JP4537704B2 - カルシウム流入阻害因子およびその単離方法 - Google Patents
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Description
多形核白赤球すなわち顆粒球は、好中球、好酸球、および好塩基球を含む広範囲の白血球のクラスであり、これらは骨髄で産生され、感染生物または外来物質から身体を防御する。好中球は急性炎症の最も重要な細胞成分である。罹患部位への好中球の移動は炎症応答の特徴を示している。好中球は炎症性疾患においても役割を果たすことが示されており、「不適切」な好中球活性化およびそれに続く抑制は、ある特定の疾患における好中球の役割を説明することが提案されている。例えば、不適切な活性化、不活化、および起こり得る自動酸化損傷は、外傷における好中球運動欠陥のメカニズムとして関与してきた。不適切な好中球活性化はまた様々な疾患にも関与してきた。
本願は、細胞外カルシウム流入阻害因子およびそれをヒト乳汁から精製する方法に関する。ヒト乳汁は広範囲の抗炎症性を有し、PMNまたは好中球などの細胞炎症メディエーターを阻害することが示されている。PMNおよび好中球の活性は細胞内遊離カルシウム濃度と相関している。ヒト乳汁は、PMNまたは好中球がアゴニストで刺激された後、ホメオスタシスの状態に戻る時に、外部供給源から細胞へのカルシウム流入を阻害することによってPMNまたは好中球の機能を抑制することができる。他の研究から、ヒト乳汁はまた、細胞内貯蔵器官へのCa++再移行および外部環境へのCa++流出を改善できることも示唆されている。細胞内カルシウム平衡は多くの正常なPMN機能に重要であるように思われるので、細胞内カルシウム貯蔵を枯渇させることによって、広範囲のPMN機能抑制による抗炎症作用を達成する手段が得られるかもしれない。
本願は、PMNへのカルシウム流入を阻害することができるヒト乳汁由来因子の単離および/または精製に関する。
1.清澄化ヒト乳汁を10kDa透析膜で透析し、透析液(「濾液」)を第1の画分として集める段階(例えば、清澄化ヒト乳汁を10kDa透析膜でリン酸緩衝食塩水(「PBS」)に対して一晩透析する);
2.第1の画分を1kDa透析膜で透析して、保持液(「濃縮液」)を第2の画分として集める段階(例えば、第1の画分を1kDaカットオフ膜で吸収透析/濃縮する);
3.第2の画分を有機溶媒(例えば、クロロホルムおよびメタノールの混合物)で抽出し、結果として生じる水相(「水溶性濃縮液」)を集める段階。
遊離Ca++濃度=Kd((R-Rmin)/(Rmax-R))Q
式中、Rは、特定の試験条件下での340/380nm蛍光の比であり、Rmaxは、0.1% トライトン(Triton)X-100で処理された細胞の340/380nm蛍光の比であり、Rminは、0.1% トライトン X-100および20mM EGTAで処理された細胞の340/380nm蛍光の比であり、「Q」は、Ca++遊離条件/Ca++飽和条件下での380nm蛍光の比であり、Kdは、fura2へのCa++結合の解離定数である(校正曲線に基づいてKd =145nM)。アゴニスト刺激後(例えば、PMNを1μM fMLPで処理した後)、遊離Ca++の計算値を用いて遊離Ca++対時間の曲線を作成することができ、この曲線下の面積はアゴニストに対する遊離Ca++応答を示す。
ヒト乳汁から精製CaII因子を生成する本方法は、以下の説明を参照することによって例示される。この説明は、本明細書に示された発明の範囲を例示することを目的とし、本発明の範囲を限定しない。
精製CaII因子は、1回目の透析段階で用いられた膜に応じて、1〜10kDa(すなわち、因子は10kDa透析膜で保持されないが、1kDa膜では保持される)または1〜3.5kDa(すなわち、因子は3.5kDa透析膜で保持されないが、1kDa膜では保持される)の見かけの分子量を有する。因子は、クロロホルム/メタノール混合物などの有機溶媒で抽出されると水相に分配される。因子は陽イオン樹脂にも陰イオン樹脂にも強く結合しない(例えば、本発明のCaII因子はヘパリンセファロースにもダウェックス(Dowex)樹脂にも結合しない)。
ハイパック-フィコール(Hypaque-ficoll)/デキストラン沈降法を用いて、成人ボランティアドナーから得たヘパリン添加血液からPMNを精製した。結果として得られた細胞調製物(一般的に>95%PMN)をCa++およびMg++含有ハンクス液(HBSSw)で107細胞/mlに調整し、記載のように実験に使用した。
血清標本は、室温で30分間凝固させ、縁をつけ(rim)、血餅収縮するように30〜60分間氷上におき、沈殿させた(500×g、10分、4℃)、6個の新鮮な血液試料から調製した。血清を取り出し、使用するまで-20℃で凍結した。血漿試料は、沈殿させ(500×g、10分、4℃)、結果として得られた血小板を多く含む血漿を0.4μフィルターで濾過して含有血小板を除去し、次いで、使用するまで-20℃で凍結することによって6個の異なるヘパリン添加血液試料から調製した。
精製PMNをCa++およびMg++を含まないハンクス液(HBSSw/o)に移し、5×106細胞/mlに調整し、前述のように(8)、37℃、5%CO2で45分間、2μM fura2-AM(モレキュラープローブス、Eugene、OR)と混ぜ合わせた。fura2標識後、細胞を2回洗浄し(15ml HBSSw/o)、HBSSwで107/mlに調整し、励起波長340nmおよび380nmならびに蛍光波長510nmでLS-50B蛍光分光光度計(パーキンエルマーセタス、Norwalk、CT)に入れた。蛍光測定値が安定した後、0〜9%乳汁を細胞に添加し、その反応を記録した。その後、1μM fMLPを添加し、結果として生じた蛍光変化を連続的に記録した。10%、50%、および100%乳汁曝露を調べる実験の場合、適切に希釈した乳汁にfura2標識細胞を再懸濁し、10分間、37℃に保ち、2回洗浄し、HBSSwで107/mlに再調整し、蛍光分光光度計に入れた。安定なベースラインまで平衡に達した後、1μM fMLPを細胞に添加し、その蛍光を、ある期間にわたって連続的に記録した。細胞内遊離Ca++濃度を前述のように計算した。各実験条件のRmaxおよびRminは、Rmaxを計算するために0.1%トライトン X-100による細胞溶解後に観察された蛍光およびRminを計算するために20mM EGTAによるCa++キレート化後に観察された蛍光に基づいている。ホルミルペプチドまたは乳汁曝露後に生じた細胞内遊離Ca++濃度の急な上昇およびゆっくりとした低下(Ca++トランジエント(transient))は、細胞内遊離Ca++濃度のベースラインレベルと、fMLP添加後に達した最大の高さとの差を測定することによって定量した。fMLPで動員された細胞内Ca++貯蔵に及ぼす複数回の乳汁添加の影響を調べる実験では、3%乳汁を蛍光光度計キュベットに0〜4回連続添加した後にfMLPを添加し、fMLPで誘導されたCa++トランジエントの高さを前述のように測定し、対照(先行する乳汁添加なし)のパーセントとして、fMLPで誘導されたトランジエントの高さを表した。
精製PMN(107)を乳汁/HBSSw希釈液の0.5mlアリコートに再懸濁し、10分間、37℃に保った。乳汁対照は、希釈した乳汁(添加細胞なし)の同じアリコートを含み、血漿対照は、血漿希釈液±添加細胞であった。インキュベーション後、細胞を沈殿させ(5分、14,000×g、室温)、これらの上清およびその対応する対照乳汁希釈液を取り出し、試験するまで-70℃で凍結した。受容体シェディングを定量するために、試料(細胞ありおよび細胞なし)のsTNFRIおよびsTNFRII含有量をEASIA(メドジェニクス(Medgenix Inc)、Fleures、Belgium)で調べ、sIL-1RII含有量をELISA(アールアンドディーシステムズ(R&D Systems)、Minneapolis、MN)で調べた。添加細胞のある試料と添加細胞のない試料との可溶性サイトカイン受容体含有量の差を、乳汁、精製因子、または血漿の曝露中にシェディングされたサイトカイン受容体の量とした。実験は、2種類の異なる試料と各PMN調製物を用いて、または1種類の異なるPMN調製物と各試料を用いて行うことができる。
精製PMNを2×107細胞/mlに調整し、HBSSw、1μM fMLP、乳汁、乳汁画分、または血清希釈液に曝露し、5分間、37℃に保った。インキュベーション後、細胞を固定し(ホルマリン10%v/v、25℃、30分)、沈殿させ、ホルマリンから取り出し、107細胞/mlで冷HBSSwに再懸濁した。5μlの細胞懸濁液を、水に溶解した0.1%クリスタルバイオレットと1:1で混ぜ合わせ、カバーガラスの下に入れ、オリンパス(Olympus) BH2倒立顕微鏡を用いて調べた。細胞の顕微鏡画像をデジタル形式で取り込み(400×、Connectix Color QuickCam、コネティックス(Connectix)、San Mateo、CA)、グレースケールファイルとして保存し、デジタル画像に取り込まれた全細胞の長軸および短軸の長さ(ピクセル)を測定するために画像解析ソフトウェア(SigmaScan Pro、ジャンデルサイエンティフィック(Jandel Scientific)、San Rafael、CA)にインポートした。これらの測定値から、各細胞の長軸:短軸比を計算した(丸い細胞の場合、長軸:短軸=1)。各実験条件から少なくとも25の画像(54〜120の個々の細胞)を集め、測定し、データをプールし、各試料の細胞形状の尺度として平均軸比を調べた。同じ希釈の各試料のこれらの平均値を平均し、結果として得られた値を、それぞれの試料希釈条件における細胞形状の尺度とした。
1mlアリコート中の精製PMN(HBSSwで5×106/ml)を、2mlで0%〜50%の最終試料濃度となるように乳汁または乳汁画分と混ぜ合わせた。0.5ミリリットル体積のこの細胞懸濁液を、24ウェル組織培養プレートの2通りのウェルに入れ、20ng/ml(最終)ホルボールミリステートアセテート(PMA)を2通りのウェルの一方に添加した。培養プレートを15分間、37℃、5%CO2に保ち、次いで、非接着細胞を除去するために各ウェルをHBSSwで穏やかに2回洗浄し、水切りし、接着細胞を可溶化するためにHTAB緩衝液(50mMリン酸カリウム(pH6.0)に溶解した0.5%ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド)0.5mlを各ウェルに添加した(25℃、15分)。インキュベーション後、HTAB緩衝液を除去し、ペルオキシダーゼ活性をアッセイするまで-70℃で凍結した。アッセイ法を校正するために、2.5×106PMNのアリコートを沈殿させ、細胞ペレットをHTAB緩衝液で可溶化し、この試料のペルオキシダーゼ活性を2.5×106細胞に存在する活性とした。ペルオキシダーゼ活性を測定するために、HTAB緩衝液上清を融解し、0.1mlをアッセイ緩衝液(0.167mg O-ジアニソジンHCl/mlおよび50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)に溶解した0.0005% H2O2)2.9mlと混ぜ合わせ、茶色の発色を、ラムダ-6分光光度計(パーキンエルマーセタス、Norwalk CT)を用いてOD460で追跡した。色強度の測定値を90秒間10秒毎に記録し、最後の60秒間のΔOD460を試料のペルオキシダーゼ活性の尺度とした。データを、各条件におけるプラスチックに接着した細胞のパーセントに換算するために、各実験試料について観察されたΔOD460を、2.5×106細胞に相当する標準で観察されたΔOD460で割った。
新鮮に精製されたPMN(HBSSw中で2×107/ml)を、所望の最終試料濃度になるように乳汁または乳汁画分と1:1で混ぜ合わせ、500rpmで連続攪拌しながら37℃でクロノログ(Chrono-Log)モデル560血小板凝集計に入れた。各実験間の細胞老化による系統だった人為結果を避けるために、異なる試料濃度を調べる順序を実験ごとに反対にした。温度が平衡状態に達する間、光透過の上限および下限を、それぞれ、8×106細胞/mlおよび10×108細胞/mlに設定し、凝集を誘導するためにfMLP(1μM最終)を細胞懸濁液に添加した。凝集細胞の光透過をfMLP添加後3分間記録した。紙の形の凝集曲線記録を、フラットベットスキャナーを用いてデジタル画像に変換した。各条件での凝集反応の尺度として凝集曲線下の3分間の面積(ピクセル2)を定量するために、結果として得られた画像を解析した(SigmaScan Pro、Jandel Scientific、San Rafael、CA)。1μM fMLPに対するPMN凝集反応に及ぼす1%、4%、10%、25%、および50%血清の影響を調べた対照実験から、これらの血清濃度はどれもPMN凝集を抑制する作用がないことが分かった。
本願は、2001年9月12日に出願された米国特許仮出願第60/322,057号の優先権を主張し、この開示内容は参照として本明細書に組み入れられる。
Claims (14)
- 清澄化ヒト乳汁由来因子を精製する方法であって、以下の段階を含む方法:
(i)清澄化ヒト乳汁から第1の画分を単離する段階であり、ここで、第1の画分が、約1kDa以上および約10kDa以下の見かけの分子量を有する成分を含む段階;及び
(ii)該第1の画分から脂溶性成分を除去して、カルシウム流入阻害活性を示す成分を含む第2の画分を得る段階であって、脂溶性成分の除去が有機溶媒での第1の画分の抽出および水相の保存を含む段階。 - 請求項1記載の方法により生成されたヒト乳汁由来精製因子。
- ヒト乳汁由来因子を精製する方法であって、以下の段階を含む方法:
(i)清澄化ヒト乳汁を10kDaカットオフ膜で透析して、透析液を第1の画分として得る段階;
(ii)第1の画分を1kDaカットオフ膜で透析して、保持液を第2の画分として単離する段階;
(iii)脂溶性成分を溶解することができる溶媒で第2の画分を抽出して、カルシウム流入阻害活性を示す成分を含む第3の画分を得る段階。 - 請求項3記載の方法により生成されたヒト乳汁由来精製因子。
- 約1kda以上および約10kda以下の見かけの分子量を有し、水溶液に可溶性であり、脂溶性物質を実質的に含まず、カルシウム流入阻害活性を示し、且つローリー法において陽性反応を生じない、ヒト乳汁由来精製因子。
- 100℃、10分間の熱処理に対して耐性である、請求項5記載の因子。
- 60℃、10分間のpH2への酸性化に対して耐性である、請求項5記載の因子。
- 25℃、10分間のpH12へのアルカリ化に対して耐性である、請求項5記載の因子。
- 37℃、10分間の1μg/mlプロテイナーゼK処理に対して耐性である、請求項5記載の因子。
- 凍結融解処理に対して安定である、請求項5記載の因子。
- 約3.5kda以下の見かけの分子量を有する、請求項5記載の因子。
- 多形核白血球へのカルシウム流入を阻害するための薬剤の製造における、請求項1記載の方法により精製された因子の使用。
- 多形核白血球へのカルシウム流入を阻害するための薬剤の製造における、請求項3記載の方法により精製された因子の使用。
- 多形核白血球へのカルシウム流入を阻害するための薬剤の製造における、請求項5記載の精製因子の使用。
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