MXPA02004228A - Derivado de acido hidroxamico como inhibidor de la formacion de cd23 humana soluble. - Google Patents

Abstract

Un compuesto de formula (1) (ver formula) en donde: R es isopropilo n es 0; Rl es naftilmetilo; R2 es t-butilo; y R3 es metilo; es util en el tratamiento de trastornos mediados por s-CD23.

Description

DERtVADO DE ACTO Hl ROXAMlCO COMO INHIBIDOR DE LA FORMACIÓN DE CD23 HUMANA SOLUBLE MEMORIA DESCRIPTIVA Esta invención se refiere a un inhibidor novedoso de la formación de CD23 humana soluble, y a su uso en el tratamiento de condiciones asociadas con la producción excesiva de CD23 soluble (s-CD23), tales como enfermedades autoinmunes, inflamación y alergias La CD23 (el receptor de IgE de baja afinidad FceRli, Blasto 2), es una proteína integral de tipo II de 45 kDa expresada sobre la superficie de una variedad de células maduras, incluyendo linfocitos B y T, macrófagos, células asesinas naturales, células de Langerhans, monocitos y plaquetas (Delespesse et al., Adv. Immunol., 49

[1991] 149-191). También hay una molécula tipo CD23 en eosinófilos (Grangette y et al., J. Immunol. 143

[1989] 3580-3588). La CD23 ha sido implicada en la regulación de la respuesta inmune (Delespesse et al., Immunol. Rev., 125

[1992] 77-97). La CD23 humana existe como dos isoformas reguladas diferencialmente, a y b, las cuales son diferentes sólo en los aminoácidos en el extremo N intracelular (Yokota et al., Cell, 55

[1988] 611-618). En el hombre la isoforma a constitutiva se encuentra únicamente en linfocitos B, mientras que el tipo b, inducible por IL4, se encuentra sobre todas las células capaces de expresar CD23. '-z*****-^.. ----*--------*--------*-- álí ¿ü , Se sabe que la CD23 intacta unida a célula (¡-CD23), sufre segmentación desde la superficie de la célula, llevando a la formación de un número de fragmentos solubles bien definidos (S-CD23), los cuales son producidos como resultado de una secuencia compleja de eventos proteolíticos, el mecanismo de los cuales aún es poco entendido (Bourget et al., J. Biol. Chem. 269

[1994] 6927-6930). Aunque no se ha probado hasta el momento, se cree que los fragmentos solubles principales (Mr 37, 33, 29 y 25 kDa) de estos eventos proteolíticos, todos los cuales conservan el dominio de lectina del extremo C común a ¡-CD23, ocurren secuencialmente por medio de la formación inicial del fragmento de 37 kDa (Letellier et al., J. Exp. Med., 172

[1990] 693-700). Una vía de corte intracelular alternativa lleva a un fragmento de 16 kDa estable en el dominio de la terminal C de ¡-CD23 (Grenier-Brosette et al., Eur. J. Immunol., 22

[1992] 1573-1577). Se han atribuido varias actividades a la ¡-CD23 unida a membrana en humanos, todas las cuales han mostrado jugar un papel en la regulación de IgE. Las actividades particulares incluyen: a) presentación de antígenos, b) citotoxicidad de eosinófilos mediada por IgE, c) regreso de células B a centros germinales de nodulos linfáticos y bazo, y d) la subregulación de la síntesis de IgE (Delespesse et al., Adv. immunol. 49,

[1991] 149-191 ). Los tres fragmentos de CD23 solubles de peso molecular más alto (Mr 37, 33 y 29 kDa) tienen propiedades de citocina multifuncionales que parecen jugar un papel principal en la producción de IgE. De esta manera, la formación excesiva de S-CD23 ha estado implicada en la sobreproducción - -«fttaj de IgE, la característica de enfermedades alérgicas tales como asma extrínseco, rinitis, conjuntivitis alérgica, eccema, dermatitis atópica y anafilaxis (Sutton y Gould, Nature, 366,

[1993] 421-428). Otras actividades biológicas atribuidas a S-CD23 incluyen la estimulación del crecimiento de células B y la inducción de la liberación de mediadores a partir de monocitos. De esta manera, se han observado niveles elevados de S-CD23 en el suero de pacientes que tienen leucemia linfocítica B-crónica (Sarfati et ai., Biood, 71

[1988] 94-98) y en los fluidos sinoviales de pacientes con artritis reumatoide (Chomarat et al., Arthritis and Rheumatism, 36

[1993] 234-242). Un número de fuentes sugieren que hay un papel para CD23 en la inflamación. Primero, se ha reportado que sCD23 se une a receptores extracelulares que cuando son activados están implicados en eventos de inflamación mediados por células. De esta manera, se reporta que sCD23 activa directamente la liberación de TNF, IL-1 e IL-6 monocíticos (Armant et al., vol. 180, J. Exp. Med., 1005-1011 (1994)). Se ha reportado que CD23 interactúa con las moléculas de adhesión de B2-integrina, CD11b y CD11c, en monocitos/macrófagos (S. Lecoanet-Henchoz et al., Immunity, vol. 3; 119-125 (1995)) las cuales activan la liberación de NO2", peróxido de hidrógeno y citocína (IL-1 , IL-6 y TNF). Finalmente, IL-4 o IFN inducen la expresión de CD23 y su liberación como sCD23 por monocitos humanos. La ligación del receptor de CD23 unido a membrana con complejos inmunes IgE/anti-lgE o mAb anti CD23 activa la producción de cAMP e I L-6 y la formación de tromboxano B2, demostrando un papel mediado por receptores de CD23 en inflamación. ¿^3^*^,;^^^^ Debido a estas varias propiedades de CD23, los compuestos que inhiben la formación de S-CD23 deben tener acciones dobles de a) incrementar la inhibición por realimentación negativa de la síntesis de IgE manteniendo niveles de ¡-CD23 sobre la superficie de células B y b) inhibir las actividades de citocina inmunoestimuladora de fragmentos solubles de peso molecular más alto (Mr 37, 33 y 29 kDa). Además, la inhibición del corte de CD23 debe mitigar la activación de monocitos inducida por S-CD23 y la formación de mediadores, reduciendo de esta manera la respuesta inflamatoria.

La solicitud de patente internacional No. WO 96/02240 (Smithlkline Beecham pie) describe que los compuestos que inhiben la acción de metaloproteasas de matriz (por ejemplo, colagenasa, estromelisina y gelatinasa) son inhibidores efectivos de la liberación de CD23 soluble humana transfectada en sistemas de cultivo de células humanas. La solicitud de patente internacional No. WO 97/02239 (British Biotech Pharmaceuticals Limited) describe que ciertos compuestos de la fórmula (A) tienen una actividad de metaloproteasa matriz: (A) La solicitud de patente internacional No. WO 99/67201 (Smithkline Beecham pie) describe que ciertos compuestos de la fórmula (I) son inhibidores efectivos de la liberación de CD23 soluble humana transfectada en sistemas de cultivo de células humanas: (I) Se ha encontrado de manera sorprendente que ciertos compuestos de fórmula (I) tiene de manera inesperada buena disponibilidad. De acuerdo con la presente invención, se provee un compuesto de la fórmula (I) anterior, en donde: n es 0; R es isopropilo R1 es naftilmetilo R2 es t-butilo; y R3 es metilo. De acuerdo con un aspecto adicional, la presente invención provee el uso de un compuesto de la invención para la producción de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de trastornos tales como alergia, trastornos inflamatorios y enfermedad autoinmune en la cual está implicada la sobreproducción de S-CD23 En un aspecto adicional, la invención provee un método para el tratamiento o profilaxis de trastornos tales como alergia, trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunes, en los cuales está implicada la fctmfagija sobreproducción de S-CD23, método que comprende la administración de un compuesto de la invención a un mamífero humano o no humano que lo requiera. La invención provee también una composición farmacéutica para el tratamiento o profilaxis de trastornos tales como alergia, trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunes, en los cuales está implicada la sobreproducción de S-CD23, la cual comprende el compuesto de la invención y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable para el mismo. Los trastornos inflamatorios particulares incluyen trastornos del SNC tales como enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple y demencia multi-infarto, así como las secuelas mediadas por inflamación de embolia y trauma craneal. Debe entenderse que las sales farmacéuticamente aceptables, solvatos y otros derivados farmacéuticamente aceptable del compuesto de la invención también se incluyen en la presente invención. Las sales de los compuestos de la fórmula (I) ¡ncluyen por ejemplo sales acidas de adición derivadas de ácidos inorgánicos u orgánicos, tales como clorhidratos, bromhidratos, yodhidratos, p-toluensulfonatos, fosfatos, sulfatos, acetatos, trifluoroacetatos, propionatos, citratos, maleatos, fumaratos, malonatos, succinatos, lactatos, oxalatos, tartratos y benzoatos. Las sales también pueden ser formadas con bases. Dichas sales incluyen sales derivadas de bases inorgánicas u orgánicas, por ejemplo, sales de metal alcalino tales como sales de sodio o potasio, y sales de amina orgánica tales como sales de morfolina, piperidina, dímetilamina o dietilamina. Se ha encontrado sorprendentemente que el compuesto de la presente invención presenta propiedades de absorción in vivo útiles por medio de la vía oral como también es inhibidor potente y selectivo del procesamiento de CD23 Los compuestos de la invención pueden prepararse mediante el uso de cualquier método convencional adecuado, por ejemplo mediante analogía con los métodos descritos en la publicación de patente WO 97/02239 (British Biotech Pharmaceuticals Limited). En consecuencia, un aspecto más de la invención provee un procedimiento para preparar un compuesto de la invención como el definido anteriormente en la presente, el cual comprende: a) desproteger un compuesto de la fórmula (II): en donde X es un grupo protector tal como bencilo o trimetilsililo o b) hacer reaccionar un compuesto de la fórmula (lll): (IID en donde el grupo hidroxi se protege opcionalmente, con hidroxilamina o una sal de la misma. Los compuestos de las fórmulas (II) y (lll) son novedosos y forman un aspecto más de la invención. El compuesto de la fórmula (II) puede prepararse a partir del compuesto de la fórmula (lll) mediante reacción con una hidroxilamina protegida. El compuesto de la fórmula (lll) que tiene un grupo hidroxi protegido, puede convertirse mediante hidrólisis en un compuesto de fórmula (lll) no protegido. Los grupos protectores adecuados para un ácido hidroxámico se conocen bien en la técnica, e incluyen bencilo, trimetilsililo, t-butilo y t- butildimetilsilílo. Los grupos protectores adecuados para un ácido carboxílico se conocen bien en la técnica e incluyen t-butilo, bencilo y metilo. El compuesto de la fórmula (lll) puede prepararse haciendo reaccionar un compuesto de la fórmula (IV) o (IVa): en donde Y es un grupo protector para carboxilo, con un compuesto de fórmula (V): (V) Si (IVa) se utiliza, una alquilación subsecuente del grupo hidroxilo puede entonces requerirse. El compuesto de la fórmula (IV) puede prepararse protegiendo un compuesto correspondiente en el cual Y sea hidrógeno, el cual a su vez puede prepararse- a) haciendo reaccionar un compuesto de la fórmula (VI): (VI) en donde R1 es como se definió anteriormente en la presente y 2 es un grupo protector para carboxilo, con un agente alquilante; y b) removiendo los grupos protectores. El compuesto de la fórmula (VI) en donde Z es hidrógeno puede prepararse haciendo reaccionar un diéster (tal como el éster dimetílico o dietílico) de ácido 2-h?droxisuccínico con un compuesto de la fórmula R1X' en presencia de una base fuerte tal como diisopropilamida de litio, en donde R1 es naftilmetilo X' es un grupo saliente tal como bromo o yodo, y después hidroiizando el compuesto resultante para remover los grupos éster. Los isómeros, incluyendo estereoísómeros, del compuesto de la presente invención pueden prepararse como mezclas de tales isómeros o como isómeros individuales. Los isómeros individuales pueden prepararse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, se pueden preparar estereoisómeros individuales mediante síntesis química estereoespecífica iniciando a partir de substratos quirales o separando mezclas de diastereoisómeros usando métodos conocidos. En un aspecto preferido, la invención provee compuestos de la fórmula (IA): (1A) l^^.tJli^r* ß¡Íl» * JLa^.aa* ¿? tt * * Se prefiere que los compuestos sean aislados en forma sustancialmente pura. Como se indicó en la presente, un inhibidor de la formación de CD23 humana soluble tiene propiedades médicas útiles. De preferencia, los compuestos activos se administran como composiciones farmacéuticamente aceptables. Las composiciones están adaptadas preferiblemente para administración oral. Sin embargo, pueden ser adaptados para otros modos de administración, por ejemplo en forma de una aspersión, aerosol u otro método para inhalación convencional, para tratar trastornos del tracto respiratorio; o administración parenteral para pacientes que sufran de insuficiencia cardiaca. Otros modos de administración alternativos incluyen administración sublingual o transdérmica. Las composiciones pueden estar en forma de tabletas, cápsulas, polvos, granulos, trociscos, supositorios, polvos reconstituibles o preparaciones líquidas, tales como soluciones o suspensiones parenterales orales o estériles. Para obtener consistencia de administración se prefiere que una composición de la invención esté en forma de una dosis unitaria. Las formas de presentación de dosis unitaria para administración oral pueden ser tabletas y cápsulas, y pueden contener excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes, por ejemplo jarabe, acacia, gelatina, sorbítol, tragacanto o polivinilpirrolidona; rellenos, por ejemplo lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato de calcio, sorbitol o glicina; lubricantes de tableteo, por ejemplo estearato de magnesio; desintegrantes, por ejemplo almidón, polivinilpirrolidona, glicolato de almidón de sodio o celulosa microcristalina o agentes humectantes farmacéuticamente aceptables tales como lauriisulfato de sodio. Las composiciones orales sólidas pueden prepararse mediante métodos convencionales de mezclado, llenado o tableteo. Pueden usarse operaciones de mezclado repetidas para distribuir el agente activo uniformemente en las composiciones que empleen grandes cantidades de rellenos. Dichas operaciones son por supuesto convencionales en la técnica. Las tabletas pueden recubrirse de acuerdo con métodos bien conocidos en la práctica farmacéutica normal, en particular con un recubrimiento entérico. Las preparaciones líquidas orales pueden estar en forma de, por ejemplo, emulsiones, jarabes o elixires, o pueden presentarse como un producto seco para su reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de usar. Dichas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes suspensores, por ejemplo, sorbitol, jarabe, metilcelulosa, gelatina, hidroxietilcelulosa, carboximetilcelulosa, gel de estearato de aluminio, grasas comestibles hidrogenadas; agentes emulsificantes, por ejemplo lecitina, monooleato de sorbitán o acacia; vehículos no acuosos (los cuales pueden incluir aceites comestibles), por ejemplo aceite de almendras, aceite de coco fraccionado, esteres aceitosos tales como esteres de glicerina, propilenglicol o alcohol etílico; conservadores, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de metilo o propilo o ácido sórbico; y si se desea agentes saborizantes o colorantes convencionales. Para administración parenteral, se preparan formas de dosificación unitaria fluidas utilizando el compuesto y un vehículo estéril, y, dependiendo de la concentración usada, pueden ser suspendidas o disueltas en el vehículo. Para preparar soluciones el compuesto puede ser disuelto en agua para inyección y esterilizarse en filtro antes de rellenarlo en un frasco o ampolleta adecuado y sellando. En forma adecuada, auxiliares tales como un anestésico local, un conservador y agentes reguladores de pH pueden ser disueltos en el vehículo. Para incrementar la estabilidad, la composición puede ser congelada después de colocarla en el frasco, y el agua removerse al vacío. Las suspensiones parenterales se preparan sustancialmente de la misma manera, excepto que el compuesto es suspendido en el vehículo en lugar de ser disuelto, y la esterilización no puede lograrse mediante filtración. El compuesto puede ser esterilizado mediante exposición a óxido de etileno antes de suspenderlo en el vehículo estéril. En forma adecuada, se incluye un agente tensioactivo o humectante en la composición para facilitar la distribución uniforme del compuesto. Las composiciones de esta invención también pueden presentarse adecuadamente para su administración al tracto respiratorio como una inhalación o un aerosol o solución para un nebulizador, o como un polvo microfíno para insuflación, solo o en combinación con un vehículo inerte tal como lactosa. En tal caso, las partículas del compuesto activo tienen * *í adecuadamente diámetros de menos de 50 mieras, preferiblemente menos de 10 mieras, por ejemplo diámetros en la escala de 1-50 mieras, 1-10 mieras o 1-5 mieras. Cuando sea adecuado, pueden incluirse cantidades pequeñas de otros anti-asmáticos o broncodilatadores, por ejemplo, aminas 5 simpatomiméticas tales como isoprenalina, ¡soetarina, salbutamol, fenilefrina y efedrina; derivados de xantina tales como teofilina y aminofilina, y corticoesteroides tales como prednisolona y estimulantes adrenales tales como ACTH. Las composiciones pueden contener de 0.1 % a 99% en peso, 10 preferiblemente de 10-60% en peso, de material activo, dependiendo del método de administración. Una escala que se prefiere para administración inhalada es 10-99%, especialmente 60-99%, por ejemplo 90, 95 ó 99%. Las formulaciones en polvo microfino pueden administrarse adecuadamente en un aerosol como una dosis medida o por medio de un 15 dispositivo activado por el aliento adecuado. Las formulaciones en aerosol de dosis medida adecuadas comprenden propelentes convencionales, cosolventes, tales como etanol, agentes tensioactivos tales como alcohol oleílico, lubricantes tales como alcohol oleílico, desecantes tales como sulfato de calcio y modificadores de 20 densidad tales como cloruro de sodio. Las soluciones adecuadas para un nebulizador son soluciones esterilizadas isotónicas, opcionalmente amortiguadas, por ejemplo a un pH de entre 4 y 7, que contengan hasta 20 mg/ml de compuesto, pero más á^M ^tiz^ ^ í^^t^ ^.j^A^áz,...^, -j^?á^ják:í1M^a¿j&^A?Mtí?M.a??. i. generalmente 0.1 a 10 mg/ml, para usarse con equipo de nebulización estándar. Una cantidad efectiva dependerá de la eficacia relativa de los compuestos de la presente invención, de la severidad del trastorno que se esté tratando y del peso del paciente. En forma adecuada, una forma de dosis unitaria de una composición de la invención puede contener de 0.1 a 1000 mg de un compuesto de la invención (0.001 a 10 mg mediante inhalación) y más usualmente de 1 a 500 mg, por ejemplo 1 a 25 ó 5 a 500 mg. Tales composiciones pueden administrarse de una a seis veces al día, más comúnmente de 2 a 4 veces al día, de una manera tal que ia dosis diaria sea de 1 mg a 1 g para un adulto humano de 70 kg, y más particularmente de 5 a 500 mg Esto se encuentra en la escala de aproximadamente 1.4 x 10"2 mg/kg/día a 14 mg/kg/día, y muy particularmente en la escala de aproximadamente 7 x 10*2 mg/kg/día a 7 mg/kg/día. Los siguientes ejemplos ilustran la invención pero no la limitan de ninguna manera.

Métodos de prueba biológicos Procedimiento 1 : Se investigó la capacidad de los compuestos de prueba para inhibir la liberación de CD23 soluble mediante el uso del siguiente procedimiento. yU*U¡Í?*A.é*?*i:>J.Lx¿>»3~*, Prueba de actividad de corte de CD23 en membrana de célula RPMI 8866 Membranas de plasma de células RPMI 8866, una línea de células B transformadas con virus de Epstein-Barr (Sarfati et al., Immunology 60

[1987] 539-547) que expresan niveles altos de CD23, son purificadas usando un método de extracción acuosa. Las células resuspendidas en amortiguador de homogeneización (20 mM de HEPES pH 7.4, 150 mM de NaCI, 1.5 mM de MgCI2, 1 mM de DTT) son rotas mediante cavitación con N2 en una bomba Parr, y la fracción de membrana de plasma mezclada con otras membranas se recupera mediante centrifugación a 10,000 Xg. La pella ligera se resuspende en fosfato de potasio 0.2 M, pH 7.2 usando 2 ml por 1-3 g de células húmedas y la pella nuclear se descarta. Las membranas se fraccionan más, dividiéndolas entre Dextran 500 (6.4% p/p) y polietilenglicol (PEG) 5000 (6.4% p/p) (ref), en sacarosa 0.25 M en un total de 16 g por 10-15 mg de proteínas de membrana [Morre y Morre, BoiTechniques 7,946-957 (1989)]. Las fases se separan mediante centrifugación breve a 1000 Xg y la fase de PEG (superior) se recoge, se diluye 3-5 veces con 20 mM de amortiguador de fosfato de potasio, pH 7.4, y se centrifuga a 100,000 Xg para recuperar las membranas en esa fase. La pella se resuspende en solución salina amortiguada con fosfato, y consiste de membranas de plasma enriquecidas 3- 4 veces, así como algunas otras membranas de células (por ejemplo, lisosomas, Golgi). Se forman alícuotas de las membranas y se almacenan a - 80°C. El fraccionado a 6.6% en Dextrano/PEG produce membranas de plasma enriquecidas 10 veces. Las membranas fraccionadas se incuban a 37°C por tiempos hasta 4 horas para producir fragmentos de CD23 los cuales son separados de la membrana mediante filtración en placas de filtro Durapore de 0.2 mieras (Millipore), después de extinguir la prueba con una preparación 1 de 5 µM de P 30994. La sCD23 liberada de la membrana se determina usando el equipo EIA de The Binding Site (Birmingham, RU) o uno similar utilizando mAb MHMß anti-CD23 [Rowe Et al., Int. J. Cáncer, 29, 373-382 (1982)] u otro mAb anti- CD23 como el anticuerpo de captura en un EIA de sandwich. La cantidad de CD23 soluble hecha por proteína de membrana de 0.5 ug en un volumen total de 50 µl de solución salina amortiguada con fosfato se mide mediante EIA y se compara con la cantidad hecha en presencia de varias concentraciones de inhbidores. Los inhibidores se preparan en soluciones de agua o sulfóxido de dimetilo (DMSO) y la concentración de DMSO final no es de más de 2%. Se determinan las IC50 mediante ajuste de curva como la concentración en donde se observa inhibición del 50% de sCD23 en relación con la diferencia en sCD23 entre los controles incubados sin inhibidor.

Resultados N'-[4-(N-hidroxiamino)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S- tert-leucinmetilamida dio un IC50 de 60 nm en la prueba anterior.

Procedimiento 2: Se investigó la capacidad de los compuestos de prueba para inhibir colagenasa usando el siguiente procedimiento.

Prueba de inhibición de colagenasa Se determinó la potencia de los compuestos para actuar como inhibidores de colagenasa mediante el método de Cawston y Barrett (Anal. Biochem. 99, 340-345, 1979), incorporado en la presente a manera de referencia, con io cual una solución de 1 mM del inhibidor que se está probando o diluciones del mismo, se incubó a 37°C durante 18 horas con colágeno y colagenasa recombinante humana, a partir de fibroblastos sinoviales clonados, expresados y purificados a partir de E. coli, (amortiguada con 150 mM de Tris, pH 7.6, que contenía 15 mM de cloruro de calcio, 0.05% de Brij 35, 200 mM de cloruro de sodio y 0.02% de azida de sodio). El colágeno fue colágeno de bovino 3H tipo 1 acetilado preparado mediante el método de Cawston y Murphy (Methods in Enzimology 80, 711 , 1981 ). Las muestras fueron centrifugadas para sedimentar colágeno no digerido y una alícuota del sobrenadante radioactivo se removió para prueba en un contador de escintilación como una medida de hidrólisis. Se comparó la actividad de colagenasa en presencia de 1 mM de inhibidor, o la dilución del mismo, con la actividad en un control sin inhibidor, y los resultados se reportan como la concentración que efectúa 50% de la coleganeasa (IC50). Procedimiento 3: Se investigó la capacidad de los compuestos de prueba para inhibir la liberación de TNF usando el siguiente procedimiento.

Prueba para la inhibición de la liberación de TNFa a partir de monocitos humanos estimulados mediante endotoxina de lipopolisacárido (LPS) Monocitos humanos, cultivados en medio RPMI 1640 complementado con 10% de suero de becerro fetal, se centrifugan a 1000 Xg durante 5 minutos y después se resuspenden en medio a 2 X 106 células/ml. Se forman alícuotas de la suspensión de células en placas de 24 cavidades, 1 ml por cavidad. Los compuestos a ser probados se disuelven en sulfóxido de dimetilo (DMSO) concentrado y se añadieron al cultivo con la concentración final de DMSO a 0.1%. Los compuestos se añaden a las células en cavidades triplicadas. La liberación de TNFa es estimulada mediante la adición de LPS a las células a una concentración final de 200 ng/ml. También se establecen cultivos de control adecuados por triplicado. Las placas se incuban durante 18-20 horas a 37°C, 5% de CO2 y después se centrifugan a 1000 Xg durante 5 minutos. Se usa una prueba ELISA específica para TNFa humano (Smithkline Beecham) para medir los niveles de TNF en los sobrenadantes de cultivo libres de células.

Resultados La N'-[4-(N-hidroxiamino)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-tert-leucinametilamida no mostró efecto en la liberación de TNF a 10 uM.

Procedimiento 4: La biodisponibilidad de los compuestos de prueba se investigo utilizando los siguientes estudios de bio-equivalencia.

Un estudio para evaluar los parámetros de farmacocinética i.v, v biodisponibilidad oral en ratas Spraque Dawlev macho Este estudio se llevó a cabo utilizando un diseño entrecruzado de cuatro días de estudio por separado. Tres ratas recibieron catéteres en la vena femoral implantados quirúrgicamente para infusión de moléculas prueba a! menos tres días antes del inicio del estudio. Todas ias dosis en este estudio se preparan utilizando compuesto de prueba cristalino. En el día de estudio uno, los animales (alimentados) recibieron el compuesto de prueba como una infusión intravenosa de 30-minutos a una dosificación objetivo de 4.0 umoles/kg (7.0 mL/kg). Esta solución de la dosis se preparó en Encapsin® acuosa al 20% (pH = 8 0) y que contenía 1 % de DMSO. Encapsin® (Cerestar USA Inc., Hammond, IN) es hidroxipropil-beta-ciclodextrina, un oligosacárido cíclico utilizado para mejorar la solubilidad de compuestos que de otra manera requerirían la formulación utilizando solventes no acuosos. En el día de estudio dos, los animales (en ayuno) recibieron el compuesto prueba como una solución en una dosificación objetivo de 8 umoles/kg mediante gavage oral (16 mL/kg). La solución de dosificación se preparó en gelatina porcina succinada acuosa al 5% (pH = 7.5) y que contenía 1 % de DMSO.

Las muestras de sangre se recolectaron a partir de una vena de la cola lateral. Un alícuota de 25 uL de cada muestra de sangre total se añadió a 25 tú. de agua y se permitió que estuviera sobre el hielo durante aproximadamente 5 minutos para facilitar la hemolisis completa; las muestras entonces se almacenaron congeladas hasta el análisis. Las concentraciones de sangre del compuesto de prueba se cuantificaron medíante LC/MS/MS (LLQ = 10.0 ng/mL). Tanto los análisis farmacocinéticos de no compartimento como los de compartimento se realizaron en estos datos utilizando WinNonlin para recuperar los parámetros farmacocinéticos i.v, apropiados. Varios modelos de compartimento y paradigmas de peso se emplearon; un modelo de dos compartimentos con un eliminación de primer orden del compartimento central y una carga de mínimos cuadrados iterativos con un peso de 1/Y2 proveyeron un mejor ajuste a los datos observados, de conformidad con el criterio de selección de modelo estándar (es decir, Akaike's Information Criterion, Schwartz Criterion, and sum of squared residuals). Los parámetros de farmacocinética se calcularon utilizando el modelo de compartimento de mejor ajuste; todos los cálculos que requirieron utilizar los valores AUC (incluyendo biodisponibilidad) se realizaron utilizando AUC recuperado del análisis de no compartimento. »? xA*J>?^a?a^.?b*?i?? Un estudio pata estimar los parámetros farmacocinéticos i.v v biodisponibilidad oral en perros Beagle macho Este estudio se realizó utilizando un diseño entrecruzado y dos días de estudio por separado, con siete días de diferencia. Tres perros Beagle macho se utilizaron en este estudio. En cada día de estudio, un catéter se colocó temporalmente en una vena cefálica para muestra de sangre; en el día de estudio uno, únicamente, un catéter también se colocó temporalmente en una vena safena por infusión i.v. En el día de estudio uno, cada animal recibió un compuesto de prueba (una dosis objetivo de 2.0 umoles/kg) como una infusión intravenosa 1-h (4.0 mL/kg). La solución de dosificación se preparó en Encapsin® al 20% acuosa (pH = 8.0) y contenía 1 % de DMSO. Encapsin® (Cerestar USA Inc., Hammond, IN) es una hidroxipropil-beta-ciclodextrina, un oligosacárido cíclico (7 unidades de glucosas) que se utilizó para mejorar la solubilidad en la preparación de soluciones de dosificación que de otra manera no requerían formulación utilizando solventes no acuosos. En el día de estudio dos, cada animal recibió un compuesto de prueba (dosificación objetivo 6 0 umoles/kg) mediante gavage oral (8.0 mL/kg). La solución de dosificación se preparó en gelatina porcina succinada acuosa al 5% (pH = 7 5) y que contenía 1 % de DMSO. Las concentraciones de plasma en el compuesto de prueba se cuantificaron mediante LC/MS/MS (LLQ = 10 ng/mL). Los métodos de no cdompartimento se utilizaron para análisis de concentración de plasma contra los datos tiempo.

Un estudio para estimar los parámetros de farmacocinética i.v v biodisponibilidad oral en changos Cynomolgus macho Este estudio se realizó utilizando un diseño entrecruzado y dos días de estudio por separado con diferencia de siete días. Tres changos Cynomolgus macho se utilizaron para este estudio. En ambos días de estudio, un catéter se colocó en una vena safena para recolección de muestras de sangre. En el día de estudio uno, un catéter también se colocó temporalmente en una vena safena contralateral mediante infusión i.v. En el día de estudio uno, cada animal (en ayuno) recibió un compuesto de prueba (dosificación objetivo 2.0 umoles/kg) como una infusión intravenosa 1 -h (4.0 mL/kg). La solución de dosificación se preparó en Encapsin® acuosa al 20% (pH = 8.0) y que contenía 1 % de DMSO. Encapsin® (Cerestar USA Inc., Hammond, IN) es una hidroxipropil-beta-ciclodextrina, un oligosacárido cíclico (7 unidades de glucosa) que se utilizó para mejorar la solubilidad en la preparación de soluciones de dosificación que de otra manera requerían que la formulación utilizara solventes no acuosos. En el día de estudio dos, cada animal (en ayuno) recibió el compuesto de prueba (dosificación objetivo 6.0 umoles/kg) mediante gavage oral (8.0 mL/kg). La solución de dosificación se preparó en gelatina porcina succinada acuosa al 5% (pH = 8.0) y que contenía 1% de DMSO.

Las muestras de sangre se obtuvieron a partir del catéter de vena femoral; el plasma se aisló mediante centrifugación. Las concentraciones de plasma del compuesto de prueba se cuantificaron mediante LC/MS/MS (LLQ = 10 ng/mL). Los métodos de no compartimento se utilizaron para análisis de farmacocinética de concentración de plasma contra los resultados de tiempo.

Abreviaturas Cmax - Concentración máxima lograda después de una infusión i v ; 1A vida media, MRT tiempo de residencia promedio de la molécula de prueba; CL depuración de plasma sistémico, Vdss volumen de estado estable de distribución; F porcentaje de biodisponibilidad aLa biodispombilidad se calculó al dividir AUCo-t de dosis normalizada (en donde t es el punto de tiempo último con concentraciones de g ¡ji ^j^ j^ jgi^ compuesto de prueba observable a partir del segmento oral (en el caso de estudios con ratas) o concentraciones de fármaco medidas en extremos orales e intraduodenales de estudio (estudios con perros y changos)) por medio de AUCo-t de dosis normalizada a partir del segmento i v. y multiplicado por 100. Valores individuales nombrados debido a la gran variabilidad mayor; los animales siempre se nombran en el mismo orden.

PREPARACIÓN 10 a) 3S-t-Butoxicarbon¡l-2R-(2-naftilmetil)prop¡olactona "*». (t-Butil-(3R)-carboxi-4-(2-naftil)butirato (10 g, 31.9 mmoles) en THF (160 ml) se agitó a -70°C bajo argón y se añadió por goteo bis(trimetilsili!)amida de litio (63.7 ml de solución 1 M en THF, 63.7 mmoles). La mezcla se agitó entre -60°C y -70°C durante una hora y después se enfrió 20 a -80°C y se añadió con una cánula N-yodosuccinimida (7.17 g, 31.9 mmoles) en THF (20 ml). La mezcla se dejó calentar a aproximadamente -30°C durante una hora y después se extinguió con solución saturada de cloruro de amonio. Se añadió acetato de etilo y la mezcla de dos fases se agitó rápidamente a temperatura ambiente durante 1.5 horas. Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2x) y las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución de tiosulfato de sodio al 5% y salmuera y después se secó (Na2S04) y se evaporó. La cromatografía en gel de sílice (elución con acetato de etilo al 10% en hexano) y la trituración del producto recuperado con hexano dio 5.70 g de un sólido blanco (63%). EM (AP +ve) M+Na = 335 1H RMN (CDCI3): 1.31 (9H, s), 3.29 (1 H, dd, J = 8.5, 14.6 Hz), 3.38 (1 H, dd, J = 6.1 , 14.6 Hz), 4.06 (1H, m), 4.45 (1H, d, J = 4.4 Hz), 7.34 (1 H, dd, J = 1.7, 8.5 Hz), 7.48 (2H, m), 7.68 (1 H, s), 7.82 (3H, m).

EJEMPLO N'-f4-(N-hidroxiamino)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinilT-S-tert- leucinmetilamida a) Ester N'-f4-(t-butoxi)-3S-h¡droxi-2R-(2-naftilmetil)succinil1-S- tert-leucinbencílico La sal TFA de éster bencílico de tert-leucina (6.49 g) se agitó con carbonato de potasio anhidro (2.89 g) en THF (100 mL) durante 20 minutos.

HOAT (2.24 g) y 3S-t-butoxi-carbonil-2R-(2-naftilmetil)propiolactona (4.66 g, 14.94 mmoles) se añadieron y la mezcla se agitó durante 72 horas adicionales (HOAT adicional (1.02 g) se añadió después de 48 horas). Los sólidos se filtraron, y lavaron bien con THF. Los filtrados combinados se evaporaron a una espuma que se disolvió en EtOAc y se lavó con HCl de 0.5 M,. N3HCO3 sat. aq (2x),agua, y salmuera; se secó (MgS04) y se evaporó a una goma que se cristalizó a partir de hexano/Et2O para dar el producto como un sólido blanco 6.35 g (80%). 1H RMN (DMSO-de): 0.88 (9H, s), 1.40 (9H, s), 2.88 (1 H, dd, J=13 5, 6 Hz), 3.00 (1 H, dd, J= 13.5, 8.5 Hz), 3.19 (1 H, m), 3.92 (1 H, t, J« 6 5 Hz), 4.18 (1 H, d, J=8.5 Hz), 4.77 (1 H, d, J= 12.5 Hz), 4.84 (1 H, d, J=12.5 Hz), 5.53 (1 H, d, J=7.5), 7.24 (2H, m), 7.30-7.37 (4H, m), 7.45 (2H, m), 7.65 (1 H, s), 7.77-7.87 (3H, m), 8.09 (1 H, d, J«9Hz). b) Ester N'-f4-(t-butoxO-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succtnip- S-tert-lelucina bencílico La solución de éster N'-[4-(t-butoxi)-3S-hidroxi-2R-(2- naft?lmetil)succinil]-S-tert-leucinbencílico (3.0 g, 5.62 mmoles), en 1 ,2- díetoxietano (75 mL) se añadió NaH (suspención al 60% en parafina; 0.27 g), después de agitación durante 2-3 minutos; se añadió una solución de 'PrOTf en pentano (~30% p/p; 6 mL). La mezcla se agitó durante 25 minutos a temperatura ambiente y además se añadió NaH (0.054 g) y solución de 'PrOTf (3 mL) adicionales. Después de agitar durante 25 minutos adicionales, una carga adicional tanto de NaH (0.054 g) como de 'PrOTf (3 mL), se añadió. Después de agitar durante 20 minutos, se añadió HCl 0.5 M, y la mezcla se extrajo (2X) con EtOAc. Los extractos combinados se lavaron con NaHCÜ3 sat.aq., agua y salmuera; se secaron (MgSÜ4) y evaporaron hasta obtener una goma, que se purificó mediante cromatografía en sílice (hexano/Et=O), dando ei producto como una goma casi incolora 1.33 g (41%). EM (ES + ve) M + H = 576, M + Na = 598. 1H RMN (CDCI3): 0.87 (9H, s), 1.09 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.21 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.49 (9H, s), 2.87-3 0 (2H, m), 3.10-3.22 (1 H, m), 3.69 (1H, 7-tet, J = 6.0 Hz), 4.00 (1 H, d, J = 6.5 Hz), 4.36 (1 H, d, J = 9Hz), 4.57 (1 H, d, J aparente = 12.5 Hz), 4.63 (1 H, d, J aparente = 12.5 Hz), (dos mitades de abq.), 6.50 (1 H, d, J = 9 Hz), 7.15-7.19 (2H, m), 7.27-7.40 (4H, m), 7.40-7.45 (2H, m), 7.60 (1 H, s), 7 72-7.80 (3H, m). c) N'-f4-(t-^µtoxi)-3S-isopro?oxi-2R-(2-naftilmetil)succinill-S-tert- leucina © ^ Ester N'-[4-(t-butoxi)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S- tert-leucinbencílico (1.33 g, 2.31 mmoles) se hidrogenó a presión atmósfera en MeOH (30 mL), con catalizador Pd-BaSO4 (0.67 g) durante 1 hora. El 10 catalizador se separó por filtración y se lavó bien con MeOH. Los filtrados combinados se evaporaron para dar el producto como una espuma, 1.09 g (97%). EM (ES + ve) M + H = 486, M + Na = 508. 1H RMN (DMSO-de): 0.92 (9H, s), 1.02 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.08 15 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.42 (9H, s), 2.75 (1 H, dd, J = 14.4 Hz), 3.00 (1 H, dd, J = * 14, 9.5 Hz), 3.21 (1 H, m), 3.57 (1 H, 7-tet, J = 6.0 Hz), 3.93 (1 H, d, J = 8.5 Hz), ? 4.10 (1 H, d, J = 9 Hz), 7.29 (1 H, m), 7.44 2H, m), 7.62 (1H, s), 7.74-7.84 (3H, m), 7.90 (1 H, d, J « 9Hz), 12.35 (1 H, v, br.).

^^^S^ i i í ' í t • J í Í kjilfcjái^i^^^a^^ d) N'-f4-(t-butoxi)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetinsuccinin-S-tert-leucinmetilamida N'-[4-(t-butoxi)-3S-isopropoxi-2R-(2-naftilmetil)succ¡nil]-S-tert-leucina (1 09 g, 2.24 mmoles) se disolvió en DMF (29 ml) y se trató con HOAT (0.61 g) y DEC (0.86 g). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 minutos y se añadió entonces clorhidrato de metilamina (0.61 g) y N-metilmorfolina (0.74 ml). La mezcla se agitó durante 2 horas adicionales y entonces se concentró al vacío. El residuo se disolvió en EtOAc y se lavó sucesivamente con HCl 0.5 M, NaHCÜ3 sat. aq., agua y salmuera; se secó (MgSO4) y se evaporó hasta obtener una goma que se purificó mediante cromatografía en sílice (hexano/EtOAc). El producto se obtuvo como una goma 0.77 g (69%). EM (ES + ve) M + H = 499, M + Na = 521. 1H RMN (DMSO-d6): 0.84 (9H, s), 1.02 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.09 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.45 (9H, s), 2.16 (3H, d, J = 4.5 Hz), 2.74 (1 H, dd, J = 13.5, 4.5 Hz), 2.93 (1 H, dd, J = 13.5, 10 Hz), 3.17 (1 H, m), 3 56 (1 H, 7-tet, J = 6 Hz), 3.94 (1 H, d, J = 8.5 Hz), 4.06 (1 H, d, J = 9.5 Hz), 7.25 (1 H, br, m), 7.28 ' « f N'-f4-(N-hidroxiamino)-3$-ispropoxi-2R-(2-naftilmetil succínin- S-tert-leucinmetilamina N'-[4-hidroxi-3S-ispropoxi-2R-(2-naftilmetil)succinil]-S-tert- leucinmetilamina (0.67 g, 1.514 mmoles) se disolvió en DMF (20 mL) y se trató con HOAT (0.41 g) y DEC (0.58 g). La solución se agitó a temperatura ambiente durante 5 minutos y se añadió clorhidrato de hidroxilamina (0.32 g) y N-metilmorfolina (0.5 ml). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas, y posteriormente se concentró al vacío. El residuo se dividió entre EtOAc y NaHC?3 sat.aq. (2X), agua (2X) y salmuera; se secó (MgSO- Y se evaporó hasta obtener un sólido que se trituró con éter para dar el producto como un sólido blanco, 0 51 g (74%). EM (ES + ve) M + H = 458, M + Na = 480 1H RMN (DMSO-d6): 0 84 (9H, s), 1.00 (3H, d, J = 6.0 Hz), 1.04 (3H, d, J = 6.0 Hz), 2 02 (3H, d, J = 5 Hz), 2.65 (1 H, dd, J = 14.4 Hz), 2.83 (1 H, dd, J = 1 1.5 Hz), 3.18 (1 H, m), 3.52 (1 H, 7-tet, J = 6 0 Hz), 3.90 (1 H, d, J = 9 Hz), 4.01 (1 H, d, J = 9 Hz), 6.93 (1 H, q, J = 5 Hz), 7 25 (1 H, dd, J = 8.5, 1.5 Hz), 7.44 (2H, m), 7.53 (1 H, d, J = 9 Hz), 7.57 (1 H, s), 7.75-7.85 (3H, ), 9.08 (1 H, s), 10.89 (1 H, br, s).

Claims (7)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto de fórmula (I). ( 10 en donde: R es isopropilo; n es 0; R1 es naftilmetilo; R2 es t-butilo; y R3 metilo. 2.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque es un compuesto de fórmula (IA):

(IA)

3.- El uso de un compuesto como el que se reclama en la 20 reivindicación 1 o reivindicación 2, para la producción de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de trastornos tales como alergia, trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunes en las cuales se ve implicada la sobreproducción de S-CD23. . ***£ ?*lfr *±l A . ^. At^? Áii

4.- Una composición farmacéutica para el tratamiento o profilaxis de trastornos íales comtír alergia, trastornos inflamatorios y enfermedades autoinmunes en las cuales se ve implicada la sobreproducción de S-CD23 que comprende un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 y opcionalmente un portador farmacéuticamente aceptable de la misma. %

5.- Un procedimiento para preparar un compuesto de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, que comprende: (a) desproteger un y'í - compuesto de fórmula (II): 15 en donde X es un grupo protector tal como bencilo o trimetilsililo o (b) hacer reaccionar un compuesto de fórmula (lll): en donde el grupo hidroxi se protege opcionalmente, con hidroxilamina o una sal de la misma.

6.- Un compuesto de la fórmula (II) como definió en la reivindicación 5.

7.- Un compuesto de la fórmula (lll) como se definió en la reivindicación 5. » \ i "f