CN1993125A

CN1993125A - 涉及嘧啶合成抑制剂的组合物和方法

Info

Publication number: CN1993125A
Application number: CNA2005800245614A
Authority: CN
Inventors: S·马塔朗; I·C·戴维斯
Original assignee: UAB Research Foundation
Current assignee: UAB Research Foundation
Priority date: 2004-05-21
Filing date: 2005-05-20
Publication date: 2007-07-04
Also published as: JP2008500393A; MXPA06013435A; EP1763346A4; AU2005257862A1; WO2006001961A3; US20070219224A1; BRPI0511290A; EP1763346A2; KR20070044399A; WO2006001961A2; CA2567602A1

Abstract

本发明提供一种包含嘧啶合成抑制剂和可药用载体的组合物。所述组合物可用于：使肺上皮细胞的Na⁺依赖性液体清除率增加的方法、治疗受试者肺部疾病的方法、减轻受试者的一种或多种呼吸道合胞病毒感染症状或体征的方法、鉴别具有呼吸道合胞病毒感染风险的受试者并向该受试者给予包含有效量嘧啶合成抑制剂的组合物的方法、鉴别患有呼吸道合胞病毒感染的受试者并向该受试者给予包含可有效使受试者Na⁺依赖性肺泡液减少的量的嘧啶合成抑制剂的组合物的方法、以及筛选使肺上皮细胞的Na⁺依赖性液体吸收增加的测试化合物的方法。

Description

涉及嘧啶合成抑制剂的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求要求以2004年5月21日提交的美国临时申请No.60/573,558作为优先权基础，该临时申请通过引用的方式全文纳入本说明书。

致谢

本发明是在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)No.RR17626，HL31197，HL075540，HL51173，HL72817资助款的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。

背景技术

呼吸道合胞病毒(RSV)是引起世界范围内婴儿和儿童下呼吸道(LRT)疾病的最常见的病因，它也可能是诊断不足的成人社区获得性LRT感染的病因。

1980-1996年间，5岁以下儿童中因发生细支气管炎而住院治疗的估计有一百六十五万例，由此产生七百万个住院日(inpatient day)。57％的上述的住院治疗发生于6个月以下的儿童，81％发生于一岁以下的儿童。一岁以下儿童中，年细支气管炎住院率从1980年的12.9‰至1996年的31.2‰增长了2.4倍。一岁以下儿童中，与细支气管炎有关的因下呼吸道疾病的住院治疗的比例从1980年的22.2％增长至1996年的47.4％；在总的住院治疗中，这个比例从5.4％增长至16.4％。一岁以下儿童中，年细支气管炎住院治疗中估计有51,240至81,985例与RSV感染相关。如果还考虑到伴有肺炎的细支气管炎住院治疗，仅在美国每年就有最高达126,000例住院治疗是由于RSV感染。现在对于RSV还没有有效疗法。

鼻漏、肺充血和低氧血症是包括RSV感染在内的多数呼吸道感染的重要组成部分，但对这些疾病中改变的肺部液体动力学所暗含的机制仍知之甚少。另外，流行病学研究表明婴儿中呼吸道合胞病毒(RSV)诱发的严重细支气管炎和变应性疾病关系密切。RSV感染对于牛也尤为重要，牛的这种感染会导致严重的呼吸道疾病。

本领域中所需要的是预防和治疗包括RSV感染在内的呼吸道感染的改进的方法和组合物。

发明内容

本发明提供一种包含嘧啶合成抑制剂和可药用载体的组合物。该组合物适于向受试者的肺上皮细胞局部给药。本发明还提供一种包含至少一份定量剂量的包含治疗量嘧啶合成抑制剂的组合物的装置。每份定量剂量包括治疗受试者肺部疾病的嘧啶合成抑制剂的治疗量或治疗量的一部分。

本发明还提供使肺上皮细胞的Na⁺依赖性液体清除率增加的方法，治疗受试者的肺部疾病的方法，减少受试者的一种或多种呼吸道合胞病毒感染症状或体征的方法，鉴别具有呼吸道合胞病毒感染风险的受试者并向该受试者给予包含有效量嘧啶合成抑制剂的组合物的方法，鉴别患有呼吸道合胞病毒感染的受试者并向该受试者给予包含可有效使受试者Na⁺依赖性肺泡液体减少的量的嘧啶合成抑制剂的组合物的方法，以及筛选使肺上皮细胞增加Na⁺依赖性液体吸收的测试化合物的方法。

其它优点，部分将在说明书下文中得到说明，部分将从说明书中显而易见，或者可通过实施下述方面而获知。通过随附的权利要求中具体指出的要素和组合，将认识到并获得下述的优点。应理解的是，前述的一般性说明和随后的详细说明均仅为示例性和解释性的，并非限制性的。

附图说明

附图说明了下述的多个方面内容，这些附图包含于本说明书中并且构成说明书的一部分。

图1为说明嘧啶和嘌呤生物合成途径的示意图。

图2表示RSV感染对外周氧合作用的影响。(A)在有知觉的BALB/c小鼠(每天n＝10-36)中RSV感染对SmO₂(混合氧饱和度)影响的时程。(B)假感染小鼠和RSV感染第2天的小鼠在肺泡液体清除(AFC)时期开始时和终末时的3导联ECG(心电图)描图样本。(C)RSV感染对第2天％ΔHR 30的影响(假感染小鼠n＝17；RSV感染小鼠n＝11)。与假感染小鼠比较，*p＜0.05。

图3表示RSV感染对BALB/c小鼠的鼻电位差(NPD)的影响。(A)假感染小鼠和RSV感染第4天的小鼠的NPD代表性描图。(B)RSV感染对基础NPD的影响。(C)RSV感染对NPD的氨氯吡嗪脒(amiloride)敏感部分(NPDAMIL)的影响。(D)向假感染小鼠和RSV感染第4天的小鼠的鼻上皮施加±60nA脉冲时NPD改变的描图样本。(E)向鼻上皮施加±60nA脉冲后RSV感染对ΔNPD的影响。所有组均n＝5-9。图中的描图样本上的虚线表示0mV，箭头表示加入100μM氨氯吡嗪脒的时间。与假感染动物比较，*p＜0.05，**p＜0.005。

图4表示RSV感染后，核苷酸合成的抑制对体重的影响。(A)来氟米特(leflunomide)(一种UTP合成抑制剂)对BALB/c小鼠(未治疗的小鼠n＝35；来氟米特治疗的小鼠n＝19)RSV感染后的急性体重减轻的影响。(B)6-MP治疗对BALB/c小鼠(未治疗的小鼠n＝35；6-MP治疗的小鼠n＝30)RSV感染后的急性体重减轻的影响。在各时间点与未治疗的小鼠的体重比较，*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.0005。

图5表明来氟米特(LEF)管饲小鼠的效应使p.i.第2天的RSV介导的AFC抑制逆转。LEF的效应被同时给予尿苷阻滞。

图6表明来氟米特(LEF)管饲小鼠的效应使p.i.第2天的RSV诱导的肺部含水量的增加逆转。LEF的效应被同时给予尿苷阻滞。重要的是，用LEF和/或尿苷的治疗对p.i.第二天的小鼠肺组织中的病毒复制没有作用。

图7表明向AFC滴注剂(instillate)加入广谱的容积调节的阴离子通道(VRAC)抑制剂，使p.i.第2天的RSV介导的AFC抑制逆转。

图8表示RSV感染后，核苷酸合成的抑制对肺部含水量的影响。(A)来氟米特和尿苷的治疗对第2天肺部含水量的影响(所有组均n＝7-8)。(B)6-MP对第2天肺部含水量的影响(未感染的小鼠，n＝8；未治疗的RSV感染的小鼠，n＝7；6-MP治疗的小鼠，n＝15)。通过湿重：干重之比测定肺部含水量。与未感染小鼠的湿重：干重之比比较，***p＜0.0005。

图9表示小鼠肺中核苷酸合成抑制对RSV复制的影响。(A)来氟米特和尿苷的治疗对第2天病毒复制的影响(未治疗的小鼠、尿苷治疗的小鼠以及来氟米特和尿苷治疗的小鼠，n＝6；来氟米特治疗的小鼠，n＝12)。(B)6-MP对第2天病毒复制的影响(未治疗的小鼠，n＝6；6-MP治疗的小鼠，n＝12)。(C)连续的来氟米特治疗对第8天病毒复制的影响(未治疗的小鼠，n＝6；来氟米特治疗的小鼠，n＝12)。(D)至第2天的来氟米特治疗对第8天病毒复制的影响(两组均n＝6)。虚线表示测定方法的检出限。与未治疗的小鼠的病毒滴度比较，***p＜0.0005。

图10表示来氟米特治疗对RSV感染后低氧血症的影响。(A)来氟米特治疗对第2天小鼠SmO₂的影响(未治疗的、RSV感染的小鼠，n＝8；来氟米特治疗的、RSV感染的小鼠，n＝7)。(B)RSV感染和来氟米特治疗对第2天％ΔHR30的影响(未治疗的、RSV感染的小鼠，n＝11；来氟米特治疗的、RSV感染的小鼠，n＝9)。与未治疗的值比较，*p＜0.05。

图11表示来氟米特的治疗对BALB/c小鼠的NPD的影响。(A)来氟米特治疗的、RSV感染的小鼠在第4天的NPD描图样本。(B)来氟米特的治疗对RSV感染的小鼠的基础NPD的影响。(C)来氟米特的治疗对RSV感染的小鼠的NPDAMIL的影响。所有组均n＝5-9。图中描图样本上的虚线表示0mV，箭头表示加入100μM氨氯吡嗪脒的时间。与未治疗的动物的NPD比较，*p＜0.05，**p＜0.005。

图12表明感染后(p.i.)第2天和第4天时RSV感染显著抑制基础肺泡液体清除率(AFC)。与未感染的小鼠(U)相比，假感染(M)对AFC没有影响。基础AFC在第2天被抑制43％(相对于假感染的值)，在第4天被抑制26％。AFC的氨氯吡嗪脒敏感性也在p.i.第1天降低，在p.i.第2天和第4天消失。

图13表明向AFC滴注剂加入二氢乳清酸还原酶(25μm A77-1726)逆转p.i.第2天RSV介导的AFC抑制。A77-1726的作用被同时向AFC滴注剂中加入50mM尿苷完全逆转，但不能由25mM染料木黄酮(非特异性酪氨酸激酶抑制剂)重现。

图14表明向AFC滴注剂中加入IMP脱氢酶抑制剂(25μm 6-MP或MPA)对p.i.第2天RSV介导的AFC抑制仅有很小的作用。IMP脱氢酶抑制剂较小的作用是ATP缺失的结果，而ATP是嘧啶从头合成的必需前体。由于可通过嘌呤补救途径合成ATP，MPA的作用被同时向AFC滴注剂中加入50mM次黄嘌呤(HXA)完全逆转。

具体实施方式

通过参考下文本发明优选实施方式的详细叙述及本说明书中所包括的实施例和附图以及它们的先前的和以下的说明，可使本发明更易被理解。

本申请通篇引用了各种出版物。这些出版物的公开内容通过引用的方式全文纳入本申请，以便更充分地描述与本发明有关的现有技术状况。基于倚赖参考文献的句子中所论述的包含在所述参考文献中的素材，公开的参考文献也通过引用的方式单独地并特别地纳入本说明书。

除非上下文另外清楚指明，本说明书和所附的权利要求所使用的单数形式“一种”、“一个”和“该”包括它们所指物质的复数。因此，例如，提到的“一种嘧啶合成抑制剂”包括一种或多种嘧啶合成抑制剂的混合，等等。类似地，提到的“一种肺上皮细胞”包括一种或多种肺上皮细胞。因此，例如，适于向“一种肺上皮细胞”给药的组合物即适于向一种或多种这类细胞给药。

本说明书通篇可使用一些缩写，这些缩写具有以下含义。所述缩写包括但不限于AFC(肺泡液体清除(率))、ALF(airspace lining fluid，气室衬里层液体)、BALF(支气管肺泡灌洗液)、ΔNPD(鼻电位差的变化)、DHOD(二氢乳清酸脱氢酶)、HXA(次黄嘌呤)、HRSTART(通气期初始时的心率)、HREND(通气期结束时的心率)、LEF(来氟米特)、MPA(霉酚酸)、6-MP(6-巯基嘌呤)、NPD(鼻电位差)、NPDAMIL(鼻电位差的氨氯吡嗪脒敏感的部分)、NRte(鼻跨上皮电阻)、％ΔHR30(30分钟通气期的心率变化百分比)、P2YR(P2Y嘌呤能核苷酸受体)、RSV(呼吸道合胞病毒)、SmO₂(平均血红蛋白O₂饱和度)和VRAC(容积调节的阴离子通道)。此外还可使用其它缩写，所述的其它缩写对本领域技术人员而言是清楚的和/或从使用给出缩写的上下文来看是清楚的。

本说明书中范围可通过以下方式表述：从“约”一个具体值，和/或至“约”另一个具体值。当表述为该范围时，另一个实施方案包括从一个具体值和/或至另一个具体值。类似地，当数值通过使用前置的“约”表述为近似值时，应理解为由具体值形成另一个实施方案。应进一步理解的是每个范围的端点在与另一端点相关时和独立于另一端点时都是有意义的。

如本说明书通篇所使用，“受试者”意为个体。因此所述“受试者”可包括驯养的动物，例如猫、狗等，牲畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鸟。一种情况是，受试者是牛类，例如，黄牛(Bos taurus)、瘤牛(Bos indicus)或其杂交种。另一种情况是，受试者是哺乳动物例如灵长类动物或人。

“任选的”或“任选地”意为随后描述的事件或情形可发生或可不发生，而该描述包括事件或情形发生的情况以及不发生的情况。例如，用语“任选地组合物可包含一种组合”意为该组合物可包含一种不同分子的组合或者可不包含一种组合，从而该描述既包括这种组合也包括不含这种组合(即组合的各成分)。

术语“较高”、“增加”、“升高”或“提高”是指增加至高于对照值(例如基础水平)。术语“低”、“较低”、“减小”或“减轻”是指降低至低于对照值(例如基础水平)。例如，基础水平是加入试剂之前或不加这些试剂的正常体内水平，所述试剂例如来氟米特、A77-1726或另一种嘧啶合成抑制剂。对照水平还可包括未处于疾病状态的受试者或样本的水平。对照值可由疾病或治疗之前或之后的同一个或同一批受试者或样本而确定。对照值可来自于未患疾病或未接受治疗的非同一个或非同一批受试者或样本。

本发明提供一种包含嘧啶合成抑制剂和可药用载体的组合物。该组合物可用于：使肺上皮细胞的Na⁺依赖性液体清除率增加的方法，治疗受试者肺部疾病的方法，减少受试者的一种或多种呼吸道合胞病毒感染症状或体征的方法，鉴别具有呼吸道合胞病毒感染风险的受试者并向该受试者给予包含有效量嘧啶合成抑制剂的组合物的方法，鉴别患有呼吸道合胞病毒感染的受试者并向该受试者给予包含可有效使受试者Na⁺依赖性肺泡液减少的量的嘧啶合成抑制剂的组合物的方法，以及筛选使肺上皮细胞增加Na⁺依赖性液体吸收的测试化合物的方法，这些内容在下文得到更详细地叙述。

本说明书所使用的“治疗”包括受试者特定呼吸道感染的症状或体征的减少。因此，公开的组合物和方法可用于减少受试者一种或多种呼吸道感染症状或体征。所述症状和体征包括但不限于鼻漏、低氧血症、肺水肿、心功能减弱、咳嗽、体重减轻、喘鸣、恶病质和肺充血。

可用所公开的组合物和方法治疗的一种示例性疾病为呼吸道合胞病毒(RSV)感染。RSV抑制BALB/c小鼠的Na⁺依赖性肺泡液体清除(AFC)，而P2Y核苷酸受体拮抗剂和嘧啶分解酶(pyrimidinolytic enzyme)阻滞AFC的抑制。RSV感染导致UTP和ATP均释放入ALF，AFC的减少与导致宿主明显生理损伤的RSV感染早期有关。

与对照婴儿相比，在因严重RSV感染而通气的婴儿肺部，表面活性蛋白SP-A和SP-D的水平降低，主要表面活性磷脂即双十六烷基磷脂酰胆碱的量降低，并且恢复的表面活性物质的生物物理学表面活性受损(Kerr和Patton，1999)。虽然β-肾上腺素能受体激动剂(βARA)类支气管扩张药已用于通过提高细胞内cAMP来改善成人呼吸窘迫综合征的肺泡液体清除率，但RSV感染后，呼吸上皮中的β-肾上腺素能受体介导的信号传导异常，这可能是RSV治疗中βARA效果较差的原因。因此，就RSV感染而言，公开的方法和组合物用于提高婴儿的如双十六烷基磷脂酰胆碱的表面活性磷脂的水平，或者改善β-肾上腺素能受体激动剂(βARA)类支气管扩张药的功效。

此外，流行病学研究提出婴儿中严重的呼吸道合胞病毒(RSV)诱发的细支气管炎和变应性疾病关系密切。本发明所提供的组合物和方法可用于在RSV感染过程中减轻RSV诱导的气道的过敏性，并减少随后的哮喘发生的易感性。RSV感染对于牛(即黄牛和瘤牛，或其杂交种)也尤为重要，这种感染可导致严重的呼吸道疾病。

肺泡液体清除率与肺上皮细胞的离子转运相关。例如，肺泡上皮壁由两种细胞组成：I型细胞和II型细胞。I型细胞占肺泡上皮的绝大部分(约95％)。II型细胞产生表面活性物质。现认为I型和II型细胞均以主动方式转运钠离子。位于上皮细胞基底外侧表面的钠钾泵形成有利于钠离子从肺泡腔进入细胞质的跨过顶膜的电化学梯度。钠主要通过被称作通道的蛋白质跨过肺泡上皮。一旦在细胞质中，即通过利用ATP的钠钾泵将它们穿过基底外侧膜排出。为保持电中性，氯离子通过位于细胞间的通路或通过细胞通道而随着钠离子流动。离子的流动造成间质和肺泡腔间的渗透压差，从而有利于液体重吸收。

主动钠转运在许多病理状况下(病毒感染、肺炎、急性肺损伤等)在限制肺泡腔液体量中具有重要作用。在基础条件下，呼吸上皮的最主要离子转运过程是主动的、氨氯吡嗪脒敏感的、从腔液(lumenal fluid)向上皮下的胞间隙的Na⁺离子转运。肺泡衬里层液(ALF)中的Na⁺离子主要通过顶膜中的阳离子和Na⁺选择性、氨氯吡嗪脒敏感性上皮Na⁺通道(ENaC)而被动扩散入支气管肺泡上皮细胞。Cl^-离子通过细胞侧面通路或可能通过囊性纤维化跨膜传导调节因子(cystic fibrosistransmembrane regulator，CFTR)而随着Na⁺流动以保持电中性。NaCl的转运形成跨上皮渗透梯度。由于呼吸上皮的跨上皮水渗透性较高，因此上述梯度使水被动地自气室向间质流动，由此清除气室液体。

RSV介导的AFC抑制与低氧血症、受损的心脏功能以及支气管肺泡灌洗液中升高的UTP和ATP含量有关。而且，尽管使用来氟米特全身性地抑制嘧啶从头合成对肺中RSV复制没有直接抗病毒作用，但却不仅改善了RSV感染小鼠的AFC和肺的含水量，而且改善了RSV感染小鼠的生理损伤(包括体重减轻、SmO₂和心功能降低、以及鼻电位差变化)。RSV介导的AFC抑制可通过容积调节的阴离子通道(VRAC)的药物阻断而阻滞，表明UTP的从头合成和经VRAC的释放对RSV介导的AFC抑制的发生是必要的，并且证明对于为减轻RSV感染症状或其它呼吸感染症状而设计的抑制剂疗法而言，嘧啶的从头合成和释放路径是引人注目的靶点。

图1为说明嘧啶和嘌呤生物合成途径的示意图。UTP自谷氨酰胺、ATP和HCO₃ ^-开始从头合成。UTP还可经补救途径自尿苷开始合成。来氟米特及其活性代谢物A77-1726均抑制将二氢乳清酸转变为乳清酸的二氢乳清酸脱氢酶的活性。两种物质均阻断嘧啶的从头合成，但对嘧啶补救途径或嘌呤合成没有影响。

任选地，组合物包含嘧啶合成抑制剂来氟米特。任选地，组合物包含嘧啶合成抑制剂A77-1726。任选地，组合物包含来氟米特和A77-1726的组合和/或来氟米特或A77-1726与另一种嘧啶合成抑制剂的组合。来氟米特是活性代谢物为A77-1726的前药，用于治疗类风湿性关节炎，其商品名为ARAVA(Aventis Pharmaceuticals，Bridgewater，NJ)。来氟米特和A77-1726均作为酶即二氢乳清酸还原酶(也被称为二氢乳清酸脱氢酶或二氢乳清酸酶)的抑制剂而发挥作用，该酶是三功能酶复合体CAD(氨甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶和二氢乳清酸酶)的组成成分，CAD是嘧啶从头合成途径的中心组分。因此，由于含有来氟米特和A77-1726，组合物就可以为二氢乳清酸还原酶抑制剂。

组合物可于可药用载体中进行体内给药。“可药用”意为生物学上或其它因素上无不良作用的物质。因此，可对受试者给予该物质而不引起不良的生物学效应或者不以有害的方式与含有该物质的药用组合物所含的任意其它成分相互作用。正如本领域技术人员已知的，当然选择使活性成分的任何降解最小并且使受试者副作用最小的载体。该物质可在溶液中、悬浮体中(例如包含在微粒、脂质体或细胞中)。这些可通过抗体、受体或受体配体靶向于特定的细胞类型。

Remington：The Science and Practice of Pharmacy(19th ed.)ed.A.R.Gennaro，Mack Publishing Company，Easton，PA 1995中描述了合适的载体及其制剂。通常，合适量的可药用盐用于制剂中以使该制剂等渗。可药用载体的实例包括但不限于盐水、林格氏液(Ringer’ssolution)和葡萄糖溶液。溶液的pH优选约5至约8.5，更优选约7.8至约8.2。其他的载体包括缓释制剂例如包含抗体的固体疏水聚合物半渗透性基质，该基质为成形制品例如膜、脂质体或微粒的形式。根据例如给药途径和给药组合物的浓度，某种载体为更优选的，这一点对于本领域技术人员而言应是显而易见的。例如对适于吸入和/或鼻内给药的具体载体或者适用于对肺上皮细胞局部给药的组合物的具体载体的选择即在本领域技术人员能力范围之内。

除了各成分和载体外，组合物还可包含增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。组合物还可包含一种或多种活性成分例如抗微生物药物、抗炎药物、麻醉剂等。

公开的组合物适于向受试者的一种肺上皮细胞或多种肺上皮细胞局部给药。因此，包含嘧啶合成抑制剂的组合物任选地适于经吸入给药(即该组合物为吸入剂)。另外，该组合物任选地为气雾化的。再另外，该组合物任选为喷雾化的。可经喷射或微滴机制的给药方式通过鼻或口进行组合物吸入给药。也可经插管法向呼吸***(例如肺)的任何区域直接递送。任选地，组合物给药的肺上皮细胞位于受试者的鼻腔、鼻道、鼻咽、咽、气管、支气管、细支气管或肺泡中。任选地，组合物给药的肺上皮细胞为支气管肺泡上皮细胞。而且，如果向多种肺上皮细胞给予组合物，那么细胞任选可位于任意或所有以上解剖部位或者位于这些部位的组合。

肺上皮细胞的局部给药相应地可通过经喷雾法、气雾作用或直接肺滴注的肺部递送进行。因此，适于向受试者肺上皮细胞局部给药的组合物包括适于例如作为喷雾化或气雾化制剂的吸入给药的组合物。例如，可通过吸入器例如定量剂量吸入器或干粉吸入器、吹入器、喷雾器的方式或任何其它常规已知的可吸入药物给药方法向个体给予组合物。

本发明组合物可以是可吸入溶液。该可吸入溶液可适于经喷雾法给药。组合物也可以水性悬浮液形式提供。任选地，本发明的制剂包括水性悬浮液中的治疗有效量的嘧啶合成抑制剂。

任选地，组合物可通过加压气雾剂的方式给药，该气雾剂单独地包含一种嘧啶合成抑制剂或者其盐或酯及至少一种推进剂或及一种表面活性剂或表面活性剂的混合物。可使用任何常规已知的推进剂。

本发明还提供包括本发明所提供的组合物和喷雾器的组合。包含本发明所教导的试剂和组合物的容器也是本发明所公开的。该容器可以是例如鼻喷雾器、喷雾器、吸入器、瓶或任意其它含有组合物的粘膜表面给药形式的工具。任选地，该容器可给予定量剂量的组合物。

任何喷雾器可与本发明公开的组合物和方法一同使用。具体而言，本发明所使用的喷雾器使包括有本发明提供的组合物而不含推进剂的液体制剂雾化。该喷雾器可通过本领域技术人员已知的任意方法产生雾化的气雾，所述方法包括但不限于压缩气体、超声波或振动。该喷雾器可进一步具有内挡板。该内挡板与喷雾器外壳一起通过碰撞从气雾中选择性地除去大液滴，并使大液滴返回贮液器中。由此产生的气溶胶细微滴通过吸入空气/氧气而夹带入肺中。

因此，使不含推进剂的液体制剂喷雾化的喷雾器适于与本发明提供的组合物一起使用。该喷雾器的实例在本领域内是已知的并且是市售的。本发明使用的喷雾器还包括但不限于喷射雾化器、超声喷雾器和其它喷雾器。喷射雾化器的实例在本领域内是已知的并且是市售的。

组合物可为无菌的，被过滤并装于小瓶中，所述小瓶包括提供用于喷雾器并被适当地喷雾化的单位剂量无菌制剂。每个单位剂量小瓶可以是无菌的并被适当地雾化而不污染其它小瓶或下一剂量。

任选地，公开的组合物以适于鼻内给药的形式存在。该组合物适于经一个或两个鼻孔向鼻内和鼻道递送，并且可包括通过喷射机制或微滴机制或者经气雾化作用递送。

如果组合物用于不使用局部肺部给药的方法中，则可通过本领域已知的其它方法给予该组合物，例如口服、胃肠外(例如静脉内)、肌内注射、腹膜内注射和经皮给药。

本发明还提供包括至少一份定量剂量的包含治疗量嘧啶合成抑制剂的组合物的装置，其中每份定量剂量包括用于治疗受试者肺部疾病的嘧啶合成抑制剂的治疗量或治疗量的一部分。该嘧啶合成抑制剂可包括以上公开的嘧啶合成抑制剂或其组合。

本发明还提供一种使肺上皮细胞的Na⁺依赖性液体清除率增加的方法，该方法包括使细胞与有效量的嘧啶合成抑制剂相接触。所述接触使细胞的Na⁺依赖性液体清除率增加。任选地，肺上皮细胞在体内被接触。任选地，肺上皮细胞在体外被接触。

本发明还提供治疗受试者肺部疾病的方法，该方法包括使受试者的多种肺上皮细胞与有效量的嘧啶合成抑制剂相接触。有效量的嘧啶合成抑制剂使得受试者的Na⁺依赖性肺泡液体清除率增加。该方法可用于受试者患有呼吸道合胞病毒感染或具有发生呼吸道合胞病毒感染风险的情形。引起可使用所公开方法的疾病的其它肺部病原体包括但不限于：副黏病毒(呼吸道合胞病毒[人和牛]、间质肺病毒(metapneumovirus)、副流感病毒、麻疹病毒)、正黏病毒(A型、B型和C型流感病毒)、痘病毒(天花、猴痘)、新世界汉坦病毒、鼻病毒、冠状病毒(严重急性呼吸综合征的病因)、疱疹病毒(单纯疱疹病毒、巨细胞病毒)、肺炎链球菌(Streptococcus pneurnoniae)、流感嗜血菌(Hemophilusinfluenzae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎枝原体(Mycoplasmapneumoniae)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、侵肺军团菌(Legionella pneumophila)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、衣原体、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogene)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)和洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)。

本发明还提供了减少具有呼吸道合胞病毒感染风险的受试者的一种或多种呼吸道合胞病毒感染症状或体征的方法，该方法包括向受试者给予包含有效量嘧啶合成抑制剂的组合物。如上所述，这些症状或体征包括但不限于鼻漏、低氧血症、肺水肿、心脏功能减弱、咳嗽、体重减轻、喘鸣、恶病质和肺充血。本领域技术人员可容易地确定具有呼吸道合胞病毒感染风险的受试者。例如，这种确定可由医生或兽医根据受试者的医疗史、表现的症状/体征、身体检查、诊断测试或其任意组合来作出。

本发明还提供一种包括鉴别具有呼吸道合胞病毒感染风险的受试者和向该受试者给予包含有效量嘧啶合成抑制剂的组合物的方法。此外，还提供一种包括鉴别患有呼吸道合胞病毒感染的受试者和向该受试者给予包含可有效使受试者Na⁺依赖性肺泡液减少的量的嘧啶合成抑制剂的组合物的方法。

在所公开的方法中，嘧啶合成抑制剂任选地为来氟米特、A77-1726或其组合。此外，来氟米特和/或A77-1726可与一种或多种其它嘧啶合成抑制剂结合用于公开的方法中。

术语“有效量”、“有效剂量”或“治疗量”可以互换使用。术语“有效量”定义为产生所需生理反应的任意必需量。用于所公开的方法的组合物的给药有效量和给药时间安排可凭经验确定，并且做这种确定是在本领域技术人员能力范围之内的。用于所公开的方法的组合物的有效给药剂量范围大至产生使疾病症状受到影响的所需效应。该剂量不应大至引起不良副作用，例如不良交叉反应、过敏反应等。

通常，治疗量或治疗剂量根据受试者的年龄、状况、性别和患病程度、给药途径或治疗方案中是否包括其它药物而变化，本领域技术人员可确定该治疗量或治疗剂量。如果有任何禁忌症发生，个别医生或兽医可调节剂量。剂量可以在一天或几天内变化，并且在一天或几天内每天给予一次或多次剂量的给药。用于所公开的方法的组合物的所需有效量可根据所使用的方法和所治疗的气道病症、所使用的具体的嘧啶合成抑制剂和/或载体以及给药的方式等而变化。因此不可能明确地说明每种组合物的确切的量。然而，在给出本说明书教导的情况下，本领域技术人员仅使用常规的实验即可确定适宜的量。例如，体内使用的二氢乳清酸还原酶或嘧啶合成抑制剂可以以约10-50mg/kg的剂量、以约25-45mg/kg的剂量或以约30-40mg/kg的剂量给药。

可按合理的间隔以气溶胶给予治疗量、有效量或有效剂量的A77-1726、来氟米特和/或其它嘧啶抑制剂，并保持有效。例如可一天、数天、一周或更长时间内S.I.D.、B.I.D.、Q.I.D.或者每小时一次或多次地给予有效剂量的本发明所述组合物。因此，例如可在1天、2天、3天、4天、5天、6天或一周或更长时间或其任意间隔或其任意组合的期间内，每1、2、4、8、12或24小时或者其组合或其间隔给予一次该组合物。间隔意为在所给值内的时间的任意增量。因此组合物例如可在12小时内每三小时进行给药，等等。任选地，一次给予组合物。该时间进程可由本领域技术人员使用例如用于确定有效剂量的上述参数来确定。

根据本发明所述方法给予的具体剂量组合物的有效性，可通过评价已知可用于评价患有例如RSV感染的肺部感染患者或具有感染肺部感染风险患者的状态的医疗史、指征、症状和客观实验室测试的具体各方面来测定。这些指征、症状和客观实验室测试将根据具体的所治疗或预防的疾病或病患变化，这一点对于任何治疗这类患者的临床医生或在该领域内进行实验的研究者而言应是已知的。例如，如果基于与适当的对照组的比较和/或与对普通群体或特定个体的正常疾病进程的认识的比较：1)受试者身体状况显示得到改善(例如肺充血减轻或消除)，2)疾病即感染的进程显示出得到稳定、减慢或逆转，或者3)对治疗该疾病或疾患的其它药物的需要减少或避免了，那么就认为一个具体的治疗方案是有效的。可在群体中的单个受试者中测定(例如使用流行病学研究)这种作用。

本发明的教导还可用于筛选的方法。例如本发明提供一种筛选使肺上皮细胞增加Na⁺依赖性液体吸收的测试化合物的方法，该方法包括：当存在过量的UTP时使肺上皮细胞与测试化合物相接触，检测肺上皮细胞的Na⁺依赖性液体吸收，由相比于对照的Na⁺依赖性液体吸收的增加指示出使肺上皮细胞的Na⁺依赖性液体吸收增加的测试化合物。任选地，细胞在体内被接触。任选地，细胞在体外被接触。该方法任选地还包括去除UTP和检测Na⁺依赖性液体吸收增加的可逆性。

在另一个筛选方法的实例中，筛选使Na⁺依赖性液体吸收增加的测试化合物的方法包括：使测试化合物与表达编码嘧啶合成基因的异源核酸的细胞相接触，并检测细胞的Na⁺依赖性液体吸收，由相比于对照水平的Na⁺依赖性液体吸收的增加指示出使Na⁺依赖性液体吸收增加的测试化合物。任选地，细胞在体内被接触。任选地，细胞在体外被接触。

又一个筛选使呼吸上皮的Na⁺依赖性液体吸收增加的测试化合物的方法包括：用RSV感染H441细胞或细胞系，使受感染的细胞或细胞系与测试化合物相接触，并测量跨受感染细胞或受感染细胞系的细胞的离子转运。由相比于对照的跨受感染的H441细胞或细胞系的离子转运的增加，指示出使Na⁺依赖性液体吸收增加的测试化合物。离子转运可与跨对照细胞或细胞系的离子转运比较，对照细胞或细胞系任选可以是非RSV感染的H441细胞系，或者可以是不存在测试化合物时受感染的H441细胞或细胞系。任选地，测试化合物包括嘧啶合成抑制剂。任选地，细胞在体内被接触。任选地，细胞在体外被接触。

实施例

为向本领域技术人员提供本发明所要求保护的方法的完整公开和说明而提出以下实施例，以下实施例的意图仅在于作为本发明的示例，并不意在限制发明人所认为的他们的发明的范围，除非是在它们包括于随附权利要求的意义上。已努力确保与数字有关的准确性(例如，用量、温度等)，但还应说明可能有一些误差和偏差。

方法：

病毒接种体的制备和小鼠的感染。按Davis et al.，″Nucleotide-mediated inhibition of alveolar fluid clearance in BALB/c miceafter respiratory syncytial virus infection，″Am.J.Physiol.LungCell Mol.Physiol.286：L112-L120.(2004)所述制备病毒原种并用RSV的A2株(100μL 106PFU)鼻内感染任意一种性别的8至12周的无病原体BALB/c小鼠。每个实验组的数据来源于最少两次独立感染。

平均外周血氧饱和度的测定。使用连接到TUFFSAT^TM脉搏血氧计(Datex-Ohmeda，Inc.，Madison，WI)的PREEMIE OXYTIP传感器(Datex-Ohmeda，Inc.，Madison，WI)，对有知觉的小鼠测定外周血氧饱和度。由于小鼠脉率极快，血氧定量法的值为动脉血和静脉血的平均血红蛋白O₂饱和度(SmO₂)值。

通气时心率的变化的测定。将ECG描图用于测量AFC测定开始(HRSTART)和终末(HREND)时的心率(QRS复合波数/cm)。按(HRSTART-HREND)/HRSTART计算30分钟通气期内心率的改变的百分比(％ΔHR30)。

鼻电位差的测定。如先前Grubb et al.，(1994)″Hyperabsorptionof Na+and raised Ca(2+)-mediated C1-secretion in nasal epitheliaof CF mice，″Am.J.Physiol 266：C1478-C1483所述测定麻醉小鼠(以尾部作参考)的跨鼻孔电位差。在用乳酸林格氏液灌注鼻上皮期间记录基线NPD。通过用含100μM氨氯吡嗪脒的乳酸林格氏液灌注来确定NPD的氨氯吡嗪脒敏感的部分(NPDAMIL)。通过串联的12V电池以及200MΩ电阻，跨上皮施加±60nA的电流脉冲。记录对电流脉冲的反应的NPD的变化(与鼻跨上皮电阻NRte成比例)(ΔNPD)。

支气管肺泡灌洗。使用1ml用于细胞因子ELISA的无菌生理盐水或者0.3ml用于核苷酸分析的无菌盐水，按先前Davis et al.(2004)所述收集支气管灌洗液(BALF)。离心灌洗收集液(lavagate)以去除细胞，上清液储存于-80℃。

BALF中的核苷酸的测定。加热(100℃，3分钟)使BALF中的内源性核苷酸酶变性，分别使用UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和荧光素-荧光素酶测定法测定UTP/ATP的含量。

BALF中的血红素的测定。使用Drabkins测定法，利用分光光度法测定BALF血红素含量。

嘧啶和嘌呤从头合成的全身性抑制。在感染前及随后整个感染期的时间内，每天一次按300μl/小鼠的体积管饲口服给予来氟米特(5-甲基异唑-4-[4-三氟甲基]甲酰苯胺，35mg/kg溶于含1％甲基纤维素的蒸馏水中)共8天。管饲等体积的含1％甲基纤维素的蒸馏水作为赋形剂对照。按每12小时i.p.注射100μl的体积(8)给予尿苷(1g/kg溶于0.9％NaCl中)。在感染前及随后整个感染期的时间内，按每24小时i.p.注射100μl的体积给予6-MP(35mg/kg溶于1N NaOH中，用2M Na₂HPO₄调节pH至7.9)共5天。

BALF中的促炎细胞因子的测定。根据厂商说明书使用Quantikine MELISA试剂盒(R&D System)测定细胞因子水平。

统计学分析。使用Instat软件(GraphPad，San Diego，CA)计算描述性的统计结果。用ANOVA或Student’s检验，以及适宜的之后的检验分析组平均值间的差异。所有数据值均表示为平均值±标准差。

结果：

RSV感染对外周血氧合作用的影响。第2天的基础AFC的减少与相比于假感染动物的较小但有意义的外周血SmO₂减少(图2A)有关。在其它时间点没有发现SmO₂下降。

作为低氧血症的另一个指标，评价假感染小鼠和第2天的RSV感染小鼠的3导联ECG描图，以证明AFC测定过程中心率的变化(％ΔHR30)。RSV感染与在第2天％ΔHR30的显著增加相关(图2B和2C)。在麻醉过程中两组间无差异。

RSV感染对鼻电位差的影响。与假感染动物比较，第2天的RSV感染对BALB/c小鼠的基础NPD(鼻电位差)或NPDAMIL(鼻电位差的氨氯吡嗪脒敏感的部分)没有影响。然而在第4天和第8天基础NPD和NPDAMIL显著减小(图3A-3C)。

测定了向鼻上皮施加±60nA的脉冲而引发的NPD的变化(ΔNPD)，以此作为对RSV感染后NRte(鼻跨上皮电阻)的估测。在第4天和第8天ΔNPD显著高于假感染对照(图3D-3E)。

RSV感染和核苷酸合成的抑制对BALF核苷酸的影响。未感染小鼠的BALF含有等水平的ATP和UTP，该水平未因假感染而受影响。然而RSV感染导致在第2天UTP和ATP水平增加一倍，而BALF血红素的含量没有同时增加(在第2天，相对于未感染小鼠的7.3±0.7μM，为7.3±1.4μM)。在第6天BALF核苷酸水平回到对照水平(表1)。

在第2天，在来氟米特治疗的RSV感染的小鼠中没有检测到BALF核苷酸水平的增长。事实上，来氟米特的治疗使BALF的两种核苷酸的含量降低至低于在未治疗的未感染小鼠中的含量水平(表1)。并行的尿苷的治疗不仅逆转了来氟米特对BALF的UTP和ATP水平的作用，还引起BALF核苷酸含量相对于未治疗的RSV感染小鼠的该含量的显著增长。

表1 RSV感染和核苷酸合成的抑制对BALF核苷酸水平的影响

	n^A	ATP^B	UTP^B
	n^A	ATP^B	UTP^B	未感染的假感染的d2d6d2 LEF^Cd2 LEF+U^D	11614997	16±213±438±7^*17±26±1^69±29	16±410±432±4^11±45±2^95±29^*

A：核苷酸水平被评价的每组小鼠的数目

B：BALF中的平均核苷酸浓度±SE(hmol/l)

C：来氟米特治疗的小鼠

D：来氟米特和尿苷治疗的小鼠

与未感染的小鼠比较，**p＜0.005，***p＜0.0005

核苷酸合成的抑制对小鼠体重的影响。在预治疗时期，与甲基纤维素治疗的或未治疗的小鼠比较，来氟米特未引起明显的体重下降。更重要的是，在感染期间，来氟米特疗法显著降低在BALB/c小鼠中第1天和第2天常见的体重减轻(图4)的程度。在整个来氟米特治疗期间同时给予尿苷不阻滞该效应。

与上述发现相反，与未治疗的RSV感染的小鼠和来氟米特治疗的RSV感染的小鼠比较，6-MP的治疗导致在整个感染前时期体重显著减轻、对麻醉的耐受性差(导致个别死亡)、以及在第1天和第2天体重减轻的显著增加(图4B)。

核苷酸合成的抑制对RSV介导的AFC抑制的影响。RSV感染的小鼠的来氟米特的预治疗阻断了第2天的RSV诱导的AFC抑制(表2)。单独管饲甲基纤维素不能模拟该效应，而并行的尿苷治疗逆转该效应。单独的尿苷治疗对AFC没有影响。来氟米特的治疗还导致正常的AFC的氨氯吡嗪脒敏感性的恢复：与未感染小鼠的61％和未治疗第2天小鼠的-8％相比，来氟米特治疗的小鼠在第2天的AFC的57％为氨氯吡嗪脒敏感的。

与来氟米特疗法的有益作用相反，用嘌呤从头合成抑制剂6-巯基嘌呤(6-MP)的全身预治疗的类似方案对第2天的AFC没有影响(表2)。最后一点，来氟米特对未感染小鼠的治疗导致AFC的显著抑制。

表2 核苷酸合成的抑制对第2天的RSV介导的AFC抑制的影响

	n^A	AFC^B
	n^A	AFC^B	未感染的未感染的AMIL^C未感染的LEF^Dd2d2 AMILd2 MC^Ed2 LEFd2 LEF+AMILd2 U^Fd2 LEF+U^Gd2 6-MP^H	7717257111411191011	34.89±2.49^*14.65±1.5929.98±1.5^22.01±1.0422.82±1.9222.89±1.2734.52±2.1^***14.92±2.322.89±2.2221.9±2.6916.52±2.51

A：AFC被评价的小鼠的数目

B：％AFC平均值±SE

C：向滴注剂中加入1.5mM氨氯吡嗪脒的AFC

D：来氟米特治疗的小鼠

E：甲基纤维素治疗的小鼠

F：尿苷治疗的小鼠

G：来氟米特和尿苷治疗的小鼠

H：6-巯基嘌呤治疗的小鼠

与第2天的AFC比较，**p＜0.005，***p＜0.0005

与第2天的AFC的AMIL比较，p＜0.0005

为了全身性阻断嘧啶从头合成，在感染前8天每天一次管饲小鼠300ml/小鼠的二氢乳清酸还原酶(DHOR)抑制剂来氟米特(5mg/Kg悬浮于1％甲基纤维素中)或赋形剂，并且在p.i.0小时和24小时如上所述给药。p.i.48小时进行AFC研究，AFC滴注剂中未加入添加物。

在所表述的情况下，通过在整个来氟米特治疗期间同时给予尿苷(1mg/kg I.P.，q12h)来试图逆转来氟米特(LEF)的效应。如图5所示，用来氟米特(LEF)管饲小鼠逆转了p.i.第2天RSV介导的AFC抑制。LEF的效应被同时给予尿苷阻滞。LEF对正常小鼠的AFC没有影响。

LEF治疗还导致p.i.第1天和第2天体重减轻的显著减少以及支气管肺泡灌洗液中促炎细胞因子(IFN-a、I1-b、TNF-a、KC)浓度的显著降低。如图6所示，用来氟米特(LEF)管饲小鼠逆转了p.i.第2天的RSV诱导的肺含水量增加。来氟米特的效应被同时给予尿苷阻滞。重要的是，用LEF和/或尿苷治疗对p.i.第2天肺组织中的病毒复制没有作用。

如图7所示，向AFC滴注剂中加入广谱的容积调节的阴离子通道(VRAC)抑制剂逆转了p.i.第2天RSV介导的AFC抑制。尽管所使用的某些抑制剂对多种其它细胞功能也有不同影响，然而这些试剂具有的VRAC抑制作用为仅有的共同作用。然而，NPPB(100mM)是相对VRAC特异性的。这个发现证实了在RSV感染早期UTP经VRAC自细胞释放。此外，氟西汀(fluxetine，10mM)还作为选择性5-羟色胺重吸收抑制剂起作用。维拉帕米(verapamil，10mM)还作为Ca⁺⁺通道阻断剂起作用。他莫昔芬(tamoxifen，25mM)还是一种抗***。

BALB/c小鼠模型中在感染后的早期时间点，呼吸道合胞病毒抑制氨氯吡嗪脒敏感性AFC(表示主动Na⁺转运)，而不诱导显著的呼吸上皮细胞病理学。而且，RSV对AFC的抑制作用由UTP通过它对肺中的P2Y嘌呤能受体的作用来介导。

介导感染后第2天RSV诱导的AFC抑制的UTP源于从头合成，该路径的抑制阻止RSV诱导的AFC的减少及肺含水量的增加而不改变病毒复制。而且，介导感染后第2天RSV诱导的AFC抑制的UTP经容积调节的阴离子通道释放。

证实了来氟米特对感染后第2天RSV诱导的AFC抑制的作用。用来氟米特(5mg/kg，悬浮于1％甲基纤维素，每天一次)口服管饲小鼠预治疗8天，然后用RSV感染并在p.i.24小时再用来氟米特治疗。该方案阻滞了p.i.第2天RSV诱导的AFC的抑制。单独管饲甲基纤维素不能模拟该效应，而在整个来氟米特治疗期同时给予尿苷(1mg/kg i.p.q12h，10天)能逆转该效应。而且单独的尿苷治疗对AFC也没有影响。来氟米特对正常(假感染)小鼠的AFC也没有有害作用。

表3 来氟米特对p.i.第2天RSV诱导的AFC抑制的影响

治疗	nA	AFC_30BASAL ^B
治疗	nA	AFC_30BASAL ^B	无甲基纤维素来氟米特尿苷来氟米特+尿苷来氟米特(假感染小鼠)	23111219107	21.19±0.9422.89±1.2733.4±3.00^*22.89±2.2221.9±2.6933.16±2.40^*

A：AFC被评价的小鼠的数目；B：30分钟后％基础AFC的平均值±SE；***p＜0.0005(与未治疗的小鼠比较)。假感染BALB/c小鼠的AFC_30BASAL为37.21±1.2％(n＝8)。

来氟米特的抑制效应并不简单地为抗病毒作用的结果。病毒复制不受甲基纤维素、来氟米特或尿苷治疗的影响。因此RSV诱导的AFC抑制的消失并不是简单的阻滞病毒复制的结果，而是来氟米特对嘧啶从头合成的特异性抑制作用的结果。

来氟米特疗法与RSV感染后第2天增加的肺的湿重∶干重之比(肺含水量和水肿形成的指标)的正常化相关。并行的尿苷的治疗逆转此作用，并导致湿重∶干重之比增加(与假感染小鼠比较)。来氟米特疗法显著降低了p.i.第1天和第2天BALB/c小鼠中常见的体重减轻的程度，表明对食欲的有益作用(可能与抗炎作用有关)。这也表示在此剂量上来氟米特的毒性非常有限。通常当低氧血症的程度明显时，来氟米特疗法改善p.i.第2天的平均血氧饱和度。来氟米特疗法显著降低支气管灌洗液的促炎细胞因子(干扰素-α、白细胞介素-1β、KC[人白细胞介素-8的鼠同系物]和肿瘤坏死因子-α)的水平，该作用仅被并行的尿苷疗法部分逆转(因此这可能部分地是药物的非特异性酪氨酸激酶抑制作用的结果)。

总之，这些数据证实来氟米特对RSV疾病具有多种有益作用，但不具有直接的抗病毒作用。这些作用包括消除低氧血症和肺水肿、体重方面的改善、以及减少肺部炎症。

核苷酸合成的抑制对肺含水量的影响。来氟米特的全身性疗法使第2天肺湿重：干重之比恢复正常，而在来氟米特整个治疗过程中同时给予尿苷阻滞了该作用(图8A)。然而，对第2天AFC无有益作用的6-MP全身性疗法未改变第2天的肺湿重∶干重之比(图8B)。

核苷酸合成的抑制对促炎细胞因子的影响。来氟米特在临床上用作免疫抑制剂。为证实该治疗方案的有效性，分析其对BALF中的促炎细胞因子水平的影响。感染后的任何时间点均检测不到IL-4或IL-10。在假感染小鼠的BALF中仅检测到少量的IL-1β和KC(人IL-8的鼠同系物)(表4)。在第2天除IFN-γ外所有其它细胞因子均呈现显著量，但在第4天-第8天IL-1β、KC和TNF-γ的水平下降。BALF中，只在第6天和第8天发现显著量的IFN-γ。

来氟米特疗法显著降低第2天BALF中的IFN-α、IL-1β、KC和TNF-α的水平(表4)。除IFN-α外，该效应仅被并行的尿苷疗法部分逆转。

重要的是，6-MP疗法导致的BALF的IFN-α、IL-1β、KC和TNF-α水平下降与由来氟米特疗法引起的上述水平的下降相当(表4)。在用任一试剂治疗时，在第2天两种疗法的小鼠的IFN-α、IL-1β、KC和TNF-α水平无显著差异。

表4 RSV感染和核苷酸合成的抑制对BALF中促炎细胞因子的影响

	n^A	IFN-α^B	IFN-γ^B	IL-1β^B	KC^B	TNF-α^B
	n^A	IFN-α^B	IFN-γ^B	IL-1β^B	KC^B	TNF-α^B	假感染组d2d4d6d8d2 LEF^Cd2 LEF+U^Dd2 6-MP^E	81388612108	0^*151±12ND^FNDND72±12^246±68105±14^	02±130±16912±116^*195±25^*NDNDND	10±6^*136±246±1^20±3^8±2^20±8^20±6^9±3^**	80±21^*913±36106±27^72±9^88±16^425±58^334±62^329±63^**	0^*81±160^1±1^0^0^0^0^**

A：测定BALF细胞因子水平的小鼠的数目

B：BALF中平均细胞因子浓度±SE(pg/ml)

C：来氟米特治疗的小鼠

D：来氟米特和尿苷治疗的小鼠

E：6-巯基嘌呤治疗的小鼠

F：未测定

与第2天的水平比较，***p＜0.0005

核苷酸合成的抑制对小鼠肺部RSV复制的影响。在第2天的病毒复制既不受来氟米特治疗的影响，也不受尿苷治疗的影响(图9A)。同样，6-MP的预治疗对第2天小鼠肺部的病毒复制没有显著抑制作用(图9B)。当在整个8天感染期内连续用来氟米特治疗时，在第8天病毒复制持续为高水平(图9C)。然而，当在第2天以后中止来氟米特治疗时，病毒复制仅在第8天有很小程度地增加(图9D)。

来氟米特疗法对RSV感染后低氧血症的影响。来氟米特疗法导致第2天SmO₂读数的正常化(图10A)。同样地，来氟米特疗法阻滞RSV感染的小鼠在AFC过程中在第2天所见的％ΔHR30的增加(图10B)。

来氟米特疗法对RSV感染后鼻电位差的影响。在整个感染期使用来氟米特治疗完全阻止了RSV诱导的基础NPD和NPDAMIL下降(图11A-11C)。

阴离子通道的阻断对RSV介导的AFC抑制的影响。通过向AFC滴注剂加入每种各结构上不相关的VRAC抑制剂，使第2天RSV介导的AFC的抑制被阻断，上述抑制剂为：氟西汀、他莫昔芬、克罗米芬(clomiphene)、维拉帕米、NPPB或IAA-94(表5)。该效应被同时向滴注剂中加入500nMUTP而逆转。相比之下，第2天的AFC不受格列本脲(glibenclamide)对囊性纤维化跨膜传导调节因子抑制的影响、以及氟甲烟酸对Ca²⁺激活的Cl^-通道活性抑制的影响。

表5 向AFC滴注剂加入阴离子通道抑制剂对第2天RSV介导的AFC的抑制的影响

抑制剂	浓度(μM)	n^A	AFC^B
抑制剂	浓度(μM)	n^A	AFC^B	无氟西汀氟西汀+UTP他莫西芬克罗米芬维拉帕米NPPB^CR(+)-IAA 94^D格列本脲氟甲烟酸	-1010/0.5252010100100100100	2516898695910	22.01±1.0434.54±0.79^*23.64±2.4234.50±0.94^31.05±2.65^33.04±1.49^32.70±2.18^34.25±1.98^*24.24±4.2420.28±1.53

A：AFC被评价的小鼠的数目

B：平均％AFC±SE

C：5-硝基-2-(3-苯基丙氨基)苯甲酸

D：R(+)-[(6，7-二氯-2-环戊基-2，3-二氢-2-甲基-1-氧代-1H-茚-5-基)-氧]乙酸94

与第2天的AFC_30BASAL比较，**p＜0.005，***p＜0.0005

A77-1726对RSV介导的AFC抑制的影响。如先前已知的，BALB/c小鼠鼻内感染呼吸道合胞病毒(RSV)A2株导致在感染后(p.i.)第2天和第4天基础AFC和氨氯吡嗪脒敏感性AFC减小，这种抑制作用是由UTP经P2Y受体起作用而介导的(AJPLCMP，2004)。已进一步表明，在第2天的RSV介导的AFC抑制被向AFC滴注剂中加入25mM阻断嘧啶从头合成的A77-1726阻滞，但不被25mM霉酚酸或6-巯基嘌呤阻滞，霉酚酸和6-巯基嘌呤均阻断嘌呤从头合成。A77-1726介导的阻断被50mM尿苷(它使得可通过补救途径合成嘧啶)的加入逆转，而不能由25mM染料木黄酮(它模拟A77-1726的非特异性酪氨酸激酶抑制剂作用)重现，说明A77-1726的阻断效应是通过嘧啶从头合成途径介导的。类似地，对小鼠使用嘧啶从头合成抑制剂来氟米特(于1％甲基纤维素中5mg/kgp.o.10天)的治疗逆转了RSV对AFC的抑制作用。而且，容积调节的阴离子通道(VRAC)功能抑制剂，例如氟西汀(10mM)、维拉帕米(10mM)和他莫昔芬(25mM)，也阻断p.i.第2天的RSV介导的AFC抑制。综上，这些数据证实在RSV感染期间抑制AFC的UTP源于嘧啶从头合成并且经VRAC释放。这些路径提供了阻滞UTP诱导的AFC减少的新的治疗方法，所述AFC的减少促使RSV感染后黏液液体体积增加、气道充血和鼻漏的形成。

如图12所示，在感染后(p.i.)第2天和第4天，RSV感染显著抑制基础肺泡液体清除率(AFC)。与未感染的小鼠(U)相比，假感染(M)对AFC没有影响。基础AFC(与假感染的值相比)在第2天被抑制43％，在第4天被抑制26％。AFC的氨氯吡嗪脒敏感性也在p.i.第1天减小，在p.i.第2天和第4天消失。

p.i.第2天RSV介导的AFC抑制被向AFC滴注剂中加入腺苷三磷酸双磷酸酶(降解UTP和ATP)或UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(有葡萄糖-1-磷酸和无机焦膦酸酶存在时降解UTP)而逆转，但不被己糖激酶(有葡萄糖存在时降解ATP)的加入逆转。向滴注剂加入P2Y受体特异性拮抗剂(200mM XAMR0721)也逆转p.i.第2天RSV介导的AFC抑制。

在具有正常体温和血气指标的麻醉、通气的BALB/c小鼠上、在气管滴注0.3ml含5％无脂肪酸的BSA的等渗(isosmolar)NaCl后的30分钟时间里进行AFC研究。被分析的每组小鼠的数目列于各图的相关图柱中。

如图13所示，向AFC滴注剂中加入二氢乳清酸还原酶抑制剂(25μm A77-1726)逆转p.i.第2天RSV介导的AFC抑制。A77-1726的作用被同时向AFC滴注剂中加入50mM尿苷而完全逆转，但该作用不能由25mM染料木黄酮(非特异性酪氨酸激酶抑制剂)重现。因此A77-1726的作用具有针对嘧啶从头合成途径的特异性。

如图14所示，向AFC滴注剂中加入IMP脱氢酶抑制剂(25μm 6-MP或MPA)对在p.i.第2天的RSV介导的AFC抑制仅有很小的作用。IMP脱氢酶抑制剂的较小作用是ATP缺失的结果，而ATP是嘧啶从头合成的必需前体。由于可通过嘌呤补救途径合成ATP，MPA的作用被同时向AFC滴注剂中加入50mM次黄嘌呤(HXA)完全逆转。这个发现证实在RSV感染期间ATP的储存很少。

在p.i.第2天的RSV诱导的AFC抑制被一种嘧啶从头合成抑制剂即A77-1726阻滞。A77-1726的作用被促进UTP经补救途径合成的外源性尿苷的加入阻断，并且不能通过模拟A77-1726的非特异性酪氨酸激酶抑制作用的染料木黄酮重现。嘌呤从头合成抑制剂例如霉酚酸(MPA)和6-巯基嘌呤(6-MP)对RSV介导的AFC抑制仅有很小的阻断作用，这可能是因为ATP合成减少(ATP是嘧啶从头合成的必需前体)。而该作用又被促进ATP经补救途径合成的外源性次黄嘌呤的加入阻断。有趣的是，在第2天的RSV诱导的AFC抑制还被多种不同的容积调节的阴离子通道(VRAC)抑制剂阻滞以及被Rho激酶的抑制所阻滞，其中VRAC已被认为是一种ATP和UTP的释放机制，而已知Rho激酶被RSV激活，并且还已知它可激活VRAC。

表6 嘧啶和嘌呤合成抑制剂和VRAC抑制剂对p.i.第2天RSV诱导的AFC抑制的影响

靶点	抑制剂	浓度^A	n^B	AFC_30BASAL ^C
靶点	抑制剂	浓度^A	n^B	AFC_30BASAL ^C	嘧啶从头合成酪氨酸激酶嘌呤从头合成VRACsRho激酶	无A77-1726A77-1726+尿苷染料木黄酮MPA6-MPMPA+次黄嘌呤氟西汀维拉帕米他莫西芬克罗米芬NPPBROCK抑制剂	-2525/5025252525/501010252010020	23161271212716698710	21.19±0.9434.06±1.88^**21.3±2.0220.39±0.7326.2±1.7^26.31±1.85^22.36±2.7334.54±0.79^33.04±1.49^34.5±0.95^31.0±2.67^35.12±1.94^*36.58±2.11^*

A：终浓度(μM)；B：AFC被评价的小鼠的数目；C：30分钟后平均基础AFC％±SE；*：p＜0.05；**：p＜0.005；***：p＜0.0005；(均相对于未治疗的小鼠)。

假感染的BALB/c小鼠的AFC_30BASAL为37.21±1.2％(n＝8)。

感染后A77-1726治疗对p.i.第2天RSV诱导的AFC抑制的影响。当在p.i.24小时使用A77-1726(50μM于100μl生理盐水中，分为两鼻孔)对小鼠鼻内给药治疗时，在p.i.24小时RSV对AFC的抑制作用被完全阻断，这说明当向肺内局部给药时，A77-1726对嘧啶从头合成具有延长的抑制作用。A77-1726的鼻内预治疗也与RSV感染后增加的肺湿重：干重之比(肺含水量和水肿形成的指标)的正常化相关。

表7在p.i.24小时的A77-1726的鼻内治疗对p.i.第2天的RSV诱导的AFC抑制的影响

感染状态	治疗	n^A	AFC_30BASAL ^B
感染状态	治疗	n^A	AFC_30BASAL ^B	未感染的未感染的RSV-p.i.第2天RSV-p.i.第2天	无A77-1726^C无A77-1726^D	7102314	34.9±2.523.19±5.95^*21.19±0.9432.68±1.1^*

A：AFC被评价的小鼠的数目；B：30分钟后基础AFC％平均值±SE；C：50μM于100μl生理盐水中，AFC测定前24小时鼻内给药；D：50μM于100μl生理盐水中，感染后24小时鼻内给药；***：p＜0.0005(相对于未治疗的小鼠)

对本发明所述化合物、组合物和方法可作各种修改和变换。本发明所述化合物、组合物和方法的其它方面应从对说明书的考虑以及本发明公开的化合物、组合物和方法的实施中显而易见。应当理解上述详细说明和实例均为示例性的。

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Claims

1.一种包含嘧啶合成抑制剂和可药用载体的组合物，其中所述组合物适于向受试者肺上皮细胞局部给药。

2.权利要求1的组合物，其中所述组合物为吸入剂。

3.权利要求1的组合物，其中所述组合物为气雾化组合物。

4.权利要求1的组合物，其中所述组合物为喷雾化组合物。

5.权利要求1的组合物，其中所述嘧啶合成抑制剂为来氟米特。

6.权利要求1的组合物，其中所述嘧啶合成抑制剂为A77-1726。

7.权利要求1的组合物，其中所述嘧啶合成抑制剂为二氢乳清酸还原酶抑制剂。

8.权利要求1的组合物，其中所述组合物为适于鼻内给药的形式。

9.权利要求1的组合物，其中所述肺上皮细胞位于受试者的鼻腔、鼻道、鼻咽、咽、气管、支气管、细支气管或肺泡。

10.权利要求9的组合物，其中所述肺上皮细胞为支气管肺泡上皮细胞。

11.一种包括至少一份定量剂量的包含治疗量嘧啶合成抑制剂的组合物的装置，其中每份定量剂量包括治疗受试者肺部疾病的嘧啶合成抑制剂的治疗量或治疗量的一部分。

12.权利要求11的装置，其中所述组合物为适于向受试者肺上皮细胞局部给药的形式。

13.权利要求11的装置，其中所述组合物为吸入剂。

14.权利要求11的装置，其中所述组合物为气雾化组合物。

15.权利要求11的装置，其中所述组合物为喷雾化组合物。

16.权利要求11的装置，其中所述嘧啶合成抑制剂为来氟米特。

17.权利要求11的装置，其中所述嘧啶合成抑制剂为A77-1726。

18.权利要求11的装置，其中所述嘧啶合成抑制剂为二氢乳清酸还原酶抑制剂。

19.权利要求11的装置，其中所述组合物为适于鼻内给药的形式。

20.权利要求11的装置，其中所述肺部疾病为呼吸道合胞病毒感染。

21.一种使肺上皮细胞的Na⁺依赖性液体清除率增加的方法，包括使细胞与有效量的嘧啶合成抑制剂相接触，其中所述接触导致细胞的Na⁺依赖性液体清除率增加。

22.权利要求21的方法，其中所述肺上皮细胞在体内被接触。

23.权利要求21的方法，其中所述肺上皮细胞在体外被接触。

24.权利要求21的方法，其中所述嘧啶合成抑制剂为来氟米特。

25.权利要求21的方法，其中所述嘧啶合成抑制剂为A77-1726。

26.权利要求21的方法，其中所述嘧啶合成抑制剂为二氢乳清酸还原酶抑制剂。

27.一种治疗受试者肺部疾病的方法，包括使受试者的多种肺上皮细胞与有效量的嘧啶合成抑制剂相接触，其中所述有效量的嘧啶合成抑制剂使得受试者的Na⁺依赖性肺泡液体清除率增加。

28.权利要求27的方法，其中所述肺上皮细胞位于鼻腔、鼻道、鼻咽、咽、气管、支气管、细支气管或肺泡。

29.权利要求28的方法，其中所述肺上皮细胞为支气管肺泡上皮细胞。

30.权利要求27的方法，其中所述肺部疾病为呼吸道合胞病毒感染。

31.权利要求27的方法，其中所述嘧啶合成抑制剂包括来氟米特。

32.权利要求27的方法，其中所述嘧啶合成抑制剂包括A77-1726。

33.权利要求27的方法，其中所述有效量的嘧啶合成抑制剂包括二氢乳清酸还原酶抑制剂。

34.一种减少具有呼吸道合胞病毒感染风险的受试者的一种或多种呼吸道合胞病毒感染症状或体征的方法，包括向受试者给予包含有效量嘧啶合成抑制剂的组合物。

35.权利要求34的方法，其中所述嘧啶合成抑制剂为二氢乳清酸还原酶抑制剂。

36.权利要求34的方法，其中所述嘧啶合成抑制剂为来氟米特。

37.权利要求34的方法，其中所述嘧啶合成抑制剂为A77-1726。

38.一种方法，包括鉴别具有呼吸道合胞病毒感染风险的受试者和向该受试者给予包含有效量嘧啶合成抑制剂的组合物。

39.权利要求38的方法，其中所述嘧啶合成抑制剂为二氢乳清酸还原酶抑制剂。

40.权利要求38的方法，其中所述嘧啶合成抑制剂为来氟米特。

41.权利要求38的方法，其中所述嘧啶合成抑制剂为A77-1726。

42.一种方法，包括鉴别患有呼吸道合胞病毒感染的受试者和向该受试者给予包含可有效使受试者的Na⁺依赖性肺泡液体减少的量的嘧啶抑制剂的组合物。

43.一种治疗患有呼吸道合胞病毒感染的受试者的方法，包括向受试者给予权利要求1的组合物。

44.一种治疗患有呼吸道合胞病毒感染的受试者的方法，包括向受试者给予权利要求2的组合物。

45.一种治疗患有呼吸道合胞病毒感染的受试者的方法，包括向受试者给予权利要求5的组合物。

46.一种治疗患有呼吸道合胞病毒感染的受试者的方法，包括向受试者给予权利要求8的组合物。

47.一种筛选使肺上皮细胞的Na⁺依赖性液体吸收增加的测试化合物的方法，该方法包括在过量的UTP存在时使肺上皮细胞与测试化合物相接触，检测肺上皮细胞的Na⁺依赖性液体吸收，由相比于对照的Na⁺依赖性液体吸收的增加指示出使肺上皮细胞的Na⁺依赖性液体吸收增加的测试化合物。

48.权利要求47的方法，其中所述细胞在体内被接触。

49.权利要求47的方法，其中所述细胞在体外被接触。

50.权利要求47的方法，还包括去除所述UTP和检测Na⁺依赖性液体吸收增加的可逆性。

51.一种筛选使细胞的Na⁺依赖性液体吸收增加的测试化合物的方法，该方法包括使测试化合物与表达编码嘧啶合成基因的异源核酸的细胞相接触，并检测细胞的Na⁺依赖性液体吸收，由相比于对照水平的Na⁺依赖性液体吸收的增加指示出使Na⁺依赖性液体吸收增加的测试化合物。

52.权利要求51的方法，其中所述细胞在体内被接触。

53.权利要求51的方法，其中所述细胞在体外被接触。

54.一种筛选使呼吸上皮细胞的Na⁺依赖性液体吸收增加的测试化合物的方法，该方法包括用呼吸道合胞病毒感染H441细胞或细胞系，使受感染的细胞或细胞系与嘧啶合成抑制剂相接触，并测定跨受感染细胞或受感染细胞系的细胞的离子转运，由相比于对照水平的离子转运的增加指示出使Na⁺依赖性液体吸收增加的测试化合物。

55.权利要求54的方法，其中所述细胞在体内被接触。

56.权利要求54的方法，其中所述细胞在体外被接触。