MXPA05010697A - Emulsiones de aceite en agua microfluidizadas y composiciones de vacunas. - Google Patents

Emulsiones de aceite en agua microfluidizadas y composiciones de vacunas.

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Abstract

Esta invencion proporciona emulsiones submicrometricas de aceite en agua de utilidad como adyuvante de vacuna para potenciar la capacidad inmunogena de antigenos; la presente invencion proporciona tambien composiciones de vacunas que contienen un antigeno combinado con emulsiones de ese tipo de forma intrinseca o extrinseca; la presente invencion proporciona tambien procedimientos para preparar las emulsiones y vacunas.

Description

EMULSIONES DE ACEITE EN AGUA MICROFLUIDIZAPAS Y COMPOSICIONES DE VACUNAS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se refiere de forma general al campo de las vacunas y, en particular, a formulaciones de adyuvantes para potenciar la respuesta inmunitaria en animales veterinarios. En particular, la invención se refiere al uso de una emulsión submicrométrica de aceite en agua como un adyuvante de vacunas para potenciar la capacidad inmunógena de los antígenos. La presente invención proporciona formulaciones de emulsiones submicrométricas de aceite en agua, composiciones de vacunas que contienen un antígeno incorporado en dicha emulsión, así como procedimientos para preparar las emulsiones y vacunas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las infecciones bacterianas, víricas, parasitarias y micoplásmicas están ampliamente difundidas en los animales veterinarios tales como ganado vacuno, porcino y animales de compañía. Las enfermedades provocadas por estos agentes infecciosos son a menudo resistentes a la terapia farmacéutica antimicrobiana, sin dejar medios efectivos de tratamiento. En consecuencia, cada vez se usa más una estrategia de vacunación para controlar la enfermedad infecciosa en los animales veterinarios. Un patógeno infeccioso entero puede hacerse adecuado para usarse en una formulación de vacuna después de la inactivación química o manipulación genética apropiada. De forma alternativa, puede expresarse una subunidad proteínica del patógeno en un sistema de expresión recombinante y purificarse para su uso en una formulación de vacuna. Adyuvante en general se refiere a cualquier material que aumenta la respuesta inmunitaria humoral y/o celular a un antígeno. Las vacunas tradicionales están compuestas por una preparación bruta de microorganismos patógenos inactivados y las impurezas asociadas a los cultivos de microorganismos patológicos podrían actuar como adyuvantes para potenciar la respuesta inmunitaria. Sin embargo, cuando se usan preparaciones homogéneas de microorganismos patológicos o subunidades proteínicas purificadas como antígenos para la vacunación, la inmunidad provocada por dichos antígenos es deficiente y, por lo tanto, se hace necesaria la adición de ciertos materiales exógenos como adyuvantes. Además, las vacunas sintéticas y de subunidades son caras de producir. Por lo tanto, con la ayuda de adyuvantes, puede ser necesaria una dosis menor de antígeno para estimular la respuesta inmunitaria, reduciendo así en el coste de producción de las vacunas. Se sabe que los adyuvantes actúan de diferentes maneras para potenciar la respuesta inmunitaria. Muchos adyuvantes modifican la red de citocinas asociadas a la respuesta inmunitaria. Estos adyuvantes inmunomoduladores pueden ejercer su efecto incluso cuando no están combinados con antígenos. En general, los adyuvantes inmunomoduladores provocan una regulación por aumento general de ciertas citocinas y una regulación por disminución concomitante de otras provocando una respuesta celular Th1 y/o humoral Th2. Algunos adyuvantes tienen la capacidad de preservar la integridad de la conformación de un antígeno de forma que los antígenos puedan presentarse de forma eficiente a las células efectoras inmunitarias apropiadas. Como resultado de esta preservación de la conformación del antígeno por la formulación del adyuvante, la vacuna tendría una vida útil mayor como la mostrada por los complejos inmunoestimuiadores (ISCOM). Ozel M. y cois.; Quaternary Structure of the Immunestimmulating Complex (Iscom), J. of Ultrastruc. And Molec. Struc. Res. 102, 240-248 (1989). Algunos adyuvantes tienen la propiedad de retener el antígeno en forma de formulación de liberación prolongada en el sitio de inyección. Como resultado de este efecto de liberación prolongada el antígeno no se pierde rápidamente por aclaramiento hepático. Las sales de aluminio y las emulsiones de agua en aceite actúan a través de este efecto de liberación prolongada con una duración menor. Por ejemplo, se puede obtener una formulación de liberación prolongada a largo plazo usando adyuvante completo de Freund (FCA) que es una emulsión de agua en aceite. FCA típicamente se mantiene en el sitio de inyección hasta que la biodegradación permite la separación del antígeno por las células presentadoras de antigeno.
Basándose en su naturaleza física, los adyuvantes pueden agruparse en dos categorías muy amplias, en concreto adyuvantes particulados y adyuvantes no particulados. Los adyuvantes particulados existen en forma de micropartículas. El inmunógeno es capaz de incorporar o asociarse a las micropartículas. Sales de aluminio, emulsiones de agua en aceite, emulsiones de aceite en agua, complejos inmunoestimuladores, liposomas y nanopartículas y micropartículas son ejemplos de adyuvantes particulados. Los adyuvantes no particulados son generalmente inmunomoduladores y se usan generalmente junto con adyuvantes particulados. Muramil dipéptido (un componente activo-adyuvante de un peptidoglicano extraído de Mycobacteria), copolímeros de bloque no iónicos, saponinas (una mezcla compleja de triterpenoides extraídos de la corteza del árbol Quillaja saponaria), Lípido A (un disacárido de glucosamina con dos grupos fosfato y cinco o seis cadenas de ácidos grasos generalmente de C12 a C16 de longitud), citocinas, polímeros de carbohidratos, polisacáridos derivatizados y toxinas bacterianas tales como la toxina del cólera y la toxina lábil de E. coli (LT) son ejemplos de adyuvantes no particulados. Algunos de los adyuvantes mejor conocidos son combinaciones de inmunomoduladores no particulados y materiales particulados que podrían conferir un efecto de liberación prolongada a la formulación de adyuvante. Por ejemplo, FCA combina las propiedades inmunomoduladoras de componentes de Mycobacterium tuberculosis con el efecto depósito a corto plazo de las emulsiones en aceite.
Las emulsiones en aceite se han usado como adyuvante de vacunas durante mucho tiempo. Le Moignic y Pinoy encontraron en 1916 que una suspensión de Salmonella typhimurium inactivados en aceite minera! aumentaba la respuesta ¡nmunitaria. Subsiguientemente, en 1925, Ramón describió el aceite de almidón como una de las sustancias que aumentan la respuesta antitóxica al toxoide de la difteria. Sin embargo, las emulsiones en aceite no se hicieron populares hasta 1937 cuando Freund logró su formulación de adyuvante que hoy se conoce como Adyuvante Completo de Freund (FCA). FCA es una emulsión de agua en aceite compuesta por aceite mineral (parafina) mezclado con Mycobacteria inactivadas y Arlacel A. Arlacel A es principalmente monooleato de manida y se usa como agente emulsionante. Aunque FCA es excelente para inducir una respuesta de anticuerpos, provoca un dolor fuerte, formación de abscesos, fiebre e inflamación granulomatosa. Para evitar estas reacciones secundadas indeseables, se desarrolló el Adyuvante Incompleto de Freund QFA). IFA es similar a FCA en su composición excepto por la ausencia de componentes de micobacteria. IFA actúa mediante formulación de liberación prolongada en el sitio de inyección y liberación lenta del antígeno con estimulación de células productoras de anticuerpos. Otra estrategia para mejorar FCA se basó en la noción de que la sustitución del aceite mineral por un aceite biocompatible ayudaría a eliminar las reacciones asociadas a FCA en el sitio de inyección. Se creía también que la emulsión debería ser una de aceite en agua en lugar de agua en aceite porque ésta produce efecto de liberación prolongada de larga duración en el sitio de inyección. Hilleman y cois, describieron un adyuvante basado en aceite "Adjuvant 65", que consiste en aceite de cacahuete al 86%, Arlacel A al 10% como emulsionante y monoestearato de aluminio al 4% como estabilizador. Hilleman, 1966, Prog. Med. Virol. 8: 131-182; Hilleman y Beale, 1983, en New Approaches to Vaccine Development (Editores Bell, R. y Torrigiani, G.), Schwabe, Basel. En los seres humanos, el uso de Adjuvant 65 era seguro y potente, pero mostraba menos capacidad adyuvante que IFA. Sin embargo, se suspendió el uso de Adjuvant 65 debido a la capacidad reactógena en el hombre con ciertos lotes de vacunas y la reducción de la capacidad de adyuvante cuando se usaba emulsionante purificado o sintético en lugar de Arlacel A. Las patentes de Estados Unidos n° 5,718,904 y 5,690,942 enseñan que el aceite mineral en la emulsión de aceite en agua puede sustituirse por aceite metabolizable con el fin de mejorar el perfil de seguridad. Además de la capacidad adyuvante y la seguridad, el aspecto físico de una emulsión es también una consideración comercial importante. El aspecto físico depende de la estabilidad de la emulsión. La separación de fases, sedimentación y coalescencia son indicadores de la inestabilidad de la emulsión. La separación de fases ocurre cuando las fases oleaginosa y acuosa de la emulsión tienen una gravedad específica diferente. También se da la separación de fases cuando el tamaño inicial de la gota de la emulsión es grande y las gotas de emulsión no tienen movimiento Browniano. Cuando el tamaño de la gota es grande, hay una tendencia a la ruptura de la interfase y las gotas se fusionan en forma de partículas grandes. La estabilidad de la emulsión se determina mediante un número de factores tales como la naturaleza y cantidad de emulsionante usado, el tamaño de la gota en la emulsión y la diferencia de densidades entre la fase oleaginosa y acuosa. Los emulsionantes promueven la estabilización de gotas dispersas reduciendo la energía libre de la interfase y creando barreras físicas o electroestáticas a la coalescencia de las gotas. Se han usado detergentes no iónicos as! como iónicos como emulsionantes. Los emulsionantes no iónicos se orientan en la interfase y producen estructuras relativamente voluminosas, lo que conlleva al impedimento esférico de las gotas dispersas. Los emulsionantes aniónicos o catiónicos inducen la formación de una capa doble eléctrica atrayendo los contraiones; las fuerzas de repulsión de la capa doble provocan que las gotas se repelan las unas a las otras cuando se acercan. Además de usar emulsionantes, puede lograrse también la estabilidad de la emulsión reduciendo el tamaño de la gota de la emulsión por medios mecánicos. Típicamente se han usado mezcladores de propelentes, rotores de turbina, molinos de coloides, homogeneizadores y aparatos de ultrasonidos para fabricar emulsiones. La microfluidización es otra forma de aumentar la homogeneidad del tamaño de la gota en la emulsión. La microfluidización puede producir una emulsión elegante, físicamente estable con un tamaño de partícula consistente en el intervalo submicrométrico.
Además de aumentar la estabilidad de la emulsión, el proceso de la microfluidización permite la filtración final que es una forma . preferida de asegurar la esterilidad del producto final. Además, las partículas oleaginosas submicrométricas pueden pasar desde los sitios de inyección a los vasos linfáticos y después a los nodulos linfáticos de la cadena de drenaje, sangre y bazo. Esto reduce la probabilidad de establecer una formulación de liberación prolongada oleaginosa en el sitio de la inyección que puede producir inflamación local y una reacción significativa en el sitio de inyección. Los microfluidizadores están ahora disponibles en el mercado. La formación de emulsiones ocurre en un microfluidizador al interactuar dos corrientes fluidizadas a velocidades elevadas dentro de una cámara de interacción. El microfluidizador es aire o nitrógeno impulsado que puede operar con presiones internas por encima de 137900 KPai. La patente de Estados Unidos 4,908,154 enseña el uso de un microfluidizador para obtener emulsiones esencialmente libres de cualesquiera agentes emulsionantes. En la bibliografía se han describo un número de formulaciones de adyuvantes de aceite en agua submicrométricas. La patente de Estados Unidos 5,376,369 describe un adyuvante de emulsión submicrométrica de aceite en agua que se conoce como Syntax Adjuvant Formulation (SAF). SAF contiene escualeno o escualano como el componente oleaginoso, una cantidad de polímero de bloque Plurónico L121 que forma emulsiones (polioxi-propilen-polioxietileno) y una cantidad inmunopotenciadora de muramil dipéptido. Escualeno es un precursor de colesterol de tipo hidrocarburo lineal que se encuentra en muchos tejidos, de forma notable en el hígado de tiburones y otros peces. Escualano se prepara mediante hidrogenación de escualeno y está completamente saturado. Tanto escualeno como escualano pueden metabolizarse y tienen unos buenos antecedentes en estudios toxicológicos. Las emulsiones de escualeno o escualano se han usado en vacunas contra el cáncer en humanos con efectos secundarios leves y con una eficacia deseable. Véase, por ejemplo, Anthony C. Allison, 1999, Squalene and Squalane emulsione as adjuvants, Methods 19: 87-93. La patente de Estados Unidos 6,299,884 y la publicación de patente internacional WO 90/14837 enseñan que los copolímeros de bloque de polioxi-propilen-polioxietileno no son esenciales para la formación de emulsiones submicrométricas de aceite en agua. Además, estas referencias enseñan el uso de aceite metabolizable no tóxico y expresamente excluyen el uso de aceite mineral y aceites de derivados del petróleo tóxicos en sus formulaciones de emulsiones. La patente de Estados Unidos 5,961 ,970 enseña otra emulsión submicrométrica de aceite en agua más para usarse como adyuvante en vacunas. En la emulsión que se describe en esta patente, el componente hidrófobo se selecciona del grupo que consiste en un aceite triglicérido de cadena media, un aceite vegetal y una mezcla de los mismos. El tensioactivo que se incluye en esta emulsión puede ser un tensioactivo biológicamente compatible natural tal como un fosfolípido (por ejemplo lecitina) o un tensioactivo no natural farmacéuticamente aceptable tal como TWEEN-80.
Esta patente enseña también la incorporación del antígeno a la emulsión en el momento en que se forma la emulsión, contrastando con la mezcla del antígeno con la emulsión después de que se ha formado la emulsión de forma independiente y extrínseca. La patente de Estados Unidos 5,084,269 enseña que una formulación de adyuvante que contiene lecitina combinada con aceite mineral provoca un descenso de la irritación en el animal hospedador y simultáneamente induce una inmunidad sistémica aumentada. La formulación del adyuvante que resulta de la patente de Estados Unidos 5,084,269 se usa comercialmente en vacunas veterinarias con el nombre comercial AMPHIGEN®. La formulación de AMPHIGEN® está formada por micelas -gotas de aceite rodeadas de lecitina. Estas micelas permiten que se unan más antígenos celulares completos que los adyuvantes con base oleaginosa tradicionales. Además, las formulaciones de vacunas a base de AMPHIGEN® contienen un bajo contenido en aceite de 2.5 a 5% de aceite mineral, comparado con otras formulaciones de vacunas que contienen adyuvantes oleaginosos, que típicamente contienen de 10% a 20% de aceite. Su bajo contenido en aceite hace que esta vacuna con base de adyuvante sea menos irritante para los tejidos en el sitio de inyección, dando como resultado menos lesiones y que haya menos desechos al sacrificar. Además, el recubrimiento de lecitina que rodea las gotas de aceite reduce adicionalmente las reacciones en el sitio de inyección dando como resultado una vacuna que es tanto segura como eficaz.
La formulación de A PHIGEN® se usa como adyuvante en un número de vacunas veterinarias y existe una necesidad de mantener el aspecto físico de la vacuna durante períodos de almacenamiento cortos y largos as! como en el momento de la reconstitución. Además, un antígeno liofilizado se mezcla con la formulación de adyuvante preparada previamente justo antes de la inyección. Esta práctica no asegura siempre que exista una distribución uniforme del antígeno en la emulsión de aceite en agua y el aspecto de la emulsión puede no ser deseable. Además, al reposar, la emulsión homogeneizada puede mostrar separación de fases. Por lo tanto, existe una necesidad de una formulación de adyuvante estable que no muestre separación de fases durante una vida útil larga. Una forma de prevenir la separación de fases es reducir el tamaño de la gota y aumentar la homogeneidad de las partículas de la emulsión. Aunque se ha documentado el proceso de microfluidización de formulaciones en emulsión a base de aceite metabolizable, la microfluidización de las emulsiones de aceite en agua tales como la formulación de AMPHIGEN® no se ha realizado todavía. En la presente invención, se ha usado la microfluidización para llevar el tamaño de las gotas de aceite mineral rodeadas de lecitina a tamaño submicrométrico. De forma inesperada, los presentes inventores han descubierto que la microfluidización de formulaciones de vacunas que tienen como adyuvante una emulsión de aceite en agua formada por una mezcla de lecitina y aceite no únicamente mejora el aspecto físico de las formulaciones, sino que potencia también los efectos inmunizadores de las formulaciones.
Las formulaciones microfluidizadas se caracterizan también por un perfil de seguridad mejorado.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Los presentes inventores han descubierto de forma inesperada que la actividad de adyuvante y perfil de seguridad de emulsiones con base oleaginosa de aceite en agua no metabolizables pueden mejorarse mediante la microfluidización. Los antígenos que se incorporan en emulsiones microfluidizadas son estables incluso cuando los antígenos se incorporan de forma intrínseca a las emulsiones antes de la microfluidización. En consecuencia, en una realización, la presente invención proporciona formulaciones de emulsión submicromótrica de aceite en agua de utilidad como un adyuvante de vacuna. Las emulsiones submicrométricas de aceite en agua de la presente invención están compuestas por un aceite no metabolizable, al menos un tensioactivo y un componente acuoso, en el que el aceite está disperso en el componente acuoso con un tamaño medio de gota de aceite en el intervalo submicrométrico. Un aceite no metabolizable preferido es aceite mineral ligero. Tensioactivos preferidos incluyen lecitina, Tween-80 y SPAN-80. Una emulsión de aceite en agua preferida proporcionada por la presente invención está compuesta por una formulación de AMPH1GEN®.
Las emulsiones de aceite en agua de la presente invención pueden incluir componentes adicionales que son apropiados y deseables, incluyendo conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadhesivas y moléculas inmunoestimuladoras. Moléculas inmunoestimuladoras preferidas incluyen, por ejemplo Quil A, colesterol, GPI-0100, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA). En otra realización, la presente invención proporciona procedimientos para preparar una emulsión submicrométrica de aceite en agua. De acuerdo con la presente invención, se mezclan los diversos componentes de la emulsión, incluyendo el aceite, uno o más tensioactivos, un componente acuoso y cualquier otro componente apropiado para usarse en la emulsión. La mezcla se somete a un proceso de emulsionamiento primario para formar una emulsión de aceite en agua, que después se pasa por un microfluidizador para obtener una emulsión de aceite en agua de gotas con un diámetro inferior a 1 miera, preferiblemente con un tamaño de gota medio inferior a 0.5 mieras. En otra realización más, la presente invención proporciona composiciones de vacuna que contienen un antígeno y una emulsión submicrométrica de aceite en agua descrita anteriormente. El antígeno se incorpora en la emulsión de forma extrínseca o intrínseca, preferiblemente de forma intrínseca. El antígeno que puede incluirse en las composiciones de la vacuna de la presente invención puede ser un antígeno bacteriano, fúngico o vírico o una combinación de ellos. El antígeno puede tener forma de una preparación inactivada de células o virus completos o parciales, o tomar la forma de moléculas antígenas obtenidas mediante purificación convencional de proteínas, técnicas de ingeniería genética o síntesis química. En una realización adicional, la presente invención proporciona procedimientos para preparar composiciones de vacunas que contienen un antígeno o antígenos combinado(s) con una emulsión submicrométrica de aceite en agua. Para preparar las composiciones de vacunas de la presente invención, el (los) antigeno(s) puede(n) combinarse de forma intrínseca (por ejemplo antes de la microfluidizacíón) o de forma extrínseca (por ejemplo después de la microfluidización) con los componentes de la emulsión de aceite en agua. Preferiblemente, el antígeno se combina con los componentes de la emulsión de aceite en agua de forma intrínseca. En otra realización más, la presente invención proporciona composiciones de vacunas que contienen un antígeno mícroencapsulado y una emulsión submicrométrica de aceite en agua descrita anteriormente, en las que el antígeno mícroencapsulado se combina con la emulsión de forma extrínseca.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa el procedimiento para la preparación en lotes de composiciones de vacunas no microfluidizadas. En este procedimiento los diversos componentes de la vacuna se añaden al recipiente de adición de la izquierda y finalmente se bombean ai vaso de mezclado donde los componentes se mezclan por medios mecánicos simples. La Figura 2 representa el procedimiento para la preparación de composiciones de vacunas microfluidizadas que contienen antígeno incorporado de forma intrínseca. Los diversos componentes de la vacuna se añaden al recipiente de adición y se transfieren a la unidad de mezclado de la preemulsión para mezclar por medios mecánicos simples. Subsiguientemente, se pasa la emulsión por un microfluidizador y se recoge en la cámara de post-microfluidización. La Figura 3 representa la distribución del tamaño de las gotas de la vacuna basada en de la formulación de AMPHIGEN® no microfluidizada, la vacuna basada en de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada y la preparación de vacuna de mezclado en banco. La Figura 4 muestra la ausencia de separación de fases en la preparación de vacuna microfluidizada. La Figura 5 representa una comparación de la estabilidad de los antígenos que se incorporan de forma intrínseca a la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada (A907505) y tres preparaciones de vacunas con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidizadas de control (A904369, A904370 y A904371). Las cuatro preparaciones de vacunas se almacenaron a 4°C durante dos años. En momentos diferentes durante el almacenamiento (0, 6, 12 ó 24 meses), se usaron las cuatro formulaciones para vacunar vacas de tres meses de edad. La vacunación se realizó el Día 0 y 21 con 2 mi de una dosis de vacuna y se recogieron los sueros dos semanas después de la segunda vacunación. Se determinó la valoración de anticuerpos neutralizadores para el virus de BVD Tipo II en cada una de las muestras de suero. Los datos se presentan como la media geométrica de 5 animales. La Figura 6 muestra la media por mínimos cuadrados de la temperatura rectal del ganado vacuno antes y después de la administración de vacunas microfluidizadas y no microfluidizadas. T01 : Grupo placebo - dosis única; Grupo Placebo - Dosis Doble; T03: Formulación no microfluidizada -Dosis única; T04: Formulación no microfluidizada - Dosis doble; T05: Formulación microfluidizada - Dosis única; T06: Formulación microfluidizada -Dosis doble. La Figura 7 muestra la media por mínimos cuadrados de los volúmenes de reacción en el sitio de inyección observados en el ganado vacuno después de la administración de vacunas microfluidizadas y no microfluidizadas. T03: Formulación no microfluidizada - Dosis única; T04; Formulación no microfluidizada - Dosis doble; T05: Formulación microfluidizada - Dosis única; T06: Formulación microfluidizada - Dosis doble.
La Figura 8 representa la media geométrica de las valoraciones de IgG para antígeno PauA recombinante de Streptococcus uberis después de la vacunación con las diversas formulaciones de vacuna que contenían tanto antígeno PauA recombinante como antígeno de célula entera de E. coli. La Figura 9 representa la media geométrica de las valoraciones de IgG para antígeno de células enteras de E. coli de Streptococcus uberis después de la vacunación con las diversas formulaciones de vacuna que contenían tanto antígeno PauA recombinante como antígeno de célula entera de E. coli. La Figura 10A y 10B representan la distribución de tamaño de partícula de una formulación de Amphigen microfluidizada en la producción inicial (Figura 10A) y a los 22 meses después de la producción (Figura 10B).
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los presentes inventores han descubierto de forma inesperada que la microfluidización de formulaciones de vacunas que tienen como adyuvantes una emulsión de aceite en agua compuestas por una mezcla de lecitina y aceite mineral no sólo mejora el aspecto físico de las formulaciones de vacunas, sino que también potencia los efectos inmunizadores de las formulaciones de vacunas. Las formulaciones de vacunas microfluidizadas se caracterizan también por un perfil de seguridad mejorado.
Basándose en estos descubrimientos, la presente invención proporciona emulsiones submicrométricas de aceite en agua de utilidad como un adyuvante en composiciones de vacunas. Se proporcionan también procedimientos para preparar estas emulsiones submicrométricas de aceite en agua usando un microfluidizador. Además, la presente invención proporciona composiciones de vacunas submicrométricas en las que un antígeno se combina con una emulsión submicrométrica de aceite en agua. También se proporcionan los procedimientos para preparar dichas composiciones de vacunas. La presente invención proporciona además composiciones de vacunas que contienen antígenos microencapsulados combinados con una emulsión submicrométrica de aceite en agua y procedimientos para preparar dichas vacunas. Para hacer más clara la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, realizaciones o aplicaciones de la invención.
Emulsiones submicrométricas de aceite en agua En una realización, la presente invención proporciona emulsiones submicrométricas de aceite en agua de utilidad como un adyuvante de vacunas. Las emulsiones submicrométricas de aceite en agua de la presente invención potencian la capacidad inmunógena de los antígenos de las composiciones de vacunas, son seguras para administrarse a animales y permanecen estables durante el almacenamiento. Las emulsiones submicrométricas de aceite en agua de la presente invención están compuestas por un aceite no metabolizable, al menos un tensioactivo y un componente acuoso, en los que el aceite está disperso en el componente acuoso con un tamaño medio de gota de aceite en el intervalo submicrométñco. Por "submicrométrico" se quiere decir que las gotas son de un tamaño inferior a 1 µ? (miera) y el tamaño medio de gota de aceite es inferior a 1 pm. Preferiblemente, el tamaño medio de gota de la emulsión es inferior a 0.8 pm; más preferiblemente inferior a 0.5 pm; e incluso más preferiblemente inferior a 0.4 pm o aproximadamente 0.1-0.3 pm. El "tamaño medio de la gota" se define como el tamaño de partícula del Diámetro Medio del Volumen (DMV) en una distribución de volumen de tamaños de partícula. EL DMV se calcula multiplicando cada-diámetro de partícula por el volumen de todas las partículas de ese tamaño y sumando. Esto se divide después entre el volumen total de todas las partículas. El término "aceite no metabolizable" como se usa en la presente memoria se refiere a aceites que no pueden ser metabolizados por el cuerpo del sujeto animal al que se administra la emulsión.
Los términos "animal" y "sujeto animal" como se usan en la presente memoria se refieren a todos los animales no humanos, incluyendo ganado vacuno, ovejas y cerdos por ejemplo. Los aceites no metabolizables adecuados para usarse en las emulsiones de la presente invención incluyen alcanos, alquenos, alquinos y sus ácidos y alcoholes correspondientes, sus éteres y ésteres, y sus mezclas. Preferiblemente, los compuestos individuales del aceite son compuestos de hidrocarburo ligeros, es decir, los componentes de ese tipo tienen 6 a 30 átomos de carbono. El aceite puede prepararse o purificarse sintéticamente a partir de productos de petróleo. Los aceites preferidos no metabolizables para usarse en las emulsiones de la presente invención incluyen aceite mineral, aceite de parafina y cicloparafinas por ejemplo. El término "aceite mineral" se refiere a una mezcla de hidrocarburos líquidos que se obtienen a partir de vaselina mediante una técnica de destilación. El término es sinónimo de "parafina líquida", "vaselina liquida" y "aceite mineral blanco". El término se pretende que incluya también "aceite mineral ligero", es decir, aceite que se obtiene de forma similar mediante destilación de vaselina pero que tiene una gravedad específica ligeramente menor que la vaselina. Véase, por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 181 Edición (Easton, Pa.; Mack Publishing Company, 1999, en las páginas 788 y 1323). El aceite mineral puede obtenerse a partir de diversas fuentes comerciales, por ejemplo J.T. Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH). El aceite mineral preferido es el aceite mineral blanco ligero disponible comercialmente con el nombre de DRAKEOL®. Típicamente, el componente oleaginoso de las emulsiones submicrométricas de la presente invención está presente en una cantidad de 1 % a 50% en volumen; preferiblemente, en una cantidad de 10% a 45; más preferiblemente en una cantidad de 20% a 40%. Las emulsiones de aceite en agua de la presente invención típicamente Incluyen al menos un (es decir, uno o más) tensioactivo. Los tensioactivos y emulsionantes, términos que se usan de forma indistintamente en la presente memoria, son agentes que estabilizan la superficie de las gotas de aceite y mantienen las gotas de aceite dentro del tamaño deseado. Tensioactivos adecuados para usarse en las presentes emulsiones incluyen tensioactivos biológicamente compatibles naturales y tensioactivos sintéticos no naturales. Los tensioactivos biológicamente compatibles incluyen compuestos de fosfolípidos o una mezcla de fosfolípidos. Los fosfolípidos preferidos son fosfatidilcolinas (lecitina), tales como lecitina de soja o de huevo. La lecitina puede obtenerse como mezcla de fosfátidos y triglicéridos lavando aceites vegetales crudos con agua, y separando y secando las gomas hidratadas resultantes. Un producto refinado puede obtenerse fraccionando la mezcla para obtener los fosfolípidos y glucolípidos insolubles en acetona que permanecen después de separar los triglicéridos y aceite vegetal lavando con acetona. De forma alternativa, puede obtenerse lecitina de diversas fuentes comerciales. Otros fosfolípidos adecuados incluyen fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, cardiolipina y fosfatidiletanolamina. Los fosfolípidos pueden aislarse de fuentes naturales o sintetizarse convencionalmente. Tensioactivos sintéticos no naturales adecuados para usarse en las emulsiones submicrométricas de la presente invención incluyen tensioactivos no iónicos con base de sorbitan, por ejemplo tensioactivos de sorbitan sustituidos con ácidos grasos (disponibles comercialmente con el nombre SPAN® o ARLACEL®), ésteres de ácidos grasos de sorbitol polietoxilado (TWEEN®), ésteres de polietilenglicol de ácidos grasos de fuentes tales como aceite de ricino (EMULFOR); ácido graso polietoxilado (por ejemplo ácido esteárico disponible con el nombre de SIMULSOL M-53), polímero de ¡sooctilfenol polietoxilado/formaldehído (TYLOXAPOL), éteres de alcoholes grasos de polioxietileno (BRIJ®); éteres de polioxietilen nonfenilo (TRITON®N), éteres de polioxietilen isooctilfenilo (TRITON®X). Tensioactivos sintéticos preferidos son los tensioactivos disponibles con el nombre de SPAN® y TWEEN®. Tensioactivos preferidos para usarse en las emulsiones de aceite en agua de la presente invención incluyen lecitina, Tween-80 y SPAN-80. En general el tensioactivo, o la combinación de tensioactivos si se usan dos o mas, está presente en la emulsión en una cantidad de 0.01 % a 10% en volumen, preferiblemente 0.1 % a 6.0%, más preferiblemente 0.2% a 5.0%.
El componente acuoso constituye la fase continua de la emulsión y puede ser agua, solución salina tamponada o cualquier otra solución acuosa adecuada. Las emulsiones de aceite en agua de la presente invención pueden incluir componentes adicionales que son apropiados y deseables, incluyendo conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadhesivas y moléculas inmunoestimuladoras. Se cree que las moléculas bioadhesivas pueden potenciar la administración y unión de antígenos sobre o a través de la superficie mucosa diana confiriendo inmunidad mucosa. Ejemplos de moléculas bioadhesivas adecuadas incluyen polímeros ácidos no naturales tales como ácido poliacrílico y ácido polimetracrílico (por ejemplo CARBOPOL®, CARBOMER); polímeros naturales modificados sintéticamente ácidos tales como carboximetilcelulosa; polímeros naturales modificados sintéticamente neutros tales como (hidroxipropil)metilcelulosa; polímeros que portan aminas-básicas tales como chitosan; polímeros ácidos que pueden obtenerse de fuentes naturales tales como ácido algínico, ácido hialurónico, pectina, goma de tragacanto y goma de karaya; y polímeros neutros no naturales, tales como polivinilalcohol; o sus combinaciones. La frase "moléculas inmunoestimuladoras" como se usa en la presente memoria, se refiere a las moléculas que potencian la respuesta inmunitaria protectora inducida por un componente antígeno en las composiciones de las vacunas. Los materiales inmunoestimuladores adecuados incluyen componentes de la pared celular bacteriana, por ejemplo derivados de N-acetil-muramil-L-alanil-D-isoglutamina tales como murabutida, treonil-MDP y muramil tripéptido; glucósidos de saponina y sus derivados, por ejemplo Quil A, QS 21 y GPI-0100; colesterol y compuestos de amonio cuaternario por ejemplo bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) y N, N-dioctadecil-N, N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina ("avridina"). Las saponinas son compuestos glucosídicos que se producen como metabolitos secundarios en una gran variedad de especies vegetales. La estructura química de las saponinas confiere una amplia gama de actividades farmacológicas y biológicas, que incluyen alguna actividad inmunológica potente y eficaz. Estructuralmente, las saponinas están constituidas por cualquier aglucona unida a una o más cadenas de azúcares. Las saponinas pueden clasificarse de acuerdo con su composición de agluconas: glucósidos triterpénicos, glucósidos esteroideos y glucósidos alcaloides esteroideos. La saponina puede aislarse de la corteza de Quillaja saponaria. La saponina ha sido conocida desde hace mucho como un inmunoestimulador. Dalsgaard, K., "Evaluation of its adjuvant activity with special reference to the application in the vaccination of cattle against foot-and-mouth disease", Acta. Vet. Scand. 69: 1-40 1978. Los extractos brutos de plantas que contenían saponinas mejoraron la potencia de las vacunas contra la glosopeda. Sin embargo, los extractos brutos se asociaron a efectos secundarios adversos cuando se usaron en vacunas. Subsiguientemente, Daisgaard purificó parcialmente el componente activo del adyuvante de saponina mediante diálisis, intercambio de iones y cromatografía por filtración en gel. Daisgaard, K. y cois. «Saponin Adjuvants III. Isolation of a substance from Quillaja saponaria Morina with adjuvant activity in foot-and-mouth disease vaccines", Arch. Gesamte. Virusforsch. 44: 243-254 1974. Un componente activo de adyuvante purificado de esta forma se conoce como "Quil A". En base al peso Quil A-demostró una potencia aumentada y mostró reacciones locales reducidas cuando se comparó con saponina. Quil A se usa extensamente en vacunas veterinarias. El análisis adicional de Quil A mediante cromatografía líquida de" alta presión (HPLC) reveló una mezcla heterogénea de saponinas muy similares y llevó al descubrimiento de QS21 que era un adyuvante potente con una toxicidad mínima o reducida. Kensil C.R. y cois., "Separation and characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex", J. Immunol. 146: 431-437, 1991. Al contrario que la mayoría de otros inmunoestimuladores, QS21 es soluble en agua y puede usarse en vacunas con o sin formulaciones tipo emulsión. Se ha demostrado que QS21 provoca una respuesta de tipo Th1 en ratones estimulando la producción de anticuerpos lgG2a e lgG2b e indujo CD8 + CTL (MHC clase I) específico de antígeno en respuesta a antígenos subunitarios. Los estudios clínicos en humanos han demostrado su capacidad como adyuvante con un perfil toxicológico aceptable. Kensil, C.R. y cois., "Structural and immunological, characterization of the vaccine adjuvant QS-21. In Vaccine Design: the subunit and Adjuvant Approac ," Editores Powell, M.F. y Newman, M.J. Plenum Publishing Corporation, New York 1995, páginas 525-541. La patente de Estados Unidos 6,080,725 enseña los procedimientos para preparar y usar conjugado de saponina-lipófilo. En este conjugado de saponina-lipófilo, un resto lipófilo tal como un lípido, ácido graso, polietilenglicol o terpeno se une covalentemente a una saponina triterpénica no acilada o desacilada mediante un grupo carboxi presente en el ácido 3-0-glucurónico de la saponina triterpénica. La unión de un resto lipófilo al ácido 3-O-glucurónico de una saponina tal como desacilsaponina de Quillaja, luciosida P o saponina de Gypsophila, saponaria y Acanthophyllium potencia sus efectos adyuvantes sobre la inmunidad mediada humoral y celular. Además, la unión de un resto lipófilo al resto de ácido 3-O-glucurónico de desacilsaponina o saponina no acilada proporciona un análogo de saponina que es más fácil de purificar, menos tóxico, químicamente más estable y posee propiedades como adyuvante ¡guales o mejores que la saponina original. GPI-0100 es un conjugado de saponina-lipófilo que se describe en la patente de Estados Unidos 6,080,725. GPI-0100 se produce mediante la adición de una amina alifática a desacilsaponina mediante el grupo carboxilo del ácido glucurónico. Compuestos de amonio cuaternario - Se ha propuesto un número de bases nitrogenadas alifáticas para usarse como adyuvantes inmunológicos, incluyendo aminas, compuestos de amonio cuaternario, guanidinas, -benzamidinas y tiouronios. Compuestos de ese tipo específicos incluyen bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxiet¡l)propanodiamina ("avridina"). La patente de Estados Unidos 5,951 ,988 enseña una formulación de adyuvante que contiene sales de amonio cuaternario tales como DDA en conjunción con un componente oleaginoso. Esta formulación es útil en conjunción con sustancias ¡nmunológicas conocidas, por ejemplo antígenos víricos o bacterianos en una composición de vacuna, para potenciar la respuesta inmunógena. La composición es también útil sin un antígeno incorporado como formulación inmunoestimuladora no especifica. La patente de Estados Unidos 4,310,550 describe el uso de N, realquilo superior-N,N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina y ?,?-alquilo superior-xililendiaminas formuladas con emulsión grasa o lipídica como adyuvante de vacunas. En la patente de Estados Unidos 4,310,550 se describe un procedimiento para inducir o potenciar la respuesta inmunógena de un antígeno en el hombre o en un animal a través de la administración parenteral de la formulación de adyuvante. En una realización preferida, la presente invención proporciona una emulsión submicrométrica de aceite en agua de utilidad como adyuvante de vacunas, que se compone de una formulación de AMPHIGEN®, con gotas de un tamaño inferior a 1 µ?? y un tamaño medio de gota de aproximadamente 0.25 pm. El término "formulación de AMPHIGEN®" como se usa en la presente memoria se refiere a una solución formada mezclando una solución de aceite de lecitina DRAKEOL® (Hydronics, Lincoln, NE) con solución salina en presencia de TWEEN® 80 y SPAN® 80. Una formulación típica de AMPHIGEN® contiene aceite mineral ligero al 40% en volumen (v/v), aproximadamente 25% p/v de lecitina, aproximadamente 0.18% de TWEEN 80 en volumen (v/v) y aproximadamente 0.08% de Span 80 en volumen (v/v).
Procedimientos para preparar emulsiones submicrométricas de aceite en agua En otra realización, la presente invención proporciona procedimientos para preparar las emulsiones submicrométricas de aceite en agua que se describen anteriormente. De acuerdo con la presente invención, los diversos componentes de la emulsión, incluyendo el aceite, uno o más tensioactivos, un componente acuoso y cualquier otro componente adecuado para usarse en la emulsión se combinan y mezclan los unos con los otros. La mezcla formada se somete a un procedimiento de emulsificación, típicamente pasando una o más veces a través de uno o más homogenizadores o emulsionadores para formar una emulsión de aceite en agua que tiene un aspecto uniforme y un tamaño medio de gota de aproximadamente 0.5 pm. Para este fin puede usarse cualquier homogenizador o emulsionador comercial, por ejemplo emulsionador Ross (Hauppauge, NY), homogenizador Gaulin (Everett, MA).
La emulsión así formada se' somete después a microfluidización para llevar el tamaño de gota al intervalo submicrométrico. La microfluidización puede lograrse usando un microfluidizador comercial tal como el modelo de número 1 10Y disponible en Microfluidics, Newton, Mass; el modelo 30CD de Gaulin (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); y Rainnie Minilab tipo 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy Inc., Hudson, Wis.). Estos microfluidizadores operan forzando los fluidos a través de pequeñas aperturas a presión elevada, de tal forma que las dos corrientes de fluido interactúan a velocidades elevadas en una cámara de interacción para formar emulsiones con gotas de un tamaño submicrométrico. El tamaño de la gota puede determinarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, difracción por láser, usando instrumentos de medición disponibles en el mercado. El tamaño puede variar dependiendo del tipo de tensioactivo usado, la relación entre tensioactivo y aceite, la presión de trabajo, temperatura y similares. Los expertos en la técnica pueden determinar la combinación deseada de estos parámetros para obtener emulsiones con el tamaño de gota deseado sin experimentación excesiva. Las gotas de las emulsiones de la presente invención son inferiores a 1 pm de diámetro, preferiblemente con un tamaño medio de gota inferior a 0.8 pm, y más preferiblemente con un tamaño medio de gota inferior a 0.5 pm, e incluso más preferiblemente con un tamaño medio de gota inferior a 0.3 pm.
En una realización preferida de la presente invención, la solución oleaginosa de lecitina DRAKEOL, que está disponible en el mercado de Hydronics (Lincoln, NE) y contiene lecitina al 25% en aceite mineral ligero, se combina y mezcla con solución salina así como con los tensioactivos TWEEN® 80 y SPAN® 80 para formar una "solución de A PHIGEN® o "formulación de AMPHIGEN®". La solución de AMPHIGEN® se emulsiona después con un emulsionador Ross® (Hauppauge, NY 11788) aproximadamente a 3400 rpm para formar una emulsión de aceite en agua. Subsiguientemente la emulsión se hace pasar una vez a través de un Microfluidizador que trabaja a aproximadamente 3,102.5±3,447.5 kPa. La emulsión de aceite en agua microfluidizada tiene gotas de un tamaño inferior a 1 pm, con un tamaño medio de gota de aproximadamente 0.25 µ??.
Composiciones de vacuna que contienen antígenos incorporados en emulsiones submicrométricas de aceite en agua En otra realización, la presente invención proporciona composiciones de vacunas que contienen un antígeno(s) y una emulsión submicrométrica de aceite en agua descrita anteriormente. Estas composiciones de vacunas se caracterizan porque tienen un efecto inmunógeno potenciado y un aspecto físico mejorado (por ejemplo no se observa separación de fases después de un periodo de almacenamiento largo). Además, las composiciones de vacunas de la presente invención son seguras para la administración a animales.
De acuerdo con la presente invención, el antígeno puede combinarse con la emulsión de forma extrínseca o, preferiblemente, de forma intrínseca. El término "intrínsecamente" se refiere al procedimiento en el que el antígeno se combina con los componentes de la emulsión antes de la etapa de microfluidización. El término «extrínsecamente" se refiere al procedimiento en el que el antigeno se añade a la emulsión después de que la emulsión ha sido microfluidizada. El antígeno añadido de forma extrínseca puede ser antígeno libre o puede estar encapsuiado en micropartículas como se describe con más detalle a continuación. El término "antígeno" como se usa en la presente memoria se refiere a cualquier molécula, compuesto o composición que es inmunógeno en un animal y se Incluye en la composición de vacuna para provocar una respuesta inmunitaria protectora en el animal al que se administra la composición de vacuna. El termino "inmunógeno" como se usa en relación con un antígeno se refiere a la capacidad del antígeno de provocar una respuesta inmunitaria en un animal contra el antígeno. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria celular mediada primordialmente por linfocitos T citotóxicos, o una respuesta inmunitaria humoral mediada primordialmente por linfocitos T cooperadores, que a su vez activa linfocitos B que provocan la producción de anticuerpos. Una "respuesta inmunitaria protectora" se define como cualquier respuesta inmunitaria, ya sea respuesta inmunitaria mediada por anticuerpos o células, o ambos, que ocurre en el animal que previene o reduce de forma detectable la aparición o elimina o reduce de forma detectable la gravedad, o ralentiza de forma detectable la velocidad de progresión, del trastorno o enfermedad provocada por el antígeno o un patógeno que contiene el antígeno. Los antígenos que pueden incluirse en la composición de vacuna de la presente invención incluyen antígenos preparados a partir de bacterias patógenas tales como Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus pleuropneumonie, Pasteurella multocida, Manheimia hemolytica, Mycoplasma bovis, Mycoplasma galanacieum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium paratuberculosis, Clostridial spp., Streptococcus uberis, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Erysipelothrix rhusopathiae, Campylobacter spp., Fusobacterium necrophorum, Escherichia coli, Salmonella entérica serovars, Leptospira spp.; hongos patógenos tales como Candida; protozoos tales como Cryptosporidium parvum, Neospora canium, Toxoplasma gondii, Eimeria spp.; helmintos tales como Ostertagia, Cooperia, Haemonchus, Fasciola, ya sea en forma de una preparación de células enteras o parciales inactivadas o en forma de moléculas antígenas obtenidas por purificación convencional de proteínas, técnicas de ingeniería genética o síntesis química. Antígenos adicionales incluyen virus patógenos tales como virus del herpes bovino 1 , 3, 6, virus de diarrea vírica bovina (BVDV) tipos 1 y 2, virus de la pseudogripe bovina, virus sinticial respiratorio bovino, virus de leucosis bovino, virus de rinderpest, virus de la glosopeda, rabia, virus de la fiebre porcina, virus de la fiebre porcina africana, parvovirus porcino, virus PRRS, circovirus porcino, virus de la gripe, virus de enfermedad vesicular porcino, virus de fiebre de Techen, virus de pseudorrabia, ya sea en forma de una preparación de virus completos o parciales ¡nactivados, o en forma de moléculas antígenas obtenidas por purificación convencional de proteínas, técnicas de ingeniería genética o síntesis química. La cantidad del antigeno debe ser tal que el antigeno combinado con la emulsión de aceite en agua, sea efectivo para inducir una respuesta inmunitaria protectora en un animal. La cantidad precisa para que un antígeno sea efectivo depende de la naturaleza, actividad y pureza del antígeno y puede ser determinada por los expertos en la técnica. La cantidad de emulsión de aceite en agua presente en las composiciones de vacunas debe ser suficiente para potenciar la capacidad inmunógena del (de los) antígeno(s) en las -composiciones de vacunas. Cuando sea deseable y apropiado, pueden añadirse cantidades adicionales de tensioactivo(s) o tensioactivo(s) adicional(es) a la composición de vacuna además del (de los) tensioactivo(s) proporcionado(s) por la emulsión de aceite en agua. De forma general, el componente oleaginoso está presente en el volumen final de una composición de vacuna en una cantidad de 1.0% a 20% en volumen; preferiblemente en una cantidad de 1.0% a 10%; más preferiblemente en una cantidad de 2.0% a 5.0%. El tensioactivo, o la combinación de tensioactivos si se usan dos o más tensioactivos, está presente en el volumen final de una composición de vacuna en una cantidad de 0.1 % a 20% en volumen, preferiblemente 0.15% a 10%, más preferiblemente 0.2% a 6.0%. Además del (de los) antígeno(s) y la emulsión de aceite en agua, la composición de vacuna puede incluir otros componentes que son apropiados y deseables, tales como conservantes, agentes osmóticos, moléculas bioadhesivas y moléculas inmunoestimuladoras (por ejemplo Quil A, colesterol, GPI-0100, bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA)), como se describe anteriormente en relación con la emulsión de aceite en agua. Las composiciones de vacunas de la presente invención pueden incluir también un vehículo veterinariamente aceptable. El término "un vehículo veterinariamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, agentes estabilizadores, diluyentes, conservantes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes ¡sotónicos, agentes retardantes de la adsorción y similares. Los diluyentes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Agentes isotónicos pueden incluir cloruro sódico, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa entre otros. Estabilizadores incluyen albúmina entre otros. En una realización preferida, la presente invención proporciona una composición de vacuna que incluye al menos un antígeno de BVDV tipo I o BVDV tipo II, que se incorpora de forma intrínseca a una emulsión de aceite en agua que tiene gotas de un tamaño inferior a 1 µ?t?, preferiblemente con un tamaño medio de gota inferior a 0.8 pm, más preferiblemente inferior a 0.5 µ?t?, e incluso más preferiblemente con un tamaño medio de gota de aproximadamente 0.5 µp?. El antígeno de BVDV tipo I y/o II está preferiblemente en forma de una preparación vírica inactivada. La emulsión submicrométrica de aceite en agua preferiblemente está compuesta por una formulación de AMPHIGEN® (es decir, una formulación que contiene aceite mineral ligero, lecitina, TWEEN® 80 y SPAN® 80). La composición de vacuna preferiblemente incluye también Quil A, colesterol y timerosol. En otra realización preferida, la presente invención proporciona una composición de vacuna que incluye un antígeno de Leptospira y al menos un antígeno de BVDV tipo I o BVDV tipo II en una emulsión de aceite en agua. Los antígenos, preferiblemente en forma de preparación celular o vírica inactivada, se incorporan de forma intrínseca a la emulsión submicrométrica de aceite en agua que tiene gotas de un tamaño inferior a 1 pm; preferiblemente con un tamaño medio de gota inferior a 0.8 pm, más preferiblemente inferior a 0.5 pm, e incluso más preferiblemente con un tamaño medio de gota de aproximadamente 0.5 pm. La emulsión submicrométrica de aceite en agua preferiblemente está compuesta por una formulación de AMPHIGEN® (es decir, una formulación que contiene aceite mineral ligero, lecitina, TWEEN® 80 y SPAN® 80). La composición de vacuna preferiblemente incluye también una o más moléculas inmunoestimuladoras que se seleccionan de Quil-A, colesterol, DDA, GPI-100 e hidróxido de aluminio (AIOH).
En otra realización preferida más, la presente invención proporciona una composición de vacuna que incluye al menos un agente bacteriano, por ejemplo la proteína PauA de Streptococcus uberis recombinante o una preparación celular de E. coli o una combinación de ambas en una emulsión de aceite en agua. El (los) antígeno(s) se combina(n) de forma intrínseca con la emulsión submicrométrica de aceite en agua que tiene gotas de un tamaño inferior a 1 pm; preferiblemente con un tamaño medio de gota inferior a 0.8 pm, más preferiblemente inferior a 0.5 pm, e incluso más preferiblemente con un tamaño medio de gota de aproximadamente 0.25 pm. La emulsión submicrométrica de aceite en agua preferiblemente está compuesta por una formulación de A PHIGEN® (es decir, una formulación que contiene aceite mineral ligero, lecitina, TWEEN® 80 y SPAN® 80). La composición de vacuna preferiblemente incluye también una o más moléculas inmunoestimuladoras que se seleccionan de Quil-A, DDA, GPI-100. Las composiciones de vacunas de la presente invención pueden administrarse a un animal por vías conocidas, incluyendo la oral, intranasal, mucosa, tópica, transdérmica y parenteral (por ejemplo Intravenosa, intraperitoneal, ¡ntradérmica, subcutánea o intramuscular). La administración puede lograrse usando una combinación de vías, por ejemplo la primera administración usando una vía parenteral y una administración posterior usando una vía mucosa.
Procedimientos para preparar composiciones de vacunas En una realización adicional, la presente invención proporciona procedimientos para preparar composiciones de vacunas que contienen un antígeno o antígenos y una emulsión submicrométrica de aceite en agua. Para preparar las composiciones de vacunas de la presente invención, el (los) antígeno(s) puede(n) combinarse de forma intrínseca o de forma extrínseca con los componentes de la emulsión de aceite en agua. Preferiblemente, el antígeno se combina con los componentes de la emulsión de aceite en agua de forma intrínseca. El antígeno puede combinarse con los diversos componentes de la emulsión, incluyendo el aceite, uno o más tensioactivos, un componente acuoso y cualquier otro componente apropiado para formar una mezcla. La mezcla se somete a un procedimiento de mezclado primario típicamente pasando una o más veces a través de uno o más homogenizadores o emulsionadores para formar una emulsión de aceite en agua que contiene el antígeno. Puede usarse cualquier homogenizador o emulsionador comercial, por ejemplo emulsionador Ross (Hauppauge, NY), homogenizador Gaulin (Everett, MA) o Microfluidics (Newton, MA). De forma alternativa, los diversos componentes del adyuvante de la emulsión, incluyendo aceite, uno o más tensioactivos y un componente acuoso pueden combinarse primero para formar una emulsión submicrométrica de aceite en agua usando un homogenizador o emulsionador; y el antígeno se añade después a esta emulsión. El tamaño medio de gota de la emulsión de aceite en agua después del mezclado primario es de aproximadamente 1.0-1.2 mieras. La emulsión que contiene el antígeno se somete después a microfluidización para llevar el tamaño de gota al intervalo submicrométrico. La microfluidización puede lograrse usando un microfluidizador comercial tal como el modelo de número 0Y disponible en Microfiuidics, Newton, Mass; el modelo 30CD de Gaulin (Gaulin, Inc., Everett, Mass.); y Rainnie Minilab tipo 8.30H (Miro Atomizer Food and Dairy Inc., Hudson, Wis.). El tamaño de la gota puede determinarse mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, difracción por láser, usando instrumentos de medición disponibles en el mercado. El tamaño puede variar dependiendo del tipo de tensioactivo usado, la relación entre tensioactivo y aceite, la presión de trabajo, temperatura y similares. Se puede determinar una combinación deseada de estos parámetros para obtener emulsiones con un tamaño de gota- deseado. Las gotas de aceite de las emulsiones de la presente invención son inferiores a 1 pm en diámetro. Preferiblemente el tamaño medio de gota es inferior a 0.8 pm. Más preferiblemente, el tamaño medio de gota es inferior a 0.5 pm. Incluso más preferiblemente, el tamaño medio de gota está aproximadamente entre 0.1 pm y 0.3 pm. En una realización preferida de la presente invención, la solución oleaginosa de lecitina DRAKEOL®, que contiene lecitina al 25% en aceite mineral ligero, se combina y mezcla con solución salina así como los tensioactivos TWEEN® 80 y SPAN® 80 para formar una mezcla que contiene aceite mineral ligero al 40%, TWEEN® 80 al 0,18% y SPAN® 80 al 0.08%. La mezcla se emulsiona después con un emulsionador Ross® (Hauppauge, NY 11788) aproximadamente a 3400 rpm para formar un producto de emulsión que se denomina también "formulación de A PHIGEN®" o "solución de AMPHIGEN®". Subsiguientemente, el (los) antigeno(s) deseado(s) se combina con la solución de AMPHIGEN® y cualesquiera otros componentes adecuados (por ejemplo moléculas inmunoestimuladoras) con ayuda de un emulsionador, por ejemplo, homogenizador Ross, para formar una emulsión de aceite en agua que contiene el (los) antigeno(s). Ésta emulsión se hace pasar una vez a través de un Microfluidizador que trabaja aproximadamente 68,950±3,447.5 kPa. La emulsión de aceite en agua microfluidizada tiene gotas de un tamaño inferior a 1 µ?t?, con un tamaño medio de gota de aproximadamente 0.25 µ?t?.
Composiciones de vacunas que contienen antígenos microencapsulados en una emulsión submlcrométrica de aceite en agua y procedimientos de preparación En otra realización más, la presente invención proporciona composiciones de vacunas que contienen un antígeno encapsulado en micropartículas (o "antígeno microencapsulado"), donde el antigeno microencapsulado se incorpora de forma extrínseca a una emulsión submicrométrica de aceite en agua descrita anteriormente.
Los procedimientos para absorber o atrapar antígenos en vehículos particulados son notorios en la técnica. Véase por ejemplo Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications (Justin Hanes, Masatoshi Chiba y Robert Langer. Polymer microspheres for vaccine delivery. En: Vaccine design. The subunit and adjuvant approach. Editores Michael F. Powell y Mark J. Newman, 1995 Plenum Press, Nueva York y Londres). Los vehículos particulados pueden presentar copias múltiples de un antígeno seleccionado al sistema inmunitario en un sujeto animal y promover la captura y retención de antígenos en nodulos linfáticos locales. Las partículas pueden ser fagocitadas por macrófagos y pueden potenciar la presentación de antígeno a través de la liberación de citocinas. También se han descrito en la técnica vehículos particulados e incluyen por ejemplo los que se derivan de polímeros de polimetilmetacrilato, así como los que se derivan de poli(lactídas) y poli(lactida-co-glucolidas), que se conocen como PLG. Los polímeros de polimetilmetacrilato no son biodegrádables mientras que las partículas de PLG pueden ser biodegrádables por hidrólisis aleatoria no enzimática de enlaces éster a ácidos láctico y glicólico que se excretan por rutas metabólicas normales. También se han usado microesferas biodegrádables para lograr la liberación controlada de vacunas. Por ejemplo puede lograrse una liberación continuada de antígeno durante un periodo prolongado. Dependiendo del peso molecular del polímero y la relación entre ácido láctico y glicólico en el polímero, un polímero de PLGA puede tener una velocidad de hidrólisis desde unos pocos días o semanas a varios meses o un año. Una liberación lenta controlada puede dar como resultado la formación de niveles elevados de anticuerpos similares a los que se observan tras inyecciones múltiples. De forma alternativa, puede lograrse una liberación pulsátil de antígenos de vacunas seleccionando polímeros con velocidades diferentes de hidrólisis. La velocidad de hidrólisis de un polímero típicamente depende del peso molecular del polímero y la relación entre ácido láctico y ácido glicólico en el polímero. Las micropartículas que están formadas por dos o más polímeros diferentes con velocidades variables de liberación de antígenos proporcionan liberaciones pulsátiles de antígenos e imitan los regímenes de vacunación de dosis múltiples. De acuerdo con la presente invención, un antígeno, incluyendo cualquiera de los que se describen anteriormente, puede absorberse sobre un vehículo polimérico particulado, preferiblemente un polímero de PLG, usando cualquier procedimiento conocido en la técnica (tal como el que se ejemplifica en el Ejemplo 17) para formar una preparación de antígeno microencapsulado. La preparación de antígeno microencapsulado se mezcla después y se dispersa en una emulsión submicrométrica de aceite en agua , emulsión que ha sido descrita anteriormente, para formar la composición de vacuna. En una realización preferida, la presente invención proporciona una composición de vacuna que contiene un antígeno encapsulado en un polímero de PLG, en el que el antígeno microencapsulado está disperso de forma extrínseca en una emulsión de aceite en agua microfluidizada que está compuesta por aceite mineral ligero, lecitina, TWEEN80, SPAN80 y solución salina y tiene un tamaño medio de gota inferior a 1.0 pm. A continuación están los ejemplos de realizaciones específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen únicamente con fines de ilustración y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención en modo alguno.
EJEMPLO 1 Preparación de una formulación de AMPHIGEN® Se preparó una formulación de AMPHIGEN® en un procedimiento de dos etapas. En la primera etapa se mezclaron 80 litros de solución de aceite de lecitina Drakeol, 116 litros de solución salina de Toxoide de ténanos, 1.2 litros de SPAN 80, y 2.8 litros de Tween 80 y se emulsionaron usando un emulsionador Ross. La solución de aceite de lecitina Drakeol contenía lecitina de soja al 25% y aceite mineral al 75%. El producto emulsionado se hizo recírcular por el emulsionador Ross durante un mínimo de 5 volúmenes o un mínimo de 10 minutos. El producto emulsionado se almacenó a 2-7°C durante un máximo de 24 horas para procesamiento adicional. La emulsión del tanque del emulsionador Ross se transfirió a un homogenízador Gaulin y se homogenizó durante 20 minutos a una presión de 31027.5 kPa. La solución de aceite de lecitina Drakeol al 40% (en lo sucesivo "formulación de AMPHIGEN®" o "solución de AMPHIGEN®") se dispensó después en envases de carboxi polipropileno estériles. El dispensado se realizó dentro de un embudo de dispensado de clase 100 localizado en un ambiente controlado de clase 10,000. Los envases se almacenaron a 2-7°C. Esta formulación de AMPHIGEN® se usó en los experimentos que se describen a continuación a no ser que se indique lo contrario.
EJEMPLO 2 Mezclado primario mediante homogenización por mezclado ultrarrápido de la vacuna contra BVD El aparato usado para este procedimiento de homogenización se muestra en la Figura 1. Usando técnica aséptica o válvulas de cruce de vapor, se unió un frasco que contenía un antígeno de BVD Tipo I (una preparación vírica de BVD tipo I inactivada) al puerto de la parte inferior del vaso de mezclado. Después de completar la transferencia del volumen requerido del antigeno de BVD Tipo I, se sustituyó el frasco de BVD Tipo I por el envase que contenía una preparación vírica de BVD Tipo II inactivada (una preparación vírica de BVD Tipo II inactivado). Después de completar la transferencia de la cantidad requerida de un antígeno de BVD Tipo II, se unió el homogenizador Ross al recipiente portátil y se inició la recirculación a RPM máximas (3300 rpm). La agitación del recipiente se mantuvo a velocidad media.
Usando técnica aséptica o válvulas de cruce de vapor, se unió un frasco que contenía Quil-A con una concentración de 50 mg/ml al homogenizador al puerto en línea del vaso de mezclado. Se pasó una cantidad requerida de la solución de Quil-A al recipiente a través de succión en línea. Después de completar la transferencia de solución de Quil-A, se retiró el frasco. Del mismo modo, se transfirió una cantidad requerida de colesterol en solución de etanol (18 mg/ml) al vaso de mezclado. Subsiguientemente, se añadieron al vaso de mezclado una cantidad requerida de la formulación de AMPHIGEN®, solución de timerosol al 10% y soluciones de dilución de medio de Eagle Modificado Básico ("BME"). Una vez se completaron las adiciones, se continuó mezclando durante otros 15 minutos. La formulación resultante se dividió en dosis alícuotas de 2 mi y representaba una vacuna de BVD con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidizada. Cada dosis de la vacuna contenía 500 pg de Quil-A, 500 pg de colesterol, formulación de AMPHIGEN® al 2,5% y timerosol al 0,009%. La concentración de antígeno para las dos cepas diferentes de BVD se determinó en términos de la valoración de ELISA para gp53.
EJEMPLO 3 Mezclado secundario por microfluidización La Figura 2 ilustra el procedimiento usado para la mezcla secundaria mediante microfluidización. El microfluidizador se esterilizó al vapor. Primero se instaló la cámara del módulo de procesamiento auxiliar en la unidad y se instaló la cámara del blanco en la segunda posición de la cámara. Se conectó el vaso que contenía la vacuna de BVD con todos los adyuvantes preparada como se describe en el Ejemplo 2 al microfluidizador uniendo una línea de transferencia desde la válvula de drenaje del vaso suministrador a la entrada del microfluidizador. Se conectó gas nitrógeno a la entrada del filtro de aire del vaso suministrador y se ajustó la presión de vaso a 138 +/- 34 kPa. La válvula de drenaje del vaso de recogida se conectó a la línea de transferencia de la salida del microfluidizador. Después de realizar todas las conexiones - necesarias, se abrieron las válvulas y se inició la microfluidización con una presión de trabajo de 68,950 +/- 3,447.5 kPa. El contenido completo de la vacuna se pasó a través del microfluidizador una vez y se recogió en la cámara post-microfluidización. Esta preparación se dividió en dosis alícuotas de 2 mi y representa la vacuna de BVD con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada.
EJEMPLO 4 Preparación de una composición de vacuna mediante mezclado en banco La formulación de AMPHIGEN® preparada como se describe en el ejemplo 1 se diluyó al 2.5% añadiendo antígenos de BVD y el extensor. La solución resultante se mezcló en el banco usando una barra de agitación en lugar de un homogenizador. La preparación final contenía la siguiente composición: antígenos de BVD Tipo 1 y Tipo 2, formulación de AMPHIGEN® al 2.5% (que contiene aceite, lecitina, SPAN® y TWEEN®, como se describe en el Ejemplo 1) y solución salina. TWEEN 80 y SPAN 80 están presentes en la preparación de vacuna final a 0.18% y 0.08% en volumen respectivamente.
EJEMPLO 5 Comparación de una distribución de tamaño de gotas entre las preparaciones de vacunas con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada y no microfluidizada Se usaron la vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidizada preparada como se describe en el Ejemplo 2, la vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada preparada como se describe en el Ejemplo 3 y la preparación preparada por mezcla en banco como se describe en el Ejemplo 4 para comparar el tamaño de gota de las preparaciones de vacunas. Se añadieron 2 mi de la muestra de cada una de las preparaciones a un difractómetro malvem 2000 Láser y se determinó la distribución del tamaño de gota. Como se muestra en la Figura 3, los resultados indican que la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada tenía el volumen de partícula máximo alrededor de 0.1 mieras mientras que la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidizada tenía el volumen máximo de distribución de partículas alrededor de 1 miera.
EJEMPLO 6 Reducción en la separación de fases de la vacuna.
Se compararon tres preparaciones de vacuna diferentes: la vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidizada preparada como -se describe en el Ejemplo 2, la vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada preparada como se describe en el Ejemplo 3 y la vacuna preparada por mezcla en banco como se describe en el Ejemplo 4, para determinar sus propiedades de separación de fases después de almacenamiento prolongado. Todas estas preparaciones se dejaron reposar a 4°C durante aproximadamente un mes y la separación de fases se controló en términos de aparición de una capa cremosa en la parte superior de las preparaciones de vacunas. Como se muestra en la Figura 4, no se produjo separación de fases en la preparación con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada cuando se comparó con las otras dos preparaciones.
EJEMPLO 7 Preparación de vacuna para ganado vacuno microfluidizada y no microfluidizada contra el virus de la diarrea vírica bovino Se incorporó de forma intrínseca el antígeno vírico del virus de la diarrea bovino a la formulación de AMPHIGEN® mediante microfluidlzación. El término Incorporado de forma intrínseca" se refiere al procedimiento por el cual se añadió el antígeno a la formulación de AMPHIGEN® antes de la microfluidlzación. El antigeno se sometió a las fuerzas físicas del procedimiento de microfluidización junto con los componentes de la formulación de adyuvante. En el grupo control no microfluidizado, la preparación de -antigeno se dispersó en la formulación de AMPHIGEN® mediante mezclado. La composición final de las preparaciones control y microfluidizada era la siguiente: BVD tipo I con una valoración ELISA tras la inactivación de 2535 UR/dosis para gp53, BVD Tipo II con una valoración ELISA tras la inactivación de 3290 UR/dosis para gp53, Quil-A con la concentración de 1.25 mg/dosís, cofesterol con una concentración de 1.25 mg/dosis, la formulación de AMPHIGEN® con una concentración final de 2.5% y timerosol con una concentración final de 0.009%. La dosis de la vacuna era de 5 mi.
EJEMPLO 8 Estabilidad a largo plazo de antíqenos víricos de BVD incorporados de forma intrínseca en la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada Este experimento se realizó para determinar la estabilidad del antigeno incorporado de forma intrínseca durante el almacenamiento a largo plazo. Se incorporó de forma intrínseca el antigeno vírico de BVD Tipo II inactivado en la formación AMPHIGEN® durante el procedimiento de microfluidización para obtener una preparación de vacuna microfluidizada (A907505). Otras tres preparaciones de vacunas que contenían el mismo antígeno en una formulación de AMPHIGEN® no microfluidizada (A904369, A904370 y A904371 ) sirvió como control. En las preparaciones no microfluidizadas, el antigeno se mezcló con formulación de AMPHIGEN® y se mezcló usando un homogenizador Ross. Las cuatro preparaciones de vacunas se almacenaron a 4°C durante dos años. En momentos diferentes durante el almacenamiento (0, 6, 12 o 24 meses) se usaron las cuatro formulaciones para vacunar vacas de tres meses de edad. Los días 0 y 21 se vacunaron vacas de tres meses de edad por vía subcutánea con una formulación de vacuna de 2 mi. El suero de los animales vacunados se extrajo el día 35 y se midió la respuesta serológica a la vacuna en términos de la valoración de anticuerpo mediante un ensayo ELISA de BVDV-E2. Como se muestra en la Figura 5, la preparación de vacuna microfluidizada mostró una valoración de anticuerpos más elevada en todos los tiempos analizados (0, 6, 12 y 24 meses), sugiriendo que no se pierde la estabilidad de la preparación de antígeno durante la incorporación intrínseca del antígeno durante el procedimiento de microfluidización. Además, se encontró también de forma sorprendente que la preparación de vacuna microfluidizada indujo una respuesta inmunitaria potenciada en todos los tiempos.
EJEMPLO 9 Reducción del aumento de temperatura rectal inducida por la vacuna después de la microfluidización Se usaron las preparaciones de vacunas microfluidizada y no microfluidizada como se describe en el Ejemplo 7 para vacunar el ganado vacuno el día cero y se controló la temperatura rectal durante el período desde un día antes de la vacunación hasta cuatro días después de la vacunación. La dosis de la vacuna era de 2 mi. Los grupos se vacunaron con una dosis única o doble de la vacuna. Se midieron las temperaturas rectales y se registraron diariamente desde el Día 1 hasta el Día 4 inclusive. Se midieron las temperaturas réctales el día O antes de la administración del artículo de experimentación. Como se muestra en la Figura 6, los resultados indican que se dio un aumento brusco en la temperatura rectal aproximadamente en las 24 horas después de la vacunación en los animales vacunados con una dosis única o doble de la formulación de vacuna no microfluidizada. Sin embargo, en los animales vacunados con formas microfluidizadas de la vacuna, el aumento de la temperatura rectal tras la vacunación fue mínima y significativa mente menor que en los animales vacunados con la formulación no microfluidizada (Figura 6).
EJEMPLO 10 El volumen de reacción en el sitio de la inyección se resolvió más rápido cuando se vacunó con formulaciones de vacunas microfluidizadas Se usaron las preparaciones de vacunas microfluidizadas y no microfluidizadas preparadas como se describe en el Ejemplo 7 para vacunar el ganado vacuno el día cero. Los animales incluidos en este estudio eran ganado vacuno de carne híbridos. Había tres animales en cada uno de los grupos de tratamiento con placebo (T01 y T02). Había seis animales en cada uno de los grupos T03 a T06. La dosis de vacuna era de 2 mi y los grupos se vacunaron con una o dos dosis de la vacuna el día cero. En día 0, se administró el artículo de experimentación en el lado derecho del cuello. Los animales que recibieron la dosis doble (4 mi) del articulo de experimentación (T02, T04 y T06) recibieron la dosis doble completa en forma de inyección única en un lado. La observación de los sitios de inyección, incluyendo la estimación del tamaño de reacción en el sitio de inyección se realizó en el lado derecho del cuello del Día 0 al Día 4 inclusive, y los Días 6, 9 y 14. El Día 0 se observaron los sitios de inyección antes de la administración de ¡os artículos de experimentación. Los grupos vacunados con una o dos dosis del placebo no mostraron aumento significativo del volumen de reacción en el sitio de inyección y por lo tanto esos datos no se muestran en la Figura 7. En el caso de la formulación de vacuna no microfluidizada, se dio un aumento proporciona¡ del volumen de reacción en el sitio de inyección entre la vacunación con una dosis y la de dos dosis. Por otra parte, en el caso de la formulación de vacuna microfluidizada, aunque la dosis única indujo un volumen de reacción en el sitio de inyección mayor, la inyección con la segunda dosis no provocó un aumento mayor. Sin embargo, en el caso de los animales a los que se inyectó formulación de vacuna microfluidizada, el volumen de reacción en el sitio de inyección se resolvió con una velocidad mayor cuando se comparó con el de los animales inyectados con una formulación de vacuna no microfluidizada. Estos resultados se muestran en la Figura 7.
EJEMPLO 11 Preparación de preparaciones de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada con antí enos víricos BVD y Leptospira incorporados de forma intrínseca y moléculas inmunoestlmuladoras tales como Quil A y PDA Se formuló Leptospira de la cepa hardjo-bovi CSL inactivado en formalina en el adyuvante apropiado con recuentos directos de aproximadamente 1.4 x 109 organismos/dosis de 5 mi. La cepa de Leptospira Pomna T262 inactivada en formalina se formuló a aproximadamente 2400 Unidades nefalómeras/dosis de 5 mi. Las unidades nefalómeras se calcularon basándose en la medición nefalométrica de fluido de fermentación procesado previamente. El virus BVD Tipo 1 se formuló con una valoración de Elisa E2 de aproximadamente 3000 Unidades relativas/dosis de 5 mi. El virus BVD Tipo 2 se formuló con una valoración por ELISA E2 de aproximadamente 3500 Unidades relativas/dosis de 5 mi. La unidad relativa se calculó basándose en la valoración por ELISA E2 de fluido volumétrico tras la inactivación antes del ensamblado. Se usaron tanto Quil-A como colesterol con una concentración de 0.5 mg por dosis. Se usaron timerosol y la formulación de AMPHIGEN® con la concentración final de 0.009% y 2.5% respectivamente. Se usó hidróxido de aluminio (Rehydragel Lv) con una concentración final de 2.0%. Cuando se usó DDA como inmunomodulador, DDA se incluyó en la formulación de AMPHIGEN®. La formulación de AMPHIGEN® (es decir, la solución madre de Drakeol-lecitina al 40%) contenía 1.6 mg/ml de DDA y, cuando se diluía de forma apropiada, la preparación de vacuna final contenía 2.5% de formulación de AMPHIGEN® y 0.1 mg/ml de DDA. En la preparación de diferentes formulaciones de vacunas se añadieron fracciones de BVD, Leptos, Quil-A, colesterol, timerosol, la formulación de AMPHIGEN® y solución salina como un agente extensor a un homogenizador Silverson y se mezcló durante 15 minutos a 10,000 ± 500 rpm. Después se microfluidizaron los componentes con un tamiz de 200 mieras a 68.950 kPa. Cuando la formulación de la vacuna contenía hidróxido de aluminio, la microfluidicación se llevó a cabo sin hidróxido de aluminio. Cuando se completó la microfluidización, se añadió hidróxido de aluminio y se mezcló con una barra de agitación hasta la mañana siguiente a 4°C.
EJEMPLO 12 Preparación de vacuna de virus BVD para estudios de exposición La preparación de vacuna que se usó en este experimento contenía antígenos del virus BVD Tipo 1 y el virus BVD Tipo 2. Se usó antígeno BVD 1-5960 con una valoración después de inactivación por ELISA de 2535 UR/dosis para gp53. Se usó el antígeno BVD2-890 con una valoración después de inactivación por ELISA de 3290 UR/dosis para gp53. Se usaron Quil-A y colesterol a la concentración de 0.5 mg/ml. Se usaron timersol y la formulación de AMPHIGEN® con una concentración final de 0.009% y 2.5% respectivamente. Cuando se uso DDA como inmunomodulador, DDA se incluyó en la formulación de AMPHIGEN®. La solución madre de AMPHIGEN® (solución de Drakeol-lecitina al 40%) contenía cantidades variables de DDA y, cuando se diluía de forma adecuada, la preparación final de vacuna contenía 2.5% de formulación de AMPHIGEN® y concentraciones de DDA que variaban en el intervalo de 0.5 mg/dosis a 2.0 mg/dosis. Se usó gel de aluminio (Rehydragel-LV) con una concentración final de 2%. Se usó GPI-0100 en el intervalo de 2, 3 y 5 mg/dosis. Todos los componentes se añadieron a un homogenizador Silverson y se mezclaron durante 15 minutos a 10,500 rpm y después se microfluidizaron pasando por una cámara de 200 mieras con 68,950 kPa. Cuando la preparación de la vacuna contenía hidróxido de aluminio, la microfluidización se llevó a cabo sin hidróxido de aluminio. Cuando se completó la microfluidización, se añadió hidróxido de aluminio y se mezcló con una barra de agitación hasta la mañana siguiente a 4°C.
EJEMPLO 13 Protección contra exposición a Leptospira después de vacunación con una formulación microfluidizada de vacuna con Amphigen con antfqenos de Leptospira CUADRO 1 Grupos de tratamiento El Cuadro 1 muestra la composición de las formulaciones de •adyuvante en las preparaciones de vacunas experimentadas en este estudio. Las preparaciones de vacunas se prepararon como se describe en el Ejemplo 1 1. Había seis animales en cada grupo. En este estudio se usaron novillos de carne híbridos de aproximadamente siete meses de edad. La vacunación se realizó el Día 0 y el Día 21 por vía subcutánea con un volumen de vacuna de 5 mi. La exposición se realizó con L. Hardjo-bovis cepa 203 de NADC (Nacional Agricultural Disease Center). La exposición se realizó durante los días 57-59 con un inoculo de 1 mi. La exposición se administró de forma conjunta ocular y por vía vaginal. El material de exposición contenía 5.0 x 106 unidades de leptospira/ml. La orina se recogió semanalmente para realizar un cultivo de Iepto, FA y PCR. La recogida de los ríñones se realizó durante los días 112 y 113.
CUADRO 2 Resultados del estudio de exposición a Leptospira El Cuadro 2 muestra los datos del estudio de exposición a Leptospira. Para determinar el porcentaje de infección por Leptospira en el animal expuesto, se usaron los siguientes criterios. Si el cultivo de riñon era positivo sólo en una muestra, se considera que el animal es Leptospira positivo. Si un animal es positivo sólo en una muestra para FA o PCR, se considera que el animal es negativo. Si la muestra es positiva para FA y PCR sólo en una muestra, se considera que es Leptospira positivo.
Los resultados que se muestran en el Cuadro 2 indican que la duración de la eliminación urinaria en todos los grupos vacunados fue significativamente más corta basándose en los tres ensayos. En lo que se refiere a la colonización urinaria y renal, las eficacias de las formulaciones que contenían QAC y DDA sin AlOH fueron comparables. AlOH no mejoró e incluso redujo las eficacias de las vacunas que contenían QAC o DDA en este estudio de exposición.
CUADRO 3 intervalo de valoración de aglutinación microscópica el día de valoración media geométrica máxima antes de la exposición (Día 35) Se detectaron respuestas serológicas contra ambos antígenos de Leptospira de la formulación de vacuna en los animales vacunados y la respuesta máxima se notó el Día 35. No existió correlación entre la respuesta serológica y la protección contra la exposición. La presencia de gel de aluminio en la formulación de vacuna redujo el nivel de protección aunque potenció la respuesta serológica por la presencia de gel de aluminio en la vacuna.
EJEMPLO 14 Provocación de respuesta ¡nmunítaria al antígeno vírico de BVD y Protección contra la exposición al virus BVD Tipo 2 tras la inmunización con una preparación de vacuna microflu id izada que contiene formulación de AMPHIGEN® v PDA.
En este experimento se usaron terneras seronegativas de cuatro a siete meses de edad. Había seis grupos diferentes y cada grupo tenía diez animales (Cuadro 4). El Día 0 y el Día 21 cada animal recibió una dosis subcutánea de 2 mi de la vacuna o placebo en el lado del cuello aproximadamente a medio camino entre la escápula y la cabeza.
CUADRO 4 Grupos de tratamiento Se administró una dosis de 5 mi de preparación de exposición del virus (aproximadamente 2.5 mi por fosa) por vía intranasal el día 44 del estudio. En este estudio se usó virus BVD Tipo 2, cepa aislada n° 24515 (Cepa Ellis), lote n° 46325-70 no citopático como cepa de exposición. Se valoraron muestras retenidas de material de exposición (dos copias por valoración) en el momento del inicio de la exposición e inmediatamente después de completado. La valoración de virus vivos media por dosis de 5 mi era de 5.3 log™ DIAF50/5 mi antes de la exposición y 5.4 logio DIAF50/5 mi después de la exposición (DIAF es equivalente a DICT50). Se controló a los animales todos los días desde el Día 3 al día 58. Se asignaron puntuaciones de enfermedad clínica de 0, 1 , 2, o 3 basándose en los signos clínicos atribuibles a la infección por BVD 2 para cada animal los Días 42 a 58. Las puntuaciones del Día 44 se registraron antes de la exposición. Se extrajeron muestras de sangre (dos tubos de separación de suero de 13 mi, SST) de cada animal los Días 0, 21 , 35. 44 y 58 para determinar las valoraciones en suero de anticuerpos de neutralización de los virus BVD Tipo 1 y BVD tipo 2. Se extrajeron muestras de sangre de cada animal, del Día 42 al Día 58, inclusive, y se determino la presencia de virus BVD en la capa leucocitaria. El Día 44 se obtuvieron muestras antes de la exposición. Se extrajeron de cada animal muestras de sangre (un tubo de EDTA de 4 mi) para determinar la leucocitometría el Día 42 al Día 58, inclusive. El Día 44 se obtuvieron muestras antes de la exposición. Leucopenia se definió como un descenso del 40% o mayor de la leucocitometría desde el nivel inicial (leucocitometría anterior a la exposición media de dos días anteriores y del día de la exposición).
Se usaron las puntuaciones de enfermedad clínica para definir el estado de enfermedad de la forma siguiente; si la puntuación es 1 , entonces enfermedad = no; si la puntuación es > 2, entonces enfermedad = si. Como se muestra en los Cuadros 5 y 6, los grupos que se vacunaban con vacunas que contenían antígenos víricos de BVD junto con la formulación de AMPHIGEN®, Quil A o DDA y microfluidizadas, se seroconvirtieron con valoraciones de neutralización de virus en suero significativas para los virus BVD Tipo 1 y BVD Tipo 2. En esos grupos hubo también una reducción significativa del porcentaje de animales que mostraban viremia después de la exposición, mientras que en el grupo de control 100% de los animales mostraban viremia (Cuadro 7). Además, en los grupos vacunados la frecuencia de la enfermedad se redujo también de forma significativa (Cuadro 8). De forma similar, el porcentaje de animales que mostraban leucopenia se redujo también en los grupos vacunados y la reducción de la leucopenia fue más significativa en el grupo que contenía DDA que en el grupo que contenía Quil A (Cuadro 9). En el grupo de control se dio un descenso significativo de la subida de peso comparado con los grupos vacunados. (Cuadro 10).
Serología Antes de la vacunación el Día 0, todos los animales del estudio eran seronegativos (SVN < 1 :2) para anticuerpos contra virus de BVD Tipos 1 y 2 (no se muestran los datos). Catorce días después de la segunda vacunación (Día 35) todos los animales a los que se administró placebo (T01 ) seguían siendo seronegativos para anticuerpos contra el virus BVD Tipos 1 y 2; y los animales vacunados con los ITA (Antígeno en experimentación de investigación) (T02, T03, T04, T05 y T06) eran seropositivos (SVN 1 :8) para anticuerpos contra el virus BVD, Tipos 1 y 2. Un animal al que se administró la vacuna con adyuvante de formulación de AMPHIGEN® a 2 mg/dosis de DDA tenía una valoración de SVN de 3 para anticuerpos contra el virus BVD Tipo 2 el Día 35 (Cuadro 1 1 y 12). Antes de la exposición el Día 44, todos los controles (T01 ) excepto uno, eran seronegativos (SVN <1 :2) para anticuerpos contra el virus BVD Tipos 1 y 2 (no se muestran datos). Uno de los controles (n° 2497) era seropostivo (SVN = 10) para anticuerpos contra el virus BVD Tipo 1 y seronegativo para anticuerpos contra el virus BVD Tipo 2. Catorce días después de la exposición, todos los animales del estudio eran seropostivos para anticuerpos contra el virus BVD Tipos 1 y 2.
CUADRO 5 Media geométrica de las valoraciones de neutralización en suero de virus BVD Tipo 1 CUADRO 6 Media geométrica de las valoraciones de neutralización en suero de virus BVD Tipo 2 Tratamiento Media g eométrica de valoraciones de ¡ 3VN contra el virus BVD Tipo 1 en el Día del estud io 0 21 35 44 58 T01 Solución salina <2 <2 <2 <2 522.0 T02 Amphigen, <2 8.9 2272.4 2048.2 24833.6 Quil A T03 Amphigen, <2 9.5 3565.7 2702.2 20881.8 0.5 mg de DDA, Al T04 Amphigen, <2 4.1 1260.7 989.1 18496.2 0.5 mg de DDA 1 T05 Amphigen, <2 6.4 1398.8 1453.9 30047.8 1.0 mg de DDA T06 Amphigen, <2 7.7 1673.2 1428.9 16384.0 2.0 mg de DDA CUADRO 7 Aislamiento de virus BVD después de la exposición CUADRO 8 Signos clínicos de enfermedad por BVD después de la exposición CUADRO 9 Leucopenia tras la exposición CUADRO 10 Peso corporal y subida de peso corporal durante el estudio Aislamiento de virus Como muestran los datos en el Cuadro 13, durante el periodo de exposición (Días 44 a 58), los diez animales del grupo control (T01 ) sufrían viremia (se aislo virus BVD uno o más días). En los grupos a los que se había administrado ITA, la frecuencia de los animales con viremia era uno, cero, tres, dos y dos en cada grupo de diez (T02, T03, T04, T05 y T06, respectivamente). La diferencia entre el control y los grupos a los que se había administrado los ITA era estadística mente significativa (P 0.05). La media por mínimos del número de días de viremia era también significativamente mayor (10.4 días) para el control comparado con los grupos a los que se había administrado los ITA (0.0 a 0.5 días).
Enfermedad Clínica Se consideraba que los animales con puntuaciones de señales clínicas de 2 o 3 demostraban signos de enfermedad por BVD. Como se muestra en el Cuadro 14, la frecuencia de los animales con signos clínicos de enfermedad por virus BVD era nueve de diez en el control (T01) y uno, dos, cero, cero y cero de diez en cada uno de los grupos a los que se administraron los ITA (T02, T03, T04, T05 y T06 respectivamente). La diferencia entre el control y los grupos a los que se administraron los ITA era estadísticamente significativa (P 0,05).
Leucopenia Como se muestra en el Cuadro 15, durante el periodo de exposición (Días 44 a 58), los diez animales del control (T01 ) sufrían leucemia (una reducción del 40% en la leucocitometría comparada con la inicial antes de la exposición, Días 42-44). La frecuencia de animales con leucemia era seis, dos, cuatro, tres y dos de los diez animales de cada uno de los grupos a los que se administraron los ITA (T02, T03, T04, T05 y T06 respectivamente). La diferencia entre el control y los grupos a los que se administró la vacuna que tenía la formulación de AMPHIGEN® como adyuvante a 0.5 mg/dosis e hidróxido de aluminio (T03) era estadísticamente significativa (P 0.05). La media por mínimos cuadrados del número de días de leucemia era significativa mente mayor (7.8 días) para el control comparado con los grupos a los que se administraron los ITA (0.2 a 1.2 días).
EJEMPLO 15 Provocación de respuesta inmunitaria al antíqeno vírico de BVD y Protección contra la exposición al virus BVD Tipo 2 tras la inmunización con una formulación de vacuna microfluidizada que contiene GPI-0100.
Se siguió un grupo de condiciones experimentales como se describe en el Ejemplo 14 y se realizó una comparación directa entre Quil A y GPI-0100. Como se muestra en los Cuadros 1 1 y 12, los animales vacunados con antígenos de BVD en la preparación de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada que contenía Qu¡l-A o GPI-0100 tenía una valoración de anticuerpos significativa para los virus BVD Tipo 1 y BVD Tipo 2. La valoración de anticuerpos para el virus BVD Tipo 1 era muy superior a la de virus BVD Tipo 2. Sin embargo, la exposición subsiguiente a virus BVD Tipo 2 demostró una fuerte protección y se redujo significativamente la incidencia de la enfermedad en las terneras vacunadas con la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada que contenía GPI-0100.
CUADRO 11 Media geométrica de las valoraciones de neutralización en suero de virus BVD Tipo 1 Tratamiento Media geométrica de valoraciones de SVN 0 21 35 43 57 T01 Solución salina <2 <2 <2 <2 35.5 T02 Amphigen, <2 98.7 20171.0 12203.4 44762.4 Quil A T03 Amphigen, <2 84.6 10998.5 7383.2 25709.2 2 mg de GPI- 0100 AIOH T04 Amphigen, <2 106.0 18179.2 8933.2 28526.2 2 mg de GPI- 0100 T05 Amphigen, <2 62.9 15024.3 8780.1 19824.4 3 mg de GPI- 0100 T06 Amphigen, <2 71.1 12203.3 7512.0 16670.2 5 mg de GPI- 0100 CUADRO 12 Media geométrica de las valoraciones de neutralización en suero de virus BVD Ti o 2 CUADRO 13 Aislamiento de virus BVD después de la exposición CUADRO 14 Signos clínicos de enfermedad por BVD después de la exposición CUADRO 15 Leucopenia tras la exposición Tratamiento Leucopenia Frecuencia (%) de Media por MC de animales leucopénicos Días de leucopenia T01 Solución salina 9/10(90.0) 8.7 T02 Quil A 6/10(60.0) 1.6 T03 2 mg de GPI-0100 7/10(70.0) 2.6 AIOH T04 2 mg de GPI-0100 4/10(40.0) 1.5 T05 3 mg de GPI-0100 7/10(70.0) 2.6 T06 5 mg de GPI-0100 8/10(80.0) 2.9 En conclusión, se demostró la seguridad de cada vacuna por la ausencia de reacciones adversas de mortandad en los animales vacunados. La potencia de cada vacuna se demostró por seroconversión (valoraciones de anticuerpos de SVN contra BVD-1 y BVD-2 >1 :8) en 100% de los animales vacunados. Se demostró la resistencia satisfactoria a la exposición por la vacuna con 2 mg de GPI-0 00 sólo como adyuvante.
EJEMPLO 16 Preparación de vacuna que contiene antíqeno microencapsulado en emulsión microfluidizada de aceite en agua Se añadieron tres gramos de Trehalosa (Fluka) a agua para obtener una solución madre de 333 mg/ml de solución de Trehalosa. Se añadió antígeno PauA recombinante solubilizado en solución de SDS al 0.8% (SDS/rPauA) a la solución de Trehalosa para obtener una concentración final de 494 pg de rPauA/ml. En la siguiente etapa se disolvieron 10 gramos de ácido politactidaglicólico (PLG-Resomer RE 503H, Boeringher Ingelheim) en 200 mi de cloruro de metileno (MeCI2). La solución resultante de PLG/MeCI2 se combinó con la solución de SDS-rPauA/trehalosa preparada en la primera etapa. La solución combinada se sometió a microfluidización usando Microfluidizador (de Microfluidics Modelo M1 10EH) y la preparación microfluidizada se desecó por pulverización usando un secador por pulverización Temco Modelo SD-5). El material desecado por pulverización se recogió usando un tamiz de 500 mieras. La concentración de rPauA en este material desecado por pulverización se cuantificó usando un análisis por transferencia Western. Se disolvió 1.04 mg de material desecado por pulverización en 50 pl de acetona y se centrifugó a 13,200 rpm a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se separó el sobrenadante. Las fracciones de sobrenadante y de sedimento se secaron en una campana de seguridad biológica durante 2,5 horas. Se resuspendió el sedimento en 47.43 µ? de solución de muestra (25 µ? de tampón de muestra + 10 µ? de agente reductor + 65 µ? de agua). La fracción de sobrenadante desecado se resuspendió con 20 µ? de solución de muestra. En el análisis Western se usó PauA purificado como patrón para cuantificar el contenido de rPauA del material desecado por pulverización. Se preparó una solución madre de manitol al 20% disolviendo 100 gramos de manitol (Sigma) en 500 mi de agua para inyectables (WFI). La solución se calentó a 40°C con placa calefactora/agitador y se enfrió a 30°C. La solución se esterilizó por filtración con un filtro estéril de 0.22 mieras (Millipore). Se preparó una solución de carboximetilcelulosa al 2.5% disolviendo 12.5 gramos de carboximetilcelulosa (Sigma) en 500 mi de WFI y se mezcló hasta la mañana siguiente a 4°C. La solución se sometió a autoclave a 121 °C. El polvo resultante de la desecación por pulverización se reconstituyó en una solución que contenía manitol al 5%, carboximetilcelulosa. al 0.3% y timerosol 1 :5000. La solución final se dividió en alícuotas en viales de 3 mi y se liofilizó usando un Lyophilizer (USIFROID). El polvo liofilizado representa el rPauA microencapsulado. El antígeno de subunídad proteica microencapsulado se resuspendió en 2 mi de emulsión de aceite en agua microfluidizada que contenía una formulación de AMPHIGEN® (tal como la emulsión microfluidizada que se describe en el Ejemplo 20) y que se usa como vacuna.
EJEMPLO 17 Preparación de una formulación de vacuna microfluidizada que contiene antígeno bacteriano de células enteras y antígeno de proteína recombinante en emulsión de aceite en agua Se prepararon dos preparaciones de vacunas que contenían proteína PauA de Streptococcus uberis recombinante y células bacterianas de Escherichia coli, se añadieron de forma intrínseca a emulsiones de aceite en agua como se describe en los Ejemplos 2 y 3. El antígeno PauA recombinante estaba en una concentración de 100 pg por dosis y las células de E. coli daban un recuento final de 4 x 109 por dosis. Las composiciones de adyuvantes en emulsión de las dos formulaciones de vacuna se muestran en el Cuadro 16.
CUADRO 16 Formulaciones de vacunas que contienen tanto proteína recombinante como células enteras de E. coli EJEMPLO 18 Respuesta inmunitaria a vacuna microfluidizada que contiene rPauA y agentes bacterianos de células enteras en emulsión de aceite en agua En este experimento se usaron vacas lecheras maduras. Los animales estaban al final de su primera o segunda lactancia en el momento de la admisión. Se administraron por vía subcutánea 2 mi de cada formulación de vacuna tres veces, una en el momento de secado (D - 0), 28 días después (D = 28) y de nuevo 4 a 10 días después del parto (C + 4 - C+10). La primera y tercera dosis se administraron en el lado izquierdo del cuello y la segunda se administró en el lado derecho del cuello. Se extrajo sangre antes de cada vacunación y aproximadamente 14 días y 32 días después de la tercera vacunación. La valoración de anticuerpos para E. coli y el antígeno rPauA se determinaron mediante ELISA. Como se muestra en la Figura 8, los resultados indican que la valoración de anticuerpos para rPauA era superior en el grupo vacunado con la formulación de vacuna que contiene GPl-0100 como ¡nmunoestimulante y era máxima el día 70 después de la vacunación inicial. La valoración de anticuerpos para antígeno contra E. coli se muestra en la Figura 9. La valoración de anticuerpos contra antígeno de E. coli era comparable en ambas formulaciones de vacunas, aunque la presencia de GPl-0100 como inmunoestimulante indujo una valoración de anticuerpos relativamente mayor comparada con la formulación con DDA como inmunoestimulante.
EJEMPLO 19 Análisis de actividad viricida de las preparaciones de vacunas con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada Para determinar si la microfluidización inactiva el virus, se determinó la actividad viricida de tres preparaciones de vacunas con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada. Las tres preparaciones contenían tres virus infecciosos bovinos diferentes, específicamente virus del herpes bovino (BHV), virus de paragripe 3 (PI3), y virus sintial respiratorio bovino (BRSV). La detección de la actividad viricida de las tres preparaciones de vacunas se realizó de acuerdo con los requisitos de la USDA 9CFR-1 13,35.
Los resultados que se muestran en el Cuadro 17 indican que la microfluidización de las preparaciones de vacunas con base de formulación de AMPHIGEN® no provoca inactivación significativa de la preparación de vacuna.
CUADRO 17 Análisis de actividades viricídas de vacunas microfluidizadas A = colesterol añadido a 650 ml/minuto B = colesterol añadido a 28 ml/minuto C = colesterol añadido a 5 ml/minuto M200 = microfluidizada con tamiz de 200 mieras M75 = microfluidizada con tamiz de 75 mieras M75 a 37C = fluidos calentados a 37°C antes de microfluidización Un valor por encima de 0.7 es indicador de efecto viricida.
EJEMPLO 20 Preparación de una formulación de AMPHIGEN® microfluidizada Se preparó una formulación de AMPHIGEN® combinando solución de aceite de lecitina DRAKEOL (aceite mineral ligero con lecitina al 25%) y TWEEN 80 (con la concentración final de 0.18%) y Span 80 (con la concentración final de 0.08%) mezclando durante 8-22 horas a 36 ± 1 °C. La mezcla de aceite se añadió después a solución salina con ayuda de un emulsionador Ross® (Hauppauge, NY 11788) aproximadamente a 3400 rpm. Subsiguientemente la mezcla se pasó una vez por un microfluidizador con una cámara de interacción de 200 µ?? a 31 ,027.5 ± 3,447.5 kPa. Las Figuras 10A y 10B muestran la estabilidad de la formulación de AMPHIGEN® microfluidizada. La distribución del tamaño de partículas, medida por difracción de láser, en el momento inicial de partida (Figura 10A) era casi idéntico a la distribución de tamaño de partícula después de 22 meses de almacenamiento a 4°C (Figura 10B). Habiendo descrito la invención como antecede se declara como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES
1. Una emulsión submicrométrica de aceite en agua de utilidad como adyuvante de vacuna que comprende un aceite no metabolizable hidrocarburo ligero, un tensioactivo y un componente acuoso, en la que dicho aceite está disperso en dicho componente acuoso y el tamaño medio de gota de aceite es inferior a 1 pm.
2. La emulsión de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho aceite es aceite mineral ligero y está en una cantidad de 1 % a 50% v/v, dicho tensioactivo comprende lecitina y está en una cantidad de 0.01 % a 10% v/v, y en la que dicho aceite está disperso en dicho componente acuoso y el tamaño medio de gota de aceite está entre 0.1 µ?t? y 0.5 µ?t?.
3. Una emulsión submicrométrica de aceite en agua de utilidad como adyuvante de vacuna que comprende aproximadamente 40% v/v de aceite mineral, aproximadamente 10% p/v de lecitina, aproximadamente 0.18% v/v de TWEEN-80, aproximadamente 0.08% v/v de SPAN-80 y una fase acuosa, en la que dicho aceite está disperso en dicha fase acuosa y el tamaño medio de gota de aceite está entre 0.1 m y 0.5 µ??.
4. Un procedimiento para preparar una emulsión submicrométrica de aceite en agua que comprende: (a) preparar, una mezcla combinando un aceite no metabolizable hidrocarburo ligero, un tensioactivo y un componente acuoso; (b) someter dicha mezcla a un procedimiento de emulsificación primario para producir una emulsión de aceite en agua que tiene un tamaño medio de gota de aceite de 1.0 pm a 1.1 pm; y (c) someter la emulsión de aceite en agua preparada en (b) a microfluidización para producir dicha emulsión submicrométrica de aceite en agua, en el que la emulsión submicrométrica tiene un tamaño medio de gota de aceite inferior a 1 pm.
5. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque dicho aceite es aceite mineral ligero y está en una cantidad de 1 % a 50% v/v, dicho tensioactivo comprende lecitina y está en una cantidad de 0.01, % a 10% v/v y en el que dicho tamaño medio de gota de aceite de dicha emulsión submicrométrica está entre 0.1 pm y 0.5 pm.
6. Una composición de vacuna que comprende una emulsión de aceite en agua y un antígeno, en el que dicho antígeno está disperso en dicha emulsión, dicha emulsión comprende un aceite no metabolizable hidrocarburo ligero, un tensioactivo y un componente acuoso, y en la que dicho tamaño medio de gota de aceite de dicha emulsión es inferior a 1 pm.
7. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicho aceite es aceite mineral ligero y está en dicha composición de vacuna en una cantidad de 1 % a 20% v/v, dicho tensioactivo comprende lecitina y está presente en dicha composición de vacuna en una cantidad de 0.01 % a 10% v/v, y en la que dicho tamaño medio de gota de aceite está entre 0.1 pm y 0.5 pm.
8. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque dicho antígeno es un antígeno vírico o un antígeno bacteriano.
9. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dicho antígeno vírico comprende Virus de Diarrea Bovino Tipo 1 o Tipo 2 inactivado y en la que dicho antígeno bacteriano comprende al menos uno de una bacteria Leptospira inactivada, la proteína PauA de Streptococcus uberis recombínante o una preparación de células de E. coli.
10. Un procedimiento para preparar una composición de vacuna que comprende: (a) preparar una mezcla combinando un aceite no metabolizable hidrocarburo ligero, un tensioactivo y un componente acuoso; (b) añadir un antígeno a la mezcla formada en (a); (c) someter la mezcla que contiene dicho antígeno, que se forma en (b), a un procedimiento de emulsificación primario para producir una emulsión de aceite en agua que tiene un tamaño medio de gota de aceite de 1.0 pm a 1.1 pm; y (d) someter la emulsión preparada en (c) a microfluidización para producir dicha composición de vacuna, en el que la composición tiene un tamaño medio de gota de aceite inferior a 1 pm. 1 1. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho aceite es aceite mineral ligero y está presente en la composición de vacuna en una cantidad de 1 % a 20% v/v, dicho tensioactivo comprende lecitina y está presente en dicha composición de vacuna en una cantidad de 0.01 % a 10% v/v y en el que dicho tamaño medio de gota de aceite está entre 0.1 pm y 0.5 pm. 12. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque dicho antígeno es un antígeno vírico o un antígeno bacteriano. 13. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicho antígeno vírico comprende Virus de Diarrea Bovino Tipo 1 o Tipo 2 inactivado y en el que dicho antígeno bacteriano comprende al menos uno de una bacteria Leptospira inactivada, la proteína PauA de Streptococcus uberis recombinante o una preparación de células de E. coli. 14. Una composición de vacuna que comprende un antígeno microencapsulado y una emulsión de aceite en agua, en la que dicho antígeno microencapsulado está disperso en dicha emulsión, y dicha emulsión comprende un aceite no metabolízable hidrocarburo ligero, un tensioactivo y un componente acuoso, y en la que el tamaño medio de gota de aceite de dicha emulsión es inferior a 1 pm. 15. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada además porque dicho aceite es aceite mineral ligero y está presente en dicha composición de vacuna en una cantidad de 1.0% a 20% v/v, dicho tensioactivo comprende lecitina y está presente en dicha composición de vacuna en una cantidad de 0.01% a 10% v/v, dicho antígeno es un antígeno vírico o un antígeno bacteriano y. está encapsulado en un vehículo particulado, y en la que dicho vehículo comprende ácido polilactidaglicólico.
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Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7767216B2 (en) * 1999-04-28 2010-08-03 The Regents Of The University Of Michigan Antimicrobial compositions and methods of use
US7655252B2 (en) 1999-04-28 2010-02-02 The Regents Of The University Of Michigan Antimicrobial nanoemulsion compositions and methods
ATE317267T1 (de) * 2000-11-07 2006-02-15 Immunovaccine Technologies Inc Impfstoffe mit erhöhter immunantwort und verfahren zur deren herstellung
WO2004060396A2 (en) * 2002-12-27 2004-07-22 Chiron Corporation Immunogenic compositions containing phospholpid
US20050208083A1 (en) * 2003-06-04 2005-09-22 Nanobio Corporation Compositions for inactivating pathogenic microorganisms, methods of making the compositons, and methods of use thereof
GB0319500D0 (en) 2003-08-19 2003-09-17 Resolution Chemicals Ltd Particle-size reduction apparatus,and use thereof
KR20070008625A (ko) * 2004-04-05 2007-01-17 화이자 프로덕츠 인코포레이티드 미세유체화된 수중유 유화액 및 백신 조성물
EP2444071A1 (en) * 2004-09-27 2012-04-25 Sigmoid Pharma Limited Minicapsule formulations
FR2878746B1 (fr) 2004-12-02 2007-02-23 Vetoquinol Sa Sa Nouvelle composition pharmaceutique utilisable dans le domaine des vaccins
GB0427568D0 (en) 2004-12-16 2005-01-19 Resolution Chemicals Ltd Particle-size reduction apparatus, and the use thereof
WO2006110699A1 (en) * 2005-04-11 2006-10-19 Nanobio Corporation Quaternary ammonium halides for treatment of infectious conditions
CA2618655C (en) * 2005-07-18 2015-12-22 University Of Massachusetts Lowell Compositions and methods for making and using nanoemulsions
WO2008051186A2 (en) * 2005-08-09 2008-05-02 Nanobio Corporation Nanoemulsion containing compositions having ant i -inflammatory activity
US9486408B2 (en) 2005-12-01 2016-11-08 University Of Massachusetts Lowell Botulinum nanoemulsions
KR101238486B1 (ko) * 2006-09-11 2013-03-04 화이자 프로덕츠 인크. 열 처리된 박테린, 및 상기 열 처리된 박테린으로부터 제조된 에멀젼 백신
CN103120653B (zh) * 2007-04-04 2015-09-30 希格默伊德药业有限公司 一种口服药物组合物
US8747872B2 (en) 2007-05-02 2014-06-10 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same
EP2197497B1 (en) 2007-09-27 2016-06-01 ImmunoVaccine Technologies Inc. Use of liposomes in a carrier comprising a continuous hydrophobic phase for delivery of polynucleotides in vivo
CA2710186C (en) * 2007-12-21 2015-11-03 Pfizer Inc. Heat treated bacterins, and emulsion vaccines prepared from such heat treated bacterins
US8444989B1 (en) * 2008-04-18 2013-05-21 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh One dose vaccination against mycoplasma infections of pigs
CN102056622B (zh) 2008-06-05 2016-04-06 免疫疫苗技术有限公司 包含脂质体、抗原、多核苷酸和含疏水物质的连续相的载体的组合物
ES2728949T3 (es) 2008-06-27 2019-10-29 Zoetis Services Llc Composiciones adyuvantes novedosas
ES2530049T3 (es) 2009-05-18 2015-02-26 Sigmoid Pharma Limited Composición que comprende gotas de aceite
US9878036B2 (en) 2009-08-12 2018-01-30 Sigmoid Pharma Limited Immunomodulatory compositions comprising a polymer matrix and an oil phase
WO2011026076A2 (en) 2009-08-31 2011-03-03 Dr. Reddy's Laboratories Ltd. Topical formulations comprising a steroid
DE102009056871A1 (de) 2009-12-03 2011-06-22 Novartis AG, 4056 Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben
CL2012001399A1 (es) 2009-12-03 2013-03-08 Novartis Ag Metodo para fabricar adyuvante para vacuna (emulsion aceite/agua con escualeno, polisorbato 80 y trioleato de sorbitan), que comprende (i) formar primera emulsion en homogenizador desde un contendor a otro para formar segunda emulsion, (ii) y microfluidizar primera emulsion para formar segunda emulsion.
DE102009056883B4 (de) * 2009-12-03 2012-08-16 Novartis Ag Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben
US8895629B2 (en) * 2009-12-03 2014-11-25 Novartis Ag Circulation of components during homogenization of emulsions
WO2011067672A2 (en) * 2009-12-03 2011-06-09 Novartis Ag Arranging interaction and back pressure chambers for microfluidization
DE102009056884B4 (de) 2009-12-03 2021-03-18 Novartis Ag Impfstoff-Adjuvantien und verbesserte Verfahren zur Herstellung derselben
JP5754860B2 (ja) 2009-12-03 2015-07-29 ノバルティス アーゲー ワクチンアジュバントの製造の間の親水性濾過
FR2957803B1 (fr) * 2010-03-24 2012-06-01 Soc Dexploitation De Produits Pour Les Industries Chimiques Seppic Diluants adjuvants de vaccins vivants pour maladies porcines
CN101829323A (zh) * 2010-04-28 2010-09-15 洛阳普莱柯生物工程有限公司 一种禽用油乳剂疫苗及其制备方法
GB201009673D0 (en) * 2010-06-10 2010-07-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Novel process
CN101926994B (zh) * 2010-08-19 2012-10-10 中国医学科学院医学生物学研究所 一种鳖甲免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗
CN101926995B (zh) * 2010-08-19 2013-05-29 中国医学科学院医学生物学研究所 一种天冬免疫佐剂及含有该佐剂的流感疫苗
CN101978948A (zh) * 2010-11-02 2011-02-23 扬州威克生物工程有限公司 兽用油乳剂灭活疫苗的低温乳化工艺方法
GB201020032D0 (en) 2010-11-25 2011-01-12 Sigmoid Pharma Ltd Composition
EP3329936A1 (en) 2011-08-22 2018-06-06 Nanobio Corporation Herpes simplex virus nanoemulsion vaccine
BR112014007927B1 (pt) 2011-10-06 2021-04-13 Immunovaccine Technologies Inc Composições de lipossoma compreendendo um adjuvante e usos das referidas composições e usos das referidas composições
GB201212010D0 (en) 2012-07-05 2012-08-22 Sigmoid Pharma Ltd Formulations
US10400280B2 (en) 2012-08-14 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10323279B2 (en) 2012-08-14 2019-06-18 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10273541B2 (en) 2012-08-14 2019-04-30 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US9951386B2 (en) 2014-06-26 2018-04-24 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US11591637B2 (en) 2012-08-14 2023-02-28 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US20140155295A1 (en) 2012-08-14 2014-06-05 10X Technologies, Inc. Capsule array devices and methods of use
US9701998B2 (en) 2012-12-14 2017-07-11 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10752949B2 (en) 2012-08-14 2020-08-25 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10221442B2 (en) 2012-08-14 2019-03-05 10X Genomics, Inc. Compositions and methods for sample processing
US10533221B2 (en) 2012-12-14 2020-01-14 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
EP3567116A1 (en) 2012-12-14 2019-11-13 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN104981231B (zh) * 2012-12-27 2018-01-30 让-克劳德·埃皮法尼 水性乳液的制造方法、水性乳液、包含其的凝胶和乳膏
WO2014124338A1 (en) 2013-02-08 2014-08-14 10X Technologies, Inc. Polynucleotide barcode generation
US10395758B2 (en) 2013-08-30 2019-08-27 10X Genomics, Inc. Sequencing methods
WO2015042369A2 (en) 2013-09-19 2015-03-26 Zoetis Llc Oil-based adjuvants
GB201319791D0 (en) 2013-11-08 2013-12-25 Sigmoid Pharma Ltd Formulations
US9824068B2 (en) 2013-12-16 2017-11-21 10X Genomics, Inc. Methods and apparatus for sorting data
US20160184431A1 (en) 2014-03-11 2016-06-30 Promius Pharma Llc Topical compositions comprising a corticosteroid
WO2015157567A1 (en) 2014-04-10 2015-10-15 10X Genomics, Inc. Fluidic devices, systems, and methods for encapsulating and partitioning reagents, and applications of same
MX2016016902A (es) 2014-06-26 2017-03-27 10X Genomics Inc Metodos para analizar acidos nucleicos de celulas individuales o poblaciones de celulas.
CN110211637B (zh) 2014-06-26 2023-10-27 10X基因组学有限公司 核酸序列装配的方法和***
WO2016007576A2 (en) * 2014-07-11 2016-01-14 Zoetis Services Llc Novel vaccine compositions for porcine epidemic diarrhea virus and porcine deltacoronavirus
EP3191124A1 (en) * 2014-09-12 2017-07-19 Intervet International B.V. Vaccine for use in protecting a pig against porcine endemic diarrhea virus
CN114807307A (zh) 2014-10-29 2022-07-29 10X 基因组学有限公司 用于靶核酸测序的方法和组合物
US9975122B2 (en) 2014-11-05 2018-05-22 10X Genomics, Inc. Instrument systems for integrated sample processing
JP6716582B2 (ja) 2014-11-07 2020-07-01 サブリミティ・セラピューティクス・リミテッドSublimity Therapeutics Limited シクロスポリンを含む組成物
CN107427808B (zh) 2015-01-12 2020-10-23 10X基因组学有限公司 用于制备核酸测序文库的方法和***以及用其制备的文库
EP4092681A1 (en) 2015-01-13 2022-11-23 10X Genomics, Inc. Systems and methods for visualizing structural variation and phasing information
PL3244920T3 (pl) 2015-01-16 2023-09-25 Zoetis Services Llc Szczepionka przeciw pryszczycy
EP3256606B1 (en) 2015-02-09 2019-05-22 10X Genomics, Inc. Systems and methods for determining structural variation
WO2016138148A1 (en) 2015-02-24 2016-09-01 10X Genomics, Inc. Methods for targeted nucleic acid sequence coverage
US10697000B2 (en) 2015-02-24 2020-06-30 10X Genomics, Inc. Partition processing methods and systems
AU2016225119B2 (en) 2015-02-27 2021-06-03 Iowa State University Research Foundation, Inc. Porcine Epidemic Diarrhea Virus strains and immunogenic compositions therefrom
ES2926495T3 (es) 2015-12-04 2022-10-26 10X Genomics Inc Métodos y composiciones para el análisis de ácidos nucleicos
WO2017138984A1 (en) 2016-02-11 2017-08-17 10X Genomics, Inc. Systems, methods, and media for de novo assembly of whole genome sequence data
WO2017197338A1 (en) 2016-05-13 2017-11-16 10X Genomics, Inc. Microfluidic systems and methods of use
JP6253210B1 (ja) * 2016-08-17 2017-12-27 一般財団法人日本生物科学研究所 豚流行性下痢の予防又は治療方法、ワクチン、及びワクチンキット
US11311496B2 (en) 2016-11-21 2022-04-26 Eirion Therapeutics, Inc. Transdermal delivery of large agents
US10550429B2 (en) 2016-12-22 2020-02-04 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10815525B2 (en) 2016-12-22 2020-10-27 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
US10011872B1 (en) 2016-12-22 2018-07-03 10X Genomics, Inc. Methods and systems for processing polynucleotides
CN117512066A (zh) 2017-01-30 2024-02-06 10X基因组学有限公司 用于基于微滴的单细胞条形编码的方法和***
WO2018213774A1 (en) 2017-05-19 2018-11-22 10X Genomics, Inc. Systems and methods for analyzing datasets
CN109526228B (zh) 2017-05-26 2022-11-25 10X基因组学有限公司 转座酶可接近性染色质的单细胞分析
US10400235B2 (en) 2017-05-26 2019-09-03 10X Genomics, Inc. Single cell analysis of transposase accessible chromatin
WO2019099751A1 (en) 2017-11-15 2019-05-23 10X Genomics, Inc. Functionalized gel beads
US10829815B2 (en) 2017-11-17 2020-11-10 10X Genomics, Inc. Methods and systems for associating physical and genetic properties of biological particles
JP7370983B2 (ja) * 2017-12-20 2023-10-30 ゾエティス・サービシーズ・エルエルシー ヘンドラウイルス感染症及びニパウイルス感染症に対するワクチン
CN108159414B (zh) * 2018-01-15 2021-07-27 四川诺顺科技有限公司 动物疫苗用油包水佐剂及其制备方法和用途
EP3775271A1 (en) 2018-04-06 2021-02-17 10X Genomics, Inc. Systems and methods for quality control in single cell processing
CN108721614A (zh) * 2018-06-12 2018-11-02 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 兔葡萄球菌病、波氏杆菌病二联组织灭活疫苗及制备方法
CN110665002B (zh) * 2019-10-29 2023-01-24 信阳市动物疫病预防控制中心 一种用于防治牛病毒性腹泻的抗体制剂及其制备方法
US11786592B2 (en) * 2021-05-19 2023-10-17 The University Of Hong Kong Compositions of cardiolipin adjuvants and methods of use thereof
US20230109193A1 (en) * 2021-10-02 2023-04-06 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic Combination of Alum and Non-Liposome, Non-Micelle Particle Vaccine Adjuvants
CN114569715A (zh) * 2022-05-07 2022-06-03 中义(北京)健康研究院 疫苗组合物、疫苗佐剂及其制备方法和制备***

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3919411A (en) * 1972-01-31 1975-11-11 Bayvet Corp Injectable adjuvant and compositions including such adjuvant
US4908154A (en) * 1981-04-17 1990-03-13 Biotechnology Development Corporation Method of forming a microemulsion
US4505900A (en) * 1982-05-26 1985-03-19 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4606918A (en) * 1983-08-22 1986-08-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants
US4772466A (en) * 1983-08-22 1988-09-20 Syntex (U.S.A.) Inc. Vaccines comprising polyoxypropylene-polyoxyethylene block polymer based adjuvants
CA1280739C (en) 1985-09-19 1991-02-26 Tatsuo Kinoshita Oil-in-water emulsion and use thereof as metal processing oil or the like
US4803070A (en) * 1986-04-15 1989-02-07 Ribi Immunochem Research Inc. Immunological emulsion adjuvants for polysaccharide vaccines
US4806350A (en) 1986-04-18 1989-02-21 Norden Laboratories, Inc. Vaccine formulation
US5084269A (en) * 1986-11-06 1992-01-28 Kullenberg Fred W Adjuvant for dose treatment with antigens
EP0513861B1 (en) * 1987-11-03 1997-02-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Vaccine adjuvant comprising a tetra-polyol
US5376369A (en) * 1987-11-03 1994-12-27 Syntex (U.S.A.) Inc. Vaccine adjuvant
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
EP0596032B2 (en) * 1991-07-25 2004-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Induction of cytotoxic t-lymphocyte responses
WO1993015736A1 (en) 1992-02-18 1993-08-19 Pharmos Corp. Dry compositions for preparing submicron emulsions
WO1993024147A1 (en) * 1992-05-29 1993-12-09 Smithkline Beecham Corporation Lecithin adjuvanted modified live virus vaccines
RU2058154C1 (ru) * 1992-12-21 1996-04-20 Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных Адъювант
JPH0731413A (ja) 1993-07-14 1995-02-03 Ajinomoto Co Inc 広域温度安定性乳化組成物
EP0640348A1 (en) * 1993-07-26 1995-03-01 Akzo Nobel N.V. Oil-based and water-based adjuvant mixture
WO1995011700A1 (en) * 1993-10-29 1995-05-04 Pharmos Corp. Submicron emulsions as vaccine adjuvants
US5961970A (en) * 1993-10-29 1999-10-05 Pharmos Corporation Submicron emulsions as vaccine adjuvants
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
FR2733151B1 (fr) * 1995-04-20 1997-05-23 Seppic Sa Composition therapeutique comprenant un antigene ou un generateur in vivo d'un compose comprenant une sequence d'acides amines
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US5718904A (en) * 1995-06-02 1998-02-17 American Home Products Corporation Adjuvants for viral vaccines
US5690942A (en) * 1995-06-02 1997-11-25 American Home Products Corporation Adjuvants for viral vaccines
EP0878197B1 (en) 1997-05-14 2002-08-21 Senju Pharmaceutical Co., Ltd. Compositions containing difluprednate
SE9702776D0 (sv) * 1997-07-22 1997-07-22 Pharmacia & Upjohn Ab Method of preparing pharmaceutical compositions
US6682745B1 (en) 1998-07-28 2004-01-27 Christiaan Antonius Arnoldus Jacobs Use of bacterium for manufacture of a vaccine
GB9718901D0 (en) * 1997-09-05 1997-11-12 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
EP1279401B1 (en) 1997-09-05 2008-01-09 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Oil in water emulsions containing saponins
CA2314934C (en) * 1997-12-16 2006-08-29 Chiron Corporation Use of microparticles combined with submicron oil-in-water emulsions
AU769539B2 (en) * 1999-01-29 2004-01-29 Zoetis Services Llc Adjuvants for use in vaccines
JP2002193790A (ja) 2000-12-27 2002-07-10 Lion Corp 水難溶性薬剤含有水中油型エマルジョン及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
PT1613346E (pt) 2013-01-29
DK1613346T3 (da) 2013-01-07
SI1613346T1 (sl) 2013-02-28
EP1613346B8 (en) 2013-01-09
BRPI0408635B1 (pt) 2019-07-16
NO20054376L (no) 2006-01-03
AU2004226591B2 (en) 2009-06-04
RU2009113834A (ru) 2010-10-20
TWI353850B (en) 2011-12-11
JP2006522090A (ja) 2006-09-28
KR100720213B1 (ko) 2007-05-21
AR043803A1 (es) 2005-08-10
US8771727B2 (en) 2014-07-08
TW200509966A (en) 2005-03-16
NO20054376D0 (no) 2005-09-21
EP1613346B1 (en) 2012-11-28
HK1086484A1 (en) 2006-09-22
RU2005130646A (ru) 2006-01-27
CN1767854A (zh) 2006-05-03
CL2004000691A1 (es) 2005-05-06
WO2004087204A3 (en) 2004-12-23
WO2004087204A2 (en) 2004-10-14
CA2521051A1 (en) 2004-10-14
RU2541809C2 (ru) 2015-02-20
CN1767854B (zh) 2013-07-24
US20040258701A1 (en) 2004-12-23
US20100173854A1 (en) 2010-07-08
EP1613346A2 (en) 2006-01-11
NZ542576A (en) 2008-11-28
PL1613346T3 (pl) 2013-03-29
BRPI0408635A (pt) 2006-03-28
CA2521051C (en) 2012-03-20
AU2004226591A1 (en) 2004-10-14
UY28256A1 (es) 2004-11-30
ES2398235T3 (es) 2013-03-14
CY1113546T1 (el) 2016-06-22
ZA200507994B (en) 2007-03-28
KR20060006909A (ko) 2006-01-20

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