MXPA04011134A - Metodo para identificar compuestos que interactuan con las proteinas de transmembrana. - Google Patents

Metodo para identificar compuestos que interactuan con las proteinas de transmembrana.

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Abstract

Se proporciona un metodo para seleccionar compuestos por su habilidad para interactuar con las proteinas de transmembrana. Tambien de proporciona un metodo para determinar si las proteina tales como las proteinas de transmembrana son capaces de oligomerizarse.

Description

MÉTODO PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS QUE INTERACTUAN CON LAS PROTEÍNAS DE TRANSMEMBRANA CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos para seleccionar compuestos en cuanto a su habilidad para interactuar con las proteínas de transmembrana. La invención se refiere también a métodos para seleccionar las proteínas de transmembrana en cuanto a su habilidad para dimerizarse u oligomerizarse en grupos de dos o más proteínas . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En la descripción que sigue, se hace referencia a ciertas citas de la literatura las cuales están listadas al final de la especificación y todas las cuales se incorporan aquí como referencia. Las proteínas transmembrana han sido clasificadas en varias clases principales, incluyendo los receptores acoplados a la proteína G, transportadoras, receptores de tirosina cinasa, receptores de citosina y receptores de LDL. Los receptores acoplados a la proteína G (GPCRs) pueden agrupados en base a la estructura y la homología de secuencia en varias familias. La Familia 1 (también conocida como la familia A o la familia similar a rhodopsina) es con mucho el subgrupo más grande y contiene receptores para moléculas pequeñas tales como la catecolaminas, dopamina y noradrenalina, péptidos tales como los opioides, somatoestatina y vasopresina, hormonas de glicoprotelnas tales como hormona estimulante de tirotropina y la clase completa de moléculas olorosas (George et al, 2002) . La familia 2 o familia B contiene los receptores tales como para glocagona, hormona paratiroides y secretina. Estos GP Cs se caracterizan por una amino terminal larga que contiene varias cisternas, las cuales pueden formar puentes bisulfuro. La familia 3 o familia C contiene receptores tales como los receptores de glutamato metabotropico, el sensibilizante a Ca2+ y del ácido gama-amino butírico (GABA)B. Estos receptores se caracterizan también por una amino terminal compleja. Aunque todos los GPCRs comparten las siete hélices periféricas de membrana, las varias familias de GPCR no muestran homología de secuencia una con las otras. Los GPCRs son el grupo más grande conocido de mediadores de la superficie celular de la transduccion de señales y están presentes en todas las células del cuerpo. La Acción de los GPCR regula el espectro completo de funciones fisiológicas, tales como aquellas que involucran al cerebro, el corazón, riñon, pulmones, y los sistemas inmune y endocrino. Esfuerzos extensivos durante la última década han identificado un gran número de nuevos GPCRs, incluyendo múltiples subtipos de receptores para los ligandos previamente conocidos, y numerosos receptores para los cuales los ligandos endógenos permanecen sin identificar hasta el momento, llamados receptores 'huérfanos' u oGPCRs (Lee et al., 2001; Lee et al., 2002; Bailey et al., 2001). Los GPCRs han sido objetivos exitosos de numerosos fármacos para diversos trastornos en el uso clínico actualmente, con un 50% del mercado de fármacos que busca como objetivos a estas moléculas. Entre los GPCRs conocidos, -335 receptores son objetivos del desarrollo de fármacos potenciales, de los cuales 195 tienen ligandos conocidos, y los restantes 140 son oGPCRs, esperando la identificación de sus ligandos. Aunque varios avances metodológicos han acelerado el ritmo del descubrimiento de nuevos receptores, el ritmo del descubrimiento de ligando y fármacos va muy retrasado. Los métodos de análisis de selección farmacológicos a pequeña escala, convencionales se usaron inicialmente para descubrir los ligandos y fármacos para muchos de los GPCRs, pero nuevos procedimientos de análisis están siendo buscados continuamente . Ya que los GPCRs forman más del 80% de los receptores de la superficie celular, estos representan un recurso substancial y constituyen un grupo altamente relevante de proteínas objetivos para el descubrimiento de nuevos fármacos. Los fármacos que interactúan con los GPCRs tienen el potencial de ser altamente selectivos, ya que las interacciones estarán confinadas a la superficie celular y a los tejidos que producen los receptores exclusivamente . La convergencia del descubrimiento de los GPCRs con la comprensión de que estos son objetivos de fármacos importantes, ha llevado al interés farmacéutico intenso para idear mejores maneras para detectar y seleccionar los compuestos que interactúan con los GPCRs .
Por lo tanto, crear métodos de análisis mejorados es un requerimiento urgente hacia el objetivo de la selección y descubrimiento más rápido de fármacos . Existe una necesidad para optimizar la habilidad para detectar una interacción entre compuestos de prueba y los receptores, la cual es el paso inicial fundamental en el proceso del desarrollo de f rmacos .
Las estrategias de identificación de ligandos mejoradas / aceleran la caracterización de todos los GPCRs definirán sus funciones fisiológicas y hará realidad su potencial en el descubrimiento de nuevos fármacos. Aun con los GPCRs identificados, existe una escasez de fármacos específicos del subtipo altamente selectivos que sea descubiertos y las casas farmacéuticas están experimentando una escasez de compuestos guía prometedores, a pesar del acervo de objetivos de fármacos definidos. La lista de nuevas aprobaciones de productos farmacológicos por las 20 mejores compañías farmacéuticas ha declinado considerablemente durante el periodo 1999-2001, en comparación con el periodo de tres años precedente (Smith, 2002) . Por lo tanto, existe una necesidad real para tener sistemas de análisis versátiles, mejorados, donde no sólo puedan ser analizados e identificados los ligando endógenos, sino los nuevos compuestos que interactuan con los receptores, en una manera rápida y eficiente que se pueda someter a la automatización. Ya que la vía o de trayectoria de transduccion de señales requerida para activar un oGPCR no se puede predecir, se requiere un sistema de análisis para los compuestos que interactuan el cual sea independiente de las predicciones previas de cual sistema efector (tal como la actividad de adenilil ciclasa, PLC, cGMP, fosfodiesterasa) sea empleado por el receptor. Asignar ligandos a los GPCRs u oGPCRs es una tarea importante; sin embargo la diversidad de ambos ligandos de GPCR y sistemas efectores, puede limitar la utilidad de algunos análisis de identificación de ligandos existentes, requiriéndose nuevos enfoques para el descubrimiento de f rmacos . Recientemente, varios métodos que utilizan sistemas de análisis refinados que prueban extractos de tejidos, grandes bibliotecas de ligandos y ligandos específicos de interés, han descubiertos exitosamente los ligandos endógenos para un número de estos oGPCRs. Tales métodos han sido llamados colectivamente como "Farmacología Invertida" (Howard et al., 2001) . Varios métodos han sido usados para analizar la actividad celular inducida en respuesta a un compuesto agonista, incluyendo el análisis de Lector de placas por Formación de Imágenes de Fluorescencia (FLIPR, Molecular Devices Corp., Sunnyvale, Calif.) y Barak et al., (1997), y las Patentes Norteamericanas Nos. 5,891,646 y 6,110,693 las cuales describen el uso de la proteína de fusión fluorescente verde de ß-arrestina para formar una imagen de la translocación de la arrestina a la superficie celular por la estimulación de un GPCR. Las desventajas potenciales de tales métodos son las siguientes: 1) la visualización no es del receptor; 2) la translocación de proteínas requiere tecnologías analíticas computarizadas complejas; 3) antes de la identificación del agonista es necesario para seleccionar los antagonistas; y 4) el acoplamiento a la proteína G específica es necesario para generar una señal . Los mecanismos de enlace del ligando y transducción de señales por GPCRs han sido modelados tradicionalmente sobre la suposición de que los receptores monomericos participan en el proceso, y un modelo monomerico para los GPCRs ha sido aceptado de manera general. Desde la mitad de los años 1990s, sin embargo, numerosos reportes han demostrado la oligomerización de muchos GPCRs (revisado por George et al., 2002) , y está realizado ahora que la oligomerización es un aspecto inherente de la estructura y biología de GPCR. También ciertos subtipos de receptores forman hetero-oligomeros y estos receptores tienen características funcionales que difieren de las poblaciones de receptores homogéneos. Actualmente, los estudios de la oligomerización de GPCR no hacen una distinción entre dímeros y complejos más grandes, y el término dímero se usa de manera intercambiable con los términos oligómero y mutimero. No existen datos concluyentes para indicar cuan grandes son los oligomeros o los GPCR funcionales. De manera importante, la generación de nuevas propiedades a través de la hetero-oligodimerización sugiere un mecanismo para generar diversidad de funciones entre los GPCRs . La homooligomerización de GPCRs se acepta como un acontecimiento natural y se conoce un número de GPCRs para ensamblar como complejos de receptores heterooligomericos (George et al., 2002) . Por ejemplo los receptores GABA-Bl y GABA-B2 no son funcionales individualmente y sólo forman un receptor funcional cuando son coexpresados (White et al . , 1998) . El ensamble de complejos de receptores heterooligomeros puede resultar en nuevos enlaces receptor-ligando, propiedades de señalización o tráfico intracelular. Por ejemplo, la co-transfección de los receptores mu y delta opioides resultó en la formación de oligomeros con propiedades funcionales que fueron distintas de las de cada uno de los receptores individualmente (George et al., (2000)). La interacción de los receptores de mu y delta opioides para formar oligomeros generó nuevas propiedades farmacológicas y de acoplamiento a la proteína G. cuando los receptores de mu y delta opioides fueron co-expresados, los agonistas altamente selectivos (DAMGO, DPDPE, y morfina) tuvieron potencia reducida y orden de jerarquía alterado, en tanto que ciertos ligandos endógenos endomorfina-1 y leu-encefaliña tuvieron afinidad mejorada, sugiriendo la formación de un nueva bolsa de enlace al ligando (George et al., 2000) . En contraste a los receptores mu y delta expresados individualmente, los receptores coexpresados mostraron transducción de la señal insensible a la toxina de tos ferina, probablemente debido a la interacción con un subtipo diferente de protelna G. Seria por lo tanto muy útil desde el punto de vista de la identificación de objetivos de fármacos potenciales, tener un medio para determinar si un par particular de GPCRs son capaces de formar heterooligomeros. En muchos reportes, los heterooligomeros han sido identificados tentativamente por la habilidad para co-inmunoprecipitarse . Cuando se muestra que dos GPCRs se co-inmuniprecipitan, sin embrago, existen dos posibles interpretaciones ya sea que los receptores estén interactuando físicamente, directamente, o ambas están interactuando a través del contacto con una tercera proteina común (o proteínas) . Un enfoque alternativo para detectar los oligomeros de receptores ha sido el desarrollo de análisis de transferencia de energía usando transferencia de energía de resonancia bioluminiscente (BRET) o transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) . Aunque estos métodos detectan la transferencia de energía entre dos moléculas de receptores etiquetadas por fluoroforos o en las proximidades de menos a 100 angstroms, es poco claro si los cambios comformacionales del receptor puede ser distinguidos fácilmente de la oligomerizacion de novo . Los transportadores son bombas de proteínas que mueven moléculas, iones y otros químicos dentro y fuera de las células y existen en virtualmente todas las células. Los transportadores pueden ser agrupados en familias sobre la base de su estructura, secuencia, homología y las moléculas que transportan. Existen transportadores separados para los neurotransmisores de monoamina tales como dopamina, serotonina, norepinefri a y GABA, para los aminoácidos tales como glicina, taurina, prolina y glutamato, para las monoaminas vesiculares, acetilcolina y GABA/glicina, para azucares tales como glucosa y disacáridos, para cationes orgánicos y aniones orgánicos, para oligopeptidos y peptidos, para ácidos grasos, ácidos biliares, nucleósidos, para agua y para creatina. Las bombas que exportan moléculas grandes tales como fármacos, toxinas y antibióticos desde la células están ejemplificadas por la familia de la P-glicoproteína (proteína de resistencia a múltiples fármacos) . Existen también varios transportadores relacionados, la función de los cuales permanece desconocida (Masson et al., 1999). Estos transportadores son proteínas de membrana que consisten de un polipéptido de manera general con 12 dominios de transmembrana. Los transportadores de glutamato y aspartato pertenecen a una familia separada cuyos miembros tienen 6 a 10 dominios de TM y no comparten homología con los otros transportadores (Masson et al., 1999). Tanto la amino y la carboxi terminales se localizan en el lado intracelular de la membrana . Se considera que un gran número de trastornos neurológicos y psiquiátricos incluyendo depresión, enfermedad de Parkinson, esquizofrenia, adición a fármacos, síndrome de Tourette, y trastornos de déficit de atención, involucran transportadores de monoamina. El transportador de dopamina (DAT) es el objetivo principal para los psicoestimulantes tales como la cocaína y metilfenidato . Los transportadores han sido los objetivos exitosos de numerosos fármacos para diversos trastornos en el uso clínico actual, particularmente fármacos antidepresivos, incluyendo fluoxetina, sertralina y los otros relacionados con inhibidores de reasimilación selectiva de serotonina (SSRIs) . Aunque los avances moleculares metodológicos han identificado los transportadores conocidos, el ritmo del descubrimiento de ligandos y fármacos está rezagado, los métodos de análisis para la selección farmacológica, convencionales fueron usados para descubrir los ligandos y fármacos para algunos de los transportadores, pero nuevos procedimientos de análisis están siendo buscados con urgencia. Las estrategias de identificación de ligandos mejoradas para acelerar la caracterización de todos los transportadores definirán además sus funciones fisiológicas y realizaran su potencial en el descubrimiento de nuevos fármacos. Aun con los transportadores identificados, existe une escasez de fármacos específicos altamente selectivos a ser descubiertos . Los miembros de la familia del receptor de tirosina cinasa se caracterizan por su similitud estructural, con un dominio de enlace al ligando extracelular, un sólo dominio transmembrana y un dominio intracelular con actividad de tirosina cinasa para la transducción de señales . Existen muchas subfamilias de receptores de tirosina cinasas, ejemplificados por el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (también llamado HERI o erbBl) , el cual es uno de los cuatro miembros de tal subfamilia, la cual también incluye HER2, HER3 y HER4. Los principales ligandos de EGF-R son EGF, TGF-a, EGF de enlace de heparina, amfirregulina, betacelulina y epirregulina (Shawver et al., 2002). La activación de EGF-R causa que el receptor se dimerice ya sea con el monómero de EGF-R u otro miembro de la subfamilia de HER. La marcada diversidad del enlace del ligando y la señalización se genera por la formación de -heterodímeros entre los miembros de la familia (Yarden y Sliwkowski, 2001). El EGF-R se expresa ampliamente en una variedad de tejidos y media importantes funciones tales como el crecimiento celular y la reparación de tej idos . La sobreexpresion de EGF-R ocurre en muchos tipos de cáncer, tales como de cabeza, cuello, pulmones, laringeal, esofaringeal , gástrico, pancreático, de colon, renal, de la vejiga, pecho, ovárico, cervical, de próstata, de tiroides, melanoma y glioma, y se correlaciona con pobres resultados (Nicholson et al., 2001). Por lo tanto, existe gran interés y necesidad para desarrollar fármacos que tienen como objetivo el EGF-R y por métodos los cuales ayudan en la identificación de tales fármacos. Otras subfamilas de tirosina cinasas receptoras se ejemplifican por los receptores para el factor endotelial vascular (cuatro miembros) y el factor de crecimiento de fibroblastomas (cuatro miembros) . Estos tienen papeles importantes en la angiogénesis y también tienen roles significativos en la proliferación descontrolada de los vasos que caracterizan la carcinogénesis (Hanahan y Folkman, 1996) . Los receptores de citocina son proteínas periféricas a la membrana con un dominio de enlace del ligando extracelular y un dominio intracelular con actividad intrínseca de cinasa o regiones adaptadores capaces de interactuar con las cinasas intracelulares . Los receptores se dividen en subclases en base a su complejidad estructural. Los receptores * simples' son aquellos que incluyen los receptores para la hormona de crecimiento, eritropoyetina e interleucinas , y los receptores Complejos' incluyen la familia del receptor del factor de necrosis de tumores, la familia del receptor de citosina de 4 hélices, la familia del receptor de insulina/similar a insulina y el receptor estimulante de la colonia de granulocitos (Grotzinger, 2002) . La familia del receptor del factor de crecimiento similar a insulina (IGF) controla el metabolismo, reducción y crecimiento (Nakae et al., 2001) . Existen nueve diferentes péptidos similares a insulina conocidos y existen tres receptores conocidos que interactúan con ellos, IR, IGF- IR e IGF-2R, y un receptor huérfano relacionado con el miembro IR.
Cada receptor existe como homodímeros en la superficie celular o heterodímeros . La subfamilia IR se relaciona también con la familia EGF-R. Los IR, producidos a partir de un AR m individual, experimentan escisión y dimerización y translocación a la membrana plasmática. Cada componente monomerico contiene un sólo dominio de transmembrana; el receptor completo comprendió dos subunidades a y dos ß, enlazadas por puentes de disulfuro. Las subunidades beta contienen el TM único y la región intracelular . Este receptor es una tirosina cinasa que cataliza la fosforilación de varios substratos intracelulares .
La familia del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL) actúa como transportadores de carga, regulando los niveles de lipoprotelnas y proteasas (Strickland et al., 2002) . Existen nueve miembros reconocidos de la familia, todos de los cuales comparten similaridades estructurales, incluyendo una región extracelular, una sola región de domino de transmembrana y una cola citoplasmática . El receptor de LDL juega un papel principal en la limpieza de lipoproteínas, y los defectos genéticos en el receptor de LDL pueden resultar en la acumulación de LDL en el flujo sanguíneo. El primer motivo o radical caracterizado que mostró ser capaz de dirigir la importación nuclear de proteínas fue ejemplificado por la secuencia de aminoácidos (P KKRKV) contenida en la proteína del antígeno T largo de SV40. Los motifs de la secuencia de localización nuclear (NLS) son reconocidos por el complejo de receptores de importina a-ß, el cual se enlaza al NLS (Gorlich et al., 1996) . Estas son proteínas citosólicas, las cuales reconocen las proteínas que contienen NLS y transportan estas proteínas para acoplarlas en los poros nucleares. El complejo completo se acopla subsecuentemente en el complejo de poro nuclear (Weiss et al., 1998, Schlenstedt et al., 1996), contenido en la envoltura nuclear. La envoltura nuclear es una frontera que contiene poros que median el proceso de transporte nuclear (Weiss et al. , 1998) . Ha habido muy pocos y raros reportes de GPCRs que se localizan en el núcleo. Uno de tales ejemplos es el receptor de angiotensina de GPCR tipo 1 (???) , el cual contiene un NLS endógeno el cual sirve para dirigir al GPCR hacia el núcleo (Lu et al., 1998), proporcionando evidencia de que esta secuencia de NLS estaba involucrada en el reconocimiento nuclear del receptor ATI. Estos autores y Chen et al., (2000) reportaron que los receptores ATI se incrementaron en el núcleo en respuesta a loa agonistas. La localización nuclear del receptor de la hormona paratiroides ha sido reportada (Watson et al., 2000). Sin embargo muy poco de la superfamilia de GPCRs contienen un NLS endógeno que media la translocación del receptor al núcleo. Ahí permanece por lo tanto una necesidad por nuevos métodos, más convenientes para identificar los compuestos los cuales interactúan con las proteínas de transmembrana tales como GPCRs, transportadores, etc. Ahí también permanece una necesidad por métodos mejorados, menos ambiguos para detectar la oligomerizacion de las proteínas de transmembrana. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los inventores han mostrado que la incorporación de una secuencia de localización nuclear (NLS) en una proteína de transmembrana (que no contiene una NLS funcional endógena) encamina la proteína desde la superficie celular hacia el núcleo de una célula en una manera dependiente del tiempo e independiente del ligando. Para visualizar este tráfico de las proteínas de transmembrana desde la superficie celular, estas transportan una porción detectable para su visualización mediante una variedad de medios . Se ha demostrado que las proteínas de la membrana de diversas familias de proteínas que contienen una NLS incorporada sintéticamente se redistribuyen bajo condiciones básales, desde la superficie celular a y hacia el núcleo. Este proceso puede ser explotado para identificar compuestos los cuales interactúan con las proteínas de transmembrana, determinando si los compuestos candidatos son capaces de modular esta transferencia independiente del ligando de una proteína de transmembrana lejos de la membrana celula . Es posible también, usar método basados en este proceso para determinar si las moléculas de proteínas son capaces de oligomerizarse . De acuerdo con una modalidad, la invención proporciona un método para seleccionar un compuesto candidato por su habilidad para interactuar con al menos una proteína de transmembrana, que comprende: transfectar células con al menos una secuencia de nucleótido que codifica una proteína que comprende una proteína de transmembrana que contiene al menos una secuencia de localización nuclear (NLS) y una porción detectable y permitir la expresión de la proteína codificada en las células ; poner en contacto las células con un compuesto candidatos ; y determinar la distribución de la proteína expresada en las células detectando la distribución de la porción detectable en las células; en donde la detección de una distribución alterada de la porción detectable en las células con relación a la distribución de la porción detectable en células de control no puestas en contacto con el compuesto candidato indica que el compuesto interactúa con la proteina de transmembrana. De acuerdo con otra modalidad de este método, las células se ponen en contacto con un compuesto conocido por interactuar con la al menos una proteina de transmembrana, antes de poner en contacto las células con el compuesto candidato y en donde la detección de una distribución alterada de la porción detectable en las células con relación a la distribución de la porción detectable en células de control puestas en contacto con el compuesto conocido por interactuar con la proteína de transmembrana pero no puestas en contacto con el compuesto candidato indica que el compuesto candidato interactúa con la proteína de transmembrana. De acuerdo con otra modalidad, la invención proporciona un método para seleccionar un compuesto candidato por su habilidad para interactuar con al menos una proteína de transmembrana, que comprende : transfectar células con al menos una secuencia de nucleótido que codifica una proteína de transmembrana que contiene una NLS y permitir la expresión de la proteína codificada en las células; poner en contacto las células con un compuesto candidato; y determinar el nivel de la proteína de transmembrana que contiene la NLS que permanece en la membrana de las células aislando la fracción de membranas de las células, poner en contacto la fracción con un ligando etiquetado de la proteína de transmembrana y determinar el nivel de enlace del ligando a la fracción; en donde la detección de un nivel alterado de la proteína de transmembrana en la membrana de las células con relación al nivel de la membrana de las células en células de control no puestas en contacto con el compuesto candidato indica que el compuesto interactúa con la proteína de transmembrana. De acuerdo con una modalidad adicional, la invención proporciona células aisladas transfectadas con al menos una secuencia de nucleótido que codifica una proteína que comprende una proteína de transmembrana que contiene al menos una NLS y una porción detectable. De acuerdo con una modalidad adicional, la invención proporciona un método para determinar si una primera proteína y una segunda proteína son capaces de oligomerizarse, que comprende : transfectar células con una primera secuencia de nucleótido que codifica una primera proteína que contiene una NLS y una segunda secuencia de nucleótido que codifica una segunda proteína que comprende una porción detectable y permitir la expresión de la primera y la segunda proteínas codificadas en las células,- y determinar la distribución de la porción detectable en las células; en donde la detección de la porción detectable en o junto al núcleo de las células o la detección de un nivel reducido de la porción detectable en la superficie celular, con relación a células de control, indica que la primera y la segunda proteínas interactúan. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Se describen ciertas modalidades de la invención, se hace referencia a los dibujos anexos en donde: La Figura 1 muestra en forma diagramática la estructura de un GPCR típico, el receptor de dopamina DI, modificado para contener una NLS . La Figura 2 muestra la fluorescencia (unidades de fluorescencia relativa) en la superficie de células HEK transíectadas con la NLS del receptor de dopamina DI y tratadas con varas concentraciones de butaclamol . La Figura 3 muestra la fluorescencia de la superficie de la superficie celular de células HEK transfectadas con NLS del receptor de HA-dopamina DI y tratadas con varias concentraciones de SHC23390 individualmente o con SFK81297 (100 nM) . La Figura 4 muestra la fluorescencia de la superficie celular de células HEK transfectadas con NLS del receptor de HA-dopamina DI y tratadas con SCH23390 0.5 µ? individualmente o junto con varias concentraciones de SKF81297. La Figura 5 muestra la cantidad de 3H-SCH 23390 enlazada a la fracción de membranas celulares de células HEK transfectadas con NLS del receptor de dopamina DI y tratadas con butaclamol (A) o células de control no tratadas (¦) . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención proporciona, en una modalidad, un nuevo y conveniente método para seleccionar compuestos candidatos por su habilidad para interactuar con una proteína de transmembrana . Como se usa aquí, cuando un compuesto candidato y una proteína de transmembrana "ínteractúan" , esto significa que el compuesto es un ligando de la proteína de transmembrana y se enlaza a la proteína o es capaz de modular el tráfico de la proteína de transmembrana lejos de le membrana celular descrito aquí . La identificación de los compuestos los cuales interactúan con una proteína de transmembrana es el primer paso importante en el proceso para identificar compuestos guía para el desarrollo de fármacos . Trabajando inicialmente con GPCRs, los inventores han encontrado que cuando una célula eucariótica con núcleo es transfectada con una secuencia de nucleótido la cual codifica un GPCR que contiene una NLS incorporada sintéticamente, o una NLS de formación natural, y se permite a la células expresar la secuencia de nucleótido, el GPCR expresado viaja primero a la membrana celular y después se transfiere al núcleo celular. Este proceso es independiente de la activación del ligando y toma desde aproximadamente 6 a aproximadamente 72 horas, dependiendo de la proteína de transmeiribrana involucrada, con un promedio de 24 a 48 horas. Esta es en contraste a la situación cuando un GPCR que no contiene una NLS se expresa en células, cuando el GPCR expresado permanece predominantemente en la superficie celular, con pequeñas cantidades que aparecen en el citoplasma pero sin cantidades detectables en el núcleo.
Los inventores han descubierto también que la transferencia o tráfico del GPCR que contiene NLS expresado desde la membrana celular a o hacia el núcleo puede ser modulado tratando las células transfectadas con un compuesto el cual interactúa con el GPCR. La selección de compuestos candidatos por su habilidad para interactuar con un GPCR puede llevarse a cabo por lo tanto detectando esta modulación de la transferencia del GPCR expresado desde la membrana celular al núcleo . Los inventores han descubierto además que estas observaciones son ampliamente aplicables a las proteínas de transmembrana de manera general, y no se limitan a los GPCRs.
"Proteína de transmembrana" como se usa aquí significa una proteína de cadena simple encontrada en la membrana celular y que tiene al menos un dominio que se extiende sobre la membrana celular. Los inventores han mostrado que una amplia variedad de proteínas de transmembrana de varias familias del grupo de GPCR, del grupo de transportadores, del grupo de receptores de citosina, del grupo de la tirosina cinasa y del grupo de receptores de lipoproteína de baja densidad, si se expresan en células con núcleo de modo que contienen un grupo NLS, todas muestran acumulación inicial de la proteína expresada en la membrana celular, seguido por transferencia independiente de la activación del ligando de la proteína expresada lejos de la membrana celular y hacia el núcleo celular. La amplia aplicabilidad de los métodos de la invención está indicada por la inmensa variedad de estructuras de proteínas de transmembrana representadas por las proteínas de transmembrana ejemplificadas usadas en los métodos; la inserción de NLS en una proteína de transmembrana que resulta en la translocación de la proteína fuera de la superficie celular y al núcleo ha sido mostrada ser efectiva con proteínas de membranas que tienen un domino de transmembrana (TM) , siete dominios TM y doce dominios TM y que comparten poca o ninguna homología de la secuencia. Se ha encontrado que el método de la invención es ampliamente aplicable para identificar compuestos los cuales interactúan con las proteínas de transmembrana. Se ha encontrado que los compuestos los cuales interactúan con las proteínas de transmembrana, modulan su transferencia desde la membrana celular al núcleo, en diferentes maneras, incluyendo la inhibición de la transferencia, aceleración de la transferencia e interferencia con la modulación producida por otros compuestos. Cualquier compuesto interactuante es de interés como un candidato farmacológico potencial . La modulación de la transferencia de la proteína de transmembrana expresada se determina comparando la distribución de la proteína de transmembrana dentro de las células en células de control y células tratadas con un compuesto candidato. En una modalidad, el método proporciona una herramienta conveniente para seleccionar compuestos candidatos por su habilidad para interactuar con un GPCR y modular su tráfico. Los compuestos que interactúan específicamente con los GPCR pueden inhibir o prevenir la transferencia del GPCR desde la superficie celular al núcleo y pueden ser antagonistas para el GPCR, en tanto que otros compuestos pueden acelerar la transferencia del GPCR al núcleo, con relación a células de control y pueden ser agonistas para el GPCR. Para permitir la determinación de la distribución de la proteína de transmembrana expresada dentro de las células, con o sin exposición a un compuesto de prueba, la proteina de transmembrana expresada puede transportar una porción detectable, la cual puede detectada en las células. La porción detectable puede ser cualquier porción la cual permanecerá asociada con la proteína de transmembrana en el transcurso de su expresión y tráfico dentro de las células y puede ser detectada directamente o indirectamente para determinar su distribución dentro de las células y para determinar una distribución alterada que resulta de la exposición a un compuesto candidato. En una primera modalidad, las células son transíectadas con una secuencia de nucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína de transmembrana que comprende al menos una NLS enlazada a una porción detectable que comprende un péptido o polipéptido detectable. Como se usa aquí, un péptido significa una secuencia de dos a 20 residuos de aminoácido, preferiblemente una secuencia de aproximadamente 5 a 15 residuos de aminoácido, y un polipéptido significa una secuencia de más de 20 residuos de aminoácido, incluyendo propinas completas de cualquier longitud. El péptido o polipéptido detectable puede ser directamente detectable o puede reaccionar para dar una señal detectable. El péptido detectable puede ser, por ejemplo, un péptido o epitope antigénico el cual se expresa, por ejemplo, en la amino-terminal de la proteína de transmembrana. La distribución de la proteína de transmembrana dentro de las células se detecta mediante la detección del epitope usando un anticuerpo detectable específico para el epitope. Un número de sistemas epitope anticuerpo están disponibles comercialmente . Los ejemplos son los sistemas epitope/anticuerpo HA (Roche Diagnostics) , FLAG (Sigma Chemical Co . ) , c-myc (Santa Cruz), hexamero de Histidina (BD Biosciences Clontech) , GST (ABR Affinity BioReagents) , V5 (Abcam) y Xpres (Invitrogen) . Las secuencias de nucleótidos que codifican estos epitopes pueden ser compradas, así como los anticuerpos específicos para los epitopes. Estos anticuerpos pueden transportar una etiqueta detectable (por ejemplo, isotiociantao de fluoresceína (FITC) ) o pueden ser detectables por si mismos mediante el uso de un segundo anticuerpo que transporta una señal detectable, como serpa entendido por aquellos con experiencia en la técnica. Esta modalidad de la invención es particularmente adaptable a un método automatizado o semiautomatizado, por ejemplo, examinando las placas tratadas con el anticuerpo de células en un lector de platas automatizado, permitiendo la selección con alto rendimiento . El polipéptido detectable puede ser un polipéptido detectable ópticamente, tal como proteína fluorescente verde (GFP) , proteína fluorescente roja (RFP) , proteína fluorescente amarilla (YFP) o proteína ciano fluorescente (CFP) , o cualquiera de las variantes modificadas de estas proteínas, las cuales están disponibles comercialmente . El polipéptido detectable puede ser también una enzima tal como la luciferasa o ß-galactosidasa, al cual puede hacerse reaccionar para dar un punto final detectable tal como emisión de luz o cambio de color. Las secuencias de nucleótidos que codifican tales polipéptidos son fáciles de conseguir, por ejemplo de Clontech, y están enlazadas a la secuencia de nucleótido que codifica la proteína de transmembrana que contiene la NLS, preferiblemente en el extremo C-terminal de esa proteína. En una modalidad adicional, la porción detectable es un péptido antigénico que comprende una porción de la secuencia de aminoácido de la proteína de transmembrana en si, preferiblemente una porción de una región extracelular de la proteína. Como se describe arriba, la distribución de la proteína de transmembrana dentro de las células se determina usando un anticuerpo detectable específico para el epitope. Los anticuerpos adecuados están disponibles comercialmente, por ejemplo el anticuerpo anti-Dl dirigido a los aminoácidos 9-21 de la amino terminal del receptor de dopamina DI humano, o pueden ser preparados mediante métodos convencionales . En una modalidad adicional, aplicable a las proteínas de transmembrana con los ligando conocidos, las células son transfectadas con una secuencia de nucleótido que codifica una protelna de transmembrana que contiene al menos una NLS . Las células se ponen en contacto con un compuesto candidato y se incuban como se describe arriba. Las células se cosechan entonces y se aisla la fracción de la membrana celular y se pone en contacto con un ligando etiquetado de manera detectable de la proteína de transmembrana , por ejemplo, un ligando radio etiquetado. La determinación de la cantidad de ligando etiquetado, enlazado a la fracción de la membrana de las células tratadas, con relación a la cantidad enlazada a la fracción de la membrana de las células de control sin contacto con el compuesto candidato, puede ser usada para cuantificar la proteína de transmembrana que permanece en la superficie celular e indica la interacción del compuesto candidato con la proteína de t ansmembrana. Las secuencias de nucleótidos que codifican la proteína de transmembrana pueden ser obtenidas de bases de datos públicas tales como Genbank (http : //www. ncbi .nlm.nih.gov: 80/entrez) o de bases de datos comerciales. Los constructos adecuados pueden ser sintetizados mediante métodos convencionales, como se describe en los ejemplos de ahí, u obtenidos comercialmente . "Una proteína de transmembrana que contiene una NLS" incluye una proteína de transmembrana la cual contiene una NLS en su secuencia de tipo silvestre y una proteína de transmembrana cuya secuencia de aminoácido ha sido modificada para contener una NLS . Las NLSs convencionales son secuencias de péptidos cortas que facilitan la localización nuclear de las proteínas que las contienen (ver por ejemplo, la Tabla 1, la cual lista las NLSs y Jans et al., 2000) . Existen tres clases principales de NLSs, dos de estas clases consisten de residuos de aminoácidos básicos, las NLSs monopartitas ejemplificadas por el antígeno de tumores grandes SV40, PKK RKV, que consiste de un sólo trecho de aminoácidos básicos, y las NLSs bipartitas las cuales contienen dos trechos de aminoácidos básicos separados por 10 a 22 (algunas veces hasta cientos) de aminoácidos. Otros tipos de NLSs están ejemplificados por aquellos de la levadura de proteína Mata2 NLS donde los residuos cargados/polares están contenidos dentro del trecho de residuos no polares, o el protooncogen c-myc NLS, donde los residuos de prolina y ácido aspártico que flanquean los residuos básicos se requieren (PAARVKLD) para el direccionamiento nuclear. Todas las clases de NLS son reconocidas específicamente por las a-ß-importinas . Cualquier NLS puede ser empleada en los métodos de la invención, las secuencias de nucleotidos que codifican una NLS seleccionada pueden ser derivadas de la secuencias de aminoácido de la NLS y se sintetizan e incorporan en la secuencia de nucleótido que codifica la proteina de transmembrana mediante métodos convencionales, como se describen aquí . Muchas diferentes posiciones dentro de cualquiera de los lazos intracelulares o las terminales intracelulares podrían ser colocadas en las terminales intracelulares amino o carboxi o cualquiera de los lazos intracelulares . Cuando una NLS se inserta en una proteína de transmembrana para usarse en los métodos de la invención, la eficiencia de la inserción puede ser seleccionada confirmando que la proteína de transmembrana que contiene la NLS está substancialmente tanslocalizada desde la membrana celular al núcleo celular en cuestión de 24 a 48 horas y que los ligandos de la proteína de transmembrana interfieren con la translocación . Las secuencias de nucleotidos que codifican las proteínas de transmembrana que contienen la NLS están enlazadas a secuencias que codifican péptidos o polipéptidos detectables, mediante métodos convencionales . Una secuencia de nucleótido que codifica una proteína de transmembrana que contiene la NLS seleccionada que contiene o enlaza a una porción detectable, es transfectada en células con núcleo clonando la secuencia en un sistema de vectores que contiene un promotor adecuado, usando técnicas convencionales como se describe en la literatura científica, por ejemplo en Current Protocols in Molecular Biology, (1987) . Los vectores adecuados incluyen el pEGF-Nl (Clontech) el cual contiene el promotor del citomegalovirus humano (CMV) , y el vector pcDNA.
Cualquier tipo de células puede ser usado, el cual es capaz de expresar las secuencias de nucleótidos transfectadas y en las cuales una NLS facilita la transferencia de una proteína de transmembrana lejos de la membrana celular. Las células adecuadas incluyen células procaríóticas, incluyendo células bacteriales, y células eucarióticas . Las células eucarióticas adecuadas incluyen células de mamíferos aisladas, células de levadura, células de plantas, células de insectos, células de nemátodos y células fúngicas . Las células de mamíferos adecuadas incluyen líneas celulares humanas, líneas celulares de roedor, líneas celulares de hámster, y líneas celulares de primates no humanos . En una modalidad, las células se transfectan con un número de secuencias de nucleótidos, cada una que codifica una proteína de transmembrana que contiene NLS diferente y una porción detectable diferente. La interferencia con el tráfico que la proteína de transmembrana lejos de la membrana celular por un compuesto de prueba puede estar relacionada con la interacción del compuesto con una proteína de transmembrana particular por la identidad de la porción detectable cuyo movimiento desde la superficie celular está interrumpido. En una modalidad adicional, para una selección inicial con rendimiento superior, las células se transíectan con un número mayor de secuencias de nucleótidos, cada una que codifica una proteína de transmembrana que contiene NLS y una porción detectable diferentes, algunas de las porciones detectables son comunes a más de una proteína de transmembrana. Si la selección inicial indica que un compuesto candidato está interactuando con una o más de las proteínas de transmembrana, el compuesto se deselecciona usando células que expresan menos proteínas de transmembrana, o sólo una, hasta que se identifica la proteína de transmembrana interactuante específica. En células transfectadas con más de una proteína de transmembrana, puede existir oligomerización entre ares de proteínas como se discute aquí, y esto puede afectar la interpretación del efecto de incompuesto candidato. La reselección subsecuente del compuesto usando células transfectadas sólo con una proteína de transmembrana permite la clarificación de la interacción del compuesto con la proteína particular. Alternativamente, para multiplicar células transfectadas, las proteína de transmembrana pueden ser seleccionadas las cuales ha sido demostrado que no se oligomerizan mutuamente. Identificación de compuestos que interactúan En una modalidad de la invención, células con núcleo son transfectadas con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que comprende una proteína de transmembrana que contiene una NLS y una porción detectable y se incuban durante un periodo de tiempo adecuado para permitir la expresión de la NLS-proteína de transmembrana y el comienzo de su acumulación en la membrana celular. Para los GPCRs y trasportadores , por ejemplo, un periodo de aproximadamente 6 a 24 horas es adecuado. Una persona con experiencia en la técnica puede determinar fácilmente un tiempo de incubación adecuado para otras proteínas de transmembrana por la observación de la acumulación de la proteína en la membrana celular. No toda la proteína de transmembrana expresada necesita haber alcanzado la membrana celular cuando se agrega en compuesto candidato. Las células de prueba se ponen en contacto entonces con un compuesto candidato el cual deberá ser evaluado en cuanto a su interacción con la proteína de transmembrana por un periodo de tiempo el cual es suficiente para permitir la translocación de una porción substancial de la NLS-proteína de transmembrana, preferiblemente al menos 20%, más preferiblemente al menos 50%, y aun más preferiblemente al menos 90%, lejos de la membrana celular y dentro o hacia el núcleo en células de control no tratadas con el compuesto. Dependiendo de la proteína de transmembrana, este periodo de tiempo puede ser desde aproximadamente 6 horas a aproximadamente 72 horas; un periodo de tiempo de aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas es adecuado para la mayoría de las proteina de transmembrana examinadas . Una persona con experiencia en la técnica puede determinar fácilmente un tiempo adecuado mediante la observación de células de control . Los compuestos de prueba se evalúan inicialmente de manera general a una concentración de aproximadamente 1 a 10 micromolar . Las células de prueba y de control se examinan entonces para determinar la distribución de la porción detectable y por ello la distribución de la NLS-proteína de transmembrana. La distribución de la porción detectable puede ser determinada mediante varios métodos. Por ejemplo, cuando la porción detectable es una proteina detectable ópticamente, las células pueden ser examinadas mediante microscopía directa y la cantidad de proteína en el núcleo se compara entre las células de prueba y de control. En otra modalidad, se comparan las cantidades de proteína o el péptido detectable que permanecen en la membrana de las células de prueba y de control. En varios campos microscópicos (5-10) , que contiene cada uno 30-100 células, se determina la posición de la porción detectable en estas células y se contabiliza con respecto a cada posición. El porcentaje de células que tienen etiquetado de la superficie celular, o nuclear y la suma de todos los campos se calcula entonces con respecto a las células tratadas y de control . En otro ejemplo, cuando la porción detectable es un epitope antigénico, las células se ponen en contacto con un sistema de anticuerpos detectables que contiene un anticuerpo específico para el epitope, como se describe arriba. Por ejemplo, un primer anticuerpo específico para el epitope puede ser usado, seguido por una segundo anticuerpo específico para el primer anticuerpo, etiquetado de manera fluorescente, la señal fluorescente se cuantifica mediante un fluorometro. Cuando las células de control muestran una porción substancial, preferiblemente al menos 50% de la proteína de transmembrana translocalizada lejos de la membrana celular y las células de prueba muestran retención de la proteína de transmembrana en la membrana celular, con relación a las células de control, esto indica interacción del compuesto de prueba con la proteína de transmembrana. En una modalidad preferida, se indica interacción cuando el nivel de proteínas en la membrana celular es mayor en las células de prueba en al menos 10%, preferiblemente en al menos 15%, y más preferiblemente en al menos 20%. La proporción de la porción detectable que permanece en la membrana celular tras la exposición al compuesto que interactúa se relaciona con al concertación y la potencia del compuesto. Por ejemplo, el uso de un antagonista de GPCR potente conocido en concertación micromolar, resulta típicamente en aproximadamente 50 a 100% de la proteína permaneciendo en la superficie celular, 0 a 15% en el núcleo y el resto en el citoplasma. Concentraciones nanomolares menores del mismo antagonista resultan en retención del 20 al 40% de la proteína en la superficie celular, con el resto de la proteína en el citoplasma y el núcleo. En las células de control sin tratamiento, 0-15% de la proteína fue indetectable en la superficie celular, con el resto en el citoplasma y el núcleo. En una variante de este método, usado cuando la proteína de transmembrana tiene ligandos conocidos, se usa una proteína de transmembrana que contiene NLS sin una porción detectable y se determina la distribución de la proteína en las células después del tratamiento con un compuesto de prueba mediante el aislamiento de la fracción de la membrana celular y la determinación de su componente de proteína de transmembrana usando ligandos etiquetados de manera detectable, como se discute arriba. En una modalidad adicional de la invención se usa un método similar para identificar compuestos los cuales interactúan con una NLS-proteína de transmembrana para promover sus translocación lejos de la superficie celular y dentro o hacia el núcleo. Las células se transfectan e incuban para permitir la expresión de la NLS-proteína de transmembrana y su acumulación en la superficie celular. Preferiblemente, las células se incuban hasta que al menos aproximadamente 70 a 90% de la proteína de transmembrana expresada se ha acumulado en la superficie celular. Para muchas proteínas de transmembrana, un periodo de tiempo de aproximadamente 12 a aproximadamente 24 horas desde la transfeccíón es adecuado. Las células de prueba se ponen en contacto entonces con un compuesto candidato, y se observan inmediatamente las células de prueba y de control individuales en tiempo real hasta por 4 horas para observar la distribución de la porción detectable. Una acumulación incrementada de la poción detectable en el núcleo de las células de prueba en comparación con las células de control indica que el compuesto de prueba ha promovido la translocación de la proteína de transmembrana. En una modalidad preferida, la interacción se indica cuando las células de prueba muestran acumulación nuclear incrementada en al menos 5%, preferiblemente en al menos 10%, y más preferiblemente en al menos 20%. Una modalidad adicional de la invención es un método para identificar compuestos los cuales, aunque no previenen por si mismos la translocación de una proteína de transmembrana que contiene NLS lejos de la membrana celular, no obstante pueden interferir con la interacción de la proteína de transmembrana con un compuesto de interacción. Los compuestos los cuales han probado ser negativos en el primer método de selección descrito arriba pueden ser evaluados mediante este método adicional en cuanto a su habilidad para competir con un compuesto de interacción conocido . En este método, las células se transíectan como se describe arriba y se incuban por un periodo de tiempo adecuado para permitir la expresión y la acumulación de la proteína de transmembrana en la superficie celular, por ejemplo, durante aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas. Las células de prueba y las células de control se ponen en contacto entonces con un compuesto conocido por interactuar con la proteína de transmembrana, ya sea un ligando conocido o un compuesto de interacción identificado mediante el método descrito arriba, durante aproximadamente 24 a aproximadamente 48 horas. Las células de prueba se ponen en contacto entonces con un compuesto candidato y las células de prueba y las células de control se observan después de 1 hora, en uno o más puntos de tiempo, hasta 24 horas, para determinar la distribución de la NLS-proteína de transmembrana dentro de las células como se describe arriba. En las células de control, el compuesto de interacción conocido origina que la proteína de transmembrana sea retenida en la membrana celular. Si un compuesto candidato compite con el compuesto de interacción, las células de prueba muestran una reducción de la proteina de transmembrana en la superficie celular y translocación incrementada de la proteína lejos de la superficie celular. En una modalidad preferida, la interacción está indicada cuando las células de prueba muestran una reducción de al menos 10%, preferiblemente 15%, y más preferiblemente 20%. En una modalidad adicional, células las cuales expresan endógenamente una proteína de transmembrana que contiene NLS pueden ser empleadas, en conjunción con un primer compuesto el cual ha sido demostrado que interactúa con la proteína e inhibe sus transferencia desde la membrana celular, reteniendo por lo tanto la proteína en la membrana celular. Cuando tal sistema se pone en contacto con un compuesto candidato, si ese compuesto interactúa con la proteína de transmembrana y compite con el primer compuesto, se observa una transferencia incrementada de la proteína lejos de la membrana celular. Identificación de las interacciones de la proteína de transmembrana con otras proteínas Un número de proteína de transmembrana, incluyendo GPCRs, transportadores, receptores de tirosina cinasa, los receptores de citosina para la insulina, factores de crecimiento similares a insulina, factor de crecimiento epidérmico y factor de crecimiento endotelial vascular, son capaces tanto de homo- y heterooligomerización (ver, por ejemplo, revisión de GPCRs en George et al., 2002) . Como se usa aquí, "oligomerización" de una proteína significa asociación de dos o más moléculas de la proteína. Para los receptores hipotéticos A y B la superficie celular puede contener dímeros AA, BB y AB y se cree que estos pueden representar tres complejos funcionales diferentes y por lo tanto tres diferentes objetivos de fármacos. Es importante por lo tanto identificar cuales proteínas de transmembrana pueden interactuar unos con otros o con otras proteínas mediante oligomerización. En otras modalidades, la invención proporciona métodos para determinar si dos proteínas de transmembrana son capaces de oligomerización o si una proteína de transmembrana y una proteína no se transmembrana son capaces de oligomerizacion. En una modalidad, células con núcleo se co-transfectan con una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de transmembrana que contiene una NLS y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de transmembrana que contiene una NLS pero que transporta o se enlaza a una porción detectable. La creación de estas secuencias de nucleótidos es como se describe arriba. Después de un intervalo de tiempo adecuado para permitir la expresión de las proteínas codificadas, la acumulación en la membrana celular y la translocación subsecuente de la proteína que contiene NLS lejos de la membrana celular a o hacia el núcleo, se determina la distribución de la porción detectable en las células, por ejemplo, determinando un incremento de la porción detectable en el núcleo o por una disminución de la porción detectable en la superficie celular. Ha sido encontrado que cuando las células son transíectadas doblemente, y las primera y segunda proteínas de transmembrana son la misma. Excepto que una proteína de transmembrana contiene una NLS insertada y la otra no, existe una reducción de velocidad de la trasferencia entre la proteína de transmembrana que contiene NLS al núcleo en comparación con la transferencia en células transfectadas sólo con la proteína que contiene NLS . El proceso de la translocación, de proteínas al núcleo puede tomar ahora aproximadamente 24 a 48 horas. En este método, por lo tanto, las células se incuban por aproximadamente 24 a 48 horas antes del examen de la distribución de la proteína en las células. La translocación de la porción detectable desde la superficie celular a o hacia el núcleo indica que la primera proteína de transmembrana ha transportado la segunda proteína de transmembrana lejos de la superficie celular, indicando la oligomerización de la primera y la segunda proteínas. La retención de la poción detectable en la superficie celular indica una carencia de interacción entre las proteínas . Cuando las primera y segunda proteínas de transmembrana son la misma proteína, el método permite la identificación de la habilidad de la proteína para homodimerizarse . Cuando las primera y segunda proteínas de transmembrana son diferentes, el método permite la identificación de la habilidad de dos diferentes proteínas para heterodimerizarse y permite la determinación de la especificidad de la interacción entre dos proteínas de transmembrana. El método puede ser llevado acabo ya sea en ausencia de activación del ligando o en presencia de un ligando de cualquier proteína . Usando este método, ha sido demostrada la oligomerización tanto dentro y entre diferentes clases de GPCRs y dentro y entre otras clases de proteínas de transmembrana. Además, han sido detectadas las interacciones entre proteínas de transmembrana GPCRs y no GPCR, por ejemplo entre el receptor de dopamina D5 y el receptor de GABA-A, y entre proteínas de transmembrana y proteínas no de transmembrana. La invención proporciona por lo tanto, de manera general, un método para detectar la oligomerización entre dos proteínas mediante el método descrito arriba, donde se cotransfectan células con una de las proteínas que contienen una NLS y la otra proteína que transporta una señal detectable. La co-transfección de células con una primera proteína de transmembrana que contiene una NLS y una segunda proteína etiquetada de manera detectable, tal como una proteína de transmembrana de un grupo diferente, la cual ha sido mostrada por el método de la invención que se oligomeriza con la primera proteína, proporciona células las cuales pueden ser usadas para seleccionar compuestos candidatos por la interacción ya sea con la primera o la segunda proteína. Un compuesto el cual interactúa con cualquier proteína influenciará la oligomerización o translocación de las proteínas oligomerizadas lejos de la membrana celular. Los compuestos los cuales interactúan con un miembro del par de proteínas o con el oligómero para causar la retención de la proteína detectable en la superficie celular o causa la translocación acelerada de la proteína detectable lejos de la superficie celular pueden ser identificado mediante este método . En una modalidad adicional, células las cuales expresan endógenamente una proteína de transmembrana que contiene NLS son transfectadas con una secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de transmembrana que transporta una porción detectable pero que carece de NLS. La oligomerización de las dos proteínas se indica por el tráfico de la porción detectable lejos de la membrana celular y dentro o hacia el núcleo. En una modalidad adicional, una proteína de membrana que contiene una NLS puede ser usada para identificar nuevas proteínas de interacción. En este método, una proteína de transmembrana que contiene NLS se expresa en células y se le permite translocarse al núcleo. Los núcleos se cosechan entonces y se analizan por nuevas bandas de proteínas apareadas mediante teñido de Coomassie o teñido con plata y después identificación mediante espectrometría de masas. El control serán los núcleos de las células que expresan la proteína de membrana sin una NLS. Uso de FRET para la detección de la translocacion nuclear. En un aspecto adicional de la invención, que involucra transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) (Hailey et al.,.., 2002) células con núcleo se co-transfectan con una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de transmembrana que contiene NLS enlazada a una primera proteína ópticamente detectable y una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína de transmembrana que no contiene NLS enlazada a una segunda proteína ópticamente detectable cuya fluorescencia puede ser activada por la emisión de la primera proteína ópticamente detectable cuando estas están en proximidad. Por ejemplo, la primera protexna puede ser enlazada a GFP y la segunda a cualquier otra porción ópticamente detectable que puede ser activada por el espectro de emisión activada por láser de GFP. Esta segunda porción ópticamente detectable, después de la activación por la GFP, emite a una longitud de onda diferente. Cuando los oligomeros se forman entre las dos proteínas de transmembrana, las dos etiquetas están en proximidad cercana una a la otra y su interacción FRET puede ser detectada. La interacción física se detecta mediante la activación de la fluorescencia selectiva del donador y la detección de la emisión por el receptor, usando el método FRET o sus variantes tales como fotoblanqueado FRET, FRAP o FLIM. La carencia de interacciones FRET indica carencia de oligomerizació .
La microscopía confocal con FRET entre dos moléculas fluorescentes puede ser llevada a cabo (por ejemplo, los pares espectrales GFP y DsRred2 , o CFP y YFP) para obtener una señal cuantificante que indica la translocación al núcleo. FRET requiere un traslape entre los espectros de emisión y excitación de las moléculas donadora y aceptora y la proximidad bajo 100 angstroms (10-100), haciendo al FRET un sistema altamente adecuado para analizar las interacciones de proteína-proteina cercanas específicas en células. Las proteínas fluorescentes listadas arriba son excelentes parejas espectrales . Un fluoroforo residente en el núcleo podría permitir que ocurra el FRET cuando una proteína de transmembrana etiquetada con el segundo fluoroforo es translocado al núcleo. Esto facilitara una fácil lectura, usando un lector de placas FRET. Este método es útil para detectar interacciones entre dos proteína de transmembrana o entre una proteína de transmembrana y otra proteína y proporciona una lectura de señales más sensible a la automatización. Este método puede ser usado también en procedimiento de selección de agonistas y antagonistas de GPCR. En el método de selección de antagonistas, una reducción de una señal FRET entre una GPCR-NLS-GFP traficada al núcleo con un fluorófo en el núcleo de células tratadas, en comparación con células no tratadas indicaría un efecto antagonista. En el método de selección de agonistas, el incremento en la señal FRET entre una GPCR-NLS-GFP traficada al núcleo con un fluoróforo en el núcleo de células tratadas en comparación con células no tratadas indicarla un efecto agonista. En una modalidad adicional, las células transíectadas doblemente pueden ser tratadas con agonistas antes de la examinación por evidencia de oligomerización, ya que esta puede ser aumentada en presencia del agonista. En la medición de las interacciones receptor:receptor, una GPCR-NLS-GFP es co-expresada con una segunda GPCR-DsRED. Si estos receptores interactúan mutuamente y circulan juntos al núcleo una señal FRET nuclear será detectada. Si los receptores no interactúan, entonces no será obtenida una señal FRET en el núcleo . La FRET también puede ser medida entre dos anticuerpo conjugados a fluoróforo que reconocen los epitopes incorporados o nativos en los GPCRs. EJEMPLOS Los ejemplos se describen para propósitos de ilustración y no se destinan para limitar el ámbito de la invención. Los métodos de la química, biología molecular, bioquímica de proteínas y péptidos e inmunología mencionados pero descritos explícitamente en esta descripción y ejemplos están reportados en la literatura científica y son bien conocidos por aquellas personas experimentadas en la técnica.
Materiales y Métodos Proteína fluorescente verde: una secuencia de ADN que codifica la proteina fluorescente verde de Aequoria victoria (Prasher et al.,., 1992) fue obtenida de Clontech, E.U.A. Proteína fluorescente roja: una secuencia de ADN que codifica las proteínas fluorescentes rojas (Matz et al., 1999) pDsRed2 y pDsRed2-nuc fueron obtenidas de Clontech, E.U.A. Este constructo codifica una proteína derivada de Discosoma sp. C lulas COS y células HEK fueron obtenidas de American Type Culture Collection, Washington, D.C.. El medio de cultivo fue preparado por los servicios de laboratorio en la Universidad de Toronto. Compuestos antagonistas y agonistas fueron obtenidos de varias fuentes comerciales tales como Sigma Chemical Company E.U.A. Anticuerpos usados para la inmunodetección de las marcas de epitope, fueron obtenidos de las siguientes fuentes: anticuerpo monoclonal Anti-HA fue obtenido de Roche Diagnostics. E.U.A. Anticuerpo monoclonal Anti-FLAG fue obtenido de Sigma Chemical Company. E.U.A. anticuerpo monoclonal Anti-c-myc fue obtenido de Santa cruz E.U.A. Radioligando 3H-SCH 23390 usado en el análisis de enlace del receptor fue obtenido de NEM Perkin Elmer, E.U.A.
Creación de constructos de ADN Las secuencias de nucleótidos que codifican los GPCRs o transportadores fueron obtenidas del sitio de red del Genebank (http://www.ncbi .nlm.nih.gov: 80/entrez) , establecido por la Nacional Library of Science. Una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de transmembrana seleccionada fue unida a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de señalización detectable seleccionada. Los constructos fueron clonados en el sistema de vector, pEGFP (Clontech) o el vector pDsRed2-Nl o el vector pcDNA3. la. Construcción del receptor de dopamina DI con una NLS en la cola carboxi próxima (hélice 8) y fusionada a GFP (Dl-GFP y Dl-NLS-GFP) . Usando el método de PCR con las siguientes condiciones experimentales, ADN que codifica el receptor de dopamina DI en el vector pcDNA3 fue sometido a PCR. La mezcla de reacción contenía agua (32 microlitos) , lOx amortiguador de Pfu (Stratagene) (5 microlitros) , DMSO (5 microlitros) , cebadores de oligonucleótido (100 ng) (1 microlito de cada uno) , plantilla de ADN (100 ng) , enzima Pfu (5 unidades) . El volumen total fue de 50 microlitros. Se usaron las siguientes condiciones de PCR, un ciclo a 94°C por 2 mins, 30-35 ciclos a 94°C por 30 seg, 55°C por 30 segs, 72°C por 1 min, por ciclo, y después un ciclo a 72 °C por 5 mins.
Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN que codifica el receptor de la dopamina DI : HDl-Pl : 5 ' GAGGACTCTGAACACCGAATTCGCCGCCATGGACGGGACTGG GCTGGTG 3' HD1-P2 : 5 ' GTGTGGCAGGATTCATCTGGGTACCGCGGTTGGGTGCTGACCGTT 3 ' El sitio de restricción EcoRl fue incorporado en el cebador HDl-Pl, y el sitio de restricción Kpnl fue incorporado en el cebador HD1-P2. El producto de PCR, el cual no contenía el codón de detención fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (de Clontech) en EcoRl y Kpnl y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP. La secuencia de la NLS, KKFKR del receptor de ATI humano fue insertada en el ADN que codifica la base de TM7 (hélice 8) del receptor de la dopamina DI por PCR, reemplazando la secuencia codificante natural por DFRKA. El conjunto de cebadores para la construcción de ADN que codifica Dl-NLS : HDl-NLSF: 5' CCTAAGAGGGTTGAAAATCTTTTAAATTTTTTAGCATTA AAGGCATAAATG 3' HD1-NLSR: 5' GCCTTTAATGCTAAAAAATTTAAAAGATTTTCAACCCTC TTAGGATGC 3' Usando el ADN que codifica a Dl-GFP como una plantilla con los cebadores NDl-Pl y HDl-NLSF resultó en un producto de lOOObp (PCR#1) . Usando el ADN que codifica a DI GFP PCR con los cebadores HD1-P2 y HD1-NLSR resultó en un producto de 300bp (PCR#2) . Una PCR subsecuente llevada a cabo con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2 resultó en un producto de 1300 bp usando el producto de PCR#1 y el producto de PCR#2 como plantillas. El ADN resultante que codifica a Dl-NLS fue subclonado en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoRl y Kpnl . Todos los constructos adicionales descritos abajo fueron preparados usando el mismo método de PCR y las condiciones experimentales como de describe arriba para el receptor de dopamina DI, pero con los cebadores específicos como se describen abajo. Ib. Construcción del receptor DI de dopamina que contiene una NLS fusionada a RFP (Dl-NLS-RFP) La secuencia de NLS K K F K R fue insertada en el segmento de la hélice 8 de la cola de carboxilo intracelular del receptor de DI humano mediante el método de PCR como sigue. Usando el ADN que codifica el receptor de DI humano en el vector pcDNA3 como plantilla, se llevó a cabo la primera PCR con los cebadores HD1-P1 y HD1-NLSR resultando en un producto de Ikb. Se hizo una segunda PCR usando los cebadores HD1-P2 y HD1-NLSF resultando en un producto de 300bo. Usando los productos PCR#1 y PCR#2 como plantillas, se hizo la PCR final con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2 lo cual generó un producto de 1.3kp . D1NLS se clonó en el vector pDsRed (Clontech) en EcoRI y Kpnl y se fusiono a RFP. Secuencias de cebadores HD1-P1: 5' GAGGACTCTGAACACCGAATTCGCCGCCATGGACGGGACTGGGCTGGTG 3' HD1-P2: 5' GTGTGGCAGGATTCATCTGGGTACCGCGGTTGGGTGCTGACCGTT 3 ' HD1-NLSF: 5' GCCTTTAATGCTAAAAAATTTAAAAGATTTTCAACCCTCTTAGGATGC 3' HD1-NLSR: 5' CCTAAGAGGGTTGAAAATCTTTTAAATTTTTTAGCATTAAAGGCATAAA TG 3' Dl-tipo silvestre: N P I I Y A F NAD F R KA F S T L L Hélice 8 de D1NLS : N P I I Y A F NA K K F KR F S T L L le. Construcción del receptor de dopamina DI con una etiqueta de epitope de hemaglutinina (HA) en la amino terminal La etiqueta de HA es como sigue: Secuencia de nucleótidos : TACCCTTACGACGTGCCGGATIACGCC Secuencia de aminoácidos de HA: Y P Y O V P D YA La etiqueta de epitope de HA se insertó en la amino terminal del receptor DI humano usando Dl-pcDNA3 como plantilla con los siguientes cebadores : PIHA-BamH: 5'ggatccactagtaacggccgccagaccaccATGGGATACCCGTACGACGTCCCCGACTAC GCAAGGACTCTGAACACCTCTGCC3 ' P2-Notl: 5' ggccgccagctgcgagTTCAGGTTGGGTGCTGACCG 3' El ADNc amplificado resultante (1.3 kb) se subclonó en el vector pcDNA3 en BamH I y Not I . DI tipo silvestre: M R T L N T S A M D G T G L V V Etiqueta DI-HA : G Y P Y D V P D Y A R T L N T S A M D G T G L V V Id- Construcción del receptor de dopamina DI con una epitope de HA y LS en la cola de carboxilo cercana (hélice 8) (D1HA-NLS) Conjunto de cebadores para la amplificación por PCR del ADN que codifica Dl-NLS (hélice 8) usando el ADN que codifica DI-HA como plantilla. Usando el ADN DI-HA como plantilla con los cebadores T7 y HDl-NLSR el ADN amplificado resultante fue de lOOObp (PCR#1) . Usando el ADN DI-HA como plantilla con los cebadores Sp6 y HDl-NLSR el ADN resultante fue de 300bp, (PCR#2) . Usando los cebadores T7 y Sp6 y el producto de PCR#1 y PCR#2 como plantillas el ADN resultante fue de 1300 bp (PCR#3) . HD1 -NLS : 5 ' CCTAAGAGGGTTGAAAATCTTTTAAATTTTTTAGCATTA AAGGCATAAATG 3' HD1-NLSF : 5 ' GCCTTTAATGCTAAAAAATTTAAAAGATTTTCAACC CTCTTAGGATGC 3' El PCR de D1HA-NLS (hélice 8) estaba romo en pcDNA3 en EcorV. Se secuenció el clon con la orientación correcta.
DI-HA tipo silvestre: N P I I Y A F N A D F R KA F S T L L D1-NLSR-IC3: N P I I Y A F NA K K F K R F S T L L le. Construcción del receptor DI de dopamina con una NLS en el lazo intracelular 3, fusionado a GFP (D1- LS-IC3 -GFP) Conjunto de cebadores para la construcción de D1-NLS-IC3- EGFP: D1NLSF-IC3: 5' GGAAAGTTCTTTTMGAAGAAGTTCAAAAGAGAAAC 3' D1-NLSR-IC3: 5' GTTTCTCTTTTGAACTTCTTCTTAAAAGAACTTTCC 3' Usando la plantilla DI pcDNA3 : PCR#1: cebadores HD1-P1 y D1NLSR-IC3 PCR#2: cebadores HD1-P2 y D1NLSF (500bp) PCR#3: cebadores HD1-P1 y HD1-P2 usando PCR#1 y PCR#2 como plantillas (3.1 kb) El fragmento de ADN resultante que codifica D1-NLS-IC3 se subclonó en el vector pEGFP en EcoRl y Kpnl . DI tipo silvestre: Q P E S S F K M S F K R E T KV L D1-NLS-IC3 : Q P E S S F K K K F K R E T KV L La secuencia de NLS KKFKR se insertó en el segmento del lazo 3 de IC del receptor DI reemplazando la secuencia MFSKR usando DI pcDNA3 como plantilla. Usando el ADN que codifica a DI en pcDNA3 como plantilla, se llevó a cabo la PCR con los siguientes cebadores HD1-P1 y D1-NLSR-IC3 resultando en un producto de 800 bp (PCR#1) .
Usando el ADN que codifica a DI en pcDNA3 con los cebadores HD1-P2 y HD1-NLSF-IC3 resultó en un producto de 500 bp (PCR#2) . Una PCR subsecuente se llevo a cabo con los cebadores HDl-Pl y HD1-P2 resultando en un producto de 1300 bp usando el producto de PCR#1 y el producto de PCR#2 como plantillas. El constructo resultante que codifica a Dl-NLS se subclonó en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoRl y Kpnl. lf. Construcción del receptor DI de dopamina con una NLS en el lazo 2 intracelular fusionado con GFP (D1-NLS-IC2-GFP) El conjunto de cebadores para la construcción de ADN que codifica a D1NLS-IC2 D1NLSF-IC2: 5' CCGGTATGAGAAAAAGTTTAAACGCAAGGCAGCCTTC 3' D1-NLSR-IC2: 5' GGCTGCCTTGCGTTTAAACTTTTTCTCATACCGGAAAGG 3' Usando el ADN que codifica el receptor de dopamina DI en pcDNA3 como plantilla, la PCR con los cebadores HDl-Pl y D1NLSR-IC2 (PCR#2) , resultó en un producto de 500 bp. Usando el ADN que codifica al receptor de dopamina DI en pcDNA3 como una plantilla con los cebadores HD1-P2 y D1NLSF-IC2 (PCR#2) resultó en un producto de 800 bp. Una PCR subsecuente llevada a cabo con los cebadores HDl-Pl y HD1-P2 usando PCR#1 y PCR#2 como plantillas resultó en un producto de 1300 bp. El ADN resultante que codifica a D1NLS-IC2 PCR se subclonó en el vector EGFP en EcoRl y Kpnl . DI tipo silvestre: N P F R Y E R K M T P KAA F I L I D1-NLS-IC2: N P F R Y E K K F K R KAA F I L I Ig. Construcción del receptor de dopamina DI con NLS en el lazo intracelular 1 fusionado con GPP (D1-NLS-IC1-GFP) El conjunto de cebadores para la construcción del ADN que codifica a D1-NLS-IC1. Dl-NLSF-ICl: 5' GTGCTGCCGTTAAAAAGTTCAAACGCCTGCGGTCCAAGG 3' D1-NLSR-IC1: 5' GGACCGCAGGCGTTTGAACTTTTTAACGGCAGCACAGACC 3' Usando el ADN que codifica al receptor de dopamina DI en pcDNA3 como plantilla, la PCR con los cebadores HD1-P1 y Dl-NLSR-IC1 (PCR#1) , resultó en un producto de 300 bp. Usando el ADN que codifica al receptor de dopamina DI en pcDNA3 como plantilla la PCR con los cebadores HD1-P2 y DINLSF resultó en un producto de lOOObp (PCR#2) . Una PCR subsecuente llevada a cabo con los cebadores HD1-P1 y HD2-P2 usando PCR#1 y PCR#2 como plantillas resultó en un producto de 1300 bp. El ADN resultante que codifica a D1-NLS-IC1 se subclonó en el vector pEGFP en EcoRl y Kpnl . DI tipo silvestre: L V C AA V I R F R H L R S KV T N D1- LS-IC1: L V C A AV K K F KR L R S KV T N l . Construcción del receptor de dopamina DI con una NLS alternativa en la cola de carboxilo cercana y fusionado con GFP (D1-NLS2 -GFP) El método PCR se uso para introducir la secuencia de NLS PK KRKV en reemplazo de la secuencia natural ADFRKAF en el receptor DI. El ADN que codifica el receptor de dopamina DI en pcDNA3 se sometió a PCR con los cebadores HDl-Pl y HD1-NLS2R, resultando en un producto de lkb (PCR#1) . Otra PCR usando DI en pcDNA3 son los cebadores HD1-P2 y HD1-NLS2F resultó en un producto de 300bp (PCR#2) . La tercera PCR usando PCR#1 y PCR#2 como plantillas y los cebadores HDl-Pl y HD1-P2 resultó en un producto de 1.3 kb, y se subclonó en el vector pEGFP en EcoRl y Kpnl . HD1-NLS2F: 5' GCCTTTAATCCTAAAAAAAAAAGAAAGGTTTCAACCCTCTTAGG 3' HD1-NLS2R: 5' CCTAAGAGGGTTGAAACCTTTCTTTTTTTTTTAGGATTAAAGGC 3' DI tipo silvestre: N P I I Y A F N A O F R KA F S T L L D1-NLS2 : N P I I Y A F N P K K K R KV S T L L 2. Construcción de los receptores de dopamina DI y dopamina D2-NLS fusionados a GFP (D2-GFP y D2-NLS-GFP) El conjunto de cebadores para la ampli icación del ADN en pcDNA3 que codifica el receptor de dopamina D2. HD2-P1: 5' GGCCGTGGCTCCACCGAATTCGCCGCCATGGATCCACTGAATCTG 3' HD2-P2: 5' CTGTGCGGGCAGGCAGGGTACCGCGCAGTGGAGGATCTTCAGG 3 ' El sitio de restricción EcoRl se incorporó en el cebador HD2-P1, y el sitio de restricción Kpnl se incorporo en el cebador HD2-P2. El producto D2-PCR, el cual no contenía el codón de detención, se subclonó unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en EcoRl y Kpnl y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP. Conjunto de cebadores para la construcción de D2-NLS-GFP HD2-NLSF: 5' CACCACCTTCAACAAAAAATTCAAAAGAGCCTTCCTGAAGATCC 3' HD2-NLSR: 5' GGATCTTCAGGAAGGCTGTTTTGAATTTTTTGTTGAAGGTGGTG 3' La secuencia de NLS KKF R se insertó en la base del segmento TM7 del receptor D2 , reemplazando la secuencia IEFR , usando el constructo de ADN D2-GFP como plantilla. Usando el ADN que codifica a D2-GFP como plantilla, se llevó a cabo la PCR con los siguientes cebadores, HD2-P1 y HD2-NLSR resultando en un producto de 1300 bp(PCR#l). Usando el ADN que codifica a DI-GFP PCR con los cebadores HD2-P2 y HD1-NLSF resultó en un producto de lOObp (PCR#2) . Una PCR subsecuente llevada a cabo con los cebadores HD2-P1 y HD2-P2 resultó en un producto de 1400bp usando el producto de PCR#1 y el producto de PCR#2 como plantillas. El constructo resultante que codifica a D2-NLS se subclonó en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoRl y pnl . 3. Construcción del ADN que codifica a los receptores de dopamina D3 y D5 fusionado a GFP (D3-GFP y D5-GFP) Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN en pcDNA3 que codifica el receptor de dopamina D3. HD3-Hind: 5' GGCATCACGCACCTCAAGCTTGCCGCCATGGCATCTCTGAGTCAGC 3' HD3-Kpn : 5' GAGTGTTCCCTCTTCTGCGGTACCGCGCAAGACAGGATCTTGAGG 3' El sitio de restricción HindIII se incorporó en el cebador HD3 -Hind, y el sitio de restricción Kpnl y se incorporó en el cebador HD3-Kpn. El producto D3-PCR, el cual no contenía el codón de detención se subclonó unidireccionalmente en el vector pEGFP en HindIII y Kpnl y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP. Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN en pcDNA3 que codifica al receptor de dopamína D5. T7: 5' AATACGACTCACTATAG 3' HD5-Kpn: 5' CGCCAGTGTGATGGATAATGGTACCGCATGGAATCCATTCGGGGTG 3' El sitio de restricción Kpnl se incorporó en el cebador HD5-Kpn. El producto D5-PCR, el cual no contenía el codón de detención, se subclonó unidireccionalmente en el vector pEGFP en EcoRl y Kpnl y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP . 4. Construcción de los receptores de Histamina 1 e Histamina 2-NLS fusionados a GFP (Hl-GFP y Hl-NLS-GFP) Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN, del ADN genómico humano. Que codifica el receptor de Histamina Hl . Hl-MET: 5' GCGCCAATGAGCCTCCCCAATTCC 3' H1-ST0P: 5' GAGCCTCCCTTAGGAGCGAATATGC 3' Este producto Hl-PCR se uso como una plantilla para el experimento de PCR subsecuente . Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN que codifica el constructo Hl-GFP. Hl-PST: 5' CGCCTGCAGGCCGCCATGAGCCTCCCCAATTCCTCC 3' Hl-APA: 5' CCGGTGGATCCCGGGCCCCGGAGCGAATATGCAG 3' El sitio de restricción PstI se incorporó en el cebador Hl-PST, y el sitio de restricción Apal se incorporó en el cebador Hl-APA. Este producto Hl-PCR el cual no contenía el codón de detención, se clono unidireccionalmente en el vector pEGFP en PstI y Apal y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP . Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN que codifica el Hl-NLS-GFP Hl-NLSR: 5' GGGCCCCGGAGCGAATATGCAGAATTCTCTTGAATGTCCTCTTGAAIII 111ATTGCACAAGG 3' La secuencia de NLS : K SKR se insertó en el ADN que codifica el segmento TM7 del receptor Hl mediante el método PCR, usando la plantilla Hl-GFP, reemplazando la secuencia ENFKK. La PCR con los cebadores Hl-PST y Hl-NLSR dio un producto de 1500 bp. El fragmento resultante que codifica Hl- NLS se subclonó en el vector pEGFP en los sitios de restricción PstI y Apal. 5. Construcción del receptor 1 de cisteinil leucotrieno y CysLTl- LS fusionados a GFP (CysLTl-GFP y CysLTl- LS-GFP) . Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN que codifica al receptor CysLTl . LTl-EcorI: 5' AAGAATTCGCCACCATGGATGAAACAGGAAATCTG 3' LTl-Kpnl: 5' GGGTACCGCTACTTTACATATTTCTTCTCC 3' El sitio de restricción EcoRl se incorporó en el cebador LTl-EcoRI y el sitio de restricción Kpnl se incorporó en el cebador LTl-Kpni. El producto cysLTl-PCR ADN, el cual no contenia el codón de detención, se subclonó unidireccionalmente en el vector PGFP en EcoRl y Kpnl y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP. Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN que codifica la CysLTl-NLS-GFP LT1-NLSF: 5' TTCTTTTCTGGGAAAAAATTTAAGAGAAGGCTGTCTAC 3' LT1-NLSR: 5' TGTAGACAGCCTTCTCTTAAATTTTTTCCCAGAAAAG 3' La secuencia de NLS, KKFKR se insertó en el ADN que codifica el segmento T 7 de la CysLTl mediante PCR, usando el ADN que codifica al CysLTl-GFP como plantilla, remplazando la secuencia GNFKR. Usando el ADN que codifica a CysLTl-GFP como plantilla, la PCR con los siguientes cebadores LTl-EcoRI y CysLt1-NLSR resultó en un fragmento de 900bp (PCR#1) . Usando el ADN que codifica a CysLTl-GFP PCR con los cebadores LT1-Kpnl y LT1-NLSF resultó en un fragmento de lOObp (PCR#2) . Una PCR llevada a cabo subsecuentemente con los cebadores LT1-EcoRI y LTl-Kpni resultó en un producto de lOObp usando el producto de PCR#1 y el producto de PCR#2 como plantillas. El ADN resultante que codifica a CysLTl-NLS se subclonó en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoRl y Kpnl. 6. Construcción del receptor de cisteinil leucotrieno CysLT2 y CysLT2-NLS fusionados a GFP (CysLT2-GFP y CysLT2 -NLS-GFP) Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN en pcDNA3 que codifica al recetor CysLT2. LT2-EcoRI : 5' CTTTTTGTGTCTGTTTCTGAATTCGCCACCATGGAGAGAAAATTTATG 3' LT2-KpnI: 5' GAACAGGTCTCATCTAAGAGGTACCGCTACTCTTGTTTCCTTTCTC 3' El sitio de restricción EcoRl se incorporó en el cebador LT2-EcoRI, y el sitio de restricción Kpnl se incorporó en el cebador LT2-KpnI. El producto CysLT2 , el cual no contenía el codón de detención, se subclonó unidireccionalmente en el vector pEGFP en EcoRl y Kpnl y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP . Conjunto de cebadores para la amplificación del CysLT2- NLS-GFP LT2-NLSF: 5' GCTGGGAAAAAATTTAAAAGAAGACTAAAGTCTGCAC 3' LT2-NLSR: 5' GTCTTCTTTTAAATTTTTTCCCAGCAAAGTAATAGAGC 3' La secuencia de NLS KKFKR se insertó en el segmento TM7 del CysTL2 mediante el método PCR reemplazando la secuencia EMFKD . Usando el ADN que codifica a CysLT2-EGFP como plantilla, una PCR con los siguientes cebadores LT2-EcoRl y LT2-NLSR resultó en un fragmento de 900bp (PCR#1) . Usando el ADN que codifica a LT2-KpnI y LT2-NLSF una PCR resultó en un fragmento de 200bp (PCR#2) . Una PCR subsecuente llevada a cabo con los cebadores LT2-EcoRl y LT2-KpnI usando el producto de PCR#1 y el producto de PCR#2 como plantillas resultó en un producto de llOObp. El ADN resultante que codifica a CysLT2-NLS se subclonó en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoRl y Kpnl . 7. Construcción del receptor muscarxnico MI y el receptor NLS muscarínico fusionados a GFP (Ml-NLS-GFP) Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN que codifica al receptor muscarínico (MI) a partir de ADN genómico humano . Ml-MET: 5' CCCCACCTAGCCACCATGAACACTTC 3' Mi -STOP: 5' GGGGACTATCAGCATTGGCGGGAGG 3' Conjunto de cebadores para MR1-EGFP Ml-PST: 5' CCCCACCTGCAGCCACCATGAACACTTCAGCC 3' Ml-BAMH: 5' GGGGAGGATCCGCGCATTGGCGGGAGGGAGTGC 3' El sitio de restricción PstI se incorporó en el cebador Ml-PST, y el sitio de restricción BamHI se incorporó en el cebador Ml-BAMH. El producto PCR de MI, el cual no contenía el codón de detención, se subclonó unidireccionalmente en el vector pEGFP en PstI y BamHI y en marco con el codón de inicio del la proteína EGFP. Conjunto de cebadores para MI-NLS EGFP. Ml-NLSF: 5' CGCACTCTGCAACAAAAAATTCAAACGCACCTTTCGCC 3' Ml-NLSR: 5' GGCGAAAGGTGCGTTTGAATTTTTTGTTGCAGAGTGCG 3' La secuencia de NLS, KKFKR se insertó en el segmento TM7 de MI mediante PCR, usando la plantilla de MR1, reemplazando la secuencia KAFRD. Usando el ADN que codifica a MR1 como plantilla, la PCR con los siguientes cebadores usando Ml-PST y Ml-NLSR resultó en un producto de 1200bp (PCR#1) . Usando el ADN que codifica a MR1 una PCR con reacción de cebadores usando los cebadores Ml-BAMH y Ml-NLSF resultó en un producto de 100 bp (PCR#2) . Una PCR subsecuente llevada a cabo con los cebadores Ml-PST y Ml-BAMH resultó en un producto de 1300bp, usando el producto de PCR#1 y el producto de PCR#2 como plantillas. Este fragmento que codifica a MR1-NLS se subclonó en el vector pEGFP en los sitios de restricción PstI y BamHI . 8. Construcción de los receptores de serotonina (5HT1B) y serotonina NLS fusionados a GFP (5HT1B-GFP y 5HT1B-NLS-GFP) Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN que codifica al receptor 5HT1B a partir del pl smido pcDNA3 que codifica al receptor 5HT1B. 5HT1 B-El: 5' GGGGCGAATTCGCCGCCATGGAGGAACCGGGTGC 3' 5HT1B-KPN: 5' GCAAACGGTACCGCACTTGTGCACTTAAAACGTA 3' El sitio de restricción EcoRl se incorporó en el cebador 5HT1B-E1 y el sitio de restricción Kpnl se incorporó en el cebador 5HT1B-KPN. El producto 5HTB1-PCR, el cual no contenía el codón de detención, se subclonó unidireccionalmente en el vector pEGFP en EcoRl y Kpnl y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP. Conjunto de cebadores para 5HT1B-NLS EGFP 5HT1B-NLSF : 5 'ATGTCCAATAAAAAATTTAAAAGAGCATTCCATAAACTG 3 ' 5HT1B-NLSR: 5 ' GGAATGGTCTTTTAAATTTTTTATTGGACATGGTATAG 3' La secuencia de NLS : KKFKR se insertó en el segmento TM7 de 5HT1B mediante PCR usando la plantilla de 5HT1B-EGFP , reemplazando la secuencia EDFKQ. Usando el ADN que codifica a 5HT1B-EGFP como plantilla, una PCR con los siguientes cebadores con los cebadores 5HT1B-E1 y HD1-NLSF dio un producto de llOObp (PCR#1) . Usando el ADN que codifica a 5HT1B-EGFP con los cebadores 5HT1B-KPN y HD1-NLSR resultó en un producto de lOObp (PCR#2) . Una PCR subsecuente llevada a cabo con los cebadores 5HT1B-E1 y 5HT1B-KPN resultó en un producto de 1200bp usando el producto de PCR#1 y el producto de PCR#2 como plantillas. El ADN resultante que codifica a 5HT1B-NLS se subclonó en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoRl y Kpnl . 9. Construcción de los receptores beta2-adrenérgico (beta2-AR) y beta2-AR-NLSl fusionados a GFP (beta2 -AR-GFP y beta2AR-NLSl-GFP) Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN que codifica al receptor de beta2-AR a partir de pcDNA3. T7: 5' AATACGACTCACTATAG 3' Beta2- pn: 5' GCCGCCAGTGTGATGGATACTGGTACCGCTAGCAGTGAGTCATTTGTA G 3' El sitio de restricción Kpnl se incorporo en el cebador beta2-Kpn. El producto beta 2-AR, el cual no contenía el codon de detención, se subclonó unidireccionalmente en el vector pEGFP en EcoRl y Kpnl y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP . La secuencia de NLS KKFKR se insertó en el segmento TM7 del beta2-AR mediante PCR usando la plantilla de beta2-AREGFP, reemplazando la secuencia PDFRI . Usando el ADN que codifica a beta2-AR-EGFP como plantilla, una PCR con los siguientes cebadores con los cebadores T7 y B2-NLSR resultó en un producto de 1100 bp (PCR#1) . Usando el ADN que codifica a beta2-AR-EGP con los cebadores beta2-Kpn y B2-NLSF resultó en un producto de 300bp (PCR#2) . Una PCR subsecuente llevada a cabo con los cebadores T7 y beta2-kpn resultó en un producto de 1300bp usando el producto de PCR#1 y el producto de PCR#2 como plantillas. El ADN resultante que codifica a beta2-NLS se subclonó en el vector EGFP en los sitios de restricción EcoRl y Kpnl. 10. Construcción del receptor beta2-adrenérgico con una NLS alternativa y fusionado a GFP (beta2-NLS2 -GFP) Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN que codifica al receptor de beta2-NLS2 a partir de pcDNA3.
B2D1NLSF : 5 ' CCCCTTATCTACGCCTTTAGCGCAAAGAAGTTCAAGCGC 3 ' B2D1NLSR: 5 ' GCGCTTGAACTTCTTTGCGCTAAAGGCGTAGATAAGGGG 3 ' Usando el ADN que codifica a beta2-AR-GFP como plantilla, una PCR con los siguientes cebadores, con los cebadores T7 y B2D1NLSR resultó en un producto de lOOObp (PCR#1) . Usando el ADN que codifica a beta2~AR-GFP con beta2-Kpn y B2D1NLSF resultó en un producto de 300bp (PCR32) . Una PCR subsecuente llevada a cabo con los cebadores T7 y beta2-Kpn usando PCR#1 y PCR#2 como plantillas resultó en un producto de 1300bp. El ADN resultante que codifica a beta2-NLS2 se subclonó en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoRl y Kpnl. La secuencia de NLS AFSAKKFKR se insertó en el segmento TM/ de beta2-AR mediante PCR usando la plantilla de beta2-GFP, reemplazando la secuencia CRSPDFRIA. El ADN resultante que codifica a beta2-NLS2 se subclonó en el vector pEGFP en los sitios de restricción EcoRl y Kpnl. 11. Construcción del receptor beta2-adrenérgico con una NLS alternativa y fusionado a GFP (beta2-NLS3-GFP) La secuencia de NLS K K F K R se insertó en otra posición del segmento cercano de la cola de carboxilo del beta2-AR. Usando el ADN que codifica al beta2AR en el vector pcDNA3 como plantilla, se llevó a cabo la PCR con los cebadores T7 y RB2-NLS3R resultando en un producto de lOOObp. La PCR usando los cebadores Beta2-Kpn y 2-NLS3F resultó en un producto de 300bp.
Usando los productos de PCR#1 y PCR#2 como plantillas la PCR con los cebadores T7 y Beta2-Kpn generó un producto de 1300bp (beta2AR-NLS3 ) la cual se subclonó en el vector pEGFP en EcoRl y Kpnl . Conjunto de cebadores para Beta2-NLS3-GFP B2-NLS3F: 5' CTGCCGGAGCAAAAAATTCAAAAGAGCCTTCCAGGAGC 3' B2-NLS3R: 5' CCTGGAAGGCTCTTTTGAATTTTTTGCTCCGGCAGTAG 3' Beta2 de tipo Silvestre: N P L I Y C R S P D F I R A F Q E L L Beta2AR-NLS3 : N P L I Y C R S K K F K RA F Q E L L 12. Construcción del transportador de dopamina fusionado a GFP (DAT-GFP) El ADN de longitud completa que codifica el transportado de dopamina humano (hDAT) se amplificó usando el DAT en pcDNA3 como plantilla mediante PCR con el cebador T7 y el cebador DT-1 (5' CGTCTCTGCTCCCTGGTACCGCCACCTTGAGCCAGTGG 3'). Este producto de PCR no contenia el codón de detención y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (de Clontech) en los sitios de restricción EcoRl y Kpnl y en marco con el codón de detención de la proteína GFP. 13a. Construcción del transportador de dopamina humano que contiene una NLS fusionada a RFP (DAT-NLS-RFP) El ADNc que codifica el transportador de dopamina humano (hDAT) se amplificó mediante PCR con los cebadores 1718 y HDAT-NLSF produciendo un fragmento de 100 bp. El ADNc que codifica el transportador de dopamina humano (hDAT) se amplificó también mediante PCR con los cebadores T7 y hDAT-NLSR, produciendo un fragmento de 1.7 kB. Estos dos fragmentos de PCR se usaron como plantillas con los cebadores T7 y 1718, resultando en un fragmento de 1.8 kB. Cebador T7 : 5' TAATACGACTCACTATAGGG 3' Cebador 1718: 5' CGTCTCTGCTCCCTGGTACCGCCACCTTGAGCCAGTGG 3' hDAT-NLSF: 5' CTATGCGGCCAAAAAGTTCAAAAGACTGCCTGGGTCC 3' hDAT-NLSR: 5' CAGGCAGTCTTTTGAACTTTTTGGCCGCATAGATGGGC 3' Este producto de PCR se subclonó unidireccionalmente en el vector pRFP en EcoRl y Kpnl y en marco con el codón de inicio de la proteína RFP . El fragmento de PCR resultante codificó la secuencia de NLS K K F K R después de TM12 como sigue: DAT de tipo silvestre: S S MA M V P I Y AA Y K F C S L P G S F R E K DA T-NLS: S S MA M V P I Y A ?? K F K R L P G S F R E K 13b. Construcción del transportador de dopamina humano con una NLS y fusionado a GFP (DAT-NLS-GFP) La secuencia de NLS, K F K R se insertó en la cola de carboxilo cercana enseguida del segmento de transmembrana 12 del DAT humano. Usando el ADN que codifica al DAT-ADNc en pcDNA3, como plantilla, se llevó a cabo la PCR con los cebadores T7 y hDAT-NLSR resultando en un producto de 1.7kb.
Una segunda PCR se hizo usando los cebadores 1718 y hDAT-NLSF resultando en un producto de lOObp, después usando los productos de PCR#1 y PCR#2 como plantillas se hizo la PCR final con los cebadores T7 y 1718 la cual generó un producto de 1.8kp (DAT-NLS) el cual se subclonó en el vector pEGFP (Clontech) en EcoRl y Kpnl y se fusionó con GFP. Secuencias de los cebadores : hDAT-NLSF: 5' CTATGCGGCCAAAAAGTTCAAAAGACTGCCTGGGTCC 3' hDAT-NLSR: 5' CAGGCAGTCTTTTGAACTTTTTGGCCGCATAGATGGGC 3' DAT humano de tipo silvestre: S S M A M V P I Y AA Y K F C S L P G S F R E K DAT humano-NLS: S S M A M V P I Y AA K K F K R L P G S F R E K 14. Construcción del transportador de serotonina humano fusionado a GFP (SERT-GFP) El ADNc de SERT humano de longitud completa se aisló mediante PCR a partir de pcDNA3 que contenía el ADNc de SERT, usando los dos siguientes cebadores : SERT-HIND: 5' GTCATTTACTAAGCTTGCCACCATGGAGACGACGCCCTTG 3' SERT-KPN: 5' CCTCTCGGTGAGTGGTACCGCCACAGCATTCAAGCGG 3' Este producto de PCR no contenía el codón de detención y se subclonó unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y Kpnl y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP .
. Construcción del receptor de Lipoproteína de Baja Densidad fusionado a GFP (LDL-R-GFP) El ADNc de longitud completa que codifica la LDL se sometió a PCR con los cebadores LDLR-HIND y LDLR-KPN: LDLR-HIND: 5' GGACACTGCCTGGCAAAGCTTGCGAGCATGGGGCCCTGG 3' LDLR-KP : 5 ' GGCGGGACTCCAGGCAGGTACCGCCGCCACGTCATCCTCC 3 ' Este producto de PCR (2600bp) no contenía el codón de detención y se subclonó unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y Kpnl y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP . 16. Construcción del receptor de la Lipoproteína de Baja Densidad con una NLS fusionada a GFP (LDLR-NLS-GFP) La secuencia de NLS KKFKR se insertó en el ADN que codifica el receptor de LDL mediante PCR, reemplazando la secuencia natural codificante para RLKNI . El conjunto de cebadores para la construcción de ADN que codifica a LDL-NLS : LDL-NLSF : 5' CTATGGAAGAACTGGAAAAAATTTAAAAGAAACAGCATCAAC 3' LDL-NLSR: 5 ' CAAAGTTGATGCTGTTTCTTTTAAATTTTTTCCAGTTCTTCC 3 ' Usando el ADN humano que codifica el ADNc de LDL en pcDVl como plantilla, la PCR con los cebadores LDLR-HIND y LDL-NLSR resultó en un producto de 2450 bp (PCR#1) . Usando el ADN que codifica la LDL como una plantilla, con los cebadores LDLR-KPN y LDL-NLSF resultó en un producto de 150bp (PCR#2) . Una PCR subsecuente llevada a cabo con los cebadores LDLR-HIND y LDL-KPN usando el producto de PCR#1 y PCR#2 como plantilla resultó en un producto de 260Obp. El PCR resultante contenía la secuencia de mutación de la secuencia de NLS, K K F K R, como sigue: LDL humana-R tipo silvestre: F L L W KN W R L KN I N S I N F D N P LDL humana-R: F L L KN K K F K R N S I N F D N P Este producto de PCR no contenía el codón de detención y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y Kpnl y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP . 17. Construcción del Receptor del Factor de Crecimiento Epidérmico fusionado a GFP (EGFR-GFP) El ADNc de EGFR de longitud completa en el vector Prkf se aisló mediante PCR con los dos siguientes cebadores: HE-XHO: 5' GCTCTTCGGGCTCGAGCAGCGATGCGACCCTCCGGGACGG 3' 5HER-KPN: 5' CTATCCTCCGTGGTACCGCTGCTCCAATAAATTCACTGC 3' Este producto de PCR (3600 bp) no contenía el codón de detención y fue clonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en Xhol y Kpnl y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP . 18. Construcción del transportador de serotonina humano con NLS y fusionada a GFP (SERT-NLS-GFP) La secuencia de NLS, K FKR se insertó en el ADN que codifica el SERT mediante PCR, reemplazando la secuencia natural codificante para GTFKE. Conjunto de cebadores para la amplificación del ADN que codifica a SER -NLS . SERT-NLSF: 5' GATCATCACTCCAAAGAAATTTAAAAGACGTATTATT 3' SERT-NLSR: 5' TAATACGTCTTTTAAATTTCTTTGGAGTGATGATCAACCG 3' Usando el ADNc de SERT en PcDNA3 como plantilla, la PCR con los cebadores SERT-HIND y SERT-NLSR resultó en un producto de 1800 bp (PCR#1) . Usando el ADN que codifica a SERT como una plantilla con los cebadores SERT-KPN y SERT-NLSF resultó en un producto de 100 bp (PCR#2) . Una PCR subsecuente llevada a cabo con los cebadores SERT-HIND y SERT-KPN usando los productos de PCR#1 y PCR#2 como plantilla resultó en un producto de 1900 bp. El producto de PCR resultante codificó la mutación de la secuencia de NLS, KKFKR después de TM12 de SERT como sigue: SERT Humana tipo silvestre: R L I I T P G T F K E R I I K S I T SERT Humana: R L I I T P K K F K R R I I K S I T Este producto de PCR no contenía el codón de detención y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HINDIII y Kpnl y en marco con el codón de detención de la proteina GFP. 19. Construcción del receptor de glutamato 4 metabotropico fusionado a GFP, con un sin NLS (mGluR4-GFP y mGluR4-NLS-GFP) El ADN que codifica a mGluR4 se aisló de un ADNc de rata usando el conjunto de cebadores GLUR4-HI D: 5' GGGTCTCTAAGCTTGCCGCCATGTCCGGGAAGGG 3' GLUR4-EC0 I: 5' CCGCGGCCCGGAATTCGGATGGCATGGTTGGTG 3' Un sitio de restricción HindIII se incorporó en el cebador GLUR4-HIND, y un sitio de restricción EcoRI se incorporó en el cebador GLUR4-ECORI . El producto de mGluR4-PCR, el no contenía el codón de detención, se subclonó unidireccionalmente en el vector EGPP (Clontech) en HindIII y EcoRI y en macro con el codón de inicio de la proteína GFP. La NLS KKFKR se introdujo en el ADN que codifica la mGluR4 reemplazando a la secuencia natural RKRS . Conjunto de cebadores para a la amplificación de ADN para introducir le NLS en el mGluR4-EGFP de rata GLUR-NLSF : 5 ' CGTGCCCAAGAAATTCAAGCGCCTCAAAGCCGTGGTC 3 ' GLUR4-NLSR: 5' CGGCTTTGAGGCGCTTGAATTTCTTGGGCACGTTCTGC 3' Usando el ADN de rata que codifica a GluR4 como plantilla, la PCR con los cebadores GLUR4-HIND y GLUR4-NLSR resultó en un producto de 2600 bp. (PCR$1) . Usando el ADN que codifica a GluR4 con los cebadores GLUR -ECORI y GLUR4-NLSF resultó en un producto de 160 bp (PCR#2) . Una PCR llevada a cabo usando el producto de PCR#1 y PCR#2 como plantilla, con los cebadores GLUR4-HIMD y GLUR4-ECORI , resultó en un producto de 2760 bp. El PCR resultante contenía la mutación de la secuencia de NLS, KKFKR, como sigue: mGluR4 de rata del Tipo Silvestre: F H P E Q N V P K R K R S L KAVV T AA T mGluR4 de rata: F H P E Q N V P K K F K R L KAV V T AA T Este producto de PCR se subclonó unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y EcoRI y en marco con el codón de inicio de la proteína GFP . 20. Construcción del Receptor de Insulina Humano fusionado a GFP (IR-GFP) El ADMc de IR de longitud completa en el plásmido pRK5 se aisló con los dos cebadores de PCR: HIR-HI D: 5' GGAGACCCCAAGCTTCCGCAGCCATGGGCACCGGGGGCC 3' HIR-APA: 5' CCCCGCCACGGGCCCCGGAAGGATTGGACCGAGGCAAGG 3' El producto de PCR (4.2kb) no contenía el codón de detención y fue clonado unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en HindIII y Apal y fusionado a la proteína GFP. 21. Construcción del Receptor de Insulina Humano con una NLS y fusionado a GFP (IR-NLS-GFP) La secuencia de NLS, KKFKR se introdujo en el receptor de insulina humano para reemplazar la secuencia LYASS.
Usando el ADNc del receptor de insulina humano en el vector pRK5 como plantilla, el primera PCR#1 con los cebadores HIR-HIND y HIR-NLSR generó un producto de 2.9 kb, la segunda PCR#2 con los cebadores HIR-APA y HIR-NLSF generó un producto de 1.3 kb, y después usando los productos de PCR#1 y PCR#2 como plantillas, la tercera PCR#3 produjo un fragmento con los cebadores HIR-HIND y HIR-APA (4.2 kb) . Este no contenía el codón de detención y fue subclonado unidireccionalmente en el vector pEGFP en HindIII y Apal y después fusionado a la proteína GFP . Cebadores para HIR-NLS : HIR-NLSF: 5' CCGCTGGGACCGAAAAAATTTAAGAGAAACCCTGAGTATCTC 3' HIR-NLSR: 5' GATACTCAGGGTTTCTCTTAAATTTTTTCGGTCCCAGCGGCCC 3' 22. Construcción del receptor de Eritopoyetina humano fusionado a GFP (EPO-GFP) Usando el método PCR y el ADNc en el vector pc3.1 que codifica el receptor de Eritopoyetina humano (EPO) como plantilla, el ADNc de longitud completa se aisló con los siguientes cebadores : T7: 5' TAATACGACTCACTATAGGG 3' EPO-KPN: 5 ' GACTGCAGCCTGGTGGTACCGCAGAGCAAGCCACATAGCTGGGG 3 ' Este producto de PCR (1.6 kb) no contenía el codón de detención y se subclono unidireccionalmente en el vector pEGFP en HindIII y Kpnl y fusionado a la proteína GFP. 23. Construcción del receptor de eritopoyetina humano con una NLS y fusionado a GFP (EPO-NLS-GFP) . La secuencia de NLS, KKF R se insertó en el ADN que codifica el receptor de EPO mediante PC , reemplazando su secuencia natural RRALK. Usando el ADNc de APO humano en pc3.1 como plantilla, la primera PCR#1 con los cebadores T7 y EPO-NLSR generó un producto de 900bp, la segunda PCR #2 con los cebadores EPO-KPN y EPO-MLSF generó un producto de 700bp, y después usando los productos de PCR#1 y PGR#2 como plantillas, la tercera PCR#2 con los cebadores T7 y EPO-KPN y produjo un fragmento de 1.6 kb. Este producto de PCR (1.6 kb) no contenía el codón de detención y se subclonó unidireccionalmente en el vector pEGFP en HindIII y Kpnl y después se fusionó a la proteína GFP. Secuencias de los cebadores : T7: 5' TAATACGACTCACTATAGGG 3' EPO-KPN: 5' GACTGCAGCCTGGTGGTACCGCAGAGCAAGCCACATAGCTGGGG 3' EPO-NLSF: 5' GCTGCTCTCCCACAAAAAGTTTAAGCGGCAGAAGATCTGG 3' EPO-NLSR: 5' CCAGATCTTCTGCCGCTTAAACTTTTTGTGGGAGAGCAGC 3' EPO Humano tipo silvestre: T V L A L L S H R R A L K O K I W P G I P EPO Humano NLS: T V L A L L S H K K F K R O K I W P G I P 24. Construcción del receptor del f ctor de crecimiento epidérmico humano fusionado a GFP (EGFR-GFP) Usando el ADNc del receptor del factor de crecimiento epidérmico en el vector Prk5 como plantilla, se aisló el ADNc de longitud completa mediante PCR con los dos cebadores : HER-XHO (5' GCTCTTCGGGCTCGAGCAGCGATGCGACCCTCCGGGACG G 3') y HER-KPN (5' CTATCCTCCGTGGTACCGCTGCTCCAATAAATTCACTGC 3 ' ) Este producto de PCR (3.6 kb) no contenia el codón de detención y se subclonó unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en Xhol y Kpnl y se fusionó a la proteína GFP. 25. Construcción del receptor del factor de crecimiento epidérmico humano con una NLS y fusionado a GFP (EGFR-NLS-GFP) La secuencia de NLS, KFKR se insertó en la secuencia del receptor del factor de crecimiento epidémico humano mediante PCR, como sigue. Usando el ADNc de EGFR humano en le vector Prk5 como plantilla, la primera PCR se llevó a cabo con los cebadores HER-XHO y EGF-NLSR resultando en un producto de 12.1kb. Se hizo una segunda PCR usando los cebadores HER-KPN y EGF-NLSF resultando en un producto de 1.5kb, y después usando los productos de PCR#1 y PCR#2 como plantillas, se hizo la PCR final con los cebadores HR-XHO y HER-KPN, lo cual generó un producto de 3. Skb (EGFR-NLS) el cual se subclonó en el vector pEGFP (Clontech) en Xhol y Kpnl y se fusionó a GFP. Secuencias de los cebadores: EGF-NLSF: 5' CACATCGTTCGGAAGAAGTTTAAGCGGAGGCTGCTGC 3' EGF-NLSR: 5' CCTGCAGCAGCCTCCGCTTAAACTTCTTCCGAACGATGTG 3' EGFR Humano tipo silvestre: R R R H I V R K R T L R R L L Q E R E EGFR humano-NLS: R R R H I V R K K F K R R L L Q E R E 26. Construcción del receptor de dopamina DI que contiene 2 NLSs y fusionado a RFP (Dl-NLS (Hélice 8 y C-cola) -RFP) Una segunda secuencia de NLS, K K K R K se insertó en el segmento de la cola de carboxilo del DI-NLS-Hélice 8 humano mediante el método PCR como sigue. Usando el ADN que codifica el DI-NLS-Hélice 8 humano en el vector pDsRed como una plantilla, la primera PCR se llevó a cabo con los cebadores HD1-P1 y HD1-NLSCR resultando en un producto de 1.2kb, y se hizo una segunda PCR usando los cebadores HD1-P2 y HD1-NLSCF resultando en un producto de lOObp. Después usando los productos de PCR#1 y PCR#2 como plantillas, se hizo la PCR final con los cebadores HD1-P1 y HD1-P2 lo cual generó un producto de 1.3kp (Dl-NLS-Hélice 8 y C-cola) el cual se subclonó en el vector pDsRed en EcoRI y Kpnl y se fusionó con la proteína DsRed. Secuencias de los cebadores HD1-P1: 5' GAGGACTCTGAACACCGAATTCGCCGCCATGGACGGGACTGGGCTGGTG 3' HD1-P2: 5' GTGTGGCAGGATTCATCTGGGTACCGCGGTTGGGTGCTGACCGTT 3 ' HD1-NLSCF: 5' CCTCTGAGGACCTGAAAAAGAAGAGAAAGGCTGGCATCGCC 3' HD1-NLSCR: 5' GGCGATGCCAGCCTTTCTCTTCTTTTTTCAGGTCCTCAGAGG 3' DI tipo silvestre: N P I I Y A F NA D F R KA F S T L L S S E D L K K E E AA G I A Dl-NLS (Hélice 8 y C-cola) : P I I Y A F NA K K F K R F S T L L S S E D L K K R KA G I A 27. Construcción del receptor de opioides Mu fusionado a GFP (Mu-GFP) Usando el ADN que codifica el receptor de opioides Mu en el vector pcDNA3 como plantilla, se llevó a cabo la PCR con los siguientes dos cebadores-RATMU1: 5 ' CCTAGTCCGCAGCAGGCCGAATTCGCCACCATGGACAGCAGCACC 3' RATMU-2 : 5 ' GATGGTGTGAGACCGGTACCGCGGGCAATGGAGCAGTTTCTGCC 3 ' El sitio de restricción EcoRI se incorporó en el cebador RATMU-1. El sitio de restricción Kpnl se incorporó en el cebador RATMU-2. El producto de PCR (1.2 kb) el cual no contenía el codón de detención se subclonó entonces unidireccionalmente en el vector pEGFP (Clontech) en EcoRI y Kpnl y después se fusionó a GFP. 28. Construcción del receptor de opioides Mu que contiene una LS y fusionado a GFP (Mu-NLS-GFP) La secuencia de NLS K K F K R se insertó en el segmento de la cola de carboxilo cercana (hélice 8) del receptor de opioides Mu mediante PCR, como sigue. Usando el ADN que codifica la Mu de rata en pcDNA3 como plantilla, se llevó a cabo la primera PCR con los cebadores RATMU1 y Mu-NLSR resultando en un producto de lOOObp, otra segunda PCR se hizo usando los cebadores RATMU-2 y MU-NLSF resultando en un producto de 200bp. Usando los productos de PCR#1 y PCR#2 como plantillas, se hizo la PCR final con los cebadores RATMU1 y RATMU2 generando un producto de 1200bp (Mu-NLS) el cual se subclonó en el vector pEGFP en EcoRl y Kpnl y se fusionó con GFP. Secuencias de los cebadores : RATMU-1: 5' CCTAGTCCGCAGCAGGCCGAATTCGCCACCATGGACAGCAGCACC 3' RATMU-2: 5 ' GGATGGTGTGAGACCGGTACCGCGGGCAATGGAGCAGTTTCTGCC 3 MU-NLSF: 5' GCCTTCCTGGATAAAAAATTCAAGCGATGC 3' MU-NLSR: 5' GCATCGCTTGAATTTTTTATCCAGGAAGGCG 3' Cultivo y transfección de células Células ríñones de mono COS y células de ríñones embrionarios humanos (American Type Culture Collection, Manassa, VA) se mantuvieron como cultivos monocapa a 37°C y 5% de CO2 en medio esencial mínimo suplementado con 10% de suero de bovino fetal y antibióticos. Para la recolección de las membranas celulares, placas de 100 mm de células se transíectaron transitoriamente a 70-80% de confluencia usando el reactivo de lipofectamina (Life Technologies, Rockvile, MD) . Para estudios de microscopía confocal, placas de 60 mm se células se transfectaron transitoriamente a 10-20% de confluencia usando reactivo de lipofectamina. Seis horas después de la transfeccion, la solución se removió y se agregó medio fresco y otra vez se reemplazó con medio fresco 24 horas después de la transfeccion. El medio de transfeccion se preparó mezclando 120 microlitros de medio sin antibióticos y/o suero de bovino fetal (FBS) y 15 microlitros de lipofectamina en un tubo de 14 mL. 2 microgramos del constructo de ADN que codifica la proteína de fusión deseada y 120 microlitros de medio se mezclaron y se agregaron al tubo de 14 mL, el cual se mezcló suavemente y se incubó a la temperatura ambiente por 25 minutos . 4 mL adicionales de medio se agregaron y se mezclaron. Si están siendo transfectadas múltiples proteínas de transmembrana, los ADNcs se mezclan y se transfretan juntos. El medio de crecimiento se removió de una placa de células y se reemplazo con la mezcla de transfeccion del tubo de 14 mL. Las células se incubaron con la mezcla de transfeccion por 5-6 horas, después de lo cual se removió la mezcla y se reemplazó con medio de cultivo regular que contenía FBS y antibióticos. Las células se incubaron con un cambio de medio de cultivo regular en el segundo día. Tratamiento con los Compuestos de Prueba Protocolo para determinar el retardo de la translocación fuera de la superficie celular Se prepararon los compuestos de prueba en una solución base de una concentración 1 milimolar y se diluyeron en medio de cultivo para lograr una concentración final que varió entre 10 nanomolar y 10 micromolar cuando se agregó a las placas celulares . El medio que contenia el compuesto fresco se agregó a las células a las 6 horas, 22 horas, 30 horas, y 42 horas después de la transfección. Protocolo para determinar la promoción de la translocación fuera de la superficie celular Los compuestos de prueba se prepararon en una solución base de 1 milimolar y se diluyeron en medio de cultivo a 37°C para lograr una concentración final de 10 micromolar cuando se agregaron a las células . Los cultivos celulares se examinaron mediante microscopía para enfocar una sola célula y detectar la presencia de expresión superficial de la proteína etiquetada detectable. El medio de cultivo se reemplazó con el medio que contenía el compuesto y las células se examinaron por microscopía en tiempo real a los 5, 10, 15, 20, 30, y 35 mins, después de la adición del compuesto, por los cambios en la distribución de la porción detectable. Microscopía Las células se visualizaron usando el microscopio de láser confocal LSM510 de Zeiss, la GFP se visualizó enseguida de la excitación con el láser de argón a una longitud de onda de excitación de 488nm y la DsRed se visualizó enseguida de la excitación con el láser de helio neón a una longitud de onda de 543 nra para la excitación. Las imágenes confocales se capturaron en un disco y se evaluaron. En cada experimento, se contabilizaron múltiples campos de células (n=6-8 con 30-90 células cada uno) y se evaluaron en cuanto a la localización de la señal sobre la superficie celular, en el citoplasma y en el núcleo. Fluorocitometria Una placa de 96 pozos se revistió con poli-L-omitina (1/10 en PBS) y se incubó por una hora. 50,000 células se agregaron a cada pozo y se transfectaron con el ADNc que codifica el receptor etiquetado, usando Lipofectamina (Invitrogen E.U.A) . El medio (MEM) se cambió cada 12 horas y contenía el fármaco de prueba en concentraciones variables o vehículo. 48 horas después, las células se lavaron y se fijaron con paraformaldehído al 4% y se incubaron por 30 min en hielo . Las células se incubaron entonces con el anticuerpo primario dirigido contra el epitope y después con el anticuerpo secundario conjugado a FITC (isotiocianato de fluoresceína) y se mantuvieron protegidas de la luz . El anticuerpo en exceso se lavo y la señal se detectó leyendo la placa en un Cytofluor 4000 (PerSpective Biosystems, E.U.A.) . El FITC se activó usando luz a 488 nm para la excitación y la lectura de señales en su longitud de onda de emisión de 530 nm. Enlace del Radioligando Las células se transfectaron con el ADM que codifica a Dl-NLS y se trataron con concentraciones variables del fármaco antagonista o se dejaron sin tratamiento. Después de 48 horas, las células se lavaron, se recolectaron, se lasaron y se homogeneizaron mediante un politron. La fracción de las membranas se recolectó mediante centrifugación y después se revistieron sobre solución de sucrosa a 35% y se sometieron a centrifugación a 30,000 rpm a 4 grados C por 90 min para recolectar la fracción pesada de las membranas. El sobrenadante se sometió otra vez a centrifugación a 35,000 rpm a 4 grados C por 60 min para recolectar la fracción ligera de las membranas. Las membranas se sometieron al análisis de enlace del radioligando usando [3H] -SCH23390 con (+) utaclamol 10 micromolar usado para definir el enlace específico. La incubación fue a temperatura ambiente por 2 horas, seguido por filtración rápida y cuantificación mediante conteo por centelleo. Aislamiento de los Núcleos de los Cultivos Celulares Las células se lavaron con PBS 3 veces, usando 10 mi y se raparon suavemente fuera de los platos de cultivo. Las células se conjuntan y se centrifugan a 500g por 5 min, a 4 grados C. las células convertidas en pelotilla se resuspendieron en amortiguador de lisis (Tris HC1 10 mM, pH 7.4, NaCl 10 mM, MgCl2 3 mM) y cóctel inhibidor (leupeptina al 0.5%, tripsina de soya al 1%, benzamidina al 1%) a una densidad de 50 millones de células por mi. Se homogenizaron con un mortero B con Teflón de vidrio estéril (separación hermética 20-50 mm; Bélico Glass) usando 100 golpes arriba y abajo. Se centrifugaron a 4 grados C por 700 g por 10 min, después centrifugación secuencialmente del sobrenadante a 10,000 g, por 15 min a 4 C (para remover las mitocondrias) y 120,000 g por 60 min, 4 grados C (para remover la membrana plasmática) . La pelotilla nuclear se resuspendió en amortiguador de lisis (con inhibidores) y 0.1% de NP-40, se mantuvo en hielo 5 min y después se sometió a centrifugación a 700 g por 10 min a 4 grados C. Se desecha el sobrenadante y se repite el proceso de lavado 3 x con 15 mi de amortiguador de lisis. La pelotilla nuclear se resuspende en 2 mi de amortiguador de lisis y se carga en lo alto de un gradiente discontinuo de sucrosa hecho mediante el revestimiento sucesivo de 4.5 mi de sucrosa 2.0 y 1.6 M conteniendo MgCl2 1 mM y se centrifugó a 100 OOOg por 60 min a 4 grados. La pelotilla en el fondo del tubo se recolecta y contendrá los núcleos puros. Ejemplo 1; Receptor de dopamina DI fusionado a la proteína fluorescente roja (Dl-RFP) o que contiene una NLS y fusionada a la proteína fluorescente roja (Dl-NLS-RFP) La secuencia del receptor de dopamina DI, la cual no contiene una NLS se modificó para reemplazar los aminoácidos DFRK en la base del dominio T 7 con la secuencia de NLS, KKFKR (la cual corresponde a la NLS de un receptor ATI humano) , como se describe en los métodos (ver la Figura 1) . Se crearon constructos de ADN que contenían las proteínas de fusión del receptor de dopamina DI Dl-RFP y Dl-NLS-RFP. Células COS se transfectaron con el ADN que codifica a DI-NLS o Dl-RFP (2 microgramos) y se incubaron por 24 y 48 horas. Las células se examinaron mediante microscopía confocal a una magnificación de 100X. Las células se contabilizaron manualmente en 8 a 10 campos microscópicos y se calcularon los porcentajes etiquetado en los diferentes compartimientos subcelulares . A las 24 y 48 horas, las células se transfectadas con DI-NLS mostraron expresión en la superficie celular en la mayoría de las células, en tanto que las células transfectadas con Dl-NLS-RFP mostraron poca expresión del receptor en la superficie celular, con localización nuclear en el 60% de las células a las 24 horas, y en el 80% de las células a las 48 horas . Ejemplo 2; Proteína de fusión conteniendo una NLS (Dl-NLS-RFP) trata con el antagonista Células COS se transfectaron con un constructo que codifica a Dl-NLS-RFP y con DI del tipo silvestre (2 microgramos) por 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas después de la transfección, las células se trataron con el antagonista del receptor de dopamina DI SCH23390 (concentración final 10 microraolar) . También a las 6, 22, 30 y 42 horas después de la transfección, las células se trataron con el antagonista (+) butaclamol (concentración final 10 µ?) . Las células de control no recibieron el tratamiento del antagonista. A las 48 horas, la mayoría de las células de control tenían Dl-NLS-RFP detectable en el núcleo. En contraste, la mayoría de las células tratadas con el antagonista tenían fluorescencia sólo sobre la superficie celular, en tanto que el 42% tenía fluorescencia tanto en la superficie y en el núcleo. Ej emplo 3 : Receptor de dopamina DI (Dl-GFP) coexpresado con el receptor que contiene una NLS (Dl-NLS) Células HE se transfectaron con constructos de ADN que codifican a Dl-NLS (3 microgramos) y/o Dl-GFP (1.5 microgramos), y se incubaron por 48 horas. Las células se transfectaron también con un plásmido que codifica a DsRed-NUC para verificar la localización del núcleo (1 microgramos) . Las células se transfectaron también con el ADN que codifica a Dl-GFP (2 microgramos) , se incubaron por 48 horas y se examinaron mediante microscopía confocal . La Dl-GFP expresada individualmente reveló que el 90% de las células demostraron etiquetado de la superficie celular y 10% mostraron etiquetado tanto de la superficie celular y nuclear. Con cualquier ADN que codifica una transfección de GPCR, hasta 10% de las células pueden ser observadas con una localización nuclear. Las células que expresan Dl-GFP y Dl-NLS mostraron 35% de células tanto con etiquetado nuclear y de la superficie celular y 70% con la expresión del receptor sobre la superficie celular solamente. Este experimento indica que la Dl-GFP se co-transporta con la Dl-NLS resultando de la oligomerización de la Dl-NLS y la Dl-GFP. Ejemplo 4: El receptor de dopamina DI conteniendo una NLS se trato con un agonista en un estudio de respuesta a la dosis Células HEK se transfectaron con el ADN que codifica a Dl-NLS-GFP (2 microgramos) , y Dl-WT (6 microgramos) por 48 horas . Estas células se trataron 6 hrs después de la transfección con SCH-23390 (10 micromolar) , o (+) butaclamol (10 micromolar) . El medio conteniendo el agonista se cambió a las 6, 22, 30, y 42 horas después de la transfección. Las células de control no recibieron el tratamiento del antagonista. Enseguida del tratamiento con SCH-23390 por 48 horas, el 59% de las células tenía expresión de la superficie celular de Dl-NLS-GFP, menos del 10% de las células tenía expresión del receptor en el núcleo y 32% de las células tenía expresión del receptor tanto en la superficie celular y en el núcleo. Enseguida del tratamiento de (+) butaclamol por 48 horas, 62% de las células tenía expresión en a superficie celular del receptor da-NLS-GFP, 10% tenía expresión en el núcleo, y 28% de las células tenía expresión del receptor sobre la superficie celular y en el núcleo. Las células de control a las 48 horas mostraron aproximadamente 65% con expresión del receptor de Dl-NLS-GFP en el núcleo, y 35% con expresión del receptor en el citoplasma. No se encontró expresión del receptor sobre la superficie celular de las células de control . La incorporación de una NLS en la secuencia del receptor causó muy poca remoción eficiente del receptor de Dl-NLS-GFP desde la superficie celular y la translocación en el núcleo. Estudios similares se llevaron a cabo a varias dosis de SCH-23390 o (+) butaclamol . Los resultados se muestran en las Tablas 2 y 3. 32% a 35% de las células de control mostraron el receptor en el citoplasma.
Tabla 2 Tabla 3 La incorporación de una NLS en la secuencia del receptor causó una remoción muy eficiente del receptor de dopamina DI de la superficie celular y localización en el núcleo. El tratamiento con los antagonistas selectivos de Di previno la translocación de este receptor en una manera sensible a la dosis . Ejemplo 4a: Expresión del receptor de dopamina Di con una NLS insertada (Dl-NLS-GFP) y tratamiento con agonistas Células HEK se transíectaron con un constructo de ADN que codifica a Dl-NLS-GFP (1.5 raicrogramos) , y se incubaron con el agonista de DI SFK-81297 (10 micromolar) por 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas después de la transfeccion, las células se trataron con medio fresco conteniendo SFK-81297 (concentración final 10 micromolar) . Las células se examinaron mediante microscopía confocal . Células HEK se transfectaron con un constructo de ADN que codifica a Dl-NLS-GFP (1.5 microgramos de ADN), y se incubaron con el agonista pergolida (10 micromolar) por 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas después de la transfeccion, las células se trataron con medio fresco conteniendo SFK-81297 (concentración final 10 micromolar) . Las células se examinaron mediante microscopía confocal . Células HEK de control se transfectaron con un constructo de ADN que codifica a Dl-NLS-GFP (1.5 microgramos de ADN) y se dejaron sin tratar. En las células sin tratar después de 48 horas, no hubo receptor detectado en la superficie celular. Con las células tratadas con SFK-81297, 59% de las células tuvo expresión del receptor en la superficie celular. Con las células tratadas con perglolida hubo expresión superficial del receptor en 59% de las células . Por lo tanto el tratamiento a largo plazo con los agonistas previene que el receptor DI se transporte al núcleo . E emplo 5 ; Receptor de dopamina DI con una NLS incorporada (Dl-NLS-RFP) co-expresado con el receptor DI del tipo salvaje Células COS se co-transfectaron con un constructo de ADN que codifica a Dl-NLS-RFP (1 microgramo) y una secuencia de ADN que codifica la el receptor de dopamina DI nativo (Dl-WT, 7 microgramos) y se incubaron por 24 o 48 horas. A las 24 horas, el Dl-NLS-RFP se detectó sólo en la superficie celular, mientras que a las 48 horas, 80% de las células tuvo Dl-NLS-RFP en el núcleo. El receptor de tipo silvestre retardó el movimiento del Dl-NLS-RFP al núcleo por la homo-oligomerización . Ejemplo 6; Receptor de dopamina DI con una NLS incorporada (Dl-NLS-RFP) co-expresado con Dl-GFP Células COS se transfectaron con un constructo que codifica a Dl-NLS-RFP (4 microgramos) y la dopamina Dl-GFP (4 microgramos) y se incubaron por 48 horas. Las células se examinaron mediante microscopía confocal . El Dl-GFP se detectó en la superficie celular y se detectó una fluorescencia amarilla en los núcleos, lo último indica co-localización tanto de Dl-NLS-RFP y Dl-GFP en el núcleo, confirmando la oligomerizacion de Dl-NLS-RFP y Dl-GFP, llevando a la importación de Dl-GFP dentro del núcleo.
Ejemplo 6a: Expresión del receptor de dopamina DI con una NLS insertada en el tercer lazo citoplasmático intracelular (D1-IC3-NLS-GFP) Células HEK se transfectaron con un constructo de ADN que codifica a D1-IC3 -NLS-GFP (2 microgramos) , y se incubaron por 48 horas. Los núcleos se visualizaron con DsRED- UC (2 microgramos) . Las células se examinaron mediante microscopía confocal . En las células transfectadas con D1-IC3 -NLS-GFP, se detectó el receptor en el núcleo de 85% de las células. Por lo tanto la inserción de una NLS en el tercer lazo intracelular permitió al receptor transportarse al núcleo. Ejemplo 6b: Expresión del receptor de dopamina DI con una NLS insertada en el primer lazo citoplasmático intracelular (D1-IC1-NLS-GFP) Células HEK se transfectaron con un constructo de ADN que codifica a DI-IC1-NLS-GFP (2 microgramos) , y se incubaron por 48 horas. Los núcleos se visualizaron con DsRED-NUC. Las células se examinaron mediante microscopía confocal. En las células transfectadas con DI-IC1-NLS-GFP, se detectó el receptor en el núcleo de 85% de las células. Por lo tanto la inserción de una NLS en el primer lazo intracelular permitió al receptor transportarse al núcleo . Ejemplo 6c: El efecto del antagonista butaclamol o SCH-23390 sobre el tráfico del receptor de dopamina DI con una NLS insertada en el primer lazo citoplasmático (D1-IC1-NLS-GFP) Células HEK se transfectaron con un constructo de ADN que codifica a D1-IC1-NLS-GFP (2 microgramos) , y se trataron ya sea con butaclamol (concentración final 1 micromolar) o SCH-23390 (1 micromolar), por 48 horas. Los núcleos se visualizaron con DsRED-NUC (2 micromolar) . Las células se examinaron mediante microscopía confocal . Las células tratadas con butaclamol tenían 82% del receptor sobre la superficie celular o en el citoplasma, 18% de las células tuvieron el receptor en el núcleo. Por lo tanto el tratamiento con butaclamol redujo el tráfico de Dl-ICl-NLS-GFP al núcleo. Las células tratadas con el SCH-23390, 77% de las células tuvo el receptor en la superficie celular o en el citoplasma. 23% de las células tuvo el receptor en el núcleo. Por lo tanto el tratamiento con SCH-23390 redujo el tráfico del receptor al núcleo . Con las células no tratadas 76% tuvo expresión del receptor en el núcleo y el citoplasma. Ejemplo 6d; Efecto del antagonista SCH-23390 sobre el tráfico del receptor de dopamina DI con una NLS insertada en el tercer lazo citoplasmático (D1-IC3 -NLS-GFP) Células HEK se transfectaron con un constructo de ADN que codifica a DI-IC3 -NLS-GFP (2 microgramos) , y se trataron con cuatro diferentes concentraciones de SCH-23390 (10 raicromolar, 1 micromolar, 500 nanomolar y 100 nanomolar) , por 48 horas. Los núcleos se visualizaron mediante microscopia confocal. 86% de las células transíectadas con DI-IC3 -NLS-GFP tuvo el receptor en el núcleo, y 0% tuvo el receptor en la superficie. Con las células tratadas con SCH-23390, 84% tuvo el recetor en el núcleo y 15% de las células tuvo el receptor en la superficie. La inserción de una NLS en esta posición en el GPCR translocará el receptor al núcleo e icientemente pero no responderá al f rmaco . Ejemplo 6e: Expresión del receptor de dopamina DI con una NLS insertada en el segundo lazo citoplasmático intracelular (DI-IC2-NLS-GFP) Células HEK se transfectaron con un constructo de ADN que codifica a DI- IC2 -NLS-GFP (2 microgramos) , y se incubaron por 48 horas. Los núcleos se visualizaron con DsRED-NUC (2 microgramos) . Las células se examinaron mediante microscopia confocal . En las células transfectadas con D1-IC2 -NLS-GFP, se detectó el receptor en el núcleo de 51% de las células. Ejemplo 6f; Habilidad del receptor de dopamina DI para homodimerizarse, con transfección etiquetada Células HEK se transfectaron con un constructo de ADN que codifica a Dl-RFP (2 microgramos) y después de 24 horas de incubación, las células se transfectaron con un segundo constructo de ADN que codifica a Dl-NLS-GFP (2 microgramos) . Las células de control se transfectaron con el constructo de Dl-RFP (2 microgramos) individualmente. Las células se incubaron por 48 horas enseguida de la segunda transfeccion y se examinaron mediante microscopía confocal . 90% de las células transfectadas con Dl-RFP individualmente expresaron el receptor en la superficie celular, y 6% de las células expresaron el receptor en el núcleo. En contrate, 97% de las células que expresaron ambas formas del receptor expresaron ambos receptores (rojo más verde igual a fluorescencia amarilla) en el núcleo. Por lo tanto, el receptor DI sin la NLS insertada interactúa con el receptor DI con la NLS para transportarse al núcleo. Ejemplo 7: receptor de dopamina D5 (D5-GFP) Un constructo que codifica el receptor de dopamina D5-GFP (D5-GFP) se preparó y se uso para transfectar células COS (4 microgramos) . Las células transfectadas con dopamina D5-GFP, a las 48 horas, mostraron principalmente una localización citoplasmática del receptor, con localización en la membrana celular solamente en unas pocas células y sin casos de localizaron nuclear.
Ej emplo 8 ; Dopamina DI con una NLS incorporada (Dl-NLS) , co-expresada con el receptor de dopamina D5 (D5-GFP) Células HEK se transfectaron con dos constructos de ADN, uno que codifica a Dl-NLS (7 microgramos) y el otro que codifica a D5-GFP (1.5 microgramos), y se incubaron por 48 horas . Aproximadamente 70% de las células transfectadas con Dl-NLS y D5-GFP tuvo expresión en la superficie celular de D5-GFP, 20% de las células tuvo tato expresión de la superficie y citoplasmática de D5-GFP, y 10% tuvo expresión nuclear de D5-GFP. No existió translocación nuclear del receptor de dopamina D5 coexpresado con Dl-NLS, indicando que los receptores DI y D5 no se oligomerizaron. Ejemplo 9; Receptor de dopamina DI que contiene dos motifs de NLS (D1-2NLS-RFP) y tratado con el antagonista Modificando el constructo que codifica a Dl-NLS-RFP, se creó un constructo de ADN (D1-2NLS-RFP) para introducir una segunda NLS en la cola de carboxilo del receptor de dopamina DI reemplazando la secuencia KKEEA del receptor de dopamina DI de tipo silvestre con la NLS, KKKRK. Células HEK se transfectaron con el ADN que codifica a este constructo (D1-2NLS-RFP) , y se trataron a intervalos con el antagonista SCH-23390 (10 µ?) como se describe previamente. A las 6, 22, 30 y 48 horas después de la transfección, se reemplazó el medio de cultivo conteniendo al antagonista. Las células de control no recibieron al antagonista. En ambas células COS y HEK transfectadas con D1-2NLS-RFP, el receptor se localizó en el núcleo en 100% de las células después de 24 horas, indicando un aumento de la translocación nuclear cuando estaba presente una segunda NLS . A las 48 horas, 90% de las células no tratadas con el antagonista mostró fluorescencia en el núcleo y 0% de las células tuvo fluorescencia en la superficie celular. Las células tratadas con el antagonista mostraron 51% de células con etiqueta de la superficie celular y 49% con etiqueta nuclear . La incorporación de una segunda NLS resultó en un transporte más eficiente del receptor al núcleo, y este evento fue retardado aun por el tratamiento con el antagonista. Ejemplo 10; Receptor de dopamina D2 (D2-GFP) Células HEK se transfectaron con constructos de ADN que codifican a D2-GFP (2 microgramos) y DsRED-NUC (1 microgramo) , y se incubaron por 48 horas. Las células se examinaron mediante microscopía confocal . Aproximadamente 90% de las células que expresan Dl-GFP tuvo expresión en la superficie celular, y 10% tuvo expresión nuclear o citoplasmática . El receptor de dopamina D2, que no tenia NLS endógena, se expresa predominantemente en la superficie celular. Ejemplo lia; Receptor de dopamina DI con una NLS incorporada (DI-NLS) y dopamina D2 (da-GFP) Células HEK se transfectaron con constructos de ADN que codifican a DI-NLS (7 microgramos) y D2-GFP (1.5 microgramos) y se incubaron por 48 horas. Las células se transfectaron también con Ds-Red-NUC para verificar la localización del núcleo (1 microgramo) . Las células se examinaron mediante microscopía confocal . En las células transfectadas con Dl-NLS y D2-GFP, 33% de las células tuvo expresión de D2-GFP en el núcleo, indicando transporte tanto de Dl-NLS y D2-GFP al núcleo, debido a la oligomerización entre los receptores DI y D2. 67% de las células tuvo receptores D2-GFP en la superficie celular solamente o en la superficie y el citoplasma. Ejemplo 11b; Habilidad del receptor de dopamina D2 corto (D2S) para dimerizarse con el receptor de dopamina D2 largo (D2L) Células HEK se transfectaron con constructos de ADN que codifican a D2S-GFP (2 microgramos) y D2L-NLS (2 microgramos) y se incubaron por 48 horas. Los núcleos se visualizaron con DsRED-NUC (2 microgramos) . Las células se examinaron mediante microscopía confocal . El receptor D2S-GFP se visualizó en los núcleos de 29% de las células. Esto indicó que el D2S se dimerizó con el D2L y fue transportado al núcleo. Ejemplo 11c: Habilidad del receptor de dopamina D2S para dimerizarse con el receptor de dopamina D2L. Células HEK se transfectaron con constructos de ADN que codifican a D2S-RFP (2 microgramos) y D21-NLS-GFP (2 microgramos) y se incubaron por 48 horas. Las células se examinaron mediante microscopía confocal . 40% de las células tuvo un color amarillo (rojo más verde encimados) en el núcleo, indicando que D2L-NLS se dimerizó con D2S-RFP y lo transportó al núcleo. Ejemplo 12; Receptor de dopamina D2 con una NLS incorporada (D2-NLS-GFP) tratado con antagonistas Células HEK se transfectaron con ADN que codifica a D2-NLS-GFP y las células se trataron con los antagonistas del receptor D2 de dopamina, (+) butaclamol (10 micromolar) o racloprida (10 micromolar) . A las 6, 22, 30 y 48 horas después de la transfección, las células se trataron con los antagonistas . Las células se incubaron 8 horas después del tratamiento con los fármacos y se examinaron mediante microscopía confocal . En ausencia del antagonista, las células que expresan D2-NLS-GFP mostraron etiqueta nuclear en 70% de las células y etiquetado citoplasmático en 20% y etiquetado citoplasmático y superficial en 10% de las células. Con el tratamiento de (+) butaclamol , el etiquetado nuclear apareció en sólo 5% de las células, 5% de las células tuvo etiquetado citoplasmático y 90% de las células tuvo etiquetado de la superficie celular. Con el tratamiento de racloprida, 5% de las células mostró etiquetado nuclear, 15% de las células tuvo etiquetado citoplasmático y 80% de las células tuvo etiquetado de la superficie celular. Ambos antagonistas del receptor D2 previnieron la translocación del receptor fuera de la superficie celular y al núcleo. Ejemplo 13; Receptor beta2 -adrenérgico-GFP (beta2-AR-GFP) Se creó un constructo de ADN que codifica una proteína de fusión que comprende el receptor beta2-adrenérgico y GFP (beta2-AR-GFP) . Las células se transfectaron con el constructo de ADN que codifica a beta2-ER-GFP (2 microgramos) , y se incubaron por 24 horas y se examinaron mediante microscopía confocal . En las células que expresan beta2-AR-GFP, 42% de las células tuvo expresión del receptor en el citoplasma solamente, y 58% de las células tuvo expresión del receptor en el citoplasma y sobre la superficie celular. No se observó localización nuclear del receptor. Ejemplo 14; Receptor beta2-adrenérgico con una NLS incorporada (beta2 -AR-NLS3 -GFP) Se creó un constructo de ADN que codifica la proteina de fusión que comprende el beta2-AR-NLS3-GFP humano. Células HEK-se transfectaron con el ADN que codifica a beta2-AR-NLS3-GFP (2 microgramos) , y Ds-Red-NUC (1 microgramo) y las células se incubaron por 48 horas. 45% de las células transfectadas con beta2 -AR-NLS3-GFP tuvo localización nuclear del receptor y 55% de las células tuvo expresión superficial y citoplasmática. La incorporación de una NLS en el beta2-AR indujo la translocación del receptor al núcleo. Ejemplo 15; Receptor beta2-adrenérgico con una NLS incorporada (beta2-AR-NLS3-GFP) , tratado con antagonista Células HEK se transfectaron con el ADN que codifica a beta2-AR~NLS3-GFP (1 microgramo) y Ds-Red-NUC (1 microgramo) y se incubaron por 48 horas. Las células se trataron a intervalos con atenolol (10 micromolar) , un antagonista del receptor adrenérgico. A las 6, 22, 30 y 48 horas después de la transfección se reemplazó el medio de cultivo conteniendo al antagonista . Las células de control no recibieron al antagonista. En las células de control 60% tuvo expresión del receptor en el núcleo, 21% tuvo expresión del receptor sobre la superficie celular, 19% tuvo expresión del receptor en el citoplasma. En las células tratadas con el antagonista atenolol, 70% tuvo expresión sobre la superficie celular, 14% tuvo expresión del receptor en el núcleo, y 16% tuvo expresión del receptor en el citoplasma. El tratamiento con el antagonista atenolol previno el tráfico del beta2-AR-NLS3-GFP al núcleo y retuvo al receptor sobre la superficie celular. Ejemplo 16; Receptor beta2-adrenérgico (beta2-AR-GFP) coexpresado con el receptor de dopamina DI con una NLS incorporada (DI-NLS) Células HEK se transíectaron con constructos de ADN que codifican el beta2-AR-GFP (1.5 microgramos) y DI-NLS (3 microgramos) por 48 horas. Aproximadamente 40% de las células mostró expresión del receptor beta2~AR-GFP en el núcleo, demostrando que el beta2-AR no que contenía una NLS se había transportado al núcleo. Esto indicó que la oligomerización había ocurrido entre el receptor beta2-AR y el receptor de dopamina DI, que contenía la NLS. 45% de las células mostraron beta2-AR-GFP en el citoplasma y 15% en el citoplasma y sobre la superficie celular. Ejemplo 17; Receptor beta2-adrenérgico (beta2-AR-GFP) y receptor de dopamina DI con una NLS incorporada tratados con antagonista Células HEK se transíectaron con constructos de ADN que codifican a beta2-AR-GFP (1.5 microgramos) y DI-NLS (3 microgramos) y se incubaron por 48 horas. Estas células se trataron con el antagonista adrenérgico, propranolol (5 micromolar) . A las 6, 22, 30 y 48 horas después de la transfección se reemplazó el medio de cultivo conteniendo al antagonista. Las células control no recibieron el antagonista. Las células se examinaron mediante microscopia confocal . 25% de las células de control mostró expresión nuclear de beta2 -AR-GFP y 75% de las células mostró etiquetado en e citoplasma y sobre la superficie celular. En las células tratadas con propanolol, la expresión nuclear de beta2 -AR-GFP fue 10%, y 90% de las células mostraron etiquetado citoplasmático y superficial. La formación de un heterodímero entre beta2-AR-GFP y Dl-NLS resultó en el tráfico del beta2 -AR-GFP al núcleo. Este tráfico fue atenuado por la presencia del antagonista para el receptor adrenérgico. Ejemplo 18; Receptor beta2-adrenérgico con una NLS incorporada (beta2 -AR-NLS3 -GFP) Células HEK se transfectaron con un constructo de ADN conteniendo una NLS que codifica a beta2 -AR-NLS3-GFP (8 microgramos) por 48 horas. Las células se transfectaron también con Ds-Red- UC para verificar la localización del núcleo (1 microgramo) . 80% de las células mostró al receptor beta2-AR-NLS3 -GFP en el núcleo. La eficiencia de la NLS se mejoro, resultando en una localización mayor del receptor en el núcleo. Ejemplo 19: Receptor de serotonina IB con una NLS incorporada (5HT1B-NLS-GFP) y tratamiento con un antagonista Células HEK se transfectaron con un constructo de ADN codificando a la serotonina 5HT1B-NLS-GFP (2 microgramos) . Las células se transfectaron con Ds-Red-NUC para verificar la localización del núcleo (1 microgramo) . Las células se trataron con metisergida (10 micromolar) , una antagonista del receptor de serotonina. A las 6, 22, 30 y 48 horas después de la transfección, se reemplazo el medio de cultivo conteniendo al antagonista. Las células de control no recibieron el antagonista. Las células se examinaron mediante microscopía confocal . Las células de control no tratadas con el antagonista mostraron 55% con el receptor localizado en el núcleo, y 20% con el receptor localizado sobre la superficie celular. A las 48 horas, las células tratadas con metisergida mostraron 25% de las células tuvo al receptor en el núcleo y 62% de las células tuvo localización sobre la superficie celular. El receptor de serotonina 5HT1B fue traslocado eficientemente desde la superficie celular al núcleo por la inserción de la NLS. El tratamiento con el antagonista de serotonina metisergida previno la translocación del receptor.
Ejemplo 20; Receptor de cisterna leucotrieno 2 con una NLS incorporada (CysLT2 -NLS-GFP) Células HEK fueron transfectadas por 48 horas con un constructo de ADN que codifica a CysLT2-NLS-GFP (8 microgramos) . Las células fueron transfectadas también con Ds-RED-NUC para verificar la localización del núcleo (1 microgramo) . Las células se examinaron mediante microscopía confocal . 83% de las células que expresan Cys-LT2-NLS-GFP mostró la expresión del receptor en el núcleo y 0% de las células tuvo expresión del receptor sobre la superficie celular, indicando la localización de Cys-LT2-NLS-GFP en el núcleo. Ejemplo 21: Receptor 2 de cisteinil leucotrieno con una NLS incorporada (Cys-LT2-NLS-GFP) tratado con un antagonista El ADN que codifica a Cys-LT2-NLS-GFP (3 microgramos) se usó para transfectar células HEK. Estas células se trataron con el antagonista del receptor de cisteinil leucotrieno, montelicast (10 micromolar) . A las 6, 22, 30 y 48 horas después de la transfección se reemplazó el medio de cultivo conteniendo el antagonista. Las células de control no recibieron el antagonista. Las células se examinaron mediante microscopía confocal . En ausencia del antagonista, 70% de las células que expresan Cys-LT2 -NLS-GFP tuvo localización del receptor en el núcleo y 30% de las células mostró localización citoplasmática con 0% de las células que mostraron el receptor sobre la superficie celular. Para las células tratadas con el antagonista, sólo 10% mostró localización nuclear del receptor, en tanto que el 90% mostró expresión en la superficie celular del receptor. Por lo tanto el antagonista del receptor de cisteinil leucotrieno montelucast previno el transporte del receptor de Cys-LT2-NLS-GFP fuera de la superficie celular y hacia el núcleo. Ejemplo 22: Receptor de opioides Mu con una NLS incorporada (mu-opioide-NLS-GFP) Células HEK fueron transfectadas por 48 horas con un constructo de ADN que codifica al mu opioide-NLS-GFP (2 microgramos) . Las células se transfectaron también con Ds-Red-NUC (1 microgramo) para verificar la localización del núcleo. Las células se examinaron mediante microscopía confocal . 65% de las células transfectadas con mu opioide-NLS-GFP mostró expresión del receptor en el núcleo. 15% de las células mostró localización sobre la superficie celular del receptor y 20% de las células tuvo etiquetado citoplasmático . Por lo tanto la inserción de la NLS permitió al receptor de opioides mu transportarse al núcleo. Ejemplo 23; Receptor de opioides mu con una NLS incorporada (mu-NLS-GFP) tratado con antagonistas Células HEK fueron transfectadas con un constructo de ADN que codifica el mu opioide-NLS-GFP (2 microgramos) . Las células transfectadas se trataron con los antagonistas de mu opioide, naxolona (10 micromolar) o naltrexona (10 micromolar) . A las 6, 22, 30 y 48 horas después de la transfección se reemplazó el medio de cultivo conteniendo los antagonistas . Las células de control no recibieron los antagonistas . Las células se examinaron mediante microscopía confocal . Cuando no se trataron, 62% de las células tuvo Mu-NLS-GFP en el núcleo y 20% de las células tuvo el receptor detectable sobre la superficie celular. Con el tratamiento de naloxona, 21% de las células tuvo expresión del receptor en el núcleo y 6S% de las células tuvo al receptor sobre la superficie celular. Con el tratamiento de naltrexona, 22% de las células tuvo expresión del receptor en el núcleo y 58% de las células tuvo al receptor sobre la superficie celular. Por lo tanto los antagonistas de mu opioide naloxona y naltrexona redujeron la translocación del receptor fuera de la superficie celular y al núcleo. Ejemplo 24; Receptor muscarinico MI con una NLS incorporada (Ml-NLS-GFP) tratado con antagonista Células HEK fueron transfectadas con el ADN que codifica a Ml-NLS-GFP (1 microgramo) , y Ds-Red-NUC (1 microgramo) por 48 horas. Estas células se trataron con bromuro de iprotropio (10 micromolar) . El medio conteniendo el agonista se reemplazo a las 6, 22, 30, y 48 horas después de la transfección. Las células de control no recibieron el antagonista. Las células se examinaron mediante microscopía confocal . Enseguida del tratamiento con bromuro de iprotropio, 72% de las células tuvo expresión del receptor sobre la superficie celular, 17% tuvo expresión del receptor en el citoplasma solamente, 11% de las células tuvo expresión del receptor en el núcleo. Para las células de control, 64% tuvo expresión del receptor en el núcleo, 23% tuvo expresión del receptor sobre la superficie celular y 13% de las células tuvo expresión del receptor en el citoplasma. El tratamiento con un antagonista muscarinico previno la translocación del Ml-NLS-GFP fuera de la superficie celular y el tráfico al núcleo. Ejemplo 25; receptor de histamina Hl con una NLS incorporada (Hl-NLS-GFP) Células HEK fueron transfectadas con un constructo de ADN que codifica el receptor de histamina Hl-NLS-GFP (2 microgramos) , y un constructo que codifica a Ds-Red-NUC (1 microgramo) y se incubaron por 48 horas. Aproximadamente 65 de las células tuvo expresión del receptor en el núcleo, y 35% de las células tuvo expresión del receptor tanto en la superficie y el citoplasma. La inserción de la NLS en el receptor de histamina Hl resultó en la translocación del receptor fuera de la superficie y al núcleo. Ejemplo 26: Efecto del antagonista prometazina sobre el tráfico del receptor de histamina Hl con una NLS insertada (Hl-NLS-GFP) Células HEK fueron transfectadas con Hl-NLS-GFP (2 microgramos ( y DsRED-NUC (2 microgramos) y se incubaron por 48 horas. Las células se trataron con prometazina (10 micromolar) por 48 horas. Los núcleos se visualizaron con DsRED-NUC. Las células se examinaron mediante microscopía confocal. Con las células tratadas con prometazina 88% de las células tuvo al receptor sobre la superficie celular, 10% de las células tuvo al receptor en el núcleo. Con las células no tratadas 85% tuvo expresión del receptor en el núcleo y el citoplasma. Por lo tanto el tratamiento con prometazina redujo el tráfico de Hl-NLS-GFP al núcleo. E eanplo 26 i Receptor ??1 de angiotensina (AT1R) Se creó un constructo de ADN (AT1R-RFP) que codifica una proteína de fusión que comprende la receptor ATI de angiotensina humano que contiene NLS y DsRed2 (RFP) . Células COS se transfectaron con el constructo de ADN AT1R-RFP (4 microgramos) y se incubaron por 48 horas a 37°C.
Las células se examinaron mediante microscopía confocal y se encontró que el receptor estuvo localizado exclusivamente dentro de los núcleos de las células, indicando una translocación basal independiente del agonista del ATIR dentro del núcleo. Ejemplo 27; Receptor de dopamina (Dl-NLS-GFP) tratado con el agonista por un corto plazo Células HE fueron transfectadas con los constructos de ADN que codifican el Dl-NLS-GFP (2 microgramos) , y Dl-WT (4 microgramos), y las células se incubaron por 24 horas. Las células se trataron con el agonista de dopamina Di, S F 81297 (10 micromolar) por 35 mins . Un sólo grupo se células fue visualizado mediante microscopia confocal en tiempo real. Se demostró una expresión aumentada del receptor en el núcleo, con un incremento ocurrido a los 20 minutos, indicando efector del agonista a corto plazo. Ejemplo 28: Transportador de dopamina con una NLS, fusionada a GFP y RFP (DAT-NLS-GFP y DAT-NLS-RFP) Células HEK fueron transfectadas con un constructo de ADN que codifica a DAT-GFP (2 microgramos) por 48 horas. Los núcleos se visualizaron con DsRED-NUC (2 microgramos) usando microscopia confocal. A las 48 horas, se detectó la DAT-GFP sobre la superficie celular o en el citoplasma en 86% de las células. En el 14% de las células, el transportador estuvo en el núcleo. Células HEK fueron transfectadas con un constructo que codifica DAT-NLS-RFP (2 microgramos) y se visualizaron mediante microscopía confocal a las 48 horas. DAT-NLS-RFP se detectó en los núcleos en 85% de las células. En el 18% de las células, el transportador estuvo ya sea en la superficie o en el citoplasma. Células HEK fueron transfectadas con el ADN que codifica DAT-NLS-GFP (2 microgramos) y se visualizaron mediante microscopía confocal a los 48 horas. Los núcleos se visualizaron con DsRED-NUC (2 microgramos) . El DAT-NLS-GFP se detectó en el núcleo del 77% de las células. Ejemplo 29; Co-transporte de DAT-GFP con DAT-NLS-RFP Células HEK fueron transfectadas con constructos de ADN que codifican a DAT-NLS-RFP (2 microgramos) y DAT-GFP (2 microgramos), y se incubaron por 48 horas. Las células se examinaron mediante microscopía confocal . Una fluorescencia amarilla se detectó en los núcleos en el 56% de las células, indicando la co-localización de DAT-NLS-RFP y DAT-GFP en el núcleo, confirmando la oligomerización de DAT-NLS-RFP y DAT-GFP. Ej emplo 30 : Efecto de la cocaína sobre el tráfico de DAT-NLS-RFP al núcleo Células HEK fueron transfectadas con un constructo de ADN que codifica a DAT-NLS-RFP (2 microgramos) y se incubaron por 48 horas. A las 6, 22, 30, y 42 horas después de la transfección, las células se trataron con cocaína o anfetamina (concentración final 10 micromolar) , o se dejaron sin tratar. Las células se examinaron mediante microscopía confocal . En las células HE no tratadas, 77% de las células tuvo expresión de DAT-NLS-RFP en el núcleo. Enseguida del tratamiento con cocaína. 75% de las células tuvo expresión citoplasmática o sobre la superficie celular de DAT-NLS-RFP, en tanto que el 25% de las células tuvo expresión del transportador en el núcleo y el citoplasma. El tratamiento con cocaína redujo el tráfico de DAT-NLS-RFP al núcleo. Enseguida del tratamiento con anfetamina, 34% de las células tuvo expresión en la superficie células/citoplasma. El tratamiento con una anfetamina (la cual no tiene como objetivo el DAT sino al transportador de monoamina vesicular, VMAT) no tuvo efecto inhibidor sobre el tráfico de DAT-NLS-RFP al núcleo . Ejemplo 31: Expresión del transportador de dopamina con una NLS (DAT-NLS-GFP) y tratamiento con antagonistas Células HEK fueron transfectadas con un constructo de ADN que codifica a DAT-NLS-GFP (2 microgramos) y se incubaron por 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas después de la transfección, las células se trataron con GBR-12909 (concentración final 1 micromolar) . Las células se examinaron mediante microscopía confocal . Células HE fueron transfectadas con un constructo que codifica a DAT-NLS-GFP (2 microgramos) y se incubaron por 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas después de la transfección las células se trataron con mazindol (concentración final 1 micromolar) . Las células se examinaron mediante microscopía confocal . Células HEK de control se transfectaron con DAT-NLS-GFP se incubaron por 48 horas y no se trataron con fármacos. En las células HEK no tratadas transfectadas con DAT-NLS-GFP, 77% de las células tuvo expresión del transportador en el núcleo y el citoplasma, 23% en el citoplasma solamente, y 0% sobre la superficie celular. Enseguida del tratamiento con GBR-12909, 62% de las células tuvo expresión del transportador sobre la superficie celular y en el citoplasma, y 38% de las células tuvo expresión del transportador en el núcleo y el citoplasma. El tratamiento con GBR-12909 redujo la translocación de DAT-NLS-GFP fuera de la superficie celular y el tráfico al núcleo. Enseguida del tratamiento con mazindol 61% de las células tuvo expresión del transportador en la superficie celular y el citoplasma, y 395 de las células tuvo expresión del transportador en el núcleo y el citoplasma. El tratamiento con mazindol redujo la translocación de DAT-NLS-GFP de la superficie celular y el tráfico al núcleo . Ejemplo 32; Habilidad del transportador de dopamina para oligomerizarse, usando la expresión en etapas de DAT-GFP y DAT-NLS-RFP Células HEK fueron transfectadas con el constructo de ADN que codifica a DAT-GFP (2 microgramos) y 24 horas más tarde con e constructo de ADN que codifica a DAT-NLS-RFP (0.5, 1 y 2 microgramos) y se incubaron por 48 horas. Las células se transfectaron también con DAT-GFP individualmente como control. Las células se incubaron 48 horas después de la segunda transfección. El periodo de incubación total fue de 72 horas . 85% de las células transfectadas con DAT-GFP individualmente contenían el transportador en el citoplasma, y 7% en el núcleo. En el experimento en etapas (relación 1:0.5), 97% de las células tuvo fluorescencia amarilla (=rojo + verde) en el núcleo. En el experimento en etapas (relación 1:1), 94% de las células tuvo fluorescencia verde en el núcleo. En el experimento en etapas (relación 1:2), 94% de las células tuvo fluorescencia amarilla en el núcleo. Por lo tanto el DAT-GFP interactúa con y se dimeriza con DAT-NLS-GFP para transportarse al núcleo. Ejemplo 33; Expresión del receptor de glutamato metabotropico glutamato-4 (mGluR4-GFP) Células HEK fueron transfectadas con un constructo de ADN que codifica el mGluR4-GFP (2 microgramos) y se incubaron por 48 horas. Los núcleos se visualizaron con DsRED- UC (2 microgramos) . Las células se examinaron mediante microscopia confocal . 89% de los receptores se expresó en la superficie celular. Por lo tanto el receptor mGluR4 estuvo localizado en gran medida en la superficie celular. Ejemplo 34; Expresión del receptor de glutamato 4 metabotropico con una NLS insertada (mGluR4-NLS-GFP) Células HEK fueron transfectadas con un constructo que codifica a mGluR4-NLS-GFP (2 microgramos) , y se incubaron por 48 horas. Las células se transfectaron también con Ds-RED- UC (2 microgramos) para verificar la localización del núcleo. Las células se examinaron mediante microscopia confocal . 60% de las células que expresan mGluR4~NLS-GFP mostró expresión del receptor en el núcleo. Por lo tanto la inserción de un NLS en el receptor de mGluR4 incrementó la localización nuclear del receptor. Ejemplo 35; Expresión del receptor muscarinico MI con o sin incorporación de NLS (Ml-GFP y Ml-NLS-GFP) Células HEK fueron transfectadas con un constructo de ADN que codifica el Ml-GFP (2 microgramos) o con un constructo que codifica el Ml-NLS-GFP (2 microgramos) y se incubaron por 48 horas. Los núcleos se visualizaron con DsRED-NUC 2 microgramos) . Las células se examinaron mediante microscopía confocal . Después de la transfeccion con Ml-GFP, 67% de las células tuvo al receptor expresado sobre la superficie celular o en el citoplasm . La transfeccion con Ml-NLS-GFP mostró 92% de las células con expresión nuclear del receptor, indicando que la NLS dirigió al receptor al núcleo. Ejemplo 36; expresión del receptor de histamina Hl (Hl- GFP) Células HEK fueron transíectadas con un constructo de ADN que codifica a Hl-GFP (1.5 microgramos) y se incubaron por 38 horas. Los núcleos se visualizaron con Ds-Red-NUC (2 microgramos) . Las células se examinaron mediante microscopía confocal . 97% de las células expresaron al receptor en la superficie celular. Por lo tanto, el receptor no modificado no se transporta al núcleo. Ejemplo 37 t Expresión del receptor de Cisteinil leucotrieno con NLS insertada (CysLTl-NLS-GFP) Células HEK fueron transíectadas con un constructo de ADN que codifica a CysLTl-NLS-GFP (2 microgramos) y se incubaron por 48 horas. Los núcleos se visualizaron con DsRED-NUC (2 microgramos) . Las células se examinaron mediante microscopia confocal . Con las células de control sin tratar, 0% de las células tuvo expresión del receptor sobre la superficie celular, y 100% de las células tuvo expresión nuclear, indicando la remoción contundente del receptor fuera de la superficie celular. Ejemplo 38; Expresión del transportador de serotonina fusionado a GFP (SERT-GFP) Células HE fueron transfectadas con un constructo de ADN que codifica a SERT-GFP (2 microgramos) y se incubaron por 48 horas. 91% de las células expreso el transportador sobre la superficie celular y el citoplasma. Ejemplo 39; Expresión del transportador de serotonina con una NLS insertada y tratamiento con fluoxetina (SERT-NLS-GFP) Células HEK fueron transfectadas con el ADN que codifica a SERT-NLS-GFP (2 microgramos de ADN) y se trataron con fluoxetina (concentración final 1 micromolar) por 48 horas. A las 6, 22, 30, y 42 horas después de la transfección, las células se trataron con fluoxetina (concentración final 1 micromolar) . Las células se examinaron mediante microscopia confocal . En las células no tratadas que expresan SERT-NLS-GFP, 0% de las células tuvo expresión del transportador sobre la superficie celular, 26% tuvo expresión del transportado en el citoplasma, y 60% de las células tuvo expresión del transportador en el núcleo y el citoplasma. Enseguida del tratamiento de fluoxetina, 68% de las células tuvo expresión del transportador de SERT-NLS-GFP sobre la células y el citoplasma, y 27% de las células tuvo expresión del transportador en el núcleo y el citoplasma. Por lo tanto el tratamiento con fluoxetina inhibió la translocación del SERT-NLS-GFP fuera de la superficie celular y el tráfico al núcleo. Ejemplo 40: Evaluación de la habilidad de dos diferentes proteínas de membrana de la superficie celular para interactuar mutuamente (D2-GFP y DAT-NLS-RFP) Células HE se transfectaron con constructos de ADN codificando al D2-GFP (2 microgramos) y DAT-NLS-RFP (2 microgramos) y se incubaron por 48 horas. Las células se transfectaron también por separado con D2-GFP y DAT-NLS-RFP individualmente como controles . Las células se examinaron por microscopía confocal . 85% de las células transfectadas con DAT-NLS-RFP contenía el transportador en el núcleo. 97% de las células transfectadas con D2-GFP contenía el receptor sobre la superficie celular, y 4% de las células contenía el receptor en el núcleo. 86& de las células cotransfectadas contenía fluorescencia amarilla (rojo más verde) en el núcleo, indicando la presencia tanto de la proteína D2 y DAT en el núcleo y confirmando la dimerización de las proteínas coexpresadas . Ejemplo 41; Evaluación de la habilidad de una proteína de membrana y una proteína no de membrana, para asociarse en un complejo e interactuar mutuamente (Dl-NLS y beta- arrestina 1-GPP) Células HE se co-transfectaron constructos de ADN codificando Dl-NLS (2 microgramos) y beta-arrestina-l-GFP (2 microgramos) y se incubaron por 48 horas. Las células e transfectaron también con beta-arrestinal-GFP individualmente. Las células se verificaron mediante microscopía confocal . 100% de las células transfectadas con beta-arrestina-l-GFP individualmente expresaron la proteína fluorescente en el citoplasma. De estas células 15% también tuvo fluorescencia en el núcleo. 89% de las células co-transfectadas con ambas proteínas expresó la proteína fluorescente en el núcleo y de estas 16% tuvo expresión en el citoplasma. Por lo tanto, la interacción entre el GPCR y la proteína de no membrana permitió el tráfico de la proteína de beta-arrestina que no contenía NLS al núcleo. Ejemplo 42; Expresión del receptor de dopamina DI con una NLS insertada (HA-Dl-NLS) tratamiento con el antagonista y detección con fluorometria Los pozos en una placa de múltiples pozos se revistieron con poli-L-ornitina y después se revistieron con 50,000 células por pozo. Las células se transfectaron con el ADN que codifica un receptor de Dl-WLS etiquetado con el epitope HA y se trataron con (+) butaclamol (10 nanomolar a 10 micromolar) durante 48 horas. Enseguida de esto, las células se fijaron con paraformaldehído, y los receptores de la superficie celular se detectaron con una anticuerpo anti-HA de rata y después un anticuerpo anti-rata de cabra conjugado a FITC. La señal fluorescente se detectó mediante fluorometria (Cytofluor) . Los resultados son el promedio de cinco pozos por condición experimental y se muestran en la Figura 2. Existió un efecto dependiente de la dosis del butaclamol para retener al receptor sobre la superficie celular, indicando que este antagonista redujo el tráfico del receptor desde la superficie celular. Por lo tanto, la fluorometria puede ser utilizada para detectar el receptor retenido en la superficie celular. Ejemplo 43: Expresión del receptor de dopamina DI con una NLS insertada (HA-Dl-NLS) , y bloqueo del efecto de respuesta a la dosis del antagonista por el agonista y detección con fluorometria Los pozos en una placa de múltiples pozos se revistieron con poli-L-ornitina y después se revistieron con 50,000 células por pozo. Las células se transfectaron con ADN que codifica un receptor Dl-NLS etiquetado con el epitope HA y se trataron con el antagonista SCH 23390 (1 nanomolar a 1 micromolar) con o sin en antagonista SKF 81297 (1 micromolar) durante 48 horas. Enseguida de esto, las células se fijaron con paraformaldehído, y los receptores de la superficie celular se detectaron con un anticuerpo anti-HA de rata y después un anticuerpo anti-rata de cabra conjugado a FITC. La señal fluorescente se detectó mediante fluorometria (Cytofluor) . Los resultados son el promedio de cinco pozos por condición experimental . Existió un efecto dependiente de la dosis del SCH 23390 para retener al receptor sobre la superficie celular, indicando que este antagonista redujo el tráfico del receptor desde la superficie celular. La adición concomitante del agonista redujo el efecto del antagonista (Figura 3) . Por lo tanto la acción del agonista puede ser detectada por el bloqueo del efecto del antagonista y la fluorometria puede ser utilizada para cuantificar el efecto del agonista . Ejemplo 43b: Expresión del receptor de dopamina DI con una NLS insertada (HA-D1-NLS) , y el bloqueo del efecto del antagonista mediante la respuesta a la dosis del agonista y detección con fluorometria .
Células HEK se transfectaron con HA-Dl-NLS en un placa de múltiples pozos se revistieron con poli-L-omitina a una concentración de 50,000 células por pozo. Las células se trataron con el antagonista SCH 23390 (0.5 micromolar) por 48 horas. El agonista SKF 81297 (100 nanomolar a 1 micromolar) junto con SCH 23390 se agregó durante la ultima hora de la incubación. Enseguida de esto, las células se fijaron con paraformaldehído, y los receptores de la superficie celular se detectaron con una anticuerpo anti-?? y después un anticuerpo anti-rata de cabra conjugado con FITC. La señal fluorescente se detectó mediante fluorometria (Cytofluor) . Los resultados son el promedio de cinco pozos por condición experimental . El tratamiento con SCH 23390 retuvo el H-D!-NLS en la superficie celular (Figura 4, Columna 1 vs Columna 6) . La adición a corto plazo del agonista resulto en un bloqueado dependiente de la dosis del efecto del SCH 23390. la remoción del SCH 23390 de las células durante la ultima hora de incubación (y en ausencia del agonista) resultó en la perdida del 33% de receptores Ha-Dl-NLS de la superficie celular (Figura 4, Columna 5 vs . Columna 6), en tanto que la adición del agonista SKF 81297 100 nanomolar en presencia continua de SCH 23390 resultó en una perdida de 66% de los receptores de la superficie celular (Figura 4, Columna 4 vs. Columna 6), hasta un 78% de pérdida de los receptores con adición de SKF 81297 1 micromolar (Figura 4, Columna 2 vs. Columna 6) . El efecto del antagonista SCH 23390 resultó en la retención del receptor sobre la superficie celular, indicando que este antagonista redujo el tráfico del receptor desde la superficie celular. La adición concomitante del agonista redujo el efecto del antagonista y aceleró la remoción del receptor desde la superficie celular en una manera sensible a la dosis . Por lo tanto los compuestos que interactúan pueden ser detectados por el bloqueo del efecto de los compuestos que retinen el receptor de NLS en la superficie celular y la fluorometria puede ser utilizada para cuantificar el efecto. Ejemplo 4 t Expresión del receptor de dopamina DI con una NLS insertada (Dl-NLS) , tratamiento con (+) butaclamol 10 micromolar y detección con enlace del radioligando Células HEK se transfectaron con el ADN que codifica a Dl-NLS y se trataron con (+) utaclamol (10 micromolar) o se dejaron sin tratar. Después de 8 horas, las células se lavaron, se recolectaron, se lisaron y se homogeneizaron mediante el politron. La fracción de membranas se recolectó mediante centrifugación y después se revistió sobre solución de sacarosa al 35% y se sometieron a centrifugación a 30,000 rpm a 4 grados C por 90 min para recolectar la fracción pesada de las membranas . Las fracciones de membranas se sometieron al análisis de enlace del radioligando usando [3H] -SCH23390 con (+) butaclamol (10 micromolar) usado para definir el enlace específico. La incubación fue a temperatura ambiente por 2 horas, seguido por filtración rápida y cuantificación mediante conteo por centelleo. El tratamiento con el antagonista de Dl-NLS previno su translocación fuera de la superficie celular y al núcleo y el receptor retenido sobre la superficie celular se cuantifico mediante el análisis de enlace del radioligando (Figura 5) . Ejemplo 45; Expresión del receptor de dopamina DI con una NLS insertada (Dl-NLS), tratamiento con (+) utaclamol 500 nanomolar y detección con enlace del radioligando Células HEK se transfectaron con el ADN que codifica a Dl-NLS y se trataron con (+) butaclamol 500 nanomolar o se dejaron sin tratar. Después de 48 horas, las células se lavaron, se recolectaron, se lisaron y se homogeneizaron mediante el politron. La fracción de las membranas se recolectó mediante centrifugación y después se revistió sobre solución de sucrosa al 35% y se sometió a centrifugación a 30,000 rpm a 4 grados C por 90 min para recolectar la fracción pesada de las membranas . Las membranas se sometieron al análisis de enlace del radioligando usando [3H] -SCH23390 con (+) butaclamol 10 micromolar usado para definir el enlace específico. La incubación fue a temperatura ambiente por 2 horas, seguido por filtración rápida y cuantificación mediante conteo por centelleo. Los resultados se muestran en las Tablas 4 y 5.
Tabla 4 : Fracción de las membranas del plasma de control Tabla 5 : Fracción de las membranas del plasma tratado con butaclamol NBS: Enlace no específico SB: enlace específico El tratamiento del antagonista con (+) butaclamol de Dl-NLS previno su translocación al núcleo y el receptor retenido sobre la superficie celular fue cuantificado mediante el análisis de enlace del radioligando. Ejemplo 46; Expresión del receptor de dopamina DI con una NLS insertada, tratamiento con 8+) butaclamol 100 nanomolar y detección con enlace del radioligando Células HEK se transíectaron con el ADN que codifica a Dl-NLS y se trataron con (+) butaclamol 100 nanomolar o se dejaron sin tratar. Después de 48 horas las células se lavaron, se recolectaron las células se lavaron, se recolectaron, se lisaron y se homogeneizaron mediante el politron. La fracción de las membranas se recolectó mediante centrifugación y después se revistió sobre solución de sucrosa al 35% y se sometió a centrifugación a 30,000 rpm a 4 grados C por 90 min para recolectar la fracción pesada de las membranas . Las membranas se sometieron al análisis de enlace del radioligando usando [3H] -SCH23390 con (+) butaclamol (10 micromolar) para definir el enlace específico. La incubación fue a temperatura ambiente por 2 horas, seguido por filtración rápida y cuantificación mediante conteo por centelleo. El tratamiento del antagonista con (+) butaclamol (100 nanomolar) de previno la translocación del Dl-NLS al núcleo y el receptor retenido sobre la superficie celular fue cuantificado mediante el análisis de enlace del radioligando. En ausencia del tratamiento con butaclamol, 0.030 pmol/mg de proteina del receptor se detecto en las membranas de la superficie celular, y con el tratamiento con butaclamol, 0.09 pmol/mg de proteina del receptor se detectó en las membranas de la superficie celular. Ejemplo 47; Expresión del receptor del factor de crecimiento epidérmico (receptor de tirosina cinasa) EGFR-GFP y EGFR-NLS-GFP. Células HEK se transfectaron con el ADN que codifica a EGFR-NLS-GFP (2 microgramos) . Las células HEK se transfectaron también con el ADN que codifica a EGFR-GFP (2 microgramos) . Y se incubaron por 24 horas. El EGFR-GFP se expresó sobre la superficie celular en el 73% de las células y el 12% de las células tuvieron al receptor en el núcleo. El EGFR-NLS-GFP fue expresado en el núcleo en 91% de las células y 0% de las células tuvieron al receptor sobre la superficie celular. La incorporación de una NLS en la secuencia del receptor de EGF indujo la translocación consistente fuera de la superficie celular y hacia el núcleo. Ejemplo 48; Expresión del receptor de lipoproteína de baja densidad (LDL-GFP) . Células HEK se transfectaron con el ADN que codifica al LDL-GFP (2 microgramos) y se incubaron por 24 horas. El receptor se expreso sobre la superficie celular en 67% de las células y en el núcleo en el 8% de las células. El receptor de LDL se expresó sobre la superficie celular en la mayoría de las células con no muchas células que contienen el receptor en el núcleo. Ejemplo 49: Expresión del receptor de LDL con una NLS (LDL-NLS-GFP) Células HEK se transíectaron con el ADN que codifica a LDL-NLS-GFP (2 microgramos) , y DsRED-NUC (2 microgramos) , y se incubaron por 48 horas. Las células se examinaron mediante microscopía confocal . El LDL-NLS-GFP fue expresado en el núcleo en 22% de las células, y sobre la superficie celular en el 67%. La incorporación de una NLS en el receptor de LDL indujo la translocación del receptor hacia el núcleo. Ejemplo 50; Expresión del receptor de eritopoyetina (receptor de citosina) RPO-GFP y EPO-NLS-GFP Células HEK se transíectaron con el ADN que codifica a EPO-NLS-GF (2 microgramos) . Las células HEK se transíectaron con EPO-FP (2 microgramos) . Las células se transfectaron también con DsRed-MJC (2 microgramos) . Las células se incubaron por 48 horas y fueron examinados mediante microscopía confocal . El EPO-NLS-GFP estuvo localizado en el núcleo de 72% de células y sobre la superficie celular en 0% de las células. El EPO-GFP estuvo localizado sobre la superficie celular en 79% de las células y 28% de las células tuvieron expresión del receptor en el núcleo. La incorporación de una NLS en la secuencia del receptor EPO indujo la translocación fuera de la superficie celular y hacia el núcleo. Ejemplo 51: Expresión del transportador de serotonina con una NLS (SERT-NLS-GFP) y tratamiento con sertralina Células HEK se transfectaron con el ADN que codifica a SERT-NLS-GFP (2 microgramos de ADN) y se trataron con sertralina (concentración final 500 nanomolar) por 48 horas. A las 6, 22, 30 y 42 horas después de la transfección, las células se trataron con sertralina. Las células se examinaron mediante microscopía confocal . En las células sin tratar que expresan SERT-NLS-GFP, 0% de las células tuvo expresión del transportador sobre la superficie celular y 75% de las células tuvo expresión del transportador en el núcleo y el citoplasma. Enseguida del tratamiento con sertralina, 69% de las células tuvo expresión del transportador de SERT-NLS-GFP sobre la superficie celular y el citoplasma, y 21% de las células tuvo expresión del transportador en el núcleo y el citoplasma. Por lo tanto el tratamiento con sertralina inhibió la transíocacion del SERT-NLS-GFP fuera de la superficie celular y el tráfico al núcleo. Ejemplo 52: Expresión del receptor de dopamina DI con una NLS alternativa (D-NLS2-GFP) y tratamiento con antagonistas Células HEK se transfectaron con el ADN que codifica a D ! -NLS2 -GFP (2 microgramos ( y se trataron con (+) butaclamol o SCH 23390 (1 micromolar) por 48 hrs. Los núcleos fueron visualizados con DsRed-nuc (2 microgramos) . Las células se examinaron mediante microscopía confocal . Con el tratamiento de butaclamol, 81% de las células tuvo al receptor sobre la superficie celular o en el citoplasma y 19% de las células tuvo expresión del receptor en el núcleo. Con el tratamiento de SCH 23390, 78% de las células tuvo al receptor en sobre la superficie celular o en el citoplasma y 22% tuvo expresión del receptor en el núcleo. En las células sin tratar, 89% de las células tuvo expresión del receptor en el núcleo y el citoplasma. Por lo tanto, el tratamiento con los antagonistas de dopamina DI previene la translocación del receptor de D1-NLS2-GFP fuera de la superficie y el tráfico a o hacia el núcleo. La presente invención no se limita a las características de las modalidades descritas aquí, sino que incluye todas las variaciones y modificaciones dentro del ámbito de las reivindicaciones .
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LISTADO DE SECUENCIAS <110> O'DOWD, BRIAN F. GEORGE, SUSAN R. <120> MÉTODO PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS QUE INTERACTUAN CON LAS PROTEÍNAS DE TRANSMEMBRANA <130> 11783-15/PAR <140> PCT/CA03/00542 <141> 2003-04-11 <150> 60/371,704 <151> 2002-04-12 <150> 60/379,419 <151> 2002-05-13 <150> 60/387,570 <151> 2002-06-12 <150> 60/422,891 <151> 2002-11-01 <150> 60/442,556 <151> 2003-01-27 <160> 158 <170> Patentln versión 3.1 <210> 1 <211> 49 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 1 gaggactctg aacaccgaat tcgccgccat ggacgggact gggctggtg <210> 2 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 2 gtgtggcagg attcatctgg gtaccgcggt tgggtgctga ccgtt 45 <210> 3 <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 3 cctaagaggg ttgaaaatct tttaaatttt ttagcattaa aggcataaat g 51 <210> 4 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 4 gcctttaatg ctaaaaaatt taaaagattt tcaaccctct taggatgc <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 5 Asn Pro lie lie Tyr Ala Phe Ala Asp Phe Arg Lys Ala Phe Ser 1 5 10 15 Thr Leu Leu <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 6 Asn Pro lie lie Tyr Ala Phe Asn Ala Lys Lys Phe Lys Arg Phe Ser 1 5 10 15 Thr Leu Leu <210> 7 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 7 tacccttacg acgtgccgga ttacgc <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 8 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 9 <211> 84 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 9 ggatccacta gtaacggccg ccagaccacc atgggatacc cgtacgacgt ccccgactac 60 gcaaggactc tgaacacctc tgcc 84 <210> 10 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 10 ggccgccagc tgcgagttca ggttgggtgc tgaccg 36 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 11 Met Arg Thr Leu Asn Thr Ser Ala Met Asp Gly Thr Gly Leu Val Val 1 5 10 15 <210> 12 <211> 26 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 12 Met Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Arg Thr Leu Asn Thr 1 5 10 15 Ser Ala Met Asp Gly Thr Gly Leu Val Val 20 25 <210> 13 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 13 ggaaagttct tttaagaaga agttcaaaag agaa <210> 14 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 14 gtttctcttt tgaacttctt cttaaaagaa ctttcc 36 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 15 Gln Pro Glu Ser Ser Phe Lys Met Ser Phe Lys 1 5 10 15 Leu <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 16 Gln Pro Glu Ser Ser Phe Lys Lys Lys Phe Lys 1 5 10 15 Leu <210> 17 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial- <220> <223> primer o cebador <400> 17 ccggtatgag aaaaagttta aacgcaaggc agccttc 37 <210> 18 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 18 ggctgccttg cgtttaaact ttttctcata ccggaaagg 39 <210> 19 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 19 Asn Pro Phe Arg Tyr Glu Arg Lys Met Thr Pro Lys Ala Ala Phe lie 1 5 10 15 Leu lie <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 20 Asn Pro Phe Arg Tyr Glu Lys Lys Phe Lys Arg Lys Ala Ala Phe lie 1 5 10 15 Leu lie <210> 21 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 21 gtgctgccgt taaaaagttc aaacgcctgc ggtccaagg 39 <210> 22 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 22 ggaccgcagg cgtttgaact ttttaacggc agcacaga' <210> 23 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 23 Leu Val Cys Ala Ala Val lie 1 5 10 15 Thr Asn <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 24 Leu Val Cys Ala Ala Val Lys 1 5 10 15 Thr Asn <210> 25 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 25 gcctttaatc ctaaaaaaaa aagaaaggtt tcaaccctct tagg 44 <210> 26 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 26 cctaagaggg ttgaaacctt tctttttttt ttaggattaa aggc <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 27 Asn Pro lie lie Tyr Ala Phe 1 5 10 15 Thr Leu Leu <210> 28 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 28 Asn Pro lie lie Tyr Ala Phe 1 5 10 15 Thr Leu Leu <210> 29 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 29 ggccgtggct ccaccgaatt cgccgccatg gatccactga atctg 45 <210> 30 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 30 ctgtgcgggc aggcagggta ccgcgcagtg gaggatcttc agg 43 <210> 31 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 31 caccaccttc aacaaaaaat tcaaaagagc cttcctgaag atcc <210> 32 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 32 ggatcttcag gaaggctctt ttgaattttt tgttgaaggt ggtg <210> 33 <211> ¦ 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 33 ggcatcacgc acctcaagct tgccgccatg gcatctctga gtcagc <210> 34 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 34 gagtgttccc tcttctgcgg taccgcgcaa gacaggatct tgagg <210> 35 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 35 aatacgactc actatag <210> 36 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 36 cgccagtgtg atggataatg gtaccgcatg gaatccattc ggggtg <210> 37 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 37 gcgccaatga gcctccccaa ttcc <210> 38 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 38 gagcctccct taggagcgaa tatgc <210> 39 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 39 cgcctgcagg ccgccatgag cctccccaat tcctcc 36 <210> 40 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 40 ccggtggatc ccgggccccg gagcgaatat g< <210> 41 <211> 63 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 41 gggccccgga gcgaatatgc agaattctct tgaatgtcct cttgaatttt ttattgcaca 60 agg 63 <210> 42 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 42 aagaattcgc caccatggat gaaacaggaa atctg 35 <210> 43 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 43 gggtaccgct actttacata tttcttctcc <210> 44 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 44 ttcttttctg ggaaaaaatt taagagaagg ctgtctac 38 <210> 45 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 45 tgtagacagc cttctcttaa attttttccc agaaaag 37 <210> 46 <211> 48 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 46 ctttttgtgt ctgtttctga attcgccacc atggagagaa 48 <210> 47 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 47 gaacaggtct catctaagag gtaccgctac tcttgtttcc tttctc 46 <210> 48 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 48 gctgggaaaa aatttaaaag aagactaaag tctgcac 37 <210> 49 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial primer o cebador <400> 49 gtcttctttt aaattttttc ccagcaaagt aatagagc <210> 50 <211> 26 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 50 ccccacctag ccaccatgaa cacttc 26 <210> 51 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador ^ <400> 51 ggggactatc agcattggcg ggagg 25 <210> 52 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 52 ccccacctgc agccaccatg aacacttcag ce 32 <210> <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 53 ggggaggatc cgcgcattgg cgggagggag tgc <210> 54 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 54 cgcactctgc aacaaaaaat tcaaacgcac ctttcgcc 38 <210> 55 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 55 ggcgaaaggt gcgtttgaat tttttgttgc agagtgcg 38 <210> 56 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o .cebador <400> 56 ggggcgaatt cgccgccatg gaggaaccgg gtgc 34 <210> 57 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 57 gcaaacggta ccgcacttgt gcacttaaaa cgta 34 <210> 58 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 58 atgtccaata aaaaatttaa aagagcattc cataaactg 39 <210> 59 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 59 ggaatgctct tttaaatttt ttattggaca tggtatag 38 <210> 60 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o iniciador <400> 60 ' aatacgactc actatag 17 <210> <211> <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o iniciador <400> 61 gccgccagtg tgatggatac tggtaccgct agcagtgagt catttgtac 49 <210> 62 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 62 ccccttatct acgcctttag cgcaaagaag ttcaagcgc <210> 63 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 63 gcgcttgaac ttctttgcgc taaaggcgta gataagggg <210> 64 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 64 ctgccggagc aaaaaattca aaagagcctt ccaggagc <210> 65 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 65 cctggaaggc tcttttgaat tttttgctcc ggcagtag <210> 66 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia <220> <223> péptido <400> 66 Asn Pro Leu lie Tyr Cys Arg Ser Pro Asp Phe lie Arg Ala Phe Gln 1 5 10 15 Glu Leu Leu <210> 67 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 67 Asn Pro Leu lie Tyr Cys Arg 1 5 10 15 Glu Leu Leu <210> 68 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 68 cgtctctgct ccctggtacc gccaccLtga gccagtgg <210> 69 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 69 taatacgact cactataggg <210> 70 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 70 cgtctctgct ccctggtacc gccaccttga gccagtgg <210> 71 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 71 ctatgcggcc aaaaagttca aaagactgcc tgggtcc <210> 72 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 72 caggcagtct tttgaacttt ttggccgcat agatgggc <210> 73 <211> 24 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 73 Ser Ser Met Ala Met Val Pro lie Tyr Ala Ala Tyr Lys Phe Cys Ser 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ser Phe Arg Glu Lys 20 <210> 74 <211> 24 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 74 Ser Ser Met Ala Met Val Pro lie Tyr Ala Ala Lys Lys Phe Lys Arg 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ser Phe Arg Glu Lys 20 <210> 75 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 75 ctatgcggcc aaaaagttca aaagactgcc tgggtcc 37 <210> 76 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 76 caggcagtct tttgaacttt ttggccgcat agatgggc <210> 77 <211> 24 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 77 Ser Ser Met Ala Met Val Pro lie Tyr Ala Ala Tyr Lys Phe Cys Ser 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ser Phe Arg Glu Lys 20 <210> 78 <211> 24 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 78 Ser Ser Met Ala Met Val Pro lie Tyr Ala Ala Lys Lys Phe Lys Arg 1 5 10 15 Leu Pro Gly Ser Phe Arg Glu Lys 20 <210> 79 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 79 gtcatttact aagcttgcca ccatggagac gacgcccttg <210> 80 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 80 cctctcggtg agtggtaccg ccacagcatt caagcgg 37 <210> 81 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 81 ggacactgcc tggcaaagct tgcgagcatg gggccctgg 39 <210> 82 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 82 ggcgggactc caggcaggta ccgccgccac gtcatcctcc 40 <210> 83 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 83 ctatggaaga actggaaaaa atttaaaaga aacagcatca 42 <210> 84 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 84 caaagttgat gctgtttctt ttaaattttt tccagttctt 42 <210> 85 <211> 20 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 85 Phe Leu Leu Trp Lys Asn Trp Arg Leu Lys Asn lie Asn Ser lie Asn 1 5 10 15 Phe Asp Asn Pro 20 <210> 86 <211> 20 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 86 Phe Leu Leu Trp Lys Asn Trp Lys Lys Phe Lys Arg Asn Ser lie Asn 1 5 10 15 Phe Asp Asn Pro 20 <210> 87 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 87 gctcttcggg ctcgagcagc gatgcgaccc tccgggacgg <210> 88 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 88 ctatcctccg tggtaccgct gctccaataa attcactgc 39 <210> 89 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 89 gatcatcact ccaaagaaat ttaaaagacg tattatt <210> 90 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 90 taatacgtct tttaaatttc tttggagtga tgatcaaccg 40 <210> 91 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 91 Arg Leu He He Thr Pro Gly 1 5 10 He Thr <210> 92 <211> 18 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 92 Arg Leu He He Thr Pro Lys 1 5 10 15 He Thr <210> 93 <211> 34 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 93 gggtctctaa gcttgccgcc atgtccggga aggg <210> <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 94 ccgcggcccg gaattcggat ggcatggttg gtg <210> 95 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 95 cgtgcccaag aaattcaagc gcctcaaagc cgtggtc <210> 96 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 96 cggctttgag gcgcttgaat ttcttgggca cgttctgc 38 <210> 97 <211> 22 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 97 Phe His Pro Glu Gln Asn Val Pro Lys Arg Lys Arg Ser Leu Lys Ala 1 5 10 15 Val Val Thr Ala Ala Thr 20 <210> 98 <211> 22 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 98 Phe His Pro Glu Gln Asn Val Pro Lys Lys Phe Lys Arg Leu Lys Ala 1 5 10 15 Val Val Thr Ala Ala Thr 20 <210> 99 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 99 ggagacccca agcttccgca gccatgggca ccgggggcc 39 <210> 100 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 100 ccccgccacg ggccccggaa ggattggacc gaggcaagg <210> 101 <211> 42 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 101 ccgctgggac cgaaaaaatt taagagaaac cctgagtatc tc 42 <210> 102 <211> 43 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 102 gatactcagg gtttctctta aattttttcg gtcccagcgg ccc 43 <210> 103 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 103 taatacgact cactataggg <210> 104 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 104 gactgcagcc tggtggtacc gcagagcaag ccacatagct gggg 44 <210> 105 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 105 taatacgact cactataggg <210> 106 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 106 gactgcagcc tggtggtacc gcagagcaag ccacatagct gggg <210> 107 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 107 gctgctctcc cacaaaaagt ttaagcggca gaagatctgg 40 <210> 108 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 108 ccagatcttc tgccgcttaa actttttgtg ggagagcagc 40 <210> 109 <211> 21 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <220> <221> MISC_FEATüRE <222> (14) .. (14) <223> Xaa igual Orn <400> 109 Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser His Arg Arg Ala Leu Lys Xaa Lys lie 1 5 10 15 Trp Pro Gly lie Pro 20 <210> 110 <211> 21 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <220> <221> MISC FEATURE <222> (14) .. (14) <223> Xaa igual Orn <400> 110 Thr Val Leu Ala Leu Leu Ser His Lys Lys Phe 1 5 10 15 Trp Pro Gly lie Pro 20 <210> 111 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 111 gctcttcggg ctcgagcagc gatgcgaccc tccgggacgg 40 <210> 112 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 112 ctatcctccg tggtaccgct gctccaataa attcactgc 39 <210> 113 <211> 37 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 113 catcgttc ggaagaagtt taagcggagg ctgctgc <210> 114 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 114 cctgcagcag cctccgctta aacttcttcc gaacgatgtg 40 <210> 115 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 115 Arg Arg Arg His lie Val Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gln 5 10 15 Glu Arg Glu <210> 116 <211> 19 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 116 Arg Arg Arg His lie Val Arg Lys Lys Phe Lys Arg Arg Leu Leu Gln 1 5 10 15 Glu Arg Glu <210> 117 <211> 49 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 117 gaggactctg aacaccgaat tcgccgccat ggacgggact gggctggtg 49 <210> 118 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 118 gtgtggcagg attcatctgg gtaccgcggt tgggtgctga ccgtt 45 <210> 119 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 119 cctctgagga cctgaaaaag aagagaaagg ctggcatcgc <210> 120 <211> 41 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 120 ggcgatgcca gcctttctct tctttttcag gtcctcagag g 41 <210> 121 <211> 33 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 121 Asn Pro lie lie Tyr Ala Phe Asn Ala Asp Phe Arg lya Ala Phe Ser 1 5 10 15 Thr Leu Leu Ser Ser Glu Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Ala Gly lie 20 25 30 Ala <210> 122 <211> 33 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 122 Asn Pro lie lie Tyr Ala Phe Asn Ala Lys Lys Phe Lys Arg Phe Ser 1 5 10 15 Thr Leu Leu Ser Ser Glu Asp Leu Lys Lys Lys Arg Lys Ala Gly lie 20 25 30 Ala <210> 123 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 123 cctagtccgc agcaggccga attcgccacc atggacagca gcacc <210> 124 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 124 gatggtgtga gaccggtacc gcgggcaatg gagcagtttc tgcc <210> 125 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 125 cctagtccgc agcaggccga attcgccacc atggacagca gcacc 45 <210> 126 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 126 ggatggtgtg agaccggtac cgcgggcaat ggagcagttt ctg> <210> 127 <211> 30, <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 127 gccttcctgg ataaaaaatt caagcgatgc <210> 128 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> primer o cebador <400> 128 gcatcgcttg aattttttat ccaggaaggc g 31 <210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 129 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 130 <211> 8 · <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4).. (14) <223> Xaa igual a una secuencia de cualquiera de 11 aminoácidos <400> 130 Arg Arg Arg Xaa Lys , Arg Arg Lys 1 5 <210> 131 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <22.0> <221> MISC_FEATURE <222> (3) .. (17) <223> Xaa igual a una secuencia de cualquiera de 15 aminoácidos <400> 131 Lys Lys Xaa Lys Lys Arg Lys 1 5 <210> 132 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 132 Lys Arg Lys Arg Arg Pro <210> 133 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 133. Pro Lys Lys Asn Arg Leu Arg Arg Lys 1 5 <210> 134 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <220> <221> ISC_FEATÜRE <222> (5) .. (24) <223> Xaa igual a una secuencia de cualquiera de 20 aminoácidos <400> 134 Lys Arg Gln Arg Xaa Lys Lys Ser Lys Lys 1 5 10 <210> 135 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 135 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 136 <211> 6 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 136 Gln Arg Lys Arg Gln 1 5 <210> 137 <211> 17 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 137 His Arg lie Glu Glu Lys Arg Lys Arg Thr Tyr Glu Thr Phe Lys Ser 1 5 10 15 lie <210> 138 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 138 Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys <210> 139 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 139 Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln <210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 140 Lys Lys Lys Lys Arg Lys Arg Glu Lys 1 5 <210> 141 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 141 Leu Lys Arg Pro Arg Ser Pro Ser Ser 1 5 <210> 142 <211> 13 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <220> <221> MISC FEATÜRE <222> (4) .. (25) <223> Xaa igual a una secuencia de cualquiera de 22 <400> 142 Lys Arg Lys Xaa Lys Glu Leu Gln Lys Gln lie Thr Lys 1 5 10 <210> 143 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 143 Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys His 1 5 <210> 144 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 144 Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys 1 5 <210> 145 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 145 Lys Ser Lys Lys Lys Ala Gln 1 5 <210> 146 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4).. (353) <223> Xaa igual a una secuencia de cualquiera de 350 aminoácidos <400> 146 Glu Glu Asp Xaa Lys Lys Lys Arg Glu Arg Leu Asp 1 5 10 <210> 147 <211> 25 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 147 Cys Tyr Phe Gln Lys Lys Ala Ala Asn Met Leu Gln Gln Ser Gly Ser 1 5 10 15 Lys Asn Thr Gly Ala Lys Lys Arg Lys 20 25 <210> 148 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <220> <221> MISC_FEATÜRE <222> (6) .. (328) <223> Xaa igual a una secuencia de cualquiera de 323 aminoácidos <400> 148 Asp lie Leu Arg Arg Xaa Pro Lys Gln Lys Arg Lys 1 5 10 " <210> 149 <211> 22 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 149 Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser Thr Pro Pro 1 5 10 15 Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 <210> 150 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <220> <221> MISCJTEATURE <222> (6) .. (14) <223> Xaa igual a una secuencia de cualquiera de 9 aminoácidos <400> 150 Arg Lys Lys Arg Lys Xaa Lys Ala Lys Lys Ser Lys 1 5 10 <210> 151 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <220> <221> MISC_FEATÜRE <222> (3) .. (13) <223> Xaa igual a una secuencia de cualquiera de 11 aminoácidos <400> 151 Lys Arg Xaa Lys Lys Leu Arg 1 5 <210> 152 <211> 11 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) .. (27) <223> Xaa igual a una secuencia de cualquiera de 22 aminoácidos <220> <221> MISC_FEATÜRE <222> (5).. (26) <223> Xaa igual a cualquier aminoácido <400> 152 Arg Arg Pro Ser Xaa Arg Arg Lys Arg Gln Lys 1 5 10 <210> 153 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4) - . (14) <223> Xaa igual a una secuencia de cualquiera de 11 aminoácidos <400> 153 Arg Arg Arg Xaa Lys Arg Arg Lys 1 5 <210> 154 <211> 7 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <220> <221> MISC_FE TURE <222> (3) .. (12) <223> Xaa igual a una secuencia de cualquiera de 10 aminoácidos <400> 154 Lys Arg Xaa Lys Lys Lys Leu 1 5 <210> 155 <211> 12 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <220> <221> MISC FEATÜRE <222> (5) .. (11) <223> Xaa igual a una secuencia de <400> 155 Arg Lys Arg Lys Xaa Arg Arg Ser Arg 1 5 10 <210> 156 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 156 Met lie Ser Glu Ala Leu Arg Lys 1 5 <210> 157 <211> 5 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 157 Lys Lys Phe Lys Arg 1 5 <210> 158 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> péptido <400> 158 Ala Phe Ser Ala Lys Lys Phe Lys Arg 1 5 46 1

Claims (28)

  1. R E I V I N D I C A C I O N E S 1. ün método para seleccionar un compuesto candidato por su habilidad para interactuar con al menos una proteina de transmembrana que comprende: transfectar células con al menos una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que comprende una proteina de transmembrana que contiene al menos una secuencia de localización nuclear (NLS) y una porción detectable y permitir la expresión de la proteina codificada en las células; poner en contacto las células con un compuesto candidato; y determinar la distribución de la proteina expresada en las células detectando la distribución de la porción detectable en las células; caracterizado porque la detección de una distribución alterada de la porción detectable en las células con relación a la distribución de la porción detectable en células control sin contacto con el compuesto candidato indica que e compuesto interacciona con la proteina de transmembrana .
  2. 2. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque la porción detectable es un péptido detectable que comprende una porción antigénica de la secuencia de amino ácido de la proteina de transmembrana yo a secuencia de nucleotidos que codifica una proteina de fusión que comprende una proteina de transmembrana que contiene al menos una NLS y una porción detectable, en donde la proteina de transmembrana de tipo silvestre contiene una NLS o la proteina de transmembrana de tipo silvestre carece de una NLS y la secuencia de nucleotidos que codifica la proteina de transmembrana se modifica para codificar una NLS, preferiblemente una NLS seleccionada a partir de la Tabla 1 o del grupo que consiste de KKFKR (SEC ID NO: 158), PKKKRKV (SEC ID NO: 154) y AFSAKKFKR (SEC ID NO: 159).
  3. 3. El método de la reivindicación 1 o . 2, caracterizado porque las células son células procarióticas o células eucarióticas, preferiblemente seleccionadas a partir del grupo que consiste de células de mamífero, preferiblemente seleccionadas del grupo que consiste de células HEK, COS y CHO, células de levadura, células de insectos, Células de nematodos, células de plantas y células fúngicas .
  4. 4. El método de la reivindicación .1, caracterizado porque la porción detectable es un péptido antigénico y en donde la distribución del péptido antigénico en las células se determina permitiéndole enlazarse a un sistema de detección a base de anticuerpos que comprende un anticuerpo específico para el péptido antigénico, preferiblemente un · sistema de detección a base de anticuerpo que comprende un primer anticuerpo especifico para el péptido antigénico y un segundo anticuerpo que transporta una etiqueta detectable y especifico para el primer anticuerpo o un sistema de detección a base de anticuerpos que comprende un primer anticuerpo especificó para el péptido antigénico y que transporte una etiqueta detectable, preferiblemente una etiqueta ópticamente detectable, y más preferiblemente una etiqueta luminiscente o fluorescente o en donde la porción detectable es un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste de la proteiha fluorescente verde, la proteina fluorescente roja y variantes modificadas de las mismas.
  5. 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones l a 4, caracterizado porque la proteina de transmembrana se selecciona a partir del grupo que consiste de un receptor acoplado a la proteina G (GPCR) , preferiblemente un receptor de dopamina Di, receptor de dopamina D2, receptor de dopamina D3, receptor de dopamina D, receptor de histamina 1, receptor 1 de cisteinil leucotrieno, receptor 2 de cisteinil leucotrieno, receptor de opioides, receptor muscarinico, receptor de serotonina, receptor beta2-adrenérgico, y receptor de glutamató 4 metabotropico; un transportador, preferiblemente un transportador de dopamina o un transportador de serotonina; un receptor de citosina, preferiblemente un receptor de eritropoyetina o un receptor de insulina; un receptor de tirosina cinasa preferiblemente un receptor del factor de crecimiento epidérmico o un receptor de insulina y un receptor de lipoproteina de baja densidad (LDL) .
  6. 6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las células se transfectan con una pluralidad de secuencias de nucleótidos, cada una de dichas secuencias de nucleótidos que codifica una proteina que comprende una proteina de transmembrana diferente que contiene al menos una NLS, preferiblemente en donde cada una de dichas secuencias de nucleótidos c'odifica una proteina que comprende una porción detectable diferente o en donde la menos una porción detectable es común a al menos dos proteínas codificadas.
  7. 7. El método de la reivindicación 1, caracterizado porque, las células se ponen en contacto con un compuesto conocido por interactuar con la al menos una proteína de transmembrana antes de poner en contacto las células con el compuesto candidato, y en donde la detección de una distribución alterada de la porción detectable en las células correlación a la distribución de la porción detectable en células de control puestas en contacto con el compuesto conocido por interactuar con la proteína de transmembrana pero no puesta en contacto con el compuesto candidato, indica que el compuesto candidato interactúa con la proteína de transmembrana.
  8. 8. El método de cualquiera de las reivindicación 1 a 7, caracterizado porque, la detección de una distribución alterada de la porción detectable en las células comprende la detección de un nivel reducido o de un nivel incrementado de la porción detectable asociada con la membrana de las células o en el núcleo de las células.
  9. 9. Un método para seleccionar un compuesto candidato por su habilidad para interactuar con al menos una proteina de transmembrana que comprende : transfectar células con al menos una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina de transmembrana que contiene la NLS y permitir la expresión de la proteina codificada en las células; poner en contacto las células con un compuesto candidato; y determinar el nivel de la proteina de transmembrana que contiene la NLS, que permanece en las células aislando la fracción de membranas de las células de las células, poner en contacto la fracción con un ligando etiquetado de la proteina de transmembrana y determinar el nivel de enlace del ligado a la fracción; caracterizado porque la detección de un nivel alterado de la proteina de transmembrana en las membranas celulares con relación al nivel en las membranas celulares en células de control sin contacto con el compuesto candidato, indica que el compuesto interactúa con la proteina de transmembrana .
  10. 10. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque, el ligando etiquetado es un ligando radioetiquetado, en donde la proteina de transmembrana de tipo silvestre contiene una NLS o la proteina de transmembrana del tipo silvestre carece de una NLS y la secuencia de nucleótidos que codifica la proteina de transmembrana se modifica para codificar una NLS, preferiblemente una NLS seleccionada a partir de la Tabla 1 o del grupo que consiste de KKFKR (SEC ID NO: 158), PKKKRKV (SEC ID NO: 154) y AFSAKKFKR (SEC ID NO: 159) .
  11. 11. El método de las reivindicaciones 9 o 10, caracterizado porque, las células son células procarioticas o células eucarióticas , seleccionadas preferiblemente a partir del grupo que consiste de células de mamífero, seleccionadas preferiblemente a partir del grupo que consiste de células HE , COS y CHO, células de levadura, células de insectos, células de nematodos, células de plantas y células fúngicas..
  12. 12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, caracterizado porque, la proteína de transmembrana se selecciona a partir del grupo que consiste de un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) , preferiblemente un receptor de dopamina DI, receptor de dopamina D2, receptor de dopamina D3, receptor de dopamina D, receptor de histamina 1, receptor 1 de cisteinil leucotrieno, receptor 2 de cisteinil leucotrieno, receptor de opioides, receptor muscarínico, receptor de serotonina, receptor beta2-adrenérgico, y receptor de glutamato 4 metabotropico un transportador, preferiblemente un transportador de dopamina o un transportador de serotonina; un receptor de citocina, preferiblemente un receptor de eritropoyetina o un receptor de insulina; un receptor de tirosina cinasa preferiblemente un receptor del factor de crecimiento epidérmico o un receptor de insulina y un receptor de lipoproteina de baja densidad (LDL) .
  13. 13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, caracterizado porque, las células se transfectan con una pluralidad de secuencias de nucleótidos, cada una de dichas secuencias de nucleótidos que codifica una proteina que comprende una proteina de transmembrana diferente que contiene al menos una NLS, preferiblemente en donde cada una de dichas secuencias de nucleótidos codifica una proteina que comprende una porción detectable diferente o en donde la menos una porción detectable es común a al menos dos proteínas codificadas.
  14. 14. El método de cualquiera de las reivindicación 9 a 13, caracterizado porque, la detección de una distribución alterada de la porción detectable en las células comprende la detección de un nivel reducido o de un nivel incrementado de la porción detectable asociada con la membrana de las células .
  15. 15. Células aisladas transfectadas con al menos una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina que comprende una proteína de transmembrana que contiene al menos una NLS y una porción detectable.
  16. 16. Las células de la reivindicación 15, caracterizado porque, la porción detectable es un péptido detectable que comprende una porción antigénica de la secuencia de amino ácido de la proteína de transmembrana yo a secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión que comprende una proteína de transmembrana que contiene al menos una NLS y una porción detectable, en donde la proteína de transmembrana de tipo silvestre contiene una NLS o la proteína de transmembrana de tipo silvestre carece de una NLS y la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de transmembrana se modifica para codificar una NLS, preferiblemente una NLS seleccionada a partir de la Tabla 1 o del grupo que consiste de KKFKR (SEC ID NO: 158), PKKKRKV (SEC ID NO: 154) y AFSAKKFKR (SEC ID NO: 159) .
  17. 17. Las células de la reivindicación 15, caracterizadas porque, la porción detectable es un péptido antigénico y en donde la distribución del péptido antigénico en las células se determina permitiéndole enlazarse a un sistema de detección a base de anticuerpos que comprende un anticuerpo especifico para el péptido antigénico, preferiblemente un sistema de detección a base de anticuerpo que comprende un primer anticuerpo especifico para el péptido antigénico y un segundo anticuerpo que transporta una etiqueta detectable y especifico para el primer anticuerpo o un sistema de detección a base de anticuerpos que comprende un primer anticuerpo especifico para el péptido antigénico y que transporte una etiqueta detectable, preferiblemente una etiqueta ópticamente detectable, y más preferiblemente una etiqueta luminiscente o fluorescente o en donde la porción detectable es un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste de la proteina fluorescente verde, la proteina fluorescente roja y variantes modificadas de las mismas.
  18. 18. Las células de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, caracterizadas porque, la proteina de transmembrana se selecciona a partir del grupo que consiste de un receptor acoplado a la proteina G (GPCR) , preferiblemente un. receptor de dopamina Di, receptor de dopamina D2, receptor de dopamina D3, receptor de dopamina D, receptor de histamina 1, receptor 1 de cisteinil leucotrieno, receptor 2 de cisteinil leucotrieno, receptor de opioides, receptor muscarinico, receptor de serotonina, receptor beta2-adrenérgico, y receptor de glutamato 4 metabotrópico; un transportador, preferiblemente un transportador de dopamina o un transportador de serotonina; ¦ un receptor de citosina, preferiblemente un receptor de eritropoyetina o un receptor de insulina; un receptor de tirosina cinasa preferiblemente un receptor del factor de crecimiento epidérmico o un receptor de insulina y un receptor de lipoproteina de baja densidad (LDL) .
  19. 19. Las células de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizadas porque, las células se transfectan con una pluralidad de secuencias de nucleótidos, cada una de dichas secuencias de nucleótidos que codifica una proteina que comprende una proteina de transmembrana diferente que contiene al menos una NLS, preferiblemente en donde cada una de dichas secuencias de nucleótidos codifica una proteina que comprende una porción detectable diferente o en donde la menos una porción detectable es común a al menos dos proteínas codificadas
  20. 20. Las células de cualquiera de las reivindicaciones 15 a 19, caracterizadas porque, las células son células procarióticas o células eucarióticas, seleccionadas preferiblemente a partir del grupo que consiste de células de mamífero, seleccionadas preferiblemente a partir del grupo que consiste de células HEK, COS y CHO, células de levadura, células de insectos, células de nematodos, células de plantas y células fúngicas.
  21. 21. Un compuesto, caracterizado porque, está identificado como capaz de interactuar con una proteína de transmembrana mediante el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
  22. 22. Un método para determinar si una primera proteina y una segunda proteina son capaces de oligomerizarse, que comprende: transfectar células con una secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteina que contiene una NLS y una secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteina que comprende una porción detectable y permitir la expresión de la primera y la segunda proteínas codificadas en las células; y determinar la distribución de la porción detectable en las células; caracterizado porque, la detección de la porción detectable en o junto al núcleo de las células o la detección de un nivel reducido de la porción detectable en la superficie celular, con relación a células de control, indica que la primera y segunda proteínas interactúan, en donde la primera y al segunda proteínas son diferentes proteínas de transmembrana, preferiblemente GPCR' s o son a misma proteína de transmembrana, o una de las primera y la segunda proteínas es una proteína de transmembrana y la otra es una proteína no de transmembrana.
  23. 23. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque, la porción detectable es un péptido detectable que comprende una porción antigénica de la secuencia de aminoácido de la segunda proteína y/o en donde la segunda secuencia de nucleótidos codifica una proteína de fusión que comprende la segunda proteína y una porción detectable.
  24. 24. El método de la reivindicación 22 o 23, caracterizado porque, la primera proteína del tipo silvestre contiene una NLS, o la primera proteína del tipo silvestre carece de una NLS y la primera secuencia de nucleótidos que codifica la primera proteína se modifica para codificar una NLS, preferiblemente una NLS seleccionada a partir de la Tabla 1 o del grupo que consiste de KKFKR (SEC ID NO:158), PKKKR V (SEC ID NO: 154) y AFSAKKFKR (SEC ID NO: 159) .
  25. 25. El método de cualquiera de las 22 a 24, caracterizado porque, las células son células procarióticas o células eucarióticas , seleccionadas preferiblemente a partir del grupo que consiste de células de mamífero, seleccionadas preferiblemente a partir del grupo que consiste de células HEK, COS y CHO, células de levadura, células de insectos, células de nematodos, células de plantas y células fúngicas .
  26. 26. El método de la reivindicación 22, caracterizadas porque, la porción detectable es un péptido antigénico y en donde la distribución del péptido antigénico en las células se determina permitiéndole enlazarse a un sistema de detección a base de anticuerpos que comprende un anticuerpo' especifico para el péptido antigénico, preferiblemente un sistema de detección a base de anticuerpo que comprende un primer anticuerpo especifico para el péptido antigénico y un segundo anticuerpo que transporta una etiqueta detectable y especifico para el primer anticuerpo o un sistema de detección a base de anticuerpos que comprende un primer anticuerpo especifico para el péptido antigénico y que transporte una etiqueta detectable, preferiblemente una etiqueta ópticamente detectable, y más preferiblemente una etiqueta luminiscente o fluorescente o en donde la porción detectable es un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste de la proteina fluorescente verde, la proteina fluorescente roja y variantes modificadas de las mismas.
  27. 27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26, caracterizadas porque, la primera y la segunda proteínas son proteínas de transmembrana seleccionadas a partir del grupo que consiste de un receptor acoplado a la proteína G (GPCR) , preferiblemente un receptor de dopamina Di, receptor de dopamina D2, receptor de dopamina D3, receptor de dopamina D, receptor de histamina 1, receptor 1 de cisteinil leucotrieno, receptor 2 de cisteinil leucotrieno, receptor de opioides, receptor muscarínico, receptor de serotonina, receptor beta2-adrenérgico, y receptor de glutamato 4 metabotrópico; un transportador, preferiblemente un transportador de dopamina o un transportador de serotonina; un receptor de citocina, preferiblemente un receptor de eritropoyetina o un receptor de insulina; un receptor de tirosina cinasa preferiblemente un receptor del factor de crecimiento epidérmico o un receptor de insulina y un receptor de lipoproteina de baja densidad (LDL) .
  28. 28. El método de la reivindicación 22, caracterizado porque, la primera secuencia de nucleótidos codifica una primera proteina que comprende además una porción detectable diferente de la porción detectable de la segunda proteina, en donde la detección de una interacción de transferencia de energía entre la porción detectable de la primera proteina y la porción detectable de la segunda proteina indica que la primera y la segunda proteina se oligomerizan.
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