MXPA06011569A - Emulsiones de aceite en agua microfluidizadas y composiciones de las vacunas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición de vacuna que comprende un glucósido de saponina, un esterol y un antígeno, en donde la saponina y esterol forman complejos en forma de micelas helicoidales. El antígeno se encuentra mezclado con las micelas helicoidales. Antígenos adecuados incluyen virus, bacterias o una combinación de ambos. En una modalidad, el antígeno comprende el virus de la diarrea viral bovina.

Description

poíenciar la respuesía inmunilaria. Muchos adyuvaníes modifican la red de ciíocinas asociadas a la respuesía inmuniíaria. Eslos adyuvanfes ¡nmunomoduladores pueden ejercer su efecío incluso cuando no esíán combinados con aníígenos. En general, los adyuvaníes ¡nmunomoduladores provocan una regulación por aumento general de ciertas citocinas y una concomilaníe regulación por disminución de oirás provocando una respuesía celular Th1 y/o una humoral Th2. Algunos adyuvaníes íienen la capacidad de preservar la iníegridad de la configuración de un anfígeno de forma que los aníígenos puedan ser preseníados de forma eficieníe a las células efecíoras ¡nmunif arias apropiadas. Como resulíado de esía conservación de la configuración del aníígeno medianfe la formulación del adyuvaníe, la vacuna íendría una vida úíil de anaquel mayor como la que demueslran para los complejos ¡nmunoesfimuladores (ISCOM). Ozel M. y cois.; Qualernary Structure of the Immunoestimmulafing Complex (Iscom), J. of Ultrastruc. and Molec. Struc. Res. 102, 240-248 (1989). Algunos adyuvantes tienen la propiedad de retener el antígeno en forma de depósiío en la zona de la inyección. Como resulíado de esíe efecío depósiío, el anfígeno no se pierde rápidameníe por aclaramienío hepálico. Las sales de aluminio y las emulsiones de agua en aceiíe acíúan a íravés de esíe efecto depósiío con una duración menor. Por ejemplo, se puede obfener un depósiío a largo plazo usando adyuvante completo de Freund (FCA) que es una emulsión de agua en aceite. El FCA típicameníe se maníiene en la zona de la inyección hasía que la biodegradación permite la eliminación del antígeno por las células presentadoras de antígeno. Basándose en su naíuraleza física, los adyuvantes pueden agruparse en dos categorías muy amplias, específicamente adyuvantes particulados y adyuvantes no particulados. Los adyuvaníes particulados exislen en forma de micropartículas. El inmunógeno es capaz de incorporar o asociarse a las micropartículas. Sales de aluminio, emulsiones de agua en aceiíe, emulsiones de aceiíe en agua, complejos inmunoesíimuladores, liposomas y nanopartículas y micropartículas son ejemplos de adyuvaníes particulados. Los adyuvaníes no particulados son generalmeníe ¡nmunomoduladores y se usan generalmenle junio con adyuvaníes particulados. Muramil dipéptido (un componeníe adyuvaníe acíivo de un pepfidoglicano exíraído de Mycobacíería), copolímeros de bloque no iónicos, saponinas (una mezcla compleja de fhíerpenoides exíraídos de la corteza del árbol Quillaja saponaria), Lípido A (un disacárido de glucosamina con dos grupos fosfato y cinco o seis cadenas de ácidos grasos generalmente de C12 a C16 de longitud), citocinas, polímeros de carbohidratos, polisacáridos derivatizados y toxinas bacterianas íales como la íoxina del cólera y la íoxina lábil de E. coli (LT) son ejemplos de adyuvaníes no particulados. Algunos de los adyuvaníes mejor conocidos son combinaciones de ¡nmunomoduladores no particulados y de maíeriales particulados que podrían conferir un efecío depósiío a la formulación de adyuvaníe. Por ejemplo, FCA combina las propiedades ¡nmunomoduladoras de componeníes de Mycobacterium tuberculosis con el efecto depósiío a corto plazo de las emulsiones en aceiíe. Las emulsiones en aceiíe se han usado como adyuvaníe de vacunas duraníe mucho liempo. Le Moignic y Pinoy enconíraron en 1916 que una suspensión de Salmonella typhimurium inacíivados en aceiíe de parafina aumentaba la respuesta inmuniíaria. Subsiguienlemenfe, en 1935 Ramón describió el aceife de almidón como una de las sustancias que aumenían la respuesía aníiíóxica al íoxoide de la difteria. Sin embargo, las emulsiones en aceiíe no se hicieron populares hasía 1937 cuando Freund logró su formulación de adyuvaníe que hoy se conoce como Adyuvaníe Compleío de Freund (FCA). El FCA es una emulsión de agua en aceiíe compuesía por aceite mineral (parafina) mezclado con Mycobacteria inacíivados y Arlacel A. Arlacel A es principalmenfe monooleato de manida y se usa como ageníe emulsionanfe. Aunque el FCA es exceleníe para inducir una respuesfa de aníicuerpos, provoca dolor fuerte, formación de abscesos, fiebre e inflamación granulomatosa. Para evitar estas reacciones secundarias indeseables, se desarrolló el Adyuvante Incompleto de Freund (IFA). El IFA es similar al FCA en su composición a excepción de la ausencia de componentes de micobacteria. El IFA acíúa medlanfe formulación en depósiío en la zona de la inyección y liberación lenía del aníígeno esíimulando las células producíoras de aníicuerpos. Oíra estrategia para mejorar el FCA se basó en la noción de que la sustiíución del aceiíe de parafina por un aceiíe biocompalible ayudaría a eliminar las reacciones asociadas al FCA en la zona de la inyección. Se creía íambién que la emulsión debería ser una de aceiíe en agua en lugar de agua en aceite porque ésía produce un depósito de larga duración en la zona de la inyección. Hilleman y cois, describieron un adyuvaníe con base de aceite "Adjuvant 65", que consisíía en aceife de cacahuete al 86%, Arlacel A al 10% como emulsionante y monoesíearafo de aluminio al 4% como esíabilizador. Hilleman, 1966, Prog. Med. Viral. 8: 131-182; Hilleman y Beale, 1983, en New Approaches ío Vaccine Developmení (Editores Bell, R. y Torrigiani, G.), Schwabe, Basel. En los seres humanos, el uso de Adjuvaní 65 era seguro y poíeníe, pero mosíraba menos capacidad adyuvante que el IFA. Sin embargo, se suspendió el uso de Adjuvant 65 debido a la capacidad reactógena en el hombre con ciertos lotes de vacunas y la reducción de la capacidad adyuvante cuando se usaba emulsionante purificado o sintéíico en lugar de Arlacel A. Las patentes de Estados Unidos n° 5,718,904 y 5,690,942 enseñan que el aceite de parafina en la emulsión de aceiíe en agua puede susíifuirse por aceiíe meíabolizable con el fin de mejorar el perfil de seguridad. Además de la capacidad adyuvaníe y la seguridad, el aspecto físico de una emulsión es fambién una consideración comercial importante. El aspecto físico depende de la esíabilidad de la emulsión. La separación de fases, la sedimentación y la coalescencia son indicadores de la inestabilidad de la emulsión. La separación de fases ocurre cuando las fases oleaginosa y acuosa de la emulsión tienen una gravedad específica diferente. También se da la separación de fases cuando el tamaño de la gota de la emulsión es grande y las goías de la emulsión no íienen movimiento Browniano. Cuando el tamaño de la gota es grande, hay una tendencia a la ruptura de la interfase y las gotas se fusionan en forma de partículas grandes. La estabilidad de la emulsión se determina medianíe un número de facíores íales como la naíuraleza y canfidad de emulsionante usado, el íamaño de la gofa en la emulsión y la diferencia de densidades entre la fase oleaginosa y acuosa. Los emulsionantes promueven la estabilización de goías dispersas reduciendo la energía libre de la inferíase y creando barreras físicas o elecfroesíáíicas a la coalescencia de las goías. Se han usado detergentes no iónicos así como iónicos como emulsionantes. Los emulsionantes no iónicos se orienlan en la iníerfase y producen esírucfuras relaíivamenle voluminosas, lo que conlleva la eviíación esférica de las goías dispersas. Los emulsionantes aniónicos o cafiónicos inducen la formación de una doble capa elécírica aírayendo los iones conjugados; las fuerzas repelentes de la capa doble provocan que las gotas se repelan las unas a las otras cuando se acercan. Además de usar emulsionantes, también puede lograrse la estabilidad de la emulsión reduciendo el tamaño de la gofa de la emulsión por medios mecánicos. Típicamenfe se han usado mezcladores de propelentes, rotores de íurbina, molinos de coloides, homogeneizadores y aparatos de ulírasonidos para fabricar emulsiones. La microfluidización es oíra forma de aumeníar la homogeneidad del íamaño de la gofa en la emulsión. La microfluidización puede producir una emulsión elegante, físicamente eslable con un íamaño de las partículas consistente en el intervalo submicromeírico. Además de aumeníar la esíabilidad de la emulsión, el procedimiento de la microfluidización permite la filtración final que es una forma preferida de asegurar la esterilidad del producto final. Además, las partículas oleaginosas submicroméíricas pueden pasar desde las zonas de inyección a los vasos linfáticos y después a los nodulos linfáticos de la cadena de drenaje, sangre y bazo. Esío reduce la probabilidad de esíablecer un depósiío oleaginoso en la zona de la inyección que puede producir inflamación local y una reacción significaíiva en la zona de la inyección. Los microfluidizadores esíán ahora disponibles comercialmeníe.

La formación de emulsiones se produce en un microfluidificador al iníeracíuar dos chorros fluidizados a velocidades elevadas deníro de una cámara de interacción. El microfluidizador es impulsado por aire o nilrógeno y puede operar con presiones internas por encima de 137.900 kPa. La patente de Estados Unidos 4,908,154 enseña el uso de un microfluidizador para obíener emulsiones esencialmente libres de cualesquiera agentes emulsionantes. En la bibliografía se han descrito un número de formulaciones adyuvantes de aceiíe en agua submicroméíricas. La patente de Estados Unidos 5,376,369 describe un adyuvante de emulsión submicrométrica de aceiíe en agua que se conoce como Syntax Adjuvanf Formulafion (SAF). SAF coníiene escualeno o escualano como componente oleaginoso, una caníidad de polímero de bloque Plurónico L121 (polioxipropileno y polioxieíileno) que forma emulsiones y una caníidad ¡nmunopoíenciadora de muramil dipépfido.

Escualeno es un precursor de colesferol de hidrocarburo lineal que se encueníra en muchos tejidos, de forma noíable en el hígado de íiburones y oíros peces. Escualano se prepara mediante hidrogenación de escualeno y esíá complefameníe saíurado. Tanío escualeno como escualano pueden meíabolizarse y íienen unos buenos antecedentes en estudios toxicológicos. Las emulsiones de escualeno y escualano se han usado en vacunas coníra el cáncer en seres humanos con efectos secundarios leves y con una eficacia deseable. Véase, por ejemplo, Anthony C. Allison, 1999, Squalene and Squalane emulsions as adjuvants, Methods 19: 87-93. La patente de Esíados Unidos 6,299,884 y la publicación de patente internacional WO 90/14837 enseñan que los copolímeros de bloque de polioxipropileno y polioxiefileno no son esenciales para la formación de emulsiones submicrométricas de aceiíe en agua. Además, eslas referencias enseñan el uso de aceiíe meíabolizable no tóxico y expresamente excluyen el uso de aceiíe de parafina y aceites de derivados del petróleo tóxicos en sus formulaciones de emulsiones. La patente de Estados Unidos 5,961 ,970 describe otra emulsión submicrométrica de aceiíe en agua para usar como adyuvaníe en vacunas. En la emulsión que se describe en esía patente, el componente hidrófobo se selecciona del grupo que consisíe en un aceiíe íriglicérido de cadena media, un aceite vegeíal y una mezcla de los mismos. El íensioactivo que se incluye en esía emulsión puede ser un íensioacíivo biológicamente compaíible naíural tal como un fosfolípido (por ejemplo lecltina) o un íensioacfivo no naíural farmacéuíicameníe acepíable íal como TWEEN-80. Esta patente enseña también la incorporación del antígeno a la emulsión en el momento en que se forma la emulsión, contrasíando con la mezcla del aníígeno con la emulsión después de que se ha formado la emulsión de forma independiente y exírínseca. La patente de Eslados Unidos 5,084,269 enseña que una formulación de adyuvante que coníiene leciíina combinada con aceite de parafina provoca un descenso de la irrilación en el animal hospedador y simulíáneameníe induce una inmunidad sisíémica aumeníada. La formulación del adyuvaníe que resulía de la patente de Eslados Unidos 5,084,269 se usa comercialmeníe en vacunas veterinarias con el nombre comercial AMPHIGEN®. La formulación de AMPHIGEN® esíá formada por micelas -gofas de aceite rodeadas de leciíina. Estes micelas permiten que se unan más aníígenos celulares completos que los adyuvaníes con base oleaginosa íradicionales. Además, las formulaciones de las vacunas con base de AMPHIGEN® coníienen un bajo contenido en aceiíe de 2.5 a 5% de aceife de parafina, comparadas con oirás formulaciones de las vacunas que contienen adyuvantes oleaginosos, que fípicamenle coníienen de 10% a 20% de aceiíe. Su bajo contenido en aceite hace que esta vacuna con base de adyuvante sea menos irritante para los tejidos en la zona de la inyección, dando como resulíado menos lesiones y que haya menos desechos al sacrificar. Además, el recubrimiento de lecitina que rodea las gotas de aceite reduce más las reacciones en la zona de la inyección dando como resultado una vacuna que es íanto segura como eficaz. La formulación de AMPHIGEN® se usa como adyuvaníe en un número de vacunas veterinarias y existe la necesidad de mantener el aspecto físico de la vacuna durante periodos de almacenamiento cortos y largos así como en el momento de la reconstiíución. Además, un antígeno liofilizado se mezcla con la formulación de adyuvante preparada previamente justo antes de la inyección. Esta prácíica no asegura siempre que exisía una disíribución uniforme del aníígeno en la emulsión de aceiíe en agua y el aspecto de la emulsión puede no ser deseable. Además, al reposar, la emulsión homogeneizada puede mostrar separación de fases. Por lo íanfo, existe la necesidad de una formulación de adyuvante esíable que no muesfre separación de fases duraníe una vida de anaquel larga. Una forma de prevenir la separación de fases es reducir el íamaño de la gofa y aumentar la homogeneidad de las partículas de la emulsión. Aunque se ha documeníado el proceso de microfluidización de formulaciones de emulsiones con base de aceite meta bol iza ble, todavía no se ha realizado la microfluidización de las emulsiones de aceife en agua fales como la formulación de AMPHIGEN®. En la presente invención, se ha usado la microfluidización para llevar el lamaño de las goías de aceiíe de parafina rodeadas de lecitina a tamaño submicrométrico. De forma inesperada, los presentes inventores han descubierto que la microfluidización de formulaciones de las vacunas con adyuvantes de una emulsión de aceite en agua formada por una mezcla de leciíina y aceiíe no sólo mejora el aspecto físico de las formulaciones, sino que potencia íambién los efectos inmunizadores de las formulaciones. Las formulaciones microfluidizadas se caracterizan fambién por un perfil de seguridad mejorado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han descubierto de forma inesperada que la acíividad de adyuvaníe y el perfil de seguridad de las emulsiones con base oleaginosa de aceiíe en agua no meíabolizables pueden mejorarse medianíe la microfluidización. Los antígenos que se incorporan a las emulsiones microfluidizadas son estables incluso cuando los antígenos se incorporan de forma intrínseca a las emulsiones antes de la microfluidización. En consecuencia, en una modalidad, la preseníe invención proporciona formulaciones de emulsiones submicrométricas de aceite en agua de utilidad como adyuvaníes de vacunas. Las emulsiones submicrométricas de aceite en agua de la preseníe invención esíán compuesías por un aceiíe no meíabolizable, al menos un tensioaclivo y un componente acuoso, en las que el aceiíe esfá disperso en el componente acuoso con un íamaño medio de las golas de aceite en el intervalo submicrométrico. Un aceiíe no meíabolizable preferido es aceite de parafina fluido. Tensioactivos preferidos incluyen lecitina, Tween-80 y SPAN-80. Una emulsión de aceiíe en agua preferida proporcionada por la preseníe invención esíá compuesía por una formulación de AMPHIGEN®.

Las emulsiones de aceite en agua de la presente ¡nvención pueden incluir componeníes adicionales que son apropiados y deseables, incluyendo conservadores, ageníes osmólicos, moléculas bioadhesivas y moléculas inmunoeslimuladoras. Moléculas inmunoeslimuladoras preferidas incluyen, por ejemplo Quil A, colesíerol, GPI-0100, bromuro de dimefildiocíadecilamonio (DDA). En otra modalidad, la presente ¡nvención proporciona méíodos para preparar una emulsión submicroméfrica de aceite en agua. De acuerdo con la presente invención, se mezclan los diversos componentes de la emulsión, incluyendo el aceiíe, uno o más lensioacíivos, un componente acuoso y cualquier oíro componeníe apropiado para usar en la emulsión. La mezcla se somete a un procedimienío de emulsionamienío primario para formar una emulsión de aceite en agua, que después se pasa por un microfluidizador para obíener una emulsión de aceite en agua de goías con un diámeíro inferior a 1 micrómetro, preferiblemente con un tamaño medio de las gotas inferior a 0.5 micrómetros. Todavía en otra modalidad, la presente invención proporciona composiciones de las vacunas que coníienen un aníígeno y una emulsión submicroméírica de aceiíe en agua descrifa aníeriormeníe. El aniígeno se incorpora a la emulsión de forma exírínseca o inírínseca, preferiblemenfe de forma intrínseca. El antígeno que puede incluirse en las composiciones de las vacunas de la presente ¡nvención puede ser un antígeno bacteriano, fúngico o vírico o una combinación de ellos. El antígeno puede tener forma de una preparación inactivada de células o virus completos o parciales, o tener forma de moléculas antigénicas obtenidas mediante purificación convencional de proteínas, técnicas de ingeniería genética o síntesis química. En una modalidad adicional, la presente ¡nvención proporciona procedimientos para preparar composiciones de las vacunas que contienen un antígeno o antígenos combinado(s) con una emulsión submicrométrica de aceite en agua. Para preparar las composiciones de las vacunas de la presente ¡nvención, el/los antígeno(s) puede(n) combinarse de forma intrínseca (por ejemplo antes de la microfluidización) o de forma extrínseca (por ejemplo después de la microfluidización) con los componentes de la emulsión de aceite en agua. Preferiblemente, el antígeno se combina con los componentes de la emulsión de aceiíe en agua de forma inírínseca. Todavía en oíra modalidad, la preseníe ¡nvención proporciona composiciones de las vacunas que confienen un aníígeno microencapsulado y una emulsión submicrométrica de aceite en agua descrila anteriormente, en las que el aníígeno microencapsulado se combina con la emulsión de forma exírínseca. También se ha encontrado sorprendentemente que una saponina y un esterol, cuando se combinan en solución, se asocian eníre si para formar complejos en forma de micelas helicoidales. De acuerdo con la presente ¡nvención, estos complejos de micelas helicoidales tienen acfivídades inmunoestimuladoras y son especialmente útiles como adyuvantes en composiciones de las vacunas. En consecuencia, la presente invención proporciona composiciones de las vacunas que coníienen una saponina y un esíerol, en las que la saponina y el esíerol forman complejos en forma de micelas helicoidales. La preseníe invención proporciona íambién composiciones que coníienen una saponina, un esíerol y un aníígeno, en las que la saponina y el esíerol forman complejos en forma de micelas helicoidales y en las que el antígeno se mezcla pero no se incorpora a las micelas helicoidales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 representa el procedimiento para la preparación en lotes de composiciones de las vacunas no microfluidizadas. En este procedimienío los diversos componentes de la vacuna se añaden al recipiente de adición de la izquierda y finalmente se bombean al recipiente de mezclado donde los componentes se mezclan por medios mecánicos simples. La Figura 2 representa el procedimiento para la preparación de composiciones de las vacunas microfluidizadas que contienen el antígeno incorporado de forma inírínseca. Los diversos componeníes de la vacuna se añaden al recipiente de adición y se íransfieren a la unidad de mezclado de la preemulsión para mezclar por medios mecánicos simples. Subsiguientemente, se pasa la emulsión por un microfluidizador y se recoge en la cámara post- microfluidización. La Figura 3 represente la dislribución del íamaño de las goías de la vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidizada, la vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada y la preparación de vacuna mezclada en banco. La Figura 4 muesfra la ausencia de separación de fases en la preparación de vacuna microfluidizada. La Figura 5 represente una comparación de la estabilidad de los aníígenos que se incorporan de forma inírínseca a la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidizada (A907505) y fres preparaciones de las vacunas con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidizadas de conírol (A904369, A904370 y A904371). Las cuaíro preparaciones de las vacunas se almacenaron a 4°C durante dos años. En momentos diferentes durante el almacenamiento (0, 6, 12 ó 24 meses), se usaron las cuaíro formulaciones para vacunar vacas de fres meses de edad.

La vacunación se realizó el Día 0 y 21 con 2 ml de una dosis de vacuna y se recogieron los sueros dos semanas después de la segunda vacunación. Se determinó la valoración de aníicuerpos neuíralizadores para el virus de BVD Tipo II en cada una de las mueslras de suero. Los daíos se presentan en términos de la media geométrica de 5 animales. La Figura 6 muesíra la media de los mínimos cuadrados de la íemperatura rectal del ganado antes y después de la adminisfración de vacunas microfluidifizadas y no microfluidifizadas. T01 : Grupo placebo - dosis única; Grupo Placebo - Dosis Doble; T03: Formulación no microfluidifizada -Dosis única; T04: Formulación no microfluidifizada - Dosis doble; T05: Formulación microfluidifizada - Dosis única; T06: Formulación microfluidifizada - Dosis doble. La Figura 7 representa la media de los mínimos cuadrados de los volúmenes de reacción en la zona de la inyección observados en el ganado tras la administración de vacunas microfluidifizadas y no microfluidifizadas. T03: Formulación no microfluidifizada - Dosis única; T04: Formulación no microfluidifizada - Dosis doble; T05: Formulación microfluidifizada - Dosis única; T06: Formulación microfluidifizada - Dosis doble. La Figura 8 representa la media geométrica de las valoraciones de IgG para aníígeno PauA recombinaníe de Streptococcus uberis iras la vacunación con las diversas formulaciones de las vacunas que contenían íanfo aníígeno PauA recombinaníe como anfígeno de células eníeras de E. coli. La Figura 9 representa la media geoméírica de las valoraciones de IgG para aníígeno de células eníeras de E. coli de Streptococcus uberis iras la vacunación con las diversas formulaciones de las vacunas que contenían tanío anfígeno PauA recombinante como aniígeno de células enteras de E. coli. Las Figuras 10A y 10B representan la distribución del tamaño de las partículas de una formulación de Amphigen microfluidifizada al inicio de la producción (Figura 10A) y a los 22 meses tras la producción (Figura 10B). La Figura 11 es una fotografía de microscopía electrónica que muestra micelas helicoidales formadas con micelas de Quil A y cristales de colesterol. La Figura 12 es una fotografía de microscopía electrónica que muestra complejos inmunógenos helicoidales formados por Quil A y colesterol en la superficie del antígeno de BVD Tipo I.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores han descubierto de forma inesperada que la microfluidización de las formulaciones de las vacunas con adyuvantes de emulsión de aceite en agua compuestas por una mezcla de lecitina y aceite de parafina no sólo mejora el aspecto físico de las formulaciones de las vacunas, sino que también potencia los efectos inmunizadores de las formulaciones de las vacunas. Las formulaciones de acunas microfluidizadas se caracterizan también por un perfil de seguridad mejorado. Basándose en estos descubrimientos, la presente invención proporciona emulsiones submicrométricas de aceite en agua de utilidad como adyuvaníes en las composiciones de las vacunas. Se proporcionan íambién métodos para preparar esías emulsiones submicroméíricas de aceife en agua usando un microfluidizador. Además, la preseníe invención proporciona composiciones de las vacunas submicroméíricas en las que un aniígeno se combina con una emulsión submicrométrica de aceite en agua. También se proporcionan los métodos para preparar tales composiciones de las vacunas. La presente invención proporciona además composiciones de las vacunas que contienen antígenos microencapsulados combinados con una emulsión submicrométrica de aceite en agua y métodos para preparár teles vacunas. Para hacer más clara la descripción, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la ¡nvención se divide en las siguientes subsecciones que describen o ilustran ciertas características, modalidades o aplicaciones de la invención.

Emulsiones submicrométricas de aceite en aqua En una modalidad, la presente ¡nvención proporciona emulsiones submicrométricas de aceite en agua de utilidad como adyuvantes de vacunas. Las emulsiones submicrométricas de aceite en agua de la presente invención potencian la capacidad inmunógena de los antígenos de las composiciones de las vacunas, son seguras para administrarse a animales y permanecen estables durante el almacenamiento. Las emulsiones submicrométricas de aceite en agua de la presente invención están compuestas por un aceite no metabolizable, al menos un tensioactivo y un componente acuoso, en las que el aceite está disperso en el componente acuoso con un tamaño medio de las gotas de aceite en el intervalo submicrométrico. Por "submicroméírico" se quiere decir que las goías son de un tamaño inferior a 1 µm (micrómetro) y el tamaño medio de las gotas de aceite es inferior a 1 µm. Preferiblemente, el tamaño medio de las gotas de la emulsión es inferior a 0.8 µm; más preferiblemente inferior a 0.5 µm; e incluso más preferiblemente inferior a 0.4 µm o aproximadamente 0.1-0.3 µm. El "tamaño medio de las gotas" se define como el tamaño de las partículas del diámetro medio del volumen (DMV) en una distribución del volumen de los tamaños de las partículas. EL DMV se calcula multiplicando cada diámetro de partícula por el volumen de todas las partículas de ese tamaño y sumando. Esto se divide después entre el volumen total de todas las partículas. El término "aceite no metabolizable" tal como se usa en la presente memoria se refiere a aceites que no pueden ser metabolizados por el cuerpo del sujeto animal al que se administra la emulsión. Los términos "animal" y "sujeto animal" tal como se usan en la presente memoria se refieren a lodos los animales no humanos, incluyendo ganado bovino, ovino y porcino por ejemplo. Los aceites no metabolizables adecuados para usar en las emulsiones de la présenle invención incluyen aléanos, alquenos, alquinos y sus ácidos y alcoholes correspondientes, sus éteres y esteres, y sus mezclas. Preferiblemente, los compuestos individuales del aceite son compuesíos hidrocarbonados ligeros, es decir, los componentes de ese tipo tienen de 6 a 30 átomos de carbono. El aceite puede prepararse sintéticamente o purificarse a partir de productos de petróleo. Los aceites preferidos no metabolizables para usar en las emulsiones de la presente invención incluyen aceite mineral, aceite de parafina y cicloparafinas por ejemplo. El término "aceite de parafina" se refiere a una mezcla de hidrocarburos líquidos que se obtienen a partir de vaselina mediante una técnica de destilación. El término es sinónimo de "parafina líquida", "vaselina líquida" y "aceite de parafina blanco". El término se pretende que incluya también "aceite de parafina fluido", es decir, aceite que se obíiene de forma similar mediante destilación de vaselina pero que íiene una gravedad específica ligeramente menor que la vaselina. Véase, por ejemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición (Easíon, Pa.; Mack Publishing Company, 1990, páginas 788 y 1323). El aceite de parafina puede obtenerse en diversas fuentes comerciales, por ejemplo J.T. Baker (Phillipsburg, PA), USB Corporation (Cleveland, OH). El aceiíe de parafina preferido es el aceiíe de parafina fluido disponible comercialmente con el nombre de DRAKEOL®. Típicamente, el componente oleaginoso de las emulsiones submicrométricas de la presente invención está presente en una cantidad de 1 %o a 50%) en volumen; preferiblemente, en una cantidad de 10% a 45; más preferiblemente en una cantidad de 20% a 40%. Las emulsiones de aceite en agua de la presente invención fípicamenle incluyen al menos un (es decir, uno o más) tensioactivo. Los tensioacíivos y emulsionantes, términos que se usan de forma intercambiable en la presente memoria, son agentes que estabilizan la superficie de las gotas de aceite y mantienen las gotas de aceite al tamaño deseado. Tensioactivos adecuados para usar en las presentes emulsiones incluyen tensioactivos biológicamente compatibles naturales y tensioacíivos sintéticos no naturales. Los tensioactivos biológicamente compatibles incluyen compuestos de fosfolípidos o una mezcla de fosfolípidos. Fosfolípídos preferidos son fosfatidilcolinas (lecitina), tales como lecitina de soja o de huevo. La lecitina puede obtenerse en forma de mezcla de fosfátidos y triglicéridos lavando aceites vegetales crudos con agua, y separando y desecando las gomas hidratadas resultantes. Un producto refinado puede obtenerse fraccionando la mezcla para obtener los fosfolípidos y glucolípidos insolubles en acetona que quedan después de eliminar los triglicéridos y el aceiíe vegetal lavando con acetona. De forma alternativa, puede obtenerse lecitina en diversas fuentes comerciales. Otros fosfolípídos adecuados incluyen fosfatidilglicerol, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, ácido fosfatídico, cardiolipina y fosfatidiletanolamina. Los fosfolípidos pueden aislarse de fuentes naturales o siníentizarse convencionalmente. Tensioactivos sintéticos no naturales adecuados para usar en las emulsiones submicrométricas de la presente invención incluyen tensioactivos no iónicos con base de sorbitan, por ejemplo tensioactivos de sorbitan sustituidos con ácidos grasos (disponibles comercialmente con el nombre SPAN® o ARLACEL®), esteres de ácidos grasos de sorbitol polietoxilado (TWEEN®), esteres de polietilenglicol de ácidos grasos de fuentes tales como aceite de ricino (EMULFOR); ácido graso polietoxilado (por ejemplo ácido esteárico disponible con el nombre de SIMULSOL M-53), polímero de isooctilfenol polietoxilado y formaldehído (TYLOXAPOL), éteres de alcoholes grasos de polioxietileno (BRIJ®); éteres de polioxietilen nonfenilo (TRITÓN® N), éteres de polioxieíilenisoocíilfenilo (TRITÓN® X). Tensioacíivos sintéticos preferidos son los tensioaclivos disponibles con el nombre de SPAN® y TWEEN®. Tensioacíivos preferidos para usar en las emulsiones de aceite en agua de la présenle invención incluyen lecitina, Tween-80 y SPAN-80. En general el tensioactivo, o la combinación de tensioactivos, si se usan dos o mas tensioactivos, está presente en la emulsión en una cantidad de 0.01 % a 10% en volumen, preferiblemente de 0.1 % a 6.0%, más preferiblemente de 0.2% a 5.0%. El componente acuoso constifuye la fase coníinua de la emulsión y puede ser agua, solución salina regulada de pH o cualquier oíra solución acuosa adecuada. Las emulsiones de aceite en agua de la presente ¡nvención pueden incluir componentes adicionales que son apropiados y deseables, incluyendo conservadores, agentes osmóticos, moléculas bioadhesivas y moléculas ¡nmunostimuladoras. Se cree que las moléculas bioadhesivas pueden potenciar la administración y unión de antígenos sobre o a través de la superficie mucosa objetivo confiriendo inmunidad a las mucosas. Ejemplos de moléculas bioadhesivas adecuadas incluyen polímeros ácidos no naturales tales como ácido poliacrílico y ácido polimetracrílico (por ejemplo CARBOPOL®, CARBOMER); polímeros naturales modificados sintéticamente ácidos tales como carboximetilcelulosa; polímeros naturales modificados sintéíicameníe neutros tales como (hidroxipropil)metilcelulosa; polímeros que portan aminas básicas tales como quitosan; polímeros ácidos que pueden obtenerse de fuentes naturales tales como ácido algínico, ácido hialurónico, pectina, goma de tragacanto y goma de karaya; y polímeros naturales neutros no naturales, tales como alcohol polivinílico; o sus combinaciones. La frase "moléculas inmunoestimuladoras" íal como se usa en la presente memoria, se refiere a las moléculas que potencian la respuesta ¡nmunitaria protectora inducida por un componente antígeno en las composiciones de las vacunas. Los materiales inmunoesíimuladores adecuados incluyen componeníes de la pared celular bacteriana, por ejemplo derivados de N-acetil-muramil-L-alan¡l-D-isoglutamina tales como murabutida, treonil-MDP y muramil tripéplido; glucósidos de saponina y sus derivados, por ejemplo Quil A, QS 21 y GPI-0100; colesíerol y compuesíos de amonio cuaternario, por ejemplo bromuro de dimetildiocíadecilamonio (DDA) y N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxíetil)propanodiam¡na ("avridina"). Las saponinas son compuestos glucosídicos que se producen como metabolitos secundarios en una gran variedad de especies vegetales. La estructura química de las saponinas confiere una amplia gama de actividades farmacológicas y biológicas, que incluyen alguna actividad inmunológica poteníe y eficaz.

Estructuralmente, las saponinas están constituidas por cualquier aglucona unida a una o más cadenas de azúcares. Las saponinas pueden clasificarse de acuerdo con su composición de agluconas: glucósidos triterpénicos, glucósidos esteroideos y glucósidos alcaloides esteroideos. La saponina puede aislarse de la corteza de Quillaja saponaria.

La saponina ha sido conocida desde hace mucho como inmunoestimulador. Dalsgaard, K., "Evaluation of ¡ts adjuvant activity with special reference to the applicaíion in íhe vaccinaíion of cattle against foot-and-mouth disease", Acta. Ver. Scand. 69: 1-40 1978. Los extractos brutos de plantas que contenían saponinas mejoraron la potencia de las vacunas contra la glosopeda. Sin embargo, los exíracfos brutos se asociaron a efectos secundarios adversos cuando se usaron en vacunas. Subsiguientemente, Dalsgaard purificó parcialmente el componente activo del adyuvante de saponina mediante diálisis, intercambio de iones y cromatografía por filtración en gel. Dalsgaard, K. y cois. "Saponin Adjuvants III. Isolation of a substance from Quillaja saponaria Morina with adjuvant activity in foot-and-mouth disease vaccines", Aren. Gesamte. Virusforsch. 44: 243-254 1974. Un componente acíivo de adyuvante purificado de esta forma se conoce como "Quil A". En base al peso, Quil A demostró una potencia aumentada y mostró reacciones locales reducidas cuando se comparó con saponina bruta. Quil A se usa extensamente en vacunas veterinarias. El análisis ulterior de Quil A mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) reveló una mezcla heterogénea de saponinas muy similares y condujo al descubrimiento de QS21 que era un adyuvante potente con una toxicidad reducida o mínima. Kensil C.R. y cois., "Separation and characíerizafion of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex", J. Immunol. 146: 431-437, 1991. Al contrario que la mayoría de los otros inmunoestimuladores, QS21 es soluble en agua y puede usarse en vacunas con o sin formulaciones de tipo emulsión. Se ha demostrado que QS21 provoca una respuesta de tipo Th1 en ratones estimulando la producción de anticuerpos lgG2 e lgG2b e indujo CD8 + CTL (MHC clase I) específico de antígeno en respuesta a antígenos subunitarios. Los estudios clínicos en seres humanos han demostrado su capacidad como adyuvante con un perfil íoxicológico aceptable. Kensil, C.R. y cois., "Structural and ¡mmunological characterization of the vaccine adjuvant QS-21. In Vaccine Design: the subunit and Adjuvaní Approach," Editores Powell, M.F. y Newman, M.J. Plenum Publishing Corporation, New York 1995, páginas 525-541. La patente de Estados Unidos 6,080,725 enseña los métodos para preparar y usar conjugado de saponina y lipófilo. En este conjugado de saponina y lipófilo, un resto lipófilo tal como un lípido, ácido graso, polietilenglicol o íerpeno se une covalentemente a una saponina triterpénica no adiada o desacilada mediante un grupo carboxi presente en el ácido 3-O-glucurónico de la saponina triterpénica. La unión de un resto lipófilo al ácido 3-O-glucurónico de una saponina tal como desacilsaponina de Quillaja, luciosida P o saponina de Gypsophila, saponaria y Acanthophyllum potencia sus efectos adyuvantes sobre la inmunidad humoral y mediada por células.

Además, la unión de un resto lipófilo al resto de ácido 3-O-glucurónico de una saponina no adiada o desacilada proporciona un análogo de saponina que es más fácil de purificar, menos tóxico, químicamente más estable y posee propiedades como adyuvante ¡guales o mejores que la saponina original. GPI-0100 es un conjugado de saponina y lipófilo que se describe en la patente de Estados Unidos 6,080,725. GPI-0100 se produce mediante la adición de una amina alifática a desacilsaponina mediante el grupo carboxilo del ácido glucurónico. Compuestos de amonio cuaternario - Se ha propuesto un número de bases nitrogenadas alifáticas para usar como adyuvantes inmunológicos, incluyendo aminas, compuestos de amonio cuaternario, guanidinas, benzamidinas y tiouronios. Compuestos específicos de ese tipo incluyen bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) y N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxieíil)propanodiamina ("avridina"). La patente de Estados Unidos 5,951 ,988 enseña una formulación de adyuvante que contiene sales de amonio cuaternario tales como DDA junto con un componente oleaginoso. Esta formulación es útil junto con sustancias inmunológicas conocidas, por ejemplo antígenos víricos o bacterianos en una composición de vacuna, para potenciar la respuesía ¡nmunógena. La composición es íambién útil sin un antígeno incorporado como formulación ¡nmunoestimuladora no específica. La patente de Estados Unidos 4,310,550 describe el uso de N,N-alquilo superior-N,N'-bis(2-hidrox¡eíil)propanodiam¡na y N, N-alquilo superior- xililendiaminas formuladas con emulsión grasa o lipídica como adyuvante de vacunas. En la patente de Estados Unidos 4,310,550 se describe un méíodo para inducir o potenciar la respuesta inmunógena de un antígeno en el hombre o en un animal mediante la administración parenteral de la formulación de adyuvante. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona una emulsión submicrométrica de aceite en agua de utilidad como adyuvante de vacunas, que se compone de una formulación de AMPHIGEN®, con gotas de un tamaño inferior a 1 µm y un tamaño medio de las gotas de aproximadamente 0.25 µm. El término "formulación de AMPHIGEN®" tal como se usa en la presente memoria se refiere a una solución formada mezclando una solución de aceite de leciíina DRAKEOL® (Hydronics, Lincoln, NE) con solución salina en presencia de TWEEN® 80 y SPAN® 80. Una formulación típica de AMPHIGEN® contiene aceite de parafina fluido al 40%> en volumen (v/v), aproximadameníe 25% p/v de lecííina, aproximadameníe 0.18% en volumen (v/v) de TWEEN 80 y aproximadameníe 0,08%> en volumen (v/v) de Span 80.

Méíodos para preparar emulsiones submicrométricas de aceiíe en agua En oíra modalidad, la preseníe invención proporciona métodos para preparar las emulsiones submicrométricas de aceiíe en agua que se describen anteriormente.

De acuerdo con la presente invención, los diversos componentes de la emulsión, incluyendo el aceiíe, uno o más tensioactivos, un componente acuoso y cualquier oíro componeníe adecuado para usar en la emulsión se combinan y mezclan eníre si. La mezcla formada se somete a un procedimiento de emulsificación, íípicameníe pasando una o más veces a íravés de uno o más homogenizadores o emulsionadores para formar una emulsión de aceite en agua que íiene un aspecto uniforme y un íamaño medio de las goías de aproximadameníe 0.5 µm. Para esíe fin puede usarse cualquier homogenizador o emulsionador disponible comercialmente, por ejemplo emulsionador Ross (Hauppauge, NY), homogenizador Gaulin (Everetí, MA). La emulsión así formada se somete después a microfluidificación para llevar el tamaño de las goías al intervalo submicrométrico. La microfluidificación puede lograrse usando un microfluidizador comercial tal como el número de modelo 110Y disponible en Microfluidics, Newton, Mass; el modelo 30CD de Gaulin (Gaulin, Inc., Evereíí, Mass.); y Rainnie Minilab íipo 8.30H (Miro Alomizer Food and Dairy Inc., Hudson, Wis.). Esíos microfluidizadores operan forzando los fluidos a íravés de pequeñas aperturas a presión elevada, de íal forma que los dos chorros de fluido ¡níeracfúan a velocidades elevadas en una cámara de interacción para formar emulsiones con golas de un íamaño submicrométrico. El tamaño de la gota puede determinarse mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, difracción por láser, usando insírumentos de medición disponibles comercialmente. El tamaño puede variar dependiendo del íipo de lensioacíivo usado, la relación enlre tensioactivo y aceite, la presión a la que se trabaje, la temperatura y similares. El experto en la íécnica puede determinar la combinación deseada de estos parámeíros para obtener emulsiones con el tamaño de las gotas deseado sin experimentación excesiva. Las gofas de las emulsiones de la presente invención íienen un diámeíro inferior a 1 µm, preferiblemeníe un íamaño medio de las goías inferior a 0.8 µm, y más preferiblemeníe un tamaño medio de las gotas inferior a 0.5 µm, e incluso más preferiblemente un tamaño medio de las gotas inferior a 0.3 µm. En una modalidad preferida de la presente ¡nvención, la solución oleaginosa de lecitina DRAKEOL, que está disponible comercialmente de Hydronics (Lincoln, NE) y coníiene leciíina al 25% en aceite de parafina fluido, se combina y mezcla con solución salina así como con los íensioacfivos TWEEN® 80 y SPAN® 80 para formar una "solución de AMPHIGEN®" o "formulación de AMPHIGEN®". La solución de AMPHIGEN® se emulsiona después con un emulsionador Ross® (Hauppauge, NY 11788) aproximadameníe a 3400 rpm para formar una emulsión de agua en aceiíe. Subsiguientemente la emulsión se hace pasar una vez a fravés de un Microfluidizador que trabaja a 31 ,027.5 kPa ± 3,447.5 kPa. La emulsión de aceite en agua fiene goías de un tamaño inferior a 1 µm, con un tamaño medio de las gotas de aproximadamente 0.25 µm.

Composiciones de las vacunas que coníienen aníígenos incorporados en emulsiones submicroméírícas de aceite en agua En otra modalidad, la preseníe ¡nvención proporciona composiciones de las vacunas que coníienen un antígeno(s) y una emulsión submicroméírica de aceite en agua descriía anteriormente. Esías composiciones de las vacunas se caracterizan porque fienen un efecío inmunógeno potenciado y un aspecto físico mejorado (por ejemplo no se observa separación de fases después de un periodo de almacenamiento largo). Además, las composiciones de las vacunas de la presente invención son seguras para la administración a animales. De acuerdo con la presenfe invención, el aníígeno puede combinarse con la emulsión de forma exlrínseca o, preferiblemeníe, de forma inírínseca. El término "¡nírínseco" se refiere al procedimiento en el que el antígeno se combina con los componentes de la emulsión antes de la etapa de microfluidifización. El término "exírínseco" se refiere al procedimiento en el que el antígeno se añade a la emulsión después de que la emulsión ha sido microfluidifizada. El antígeno añadido de forma extrínseca puede ser antígeno libre o puede estar encapsulado en micropartículas tal como se describe con más detalle más adelanté. El término "aníígeno" íal como se usa en la preseníe memoria, se refiere a cualquier molécula, compuesto o composición que es inmunógeno en un animal y se incluye en la composición de vacuna para provocar una respuesía inmunifaria proíeclora en el animal al que se administra la composición de vacuna. El término "inmunógeno" íal como se usa en relación con un aníígeno se refiere a la capacidad del aníígeno de provocar una respuesta ¡nmunifaria en un animal confra el aníígeno. La respuesta inmunilaria puede ser una respuesía inmuniíaria celular mediada primord ¡alíñente por linfocitos T citoíóxicos, o una respuesta inmunitaria humoral mediada primordialmeníe por linfocifos T cooperadores, que a su vez acíivan linfociíos B que provocan la producción de aníicuerpos. Una "respuesta ¡nmunifaria proíeclora" se define como una respuesía inmunitaria cualquiera, ya sea respuesta inmunitaria de anticuerpos o mediada por células, o ambos, que se produce en el animal que previene o reduce de forma detectable la aparición o elimina o reduce de forma detectable la gravedad, o ralentiza de forma detectable la velocidad de la progresión, del trastorno o enfermedad provocada por el antígeno o un patógeno que coníiene el aniígeno. Los aníígenos que pueden incluirse en la composición de vacuna de la preseníe invención incluyen aníígenos preparados a partir de bacterias patógenas tales como Mycoplasma hyponeumoniae, Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, Bordetella bronchiseptica, Actinobacillus pleuropneumonie, Pasteurella multocida, Manheimia hemolitica, Mycoplasma bovis, Mycoplasma galanacieum, Mycobacterium bovis, Mycobacteríum paratuberculosis, Clostridial spp., Streptococcus uberis, Streptococcus suis, Staphylococcus aureus, Erysipelothrix rhusopathiae, Campylobacter spp., Fusobacterium necrophorum, Escherichia coli, Salmonella entérica serovars, Leptospira spp.; hongos patógenos tales como Candida; protozoos tales como Cryptosporidium parvum, Neospora canium, Toxoplasma gondii, Eimeria spp.; helmintos tales como Ostertagia, Cooperia, Haemonchus, Fasciola, ya sea en forma de una preparación de células eníeras inacíivadas o parciales o en forma de moléculas antigénicas obtenidas por purificación convencional de proteínas, técnicas de ingeniería genética o síntesis química. Antígenos adicionales incluyen virus patógenos íales como virus del herpes bovino 1 , 3, 6, virus de diarrea vírica bovina (BVDV) lipos 1 y 2, virus de la pseudogripe bovina, virus sincitial respiratorio bovino, virus de leucosis bovino, virus de rinderpest, virus de la glosopeda, rabia, virus de la fiebre porcina, virus de la fiebre porcina africana, parvovirus porcino, virus PRRS, circovirus porcino, virus de la gripe, virus de enfermedad vesicular porcino, virus de fiebre de Techen, virus pseudorrábico, ya sea en forma de una preparación de virus enteros inactivados o parciales, o en forma de moléculas antigénicas obtenidas por purificación convencional de proteínas, técnicas de ingeniería genética o síntesis química. La cantidad del antígeno debe ser tal que el antígeno, combinado con la emulsión de aceite en agua, sea efectivo para inducir una respuesta inmunitaria protectora en un animal. La caníidad precisa para que un anfígeno sea efecíivo depende de la naíuraleza, acíividad y pureza del aniígeno y puede ser determinada por los expertos en la técnica. La cantidad de emulsión de aceite en agua presente en las composiciones de las vacunas debe ser suficiente para potenciar la capacidad inmunógena del (de los) antígeno(s) en las composiciones de las vacunas. Cuando sea deseable y apropiado, pueden añadirse cantidades adicionales de tensioactivo(s) o tensioactivo(s) adicional(es) a la composición de la vacuna además del (de los) tensioacíivo(s) proporcionados por la emulsión de aceife en agua. De forma general, el componente oleaginoso está presente en el volumen final de una composición de vacuna en una cantidad de 1.0% a 20%o en volumen; preferiblemente en una caníidad de 1.0% a 10%>; más preferiblemenfe en una caníidad de 2.0% a 5.0%. El íensioacíivo, o la combinación de íensioacíivos si se usan dos o más íensioacfivos, esíá preseníe en el volumen final de una composición de vacuna en una caníidad de 0.1 %) a 20% en volumen, preferiblemeníe 0.15%) a 10%, más preferiblemente 1.2% a 6.0%. Además del (de los) aníígeno(s) y la emulsión de aceiíe en agua, la composición de vacuna puede incluir oíros componeníes que son apropiados y deseables, íales como conservadores, ageníes osmóíicos, moléculas bioadhesivas y moléculas ¡nmunoestimuladoras (por ejemplo Quil A, colesterol, GPI-0100, bromuro de dimeíildiocíadecilamonio (DDA)), tal como se describe anteriormente en relación con la emulsión de aceite en agua. Las composiciones de las vacunas de la presente invención pueden incluir también un vehículo veterinaria mente aceptable. El término "un vehículo veíerinariameníe aceptable" incluye cualquiera y iodos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, adyuvantes, ageníes estabilizantes, diluyentes, conservadores, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes ¡soíónicos, agentes retardantes de la adsorción y similares. Los diluyenles pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, etanol, glicerol y similares. Agentes isotónicos pueden incluir cloruro sódico, dexírosa, maniíol, sorbifol y lactosa enfre oíros. Estabilizadores incluyen albúmina eníre otros. En una modalidad preferida, la presente ¡nvención proporciona una composición de vacuna que incluye al menos uno de un antígeno de BVDV fipo I o BVDV tipo II, que se incorpora de forma intrínseca a un emulsión de aceite en agua que íiene goías de un tamaño inferior a 1 µm, preferiblemeníe de un íamaño medio de las goías inferior a 1.8 µm, más preferiblemenfe inferior a 1.5 µm, e incluso más preferiblemente de un tamaño medio de las gotas de aproximadamente 1.5 µm. El antígeno de BVDV íípo I y/o II está preferiblemente en forma de una preparación vírica ¡nactivada. La emulsión submicrométrica de aceite en agua preferiblemente está compuesta por una formulación de AMPHIGEN® (es decir, una formulación que contiene aceite de parafina fluido, lecitina, TWEEN® 80 y SPAN® 80). La composición de vacuna preferiblemente incluye también Quil A, colesterol y timerosol. En oíra modalidad preferida, la preseníe ¡nvención proporciona una composición de vacuna que incluye un aníígeno de Lepfospira y al menos uno de un aníígeno de BVDV íipo I o BVDV tipo II en una emulsión de aceite en agua. Los antígenos, preferiblemente en forma de preparación celular o vírica inactivada, se incorporan de forma intrínseca a la emulsión submicrométrica de aceite en agua que tiene gotas de un íamaño inferior a 1 µm; preferiblemente de un íamaño medio de las goías inferior a 1.8 µm, más preferiblemente inferior a 1.5 µm, e incluso más preferiblemente de un tamaño medio de las goías de aproximadamente 1.5 µm. La emulsión submicroméírica de aceiíe en agua preferiblemeníe está compuesta por una formulación de AMPHIGEN® (es decir, una formulación que contiene aceite de parafina fluido, lecitina, TWEEN® 80 y SPAN® 80). La composición de vacuna preferiblemeníe incluye íambién una o más moléculas ¡nmunoesfimuladoras que se seleccionan de Quil-A, colesíerol, DDA, GPI-100 e hidróxido de aluminio (AIOH). Todavía en oíra modalidad preferida, la presente ¡nvención proporciona una composición de vacuna que incluye al menos un agente bacteriano, por ejemplo la proteína PauA de Streptococcus uberis recombinante o una preparación de células de E. coli o una combinación de ambas en una emulsión de aceiíe en agua. El/Ios anlígeno(s) se combína(n) de forma intrínseca con la emulsión submicrométrica de aceite en agua que tiene gotas de un tamaño inferior a 1 µm, preferiblemente de un tamaño medio de las goías inferior a 1.8 µm, más preferiblemeníe inferior a 1.5 µm, e incluso más preferiblemeníe de un tamaño medio de las gotas de aproximadamente 1.25 µm. La emulsión submicrométrica de aceite en agua preferiblemente está compuesta por una formulación de AMPHIGEN® (es decir, una formulación que coníiene aceite de parafina fluido, lecilina, TWEEN® 80 y SPAN® 80). La composición de vacuna preferiblemente incluye también una o más moléculas inmunoestimuladoras que se seleccionan de Quil-A, DDA, GPI-100. Las composiciones de las vacunas de la presente ¡nvención pueden administrarse a un animal por vías conocidas, incluyendo la vía oral, iníranasal, mucosa, tópica, transdérmica y parenteral (por ejemplo intravenosa, iníraperitoneal, ¡nfradérmica, subcutánea o intramuscular). La administración puede lograrse usando una combinación de vías, por ejemplo la primera adminisíración usando una vía pareníeral y la adminisíración subsiguiente usando una vía mucosa.

Méíodos para preparar composiciones de las vacunas En una modalidad adicional, la presenfe invención proporciona métodos para preparar composiciones de las vacunas que confienen un anfígeno o aníígenos y una emulsión submicroméírica de aceite en agua. Para preparar las composiciones de las vacunas de la presente invención, el/los antígeno(s) puede(n) combinarse de forma intrínseca o de forma extrínseca con los componentes de la emulsión de aceite en agua.

Preferiblemeníe, el antígeno se combina con los componentes de la emulsión de aceite en agua de forma intrínseca. El aníígeno puede combinarse con los diversos componeníes de la emulsión, incluyendo el aceiíe, uno o más íensioacíivos, un componente acuoso y cualquier otro componente apropiado para formar una mezcla. La mezcla se somete a un método de mezclado típicamente pasándola una o más veces a través de uno o más homogenizadores o emulsionadores para formar una emulsión de aceiíe en agua que confiene el antígeno. Puede usarse cualquier homogenizador o emulsionador disponible comercialmente, por ejemplo emulsionador Ross (Hauppauge, NY), homogenizador Gaulin (Everett, MA) o Microfluidics (Newton, Ma). De forma alternaíiva, los diversos componeníes de la emulsión adyuvaníe, incluyendo el aceite, uno o más tensioacfivos y un componente acuoso puede combinarse primero para formar una emulsión submicrométrica de aceiíe en agua usando un homogenizador o emulsionador; y el antígeno se añade después a esta emulsión. El tamaño medio de las goías de la emulsión de aceiíe en agua después del mezclado primario es de aproximadamente 1.0-1.2 micrómetros. La emulsión que contiene el aníígeno se somete después a microfluidificación para llevar el tamaño de las gotas al intervalo submicrométrico. La microfluidificación puede lograrse usando un microfluidizador comercial tal como el número de modelo 110Y disponible en Microfluidics, Newton, Mass; el modelo 30CD de Gaulin (Gaulin, Inc., Everetf, Mass.); y Rainnie Minilab íipo 8.30H (Miro Aíomizer Food and Dairy Inc., Hudson, Wis.). El tamaño de la gofa puede determinarse mediante una variedad de métodos conocidos en la íécnica, por ejemplo, difracción de rayos láser, usando insírumenlos de medición disponibles comercialmente. El íamaño puede variar dependiendo del tipo de tensioacíivo usado, la relación enlre fensioactivo y aceite, la presión a la que se trabaje, la temperatura y similares. Se puede determinar una combinación deseada de estos parámetros para obíener emulsiones con un tamaño de las goías deseado. Las goías de aceiíe de las emulsiones de la preseníe ¡nvención son inferiores a 1 µm de diámeíro. Preferiblemente el tamaño medio de las golas es inferior a 1.8 µm. Más preferiblemente, el tamaño medio de las gotas es inferior a 1.5 µm. Incluso más preferiblemente, el tamaño medio de las gotas está entre 0.1 µm y 1.3 µm. En una modalidad preferida de la presente invención, la solución oleaginosa de lecitina DRAKEOL®, que contiene lecitina al 25% en aceite de parafina fluido, se combina y mezcla con los tensioacíivos TWEEN® 80 y SPAN® 80 y solución salina para formar una mezcla que coníiene aceite de parafina fluido al 40%, TWEEN® 80 al 0.18%) y SPAN® 80 al 0.08%. La mezcla se emulsiona después con un emulsionador Ross® (Hauppauge, NY 11788) aproximadamente a 3400 rpm para formar un producto emulsionado que se denomina también "formulación de AMPHIGEN®" o "solución de AMPHIGEN®". Subsiguientemente, el/los antígeno(s) deseado(s) se combinan con la solución de AMPHIGEN® y cualesquiera oíros componeníes adecuados (por ejemplo moléculas inmunoesfimuladoras) con ayuda de un emulsionador, por ejemplo, homogenizador Ross, para formar una emulsión de agua en aceite que coníiene el/los antígeno(s). Tal emulsión se hace pasar una vez a íravés de un Microfluidizador que írabaja a 6895 ± 3447.5 pKa. La emulsión de aceiíe en agua íiene goías de un tamaño inferior a 1 µm, con un tamaño medio de las gotas de aproximadamente 1.25 µm. En otra modalidad preferida, antes de combinar una emulsión de aceite en agua (por ejemplo una formulación de AMPHIGEN®) con un(os) anlígeno(s) deseado(s), el/los antígeno(s) se combina(n) con un glucósido de saponina, por ejemplo Quil A, formando una mezcla. Esta mezcla de aníígeno(s) y saponina se somete a homogenización, por ejemplo, en un recipiente de homogenización. Después se añade un esteral, por ejemplo, colesíerol, a la mezcla homogenizada de antígeno(s) y saponina. Después, la mezcla que coníiene el/los aníígeno(s), la saponina y el esteral se vuelve a someter a homogenización. Después, la mezcla de antígeno(s), saponina y esferal homogenizada se combina con una emulsión de aceife en agua (por ejemplo una formulación de AMPHIGEN®) con ayuda de un homogenizador, por ejemplo. Después, ia emulsión de aceite en agua que coníiene el/los anfígeno(s), la saponina y el esteral se somete a homogenización a presión elevada, íal como microfluidización. .

Composiciones de las vacunas que coníienen aníígenos microencapsulados en una emulsión submicroméírica de aceiíe en agua y méíodos de preparación Todavía en oíra modalidad, la preseníe ¡nvención proporciona composiciones de las vacunas que coníienen un aníígeno encapsulado en micropartículas (o "agente microencapsulado"), en los que el aníígeno microencapsulado se incorpora de forma exlrínseca a una emulsión submicroméírica de aceite en agua descriía anteriormente. Los métodos para absorber o atrapar antígenos en vehículos particulados son notorios en la técnica. Véase por ejemplo Pharmaceutical Particulate Carriers: Therapeutic Applications (Justin Hanes, Masaíoshi Chiba y Robert Langer. Polymer microspheres for vaccine delivery. En: Vaccine design. The subunií and adjuvaní approach. Editores Michael F. Powell y Mark J. Newman, 1995 Plenum Press, Nueva York y Londres). Los vehículos particulados pueden presentar copias múltiples de un antígeno seleccionado al sisíema inmuniíario en un sujeío animal y promover la capíura y retención de anfígenos en los nodulos linfáticos locales. Las partículas pueden ser fagociíadas por macrófagos y pueden potenciar la presentación de los antígenos a través de la liberación de citocinas. También se han descriío en la técnica vehículos particulados e incluyen por ejemplo los que se derivan de polímeros de polimeíacrilaío de metilo, así como los que se derivan de poli(lactidas) y poli(lací¡da-co-glucolidas), que se conocen como PLG. Los polímeros de polimetilmeíacrilato no son biodegradables mientras que las partículas de PLG pueden ser biodegradables por hidrólisis aleatoria no enzimática de enlaces éster hacia ácidos láctico y glucólico que se excretan por rutas metabólicas normales. También se han usado microesferas biodegradables para lograr la liberación controlada de vacunas. Por ejemplo puede lograrse una liberación continuada de antígeno durante un periodo prolongado. Dependiendo del peso molecular del polímero y de la relación eníre ácido lácíico y glucólico en el polímero, un polímero de PLGA puede tener una velocidad de hidrólisis desde unos pocos días o semanas hasta varios meses o un año. Una liberación lenta y controlada puede provocar la formación de niveles elevados de anticuerpos similares a los que se observan tras inyecciones múltiples. De forma alternativa, puede lograrse una liberación pulsátil de antígenos de las vacunas seleccionando polímeros con diferentes velocidades de hidrólisis. La velocidad de hidrólisis de un polímero típicamente depende del peso molecular del polímero y la relación entre ácido láctico y ácido glucólico en el polímero. Las micropartículas que están formadas por dos o más polímeros diferentes con velocidades variables de liberación de anlígenos proporcionan liberaciones pulsátiles de antígenos e imitan las pautas de vacunación de dosis múltiples. De acuerdo con la presente invención, un anfígeno, incluyendo cualquiera de los que se describen anteriormente, puede absorberse sobre un vehículo polimérico particulado, preferiblemeníe un polímero de PLG, usando cualquier méíodo conocido en la íécnica (lal como el que se ejemplifica en el ejemplo 17) para formar una preparación de aníígeno microencapsulado. La preparación de antígeno microencapsulado se mezcla después y se dispersa en una emulsión submicrométrica de aceite en agua, emulsión que ha sido descrita anteriormente, para formar la composición de vacuna. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona una composición de vacuna que contiene un antígeno encapsulado en un polímero de PLG, en la que el antígeno microencapsulado está disperso de forma extrínseca en una emulsión de aceiíe en agua microfluidifizada que esíá compuesta por aceiíe de parafina fluido, lecifina, TWEEN80, SPAN80 y solución salina y tiene un tamaño medio de las gotas inferior a 1.0 µm.

Complejos formados por una saponina y un esteral En una modalidad, la presente ¡nvención proporciona composiciones que contienen una saponina y un esíerol, en las que la saponina y el esteral forman complejos en forma de micelas helicoidales. De acuerdo con la preseníe invención, estos complejos íienen acíividades inmunoesíimuladoras. Por "inmunoestimulador" se quiere decir que los complejos pueden potenciar la respuesía inmuniíaria inducida por un componente antígeno o que los complejos pueden inducir una respuesta inmunitaria independiente de un componeníe antígeno aparte. De acuerdo con la preseníe invención, una saponina preferida para usar en una composición de la preseníe invención es Quil A. Esferales preferidos para usar en las composiciones de adyuvantes de la preseníe invención incluyen beía-siíoslerol, esíigmasterol, ergosterol, ergocalciferol y colesíerol. Estos esterales son notorios en la técnica, por ejemplo, el colesterol se describe en Merck Index, 11a Edición, página 341 , como un esteral natural que se encuentra en la grasa animal. Más preferiblemente el esteral es colesterol. La relación entre la saponina y el esteral en la composición es fípicameníe del orden de 1 :100 a 5:1 en peso. Preferiblemente, la relación es 1 :1.

En olra modalidad, la presente ¡nvención proporciona composiciones de vacunas que contienen una saponina, un esterol y un anfígeno, en las que la saponina y esíerol forman complejos en forma de micelas helicoidales y en las que el aniígeno se mezcla pero no se incorpora a las micelas helicoidales. A coníinuación se incluyen ejemplos de modalidades específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen únicamente con fines ilustrativos y no se pretende que limiíen el alcance de la preseníe invención en modo alguno.

EJEMPLO 1 Preparación de una formulación de AMPHIGEN® Se preparó una formulación de AMPHIGEN® por un méíodo en dos etapas. En la primera etapa se mezclaron 80 litros de solución en aceite de lecifina Drakeol, 116 liíros de solución salina de Toxoide de ténanos, 1.2 litros de SPAN 80, y 2.8 litros de Tween 80 y se emulsionaron usando un emulsionador Ross. La solución resultante en aceite de lecitina Drakeol contenía lecilina de soja al 25% y aceife de parafina al 75%. El produelo emulsionado se hizo redrcular por el emulsionador Ross durante un mínimo de 5 volúmenes o un mínimo de 10 minutos. El produelo emulsionado se almacenó a 2-7°C duraníe un máximo de 24 horas para procesamiento adicional. La emulsión del tanque del emulsionador Ross se transfirió a un homogenizador Gaulin y se homogenizó durante 20 minutos a una presión de 3.102.75 kPa. La solución en aceite de lecitina Drakeol al 40%¡ (en lo sucesivo "formulación de AMPHIGEN®" o "solución de AMPHIGEN®") se dispensó después en envases de carboxi polipropileno estériles. La distribución se realizó dentro de una campana de distribución de clase 100 localizada en un ambiente controlado de clase 10.000. Los envases se almacenaron a 2-7°C. Esta formulación de AMPHIGEN® se usó en los experimentos que se describen a continuación a no ser que se indique lo contrario.

EJEMPLO 2 Mezclado primario mediante homogenización por mezclado ultrarrápido de la vacuna contra BVD El aparato usado para este método de homogenización se muestra en la figura 1. Usando técnica aséptica o válvulas cruzadas de vapor, se unió un frasco que contenía un antígeno de BVD Tipo I (una preparación vírica de BVD Tipo I inacíivado) al puerto de la parte inferior del recipiente de mezclado. Después de completar la transferencia del volumen requerido del antígeno de BVD Tipo I, se sustiíuyó el frasco de BVD Tipo I por el envase que contenía una preparación vírica de BVD Tipo II (una preparación vírica de BVD Tipo II inactivaclo). Después de completar la íransferencia de la canfidad requerida de un aníígeno de BVD Tipo II, se unió el homogenizador Ross al recipiente portátil y se inició la recirculación a las máximas RPM (3300 rpm).

La agitación del recipiente se maníuvo a velocidad media. Usando íécnica asépíica o válvulas cruzadas de vapor, se unió un frasco que contenía Quil-A con una concentración de 50 mg/ml al puerto en línea del homogenízador del recipiente de mezclado. Se pasó una cantidad requerida de la solución de Quil-A al recipiente a través de succión en línea. Después de completar la transferencia de solución de Quil-A, se retiró el frasco. Del mismo modo, se transfirió una cantidad requerida de colesterol en solución de eíanol (18 mg/ml) al recipienfe de mezclado. Subsiguientemente, se añadieron al recipiente de mezclado una cantidad requerida de la formulación de AMPHIGEN®, solución de timerosol al 10% y soluciones de dilución de medio de Eagle Modificado Básico ("BME"). Una vez se completaron las adiciones, se continuó mezclando durante oíros 15 minuíos. La formulación resultante se dividió en dosis alícuotas de 2 ml y representaba una vacuna de BVD con base de formulación de AMPHIGEN® no mícrofluidifizada. Cada dosis de la vacuna contenía 500 µg de Quil-A, 500 µg de colesterol, formulación de AMPHIGEN® al 2.5% y timerosol al 0.009%. La concentración de antígeno para las dos cepas diferentes de BVD se determinó en términos de la valoración de ELISA para gp53.

EJEMPLO 3 Mezclado secundario por microfluidifización La figura 2 ¡lustra el método usado para la mezcla secundaria medianíe microfluidización. El microfluidizador se eslerilizó al vapor. Primero se instaló la cámara del módulo de procesamiento auxiliar en la unidad y se instaló la cámara del blanco en la segunda posición de la cámara. Se conectó el recipiente que coníenía la vacuna de BVD con todos los adyuvaníes preparada íal como se describe en el ejemplo 2 al microfluidizador uniendo una línea de íransferencia desde la válvula de drenado del recipiente de suministro a la admisión del microfluidizador. Se conectó gas nitrógeno a la admisión del filtro de aire del recipiente de suminisíro y se ajusfó la presión de recipiente a 137.9 +/- 34.475 kPa. La válvula de drenaje del recipiente colector se conectó a la línea de transferencia de la salida del microfluidizador. Después de realizar todas las conexiones necesarias, se abrieron las válvulas y se inició la microfluidización con una presión de apertura de 6895 +/- 3447.5 kPa. El contenido completo de la vacuna se pasó a través del microfluidizador una vez y se recogió en la cámara post-microfluidización. Esta preparación se dividió en dosis alícuotas de 2 ml y representa la vacuna de BVD con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidifizada.

EJEMPLO 4 Preparación de una composición de vacuna mediante mezclado en banco La formulación de AMPHIGEN® preparada tal como se describe en el ejemplo 1 se diluyó al 2.5% añadiendo antígenos de BVD y el diluyente. La solución resultante se mezcló en el banco usando una barra de agitación en lugar de un homogenizador. La preparación final contenía la siguiente composición: aníígenos de BVD Tipo 1 y Tipo 2, formulación de AMPHIGEN® al 2.5%) (que coníiene aceite, lecitina, SPAN® y TWEEN®, fal como se describe en el ejemplo 1 ) y solución salina. TWEEN 80 y SPAN 80 esíán presentes en la preparación de vacuna final a 0.18% y 0.08%o en volumen respecíivamenfe.

EJEMPLO 5 Comparación de la distribución de tamaño de las gotas entre las preparaciones de las vacunas con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidifizada y microfluidifizada La vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidifizada preparada íal como se describe en el ejemplo 2, la vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidifizada preparada íal como se describe en el ejemplo 3 y la preparación preparada por mezcla en banco tal como se describe en el ejemplo 4 se usaron para comparar el tamaño de las gotas de las preparaciones de las vacunas. Se añadieron 2 ml de la muestra de cada una de las preparaciones a un difractómetro láser Malvern 2000 y se determinó la distribución del tamaño de las gofas. Como se muestra en la figura 3, los resultados indican que la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidifizada tenía el volumen máximo de partícula alrededor de 0.1 micrómeíros mienfras que la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidifizada tenía el volumen máximo de disíribución de partículas alrededor de 1 micrómelro.

EJEMPLO 6 Reducción de la separación de las fases de las vacunas.

Se compararon fres preparaciones de las vacunas diferentes: la vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® no microfluidifizada preparada tal como se describe en el ejemplo 2, la vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidifizada preparada tal como se describe en el ejemplo 3 y la vacuna preparada por mezcla en banco tal como se describe en el ejemplo 4, para determinar sus propiedades de separación de fases después de almacenamiento prolongado. Todas estas preparaciones se dejaron reposar a 4°C duraníe aproximadamenfe un mes y la separación de fases se coníroló considerando la aparición de una capa cremosa en la paríe superior de las preparaciones de las vacunas. Tal como se muestra en la figura 4, no se produjo separación de fases en la preparación con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidifizada cuando se comparó con las otras dos preparaciones.

EJEMPLO 7 Preparación de vacuna para ganado vacuno microfluidifizada y no microfluidifizada contra el virus de la diarrea vírica bovina Se incorporó el antígeno vírico del virus de la diarrea bovino a la formulación de AMPHIGEN® mediante microfluidización. El término "incorporado de forma intrínseca" se refiere al método por el cual se añadió el antígeno a la formulación de AMPHIGEN® antes de la microfluidificación. El antígeno se sometió a las fuerzas físicas del método de microfluidificación junto con los componentes de la formulación adyuvante. En el grupo de control no microfluidifizado, la preparación de antígeno se dispersó en la formulación de AMPHIGEN® mezclando. La composición final de las preparaciones control y microfluidifizada era la siguiente: BVD tipo I con una valoración en ELISA tras la inactivación de 2535 UR/dosis para gp53, BVD Tipo II con una valoración en ELISA iras la inactivación de 3290 UR/dosis para gp53, Quil-A con una concentración de 1.25 mg/dosis, colesterol con una concentración de 1.25 mg/dosis, la formulación de AMPHIGEN® con una concentración final de 2.5% y timerosol con una concentración final de 0.009%). La dosis de la vacuna era de 5 ml.

EJEMPLO 8 Estabilidad a largo plazo de antígenos víricos de BVD incorporados de forma intrínseca a la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidifizada Este experimento se realizó para delerminar la estabilidad del antígeno incorporado de forma intrínseca durante el almacenamiento a largo plazo. Se incorporó de forma inírínseca el antígeno vírico de BVD Tipo II ¡nactivado a la formulación de AMPHIGEN® durante el método de microfluidización para obíener una preparación de vacuna microfluldifizada (A907505). Otras tres preparaciones de las vacunas que contenían el mismo antígeno en una formulación de AMPHIGEN® no microfluidifizada (A904369, A904370 y A904371 ) sirvieron como coníroles. En las preparaciones no microfluidifizadas, el antígeno se mezcló con la formulación de AMPHIGEN® y se mezcló batiendo con un homogenizador Ross. Las cuatro preparaciones de las vacunas se almacenaron a 4°C durante dos años. En momentos diferentes durante el almacenamienío (0, 6, 12 ó 24 meses) se usaron las cuaíro formulaciones para vacunar vacas de íres meses de edad. Los días 0 y 21 se vacunaron vacas de tres meses de edad por vía subcutánea con una formulación de vacuna de 2 ml. El suero de los animales vacunados se extrajo el día 35 y se midió la respuesta serológica a la vacuna valorando los anticuerpos medianíe un ELISA de BVDV-E2. Tal como se muesíra en la figura 5, la preparación de vacuna microfluidifizada mosíró una valoración de anticuerpos más elevada en todos los tiempos analizados (0, 6, 12 y 24 meses), lo que sugiere que la estabilidad de la preparación de antígeno no se pierde durante la incorporación intrínseca del antígeno durante el método de microfluidificación. Además, se encontró también de forma sorprendente que la preparación de vacuna microfluidifizada indujo una respuesta inmunitaria potenciada en todos los tiempos.

EJEMPLO 9 Reducción del aumento de temperatura rectal inducida por la vacuna tras la microfluidización Se usaron las preparaciones de las vacunas microfluidifizadas y no microfluidifizadas tal como se describe en el ejemplo 7 para vacunar el ganado vacuno el día cero y se controló la temperafura rectal durante el periodo desde un día antes de la vacunación hasía cuaíro días iras la vacunación. La dosis de la vacuna era de 2 ml. Los grupos se vacunaron con una dosis única o doble de la vacuna. Se midieron las temperaturas rectales y se registraron diariamente desde el Día 1 hasta el Día 4 inclusive. Se midieron las temperafuras rectales el día 0 antes de la administración del artículo de experimentación.

Como se muestra en la figura 6, los resultados indican que se produjo un aumento brusco en la temperaíura rectal aproximadamente en las 24 horas posteriores a la vacunación en los animales vacunados con una dosis única o doble de la formulación de vacuna no microfluidifizada. Sin embargo, en los animales vacunados con formas microfluidifizadas de la vacuna, el aumento de la temperaíura recial tras la vacunación fue mínimo y significativamente menor que en los animales vacunados con la formulación no microfluidifizada (figura 6).

EJEMPL0 10 El volumen de reacción en la zona de la inyección se resolvió más rápido cuando se vacunó con formulaciones de las vacunas microfluidifizadas Se usaron las preparaciones de las vacunas microfluidifizadas y no microfluídifizadas preparadas tal como se describe en el ejemplo 7 para vacunar el ganado vacuno el día cero. Los animales incluidos en este estudio eran ganado vacuno híbrido de carne. Había tres animales en cada uno de los grupos de tratamiento con placebo (T01 y T02). Había seis animales en cada uno de los grupos T03 a T06. La dosis de vacuna era de 2 ml y los grupos se vacunaron con una o dos dosis de la vacuna el día cero. En día 0, se administró el artículo de experimentación en el lado derecho del cuello. Los animales que recibieron la dosis doble (4 ml) del artículo de experimentación (T02, T03 y T06) recibieron la dosis doble completa en forma de inyección única en un lado. La observación de las zonas de inyección, incluyendo la estimación de la zona de reacción en la zona de la inyección se realizó en el lado derecho del cuello desde el Día 0 hasta el Día 4 inclusive, y los Días 6, 9 y 14. El Día 0 se observaron las zonas de inyección antes de la adminisíración de los artículos de experimentación. Los grupos vacunados con una o dos dosis del placebo no mostraron aumento significativo del volumen de reacción en la zona de la inyección y por lo tanío esos datos no se muestran en la figura 7. En el caso de la formulación de vacuna no microfluidifizada, se produjo un aumento proporcional del volumen de reacción en la zona de la inyección entre la vacunación con una dosis y con dos dosis. Por otra parte, en el caso de la formulación de vacuna microfluidifizada, aunque la dosis única indujo un volumen de reacción mayor en la zona de la inyección, la inyección con la segunda dosis no provocó un aumento adicional. Sin embargo, en el caso de los animales a los que se les inyectó la formulación de vacuna microfluidifizada, el volumen de reacción en la zona de la inyección se resolvió con una velocidad mayor comparada con la de los animales a los que se les inyectó una formulación de vacuna no microfluidifizada. Estos resultados se muestran en la figura 7.

EJEMPLO 11 Preparación de una vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidifizada. Preparaciones con antígenos víricos BVD y Leptospira incorporados de forma intrínseca y moléculas inmunoestimuladoras tales como Quil A y DDA Se formuló Leptospira hardjo-bovis de la cepa CSL inactivado en formalina con el adyuvaníe apropiado con recuentos directos de aproximadameníe 1.4 x 109 organismos/dosis de 5 ml. La cepa de Lepíospira Pomona T262 ¡nacíivada en formalina se formuló a aproximadamente 2400 unidades nefalómeras/dosis de 5 ml. Las unidades nefalómeras se calcularon basándose en la medición nefalométrica de fluido de fermentación procesado previamente. El virus BVD Tipo 1 se formuló con una valoración en Elisa E2 de aproximadamente 3000 unidades relativas/dosis de 5 ml. El virus BVD Tipo 2 se formuló con una valoración en ELISA E2 de aproximadamente 3500 unidades relafivas/dosis de 5 ml. La unidad relativa se calculó basándose en la valoración en ELISA E2 de fluido granel tras la inactivación antes del ensamblado. Se usaron tanío Quil-A como colesíerol con una conceníración de 1.5 mg por dosis. Se usaron timerosol y la formulación de AMPHIGEN® con concentraciones finales de 0.009%o y 2.5% respectivamente. Se usó hidróxido de aluminio (Rehydragel LV) con una concentración final de 2.0%. Cuando se usó DDA como inmunomodulador, DDA se incluyó en la formulación de AMPHIGEN®. La formulación de AMPHIGEN® (es decir, la solución madre de Drakeol-lecitina al 40%) contenía 1.6 mg/ml de DDA y, cuando se diluía de forma apropiada, la preparación de vacuna final contenía 2.5% de formulación de AMPHIGEN® y 0.1 mg/ml de DDA. En la preparación de diferentes formulaciones de las vacunas se añadieron fracciones de BVD, Leptos, Quil-A, colesterol, timerosol, la formulación de AMPHIGEN® y solución salina como diluyente a un homogenizador Silverson y se mezclaron durante 15 minutos a 10.000 + 500 rpm. Después se microflu id iza ron los componentes con un tamiz de 200 micrómetros a 68.950 kPa. Cuando la formulación de la vacuna contenía hidróxido de aluminio, la microfluidificación se llevó a cabo sin hidróxido de aluminio. Cuando se completó la microfluidificación, se añadió hidróxido de aluminio y se mezcló con una barra de agitación hasta la mañana siguiente a 4°C.

EJEMPL0 12 Preparación de vacuna de virus BVD para estudios de exposición La preparación de vacuna que se usó en esíe experimento coníenía anfígenos del virus BVD Tipo 1 y el virus BVD Tipo 2. Se usó antígeno BVD1-5960 con una valoración por ELISA postinacíivación de 2535 UR/dosis para gp53. Se usó el aníígeno BVD2-890 con una valoración por ELISA posíinactivación de 3290 UR/dosis para gp53. Se usaron Quil-A y colesferol a una conceníración de 1.5 mg/ml. Se usaron íimersol y la formulación de AMPHIGEN® con una concenlración final de 0.009% y 2.5% respecíivamente. Cuando se uso DDA como inmunomodulador, se incluyó DDA en la formulación de AMPHIGEN®. La solución madre de AMPHIGEN® (solución de Drakeol-lecifina al 40%>) contenía cantidades variables de DDA y, cuando se diluía de forma adecuada, la preparación final de vacuna contenía formulación de AMPHIGEN® al 2.5%o y una concentración de DDA que variaba en el intervalo de 1.5 mg/dosis a 2.0 mg/dosis. Se usó gel de aluminio (Rehydragel-LV) con una concentración final de 2%. Se usó GPI-0100 en el intervalo de 2, 3 y 5 mg/dosis. Todos los componentes se añadieron a un homogenizador Silverson y se mezclaron duraníe 15 minutos a 10,500 rpm y después se microfluldizaron pasándolos por una cámara de 200 micrómetros con 68.950 kPa. Cuando la formulación de la vacuna contenía hidróxído de aluminio, la microfluidificación se llevó a cabo sin hidróxido de aluminio. Cuando se completó la microfluidificación, se añadió hidróxido de aluminio y se mezcló con una barra de agitación hasía la mañana siguiente a 4°C.

EJEMPLO 13 Protección contra exposición a Leptospira tras la vacunación con una formulación microfluidizada de vacuna de Amphigen con antígenos de Leptospira CUADRO 1 Grupos de tratamiento El cuadro 1 muestra la composición de las formulaciones de adyuvante de las preparaciones de las vacunas que se experimentan en este estudio. Las preparaciones de las vacunas se prepararon tal como se describe en el ejemplo 11. Había seis animales en cada grupo. En este estudio se usaron novillos híbridos de carne de aproximadamente siete meses de edad. La vacunación se realizó el Día 0 y el Día 21 por vía subcutánea con un volumen de vacuna de 5 ml. La exposición se realizó con L. hardjo-bovis cepa 203 del NADC (Nacional Agricultural Disease Center). La exposición se realizó durante los días 57-59 con un inoculo de 1 ml. La exposición se administró por vía de la conjuntiva ocular y por vía vaginal. El material de exposición contenía 5.0 x 106 lepfóspiros/ml. La orina se recogió semanalmente para realizar un cultivo de leptospira, FA y PCR. Los ríñones se realizó extrajeron durante los Días 112 y 113.

CUADRO 2 Resultados del estudio de exposición a Leptospira El cuadro 2 muestra los datos del estudio de exposición a Leptospira. Para determinar el porcentaje de infección por Leptospira en el animal expuesto, se usaron los siguientes criterios. Si el cultivo de riñon era positivo sólo en una muestra, se considera que el animal es positivo para Leptospira. Si un animal es positivo sólo en una muestra para FA o PCR, se considera que el animal es negativo. Si la muestra es positiva para FA y PCR sólo en una muestra, se considera que es positivo para Leptospira. Los resultados que se muestran en el cuadro 2 indican que la duración de la presencia en la orina en todos los grupos vacunados fue significativamente más corta basándose en los fres ensayos. En lo que se refiere a la colonización urinaria y renal, las eficacias de las formulaciones que contenían QAC y DDA sin AIOH fueron comparables. El AIOH no mejoró e incluso redujo las eficacias de las vacunas que contenían QAC o DDA en este estudio de exposición.

CUADRO 3 Intervalo de valoración de la aglutinación microscópica el día de valoración con media geométrica máxima antes de la exposición (Día 35) Se detectaron respuestas serológicas contra ambos antígenos de Leptospira de la formulación de vacuna en los animales vacunados y la respuesta máxima se observó el Día 35. No existió correlación entre la respuesta serológíca y la protección contra la exposición. La presencia de gel de aluminio en la formulación de la vacuna redujo el nivel de protección aunque la respuesta serológica fue potenciada por la presencia de gel de aluminio en la vacuna.

EJEMPLO 14 Provocación de respuesta inmunitaria al antígeno vírico de BVD y Protección contra la exposición al virus BVD Tipo 2 tras la inmunización con una preparación de vacuna microfluidifizada gue contenía formulación de AMPHIGEN® y DDA En este experimento se usaron terneras seronegativas de cuatro a siete meses de edad. Había seis grupos diferentes y cada grupo tenía diez animales (cuadro 4). El Día 0 y el Día 21 cada animal recibió una dosis subcutánea de 2 ml de la vacuna o placebo en el lateral del cuello aproximadamente a medio camino entre la escápula y la cabeza.

CUADRO 4 Grupos de tratamiento del virus (aproximadamente 2.5 ml por tosa) por via intranasal el dia 44 del esíudio. En esíe esludio se usó virus BVD Tipo 2, cepa aislada n° 24515 (Cepa Ellis), lote n° 46325-70 no citopáíico como cepa de exposición. Se valoraron las muestras retenidas de material de exposición (dos repeticiones por valoración) en el momento del inicio de la exposición e inmediatamente después de completarlo. La valoración media de virus vivos por dosis de 5 ml era de 5.3 log-io FAID50/5 ml antes de la exposición y 5.4 log10 IDAD5o/5 ml iras la exposición (FAID es equivalente a TCID50). Se coníroló a los animales iodos los días desde el Día 3 al día 58. Se asignaron puníuaciones de enfermedad clínica de 0, 1 , 2, ó 3 basándose en los signos clínicos atribuibles a la infección por BVD 2 para cada animal los Días 42 a 58. Las puntuaciones del Día 44 se registraron antes de la exposición. Se extrajeron muestras de sangre (dos tubos de separación de suero de 13 ml, SST) de cada animal los Días 0, 21 , 35, 44 y 58 para determinar las valoraciones en suero de anticuerpos de neutralización de los virus BVD Tipo 1 y BVD íipo 2. Se exírajeron muesíras de sangre de cada animal de los Días 42 al Día 58 inclusive, y se determinó la presencia de virus BVD en la capa leucocitaria. El Día 44 se obíuvíeron muestras antes de la exposición. Se extrajeron muestras de sangre (un tubo con EDTA de 4 ml) para determinar la leucocitomeíría del Día 42 al Día 58 inclusive. El Día 44 se obtuvieron muestras antes de la exposición. Leucopenia se definió como un descenso del 40% o mayor de la leucocilomelría comparada con el nivel inicial (leucocitomeíría anterior a la exposición media de dos días aníeriores y del día de la exposición). Se usaron las puníuaciones de enfermedad clínica para definir el estado de enfermedad de la forma siguiente; si la puníuación es < 1 , entonces enfermedad = no; si la puníuación es > 2, eníonces enfermedad = si. Tal como se muesíra en las cuadros 5 y 6, los grupos que se vacunaban con vacunas que contenían aníígenos víricos de BVD junio con la formulación de AMPHIGEN®, Quil A o DDA y microfluidifizadas, se seroconvirtieron con valoraciones de neulralización de virus en suero significaíivas para los virus BVD Tipo 1 y BVD Tipo 2. En esos grupos se produjo también una reducción significaíiva del porceníaje de animales que mostraban viremia tras la exposición, mientras que en el grupo de control el 100% de los animales mostraban viremia (cuadro 7). Además, en los grupos vacunados la frecuencia de la enfermedad se redujo también de forma significativa (cuadro 8). De forma similar, el porcentaje de animales que mostraban leucopenia se redujo también en los grupos vacunados y la reducción de la leucopenia fue más significativa en el grupo que contenía DDA que en el grupo que contenía Quil A (cuadro 9). En el grupo de control se produjo un descenso significativo de la subida de peso comparada con los grupos vacunados, (cuadro 10).

Seroloqía Antes de la vacunación el Día 0, todos los animales del estudio eran seronegativos (SVN < 1 :2) para anlicuerpos confra virus de BVD Tipos 1 y 2 (no se muestran los datos). Catorce días tras la segunda vacunación (Día 35) todos los animales a los que se administró placebo (T01 ) seguían siendo seronegativos para anficuerpos contra el virus BVD Tipos 1 y 2; y todos los animales vacunados con los ITA (Aníígeno en experimentación de investigación) (T02, T03, T04, T05 y T06) eran seropositivos (SVN > 1 :8) para anticuerpos contra el virus BVD, Tipos 1 y 2. Un animal al que se le administró la vacuna con adyuvante de la formulación de AMPHIGEN® a 2 mg/dosis de DDA tenía una valoración de SVN de 3 para anticuerpos contra el virus BVD Tipo 2 el Día 35 (cuadro 11 y 12). Antes de la exposición el Día 44, todos los controles (T01 ) excepto uno, eran seronegaíivos (SVN <1.2) para anticuerpos contra los virus BVD Tipos 1 y 2 (no se muestran datos). Uno de los controles (n° 2497) era seropostivo (SVN = 10) para aníicuerpos contra el virus BVD Tipo 1 y seronegativo para el virus BVD Tipo 2. Catorce días iras la exposición, todos los animales del estudio eran seropositivos para anticuerpos contra los virus BVD Tipos 1 y 2.

CUADRO 5 Media geométrica de las valoraciones de neutralización de virus en suero para el virus BVD Tipo 1 CUADRO 6 Media geométrica de las valoraciones de neutralización de virus en suero para el virus BVD Tipo 2 CUADRO 7 Aislamiento de virus BVD tras la exposición CUADRO 8 Signos clínicos de enfermedad por BVD tras la exposición CUADRO 9 Leucopenia tras la exposición CUADRO 10 Aislamiento de virus Tal como muestran los datos del cuadro 13, durante el periodo de exposición (Días 44 a 58), los diez animales del grupo control (T01) sufrían viremia (el virus BVD se aislo uno o más días). En los grupos a los que se les habían administrado los ITA, la frecuencia de los animales con viremia era uno, cero, fres, dos y dos en cada grupo de diez (T02, T03, T04, T05 y T06, respecíivamente). La diferencia eníre los grupos de conírol y los grupos a los que se les habían adminisírado los ITA era estadísticamente significafiva (P < 0.05). La media de los mínimos cuadrados del número de días de viremia era también significativamente mayor (11.4 días) para el control comparado con los grupos a los que se les habían administrado los ITA (0.0 a 1.5 días).

Enfermedad Clínica Se consideraba que los animales con puntuaciones de señales clínicas de 2 ó 3 demostraban signos de enfermedad por BVD. Tal como se muestra en el cuadro 14, la frecuencia de los animales con signos clínicos de enfermedad por virus BVD era nueve de diez en el control (T01 ) y uno, dos, cero y cero de diez en cada uno de los grupos a los que se les adminisíraron los ITA (T02, T03, T04, T05 y T06 respecíivameníe). La diferencia entre el control y los grupos a los que se les administraron los ITA era estad ísf icamente significativa (P < 0.05).

Leucopenia Tal como se muestra en el cuadro 15, durante el periodo de exposición (Días 44 a 58), los diez animales del control (T01 ) sufrían leucemia (una reducción del 40%o en la leucociíometría comparada con la inicial antes de la exposición, Días 42-44). La frecuencia de animales con leucemia era seis, dos, cuatro, fres y dos de los diez animales de cada uno de los grupos a los que se les adminisíraron los ITA (T02, T03, T04, T05 y T06 respecfivamente). La diferencia eníre el confrol y los grupos a los que se administró la vacuna que tenía la formulación de AMPHIGEN® como adyuvante a 1.5 mg/dosis e hidróxido de aluminio (T03) era estadísticamente significativa (P < 0.05). La media de los mínimos cuadrados del número de días de leucemia era significativamente mayor (7.8 días) para el control comparado con los grupos a los que se les administraron los ITA (1.2 a 1.2 días).

EJEMPLO 15 Provocación de respuesta inmunitaria al antígeno vírico de BVD y protección contra la exposición al virus BVD Tipo 2 tras la inmunización con una preparación de vacuna microfluidifizada que contiene GPI-0100 Se siguió un grupo de condiciones experimentales tal como el que se describe en el ejemplo 14 y se realizó una comparación directa eníre Quil A y GPI-0100. Tal como se muesíra en las cuadros 11 y 12, los animales vacunados con aníígenos de BVD en la preparación de formulación de AMPHIGEN® microfluidifizada que coníenía Quil-A o GPI-0100 tenía una valoración de anticuerpos significativa para los virus BVD Tipo 1 y BVD Tipo 2. La valoración de anticuerpos para el virus BVD Tipo 1 era muy superior a la de virus BVD Tipo 2. Sin embargo, la exposición subsiguiente a virus BVD Tipo 2 demosfró una protección potente y se redujo significativamente la incidencia de la enfermedad en los terneros vacunados con la preparación de vacuna con base de formulación de AMPHIGEN® microfluid ¡fizada que contenía GPI-0100.

CUADRO 11 Media geométrica de las valoraciones de neutralización de virus en suero para el virus BVD Tipo 1 CUADRO 12 Media geométrica de las valoraciones de neutralización de virus en suero para el virus BVD Tipo 2 CUADRO 13 Aislamiento de virus BVD tras la exposición CUADRO 14 Signos clínicos de enfermedad por BVD tras la exposición Tratamiento Frecuencia Frecuencia (%) observaciones con Total (%) con una puntuación de enfermedad Obs. enfermedad clínica de 0 1 2 T01 Solución salina 5/10(50.0) 103(60.6) 55(32.4) 12(7.1) 170 T02 Amphigen. 5/10(50.0) 115(67.6) 48(28.2) 7(4.1) 170 Quil A T03 Amphigen. 0/10(0.0) 128(75.3) 42(24.7) 0(0) 170 2 mg de GPI- 0100. AIOH T04 Amphigen. 0/10(0.0) 124(72.9) 46(27.1) 0(0) 170 2 mg de GPI- 0100 T05 Amphigen. 0/10(0.0) 104(61.2) 66(38.8) 0(0) 170 3 mg de GPI- 0100 T06 Amphigen. 0/10(0.0) 128(75.3) 42(24.7) 0(0) 170 5 mg de GPI- 0100 CUADRO 15 Leucopenia tras la exposición En conclusión, se demostró la seguridad de cada vacuna por la ausencia de reacciones adversas de mortandad en los animales vacunados.

La potencia de cada vacuna se demostró mediante la seroconversión (valoraciones de aníicuerpos de SVN para BVD-1 y BVD-2 >1 :8) en 100% de los animales vacunados. La vacuna con 2 mg de GPI-0100 sólo como adyuvaníe demostró una resistencia satisfactoria a la exposición.

EJEMPL0 16 Preparación de vacuna que contiene antígeno microencapsulado en emulsión microfluidifizada de aceite en agua Se añadieron tres gramos de Trehalose (Fluka) a agua para obtener una solución madre de 333 mg/ml de solución de Trehalose. Se añadió antígeno PauA recombinante solubilizado en solución de SDS al 1.8% (SDS/rPauA) a la solución de Trehalose para obtener una concentración final de 494 µg de rPauA/ml. En la siguiente etapa, se disolvieron 10 gramos de ácido polilactidaglucólico (PLG-Resomer RE 503H, Boeringher Ingelheim) en 200 ml de cloruro de metileno (MeCI2). La solución resultante de PLG/MeCI2 se combinó con la solución de SDS-rPauA/trehalose preparada en la primera etapa. La solución combinada se sometió a microfluidización usando Microfluidizer (de Microfluidics Modelo M110EH) y la preparación microfluidifizada se desecó por pulverización usando Temco Spray Dryer (Modelo SD-5). El material desecado por pulverización se recogió usando un tamiz de 500 micrómetros. La concentración de rPauA en este material desecado por pulverización se cuantificó usando un análisis por transferencia Western. Se disolvió 1.04 mg de maíerial desecado por pulverización en 50 µl de acetona y se cenírifugó a 13.200 rpm a íemperafura ambiente duraníe 10 minutos. Se eliminó el sobrenadaníe. Las fracciones de sobrenadaníe y de sedimenío se desecaron en una campana de seguridad biológica durante 2.5 horas. Se resuspendió el sedimento en 47.43 µl de solución de muesíra (25 µl de regulador de pH de mueslra + 10 µl de agente reductor + 65 µl de agua). La fracción de sobrenadaníe desecado se resuspendió con 20 µl de solución de muesíra. En el análisis Western se usó PauA purificado como paírón para cuaníificar el contenido de rPauA del material desecado por pulverización. Se preparó una solución madre de manifol al 20%o disolviendo 100 gramos de maniíol (Sigma) en 500 ml de agua para inyectables (WFI). La solución se calentó a 40°C con placa calefacíora/agilador y se enfrió a 30°C. La solución se esterilizó por filtración con un filfro estéril de 1.22 micrómefros (Millipore). Se preparó una solución de carboximefilcelulosa al 2.5%) disolviendo 12.5 gramos de carboximeíilcelulosa (Sigma) en 500 ml de WFI y se mezcló hasta la mañana siguiente a 4°C. La solución se esterilizó en autoclave a 121°C. El polvo resulíaníe de la desecación por pulverización se reconsfiluyó en una solución que contenía maniíol al 5%o, carboximefilcelulosa al 1.3%) y íimerosol 1 :5000. La solución final se ¡nírodujo en víales en alícuotas de 3 ml y se liofilizó usando un Lyophilizer (USIFROID). El polvo liofilizado representa el rPauA microencapsulado. El antígeno de subunidad proteica microencapsulado se resuspendió en 2 ml de emulsión de aceite en agua microfluidifizada que coníenía una formulación de AMPHIGEN® (íal como la emulsión microfluidifizada que se describe en el ejemplo 20) y se usa como vacuna.

EJEMPL0 17 Preparación de una formulación de vacuna microfluidifizada gue contiene tanto antígeno bacteriano de células enteras como antígeno de proteína recombinante en emulsión de aceite en agua Se formularon dos preparaciones de las vacunas que contenían tanío proíeína PauA recombinaníe de Streptococcus uberis como células bacterianas de Escherichia coli, se añadieron de forma intrínseca a emulsiones de aceite en agua íal como se describe en los ejemplos 2 y 3. El aníígeno PauA recombinaníe estaba a una conceníración de 100 µg por dosis y las células de E. coli daban un recuento final de 4 x 109 por dosis. Las composiciones de los adyuvantes en emulsión de las dos formulaciones de las vacunas se muesfran en el cuadro 16.

CUADRO 16 Formulaciones de las vacunas que contienen tanto proteína recombinante como células enteras de E. coli EJEMPLO 18 Respuesta inmunitaria a la vacuna microfluidifizada gue contiene la emulsión de aceite en agua con rPauA y agentes bacterianos de células enteras En este experimento se usaron vacas lecheras maduras. Los animales esíaban al final de su primera o segunda lactancia en el momento de la admisión. Se adminisíraron por vía subcuíánea 2 ml de cada formulación de vacuna fres veces, una en el momento de secado (D - 0), 28 días después (D = 28) y de nuevo 4 a 10 días después del parto (C + 4 - C+10). La primera y íercera dosis se adminisíraron en el lado izquierdo del cuello y la segunda se administró en el lado derecho del cuello. Se extrajo sangre antes de cada vacunación y aproximadamente 14 días y 32 días iras la íercera vacunación.

Las valoraciones de anficuerpos contra E. coli y el aníígeno rPauA se determinaron medianíe ELISA. Como se muesíra en la figura 8, los resultados indican que la valoración de anlicuerpos para rPauA era superior en el grupo vacunado con la formulación de vacuna que contiene GPI-0100 como inmunoestimulanfe y era máxima el día 70 tras la vacunación inicial. La valoración de anticuerpos para el antígeno contra E. coli se muestra en la figura 9. La valoración de anticuerpos contra aníígeno de E. coli era comparable en ambas formulaciones de las vacunas, aunque la presencia de GPI-0100 como inmunoeslimulaníe indujo una valoración de aníicuerpos relaíivameníe mayor comparada con la formulación con DDA como inmunoesíimulaníe.

EJEMPLO 19 Análisis de actividad viricida de las preparaciones de las vacunas con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidifizada Para deíerminar si la microfluidización inacfiva el virus, se determinó la acíividad viricida de fres preparaciones de las vacunas con base de formulación de AMPHIGEN® microfluidifizada. Las íres preparaciones coníenían íres virus infecciosos bovinos difereníes, específicameníe virus del herpes bovino (BHV), virus paragripal 3 (PI3) y virus sincitial respiratorio bovino (BRSV). La detección de la actividad viricida de las tres preparaciones de las vacunas se realizó de acuerdo con los requisitos de la normativa USDA 9CFR-113.35. Los resultados que se muestran en el cuadro 17 indican que la microfluidización de las preparaciones de las vacunas con base de formulación de AMPHIGEN® no provoca una ¡naclivación significafiva de la preparación de la vacuna.

CUADRO 16 Análisis de actividades viricidas de las vacunas microfluidifizadas A = colesterol añadido a 650 ml/minuto B = colesíerol añadido a 28 ml/minufo C = colesterol añadido a 5 ml/minuto M200 = microfluidífizada con tamiz de 200 micrómetros M75 = microfluidifizada con tamiz de 75 micrómetros M75 a 37C = fluidos calentados a 37°C antes de la microfluidización Un valor por encima de 1.7 indica un efecío viricida.

EJEMPLO 20 Preparación de una formulación de AMPHIGEN® microfluidifizada Se preparó una formulación de AMPHIGEN® combinando solución de aceite de lecitina DRAKEOL (aceite de parafina fluido con lecitina al 25%) y TWEEN 80 (con una concentración final de 0.18%) y Span 80 (con una conceníración final de 0.08%>) mezclando duranle 8-22 horas a 36 + 1°C. La mezcla de aceite se añadió después a solución salina con ayuda de un emulsíonador Ross® (Hauppage, NY 11788) aproximadamente a 3400 rpm. Subsiguientemente la mezcla se pasó una vez por un microfluidizador con una cámara de interacción a 31.027.5 kPa ± 3.447.5 kPa. Las figuras 10 A y 10 B muestran la estabilidad de la formulación de AMPHIGEN® microfluidifizada. La distribución del tamaño de las partículas, medida por difracción de rayos láser, al inicio (figura 10A) era casi idéntico a la distribución del tamaño de las partículas después de 22 meses de almacenamienío a 4°C (figura 10b).

EJEMPLO 21 Análisis por microscopía electrónica del complejo inmunógeno de Quil A y colesterol Para determinar la naturaleza del complejo inmunógeno formado por Quil A y colesterol, se preparó una mezcla de estos dos componentes o en presencia o en ausencia de un antígeno. En un matraz que contenía 50 ml de regulador de pH de HR-Hals, se añadió antígeno de BVD Tipo I mieníras se agitaba la solución con una barra magnéíica. Después, se añadió una solución madre concentrada-de Quil A (50 mg/ml) gota a gofa mientras se agitaba la solución alcanzando una concentración final de 50 µg/ml. La adición de Quil A se siguió con de la adición de una solución madre de colesterol en etanol (18 mg/ml) hasta una concentración final de 50 µg/ml. En un segundo matraz, se añadieron Quil A y colesterol del mismo modo al regulador de pH de 50 ml sin anfígeno de BVD Tipo I. Para la microscopía de transmisión electrónica, se adsorbieron 10 µl de cada muestra sobre rejillas de cobre de 400 mesh con una plataforma de soporte de formvar y carbono (Elecíron Microscopy Sciences, Inc., Fort Washington, PA). Las muestras se tiñeron negativamente usando 10 µl de ácido fosfotúngsíico al 2% filírado, a pH 5.2 como ageníe de conírasle. Las muestras se examinaron usando un microscopio de transmisión electrónica JEOL 1230 (JEOL Inc., Tokio, Japón) con un voltaje de aceleración de 80 kV.

La obtención de imágenes digitales se realizó con una cámara Gafan BioScan 792. La microscopía en película se realizó en película 4489 EM y se imprimió en papel Kodabrome II RC F3 (Eastman Kodak Company, Rochester, NY.). En la solución que sólo contenía colesterol y Quil A sin antígeno de BVD Tipo I, se detectaron micelas helicoidales junto con micelas de Quil A y cristales de colesterol (figura 11 ). Las micelas helicoidales estaban entrecruzadas y tenían aspecto de malla. En la muestra que contenía el antígeno de BVD Tipo I, se observó que las micelas helicoidales aleatoriamente rodeaban ciertas áreas densas (figura 12). Las áreas densas representan el antígeno de BVD Tipo 1 y el complejo inmunógeno helicoidal que se produce por la asociación de Quil A y colesterol se encuentra adsorbido sobre la superficie del antígeno de BVD Tipo I. Habiendo descrito la invención como antecede se declara como propiedad lo contenido en las siguientes:

Claims (8)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una vacuna que comprende un glucósido de saponina, un esteral y un aníígeno, en la que dicho glucósido de saponina y dicho esíerol se asocian eníre si para formar complejos en forma de micelas helicoidales y en la que dicho aníígeno esíá mezclado, pero no iníegrado, en dichas micelas helicoidales.

2.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque también comprende un vehículo veterinariamente aceptable.

3.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicho vehículo veíerinariameníe aceptable es una emulsión de aceite en agua.

4.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho glucósido de saponina es un íriíerpenoide.

5.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicho triterpenoide es Quil A.

6.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho esteral es colesterol.

7.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicho antígeno comprende un agente vírico, un agente bacteriano o una combinación de los mismos.

8.- La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dicho antígeno comprende un antígeno de BVDV tipo 1 o tipo 2.