JP2966923B2 - リポ多糖関連グラム陰性細菌感染を治療するための殺菌性／透過性増強タンパク質またはその生物学的に活性な類縁体の使用 - Google Patents
リポ多糖関連グラム陰性細菌感染を治療するための殺菌性／透過性増強タンパク質またはその生物学的に活性な類縁体の使用Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 グラム陰性細菌感染は、特に入院患者及び免疫力弱体
化患者（immunocompromised patients）における罹患及
び死亡の主因である〔Duma,R.J.,Am.J.of Med.,78（Sup
pl.6A）:154−164（1985）；並びにKreger B.E.,D.E.Cr
aven及びW.R.McCabe,Am.J.Med.,68:344−355（198
0）〕。
化患者（immunocompromised patients）における罹患及
び死亡の主因である〔Duma,R.J.,Am.J.of Med.,78（Sup
pl.6A）:154−164（1985）；並びにKreger B.E.,D.E.Cr
aven及びW.R.McCabe,Am.J.Med.,68:344−355（198
0）〕。
入手可能な抗生物質は上記感染を阻止する場合に有効
であるが、それらは、リポ多糖（LPS）に関連する病態
生理学的作用を中和するためには何ら効果的でない。LP
S即ち内毒素はグラム陰性細菌の外膜の主成分であり、
その細菌が溶解されたときに放出される〔Ahenep,J.L.
及びK.A.Morgan,J.Infect.Dis.,150（３）:380−388（1
984）〕。
であるが、それらは、リポ多糖（LPS）に関連する病態
生理学的作用を中和するためには何ら効果的でない。LP
S即ち内毒素はグラム陰性細菌の外膜の主成分であり、
その細菌が溶解されたときに放出される〔Ahenep,J.L.
及びK.A.Morgan,J.Infect.Dis.,150（３）:380−388（1
984）〕。
抗生物質療法の際に放出されるLPSは炎症応答の強力
な刺激物質である。LPSの多くのin vivoでの有害作用
は、炎症細胞によって放出される可溶性媒介物質によっ
て引き起こされる〔Morrison D.C.及びR.J.Ulevich.Am.
J.Pathol.,93（２）:527−617（1978）〕。LPSは宿主炎
症細胞による媒介物質の放出を誘発し、これは最終的に
散在性血管内凝固（DIC）、成人呼吸窮迫症候群（ARD
S）、腎不全及び不可逆性ショックをもたらし得る。
な刺激物質である。LPSの多くのin vivoでの有害作用
は、炎症細胞によって放出される可溶性媒介物質によっ
て引き起こされる〔Morrison D.C.及びR.J.Ulevich.Am.
J.Pathol.,93（２）:527−617（1978）〕。LPSは宿主炎
症細胞による媒介物質の放出を誘発し、これは最終的に
散在性血管内凝固（DIC）、成人呼吸窮迫症候群（ARD
S）、腎不全及び不可逆性ショックをもたらし得る。
単球及び好中性顆粒球は、細菌感染に対する宿主の防
御において重要な役割を果たし、内毒素血症の病理にも
関与する。これらの細胞は微生物を細胞内に摂取して殺
し、更に、殺菌性、タンパク質分解性、オプソニン性、
発熱性、補体活性化及び組織損傷作用を有する可溶性タ
ンパク質を放出することによりin vivo及びin vitroでL
PSに応答する。LPSに刺激された単球によって放出され
るサイトカインである腫瘍壊死因子（TNF）はin vivo
で、LPSのもつ毒作用のうち幾らかの作用を模倣的に有
する。動的にTNFを注入すると、発熱、ショック及びグ
ルコース代謝の変化がもたらされる。TNFは強力な好中
球刺激因子でもある。
御において重要な役割を果たし、内毒素血症の病理にも
関与する。これらの細胞は微生物を細胞内に摂取して殺
し、更に、殺菌性、タンパク質分解性、オプソニン性、
発熱性、補体活性化及び組織損傷作用を有する可溶性タ
ンパク質を放出することによりin vivo及びin vitroでL
PSに応答する。LPSに刺激された単球によって放出され
るサイトカインである腫瘍壊死因子（TNF）はin vivo
で、LPSのもつ毒作用のうち幾らかの作用を模倣的に有
する。動的にTNFを注入すると、発熱、ショック及びグ
ルコース代謝の変化がもたらされる。TNFは強力な好中
球刺激因子でもある。
可溶性LPSは好中球の走化性を低下させ、付着性を増
大し、ヘキソースモノホスフェート封鎖活性及びO2ラジ
カル産生を上昇させ、補体の表面レセプターのアップレ
ギュレーション（upregulation）を行い、顆粒タンパク
質を周囲の媒質中に放出する〔Morrison及びUlevich（1
978）〕。
大し、ヘキソースモノホスフェート封鎖活性及びO2ラジ
カル産生を上昇させ、補体の表面レセプターのアップレ
ギュレーション（upregulation）を行い、顆粒タンパク
質を周囲の媒質中に放出する〔Morrison及びUlevich（1
978）〕。
特異的なコンパートメント及びアズール好性コンパー
トメントはともにLPSに応答して脱顆粒反応を起こす〔B
annatyne,R.M.,N,M.Harnett,K.Y.Lee及びW.D.Rigger,J.
Infect.Dis.,156（４）:469−474（1977）〕。LPSに応
答して放出されたアズール好性タンパク質は宿主にとっ
て有害でも有益でもあり得る。好中球エラスターゼは、
凝固カスケードの抑制に関わるプロテアーゼ阻害物質の
分解をもたらす。これにより、内毒素血症の潜在的に致
命的な結果である散在性血管内凝固のような凝固阻害を
引き起こす。アズール好性顆粒は更に、ミエロペルオキ
シダーゼ及び殺菌／透過性増強因子（Bactericidal/Per
meability Increasing Factor,BPI）のような殺菌性分
子をも含む。
トメントはともにLPSに応答して脱顆粒反応を起こす〔B
annatyne,R.M.,N,M.Harnett,K.Y.Lee及びW.D.Rigger,J.
Infect.Dis.,156（４）:469−474（1977）〕。LPSに応
答して放出されたアズール好性タンパク質は宿主にとっ
て有害でも有益でもあり得る。好中球エラスターゼは、
凝固カスケードの抑制に関わるプロテアーゼ阻害物質の
分解をもたらす。これにより、内毒素血症の潜在的に致
命的な結果である散在性血管内凝固のような凝固阻害を
引き起こす。アズール好性顆粒は更に、ミエロペルオキ
シダーゼ及び殺菌／透過性増強因子（Bactericidal/Per
meability Increasing Factor,BPI）のような殺菌性分
子をも含む。
まず1975年にウサギBPIが発見された〔Weiss,J.,R.C.
Franson,S.Becherdite,K.Schmeidler及びP.Elsbach,J.C
lin.Invest.,53:33（1975）〕。1978年にはBPIがヒト好
中球から単離された〔Weiss,J.,P.Elsbach,I.Olson及び
H.Odeberg,J.Biol.Chem.,253（８）:2664−2672（197
8）〕。
Franson,S.Becherdite,K.Schmeidler及びP.Elsbach,J.C
lin.Invest.,53:33（1975）〕。1978年にはBPIがヒト好
中球から単離された〔Weiss,J.,P.Elsbach,I.Olson及び
H.Odeberg,J.Biol.Chem.,253（８）:2664−2672（197
8）〕。
1984年には類似の特性を有する57kDのタンパク質がヒ
ト好中球から単離された〔Shafer,W.M.,C.E.Martin及び
J.K.Spitznagel,Infect.Immun.,45:29（1984）〕。この
タンパク質は、Ｎ末端配列のアミノ酸組成、分子量及び
起源においてBPIと同一である。しかしながら上記文献
の著者は、Elsbachら及びWeissらによって使用されたク
ロマトグラフィー単離手順を再現することはできなかっ
た。
ト好中球から単離された〔Shafer,W.M.,C.E.Martin及び
J.K.Spitznagel,Infect.Immun.,45:29（1984）〕。この
タンパク質は、Ｎ末端配列のアミノ酸組成、分子量及び
起源においてBPIと同一である。しかしながら上記文献
の著者は、Elsbachら及びWeissらによって使用されたク
ロマトグラフィー単離手順を再現することはできなかっ
た。
ヒトBPIは、感受性グラム陰性細菌の外膜に結合する5
7kDのタンパク質である〔Weissら，（1978）〕。BPIが
リピドＡ結合タンパク質であるという事実は、（１）ラ
フ型細菌株はBPIの殺菌性及び透過性両方の増強活性に
対しより多くの感受性を示すこと〔Weiss,J.,M.Hutzler
及びL.Kao,Infect.Immun.,51:594（1986）〕；（２）リ
ピドＡにおける突然変異は、結合を低下させ且つポリミ
キシンＢ及びBPI両方の殺菌活性に対する抵抗性を増大
させること〔Farley,M.M.,W.M.Shafer及びJ.K.Spitznag
el,Infect.Immun.,56:1589（1988）〕；（３）BPIは、
S.typhimuriumへの結合においてポリミキシンＢと拮抗
すること〔Farely,1988〕；（４）BPIは、別のLPS結合
タンパク質であるリポ多糖結合タンパク質（LBP）と配
列相同及び免疫交差反応性を有することによって立証さ
れている。LBP−LPS複合体は、ホルミル化ペプチドに応
答して好中球において酸化的破裂を刺激することが判っ
ている。ヒト血清中に認められたLPSと複合体を形成し
ている別のLPS結合タンパク質即ち高密度リポタンパク
質（HDL）は、好中球に対し刺激作用を示さない。BPI結
合はLPS構造を破壊し、微生物透過性を変え且つ小さな
疎水性分子と為し、細胞死を惹起する〔Weissら,197
8〕。BPIは、生理学的pH及びイオン強度条件下にin vit
roで細菌を殺すが、このことはBPIが、低pH環境のファ
ゴリソソームの外でin vivoで活性であり得ることを示
唆する。BPIの殺菌性及び透過性増強活性の全ては、該
タンパク質のＮ末端の25kDの断片に存在する〔Ooi,C.
E.,J.Weiss,P.Elsbach,B.Frangione及びB.Marrion,J.Bi
ol.Chem.,262:14891（1987）〕。しかしながら本発明以
前には、BPIの有益性はその殺菌効果に限定されると考
えられていた。
7kDのタンパク質である〔Weissら，（1978）〕。BPIが
リピドＡ結合タンパク質であるという事実は、（１）ラ
フ型細菌株はBPIの殺菌性及び透過性両方の増強活性に
対しより多くの感受性を示すこと〔Weiss,J.,M.Hutzler
及びL.Kao,Infect.Immun.,51:594（1986）〕；（２）リ
ピドＡにおける突然変異は、結合を低下させ且つポリミ
キシンＢ及びBPI両方の殺菌活性に対する抵抗性を増大
させること〔Farley,M.M.,W.M.Shafer及びJ.K.Spitznag
el,Infect.Immun.,56:1589（1988）〕；（３）BPIは、
S.typhimuriumへの結合においてポリミキシンＢと拮抗
すること〔Farely,1988〕；（４）BPIは、別のLPS結合
タンパク質であるリポ多糖結合タンパク質（LBP）と配
列相同及び免疫交差反応性を有することによって立証さ
れている。LBP−LPS複合体は、ホルミル化ペプチドに応
答して好中球において酸化的破裂を刺激することが判っ
ている。ヒト血清中に認められたLPSと複合体を形成し
ている別のLPS結合タンパク質即ち高密度リポタンパク
質（HDL）は、好中球に対し刺激作用を示さない。BPI結
合はLPS構造を破壊し、微生物透過性を変え且つ小さな
疎水性分子と為し、細胞死を惹起する〔Weissら,197
8〕。BPIは、生理学的pH及びイオン強度条件下にin vit
roで細菌を殺すが、このことはBPIが、低pH環境のファ
ゴリソソームの外でin vivoで活性であり得ることを示
唆する。BPIの殺菌性及び透過性増強活性の全ては、該
タンパク質のＮ末端の25kDの断片に存在する〔Ooi,C.
E.,J.Weiss,P.Elsbach,B.Frangione及びB.Marrion,J.Bi
ol.Chem.,262:14891（1987）〕。しかしながら本発明以
前には、BPIの有益性はその殺菌効果に限定されると考
えられていた。
抗生物質療法における改良にも拘らず、内毒素血症に
関連する罹患率及び死亡率は依然として高い。LPSの毒
作用を中和する上で、抗生物質単独では有効でない。従
って、直接的なLPS中和活性をもつ補助剤療法の必要性
が生じる。内毒素血症を治療する現在の方法は抗生物質
を使用し、支持介護を要する。最も実施可能な補助剤療
法は、低血圧及び発熱のような内毒素ショックの症状を
治療するものであるが、内毒素を失活させることはな
い。他の療法は、LPSに対する宿主の炎症応答を阻害す
るものである。以下に記載するように、現在の療法は、
毒性、免疫原性または動物モデルとヒト試験との間での
再現不可能な効能のために多くの制限を有する。
関連する罹患率及び死亡率は依然として高い。LPSの毒
作用を中和する上で、抗生物質単独では有効でない。従
って、直接的なLPS中和活性をもつ補助剤療法の必要性
が生じる。内毒素血症を治療する現在の方法は抗生物質
を使用し、支持介護を要する。最も実施可能な補助剤療
法は、低血圧及び発熱のような内毒素ショックの症状を
治療するものであるが、内毒素を失活させることはな
い。他の療法は、LPSに対する宿主の炎症応答を阻害す
るものである。以下に記載するように、現在の療法は、
毒性、免疫原性または動物モデルとヒト試験との間での
再現不可能な効能のために多くの制限を有する。
ポリミキシンＢは、内毒素の最高の毒性及び生物学的
活性をもつ成分リピドＡに結合し、それを構造的に破壊
することが判っている塩基性ポリペプチド抗生物質であ
る。ポリミキシンＢは、in vitroで好中球顆粒を放出す
るLPS活性化を阻害することが判っており、ヒトにおけ
るグラム陰性細菌敗血症に対する有効な治療手段であ
る。しかしながらその全身性毒性の故に、この薬剤は局
所適用薬剤として以外の使用は制限されている。
活性をもつ成分リピドＡに結合し、それを構造的に破壊
することが判っている塩基性ポリペプチド抗生物質であ
る。ポリミキシンＢは、in vitroで好中球顆粒を放出す
るLPS活性化を阻害することが判っており、ヒトにおけ
るグラム陰性細菌敗血症に対する有効な治療手段であ
る。しかしながらその全身性毒性の故に、この薬剤は局
所適用薬剤として以外の使用は制限されている。
抗生物質と高い投与量のメチルプレドニソロンナトリ
ウムスクシネート（MPSS）とを使用するコンビネーショ
ン療法は、イヌを使用したグラム陰性細菌敗血症の実験
モデルにおいて死を回避することが示された。全身性敗
血症の臨床兆候が見られる223人の患者に行なった二重
重点方式（multicenter）、二重盲検法、プラシーボ制
御の臨床研究において抗生物質と一緒にMPSSを使用した
別の研究では、治療グループとプラシーボグループとの
間で死亡率に有意な差はないと結論された。更に、調査
の結果、14日以内の二次感染の消散はプラシーボグルー
プにおいて有意に高いことが判った。
ウムスクシネート（MPSS）とを使用するコンビネーショ
ン療法は、イヌを使用したグラム陰性細菌敗血症の実験
モデルにおいて死を回避することが示された。全身性敗
血症の臨床兆候が見られる223人の患者に行なった二重
重点方式（multicenter）、二重盲検法、プラシーボ制
御の臨床研究において抗生物質と一緒にMPSSを使用した
別の研究では、治療グループとプラシーボグループとの
間で死亡率に有意な差はないと結論された。更に、調査
の結果、14日以内の二次感染の消散はプラシーボグルー
プにおいて有意に高いことが判った。
内毒素血症を治療する比較的新しい方法は、内毒素中
和抗体を用いた受動免疫感作である。E.Coli J5に対す
る高度免疫ヒト免疫グロブリンは、グラム陰性菌血症及
びショックを有する患者の死亡率を50％低下させること
が判っている。他のグループは、マウス、キメラ動物及
びヒトのモノクローナル抗体を使用しての動物モデルに
おいて有望な結果を示した。モノクローナル抗体は、例
えば薬剤の効能がより一貫しているかヒト病原体の伝染
を低下させるなど高度免疫血清よりも有効であるが、LP
Sを中和するために免疫グロブリンを投与することに関
連する問題は尚多く存する。免疫グロブリン自体に対す
る宿主の応答は過敏症をもたらし得る。免疫複合体の補
体活性化及び沈着に続く組織損傷は、敗血症患者に抗内
毒素抗体を含む療法を使用する上での別の懸念事項であ
る。また免疫グロブリンは大きな分子、特に最近の臨床
試験におけるペンタマーIgMであり、細網内皮系によっ
て迅速に一掃され、そのような薬剤の半減期を小さくす
る。
和抗体を用いた受動免疫感作である。E.Coli J5に対す
る高度免疫ヒト免疫グロブリンは、グラム陰性菌血症及
びショックを有する患者の死亡率を50％低下させること
が判っている。他のグループは、マウス、キメラ動物及
びヒトのモノクローナル抗体を使用しての動物モデルに
おいて有望な結果を示した。モノクローナル抗体は、例
えば薬剤の効能がより一貫しているかヒト病原体の伝染
を低下させるなど高度免疫血清よりも有効であるが、LP
Sを中和するために免疫グロブリンを投与することに関
連する問題は尚多く存する。免疫グロブリン自体に対す
る宿主の応答は過敏症をもたらし得る。免疫複合体の補
体活性化及び沈着に続く組織損傷は、敗血症患者に抗内
毒素抗体を含む療法を使用する上での別の懸念事項であ
る。また免疫グロブリンは大きな分子、特に最近の臨床
試験におけるペンタマーIgMであり、細網内皮系によっ
て迅速に一掃され、そのような薬剤の半減期を小さくす
る。
内毒素は、宿主に有益である共に損傷をも与える応答
を誘発する。内毒素血症は肝臓からLPS結合タンパク質
の生成を誘導し、白血球から殺菌性タンパク質の放出を
惹起する。宿主の防御に関与する好中球タンパク質の本
出願人らの研究において、これらのタンパク質の１つBP
Iはin vitroで強力な殺菌物質であるだけでなく、LPSの
好中球を刺激する能力も阻害すると判断された。特に、
BPIは可溶性LPSに結合し、その好中球を活性化する能力
を中和することが示された。従って本発明は、グラム陰
性細胞敗血症におけるLPS毒性を治療する方法を提供す
る。
を誘発する。内毒素血症は肝臓からLPS結合タンパク質
の生成を誘導し、白血球から殺菌性タンパク質の放出を
惹起する。宿主の防御に関与する好中球タンパク質の本
出願人らの研究において、これらのタンパク質の１つBP
Iはin vitroで強力な殺菌物質であるだけでなく、LPSの
好中球を刺激する能力も阻害すると判断された。特に、
BPIは可溶性LPSに結合し、その好中球を活性化する能力
を中和することが示された。従って本発明は、グラム陰
性細胞敗血症におけるLPS毒性を治療する方法を提供す
る。
発明の要約 本発明は、細胞のリポ多糖（LPS）媒介刺激を阻害す
る方法を提供する。この方法は、細胞刺激量のリポ多糖
の存在下に細胞を、細胞刺激を阻害するのに有効な量の
殺菌性／透過性増強タンパク質（BPI）と接触させるこ
とからなる。
る方法を提供する。この方法は、細胞刺激量のリポ多糖
の存在下に細胞を、細胞刺激を阻害するのに有効な量の
殺菌性／透過性増強タンパク質（BPI）と接触させるこ
とからなる。
本発明は更に、グラム陰性細菌感染を治療する方法を
も提供する。この方法は、細菌感染体を、細胞のLPS媒
介刺激を阻害し、それによって細菌感染を治療するのに
有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリペ
プチド類縁体と接触させすることからなる。
も提供する。この方法は、細菌感染体を、細胞のLPS媒
介刺激を阻害し、それによって細菌感染を治療するのに
有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリペ
プチド類縁体と接触させすることからなる。
更に本発明は、グラム陰性細菌感染を治療するための
組成物を提供する。この組成物は、細胞のLPS媒介刺激
を阻害するのに有効な量の精製BPIまたはその生物学的
に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有す
る。
組成物を提供する。この組成物は、細胞のLPS媒介刺激
を阻害するのに有効な量の精製BPIまたはその生物学的
に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有す
る。
本発明は更に、グラム陰性細菌感染によって生じた内
毒素関連ショックを患った被検体を治療する方法であっ
て、該被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素
関連ショックを緩和するように被検体を治療するのに有
効な量のBPIを投与することからなる方法を提供する。
毒素関連ショックを患った被検体を治療する方法であっ
て、該被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素
関連ショックを緩和するように被検体を治療するのに有
効な量のBPIを投与することからなる方法を提供する。
更に本発明は、散在性血管内凝固を伴なう疾患を有す
る被検体を治療する方法をも提供する。この方法は、被
検体に、散在性血管内凝固の症状を緩和し、それによっ
て被検体を治療するのに有効な量のBPIを投与すること
からなる。
る被検体を治療する方法をも提供する。この方法は、被
検体に、散在性血管内凝固の症状を緩和し、それによっ
て被検体を治療するのに有効な量のBPIを投与すること
からなる。
更に本発明は、グラム陰性細菌感染によって生じた内
毒素血症を患った被検体を治療する方法であって、被検
体に、グラム陰性細胞感染を撲滅し、内毒素血症の被検
体を治療するのに有効な量のBPIを投与することからな
る方法をも提供する。
毒素血症を患った被検体を治療する方法であって、被検
体に、グラム陰性細胞感染を撲滅し、内毒素血症の被検
体を治療するのに有効な量のBPIを投与することからな
る方法をも提供する。
本明細書中、内毒素血症（endotoxemia）とは、血液
が体細胞によって産生されるかまたは微生物即ちグラム
陰性細菌から生じる毒性産物を含む状態を意味する。
が体細胞によって産生されるかまたは微生物即ちグラム
陰性細菌から生じる毒性産物を含む状態を意味する。
本発明は更に、グラム陰性細菌感染によって生じた内
毒素関連貧血を患った被検体を治療する方法であって、
被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素関連貧
血を緩和するように被検体を治療するのに有効な量のBP
Iを投与することからなる方法を提供する。
毒素関連貧血を患った被検体を治療する方法であって、
被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素関連貧
血を緩和するように被検体を治療するのに有効な量のBP
Iを投与することからなる方法を提供する。
本発明は更に、グラム陰性細菌感染によって生じた内
毒素関連白血球減少症を患った被検体をも治療する方法
を提供する。この方法は、被検体に、グラム陰性細菌感
染を撲滅し、内毒素関連白血球減少症を緩和するように
被検体を治療するのに有効な量のBPIを投与することか
らなる。更に本発明は、グラム陰性細菌感染によって生
じた内毒素関連血小板減少症を患った被検体を治療する
方法であって、被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅
し、内毒素関連血小板減少症を緩和するように被検体を
治療するのに有効な量のBPIを投与することからなる方
法をも提供する。
毒素関連白血球減少症を患った被検体をも治療する方法
を提供する。この方法は、被検体に、グラム陰性細菌感
染を撲滅し、内毒素関連白血球減少症を緩和するように
被検体を治療するのに有効な量のBPIを投与することか
らなる。更に本発明は、グラム陰性細菌感染によって生
じた内毒素関連血小板減少症を患った被検体を治療する
方法であって、被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅
し、内毒素関連血小板減少症を緩和するように被検体を
治療するのに有効な量のBPIを投与することからなる方
法をも提供する。
本発明は更に、発熱物質を阻害する方法であって、発
熱物質を阻害するような量のBPIを発熱物質に接触させ
ることからなる方法をも提供する。
熱物質を阻害するような量のBPIを発熱物質に接触させ
ることからなる方法をも提供する。
更に本発明は、細胞によりリポ多糖媒介腫瘍壊死因子
産生を阻害する方法であって、細胞刺激量のリポ多糖の
存在下で細胞を、細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子
産生を阻害するのに有効な量のBPIと接触させることか
らなる方法をも含む。
産生を阻害する方法であって、細胞刺激量のリポ多糖の
存在下で細胞を、細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子
産生を阻害するのに有効な量のBPIと接触させることか
らなる方法をも含む。
本発明は更に、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊
死因子産生を阻害する方法であって、グラム陰性細菌
を、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子細菌を
阻害するのに有効な量のBPIと接触させることからなる
方法をも含む。
死因子産生を阻害する方法であって、グラム陰性細菌
を、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子細菌を
阻害するのに有効な量のBPIと接触させることからなる
方法をも含む。
更に本発明は、内毒素関連ショックを患った被検体を
治療するための組成物をも含む。この組成物は、内毒素
関連ショックの被検体を治療するのに有効な量の精製BP
Iまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適
当な担体とを含有する。
治療するための組成物をも含む。この組成物は、内毒素
関連ショックの被検体を治療するのに有効な量の精製BP
Iまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適
当な担体とを含有する。
更に本発明は、散在性血管内凝固を患った被検体を治
療するための組成物をも含む。この組成物は、散在性血
管内凝固を患った被検体を治療するのに有効な量の精製
BPIまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と
適当な担体とを含有する。
療するための組成物をも含む。この組成物は、散在性血
管内凝固を患った被検体を治療するのに有効な量の精製
BPIまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と
適当な担体とを含有する。
本発明は更に、内毒素血症を患った被検体を治療する
のに有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポ
リペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、内毒素血
症の被検体を治療するための組成物をも含む。
のに有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポ
リペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、内毒素血
症の被検体を治療するための組成物をも含む。
本発明は更に、内毒関連貧血を患った被検体を治療す
るのに有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性な
ポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、内毒素
関連貧血の被検体を治療するための組成物をも提供す
る。
るのに有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性な
ポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、内毒素
関連貧血の被検体を治療するための組成物をも提供す
る。
更に本発明は、内毒素関連白血球減少症を患った被検
体を治療するための組成物を提供する。この組成物は、
内毒素関連白血球減少症の被検体を治療するのに有効な
量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリペプチド
類縁体と適当な担当とを含有する。更に、内毒素関連血
小板減少症の被検体を治療するための組成物も提供す
る。この組成物は、内毒素関連血小板減少症の被検体を
治療するのに有効な量の精製BPIまたはその生物学的に
活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する。
体を治療するための組成物を提供する。この組成物は、
内毒素関連白血球減少症の被検体を治療するのに有効な
量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリペプチド
類縁体と適当な担当とを含有する。更に、内毒素関連血
小板減少症の被検体を治療するための組成物も提供す
る。この組成物は、内毒素関連血小板減少症の被検体を
治療するのに有効な量の精製BPIまたはその生物学的に
活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する。
本明細書中、内毒素関連白血球減少症とは、その兆候
が末梢血液中の白血球が正常値以下に減少することに現
れるグラム陰性細菌感染に伴なう状態である。更に本明
細書中、内毒素関連血小板減少症とは、その兆候が血小
板が正常値以下に低下することに現れるグラム陰性細菌
感染に関連する状態である。
が末梢血液中の白血球が正常値以下に減少することに現
れるグラム陰性細菌感染に伴なう状態である。更に本明
細書中、内毒素関連血小板減少症とは、その兆候が血小
板が正常値以下に低下することに現れるグラム陰性細菌
感染に関連する状態である。
更に本発明は、細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子
産生を阻害するのに有効な量の精製BPIまたはその生物
学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有
する、細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害
するための組成物をも提供する。更に本発明は、細胞に
よるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するの
に有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリ
ペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、細胞による
グラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するための
組成物をも提供する。
産生を阻害するのに有効な量の精製BPIまたはその生物
学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有
する、細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害
するための組成物をも提供する。更に本発明は、細胞に
よるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するの
に有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリ
ペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、細胞による
グラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するための
組成物をも提供する。
更に本発明は、発熱物質を阻害するための組成物をも
提供する。この組成物は、発熱物質を阻害するのに有効
な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリペプチ
ド類縁体を含有する。
提供する。この組成物は、発熱物質を阻害するのに有効
な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリペプチ
ド類縁体を含有する。
更に本発明は、被検体におけるグラム陰性細菌感染に
伴なう症状を予防する方法であって、被検体に、グラム
陰性細菌感染を予防し、それによって該症状を予防する
のに有効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質を投与す
ることからなる方法を提供する。
伴なう症状を予防する方法であって、被検体に、グラム
陰性細菌感染を予防し、それによって該症状を予防する
のに有効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質を投与す
ることからなる方法を提供する。
更に、被検体における散在性血管内凝固を伴なう疾患
を予防する方法であって、被検体に、散在性血管内凝固
の症状を予防するのに有効な量の殺菌性／透過性増強タ
ンパク質を投与し、それによって疾患を予防することか
らなる方法も提供する。
を予防する方法であって、被検体に、散在性血管内凝固
の症状を予防するのに有効な量の殺菌性／透過性増強タ
ンパク質を投与し、それによって疾患を予防することか
らなる方法も提供する。
最後に本発明は、精製殺菌性／透過性増強タンパク質
を単離及び回収する方法であって、（ａ）殺菌性／透過
性増強タンパク質の粗試料を調製し、（ｂ）その粗試料
を、脱発熱物質溶液（de−pyrogenated solution）を使
用するカラムクロマトグラフィーによって分離し、精製
殺菌性／透過性増強タンパク質を単離及び回収すること
からなる方法をも提供する。
を単離及び回収する方法であって、（ａ）殺菌性／透過
性増強タンパク質の粗試料を調製し、（ｂ）その粗試料
を、脱発熱物質溶液（de−pyrogenated solution）を使
用するカラムクロマトグラフィーによって分離し、精製
殺菌性／透過性増強タンパク質を単離及び回収すること
からなる方法をも提供する。
図面の簡単な説明 図1a:新鮮に単離した好中球におけるCR1の平均蛍光強度
をFACS分析によって測定した。試料及び方法のセクショ
ンに記載したように細胞を種々の量のE.Coll0111:B4LPS
で刺激した。平均蛍光強度は個体間で変化するので、デ
ータは、認められた最大応答の百分率（％）で表わし
た。図のデータは３回の実験の平均＋／−標準誤差を表
わしている。
をFACS分析によって測定した。試料及び方法のセクショ
ンに記載したように細胞を種々の量のE.Coll0111:B4LPS
で刺激した。平均蛍光強度は個体間で変化するので、デ
ータは、認められた最大応答の百分率（％）で表わし
た。図のデータは３回の実験の平均＋／−標準誤差を表
わしている。
図1b:好中球刺激を試験する前に、0111:B4 LPS（10ng/m
l）を、種々の量の粗アズール好性抽出物と一緒に37℃
で30分間プレインキュベートした。図のデータは、代表
実験の二重反復試験の平均＋／−標準誤差を表わしてい
る。値は、LPSのみに対する応答の％阻害で表されてい
る。
l）を、種々の量の粗アズール好性抽出物と一緒に37℃
で30分間プレインキュベートした。図のデータは、代表
実験の二重反復試験の平均＋／−標準誤差を表わしてい
る。値は、LPSのみに対する応答の％阻害で表されてい
る。
図2:粗アズール好性抽出物を逆相HPLCによって分離し
た。各ピークを手作業で回収し、アミノ酸分析によって
タンパク質濃度を決定した。各ピークのアリコート（１
μｇ）を低内毒素BSAの存在下に乾燥し、発熱物質非含
有0.1％酢酸の存在下に再度乾燥した。図のデータは、
代表実験の二重反復試験の平均＋／−標準誤差を表わし
ている。
た。各ピークを手作業で回収し、アミノ酸分析によって
タンパク質濃度を決定した。各ピークのアリコート（１
μｇ）を低内毒素BSAの存在下に乾燥し、発熱物質非含
有0.1％酢酸の存在下に再度乾燥した。図のデータは、
代表実験の二重反復試験の平均＋／−標準誤差を表わし
ている。
図3a:まず分子ふるいにかけ、次いでカチオン交換HPLC
によって精製したBPIを逆相HPLCにかけ、フラクション
をLPS阻害活性について試験した。
によって精製したBPIを逆相HPLCにかけ、フラクション
をLPS阻害活性について試験した。
図3b:データは、フラクション20,21及び22の阻害活性に
ついての2X精製材料のRPLCプロフィールとSDS−PAGE分
析とを示す。
ついての2X精製材料のRPLCプロフィールとSDS−PAGE分
析とを示す。
図4:0111:B4 LPS（10ng/ml）を種々の量の（Ａ）精製BP
I及び（Ｂ）ポリミキシンＢと一緒にプレインキュベー
トし、好中球刺激活性について試験した。２つの実験の
結果は、好中球における補体レセプター発現の阻害を複
製試料の標準誤差で示す。
I及び（Ｂ）ポリミキシンＢと一緒にプレインキュベー
トし、好中球刺激活性について試験した。２つの実験の
結果は、好中球における補体レセプター発現の阻害を複
製試料の標準誤差で示す。
図5:（ａ）棒グラフは、FMLP、TNF及びLPSで刺激した好
中球の表面におけるBPI発現を示す。（ｂ）棒グラフ
は、ヒト好中球細胞表面の発現の最大CR3アップレギュ
レーションを示す。
中球の表面におけるBPI発現を示す。（ｂ）棒グラフ
は、ヒト好中球細胞表面の発現の最大CR3アップレギュ
レーションを示す。
図6:BPI及びポリミキシンＢが、LPSに対する好中球応答
を時間＝０において70％以上阻害したことを示す棒グラ
フ。
を時間＝０において70％以上阻害したことを示す棒グラ
フ。
図7:LALアッセイにおいてBPIがLPS活性を阻害すること
を示すグラフ。
を示すグラフ。
図8:カチオン交換HPLC（ステップ１）によって分画され
たアズール好性顆粒抽出物を示すクロマトグラム。点線
はLPS阻害活性を示し、実線はタンパク質吸収を示す。
たアズール好性顆粒抽出物を示すクロマトグラム。点線
はLPS阻害活性を示し、実線はタンパク質吸収を示す。
図9:カチオン交換HPLC（ステップ）によって分画された
アザール好性顆粒抽出物を示すクロマトグラム。点線は
LPS阻害活性を示し、実線はタンパク質吸収を示す。
アザール好性顆粒抽出物を示すクロマトグラム。点線は
LPS阻害活性を示し、実線はタンパク質吸収を示す。
図10:分子ふるいHPLC（ステップ３）によって分画され
たアザール好性顆粒抽出物を示すクロマトグラム。点線
はLPS阻害活性を示し、実線はタンパク質吸収を示す。
たアザール好性顆粒抽出物を示すクロマトグラム。点線
はLPS阻害活性を示し、実線はタンパク質吸収を示す。
図11:アズール好性顆粒抽出物、沈澱抽出物及び上記３
つのクロマトグラフィーステップから得られたフラクシ
ョンプールのSDS−PAGEゲル。
つのクロマトグラフィーステップから得られたフラクシ
ョンプールのSDS−PAGEゲル。
図12:総タンパク質の97％を占める単一主ピークを同定
する微細孔逆相HPLCによる精製BPIの分析。
する微細孔逆相HPLCによる精製BPIの分析。
図13:10ng/mlのLPSに対する好中球応答のBPIによる阻害
を示す折れ線グラフ。
を示す折れ線グラフ。
図14:BPIがLPSに直接結合することを示す折れ線グラ
フ。
フ。
図15:固定されたLPSへのBPIの結合がポリミキシンＢに
よって阻害されたことを示す折れ線グラフ。
よって阻害されたことを示す折れ線グラフ。
図16:血漿の存在下にBPIがLPSに結合することを示す折
れ線グラフ。
れ線グラフ。
図17:血清の存在下にBPIがLPSに結合することを示す折
れ線グラフ。
れ線グラフ。
図18:BPIが、LPSに対する発熱物質の応答を調節するこ
とを示す棒グラフ。
とを示す棒グラフ。
発明の詳細 本発明は、細胞のリポ多糖（LPS）媒介刺激を阻害す
る方法を提供する。この方法は、細胞刺激量のリポ多糖
の存在下に細胞を、細胞刺激を阻害するのに有効な量の
BPIと接触させることからなる。
る方法を提供する。この方法は、細胞刺激量のリポ多糖
の存在下に細胞を、細胞刺激を阻害するのに有効な量の
BPIと接触させることからなる。
細胞刺激を阻害するのに有効なBPIの量は、存在する
条件に従って変化する。細胞刺激を阻害するのに有効な
量は好ましくは約100ng〜約100mgであり、最も好ましい
量は約10μｇ〜約10mgである。
条件に従って変化する。細胞刺激を阻害するのに有効な
量は好ましくは約100ng〜約100mgであり、最も好ましい
量は約10μｇ〜約10mgである。
好中球及び単球は、本発明の適用に関して最も重要な
細胞である。しかしながら、内皮細胞のような他の細胞
もLPSによって影響を受け、本発明に使用することがで
きる。
細胞である。しかしながら、内皮細胞のような他の細胞
もLPSによって影響を受け、本発明に使用することがで
きる。
好ましい実施態様においては精製BPIを使用する。ま
たBPIは組換えBPI及びその生物学的に活性なポリペプチ
ド類縁体でもよい。１つの適当なBPIの類縁体は、分子
量約25kDを有し、BPIのＮ末端アミノ酸に対応するポリ
ペプチドからなる。
たBPIは組換えBPI及びその生物学的に活性なポリペプチ
ド類縁体でもよい。１つの適当なBPIの類縁体は、分子
量約25kDを有し、BPIのＮ末端アミノ酸に対応するポリ
ペプチドからなる。
本明細書中、殺菌性／透過性増強タンパク質の生物学
的に活性なポリペプチド類縁体とは、無傷の又は天然の
殺菌性／透過性増強タンパク質と実質的に同じアミノ酸
配列を有し、従って同じ生物学的活性を有するポリペプ
チドを意味する。
的に活性なポリペプチド類縁体とは、無傷の又は天然の
殺菌性／透過性増強タンパク質と実質的に同じアミノ酸
配列を有し、従って同じ生物学的活性を有するポリペプ
チドを意味する。
本発明は更に、グラム陰性細菌感染を治療する方法を
も提供する。この方法は、細菌感染体を、細胞のLPS媒
介刺激を阻害し、それによって細菌感染を治療するのに
十分な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリペ
プチド類縁体と接触させることからなる。
も提供する。この方法は、細菌感染体を、細胞のLPS媒
介刺激を阻害し、それによって細菌感染を治療するのに
十分な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリペ
プチド類縁体と接触させることからなる。
グラム陰性細菌感染として、死を招く最も一般的な院
内感染であるグラム陰性細菌敗血症が挙げられることは
当業者には明らかであろう。一般にグラム陰性細菌敗血
症は、敗血症を伴なうまたは伴わない発熱原性微生物に
よる感染から生じる重症の毒性有熱状態である。
内感染であるグラム陰性細菌敗血症が挙げられることは
当業者には明らかであろう。一般にグラム陰性細菌敗血
症は、敗血症を伴なうまたは伴わない発熱原性微生物に
よる感染から生じる重症の毒性有熱状態である。
グラム陰性細菌感染は、内毒素ショックまたは炎症状
態を伴ない得る。炎症状態は例えば、散在性血管内凝固
（DIC）、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）または腎不全を
伴ない得る。
態を伴ない得る。炎症状態は例えば、散在性血管内凝固
（DIC）、成人呼吸窮迫症候群（ARDS）または腎不全を
伴ない得る。
好しい実施態様においてはグラム陰性細菌感染は被検
体、最も好ましくはヒトに存在する。
体、最も好ましくはヒトに存在する。
更に本発明は、グラム陰性細菌感染を治療するための
組成物をも提供する。この組成物は、細胞のLPS媒介刺
激を阻害するのに有効な量の精製BPIまたはその生物学
的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有す
る。
組成物をも提供する。この組成物は、細胞のLPS媒介刺
激を阻害するのに有効な量の精製BPIまたはその生物学
的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有す
る。
好ましい実施態様においては、BPIまたはその生物学
的に活性なポリペプチド類縁体は医薬的に許容可能な担
体中に含有させて投与される。医薬的に許容可能な担体
は、無菌溶液、錠剤、被膜錠剤及びカプセルのような任
意の標準的な医薬担体を包含する。典型的にはこのよう
な担体は、澱粉、ミルク、糖、所定のタイプのクレー、
ゼラチン、stensic acid、タルク、植物脂肪もしくは
油、ゴム、グリコールといった賦形剤または他の公知の
賦形剤を含む。かかる担体は更に香料及び着色剤または
他の成分を含むこともできる。このような担体を含有す
る組成物は、よく知られた通常の方法で処方される。し
かしながら、好中球または単球のLPS媒介刺激を抑制す
るのに有効な量のBPIまたはその生物学的に活性なポリ
ペプチド類縁体を含有する組成物はこれまで知られてい
ない。
的に活性なポリペプチド類縁体は医薬的に許容可能な担
体中に含有させて投与される。医薬的に許容可能な担体
は、無菌溶液、錠剤、被膜錠剤及びカプセルのような任
意の標準的な医薬担体を包含する。典型的にはこのよう
な担体は、澱粉、ミルク、糖、所定のタイプのクレー、
ゼラチン、stensic acid、タルク、植物脂肪もしくは
油、ゴム、グリコールといった賦形剤または他の公知の
賦形剤を含む。かかる担体は更に香料及び着色剤または
他の成分を含むこともできる。このような担体を含有す
る組成物は、よく知られた通常の方法で処方される。し
かしながら、好中球または単球のLPS媒介刺激を抑制す
るのに有効な量のBPIまたはその生物学的に活性なポリ
ペプチド類縁体を含有する組成物はこれまで知られてい
ない。
上記方法において組成物の投与は、これらに限定はさ
れないが、経口、静脈内、筋肉内及び皮下投与を含む任
意の公知の方法によって行なうことができる。
れないが、経口、静脈内、筋肉内及び皮下投与を含む任
意の公知の方法によって行なうことができる。
本発明の方法の実施に際しては、該組成物に配合され
るBPIまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体
の量は広範囲に変えることができる。正確な量を決定す
る方法は当業者には公知であり、特に治療される被検
体、特定の医薬歴、使用する投与経路及び組成物を投与
する頻度に従う。
るBPIまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体
の量は広範囲に変えることができる。正確な量を決定す
る方法は当業者には公知であり、特に治療される被検
体、特定の医薬歴、使用する投与経路及び組成物を投与
する頻度に従う。
本発明は更に、グラム陰性細菌感染によって生じた内
毒素関連ショックを患った被検体を治療する方法であっ
て、被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素関
連ショックを緩和するように被検体を治療するのに有効
な量のBPIを投与することからなる方法を提供する。本
明細書中、内毒素とは、微生物、主にグラム陰性細菌の
細胞壁に認められるリポ多糖複合体を含む物質である。
毒素関連ショックを患った被検体を治療する方法であっ
て、被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素関
連ショックを緩和するように被検体を治療するのに有効
な量のBPIを投与することからなる方法を提供する。本
明細書中、内毒素とは、微生物、主にグラム陰性細菌の
細胞壁に認められるリポ多糖複合体を含む物質である。
更に本発明は、散在性血管内凝固を伴なう疾患の被検
体を治療する方法をも提供する。この方法は、被検体
に、散在性血管内凝固の症状を緩和し、それによって被
検体を治療するのに有効な量のBPIを投与することから
なる。本明細書中、散在性血管内凝固なる用語は、全身
性フィブリン沈着及び血栓症、出血、更には凝固因子の
喪失を伴って凝固因子が加速度的に消費される血液凝固
機構の合併症である。更に、散在性血管内凝固は急性ま
たは慢性であり得る。
体を治療する方法をも提供する。この方法は、被検体
に、散在性血管内凝固の症状を緩和し、それによって被
検体を治療するのに有効な量のBPIを投与することから
なる。本明細書中、散在性血管内凝固なる用語は、全身
性フィブリン沈着及び血栓症、出血、更には凝固因子の
喪失を伴って凝固因子が加速度的に消費される血液凝固
機構の合併症である。更に、散在性血管内凝固は急性ま
たは慢性であり得る。
更に本発明は、グラム陰性細菌感染によって生じた内
毒素血症を患った被検体を治療する方法であって、被検
体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素血症の被検
体を治療するのに有効の量のBPIを投与することからな
る方法をも提供する。
毒素血症を患った被検体を治療する方法であって、被検
体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素血症の被検
体を治療するのに有効の量のBPIを投与することからな
る方法をも提供する。
本明細書中、内毒素血症とは、血液が、体細胞によっ
て産生されるかまたは微生物即ちグラム陰性細菌から生
じる毒性産物を含む状態を意味する。
て産生されるかまたは微生物即ちグラム陰性細菌から生
じる毒性産物を含む状態を意味する。
本発明は更に、グラム陰性細菌感染によって生じた内
毒素関連貧血を患った被検体を治療する方法であって、
被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素関連貧
血を緩和するように被検体を治療するのに有効な量のBP
Iを投与ることからなる方法をも提供する。
毒素関連貧血を患った被検体を治療する方法であって、
被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅し、内毒素関連貧
血を緩和するように被検体を治療するのに有効な量のBP
Iを投与ることからなる方法をも提供する。
本発明は更に、グラム陰性細菌感染によって生じた内
毒素関連白血球減少症を患った被検体を治療する方法を
も提供する。この方法は、被検体に、グラム陰性細菌感
染を撲滅し、内毒素関連白血球減少症を緩和するように
被検体を治療するのに有効な量のBPIを投与することか
らなる。更に本発明は、グラム陰性細菌感染によって生
じた内毒素関連血小板減少症を患った被検体を治療する
方法であって、被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅
し、内毒素関連血小板減少症を緩和するように被検体を
治療するのに有効な量のBPIを投与することからなる方
法をも含む。
毒素関連白血球減少症を患った被検体を治療する方法を
も提供する。この方法は、被検体に、グラム陰性細菌感
染を撲滅し、内毒素関連白血球減少症を緩和するように
被検体を治療するのに有効な量のBPIを投与することか
らなる。更に本発明は、グラム陰性細菌感染によって生
じた内毒素関連血小板減少症を患った被検体を治療する
方法であって、被検体に、グラム陰性細菌感染を撲滅
し、内毒素関連血小板減少症を緩和するように被検体を
治療するのに有効な量のBPIを投与することからなる方
法をも含む。
本発明は更に、発熱物質を阻害する方法であって、発
熱物質を阻害するような量のBPIを発熱物質に接触させ
ることからなる方法をも提供する。本明細書中、発熱物
質とは全ての熱生成物質であり、外因性発熱物質は細菌
特にグラム陰性細菌の内毒素を含み、内因性発熱物質
は、発熱を生起するために脳中枢に作用する単核白血球
のような細胞から誘導される熱不安定性タンパク質であ
る。
熱物質を阻害するような量のBPIを発熱物質に接触させ
ることからなる方法をも提供する。本明細書中、発熱物
質とは全ての熱生成物質であり、外因性発熱物質は細菌
特にグラム陰性細菌の内毒素を含み、内因性発熱物質
は、発熱を生起するために脳中枢に作用する単核白血球
のような細胞から誘導される熱不安定性タンパク質であ
る。
更に本発明は、細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子
産生を阻害する方法であって、細胞刺激量のリポ多糖の
存在下で細胞を、細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子
を阻害するのに有効な量のBPIと接触させることからな
る方法をも含む。
産生を阻害する方法であって、細胞刺激量のリポ多糖の
存在下で細胞を、細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子
を阻害するのに有効な量のBPIと接触させることからな
る方法をも含む。
本発明は更に、細胞によるグラム陰性細胞媒介腫瘍壊
死因子産生を阻害する方法であって、グラム陰性細菌
を、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を
阻害するのに有効な量のBPIと接触させることからなる
方法をも含む。
死因子産生を阻害する方法であって、グラム陰性細菌
を、細胞によるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を
阻害するのに有効な量のBPIと接触させることからなる
方法をも含む。
細胞刺激を阻害するのに有効な量のBPIは存在する条
件に従って変化する。細胞刺激を阻害するのに有効な量
は好ましくは約100ng〜約100mgであり、最も好ましい量
は約10μｇから約10mgである。
件に従って変化する。細胞刺激を阻害するのに有効な量
は好ましくは約100ng〜約100mgであり、最も好ましい量
は約10μｇから約10mgである。
上記方法においては、BPIは組換えＢまたはその生物
学的に活性なポリペプチド類縁体からなる。更にBPIの
生物学的に活性なポリペプチド類縁体は、分子量約25kD
を有し、BPIのＮ末端アミノ酸配列に対応するポリペプ
チドからなる。
学的に活性なポリペプチド類縁体からなる。更にBPIの
生物学的に活性なポリペプチド類縁体は、分子量約25kD
を有し、BPIのＮ末端アミノ酸配列に対応するポリペプ
チドからなる。
更に本発明は、内毒素関連ショックを患った被検体を
治療するための組成物をも含む。この組成物は、内毒素
関連ショックを患った被検体を治療するのに有効な量の
精製BPIまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁
体と適当な担体とを含有する。
治療するための組成物をも含む。この組成物は、内毒素
関連ショックを患った被検体を治療するのに有効な量の
精製BPIまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁
体と適当な担体とを含有する。
更に本発明は、散在性血管内凝固を患った被検体を治
療するための組成物をも含む。この組成物は、散在性血
管内凝固を患った被検体を治療するのに有効な量の精製
BPIまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と
適当な担体とを含有する。
療するための組成物をも含む。この組成物は、散在性血
管内凝固を患った被検体を治療するのに有効な量の精製
BPIまたはその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と
適当な担体とを含有する。
本発明は更に、内毒素血症を患った被検体を治療する
のに有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポ
リペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、内毒素血
症の被検体を治療するための組成物をも含む。
のに有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポ
リペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、内毒素血
症の被検体を治療するための組成物をも含む。
本発明は更に、内毒素関連貧血を患った被検体を治療
するのに有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性
なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、内毒
素関連貧血の被検体を治療するための組成物を提供す
る。
するのに有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性
なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、内毒
素関連貧血の被検体を治療するための組成物を提供す
る。
更に本発明は、内毒素関連白血球減少症を患った被検
体を治療するための組成物をも提供する。この組成物
は、内毒素関連白血球減少症を患った被検体を治療する
のに有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポ
リペプチド類縁体と適当な担体とを含有する。更に、内
毒素関連血小板減少症を患った被検体を治療するための
組成物も提供される。この組成物は、内毒素関連血小板
減少症の被検体を治療するのに有効な量の精製BPIまた
はその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担
体とを含有する。
体を治療するための組成物をも提供する。この組成物
は、内毒素関連白血球減少症を患った被検体を治療する
のに有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポ
リペプチド類縁体と適当な担体とを含有する。更に、内
毒素関連血小板減少症を患った被検体を治療するための
組成物も提供される。この組成物は、内毒素関連血小板
減少症の被検体を治療するのに有効な量の精製BPIまた
はその生物学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担
体とを含有する。
更に本発明は、細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子
産生を阻害するのに有効な量の精製BPIまたはその生物
学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有
する、細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害
するための組成物をも提供する。更に本発明は、細胞に
よるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するの
に有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリ
ペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、細胞による
グラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するための
組成物をも提供する。
産生を阻害するのに有効な量の精製BPIまたはその生物
学的に活性なポリペプチド類縁体と適当な担体とを含有
する、細胞によるリポ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害
するための組成物をも提供する。更に本発明は、細胞に
よるグラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するの
に有効な量の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリ
ペプチド類縁体と適当な担体とを含有する、細胞による
グラム陰性細菌媒介腫瘍壊死因子産生を阻害するための
組成物をも提供する。
本発明は、発熱物質を阻害するための組成物をも提供
する。この組成物は、発熱物質を阻害するのに有効な量
の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリペプチド類
縁体を含有する。
する。この組成物は、発熱物質を阻害するのに有効な量
の精製BPIまたはその生物学的に活性なポリペプチド類
縁体を含有する。
更に本発明は、被検体におけるグラム陰性細菌感染に
伴なう症状を予防する方法であって、被検体に、グラム
陰性細菌感染を予防し、それによって該症状を予防する
のに有効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質を投与す
ることからなる方法を提供する。前述の方法において
は、症状は、内毒素関連ショック、内毒素血症、内毒素
関連貧血、内毒素関連白血球減少症または内毒素関連血
小板減少症からなる群から選択されるいずれかの症状で
ある。
伴なう症状を予防する方法であって、被検体に、グラム
陰性細菌感染を予防し、それによって該症状を予防する
のに有効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質を投与す
ることからなる方法を提供する。前述の方法において
は、症状は、内毒素関連ショック、内毒素血症、内毒素
関連貧血、内毒素関連白血球減少症または内毒素関連血
小板減少症からなる群から選択されるいずれかの症状で
ある。
更に、被検体における散在性血管内凝固を伴なう疾患
を予防する方法であって、被検体に、散在性血管内凝固
の症状を予防し、それによって疾患を予防するのに有効
な量の殺菌性／透過性増強タンパク質を投与することか
らなる方法も提供される。
を予防する方法であって、被検体に、散在性血管内凝固
の症状を予防し、それによって疾患を予防するのに有効
な量の殺菌性／透過性増強タンパク質を投与することか
らなる方法も提供される。
最後に本発明は、精製殺菌性／透過性増強タンパク質
を単離及び回収する方法であって、（ａ）殺菌性／透過
性増強タンパク質の粗試料を調製し、（ｂ）その粗試料
を、脱発熱物質溶液を使用するカラムクロマトグラフィ
ーによって分離し、精製殺菌性／透過性増強タンパク質
を単離及び回収することからなる方法をも提供する。更
にこの方法においては殺菌性／透過性増強タンパク質
は、天然の殺菌性／透過性増強タンパク質またはその生
物学的に活性なポリペプチド類縁体からなる。更に殺菌
性／透過性増強タンパク質の生物学的に活性なポリペプ
チド類縁体は、分子量約25kDを有し、殺菌性／透過性増
強タンパク質のＮ末端アミノ酸配列に対応するポリペプ
チドからなる。本発明者らは、BPIの生物学的活性レベ
ルが、BPIを得るのに使用した方法に従って変化するこ
とを見い出した。脱発熱物質化されたBPI、即ち脱発熱
物質溶液を使用して上記方法によって単離及び回収され
たBPIは、発熱物質含有のBPIよりはるかに高い生物学的
活性レベルを示すようである（表５及び図4A）。
を単離及び回収する方法であって、（ａ）殺菌性／透過
性増強タンパク質の粗試料を調製し、（ｂ）その粗試料
を、脱発熱物質溶液を使用するカラムクロマトグラフィ
ーによって分離し、精製殺菌性／透過性増強タンパク質
を単離及び回収することからなる方法をも提供する。更
にこの方法においては殺菌性／透過性増強タンパク質
は、天然の殺菌性／透過性増強タンパク質またはその生
物学的に活性なポリペプチド類縁体からなる。更に殺菌
性／透過性増強タンパク質の生物学的に活性なポリペプ
チド類縁体は、分子量約25kDを有し、殺菌性／透過性増
強タンパク質のＮ末端アミノ酸配列に対応するポリペプ
チドからなる。本発明者らは、BPIの生物学的活性レベ
ルが、BPIを得るのに使用した方法に従って変化するこ
とを見い出した。脱発熱物質化されたBPI、即ち脱発熱
物質溶液を使用して上記方法によって単離及び回収され
たBPIは、発熱物質含有のBPIよりはるかに高い生物学的
活性レベルを示すようである（表５及び図4A）。
以下、実験の詳細及び結果のセクションにおいて本発
明を説明する。これらのセクションは本発明の理解を助
けるために記載するものであって、請求の範囲に記載し
た本発明をいかようにも制限するのでもないし、また制
限されるべきではない。
明を説明する。これらのセクションは本発明の理解を助
けるために記載するものであって、請求の範囲に記載し
た本発明をいかようにも制限するのでもないし、また制
限されるべきではない。
実施例 実施例１ 材料及び方法： 試薬 リボ多糖……E.Coli0111:B4,S.typhimurium野生型由
来； 糖脂質……S.typhimurium RE変異株由来； LipidA……S.typhimurium Re変異株由来； LPS……P.aeruginosa由来（RIBI Immunochem Researc
h,Inc.,Hamilton,MT製）； Fmet−Leu−Phe（FMLP）及びポリミキシンＢサルフェ
ート……Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO製； Hank's平衡塩類溶液（HBSS）［カルシウム、マグネシ
ウム及びフェノールレッドを含まない］……Hazelton R
esearch Products,Denver,PA製； Ficoll−Paque,Percoll及びMarcodex……Pharmacia I
nc.,Piscataway,NJ製； TNF及び抗TNF……Endogen,Boston MA製； フルオレセイン結合ヤギ抗マウスIgG……TAGO Inc.,B
urlingame,CA製； IgG1対照抗体……Coulter Immunology,Hialeah,FL
製； フィコエリトリン（Phycoerythrin;PE）を結合した抗
CR3（Leu−15）及びIgG2a対照……Becton Dickinson,Mo
untain View,CA製； 抗CR1モノクローナル抗体,Yz−１……Dr.Rick Jack
（Harvard University）から供与。
来； 糖脂質……S.typhimurium RE変異株由来； LipidA……S.typhimurium Re変異株由来； LPS……P.aeruginosa由来（RIBI Immunochem Researc
h,Inc.,Hamilton,MT製）； Fmet−Leu−Phe（FMLP）及びポリミキシンＢサルフェ
ート……Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO製； Hank's平衡塩類溶液（HBSS）［カルシウム、マグネシ
ウム及びフェノールレッドを含まない］……Hazelton R
esearch Products,Denver,PA製； Ficoll−Paque,Percoll及びMarcodex……Pharmacia I
nc.,Piscataway,NJ製； TNF及び抗TNF……Endogen,Boston MA製； フルオレセイン結合ヤギ抗マウスIgG……TAGO Inc.,B
urlingame,CA製； IgG1対照抗体……Coulter Immunology,Hialeah,FL
製； フィコエリトリン（Phycoerythrin;PE）を結合した抗
CR3（Leu−15）及びIgG2a対照……Becton Dickinson,Mo
untain View,CA製； 抗CR1モノクローナル抗体,Yz−１……Dr.Rick Jack
（Harvard University）から供与。
アズール好性顆粒の単離及び抽出 顆粒球を地方の血液銀行から得たバフィーコートから
単離した。バフィーコートをHBSSで３〜４倍に希釈し、
顆粒球を単核細胞から64％パーコールで遠心分離した。
ペレットをジイソプロピルフルオロホスフェート（DF
P）にさらし、洗浄し、次いで氷冷した溶解緩衝液［10m
M PIPES,pH6.8,100mM KCl,3mM NaCl,3.5mM MgCl2］に再
び懸濁させ、窒素空洞現象によって破砕した（Parr Ins
trument Co.,Moline,IL）。アズール好性顆粒をBorrega
ard［Borregaard,N.,J.M.Heiple,E.R.Simons及びR.A.Cl
ark,J.Cell.Biol.,97:52−61（1983）］により記載され
た不連続パーコール勾配上で単離した。アズール好性顆
粒を集め、パーコールを遠心分離（180,000×Ｇ、２時
間）して除去した。顆粒を４サイクルの凍結−融解、次
いで超音波に１分かけて溶解させた。溶解させた顆粒
を、等容量の100mMグリシン（pH2）で室温にて１時間断
続的に緩やかに撹拌することによって抽出した。酸抽出
物を遠心分離（30,000×G,20分間、次いで200,000×G,3
0分間）して透明にした。
単離した。バフィーコートをHBSSで３〜４倍に希釈し、
顆粒球を単核細胞から64％パーコールで遠心分離した。
ペレットをジイソプロピルフルオロホスフェート（DF
P）にさらし、洗浄し、次いで氷冷した溶解緩衝液［10m
M PIPES,pH6.8,100mM KCl,3mM NaCl,3.5mM MgCl2］に再
び懸濁させ、窒素空洞現象によって破砕した（Parr Ins
trument Co.,Moline,IL）。アズール好性顆粒をBorrega
ard［Borregaard,N.,J.M.Heiple,E.R.Simons及びR.A.Cl
ark,J.Cell.Biol.,97:52−61（1983）］により記載され
た不連続パーコール勾配上で単離した。アズール好性顆
粒を集め、パーコールを遠心分離（180,000×Ｇ、２時
間）して除去した。顆粒を４サイクルの凍結−融解、次
いで超音波に１分かけて溶解させた。溶解させた顆粒
を、等容量の100mMグリシン（pH2）で室温にて１時間断
続的に緩やかに撹拌することによって抽出した。酸抽出
物を遠心分離（30,000×G,20分間、次いで200,000×G,3
0分間）して透明にした。
好中球単離 健康なドナーボランティアから静脈血を酸クエン酸デ
キストロース抗凝固物質中に採取し、直ちに氷の上に置
いた。血液を５部、冷Macrodex1部と混合し、次いで４
℃で1.5〜２時間放置した。白血球に富む血漿を冷HBSS
中で１回洗浄し、次いでHBSS中に再び懸濁させ、Ficoll
−Paque上に層形成した。赤血球による汚染が顕著であ
れば、顆粒球ペレットを低張溶解に掛けた。細胞をHBSS
で２回洗浄し、HBSS＋２％同原血漿に再び懸濁させる
と、培養混合物中で１×106/mの最終顆粒球濃度とな
った。
キストロース抗凝固物質中に採取し、直ちに氷の上に置
いた。血液を５部、冷Macrodex1部と混合し、次いで４
℃で1.5〜２時間放置した。白血球に富む血漿を冷HBSS
中で１回洗浄し、次いでHBSS中に再び懸濁させ、Ficoll
−Paque上に層形成した。赤血球による汚染が顕著であ
れば、顆粒球ペレットを低張溶解に掛けた。細胞をHBSS
で２回洗浄し、HBSS＋２％同原血漿に再び懸濁させる
と、培養混合物中で１×106/mの最終顆粒球濃度とな
った。
BPI精製 粗アズール好性顆粒抽出物ほぼ2mgを、Biosil（TSK−
250）（7.8mm×600mm）高速分子ふるいカラムで、50mM
グリシンと100mM NaCl緩衝液（pH2）を用いて、流速1m
／分の一定条件下で分子ふるい分離した。最も強いLP
S阻害活性を持つカラム画分は、SDS PAGEに示されるよ
うに多量の54KD蛋白質を含んでいた。これらのTSK画分
をプールし、50mMクエン酸塩（pH5.5）を用いてAquapor
e弱カチオン交換（WCX）カラム（2.1mm×30mm）にか
け、次いで50mMクエン酸塩と1M NaCl（緩衝液Ｂ）の濃
度勾配０〜75％（25分）、そして75〜100％緩衝液Ｂ
（５分）で、流速200m／分で溶出した。57KDの材料
を、カチオン交換で回収すると、SDS pageでは１本のバ
ンドとして現れた。幾つかの実験に於いては、PBIを、V
ydac C4カラム逆相HPLC（Rainin Instruments,Emeryvil
le,CA）に、0.1％CH3CN＋0.1％TFA中12分かけて仕込
み、流速200m／分で30分間かけて溶出、精製した。
250）（7.8mm×600mm）高速分子ふるいカラムで、50mM
グリシンと100mM NaCl緩衝液（pH2）を用いて、流速1m
／分の一定条件下で分子ふるい分離した。最も強いLP
S阻害活性を持つカラム画分は、SDS PAGEに示されるよ
うに多量の54KD蛋白質を含んでいた。これらのTSK画分
をプールし、50mMクエン酸塩（pH5.5）を用いてAquapor
e弱カチオン交換（WCX）カラム（2.1mm×30mm）にか
け、次いで50mMクエン酸塩と1M NaCl（緩衝液Ｂ）の濃
度勾配０〜75％（25分）、そして75〜100％緩衝液Ｂ
（５分）で、流速200m／分で溶出した。57KDの材料
を、カチオン交換で回収すると、SDS pageでは１本のバ
ンドとして現れた。幾つかの実験に於いては、PBIを、V
ydac C4カラム逆相HPLC（Rainin Instruments,Emeryvil
le,CA）に、0.1％CH3CN＋0.1％TFA中12分かけて仕込
み、流速200m／分で30分間かけて溶出、精製した。
好中球刺激 単離した好中球を氷上に保持した後、37℃で30分間刺
激する場合と刺激しない場合に分けて培養した。培養
後、細胞を多量の冷PBS＋0.05％アジ化ナトリウム＋２
％同原血漿で洗浄した。ペレットを２つに分け、一方を
対照IgG1抗体（20μg/1×106細胞）50μで、もう一方
を抗CR1（20μg/1×106細胞）50μで０℃、30分間染
色した。培養後、細胞をPBS＋同原血漿で２回洗浄し、
次いでヤギ抗マウスIgG−FITCで染色した。幾つかの実
験に於いては、対照ウェル中でIgG2a−phycoerythrin
（PE）20μ、試験ウェル中でLeu−15 PE20μを用い
た。０℃で30分間培養後、さらに２回洗浄し、細胞をBe
cton Dickinson FAStarフロー血球計算器（Becton Dick
inson,Mountain View,CA）で、フロー血球計算によって
分析した。好中球刺激を、HBSS＋0.2％同原血漿単独
（対照）中で培養したサンプルと、BPI若しくはポリミ
キシンＢと37℃で30分間前培養したLPSまたはLPSと一緒
に培養したサンプルの平均蛍光強度を比較して測定し
た。データは、％刺激または％阻害で表示し、 ％刺激＝［（実験値−対照値）／（最大値−対照値）］×100及び ％阻害＝１−［（＋阻害剤）−（対照）］／ ［（−阻害剤）−（対照）］×100 に従って、対数目盛りで、平均蛍光強度（FI）を用いて
計算した。
激する場合と刺激しない場合に分けて培養した。培養
後、細胞を多量の冷PBS＋0.05％アジ化ナトリウム＋２
％同原血漿で洗浄した。ペレットを２つに分け、一方を
対照IgG1抗体（20μg/1×106細胞）50μで、もう一方
を抗CR1（20μg/1×106細胞）50μで０℃、30分間染
色した。培養後、細胞をPBS＋同原血漿で２回洗浄し、
次いでヤギ抗マウスIgG−FITCで染色した。幾つかの実
験に於いては、対照ウェル中でIgG2a−phycoerythrin
（PE）20μ、試験ウェル中でLeu−15 PE20μを用い
た。０℃で30分間培養後、さらに２回洗浄し、細胞をBe
cton Dickinson FAStarフロー血球計算器（Becton Dick
inson,Mountain View,CA）で、フロー血球計算によって
分析した。好中球刺激を、HBSS＋0.2％同原血漿単独
（対照）中で培養したサンプルと、BPI若しくはポリミ
キシンＢと37℃で30分間前培養したLPSまたはLPSと一緒
に培養したサンプルの平均蛍光強度を比較して測定し
た。データは、％刺激または％阻害で表示し、 ％刺激＝［（実験値−対照値）／（最大値−対照値）］×100及び ％阻害＝１−［（＋阻害剤）−（対照）］／ ［（−阻害剤）−（対照）］×100 に従って、対数目盛りで、平均蛍光強度（FI）を用いて
計算した。
アミノ酸分析 BPIの気相加水分解及びアミノ酸誘導化を、Pico−tag
ワークステーション（Waters,Milford MA）で実施し、
次いでフェニルチオカルバミルアミノ酸のクロマトグラ
フィー分析を、製造業者によって提供されたプロトコル
を用いてApplied Biosystems 130A MPLCで実施した。
ワークステーション（Waters,Milford MA）で実施し、
次いでフェニルチオカルバミルアミノ酸のクロマトグラ
フィー分析を、製造業者によって提供されたプロトコル
を用いてApplied Biosystems 130A MPLCで実施した。
配列分析 BPI N−末端配列を、Applied Biosystems 477Aパルス
液相アミノ酸配列分析装置（Applied Biosystems,Foste
r city,CA）を用いて自動エドマン分解で分析した。フ
ェニルチオヒダントインアミノ酸分析を、Applied Bios
ystems Model 120A液体クロマトグラフを用いてオンラ
インで実施した。
液相アミノ酸配列分析装置（Applied Biosystems,Foste
r city,CA）を用いて自動エドマン分解で分析した。フ
ェニルチオヒダントインアミノ酸分析を、Applied Bios
ystems Model 120A液体クロマトグラフを用いてオンラ
インで実施した。
結果 ヒト好中球を、リポ多糖によってin vivo及びin vitr
oの両方で刺激した。活性化の際に、C3b及びC3bi（各々
CR1及びCR3）レセプターの表面発現が増加する。Fluore
scence Activated Cell Sorter（FACS）を用いて、新た
に単離したヒト好中球の蛍光強度を測定し、0111:B4 LP
Sの用量を増加させて刺激した（図1a）。通常観察され
た最大刺激は10ng/m以上であったが、刺激用量として
10ng/mを使用して、0111:B4 PLSの阻害を試験した。
総ての実験を、対で実施した。多くの実験に於いては、
データはCR1に関してしか示していない。これは、我々
が好中球刺激がCR1またはCR3単独のアップレギュレーシ
ョンを引き起こす条件を知見しなかったからである［M,
Marraら（1990），J.Immunol,144（２）:662−666］。
oの両方で刺激した。活性化の際に、C3b及びC3bi（各々
CR1及びCR3）レセプターの表面発現が増加する。Fluore
scence Activated Cell Sorter（FACS）を用いて、新た
に単離したヒト好中球の蛍光強度を測定し、0111:B4 LP
Sの用量を増加させて刺激した（図1a）。通常観察され
た最大刺激は10ng/m以上であったが、刺激用量として
10ng/mを使用して、0111:B4 PLSの阻害を試験した。
総ての実験を、対で実施した。多くの実験に於いては、
データはCR1に関してしか示していない。これは、我々
が好中球刺激がCR1またはCR3単独のアップレギュレーシ
ョンを引き起こす条件を知見しなかったからである［M,
Marraら（1990），J.Immunol,144（２）:662−666］。
好中球アズール好性顆粒中に見出した蛋白質がLPSに
対する好中球応答を妨害し得るかどうかを決定するため
に、アズール好性顆粒の粗酸抽出物をLPSと共に37℃で3
0分間前培養した。次いで混合物を好中球を刺激する能
力に関して試験した。アズール好性蛋白質（１μg/m
）は、LPS10ng/mによる多形核白血球（PMN）１×10
6/mの刺激を効果的にブロックし得た（図1b）。この
効果は、LPSと共に前培養したグリシン抽出緩衝液を用
いても観察されなかったし、粗抽出物または対照グリシ
ン緩衝液を用いても好中球を刺激できなかった（データ
は示されていない）。
対する好中球応答を妨害し得るかどうかを決定するため
に、アズール好性顆粒の粗酸抽出物をLPSと共に37℃で3
0分間前培養した。次いで混合物を好中球を刺激する能
力に関して試験した。アズール好性蛋白質（１μg/m
）は、LPS10ng/mによる多形核白血球（PMN）１×10
6/mの刺激を効果的にブロックし得た（図1b）。この
効果は、LPSと共に前培養したグリシン抽出緩衝液を用
いても観察されなかったし、粗抽出物または対照グリシ
ン緩衝液を用いても好中球を刺激できなかった（データ
は示されていない）。
抽出物中のどの蛋白質が、阻害作用の原因となってい
るのかをさらに研究するために、粗酸抽出物を逆相HPLC
によって分離した。各ピークを、LPS阻害活性に関して
別個に分析した。各ピークの同定を、一次元での微少細
孔（micro−bore）逆相HPLCにかけ、次いでSDS PAGE、
エレクトロブロッティングそしてマイクロシークエンシ
ングを含む二次元精製アプローチを用いて予め決定し
た。アズール好性蛋白質は、10本の別々のピークに分か
れた。各々を表１に示す。示されているアミノ酸配列
は、Ｎ−末端の最初の15アミノ酸である。
るのかをさらに研究するために、粗酸抽出物を逆相HPLC
によって分離した。各ピークを、LPS阻害活性に関して
別個に分析した。各ピークの同定を、一次元での微少細
孔（micro−bore）逆相HPLCにかけ、次いでSDS PAGE、
エレクトロブロッティングそしてマイクロシークエンシ
ングを含む二次元精製アプローチを用いて予め決定し
た。アズール好性蛋白質は、10本の別々のピークに分か
れた。各々を表１に示す。示されているアミノ酸配列
は、Ｎ−末端の最初の15アミノ酸である。
図２には、各ピークの１μｇのLPS阻害活性が示され
ている。ピーク９は、最高のLPS中和活性を有してい
た。このピークに於ける主蛋白質種は、既述の殺菌性／
透過性増強蛋白質（BPI）［Weiss,J.,P.Elsbash,I.Olss
on及びH.Odeberg,J.Biol.Chem,253（８）:2664−2672
（1978）］とＮ−末端が一致した。BPIは、アズール好
性顆粒蛋白質抽出物中のグラム陰性殺菌活性の大部分を
有していることが示された。カテプシンＧは、LPSの阻
害を幾らか示したが、実験間のデータでは、ピーク９の
ような再現性はなかった。カテプシンＧは、in vitroで
LPSと結合してグラム陰性細菌を殺すが、BPIよりは少な
い量であることが示された。グラム陰性細菌に対して殺
菌活性を示した他の蛋白質は、エラスターゼとデフェン
スニスである。しかしながら、これらの蛋白質（１μg/
m）は、好中球上でLPSの刺激活性を阻害しなかった。
ている。ピーク９は、最高のLPS中和活性を有してい
た。このピークに於ける主蛋白質種は、既述の殺菌性／
透過性増強蛋白質（BPI）［Weiss,J.,P.Elsbash,I.Olss
on及びH.Odeberg,J.Biol.Chem,253（８）:2664−2672
（1978）］とＮ−末端が一致した。BPIは、アズール好
性顆粒蛋白質抽出物中のグラム陰性殺菌活性の大部分を
有していることが示された。カテプシンＧは、LPSの阻
害を幾らか示したが、実験間のデータでは、ピーク９の
ような再現性はなかった。カテプシンＧは、in vitroで
LPSと結合してグラム陰性細菌を殺すが、BPIよりは少な
い量であることが示された。グラム陰性細菌に対して殺
菌活性を示した他の蛋白質は、エラスターゼとデフェン
スニスである。しかしながら、これらの蛋白質（１μg/
m）は、好中球上でLPSの刺激活性を阻害しなかった。
粗アズール好性抽出物のLPS阻害活性をさらに特徴付
け、分子ふるい及びイオン交換、次いで逆相クロマトグ
ラフィーによって精製した。LPS阻害活性は、SDS PAGE
に見られる純粋な57KDバンドと一緒に移動（comigrat
e）した（図3b）。
け、分子ふるい及びイオン交換、次いで逆相クロマトグ
ラフィーによって精製した。LPS阻害活性は、SDS PAGE
に見られる純粋な57KDバンドと一緒に移動（comigrat
e）した（図3b）。
RPLC分離に使用した緩衝液［CH3CN及び0.1％トリフオ
ロ酢酸（TFA）］は、BPIのLPS阻害活性をかなり減らし
てしまうため（データは示されていない）、且つイオン
交換クロマトグラフィーで精製した材料はSDS PAGEから
判断して高純度であったため、分子ふるい／イオン交換
材料を使用して用量応答曲線を画いた（図4a）。データ
は、各々対で実施した２つの実験に基づいて示されてい
る。この分子ふるい／イオン交換で精製した材料は、Ｎ
−末端配列分析からBPIであることが確認された。蛋白
質濃度は、アミノ酸分析によって測定した。
ロ酢酸（TFA）］は、BPIのLPS阻害活性をかなり減らし
てしまうため（データは示されていない）、且つイオン
交換クロマトグラフィーで精製した材料はSDS PAGEから
判断して高純度であったため、分子ふるい／イオン交換
材料を使用して用量応答曲線を画いた（図4a）。データ
は、各々対で実施した２つの実験に基づいて示されてい
る。この分子ふるい／イオン交換で精製した材料は、Ｎ
−末端配列分析からBPIであることが確認された。蛋白
質濃度は、アミノ酸分析によって測定した。
図4aに示されているように、BPI約90ng/mが、0111/
B4 LPS 10ng/mに対する好中球応答の最大阻害に必要
である。処方したペプチド（10-7M FMLP）に対する好中
球応答は、BPIにより阻害されなかった（データは示さ
れていない）。
B4 LPS 10ng/mに対する好中球応答の最大阻害に必要
である。処方したペプチド（10-7M FMLP）に対する好中
球応答は、BPIにより阻害されなかった（データは示さ
れていない）。
図4bは、ポリペプチド抗生物質ポリミキシンＢ（PM
B）に対する同様の用量応答曲線を示している。ポリミ
キシンＢは、LPSのリピドＡ部分に結合して、in vivo及
びin vitroの両方でその毒性作用をいくらか中和する。
ポリミキシンＢはLPSに化学量論的に結合することが実
証されている［Morrison,D.C.及びD.M.Jacobs,Immunoch
em,13:813−818（1976）］。スムース型細菌由来LPS 10
ng/mを阻害するのに必要なPMBの計算量は、ほぼ0.67n
Mである。本実験に於いては、LPS 10ng/mを用いる好
中球刺激を完全に阻害するのには、ポリミキシンB0.4ng
/mまたは0.36nMが必要である。LPS10ng/mの100％阻
害には、BPI90ng/mまたは1.58nMが必要である。
B）に対する同様の用量応答曲線を示している。ポリミ
キシンＢは、LPSのリピドＡ部分に結合して、in vivo及
びin vitroの両方でその毒性作用をいくらか中和する。
ポリミキシンＢはLPSに化学量論的に結合することが実
証されている［Morrison,D.C.及びD.M.Jacobs,Immunoch
em,13:813−818（1976）］。スムース型細菌由来LPS 10
ng/mを阻害するのに必要なPMBの計算量は、ほぼ0.67n
Mである。本実験に於いては、LPS 10ng/mを用いる好
中球刺激を完全に阻害するのには、ポリミキシンB0.4ng
/mまたは0.36nMが必要である。LPS10ng/mの100％阻
害には、BPI90ng/mまたは1.58nMが必要である。
従って、モルベースでin vitroで好中球のLPS刺激を
阻害するのに必要なBPI量は、ポリミキシンＢに必要な
量のほぼ４倍であった。
阻害するのに必要なBPI量は、ポリミキシンＢに必要な
量のほぼ４倍であった。
BPIが他のグラム陰性細菌からのLPSを阻害し得るかど
うかを試験するために、種々の鎖長のポリ多糖及びリピ
ドＡをもつLPS分子を、２×精製BPI 90ng/mに対する
実験系で試験した。表２に示されているデータは、刺激
用量がこれらの分子間で様々であるが、スムース型及び
ラフ型ケモタイプ（chemotype）の両方に由来するLPS並
びにリピドＡが総てBPIによって阻害されたことを示し
ている。
うかを試験するために、種々の鎖長のポリ多糖及びリピ
ドＡをもつLPS分子を、２×精製BPI 90ng/mに対する
実験系で試験した。表２に示されているデータは、刺激
用量がこれらの分子間で様々であるが、スムース型及び
ラフ型ケモタイプ（chemotype）の両方に由来するLPS並
びにリピドＡが総てBPIによって阻害されたことを示し
ている。
実施例２ Ｉ 好中球BPIの予備研究 既に議論したように、殺菌性／透過性−増強蛋白質
（BPI）は、Weissらによりヒト好中球顆粒から最初に精
製されたカチオン性の50−60,000m.w.の蛋白質である
（Weiss,J.,P.Elsbach,I.Olsson及びH.Odegerg.1978.J.
Biol.Chem.253:2664.）。BPIは、細菌細胞膜の透過性を
変化させ、グラム陰性細菌に対し特に殺菌作用を有す
る。今日まで、BPIに関する文献は、もっぱらその殺菌
作用に注目してきた。
（BPI）は、Weissらによりヒト好中球顆粒から最初に精
製されたカチオン性の50−60,000m.w.の蛋白質である
（Weiss,J.,P.Elsbach,I.Olsson及びH.Odegerg.1978.J.
Biol.Chem.253:2664.）。BPIは、細菌細胞膜の透過性を
変化させ、グラム陰性細菌に対し特に殺菌作用を有す
る。今日まで、BPIに関する文献は、もっぱらその殺菌
作用に注目してきた。
我々は、BPIがLPSに結合し、in vitroで可溶性LPSに
対し好中球及び単球応答の両方を阻害することを報告す
る。BPIは、カブトガニ変形細胞溶解物分析（Limulus A
mebocyte Lysate assay）に於いてLPS活性も阻害する。
我々の研究から、BPIを内毒素ショックに対する新規治
療の開発の為の主要な分子として同定した。
対し好中球及び単球応答の両方を阻害することを報告す
る。BPIは、カブトガニ変形細胞溶解物分析（Limulus A
mebocyte Lysate assay）に於いてLPS活性も阻害する。
我々の研究から、BPIを内毒素ショックに対する新規治
療の開発の為の主要な分子として同定した。
LPSに対する応答に於いて、ヒト好中球は補体レセプ
ターCP1及びCP3の細胞表面発現をアップレギュレートす
る（図1a及び図5b）。LPSに対するこの好中球応答を測
定するために、我々は、新鮮に単離したヒト好中球をE.
Coli 0111:B4 LPSと共に培養し（図4a）、LPS 10ng/m
を用いると、最大CR1アップレギュレーションが観察さ
れることを示した（図４）。LPSによる好中球の刺激
は、外因性の抗TNF抗体によっては阻害されず、LPSがこ
の系で直接好中球に作用したことを示唆している。
ターCP1及びCP3の細胞表面発現をアップレギュレートす
る（図1a及び図5b）。LPSに対するこの好中球応答を測
定するために、我々は、新鮮に単離したヒト好中球をE.
Coli 0111:B4 LPSと共に培養し（図4a）、LPS 10ng/m
を用いると、最大CR1アップレギュレーションが観察さ
れることを示した（図４）。LPSによる好中球の刺激
は、外因性の抗TNF抗体によっては阻害されず、LPSがこ
の系で直接好中球に作用したことを示唆している。
BPIは、LPSに対する好中球応答を阻害する（図4a）。
CRアップレギュレーションの阻害は、ほぼ1.8〜3.6nM
（100〜200ng/m）の用量では完全である。0.4nMのポ
リミキシンＢと比較した、スムース型細菌由来LPS 10ng
/m（ほぼm.w.15,000）を阻害するのに必要なBPIは、
約0.7nMであり、実測値0.4nMと非常に近似している。モ
ルベースでのLPSを阻害するのに必要なBPI量は、ポリミ
キシンＢに必要な量のほぼ５倍以上であった。
CRアップレギュレーションの阻害は、ほぼ1.8〜3.6nM
（100〜200ng/m）の用量では完全である。0.4nMのポ
リミキシンＢと比較した、スムース型細菌由来LPS 10ng
/m（ほぼm.w.15,000）を阻害するのに必要なBPIは、
約0.7nMであり、実測値0.4nMと非常に近似している。モ
ルベースでのLPSを阻害するのに必要なBPI量は、ポリミ
キシンＢに必要な量のほぼ５倍以上であった。
BPIはLPS媒介好中球刺激を阻害するが、FMLPまたはTN
Fのいずれかの刺激は阻害しない（表３）。これらのデ
ータは、BPIがLPSを直接阻害して、CRアップレギュレー
ションに含まれる好中球メカニズムを破壊しないことを
示している。
Fのいずれかの刺激は阻害しない（表３）。これらのデ
ータは、BPIがLPSを直接阻害して、CRアップレギュレー
ションに含まれる好中球メカニズムを破壊しないことを
示している。
BPIによるLPSの中和は、迅速に起こる。前培養なしで
も、BPI（及びポリミキシンＢ）は両方とも、LPSに対す
る好中球応答の70％以上を阻害する（図６）。最大阻害
は、たった５分の前培養後に見られた。
も、BPI（及びポリミキシンＢ）は両方とも、LPSに対す
る好中球応答の70％以上を阻害する（図６）。最大阻害
は、たった５分の前培養後に見られた。
BPIは、スムース型及びラフ型細菌株由来のLPS並びに
リピドＡによって刺激されるCRアップレギュレーション
を阻害する（表４）。これらのLPSの異なる型に対するB
PI活性は広範囲であるため、これらの中でもリピドＡと
２−ケト−３−デオキシ−オクトネートだけが抗原決定
基を共有しており、BPIによるLPS阻害はリピドＡを介し
て作用するようである。
リピドＡによって刺激されるCRアップレギュレーション
を阻害する（表４）。これらのLPSの異なる型に対するB
PI活性は広範囲であるため、これらの中でもリピドＡと
２−ケト−３−デオキシ−オクトネートだけが抗原決定
基を共有しており、BPIによるLPS阻害はリピドＡを介し
て作用するようである。
BPIは、他のLPS媒介活性を阻害する。ほぼ9nMまたは5
00ng/m濃度で、BPIはLAL分析に於いてLPS活性をかな
り阻害した（図７）。LPSとBPIを前培養なしに一緒に添
加すると、阻害は全く観察されなかった（データは示さ
れていない）。このことは、BPIがLPSに作用し、LAL分
析系には作用しなかったことを示している。BPIはま
た、ヒト付着性単核細胞によるLPS媒介TNF生成を阻害す
る（表５）。
00ng/m濃度で、BPIはLAL分析に於いてLPS活性をかな
り阻害した（図７）。LPSとBPIを前培養なしに一緒に添
加すると、阻害は全く観察されなかった（データは示さ
れていない）。このことは、BPIがLPSに作用し、LAL分
析系には作用しなかったことを示している。BPIはま
た、ヒト付着性単核細胞によるLPS媒介TNF生成を阻害す
る（表５）。
好中球を、2.7nM BPIの存在下または非存在下で前培
養したE.Coli 0111:B4 LPS、FMLPまたはTNFと共に培養
した。緩衝液のみを用いて前培養した各刺激に対して、
応答に於けるCR発現の％阻害としてデータを報告した。
養したE.Coli 0111:B4 LPS、FMLPまたはTNFと共に培養
した。緩衝液のみを用いて前培養した各刺激に対して、
応答に於けるCR発現の％阻害としてデータを報告した。
好中球を、精製BPI2.7nMを加えてまたは加えないで前
培養しなLPS及びリピドＡで刺激した。結果は、各型のL
PS単独で観察された蛍光強度の％阻害として表示した。
培養しなLPS及びリピドＡで刺激した。結果は、各型のL
PS単独で観察された蛍光強度の％阻害として表示した。
BPIは、1978年にElsbach及びWeissによって最初に精
製された。初期研究に於いて、我々は、BPIをアズール
好性顆粒抽出物から逆相HPLCで一段階で単離した。逆相
からのBPI活性の回収は僅かであったが、これは多分変
性条件によるものであろう。本明細書中では、我々は非
変性段階のみを用いるLPS阻害活性の精製を示し、好中
球からの活性の大部分がBPIと重なって移動することを
示す。精製法を改良すると、以下のセクションにも示さ
れているような非常に高い比活性をもつ材料を得ること
ができる。
製された。初期研究に於いて、我々は、BPIをアズール
好性顆粒抽出物から逆相HPLCで一段階で単離した。逆相
からのBPI活性の回収は僅かであったが、これは多分変
性条件によるものであろう。本明細書中では、我々は非
変性段階のみを用いるLPS阻害活性の精製を示し、好中
球からの活性の大部分がBPIと重なって移動することを
示す。精製法を改良すると、以下のセクションにも示さ
れているような非常に高い比活性をもつ材料を得ること
ができる。
図８〜10は、我々の研究室に於いて現在使用している
３つのクロマトグラフィー段階を示している。吸収を実
線で、LPS阻害活性を点線で示す。表６は、恣意的なLPS
中和単位（NU）で測定し、活性及び蛋白質の回収率並び
に比活性を示している。１中和単位とは、LAL試験に於
いて0.5E.U.LPSを50％だけ阻害するBPI量である。これ
らのプールのCommassie染色したSDS−PAGEゲルを、図11
に示す。精製したBPIの微少細孔逆相HPLCによる分析
（図12）から、積算により総蛋白質量の97％に相当する
単一主ピークを確認した。BPIのトリプシン分解マッピ
ングにより、我々は蛋白質の同定をより確実にする幾つ
かの主要なフラグメントを配列決定することができた。
BPIの全長配列は、公知である［P.W.Grayら．（1989）
J.Biol.Chem.264（16）:9505］。
３つのクロマトグラフィー段階を示している。吸収を実
線で、LPS阻害活性を点線で示す。表６は、恣意的なLPS
中和単位（NU）で測定し、活性及び蛋白質の回収率並び
に比活性を示している。１中和単位とは、LAL試験に於
いて0.5E.U.LPSを50％だけ阻害するBPI量である。これ
らのプールのCommassie染色したSDS−PAGEゲルを、図11
に示す。精製したBPIの微少細孔逆相HPLCによる分析
（図12）から、積算により総蛋白質量の97％に相当する
単一主ピークを確認した。BPIのトリプシン分解マッピ
ングにより、我々は蛋白質の同定をより確実にする幾つ
かの主要なフラグメントを配列決定することができた。
BPIの全長配列は、公知である［P.W.Grayら．（1989）
J.Biol.Chem.264（16）:9505］。
II.発熱物質非含有の厳密な条件下に於けるBPIの精製 材料及び方法 試薬 USPグレード滅菌洗浄水……Travenol Laboratories I
nc.,Deerfield IL製； Phrosartフィルター……Sartorius GmbH,W.Germany
製； CM Sepharose FF……Pharmacia,Upsala,Sweden製； ポリアスパルトアミド弱アチオン交換HPLCカラム（10
0×4.6mm）……Nest Group,Southborough MA製； グリシン及びBio−Sil G250分子ふるいHPLCカラム（6
00×7.5mm）……Bio−Rad Laboratories,Richmond CA
製； ポリアクリルアミド電気泳動ゲル……Novex,Encitas
CA製； 配列決定及びアミノ酸分析試薬及び緩衝液……Applie
d Biosystems Inc.,Foster City,CA製； トリフルオロ酢酸、一定沸騰HCL、水解物アミノ酸標
準及びBCA蛋白質アッセイ試薬……Peirce Chemical C
o.,Rock−ford,IL製； カブトガニ変形細胞溶解物分析……Whittaker Bio−p
roducts,Inc.,Walersville,MD製； リポ多糖……RIBI Immunochem Research,Inc.,Hamilt
on,MT製； HPLCグレードアセトニトリル……J.T.Baker,Phillips
−burg,NJ製； 他の緩衝液及び塩は試薬グレードのものを使用した。
18メガオームの純度の水を、Lab Five超純水システム
（Technic,Seattle,WA）で製造した。消毒用の0.5M NaO
Hは、試薬グレードのNaOHペレットとUSP水から調製し
た。
nc.,Deerfield IL製； Phrosartフィルター……Sartorius GmbH,W.Germany
製； CM Sepharose FF……Pharmacia,Upsala,Sweden製； ポリアスパルトアミド弱アチオン交換HPLCカラム（10
0×4.6mm）……Nest Group,Southborough MA製； グリシン及びBio−Sil G250分子ふるいHPLCカラム（6
00×7.5mm）……Bio−Rad Laboratories,Richmond CA
製； ポリアクリルアミド電気泳動ゲル……Novex,Encitas
CA製； 配列決定及びアミノ酸分析試薬及び緩衝液……Applie
d Biosystems Inc.,Foster City,CA製； トリフルオロ酢酸、一定沸騰HCL、水解物アミノ酸標
準及びBCA蛋白質アッセイ試薬……Peirce Chemical C
o.,Rock−ford,IL製； カブトガニ変形細胞溶解物分析……Whittaker Bio−p
roducts,Inc.,Walersville,MD製； リポ多糖……RIBI Immunochem Research,Inc.,Hamilt
on,MT製； HPLCグレードアセトニトリル……J.T.Baker,Phillips
−burg,NJ製； 他の緩衝液及び塩は試薬グレードのものを使用した。
18メガオームの純度の水を、Lab Five超純水システム
（Technic,Seattle,WA）で製造した。消毒用の0.5M NaO
Hは、試薬グレードのNaOHペレットとUSP水から調製し
た。
好中球からの顆粒の抽出 アズール好性顆粒のパーコール分離を省略した以外に
は、文献記載通りに好中球から顆粒を抽出した（米国特
許出願第199,206号、1988年５月26日出願）。そのかわ
り、ポスト核上清を遠心分離（17,000g,20分間）して全
顆粒画分を得た。次いで顆粒ペレットを、各４×10E8個
の細胞が溶解している50mMグリシン（pH2）1mに懸濁
させた。再び懸濁させた顆粒をドライアイス／エタノー
ル上で、５回の凍結／融解サイクルで溶解させ、次いで
４℃で１時間激しく撹拌した。可溶性抽出物を、遠心分
離（30,000g,30分間）して得た。
は、文献記載通りに好中球から顆粒を抽出した（米国特
許出願第199,206号、1988年５月26日出願）。そのかわ
り、ポスト核上清を遠心分離（17,000g,20分間）して全
顆粒画分を得た。次いで顆粒ペレットを、各４×10E8個
の細胞が溶解している50mMグリシン（pH2）1mに懸濁
させた。再び懸濁させた顆粒をドライアイス／エタノー
ル上で、５回の凍結／融解サイクルで溶解させ、次いで
４℃で１時間激しく撹拌した。可溶性抽出物を、遠心分
離（30,000g,30分間）して得た。
ガブトガニ変形細胞溶解物アッセイ カブトガニ変形細胞溶解物アッセイを、製造業者の指
示通り実施した。必要により、サンプルのpHを発熱物質
非含有の0.5Mリン酸緩衝液（pH7.4）を添加して中性に
調整し、塩分をUSP水で希釈することによって＜150mMに
減少させた。
示通り実施した。必要により、サンプルのpHを発熱物質
非含有の0.5Mリン酸緩衝液（pH7.4）を添加して中性に
調整し、塩分をUSP水で希釈することによって＜150mMに
減少させた。
LPS中和アッセイ LPS中和アッセイを、前述の通りに実施した［M,Marra
ら（1990）J.Immunol.144（２）:662−666］。
ら（1990）J.Immunol.144（２）:662−666］。
顆粒抽出物の高塩分画法 抽出した蛋白質200mgを、種々の調製物からプール
し、氷上に置いた。滅菌した5M NaCl1容を、抽出物各４
容に添加した。得られた沈澱を、４℃で遠心分離（20,0
00g,20分間）してペレット化した。この上清をUSP洗浄
水４容で希釈し、次いで1M Tris pH7.4の充分量でpHを
調整し、CMsepharoseクロマトグラフィー用に調製し
て、最終濃度50mMとした。新鮮な滅菌した発熱物質非含
有のストック塩及び緩衝液のみを使用した。
し、氷上に置いた。滅菌した5M NaCl1容を、抽出物各４
容に添加した。得られた沈澱を、４℃で遠心分離（20,0
00g,20分間）してペレット化した。この上清をUSP洗浄
水４容で希釈し、次いで1M Tris pH7.4の充分量でpHを
調整し、CMsepharoseクロマトグラフィー用に調製し
て、最終濃度50mMとした。新鮮な滅菌した発熱物質非含
有のストック塩及び緩衝液のみを使用した。
CM Sepharoseクロマトグラフィー XK−16カラム（Pharmacia）に好適な樹脂を装填し
て、ベット容積5mとした。サンプルを仕込むために、
P1ポンプを備えたグラジエントFPLCにカラムを取り付け
た。使用前に移動相と接触している全表面を0.5M NaOH
で手広く洗浄した。カラムを0.5M NaOHで0.2m／分で
４時間洗浄し、きれいにした。カラムを再び平衡させ
て、ブランクを実施した。ブランクからと溶離液からの
画分を発熱性（pyrogenicity）に関してLALアッセイで
試験した。調製した抽出物を流速400m／時間で仕込ん
だ。仕込み終えてから、カラムを２〜３倍のカラム容積
の出発緩衝液で洗浄した。顆粒抽出物は、仕込みの間、
氷上に保持した。カラムを室温で操作した。
て、ベット容積5mとした。サンプルを仕込むために、
P1ポンプを備えたグラジエントFPLCにカラムを取り付け
た。使用前に移動相と接触している全表面を0.5M NaOH
で手広く洗浄した。カラムを0.5M NaOHで0.2m／分で
４時間洗浄し、きれいにした。カラムを再び平衡させ
て、ブランクを実施した。ブランクからと溶離液からの
画分を発熱性（pyrogenicity）に関してLALアッセイで
試験した。調製した抽出物を流速400m／時間で仕込ん
だ。仕込み終えてから、カラムを２〜３倍のカラム容積
の出発緩衝液で洗浄した。顆粒抽出物は、仕込みの間、
氷上に保持した。カラムを室温で操作した。
弱カチオン交換HPLC 弱カチオン交換HPLCをPheodyneインジェクター及びGi
lsonモデル111B U.V.検出器を備えたEldex三元グラジエ
ントポンプを使用して実施した。湿潤表面を0.5M NaOH
で洗浄し、次いで多量のUSP水で濯ぎ、カラムに仕込む
前に塩基の全痕跡を除去した。ブランク画分及び溶離液
を上記の通り発熱性に関し試験をした。
lsonモデル111B U.V.検出器を備えたEldex三元グラジエ
ントポンプを使用して実施した。湿潤表面を0.5M NaOH
で洗浄し、次いで多量のUSP水で濯ぎ、カラムに仕込む
前に塩基の全痕跡を除去した。ブランク画分及び溶離液
を上記の通り発熱性に関し試験をした。
ゲルパミエーションHPLC ゲルパミエーションHPLCを、弱カチオン交換HPLCで略
述したのと同一の予備操作及び装置で実施した。
述したのと同一の予備操作及び装置で実施した。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ８〜16％アクリルアミドグラジエントゲル（Novex）
を入手し、業者の使用書に従って実施した。
を入手し、業者の使用書に従って実施した。
蛋白質配列決定 120A PTHアミノ酸配列分析機器を備えたApplied Bio
−systems 447Aパルス液相シーケンサーを、自動エドマ
ン分解に使用した。
−systems 447Aパルス液相シーケンサーを、自動エドマ
ン分解に使用した。
微小細孔逆相HPLC 蛋白質シークエンシング用に材料をAquaporeブチルカ
ラム（30×2.1mm）で脱塩して調製した。勾配液は30〜1
00％Ｂ（30分）で流速200m／分で使用した。検出器
は、フルスケールを吸光度2.0で、波長214nmに設定した
（図Ｘ参照）。HP3396Aを使用して積算しデータをプロ
ットした。
ラム（30×2.1mm）で脱塩して調製した。勾配液は30〜1
00％Ｂ（30分）で流速200m／分で使用した。検出器
は、フルスケールを吸光度2.0で、波長214nmに設定した
（図Ｘ参照）。HP3396Aを使用して積算しデータをプロ
ットした。
アミノ酸分析 上記システムでは、PTCカラム、緩衝液及びABIにより
提供された分離条件を用いてアミノ酸分析を実施した。
サンプルの加水分解及びPTC誘導体を、業者のプロトコ
ルを用いて、Waters Chromatography（Millipore）のPi
co−Tagワークステーションで調製した。
提供された分離条件を用いてアミノ酸分析を実施した。
サンプルの加水分解及びPTC誘導体を、業者のプロトコ
ルを用いて、Waters Chromatography（Millipore）のPi
co−Tagワークステーションで調製した。
蛋白質分析 蛋白質濃度を、CA方法の使用説明書23230、23225（Pe
irce Chemical Co.）を用いて測定した。緩衝液の妨害
を最小とするために、サンプルを10倍に希釈し、微量試
薬プロトコルを使用した。
irce Chemical Co.）を用いて測定した。緩衝液の妨害
を最小とするために、サンプルを10倍に希釈し、微量試
薬プロトコルを使用した。
結果 アズール好性顆粒から精製したBPIは、LPSによる好中
球活性化を阻害し、LALアッアセイで直接LPSを阻害する
ことを前述に於いて示した。さらにBPIの役割を明確に
し、アズール好性顆粒及び特異顆粒の両方に他の同様の
分子が存在するかどうかを調べるために、我々は、酸性
pHで抽出した全顆粒からのLPS阻害活性の精製に着手し
た。予備研究から粗抽出物中にLPS阻害活性の存在が証
明された。
球活性化を阻害し、LALアッアセイで直接LPSを阻害する
ことを前述に於いて示した。さらにBPIの役割を明確に
し、アズール好性顆粒及び特異顆粒の両方に他の同様の
分子が存在するかどうかを調べるために、我々は、酸性
pHで抽出した全顆粒からのLPS阻害活性の精製に着手し
た。予備研究から粗抽出物中にLPS阻害活性の存在が証
明された。
内毒素中和活性を同定するために、我々は、全顆粒抽
出物からその精製を試みた。LPS中和活性の精製は、NaC
l（1M）という高濃度のため顆粒抽出物中に存在する蛋
白質の約90％が可逆的に沈澱したのを観察したことによ
り非常に促進された。本質的に、LPS阻害活性の総てが
可溶性上清中に残存した。イオン強度を下げるために、
可溶性画分を希釈し、さらに精製し、CM Sepharoseカチ
オン交換クロマトグラフィーで濃縮した。溶離した活性
のブロードなピークをポリアスパルトアミド（polyaspa
rtamide）高速カチオン交換カラムを使用してさらに精
製した。活性の幾らか鋭いピークの部分を回収し、この
活性はSDS−PAGEにより約55,000の分子量の主蛋白質と
一緒に移動した。このとき、数個のより低い分子量の蛋
白質の移動も伴った。最終精製段階として、ゲルパミエ
ーションHPLCを使用し、活性のピークを同定し、これを
溶離すると、蛋白質の単一の鋭いピークとなった。精製
した蛋白質は、SDS−PAGE上の55,000の分子量のところ
に近接した２本のバンドとして移動した。全内毒素中和
活性の25％を、250倍の精製率で回収した。
出物からその精製を試みた。LPS中和活性の精製は、NaC
l（1M）という高濃度のため顆粒抽出物中に存在する蛋
白質の約90％が可逆的に沈澱したのを観察したことによ
り非常に促進された。本質的に、LPS阻害活性の総てが
可溶性上清中に残存した。イオン強度を下げるために、
可溶性画分を希釈し、さらに精製し、CM Sepharoseカチ
オン交換クロマトグラフィーで濃縮した。溶離した活性
のブロードなピークをポリアスパルトアミド（polyaspa
rtamide）高速カチオン交換カラムを使用してさらに精
製した。活性の幾らか鋭いピークの部分を回収し、この
活性はSDS−PAGEにより約55,000の分子量の主蛋白質と
一緒に移動した。このとき、数個のより低い分子量の蛋
白質の移動も伴った。最終精製段階として、ゲルパミエ
ーションHPLCを使用し、活性のピークを同定し、これを
溶離すると、蛋白質の単一の鋭いピークとなった。精製
した蛋白質は、SDS−PAGE上の55,000の分子量のところ
に近接した２本のバンドとして移動した。全内毒素中和
活性の25％を、250倍の精製率で回収した。
精製した内毒素中和蛋白質を、逆相HPLCにかけ、次い
で自動エンドマン分解によりＮ末端配列分析した。図６
に示されている配列は、39残基が完全に相同であること
から細菌性透過性増強蛋白質であると同定した。加え
て、精製した分子のアミノ酸組成はBPIと実質的に同一
であった（データは示されていない）。
で自動エンドマン分解によりＮ末端配列分析した。図６
に示されている配列は、39残基が完全に相同であること
から細菌性透過性増強蛋白質であると同定した。加え
て、精製した分子のアミノ酸組成はBPIと実質的に同一
であった（データは示されていない）。
近接したバンドの両方がBPIであるかどうかを調べる
ために、我々は精製した蛋白質を、BPIのアミノ酸１〜2
0からなる合成ペプチドに対するBPI特異的ウサギポリク
ロナール抗血清を用いてウエスタンブロッティング分析
にかけた。両方のバンド共、免疫反応性であった。両者
の違いは、グリコシル化に由来するようである。
ために、我々は精製した蛋白質を、BPIのアミノ酸１〜2
0からなる合成ペプチドに対するBPI特異的ウサギポリク
ロナール抗血清を用いてウエスタンブロッティング分析
にかけた。両方のバンド共、免疫反応性であった。両者
の違いは、グリコシル化に由来するようである。
III.IN VITROでのBPIのLPS阻害活性 IIで述べたように、厳密な発熱物質非含有条件でBPI
の精製を実施すると、図13中の用量応答曲線によって示
されるように、より効果的にBPIを調製できた。
の精製を実施すると、図13中の用量応答曲線によって示
されるように、より効果的にBPIを調製できた。
LPS媒介CRアップレギュレーションの阻害は、BPI25ng
/mで完全に行われ、セクションＩで使用した材料と比
較して活性が４倍増加したことを示している。モルベー
スでは、BPI調製物は、LPSをほぼ化学量論量の割合で阻
害し、ポリミキシンＢのモル阻害濃度と等しい。BPI
は、発熱物質非含有条件で精製後、低濃度でヒト付着性
単核細胞によるLPS媒介TNF生成も阻害する（表７及び
８）。
/mで完全に行われ、セクションＩで使用した材料と比
較して活性が４倍増加したことを示している。モルベー
スでは、BPI調製物は、LPSをほぼ化学量論量の割合で阻
害し、ポリミキシンＢのモル阻害濃度と等しい。BPI
は、発熱物質非含有条件で精製後、低濃度でヒト付着性
単核細胞によるLPS媒介TNF生成も阻害する（表７及び
８）。
BPIはLPSと結合する（図14）。これらの実験に於いて
は、４μg LPS/ウエルを96穴プラスチックプレート上に
固定し、次いでBPIの濃度を種々変えてインキュベート
し、抗BPIポリクロナール抗血清と反応させた。LPSのBP
Iの結合は、ポリミキシンＢで阻害され（図15）、BPI結
合の特異性を実証している。血漿の存在下（図16）及び
血清の存在下（図17）の両方で、BPIがLPSと結合し、こ
のことは、BPIの潜在的なin vivoでの能力を示してい
る。
は、４μg LPS/ウエルを96穴プラスチックプレート上に
固定し、次いでBPIの濃度を種々変えてインキュベート
し、抗BPIポリクロナール抗血清と反応させた。LPSのBP
Iの結合は、ポリミキシンＢで阻害され（図15）、BPI結
合の特異性を実証している。血漿の存在下（図16）及び
血清の存在下（図17）の両方で、BPIがLPSと結合し、こ
のことは、BPIの潜在的なin vivoでの能力を示してい
る。
実施例３ BPI/内毒素発熱性 ステージI A……グリシン緩衝液の発熱性 グリシン緩衝液対照（Redwood City）305μを、PBS
（Red−wood City）中で7mに希釈し、ポリプロピレン
チューブ（発熱物質非含有）内で混合した。チューブを
ノートブック＃1990でラベルし、３匹のウサギのUSPウ
サギ発熱物質アッセイで、用量2m／ウサギで試験した
（正確な注射用量は2.2m／ウサギであった）。
（Red−wood City）中で7mに希釈し、ポリプロピレン
チューブ（発熱物質非含有）内で混合した。チューブを
ノートブック＃1990でラベルし、３匹のウサギのUSPウ
サギ発熱物質アッセイで、用量2m／ウサギで試験した
（正確な注射用量は2.2m／ウサギであった）。
生成物は非発熱性であった。これは３匹の総てのウサ
ギで全部で0.4℃温度が上昇した。
ギで全部で0.4℃温度が上昇した。
ステージI B……BPI2μの発熱性 BPI（Lot78038,8/19/89製造）304μをBPS（Redwood
City）で7mに希釈し、プロピレンチューブ（発熱物
質非含有）内で混合した。チューブをノートブック＃20
170でラベルし、用量2.0m／ウサギで３匹のウサギのU
SP発熱物質アッセイで試験した。
City）で7mに希釈し、プロピレンチューブ（発熱物
質非含有）内で混合した。チューブをノートブック＃20
170でラベルし、用量2.0m／ウサギで３匹のウサギのU
SP発熱物質アッセイで試験した。
生成物は、全温度上昇が0.2℃であることから示され
るように非発熱性であった。
るように非発熱性であった。
ステージII……内毒素と一緒に前培養したBPIの発熱性 E.Coli 055.B5（Sigma Chemicals）由来の内毒素を、
BPS（Redwood City）で4096EU/mに希釈した。この濃
度をLALアッセイで確認した。
BPS（Redwood City）で4096EU/mに希釈した。この濃
度をLALアッセイで確認した。
BPI（Lot78038,8/19/89製造）304μを、ポリプロピ
レンチューブを用いて、上述したPBSで希釈した内毒素
（4096EU/m）で7mに希釈した。チューブを、効果的
に混合するために、渦巻が生じるように混合した。BPS
中のBPI＋内毒素及び内毒素を、37℃の水浴で30分間培
インキュベートした。37℃でインキュベーション後、BP
I＋内毒素は、内毒素濃度122EU/mとなった。内毒素を
PBSで希釈しても、終点の4096EU/mに変化は生じなか
った。
レンチューブを用いて、上述したPBSで希釈した内毒素
（4096EU/m）で7mに希釈した。チューブを、効果的
に混合するために、渦巻が生じるように混合した。BPS
中のBPI＋内毒素及び内毒素を、37℃の水浴で30分間培
インキュベートした。37℃でインキュベーション後、BP
I＋内毒素は、内毒素濃度122EU/mとなった。内毒素を
PBSで希釈しても、終点の4096EU/mに変化は生じなか
った。
PBS中のBPI＋内毒素及び内毒素を、３匹のウサギのUS
P発熱物質アッセイで試験し、各々全部で4.6℃及び7.5
℃の温度上昇が知見された。
P発熱物質アッセイで試験し、各々全部で4.6℃及び7.5
℃の温度上昇が知見された。
ステージII（繰り返し） 内毒素調製の操作と共に結果を改善するために、我々
は、E.Coli 055:B5（Sigma）から公認FDA文献に変え
た。
は、E.Coli 055:B5（Sigma）から公認FDA文献に変え
た。
EC−５のバイアルを、PBS（Redwood City）で2mに
再び潤し、濃度5000EU/mとした。我々は、この濃度を
LALアッセイによる10,000EU/mのラベルクレームによ
って確認した。
再び潤し、濃度5000EU/mとした。我々は、この濃度を
LALアッセイによる10,000EU/mのラベルクレームによ
って確認した。
BPI＋内毒素サンプルを、PBS7.3m＋EC−５内毒素50
00EU/m 320μにBPI（Lot78038）38μを添加して
調製した。この調製物をポリプロピレンチューブ（発熱
物質非含有）中で混合し、よく撹拌した。EC−５内毒素
8.0mサンプルを、PBS（Redwood City）中で調製し、B
PIを添加せずに同一濃度にした。両方のサンプルを、水
浴中、37℃で30分間インキュベートした。
00EU/m 320μにBPI（Lot78038）38μを添加して
調製した。この調製物をポリプロピレンチューブ（発熱
物質非含有）中で混合し、よく撹拌した。EC−５内毒素
8.0mサンプルを、PBS（Redwood City）中で調製し、B
PIを添加せずに同一濃度にした。両方のサンプルを、水
浴中、37℃で30分間インキュベートした。
２つのサンプルを、LALアッセイを使用して内毒素活
性に関して試験をした。BPI＋内毒素は陰性であった。
内毒素サンプルは、ターゲット200EU/mで陽性であっ
た（図18）。
性に関して試験をした。BPI＋内毒素は陰性であった。
内毒素サンプルは、ターゲット200EU/mで陽性であっ
た（図18）。
両方のサンプルを、３匹のウサギのUSP発熱物質アッ
セイで、用量2.0m／ウサギで試験した。
セイで、用量2.0m／ウサギで試験した。
BPI＋内毒素は、非発熱性であり、全部で1.1℃の温度
上昇であった。BPS中のEC−５内毒素は発熱性であり、
全部で3.9℃の温度上昇であった。
上昇であった。BPS中のEC−５内毒素は発熱性であり、
全部で3.9℃の温度上昇であった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−56133（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−112888（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−258559（ＪＰ，Ａ)
Claims (10)
- 【請求項１】下記発熱活性を阻害するために有効な量の
殺菌性／透過性増強タンパク質（BPI）を含有する、内
毒素の発熱活性を阻害するための組成物。 - 【請求項２】下記リポ多糖媒介腫瘍壊死因子産生を阻害
するために有効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質
（BPI）を含有する、ヒト単核細胞によるリポ多糖媒介
腫瘍壊死因子産生を阻害するための組成物。 - 【請求項３】細胞の内毒素媒介刺激を阻害するために有
効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質（BPI）を含有
する、細胞の内毒素媒介刺激を阻害するための組成物。 - 【請求項４】細胞が好中球または内皮細胞または単核細
胞である請求項３に記載の組成物。 - 【請求項５】下記治療、予防または阻害のために有効な
量の殺菌性／透過性増強タンパク質（BPI）を含有す
る、内毒素の存在に伴う、内毒素関連ショック、内毒素
関連散在性血管内凝固、内毒素関連貧血、内毒素関連白
血球減少症、内毒素関連血小板減少症、内毒素関連呼吸
窮迫症候群または内毒素関連腎不全である疾患を治療、
予防または阻害するための組成物。 - 【請求項６】疾患が内毒素関連ショックである請求項５
に記載の組成物。 - 【請求項７】下記内毒素血症を治療するために有効な量
の殺菌性／透過性増強タンパク質（BPI）を含有する、
内毒素の存在に伴う内毒素血症を治療するための組成
物。 - 【請求項８】下記内毒素血症を予防または阻害するため
に有効な量の殺菌性／透過性増強タンパク質（BPI）を
含有する、内毒素血症に感受性の対象における内毒素の
存在に伴う内毒素結晶を予防または阻害するための組成
物。 - 【請求項９】投与されるBPIの量が10μｇから10mgであ
る請求項１ないし８のいずれか一項に記載の組成物。 - 【請求項１０】BPIが天然のBPIもしくは組み換えBPI、
またはＮ−端アミノ産配列VNPGVVVRISQKGLDを有し分子
量が約25kDである生物学的に活性なBPIの類縁体であ
る、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の組成物。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US31084289A | 1989-02-14 | 1989-02-14 | |
| US310,842 | 1989-02-14 | ||
| US468,696 | 1990-01-22 | ||
| US07/468,696 US5089274A (en) | 1989-02-14 | 1990-01-22 | Use of bactericidal/permeability increasing protein or biologically active analogs thereof to treat endotoxin-related disorders |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04506510A JPH04506510A (ja) | 1992-11-12 |
| JP2966923B2 true JP2966923B2 (ja) | 1999-10-25 |
Family
ID=26977616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2504045A Expired - Fee Related JP2966923B2 (ja) | 1989-02-14 | 1990-02-14 | リポ多糖関連グラム陰性細菌感染を治療するための殺菌性／透過性増強タンパク質またはその生物学的に活性な類縁体の使用 |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5089274A (ja) |
| EP (3) | EP0841064B1 (ja) |
| JP (1) | JP2966923B2 (ja) |
| KR (1) | KR0160133B1 (ja) |
| AT (2) | ATE246933T1 (ja) |
| AU (1) | AU647734B2 (ja) |
| CA (1) | CA2048619C (ja) |
| DE (2) | DE69032579T2 (ja) |
| ES (2) | ES2122958T3 (ja) |
| IL (1) | IL93360A (ja) |
| WO (1) | WO1990009183A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US6132775A (en) * | 1987-08-11 | 2000-10-17 | New York University | Therapeutic uses of biologically active bactericidal/permeability-increasing protein fragments |
| US5198541A (en) * | 1987-08-11 | 1993-03-30 | New York University | Dna encoding bactericidal/permeability-increasing proteins |
| US5594113A (en) * | 1988-06-23 | 1997-01-14 | Associates Of Cape Cod, Inc. | Endotoxin binding and neutralizing protein and uses thereof |
| US5234912A (en) * | 1989-02-14 | 1993-08-10 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Pharmaceutical compositions comprising recombinant BPI proteins and a lipid carrier and uses thereof |
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| US5171739A (en) * | 1989-02-14 | 1992-12-15 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of endotoxin-associated shock and preventation thereof using a BPI protein |
| US5334584A (en) * | 1989-02-14 | 1994-08-02 | Incyte Pharamaceuticals, Inc. | Recombinant, non-glycosylated bpi protein and uses thereof |
| US6265187B1 (en) | 1989-02-14 | 2001-07-24 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Recombinant endotoxin-neutralizing proteins |
| US5484885A (en) * | 1989-07-05 | 1996-01-16 | Emory University | Chemotactic, antibiotic and lipopolysaccharide-binding peptide fragments of CAP37 |
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