioniserende straling, zuurstofradicalen of stikstofoxide (NO) .

Omdat dit cellulaire $DP-riboseoverdrachtsproees ge- • * * w · associeerd is met het herstel van breuken in DNA-strengen als respons op DNA-schade veroorzaakt door radiotherapie . 35 of chemotherapie, kan het bijdragen aan de resistentie die zich vaak ontwikkelt tegen verschillende typen kankertherapieën. Bijgevolg kan remming van PARP intracellulair V;-1.025-64 2 , v; ; V . _ 2 .. · · . DNA-herstel vertragen en de antitumoreffecten van kanker-therapie versterken. In vitro en In vivo gegevens tonen namelijk aan dat veel PARP-remmers de effecten van ioniserende straling of cytotoxische geneesmiddelen zoals DNA-5 methylerende middelen versterken. Daarom zijn remmers van het PARP-enzym bruikbaar als kankerchemotherapeutica.

Bovendien is aangetoond dat remming van PARP de weerstand tegen hersenletsel na beroerte bevordert (Endree et al.,, " Is chemie Brain In jury is Mediated by the Activation 10 of P.oiy (ADP-Ribose) Polymerase," J. Cerebral Blood Flow Me-tab, 17;1143-1151 (1997)? Zhang, "PARP Inhibitioh Results in Subtantial Neuroprotection in Cerebral Ischemia," Cam~ bridge Healthtech Jnstitute's Conference on Acute Neuronal Injurys New Therapeutic Opportunities, 18-24 september 15 1998, Las Vegas, Nevada). De activering van PARP door DNA- beschadiging speelt naar men aanneemt een rol in de cel-dood als gevolg van beroerte, hoofdletsel en neurodëgene-ratieve ziekten. DNA wordt beschadigd door overmatige hoe- . 4 . .

veelheden NO dat wordt geproduceerd wanneer het NO-20 synthese-enzym wordt geactiveerd als gevolg van een reeks gebeurtenissen die op gang wordt gebracht door het vrijkomen van de neurotransmitter glutamaat uit gedepolariseerde zenuwuiteinden (Cosi et al., "Poly(ADP-Ribose) Polymerase Revisited; A New Role for an Old Enzymes PARP Involvement 25 in Neurodegeneration and PARP Inhibitors as Possible Neu-roprotective Agente," Ann. N,Y. Acad. Scio, 366-379). Ajan-·.·.

.genomen wordt dat. celdood optreedt als gevolg van energie-uitputting omdat NAD+ wordt geconsumeerd door de enzymgeka-talyseerde PARP-reactie. Remmers van het PARP-enzym zijn 30 daarom bruikbare remmers van neurotoxiciteit als gevolg van beroerte, hoofdletsel en neurodegeneratieve ziekten.

Verder zou remming van PARP een bruikbare benadering moeten zijn voor de behandeling van aandoeningen of ziekten geassocieerd met celveroudering, zoals huidveroude-35 ring, via de rol van PARP in het signalen van DNA-beschadiging. Zie bijvoorbeeld Amerikaans octrooi . 5.589.483, dat een werkwijze beschrijft voor het verlengen .

1025/84 2 3 van de levensduur en proliferatieve capaciteit van cellen, omvattende het toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een PARP-remmer aan de cellen onder zodanige omstandigheden dat PARP-activiteit wordt geremd. Rem-5 mers van het PARP-enzym zijn daarom bruikbare, therapeutica voor huidveroudering.

In nog eën andere toepassing wordt PARP-remming op klinisch niveau onderzocht ter voorkoming van ontwikkeling van insulineafhankelijke diabetes mellitus bij daarvoor 10 gevoelige personen (Saldeen et al., "Nicotinamide-induced apoptosis in insulin producing cells in associated with cleavage of poly(ADP-ribose )polymerase,.t' Mol. Cellular En-docrinol. (1998), 139:99-107). PARP-remmers zouden daarom bruikbaar moetèn zijn als diabëtes-preventietherapeutica.

15 PARP-remming is ook een benadering voor de behande ling van ontstekingsaandoeningen zoals arthritis (Szabo et al., "Protective effect of an inhibitor of poly(ADP-ribose) synthetase in collagen-induced arthritis," Portland Press Proc. (1998), 15:280-281; Szabo, "Role of Po-20 ly (ADP-ribose) Synthetase in Inflammation," Enr. J. Bio-chem. (1998), 350(1):1-19; Szabo et al., "Protection

Against Peroxynitrite-induced Fibroblast Injury and

Arthritis Development by. Inhibition of Poly(ADP-ribose) Synthetase," Proc. Na tl. Acad. Sci. USA (1998), 25 95(7):3867-72). PARP-remmers zijn daarom bruikbaar als therapeutica voor ontstekingsaandoeningen.

Remming van PARP is bruikbaar voor bescherming tegen ischemie van de hartspier en reperfusieschade (Zingarelli et al., "Protection against myocardial ischenda and reper-30 fusion in jury by 3 -aminobenzamide, an inhibitor of poly (ADP-ribose) synthetase," Cardiovaseular Research (1997), 36:205-215). Daarom zijn PARP-remmers bruikbaar bij de therapie van Cardiovasculaire ziekten.

. De PARP-familie van enzymen is uitgebreid„ Onlangs is 35 aangetoond dat tankyrasën, die binden aan het telomare eiwit TRF-1, een negatieve regulator van instandhouding van de lengte van telomeren, een katalytisch domein hebben dat · • 1 025 84 2 · · ' ' .4.

opvallend homoloog is met PARP, en aangetoond is dat ze ia vitro PARP-activiteit hebben. Voorgesteld is dat telomeer-. functie in menseïijke cellen wordt gereguleerd door poly (ADP-ribosyDering. PARP-remmers zijn bruikbaar als in-5 strumenten voor bestudering van deze functie. Verder zouden als . gevolg van regulering van telomerase-activiteit door tankyrase PARP-remmers bruikbaar moeten zijn als middelen voor de regulering van de levensduur van cellen, bijvoorbeeld voor gebruik in kankertherapie voor het ver-10 korten van de levensduur van onsterfelijke tumorcellen,· of als antiverouderingstherapeutica, omdat aangenomen wordt dat telomeerlengte geassocieerd is met celveroudering.

Competitieve remmers van PARP zijn bekend. Bijvoorbeeld Banasik et al. ("Specific Inhibitors of Poly(ADP-15 .Ribose) Synthetase and Mono (ADP-Ribosyl) transferase, n «7. Biol o Chem. (1992) 267s 1569-1575) onderzochten de PARP-, remmende activiteit van 132 verbindingen, waarvan dé krachtigste 4-amino-l,8-naftalimide, 6(5H) -fenantridon, 2-nitro-6(5H) -fehantridon, en 1,5-dihydroxyisochinoline wa-20 ren. Griffin et al. rapporteerden de PARP-remmende activiteit voor een reeks benzamideverbindingen (Amerikaans octrooi 5.756.510; zie ook "Novel Potent Inhibitors of the DNA Repair Enzyme poly(ADP-ribose)polymerase (PARP)," Anti -Cancer Drug Design (1995), 10:507-514) en chinazolinon-25 verbindingen (Internationale publicatie WO 98/33802). Suto èt al. rapporteerden PARP-remming door een reeks dihydro-i sochinol inevèrbindingen ("Dihydroisoquinolines: The De sign and Synthesis of a New Series of Potent Inhibitors of Poly (ADP-ribose) Polymerase," Anti-Cancer Drug Design .30 (1991), 7:107-117). Griffin et al. hebben andere PARP- remmers van de .chinazolineklasse vermeld ("Resistance-Modifying Agents. 5. Synthesis and Biological Properties of Quinazoline Inhibitors of the DNA Repair Enzyme Poly (ADP-ribose) Polymerase. (PARP).," J. Med. Chem., ASAP Ar-35 tikel 10. 1021/jm980273t S0022-2623(98)00273-8; Web Release Datum: 1 december 1998).

1025842 5 · ' ’ · .

Desondanks is er nog steeds behoefte aan in water oplosbare, uit kleine moleculen bestaande verbindingen die krachtige PARP-remmers zijn, in het bijzonder die wélke fysische en chemische eigenschappen hebben die wenselijk 5 zijn voor farmaceutische toepassingen.

Samenvatting van de uitvinding

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op zouten van 8-fluor-2-(4-methylaminomethyl-fènyl)-1,3,4,5-tetra-10 hydro-azepino[5,4,3»cd]indool-6-on die fungeren als krachtige remmers van poly(ADP-ribosyl)transferase (PARP), een aanzienlijke oplosbaarheid in water hebben en bruikbaar zijn als therapeutica, in het bijzonder bij de behandeling van kankers en de verlichting van de effecten van beroer-15 te, hoofdletsel en neurodegeneratieve ziekten. Als kanker-therapeutica kunnen de verbindingen van de uitvinding worden gebruikt in combinatie met DNA-beschadigende cytotoxische middelen, bijvoorbeeld topotecan, irinotecan of temo-zolomide en/of straling.

20 In het bij zonder, heeft de onderhavige uitvinding be trekking op het fosfaatzout van 8-fluor-2=(4-methylamino-methyl-fenyl)-l,3,4,5-tetrahydro-azepino[5,4,3=cd3indool» 6-on met formule (I) : 25 ^ 'N- ;/·'1025 8.4 2...

;'35 ’·....· ''··.

. ' 6 . De. onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op farmaceutische preparaten die een effectieve PARP-remmende hoeveelheid van een fosfaatzout van een verbinding met formu-. Ie I samen met een farmaceutisch aanvaardbare drager daar-5 voor omvatten.

De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze voor het remmen van PARP-enzymactiviteit in vi-vo, omvattende het in contact brengen van het enzym met een effectieve hoeveelheid van een in water oplosbaar 10 zout, bij voorkeur een fosfaatzout, van een verbinding met formule (I). Deze in water oplosbare zouten van de uitvinding zijn krachtige PARP-remmers en hebben bij voorkeur een PARP - remmende activiteit overeenkomend met een Ki van 1Ó0 μΗ of minder in de PARP-enzymremmingstest.

15 De onderhavige uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor het versterken van de cytotoxiciteit van een cytotoxisch geneesmiddel of ioniserende straling, omvattende het in contact brengen van cellen met een effectieve hoeveelheid van een in water oplosbaar zout, bij 20 voorkeur een fosfaatzout, van een verbinding met formule (I), in combinatie met een cytotoxisch geneesmiddel of ioniserende straling. De farmaceutisch aanvaardbare zouten van de uitvinding hebben bij voorkeur een cytotoxiciteits-versterkende activiteit overeenkomend met een PPB0 van ten 25 minste 1 in de cytotoxiciteitsversterkingStest.

De uitvinding voorziet ook in therapeutische interventies die geschikt zijn bij ziekte- of letseltoestanden waarbij PARP-activiteit schadelijk is voor een patiënt,, welke therapeutische werkwijzen het remmen van PARP-30 enzymactiviteit in het relevante weefsel van de patiënt omvatten dóór toediening van een fosfaatzout van formule (I) . In één dergelijke therapeutische interventiewerkwijze verschaft door de onderhavige uitvinding wordt de effectiviteit van een cytotoxisch geneesmiddel of radiotherapie . 35 toegediend aan een zoogdier tijdens therapeutische behandeling verbeterd door toediening aan het zoogdier dat behandeling nodig heeft van een effectieve PARP - remmende 1025842 7 hoeveelheid van een fosfaatzout van formule (I) in combi-, . natie met de toediening van het cytotoxische geneesmiddel of radiotherapie.

Een andere therapeutische interventiewerkwijze ver-5 · schaft door de onderhavige uitvinding is het vertragen, van het begin van celveroudering geassocieerd met huidveroude-ring bij een zoogdier, omvattende het aan fibroblastcellen in het zoogdier toedienen van een effectieve PARP-remmende hoeveelheid van een fosfaatzout van formule (I) . Nog een 10 andere therapeutische interventiewerkwijze verschaft door de onderhavige uitvinding is een werkwijze voor het reduceren van de neurotoxiciteit. als gevolg van beroerte, hoofdletsel en neurodegeneratieve ziekten bij een zoogdier door toediening van een effectieve hoeveelheid van een 15 fosfaatzout van formule (I) aan het zoogdier.

De verbindingen van de onderhavige uitvinding verschaffen een therapeutische benadering van behandeling van ontstekingsaandoeningen,. omvattende het- toèdienen van een effectieve hoeveelheid van een fosfaatzout van formule (I) 20 aan een zoogdier dat behandeling nodig heeft.

Nog een andere therapeutische interventiewerkwijze verschaft door de onderhavige uitvinding is een cardiovasculaire therapeutische werkwijze voor bescherming tégen ischemie van de hartspier en reperfusieschade bij een 25 zoogdier, omvattende het aan het zoogdier toedienen van een effectieve hoeveelheid van een fosfaatzout van formule (I). ' \ . Gedetailleerde_heschriisdlag_seêüx. de_uitvinding en 30 VQQrkeureuitvoerlngflVQrmen PARP-remmende middelen;

De synthese van 8 - f luor- 2 - (4 -methylaminomethyl - fenyl)-1,3,4,5-tetrahydro-azepirioï5,4,3-cd]indool-6-on werd beschreven ini Amerikaans octrooi 6„49S „541, hier als 35 referentie opgenomen.

: 'f0.25 84 2 ·:·· : 8

Zoals hierin gebruikt worden de termen "omvattende1'1 en "bevattende" gebruikt in hun open, niet-beperkende betekenis.

De term "halogeen" betekent chloor, fluor, broom of 5 jood.

In het geval van verbindingen, zouten of solvaten die vaste stoffen zijn, is het voor deskundigen duidelijk dat . de verbindingen, zouten, en solvaten van de uitvinding kunnen voorkomen in. verschillende kristallijn© of polymorfe 10 vormen, die alle vallen onder de beschermingsomvang van de onderhavige uitvinding en gespecificeerde formules.

In sommige gevallen zullen de verbindingen van de uitvinding chirale centra hebben. Wanneer chirale centra aanwezig zijn, kunnen de verbindingen van de uitvinding 15 voorkomen als afzonderlijke stereoisomeren, racematen en/of mengsels van enantiomeren en/of diastereomeren.. Al dergelijke afzonderlijke stereoisomeren, racematen en mengsels daarvan vallen onder de brede strekking van de algemene structuurformules (tenzij anders aangegevén). Bij .20 voorkeur echter worden de verbindingen van de uitvinding gebruikt in nagenoeg optisch zuivere vorm (zoals algemeen bekend is voor deskundigen is èen optisch zuivere verbinding een verbinding die eiiantiomeer zuiver is) .. Bij voorkeur bestaan de verbindingen van de uitvinding voor ten 25 minste 90% uit de gewenste afzonderlijke isomeer (80% enantiomere overmaat), liever ten minste 95% (90% e.e.), nog liever ten minste 97,5% (95% e.e.) en liefst ten min- .

. ste 99% (98% e.e.).

In sommige gevallen kunnen verbindingen voorkomen in 30 tautomere vormen. In dergelijke gevallen is het de bedoeling dat de structuurformules beide tautomeren omvatten.

...

Farmaceutische werkwijzen en preparaten;

De uitvinding heeft ook betrekking op een werkwijze 35 voor het remmen van PARP-enzymactiviteit, omvattende het in contact brengen van het enzym met een effectieve hoeveelheid van een in water oplosbaar zout van formule (I) , 1025842 9 bijvoorbeeld een fosfaatzout van formule (I), of een sol-vaat. van het. in Water oplosbare zout daarvan. PARP-activiteit kan bijvoorbeeld in zoogdierweefsel worden geremd door toediening van een in water oplosbaar zout van 5 formule (I), bijvoorbeeld een fosfaatzout, of solvaat van die zouten daarvan.

"Behandelen" of "behandeling" betekent de verlichting van een verwonding of een ziekte in een zoogdier, zoals een mens (bijvoorbeeld een patiënt), die wordt, gemedieerd. IQ door de remming van PARP-activiteit, zoals door versterking van antikankertherapieên of remming van neurotoxici-teit als gevolg van beroerte, hoofdletsel en neurodegene-ratieve ziekten. Typen behandeling omvatten: (a) profylactische toepassing bij een zoogdier, in het bijzonder wan-15 neer het zoogdier vatbaar blijkt te zijn voor het hebben van de ziekte maar nog niet gediagnosticeerd is als hebbende de ziekte; (b) remming van de ziekte; en/of (c) verlichting, geheel of gedeeltelijk, van de ziekte.

Eén behandelingswerkwij ze omvat het. verbeteren van de 20 effectiviteit van een cytotoxisch geneesmiddel of radiotherapie toegediend aan . een zoogdier tijdens therapeutische behandeling, omvattende het aan het zoogdier toedienen van een effectieve hoeveelheid van een fosfaatzout van formule 1 in combinatie met toediening van het. cytotoxi-25 sche geneesmiddel (bijvoorbeeld topotecan of irinotecan) of radiotherapie. De PARP-remmende fosfaatzouten van formule 1 kunnen ook goed worden gebruikt in. een werkwijze voor het reduceren van neurotoxiciteit als gevolg van beroerte, hóofdletsel en neurodegeneratieve ziekten bij een 30 zoogdier door toediening van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van fosfaatzouten van formule- l aan het zoogdier. De PARP-remmende zouten van de uitvinding kunnen ook worden gebruikt in een werkwijze voor het vertragen van het begin van celveroudering geassocieerd met huidveroude-35 ring bij een mens, omvattende het aan fibroblastcellen bij de mens toedienen van een effectieve PARP - remmende hoeveelheid van de fosfaatzouten van formule 1. Verder kunnen : 10 25 84 2 ; : • 10 ' de fosfaatzouten van formule 1 ook worden gebruikt, in een werkwijze voor het helpen voorkomen van de ontwikkeling van insuiineafhankelijke diabetes mellitus bij een daar-, voor gevoelige. persoon, omvattende het toedienen van een 5 .therapeutisch effectieve hoeveelheid van het zout. Boven dien kunnen de fosfaatzouten van formule 1 ook worden gebruikt in een werkwijze voor het behandelen van een ont-. stekingsaandoëning bij een zoogdier, omvattende het toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van 10 het zout aan het zoogdier. Bovendien kunnen de middelen ook worden gebruikt in een werkwij ze voor het behandelen van cardiovasculaire ziekte bij een zoogdier, omvattende het aan het zoogdier toedienen van een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een PARP-remmend fosfaatzout van 15 formule 1. Naarmate de kennis met betrekking tot de thera-.... peutische rollen van PARP-remmers in de techniek voortschrijdt, zullen andere toepassingen van de PARP-remmende zouten van de uitvinding .duidelijk worden.

De activiteit van de verbindingen van de uitvinding 20 als remmers van PARP-activiteit kunnen worden gemeten met elk van de geschikte werkwijzen die bekend of beschikbaar zijn in de techniek, waaronder met in vivo en is vitro bepalingen. Een voorbeeld van een geschikte bepaling voor meting van activiteit is de PARP-enzymremmingstest be-25 schreven in Amerikaans octrooi 6.495.541, hier in zijn geheel voor alle doeleinden als referentie opgenomen.

Toediening van de fosfaat- of glucuronaatzouten van formule 1 kan worden uitgevoerd volgens elk van de aanvaarde wijzen van toediening die beschikbaar zijn in de '30'. techniek. Illustratieve voorbeelden van geschikte wijzen van toediening omvatten orale, nasale, parenterale, topi-.sche, transdermale, intraveneuze en rectale toediening. Orale en intraveneuze toediening zijn vóorkeursroutes van toediening.

. 35 De fosfaatzouten van formule (I) of een farmaceutisch aanvaardbaar solvaat daarvan kunnen worden toegediend als farmaceutisch preparaat in elke farmaceutische vorm. die 1025842 11 door de vakman als geschikt kan worden gezien. Geschikte farmaceutische vormen omvatten vaste, halfvaste, vloeibare of gevriesdroogde preparaten, zoals tabletten, poeders, capsules, suppositoria, suspensies, liposomen en aêroso-5 len. Farmaceutische preparaten van de uitvinding kunnen ook geschikte excipiënten, verdunningsmiddelen, dragers alsook andere farmaceutisch actieve middelen (waaronder andere PARP-remmende middelen) bevatten, afhankelijk van het beoogde gebruik.

10 Aanvaardbare werkwijzen voor de bereiding van ge schikte farmaceutische vormen van de farmaceutische preparaten zijn bekend of kunnen op gebruikelijke wijze worden bepaald door deskundigen. Farmaceutische preparaten kunnen bijvoorbeeld worden bereid volgens gebruikelijke technie-15 ken van de farmaceutisch chemicus onder gebruik van stappen zoals mengen, granuleren en zonodig, persen voor ta= bletvormen, of mengen, vullen en oplossen van de bestanddelen naar behoefte ter verkrijging van de gewenste producten voor orale, parenterale, topisehe intravaginale, 20 intranasale, intrabronchiale, intraoculaire, intra-aurale en/of rectale toediening.

Vaste of vloeibare farmaceutisch aanvaardbare dragers, verdunningsmiddelen of excipiënten kunnen in de farmaceutische preparaten worden gebruikt.. Voorbeelden van 25 vaste dragers omvatten . zetmeel, lactose, calciumsulfaat-dihydraat, terra alba, sucrose, talk, gelatine, pectine, acacia, magnesiumstearaat en stearinezuur. Voorbeelden van vloeibare dragers omvatten siroop, arachideolie, olijfolie, zoutoplossing en water. De drager of het verdun-30 ningsmiddel kan een geschikt materiaal voor langdurige afgifte omvatten, zoals glycerylmonostearaat of glyceryldis-tearaat, alleen of met een was. Wanneer een vloeibare drager wordt gebruikt, kan het preparaat de vorm hebben van een siroop, elixer, emulsie, zachte gelatinecapsule, ste-35 riele injecteerbare vloeistof (bijvoorbeeld oplossing) of een niet-waterige of waterige.vloeibarè suspensie.

1025842 · 12

Een dosis van het farmaceutische preparaat bevat ten minste een therapeutisch effectieve hoeveelheid van een PARP-remmend middel (dat wil zeggen een fosfaatzout van formule (I) of een solvaat. daarvan) en bevat bij voorkeur 5 één of meer farmaceutische doseer eenheden. De gekozen dosis kan aan een zoogdier, bijvoorbeeld een menselijke patiënt, dat behandeling nodig heeft van een aandoening ge-medieerd door remming van PARP-activiteit, worden toegediend met elke békende of geschikte werkwijze voor toedie-10 ning van de dosis, waaronder? topisch, bijvoorbeeld als zalf of crème; oraal; rectaal, bijvoorbeeld als supposito-rium; parënteraal door middel van injectie; of continu door intravaginale, intranasale, intrabronchiale, intra-aurale of intraoculaire infusie. Een "therapeutisch effec-. 15 tieve hoeveelheid" betekent de hoeveelheid van een middel die bij toediening, aan een zoogdier dat daaraan behoefte heeft, voldoende is om behandeling voor schade of ziekte gemedieerd door remming van PARP-activiteit te bewerkstelligen, zoals voor versterking van antikankertherapieên en 20 remming van neurotoxiciteit als gevolg van beroerte, hoofdletsel en rieurodegeneratieve ziekten. De hoeveelheid . van een gegeven verbinding van de uitvinding die therapeutisch effectief ’ zai zijn, zal variëren afhankelijk van factoren zoals de specifieke verbinding, de ziekte en de 25 ernst daarvan, de identiteit van het zoogdier dat daaraan behoefte heeft; welke hoeveelheid als routine kan worden bepaald door deskundigen. .

Hét zal duidelijk zijn dat de feitelijke doseringen van de PARP - remmende middelen gebruikt in de farmaceut!-30 sche preparaten van deze uitvinding zullen worden gekozen afhankelijk, van het gebruikte specifieke complex, het specifieke geformuleerde preparaat, de wijze van toediening en de specifieke plaats, en de behandelde gastheer en aandoening . Optimale doseringen voor een gegeven stel omstan-35 dighedèn kunnen worden vastgesteld door deskundigen onder gebruik van gebruikelijke doseringsbepalingstests. Voor orale toediening is een dosis die kan worden gebruikt, 1025842 .13 bijvoorbeeld ongeveer 0,001 tot ongeveer 1000 mg/kg li chaamsgewicht, waarbij behandel ingskuren. met geschikte, tussenpozen worden herhaald.

5 Synfchesewerkwlj zen ♦

De onderhavige uitvinding heeft verder betrekking op werkwijzen voor het synthetiseren van dë PARP-remmende middelen met werkwijzen zoals die welke hieronder worden gegeven voor voorbeeldverbindigen van de uitvinding. In de 10 volgende voorbeelden werden de structuren van de verbindingen bevestigd met één of meer van de volgende technieken? proton-kernspinresonantiespectroscopie, infrarood-spectroscopie, element-microanalyse, massaspectrometrie, dunnelaagchromatografie, vloeistofchromatografie mét groot ' 15 scheidend vermogen, en smeltpuntsbepaling.

. Element-microanalyses werden uitgevoerd door Atlantic Microlab Ine. (Norcross, GA) of Galbraith Laboratories . (Nashvillé, TN), en gaven resultaten voor. de genoemde elementen binnen ± 0,4% van de theoretische waarden. Flash-20 kolomchromatografie werd uitgevoerd onder gebruik van si-licagel 60 (Merck art. 9385). Analytische dunnelaagchromatografie (TLC) werd uit gevoerd onder gebruik. van voorbeklede platen silica 60 Fa5)j (Merck art. 5719). Smeltpunten (snip) werden bepaald op een MelTemp inrichting en zijn on-25 gecorrigeerd. Alle reacties werden uitgevoerd in met een septum afgesloten kolven onder een lichte positieve argon-druk, tenzij anders opgemerkt. Alle commerciële oplosmiddelen waren van rèagenskwaliteit of beter en werden gebruikt, zoals ze werden, geleverd.

30 De volgende afkortingen kunnen hierin worden ge bruikt? EtaO (di ethyl ether); DMF (N, N-dimethyl f ormamide); DMSO (dimethyl sul f oxide); MeOH (methanol) ; EtOH (ethanol); EtOAc (ethylacetaat); THF (tetrahydrofuran); Ac (acetyl); . Me (methyl); Et (ethyl); en Ph (fenyl).

35! · De algemene hieronder beschreven reactieprotocollen kunnen worden gebruikt voor de bereiding van de verbindin- . · · - *.

! ,10.25-8:42 .

14 gen van de uitvinding en het bepalen van de oplosbaarheid . .

in water van de zouten.

_Oplosbaarheid in water van verschillende zoutvormen

Zoutvorm van formule 1_Oplosbaarheid (mg/ml)_·

Vrije base _0,18__ ' \

Hydrochloride ___ 1,6__

Mesylaat_;__15,5___ :

Gluconaat_____>128_|_ · '' .

Tart raat_ 1,1__ .

Acetaat_8,8__'

Glucuronaat_89_· _

Fosfaat___2,8_' _ .5.

Bepaling van oplosbaarheid in water

Weeg ongeveer 1,0 rag 8-fluor-2-(4-methylaminomethyl-fenyl)-1,3,4,5-tetrahydroazepino[5,4,3-cd]indool-6-on (vrijè base) af in een scintillatieflesje en voegt vervol-10 gens 2,0 ml Milli Q water toe. De monstersuspensie werd 3 uur bij kamertemperatuur geroerd. De suspensie werd overgebracht in een eppendorf flesje en 8 minuten gecentrifugeerd bij 14000 rpm. De bovenstaande oplossing werd vervolgens geanalyseerd met HPLC.

15 Weeg ongeveer 5,0 mg 8-fluor-2-(4-methylaminomethyl- fenyl)-1,3,4,5-tetrahydroazepino [5,4,3-cd] indool-6-onfosfaat of een willekeurig ander zout van formule 1 af in een scintillatieflesje en voeg vervolgens 1,0 ml Milli Q water toe. De suspensie werd 3 uur bij kamertemperatuur 20 geroerd en vervolgens 8 minuten gecentrifugeerd bij 14000. rpm. De supematant werd 10 maal verdund met Milli Q water. De uiteindelijke oplossing werd vervolgens geanalyseerd met HPLC.

25 Standaardbereiding

Weeg nauwkeurig 2,5-3,0 mg AG014447 referentiestan-daard af in een maatkolf van 10 ml en breng vervolgens' op volume met MeOH. Meng grondig.

, 1025842, . : 15 HPLC-omstandigheden s

Buffer: . 25. mM ammoniumfosfaatbuffer (pH 2,5)

Organische Modifier: Acetonitril (ACN)

Golflengte: 210 nm

Kolom: Waters Symmetry C18, 4,6x150 mm, 5 μια

Stroomsnelheid: 1,0 ml/minuut

Injec.tievolume: . 5 μΐ

Looptijd: ' . 24 minuten

Kolomtemp: Omgeving

Tijd _% Buffer_ ACN (%)_ . 0 _ 90_ 10_ 15 60 40______ 20 60 40 · 20,1 90 _ 1Ó 24 190 110 .5 Berekeningen:

De oplosbaarheid van het monster wordt berekend met . de onderstaande vergelijking:

S « A/As X Cs x D

waarin A het piekoppervlak van het monster is; As het 10 piekoppervlak-van;, de. standaard is; Cs de concentratie van de standaardoplossihg is; D de verdunningsfactor is.

15 · . H

jfTJ) aaar» MÖ®. · _ χ Θ 20. 1 Af@ 1025 84 2/; 16

In schema 1 werd het amine 1 behandeld met diverse zuren in methanol. Het verkregen zout werd. gevriesdroogd en verder zonodig gezuiverd door middel van herkristalli-satie. .

5

Voorheeld At 8-fluor-2- (4-methyl amjnomethyl-fenvl) ° i^A. ^^JS^jSi^ahydro-azepirio f5 . 4.3-rdl indaol-S-onmesylaafc 10 15 ; ‘ .

8-Fluor-2-(4-rmethylaminomethyl-feriyl)-1,3,4,5-tetra-hydro-azepino[5,4,3-cd]indool-6-on (259 mg, 0,801 mmol) 20 werd gedeeltelijk opgelost in methanol (5 ml) en werd vervolgens behandeld met methaansulfonzuur (1,0 M methanol!-sche oplossing, 0,801 ml). Het amine werd volledig opgelost door de oplossing voorzichtig te verwarmen en door . gebruik van een aanvullende hoeveelheid methanol (10 ml) .

25. De oplossing werd gefiltreerd door katoen om eventuele deeltjes te scheiden. De oplossing werd onder vacuüm gedeeltelijk geconcentreérd. 1 ml gedeioniseerd water werd toegevoegd en het. methanol werd onder vacuüm volledig verdampt. Het product werd gevriesdroogd, waarbij 326 mg.

30 (97%). werd verkregen als een helder gele vaste stof; Anal.

(CaoH33PNj04.2I^O) C, Η, N.

1025842 ·.· . 17

Moorbeald Bj-B - Fluor-2--^l4.=Tnet- hyl amlnomp.thyl -fenyl) - 1-3.,4.5-tetrahvdrQ-.a2ePi.no Γ5.4.3-CdH ndonl -6-nn-hyrironhl or-i de ' 5 .

» •f

H

10 · ,ΝτΜβ

h H

15 Op een wijze vergelijkbaar met die beschreven voor voorbeeld A werden 8-fluor-2-(4-methylaminomethyl-fenyl)- 1.3.4.5- tetrahydro-azepino[5,4,3-cd3 indool-ë-on (30 mg, 0>093 mmol) en HC1 (waterige 0,10 M oplossing, 0,90 ml) gebruikt voor het verkrijgen van 8-£luer-2-(4-methylamine- 20 methyl-fenyl)-1,3,4,5-tetrahydro-azepino[5,4,3-cd)indool- .

6-on-hydrochloride, 33 mg (99%) als een helder gelé vaste stof: Anal. (C„HieFN3OCl.O,3HaO) C, Η, N.

Voorbeeld C; 8-FTnor-2- (4-methvlaminomethvl-fenvll^ 25 1 3.4 r 5-tetrahydror-azepino (5^4.3-cdl indool - g--onacetaafc 30 Λ^Η/tl

.· JT

35.. Op een wijze vergelijkbaar met die beschreven voor voorbeeld A werden 8-fluor-2- (4-methylaminomethyl-fenyl) - 1.3.4.5- tetrahydro-azepino(5,4,3-cd)indool-5-on (30,8 mg, 1025842 '..18 0,0952 rnmol) en azijnzuur (methanolische 1,0 M oplossing., 0,952 ml) gebruikt voor het verkrijgen van 8-fluor-2™ (4-methylaminomethyl-fenyl)-1,3,4,5-tetrahydro-azepino [5,4,3-cd] indool-6-onacetaat, 36,1 mg (99%) als een helder gele 5 valste stof: Anal. (C31H33FN903.1,51^0) C, Η, N.

Voorbeeld D; 8-Fluor-2°J.4-methylaminomefchyl-fenyl) - T-3.4. 5-J^etrahydro-azenincj5^4,Jl-c^lindoo3 -6-onalnconaat 10 · ·

OH OH O

h . HONXk1ArA0© 0aY y OH OH · N-Ms

15 H Η H

Op een wijze vergelijkbaar met die beschreven voor voorbeeld A werden 8-fluor-2-(4-methylaminomethyl-fenyl)- 1,3,4, 5-tetrahydro-azepino [5,4,3-cd] indool“6·=·on (30,2 mg, 20 0,0934 inmol) en gluconzuur (waterige 2,55 M oplossing 0,0366 ml) gebruikt voor het verkrijgen van 8-fluor-2“(4-methylaminomethyl-fenyl)-1,3,4,5-tetrahydro-azepino[5,4,3-cd} indool - 6-ongluconaat, 47,5 mg (98%) als een helder gele vaste stof:. Anal„ (C3SH30FNjP8.ί,91^0) C, Η, N.

25

Ifoorheeld E- 8-fluor-2-f4-methylaminomethyl-fenyll° 1.3.4.5-tetrahydrQ^azepinQJ^AΛJL·J^dlΛχl^dml^^pnfcar¢xaaj;

: AV

/ OH 0 35

Op een wijzè vergelijkbaar met die beschreven voor voorbeeld A werden 8-fluor-2- (4-methylaminomethyl-fenyl) - 1025 84 19 1.3.4.5- te.trahydro-azepino[5,4,3-cd]indool-6-on (30,0 -.mg, 0,0928 inmol) en L-wijnsteenzuur (methanolische 1,0 M oplossing, 0,0928 ml) gebruikt voor het verkrijgen van 8-fluor-2-(4-methyl aminomethyl-fenyl.) -1,3,4,5-tetrahydro- 5 azepino[5,4,3-cd]indool-6-ontartraat, 42,7 mg (97%) als een helder gele vaste stof: Anal. (C23Ha4FN307.1,81^0) C,. H, N.

Voorbeel d F; ft - f 1 nor- 2- (4 -methyl aminomethyl - f enyl) - 10 1 r 3.4.5-tetrahydm-azepinoT5.4.3-cdl indool-6-onglucuronaat QH 0 ΗΟγ^ΛοΘ wry°

Jl J oh f^h -

Op een wijze vergelijkbaar met die beschreven voor 20 voorbeeld A werden 8-fluor-2-(4-methylaminomethyl-fenyl)- 1.3.4.5- tetrahydro-azepino[5,4,3-cd]indool-6-on (30,0 mg, O, 0928 mmol), en glucuronzuur (waterige 0,5 M oplossing, 0,186 ml) gebruikt voor het verkrijgen van 8-fluor-2-(4-methylaminomethyl-fenyl)-1,3,4,5-tetrahydro-azepino[5,4,3- 25 cd) indool-6-onglucuronaat, 47,9 mg (100%) als een helder gele vaste stof: Anal. (C3sH3BFN3Oe.l,91^0) C, Η, N.

Voorbeeld (3: 8-flnor-2-(4-methylaminomethyl°fenyl1- 1-3.4.5-J^etrahsadro^azepino TS. 4.3-odl jndool -onfosfaat .

30,

35 " HU

v1025 84 2 20 .

Op een wijze vergelijkbaar met die .beschreven voor voorbeeld A werden 8-fluor-2- (4-methylaminomethyl-£enyl) - 1,3,4,5-tetrahydro-azepino[5,4,3-cd]indoól-6-on (42,0 mg, 0,130 mmol), en fosforzuur (waterige 0,5 M oplossing, 5 0,260 ml) gebruikt voor het verkrijgen van 8-fluor-2-(4- methylaminomethyl-fenyl)-l,3,4,5-tetrahydro-azepino[5,4,3-cdjindool-6-onfosfaat na vriesdrogen en he'rkristallisatie in 0,5ϊ6,5;3 Ha0; methanol s CHaCla, waarbij 32,2 mg (58%) werd verkregen als een helder gele vaste stof? Anal. 10 (C19HalFN303P. 1,9HaO) C, Η, N.·· PARP — en zy mrexnmmgataet-s-

De PARP-enzymremmende activiteiten van de verbindingen van de uitvinding werden bepaald zoals beschreven door 15 Simonin et al. (J. Biol. Chem. (1993), 268ί8529-8535) en Marsischky et al. (J. Biol. Chem. (1995)., 270s3247-3254) met de volgende ondergeschikte modificaties. Monsters (50 μΐ) bevattende 20 nM gezuiverd PARP-eiwit, 10 /xg/ml DNAse I-geactiveerd kalfsthymus-DNA (sigma), 500 μΜ NAD*, 0,5 /iCi 20 [ïaP]NAD% 2% DMSO, en diverse concentraties testverbindin-gen werden 5 minuten bij 25°C geïncubeerd in monsterbuffer (50 mM Tris pH 8,0, 10 mM MgCl2, 1 mM tris (carboxyethyl) -fosfine.HCl). Onder deze omstandigheden was de reactiesnelheid lineair gedurende tijden tot 10. minuten. De reac-25 tie werd gestopt door toevoeging van een gelijk volume ijskoud 40% trichloorazijnzuur aan de monsters, die vervolgens 15 minuten op ijs wérden geïncubeerd. De monsters werden vervolgens overgebracht in een Bio-Dot microfiltra-tieinrichting (BioRad), gefiltreerd door Whatman 6P/C 30 glasvezelfiltreerpapier, driemaal gewassen met 150 μΐ wasbuffer (5% trichloorazijnzuur, 1% anorganisch pyrofosfaat) en gedroogd. Inbouw van [3aP]ADP-ribose in het in zuur onoplosbare materiaal werd gekwantificeerd onder gebruik van een Phosphorlmager (Molecular. Dynamics) en ImageQuant . 35 software. Remmingsconstanten (K^) werden berekend met niet-lineaire regressieanalyse onder gebruik van de snelheids-vergelijking voor competitieve remming (Segel, Enzyme Ki- 1025842 21 netics: Behavior and Analysis of Rapid Eguilibritmi and Steady-State Enzyzne Systems, John Wiley & Sons, Ine., New York (1975), 100-125). In het geval van sterk bindende remmers werd 5 nM enzym gebruikt en werd het reactiemeng-5 sel 25. minuten geïncubeerd bij 25°C. Kj-waarden voor sterk bindende remmers.werden berekend met behulp van de vergelijking beschreven door Sculley et al. (Biocbim. Biophye. Acta (1986), 874:44-53).

10 C^otoxiciteitaveraterkingategt: A549-cellen (ATCC, Rockville, MD) werden uitgezet in celkweekplaten met 96 putjes (Falcon brand. Fisher Scien-tific, Pittsburgh, PA) 16 tot 24 uur voor experimentele manipulatie. De cellen werden vervolgens 3. of 5 dagen be-15 handeld met een testverbinding (of waar aangegeven een combinatie van. testverbindingen) in een concentratie van 0,4 μΜ. Aan het eind van de behandelingen werd het relatieve aantal cellen bepaald met de MTT-bepaling of de SRB-bepaling. Voor. de MTT-bepaling werd 0,2 ^g/μΐ MTT (3-(4,5-20 . dimethylthiazool-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) aan elk putje van een plaat toegevoegd en de plaat werd 4 Uur geïncubeerd in een . celkweekincubator. Gemetaboliseerd MTT in elk putje werd onder schudden opgelost in 150 μΐ DMSO (Sigma Chemical 25 Co.) en gekwantificeerd met een Wall ac 1420 Victor plaat-lezer (EG&G Wallac, Gaithersburg, MD) bij 540 nm. Voor de SRB-bepaling werden cellen een uur bij 4®C gefixeerd met . 10%: trichloorazijnzuur (Sigma Chemical Co).. Na uitvoerig wassen werden gefixeerde cellen 30 minuten gekleurd met 30 0,4% sulforhodamine B (SRB, Sigma Chemical Co.) in 1% azijnzuur (Sigma Chemical Co). Ongebonden SRB werd weggewassen met 1% azijnzuur. Daarna. werden de kweken aan de lucht gedroogd en gewonnen kleurstof werd onder schudden gesolubiliseèrd met 10 mM ongebufferde Tris-base (Sigma 35 Chemical Co). De gebonden kleurstof werd fotometrisch gemeten. met de Wallac Victor plaatlezer bij: 515 nm. De verhouding van de OD-waarde (optische dichtheid) van een met 1025-84.2 . ' ' • 22 verbinding behandelde kweek tot. de 0D-waarde van een qua- . si-behandelde kweek, uitgedrukt als përcentage, werd gebruikt om de cytotoxicitèit van een verbinding te kwantificeren. De concentratie waarbij een verbinding 50% cyto-5 toxiciteit veroorzaakt, wordt, aangeduid als ICS0. Om de versterking van de cytotoxicitèit van topotecan of temozo-lomide door. testverbindingen te kwantificeren wordt een dimensieloze parameter PFS0 gebruikt die is gedefinieerd als de verhouding van de IC50 van topotecan of temozolomide 10 alleen tot de ICS0 van topotecan of temozolomide in combinatie met een testverbinding. Voor de verbindingen van de uitvinding werden PF50-waarden bepaald door testen met topotecan.

Remmingsconstanten (Ki-waarden) en cytotoxiciteitsver-15 sterkingsparameters (PF50-waarden) zoals bepaald voor vóórheel dverbindingen van de uitvinding, zijn gepresenteerd in onderstaande tabel 1. Als er twee Kj-waarden voor één enkele verbinding zijn, betekent dit dat de van de verbin-. ding tweemaal werd getest.

·. ' · 20 · : · _' _

Tabel 1· PARP-enzymremming ën' versterking van cytotoxicitèit_

Verbinding no. Renaingsconstante Versterking van ______' · ' _Kt (nM)_ cytotoxicitèit

Formule 1, vrije base 4,.4 _ . 2,4_

Hoewel de uitvinding is beschreven aan de hand van voorkeursuitvoeringsvormen en specifieke voorbeelden, zullen deskundigen inzien dat diverse veranderingen en modi-25 ficaties kunnen worden aangebracht zonder af te wijken van de geest en beschermihgsomvang van dè uitvinding. De uitvinding moet dus worden opgevat als niet beperkt door de voorgaande gedefinieerde beschrijving, maar als gedefinieerd door de bijgevoegde conclusies en hun equivalenten.

30 Alle Amerikaanse en buitenlandse octrooien, gepubli ceerde octrooiaanvragen en andere hierin geciteerde referenties zijn hier in hun geheel als referentie opgenomen.

10258.42

Claims (10)

1. Fosfaatzout van 8-fluor-2-(4-methylaminomethyl-f enyl j -1,3,4,5 -1 etrahydroazepi.no [ 5,4,3 - cd] indool - 6-on.

2. Farmaceutisch preparaat van de verbinding volgens 10 conclusie 1, dat geschikt is voor orale toediening en dat een farmaceutisch effectieve dosis van de verbinding volgens conclusie 1 en een farmaceutisch aanvaardbare drager daarvan omvat.

3. Farmaceutisch preparaat van de verbinding volgens 15 conclusie 'l, dat geschikt is voor toediening door middel van injectie en dat een farmaceutisch effectieve dosis van de verbinding volgens conclusie 1 en een farmaceutisch aanvaardbare drager daarvan omvat.

4. Chemotherapeutische combinatie van een farmaceu-20 tisch effectieve dosis 8-fluor-2-(4-methylaminomethyl- fenyl)-1,3,4,5-tetrahydro-azepino[5#4,3-cdJindool-6-on-fosfaat en een chemotherapeutisch middèl gekozen uit iri-notecan, temozolomide en dacarbazine. . 5. Chemotherapeutische combinatie volgens conclusie 25 4, waarbij het chemotherapeutische middel irinotecan is.

6. Chemotherapeutische combinatie volgens conclusie 4/ waarbij het. chemotherapeutische middel temozolomide is.

7. Chemotherapeutische combinatie volgens conclusie... . -4,. waarbij het chemotherapeutische middel dacarbazine is. 30,8. Werkwijze voor het verbeteren van de effectiviteit van. een cytotoxisch geneesmiddel of radiotherapie toegediend aan een zoogdier tijdens therapeutische behandeling, welke werkwijze omvat; het aan het zoogdier toedienen van een effectieve PARP-remmende hoeveelheid van de verbinding. 35 volgens, conclusie 1 in combinatie met de toediening van het. cytotöxische geneesmiddel of radiotherapie. 1025 842 r .....^

9. Werkwijze voor het beschermen tegen schade als gevolg van hartspierischemie of reperfusie bij .een zoogdier, omvattende? het aan het zoogdier toedienen van een effectieve hoeveelheid van de verbinding volgens conclusie 1.

10. Werkwijze voor het reduceren van neurotoxiciteit al gevolg van een beroerte, een hoofdletsél of een neuro-degeneratieve ziekte bij een zoogdier, omvattende? het aan het zoogdier toedienen van een effectieve hoeveelheid van de verbinding volgens conclusie 1.

11. Werkwijze voor het vertragen van het begin van celveroudering . geassocieerd met huidveroudering bij een zoogdier, omvattende? het aan fibroblastcellen in· het zoogdier toedienen van een effectieve . PARP-remmende hoeveelheid van de verbinding volgens conclusie 1.

12. Werkwijze voor het voorkomen van het begin van insulineafhankelijke diabetes bij een zoogdier, omvattende het aan het zoogdier toedienen van de verbinding volgens conclusie 1. 20 ft · 1025842 ' . . "