BRPI0509193B1 - Método para diagnosticar doença cervical de alto grau em um paciente, e kit

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BRPI0509193B1

Publication number: BRPI0509193B1
Application number: BRPI0509193-4A
Authority: BR
Inventors: Timothy J. Fischer; Douglas P. Malinowski; Adriann J. Taylor; Margaret R. Parker
Original assignee: Tripath Imaging, Inc.
Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2005-03-23
Publication date: 2019-03-26
Also published as: AU2005228026B2; US7510838B2; BRPI0509193A; CA2560782C; KR20080075045A; KR20070026475A; EP2293069A2; JP2007530949A; KR20110027823A; US7157233B2; AU2005228026A1; BRPI0509193B8; US20050260566A1; WO2005095964A3; US20090148864A1; US20060286595A1; MXPA06011020A; EP1756577B1; CN1957256A; US7455973B2

métodos e composições para a detecção de doença cervical. a presente invenção refere-se a métodos e composições para identificar a doença cervical de alto grau em uma amostra do paciente. os métodos da invenção compreendem detectar a superexpressão de pelo menos um biomarcador em uma amostra de corpo, onde o biomarcador é seletivamente superexpresso na doença cervical de alto grau. nas reivindicações particulares, a amostra de corpo é um esfregaço cervical ou monocamada de células cervicais. os biomarcadores da invenção incluem genes e proteínas que estão envolvidos na regulução do ciclo celular, na transdução de sinal, e na replicação e na transcrição de dna. nas reivindicações particulares, o biomarcador é um gene de fase s. em alguns aspectos da invenção, a superexpressão de um biomarcador de interesse é detectada no nível de proteína usando anticorpos específicos para os biomarcadores ou no nível de ácido nuclético usando técnicas de hibridização de ácido nuclético. são adicionalmente proporcionados kits para efetuar os métodos da invenção.

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR DOENÇA CERVICAL DE ALTO GRAU EM UM PACIENTE, E KIT.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos métodos e às composições para a detecção de doença cervical de alto grau.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O carcinoma do colo útero é o segundo neoplasma mais comum nas mulheres, sendo responsável por aproximadamente 12% de todos os cânceres femininos e causando aproximadamente 250.000 mortes por ano. Baldwin e outros (2003) Nature Reviews Câncer 3:1-10. Em muitos países em desenvolvimento, onde não estão disponíveis programas de triagem em massa, o problema clínico é mais sério. O câncer cervical nestes países é a causa número um de mortes por câncer em mulheres.

A maioria dos casos de câncer cervical representa o carcinoma de células escamosas, embora o adenocarcinoma também seja visto. O câncer cervical pode ser prevenido por triagem da população à medida que ele se desenvolve através de estágios intra-epiteliais não-invasivos bem definidos, que podem ser distinguidos morfologicamente. Williams e outros (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:14932-14937. Embora não seja entendido como as células normais tornam-se transformadas, tem sido amplamente aceito, por anos, o conceito de um espectro contínuo de alteração histopatológica do epitélio estratificado, normal, através de neoplasia intraepitelial cervical (NIC), até o câncer invasivo. O precursor para o câncer cervical é a displasia, também conhecida na técnica como NIC ou lesões intra-epiteliais escamosas (SIL). As anormalidades intra-epiteliais escamosas podem ser classificadas utilizando o sistema de três camadas (NIC) ou de duas camadas (Bethesda). Sob o sistema de Bethesda, as lesões intraepiteliais escamosas de baixo grau (LSIL), correspondendo à NICI e à infecção por HPV, geralmente representam as infecções por HPV produtivas, com um risco relativamente baixo de progressão até a doença invasiva. As lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau (HSIL), correspondendo à NICII e à NICIII no sistema de três camadas, mostram um risco maior de

Petição 870180167488, de 26/12/2018, pág. 6/15 /99 progressão até o câncer cervical do que o faz a LSIL, embora tanto a LSIL quanto a HSIL sejam vistas como precursores potenciais de malignidade. As amostras das pacientes também podem ser classificadas como ASCUS (células escamosas atípicas de significado desconhecido) ou AGUS (células glandulares atípicas de significado desconhecido), sob este sistema.

Foi estabelecida uma forte associação do câncer cervical e a infecção pelos tipos de alto risco de papilomavírus humano (HPV), tais como os tipos 16, 18, e 31. Na realidade, um grande conjunto de evidência epidemiológica e biológica molecular tem estabelecido a infecção por HPV como um fator causativo no câncer cervical. Além disso, o HPV é encontrado em 85% ou mais dos casos de doença cervical de alto grau. Entretanto, a infecção por HPV é muito comum, possivelmente ocorrendo em 5-15% das mulheres acima da idade de 30, porém poucas mulheres positivas para o HPV desenvolverão, em algum tempo, a doença ou o câncer cervical de alto grau. A presença do HPV sozinho é indicativa somente de infecção, não de doença cervical de alto grau, e, portanto, o teste para a infecção por HPV sozinho resulta em muitos falsos positivos. Ver, por exemplo, Wright e outros, (2004) Obstet. Gynecol. 103:304-309.

A literatura atual sugere que o HPV infecta as células-tronco basais dentro do tecido subjacente do colo uterino. A diferenciação das células-tronco em ceratinócitos maduros, com a migração resultante das células para o epitélio cervical estratificado, está associada com a replicação viral do HPV e a re-infecção das células. Ocorrem diversas alterações celulares durante este processo de replicação viral, que incluem a desregulação do ciclo celular, a proliferação ativa, a replicação de DNA, a ativação transcricional e a instabilidade genômica (Crum (2000) Modem Pathology 13:243-251; Middleton e outros (2003) J. Virol. 77:10186-10201; Pett e outros (2004) Câncer Res. 64:1359-1368).

A maior parte das infecções por HPV é de natureza transiente, com a infecção viral se resolvendo dentro de um período de 12 meses. Para aqueles indivíduos que desenvolvem infecções persistentes com um ou mais subtipos oncogênicos de HPV, há um risco pelo desenvolvimento de

neoplasia, em comparação com as pacientes sem uma infecção por HPV. Dada a importância do HPV no desenvolvimento de neoplasia cervical, a detecção clínica do HPV tem se tornado uma ferramenta diagnostica importante na identificação de pacientes que correm o risco de desenvolvimento de neoplasia cervical. A utilidade clínica da triagem à base de HPV para a doença cervical está em seu valor preditivo negativo. Um resultado negativo para HPV, em combinação com uma história de esfregaços normais de Pap, é um indicador excelente de uma condição sem doença e um baixo risco de desenvolvimento de neoplasia cervical durante os 1-3 anos subseqüentes. Entretanto, um resultado positivo para HPV não é diagnóstico de doença cervical; mais exatamente, ele é uma indicação de infecção. Embora a maior parte das infecções por HPV seja transiente e se eliminará espontaneamente dentro de um período de 12 meses, uma infecção persistente com um subtipo viral de HPV de alto risco indica um risco maior para o desenvolvimento de neoplasia cervical. Para suplementar o teste de HPV, a identificação de marcadores moleculares associados com a neoplasia cervical é esperada melhorar a especificidade clínica para a diagnose de doença cervical.

O exame citológico dos esfregaços cervicais por coloração de Papanicolaou (esfregaços de Pap) atualmente é o método de escolha para detectar o câncer cervical. O teste de Pap é um método subjetivo que tem permanecido substancialmente inalterado por 60 anos. Existem diversas considerações, entretanto, em relação ao seu desempenho. A sensibilidade descrita de um único teste de Pap (a proporção de positivos para doença que são positivos no teste) é baixa e mostra ampla variação (30-87%). A especificidade de um único teste de Pap (a proporção de negativos para doença que são negativos no teste) poderia ser tão baixa quanto 86% em uma população de triagem e consideravelmente menor na população de ASCUS PLUS para a determinação da doença de alto grau latente. Ver, Baldwin e outros, supra. Uma porcentagem significativa de esfregaços de Pap caracterizados como LSIL ou NICI é realmente positiva para as lesões de alto grau. Além disso, até 10% dos esfregaços de Pap são classificados θΑ)/ como ASCUS (células escamosas atípicas de significado indeterminado), isto é, não é possível fazer uma categorização clara como lesão normal, moderada ou grave, ou tumor. Entretanto, a experiência mostra que até 10% desta população ASCUS tem lesões de alto grau, que são conseqüente5 mente ignoradas. Ver, por exemplo, Manos e outros (1999) JAMA 281:16051610.

Desse modo, necessita-se de um método para diagnosticar a doença cervical de alto grau que seja independente dos, ou trabalhe em conjunção com os, esfregaços de Pap convencionais e os testes molecu10 lares para a infecção por HPV de alto risco. Tal método deve ser capaz de identificar especificamente a doença cervical de alto grau que está presente em todas as populações de pacientes, incluindo aqueles casos classificados como LSIL ou NICI pela coloração de Pap que são realmente positivos para as lesões de alto grau (isto é, os falsos negativos). Portanto, há uma 15 necessidade na técnica por métodos diagnósticos confiáveis específicos, que sejam capazes de detectar a doença cervical de alto grau e de diferenciar a doença de alto grau das condições que não são consideradas doença clínica, tais como a infecção por HPV em estágio inicial e a displasia branda.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

São proporcionados composições e métodos para diagnosticar a doença cervical de alto grau. Os métodos da invenção compreendem detectar a superexpressão de pelo menos um biomarcador, particularmente um biomarcador nuclear, em uma amostra de corpo, onde a detecção da 25 superexpressão do dito biomarcador especificamente identifica as amostras que são indicativas da doença cervical de alto grau. O presente método distingue as amostras que são indicativas da doença cervical de alto grau das amostras que são indicativas da proliferação benigna, da infecção por HPV em estágio inicial, ou da displasia branda. Assim, o método baseia-se 30 na detecção de um biomarcador que é seletivamente superexpresso nos estados de doenças cervicais de alto grau, porém que não é superexpresso nas células normais ou nas células que não são indicativas de doença clínica.

Os biomarcadores da invenção são proteínas e/ou genes que são seletivamente superexpressos na doença cervical de alto grau, incluindo aqueles que resultam da disfunção do ciclo celular induzida pelo HPV e da 5 ativação de certos genes responsáveis pela indução da fase S. Os biomarcadores de interesse particular incluem os genes da fase S, cuja superexpressão resulta da disfunção do ciclo celular induzida pelo HPV e da ativação subseqüente dos fatores transcricionais SP-1 e E2F. A detecção da superexpressão dos genes ou das proteínas biomarcadoras da invenção 10 permite a diferenciação das amostras que são indicativas de doença de alto grau, tal como a displasia moderada a grave e os carcinomas cervicais, das células normais ou das células que não são indicativas da doença clínica (por exemplo, a displasia ausente de infecção por HPV em estágio inicial e a displasia branda).

A superexpressão dos biomarcadores pode ser avaliada no nível de proteína ou de ácido nucléico. Em algumas modalidades, são proporcionadas técnicas de imunocitoquímica que utilizam anticorpos para detectar a superexpressão das proteínas biomarcadoras em amostras de citologia cervical. Neste aspecto da invenção, é usado pelo menos um anticorpo 20 dirigido para um biomarcador específico de interesse. A superexpressão também pode ser detectada por técnicas à base de ácidos nucléicos, incluindo, por exemplo, a hibridização e a RT-PCR. São também proporcionados kits compreendendo reagentes para praticar os métodos da invenção.

Os métodos da invenção podem também ser usados em 25 combinação com as técnicas diagnosticas ginecológicas tradicionais, que analisam as características morfológicas ou o status da infecção por HPV. Assim, por exemplo, os métodos de imunocitoquímica apresentados aqui podem ser combinados com o teste de Pap, de modo que seja conservada toda a informação morfológica do método convencional. Neste modo, a 30 detecção de biomarcadores que sejam seletivamente superexpressos na doença cervical de alto grau pode reduzir a taxa alta de falso negativo do teste de Pap e pode facilitar a triagem automatizada em massa.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 proporciona um sumário esquemático da proliferação e da desregulação do ciclo celular na displasia cervical. Alterações do ciclo celular e defeitos no controle da proliferação na neoplasia cervical. A infecção por HPV e a superexpressão das oncoproteínas E6 e E7 produz uma série de alterações no ciclo celular e no controle da proliferação. A oncoproteína HPV E6 anula os pontos de controle do ciclo celular nos limites de G1/S e G2/M, com a replicação subseqüente do DNA com mutações somáticas. A E7 promove a aceleração para a fase S com expressão prolongada dos genes da fase S requeridos para a replicação do DNA (indução da fase S anormal). Também, a E6 promove a expressão da telomerase, garantindo a integridade cromossômica continuada dos telômeros durante a proliferação e a imortalidade celular. Finalmente, a E7 anula a via de sinalização do TGF-beta e anula este mecanismo de controle para a interrupção de G1 e o controle da proliferação.

A Figura 2 proporciona uma representação esquemática da indução da fase S anormal na neoplasia cervical. Os efeitos das proteínas do HPV sobre o controle do ciclo celular e a proliferação incluem a inativação das vias do supressor do tumor p53 e Rb, a ativação da transcrição de E2F-1, a indução dos genes da fase S MCM-2, MCM-6, MCM-7, TOP2A e Ciclina E1, juntamente com outros. Além disso, a E2 interage com o fator de transcrição de Sp1 para ativar a expressão do gene de p21-waf-1.

A Figura 3 proporciona uma representação esquemática do ciclo de realimentação sobre a proliferação celular na fase S anormal do ciclo celular. A superexpressão da Ciclina E e da CDK2 na fase S resulta em um mecanismo independente para permitir a indução dos genes da fase S.

A Figura 4 proporciona uma representação esquemática da função do c-myc na indução da fase S anormal. O c-myc é um ativador transcricional importante na proliferação celular. O gene que codifica o c-myc está localizado sobre o cromossomo. Este é o mesmo local que a interação do HPV 18 documentou, com uma amplificação correspondente desta região do gene. A amplificação do gene de c-myc resultaria na superexpressão da proteína codificada e os níveis aumentados de c-myc independentemente contribuiríam para a transcrição do gene da fase S, acelerando mais a proliferação celular.

A Figura 5 proporciona uma representação esquemática dos iniciadores de TaqMan® dirigidos para as variantes do transcrito de MCM7.

A Figura 6 ilustra o padrão de coloração diferencial de um anticorpo dirigido para a Claudina 1 em um ensaio de IHC para uma paciente com displasia branda e uma paciente com carcinoma de célula escamosa.

A Figura 7 ilustra o padrão de coloração diferencial de um anticorpo dirigido para a Claudina 1 em um formato de IHC e ICC. São mostradas as células normais e as células indicativas de NICIII e HSIL.

A Figura 8 ilustra os padrões de coloração nuclear obtidos com um biomarcador nuclear (isto é, MCM2) e os padrões de coloração 15 citoplásmica obtidos com um biomarcador citoplásmico (p16). Os resultados são a partir de um ensaio de imunocitoquímica (ICC) de uma amostra de paciente com doença cervical de alto grau.

A Figura 9 ilustra a coloração de anticorpo desejável e indesejável em um ensaio de imunoistoquímica (IHC) usando dois anticorpos 20 diferentes, dirigidos para o MCM6 sobre o tecido cervical de uma paciente com doença cervical de alto grau.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona composições e métodos para identificar ou diagnosticar a doença cervical de alto grau. Os métodos 25 compreendem a detecção da superexpressão de biomarcadores específicos, que são seletivamente superexpressos na doença cervical de alto grau (por exemplo, a displasia moderada a grave e o câncer cervical). Ou seja, os biomarcadores da invenção são capazes de distinguir entre as células infectadas pelo HPV e as células infectadas pelo HPV que são pré-malignas, 30 malignas, ou visivelmente cancerosas. Os métodos para diagnosticar a doença cervical de alto grau envolvem detectar a superexpressão de pelo menos um biomarcador que seja indicativo de doença cervical de alto grau em uma amostra de tecido ou fluido corporal de uma paciente. Nas modalidades particulares, os anticorpos e as técnicas de imunocitoquímica são usados para detectar a expressão do biomarcador de interesse. São adicionalmente proporcionados kits para praticar os métodos da invenção.

Diagnosticar a doença cervical de alto grau é pretendido incluir, por exemplo, diagnosticar ou detectar a presença de doença cervical, monitorar a progressão da doença, e identificar ou detectar as células ou as amostras que são indicativas da doença cervical de alto grau. Os termos diagnosticar, detectar, e identificar a doença cervical de alto grau são usados de modo intercambiável aqui. Por doença cervical de alto grau é pretendida aquelas condições classificadas por colposcopia como patologia prémaligna, patologia maligna, displasia moderada a grave, e câncer cervical. A doença cervical de alto grau latente inclui a identificação histológica de NICII, NICIII, HSIL, carcinoma in situ, adenocarcinoma, e câncer (estágios l-IV de FIGO).

Conforme discutido acima, uma porcentagem significativa de pacientes, que mostram esfregaços de Pap classificados como normais, NICI, ou ASCUS, de fato têm lesões características de doença cervical de alto grau. Desse modo, os métodos da presente invenção permitem a identificação de doença cervical de alto grau em todas as populações de pacientes, incluindo aquelas pacientes falsas negativas, e facilitam a detecção de células anormais raras em uma amostra da paciente. A diagnose pode ser feita independente da morfologia da célula e do status da infecção por HPV, embora os métodos da invenção possam também ser usados em conjunção com as técnicas diagnosticas convencionais, por exemplo, o teste de Pap, o teste molecular para os tipos de HPV de alto risco, etc.

Os tipos de HPV foram divididos em categorias de alto e de baixo risco, com base na sua associação com o câncer cervical e as lesões pré-cancerosas. Os tipos de HPV de baixo risco incluem os tipos 6, 11, 42, 43, 44 e não estão associados com um risco aumentado de câncer cervical. Em contraste, os tipos de HPV de alto risco, incluindo os tipos 16, 18, 31, 33, cToQ

35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, têm sido fortemente associados com o câncer cervical e as lesões intra-epiteliais escamosas. Ver, por exemplo, Wright e outros (2004) Obstet. Gynecol. 103:304-309. Na realidade, mais de 99% dos cânceres cervicais estão associados com a infecção por HPV de alto risco. A infecção por HPV de alto risco persistente resulta no rompimento do ciclo celular e dos pontos de controle mitóticos nas células cervicais através da ação dos genes de HPV E2, E6, e E7. Em particular, o HPV E7 causa um aumento na ciclina E e na liberação subseqüente do fator de transcrição E2f da proteína de retinoblastoma (Rb). O fator de transcrição E2f liberado então desencadeia a transcrição de uma variedade de genes da fase S, incluindo a topoisomerase II alfa (Topo2A), as proteínas MCM, as ciclinas E1 e E2, e o p14arf, resultando na perda de controle do ciclo celular. O HPV E2 adicionalmente estimula a superexpressão dos genes da fase S, tais como o p21^waf'¹, por ativação do fator de transcrição de Sp-1. O rompimento do ciclo celular causado pela infecção por HPV persistente pode resultar na displasia cervical branda que pode, então, progredir para displasia moderada a grave e, no fim, para câncer cervical em alguns casos. Por câncer cervical pretende-se qualquer câncer ou lesão cancerosa associada com o tecido cervical ou as células cervicais.

A infecção por HPV dentro dos ceratinócitos cervicais resulta em diversas alterações que rompem as atividades dentro do ciclo celular. As oncoproteinas E6 e E7 dos subtipos de HPV de alto risco têm estado implicadas em vários processos celulares relacionados à proliferação aumentada e á transformação neoplástica dos ceratinócitos infectados. A proteína E6 tem estado implicada em dois processos críticos. O primeiro é a degradação da proteína supressora do tumor p53 através da proteólise mediada pela ubiquitina. A remoção da p53 funcional elimina um ponto de controle principal do ciclo celular, responsável pela restauração do DNA antes da entrada na replicação do DNA e na mitose (Duensing e Munger (2003) Prog Cell Cycle Res. 5:383-391). Além disso, a E6 foi mostrada interagir com a proteína c-myc e é responsável pela ativação transcricional direta do gene de hTERT, com a expressão subseqüente da telomerase (McMurray e McCance (2003) J Virol. 77:9852-9861; Veldman e outros (2003) Proc. Natl Acad Sei U.S.A. 100: 8211-8216). A ativação da telomerase é uma etapa-chave na biologia do câncer, responsável pela manutenção do comprimento do telômero nos cromossomos de replicação e 5 esta enzima assegura cromossomos funcionalmente intactos durante a imortalização celular.

A oncoproteína de HPV E7 é sabida contribuir para a proliferação celular através de dois mecanismos independentes. O primeiro é a inativação da via do supressor de tumor TGF-beta, responsável pela 10 interrupção do ciclo celular na fase G1, através da interação direta de E7 com as proteínas Smad (Smad 2, 3 e 4), desse modo inibindo a sua capacidade de ligar-se ao DNA (Lee e outros, (2002) J Biol Chem. 277:38557-38564). Também, a E7 é sabida interagir especificamente com a proteína supressora de tumor Rb. Dentro da fase G1 do ciclo celular, a Rb 15 forma complexo com o fator de transcrição de E2F e impede que o E2F ative a transcrição do gene. No limite de G1/S, a proteína Rb é fosforilada, com liberação do fator de transcrição de E2F - desse modo iniciando a transcrição do gene de E2F e a entrada na fase S do ciclo celular. A oncoproteína de HPV E7 anula este mecanismo de controle ligando-se 20 diretamente com a Rb e removendo o E2F do complexo. Isto resulta na transcrição de gene orientada por E2F independente do controle normal do ciclo celular (Duensing e Munger (2003) Prog Cell Cycle Res. 5:383-391; Duensing e Munger (2004) Int J Câncer 109:157-162; Clarke e Chetty (2001) Gynecol Oncol. 82:238-246). Esta liberação separa a transcrição do gene do 25 controle do ciclo celular e resulta na transcrição prolongada e anormal dos genes da fase S, responsáveis pela síntese de DNA e pela proliferação celular. Ademais, as ações combinadas de ambas E6 e E7 foram mostradas contribuir para as anormalidades do centrossoma e a instabilidade genômica subseqüente na neoplasia cervical (Duensing e Munger (2004) Int J Câncer 30 109:157-162).

Embora não pretendendo estar limitado a um mecanismo particular, em algumas modalidades, o comportamento molecular da doença cervical de alto grau pode ser caracterizado como a superexpressão de genes discretos, normalmente expressos somente durante a fase S do ciclo celular, como um resultado da infecção por cepas oncogênicas de HPV. A ativação descontrolada subseqüente da transcrição do gene e a indução da 5 fase S anormal são mediadas através da via do fator de transcrição de E2F-

1. Este comportamento parece ser indicativo da doença cervical de alto grau e proporciona uma ligação entre as infecções por HPV oncogênico e o comportamento molecular da neoplasia cervical. O uso destes biomarcadores moleculares da neoplasia cervical nos formatos de ensaio diagnóstico 10 molecular pode aperfeiçoar a detecção da doença cervical, com uma sensibilidade e uma especificidade melhoradas sobre os métodos atuais. Ver, de um modo geral, as Figuras 1-4 e Malinowski (2005) BioTecniques 38:1-8 (em impressão), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Desse modo, nas modalidades particulares, um método para 15 diagnosticar a doença cervical de alto grau compreende detectar a superexpressão de um biomarcador, onde a superexpressão do biomarcador é indicativa da indução da fase S anormal, conforme descrito aqui. Em ainda outras modalidades, os métodos compreendem detectar a superexpressão de um biomarcador, onde a superexpressão do biomarcador é indicativa da 20 transcrição ativa ou da superexpressão dos genes de HPV E6 e HPV E7.

A displasia é convencionalmente definida em termos morfológicos por uma perda de orientação normal das células epiteliais, acompanhada por alterações no tamanho celular e nuclear, formato, e características de coloração. A displasia é graduada de acordo com o grau das 25 anormalidades celulares (isto é, branda, moderada, grave) e é amplamente aceita ser um estágio intermediário na progressão de tecido normal para neoplasia, conforme evidenciado pela identificação das condições displásicas pré-malignas, tais como a NIC. Os métodos da presente invenção permitem a identificação da doença cervical de alto grau, que inclui a 30 displasia moderada a grave e o câncer cervical (isto é, as condições de NICII e anteriores), com base na superexpressão de biomarcadores que são específicos para a doença cervical de alto grau.

Os métodos divulgados aqui proporcionam uma detecção superior da doença cervical de alto grau, em comparação com os esfregaços de PAP e/ou o teste da infecção por HPV. Nos aspectos particulares da invenção, a sensibilidade e a especificidade dos presentes métodos são 5 iguais àquelas, ou maiores do que aquelas, dos esfregaços de Pap convencionais. Conforme usada aqui, a especificidade refere-se ao nível no qual um método da invenção pode exatamente identificar as amostras que tenham sido confirmadas como NIL por colposcopia (isto é, verdadeiros negativos). Ou seja, a especificidade é a proporção de negativos da doença 10 que são negativos no teste. Em um estudo clínico, a especificidade é calculada dividindo o número de verdadeiros negativos pela soma dos verdadeiros negativos e os falsos positivos. Por sensibilidade pretende-se o nível no qual um método da invenção pode exatamente identificar as amostras que tenham sido confirmadas, por colposcopia, como positivas 15 para a doença cervical de alto grau (isto é, verdadeiros positivos). Desse modo, a sensibilidade é a proporção de positivos da doença que são positivos no teste. A sensibilidade é calculada em um estudo clínico dividindo o número de verdadeiros positivos pela soma dos verdadeiros positivos e os falsos negativos. Ver os Exemplos 1-3 abaixo. Em algumas 20 modalidades, a sensibilidade dos métodos divulgados para a detecção da doença cervical de alto grau é preferivelmente pelo menos cerca de 70%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80%, mais preferivelmente ainda pelo menos cerca de 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% ou mais. Além disso, a especificidade dos presentes métodos é preferivelmente pelo menos 25 cerca de 70%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80%, mais preferivelmente ainda pelo menos cerca de 90, 91,92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% ou mais.

O termo valor preditivo positivo ou PPV refere-se à probabilidade que uma paciente tenha doença cervical de alto grau quando 30 restrita àquelas pacientes que são classificadas como positivas usando um método da invenção. O PPV é calculado em um estudo clínico dividindo o número de verdadeiros positivos pela soma de verdadeiros positivos e falsos positivos. Em algumas modalidades, o PPV de um método da invenção para diagnosticar a doença cervical de alto grau é pelo menos cerca de 40%, ao mesmo tempo mantendo uma sensibilidade de pelo menos cerca de 90%, mais particularmente pelo menos cerca de 95%. O valor preditivo negativo 5 ou NPV de um teste é a probabilidade que a paciente não terá a doença quando restrita a todas as pacientes que testam negativo. O NPV é calculado em um estudo clínico dividindo o número de verdadeiros negativos pela soma de verdadeiros negativos e falsos negativos.

Os biomarcadores da invenção incluem os genes e as proteínas, 10 e as variantes e os fragmentos destes. Tais biomarcadores incluem o DNA compreendendo a seqüência inteira ou parcial da seqüência de ácidos nucléicos que codifica o biomarcador, ou o complemento de tal seqüência. Os ácidos nucléicos biomarcadores também incluem o RNA compreendendo a seqüência inteira ou parcial de quaisquer das seqüências de ácidos 15 nucléicos de interesse. Uma proteína biomarcadora é uma proteína codificada por, ou correspondendo a, um biomarcador de DNA da invenção. Uma proteína biomarcadora compreende a seqüência de aminoácidos inteira ou parcial de quaisquer das proteínas ou polipeptídeos biomarcadores.

Um biomarcador é qualquer gene ou proteína cujo nível de 20 expressão, em um tecido ou célula, está alterado comparado àquele de uma célula ou tecido normal ou saudável. Os biomarcadores da invenção são seletivos para a doença cervical de alto grau latente. Por seletivamente superexpresso na doença cervical de alto grau pretende-se que o biomarcador de interesse seja superexpresso na doença cervical de alto grau, 25 porém não seja superexpresso nas condições classificadas como LSIL, NICI, amostras infectadas com HPV sem nenhuma displasia presente, células metaplásicas imaturas, e outras condições que não sejam consideradas serem uma doença clínica. Desse modo, a detecção dos biomarcadores da invenção permite a diferenciação das amostras indicativas de doença 30 cervical de alto grau latentes das amostras que são indicativas de proliferação benigna, infecção por HPV em estágio inicial, ou displasia branda. Por infecção por HPV em estágio inicial pretende-se a infecção por HPV que o/// não tenha progredido até a displasia cervical. Conforme usado aqui, a displasia branda refere-se à LSIL e à NICI onde não está presente nenhuma lesão de alto grau. Os métodos da invenção também distinguem as células indicativas de doença de alto grau das células normais, das células metaplásicas imaturas, e de outras células que não sejam indicativas da doença clínica. Neste modo, os métodos da invenção permitem a identificação acurada da doença cervical de alto grau, mesmo nos casos erroneamente classificados como normais, NICI, LSIL, ou ASCUS pelo teste de Pap tradicional (isto é, falsos negativos). Em algumas modalidades, os métodos para diagnosticar a doença cervical de alto grau são efetuados como uma consequência de um esfregaço de Pap anormal ou atípico. Ou seja, os métodos da invenção podem ser efetuados em resposta a uma paciente tendo um resultado de esfregaço de Pap anormal ou atípico. Em outros aspectos da invenção, os métodos são efetuados como um teste de triagem primária para a doença cervical de alto grau na população geral de mulheres, exatamente como o teste de Pap convencional é efetuado atualmente.

Os biomarcadores da invenção incluem qualquer gene ou proteína que seja seletivamente superexpresso na doença cervical de alto grau, como definido aqui acima. Tais biomarcadores são capazes de identificar as células dentro de uma suspensão de células para citologia que são pré-malignas, malignas, ou visivelmente cancerosas. Os biomarcadores da invenção detectam as células de condições NICII e acima, porém não detectam as células NICI e infectadas por HPV onde não haja nenhuma doença de alto grau latente. Os biomarcadores de interesse particular incluem os genes e as proteínas envolvidas na regulação do ciclo celular, no rompimento do ciclo celular pelo HPV, na replicação e na transcrição de DNA, e na transdução de sinal. Em algumas modalidades, os biomarcadores são genes da fase S, incluindo aqueles genes cuja expressão é estimulada pelo fator de transcrição de E2f ou pelo fator de transcrição de Sp-1. Os biomarcadores nucleares podem ser usados para praticar certos aspectos da invenção. Por biomarcador nuclear pretende-se um biomarcador que seja predominantemente expresso no núcleo da célula. Um biomarcador nuclear pode ser expresso até um menor grau em outras partes da célula. Embora qualquer biomarcador indicativo da doença cervical de alto grau possa ser usado na presente invenção, em certas modalidades, os 5 biomarcadores, particularmente os biomarcadores nucleares, são selecionados a partir do grupo consistindo em MCM2, MCM6, MCM7, p21^waf1, topoisomerase II alfa (Topo2A), p14^arf, e ciclina E. Mais particularmente, o biomarcador pode compreender uma proteína de MCM.

As proteínas de manutenção de minicromossomo (MCM) desempenham uma parte essencial na replicação de DNA eucariótico. As proteínas de manutenção de minicromossomo (MCM) funcionam nos estágios iniciais da replicação do DNA através do carregamento do complexo de pré-replicação sobre o DNA e funcionamento como uma helicase para auxiliar a liberar o DNA duplo durante a síntese novamente da fita de DNA em duplicata. Cada uma das proteínas de MCM tem motivos de ATPase dependentes do DNA em seu domínio central altamente conservado. Os níveis das proteínas de MCM geralmente aumentam em um modo variável à medida que as células normais progridem da fase GO para a G1/S do ciclo celular. Na fase GO, as proteínas de MCM2 e de MCM5 são muito menos 20 abundantes do que são as proteínas de MCM7 e de MCM3. A MCM6 forma um complexo com MCM2, MCM4, e MCM7, que liga a histona H3. Ademais, o subcomplexo de MCM4, MCM6, e MCM7 tem atividade de helicase, a qual é mediada pela atividade de ligação ao ATP da MCM6 e pela atividade de ligação ao DNA da MCM4. Ver, por exemplo, Freeman e outros (1999) Clin.

Câncer Res. 5:2121-2132; Lei e outros (2001) J. Cell Sei. 114:1447-1454; Ishimi e outros (2003) Eur. J. Biochem. 270:1089-1101, todos os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade.

As publicações iniciais mostraram que as proteínas de MCM, e em particular, a MCM-5, são úteis para a detecção de doença cervical 30 (Williams e outros (1998) Proc Natl Acad Sei U.S.A. 95:14932-14937), bem como outros cânceres (Freeman e outros (1999) Clin Câncer Res. 5:21212132). A literatura publicada indica que os anticorpos para MCM-5 são

capazes de detectar as células neoplásicas cervicais. A especificidade para a detecção da doença cervical de alto grau não tinha sido demonstrada para a MCM-5 (Williams e outros (1998) Proc Natl Acad Sei U.S.A. 95:1493214937). A detecção da expressão da MCM-5 não está restrita à doença cervical de alto grau, porém é também detectada em displasia de alto grau e células proliferativas que tenham reentrado no ciclo celular seguindo a infecção com o HPV de alto risco. A detecção de neoplasia cervical com anticorpos para MCM-5 é mostrada na Figura 4. Além da MCM-5, outros membros da família de MCM, incluindo a MCM-2 e a MCM-7, mostraram ser marcadores potencialmente úteis para a detecção de neoplasia cervical em amostras de tecidos (Freeman e outros (1999) Clin Câncer Res. 5:21212132; Brake e outros (2003) Câncer Res. 63:8173-8180). Os resultados recentes mostraram que a MCM-7 parece ser um marcador específico para a detecção de doença cervical de alto grau usando formatos de imunoquímica (Brake e outros (2003) Câncer Res. 63:8173-8180; Malinowski e outros (2004) Acta Cytol. 43:696).

A topoisomerase II alfa (Topo2a) é uma enzima nuclear essencial, envolvida na replicação de DNA e é um alvo para muitos fármacos anticâncer usados para a terapia do câncer. A expressão diminuída da Topo2a é um mecanismo predominante de resistência a diversos agentes quimioterapêuticos. Uma variação significativa na faixa de expressão desta proteína tem sido observada em muitos tumores diferentes. A Topo2a é predominante em células que se proliferam e é modificada na fase M por fosforilação em locais específicos, o que é crítico para a condensação de cromossomo mitotótica e a segregação.

A p21 é uma proteína codificada pelo gene de WAF1/Cip1 sobre o cromossomo 6p. Este gene foi mostrado inibir a atividade de diversos complexos de ciclina/cinase dependente de ciclina e bloquear a progressão do ciclo celular. A expressão de p21^waf1 medeia a função da p53 de interromper o ciclo celular. Porque a p21 parece mediar diversas das funções reguladoras do crescimento da p53, a sua expressão pode refletir o status funcional da p53 mais exatamente do que o acúmulo de p53. Além

disso, a p21^waf1 pode inibir a replicação do DNA por bloqueio da ação do antígeno nuclear de célula de proliferação (PCNA).

A Ciclina E é uma subunidade reguladora de cdk-2 e controla a transição de G1/S durante o ciclo celular do mamífero. As múltiplas 5 isoformas de Ciclina E são expressas somente nos tumores, porém não nos tecidos normais, sugerindo uma regulação pós-transcricional da Ciclina E. As análises in vitro indicaram que estas isoformas variantes truncadas da Ciclina E são capazes de fosforilar a histona H1. As alterações nas proteínas de Ciclina E têm estado implicadas como indicadores do prognóstico 10 insatisfatório em diversos cânceres.

Embora os biomarcadores acima mencionados tenham sido discutidos em detalhe, qualquer biomarcador que seja superexpresso nos estados de doença cervical de alto grau (por exemplo, NICII, NICIII, e carcinomas cervicais) pode ser usado na prática da invenção. Os outros 15 biomarcadores de interesse incluem os genes regulados do ciclo celular que são específicos para o limite de fases G1/S ou para a fase S. Tais genes incluem, porém não estão limitados à helicase (DDX11), uracil DNA glicolase (UNG), E2F5, ciclina E1 (CCNE1), ciclina E2 (CCNE2), CDC25A, CDC45L, CDC6, p21, WAF-1 (CDKN1A), CDKN3, E2F1, MCM2, MCM6, NPAT, 20 PCNA, BP de laço-tronco (SLBP), BRCA1, BRCA2, CCNG2, CDKN2C, diidrofolato redutase (DHFR), histona H1, histona H2A, histona H2B, histona H3, histona H4, MSH2, NASP, ribonucleotideo redutase M1 (RRM1), ribonucleotídeo redutase M2 (RRM2), timidina sintetase (TYMS), fator de replicação C4 (RFC4), RAD51, Fator de cromatina 1A (CHAF1A), Fator de 25 cromatina 1B (CHAF1B), topisomerase III (TOP3A), ORC1, primase 2A (PRIM2A), CDC27, primase 1 (PRIM1), endonuclease de estrutura de presilha (FEN1), comp. de anemia de fanconi grp A (FNACA), PKMYT1, e proteína de replicação A2 (RPA2), Ver, por exemplo, Whitfield e outros (2002) Mol. Biol. Cell 13:1977-2000, aqui incorporado por referência em sua 30 totalidade. Os outros genes de fase S de interesse incluem a cinase dependente de ciclina 2 (CDK2), MCM3, MCM4, MCM5, DNA polimerase I alfa (DNA POL1), DNA ligase 1, B-Myb, DNA metil transferase (DNA MET),

pericentrina (PER), KIF4, DP-1, ID-3, proteína de ligação de RNA (RANBP1), junção da lacuna alfa 6 (GJA6), amino levulinato desidratase (ALDH), histona 2A Z (H2A.Z), espermina sintase (SpmS), proliferina 2, proteína de ativação de linfócito T, fosfolipase A2 (PLA2), e antígeno de L6 (L6). Ver, por exemplo, Nevins e outros (2001) Mol. Cell. Biol. 21:4689-4699, aqui incorporado por referência.

Em alguns aspectos da invenção, os biomarcadores compreendem os genes que são induzidos pelo fator de transcrição de E2f. Tais genes incluem, porém não estão limitados à timidilato sintase, timidina cinase 1, ribonucleotídeo redutase M1, ribonucleotídeo redutase M2, CDK2, ciclina E, MCM3, MCM7, PONA, subunidade pequena de DNA primase, topoisomerase II A (Topo2A), DNA ligase 1, endonuclease de presilha 1, RAD51, CDC2, ciclina A2, ciclina B1, ciclina B2, KI-67, KIFC1, FIN16, BUB1, importina alfa-2, HMG2, seqüência reforçadora de zeste, STK-1, BP de laçotronco de histona, Rb, P18-INK4C, anexina VIII, c-Myb, CDC25A, ciclina D3, ciclina E1, desoxicitosina cinase, DP-1, enzima conversora de endotelina, enolase 2, P18 INK4C, ribonucleotídeo redutase, e uracil DNA glicolase 2. Ver, por exemplo, Nevins e outros, supra; Muller e outros (2000) Genes and Dev. 15:267-285. Nas modalidades particulares, o biomarcador de interesse é um gene induzido pelo fator de transcrição de E2f que está envolvido na regulação do ciclo celular e na replicação do DNA, tal como, por exemplo, a ciclina E2, o Ki-67, o p57KIP2, o RAMBPM, e a proteína de replicação A1. Alguns genes de interesse induzidos pelo E2f estão envolvidos na apoptose, incluindo o APAF1, o Bcl-2, a caspase 3, a MAP3 Cinase 5, e o fator associado ao receptor de TNF. Outros genes induzidos por E2f estão envolvidos na regulação da transcrição e incluem, por exemplo, o semelhante a ash2, o polihomeótico 2, a proteína de ectoderma embriônica, a seqüência reforçadora de zeste, felpudo/seqüência reforçadora de divisão, homeobox A10, homeobox A7, homeobox A9, homeodomínio TF1, pré-leucemia de células B FT3, YY1 TF, domínio de POU TF, TAFII130, fator de TBP 172, TF3 básico, bromodomínio/dedo de zinco, SWI/SNF, ID4, TEA-4, NFATC1, NFATC3, BT, CNC-1, MAF, MAFF, MAFG, proteína de ligação de núcleo, fator semelhante a E74 4, c-FOS, JUNB, DNA de dedo de zinco, BP, e transativador de Cpb/p300. Os genes induzidos por E2f, envolvidos na transdução de sinal, são também biomarcadores de interesse potenciais e incluem o TGF beta, a folistatina, a proteína morfogenética do osso 2, o receptor de BMP tipo 1A, o homólogo enrolado 1, o WNT10B, a esfingosina cinase 1, a fosfatase de especificidade dupla 7, a fosfatase de especificidade dupla (Y), o Receptor de FGF 3, a tirosina fosfatase protéica, a fosfatase de especificidade dupla (Y) D6655, o receptor de insulina, a proliferação de células T maduras 1, o receptor de FGF 2, o TGF alfa, a proteína efetora de CDC42 3, Met, CD58, CD83, TACC1, e TEAD4.

Embora os métodos da invenção requeiram a detecção de pelo menos um biomarcador, em uma amostra de paciente, para a detecção da doença cervical de alto grau, podem ser usados 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais biomarcadores para praticar a presente invenção. Reconhece-se que pode ser usada a detecção de mais do que um biomarcador em uma amostra de corpo para identificar situações de doença cervical de alto grau. Portanto, em algumas modalidades, são usados dois ou mais biomarcadores, mais preferivelmente, dois ou mais biomarcadores complementares. Por complementar pretende-se que a detecção da combinação de biomarcadores em uma amostra de corpo resulte na identificação bemsucedida da doença cervical de alto grau em uma porcentagem de casos maior do que seria identificada se somente um dos biomarcadores fosse usado. Assim, em alguns casos, pode ser feita uma determinação mais acurada da doença cervical de alto grau utilizando pelo menos dois biomarcadores. Desse modo, onde pelo menos dois biomarcadores forem usados, pelo menos dois anticorpos dirigidos para proteínas biomarcadoras distintas serão usados para praticar os métodos de imunocitoquímica divulgados aqui. Os anticorpos podem ser contatados com a amostra de corpo simultânea ou concorrentemente. Em certos aspectos da invenção, a superexpressão da MCM2 e da Topo2A é detectada usando três anticorpos, onde dois dos anticorpos são específicos para a MCM2 e o terceiro anticorpo é específico para a Topo2A.

Nas modalidades particulares, os métodos diagnósticos da invenção compreendem coletar uma amostra cervical de uma paciente, contatar a amostra com pelo menos um anticorpo específico para um biomarcador de interesse, e detectar a ligação do anticorpo. As amostras que exibem superexpressão de um biomarcador da invenção, conforme determinado por detecção da ligação do anticorpo, são consideradas positivas para a doença cervical de alto grau. Nas modalidades particulares, a amostra de corpo é uma monocamada de células cervicais. Em alguns aspectos da invenção, a monocamada de células cervicais é proporcionada sobre uma lâmina de vidro.

Por amostra de corpo pretende-se qualquer amostragem de células, tecidos, ou fluidos corpóreos na qual a expressão de um biomarcador possa ser detectada. Os exemplos de tais amostras de corpos incluem, porém não estão limitados ao sangue, linfa, urina, fluidos ginecológicos, biópsias, e esfregaços. As amostras de corpos podem ser obtidas de uma paciente por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, raspando ou esfregando uma área ou usando uma agulha para aspirar os fluidos corpóreos. Os métodos para coletar as diversas amostras de corpos são bastante conhecidos na técnica. Nas modalidades particulares, a amostra de corpo compreende as células cervicais, como amostras de tecido cervical ou como células cervicais em suspensão, particularmente em uma preparação de base líquida. Em uma modalidade, as amostras cervicais são coletadas de acordo com as instruções de preparação de amostras para citologia de base líquida, tal como, por exemplo, a preparação SurePath® (TriPath Imaging, Inc.) ou a ThinPrep® (CYTYC, Inc.). As amostras de corpos podem ser transferidas para uma lâmina de vidro para observação sob ampliação. As soluções fixadoras e de coloração podem ser aplicadas às células sobre a lâmina de vidro, para conservar a amostra e para facilitar o exame. Em uma modalidade, a amostra cervical será coletada e processada para proporcionar uma amostra de monocamada, como apresentado na Patente US N⁹ 5.346.831, aqui incorporada por referência.

O método de monocamada relaciona-se a um método para produzir uma monocamada de material citológico sobre um substrato carregado cationicamente. O método compreende as etapas de separar o material citológico por centrifugação sobre um gradiente de densidade, produzir um pélete comprimido do material citológico, misturar o pélete do material citológico, retirar uma alíquota de um volume predeterminado do pélete misturado, depositar a alíquota e um volume predeterminado de água em um vaso de sedimentação, o qual está fixado, de modo removível, ao substrato cationicamente carregado, permitir que o material citológico sedimente sobre o substrato sob a força da gravidade e, após a sedimentação do material citológico, remover a água do vaso de sedimentação. Para a análise automatizada, o vaso de sedimentação pode estar desprendido do substrato. A desagregação pode ser por quaisquer métodos conhecidos na técnica, tais como a injeção por seringa, a tripsinização, a ultra-sonicação, a agitação, o remoinhar, ou por utilização do dispositivo descrito na Patente U.S. co-pendente 5.316.814, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Em algumas modalidades, as lâminas compreendendo uma monocamada de células cervicais são preparadas a partir de amostras de SurePath® (TriPath Imaging, Inc.) usando o processador de lâminas PrepStain® (TriPath Imaging, Inc.).

Estão incluídos aqui quaisquer métodos disponíveis na técnica para a identificação ou a detecção dos biomarcadores. A superexpressão de um biomarcador da invenção pode ser detectada em um nível de ácido nucléico ou um nível de proteína. Para determinar a superexpressão, a amostra de corpo a ser examinada pode ser comparada com uma amostra de corpo correspondente que se origina de uma pessoa saudável. Ou seja, o nível normal de expressão é o nível de expressão do biomarcador em células cervicais de uma paciente humana não sofrendo de doença cervical de alto grau. Tal amostra pode estar presente na forma padronizada. Em algumas modalidades, particularmente quando a amostra de corpo compreender uma monocamada de células cervicais, a determinação da superexpressão do biomarcador não requer nenhuma comparação entre a amostra de corpo e uma amostra de corpo correspondente que se origina de uma pessoa saudável. Nesta situação, a monocamada de células cervicais de uma única paciente pode conter tão pouco quanto 1-2 células anormais por 50.000 células normais presentes. A detecção destas células anormais, 5 identificadas por sua superexpressão de um biomarcador da invenção, elimina a necessidade de comparação com uma amostra de corpo correspondente que se origina de uma pessoa saudável.

Os métodos para detectar os biomarcadores da invenção compreendem quaisquer métodos que determinem a quantidade ou a 10 presença dos biomarcadores no nível de ácido nucléico ou de proteína. Tais métodos são bastante conhecidos na técnica e incluem, porém não estão limitados aos western blots, northern blots, southern blots, ELISA, imunoprecipitação, imunofluorescência, citometria de fluxo, imunocitoquímica, técnicas de hibridização de ácidos nucléicos, métodos de transcrição reversa 15 de ácidos nucléicos, e métodos de amplificação de ácidos nucléicos. Nas modalidades particulares, a superexpressão de um biomarcador é detectada em um nível de proteína usando, por exemplo, os anticorpos que estão dirigidos contra proteínas biomarcadoras específicas. Estes anticorpos podem ser usados em diversos métodos, tais como as técnicas de Western 20 blot, ELISA, imunoprecipitação, ou imunocitoquímica. Também, a imunocoloração dos esfregaços cervicais pode ser combinada com os métodos de coloração de Pap convencionais, de modo que a informação morfológica e a informação imunocitoquímica possam ser obtidas. Neste modo, a detecção dos biomarcadores pode reduzir a taxa alta de falsos negativos do teste de 25 esfregaço de Pap e pode facilitar a triagem automatizada em massa.

Em uma modalidade, são utilizados anticorpos específicos para as proteínas biomarcadoras para detectar a superexpressão de uma proteína biomarcadora em uma amostra de corpo. O método compreende obter uma amostra de corpo de uma paciente, contatar a amostra de corpo 30 com pelo menos um anticorpo dirigido para um biomarcador que é seletivamente superexpresso na doença cervical de alto grau, e detectar a ligação do anticorpo para determinar se o biomarcador é superexpresso na c/olC amostra da paciente. Um aspecto preferido da presente invenção proporciona uma técnica de imunocitoquímica para diagnosticar a doença cervical de alto grau. Especificamente, este método compreende a coloração dos biomarcadores com anticorpos dentro de uma amostra da paciente que 5 são específicos para a doença cervical de alto grau. Alguém versado na técnica reconhecerá que o método de imunocitoquímica descrito aqui abaixo pode ser efetuado manualmente ou em um modo automatizado usando, por exemplo, o Autostainer Universal Staining Sistem (Dako) ou o Biocare Nemesis Autostainer (Biocare). Um protocolo para a coloração das amostras 10 cervicais com anticorpo (isto é, imunocitoquímica) é proporcionado no Exemplo 1.

Em um método de imunocitoquímica preferido, uma amostra cervical da paciente é coletada para um meio líquido, tal como, por exemplo, em um frasco pequeno de coleta de SurePath® (TriPath Imaging, Inc.). Um 15 processador automatizado, tal como o sistema PrepStain® (TriPath Imaging, Inc.), é usado para coletar as células do meio líquido e para depositá-las em uma camada fina, sobre uma lâmina de vidro, para análise adicional. As amostras da lâmina podem ser fixadas ou não fixadas e podem ser analisadas imediatamente seguindo a preparação ou podem ser armaze20 nadas para análise posterior. Em algumas modalidades, as lâminas preparadas são armazenadas em etanol a 95% por um mínimo de 24 horas. Altemativamente, em outras modalidades, as lâminas são armazenadas em um tampão de pré-tratamento, conforme descrito abaixo.

As amostras podem necessitar ser modificadas para tornar os 25 antígenos biomarcadores acessíveis para a ligação do anticorpo. Em um aspecto particular dos métodos de imunocitoquímica, as lâminas são transferidas para um tampão predeterminado, por exemplo, o Tampão de Preparação SureSlide® (TriPath Imaging, Inc.), e opcionalmente aquecidas para aumentar a acessibilidade do antígeno. O aquecimento da amostra no 30 tampão de pré-tratamento rapidamente rompe a bicamada lipídica das células e torna os antígenos (isto é, as proteínas biomarcadoras) mais acessíveis para a ligação do anticorpo. O tampão de pré-tratamento pode compreender um polímero, um detergente, ou um tensoativo não-iônico ou aniônico, tal como, por exemplo, um tensoativo aniônico ou não-iônico etiloxilado, um alcanoato ou um alcoxilato, ou mesmo as combinações destes tensoativos, ou mesmo o uso de um sal biliar. Nas modalidades 5 particulares, o tampão de pré-tratamento compreende um detergente nãoiônico ou aniônico, tal como o alcanoato de sódio com um peso molecular aproximado de 183 kD, combinado com um alcoxilato com um peso molecular aproximado de 370 kD (daqui por diante referido como RAM). Em uma modalidade particular, o tampão de pré-tratamento compreende 1% de 10 RAM. Em algumas modalidades, o tampão de pré-tratamento pode também ser usado como um tampão de armazenagem da lâmina, como indicado acima. Em uma outra modalidade, uma solução de 0,1% a 1% de monoidrato de sal sódico de ácido dessoxicólico foi usada tanto como um tampão de armazenagem como um tampão de pré-tratamento. Em mais 15 uma outra modalidade da invenção, uma solução de laureth-13-carboxilato de sódio (por exemplo, Sandopan LS) ou e o complexo aniônico etoxilado ou mesmo um ácido carboxílico de etoxilato de alquilarila pode ser usado para os tampões de armazenagem e de pré-tratamento. Em um aspecto particular da invenção, o tampão de pré-tratamento de lâmina compreende 0,05% a 20 5% de laureth-13-carboxilato de sódio, particularmente 0,1% a 1% de laureth-13-carboxilato de sódio, mais particularmente 0,5% de laureth-13carboxilato de sódio. Em uma modalidade, as lâminas podem ser armazenadas no tampão por até 72 horas antes do processo de prétratamento e de coloração. Os tampões de pré-tratamento da invenção 25 podem ser usados nos métodos para preparar os antígenos mais acessíveis para a ligação do anticorpo em um imunoensaio, tal como, por exemplo, um método de imunocitoquímica ou um método de imunoistoquímica. Ver o Exemplo 14. Os termos tampão de pré-tratamento e tampão de preparação são usados de modo intercambiável aqui para referir-se a um tampão 30 que é usado para preparar amostras de citologia ou histologia para a imunocoloração, particularmente por aumento da acessibilidade do antígeno para a ligação do anticorpo.

Pode ser usado qualquer método para preparar antígenos mais acessíveis para a ligação do anticorpo na prática da invenção, incluindo os métodos de liberação de antígenos conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Bibbo e outros (2002) Acta. Cytol. 46:25-29; Saqi e outros (2003) Diagn.

Cytopathol. 27:365-370; Bibbo e outros (2003) Anal. Quant. Cytol. Histol. 25:8-11, aqui incorporados por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, a liberação do antígeno compreende armazenar as lâminas em etanol a 95% por pelo menos 24 horas, imergir as lâminas em Solução de Liberação de Alvo 1X, pH 6,0 (DAKO S1699)/banho de dH2O, 10 preaquecida para 95°C, e colocar as lâminas em um vaporizador por 25 minutos. Ver o Exemplo 2 abaixo.

Seguindo o pré-tratamento ou a liberação do antígeno para aumentar a acessibilidade do antígeno, as amostras são bloqueadas usando um agente de bloqueio apropriado, por exemplo, um reagente de bloqueio 15 de peroxidase, tal como o peróxido de hidrogênio. Em algumas modalidades, as amostras são bloqueadas usando um reagente bloqueador de proteína para impedir a ligação não-específica do anticorpo. O reagente bloqueador de proteína pode compreender, por exemplo, a caseína purificada. Um anticorpo, particularmente um anticorpo monoclonal, dirigido para um 20 biomarcador de interesse é então incubado com a amostra. Conforme observado acima, alguém versado na técnica apreciará que pode ser obtida uma diagnose mais precisa da doença cervical de alto grau, em alguns casos, por detecção de mais do que um biomarcador em uma amostra da paciente. Portanto, nas modalidades particulares, pelo menos dois 25 anticorpos dirigidos para dois biomarcadores distintos são usados para detectar a doença cervical de alto grau. Onde for usado mais do que um anticorpo, estes anticorpos podem ser adicionados a uma amostra individual, sequencialmente como reagentes de anticorpos individuais, ou simultaneamente como um coquetel de anticorpos. Ver o Exemplo 3 abaixo. Alternati30 vamente, cada anticorpo individual pode ser adicionado a uma amostra separada da mesma paciente, e os dados resultantes reunidos. Nas modalidades particulares, um coquetel de anticorpos compreende pelo

menos três anticorpos, onde dois anticorpos especificamente se ligam à MCM2 e um terceiro anticorpo especificamente se liga à Topo2A.

As práticas para a detecção da ligação do anticorpo são bastante conhecidas na técnica. A ligação do anticorpo a um biomarcador de 5 interesse pode ser detectada através do uso de reagentes químicos que geram um sinal que corresponde ao nível de ligação do anticorpo e, conseqüentemente, ao nível de expressão da proteína biomarcadora. Em um dos métodos de imunocitoquímica da invenção, a ligação do anticorpo é detectada através do uso de um anticorpo secundário que está conjugado a 10 um polímero marcado. Os exemplos de polímeros marcados incluem, porém não estão limitados aos conjugados de polímero-enzima. As enzimas nestes complexos são tipicamente usadas para catalisar a deposição de um cromógeno no sítio de ligação de antígeno-anticorpo, desse modo resultando na coloração da célula que corresponde ao nível de expressão do 15 biomarcador de interesse. As enzimas de interesse particular incluem a peroxidase da rabano-silvestre (HRP) e a fosfatase alcalina (AP). Os sistemas de detecção de anticorpos comerciais, tais como, por exemplo, o sistema Envision+ da Dako e o sistema Mach 3 da Biocare Medicai, podem ser usados para praticar a presente invenção.

Em um método de imunocitoquímica particular da invenção, a ligação do anticorpo a um biomarcador é detectada através do uso de um polímero marcado com HRP que está conjugado a um anticorpo secundário. A ligação do anticorpo pode também ser detectada através do uso de um reagente de sonda de camundongo, que se liga aos anticorpos monoclonais 25 de camundongos, e um polímero conjugado à HRP, que se liga ao reagente de sonda de camundongo. As lâminas são tingidas para a ligação do anticorpo usando o cromógeno 3,3-diaminobenzidina (DAB) e então contratingidas com hematoxilina e, opcionalmente, um agente de azular, tal como o hidróxido de amônio ou TBS/Tween-20. Em alguns aspectos da 30 invenção, as lâminas são analisadas microscopicamente por um citotecnologista e/ou um patologista para avaliar a coloração das células (isto é, a superexpressão do biomarcador) e para determinar se a doença cervical de

alto grau está presente. Alternativamente, as amostras podem ser analisadas via microscopia automatizada, ou pela equipe com o auxílio de software de computador que facilite a identificação das células de coloração positiva.

Os termos anticorpo e anticorpos incluem de maneira ampla as formas de anticorpos de ocorrência natural e os anticorpos recombinantes, tais como os anticorpos de cadeias individuais, os anticorpos quiméricos e humanizados e os anticorpos multiespecíficos, bem como os fragmentos e os derivados de todos os precedentes, fragmentos e derivados 10 estes que têm pelo menos um sítio de ligação antigênica. Os derivados de anticorpos podem compreender uma porção protéica ou química conjugada ao anticorpo.

Os anticorpos e as imunoglobulinas (Igs) são glicoproteínas tendo as mesmas características estruturais. Embora os anticorpos exibam 15 especificidade de ligação para um antígeno, as imunoglobulinas incluem tanto os anticorpos quanto as outras moléculas semelhantes aos anticorpos que não têm a especificidade para um antígeno. Os polipeptídeos deste tipo são, por exemplo, produzidos em baixos níveis pelo sistema linfático e em níveis aumentados pelos mielomas.

O termo anticorpo é usado no sentido mais amplo e cobre os anticorpos inteiramente reunidos, os fragmentos dos anticorpos que podem ligar o antígeno (por exemplo, Fab', F’(ab)2, Fv, anticorpos de cadeias individuais, diacorpos), e os peptídeos recombinantes compreendendo o precedente.

O termo anticorpo monoclonal, como usado aqui, refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto pelas possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades pequenas.

Os fragmentos dos anticorpos compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferivelmente a região de ligação ao antígeno ou variável do anticorpo intacto. Os exemplos de fragmentos dos anticorpos incluem os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv; os diacorpos; os anticorpos lineares (Zapata e outros (1995) Protein Eng. 8(10):1057-1062); as moléculas de anticorpos de cadeias individuais; e os anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. A digestão dos anticorpos 5 com papaína produz dois fragmentos idênticos de ligação ao antigeno, chamados fragmentos Fab, cada um com um único sítio de ligação ao antigeno, e um fragmento residual Fc, cujo nome reflete a sua capacidade de cristalizar 35 prontamente. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de combinação com antigeno e é 10 ainda capaz de reticular o antigeno.

Fv é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um sítio de reconhecimento e de ligação ao antigeno completo. Em uma espécie Fv de duas cadeias, esta região consiste em um dímero de um domínio variável de uma cadeia pesada e uma leve em associação firme, não-covalente. Em 15 uma espécie Fv de cadeia individual, o domínio variável de uma cadeia pesada e uma leve pode ser ligado covalentemente por ligador peptídico flexível, de modo tal que as cadeias leve e pesada possam associar-se em uma estrutura dimérica, análoga àquela em uma espécie Fv de duas cadeias. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável 20 interagem para definir um sítio de ligação ao antigeno sobre a superfície do dímero de V_H-V_L. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação ao antigeno para o anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio variável individual (ou metade de um Fv compreendendo somente três CDRs específicas para um antigeno) tem a capacidade de reconhecer e ligar o 25 antigeno, embora em uma afinidade menor do que o sítio de ligação inteiro.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (C_H1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos Fab' pela adição de alguns resíduos na extremidade carbóxi do domínio C_H1 da cadeia pesada incluindo uma ou 30 mais cisteínas a partir da região de articulação do anticorpo. Fab’-SH é a designação aqui contida para o Fab' no qual o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contém(em) um grupo tiol livre. Os fragmentos de

anticorpos F(ab')2 originalmente eram produzidos como pares dos fragmentos Fab' que têm cisteínas de articulação entre eles.

Os anticorpos policlonais podem ser preparados por imunização de uma paciente adequada (por exemplo, coelho, cabra, camundongo, ou 5 outro mamífero) com um imunógeno de proteína biomarcadora. O título de anticorpo na paciente imunizada pode ser monitorado com o tempo por técnicas padrões, tais como com um ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA), usando proteína biomarcadora imobilizada. Em um tempo apropriado após a imunização, por exemplo, quando os títulos de anticorpo 10 estiverem os mais altos, as células produtoras de anticorpos podem ser obtidas da paciente e usadas para preparar os anticorpos monoclonais por técnicas padrões, tais como a técnica do hibridoma originalmente descrita por Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495-497, a técnica do hibridoma de células B humanas (Kozbor e outros (1983) Immunol. Today 4:72), a técnica 15 de EBV-hibridoma (Cole e outros (1985) em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, ed. Reisfeld e Sell (Alan R. Liss, Inc., Nova York, NY), págs. 77-96) ou as técnicas de trioma. A tecnologia para produzir hibridomas é bastante conhecida (ver, de um modo geral, Coligan e outros, eds. (1994) Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., Nova York, NY);

Galfre e outros (1977) Nature 266:550-52; Kenneth (1980) em Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses (Plenum Publishing Corp., NY); e Lemer (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402).

Uma alternativa para preparar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais, um anticorpo monoclonal pode ser identificado e 25 isolado por triagem de uma biblioteca de imunoglobulina combinatória recombinante (por exemplo, uma biblioteca de exposição em fago de anticorpo) com uma proteína biomarcadora para, desse modo, isolar os membros da biblioteca de imunoglobulina que ligam a proteína biomarcadora. Estão comercialmente disponíveis kits para gerar e examinar 30 as bibliotecas de exposição em fago (por exemplo, o Recombinant Phage Antibody System (Sistema de Anticorpo em Fago Recombinante) da Pharmacia, N^Q do Catálogo 27-9400-01; e o SurfZAP 9 Phage Display Kit

(Kit de Exposição em Fago SurfZAP 9) da Stratagene, N^Q do Catálogo 240612). Adicionalmente, os exemplos de métodos e reagentes particularmente receptivos para uso na geração e na triagem da biblioteca de exposição de anticorpo podem ser encontrados, por exemplo, na Patente

U.S. N^Q 5.223.409; nas Publicações PCT N~ WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; 93/01288; WO 92/01047; 92/09690; e 90/02809; em Fuchs e outros (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay e outros (1992) Hum. Antibod. Hybrídomas 3:81-85; Huse e outros (1989) Science 246:1275-1281; Griffiths e outros (1993) EMBO J. 12:725-734.

A detecção da ligação do anticorpo pode ser facilitada por ligação do anticorpo a uma substância detectável. Os exemplos de substâncias detectáveis incluem as diversas enzimas, os grupos proféticos, os materiais fluorescentes, os materiais luminescentes, os materiais bioluminescentes, e os materiais radioativos. Os exemplos de enzimas adequadas 15 incluem a peroxidase da rabano-silvestre, a fosfatase alcalina; a β-galactosidase, ou a acetilcolinaesterase; os exemplos de complexos de grupos protéticos incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem a umbeliferona, a fluoresceína, o isotiocianato de fluoresceína, a rodamina, a diclorotriazinilamina fluores20 ceína, o cloreto de dansila ou a ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui o luminol; os exemplos de materiais bioluminescentes incluem a luciferase, a luciferina e a equorina; e os exemplos de material radioativo adequado incluem ¹²⁵l, ¹³¹l, ³⁵S, ou ³H.

Com relação à detecção da coloração do anticorpo nos métodos 25 de imunocitoquímica da invenção, também existem na técnica métodos de vídeo-microscopia e software para a determinação quantitativa de uma quantidade de espécies moleculares múltiplas (por exemplo, proteínas biomarcadoras) em uma amostra biológica, onde cada espécie molecular presente é indicada por um marcador de corante representativo tendo uma 30 cor especifica. Tais métodos são também conhecidos na técnica como métodos de análise colorimétrica. Nestes métodos, a vídeo-microscopia é usada para proporcionar uma imagem da amostra biológica, após ela ter

sido tingida para indicar visualmente a presença de um biomarcador particular de interesse. Alguns destes métodos, tais como aqueles divulgados no Pedido de Patente U.S. 09/957.446 para Marcelpoil e outros e no Pedido de Patente U.S. 10/057.729 para Marcelpoil e outros, incorporados aqui por referência, divulgam o uso de um sistema de imageamento e software associado para determinar as quantidades relativas de cada espécie molecular presente, com base na presença de marcadores de corantes com cores representativos, conforme indicadas pelo valor da densidade óptica ou da transmitância daqueles marcadores de corantes com cores, respectivamente, como determinado por um sistema de imageamento e software associado. Estas técnicas proporcionam determinações quantitativas das quantidades relativas de cada espécie molecular em uma amostra biológica colorida usando uma única imagem de vídeo que é desconstruída em suas partes com cor dos componentes.

Os anticorpos usados para praticar a invenção são selecionados para terem alta especificidade para as proteínas biomarcadoras de interesse. Os métodos de preparar os anticorpos e para selecionar os anticorpos apropriados são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Celis, e outros (em impressão) Cell Biology & Laboratory Handbook, 3^a edição (Academic Press, Nova York), que é aqui incorporado em sua totalidade por referência. Em algumas modalidades, podem ser usados anticorpos comerciais dirigidos para proteínas biomarcadoras específicas, para praticar a invenção. Os anticorpos da invenção podem ser selecionados na base da coloração de amostras citológicas, em vez de histológicas. Ou seja, nas modalidades particulares, os anticorpos são selecionados com o tipo de amostra final (isto é, preparações da citologia) em mente e para a especificidade de ligação.

Em alguns aspectos da invenção, os anticorpos dirigidos para biomarcadores específicos de interesse são selecionados e purificados via um processo de triagem de múltiplas etapas. Nas modalidades particulares, os polidomas são examinados para identificar anticorpos específicos para biomarcadores que possuem as características desejadas de especificidade

e sensibilidade. Conforme usado aqui, o polidoma refere-se aos hibridomas múltiplos. Os polidomas da invenção são tipicamente proporcionados em placas de cultura de tecidos com múltiplas cavidades. Na etapa de triagem inicial do anticorpo, é gerado um microconjunto de tecidos de tumor compreendendo amostras múltiplas normais (isto é, sem NIC), com NICIII, carcinoma de células escamosas, e adenocarcinoma. Os métodos e o equipamento, tal como o Arranjador de Tecido Avançado Chemicon®, para gerar conjuntos de tecidos múltiplos sobre uma única lâmina, são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N^Q 4.820.504. Os 10 sobrenadantes não diluídos de cada cavidade contendo um polidoma são testados quanto à coloração positiva usando técnicas padrões de imunoistoquímica. Nesta etapa de triagem inicial, a ligação não-especifica, secundária, é essencialmente ignorada. Os polidomas que produzem resultados positivos são selecionados e usados na segunda fase de triagem 15 do anticorpo.

Na segunda etapa de triagem, os polidomas positivos são submetidos a um processo de diluição limitante. Os anticorpos nãoexaminados resultantes são testados quanto à coloração positiva de amostras de NICIII ou carcinoma cervical usando técnicas padrões de 20 imunoistoquímica. Neste estágio, a coloração secundária é relevante, e os polidomas candidatos que somente colorem positivo para as células anormais (isto é, as células NICIII e de câncer) somente são selecionados para análise adicional.

Para identificar os anticorpos que podem distinguir as amostras 25 normais e de NICI daquelas indicativas de doença cervical de alto grau (isto é, NICII e acima), é gerado um microconjunto de tecido de painel da doença. Este microconjunto de tecido tipicamente compreende amostras múltiplas sem NIC, com NICI, NICII, NICIII, carcinoma de células escamosas, e adenocarcinoma. As técnicas padrões de imunoistoquímica são empregadas 30 para testar os polidomas candidatos quanto à coloração positiva específica das amostras indicativas de doença cervical de alto grau somente (isto é, as amostras de NICII e acima). Os polidomas que produzem resultados positivos e coloração secundária mínima são selecionados para análise adicional.

As culturas de coloração positiva são preparadas como clones individuais, a fim de selecionar os anticorpos monoclonais candidatos individuais. Os métodos para isolar os clones individuais são bastante conhecidos na técnica. O sobrenadante de cada clone compreendendo anticorpos não purificados é testado quanto à coloração específica das amostras com NICII, NICIII, carcinoma de células escamosas, e adenocarcinoma, usando os microconjuntos de tecidos de painel da doença descritos aqui acima. Os anticorpos candidatos que mostram coloração positiva das amostras de doença cervical de alto grau (isto é, NICII e acima), coloração mínima de outros tipos de células (isto é, amostras normais e com NICI), e pouca secundária são selecionados para purificação e análise adicional. Os métodos para purificar os anticorpos através de cromatografia de adsorção por afinidade são bem conhecidos na técnica.

Para identificar os anticorpos que mostram coloração específica máxima das amostras de doença cervical de alto grau e coloração mínima não-específica, secundária, nas amostras de citologia cervical, os anticorpos candidatos, isolados e purificados no processo de triagem à base de imunoistoquímica acima descrito, são testados usando as técnicas de imunocitoquímica da presente invenção. Os protocolos ilustrativos para efetuar a imunocitoquímica são proporcionados nos Exemplos 1 e 2.

Especifica mente, os anticorpos purificados de interesse são usados para testar um número estatisticamente significativo de amostras de pacientes de citologia cervical de NIL (isto é, lesão não invasiva), ASCUS, LSIL, HSIL ou cancerosas. As amostras são analisadas por imunocitoquímica, como descrito aqui, e classificadas como positivas, negativas, ou indeterminadas para a doença cervical de alto grau, na base da coloração do anticorpo positiva para um biomarcador particular. A sensibilidade, a especificidade, os valores preditivos positivos, e os valores preditivos negativos para cada anticorpo são calculados. Os anticorpos que exibem coloração específica máxima da doença cervical de alto grau nas amostras de citologia cervical com fundo mínimo (isto é, razão máxima de sinal para ruído) são selecionados para a presente invenção.

A identificação dos anticorpos apropriados resulta em um aumento na razão de sinal para ruído e em um aumento na utilidade clínica 5 do ensaio. O formato do ensaio e o tipo de amostra a ser usada são fatores críticos na seleção dos anticorpos apropriados. Muitos anticorpos dirigidos para os biomarcadores não produzem uma razão desejável de sinal para ruído em um formato de imunocitoquímica com as preparações de citologia ou em um formato de imunoistoquímica com as amostras encerradas em 10 parafina fixadas com formalina. Além disso, os anticorpos de biomarcadores que produzem uma razão máxima de sinal para ruído em um formato de imunoistoquímica podem não funcionar também nos ensaios de imunocitoquímica. Por exemplo, um anticorpo que produz o nível desejado de coloração em um formato de imunocitoquímica pode não produzir o nível 15 apropriado de coloração em um ensaio de imunoistoquímica (dados não mostrados). Também, um anticorpo que produz uma razão de sinal para ruído aceitável quando usado no ensaio de imunoistoquímica pode resultar na coloração excessiva das amostras de imunocitoquímica (dados não mostrados). Assim, a seleção do anticorpo requer consideração inicial do 20 formato do ensaio e do tipo de amostra final a ser usada.

Os ensaios à base de citologia (isto é, imunocitoquímica) diferem dos ensaios à base de tecido (isto é, imunoistoquímica) na medida em que a arquitetura do tecido não está disponível para auxiliar com a interpretação da coloração no formato de imunocitoquímica. Por exemplo, em um ensaio de 25 imunoistoquímica efetuado nas amostras de pacientes com displasia branda ou carcinoma de células escamosas com um anticorpo dirigido para a Claudina 1, os resultados indicaram que a Claudina 1 foi expressa na lesão da amostra de displasia branda (isto é, coloração marrom-clara), porém foi significativamente superexpressa (isto é, coloração marrom-escuro) na lesão 30 de câncer (Figura 12). Os resultados obtidos com o mesmo anticorpo para Claudina 1 em um formato de ensaio de imunocitoquímica eram indeterminados (Figura 13). Embora as células anormais sejam facilmente detectáveis usando um anticorpo para Claudina 1 em um ensaio de imunoistoquímica, os resultados obtidos pela coloração da Claudina 1 no ensaio de imunocitoquímica da invenção foram mais difíceis de interpretar. Portanto, os biomarcadores que são apropriados em um formato de imunoistoquímica podem não ser adequados em um ensaio de imunocitoquímica e, assim, não estão incluídos na modalidade preferida da invenção.

Além disso, a localização dos biomarcadores dentro da célula é também uma consideração importante nos ensaios de imunocitoquímica. Os biomarcadores que mostram padrões de coloração nuclear, citoplásmica, ou de membrana podem ser confirmados morfologicamente e são apropriados para os métodos de imunoistoquímica. A coloração citoplásmica e de membrana, entretanto, torna difícil identificar as características morfológicas críticas da doença cervical (por exemplo, razão de nuclear para citoplásmica) nos ensaios de imunocitoquímica. Ver a Figura 15. Em contraste, os biomarcadores que são expressos no núcleo e mostram um padrão de coloração nuclear facilitam a detecção da coloração do anticorpo e também permitem a análise morfológica. Ver a Figura 15. Desse modo, em algumas modalidades preferidas, somente os biomarcadores que são seletivamente expressos no núcleo são usados em um ensaio de imunocitoquímica da invenção.

Alguém versado na técnica reconhecerá que a otimização do título do anticorpo e da química de detecção é necessitada para maximizar a razão de sinal para ruído para um anticorpo particular. As concentrações de anticorpo que maximizam a ligação específica aos biomarcadores da invenção e minimizam a ligação não-específica (ou secundária) serão determinadas. Nas modalidades particulares, os títulos dos anticorpos apropriados, para uso nas preparações de citologia cervical, são determinados testando inicialmente diversas diluições dos anticorpos nas amostras de tecidos normais encerradas em parafina, fixadas com formalina, e de doença cervical de alto grau. As concentrações de anticorpo e as condições da química de detecção ótimas são primeiramente determinadas para as amostras de tecidos cervicais encerradas em parafina, fixadas com

Mi formalina. O projeto dos ensaios para otimizar as condições de título e detecção do anticorpo é padrão e bastante dentro das capacidades de rotina daqueles versados na técnica. Após serem determinadas as condições ótimas para as amostras de tecidos fixadas, cada anticorpo é então usado 5 nas preparações de citologia cervical sob as mesmas condições. Alguns anticorpos requerem otimização adicional para reduzir a coloração secundária e/ou aumentar a especificidade e a sensibilidade da coloração nas amostras de citologia.

Além disso, alguém versado na técnica reconhecerá que a 10 concentração de um anticorpo particular, usado para praticar os métodos da invenção, variará dependendo de tais fatores como o tempo para a ligação, o nível de especificidade do anticorpo para a proteína biomarcadora, e o método de preparação da amostra de corpo. Além disso, quando forem usados anticorpos múltiplos, a concentração requerida pode ser afetada pela 15 ordem na qual os anticorpos são aplicados à amostra, isto é, simultaneamente como um coquetel ou sequencialmente como reagentes de anticorpos individuais. Além disso, a química de detecção, usada para visualizar a ligação do anticorpo a um biomarcador de interesse, deve também ser otimizada para produzir a razão desejada de sinal para ruído.

Nas outras modalidades, a expressão de um biomarcador de interesse é detectada no nível de ácido nucléico. As práticas à base de ácidos nucléicos para avaliar a expressão são bastante conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, determinar o nível de mRNA biomarcador em uma amostra de corpo. Muitos métodos de detecção da expressão usam 25 o RNA isolado. Qualquer técnica de isolamento do RNA que não selecione contra o isolamento de mRNA pode ser utilizada para a purificação do RNA a partir das células cervicais (ver, por exemplo, Ausubel e outros, ed., (19871999) Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Nova York). Adicionalmente, grandes quantidades de amostras de tecidos podem 30 prontamente ser processadas usando as práticas bastante conhecidas para aqueles de habilidade na técnica, tais como, por exemplo, o processo de isolamento de RNA de etapa única de Chomczynski (1989, Patente U.S. N^p

4.843.155).

O termo sonda refere-se a qualquer molécula que seja capaz de ligar-se seletivamente a uma biomolécula-alvo especificamente pretendida, por exemplo, um transcrito de nucleotídeo ou uma proteína codificada por, ou correspondendo a, um biomarcador. As sondas podem ser sintetizadas por alguém versado na técnica, ou derivadas de preparações biológicas apropriadas. As sondas podem ser especificamente projetadas para serem marcadas. Os exemplos de moléculas que podem ser utilizadas como sondas incluem, porém não estão limitadas ao RNA, DNA, proteínas, anticorpos, e moléculas orgânicas.

O mRNA isolado pode ser utilizado nos ensaios de hibridização ou amplificação que incluem, porém não estão limitados às análises de Southern ou Northern, análises de reação em cadeia por polimerase e conjuntos de sondas. Um método para a detecção dos níveis de mRNA envolve contatar o mRNA isolado com uma molécula (sonda) de ácido nucléico que pode hibridizar com o mRNA codificado pelo gene que está sendo detectado. A sonda de ácido nucléico pode ser, por exemplo, um cDNA de tamanho natural, ou uma parte do mesmo, tal como um oligonucleotídeo de pelo menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ou 500 nucleotídeos de comprimento e suficiente para hibridizar especificamente, sob condições severas, com um mRNA ou DNA genômico codificando um biomarcador da presente invenção. A hibridização de um mRNA com a sonda indica que o biomarcador em questão está sendo expresso.

Em uma modalidade, o mRNA é imobilizado sobre uma superfície sólida e contatado com uma sonda, por exemplo, correndo o mRNA isolado sobre um gel de agarose e transferindo o mRNA do gel para uma membrana, tal como a nitrocelulose. Em uma modalidade alternativa, a(s) sonda(s) é(são) imobilizada(s) sobre uma superfície sólida e o mRNA é contatado com a(s) sonda(s), por exemplo, em um conjunto de fragmento de gene Affymetrix. Um técnico versado pode prontamente adaptar os métodos de detecção de mRNA conhecidos para uso na detecção do nível de mRNA codificado pelos biomarcadores da presente invenção.

Um método alternativo para determinar o nível de mRNA biomarcador em uma amostra envolve o processo de amplificação do ácido nucléico, por exemplo, por RT-PCR (a modalidade experimental apresentada em Mullis, 1987, Patente U.S. N^Q 4.683.202), reação em cadeia por ligase 5 (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:189-193), replicação da seqüência auto-sustentada (Guatelli e outros (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:1874-1878), sistema de amplificação transcricional (Kwoh e outros (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:1173-1177), Q-Beta Replicase (Lizardi e outros (1988) Bio/Technology 6:1197), replicação de círculo contínuo 10 (Lizardi e outros, Patente U.S. N^Q 5.854.033) ou qualquer outro método de amplificação de ácido nucléico, seguido pela detecção das moléculas amplificadas usando práticas bastante conhecidas para aqueles de habilidade na técnica. Estes esquemas de detecção são especialmente úteis para a detecção das moléculas de ácidos nucléicos, se tais moléculas 15 estiverem presentes em quantidades muito baixas. Nos aspectos particulares da invenção, a expressão do biomarcador é avaliada por RT-PCR fluorogênica quantitativa (isto é, o Sistema TaqMan®). Tais métodos tipicamente utilizam pares de iniciadores de oligonucleotídeos que são específicos para o biomarcador de interesse. Os métodos para projetar iniciadores de 20 oligonucleotídeos específicos para uma seqüência conhecida são bastante conhecidos na técnica.

Os níveis de RNA de expressão do biomarcador podem ser monitorados usando uma mancha de membrana (tal como usado na análise de hibridização, tal como Northern, Southem, pequena mancha, e similar), 25 ou microcavidades, tubos de amostras, géis, glóbulos ou fibras (ou qualquer suporte sólido compreendendo ácidos nucléicos ligados). Ver as Patentes U.S. N- 5.770.722, 5.874.219, 5.744.305, 5.677.195 e 5.445.934, que são incorporadas aqui por referência. A detecção da expressão pode também compreender a utilização de sondas de ácidos nucléicos em solução.

Em uma modalidade da invenção, os microconjuntos são usados para detectar a expressão do biomarcador. Os microconjuntos são particularmente bem adequados para este propósito por causa da reprodutibilidade entre os diferentes experimentos. Os microconjuntos de DNA proporcionam um método para a medição simultânea dos níveis de expressão de grandes quantidades de genes. Cada conjunto consiste em um padrão reproduzível de sondas de captura ligadas a um suporte sólido. O RNA ou o DNA marcado é hibridizado com sondas complementares sobre o conjunto e então detectado por varredura a laser. As intensidades da hibridização para cada sonda sobre o conjunto são determinadas e convertidas em um valor quantitativo representando os níveis da expressão do gene relativos. Ver as Patentes U.S. N— 6.040.138, 5.800.992 e 6.020.135, 6.033.860, e 6.344.316, que são incorporadas aqui por referência. Os conjuntos de oligonucleotídeos de alta densidade são particularmente úteis para determinar o perfil de expressão do gene para um grande número de RNA’s em uma amostra.

As técnicas para a síntese destes conjuntos, usando métodos de síntese mecânica, são descritas, por exemplo, na Patente U.S. N^Q5.384.261, incorporada aqui por referência em sua totalidade para todos os propósitos. Embora seja preferida uma superfície do conjunto plana, o conjunto pode ser fabricado sobre uma superfície de virtualmente qualquer formato, ou mesmo uma multiplicidade de superfícies. Os conjuntos podem ser peptídeos ou ácidos nucléicos sobre glóbulos, géis, superfícies poliméricas, fibras, tais como as fibras óticas, vidro ou qualquer outro substrato apropriado, ver as Patentes U.S. N— 5.770.358, 5.789.162, 5.708.153, 6.040.193 e 5.800.992, cada uma das quais é, pelo presente, incorporada em sua totalidade para todos os propósitos. Os conjuntos podem ser acondicionados em tal maneira de modo a permitir os diagnósticos ou outra manipulação de um dispositivo com tudo incluído. Ver as Patentes U.S. N— 5.856.174 e 5.922.591, aqui incorporadas por referência.

Em uma abordagem, o mRNA total isolado da amostra é convertido no cRNA marcado e então hibridizado com um conjunto de oligonucleotídeo. Cada amostra é hibridizada com um conjunto separado. Os níveis de transcrito relativos pode ser calculado por referência aos controles

apropriados presentes no conjunto e na amostra.

São adicionalmente proporcionados kits para praticar os métodos da invenção. Por kit pretende-se qualquer manufatura (por exemplo, uma embalagem ou um recipiente) compreendendo pelo menos 5 um reagente, por exemplo, um anticorpo, uma sonda de ácido nucléico, etc., para detectar especificamente a expressão de um biomarcador da invenção. O kit pode ser promovido, distribuído, ou vendido como uma unidade para efetuar os métodos da presente invenção. Adicionalmente, os kits podem conter um inserto na embalagem descrevendo o kit e os métodos para o seu 10 uso.

Em uma modalidade particular, são proporcionados kits para praticar os métodos de imunocitoquímica da invenção. Tais kits são compatíveis com as técnicas de imunocitoquímica tanto manuais quanto automatizadas (por exemplo, coloração das células), como descritas abaixo, 15 no Exemplo 1. Estes kits compreendem pelo menos um anticorpo dirigido para um biomarcador de interesse, substâncias químicas para a detecção da ligação do anticorpo ao biomarcador, um contracorante, e, opcionalmente, um agente de azular para facilitar a identificação das células de coloração positiva. Quaisquer substâncias químicas que detectem a ligação entre 20 antígeno-anticorpo podem ser usadas na prática da invenção. Em algumas modalidades, as substâncias químicas de detecção compreendem um polímero marcado, conjugado a um anticorpo secundário. Por exemplo, pode ser proporcionado um anticorpo secundário que está conjugado a uma enzima que catalisa a deposição de um cromógeno no sítio de ligação de 25 antígeno-anticorpo. Tais enzimas e práticas para utilizá-las na detecção da ligação do anticorpo são bastante conhecidas na técnica. Em uma modalidade, o kit compreende um anticorpo secundário que está conjugado a um polímero marcado com HRP. Podem ser adicionalmente proporcionados cromógenos compatíveis com a enzima conjugada (por exemplo, DAB 30 no caso de um anticorpo secundário marcado com HRP) e soluções, tais como o peróxido de hidrogênio, para bloquear a coloração não-específica. Em outras modalidades, a ligação do anticorpo a uma proteína biomarcadora yòS é detectada através do uso de um reagente de sonda de camundongo que se liga aos anticorpos monoclonais de camundongo, seguido por adição de um polímero de dextrana conjugado com a HRP que se liga ao reagente de sonda de camundongo. Tais reagentes de detecção estão comercialmente 5 disponíveis, por exemplo, da Biocare Medicai.

Os kits da presente invenção podem adicionalmente compreender um reagente bloqueador de peroxidase (por exemplo, o peróxido de hidrogênio), um reagente bloqueador de proteína (por exemplo, a caseína purificada), e um contracorante (por exemplo, a hematoxilina). Um agente de 10 azular (por exemplo, o hidróxido de amônio ou a TBS, pH 7,4, com Tween20 e azida sódica) pode ser adicionalmente proporcionado no kit para facilitar a detecção das células de coloração positiva.

Em uma outra modalidade, os kits de imunocitoquímica da invenção adicionalmente compreendem pelo menos dois reagentes, por 15 exemplo, anticorpos, para detectar especificamente a expressão de pelo menos dois biomarcadores distintos. Cada anticorpo pode ser proporcionado no kit como um reagente individual ou, altemativamente, como um coquetel de anticorpos compreendendo todos os anticorpos dirigidos para os diferentes biomarcadores de interesse. Além disso, quaisquer ou todos os 20 reagentes do kit podem ser proporcionados dentro de recipientes que os protegem do ambiente externo, tal como em recipientes vedados. Um kit ilustrativo para praticar os métodos da invenção é descrito abaixo, no Exemplo 8.

Os controles positivos e/ou negativos podem ser incluídos nos 25 kits para validar a atividade e corrigir o uso dos reagentes empregados de acordo com a invenção. Os controles podem incluir amostras, tais como as secções de tecidos, células fixadas sobre lâminas de vidro, etc., sabidas serem positivas ou negativas quanto à presença do biomarcador de interesse. Em uma modalidade particular, o controle positivo compreende as 30 células SiHa. Esta é uma linhagem celular humana de câncer escamoso cervical que é hipertriplóide e positiva para a infecção por HPV-16 e, portanto, serve como um controle positivo para a superexpressão de

biomarcadores em estados de doenças cervicais de alto grau. As células de controle SiHa podem ser proporcionadas nos kits da invenção como lâminas preparadas ou como uma suspensão de células que é compatível com a preparação da lâmina. O projeto e o uso de controles é padrão e está bem dentro das capacidades de rotina daqueles versados na técnica.

Em outras modalidades, são adicionalmente proporcionados kits para identificar cervical de alto grau compreendendo detectar a superexpressão do biomarcador no nível de ácido nucléico. Tais kits compreendem, por exemplo, pelo menos uma sonda de ácido nucléico que especificamente se liga a um ácido nucléico biomarcador ou seu fragmento. Nas modalidades particulares, os kits compreendem pelo menos duas sondas de ácidos nucléicos que hibridizam com ácidos nucléicos biomarcadores distintos.

Em algumas modalidades, os métodos da invenção podem ser usados em combinação com as técnicas tradicionais de citologia que analisam as características morfológicas. Por exemplo, as técnicas imunocitoquímicas da presente invenção podem ser combinadas com a coloração de Pap convencional, de modo que toda a informação morfológica do método convencional seja conservada. Neste modo, a detecção dos biomarcadores pode reduzir a alta taxa de falsos negativos do teste de esfregaço de Pap e pode facilitar a triagem automatizada em massa. Em uma modalidade particular, os métodos de imunocitoquímica divulgados aqui acima são combinados com a coloração de Pap convencional em um único método, como descrito abaixo nos Exemplos 6-7. Um método combinado de imunocitoquímica e coloração de Pap permite a visualização de ambos os biomarcadores que são seletivamente superexpressos na doença cervical de alto grau e da morfologia da célula em uma única amostra (por exemplo, uma lâmina de microscópio compreendendo uma monocamada de células cervicais). O método combinado de imunocitoquímica e coloração de Pap pode permitir a identificação e a diagnose mais precisas da doença cervical de alto grau, particularmente nos casos erroneamente classificados como normais, LSIL, ou ASCUS pelo teste de Pap convencional. A análise tanto da superexpressão do biomarcador quanto da morfologia da célula em um único método podería substituir o esfregaço de Pap como o método de triagem primária para o câncer cervical.

Alguém versado na técnica reconhecerá que os parâmetros de coloração (por exemplo, os tempos de incubação, as condições de lavagem, 5 as concentrações de cromógeno/corante) para esta metodologia combinada necessitarão ser otimizados, de modo tal que seja obtido um contraste suficiente entre o resultado da imunocitoquímica (por exemplo, a coloração do cromógeno) e a coloração de Pap. O projeto dos ensaios para otimizar os parâmetros de coloração é padrão e está bem dentro das capacidades de 10 rotina daqueles de habilidade comum na técnica. Os kits para efetuar o método combinado de imunocitoquímica e coloração de Pap são também incluídos pela presente invenção. Tais kits compreendem os reagentes necessitados para a imunocitoquímica, como descrito aqui acima, e os reagentes para a coloração de Pap convencional, particularmente ο EA50 e 15 o Orange G.

Alguém versado na técnica adicionalmente apreciará que quaisquer ou todas as etapas nos métodos da invenção poderíam ser implementadas pela equipe ou, alternativamente, efetuadas em um modo automatizado. Assim, as etapas de preparação da amostra de corpo, 20 coloração da amostra, e detecção da expressão do biomarcador podem ser automatizadas.

Os exemplos que seguem são oferecidos como forma de ilustração e não como forma de limitação:

EXPERIMENTAL

Exemplo 1: Detecção da Superexpressão do Biomarcador Usando Imunocitoquímica

Preparação e Pré-tratamento da Lâmina

As amostras cervicais das pacientes são coletadas e colocadas em um frasco pequeno de coleta SurePath® (TriPath Imaging, Inc.). As 30 células cervicais são coletadas do meio líquido e depositadas em uma camada fina sobre uma lâmina de vidro usando o sistema de processador de lâmina PrepStain® (TriPath Imaging, Inc.). As lâminas preparadas são imediatamente transferidas para um tampão de pré-tratamento (1% de RAM) e aquecidas por 45 minutos, a 95°C. As lâminas são esfriadas para a temperatura ambiente e enxaguadas três vezes (2 minutos por enxágue) em TBS (salina tamponada com tris).

Imunocitoquímica Manual

Para impedir a coloração secundária não-específica, as lâminas não são deixadas secar totalmente durante o procedimento de coloração. Além disso, a fim de bloquear a coloração não-específica, o peróxido de hidrogênio é aplicado às lâminas por 5 minutos, seguido por um enxágüe 10 com TBS. Um anticorpo dirigido para a MCM6 é aplicado à lâmina por 1 hora, na temperatura ambiente. Seguindo a incubação com o anticorpo para MCM6, a lâmina é lavada três vezes com TBS por 2 minutos, por lavagem. O polímero marcado com HRP anticorpo secundário Envision+ da Dako é aplicado à lâmina por 30 minutos, na temperatura ambiente, seguido por um 15 enxágüe com TBS. O cromógeno DAB em substrato de HRP é aplicado por 10 minutos, e então as lâminas são enxaguadas por 5 minutos com a água. Cada lâmina é contratingida com hematoxilina e então enxaguada com água até ficar clara. Seguindo o contratingimento, as lâminas são embebidas em hidróxido de amônio por 10 segundos e então enxaguadas com água por 1 20 minuto.

As amostras são desidratadas imergindo as lâminas em etanol a 95% por 1 minuto e então em etanol absoluto por um minuto adicional. As lâminas são limpas enxaguando 3 vezes em xileno por 1 minuto, por enxágüe. As lâminas são então cobertas com meio de montagem perma25 nente usando uma placa de vidro e incubadas a 35°C até secar. As células de coloração positiva são visualizadas usando um microscópio de campo brilhante.

Imunocitoquímica Automatizada

O sistema de Autostainer Universal Staining da Dako é 30 programado de acordo com as instruções do fabricante, e os reagentes de coloração e contratingimento necessários descritos acima, para a imunocitoquímica manual, são carregados para a máquina. As lâminas preparadas e pré-tratadas são carregadas para o Autostainer, e o programa é corrido. No final da corrida, as lâminas são removidas e enxaguadas em água por 5 minutos. As lâminas são desidratadas, limpas, cobertas com uma placa de vidro, e analisadas conforme acima descrito.

Exemplo 2: Detecção dos Biomarcadores em Amostras Clínicas

São coletadas aproximadamente 180 amostras cervicais de pacientes de citologia, representando diversos diagnósticos. A presença ou a ausência de células ou lesões cancerosas, indicativas da doença de alto grau nestas pacientes, foi previamente confirmada por colposcopia. A tabela 10 que segue indica o número de amostras dentro de cada grupo de diagnóstico analisado neste estudo, bem como uma descrição das conclusões da colposcopia (por exemplo, a presença ou a ausência de lesões de alto grau). Tabela 1: Amostras analisadas

Diagnóstico	Contagem	Descrição
NIL	72	Negativas para HPV
ASC-US	26	26 sem lesão 0 com lesão ou HPV de alto risco
LSIL	48	42 negativas para lesão de alto grau 6 positivas para lesão de alto grau
HSIL	25
Câncer	10	Carcinoma de Célula Escamosa e Adenocarcinoma

As amostras foram analisadas por métodos de imunocitoquímica para identificar a doença de alto grau. Foram usados anticorpos para detectar a superexpressão de seis biomarcadores de interesse: MCM2, MCM6, MCM7, p21^waf1, Ciclina E, e Topo2A. Os controles de ensaio incluíram o MCM2, o MCM6, o MCM7, o p21^waf1, a Ciclina E, o Topo2A e uma corrida negativa para IgG de camundongo sobre a linhagem celular

SiHa. As amostras foram também analisadas por técnicas tradicionais de coloração de Pap.

Preparação das Lâminas

Cada amostra foi removida da armazenagem e deixada ir para a

temperatura ambiente. 6 ml de conservante CytoRich® da TriPath foram adicionados a cada frasco pequeno, e os frascos pequenos foram remoinhados. As amostras foram processadas sobre o processador automatizado PrepMate® da TriPath, e qualquer fluido restante no frasco pequeno foi 5 transferido para um tubo de centrífuga. As amostras foram centrifugadas por minutos a 200xg, e o sobrenadante foi aspirado. As amostras foram então centrifugadas por 10 minutos a 800xg, e o sobrenadante foi decantado. Os tubos da amostra foram carregados para o sistema PrepStain® da TriPath e o software do sistema (versão 1.1; Transfer Only) foi executado. Oito 10 lâminas para cada amostra de paciente foram preparadas e armazenadas em etanol a 95% por pelo menos 24 horas, porém não mais do que 2 semanas antes do uso nos métodos de coloração de Pap e imunocitoquímica.

Método de Coloração de Pap

As lâminas preparadas foram incubadas em etanol a 95% por 30 segundos e então enxaguadas com água por uns 30 segundos adicionais. A hematoxilina foi aplicada às lâminas por 6 minutos. As lâminas foram enxaguadas em água por 1 minuto, água ácida por 2 segundos, e água por segundos. Um agente de azular (hidróxido de amônio) foi aplicado por 30 20 segundos, e as lâminas foram enxaguadas primeiramente em água e então em etanol a 95% por 30 segundos cada. O EA 50 e o Orange G (Autocyte®) foram aplicados por 6 minutos. As lâminas foram enxaguadas 2 vezes em etanol a 95%, 3 vezes em etanol a 100%, e 3 vezes em xileno por 30 segundos, por enxágüe.

As lâminas foram então cobertas com uma placa de vidro usando o meio de montagem Acrytol e incubadas a 35°C até secarem. As amostras foram examinadas por um patologista usando um microscópio de campo brilhante.

Método de Imunocitoguímica

As lâminas preparadas foram removidas do etanol a 95% e enxaguadas com água deionizada por aproximadamente 1 minuto. As lâminas foram colocadas em uma Solução de Liberação de Alvo 1X, pH 6,0 (DAKO S1699)/banho de dH2O, preaquecida para 95°C, e colocadas em um vaporizador por 25 minutos. As amostras foram deixadas esfriar por 20 minutos na temperatura ambiente, enxaguadas bastante em água deionizada, e colocadas em TBS. As lâminas pré-tratadas foram coloridas para a expressão do biomarcador essencialmente conforme descrito acima no Exemplo 1, Imunocitoquímica Automatizada. Os anticorpos comerciais dirigidos para MCM2 (1:200), MCM7 (1:25), p21waf1 (1:100), e ciclina E (1:100) foram diluídos conforme indicado e usados para detectar a expressão do biomarcador. O anticorpo MCM6 purificado, identificado por exame com polidoma, como descrito no Exemplo 4, foi usado em uma diluição a 1:6000.

Interpretação das Lâminas

Cada lâmina foi examinada e analisada por um citotecnologista e um patologista. As amostras foram classificadas como positivas, negativas ou indeterminadas para a doença cervical de alto grau de acordo com os seguintes parâmetros:

• Os produtos não-celulares e as células inflamatórias colorindo marrom (DAB) foram desconsiderados.

• As células escamosas parecendo normais, maduras, e as células glandulares parecendo normais não foram contadas como positivas quando colorindo com a DAB.

• As células metaplásicas escamosas juntamente com as células anormais foram consideradas positivas.

• Uma intensidade de coloração de menos do que 1,5 foi considerada negativa.

• Os resultados discrepantes foram resolvidos através de análise conjunta das lâminas.

Os resultados da imunocitoquímica foram comparados com os resultados anteriormente obtidos por colposcopia. Cada lâmina recebeu então um resultado final de verdadeiro positivo (TP), verdadeiro negativo (TN), falso positivo (FP), falso negativo (FN), ou indeterminado. A sensibilidade, a especificidade, os valores preditivos positivos, e os valores

preditivos negativos para cada biomarcador foram calculados.

Resultados

Os resultados para cada biomarcador são resumidos abaixo.

Tabela 2: MCM2

Sensibilidade 0,8718

Especificidade 0,9478

PPV 0,8293

NPV 0,9621

Tabela 3: MCM6

TP FP FN TN Indeter. Totais

NIL	0	0	0	68	4	72
ASC-US (Sem Lesão)	0	3	0	22	1	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	14	0	24	4	42
LSIL (HSIL)	3	0	2	0	1	6
HSIL	22	0	0	0	3	25
Câncer	10	0	0	0	0	10

17 2 114 13 181

Sensibilidade 0,9459

Especificidade 0,8702

PPV 0,6731

NPV 0,9828

Tabela 4: MCM7

Sensibilidade 0,9250

Especificidade 0,8923

PPV 0,7255

NPV 0,9748

Tabela 5: Ciclina E

Sensibilidade 0,7059

Especificidade 0,9779

PPV 0,8889

NPV 0,9301

Tabela 6: p21^waf1

TP FP FN TN Indeter. Totais

Μ·

LSIL (HSIL)	3	0	3	0	0	6
	HSIL	21	0	1	0	3	25
	Câncer	7	0	2	0	1	10
		31	15	6	106	23	181
Sensibilidade	0,8378
Especificidade	0,8760
PPV	0,6739
NPV	0,9464

Tabela 7: TOPO2A

TP FP FN TN Indeter. Totais

NIL	0	0	0	68	4	72
ASC-US (Sem Lesão)	0	1	0	24	1	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	4	0	27	11	42
LSIL (HSIL)	3	0	3	0	0	6
HSIL	21	0	1	0	3	25
Câncer	9	0	0	0	1	10

5 4 119 20 181

Sensibilidade 0,8919 Especificidade 0,9597 PPV 0,8684

NPV 0,9675

Aproximadamente 180 casos foram analisados quanto à presença de doença cervical de alto grau usando os métodos de imunocitoquímica da invenção. Deste número, os biomarcadores MCM produziram uma taxa indeterminada variando de 4% a 7%. Adicionalmente, o MCM2 5 mostrou uma especificidade de 95% com uma sensibilidade de 87%. Os biomarcadores MCM6 e MCM7 produziram resultados de sensibilidade comparáveis de 95% e 93%, respectivamente. A especificidade para estes dois biomarcadores variou de 87% a 89%.

A Ciclina E produziu o maior valor de especificidade de 98%. 10 Embora a taxa indeterminada fosse 6%, a sensibilidade foi somente 71%. A taxa indeterminada para p21^waf1 foi a mais alta de todos os marcadores

testados a 13%. O p21^waf1 produziu a sensibilidade de 84% e uma especificidade de 88%. A especificidade de 96% foi observada com o biomarcador Topo2A. A taxa indeterminada para o Topo2A foi 11%, com uma sensibilidade de 89%.

Exemplo 3: Detecção dos Biomarcadores nas Amostras Clínicas Usando os Coquetéis de Anticorpos

Aproximadamente 180 amostras de citologia cervical, confirmadas por colposcopia, foram analisadas por métodos de imunocitoquímica, para identificar a doença cervical de alto grau. Cada amostra foi analisada 10 quanto à expressão dos biomarcadores múltiplos de interesse. Especificamente, diversas combinações de anticorpos dirigidos para MCM2, MCM6, MCM 7, p21waf1, Ciclina E, e Topo2A foram analisadas quanto à sua capacidade de detectar a doença cervical de alto grau. Estas amostras foram avaliadas quanto à expressão dos biomarcadores múltiplos de 15 interesse usando os métodos de imunocitoquímica e as orientações das interpretações das lâminas descritos no Exemplo 2.

Os resultados da imunocitoquímica foram comparados com os resultados anteriormente obtidos por colposcopia. Cada lâmina recebeu então um resultado final de verdadeiro positivo (TP), verdadeiro negativo 20 (TN), falso positivo (FP), falso negativo (FN), ou indeterminado. A sensibilidade, a especificidade, os valores preditivos positivos, e os valores preditivos negativos para cada biomarcador foram calculados.

Resultados

Os resultados para cada biomarcador são resumidos abaixo.

Tabela 8: MCM2 e MCM7

TP FP FN TN Indeter. Totais

NIL	0	0	0	66	6	72
ASC-US (Sem Lesão’	0	2	0	20	4	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	13	0	25	4	42
LSIL (HSIL)	4	0	2	0	0	6
HSIL	24	0	1	0	0	25
Câncer	10	0	0	0	0	10

15 3 111 14 181

Sensibilidade 0,9268

Especificidade 0,8810

PPV 0,7170

NPV 0,9737

Tabela 9: MCM6 e MCM7

TP FP FN TN Indeter. Totais

	NIL	0	0	0	65	7	72
te	ASC-US (Sem Lesão^	0	3	0	21	2	26
*	ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
-	LSIL (Sem HSIL)	0	16	0	23	3	42
	LSIL (HSIL)	4	0	2	0	0	6
	HSIL	24	0	0	0	1	25
	Câncer	10	0	0	0	0	10

19 2 109 13 181

Sensibilidade 0,9500

Especificidade 0,8516

PPV 0,6667

NPV 0,9820 οέ50

Tabela 10: MCM7 e TOPQ2A

TP FP FN TN Indeter. Totais

NIL	0	0	0	64	8	72
ASC-US (Sem Lesão;	0	2	0	21	3	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	12	0	29	1	42
LSIL(HSIL)	4	0	2	0	0	6
HSIL	20	0	2	0	3	25
Câncer	8	0	0	0	2	10

14 4 114 17 181

Sensibilidade 0,8889

Especificidade 0,8906

PPV 0,6957

NPV 0,9661

Tabela 11: MCM7 e Ciclina E

TP FP FN TN Indeter. Totais

NIL	0	0	0	67	5	72
ASC-US (Sem Lesão;	0	2	0	21	3	26
ASC-US (Lesão;	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	12	0	28	2	42
LSIL (HSIL)	4	0	2	0	0	6
HSIL	24	0	1	0	0	25
Câncer	10	0	0	0	0	10

14 3 116 10 181

Sensibilidade 0,9268

Especificidade 0,8923

PPV 0,7308

NPV 0,9748

Tabela 12: MCM7 e p21waf1

NIL	TP	FP	FN	TN	Indeter.	Totais 72
0	2	0	57	13
ASC-US (Sem Lesão)	0	3	0	20	3	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	14	0	21	7	42
LSIL (HSIL)	4	0	2	0	0	6
HSIL	24	0	1	0	0	25
Câncer	9	0	0	0	1	10
	37	19	3	98	24	181

Sensibilidade 0,9250 Especificidade 0,8376 PPV 0,6607

NPV 0,9703

Sensibilidade 0,9487

Especificidade 0,8450

PPV 0,6491

NPV 0,9820

Sensibilidade 0,8409 Especificidade 0,9231 PPV 0,8043

NPV 0,9391

Sensibilidade 0,8537

Especificidade 0,9318

PPV 0,7955

NPV 0,9535

Tabela 16: MCM2 e p21waf1

	TP	FP	FN	TN	Indeter.	Totais
NIL	0	2	0	60	10	72
ASC-US (Sem Lesão)	0	1	0	21	4	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	13	0	21	8	42
LSIL(HSIL)	3	0	3	0	0	6
HSIL	24	0	1	0	0	25
Câncer	9	0	1	0	0	10

16 5 102 22 181

Sensibilidade 0,8780 Especificidade 0,8644 PPV 0,6923

NPV 0,9533

Sensibilidade 0,8947

Especificidade 0,9520

PPV 0,8500

NPV 0,9675

Tabela 18: TOPQ2A e p21waf1

NIL	TP	FP	FN	TN	Indeter.	Totais 72
0	2	0	58	12
ASC-US (Sem Lesão)	0	2	0	21	3	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	13	0	19	10	42
LSIL(HSIL)	3	0	3	0	0	6
HSIL	25	0	0	0	0	25
Câncer	10	0	0	0	0	10
	38	17	3	98	25	181

Sensibilidade 0,9268 Especificidade 0,8522 PPV 0,6909

NPV 0,9703

Tabela 19: p21waf1 e Ciclina E

NIL	TP	FP	FN	TN	Indeter.	Totais 72
0	2	0	61	9
ASC-US (Sem Lesão)	0	1	0	22	3	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	12	0	23	7	42
LSIL (HSIL)	3	0	3	0	0	6
HSIL	22	0	1	0	2	25
Câncer	8	0	1	0	1	10
	33	15	5	106	22	181

Sensibilidade 0,8684

Especificidade 0,8760

PPV 0,6875

NPV 0,9550

Sensibilidade 0,9500 Especificidade 0,8400 PPV 0,6552

NPV 0,9813

Sensibilidade 0,9512

Especificidade 0,8739

PPV 0,7222

NPV 0,9811 &15Q.

Sensibilidade 0,9512 Especificidade 0,8455 PPV 0,6724

NPV 0,9811

Sensibilidade 0,9500

Especificidade 0,8516

PPV 0,6667

NPV 0,9820

Tabela 24: MCM2, MCM7, e Ciclina E

TP FP FN TN Indeter. Totais

NIL	0	0	0	66	6	72
ASC-US (Sem Lesão)	0	2	0	20	4	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	13	0	25	4	42
LSIL (HSIL)	4	0	2	0	0	6
HSIL	24	0	1	0	0	25
Câncer	10	0	0	0	0	10

15 3 111 14 181

Sensibilidade 0,9268 Especificidade 0,8810 PPV 0,7170

NPV 0,9737

Tabela 25: MCM2, MCM7, e p21waf1

NIL	TP	FP	FN	TN	Indeter. Totais
0	2	0	56	14	72
ASC-US (Sem Lesão;	0	3	0	18	5	26
ASC-US (Lesão^	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	14	0	20	8	42
LSIL (HSIL)	4	0	2	0	0	6
HSIL	24	0	1	0	0	25
Câncer	10	0	0	0	0	10
	38	19	3	94	27	181

Sensibilidade 0,9268

Especificidade 0,8319

PPV 0,6667

NPV 0,9691 ο25ϊ

0^5*7

Tabela 28: MCM2, ΤΟΡΟΙΙΑ e p21waf1

	TP	FP	FN	TN	Indeter.	Totais
NIL	0	2	0	57	13	72
ASC-US (Sem Lesão)	0	2	0	20	4	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	13	0	18	11	42
LSIL (HSIL)	3	0	3	0	0	6
HSIL	25	0	0	0	0	25
Câncer	10	0	0	0	0	10
	38	17	3	95	28	181

Sensibilidade	0,9268
Especificidade	0,8482
PPV	0,6909
NPV	0,9694

Tabela 29: MCM7, TOPO2A, e Ciclina E

TP FP FN TN Indeter. Totais

NIL	0	0	0	64	8	72
ASC-US (Sem Lesão)	0	2	0	21	3	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	12	0	23	7	42
LSIL (HSIL)	4	0	2	0	0	6
HSIL	25	0	0	0	0	25
Câncer	10	0	0	0	0	10

14 2 108 18 181

Sensibilidade 0,9512

Especificidade 0,8852

PPV 0,7358

NPV 0,9818

Tabela 30: MCM7, p21waf1, e Ciclina E

NIL	TP	FP	FN	TN	Indeter.	Totais 72
0	2	0	57	13
ASC-US (Sem Lesão)	0	3	0	19	4	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	14	0	21	7	42
LSIL(HSIL)	4	0	2	0	0	6
HSIL	24	0	1	0	0	25
Câncer	10	0	0	0	0	10
	38	19	3	97	24	181

Sensibilidade 0,9268 Especificidade 0,8362 PPV 0,6667

NPV 0,9700

Sensibilidade 0,9512

Especificidade 0,8273

PPV 0,6724

NPV 0,9785 <JGf

V

Tabela 32: MCM2, MCM7, Ciclina E, e p21waf1

NIL	TP	FP	FN	TN	Indeter.	Totais 72
0	2	0	56	14
ASC-US (Sem Lesão)	0	3	0	18	5	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	14	0	20	8	42
LSIL(HSIL)	4	0	2	0	0	6
HSIL	24	0	1	0	0	25
Câncer	10	0	0	0	0	10
	38	19	3	94	27	181

Sensibilidade 0,9268 Especificidade 0,8319 PPV 0,6667

NPV 0,9691

Tabela 33: MCM2, MCM7, Ciclina E e TOPOIIA

TP FP FN TN Indeter. Totais

NIL ASC-US (Sem Lesão) ASC-US (Lesão) ; LSIL (Sem HSIL) LSIL (HSIL) HSIL Câncer	0	0	0	63	9	72 26 0 42 6 25 10
0	2	0	20	4
0	0	0	0	0
0	13	0	21	8
4	0	2	0	0
25	0	0	0	0
10	0	0	0	0

15 2 104 21 181

Sensibilidade 0,9512

Especificidade 0,8739

PPV 0,7222

NPV 0,9811

Tabela 34: MCM2, MCM7, Ciclina E, p21waf1, e TQPQ2A

NIL	TP	FP	FN	TN	Indeter.	Totais 72
0	2	0	53	17
ASC-US (Sem Lesão)	0	3	0	18	5	26
ASC-US (Lesão)	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	14	0	18	10	42
LSIL (HSIL)	4	0	2	0	0	6
HSIL	25	0	0	0	0	25
Câncer	10	0	0	0	0	10
	39	19	2	89	32	181

Sensibilidade 0,9512 Especificidade 0,8241 PPV 0,6724

NPV 0,9780

Tabela 35: MCM2, MCM6, MCM7, TOPO2A, Ciclina E, e p21waf1

TP FP FN TN Indeter. Totais

NIL	0	2	0	52	18	72
ASC-US (Sem Lesão;	0	4	0	18	4	26
ASC-US (Lesão;	0	0	0	0	0	0
LSIL (Sem HSIL)	0	18	0	16	8	42
LSIL (HSIL)	4	0	2	0	0	6
HSIL	25	0	0	0	0	25
Câncer	10	0	0	0	0	10

24 2 86 30 181

Sensibilidade 0,9512

Especificidade 0,7818

PPV 0,6190

NPV 0,9773

Os dados foram compilados nos 28 coquetéis de anticorpos, conforme descrito acima. A expressão do biomarcador foi analisada usando os coquetéis compreendendo os anticorpos dirigidos para 2, 3, 4, 5 ou mesmo todos os 6 dos biomarcadores de interesse. Vinte e um dos 28 coquetéis de anticorpos mostraram sensibilidades maiores do que 92%.

Quatro dos 28 coquetéis produziram especificidades acima de 90%, com o

menor valor de 78%. Os maiores valores foram obtidos com uma combinação de MCM2, TOPOIIA e Ciclina E. Este coquetel produziu uma sensibilidade de 93% juntamente com uma especificidade de 92%. Parece que uma combinação de pelo menos 3 biomarcadores deve produzir uma 5 sensibilidade maior do que 90%. Reconhece-se que os ajustes no ensaio aumentariam mais a sensibilidade e a especificidade do ensaio.

Exemplo 4: Detecção da Expressão do Biomarcador Usando Coquetéis de Anticorpos

Os coquetéis dos anticorpos foram preparados usando diversas 10 combinações de anticorpos dirigidos para Ciclina E, MCM2, MCM6, MCM7, p21waf1 e TOPO2a. A composição de cada coquetel é listada na tabela abaixo.

Tabela 36: Composição dos Coquetéis de Anticorpos

Coquetel ID	Biomarcadores
Coquetel 1	Ciclina E, MCM2, MCM7
Coquetel 2	Ciclina E, MCM6, MCM7
Coquetel 3	Ciclina E, MCM7, p21waf1
Coquetel 4	Ciclina E, MCM7, TOPO2a
Coquetel 5	MCM2, MCM7, p21waf1
Coquetel 6	MCM6, MCM7, p21waf1
Coquetel 7	MCM7, p21waf1,TOPO2a
Coquetel 8	MCM2, MCM7, TOPO2a
Coquetel 9	MCM6, MCM7, TOPO2a
Coquetel 10	MCM2, MCM6, MCM7
Coquetel 11	Ciclina E, MCM2, MCM6, MCM7, p21waf1, TOPO2a
Coquetel 12	Ciclina E, MCM2, MCM7, p21waf1
Coquetel 13	MCM2 e MCM 7
Coquetel 14	MCM7 e p21waf1
Coquetel 15	MCM7 e Ciclina E
Coquetel 16	MCM2 e p21waf1
Coquetel 17	Ciclina E e p21waf1
Coquetel 18	MCM2 e Ciclina E

• · 67

Coquetel ID	Biomarcadores
Coquetel 19	MCM7 e TOPO2a
Coquetel 20	MCM2 e TOPO2a
Coquetel 21	Ciclina E e TOPO2a
Coquetel 22	p21waf1 eTOPO2a

Dois grupos de amostras de citologia cervical foram preparados unindo os casos HSIL (união HSIL) e os casos NIL (união NIL). Cada coquetel de anticorpos foi então testado sobre a união HSIL e a união NIL. Os anticorpos de biomarcadores foram também testados individualmente 5 como um controle. A preparação da lâmina e a imunocitoquímica automatizada foram efetuadas conforme descrito no Exemplo 2.

As lâminas foram examinadas e analisadas por um citotecnologista e um patologista. A coloração específica das células, indicativa da doença cervical de alto grau, a coloração das células glandulares, a 10 reatividade cruzada das bactérias e a posição da coloração das células eram todas variáveis que foram registradas durante o processo de triagem.

Os resultados da imunocitoquímica indicaram um aumento na coloração das células, indicativo da doença cervical de alto grau, na união HSIL, com os coquetéis de anticorpos para biomarcadores, quando 15 comparados com os resultados obtidos com a detecção de um único biomarcador. Adicionalmente, não houve nenhum aumento significativo no fundo quando o número de anticorpos nos coquetéis aumentou de 2 para 3, 4 ou 6. Além disso, os diversos coquetéis de anticorpos não mostraram um aumento na coloração secundária quando testados sobre a união NIL.

Exemplo 5: Detecção da Superexpressão do Biomarcador nas Amostras Cervicais Usando a Imunocitoquímica

Preparação e Pré-tratamento da Lâmina

As amostras cervicais das pacientes foram coletadas conforme descrito acima, no Exemplo 1. As lâminas compreendendo uma monoca25 mada de células cervicais foram preparadas pelo Sistema AutoPrep® usando o modo prep only. As lâminas preparadas foram imediatamente colocadas em 1X Tampão de Pré-tratamento SureSlide® (0,5% de laureth-13-

• >

. carboxilato de sódio (Sandopan LS) em H2O deionizada) por um mínimo de hora e um máxima de 72 horas. As lâminas pré-tratadas foram colocadas em um vaporizador a 95°C por 45 minutos, sem preaquecimento. As lâminas foram removidas do vaporizador, deixadas esfriar até a temperatura ambien5 te por 20 minutos, e então enxaguadas em água deionizada. As lâminas foram enxaguadas em TBST (TBS/Tween-20) duas vezes em 2 minutos por enxágüe. Bateu-se de leve nas lâminas para remover o tampão em excesso e elas foram colocadas em um câmara úmida. As lâminas foram submetidas à imunocitoquímica manual ou automatizada, conforme descrito abaixo.

Imunocitoquímica Manual

200 μΙ de reagente de bloqueio de peroxidase (peróxido de hidrogênio a 0,03%) foram aplicados a cada lâmina para cobrir a área de deposição das células por um período de 5 minutos. As lâminas foram então enxaguadas com TBST três vezes a 2 minutos por enxágüe. O tampão em 15 excesso foi removido, e as lâminas foram colocadas em uma câmara úmida.

200 μΙ de reagente de bloqueio de proteína (caseína purificada e tensoativo) foram aplicados a cada lâmina e incubados por 5 minutos. Após o reagente de bloqueio de proteína em excesso ser removido, as lâminas foram ^r colocadas em uma câmara úmida.

200 μΙ do coquetel de anticorpos monoclonais primários, compreendendo dois anticorpos anti-humano de camundongo dirigidos para MCM2 (clone 27C5.6 a 0,39 mg/ml, diluição a 1:800; clone 26H6.19 a 0,918 mg/ml, diluição a 1:10.000) e um terceiro anticorpo anti-humano de camundongo específico para Topo2A (clone SWT3D1 a 100 pg/ml, diluição a 1:10.000), foram aplicados a cada lâmina para cobrir completamente a área de deposição de células. As lâminas foram incubadas por 30 minutos e então enxaguadas com TBST três vezes a 2 minutos por enxágüe. O tampão em excesso foi removido, e as lâminas foram retornadas para a câmara úmida. 200 μΙ de reagente de sonda de camundongo que se liga aos anticorpos monoclonais de camundongos foram aplicados, conforme acima descrito, por 20 minutos. As lâminas foram enxaguadas com TBST três vezes a 2 minutos por enxágüe. O tampão em excesso foi removido, e as lâminas foram novamente colocadas na câmara úmida.

200 μΙ do reagente de polímero, que compreende um polímero de dextrana conjugado com a HRP e um anticorpo secundário anticamundongo de cabra que se liga ao reagente de sonda de camundongo, foram aplicados conforme acima descrito, por 20 minutos, e então as lâminas enxaguadas com TBST 3 vezes a 2 minutos por enxágüe. Após o tampão em excesso ser removido, as lâminas foram retornadas para a câmara úmida. 200 μΙ da solução de substrato-cromógeno DAB foram aplicados como acima descrito, por 5 minutos. As lâminas foram enxaguadas com água deionizada, por 5 minutos, e então enxaguadas com TBST, por 2 minutos, com uma troca de tampão. O tampão em excesso foi removido e as lâminas foram colocadas em uma câmara úmida, como antes. 200 μΙ de hematoxilina foram adicionados durante 1 minuto, seguidos por 3 enxágües com água deionizada a 2 minutos por enxágüe. A água deionizada em excesso foi removida, e as lâminas foram colocadas na câmara úmida. 200 μΙ de agente de azular (isto é, TBS, pH 7,4, com tween-20 e azida sódica) foram aplicados a cada lâmina, por 1 minuto. As lâminas foram então enxaguadas em uma troca de TBST e 1 troca de água deionizada, por 2 minutos cada. As lâminas foram então desidratadas, limpas, cobertas com uma placa de vidro, e analisadas conforme descrito nos Exemplos 1 e 2. Imunocitoquímica Automatizada

O autostainer foi programado de acordo com as instruções do fabricante para incluir a seguinte seqüência de etapas:

a. 2 enxágües com tampão (TBST)

b. bloqueio da peroxidase por 5 min

c. 2 enxágües com tampão (TBST)

d. bloqueio da proteína por 5 min, sopro

e. incubação do coquetel de anticorpos primário por 30 min

f. 3 enxágües com tampão (TBST)

g. reagente de sonda de camundongo por 20 min

h. 3 enxágües com tampão (TBST)

i. polímero-HRP por 20 min

j. 3 enxágües com tampão (TBST)
k.	DAB por 5 min (1 gota de cromógeno para 1 ml de tampão)
I.	3 enxágües com H₂O
m.	2 enxágües com tampão (TBST)
n.	hematoxilina de Mayer por 1 min
0.	3 enxágües com H₂O
P-	agente de azular por 1 min
q.	1 enxágüe com tampão (TBST)
r.	1 enxágüe com H₂O

Os reagentes necessários de coloração e de contratingimento foram carregados para a máquina. As lâminas preparadas e pré-tratadas foram carregadas para o autostainer, e o programa acima descrito foi corrido. No final da corrida, as lâminas foram removidas e enxaguadas brevemente em água da torneira. As lâminas foram desidratadas, limpas, cobertas com uma placa de vidro e analisadas conforme descrito nos Exemplos 1 e 2.

Resultados

Tabela 37: Casos NIL (n=45)

Resultado do Pap
NIL	Outro	Insatisfatório
44	1 (ASC-US)	0

Resultado da ICC
Positivo	Negativo	Insatisfatório
0	44	1

Tabela 38: Casos HSIL (n=45)

Resultado do Pap
HSIL	Outro	Insatisfatório
45	0	0

Resultado da ICC
Positivo	Negativo	Insatisfatório
45	0	0

Dos 45 casos NIL testados, uma análise das lâminas coloridas de Pap revelou um caso ASC-US. Os resultados da imunocitoquímica (ICC) para as amostras de NIL foram negativos, com um caso considerado insatisfatório para avaliação. Com relação aos casos HSIL, cada um dos 45 casos foi confirmado ser doença cervical de alto grau com base na análise das lâminas coloridas de Pap. Adicionalmente, cada um dos 45 casos HSIL foi também positivo no ensaio de ICC. O controle negativo, isto é, um controle de IgG de camundongo universal aplicado ao controle de linhagem celular SiHa, produziu resultados negativos no ensaio de ICC. O controle positivo, isto é, o coquetel de anticorpos primários aplicado ao controle de linhagem celular SiHa, produziu resultados positivos no ensaio de ICC.

Exemplo 6: Procedimento Combinado de Imunocitoquímica e Coloração de Pap

As amostras cervicais das pacientes foram coletadas como descrito acima no Exemplo 1. As lâminas compreendendo uma monocamada de células cervicais foram preparadas e pré-tratadas conforme indicado no Exemplo 5. Cada lâmina pré-tratada foi submetida à imunocitoquímica automatizada e à coloração de Pap, desse modo permitindo a visualização tanto da superexpressão do biomarcador quanto da morfologia da célula sobre uma única lâmina.

Imunocitoauímica Automatizada

A imunocitoquímica automatizada foi efetuada sobre cada lâmina, conforme descrito acima no Exemplo 5. No final do programa de coloração, as lâminas foram removidas do autostainer e enxaguadas em água da torneira por 3-5 minutos. Cada lâmina foi então colorida de acordo com os métodos convencionais de coloração de Pap, conforme descrito abaixo.

Método de Coloração de Pap

Seguindo a imunocitoquímica automatizada, cada lâmina foi adicionalmente colorida com a coloração de Pap. As lâminas foram primeiramente enxaguadas em etanol a 95% por 30 segundos. Ο EA50 e o Orange G foram aplicados à metade das lâminas por 3 minutos, e às lâminas restantes por 6 minutos. Todas as lâminas foram então enxaguadas 2 vezes em etanol a 95%, 3 vezes em etanol a 100%, e 3 vezes em xileno, por 30 segundos, por enxágue. As lâminas foram então cobertas com meio de montagem permanente usando uma placa de vidro e analisadas conforme descrito acima, nos Exemplos 1 e 2.

Resultados

Um painel de 5 casos NIL e 5 HSIL foi submetido, cada um, a 3 minutos ou a 6 minutos de coloração com EA50 e Orange G no método de coloração de Pap. Os resultados indicaram diferença mínima entre os protocolos de coloração por 3 minutos e os por 6 minutos. As lâminas submetidas a 3 minutos de coloração de Pap mostraram coloração ligeiramente menos intensa. Além disso, as células de HSIL de coloração positiva da ICC foram prontamente observadas com o contracorante de Pap.

Exemplo 7: Procedimento Combinado de Imunocitoquímica e Coloração de Pap (Otimização da Coloração de Pap)

O procedimento combinado de imunocitoquímica e coloração de Pap resumido no Exemplo 6 foi modificado para otimizar os parâmetros de coloração de Pap, a fim de maximizar o contraste entre a coloração do cromógeno (isto é, DAB) do método de imunocitoquímica e o nível de coloração de Pap.

As lâminas foram preparadas, pré-tratadas, e submetidas à imunocitoquímica automatizada, conforme descrito acima no Exemplo 6. As lâminas foram então coloridas com uma coloração de Pap convencional, essencialmente conforme descrito no Exemplo 6, com as seguintes modificações. A hematoxilina foi testada usando a formulação de Harris juntamente com a formulação de Myers. EA/Orange G foi aplicado por 3 minutos ou 6 minutos. Adicionalmente, houve 3 trocas de etanol a 95% após a adição de EA/Orange.

As lâminas receberam uma determinação de positivas, negativas, ou insatisfatórias com base na coloração de imunocitoquímica. Adicionalmente, as lâminas foram avaliadas morfologicamente para comparação com o diagnóstico de Pap recebido.

Resultados

Tabela 39: Resultados do Método Combinado de Imunocitoquímica e Coloração de Pap

Diagnóstico de Pap Recebido	Resultados da ICC	Comentários
NIL n = 7	Negativo	Todos os casos confirmados como NIL.
LSIL n = 6	Negativo	ASC-US. = 5 dos 6 casos LSIL não tinham células de LSIL sobre as lâminas. Estes casos eram NIL ou ASC-US.
HSIL n = 6	Positivo	Todos os casos confirmados como HSIL.
Câncer n = 4	Positivo	Todos os casos eram carcinoma de célula escamosa.

O procedimento combinado de ICC e coloração de Pap permitiu tanto a análise morfológica quanto a avaliação da superexpressão do biomarcador. Será requerida uma experimentação adicional para otimizar mais o método.

Exemplo 8: Kit de Imunocitoquímica para a Detecção da Superexpressão do Biomarcador em Amostras Cervicais

/. Princípios do Procedimento

Um kit de teste imunocitoquímico contém os reagentes requeridos para completar um procedimento de coloração imunocitoquímica de três etapas para as amostras cervicais de monocamadas preparadas rotineiramente. Seguindo a incubação com o coquetel de anticorpos 15 monoclonais, este kit emprega um reagente de visualização pronto para uso baseado na tecnologia da dextrana. Este reagente consiste em uma molécula de anticorpo secundário anticamundongo de cabra e moléculas de peroxidase do rabano-silvestre ligadas a uma cadeia principal de polímero de dextrana. A conversão enzimática do cromógeno subseqüentemente 20 adicionado resulta na formação de um produto de reação visível no sítio do(s) antígeno(s). A amostra é então contratingida com hematoxilina, um agente de azular é aplicado, e a lâmina é coberta com uma placa de vidro. Os resultados são interpretados usando um microscópio de luz. É obtido um (^7/ resultado positivo indicativo do alto grau cervical quando as células de interesse estão de cor marrom.

Uma galeria de células potencialmente positivas pode ser criada usando o equipamento de imageamento automatizado. A galeria então pode 5 ser analisada para determinar um resultado positivo ou um resultado negativo.

O kit de teste imunocitoquímico é aplicável para a coloração tanto manual quanto automatizada.

II. Reagentes Proporcionados

Os materiais que seguem, suficientes para 75 preparações de monocamadas usando 200 pL do coquetel monoclonal de camundongo pronto para uso, por preparação, foram incluídos no kit de teste imunocitoquímico:

Tabela 40: Componentes do Kit de Imunocitoquímica

N^Q do Frasco	Quantidade	Descrição
1a	1 x 15 mL	Reagente Bloqueador de Peroxidase: Peróxido de hidrogênio tamponado mais estabilizador e componentes patenteados.
1b	1 x 15 mL	Reagente Bloqueador de Proteína: Caseína purificada mais combinação patenteada de proteínas em PBS modificada com conservante e tensoativo.
2	1 x 15 mL	Coquetel de Anticorpos Anti-Humanos de Camundongo: Coquetel de anticorpos monoclonais pronto para uso, fornecido em solução tamponada com TRIS com Tween 20, pH 7,4. Contém 0,39 mg/mL do clone de mAb de MCM2 27C5.6 (diluição a 1:800), 0,918 mg/mL do clone de mAb de MCM2 26H6.19 (diluição de 1:10.000), 100 pg/mL do clone de mAb de Topo2A SWT3D1 (diluição de 1:10.000), proteínas estabilizantes e agente antimicrobiano.
3a	1 x 15 mL	Reagente de Sonda de Camundongo: Liga-se aos anticorpos monoclonais de camundongos.

N^Q do Frasco	Quantidade	Descrição
3b	1 x 15 mL	Reagente de Polímero: Polímero conjugado com peroxidase do rabano-silvestre que se liga ao Reagente de Sonda de Camundongo.
4a	1 x 18 mL	Tampão de Substrato para DAB: Tampão de Substrato usado na preparação do Cromógeno de DAB.
4b	1 x 1mL	Cromógeno de DAB: solução de cromógeno de 3,3'-diaminobenzidina.
5	1 x 18 mL	Contracorante de Hematoxilina: Hematoxilina de Mayers de base aquosa.
6	1 x 18 mL	Agente de Azular: Solução salina tamponada com Tris, pH 7,4, com Tween 20 e 0,09% de NaN₃

Os seguintes materiais e reagentes foram requeridos para efetuar os métodos de imunocitoquímica, porém não foram fornecidos no kit:

• Toalhas Absorventes • Linhagem Celular SiHa (TriPath Imaging, Inc.) · Água Deionizada ou Destilada • Etanol (95% e 100%) • Lamínulas de Vidro • Luvas • Câmara Úmida · Microscópio de Luz (objetivas de 10x, 20x, 40x) • Meio de Montagem • Pipetas e Ponteiras de Pipetas (capazes de distribuir volumes de 20 μΙ, 200 μΙ e 1000 μΙ) • Tampão de Preparação SureSlide (TriPath Imaging, Inc.)- Tampão de

Pré-tratamento (0,5% de laureth-13-carboxilato de sódio (Sandopan

LS) em H2O deionizada) • Vasos ou Banhos de Coloração • Relógio (capaz de intervalos de 1-60 minutos) • Solução Salina Tamponada com Tris (TBS)

• Tween 20 • Controle Negativo de IgG de Camundongo Universal • Aparelho de Remoinhar • Xileno e Substitutos de Xileno · Vaporizador/banho-maria

III. Instruções para Uso

Preparação da Amostra

As seguintes etapas foram seguidas para a preparação das amostras cervicais:

· Consultar o Manual do Operador para o Sistema SurePath PrepStain® quanto à preparação das lâminas a partir das amostras residuais.

• Adicionar 8 mL de fluido conservante de SurePath® à amostra residual no frasco pequeno de SurePath® (aprox. 2 mL). A amostra diluída é processada sobre o PrepMate® usando a técnica padrão e sobre o

PrepStain® usando a versão GYN 1.1, Preparação de Lâmina.

• As lâminas preparadas são imediatamente colocadas no tampão de pré-tratamento por um mínimo de 1 hora, com um máximo de 72 horas, antes da imunocoloração.

• A liberação do epítopo deve ser usada para o desempenho ótimo do kit. Este procedimento envolve embeber as lâminas preparadas no tampão de pré-tratamento por um mínimo de 1 hora, na temperatura ambiente, seguido por aquecimento das lâminas no tampão de prétratamento para 95°C. As lâminas são mantidas a 95°C por 15 minutos e deixadas esfriar na temperatura ambiente por 20 minutos. É reco25 mendado o uso de um banho-maria calibrado ou vaporizador vegetal capaz de manter a temperatura requerida. Os laboratórios localizados nas elevações mais altas devem determinar o melhor método de manter a temperatura requerida. O procedimento de coloração é iniciado imediatamente seguindo a liberação do epítopo e o esfriamento. Os desvios do procedimento descrito podem afetar os resultados.

Preparação dos Reagentes

Os seguintes reagentes foram preparados antes da coloração:

Solução Salina Tamponada com Tris com 0.05% de Tween 20 (TBST) • Preparar a TBS de acordo com as especificações do fabricante • Adicionar o Tween 20 até uma concentração final de 0,05%.

• Armazenar na temperatura ambiente se usada dentro de uma semana.

• A solução não utilizada pode ser armazenada a 2-8°C por 3 meses.

• A solução está limpa e incolor. Descartar a solução diluída se o aspecto estiver turvo.

Solução de Substrato-Cromógeno (DAB) (volume suficiente para 5 lâminas) • Transferir 1 mL de Substrato Tamponado com DAB para um tubo de teste.

• Adicionar uma gota (20 - 30 uL) de Cromógeno DAB+. Misturar completamente e aplicar às lâminas com uma pipeta.

• Preparar uma solução de Substrato-Cromógeno nova diariamente.

• Qualquer precipitado que se desenvolva na solução não afeta a qualidade da coloração.

IV. Protocolo de Coloração (Efetuado na Temperatura Ambiente, 20-25°C)

As seguintes etapas foram efetuadas para a imunocoloração das amostras de citologia cervical:

Observações Relativas ao Procedimento de Coloração • O usuário deve ler estas instruções cuidadosamente e tornar-se familiar com todos os componentes, antes do uso.

• Todos os reagentes são equilibrados na temperatura ambiente (2025°C) antes da imunocoloração. Todas as incubações são efetuadas na temperatura ambiente.

• Não permitir que as lâminas sequem totalmente durante o procedimento de coloração. As preparações celulares secadas podem mostrar coloração não-específica aumentada. Cobrir as lâminas expostas às correntezas de ar. As lâminas devem ser colocadas em uma câmara úmida para as incubações prolongadas.

Liberação do Epitopo • Colocar as lâminas preparadas no tampão de pré-tratamento por um mínimo de 1 hora, até um máximo de 72 horas.

• Incubar por 15 minutos a 95°C.

• Remover o vaso de coplin inteiro com as lâminas do banho-maria ou do vaporizador e deixar que as lâminas esfriem no tampão por 20 minutos.

· Enxaguar as lâminas com diH2O e transferir para um banho de TBST.

Bloqueio da Peroxidase • Retirar o tampão em excesso.

• Carregar as lâminas para a câmara de umidade preparada (enchida com toalhas de papel ou gazes umedecidas com água).

· Aplicar 200 μΙ_ de reagente de Bloqueio de Peroxidase para cobrir a área de deposição das células.

• Incubar 5 minutos (±1 minuto).

• Enxaguar as lâminas em TBST, 3 trocas, 2 minutos cada.

Bloqueio da Proteína · Retirar o tampão em excesso.

• Aplicar 200 μΙ_ de reagente de Bloqueio de Proteína para cobrir completamente a área de deposição das células.

· Incubar 5 minutos (±1 minuto).

• Não enxaguar as lâminas.

Coquetel de Anticorpos Primários • Retirar o Bloqueio de Proteína em excesso.

• Aplicar 200 μΙ_ de coquetel de anticorpos primários (para cobrir completamente a área de deposição das células).

• Incubar 30 minutos na temperatura ambiente.

• Enxaguar cada lâmina individualmente com TBST usando um frasco de lavagem (não concentrar o fluxo diretamente sobre a área de deposição das células). Carregar as lâminas para um porta-lâmina.

• Enxaguar as lâminas em TBST, 3 trocas, 2 minutos cada.

Química de Detecção • Retirar o tampão em excesso.

· Aplicar 200 μ!_ de Sonda de Camundongo para cobrir completamente a área de deposição das células.

• Incubar 20 minutos (± 1 minuto).

• Enxaguar as lâminas em TBST, 3 trocas, 2 minutos cada.

• Retirar o tampão em excesso.

· Carregar as lâminas para a câmara de umidade preparada (enchida com toalhas de papel ou gazes umedecidas com água).

• Aplicar 200 μΙ_ de Polímero para cobrir a área de deposição das células.

• Incubar por 20 minutos (± 1 minuto).

· Enxaguar as lâminas em banho de TBST, 3 trocas, 2 minutos cada.

• Retirar o tampão em excesso.

• Aplicar 200 μΙ_ de solução de trabalho de DAB para cobrir completa- mente a área de deposição das células.

• Incubar por 5 minutos (± 1 minuto).

• Enxaguar as lâminas por 5 minutos em diH2O por 5 minutos.

Contracorante • Enxaguar as lâminas em TBST, 1 troca por 2 minutos.

• Aplicar 200 μΙ_ de hematoxilina para cobrir completamente a área de deposição das células.

• Incubar por 1 minuto (± 10 segundos).

· Enxaguar as lâminas por 3 minutos em H2O corrente.

• Azular as lâminas por aplicação de 200 μΙ_ de Agente de Azular por 1 minuto (±10 segundos).

• Repetir o enxágüe em água corrente por 1 minuto.

Montagem • Imergir as lâminas em etanol a 95%, 1 minuto, ou 25 imersões.

• Imergir as lâminas em álcool absoluto, 4 trocas, 1 minuto cada, ou 25 imersões.

• Purificar com xileno, 3 trocas, 1 minuto cada, ou 25 imersões.

• Cobrir as lâminas com meio de montagem permanente, não-aquoso, usando lamínulas de vidro.

V. Controle de Qualidade

As seguintes questões de controle de qualidade foram consideradas quando utilizando o kit de imunocitoquímica descrito neste exemplo:

A variabilidade nos resultados é freqüentemente derivada das diferenças no manuseio das amostras e das modificações nos procedimentos de teste. Consultar as orientações de controle de qualidade propostas da NCCLS Quality Assurance for Immunocytochemistry (Garantia de Qualidade de NCCLS para Imunocitoquímica) quanto a informações adicionais.

A Linhagem Celular de Controle está disponível da TriPath Imaging, Inc. Cada frasco pequeno contém uma linhagem celular de câncer cervical, que é processada em um modo similar às amostras clínicas. Duas lâminas devem ser coloridas em cada procedimento de coloração. A avaliação da linhagem celular da lâmina de controle indica a validade da corrida de coloração.

VI. Interpretação da Coloração

Lâminas de Controle:

As lâminas de controle coloridas com o kit de teste imunocitoquímico foram examinadas primeiramente para verificar que todos os reagentes funcionavam adequadamente. A presença de um produto de reação (tetracloridrato de 3,3'-diaminobenzidina, DAB) marrom nos núcleos das células era indicativa da reatividade positiva.

Amostras das Pacientes:

A avaliação das amostras foi efetuada por um citotecnologista ou patologista usando um microscópio de luz. As células foram analisadas armazenadas manual ou eletronicamente em uma galeria de imagens 5 derivada de um microscópio de luz.

Foram coletadas aproximadamente 1610 amostras cervicais representando os diversos diagnósticos. A tabela que segue indica o número de amostras analisadas usando o kit de imunocitoquímica dentro de cada grupo de diagnóstico, conforme determinado por coloração de Pap 10 convencional ou biópsia.

Tabela 41: Amostras das Pacientes dentro de Cada Grupo de Diagnóstico (Coloração de Pap)

Resultados da Citologia	Número	%
NIL	671	41,7%
LSIL	395	24,53%
ASCUS	349	21,68%
HSIL	150	9,32%
ASC-H	38	2,36%
AGUS	6	0,37%
SCC	1	0,06%
Total	1610

Tabela 42: Amostras das Pacientes dentro de Cada Grupo de Diagnóstico (Biópsia)

Resultados da Biópsia	Número	%
NIL	968	60,20%
CIN1	369	22,95%
CIN2	140	8,71%
CIN3	131	8,15%
Inexistente	2
Total	1610

Guia de Classificação das Lâminas

O seguinte procedimento foi seguido para a classificação de

todas as lâminas analisadas pelos métodos de imunocitoquímica descritos neste exemplo:

Etapa 1: Ela é uma amostra adequada?

O Bethesda System for Reporting Cervical Cytology (Sistema Bethesda para o Relatório de Citologia Cervical) (segunda edição) especifica, Uma preparação de base líquida adequada deve ter um mínimo estimado de pelo menos 5000 células escamosas visualizadas na cavidade/ conservadas na cavidade. Estes mesmos critérios foram aplicados quando avaliando todas as lâminas. Entretanto, como com uma preparação de Pap de rotina, qualquer amostra com células anormais, que estejam exibindo uma reação molecular positiva, era, por definição, satisfatória para a avaliação. Se a resposta para esta etapa fosse sim, o citotecnologista prosseguia para a etapa seguinte; se a resposta fosse não, o resultado era Insatisfatório para Avaliação.

Etapa 2: Há uma coloração nuclear marrom moderada a intensa nas células epiteliais?

As substâncias químicas de detecção usadas no kit de imunocitoquímica deste exemplo (por exemplo, o Kit de Química de Detecção SureDetect) colorem os núcleos displásicos associados com > NIC 2 com um cromógeno marrom, DAB. Para responder sim a esta etapa, as amostras foram analisadas quanto à coloração marrom que foi facilmente visualizada. Se somente fosse visto um grau fraco, ou róseo, de marrom, isto não era suficiente para garantir uma interpretação de positivo. Se não fosse vista nenhuma coloração nuclear marrom, isto era considerado um resultado de teste negativo. Se houvesse coloração marrom adequada, a análise prosseguia para a etapa seguinte.

Etapa 3: Esta é uma célula escamosa (ou glandular) com coloração nuclear marrom e a célula é >ASC (AGC)?

Usando o mesmo critério morfológico resumido no The Bethesda System for Reporting Cervical Cytology (2- Ed.) (TBS), foi determinado se a célula escamosa contendo o núcleo marrom era >ASC (células escamosas atípicas). Estas incluiríam ASC-US, ASC-H, LSIL, HSIL, e câncer. Se a célula fosse de aspecto glandular, o critério de TBS para determinar se uma célula é >AGC (células glandulares atípicas) se aplicaria. Estas incluiríam as AGC endocervicais, AGC endometriais, AIS, e adenocarcinoma. Se a célula fosse considerada ser >ASC (ou ^AGC), então isto resultaria em um resultado de teste positivo. Se as células em questão fossem consistentes com NILM (negativas para lesão ou malignidade intra-epitelial), este seria um resultado de teste negativo.

VII. Resultados casos que foram originalmente classificados como NIL pelos métodos convencionais de coloração de Pap coloriram positivos no teste de imunocitoquímica. Destes 27 casos, 7 foram classificados como HSIL, 10 como ASC-H, 3 como ASC-US, e 3 como indeterminados na análise por patologista autorizado no costado. Os 7 casos HSIL são considerados doença cervical de alto grau. Estes 27 casos foram identificados por imunocoloração positiva no ensaio de imunocitoquímica, desse modo indicando o valor dos métodos divulgados aqui para identificar as pacientes classificadas erroneamente como NIL pela coloração de Pap.

Os resultados da biópsia não foram obtidos para todas as amostras NIL. As estimativas da sensibilidade e do valor preditivo positivo (PPV) para o método de imunocitoquímica descritos neste exemplo foram calculadas com base na comparação com os resultados da biópsia de padrão ouro. A biópsia sozinha tem limitações como um padrão ouro. O PPV para o ensaio de ICC melhorará por monitoramente em série da paciente ou utilização de um ponto final cirúrgico mais agressivo, tal como o procedimento de excisão eletrocirúrgica de circuito ou a biópsia de cone. A biópsia sozinha é sabida ter um resultado falso negativo para doença de pelo menos 31%. Ver Elit e outros (2004) J. Lower Genital Tract Disease 8(3):181-187.

Tabela 43: Sensibilidade e valor preditivo positivo estimados do teste de ICC com base nos resultados da biópsia

	ASC-H	ASCUS	LSIL	HSIL	>ASCUS
Sensibilidade	76,5% (52,7%, 90,4%)*	92,6% (76,6%, 97,9%)	97,7% (92,1%, 99,4%)	98,5% (94,6%, 99,6%)	96,2% (93,1%, 97,9%)
PPV	59,1% (38,7%, 76,7%)	26,0% (18,3%, 35,6%)	31,0% (25,9%, 36,7%)	90,1% (84,1%, 94,0%)	46,9% (42,8%, 51,2%)

*(95% de intervalo de segurança).

A sensibilidade e o PPV do método de imunocitoquímica foram 5 também comparados àqueles obtidos com a coloração de Pap convencional.

Dois pontos finais clínicos para a coloração de Pap (isto é, >LSIL e >HSIL) foram usados. Novamente, o padrão para todos os cálculos foi o resultado da biópsia.

Tabela 44: Comparação do Teste de Pap e o Método de Imunocitoquímica

	>LSIL (como o teste de Pap)	>HSIL (como o teste de Pap)	>ASCUS (com a ICC)
Sensibilidade	76,5% (52,7%, 90,4%)*	92,6% (76,6%, 97,9%)	97,7% (92,1%, 99,4%)
PPV	59,1% (38,7%, 76,7%)	26,0% (18,3%, 35,6%)	31,0% (25,9%, 36,7%)

*(95% de intervalo de segurança).

Os resultados apresentados na Tabela 42 indicam que o método de imunocitoquímica detectou mais amostras de doença cervical de alto grau, ao mesmo tempo mantendo um alto PPV.

Havia 14 falsos negativos neste estudo usando o kit de imuno15 citoquímica. O teste do HPV foi conduzido sobre 13 das 14 amostras das pacientes. Nenhuma amostra restante estava disponível para uma das pacientes falsas negativas.

O DNA genômico foi isolado das amostras de citologia cervical usando o Kit de DNA de Tecido NucleoSpin® (BD Clontech, Cat. n^Q 635967).

Para propósitos de controle de qualidade, foi efetuada a análise por PCR da

beta-globina, um gene constitutivo.

A amplificação do gene de HPV L1 foi efetuada conforme descrito na técnica, tanto por PCR de L1 convencional com o grupo de iniciadores MY09/11 quanto por PCR aninhada com os grupos de iniciadores 5 MY09/11 e GP5+/6+, para aperfeiçoar a sensibilidade de detecção. O seqüenciamento de DNA do amplicon L1 foi adicionalmente efetuado para identificar o(s) tipo(s) de HPV(s) presente(s).

O DNA genômico de boa qualidade foi isolado de 10 das 13 amostras clínicas de citologia. 3 amostras tinham DNA genômico de quali10 dade insatisfatória, conforme indicado através de análise por PCR de betaglobina. O DNA do HPV não era detectável ou era negativo em 10 das 13 amostras usando tanto a PCR de L1 convencional (com os iniciadores MY09/11) quanto a PCR de L1 aninhada (com os iniciadores MY09/11 e GP5+/6+). Este dado indica que ocorreu um erro de amostragem para a 15 maior parte das amostras falsas negativas, dado que o HPV é positivo para a doença cervical de alto grau (sensibilidade de >92%).

’ Exemplo 9: Seleção do Anticorpo para MCM6 » Triagem dos Polidomas ’ * Os polidomas proporcionados nas placas de cultura de tecido de múltiplas cavidades foram examinadas, para identificar os anticorpos específicos para o biomarcador MCM 6 que possuem as características desejadas de sensibilidade e especificidade. Foi gerado um microconjunto de tecido compreendendo múltiplas amostras normais (isto é, sem NIC), com NICIII, carcinoma de célula escamosa, e adenocarcinoma sobre uma única 25 lâmina. Os sobrenadantes não-diluídos de cada cavidade, contendo um polidoma, foram testados quanto à coloração positiva do microconjunto de tecido. A ligação secundária, isto é, não-específica, foi essencialmente ignorada neste estágio. Onze dos 35 polidomas testados produziram resultados de coloração positiva e foram selecionados para análise adicional.

Para determinar a especificidade dos polidomas selecionados, os padrões de coloração obtidos com os sobrenadantes de polidomas foram comparados com aqueles obtidos com um anticorpo para MCM 6 comer

cialmente disponível (BD Transduction Laboratories). Os padrões de coloração obtidos com os sobrenadantes de polidomas pareceram ser mais específicos do que aqueles observados com o anticorpo para MCM 6 comercial (Figura 17).

Os 11 polidomas selecionados foram então submetidos a um processo de diluição limitante. Trinta diluições limitantes, resultantes dos sobrenadantes dos polidomas selecionados, foram testadas quanto à coloração positiva de um microconjunto de tecido compreendendo múltiplas amostras normais (isto é, sem NIC), com NICIII, carcinoma de célula 10 escamosa, e adenocarcinoma. Dois clones da diluição limitante, 9D4.3 e 9D4.4, foram selecionados como os melhores sobrenadantes com base na coloração positiva das amostras de tecidos cervicais anormais e cancerosas. Foram então testadas diluições variadas destes clones quanto à sua reatividade ao tecido com NIL, LSIL, HSIL e às amostras de citologia 15 baseadas em líquido reunidas. O clone 9D4.3, em uma diluição de 1:100, produziu a razão máxima de sinal para ruído e foi selecionado para caracterização adicional.

t Caracterização do clone 9D4.3 para MCM 6 * ' A fim de adicionalmente caracterizar o clone 9D4.3, o clone foi testado quanto à coloração positiva de 40 amostras de citologia baseadas em líquido, selecionadas a partir das seguintes categorias de diagnósticos: NIL (7), LSIL (10), HSIL (18), e carcinoma cervical (5). As lâminas foram preparadas usando o processador de lâminas PrepStain® (TriPath Imaging, Inc.) para cada uma das 40 amostras. Duas lâminas por amostra foram, 25 cada uma, coloridas com um anticorpo para MCM 2 (Dako) e o clone 9D4.3.

As lâminas restantes foram usadas para a coloração de PAP ou como um controle negativo.

Para preparar as lâminas, cada amostra foi centrifugada por 2 minutos, a 200xg, para formar um pélete, e o sobrenadante foi decantado. 2 30 mL de água deionizada foram adicionados a cada amostra, e as amostras foram remoinhadas e então centrifugadas por 5 minutos, a 600xg. Após decantar o sobrenadante, foram adicionados uns 700 pL adicionais da água o2S^ tamponada com tris. Finalmente, as amostras foram carregadas para o processador de lâminas PrepStain® (Tripath Imaging, Inc.), versão 1.1, e o programa Transfer Only foi executado.

Todas as lâminas foram mantidas em EtOH a 95% por pelo menos 24 horas e não mais do que 3 dias, após a preparação. A liberação do antígeno para o MCM2 foi obtida colocando as lâminas em uma Solução de Liberação de Alvo 1x, pH 6,0 (DAKO S1699)/banho de dH₂O, preaquecida para 95°C por 25 minutos em um vaporizador. Para o MCM6, a acessibilidade do antígeno foi atingida colocando as lâminas em um tampão de 1x Tris pH 9,5 (Biocare)/banho de dH2O, preaquecido para 95°C, por 25 minutos, em um vaporizador. Após vaporizar, todas as lâminas foram deixadas esfriar na temperatura ambiente, por 20 minutos.

As lâminas foram coloridas por imunocitoquímica usando o Autostainer Universal da DAKO, conforme descrito no Exemplo 1, Imunocitoquímica Automatizada. As lâminas foram examinadas e avaliadas por um citotecnologista experiente para uma determinação morfológica da categoria de diagnóstico. As amostras foram avaliadas quanto à intensidade de coloração do marcador (0-3), à porcentagem de células de coloração positiva, e à posição da coloração do marcador (nuclear, citoplásmica, membrana, ou uma combinação). A intensidade da coloração das células recebeu um escore de 0-3. As células pontuando >1,5 foram contadas. As células escamosas que pareciam normais, maduras, e as células glandulares que pareciam normais não foram contadas como positivas quando colorindo de marrom. Entretanto, as células metaplásicas escamosas foram contadas como positivas juntamente com as células anormais. As lâminas de imunocitoquímica então receberam uma designação de TN (verdadeiro negativo), FN (falso negativo), TP (verdadeiro positivo), ou FP (falso positivo).

Tabela 45: Clone 9D4.3 (MCM6)

Sensibilidade	0,9655
Especificidade	0,9091
PPP	0,9655
NPP	0,9091

Sensibilidade	0,9310
Especificidade	0,9091
PPP	0,9643
NPP	0,8333

Cálculos Usados

Sensibilidade = TP/(TP + FN)

Especificidade = TN/(FP + TN)

Capacidade Preditiva Positiva (PPP) = TP/(TP + FP)

Capacidade Preditiva Negativa (NPP) = TN/(FN + TN).

A sensibilidade e a especificidade para o clone 9D4.3 eram comparáveis com aquelas obtidas com o anticorpo para MCM2 comercialmente disponível. Um caso de NIL foi negativo para ambos os anticorpos. 9 de 10 casos de LSIL foram negativos com o clone 9D4.3 e o anticorpo para MCM2 comercial. 23 dos 24 casos de HSIL foram positivos com o clone 9D4.3 e o anticorpo para MCM2 comercial. Com as amostras de câncer cervical, 5 de 5 foram positivos com o clone 9D4.3, e 4 de 5 foram positivos com o anticorpo para MCM 2.

Purificação do clone 9D4.3 para MCM 6

Por causa de sua sensibilidade, especificidade, e da apresentação de um padrão de coloração nuclear, o clone 9D4.3 foi purificado para análise adicional. O anticorpo purificado foi obtido usando a cromatografía de adsorção por afinidade de Streamline rProteinA (Amersham Biosciences), de acordo com métodos padrões. A solução de anticorpo resultante foi então testada quanto à reatividade contra as uniões de citologia cervical à base de líquido de HSIL, em diversas diluições entre 1:500 e 1:6000. O sinal estava evidente para um título de 1:6000.

Exemplo 10: Detecção dos Biomarcadores por PCR de Tempo Real nas Amostras de Tecidos Clínicas

A PCR de tempo real TaqMan® foi efetuada com o Sistema de Detecção de Seqüência ABI Prism 7700 (Applied Biosystems). Os acionadores e as sondas foram projetados com o auxílio do programa Iniciador Express®, versão 1.5 (Applied Biosystems), para a amplificação específica dos biomarcadores cervicais alvejados (isto é, MCM7, p21^waf1, p14^ARF/p16, ciclina E1, e ciclina E2), neste estudo. A informação sobre as seqüências para os iniciadores e as sondas é mostrada abaixo:

MCM7:

Nome do Iniciador: MCM7_T¹T3-F Seqüência: CTCTGAGCCCGCCAAGC (SEQ ID NO:25)

Nome do Iniciador: MCM7_T1T3-R Seqüência: TGTAAGAACTTCTTAACCTTTTCCTTCTCTA (SEQ ID NO:26) Nome da Sonda: MCM7_T1T3-Probe

Seqüência: CCCTCGGCAGCGATGGCACT (SEQ ID NO:27)

Nome do Iniciador: MCM7_T2T4-F

Seqüência: GAGGAATCCCGAGCTGTGAA (SEQ ID NO:28)

Nome do Iniciador: MCM7_T2T4-R

Seqüência: CCCGCTCCCGCCAT (SEQ ID NO:29)

Nome da Sonda: MCM7_T2T4-Probe Seqüência: CCCATGTGCTTCTTTGTTTACTAAGAGCGGAA (SEQ ID NO:30)

Nome do Iniciador: MCM7_T2-F

Seqüência: GTCCGAAGCCCCCAGAA (SEQ ID NO:31)

Nome do Iniciador: MCM7_T2-R Seqüência: CCCGACAGAGACCACTCACA (SEQ ID NO:32) Nome da Sonda: MCM7_T2-Probe

Seqüência: CAGTACCCTGCTGAACTCATGCGCA (SEQ ID NO:33)

Nome do Iniciador: MCM7_T3T4-F

Seqüência: CGCTACGCGAAGCTCTTTG (SEQ ID NO:34)

Nome do Iniciador: MCM7_T3T4-R

Seqüência: CCTTTGTTTGCCATTGTTCTCTAA (SEQ ID NO:35)

Nome da Sonda: MCM7_T3T4-Probe

Seqüência: TGCCGTACAAGAGCTGCTGCCTCA (SEQ ID NO:36) p21^waf1:

Nome do Iniciador: p21T1T2-F

Seqüência: CAAACGCCGGCTGATCTT (SEQ ID NO:37)

Nome do Iniciador: p21T1T2-R

Seqüência: CCAGGACTGCAGGCTTCCT (SEQ ID NO:38)

Nome da Sonda: p21T1T2-Probe

Seqüência: CAAGAGGAAGCCCTAATCCGCCCA (SEQ ID NO:39)

Nome do Iniciador: p21T2-F

Seqüência: GAGCGGCGGCAGACAA (SEQ ID NO:40)

Nome do Iniciador: p21T2-R

Seqüência: CCGCGAACACGCATCCT (SEQ ID NO:41)

Nome da Sonda: p21T2-Probe

Seqüência: CCCAGAGCCGAGCCAAGCGTG (SEQ ID NO:42)

Nome do Iniciador: p21T3-F

Seqüência: TGGAGACTCTCAGGGTCGAAA (SEQ ID NO:43)

Nome do Iniciador: p21T3-R

Seqüência: TCCAGTCTGGCCAACAGAGTT (SEQ ID NO:44)

Nome da Sonda: p21T3-Probe

Seqüência: CGGCGGCAGACCAGCATGAC (SEQ ID NO:45) p14^ARf7p16:

Nome do Iniciador: p16T4-F

Seqüência: GCC CTC GTG CTG ATG CTA CT (SEQ ID NO:46)

Nome do Iniciador: p16T4-R

Seqüência: TCA TCA TGA CCT GGT CTT CTA GGA (SEQ ID NO:47)

Nome da Sonda: p16T4-Probe

Seqüência: AGC GTC TAG GGC AGC AGC CGC (SEQ ID NO:48)

Nome do Iniciador: p16T1-F

Seqüência: TGCCCAACGCACCGA (SEQ ID NO:49)

Nome do Iniciador: p16T1-R

Seqüência: GGGCGCTGCCCATCA (SEQ ID NO:50)

Nome da Sonda: p16T1-Probe

Seqüência: TCGGAGGCCGATCCAGGTCATG (SEQ ID NO:51)

Nome do Iniciador: p16T2-F

Seqüência: AAGCTTCCTTTCCGTCATGC (SEQ ID NO:52)

Nome do Iniciador: p16T2-R

Seqüência: CATGACCTGCCAGAGAGAACAG (SEQ ID NO:53)

Nome da Sonda: p16T2-Probe

Seqüência: CCCCCACCCTGGCTCTGACCA (SEQ ID NO:54)

Nome do Iniciador: p16T3-F

Seqüência: GGAAACCAAGGAAGAGGAATGAG (SEQ ID NO:55)

Nome do Iniciador: p16T3 -R

Seqüência: TGTTCCCCCCTTCAGATCTTCT (SEQ ID NO.56)

Nome da Sonda: p16T3-Probe

Seqüência: ACGCGCGTACAGATCTCTCGAATGCT (SEQ ID NO:57)

Nome do Iniciador: p16Universal-F

Seqüência: CACGCCCTAAGCGCACAT (SEQ ID NO:58)

Nome do Iniciador: p16 Universal-R

Seqüência: CCTAGTTCACAAAATGCTTGTCATG (SEQ ID NO:59)

Nome da Sonda: p16 Universal-Probe

Seqüência: TTTCTTGCGAGCCTCGCAGCCTC (SEQ ID NO:60)

Ciclina E1:

Nome do Iniciador: CCNE1T1T2-F

Seqüência: AAAGAAGATGATGACCGGGTTTAC (SEQ ID NO:61)

Nome do Iniciador: CCNE1T1T2-R

Seqüência: GAGCCTCTGGATGGTGCAA (SEQ ID NO:62)

Nome da Sonda: CCNE1T1T2-P

Seqüência: CAAACTCAACGTGCAAGCCTCGGA (SEQ ID NO:63)

Nome do Iniciador: CCNE1T1-F

Seqüência: TCCGCCGCGGACAA (SEQ ID NO:64)

Nome do Iniciador: CCNE1T1-R

Seqüência: CATGGTGTCCCGCTCCTT (SEQ ID NO:65)

Nome da Sonda: CCNE1T1-Probe

Seqüência: ACCCTGGCCTCAGGCCGGAG (SEQ ID NO:66)

Ciclina E2

Nome do Iniciador: CCNE2T1T2-F

Seqüência: GGAATTGTTGGCCACCTGTATT (SEQ ID NO:67)

Nome do Iniciador: CCNE2T1T2-R

Seqüência: CTGGAGAAATCACTTGTTCCTATTTCT (SEQ ID NO:68)

Nome da Sonda por TaqMan: CCNE2T1T2-P

Seqüência: CAGTCCTTGCATTATCATTGAAACACCTCACA (SEQ ID NO:69)

Nome do Iniciador: CCNE2T1T3-F

Seqüência: TCAACTCATTGGAATTACCTCATTATTC (SEQ ID NO:70)

Nome do Iniciador: CCNE2T1T3-R

Seqüência: ACCATCAGTGACGTAAGCAAACTC (SEQ ID NO:71)

Nome da Sonda por TaqMan: CCNE2T1T3-P

Seqüência: CCAAACTTGAGGAAATCTATGCTCCTAAACTCCA (SEQ ID NO:72)

Nome do Iniciador: CCNE2T2-F

Seqüência: TTTTGAAGTTCTGCATTCTGACTTG (SEQ ID NO:73)

Nome do Iniciador: CCNE2T2-R

Seqüência: ACCATCAGTGACGTAAGCAAGATAA (SEQ ID NO:74)

Nome da Sonda por TaqMan: CCNE2T2-P

Seqüência: AACCACAGATGAGGTCCATACTTCTAGACTGGCT (SEQ ID NO:75)

As sondas foram marcadas com um corante fluorescente FAM (6-carboxifluoresceína) sobre a base em 5', e um corante de extinção TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina) sobre a base em 3'. Os tamanhos dos amplicons eram aproximadamente 100 bp. O RNA Ribossômico de 18S foi

utilizado como um controle endógeno. Uma sonda de rRNA de 18S foi marcada com um corante fluorescente VIC®. A mistura de iniciador/sonda de rRNA de 18S pré-revelada foi adquirida da Applied Biosystems. 5 pg de RNA total extraído do tecido cervical normal (N) ou canceroso (T) foram quantitativamente convertidos na forma de cDNA de fita simples com hexâmeros aleatórios, por utilização do Kit de Arquivo de cDNA de Alta Capacidade (Applied Biosystems). Foram preparados os seguintes reagentes de reação:

Mistura Principal de Iniciadores/Sonda 20X (em 200 ul)

Iniciador Avançado a 180 pM 20pl

Iniciador Reverso a 180 pM 20pl

Sonda porTaqMan a 100 pM 10pl

H₂O 150pl

Mistura de Reação Final (25 ul/cavidade)

Mistura Principal de iniciadores/sonda 20X 1,25pl

Mistura Principal de PCR Universal porTaqMan 2X (P/N: 4304437) 12,5pl

Molde de cDNA 5,0pl

H₂O 6,25pl

A Mistura Principal de PCR Universal por TaqMan 20X foi adquirida da Applied Biosystems. As concentrações finais de iniciador e sonda, em um volume total de 25 pl, foram 0,9 pM e 0,25 pM, respectivamente. 10 ng do RNA total foram aplicados a cada cavidade. As condições de amplificação foram 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 95°C, e um ciclo de duas etapas de 95°C por 15 segundos e 60°C por 60 segundos, por um total de 40 ciclos. Pelo menos três misturas de reação de controle sem molde foram incluídas em cada corrida. Todos os experimentos foram efetuados em triplicata.

No final de cada reação, a intensidade da fluorescência registrada é usada para os seguintes cálculos: Rn⁺ é o valor de Rn de uma reação contendo todos os componentes. Rn’ é o valor de Rn de uma amostra não reagida (o valor de linha de base ou o valor detectado em NTC). A ARn é a diferença entre Rn* e Rn‘ e é um indicador da magnitude do sinal gerado pela PCR. O método Ct comparativo, que não utiliza nenhuma quantidade conhecida de padrão, porém compara a quantidade relativa da seqüênciaalvo com qualquer valor de referência escolhido (por exemplo, o rRNA de 18S), foi usado neste estudo. O protocolo de Placa de Controle Endógeno Humano TaqMan® foi usado para converter os dados brutos para a análise 5 de dados da PCR de tempo real.

Resultados

Os resultados obtidos com cada biomarcador e com os iniciadores específicos são listados abaixo, na forma de tabelas. Os resultados obtidos com as amostras de tecidos cervicais normais (isto é, NIL) são 10 designados N; aqueles obtidos com os tecidos de cânceres cervicais são qualificados T.

Tabela 47: Resultados de MCM7 por TaqMan®

Amostra	T2	T5	T1T3	T2T4	T3T4
CV01-T	4	0,04	29,9	4,5	1.4
CV03-T	5,7	0,02	36,8	6,1	2,6
CV05-T	4,13	0,08	17,3	1,35	3,68
CV07-T	2,6	0,06	18,77	0,88	3,27
CV09-T	4,96	0,08	15,01	3,69	3,22
CV11-T	5,9	0,01	7,37	3,08	1,75
CV13-T	6,74	0,04	19,74	4,55	4,11
CV15-T	3,04	0,05	3,65	3,43	1,25
CV17-T	5,21	0,02	20,07	2,74	1,56
CV19-T	3,34	0,09	21,17	2,88	6
CV21-T	6,7	0,08	10,64	4,75	4,59
CV23-T	7,08	0,33	32,17	5,6	4,25
CV25-T	4,87	0,03	18,11	4,58	4,51
CV27-T	4,24	0,03	36,25	4,6	2,82
MÉDIA	4,89	0,07	20,50	3,77	3,22
N^Q MÉDIO	4,89	0,05	19,74	3,77	3,22
PAD.	1,32	0,07	9,46	1,39	1,32

CV02-N	2,5	0,02	10,6	2,6	1.1
CV04-N	4,6	0,02	7,1	4,8	2,4

Amostra	T2	T5	T1T3	T2T4	T3T4
CV06-N	1,75	0,01	2,14	1,36	2,63
CV08-N	1,35	0,01	4,8	1,71	1,54
CV10-N	5,6	0,03	5,07	5,12	1,85
CV12-N	5,68	0,02	7,34	3,19	2,29
CV16-N	4,35	0,08	3,72	2,75	1,78
CV18-N	3,98	0,01	4,74	3,63	1,7
CV20-N	2,03	0,03	5,42	1,4	2,78
CV22-N	2,66	0,02	4,33	2,26	2,42
CV24-N	4,88	0,09	9,03	1,53	2,77
CV28-N	2,71	0,01	10,38	1,36	1,7
MÉDIA	3,51	0,03	6,22	2,64	2,08
N° MÉDIO	3,51	0,02	5,42	2,60	2,08
PAD.	1,40	0,03	2,48	1,21	0,50

Tabela 48: Resultados de p21^waf1 por TaqMan®

Pacientes	T1T2	T2	T3
Pt01-T	23,33	0,06	0,00
Pt02-T	14,66	0,01	0,00
Pt03-T	11,86	0,00	0,00
Pt04-T	27,04	0,01	0,00
Pt05-T	14,72	0,00	0,00
Pt06-T	22,84	0,01	0,00
Pt07-T	14,04	0,00	0,00
Pt08-T	31,93	0,01	0,01
Pt09-T	35,02	0,00	0,00
Pt10-T	13,2	0,00	0,00
Pt11-T	24,87	0,01	0,00
Pt12-T	10,85	0,00	0,00
Pt13-T	36,51	0,02	0,01
Pt14-T	12,72	0,00	0,00
Pt15-T	10,64	0,00	0,00
Pt16-T	22,58	0,04	0,00
Pt17-T	39,64	0,14	0,04
PtO1-N	4,57	0,03	0,00

Pacientes	T1T2	T2	T3
Pt02-N	5,57	0,00	0,00
Pt03-N	3,54	0,00	0,00
Pt04-N	8,18	0,00	0,00
Pt05-N	5,4	0,10	0,00
Pt06-N	11,01	0,00	0,00
Pt08-N	10,39	0,00	0,00
Pt09-N	9,11	0,00	0,00
Pt10-N	4,41	0,00	0,00
Pt11-N	8,64	0,00	0,00
Pt12-N	3,03	0,00	0,00
Pt14-N	3,55	0,00	0,00
Pt15-N	2,42	0,01	0,00
Pt17-N	11,46	0,05	0,01

T-médio	21,5559
N-médio	6,52
Teste T de St.	7.3E-06

Tabela 49: Resultados de pi4^ARF/p16 por TaqMan®

Pacientes	T1	T2	T3	T4	UNIVERSAL
PtO1-T	0,2	0,1	0,2	0,2	0,2
Pt02-T	16,3	11,2	5,1	21,7	36,5
Pt03-T	16,5	6,2	3,1	15,1	29,6
Pt04-T	10,1	2,8	2,6	13,2	27,7
Pt05-T	12,7	3,6	2,1	11,3	23,1

PtO1-N	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Pt02-N	2,5	2,6	1,6	2,7	6,8
Pt04-N	2,6	0,6	0,8	2,4	5,8
Pt05-N	2,1	0,8	0,7	4,1	4,6

T-médio	11,2	4,8	2,6	12,3	23,4
N-médio	1,8	1.0	0,8	2,3	4,3

Tabela 50: Resultados de Ciclina E1 por TaqMan®

	T ΟΛΓ
“ OO teste t =	f ,out· Ttf2	Câncer	T1T2	Normal	T1	Câncer	T1 Nor-	Normal
PdCÍellle	-Câncei— M,	DP	Normal M,	DP	Câncei— M,	DP	mal M,	DP
Pt 01	12,19	0,12	4,11	0,13	1.34	0,04	0,5	0,03
Pt 02	16,72	0,21	4,44	0,34	1,35	0,02	0,47	0,05
Pt 03	11,45	0,41	2,81	0,13	1,17	0,01	0,06	0,02
Pt 04	21,33	0,45	5,33	0,09	0,76	0,1	0,23	0,01
Pt 05	11,17	0,25	3,68	0,15	0,95	0,05	0,15	0,03
Pt 06	21,65	0,24	3,11	0,22	0,89	0,03	0,13	0,02
Pt 07	23,26	0,54	0	0	0,75	0,06	0	0,01
Pt 08	8,37	0,24	3,1	0,01	0,12	0,01	0,13	0,02
Pt 09	17,74	0,43	2.17	0,08	0,73	0,02	0,09	0,01
Pt10	18,51	0,29	4,56	0.17	1,37	0,03	0,41	0,04
Pt 11	10,58	0,52	3,92	0,12	0,57	0,01	0,23	0,03
Pt12	33,67	0,58	7,87	0,1	0,78	0,01	0,28	0,05
Pt13	36,9	0,41	0	0	1,05	0,04	0	0
Pt 14	31,01	0,29	6,01	0,26	1,68	0,05	0,24	0,03
Pt15	7,35	0,23	1.24	0,09	0,34	0,08	0,08	0,02
Pt16	12,71	0,61	3,72	0	1.1	0,06	0,07	0,01
Pt17	12,13	0,21	11,46	0,15	0,34	0,07	0,05	0,01
Pt18	14,22	0,14	5,94	0,06	0,73	0,08	0,26	0,04
Pt19	12,69	0,81	3,52	0,02	0,41	0,04	0,24	0,02
Pt 20	16,56	0,16	6.1	0,12	0,17	0,02	0,06	0
Pt 21	11,63	0,23	3,01	0,06	0,54	0,04	0,23	0,01
Pt 22	17,39	0,34	2,36	0,02	0,47	0,02	0,24	0,05
Pt 23	16,56	0,16	2.1	0,02	0,18	0,03	0,09	0,01
Pt 24	22,23	0,33	4,06	0,28	1.9	0,17	0,52	0,01
Pt 25	13,98	0,48	3,72	0,05	0,54	0,04	0,23	0,01
Pt 26	22,71	0,76	4,48	0,07	0,47	0,02	0,24	0,05
Pt 27	16,17	0,4	5,64	0,3	0,18	0	0,12	0,01
Pt 28	12,6	0,56	3,8	0,06	0,29	0,03	0,05	0
Pt 29	13,69	0,34	3.1	0,18	0,29	0,03	0,11	0
Pt 30	17,69	0,61	4,3	0,11	0,36	0,01	0,03	0
Pt 31	20,46	0,3	3,91	0,21	0,47	0,03	0,08	0
Pt 32	18,38	0,18	3,16	0,06	0,42	0,02	0.17	0,01
Pt 33	21,1	0,62	4,52	0,33	1,07	0,05	0,24	0,01
Pt 34	21,5	1,37	4,56	0,13	0,24	0,01	0,11	0,01
Média	17,54		4,26		0,68		0,20
T/N	4,1

Tabela 51: Resultados de Ciclina E2 por TaqMan®

Pacientes	T1T2	T1T2 Desv. Pad.	T1T3	T1T3 Desv. Pad.	T2	T2 Desv. Pad.
Pt01-T	13,17	1,02	16,11	0,39	0,01	0,00
Pt02-T	13,42	0,3	18,12	2,21	0,15	0,02
Pt03-T	13,64	0,50	17,40	2,16	0,05	0,01
Pt04-T	19,37	1,41	24,26	1,01	0,01	0,00
Pt05-T	10,59	1.1	14,71	1,58	0,17	0,02
Pt06-T	7,96	0,91	9,32	0,51	0,06	0,01
Pt07-T	14,1	1,73	16,92	0,84	0,54	0,06
Pt08-T	8,11	0,67	9,50	0,66	0,34	0,07
Pt09-T	13,04	0,72	18,27	0,99	0,02	0,00
PÍ10-T	19,56	2,29	23,42	0,00	0,02	0,01
Pt11-T	16,8	1,57	18,71	2,15	0,08	0,01
Pt12-T	16,05	0,85	18,81	0,74	0,91	0,01
Pt13-T	14,91	0,87	18,51	1,59	0,61	0,16
Pt14-T	14,89	0,32	20,49	0,86	0,42	0,03
Pt15-T	12,44	0,47	15,26	1,00	0,68	0,18
Pt16-T	11,54	1,58	13,13	0,75	1,02	0,14
Pt17-T	6,78	0,47	7,91	0,45	0,85	0,10
Pt01-N	4,89	0,21	5,94	0,53	0,00	0,00
Pt02-N	6,32	0,47	8,91	0,61	0,13	0,00
Pt03-N	4,8	0,31	5,89	0,30	0,04	0,00
Pt04-N	13,28	0,74	15,28	1.37	0,01	0,00
Pt05-N	6,51	1.2	9,04	0,82	0,16	0,02
Pt06-N	4,96	0,83	6,41	0,84	0,05	0,01
Pt08-N	6,48	0,73	6,82	0,60	0,07	0,02
Pt09-N	3,74	0,48	4,63	0,66	0,03	0,01
Pt10-N	10,32	0,93	11,31	0,89	0,02	0,00
Pt11-N	10,34	0,26	13,90	0,53	0,04	0,04
Pt12-N	13,81	1,69	16,60	1,45	0,24	0,07
Pt14-N	6,92	0,63	9,07	0,95	0,14	0,03
Pt15-N	4,8	0,73	8,55	1,40	0,10	0,03
Pt17-N	5,33	0,2	5,78	0,27	0,23	0,07
T-médio	13,32		16,52		0,35
N-médio	7,32		9,15		0,09
Teste T de St.	4.16E-05		3.31742E05		0,008813

Exemplo 11: Detecção dos Biomarcadores por PCR de Tempo Real nas Amostras de Tecidos Clínicas

A PCR de tempo real TaqMan® foi efetuada conforme descrito no Exemplo 9, usando amostras de tecidos de cânceres cervicais (por 5 exemplo, adenocarcinoma, carcinoma de célula escamosa) e amostras de tecidos cervicais normais. Os iniciadores e as sondas foram projetados com o auxilio do programa Iniciador Express®, versão 1.5 (Applied Biosystems), para a amplificação específica dos biomarcadores cervicais alvejados (isto é, MCM2, MCM6, MCM7, e Topo2A), neste estudo. A informação sobre as 10 seqüências para os iniciadores e as sondas é mostrada abaixo:

Iniciadores por TaqMan

MCM2:

Nome do Iniciador: MCM2-F

Seqüência: 5-GGAGGTGGTACTGGCCATGTA-3' (SEQ ID NO:80)

Nome do Iniciador: MCM2-R

Seqüência: 5-GGGAGATGCGGACATGGAT-3’ (SEQ ID NO:81)

Nome da Sonda por TaqMan: MCM2-P

Seqüência: 5’-00ΑΑ0ΤΑ06Α0060ΑΤ0Α00ΑΑ00Α-3' (SEQ ID NO:82) MCM6:

Nome do Iniciador: MCM6-F

Seqüência: 5'-CATTCCAAGACCTGCCTACCA-3' (SEQ ID NO:83)

Nome do Iniciador: MCM6-R

Seqüência: õ^ATGCGAGTGAGCAAACCAATT-S' (SEQ ID NO:84) Nome da Sonda por TaqMan: MCM6-P

Seqüência: 5'-ACACAAGATTCGAGAGCTCACCTCATCCA-3' (SEQ ID NO:85)

MCM7:

Nome do Iniciador: MCM7_T1T3-F

Seqüência: CTCTGAGCCCGCCAAGC (SEQ ID NO:25)

Nome do Iniciador: MCM7_T1T3-R

Seqüência: TGTAAGAACTTCTTAACCTTTTCCTTCTCTA (SEQ ID NO:26) Nome da Sonda: MCM7_T1T3-Probe

100

Seqüência: CCCTCGGCAGCGATGGCACT (SEQ ID NO:27)

Nome do Iniciador: MCM7_T2T4-F

Seqüência: GAGGAATCCCGAGCTGTGAA (SEQ ID NO:28)

Nome do Iniciador: MCM7_T2T4-R

Seqüência: CCCGCTCCCGCCAT (SEQ ID NO:29)

Nome da Sonda: MCM7_T2T4-Probe

Seqüência: CCCATGTGCTTCTTTGTTTACTAAGAGCGGAA (SEQ ID

NO:30)

Nome do Iniciador: MCM7_T2-F

Seqüência: GTCCGAAGCCCCCAGAA (SEQ ID NO:31)

Nome do Iniciador: MCM7_T2-R

Seqüência: CCCGACAGAGACCACTCACA (SEQ ID NO:32)

Nome da Sonda: MCM7_T2-Probe

Seqüência: CAGTACCCTGCTGAACTCATGCGCA (SEQ ID NO:33)

Nome do Iniciador: MCM7_T3T4-F

Seqüência: CGCTACGCGAAGCTCTTTG (SEQ ID NO:34)

Nome do Iniciador: MCM7_T3T4-R

Seqüência: CCTTTGTTTGCCATTGTTCTCTAA (SEQ ID NO:35)

Nome da Sonda: MCM7_T3T4-Probe

Seqüência: TGCCGTACAAGAGCTGCTGCCTCA (SEQ ID NO:36)

TOPO2A:

Nome do Iniciador: TOP2A_F

Seqüência: 5 - GGCTACATGGTGGCAAGGA -3' (SEQ ID NO:86)

Nome do Iniciador: TOP2A_R

Seqüência: 5 - TGGAAATAACAATCGAGCCAAAG -3’ (SEQ ID NO:87) Nome da Sonda por TaqMan: TOP2A_P

Seqüência: 5'- TGCTAGTCCACGATACATCTTTACAATGCTCAGC -3' (SEQ ID NO: 88)

Resultados

Os resultados obtidos para cada biomarcador são listados abaixo, na forma de tabelas. O dado é também resumido abaixo.

101

Tabela 52: Amostras de Tecidos de Cânceres Cervicais Congeladas

Rapidamente

Paciente	IDTPO	Diag. da Patente	Tipo de HPV	MCM2 TaqM	MCM6 TaqMan	MCM7 TaqM	TOP2A TaqM
Pt 01	CV-001	CA de Célula Esc.	HPV16	8,93	11,31	29,9	23,76
Pt 02	CV-003	Adeno CA	HPV18	10,94	14,29	36,8	25,28
Pt 03	CV-005	Adeno CA	HPV18	17,67	13,84	17,3	23,18
Pt 04	CV-007	CA de Célula Esc.	HPV16	23,61	13,3	18,77	23,26
Pt 05	CV-009	CA de Célula Esc.	HPV16	9,3	11,26	15,01	20,33
Pt 06	CV-011	CA de Célula Esc.	HPV16	13,86	11,58	7,37	8,37
Pt 07	CV-013	Adeno CA	HPV18	27,03	16,32	19,74	34,29
Pt 08	CV-015	Sq.Cell CA	HPV16, HPV18, +	8,28	8,16	3,65	8,57
Pt 09	CV-017	CA de Célula Esc.	HPV18	12,61	13,56	20,07	11,31
Pt 10	CV-019	Sq Cell CA	HPV18	31,88	23,38	21,17	27,48
Pt 11	CV-021	CA de Célula Esc.	HPV16	11,27	14,76	10,64	12,73
Pt 12	CV-023	CA de Célula Esc.	HPV16	11,39	11,29	32,17	21,11
Pt 13	CV-025	CA de Célula Esc.	HPV16	23,88	18,98	18,11	27,96
Pt 14	CV-027	CA de Célula Esc.	HPV18, HPV16, +	12,26	15,53	36,25	26,63
Pt 15	CV-029	Sq Cell Carcinoma	HPV16	6,56	7,92	9,64	7,81
Pt 16	CV-031	Sq Cell Carcinoma	HPV73	28,12	12,21	27,3	21,4
Pt 17	CV-033	Sq Cell Carcinoma	HPV16	8,76	7,59	14,37	12,42
Pt 18	CV-035	Sq Cell Carcinoma	HPV16	21,4	12,65	23,63	27,57

102

Paciente	IDTPO	Diag. da Patente	Tipo de HPV	MCM2 TaqM	MCM6 TaqMan	MCM7 TaqM	TOP2A TaqM
Pt 19	CV-037	Sq Cell Carcinoma	HPV18	12,59	13,06	14,37	9,24
Pt 20	CV-039	Adeno de Célula Esc. CA	HPV16, HPV18, +	7,24	8,17	16,97	15,13
Pt 21	CV-041	CA de Célula Esc.	HPV16	9,61	11,84	13,88	11,92
Pt 22	CV-043	CA de Célula Esc.	HPV16	21,57	13,21	18,31	24,19
Pt 23	CV-045	CA de Célula Esc.	HPV16	21,19	13,18	18,76	19,97
Pt 24	CV-047	CA de Célula Esc.	HPV18	24,61	19,09	20,19	28,14
Pt 25	CV-049	CA de Célula Esc.	HPV18	11,43	10,2	13,70	10,55
Pt 26	CV-051	CA de Célula Esc.	HPV16	24,25	20,54	23,26	33,26
Pt 27	CV-053	CA de Célula Esc.	HPV45	26,74	21,34	20,96	20,34
Pt 28	CV-055	CA de Célula Esc.	HPV16, HPV18, +	12,65	12	14,42	12,17
Pt 29	CV-057	CA de Célula Esc.	HPV16	16	14,72	25,46	22,16
Pt 30	CV-059	CA de Célula Esc.	HPV16, HPV18, +	22,55	17,87	15,30	25,54
Pt 31	CV-061	CA de Célula Esc.	HPV16	24,08	21,88	23,11	25,28
Pt 32	CV-063	CA de Célula Esc.	HPV18, HPV16, +	24,16	12,55	21,63	22,39
Pt 33	CV-065	CA de Célula Esc.	HPV16	26,63	16,05	27,56	28,84
Pt 34	CV-067	CA de Célula Esc.	HPV16	19,61	23,28	19,03	25,57

103

Tabela 53: Amostras de Tecidos Normais Adjacentes

Paciente	IDTPO	Tipo de HPV	MCM2 TaqM	MCM6 TaqMan	MCM7 TaqM	TOP2A TaqM
Pt 01	CV-002	Negativo	3,04	4,4	10,6	10,52
Pt 02	CV-004	Negativo	6,26	6,28	7,1	9,06
Pt 03	CV-006	HPV18	2,06	2,53	2,14	3,86
Pt 04	CV-008	Negativo	3,14	4,15	4,8	8,03
Pt 05	CV-010	Negativo	2,2	3,45	5,07	6,91
Pt 06	CV-012	Negativo	2,06	2,29	7,34	6,82
Pt 07	CV-014	Negativo	N/A	N/A	N/A	N/A
Pt 08	CV-016	Negativo	2,55	3,13	3,72	2,02
Pt 09	CV-018	Negativo	2,09	3,09	4,74	1,24
Pt 10	CV-020	Negativo	8,15	6,76	5,42	10,41
Pt 11	CV-022	Negativo	4,53	5,34	4,33	6,64
Pt 12	CV-024	Negativo	1,94	2,45	9,03	6,13
Pt 13	CV-026	Negativo	N/A	N/A	N/A	N/A
Pt 14	CV-028	Negativo	2,62	2,95	10,38	5,3
Pt 15	CV-030	Negativo	1,14	1,28	2,06	1,54
Pt 16	CV-032	Negativo	N/A	N/A	N/A	N/A
Pt 17	CV-034	Negativo	1,24	1,91	1,32	0,42
Pt 18	CV-036	Negativo	3,4	1,89	4,01	4,32
Pt 19	CV-038	Negativo	3,48	4,98	5,60	7,92
Pt 20	CV-040	Negativo	1,84	3,28	3,73	1,38
Pt 21	CV-042	Negativo	1,53	3,3	4,77	1,01
Pt 22	CV-044	Negativo	2,65	4,03	2,74	2,59
Pt 23	CV-046	Negativo	3,09	3,53	5,90	3,42
Pt 24	CV-048	HPV18	2,57	5,19	3,82	5,32
Pt 25	CV-050	Negativo	5,84	4,64	7,78	9,14
Pt 26	CV-052	Negativo	5,11	5,22	5,37	5,13
Pt 27	CV-054	Negativo	2,91	3,29	5,10	0,76
Pt 28	CV-056	Negativo	4,14	3,74	5,54	4,15
Pt 29	CV-058	HPV16	2,83	4,98	10,13	7,57
Pt 30	CV-060	Negativo	6,41	5	5,39	10,05
Pt 31	CV-062	Negativo	5,72	4,93	9,29	9,95
Pt 32	CV-064	Negativo	8,06	5,41	7,64	9
Pt 33	CV-066	Negativo	9,93	7,94	10,78	9,95
Pt 34	CV-068	Negativo	2,36	6,39	5,73	1,81

104

Resumo dos Resultados

Tabela 54: Tumor vs. normal adjacente

Marcador	Tumor (M ± DP)	Normal (M ± DP)	R	P
MCM2	17,43 ±7,34	3,71 ±2,21	4,70	<0,0001
MCM6	14,32 ±4,32	4,12 ±1,56	3,48	<0,0001
MCM7	19,38 ±6,94	5,85 ±2,59	3,31	<0,0001
TOP2A	20,53 ±7,54	5,56 ±3,33	3,69	<0,0001
M: Média;	DP: Desvio Padrão;	R: Razão das médias de tumor versus nor-

mal; P: valor P do teste t.

Tabela 55: HPV-16 vs. HPV-18

Marcador	Tipo de HPV de tumor	Casos	Tumor (M + SD)	Normal (M ± DP)
MCM2	16	18	16,77 ±6,78	3,29 ±2,13
	18	8	17,23 ±8,16	3,99 ± 2,40
	16+18	6	14,52 ±7,18	4,27 ± 2,47
MCM6	16	18	14,19 ±4,44	3,97 ± 1,75
	18	8	14,24 ±4,10	4,35 ± 1,54
	16+18	6	12,38 ±3,89	3,92 ± 1,04
MCM7	16	18	19,39 ±6,94	6,07 ± 2,98
	18	8	17,23 ±4,16	5,07 ± 1,91
	16+18	6	18,04 ±7,71	6,07 ± 2,56
TOP2A	16	18	20,92 ± 7,38	5,46 ± 3,26
	18	8	19,78 ±9,52	6,19 ±3,33
	16+18	6	18,41 ±7,49	5,32 ± 3,57

105

Tabela 56: Carcinoma de Célula Escamosa vs. Adenocarcinoma

Marcador	Histopatologia	Casos	Tumor (M ± DP)	Normal (M ± DP)
MCM2	SCC	30	17,66 ±7,28	3,74 ± 2,23
	AC	4	15,72 ±8,69	3,39 ±2,49
MCM6	SCC	30	14,48 ±4,44	4,13 ±1,55
	AC	4	13,16 ±3,49	4,03 ±1,98
MCM7	SCC	30	19,27 ±7,25	6,01 ±2,58
	AC	4	20,20 ± 4,57	4,32 ± 2,53
TOP2ASCC	30	20,01 ± 7,47	5,65 ± 3,34
	AC	4	21,47 ±7,87	4,77 ± 3,92

SCC: Carcinoma de Célula Escamosa; AC: Adenocarcinoma.

Exemplo 12: Detecção dos Biomarcadores por PCR de Tempo Real nas Linhagens Celulares de Cânceres Cervicais e de Mama

A PCR de tempo real TaqMan® foi efetuada para detectar os níveis de expressão de MCM2, MCM6 e MCM7 nas linhagens celulares de cânceres cervicais e de mama.

Projeto e Protocolos Experimentais

Três linhagens celulares de cânceres cervicais humanas de SiHa, Caski e HeLa e três linhagens celulares de cânceres de mama humanas de MCF-7, SK-BR3 e CAMA foram adquiridas da ATCC e usadas neste experimento. O RNA celular total foi extraído de células recentemente cultivadas pelo Minikit de Proteção RNeasy® (Qiagen, Valencia, CA) e convertido na forma de cDNA de fita simples com hexâmeros aleatórios usando o Kit de Arquivo de cDNA de Alta Capacidade (Applied Biosystems, P/N: 4322171). A PCR de tempo real foi efetuada no Sistema de Detecção de Seqüência ABI Prism® 7700 usando a Mistura Principal de PCR Universal por TaqMan® (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA).

Os iniciadores e as sondas para a amplificação específica de MCM2 MCM6 e MCM7 foram projetados com o programa ABI Iniciador Express®, v1.5. O MCM7 contém quatro variantes transcricionais: a variante de transcrito 1 (T1, refseq NM_005916) e a variante de transcrito 2 (T2, refseq

106

ΝΜ_182776) foram identificadas no banco de dados de nucleotídeos NCBI Entrez. As variantes T3 e T4 têm éxons alternados próximos à extremidade de 5’, como analisado por agrupamento de EST através do Marcador de Modelo da NCBI. Os iniciadores e as sondas foram projetados como T1T3, T2T4, T2 e T3T4 especificamente para detectar as variantes T1 e T3, T2 e T4, T2, e T3 e T4, respectiva mente. As seqüências dos iniciadores e das sondas são mostradas acima, nos Exemplos 10 e 11.

As sondas foram marcadas com um corante fluorescente FAM (6-carboxifluoresceína) sobre a base em 5', e um corante de finalização TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina) sobre a base em 3'. O RNA ribossômico de 18S foi utilizado como um controle endógeno. A sonda de rRNA de 18S foi marcada com um corante fluorescente VIC®. A mistura de iniciador/sonda de rRNA de 18S pré-revelada foi adquirida da Applied Biosystems. 10 ng de cDNA foram aplicados à mistura de reação contendo 0,9 μΜ e 0,25 μΜ dos iniciadores e sondas, respectivamente, em um volume total de 25 μΙ As condições de amplificação foram: 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 95°C, e um ciclo de duas etapas de 95°C por 15 segundos e 60°C por 60 segundos, por um total de 40 ciclos. Pelo menos três misturas de reação de controle sem molde foram incluídas em cada corrida. Todos os experimentos foram efetuados em duplicata. O método de quantificação relativa foi empregado para calcular os níveis de expressão dos genes-alvo em relação ao controle endógeno de 18S, com base nos seus valores de CT, seguindo o manual do usuário da ABI (P/N 4303859).

Resultados

Os resultados obtidos para cada biomarcador são listados abaixo, na forma de tabela.

Tabela 57: Linhagens Celulares de Cãnceres Cervicais e de Mama de

Expressão dos Biomarcadores

	SiHa	Caski	HeLa	MCF7	SK-BR3	CAMA
MCM2	21,4	5,01	8,79	18,84	7,65	17,32
MCM6	12,34	5,77	6,46	12,6	5,44	13,14
MCM7	20,53	17,27	8,31	26,91	30,38	25,36

107

Conclusões

A linhagem celular HeLa cervical foi mostrada ter níveis de expressão baixa dos biomarcadores MCM2, MCM6 e MCM7. As linhagens celulares SiHa cervicais, MCM7, e CAMA de mama, todas, mostraram superexpressão dos biomarcadores MCM2, MCM6 e MCM7. As linhagens celulares Caski cervicais e SK-BR3 de mama mostraram superexpressão de MCM7, porém baixa expressão para MCM2 e MCM6.

Exemplo 13: Indução da Expressão do Biomarcador Cervical em Células 293 por Transfecção de Gene HPV16 E6/E7 Transiente

O ensaio de PCR de tempo real TaqMan® foi usado para investigar a ligação da expressão do biomarcador cervical com a transcrição do oncogene de HPV de alto risco em um sistema de linhagem celular HEK 293. Projeto e Protocolos Experimentais

Um sistema de expressão regulado por tetraciclina (sistema TRex, Invitrogen, Inc) foi adaptado neste experimento. Os vetores de T-Rex expressando a proteína HPV16 E2, E6 ou E7 foram construídos. Os vetores contendo os genes mutantes E2, E6 ou E7 foram utilizados como controles negativos. As células 293 de T-Rex foram então transfectadas com os plasmídios de HPV, e a expressão dos genes de HPV foi ativada pela tetraciclina por 4 horas, 24 horas e 72 horas. O RNA celular total foi extraído das células transfectadas pelo Minikit de Proteção RNeasy® (Qiagen, Valencia, CA) e convertido na forma de cDNA de fita simples com hexâmeros aleatórios usando o Kit de Arquivo de cDNA de Alta Capacidade (Applied Biosystems, P/N: 4322171). A PCR de tempo real foi efetuada no Sistema de Detecção de Seqüência ABI Prism® 7700 usando a Mistura Principal de PCR Universal por TaqMan® (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA).

Os iniciadores e as sondas para a amplificação específica de MCM2 MCM6, MCM7, TOP2A, Ciclina E1, p21, p14, HPV16 E2, E6 e E7 foram projetados com o programa ABI Iniciador Express®, v1.5. O MCM7 contém quatro variantes transcricionais: a variante de transcrito 1 (T1, refseq NM_005916) e a variante de transcrito 2 (T2, refseq NM_182776) foram identificadas no banco de dados de nucleotídeos NCBI Entrez. As variantes

108

Τ3 e Τ4 têm éxons alternados próximos à extremidade de 5', como analisado por agrupamento de EST através do Marcador de Modelo da NCBI. Os iniciadores e as sondas foram projetados como T1T3, T2T4, T2 e T3T4 especificamente para detectar as variantes T1 e T3, T2 e T4, T2, e T3 e T4, respec5 tivamente. As seqüências dos iniciadores e das sondas são mostradas nos Exemplos 10 e 11.

As sondas foram marcadas com um corante fluorescente FAM (6-carboxifluoresceína) sobre a base em 5', e um corante de finalização TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina) sobre a base em 3’. O RNA ribossômico 10 de 18S foi utilizado como um controle endógeno. A sonda de rRNA de 18S foi marcada com um corante fluorescente VIC. A mistura de iniciador/sonda de rRNA de 18S pré-revelada foi adquirida da Applied Biosystems. 10 ng de cDNA foram aplicados à mistura de reação contendo 0,9 μΜ e 0,25 μΜ dos iniciadores e sondas, respectivamente, em um volume total de 25 μΙ As con15 dições de amplificação foram: 2 minutos a 50°C, 10 minutos a 95°C, e um ciclo de duas etapas de 95°C por 15 segundos e 60°C por 60 segundos, por um total de 40 ciclos. Pelo menos três misturas de reação de controle sem molde foram incluídas em cada corrida. Todos os experimentos foram efetuados em duplicata. O método de quantificação relativa foi empregado para 20 calcular os níveis de expressão dos genes-alvo em relação ao controle endógeno de 18S, com base nos seus valores de CT, seguindo o manual do usuário da ABI (P/N 4303859).

Resultados

A expressão dos genes de HPV16 E2, E6 e E7 nas células 293 25 de T-Rex foi observada aumentar através do curso de tempo da transfecção.

A expressão de mRNA de Topo2A, MCM2, MCM6, MCM7 e ciclina E nas células 293 de T-Rex foi significativamente induzida pelos genes de HPV16 E6 ou E7, após a transfecção a partir de 4 horas até 72 horas. Entretanto, não houve nenhum nível de expressão elevado detectado para p21 e p14 30 após a transfecção do gene de HPV. A expressão de E6 ou E7 não pareceu ser reprimida pela co-transfecção do gene E2. Isto é porque a expressão de E6 ou E7 foi puramente orientada pelo promotor de CMV externo, em vez

109 dos promotores de HPV naturais. Estes não estão presentes neste sistema de modelo.

Tabela 58: Topo2A
Transfecção Oh Oh DP 4h 4h DP 24h	24h DP	72h	72h DP

293-H16E2	6,91	0,07	5,22	0,13	5,68	0,14	6,61	0,36
293-H16E6	6,91	0,07	11,31	0,22	18,13	0,89	17,39	0,85
293-H16E7	6,91	0,07	20,33	0,9	28,94	0,71	35,02	1,03
293-H16dE7	6,91	0,07	6,43	0,35	8,18	0,64	7,39	0,18
293-LacZ	6,91	0,07	7,4	0,07	7,36	0,22	7,25	0,67

		Tabela 59: MCM2
Transfecção	Oh	Oh DP 4h 4h DP 24h	24h DP	72h	72h DP

293-H16E2	4,79	0,23	5,25	0,36	5,24	0,31	4,44	0,3
293-H16E6	4,79	0,23	6,04	0,21	9,38	0,37	12,08	0,18
293-H16E7	4,79	0,23	10,81	0,16	12,29	0,36	16,34	0,8
293-H16dE7	4,79	0,23	5,72	0,36	4,98	0,27	5,03	0,39
293-LacZ	4,79	0,23	5,67	0,61	5,68	0,47	5,98	0,79

		Tabela 60: MCM6
Transfecção	Oh	Oh DP 4h 4h DP 24h	24h DP	72h	72h DP

293-H16E2	3,62	0,2	3,5	0,22	4,72	0	4,44	0,26
293-H16E6	3,62	0,2	4,74	0,07	9,03	0,04	9,68	0,43
293-H16E7	3,62	0,2	7,7	0,04	13,5	0,33	14,03	0,41
293-H16dE7	3,62	0,2	5,23	0,28	4,6	0,32	4,73	0,37
293-LacZ	3,62	0,2	4,77	0,12	4,66	0,14	5,34	0,39

		Tabela 61: MCM7
Transfecção	Oh	Oh DP 4h 4h DP 24h	24h DP	72h	72h DP

293-H16E2	4,2	0,04	6.3	0,28	5,3	0,18	5,8	0,31
293-H16E6	4,2	0,04	4,99	0,05	9,55	0,23	15,24	0,3
293-H16E7	4,2	0,04	10,11	0,84	14,23	0,84	21,18	0,31
293-H16dE7	4,2	0,04	3,65	0,3	6,06	0,3	4,64	0,07
293-LacZ	4,2	0,04	5,74	0,45	5,31	0,55	5,66	0,17

110

Tabela 62: Ciclina E1

Transfecção Oh Oh DP 4h 4h DP 24h ^24h 72h ^72h

DP DP

293-H16E2	6,02	5,06	0,10	5,03	0,35	5,72	0,31
293-H16E6	6,02	9,19	0,18	8,95	0,79	9,38	0,18
293-H16E7	6,02	12,91	0,38	17,63	0,17	17,32	0,25
293-H16dE7	6,02	5,45	0,24	6,87	0,20	5,11	0,08
293-LacZ	6,02	5,72	0,31	6,28	0,37	5,65	0,64

Tabela 63: p21

Transfecção Oh Oh DP 4h 4h DP 24h ^24h 72h ^72h

DP DP

293-H16E2	4,76	0,19	4,05	0,30	5,19	0,61	4,92	0,60
293-H16E6	4,76	0,19	5,56	0,19	5,60	0,08	7,21	0,07
293-H16E7	4,76	0,19	7,52	0,29	5,22	0,13	6,45	0,13
293-H16dE7	4,76	0,19	4,38	0,26	5,60	0,66	5,10	0,05
293-LacZ	4,76	0,19	3,86	0,00	4,53	0,27	5,37	0,29

Tabela 64: p14

Transfecção Oh Oh DP 4h 4h DP 24h ²⁴^ 72h ⁷²^

DP DP

293-H16E2	4,78	0,30	4,44	0,09	5,04	0,44	5,04	0,07
293-H16E6	4,78	0,30	4,77	0,12	5,48	0,13	4,52	0,11
293-H16E7	4,78	0,30	6,38	0,62	5,60	0,25	6,43	0,35
293-H16dE7	4,78	0,30	5,08	0,12	5,53	0,35	5,10	0,15
293-LacZ	4,78	0,30	4,54	0,40	4,68	0,16	5,76	0,25

111

Tabela 65: HPV16 E2

Falso	o	o	o
LacZ	o	o	o
dE2+E7	12,86		9,89
co LU + CM LU Ό	3,94	19,77	32,94
E2+E7	36,6	90,19	128,41
E2+E6	95,34	118,17	162,54
dE7	o	o	o
93P	o	o	o
dE2	110,7	111,41	141,57
E7	o	o	o
93	o	o	o
E2	130,22	162,12	251,55
	4h	24h	72h

co LU

CO >

ΟΧ co co _cp Φ co

Falso	o	o	o
LacZ	o	o	o
dE2+E7	o	o	o
dE2+E6	199,65	188,03	271,55
E2+E7	o	o	o
E2+E6	128,41	158,31	392
dE7	o	o	o
93P	219,87	225,96	315,22
CM LU Ό	o	o	o
E7	o	o	o
93	205	329,67	757,26
E2	o	o	o
	4h	24h	72h

rLU

CD v— > CL X co _co φ x» co

Falso	o	o	o
LacZ	o	o	o
dE2+E7	201,19	600,57	I 809,11
dE2+E6	o	o	o
E2+E7	120,65	857,89	1444,25
E2+E6	o	o	o
NUJ Ό	165,48	239,63	355,9
93P	o	o	o
CM LU Ό	o	o	o
rLU	330,76	1514,6	2806,8
93	o	o	o
E2	o	o	o
	4h	24h	72h

112

Exemplo 14: Acessibilidade Crescente do Antíqeno nos Métodos de Imunocitoquímica e Imunoistoquímica Usando um Tampão de Pré-Tratamento de Lâmina

Seleção da Amostra e Descrição do Reagente

As amostras correlacionadas de citologia e histologia, da mesma paciente, foram submetidas aos imunoensaios para detectar a superexpressão do biomarcador. Foram analisadas as amostras de tecido em blocos de parafina e as amostras de citologia SurePath® de pacientes categorizadas como ASCUS (3), LSIL (6), e HSIL (5). Os reagentes usados foram o Coquetel de Anticorpos (para a citologia), o Coquetel de Anticorpos Modificados (para a histologia), os Reagentes de Detecção, os Contracorantes, e o Tampão de Preparação SureSlide® 10X (tampão de pré-tratamento). Preparação da Lâmina de Citologia e Imunocitoquímica Automatizada

Para a imunocitoquímica, a preparação e o pré-tratamento da lâmina foram conduzidos conforme indicado no Exemplo 5. A imunocitoquímica automatizada foi então efetuada sobre cada amostra de citologia, conforme descrito no Exemplo 5, com uma exceção. A incubação do coquetel de anticorpos primários (Clone para MCM2 26H6.19 1:10.000, Clone para MCM2 27C5.6 1:800, Clone para TOPOIIA SWT3D1 1:1000) foi reduzida para 30 minutos para este experimento.

Preparação da Lâmina de Histologia e Imunocitoguimica Automatizada

Para cada caso, as seções de 4 micra foram cortadas e secadas durante a noite ou por 20 minutos em um forno de ar forçado a 70°C. As seções foram desparafinizadas em 3 trocas de xileno, por 5 minutos cada. As lâminas foram então limpas em álcool absoluto por 5 minutos cada. As lâminas foram levadas para a água e enxaguadas completamente. As lâminas foram transferidas para uma solução preaquecida de Tampão de Preparação SureSlide 1X e incubadas no vaporizador por 25 minutos. As lâminas foram removidas do vaporizador e deixadas esfriar na temperatura ambiente por 20 minutos. As lâminas foram lentamente enxaguadas em água até que o tampão fosse completamente trocado. Um enxágüe de TBST foi aplicado por 2 trocas, a 2 minutos cada.

113

A imunoistoquímica automatizada foi conduzida conforme descrito no Exemplo 5 para a imunocitoquímica, com duas exceções. A incubação do coquetel de anticorpos primários foi reduzida para 30 minutos para este experimento. Adicionalmente, o coquetel de anticorpos primários foi modifi5 cado com as seguintes diluições (Clone para MCM2 26H6.19 1:4.000, Clone para MCM2 27C5.6 1:200, Clone para TOPOIIA SWT3D1 1:400) Resultados

Foram observados padrões de coloração antecipados em ambas as amostras de histologia e citologia com o uso dos reagentes RUO. Especi10 ficamente, foi demonstrada com êxito a capacidade de imunocolorir ambas as amostras de histologia e citologia com o Tampão de Preparação SureSlide®, os Reagentes de Detecção e os Reagentes de Contracorantes.

Tabela 68: Informação sobre a Seqüência de Nucleotídeos e de Aminoácidos dos Biomarcadores

	Seqüência de Nucleotídeos	Seqüência de Aminoácidos
Nome do Biomarcador	N⁹ de Acesso	Identificador da Seqüência	N^Q de Acesso	Identificador da Seqüência
Ciclina E1 (Isoforma 1)	NM_001238	SEQ ID NO:1	NP_001229	SEQ ID NO:2
Ciclina E1 (Isoforma 2)	NM_057182	SEQ ID NO:3	NP_476530	SEQ ID NO:4
Ciclina E2 (Isoforma)	NM_057749)	SEQ ID NO:5	NP_477097	SEQ ID NO:6
Ciclina E2 (Isoforma 2)	NM_057735	SEQ ID NO:7	NP_477083	SEQ ID NO:8
Ciclina E2 (Isoforma 3)	NM_004702	SEQ ID NO:9	NP_004693	SEQ ID NO:10
MCM2	NM_004526	SEQ IDNO:11	NP 0045417	SEQ ID NO:12
MCM6	NM_005915	SEQ ID NO:89	NP 005906	SEQ ID NO:90
MCM7 (Isoforma 1)	NM_005916	SEQ IDNO:13	NP_005907	SEQ ID NO:14
MCM7 (Isoforma 2)	NM_182776	SEQ ID NO:15	NP_877577	SEQ ID NO:16

114

	Seqüência de Nucleotídeos	Seqüência de Aminoácidos
Nome do Biomarcador	N° de Acesso	Identificador da Seqüência	N° de Acesso	Identificador da Seqüência
p21/waf1 (Variante 1)	NM_000389	SEQ IDNO:17	NP_000380	SEQ ID NO:18
p21/waf1 (Variante 2)	NM_078467	SEQ ID NO:19	NP_510867	SEQ ID NO:20
p14ARF	NM_058195	SEQ ID NO:21	NP 478102	SEQ ID NO:22
Topo2a	NM_001067	SEQ ID NO:23	NP 0010568	SEQ ID NO:24

Levando-se em consideração a descrição e os exemplos acima mencionados, alguém versado na técnica apreciará que os métodos da invenção permitem a detecção superior da doença cervical de alto grau, independente da idade, em comparação com a prática convencional. Os métodos da invenção podem encontrar uso particular conforme abaixo descrito:

• Para as mulheres acima da idade de trinta, o teste pode ser um reflexo de um resultado positivo para HPV ou como um reflexo de um resultado de citologia de ASCUS+.

• Para as mulheres abaixo da idade de 30, o teste pode ser usado em combinação com a citologia para a detecção da doença cervical de alto grau.

• Para as mulheres acima da idade de 30, o teste pode ser usado em combinação com a citologia para a detecção da doença cervical de alto grau.

• Para as mulheres abaixo da idade de 30, o teste pode ser usado como uma triagem primária para detectar a doença cervical de alto grau.

• Para as mulheres acima da idade de 30, o teste pode ser usado como uma triagem primária para detectar a doença cervical de alto grau.

• O teste pode ser uma substituição para o esfregaço de Pap em mulheres abaixo da idade de trinta.

• Em última análise, o teste pode ser uma substituição para o esfregaço de Pap, independente da idade.

As outras vantagens potenciais que se originam da prática da presente invenção incluem:

115 • Detecção da anormalidade de alto grau histológica em mulheres de 30 anos de idade e acima com resultados positivos para NIL/HPV.

• Especificidade superior para a detecção da doença cervical de alto grau em mulheres acima da idade de 30 que são positivas para o teste de Pap de DNA+ • Detecção superior para a doença cervical de alto grau em mulheres dentro das categorias de ASC-US, ASC-H, e LSIL, independente da idade.

• Especificidade superior para a detecção de cervical de alto grau dentro da categoria de HSIL.

• Detecção da doença cervical de alto grau em conjunção com o diagnóstico baseado na citologia em mulheres abaixo da idade de 30.

• Detecção da doença cervical de alto grau em conjunção com o diagnóstico baseado na citologia, independente da idade.

• Especificidade aperfeiçoada para a detecção de doença cervical de alto grau como uma triagem primária em mulheres abaixo da idade de 30.

• Especificidade aperfeiçoada para a detecção de doença cervical de alto grau como uma triagem primária, independente da idade.

• Identificação da doença cervical e diferenciação da infecção por HPV e da doença cervical de alto grau.

• Pode ser estabelecido um desempenho de ensaio aceitável usando a interpretação manual ou a interpretação auxiliada via microscopia automatizada.

Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível daqueles versados na técnica à qual diz respeito esta invenção. Todas as publicações e pedidos de patentes são aqui incorporados por referência na mesma proporção como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado ser incorporado por referência.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe como forma de ilustração e exemplo, para os propósitos de clareza de entendimento, será óbvio que certas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das modalidades em anexo.

ASC-US (Sem Lesão)

ASC-US (Lesão)

LSIL (Sem HSIL)

1. Método para diagnosticar doença cervical de alto grau em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende:

a) prover uma amostra do corpo do dito paciente e;

b) contatar a dita amostra com pelo menos três anticorpos, em que um primeiro e um segundo anticorpos se ligam especificamente a MCM2, e em que um terceiro anticorpo se liga especificamente a Topo2A, e;

c) detectar a ligação dos ditos anticorpos a MCM2 e Topo2A.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os pelo menos três anticorpos são anticorpos monoclonais.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende efetuar imunocitoquímica.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que é efetuado manualmente ou de que é efetuado em modo automatizado.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende células cervicais; preferencial mente uma monocamada de células cervicais.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende células cervicais em suspensão em uma preparação à base de líquido.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sensibilidade do dito método para diagnosticar a doença cervical de alto grau é pelo menos 90%; ou que a especificidade do dito método para diagnosticar a doença cervical de alto grau é pelo menos 85%.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a coloração de Papanicolaou (Pa) da amostra.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os ditos pelo menos três anticorpos são contatados com a dita amostra sequencialmente como reagentes de anticorpos individuais; ou que os ditos anticorpos são contatados com a dita amostra simultaneamente coPetição 870180167488, de 26/12/2018, pág. 7/15 mo um coquetel de anticorpos.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é efetuado em resposta ao paciente que tem um resultado do esfregaço de Pap anormal; ou que é efetuado como uma triagem primária para a doença cervical de alto grau em uma população de pacientes geral.

11. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos três anticorpos, em que um primeiro e um segundo anticorpos no kit especificamente se ligam a MCM2, e em que um terceiro anticorpo especificamente se liga a Topo2A, em que o referido kit compreende ainda um reagente bloqueador de peroxidase, um reagente bloqueador de proteína, substâncias químicas para a detecção da ligação do anticorpo às ditas proteínas biomarcadoras, um contracorante, um agente de azular, e instruções para uso.

12. Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que os pelo menos três anticorpos são anticorpos monoclonais.

13. Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as ditas substâncias químicas para a detecção da ligação do anticorpo compreendem um cromógeno e um anticorpo secundário conjugado a um polímero marcado, em que o cromógeno compreende a 3',3'diaminobenzidina, e em que o polímero marcado compreende peroxidase do rabano-silvestre conjugada a um polímero de dextrana; em que o dito contracorante compreende a hematoxilina; ou em que o dito agente de azular compreende uma solução compreendendo salina tamponada com Tris, pH

7,4, Tween-20, e azida sódica.

14. Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma amostra de controle positivo; preferencialmente em que a dita amostra de controle positivo compreende células SiHa.

15. Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda os reagentes para a coloração de Pap; preferencialmente em que os reagentes para a coloração de Pap compreendem EA50 e Orange G.

16. Kit de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que os ditos pelo menos três anticorpos são proporcionados como reagentes sepa

Petição 870180167488, de 26/12/2018, pág. 8/15 rados; ou que os ditos pelo menos três anticorpos são proporcionados como um coquetel.