MXPA06013435A

MXPA06013435A - Composiciones y metodos referentes a inhibidores de sintesis de pirimidina.

Info

Publication number: MXPA06013435A
Application number: MXPA06013435A
Authority: MX
Inventors: Sadis Matalon; Ian C Davis
Original assignee: Uab Research Foundation
Priority date: 2004-05-21
Filing date: 2005-05-20
Publication date: 2007-03-23
Also published as: JP2008500393A; EP1763346A4; AU2005257862A1; WO2006001961A3; CN1993125A; US20070219224A1; BRPI0511290A; EP1763346A2; KR20070044399A; WO2006001961A2; CA2567602A1

Abstract

En la presente invencion se proveen composiciones que comprenden un inhibidor de la sintesis de pirimidina y un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Dichas composiciones se pueden utilizar en metodos para incrementar la depuracion de fluido dependiente de Na+ por parte de una celula del epitelio pulmonar; para tratar una enfermedad pulmonar en un individuo; para reducir uno o mas sintomas o signos fisicos de una infeccion por virus del sincitio respiratorio en un individuo; para identificar a un individuo en riesgo de infeccion por virus del sincitio respiratorio y administrar al individuo una composicion que comprende una cantidad efectiva de un inhibidor de la sintesis de pirimidina; para identificar a un individuo con infeccion del virus del sincitio respiratorio y administrar al individuo una composicion que comprenda un inhibidor de la sintesis de pirimidina en una cantidad efectiva para reducir el fluido alveolar dependiente de Na+ en el individuo; y para efectuar un tamizaje respecto a un compuesto de prueba que incremente la absorcion de fluido dependiente de Na+ por una celula del epitelio pulmonar.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS REFERENTES A INHIBIDORES DE SÍNTESIS DE PIRIMIDINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y métodos relacionados con inhibidores de la síntesis de pirimidina. Además en la presente invención se proveen composiciones que comprenden un inhibidor de la síntesis de pirimidina y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El virus del sincitio respiratorio (RSV por sus siglas en inglés) es la causa más común de enfermedad del tracto respiratorio inferior (LRT por sus siglas en inglés) en infantes y niños en todo el mundo, y también puede ser sub-diagnosticada como una causa de infecciones de LRT adquiridas en la comunidad entre adultos. Durante los años de 1980-1996, se presentó un estimado de 1.65 millones de hospitalizaciones por bronquiolitis entre niños menores de 5 años de edad, lo que da razón de los 7.0 millones de pacientes hospitalizados en la actualidad. 57% de estas hospitalizaciones ocurre entre niños menores de 6 meses y 81% entre aquellos menores de 1 año. Entre los niños menores de 1 año, las tasas anuales de hospitalización por bronquiolitis se incrementaron 2.4 veces, desde 12.9 por cada 1,000 en 1980 hasta 31.2 por cada 1,000 en 1996. La proporción de hospitalizaciones para enfermedades del tracto respiratorio inferior entre niños menores de 1 año asociadas con bronquiolitis se incrementó desde 22.2% en 1980 hasta 47.4% en 1996; entre las hospitalizaciones totales, esta proporción se incrementó desde 5.4% hasta 16.4%. Un cálculo de 51,240 hasta 81,985 hospitalizaciones anuales por bronquiolitis entre niños menores de 1 año están relacionadas con infección por RSV. Si también se consideran las hospitalizaciones por bronquiolitis con neumonía, la infección por RSV da razón de hasta 126,000 hospitalizaciones por año solamente en los Estados Unidos de Norteamérica. En la actualidad, no existe tratamiento efectivo para RSV. La rinorrea, congestión pulmonar e hipoxemia son componentes significativos de la mayoría de las infecciones respiratorias, incluyendo infección por RSV, pero los mecanismos subyacentes a la dinámica de fluido pulmonar alterada en dichas enfermedades se entienden muy poco. Asimismo, los estudios epidemiológicos sugieren un fuerte vínculo entre bronquiolitis grave inducida por virus del sincitio respiratorio (RSV) en la infancia y enfermedad alérgica. La infección por RSV también es de capital importancia en ganado en el cual dichas infecciones pueden dar como resultado enfermedad grave del tracto respiratorio. En la técnica son necesarios métodos y composiciones mejoradas para prevenir y tratar infecciones respiratorias incluyendo infecciones por RSV.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En la presente invención se proveen composiciones que comprenden un inhibidor de la síntesis de pirimidina y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones son apropiadas para administración por vía tópica a una célula del epitelio pulmonar de un individuo. En la presente invención también se provee un dispositivo que comprende por lo menos una dosis medida de una composición que comprende una cantidad terapéutica de un inhibidor de la síntesis de pirimidina. Cada dosis medida comprende una cantidad terapéutica o una porción de la misma del inhibidor de la síntesis de pirimidina para tratar una enfermedad pulmonar en un individuo. En la presente invención también se proveen métodos para incrementar la depuración de fluido dependiente de NA+ por parte de las células del epitelio pulmonar, para tratar una enfermedad pulmonar en un individuo, para reducir uno o más síntomas o signos físicos de una infección por virus del sincitio respiratorio en un individuo, para identificar a un individuo en riesgo de infección por virus del sincitio respiratorio y administrar al individuo una composición que comprenda una cantidad efectiva de un inhibidor de la síntesis de pirimidina, para identificar a un individuo con una infección por virus del sincitio respiratorio y administrar al individuo una composición que comprenda un inhibidor de la síntesis de pirimidina en una cantidad efectiva para reducir el fluido alveolar dependiente de NA+ en el individuo, y para efectuar el tamizaje respecto a un compuesto de prueba que incremente la absorción de fluido dependiente de NA+ por parte de una célula del epitelio pulmonar. Las ventajas adicionales quedarán indicadas en parte en la siguiente descripción, y en parte serán evidentes a partir de la descripción, o se pueden aprender practicando los aspectos descritos más adelante. Las ventajas descritas más adelante se pueden realizar y obtener por medio de los elementos y combinaciones particularmente señaladas en las reivindicaciones anexas. Se debe entender que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son únicamente para ejemplo y explicativas y que no son restrictivas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras anexas, las cuales están incorporadas en, y constituyen parte de la descripción, ilustran varios aspectos descritos más adelante. La figura 1 es un diagrama esquemático que ilustra las rutas de biosíntesis de pirimidina y purina. La figura 2 muestra el efecto de infección por RSV sobre la oxigenación periférica. (A) Transcurso del efecto de infección por RSV sobre Sm02 (saturación de oxígeno mixto) en ratones BALB/c conscientes (n = 10-36 por día) . (B) Trazos de electrocardiograma de 3 plumas de muestra al inicio y final del período de depuración de fluido alveolar (AFC) para ratones con infección simulada y ratones infectados con RSV en d2. (C) Efecto de la infección por RSV sobre %?HR30 en d2 (n = 17 para ratones con infección simulada; n = 11 para ratones infectados con RSV). *p<0.05, en comparación con ratones con infección simulada . La figura 3 muestra el efecto de infección por RSV sobre la diferencia de potencial nasal (NPD) en ratones BALB/c. (A) Trazos representativos de NPD en un ratón con infección simulada y un ratón con infección de RSV en d4. (B) Efecto de infección por RSV sobre NPD basal. (C) Efecto de infección por RSV sobre la componente sensible a amilorida de NPD (NPDAMIL) . (D) Trazos de muestra del cambio en NPD con la aplicación de pulsos de ± 60 nA al epitelio nasal en un ratón con infección simulada y un ratón con infección por RSV en d4. (E) Efecto de la infección por RSV sobre ?NPD después de la aplicación de pulsos de ±60 nA al epitelio nasal, n = 5-9 para todos los grupos. La línea punteada en los trazos de muestra indica 0 mV en la gráfica, la flecha indica el tiempo de la adición de amilorida 100 µM. *p<0.05, **p<0.005, en comparación con animales con infección simulada. La figura 4 muestra el efecto de la inhibición de síntesis de nucleótido sobre el peso corporal después de la infección por RSV. (A) Efecto de leflunomida (un inhibidor de la síntesis de UTP) sobre pérdida de peso aguda después de la infección por RSV en ratones BALB/c (n = 35 para ratones no tratados; n = 19 para ratones tratados con leflunomida) . (B) Efecto del tratamiento con 6-MP sobre la pérdida aguda de peso después de la infección por RSV en ratones BALB/c (n = 35 para ratones no tratados; n = 30 para ratones tratados con 6-MP) . *p<0.05, **p<0.005, ***p<0.0005, en comparación con el peso corporal en ratones no tratados en cada punto de tiempo. La figura 5 muestra el efecto de alimentar por sonda a ratones con leflunomida (LEF) revierte la inhibición de AFC mediada por RSV en el día 2 p.i. El efecto de LEF se evita mediante la administración concomitante de uridina. La figura 6 muestra el efecto de alimentar por sonda a ratones con leflunomida (LEF) invierte el incremento inducido por RSV en el contenido de agua pulmonar en el día 2 p.i. El efecto de leflunomida se evita mediante la administración concomitante de uridina. Como un aspecto importante, el tratamiento de los ratones con LEF y/o uridina no tiene efecto sobre la replicación viral en tejido pulmonar en el día 2 p.i. La figura 7 muestra los efectos de la adición de" un amplio espectro de inhibidores de los canales aniónicos regulados por volumen (VRAC) al instilado de AFC invierte la inhibición de AFC mediada por RSV en el día 2 p.i. La figura 8 muestra el efecto de la inhibición de síntesis de nucleótido sobre el contenido de agua pulmonar después de la infección con RSV. (A) Efectos del tratamiento con leflunomida y uridina sobre el contenido de agua pulmonar en d2 (n = 7-8 para todos los grupos) . (B) Efecto de 6-MP sobre el contenido de agua pulmonar en d2 (n = 8 para ratones no infectados; n = 7 para ratones no tratados, infectados con RSV; n = 15 para ratones tratados con 6-MP) . El contenido de agua pulmonar se mide mediante el cociente de peso húmedo: seco. ***p<0.0005, en comparación con el cociente de peso húmedo: peso seco de ratones no infectados. La figura 9 muestra el efecto de la inhibición de síntesis de nucleótido sobre la replicación de RSV en pulmones de ratón. (A) Efectos del tratamiento con leflunomida y uridina sobre la replicación viral en d2 (n = 6 para ratones no tratados, ratones tratados con uridina y ratones tratados con leflunomida y uridina; n = 12 para ratones tratados con leflunomida) . (B) Efecto de 6-MP sobre la replicación de virus en d2 (n = 6 para ratones no tratados; n = 12 para ratones tratados con 6-MP) . (C) Efectos del tratamiento continuo con leflunomida sobre la replicación viral en d8 (n = 6 para ratones no tratados; n = 12 para ratones tratados con leflunomida) . (D) Efectos del tratamiento con leflunomida hasta d2 sobre la replicación viral en d8 (n = 6 para ambos grupos) . La línea punteada indica los límites de detección de la prueba. ***p<0.0005, en comparación con el título viral en ratones no tratados. La figura 10 muestra el efecto del tratamiento con leflunomida sobre hiperoxemia después de la infección por RSV. (A) Efecto del tratamiento con leflunomida sobre Sm02 en ratones en d2 (n = 8 para ratones no tratados, infectados con RSV; n = 7 para ratones infectados con RSV tratados con leflunomida) . (B) Efecto de infección por RSV y tratamiento con leflunomida sobre %?HR30 en d2 (n = 11 para ratones infectados con RSV, no tratados; n = 9 para ratones infectados con RSV, tratados con leflunomida) . *p<0.05, en comparación con valores no tratados. La figura 11 muestra los efectos del tratamiento con leflunomida sobre NPD en ratones BALB/c. (A) Trazos de muestra de NPD en un ratón infectado con RSV, tratado con leflunomida en d4. (B) Efecto del tratamiento con leflunomida sobre NPD basal en ratones infectados con RSV.

(C) Efecto del tratamiento con leflunomida sobre NPDAMIL en ratones infectados con RSV. n = 5-9 para todos los grupos. La línea punteada en los trazos de muestra indica 0 mV en la gráfica, la flecha indica el tiempo de adición de amilorida 100 µM. *p<0.05, **p<0.005, en comparación con NPD en animales no tratados. La figura 12 muestra que la infección con RSV inhibe en forma significativa la depuración de fluido alveolar basal (AFC) en los días 2 y 4 después de la infección (p.i.). La simulación de infección (M) no tiene efecto sobre AFC, comparada con ratones no infectados (U) . La AFC basal se inhibe en un 43% (a partir de valores con simulación de infección) en el día 2 y en un 26% en el día 4. También se reduce la sensibilidad de AFC a amilorida en el día 1, y está ausente en los días 2 y 4 p.i. La figura 13 muestra que la adición de un inhibidor de dihidro-orotato reductasa (A77-1726 25 µm) al instilado de AFC revierte la inhibición de AFC mediada por RSV en el día 2 p.i. El efecto de A77-1726 es completamente revertido por la adición concomitante de uridina 50 mM al instilado de AFC, pero no es recapitulada por genisteína 25 mM (un inhibidor no específico de tirosina cinasa) . La figura 14 muestra que la adición de inhibidores de IMP deshidrogenasa (6-MPA o MPA 25 µm) al instilado de AFC tiene solamente un efecto menor sobre la inhibición de AFC mediada por RSV en el día 2 p.i. El efecto pequeño de los inhibidores de IMP deshidrogenasa es una consecuencia de la depleción de ATP, el cual es un precursor necesario para la síntesis de pirimidina de novo . El efecto de MPA se revierte completamente mediante la adición concomitante de hipoxantina (HXA) 50 mM al instilado de AFC, lo que permite la síntesis de ATP a través de la ruta de rescate de purina.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se puede entender más fácilmente mediante referencia a la siguiente descripción detallada de modalidades preferidas de la invención y los ejemplos incluidos en la misma y a las figuras y su descripción previa y posterior. A través de toda esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones. Las descripciones de estas publicaciones en sus totalidades se incorporan en la presente invención para referencia en esta solicitud con el fin de describir de manera más completa el estado de la técnica a la cual ésta pertenece. Las referencias descritas también se incorporan de manera individual y específicamente para referencia en la misma por el material contenido en éstas que se discute en la oración en la cual se basa la referencia. Tal como se utiliza en la descripción y en las reivindicaciones anexas, las formas en singular "un", "una" y "el (la)" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un inhibidor de la síntesis de pirimidina" incluye mezclas de uno o más inhibidores de la síntesis de pirimidina, y similares. De igual manera, la referencia a "una célula epitelial pulmonar" incluye una o más células del epitelio pulmonar. Por lo tanto, por ejemplo, una composición apropiada para administración a "una célula del epitelio pulmonar" es apropiada para administración a una o más de dichas células. Se pueden utilizar abreviaturas a lo largo de toda la descripción y tienen los siguientes significados. Dichas abreviaturas incluyen, pero no se limitan a AFC (depuración de fluido alveolar), ALF (fluido del recubrimiento de las vías aéreas), BALF (fluido de lavado bronquioalveolar) , ?NPD (cambio en la diferencia de potencial nasal) , DHOD (dihidro-orotato deshidrogenasa) , HXA (hipoxantina), HRSTART (frecuencia cardiaca al inicio del período de ventilación), HREND (frecuencia cardiaca al final del período de ventilación) , LEF (leflunomida) , MPA (ácido micofenólico) , 6-MP ( 6-mercaptopurina) , NPD (diferencia de potencial nasal) , NPDAMIL (componente sensible a amilorida de la diferencia de potencial nasal) , NRte (resistencia trans-epitelial nasal) , %?HR30 (% en cambio en la frecuencia a través de un período de ventilación de 30 minutos) , P2YR (receptor de nucleótido purinérgico P2Y) , RSV (virus del sincitio respiratorio) , Sm02 (saturación promedio de oxígeno en hemoglobina), y VRAC (canal aniónico regulado por volumen) . Asimismo, también se puede utilizar otras abreviaturas, las cuales pueden ser claras para el experto en la técnica y/o son claras a partir del contexto en el cual se utiliza la abreviatura dada. Los intervalos se pueden expresar en la presente invención como desde "aproximadamente" un valor particular, y/o hasta "aproximadamente" otro valor particular. Cuando se expresa dicho intervalo, otra modalidad incluye desde aquel valor particular y/o hasta el otro valor particular. De igual manera, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente "aproximadamente", se entenderá que el valor particular forma otra modalidad. También se entenderá que los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relación al otro punto final, como de manera independiente del otro punto final. Tal como se utiliza a lo largo de toda la descripción, con el término un "sujeto" se pretende decir un individuo. Por lo tanto el "individuo" puede incluir animales domesticados, tales como gatos, perros, etc, ganado (por ejemplo, bovino, equino, porcino, ovino, caprino, etc), animales de laboratorio (por ejemplo, ratón, conejo, rata, cobayo, etc) y aves. En un aspecto, el individuo es una especie bovina tal como, por ejemplo, Bos taurus , Bos indicus , o cruzas de los mismos. En otro aspecto, el individuo es un mamífero tal como un primate o un humano. "Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrita inmediatamente después puede o no presentarse, y que la descripción incluye casos en los cuales el evento o circunstancia sucede y casos en los cuales no sucede. Por ejemplo, la frase "opcionalmente la composición puede comprender una combinación" significa que la composición puede comprender una combinación de moléculas diferentes o puede no incluir una combinación de modo tal que la descripción incluye tanto la combinación como la ausencia de la combinación (es decir, miembros individuales de la combinación) . Los términos "más alto", "incrementa", "eleva", o "elevación" se refieren a incrementos por encima de un valor de control (por ejemplo un nivel basal) . Los términos "bajo", "más bajo", "reduce", o "reducción" se refieren a decrementos por debajo de un valor de control (por ejemplo, un nivel basal) . Por ejemplo, los niveles básales son niveles normales in vivo antes de, o en ausencia de, la adición de un agente tal como, leflunomida, A77-1726 u otro inhibidor de la síntesis de pirimidina. Los niveles de control también pueden incluir niveles provenientes de un individuo o muestra en ausencia de un estado patológico. El valor de control se puede determinar a partir del mismo individuo o individuos o muestra o muestras antes de o después de la enfermedad o tratamiento. El valor de control puede provenir de un individuo o individuos o muestra o muestras diferentes en ausencia de la enfermedad o tratamiento. En la presente invención se proveen composiciones que comprenden un inhibidor de la síntesis de pirimidina y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones se pueden utilizar en métodos para incrementar la depuración de fluido dependiente de Na+ por parte de una célula epitelial pulmonar; para tratar una enfermedad pulmonar en un individuo; para reducir uno o más síntomas o signos físicos de una infección por virus del sincitio respiratorio en un individuo; para identificar un individuo en riesgo de infección por virus del sincitio respiratorio y administrar al individuo una composición que comprende una cantidad efectiva de un inhibidor de la síntesis de pirimidina; para identificar a un individuo con infección por virus del sincitio respiratorio y administrar al individuo una composición que comprenda un inhibidor de la síntesis de pirimidina en una cantidad efectiva para reducir el fluido alveolar dependiente de Na+ en el individuo; y para efectuar el tamizaje respecto a un compuesto de prueba que incremente la absorción de fluido dependiente de Na+ por parte de una célula del epitelio pulmonar, los cuales se describen con mayor detalle más adelante. Tal como se utiliza en la presente invención "tratar" incluye la reducción de síntomas o signos físicos de una infección respiratoria dada en el individuo. Por lo tanto, las composiciones y métodos descritos se pueden utilizar para reducir uno o más síntomas o signos físicos de una infección respiratoria en un individuo. Dichos síntomas y signos físicos incluyen, pero no se limitan a, rinorrea, hipoxemia, edema pulmonar, función cardiaca disminuida, tos, pérdida de peso, sibilancia, caquexia, y congestión pulmonar. Una enfermedad de ejemplo, para la cual es útil el tratamiento con las composiciones y métodos descritos, es la infección por virus de sincitio respiratorio (RSV) . RSV inhibe la depuración del fluido alveolar (AFC) dependiente de Na+ en ratones BALB/c, y tanto los antagonistas de receptor de nucleótido P2Y como las enzimas pirimidinolíticas evitan la inhibición de AFC. La infección por RSV da como resultado la liberación tanto de UTP como de ATP en el ALF y la reducción en AFC está asociada con la fase temprana de infección por RSV lo que da como resultado deterioro fisiológico significativo del hospedero. En los pulmones de infantes ventilados por infección por RSV grave, los niveles de las proteínas tensoactivas SP-A y SP-D están reducidos, la cantidad del fosfolípido tensoactivo principal, dipalmitil-fosfatidilcolina está disminuida, y la actividad de superficie biofísica del compuesto tensoactivo recuperado está deteriorada en comparación con infantes de control (Kerr y Patton, 1999) . Aunque se han utilizado agentes broncodilatadores de tipo agonistas de receptor beta-adrenérgico (ßARA) para mejorar la depuración de fluido alveolar en el síndrome de dificultad respiratoria en adultos elevando el AMPc intracelular, la señalización mediada por receptor beta-adrenérgico en el epitelio respiratorio es anormal después de la infección por RSV, lo cual puede explicar la baja eficacia de ßARA en terapia para RSV. Por lo tanto, en el caso de infección por RSV, los métodos y composiciones descritas se utilizan para incrementar los niveles de fosfolípidos tensoactivos, tales como dipalmitilfosfatidilcolina, en infantes o para mejorar la eficacia de agentes broncodilatadores de tipo agonistas de receptor beta-adrenérgico (ßARA) . Asimismo, los estudios epidemiológicos sugieren un fuerte vínculo entre la bronquiolitis inducida por virus del sincitio respiratorio (RSV) grave en la infancia y enfermedad alérgica. Las composiciones y métodos provistos en la presente invención son útiles durante la infección por RSV para reducir la hiper-sensibilidad de vías aéreas inducida por RSV y la predisposición al desarrollo posterior de asma. La infección por RSV también es de importancia principal en ganado (es decir en Bos taurus y Bos indicus, o en cruzas de los mismos) y puede dar como resultado enfermedad grave del tracto respiratorio. La depuración de fluido alveolar está relacionada con el transporte iónico en células del epitelio pulmonar. Por ejemplo, la pared del epitelio alveolar consiste de dos tipos de células: células tipo I y células tipo II. Las células tipo I cubren la fracción más grande del epitelio alveolar (aproximadamente 95%) . Las células de tipo II producen compuesto tensoactivo. Actualmente se cree que tanto las células de tipo I como las de tipo II transportan iones de sodio en una manera activa. La bomba de sodio-potasio, ubicada en la superficie basolateral de las células del epitelio, establece un gradiente electroquímico a través de la membrana apical el cual favorece que los iones de sodio entren desde el espacio alveolar hacia el citoplasma. El sodio cruza el epitelio alveolar principalmente a través de proteínas denominadas canales. Una vez en el citoplasma estos son extruídos a través de la membrana basolateral por la bomba de sodio-potasio la cual utiliza ATP. Para conservar la neutralidad eléctrica, los iones cloruro siguen el movimiento de los iones sodio a través de las rutas ubicadas ya sea entre las células o a través de los canales celulares. El movimiento de los iones crea una diferencia de presión osmótica entre el espacio intersticial y alveolar favoreciendo la reabsorción de fluido. El transporte activo de sodio desempeña un papel importante al limitar la cantidad de fluido en el espacio alveolar en un número de condiciones patológicas (infecciones virales, neumonías, lesión pulmonar aguda, etc) . Bajo condiciones básales, el proceso de transporte de ion dominante del epitelio respiratorio es el transporte de iones Na+ activo, sensible a amilorida, desde el fluido del lumen hacia el espacio intersticial subyacente al epitelio. Los iones Na+ en el fluido del recubrimiento alveolar (ALF) se difunden pasivamente hacia las células del epitelio bronquio-alveolar predominantemente a través del canal de Na+ epitelial sensible a amilorida, selectivo de Na+ y de catión (ENaC) en la membrana apical. Los iones Cl" siguen el movimiento de Na+ a través de rutas para-celulares, o posiblemente a través del regulador de trans-membrana de fibrosis quística (CFTR) , para mantener la neutralidad eléctrica. El transporte de NaCl crea un gradiente osmótico trans-epitelial . Debido a que la permeabilidad del agua trans-epitelial del epitelio respiratorio es elevada, el gradiente ocasiona que el agua se mueva pasivamente desde el espacio aéreo hacia el intersticio, con lo cual se depura el fluido del espacio aéreo. La inhibición de AFC mediada por RSV está asociada con hipoxemia, función cardiaca deteriorada y contenido incrementado de UTP y ATP del fluido de lavado bronquioalveolar. Asimismo, a pesar de la ausencia de un efecto anti-viral directo sobre la replicación de RSV en los pulmones, la inhibición sistémica de la síntesis de pirimidina de novo con leflunomida mejora no solamente AFC y el contenido de agua en los pulmones, sino también los deterioros fisiológicos (incluyendo, peso corporal reducido, Sm02 y función cardiaca deprimidas, y diferencia de potencial nasal alterada) en ratones infectados con RSV. La inhibición de AFC mediada por RSV se puede evitar utilizando mediante bloqueo farmacológico de los canales de anión regulados por volumen (VRAC) lo que demuestra que son necesarias la síntesis de UTP de novo y la liberación a través de los VRAC para que ocurra la inhibición de AFC mediada por RSV, y lo que demuestra que la síntesis de pirimidina de novo y la ruta de liberación es un objetivo atractivo para terapias con inhibidor diseñadas para aliviar los síntomas de infección por RSV u otras infecciones respiratorias. La figura 1 es un diagrama esquemático que ilustra las rutas de biosíntesis de pirimidina y purina. UTP se sintetiza de novo a partir de glutamina, ATP y HCO3". UTP también se puede sintetizar a partir de uridina a través de una ruta de rescate. Leflunomida y su metabolito activo, A77-1726, inhiben ambos la actividad de dihidro-orotato deshidrogenasa, la cual convierte el dihidro-orotato en orotato. Ambos agentes bloquean la síntesis de pirimidina de novo pero no tienen efecto sobre la ruta de rescate de pirimidina, o sobre la síntesis de purina . Opcionalmente, la composición comprende un inhibidor de la síntesis de pirimidina que es leflunomida.

De manera opcional, la composición comprende un inhibidor de la síntesis de pirimidina que es A77-1726. De manera opcional, la composición comprende una combinación de leflunomida y A77-1726 y/o una combinación de leflunomida o A77-1726 con otro inhibidor de la síntesis de pirimidina. Leflunomida, un profármaco cuyo metabolito activo es A77-1726, se utiliza para el tratamiento de artritis reumatoide, bajo el nombre comercial ARAVA® (Aventis Pharmaceuticals, Bridgewater, NJ) . Tanto leflunomida como A77-1726 actúan como inhibidores de la enzima dihidro-orotato reductasa (también conocida como dihidro-orotato deshidrogenasa o dihidro-orotasa) , la cual es un componente del complejo enzimático trifuncional CAD (carbamil fosfato sintetasa, aspartato transcarbamilasa, y dihidro-orotasa) , un componente central de la ruta de síntesis de pirimidina de novo . Por lo tanto, al igual que leflunomida y A77-1726, la composición puede ser un inhibidor de dihidro-orotato reductasa. Las composiciones se pueden administrar in vivo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Con la frase "farmacéuticamente aceptable" se quiere decir un material que no sea biológicamente o de alguna otra manera indeseable. Por lo tanto, el material se puede administrar a un individuo, sin ocasionar efectos biológicos indeseables o sin que interactúe en una manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la cual éste está contenido. Desde luego, el vehículo se puede seleccionar para reducir al mínimo cualquier degradación del ingrediente activo y para reducir al mínimo cualesquiera efectos secundarios adversos en el individuo, como es bien sabido por el experto en la técnica. Los materiales pueden estar en solución, suspensión (por ejemplo, incorporados en micropartículas, liposomas o células) . Estos se pueden dirigir a un tipo de célula particular mediante anticuerpos, receptores, o ligandos de receptor. Los vehículos apropiados y sus formulaciones se describen en Remington : The Science and Practice of Pharmacy (19a ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995. Típicamente, se utiliza una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable en la formulación para hacer que la formulación sea isotónica. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. El pH de la solución de preferencia es de 5 aproximadamente hasta 8.5 aproximadamente, y de manera más preferida desde 7.8 aproximadamente hasta 8.2 aproximadamente. Los vehículos adicionales incluyen preparaciones de liberación sostenida tales como matrices semi-permeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen al anticuerpo, cuyas matrices están en forma de artículos configurados, por ejemplo, películas, liposomas o micro-partículas. Será evidente para los expertos en la técnica que pueden ser más preferidos algunos vehículos dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración y la concentración de la composición que se está administrando. Por ejemplo, está dentro de la habilidad en la técnica, elegir un vehículo particular apropiado para administración por inhalación y/o intranasal, o para composiciones apropiadas para administración por vía tópica a una célula del epitelio pulmonar. Las composiciones también pueden incluir espesantes, diluyentes, reguladores de pH, conservadores, agentes tensoactivos y similares además de las composiciones y vehículos. Las composiciones también pueden incluir uno o más ingredientes activos tales como agentes anti-microbianos, agentes anti-inflamatorios, anestésicos, y similares. Las composiciones descritas son apropiadas para administración por vía tópica a una célula del epitelio pulmonar o a una pluralidad de células del epitelio pulmonar de un individuo. Por lo tanto, las composiciones que comprenden un inhibidor de la síntesis de pirimidina son opcionalmente apropiadas para administración vía inhalación, (es decir, la composición es un inhalante) . Además, las composiciones opcionalmente están en forma de aerosol. E, incluso, las composiciones opcionalmente están nebulizadas. La administración de las composiciones mediante inhalación puede ser a través de la nariz o la boca mediante suministro utilizando un mecanismo de aspersión o de gotas minúsculas. El suministro también puede ser directamente a cualquier área del sistema respiratorio (por ejemplo pulmones) vía intubación. De manera opcional, la célula del epitelio pulmonar a la cual se administra una composición está ubicada en la cavidad nasal, pasaje nasal, nasofaringe, faringe, tráquea, bronquios, bronquiolos, o alvéolos del individuo. De manera opcional, la célula del epitelio pulmonar a la cual se administra una composición es una célula del epitelio bronquioalveolar. Asimismo, si las composiciones se administran a una pluralidad de células del epitelio pulmonar, las células se pueden estar ubicadas opcionalmente en cualquiera o en todas las ubicaciones anatómicas anteriores, o en una combinación de dichas ubicaciones . La administración por vía tópica a una célula del epitelio pulmonar, por consiguiente, se puede efectuar mediante suministro pulmonar a través de nebulización, utilización de aerosol o instilación directa a los pulmones. Por lo tanto, las composiciones apropiadas para administración por vía tópica a una célula del epitelio pulmonar en un individuo incluyen composiciones apropiadas para administración de inhalante, por ejemplo como una preparación nebulizada o convertida en aerosol. Por ejemplo, las composiciones se pueden administrar a un individuo mediante un inhalador, por ejemplo, un inhalador de dosis medida o un inhalador de polvo seco, un insuflador, un nebulizador o cualesquiera otro método conocido convencionalmente para administrar medicamentos inhalables . Las composiciones de la presente invención pueden ser una solución inhalable. La solución inhalable puede ser apropiada para administración mediante nebulización. Las composiciones también se pueden proveer como una suspensión acuosa. De manera opcional, la formulación de la presente invención comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de la síntesis de pirimidina en una suspensión acuosa. De manera opcional, las composiciones se pueden administrar por medio de un aerosol presurizado que comprende, por separado, un inhibidor de la síntesis de pirimidina, o sal o un éster del mismo con por lo menos un propelente apropiado o con un agente tensoactivo o una mezcla de agentes tensoactivos. Se puede utilizar cualquier propelente convencionalmente conocido. También se proveen en la presente invención combinaciones que comprenden una composición provista en la presente invención y un nebulizador. También se describen en la misma contenedores que comprenden los agentes y composiciones descritas en la presente. El contenedor puede ser, por ejemplo, un aspersor nasal, un nebulizador, un inhalador, una botella, o cualesquiera otros medios para contener la composición en una forma para administración a una superficie de las mucosas. De manera opcional, el contenedor puede suministrar una dosis medida de la composición . Se puede utilizar cualquier nebulizador con las composiciones y métodos descritos. En particular, los nebulizadores para uso en la presente invención nebulizan formulaciones líquidas, incluyendo las composiciones provistas en la presente, sin que contengan propelente. El nebulizador puede producir la niebla nebulizada utilizando cualquier método conocido por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, aire comprimido, ondas ultrasónicas, o vibración. El nebulizador también puede tener un deflector interno. El deflector interno, junto con el alojamiento del nebulizador, elimina selectivamente gotas grandes de la niebla mediante choque y permite que las gotas minúsculas regresen al depósito. Las gotas de aerosol finas producidas de esta manera son arrastradas hacia el pulmón por el aire/oxígeno que se inhala. Por lo tanto, los nebulizadores que nebulizan las formulaciones líquidas que no contienen propelente son apropiadas para ser utilizadas con las composiciones provistas en la presente invención. Los ejemplos de dichos nebulizadores son conocidos en la técnica y se pueden conseguir comercialmente. Los nebulizadores para uso en la presente invención también incluyen, pero no se limitan a, nebulizadores de ráfaga, nebulizadores ultrasónicos, y otros. Los ejemplos de nebulizadores de ráfaga son conocidos en la técnica y se pueden conseguir comercialmente . Las composiciones se pueden esterilizar mediante filtración y utilizar para llenar frascos, incluyendo frascos de dosis unitaria lo que provee formulaciones de dosis unitarias estériles que son utilizadas en un nebulizador y se nebulizan de manera apropiada. Cada frasco de dosis unitaria se puede esterilizar y nebulizar de manera apropiada sin contaminar otros frascos o la siguiente dosis. De manera opcional, las composiciones descritas están en una forma apropiada para administración por vía intranasal. Dichas composiciones son apropiadas para suministro en la nariz y pasajes nasales a través de una o ambas fosas nasales y puede comprender el suministro mediante un mecanismo aspersor o mecanismo de gota minúscula, o a través de utilización de aerosol. Si las composiciones se utilizan en un método en el cual no se utiliza la administración pulmonar por vía tópica, las composiciones se pueden administrar utilizando otros medios conocidos en la técnica, por ejemplo, por vía oral, por vía parenteral (por ejemplo, por vía intravenosa) , mediante inyección intramuscular, mediante inyección intra-peritoneal, y por vía transdérmica. En la presente invención también se provee un dispositivo que comprende por lo menos una dosis medida de una composición que comprende una cantidad terapéutica de un inhibidor de la síntesis de pirimidina en el cual cada dosis medida comprende una cantidad terapéutica o una porción de la misma del inhibidor de la síntesis de pirimidina para tratar una enfermedad pulmonar en un individuo. El inhibidor de la síntesis de pirimidina puede comprender un inhibidor de la síntesis de pirimidina como el descrito anteriormente, o combinaciones del mismo. También se provee en la presente invención un método para incrementar la depuración de fluido dependiente de Na+ por parte de una célula del epitelio pulmonar que comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un inhibidor de la síntesis de pirimidina. El contacto ocasiona que la célula tenga una depuración de fluido dependiente de Na+ incrementada. De manera opcional, la célula del epitelio pulmonar se pone en contacto in vivo . De manera opcional, la célula del epitelio pulmonar se pone en contacto in vi tro . También se provee un método para tratar una enfermedad pulmonar en un individuo que comprende, poner en contacto una pluralidad de células del epitelio pulmonar en el individuo con una cantidad efectiva de un inhibidor de la síntesis de pirimidina. La cantidad efectiva del inhibidor de la síntesis de pirimidina ocasiona depuración de fluido alveolar dependiente de Na+ incrementada en el individuo. El método se puede utilizar en casos en los cuales el individuo tiene o está en riesgo de desarrollar infección por virus del sincitio respiratorio. Otros patógenos pulmonares que ocasionan enfermedad para la cual se puede utilizar el método descrito incluyen pero no se limitan a Paramixovirus (virus del sincitio respiratorio [humano y bovino] , metapneumovirus, parainfluenza, sarampión) , ortomixovirus (virus de influenza A, B, y C) , poxvirus (viruela, viruela de los monos); hantavirus del Nuevo Mundo, Rhinovirus, Coronavirus (agente del síndrome respiratorio agudo grave) , Herpesvirus (virus de Herpes simplex, citomegalovirus) , Streptococcus pneumoniae, Hemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa , Mycobacterium tuberculosis , Micoplasma pneumoniae, Bacillus anthracis, Legionella pneumophila , Klebsiella pneumoniae, Chlamydia , Listeria monocytogenes , Pasteurella multocida , y Burkholderia cepacia . También se provee un método para reducir uno o más síntomas o signos físicos de una infección por virus del sincitio respiratorio en un individuo en riesgo de una infección por virus del sincitio respiratorio que comprende, administrar al individuo una composición que comprende una cantidad efectiva de un inhibidor de la síntesis de pirimidina. Como se describió anteriormente, dichos síntomas o signos físicos incluyen, pero no se limitan a, rinorrea, hipoxemia, edema pulmonar, función cardiaca reducida, tos, pérdida de peso, sibilancia, caquexia, y congestión pulmonar. Un individuo en riesgo de una infección por virus del sincitio respiratorio puede ser diagnosticado fácilmente por un experto en la técnica. Por ejemplo, dicha determinación puede ser efectuada por un médico o veterinario tomando como base el historial médico del individuo, los síntomas/signos físicos que presenta, examen físico, pruebas de diagnostico o cualquier combinación de los mismos. También se provee un método que comprende, identificar a un individuo en riesgo de una infección por virus del sincitio respiratorio y administrar al individuo una composición que comprende una cantidad efectiva de un inhibir de la síntesis de pirimidina. Asimismo, se provee un método que comprende, identificar a un individuo con una infección por virus del sincitio respiratorio y administrar al individuo una composición que comprende un inhibidor de la síntesis de pirimidina en una cantidad efectiva para reducir el fluido alveolar dependiente de Na+ en el individuo. En los métodos descritos, el inhibidor de la síntesis de pirimidina es opcionalmente leflunomida, A77-1726, o combinaciones de los mismos. Además, se puede utilizar leflunomida y/o A77-1726 en los métodos descritos en combinación con uno o más de otros inhibidores de la síntesis de pirimidina. Los términos "cantidad efectiva" y "dosis efectiva" o "cantidad terapéutica" se utilizan de manera intercambiable. El término "cantidad efectiva" se define como cualquier cantidad necesaria para producir una respuesta fisiológica deseada. Las cantidades y programas efectivos para administrar las composiciones utilizadas en los métodos descritos se pueden determinar empíricamente, y el elaborar dichas determinaciones está dentro de la habilidad en la técnica. Los intervalos de dosis efectiva para la administración de las composiciones utilizadas en los métodos descritos son aquellas lo suficientemente grandes para producir el efecto deseado en los cuales se afectan los síntomas del trastorno. La dosis no debe ser tan grande que ocasione efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas, y similares. En términos generales, la cantidad o dosis terapéutica puede variar con la edad, condición, sexo y grado de la enfermedad en el individuo, vía de administración, o si se incluyen o no otros fármacos en el régimen, y puede ser determinada por el experto en la técnica. El médico o veterinario individual puede ajustar la dosis en caso de cualesquiera contraindicaciones. La dosis puede variar, y se puede administrar en una o más administraciones de dosis diariamente, durante uno o varios días. La cantidad efectiva requerida de las composiciones utilizadas en los métodos descritos puede variar en función del método utilizado y del trastorno de vías aéreas que está siendo tratado, el inhibidor de la síntesis de pirimidina particular y/o vehículo utilizado, y el modo de administración, y similares. Por lo tanto, no es posible especificar una cantidad exacta para cada composición. Sin embargo, el experto en la técnica puede determinar una cantidad apropiada utilizando solamente experimentación de rutina dadas las enseñanzas en la presente invención. Por ejemplo, la dihidro-orotato reductasa o inhibidor de la síntesis de pirimidina utilizado in vivo se puede administrar a una dosis de aproximadamente 10-50 mg/kg, a una dosis de aproximadamente 25-45 mg/kg, o a una dosis de aproximadamente 30-40 mg/kg. Las cantidades terapéuticas, cantidades efectivas, o dosis efectivas de A77-1726, leflunomida, y/u otro inhibidor de pirimidina se pueden administrar mediante aerosol a intervalos razonables y permanecer efectivas. Por ejemplo, se puede administrar una dosis efectiva de las composiciones descritas en la presente invención una vez por día, dos veces por día, cuatro veces por día o una vez 0 más por hora durante un día, varios días, una semana o más. Por lo tanto, por ejemplo, las composiciones se pueden administrar una vez cada 1, 2, 4, 8, 12, ó 24 horas, o combinaciones o intervalos de los mismos, por una duración de 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, o durante 1 semana o más o cualquier intervalo o combinación de los mismos. Con intervalos se quiere decir cualquier incremento de tiempo dentro de los valores provistos. Por lo tanto, la composición, por ejemplo, se puede administrar cada tres horas a través de 12 horas etc. De manera opcional, la composición se administra una sola vez. Dichos cursos de tiempo pueden ser determinados por el experto en la técnica utilizando, por ejemplo, los parámetros descritos anteriormente para determinar una dosis efectiva.

La eficacia de administración de una dosis particular de las composiciones de conformidad con los métodos descritos en la presente invención se puede determinar evaluando los aspectos particulares del historial médico, signos, síntomas, y pruebas de laboratorio objetivas que son conocidas como útiles para evaluar la condición de un individuo con infección pulmonar, tal como una infección por RSV, o uno que esté en riesgo de contraer dicha infección. Estos signos, síntomas, y pruebas de laboratorio objetivas pueden variar, en función de la enfermedad o condición particular que está siendo tratada o prevenida, como es sabido por cualquier médico clínico que trata a dichos pacientes o un investigador que conduce experimentación en este campo. Por ejemplo, si, tomando como base una comparación con un grupo de control apropiado y/o el conocimiento del avance normal de la enfermedad en la población general del individuo particular: 1) se demuestra que se mejora la condición física del individuo (por ejemplo, se reduce o elimina la congestión pulmonar), 2) se demuestra que se estabiliza, desacelera, o revierte el avance de la enfermedad, infección, o 3) se disminuye o elimina la necesidad respecto a otros medicamentos para tratar la enfermedad o condición, entonces se puede considerar que un régimen de tratamiento particular es eficaz. Dichos efectos pueden ser determinados en un solo individuo en una población (por ejemplo, utilizando estudios epidemiológicos) . Las enseñanzas en la presente invención también se pueden utilizar en métodos de tamizaje. Por ejemplo, en la presente invención se provee un método de tamizaje para un compuesto de prueba que incremente la absorción de fluido dependiente de Na+ por parte de la célula del epitelio pulmonar que comprende poner en contacto una célula del epitelio pulmonar con el compuesto de prueba en presencia de un exceso de UTP, detectar la absorción de fluido dependiente de Na+ por parte de la célula del epitelio pulmonar, un incremento en la absorción de fluido dependiente de Na+ en comparación con un control indica un compuesto de prueba que incrementa la absorción de fluido dependiente de Na+ por parte de la célula del epitelio pulmonar. De manera opcional, las células se ponen en contacto in vivo . De manera opcional, las células se ponen en contacto in vi tro. El método puede comprender también de manera opcional remover el UTP y detectar la capacidad de reversión del incremento en la absorción de fluido dependiente de Na+. En otro ejemplo de método de tamizaje, un método de tamizaje para un compuesto de prueba que incremente la absorción de fluido dependiente de Na+ comprende poner en contacto el compuesto de prueba con una célula que exprese un ácido nucleico heterólogo que codifique para un gen de la síntesis de pirimidina, y detectar la absorción de fluido dependiente de Na+ por parte de la célula, un incremento en la absorción de fluido dependiente de Na+ en comparación con un nivel de control, indica un compuesto de prueba que incrementa la absorción de fluido dependiente de Na+. De manera opcional, las células se ponen en contacto in vivo . De manera opcional, las células se ponen en contacto in vi tro . Otro método de tamizaje para un compuesto de prueba que incremente la absorción de fluido dependiente de Na+ por parte de la célula del epitelio respiratorio comprende infectar una célula o línea celular H441 con RSV, poner en contacto la célula o línea celular infectada con el compuesto de prueba, y medir el transporte de iones a través de la célula infectada o las células de la línea de célula infectada. Un incremento en el transporte de iones a través de una célula o línea celular H441 cuando se compara con un control indica un compuesto de prueba que incrementa la absorción de fluido dependiente de Na+. El transporte de iones se puede comparar con el transporte de iones a través de una célula o línea celular de control, la cual opcionalmente puede ser una línea celular H441 no infectada con RSV, o puede ser una célula o línea celular H441 infectada en ausencia del compuesto de prueba. De manera opcional, el compuesto de prueba comprende un inhibidor de la síntesis de pirimidina. De manera opcional, las células se ponen en contacto in vivo . Opcionalmente, las células se ponen en contacto in vi tro .

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se presentan para proveer a los expertos en la técnica con una descripción y divulgación completa de los métodos reclamados en la presente, y pretenden ser puramente ejemplares de la invención y no pretenden limitar el campo de lo que los inventores consideran como su invención excepto hasta el grado en que estos queden incluidos en las reivindicaciones anexas. Se han hecho esfuerzos para asegurar exactitud con respecto a los números (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc) , pero se deben permitir algunos errores y desviaciones .

Métodos Preparación de inóculos virales e infección de ratones La preparación de soluciones de reserva virales y la infección intranasal de ratones BALB/c libres de patógeno de ocho a doce semanas de edad de cualquier sexo con la cepa A2 de RSV (106 PFU en 100 µl) se efectúa como se describe en Davis et al . "Nucleotide-mediated inhibition of alveolar fluid clearance in BALB/ mice after respiratory syncytial virus infection", Am . J. Physiol . Lung Cell Mol . Physiol . 286 : L112-L120. (2004). Los datos para cada grupo experimental se obtienen a partir de un mínimo de 2 infecciones independientes.

Medición de la saturación promedio de oxígeno de sangre periférica La saturación de oxígeno de sangre periférica se mide en ratones conscientes, utilizando un detector PREEMIE OXYTIP® (Datex-Ohmeda, Inc., Madison, Wl), conectado a un oxímetro de pulso TUFFSAT™ (Datex-Ohmeda, Inc., Madison, Wl). Debido a la frecuencia de pulso extremadamente rápida del ratón, los valores de oximetría son valores de saturación promedio de 02 de hemoglobina (Sm02) provenientes de sangre arterial y venosa. La medición de la frecuencia cardiaca cambia con la ventilación. Los trazos de ECG se utilizan para medir la frecuencia cardiaca (número de complejos QRS/cm) al inicio (HRSTART) y final (HREND) de la prueba de AFC. El % en cambio en la frecuencia a través del período de ventilación de 30 minutos (%?HR30) se calcula como (HRSTART-HREND) /HRSTART.

Medición de la diferencia de potencial nasal Se mide la diferencia de potencial a través de las fosas nasales de ratones anestesiados (con la cola como referencia) como fue descrito previamente Grubb et al . (1994) "Hyperabsorption of Na+ and raised Ca (2+) -mediated Cl" secretion in nasal epithelia of CF mice", Am . J.

Physiol 266:C1478-C1483. Se registra una NPD de línea basal durante la perfusión del epitelio nasal con solución de Ringer con lactato. Se determina la componente sensible a amilorida de NPD (NPDAMIL) mediante perfusión con solución de Ringer con lactato que contiene 100 µM de amilorida. Se aplican pulsos de corriente de ±60 nA a través del epitelio utilizando una batería de 12 Voltios en serie con una resistencia de 200 MO. Se registran los cambios en NPD (?NPD) en respuesta a los pulsos de corriente (proporcional a la resistencia trans-epitelial nasal, NRt) .

Lavado bronquioalveolar Se recolecta el fluido de lavado bronquioalveolar (BALF) como se describió previamente en Davis et al . (2004), utilizando 1 ml de solución salina normal estéril para pruebas ELISA de citocina, o 0.3 ml de solución salina estéril para pruebas de nucleótido. Los lavados se centrifugan para retirar las células y los sobrenadantes se guardan a -80°C.

Medición de nucleótidos en BALF Se desnaturalizan las nucleotidasas endógenas en BALF (100°C, 3 minutos) y se mide el contenido de UTP/ATP utilizando las pruebas de UDP-glucosa pirofosforilasa y luciferina-luciferasa, respectivamente.

Medición del grupo hemo en BALF El contenido de grupo hemo en BALF se mide espectrofotométricamente utilizando la prueba de Drabkins.

Inhibición sistémica de la síntesis de novo de pirimidina y purina Se administra leflunomida (5-metilisoxazol-4- [4-trifluorometil] carboxanilida, 35 mg/kg en agua destilada que contiene 1% de metilcelulosa) una vez por día mediante alimentación con sonda en un volumen de 300 µl/ratón durante 8 días antes de la infección, después a lo largo de todo el período de infección. Los controles de vehículo se administran mediante alimentación con sonda con un volumen equivalente de 1% de metilcelulosa en agua destilada. Se administra uridina (1 g/kg en NaCl al 0.9%) mediante inyección intraperitoneal cada 12 horas en un volumen de 100 µl (8) . Se administra 6-MPA (35 mg/kg en NaOH 1N, pH ajustado a 7.9 con Na2HP04 2M) mediante inyección i.p. cada 24 horas en un volumen de 100 µl, durante 5 días antes de la infección, después a lo largo de todo el período de infección.

Medición de citocinas pro-inflamatorias en BALF Se determinan los niveles de citocina utilizando estuches para pruebsa ELISA Quantikine M (R & D Systems), de conformidad con las instrucciones del fabricante.

Análisis estadístico Se calculan las estadísticas descriptivas utilizando el software Instat (GraphPad, San Diego, CA) .

Las diferencias entre las medias de grupo se analizan mediante ANOVA o la prueba t de Student, con pruebas posteriores apropiadas. Todos los valores de los datos se presentan como media ± error estándar.

Resultados Efecto de la infección por RSV sobre la oxigenación de sangre periférica El deterioro de AFC basal en d2 se asocia con una reducción pequeña pero significativa en Sm02 de sangre periférica en comparación con animales con infección simulada (figura 2A) . No se encuentra una declinación en Sm02 en otros puntos de tiempo. Como un índice adicional de hipoxemia, se evalúan los registros de ECG de 3 plumas provenientes de ratones con infección simulada e infectados con RSV en d2 respecto a la evidencia de alteraciones en la frecuencia cardiaca durante el curso de la medición de AFC (%?HR30) . La infección con RSV está asociada con un incremento significativo en %?HR30 en d2 (figura 2B y 2C) . No existe diferencia en la duración de la anestesia entre los dos grupos .

Efectos de la infección de RSV sobre la diferencia de potencial nasal La infección con RSV durante 2 días no tiene efecto sobre NPD basal (diferencia de potencial nasal) o NPDAMIL (componente sensible a Amilorida 6 de la diferencia de potencial nasal) en ratones BALB/c, en comparación con animales con infección simulada. Sin embargo, NPD basal y NPDAMIL se reducen significativamente en d4 y d8 (figura 3A-3C) . Como una estimación de NRt (resistencia trans-epitelial basal) después de la infección por RSV, se mide el cambio en NPD (?NPD) inducido por la aplicación de un pulso de ± 60 nA al epitelio nasal. ?NPD es significativamente mayor en d4 y d8 que en los controles con infección simulada (figura 3D-3E) .

Efecto de la infección por RSV y la inhibición de síntesis de nucleótido sobre nucleótidos de BALF BALF proveniente de ratones no infectados contienen niveles equivalentes de ATP y UTP, los cuales no se ven afectados por la infección simulada. Sin embargo, la infección con RSV da como resultado un aumento al doble de los niveles de UTP y ATP en d2, sin un incremento concomitante en el contenido de grupo hemo de BALF (7.3 ± 1.4 µM en d2, contra 7.3 ± 0.7 µM en ratones no infectados) . Los nucleótidos de BALF regresan a los niveles de control en d6 (tabla 1) . No se detecta incremento en los niveles de nucleótido en BALF en d2 en ratones infectados con RSV tratados con leflunomida. De hecho, el tratamiento con leflunomida reduce el contenido de BALF de ambos nucleótidos hasta niveles por debajo de aquellos en ratones no infectados, no tratados (tabla 1) . El tratamiento concomitante con uridina no sólo revierte el efecto de leflunomida sobre los niveles de UTP y ATP en BALF sino que también ocasiona un incremento significativo en el contenido de nucleótido de BALF con respecto a aquel en ratones infectados con RSV no tratados.

TABLA 1 Efecto de infección por RSV e inhibición de síntesis de nucleótido sobre los niveles de nucleótido de BALF A: Número de ratones por grupo en los cuales se evalúan los niveles de nucleótido B : Concentración promedio de nucleótido en BALF ± error estándar (nmolar/1 ) c : Ratones tratados con leflunomida D: Ratones tratados con leflunomida y uridina . * *p<0 . 005 , ***p<0 . 0005 , en comparación con ratones no infectados Efecto de la inhibición de síntesis de nucleótido sobre el peso corporal del ratón Durante el período de pre-tratamiento, leflunomida no ocasiona una declinación significativa en el peso corporal, en comparación con ratones tratados con metilcelulosa o no tratados. De manera más importante, durante el período de infección, la terapia con leflunomida reduce en forma significativa el grado de pérdida de peso normalmente observado en ratones BALB/c en DI y d2 (figura 4). La administración concomitante de uridina a través del período de tratamiento con leflunomida no evita este efecto. Opuesto a este hallazgo, el tratamiento con 6-MP da como resultado una pérdida significativa de peso corporal a lo largo de todo el período de pre-infección, baja tolerancia a la anestesia (lo que da como resultado muertes esporádicas) , y un incremento significativo en la pérdida de peso corporal en DI y d2, en comparación tanto con ratones infectados con RSV, no tratados, como en ratones infectados con RSV tratados con leflunomida (figura 4B) .

Efecto de la inhibición de síntesis de nucleótido sobre la inhibición de AFC mediada por RSV El pre-tratamiento de ratones infectados con RSV con leflunomida bloquea la inhibición de AFC inducida por RSV en d2 (tabla 2) . Este efecto no es imitado por la alimentación mediante sonda con metilcelulosa sola, y se revierte mediante tratamiento concomitante con uridina. El tratamiento con uridina solo no tiene efecto sobre AFC. El tratamiento con leflunomida también da como resultado la restauración de la sensibilidad normal a amilorida a AFC: 57% de AFC en ratones tratados con leflunomida en d2 es sensible a amilorida, en comparación con el 61% en ratones no infectados y -8% en ratones no tratados en d2. En contraste al efecto benéfico de la terapia con leflunomida, un régimen similar de pre-tratamiento sistémico con el inhibidor de la síntesis de purina de novo 6-mercaptopurina (6-MP) no tiene efecto sobre AFC en d2 (tabla 2). Por último, el tratamiento de ratones no infectados con leflunomida da como resultado una inhibición significativa de AFC.

TABLA 2 Efecto de la inhibición de síntesis de nucleótido sobre la inhibición de AFC mediada por RSV en d2 TABLA 2 (cont.) Número de ratones en los cuales se evalúa AFC % de AFC promedio ± error estándar AFC con amilorida 1.5 mM agregada al instilado Ratones tratados con leflunomida Ratones tratados con metilcelulosa Ratones tratados con uridina Ratones tratados con leflunomida y uridina Ratones tratados con 6-mercaptopurina **p<0.005, ***p<0.0005, en comparación con AFC en d2 ttt p<0.0005, en comparación con AFC en d2 AMIL Para bloquear sistémicamente la síntesis de novo de pirimidina, a los ratones se les alimenta mediante sonda una vez al día durante 8 días con 300 ml/ratón del inhibidor de dihidro-orotato reductasa (DHOR) leflunomida (5 mg/kg suspendidos en metilcelulosa al 1%) o vehículo antes de la infección, después a las 0 y 24 horas p.i. Los estudios de AFC se efectúan a las 48 horas p.i., sin adiciones al instilado de AFC. En casos en los que se indique, se hacen intentos para revertir los efectos de leflunomida (LEF) mediante la administración concomitante de uridina a lo largo de todo el período de tratamiento con leflunomida (1 mg/kg I.P., cada 12 horas) . Como se muestra en la figura 5, la alimentación mediante sonda a los ratones con leflunomida (LEF) revierte la inhibición de AFC mediada por RSV en el día 2 p.i. El efecto de LEF se evita mediante la administración concomitante de uridina. LEF no tiene efectos sobre AFC en ratones normales. El tratamiento con LEF también da como resultado una reducción significativa en la pérdida de peso en los días 1 y 2 p.i. y en las concentraciones de citocina pro-inflamatoria del lavado bronquio-alveolar (IFN-a, Il-lb, TNF-a, KC) . Como se muestra en la figura 6, la alimentación mediante sonda con leflunomida (LEF) a ratones revierte el incremento inducido por RSV en el contenido de agua pulmonar en el día 2 p.i. El efecto de leflunomida se evita mediante la administración concomitante de uridina. Como un aspecto importante, el tratamiento de los ratones con LEF y/o uridina no tiene efecto sobre la replicación de virus en el tejido pulmonar en el día 2 p.i. Como se muestra en la figura 7, la adición de un amplio espectro de inhibidores de los canales de anión regulados por volumen (VRAC) al instilado de AFC revierte la inhibición de AFC mediada por RSV en el día 2 p.i. Aunque algunos inhibidores utilizados también tienen efectos disparados sobre una variedad de otras funciones celulares, estos agentes tienen únicamente la inhibición de VRAC como un efecto común. Sin embargo, NPPB (100 mM) es relativamente específico de VRAC. Este hallazgo demuestra que UTP es liberado de las células a través de los VRAC durante la infección temprana con RSV. Fluoxetina (10 mM) también actúa como un inhibidor selectivo de la reabsorción de serotonina. Verapamil (10 mM) también actúa como un bloqueador del canal de Ca++. Tamoxifen (25 mM) es además un anti-estrógeno. El virus del sincitio respiratorio inhibe AFC sensible a amilorida (indicativo del transporte activo de Na+) en puntos de tiempo tempranos después de la infección en un modelo de ratón de BALB/c, sin inducir citopatología del epitelio respiratorio significativa. Asimismo, los efectos inhibidores de RSV sobre AFC son mediados por UTP, a través de su acción sobre los receptores purinérgicos P2Y en el pulmón. El UTP, el cual media la inhibición de AFC inducida por RSV en el día 2 después de la infección se deriva de la síntesis de novo, y la inhibición de esta ruta evita las reducciones en AFC inducidas por RSV y los incrementos en el contenido de agua pulmonar sin alterar la replicación viral. Además, el UTP, el cual media la inhibición de AFC inducida por RSV en el día 2 después de la infección se libera a través de los canales de anión regulados por volumen. Se demuestran los efectos de leflunomida sobre la inhibición de AFC inducida por RSV en el día 2 p.i. Los ratones se tratan previamente durante 8 días con leflunomida (5 mg/kg, suspendidos en metilcelulosa al 1%, una vez al día) mediante alimentación por sonda oral, después se infectan con RSV y se tratan con leflunomida de nuevo a 24 horas p.i. Este régimen evita la inhibición de AFC inducida por RSV en el día 2 p.i. El efecto no es imitado por la alimentación por sonda con metilcelulosa sola, y es revertida mediante administración concomitante de uridina a lo largo de todo el período de tratamiento con leflunomida (1 mg/kg i.p., cada 12 horas durante 10 días). De nuevo, el tratamiento con uridina sola no tiene efecto sobre AFC. El tratamiento con leflunomida tampoco tiene efecto perjudicial sobre AFC en ratones normales (con infección simulada) .

TABLA 3 Efectos de leflunomida sobre la inhibición de AFC inducida por RSV en el día 2 p.i.

Tratamiento nA AFC 0BASAL Ninguno 23 21.19 ± 0.94 Metilcelulosa 11 22.89 ± 1.27 Leflunomida 12 33.4 ± 3.00*** Uridina 19 22.89 ± 2.22 Leflunomida + uridina 10 21.9 ± 2.69 Leflunomida (ratones con 7 33.16 ± 2.40*** infección simulada) A: Número de ratones en los cuales se evalúa AFC; B: % de AFC basal media después de 30 minutos ± error estándar; ***p<0.0005 (con relación a ratones sin tratar). AFC3OBASA en ratones BALB/c con infección simulada es 37.21 ± 1.2í (n = 8) El efecto inhibidor de leflunomida no es simplemente un resultado de un efecto anti-viral. La replicación viral no se ve afectada por tratamiento con metilcelulosa, leflunomida, o uridina. Por lo tanto, la abrogación de inhibición de AFC inducida por RSV no es una consecuencia simple de evitar la replicación viral, sino el resultado de un efecto inhibidor específico de leflunomida sobre la síntesis de pirimidina de novo . La terapia con leflunomida está asociada con una normalización de los cocientes de peso húmedo: seco pulmonar (un índice del contenido de agua del pulmón y de la formación de edema) , lo's cuales se incrementan en el día 2 después de la infección con RSV. El tratamiento concomitante con uridina revierte este efecto y da como resultado cocientes incrementados de peso húmedo: seco (en comparación con ratones con infección simulada) . La terapia con leflunomida reduce en forma significativa el grado de pérdida de peso normalmente observado en ratones BALB/c en los días 1 y 2 p.i., lo que sugiere un efecto benéfico sobre el apetito (posiblemente relacionado con los efectos anti-inflamatorios) . Esto también sugiere una toxicidad muy limitada de leflunomida a esta dosis. La terapia con leflunomida mejora la saturación promedio de 02 en sangre en el día p.i., cuando un grado de hipoxemia es normalmente evidente. La terapia con leflunomida reduce en forma significativa los niveles de citocina pro-inflamatoria (interferón a, interleucina-lß, KC [el homólogo de múrido de interleucina-8 de humano] y factor a de necrosis tumoral) del lavado bronquio-alveolar, un efecto que es revertido sólo parcialmente por la terapia concomitante con uridina (y el cual puede, por lo tanto, ser parcialmente una consecuencia de la inhibición de la tirosina cinasa no específica por parte del fármaco) . Tomados juntos, estos datos demuestran que leflunomida tiene varios efectos benéficos sobre la enfermedad de RSV, sin tener efectos anti-virales directos. Estos efectos incluyen la abrogación de hipoxemia y edema pulmonar, mejoras en peso corporal, y reducciones en inflamación pulmonar.

Efecto de la inhibición de síntesis de nucleótido sobre el contenido de agua de pulmón La terapia sistémica con leflunomida restaura los cocientes de peso húmedo: seco pulmonares normales en el día 2, mientras que la administración concomitante de uridina a lo largo de todo el período de tratamiento con leflunomida evita este efecto (figura 8A) . Sin embargo, la terapia sistémica con 6-MP, la cual no tiene efecto benéfico sobre AFC en el día 2, no altera los cocientes de peso húmedo: seco de pulmón en el día 2 (figura 8B) .

Efecto de la inhibición de síntesis de nucleótido sobre las citocinas pro-inflamatorias Leflunomida se utiliza clínicamente como un agente inmuno-supresor . Para confirmar la eficacia del régimen de tratamiento, se analiza su efecto sobre los niveles de citocinas pro-inflamatorias en BALF. No se puede detectar IL-4 o IL-10 en ningún punto de tiempo después de la infección. Solamente se detectan cantidades pequeñas de IL-lß y KC (el homólogo de múrido de IL-8 de humano) en BALF proveniente de ratones con infección simulada (tabla 4). Están presentes cantidades significativas de todas las otras citocinas excepto IFN-? en d2, pero los niveles de IL-lß, KC, y TNF-? declinan en d4-d8. Cantidades significativas de IFN-? se encuentran únicamente en BALF en d6 y d8. La terapia con leflunomida reduce en forma significativa los niveles de IFN-ß, IL-lß, KC y TNF-a en BALF en d2 (tabla 4) . Con excepción de IFN-a, este efecto es solo parcialmente revertido por la terapia concomitante con uridina. Como un aspecto importante, la terapia con 6-MP da como resultado una declinación comparable en los niveles de IFN-a, IL-lß, KC y TNF-a de BALF comparable con aquella ocasionada por la terapia con leflunomida (tabla 4). No existen diferencias significativas entre los niveles de IFN-a, IL-lß, KC, y TNF-a en ratones tratados con cualquier agente en d2.

TABLA 4 Efecto de la infección de RSV y de la inhibición de síntesis de nucleótido sobre la citocinas pro-inflamatorias de BALF Número de ratones en los cuales se miden los niveles de citocina de BALF Concentración media de citocina en BALF ± error estándar (pg/ml) Ratones tratados con leflunomida Ratones tratados con leflunomida y uridina Ratones tratados con 6-mercaptopurina No efectuado *p<0.0005, en comparación con los niveles en d2 Efecto de la inhibición de la síntesis de nucleótido sobre la replicación de RSV en pulmones de ratón La replicación viral en d2 no se ve afectada por el tratamiento con cualquiera de leflunomida o uridina (figura 9A) . De igual manera, el pre-tratamiento con 6-MP no tiene efecto inhibidor significativo sobre la replicación viral en pulmones de ratón en d2 (figura 9B) . Cuando se continúa el tratamiento con leflunomida a través de todo el período de infección de 8 días, la replicación de virus persiste a niveles elevados en d8 (figura 9C) . Sin embargo, cuando se suspende el tratamiento con leflunomida después de d2, la replicación viral se incrementa sólo en forma mínima en d8 (figura 9D) .

Efecto de la terapia con leflunomida sobre hipoxemia después de infección por RSV La terapia con leflunomida da como resultado una normalización de las lecturas de Sm02 en d2 (figura 10A) . De igual manera, la terapia con leflunomida evita el incremento en %?HR30 observado en ratones infectados con RSV durante los procedimientos de AFC en d2 (figura 10B) .

Efectos de la terapia con leflunomida sobre la diferencia de potencial nasal después de la infección con RSV El tratamiento con leflunomida a lo largo de todo el período de infección evita completamente las declinaciones inducidas por RSV en NPD basal y NPDAMIL (figura 11A-11C) .

Efecto del bloqueo del canal aniónico sobre la inhibición de AFC mediada por RSV La inhibición de AFC mediada por RSV en d2 se bloquea mediante la adición al instilado de AFC de cada uno de varios inhibidores de VRAC no relacionados estructuralmente: fluoxetina, tamoxifen, clomifeno, verapamil, NPPB, o IAA-94 (tabla 5) . Este efecto es revertido por la adición concomitante de 500 nM de UTP al instilado. En contraste, AFC en d2 no se ve afectado por inhibición del regulador de trans-membrana de fibrosis quística y la actividad de canal de Cl" activado por Ca2+, con glibenclamida y ácido niflúmico, respectivamente .

TABLA 5 Efecto de la adición de inhibidores del canal aniónico al instilado de AFC sobre la inhibición de AFC mediada por RSV en d2 TABLA 5 (cont.) Número de ratones en los cuales se evalúa AFC % de AFC promedio ± error estándar Acido 5-nitro-2- (3-fenilpropilamino) benzoico Acido R ( + ) - [ ( 6, 7-dicloro-2-ciclopentil-2 , 3-dihidro-2-metil-l-oxo- lH-inden-5il ) -oxi ] acético 94 rp<0. 005 , * * *p<0. 0005, en comparación con AFC30BASA en d2 Efectos de A77-1726 de la inhibición de AFC mediada por RSV Como se sabia previamente, la infección intra-nasal de ratones BALB/c con la cepa A2 del virus del sincitio respiratorio (RSV) da como resultado AFC basal y sensible a amilorida reducidas en los días 2 y 4 después de la infección (p.i.), y esta inhibición es mediada por UTP, actuando a través de los receptores P2Y (AJPLCMP, 2004). También se ha demostrado que la inhibición de AFC mediada por RSV en el día 2 p.i. se evita mediante la adición al instilado de AFC de A77-1726 25 mM, el cual bloquea la síntesis de pirimidina de novo , pero no por cualquiera de ácido micofenólico 25 mM o 6-mercaptopurina 25 mM, de los cuales ambos bloquean la síntesis de purina de novo . El bloqueo mediado por A77-1726 es revertido por la adición de uridina 50 mM (la cual permite la síntesis de pirimidina a través de la ruta de rescate) y no es recapitulada por genisteína 25 mM (la cual simula los efectos de inhibidor de tirosina cinasa no específico de A77-1726) , lo que indica que el efecto bloqueador de A77-1726 es mediado a través de la ruta de la síntesis de pirimidina de novo . De igual manera, el tratamiento de ratones con el inhibidor de la síntesis de pirimidina de novo leflunomida (5 mg/kg por vía oral en metilcelulosa al 1% durante 10 días) revierte el efecto inhibidor de RSV sobre AFC. Asimismo, los inhibidores de la función de canal aniónico regulado por volumen (VRAC) , tal como fluoxetina (10 mM) , verapamil (10 mM) , y tamoxifen (25 mM) también bloquean la inhibición de AFC mediada por RSV en el día 2 p.i. Juntos, estos datos demuestran que el UTP que inhibe a AFC durante la infección por RSV se obtiene a partir de la síntesis de pirimidina de novo y se libera a través de los VRAC. Estas rutas ofrecen estrategias terapéuticas novedosas para evitar reducciones en AFC inducidas por UTP, lo cual contribuye a la formación de un volumen incrementado de moco fluido, congestión de vías aéreas, y rinorrea después de la infección por RSV. Como se muestra en la figura 12, la infección con RSV inhibe en forma significativa la depuración de fluido alveolar (AFC) basal en los días 2 y 4 después de la infección (p.i.). La infección simulada (M) no tiene efecto sobre AFC, en comparación con ratones no infectados (U) . La AFC basal es inhibida en un 43% (a partir de valores con infección simulada) en el día 2 y en un 26% en el día 4. La sensibilidad de AFC a amilorida también se reduce en el día 1, y está ausente en los días 2 y 4 p.i. La inhibición de AFC mediada por RSV en el día 2 p.i. es revertida por la adición de apirasa (la cual degrada tanto a UTP como a ATP) , o UDP-glucosa pirofosforilasa (la cual degrada a UTP en presencia de glucosa-1-fosfato y pirofosfatasa inorgánica) al instilado de AFC, pero no por la adición de hexocinasa (la cual degrada a ATP en presencia de glucosa). La adición de un antagonista específico de receptor P2Y (XAMR0721 200 mM) al instilado también revierte la inhibición de AFC mediada por RSV en el día 2 p.i. Se efectúan estudios de AFC en ratones BALB/c ventilados, anestesiados con temperatura corporal y gases sanguíneos normales, a través de un período de 30 minutos después de la instilación intra-tráquea de 0.3 ml de NaCl iso-osmolar que contiene BSA al 5% libre de ácidos grasos. El número de ratones analizados por grupos se enumera en la barra relevante de cada gráfica. Como se muestra en la figura 13, la adición de un inhibidor de dihidro-orotato reductasa (A77-1726 25 µm) al instilado de AFC revierte la inhibición de AFC mediada por RSV en el día 2 p.i. El efecto de A77-1726 es completamente revertido por la adición concomitante de uridina 50 mM al instilado de AFC, pero no es recapitulado por genisteína 25 mM (un inhibidor no especifico de tirosina cinasa) . Por lo tanto, el efecto de A77-1726 es específico para la ruta de síntesis de pirimidina de novo . Como se muestra en la figura 14, la adición de inhibidores de IMP deshidrogenasa (6-MP o MPA 25 µm) al instilado de AFC tienen solamente un efecto menor sobre la inhibición de AFC mediada por RSV en el día 2 p.i. El efecto pequeño de los inhibidores de IMP deshidrogenasa es una consecuencia de la depleción de ATP, el cual es un precursor necesario para la síntesis de novo de pirimidina. El efecto de MPA es completamente revertido por la adición concomitante de hipoxantina (HXA) 50 mM al instilado de AFC, lo que permite la síntesis de ATP a través de la ruta de rescate de purina. Este hallazgo demuestra que las reservas de ATP son bajas durante la infección por RSV.

La inhibición de AFC inducida por RSV en el día 2 p.i. se evita mediante A77-1726, un inhibidor de la síntesis de pirimidina de novo El efecto de A77-1726 es bloqueado por la adición de uridina exógena, la cual promueve la síntesis de UTP a través de la ruta de rescate, y no es replicado por genisteína, la cual imita los efectos inhibidores de tirosina cinasa no específicos de A77-1726. Los inhibidores de la síntesis de purina de novo, tales como ácido micofenólico (MPA) y 6-mercaptopurina (6-MP), sólo tienen un efecto bloqueador pequeño sobre la inhibición de AFC mediada por RSV, probablemente como consecuencia de la síntesis reducida de ATP (ATP es un precursor necesario para la síntesis de pirimidina de novo) . De nuevo, este efecto es bloqueado por la adición de hipoxantina exógena, lo cual promueve la síntesis de ATP a través de la ruta de rescate. Como un aspecto interesante, la inhibición de AFC inducida por RSV en el día 2 p.i. también es evitada por una variedad de inhibidores diferentes de los canales aniónicos regulados por volumen (VRAC) , los cuales se han propuesto como un mecanismo de liberación para ATP y UTP, y mediante inhibición de Rho cinasa, la cual se sabe es activada por RSV y también se sabe que activa a los VRAC.

TABLA 6 Efectos de inhibidores de la síntesis de purina y pirimidina y los VRAC sobre la inhibición de AFC inducida por RSV en el dia 2 p.i. Objetivo Inhibidor Conc.A nB AFC30BASALC Ninguno 23 21.19 ± 0.94 Síntesis de A77-1726 25 16 34.06 ± 1.88*** pirimidina de novo A77-1726 + 25/50 12 21.3 ± 2.02 uridina Tirosina Genisteína 25 7 20.39 ± 0.73 cinasas Síntesis de MPA 25 12 26.2 ± 1.7* purina de novo 6-MPA 25 12 26.31 ± 1.85* MPA + 25/50 7 22.36 ± 2.73 hipoxantina VRACs Fluoxetina 10 16 34.54 ± 0.79*** Verapamil 10 6 33.04 ±1.49*** Tamoxifen 25 9 34.5 ± 0.95*** Clomifeno 20 8 31.0 ± 2.67** NPPB 100 7 35.12 ± 1.94*** Rho cinasas Inhibidor de 20 10 36.58 ± 2.11*** ROCK A: Concentración final (µM) ; B: Número de ratones en los cuales se evalúa AFC; c: % promedio de AFC basal clespués de 30 minutos ± error estándar; *: p<0.05; **:p<0.005; ***:p<0.0005 (todos con relación a ratones no tratados) . AFC30BASAL en ratones BALB/c con infección simulada es de 37.21 ± 1.2% (n = 8) .

Tratamiento con A77-1726 post-inf ección sobre la inhibición de AFC inducida por RSV en el día 2 p.i. Cuando los ratones se tratan a las 24 horas p.i. mediante administración intranasal de A77-1726 (50 µM en 100 µl de solución salina normal, dividido entre ambas fosas nasales) , el efecto inhibidor de RSV sobre AFC a las 24 horas p.i. es completamente bloqueado, lo que demuestra que, cuando se administra tópicamente en los pulmones, A77-1726 tiene un efecto inhibidor prolongado sobre la síntesis de novo de pirimidina. El pret-tratamiento intranasal con A77-1726 también está asociado con una normalización de los cocientes de peso húmedo: seco de pulmón (un índice de contenido de agua del pulmón y de formación de edema pulmonar) , los cuales están incrementados en el día después de la infección con RSV.

TABLA 7 Efecto del tratamiento intranasal con A77-1726 a las 24 horas p.i. sobre la inhibición de AFC inducida por RSV en el dia 2 p.i.

Estatus de la Tratamiento nA AFC30BASAL infección No infectado Ninguno 1 34 . 9 ± 2 . 5 No infectado A77-1726c 10 23. 19 ± 5 . 95** * RSV-día 2 p . i Ninguno 23 21 . 19 ± 0 . 94 RSV-día 2 p . i A77-17260 14 32 . 68 ± 1 . 1*** A- Número de ratones en los cuales se evalúa AFC; % promedio de AFC basal después de 30 minutos ± error estándar; 50 µM en 100 µl de solución salina normal, administrada por vía intranasal 24 horas antes de la prueba de AFC; D: 50 µM en 100 µl de solución salina normal, administrado por vía intranasal 24 horas después de la infección; * + * . p<0.0005 (con relación a ratones no tratados) Se pueden hacer diversas modificaciones y variaciones a los compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente. Otros aspectos de los compuestos, composiciones y métodos descritos en la misma serán evidentes a partir de la consideración de la descripción y practica de los compuestos, composiciones y métodos descritos en la presente. Se pretende que la descripción y los ejemplos se consideren como ejemplares.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Una composición que comprende un inhibidor de la síntesis de pirimidina y un vehículo farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque la composición es apropiada para administración por vía tópica a una célula del epitelio pulmonar de un individuo.

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición es un inhalante .

3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición está en forma de aerosol.

4. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición está nebulizada.

5.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es leflunomida.

6.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es A77-1726.

7. - La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es un inhibidor de dihidro-orotato reductasa.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición está en forma apropiada para administración por vía intranasal.

9.- La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la célula del epitelio pulmonar se ubica en la cavidad nasal, pasaje nasal, nasofaringe, faringe, tráquea, bronquios, bronquiolos, o alvéolos del individuo.

10.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la célula del epitelio pulmonar es una célula del epitelio bronquioalveolar.

11.- Un dispositivo que comprende por lo menos una dosis medida de una composición que comprende una cantidad terapéutica de un inhibidor de la síntesis de pirimidina caracterizado porque cada dosis medida comprende una cantidad terapéutica o una porción de la misma del inhibidor de la síntesis de pirimidina para tratar una enfermedad pulmonar en un individuo.

12.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la composición está en una forma adaptable para administración por vía tópica a una célula del epitelio pulmonar de un individuo.

13.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la composición es un inhalante.

14.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la composición está en forma de aerosol.

15.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la composición está nebulizada.

16.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es leflunomida.

17.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es A77-1726.

18.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es un inhibidor de dihidro-orotato reductasa .

19.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la composición está en una forma apropiada para administración por vía intranasal .

20.- El dispositivo de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la enfermedad pulmonar es una infección por virus del sincitio respiratorio.

21.- Un método para incrementar la depuración de fluido dependiente de Na+ por parte de una célula del epitelio pulmonar que comprende poner en contacto la célula con una cantidad efectiva de un inhibidor de la síntesis de pirimidina, caracterizado porque el poner en contacto ocasiona depuración de fluido dependiente de Na+ incrementada por parte de la célula.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la célula del epitelio pulmonar se pone en contacto in vivo .

23.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la célula del epitelio pulmonar se pone en contacto in vi tro .

24.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es leflunomida.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es A77-1726.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es un inhibidor de dihidro-orotato reductasa.

27.- Un método para tratar una enfermedad pulmonar en un individuo que comprende poner en contacto una pluralidad de células del epitelio pulmonar en el individuo con una cantidad efectiva de un inhibidor de la síntesis de pirimidina, caracterizado porque la cantidad efectiva del inhibidor de la síntesis de pirimidina ocasiona depuración incrementada del fluido alveolar dependiente de Na+ en el individuo.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la célula del epitelio pulmonar se ubica en la cavidad nasal, pasaje nasal, nasofaringe, faringe, tráquea, bronquios, bronquiolos, o alvéolos.

29.- El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la célula del epitelio pulmonar es una célula del epitelio bronquioalveolar .

30.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la enfermedad pulmonar es una infección por virus del sincitio respiratorio.

31.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina comprende leflunomida.

32.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina comprende A77-1726.

33.- El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la cantidad efectiva de un inhibidor de la síntesis de pirimidina comprende un inhibidor de dihidro-orotato reductasa.

34.- Un método para reducir uno o más síntomas o signos físicos de una infección por virus del sincitio respiratorio en un individuo en riesgo de infección por virus del sincitio respiratorio que comprende, administrar al individuo una composición que comprenda una cantidad efectiva de un inhibidor de la síntesis de pirimidina.

35.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es un inhibidor de dihidro-orotato reductasa .

36.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es leflunomida.

37.- El método de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es A77-1726.

38.- Un método que comprende identificar a un individuo en riesgo de una infección por virus del sincitio respiratorio y administrar al individuo una composición que comprenda una cantidad efectiva de un inhibidor de la síntesis de pirimidina.

39.- El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es un inhibidor de dihidro-orotato reductasa .

40.- El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es leflunomida.

41.- El método de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado porque el inhibidor de la síntesis de pirimidina es A77-1726.

42.- Un método que comprende identificar a un individuo con una infección por virus del sincitio respiratorio y administrar al individuo una composición que comprenda un inhibidor de la síntesis de pirimidina en una cantidad efectiva para reducir el fluido alveolar dependiente de Na+ en el individuo.

43.- Un método para tratar a un individuo que tiene una infección por virus del sincitio respiratorio que comprende administrar al individuo la composición de conformidad con la reivindicación 1.

44.- Un método para tratar a un individuo que tiene una infección por virus del sincitio respiratorio que comprende administrar al individuo la composición de conformidad con la reivindicación 2.

45.- Un método para tratar a un individuo que tiene una infección por virus del sincitio respiratorio que comprende administrar al individuo la composición de conformidad con la reivindicación 5.

46.- Un método para tratar a un individuo que tiene una infección por virus del sincitio respiratorio que comprende administrar al individuo la composición de conformidad con la reivindicación 8.

47.- Un método de tamizaje para un compuesto de prueba que incrementa la absorción de fluido dependiente de Na+ por parte de una célula del epitelio pulmonar que comprende poner en contacto una célula del epitelio pulmonar con el compuesto de prueba en presencia de un exceso de UTP, detectar la absorción de fluido dependiente de Na+ por la célula del epitelio pulmonar, un incremento en la absorción de fluido dependiente de Na+ en comparación con un control indica un compuesto de prueba que incrementa la absorción de fluido dependiente de Na+ por parte de una célula del epitelio pulmonar.

48.- El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque las células se ponen en contacto in vivo .

49.- El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque las células se ponen en contacto in vi tro .

50.- El método de conformidad con la reivindicación 47, que comprende también retirar el UTP y detectar la reversibilidad del incremento en la absorción de fluido dependiente de Na+.

51.- Un método de tamizaje para un compuesto de prueba que incrementa la absorción de fluido dependiente de Na+ por parte de una célula que comprende poner en contacto el compuesto de prueba con una célula que exprese un ácido nucleico heterólogo que codifique para un gen de la síntesis de pirimidina, y detectar la absorción de fluido dependiente de Na+ por la célula, un incremento en la absorción de fluido dependiente de Na+ en comparación con un nivel de control indica un compuesto de prueba que incrementa la absorción de fluido dependiente de Na+.

52.- El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque las células se ponen en contacto in vivo .

53.- El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque las células se ponen en contacto in vi tro .

54.- Un método de tamizaje para un compuesto de prueba que incrementa la absorción de fluido dependiente de Na+ por parte de una célula del epitelio respiratorio que comprende infectar una célula o línea celular H441 con virus del sincitio respiratorio, poner en contacto la célula o línea celular infectada con un inhibidor de la síntesis de pirimidina, y medir el transporte iónico a través de la célula infectada o de las células de la línea celular infectada, un incremento en el transporte de iones en comparación con un nivel de control indica un compuesto de prueba que incrementa la absorción de fluido dependiente de NaA

55.- El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque las células se ponen en contacto in vivo .

56.- El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque las células se ponen en contacto in vi tro.