MXPA01005998A - Ligandos novedosos de receptor nuclear. - Google Patents

Ligandos novedosos de receptor nuclear.

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MXPA01005998A
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Abstract

Se ha encontrado recientemente que la ascociorina, que es un antibiotico liposoluble conocido publicamente, y sus homologos, sirven como un ligando del receptor X retinoide y reaccionan in vivo con el grupo amino de proteina de suero para formar bases de Schiff, sin mostrar ningun efecto secundario de retinoide; la ascociorina y sus homologos se pueden utilizar en el tratamiento y/o prevencion de enfermedades o condiciones que se pueden aliviar por regulacion transcripcional de la senal del gen dependiente de ligando del receptor X retinoide, por ejemplo enfermedades ocasionadas por la expresion de resistencia a la insulina, hipertension, enfermedades cerebrovasculares, artritis reumatoide, enfermedades autoinmunes, error metabolico de Ca, complicacion de la diabetes, arteriosclerosis, etc.); ademas, pueden inhibir desnaturalizacion y/o necrosis de celulas-? pancreaticas de los islotes de Langerhans y, por lo tanto, se pueden utilizar en la preparacion de estas celulas para sostener la productividad de insulina.

Description

f . . LIGANDOS NOVEDOSOS DE RECEPTOR NUCLEAR CAMPO TÉCNICO 5 Esta invención se refiere a ligandos del receptor X retinoide y a composiciones farmacéuticas para tratar y/o prevenir enfermedades que pueden ser aliviadas por regulación transcripcional de cierta información genética, dependiente de ligando del receptor X retinoide (RXRL). 10 ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades a ser tratadas y/o prevenidas mediante el uso de las composiciones farmacéuticas de conformidad con la presente invención, incluyen enfermedades relacionadas con el estilo de vida. Desde el 15 punto de vista del tratamiento de enfermedades relacionadas con el estilo de vida, existe una urgente necesidad de desarrollar fármacos para usar en el tratamiento de varias lesiones vasculares causantes de la aparición de las enfermedades relacionadas con el estilo de vida. La enfermedad isquémica del corazón, que prevalece cuando están presentes lesiones vasculares, 20 también es conocida como esclerosis coronaria. Se piensa que alrededor de cincuenta por ciento de todas las muertes en el mundo son atribuibles a esta enfermedad. La enfermedad isquémica del corazón es la causa principal de muerte en la mayoría de los países desarrollados, y la segunda causa más > Importante de muerte en el Japón. Además, se estima que la incidencia de la enfermedad isquémica del corazón también aumentará rápidamente en los países en desarrollo. Las causas principales de la enfermedad isquémica del ™ ^M corazón parecen incluir factores genéticos, hábitos alimenticios, tensión 5 nerviosa, diabetes e hipertensión. Se sabe que la enfermedad isquémica del corazón está estrechamente relacionada con el estilo de vida, incluyendo la dieta. La hiperiipemia y la hiperinsulinemia, que son inducidas por la ingestión excesiva de dietas altas en calorías, promueven la sedimentación de iipoproteínas de baja densidad sobre la pared arterial que son ricas en 10 colesterol. La degeneración de las lipoproteínas de baja densidad sedimentadas ocasiona daño en la pared arterial; los leucocitos reaccionan al daño en la pared arterial y la infiltran para reparar la lesión, dando como resultado inflamación crónica. Así, el mecanismo de la arteriosclerosis se entiende como sigue: En respuesta al daño de la pared arterial, los 15 leucocitos, que intentan reparar el daño, ocasionan inflamación excesiva, que tiene el efecto de engrosar la pared arterial, dando como resultado una lesión esclerosante. Los ejemplos típicos de fármacos conocidos para prevenir la enfermedad isquémica del corazón, son los inhibidores de hidroximetilglutaril- 20 CoA (HMG-CoA) reductasa. Estos inhibidores de HMG-CoA reductasa, que inhiben la biosíntesis de ácido mevalónico como el paso determinante de la velocidad en la biosíntesis de colesterol, reducen la cantidad de colesterol sintetizado en el hígado y así reducen el contenido de colesterol en la su? ^^éáj É lipoproteína de baja densidad que es sintetizada en el hígado y liberada en el suero. Es decir, la principal función de estos fármacos reside en la inhibición de la biosíntesis de colesterol y en la reducción del contenido de colesterol en ?k- el suero, reduciendo con ello la lipoproteína de baja densidad incorporada del 5 suero hacia la pared arterial que depende de la concentración. Particularmente, estos fármacos ejercen un efecto meramente indirecto y preventivo. Estos inhibidores de HMG-CoA reductasa no exhiben efecto sobre las lesiones esclerosantes asociadas con la inflamación crónica que engrasa la pared arterial, en la que participan macrófagos y linfocitos. De esta fc? 10 manera, es imposible lograr algún efecto terapéutico directo para curar la inflamación crónica de una arteria. Un remedio ideal y/o tratamiento preventivo para la arteriosclerosis, sería un fármaco que muestre un efecto de reducción del nivel de colesterol en el suero y, al mismo tiempo, un efecto terapéutico y/o preventivo sobre la inflamación crónica inducida por la 15 sedimentación de colesterol sobre la pared arterial. Sería de esperar que dicho fármaco, dado el caso, sirviera como un remedio ideal y/o tratamiento preventivo para la enfermedad isquémica del corazón. • De manera similar a la arteria coronaria, la arteria cerebral sufre frecuentemente de lesiones. Cuando procede una lesión cerebrovascular, son 20 inducidas lesiones tales como hemorragia intracerebral o infarto cerebral. Una vez que ha ocurrido una lesión cerebrovascular, frecuentemente se presentan consecuencias serias tales como trastornos del movimiento o trastornos intelectuales, aunque la muerte se puede evitar. En una sociedad en la cual la población está envejeciendo, un aumento de las personas postradas en cama o personas que sufren de demencia senil, producen problemas sociales serios, y por tanto, también hay una urgente necesidad de prevenir estos ^r problemas desde el punto de vista de aliviar la carga social de los gastos 5 médicos. En Japón, el número de personas que sufren de demencia ocasionada por demencia cerebrovascular (esto es, degeneración y/o necrosis parcial del cerebro debido a lesiones cerebrovasculares), llega a casi 50% del número total de personas que sufren de demencia. A diferencia de la arteria coronaria, la superficie de ia arteria cerebral está recubierta con células Éfk 10 endoteliales que se superponen estrechamente una con otra en la cara de contacto. Este estado de recubrimiento es referido como una conexión estrecha. En el endotelio de la arteria cerebral, las células endoteliales están dispuestas estrechamente sin huecos. Por lo tanto, no se incorpora lipoproteína de baja densidad en la pared arterial como en el corazón. En 15 otras palabras, el colesterol no inducirá arteriosclerosis en la arteria cerebral. Sin embargo, cuando la arteria se agranda debido a hipertensión y ocurre - ' daño de la arteria cerebral, los componentes del plasma son capaces de penetrar la pared arterial. En respuesta a tal daño, los leucocitos se infiltran en la pared arterial y, como en el caso de la arteria coronaria en el corazón, la 20 reacción de reparación se convierte en excesiva. Como resultado, la pared de la arteria cerebral se engrasa con lo cual se originan trastornos de la circulación de la sangre; o la pared arterial se hace frágil como resultado de inflamación crónica y no puede resistir la presión sanguínea, con lo cual se forma un aneurisma. Cuando se rompe un aneurisma, se produce hemorragia, es decir, ataque cerebral. De esta manera, se puede observar lesión cerebrovascular como resultado de inflamación crónica inducida por la í infiltración de leucocitos que responden para reparar pequeñas heridas en la 5 arteria, de manera similar a la arteriosclerosis coronaria. Para prevenir las lesiones cerebrovasculares, se han empleado exclusivamente fármacos hipotensores. El efecto de estos fármacos hipotensores reside en una reducción de la presión sanguínea para proteger los vasos de presión excesiva, impidiendo así el daño vascular. En otras t" 1 palabras, se emplean fármacos hipotensores como un tratamiento preventivo para evitar los efectos negativos consecuentes a la reparación (natural) de los vasos cerebrales. En Japón, existe una categoría de remedios para demencia cerebrovascular que son referidos como vasodilatadores cerebrales, y ha sido una práctica emplear vasodilatadores cerebrales tales como idebenona, 15 clorhidrato de bifemelano, clorhidrato de indeloxazina, nicergolina y propentofilina. Sin embargo, como resultado de pruebas de revalidación clínica, se ha puesto en claro que estos fármacos no muestran diferencia significativa con respecto a los placebos en su efecto terapéutico sobre las consecuencias negativas de las lesiones cerebrovasculares. 20 Consecuentemente, estos fármacos ya no están indicados para el tratamiento de las consecuencias negativas de las lesiones cerebrovasculares. De esta manera, se puede concluir que en la actualidad no existe remedio para las consecuencias negativas de las lesiones cerebrovasculares. Se espera que .t.»^^»..^^ *t>** »á~mJ m+»i*?t~?¿* 4 un fármaco que tenga un efecto hipotensor así como también un efecto terapéutico sobre la inflamación crónica de la arteria cerebral, si se tuviera, sirva como un remedio ideal para las lesiones cerebrovasculares. "? Como se describió arriba, se ha descubierto que lesiones 5 vasculares tales como arteriosclerosis y aneurisma, son inducidas por reparación de la arteria dañada. Además del estímulo químico, por ejemplo con un agente degenerado nocivo tal como lipoproteínas de baja densidad degeneradas, o bajo el estímulo físico de hipertensión, es conocido que cuando se agranda una arteria estrechada, por inserción de un balón o un 10 stent en la misma, o cuando los linfocitos T de un hospedero producen una reacción de rechazo contra un isoantígeno que está presente en la arteria de un órgano transplantado, se produce arteriosclerosis por daño en la pared arterial. Como ejemplos de factores físicos causantes de arteriosclerosis, 15 se pueden citar un tratamiento de inserción de un balón, o de un stent, en una parte estrechada de una arteria coronaria para agrandar una sección estrechada (esto es, angioplastía percutánea). Debido a su conveniencia y efecto inmediato, este tratamiento para agrandar físicamente una cavidad interna estrechada de una arteria coronaria, se ha llevado a cabo con una 20 frecuencia de 1 ,000,000 de casos por año en todo el mundo desde 1996. Puesto que la cavidad interna de una parte estrechada de la arteria es agrandada inmediatamente por aplicación de una fuerza física, la arteria se daña, dando como resultado que los leucocitos sensibles a tal daño se infiltren en el área en una reacción excesiva de reparación. Es conocido que en el transcurso de 6 meses, se produce engrasamiento de la pared arterial en la parte agrandada en cerca de 40% de los pacientes, en el caso de <?k- agrandamiento con un catéter de balón, mientras que en el transcurso de 6 5 meses, se produce re-constricción en 20-40% de los pacientes en el caso de agrandamiento con un stent. Cuando se produce re-constricción, se hace necesario realizar angioplastía percutánea una vez más para realizar derivación de la arteria coronaria para salvar la vida. Es decir, aunque la angioplastía percutánea es muy efectiva para agrandar rápidamente una lo cavidad intraarterial, no se ha encontrado hasta ahora un medio adecuado para impedir la arteriosclerosis que se produce por el daño vascular ocasionado por agrandamiento de la cavidad intraarterial. La arteriosclerosis causada por un mecanismo inmunológico es tipificada como arteriosclerosis asociada con transplante de órganos. De 15 forma relativamente reciente se han desarrollado inmunosupresores específicos de linfocitos T tales como ciclosporina y tacrolimo, y de esta manera se pueden suprimir casi completamente los rechazos agudos de órganos transplantados durante un año después del transplante. Sin embargo, en transplantes de corazón, hígado, riñon o transplantes 20 cardiopulmonares, los órganos transplantados son aceptados en más de 5 años en cerca de 60% de los casos. Recíprocamente, ocurre un fenómeno llamado rechazo crónico en cerca de 40% de los casos. Este fenómeno se puede diferenciar del rechazo agudo que ocurre en el transcurso de un año ? después del transplante. Aunque el nombre "rechazo crónico" es indicativo de que un órgano transplantado ha sido rechazado inmunológicamente, realmente describe una condición en la cual ocurre necrosis y decaimiento del Af órgano transplantado como resultado de trastornos circulatorios ocasionados 5 por arteriosclerosis. El rechazo crónico es inducido por daño que ocurre como resultado del ataque inmunológico después del reconocimiento de un isoantígeno en la arteria del órgano transplantado por los linfocitos del hospedero. Entonces, los leucocitos del hospedero, en respuesta al daño causado por el ataque inmunológico, reaccionan para reparar el daño, ?jjí 10 induciendo con ello arteriosclerosis. Ha quedado claro que el rechazo crónico se correlaciona con la fuerza de un rechazo agudo inicial. Particularmente, si un rechazo agudo es fuerte, se eleva el riesgo subsecuente de perder el órgano transplantado en el transcurso de 5 años, como resultado de que la arteria del órgano transplantado es sometida a un daño inmunológico más 15 serio. La razón es que probablemente es inducida una arteriosclerosis por una reacción excesiva de reparación. Si se pudiera desarrollar un medio para regular la inflamación crónica excesiva en una arteria, se podría reducir a la mitad el rechazo crónico en caso de transplante de órgano. De esta manera, se han ¡lustrado los fundamentos de la ocurrencia de la arteriosclerosis. 20 Las composiciones farmacéuticas de conformidad con la presente invención están dirigidas al tratamiento de diabetes de tipo I y diabetes de tipo II, que son enfermedades metabólicas típicas. La diabetes de tipo II es una enfermedad relacionada con el estilo de vida, y se correlaciona estrechamente con la obesidad que, a su vez, depende tanto de los hábitos alimenticios como de factores genéticos. En contraste, la diabetes de tipo I es una enfermedad que se presenta cuando hay una carencia de la cantidad total k de insulina disponible, que ocurre cuando las células o productoras de 5 insulina son destruidas por una reacción autoinmune contra las células D pancreáticas de los islotes de Langerhans. De esta manera, se requiere la administración de inyecciones regulares de insulina para asegurar la supervivencia de los pacientes con esta enfermedad. Aunque las enfermedades mencionadas arriba difieren una de otra en términos de la - 10 causa, las complicaciones de la diabetes, que se suscitan cuando la enfermedad ha estado presente durante un período largo, son comunes en ambos tipos. La terapia de dieta y la terapia de ejercicio, son las principales formas con las cuales se trata la diabetes de tipo II causada por la resistencia periférica a la insulina, y la terapia farmacológica se emplea solamente como 15 auxiliar. En la terapia farmacológica, se usan agentes de sulfonilurea que aceleran la secreción de insulina de los islotes de Langerhans, y los agentes de biguanida que promueven la utilización de glucosa en tejido periférico. Sin embargo, no ha estado disponible un fármaco que sea capaz de actuar sobre la resistencia periférica a la insulina, que es la causante de la aparición de la 20 enfermedad. Los compuestos de tiazolidindionadieno (TZD) desarrollados recientemente, han atraído la atención como fármacos que tienen la capacidad de actuar sobre la resistencia periférica a la insulina.
Se han encontrado en núcleos varios de los diez receptores referidos colectivamente como una superfamilia de receptores nucleares, que son conocidos como receptores de hormonas y vitaminas liposolubles. f Durante el estudio de la función del mecanismo de compuestos orgánicos 5 sintéticos de TZD, se han determinado los siguientes hechos: (1) el tejido objetivo de estos compuestos es el tejido adiposo; (2) son agonistas que activan específicamente PPAR?, un miembro de la superfamilia de receptores nucleares; y (3) diferencian ciertos fibroblastos que han sido acondicionados en adipocitos, a nivel de cultivo celular. Después de ser activado por TZD, el ío PPAR? forma un dímero (heterodímero) junto con el receptor X retinoide (RXR), que también es un receptor nuclear, y se unen a un sitio específico (sitio de reconocimiento de hormona) de cromosoma para regular con ello la transcripción de un gen definido. En base a experimentos a nivel de célula y tejido, se ha probado que la regulación transcripcional por parte de este 15 heterodímero, contribuye a incrementar la sensibilidad periférica a la insulina. Esto es, TZD activa el PPAR? en tejido adiposo, dependientemente de la dosis, y disminuye así el trastorno metabólico en la diabetes. Puesto que no se conoce un fármaco que actúe sobre un gen y que regule la expresión de una señal de gen, es de esperar que el TZD sea muy evaluado. 20 Puesto que se unen varios ligandos (por ejemplo ácidos grasos, prostaglandinas, agentes analgésicos/antiinflamatorios no esteroides) al receptor PPAR?, la especificidad de TZD por el receptor PPAR? no es necesariamente alta. Como los compuestos TZD existentes también tienen una función característica de activar PPAR? y así proliferar el peroxisoma hepatocelular de mamífero causando con ello hipertrofia hepática, es de sospechar que estos compuestos TZD puedan estar relacionados con hepatopatía. Entre ellos, la troglitazona, que se ha puesto en uso práctico por ^(P 5 primera vez entre los compuestos TZD, ocasiona hepatopatía en aproximadamente 2% de los pacientes a la dosis normal, y puede causar muerte en casos extremos. Por lo tanto, se requiere poner mucha atención al usar dichos compuestos desde el punto de vista de la seguridad. Ya que los agonistas del PPAR? afectan ampliamente la resistencia periférica a la 10 insulina, estos agonistas se deben considerar útiles no sólo para disminuir el • trastorno metabólico de la diabetes, sino también para tratar y/o prevenir las complicaciones de la diabetes. Sin embargo, en base a los resultados de experimentos en animales y a datos clínicos sobre los compuestos TZD, no se puede concluir si los síntomas del síndrome de resistencia a la insulina y las 15 complicaciones de la diabetes puedan ser disminuidas significativamente. Por lo tanto, persiste la oportunidad de mejorar los compuestos TZD, tomando en consideración la especificidad de función, la seguridad y la utilidad. Por otra parte, se ha dirigido la atención al efecto que el ligando RXR, al formar un heterodímero junto con PPAR?, ejerce sobre el trastorno 20 metabólico de la diabetes de tipo II. Esto es porque el PPAR? forma un heterodímero junto con RXR y regula así la expresión de la señal del gen implicado en la aparición de la diabetes. Un primer estudio que sugiere una nueva dirección para este problema, fue reportado por investigadores de ligandos en E.U.A. (Nature 386:407-410, 1997). De acuerdo con su reporte, los derivados retinoides LG100268 y LGD1069, que estaban bajo desarrollo como remedios para leucemia promielocística y sarcoma de Kaposi, mostraron los siguientes efectos en cultivos de células y en experimentos en animales: (1) estos derivados forman heterodímeros con el PPAR? como un ligando RXR, y así regulan la transcripción del gen; (2) y cuando se administran oralmente a ratones diabéticos obesos de herencia ob/ob y db/db, incrementan la sensibilidad a la insulina y reducen drásticamente los niveles de glucosa, los niveles de grasa neutra en el suero y los niveles de insulina en el suero. Los investigadores también reportaron que se podía lograr un efecto significativo de mejoramiento del metabolismo mediante la administración combinada de un derivado retinoide con un compuesto TZD, cada uno en una dosis tan pequeña que por si sola no muestra efecto farmacológico, y así se mostró que el ligando de RXR y el ligando de PPAR?, exhiben un efecto sinergístico in vivo. Los derivados retinoides reportados por los investigadores se sintetizaron para potenciar el efecto de ácido retinoide todo trans (ATRA) y áHviar los efectos secundarios. Se afirmó que estos derivados son efectivos contra cánceres de piel tales como el sarcoma de Kaposi y leucemia promielocística. Particularmente, estos derivados también se unen al receptor de ATRA (RAR) y ejercen una actividad retinoide y, por lo tanto, son deficientes en especificidad de función. Además, estos derivados retinoides tienen una notable toxicidad inherente a ATRA que los hace inútiles como diabetes. Un ligando específico de RXR, que estuviera libre de estos problemas, tenga alta seguridad y ejerza un efecto considerable de potenciar la sensibilidad a la insulina, sería un fármaco t que mostrara grandes esperanzas como remedio para la diabetes y sus 5 complicaciones. Se sabe que el receptor PPAR? es expresado en gran cantidad, no solo en tejido adiposo, que es el blanco del tratamiento de la diabetes de tipo II, sino también en el bazo, tracto intestinal y glándula adrenal. De esta manera, actualmente se desarrollan estudios para determinar las funciones Rt 10 del PPAR? expresado en estos órganos. Entre ellos, se han publicado recientemente dos reportes interesantes sobre la función del PPAR? expresado en células linfoides (M. Ricote y otros "The peroxisome proliferator- activated receptor-g is a negative regulator of macrophage activation" Nature, 391:79-82, 1998; y C. Jiang A.T. Tiang y B. Seed, "PPAR? agonists inhibit 15 production of monocyte inflammatory cytokines" Nature 391 :82-86, 1998). Estos estudios están enfocados sobre el PPAR? expresado en macrófagos f activados que activan la inducción de inflamación crónica. Cuando los macrófagos se infiltran en un sitio inflamado y sufren activación, son sintetizadas vigorosamente citocinas inflamatorias. Sin embargo, la 20 transcripción de genes relacionados con dicha inflamación crónica puede ser suprimida dependientemente de la dosis, agregando un agente analgésico/antiinflamatorio no esferoide, que es un ligando de PPAR?, al cultivo de los macrófagos activados. También se ha aclarado que el ligando de PPAR? compite parcialmente con los factores de promoción de transcripción AP-1 , STAT y NF-kB, y así regula la expresión de genes de citocina inflamatoria. Es decir, los ligandos de PPAR? tales como los agentes analgésicos/antiinflamatorios no esteroides reducen la producción del ARN 5 mensajero de citosina inflamatoria (IL-1ß, TNFa, IL-6, etc.) que ha sido transcrito vigorosamente en asociación con la activación de macrófagos y, a su vez, regulan la producción de estas citocinas inflamatorias. Desafortunadamente, los compuestos TZD existentes actúan principalmente sobre adipocitos y probablemente no regulan la producción de citocinas 10 inflamatorias por macrófagos activados. Por lo tanto, es imposible en la etapa actual tratar la inflamación crónica con el uso de estos compuestos TZD. Sin embargo, se ha sugerido que la regulación de citosinas inflamatorias por parte de ligandos de PPAR?, puede contribuir al tratamiento de inflamación crónica tal como arteriosclerosis, complicaciones de la diabetes y artritis reumatoide. 15 Sin embargo, hasta ahora no se ha hecho un estudio respecto a los ligandos de RXR que podrían ser capaces de formar un heterodímero junto con PPAR? ^1^^ y regular así la expresión de una señal de gen relacionada con la aparición de inflamación crónica. Se considera que el mecanismo de acción de los agentes 20 analgésicos/antiinflamatorios no esteroides reside en la supresión de la producción de prostaglandinas que ocasionan dolor e hinchazón en el sitio de la inflamación. Sin embargo, los autores de los reportes arriba mencionados sugieren que la supresión de la transcripción de genes que codifican citocinas inflamatorias también se relaciona con el mecanismo de acción, así como también la supresión de la biosíntesis de prostaglandinas. Es bien conocido que los agentes analgésicos/antiinflamatorios no esteroides son efectivos contra la artritis reumatoide. Los corticoides de azúcar, que se usan ^W| 5 frecuentemente para tratar inflamación crónica similarmente a los agentes analgésicos/antiinflamatorios no esteroides, ejercen un efecto terapéutico y/o preventivo sobre artritis en rata causada por adyuvante, que es un modelo experimental de arteriosclerosis y artritis reumatoide. Sin embargo, estos fármacos - no se pueden administrar continuamente durante un tiempo 10 prolongado, ya que suprimen la biosíntesís de prostaglandinas en la mucosa del tracto digestivo, dando como resultado una alta incidencia de úlceras digestivas. Una supresión de la producción de citocinas inflamatorias por macrófagos activados acumulados en el sitio inflamatorio, realizada por un ligando de PPAR? que no suprima ia biosíntesis de prostaglandinas, si fuera 15 posible, sería sin duda una contribución sustancial al tratamiento de condiciones inflamatorias crónicas tales como arteriosclerosis, complicaciones de la diabetes y artritis reumatoide. Sin embargo, en la actualidad tal suposición sigue siendo hipotética, y por lo tanto su utilidad requiere ser confirmada experimentalmente y clínicamente. Los compuestos TZD, que son 20 sintetizados como ligandos de PPAR?, exhiben solo un débil efecto en la supresión de la producción de citocinas inflamatorias y así tienen poco uso práctico. Aunque TZD actúa fuertemente sobre PPAR? en el tejido adiposo blanco, muestra solo un débil efecto sobre macrófagos activados. Por lo tanto, parece que los compuestos TZD existentes difícilmente pueden suprimir la producción de citocinas inflamatorias. Más aún, se desconoce completamente qué efectos ejercen los ligandos de RXR que forman un heterodímero con PPAR? sobre los macrófagos activados. Tampoco es claro 5 si PPAR? forma o no un heterodímero con RXR en macrófagos como en el tejido adiposo, y si regula específicamente la transcripción del gen. Como se mencionó arriba, es conocido que los agentes analgésicos/antiinflamatorios no esteroides sirven como ligandos de PPAR? y suprimen la producción de las citosinas causantes de inflamación crónica a nivel de cultivo celular. De esta 1f 10 manera, los efectos de los ligandos de RXR sobre la producción de citocinas inflamatorias, también han atraído la atención del público. Se piensa que se llevarán a cabo estudios intensivos enfocados sobre ligandos de PPAR? y RXR como agentes antiinflamatorios contra la inflamación crónica. Para tratar inflamación crónica tal como artritis reumatoide y 15 enfermedades autoinmunes, ha sido una práctica emplear agentes ánalgésicos/antiinfiamatorios no esteroides, o corticoides de azúcar, que son ^ f empleados generalmente en el tratamiento de inflamación aguda. Particularmente, se puede decir que a la fecha no hay remedio específico para la inflamación crónica. Los agentes analgésicos/antiinflamatorios no 20 esteroides tienen el problema de que su uso prolongado induce frecuentemente efectos secundarios indeseables en el sistema digestivo tales como úlceras, porque estos fármacos suprimen la biosíntesis de prostaglandinas. Por otra parte, los corticoides de azúcar tienen varios efectos secundarios que incluyen la aparición de enfermedades infecciosas debido a supresión inmune, inducción de trastornos metabólicos tales como diabetes, y un fenómeno de rebote, esto es, al descontinuar la administración del fármaco, se produce un empeoramiento de una condición tratada en comparación con el estado previo al comienzo de la administración del fármaco. De esta manera, no se puede decir que la calidad de vida de los pacientes (QOL) sea mejorada notablemente con las terapias existentes para inflamación crónica. Además de estos problemas de terapia farmacológica, se ha puesto atención a las complicaciones de la diabetes que ocurren debido a inflamación de los microvasos. Puesto que las complicaciones de la diabetes están dentro de la categoría de inflamación crónica, existe una alta posibilidad de que tales complicaciones se puedan prevenir y/o tratar, administrando un fármaco que ejerza un efecto de disminución específica de la inflamación crónica. Para tratar las condiciones inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide, arteriosclerosis, microangiopatía diabética, periarteritis nodosa y aneurisma, es necesario desarrollar un fármaco capaz de tratar inflamación crónica sin ningún empeoramiento de la QOL como resultado de la ocurrencia frecuente de efectos secundarios indeseables. En mujeres postmenopáusicas, se presentan frecuentemente trastornos metabólicos del calcio, y la osteoporosis es un problema serio en este grupo de población. La osteoporosis está caracterizada morfológicamente por una reducción de trabécula, alargamiento del tubo de Harbor y alargamiento de la cavidad medular con hueso cortical adelgazado sin ningún cambio cambio morfológico de hueso. Estas condiciones patogénicas se relacionan con trastornos en la relación entre la resorción de hueso y agregación de hueso. La osteopoliporosis observada en mujeres postmenopáusicas es un ejemplo típico. Una vez que sufren de osteoporosis, 5 los pacientes están expuestos a sufrir fracturas de hueso como resultado incluso de ligeros esfuerzos debido a una marcada reducción de la resistencia del hueso. Los métodos para tratar osteoporosis incluyen la administración oral de hormona femenina, vitamina D3 activada, o fármacos de bifosfito, e inyección de calcitonina. Un tratamiento preferido para prevenir y/o tratar jj^ 10 osteoporosis sería potenciar la eficacia de la vitamina D3 endógena activada. Sin embargo, hasta ahora no se ha iniciado un estudio desde este punto de vista, debido a la falta de los enfoques posibles.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN 15 La presente invención se ha hecho basándose en un hallazgo novedoso según el cual la ascoclorina y sus homólogos (cada uno teniendo una estructura con una cadena lateral terpenoide (que lleva preferiblemente cerca de 20 átomos de carbono) unida en la posición 3 de orcilaldehído), que 20 los inventores de la presente habían reportado previamente como antibióticos liposolubles producidos por hongos, son ligandos del receptor X retinoide. En particular, la presente invención depende de un hallazgo inesperado según el cual, debido a que tienen un grupo aldehido, la ascoclorina y sus homólogos reaccionan con el grupo amino de proteína sérica y forman bases de Schiff in vitro, no mostrando con ello los efectos secundarios de los retinoides. La ascoclorina y sus homólogos son ligandos del receptor X f retinoide y son utilizables en el tratamiento y/o prevención de enfermedades 5 que pueden ser aliviadas por regulación transcripcional de la señal del gen dependiente de ligando del receptor X retinoide (por ejemplo enfermedades ocasionadas por la expresión de resistencia a la insulina, hipertensión, angiopatía cerebral, artritis reumatoide, enfermedades autoinmunes, trastorno metabólico de Ca, complicación de la diabetes, restenosis arterial después de f* 10 angioplastía coronaria transluminal percutánea, arteriosclerosis posterior a transplante de órgano). También, estos compuestos inhiben degeneración y/o necrosis de células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans y se pueden utilizar para que estas células sostengan la productividad de insulina. Consecuentemente, la presente invención provee composiciones 15 farmacéuticas que contienen estos compuestos, un método terapéutico y/o preventivo con el uso de estos compuestos, y el uso de estos compuestos para tratar y/o prevenir las enfermedades anteriormente mencionadas.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 20 La figura 1 ilustra una reacción para formar una base de Schiff entre el compuesto de acuerdo con la presente invención y una proteína sérica.
La figura 2 muestra peso corporal, nivel de glucosa en sangre, nivel de insulina en sangre y glucosa en orina, de ratones diabéticos obesos de herencia db/db C57BL/ksj, que recibieron oralmente el compuesto 14 durante 40 semanas. La figura 3 muestra arteriosclerosis de la aorta de conejos blancos alimentados con una dieta alta en grasas, visible a simple vista. La figura 4 muestra los cambios del nivel de glucosa sanguínea en ayunas en una prueba clínica de fase I del compuesto 6. La figura 5 muestra decrementos del nivel de colesterol total en suero en la prueba clínica de fase I del compuesto 6. La figura 6 muestra el efecto hipotensor sobre pacientes con hipertensión limítrofe en la prueba clínica de fase I del compuesto 6. La figura 7 muestra el efecto hipotensor sobre pacientes con hipertensión en la prueba clínica de fase I del compuesto 6. La figura 8 muestra disminución de hidrodipsia con el paso del tiempo en una prueba clínica de fase II del compuesto 6. La figura 9 muestra la concentración en la sangre del compuesto 1 administrado oralmente a ratas. La figura 10 muestra la reducción de la forma libre de los compuestos de acuerdo con la invención agregados a suero de bovino, en donde los círculos llenos, los círculos vacíos y los cuadrados representan respectivamente los compuestos 14, 5 y 6.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los inventores de la presente han realizado estudios para encontrar un medio efectivo de tratamiento y/o prevención de las 5 enfermedades crónicas arriba mencionadas, que no pueden ser resueltas por la técnica convencional y, como resultado, concluyeron la presente invención. La presente invención se refiere a ligandos del receptor X retínoide, seleccionados de entre ascoclorina y sus homólogos. La presente invención se refiere también a ligandos del receptor X retinoide (RXRLs) ' 10 seleccionados del grupo que consiste de ascoclorina y sus análogos (particularmente, cilindroclorina, 4'-hidroxi-5'-hidroascoclorina, 4'-acetoxi-5'- hidroascoclorina, dihídroascoclorina y clornectina, producidos por hongos filamentosos), análogos y derivados de los mismos, en donde el hidrógeno de los grupos hidroxilo en las posiciones 2 y/o 4 de la porción orcilaldehído, han 15 sido sustituidos. Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir enfermedades o condiciones que se k pueden aliviar por medio de regulación de transcripción de señal del gen dependiente de ligando del receptor X retinoide, que comprende ligando del receptor X retinoide a, junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable. 20 I. Ascoclorina y sus homólogos El término "homólogo" como se usa aquí en la expresión "ascoclorina y sus homólogos", significa un compuesto que tiene una l.»..** -~.-,? . - ,* -...., - ^- ái**ik¿al&M¿ ** ^...^t^aiJ estructura similar a la de ascoclorina, en donde una cadena lateral terpenoide está unida en la posición 3 de orcilaldehído, y que es capaz de servir como un ligando del receptor X retinoide. Ejemplos típicos de ascoclorina y sus homólogos (en adelante referidos algunas veces como los compuestos de la presente invención), incluyen los siguientes compuestos: Fórmula (I): Ascoclorina y sus análogos y derivados La estructura absoluta de ascoclorina ha sido identificada por los inventores de la presente como 3-[5-[1 (R), 2(S), 6(S)-trimetil-3-oxociclohexil]- 3-metil-2,4-pentadienil]-2,4-dihidroxi-5-cloro-6-met¡lbenzaldehído, usando difractometría de rayos X. Los compuestos de fórmula (1 ) incluyen los siguientes. i 1 CUADRO 1 Ascoclorina v sus análogos v derivados w 1 5 -CHO H H Cl H Ascoclorina (ASC) 2 -CHO H H Cl -OAc LL-Z1272 ? 3 -CHO H H Br H Bromo-ASC 4 -CHO H H H H Decloro-ASC 5 -CHO H CH3CO- Cl H Acetil-ASC 6 -CHO H -CH3 Cl H 4-O-metil-ASC ^^*< Ü* JO 7 -CHO -CH3 -CH3 Cl H 2,4-dimetil-ASC 8 -CHO CH3CO- -CH3 Cl H 4-O-metil-2-O-acetil-ASC 9 -CHO -CH3 CH3CO- Cl H 2-O-metil-4-O-acetil-ACS 10 -CHO -CH3 H Cl H 2-O-metil-ASC 11 -CHO H CH3CH2- Cl H 4-O-etil-ASC 15 12 -CHO H alilo Cl H 4-O-alil-ASC 13 -CHO H butilo Cl H 4-O-butil-ASC ^ 14 -CHO H -CH2COOH Cl H 4-O-carboximetil-ASC 15-17-CHO H -(CH2)nCOOH Cl H n = 2~4 18 -CHO H -CH2COOCH3 Cl H * 19 -CHO H nicotinoilo Cl H 4-O-nicotinoil-ASC 20 20 -CHO H benzoilo Cl H 4-O-benzoil-ASC 21 -CHO H isonicotinoilo Cl H 4-O-isonicotinoil-ASC •v\ , * 24 a"'&t- Fórmula (2): Dihidroascoclorina y sus análogos v derivados Los compuestos de fórmula (2) incluyen los siguientes. 10 CUADRO 2 Dihidroascoclorina v sus análogos y derivados 22 Cl H dihidro-ASC 15 23 H H LL-Z-1272 e 24 Cl -OH 4-hidroxi-4',5'-dihidro-ASC 25 Cl -OAc closonectina Fórmula (3): Cilindroclorina (Compuesto # 26) Fórmula (4): Compuesto #27 f ío 6-Cloro-5-hidroxi-7-metil-2-[2-(1 ,2,6-trimetil-3-oxociclohexil)etenil-8- cromancarbaldehído Fórmula (5): Compuesto #28 20 S-Cloro-d-hidroxi^J-dimetil^-p-íl ^.e-trimetil-S-oxocicIohexi etenil-e- cromancarbaldehído Fórmula (6): Análogos y derivados (1 ) de ascoclorina Los compuestos de fórmula (6) incluyen los siguientes. 10 CUADRO 3 Análogos v derivados (1) de ascoclorina # Ri R2 29 Cl H 30 Cl grupo alquilo * 31 Cl grupo acilo ** 32 H H 33 H grupo alquilo * 34 H grupo acilo ** * Grupo alquilo : metilo ** Grupo acilo: acetilo Fórmula (7) Análogos y derivados (2) de ascoclorina Los compuestos de fórmula (7) incluyen los siguientes: CUADRO 4 Análogos y derivados (2) de ascoclorina 35 Cl H 36 Cl grupo alquilo * 37 Cl grupo acilo ** 38 H H 39 H grupo alquilo * 40 H grupo acilo ** Grupo alquilo: metilo * Grupo acilo: acetilo Las estructuras químicas de estos compuestos están caracterizadas porque una cadena lateral terpenoide está unida a la porción orcilaldehído para formar una estructura análoga a retinoides, como se muestra abajo.
Ascoclorina Acido retinoico todo trans Los compuestos de la presente invención se pueden obtener como metabolitos producidos mediante fermentación por hongos filamentosos o derivados de los mismos modificados por síntesis orgánica. Desde la mitad de la década de 1960, los inventores han escudriñado antibióticos antivirales liposolubles infectando con un virus de animal cultivos de fibroblastos primarios obtenidos de embriones de pollo incubados, y usando la actividad de los compuestos probados para suprimir la formación de las placas así formadas como una indicación. Durante este procedimiento, se encontró un nuevo antibiótico llamado ascoclorina, como un antibiótico liposoluble producido por un hongo Ascochyta vicias (J. Antibiotics, 21 :539-544, 1968). La estructura química de la ascoclorina determinada por difracción de rayos X, indicó que comprende una porción orcilaldehído y una cadena isoprenoide unida a la misma que consiste de 15 átomos de carbono (Bull. Chem. Soc. Japan 44:2652-2660, 1971 ). Se ha reportado hasta ahora que la ascoclorina y sus homólogos son producidos también por otros hongos aparte de Ascochyta vicias, por ejemplo, Nectria coccínea, Fusarium sp., Cylindocarpon lucidum y Verticillium sp. La cilindroclorina, 4'-hidroxi-5'-hidroascoclorina, 4'-acetoxi-5'-hidroascoclorina, dihidroascoclorina, etc., son análogos obtenidos como subproductos en la fermentación para la producción de ascoclorina. Los inventores han encontrado también que el fuerte efecto inhibidor del apetito de la ascoclorina, se redujo en compuestos obtenidos sustituyendo el hidrógeno en el o los grupos hidroxilo en las posiciones 2 y/o 4 A?.ié ¡i?A¿ . ?**Wfmi* .a¡.v .^ ||t|.. | ). ^.^ ?M??ar * *-fí *¡ • ffif||rn¡~- TlÉJ- riM lll lllÉÉtlÉt " e la porción orcilaldehído en estos compuestos. Estos derivados corresponden a la modalidad preferida de la presente invención. Es preferible que el grupo o los grupos hidroxilo en las posiciones 2 y/o 4 de la porción orcilaldehído, estén alquilados y/o acilados. El término "alquilación" como se 5 usa aquí, significa sustitución del hidrógeno del grupo hidroxilo con un grupo alquilo, a menos que se indique de otra forma. El término grupo alquilo significa un grupo hidrocarbilo monovalente saturado, lineal, cíclico o ramificado. El grupo alquilo puede tener cualquier número de átomos de carbono, siempre que se pueda lograr el efecto deseado con la sustitución y F 10 no se dañe seriamente la función inherente del compuesto. Es preferible que el grupo alquilo tenga de 1 a 10, de preferencia de 1 a 5 átomos de carbono. El término "acilación" como se usa aquí, significa la sustitución del hidrógeno del grupo hidroxilo con RCO-, a menos que se indique de otra forma. R representa un grupo hidrocarbilo alifático o aromático. R puede tener 15 cualquier número de átomos de carbono, siempre que se pueda lograr el efecto deseado con la sustitución y no se dañe seriamente la función inherente del compuesto. Es preferible que R sea de 1 a 20, de preferencia •' de 1 a 10 átomos de carbono. Cuando la ascoclorina reacciona con carbonato de potasio y un 20 compuesto de yoduro de alquilo, por ejemplo bajo calentamiento en un solvente orgánico, primero se alquila el grupo hidroxilo en la posición 4 y después, si el yoduro de alquilo está presente en exceso, también se alquila el grupo hidroxilo en la posición 2. En la porción orcilaldehído de la ascoclorina y sus homólogos, por otra parte, el grupo hidroxilo se acila selectivamente solo en la posición 4, mientras que el grupo hidroxilo de la posición 2 forma un enlace de hidrógeno intramolecular con el grupo carbonilo del aldehido y por áfc lo tanto, no sufre acilación. Es decir, se puede obtener 4-O-acetil-2-O- 5 alquilascoclorina comenzando con 4-O-acetilascoclorina y haciéndola reaccionar con un yoduro de alquilo en presencia de carbonato de potasio. Hidrolizando este producto con un álcali cáustico, se puede obtener 2-O- alquilascoclorina. En comparación con la ascoclorina, tanto la 4-O- alquilascoclorina como la 2-O-alquilascoclorina muestran una toxicidad más 10 baja por administración oral, y una selectividad de unión mejorada a RXR. Por lo tanto, estos derivados son excelentes ligandos que son efectivos incluso a una concentración baja.
II Función y efecto de los compuestos de la presente invención 15 Cada uno de los compuestos de la presente invención exhibe actividad de unión selectiva al receptor X retinoide, y regula la transcripción de ia señal del gen. Particularmente, los receptores X retinoides a los que se unen los compuestos de la presente invención, forman dímeros con receptores nucleares que tienen ligandos respectivos unidos a los mismos en 20 células, y entonces se unen al elemento de respuesta de hormona (HRE) sobre el ADN para regular así la transcripción de un gen específico. Además, los compuestos de la presente invención hacen posible probar fácilmente la actividad de regulación de transcripción de la señal de gen, con los métodos descritos en los ejemplos que se dan más adelante. La comparación entre la capacidad de los compuestos de la presente invención para unirse a RAR y su capacidad para unirse a RXR, es muy característica de que algunos de los • compuestos muestran especificidad más alta para RXR que el ácido 9-cis- retinoico (9-CRA), que es un ligando natural de RXR. Respecto a la expresión del gen luciferasa que sirve como un reportero, los compuestos de la presente invención (esto es, ascoclorina, 4-O-metilascoclorina, 2-O-metilascoclorina, 4- O-acetilascoclorina, etc.), muestran la actividad máxima a una concentración de 5 x 10"7 M a 1 x 10"5 M, aunque es más baja que la concentración máxima 10 (107 M) de 9-CRA. Los compuestos de la presente invención muestran selectividad más alta para RXR que para RAR.
CUADRO 5 Incremento en la expresión de señal de qen con los compuestos de la 15 invención Compuesto Conc. (M) Vector ^ RXR RAR RXR/RAR Acido retinoico todo trans 10'7 37 46 0.88 20 Acido 9-cis-retinoico 10"7 57 36 1.58 Compuesto 1 10"6 61 30 2.03 Compuesto 6 5x10'6 55 35 1.57 Compuesto 10 2x10'5 58 40 1.45 Compuesto 14 10"5 47 38 1.23 Compuesto 26 4x10"7 63 33 1.91 Cada valor significa el grado de incremento en la actividad de luciferasa causado por la adición del compuesto correspondiente, que se expresa refiriendo la actividad de luciferasa en el lote de control como 1. Enseguida se ¡lustrará cómo la regulación de la transcripción del gen con los compuestos de la presente invención, se relaciona con condiciones patológicas. La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas novedosas para tratar y/o prevenir la resistencia periférica a insulina, varias inflamaciones crónicas que ocurren en la arteria del corazón y en la arteria cerebral, microangiopatía inherente a complicación de la diabetes, inflamación crónica en articulaciones y tejido periférico, trastorno metabólico del calcio, etc. Los compuestos de la presente ¡nvención se unen al receptor X retinoide en las células objetivo, forman heterodímeros junto con otros receptores que sirven como socio del receptor X retinoide, y después se unen al elemento de respuesta de hormona sobre el cromosoma. Cuando la transcripción de la señal del gen es regulada por la unión de estos heterodímeros, varía la expresión de la señal de gen en las células objetivo, el tejido y el animal individual, y así se suprime la expresión del gen que participa en el comienzo patológico, con lo cual mejoran las condiciones patológicas. El RXR forma heterodímeros junto con varios receptores nucleares y así regula la expresión de la señal de gen. Entre todos, los heterodímeros formados por RXR con PPAR , LXR y VDR, son particularmente importantes, ya que la regulación de la expresión de señales de gen específico por medio de estos heterodímeros, está relacionada con efectos de disminución de varias condiciones patológicas.
CUADRO 6 Efecto de heterodímeros de receptor nuclear gue comprenden RXR como uno de los socios de unión Ahora se describirán los hallazgos novedosos de los inventores de la presente. En primer lugar, el PPAR? expresado en adipocitos, forma un heterodímero junto con RXR y suprime la producción de citocinas originadas f en adipocitos (principalmente TNFa) para con ello restaurar la sensibilidad 5 periférica a la insulina. Este efecto depende de la dosis también a nivel de animal individual. Incluso en ratones diabéticos obesos de herencia (ratones db/db), que son un modelo de diabetes de tipo II que escasamente muestran alguna reducción del nivel de glucosa en la sangre con la administración de insulina, los compuestos de la presente invención disminuyen la resistencia a ?f' 10 la insulina y así reducen considerablemente los trastornos metabólicos. Después de su unión al receptor RXR en células linfáticas, los compuestos de la presente invención forman heterodímeros junto con el receptor PPAR?, uniéndose también a un ligando y por lo tanto suprimen la producción de citocinas inflamatorias que causan inflamación crónica. Como resultado, se 15 puede suprimir la inflamación crónica en vasos, articulaciones y tejido periférico. Por otra parte, un heterodímero formado por LXR y RXR f expresado en células del hígado, incrementa la transcripción del gen de colesterol-7a hidroxilasa en el hígado, y así acelera la oxidación de colesterol en ácido biliar, promoviendo con ello la excreción de ácido biliar. El efecto de 20 reducción del nivel de colesterol total en el suero exhibido por los compuestos de la presente invención, se origina por promoción de la excreción de ácido biliar. Un heterodímero de VDR con RXR en osteoblastos normaliza el trastorno metabólico de calcio y así disminuye la osteoporosis. ...^^^^ ^i^.^.., ,. J. A. ^.^ . ,.J. ^«atAA^^iaifcjta**.
Como se mencionó arriba, las composiciones farmacéuticas de conformidad con la presente invención están dirigidas al tratamiento y/o prevención de una amplia gama de enfermedades que incluyen enfermedades circulatorias (enfermedad isquémica del corazón, hiperlipoproteinemia 5 caracterizada por un incremento de lipoproteínas de baja densidad, hipertensión, etc.), enfermedades metabólicas (diabetes de tipo I, diabetes de tipo II, etc.), inflamaciones crónicas (artritis reumatoide, etc.), enfermedades autoinmunes e inflamación crónica en la arteria que induce constricción y obstrucción de la cavidad interna de varios órganos (esto es, arteriosclerosis), jf': 10 periartritis nodosa que hace a la arteria frágil, inflamación tópica crónica (aneurisma, etc.), restenosis arterial subsecuente a angioplastía coronaria transluminal percutánea; y complicación de la diabetes, esto es, inflamación crónica de microvasos (nefropatía diabética, neuropatía diabética, retinopatía diabética, etc.). Además, los compuestos de la presente invención se pueden 15 usar en el tratamiento y/o prevención de osteoporosis caracterizada por trastorno metabólico del calcio. Los compuestos de la presente invención se pueden administrar a animales incluyendo humanos, para tratar y/o prevenir • las enfermedades arriba descritas. Enseguida se describirá el mecanismo que prueba que la 20 asoclorina y sus derivados sirven como ligandos de RXR y así ejercen efectos terapéuticos y/o preventivos sobre inflamación crónica de muchos tipos. La ascoclorina y sus derivados muestran varias actividades biológicas en pruebas de animales y pruebas clínicas. Como estas actividades biológicas parecen no estar relacionadas entre sí, el mecanismo de acción que forma la base de las mismas ha sido desconocido durante mucho tiempo. El descubrimiento del receptor nuclear de glucocorticoides en 1985 y el f descubrimiento del receptor RXR en 1990, presentaron un enfoque que 5 probablemente pudiera conducir por primera vez a la descripción del mecanismo de acción de la ascoclorina y sus derivados. El PPAR?, que es uno de los miembros de la superfamilia de receptores nucleares, es expresado en adipocitos y se une a un ligando. Después forma un heterodímero junto con RXR y promueve así la transcripción de un gen que f ío promueve la diferenciación de células precursoras en adipocitos. Se ha esclarecido que el incremento de la sensibilidad periférica a la insulina es ocasionado por la regulación de la transcripción génica por parte de este heterodímero. De 1982 a 1985, los inventores reportaron que un derivado de ascoclorina, el compuesto 14, incrementó el efecto de la insulina en ratones 15 diabéticos obesos de herencia y en ratones normales (T. Hosokawa y otros, Agr. Biol. Chem. 34: 2865-2869, 1982; y Diabetes vol. 34:267-274, 1985). fk Seis años después, se reportó que la troglitazona, que es un ligando de PPAR?, ejerció en efecto de mejoramiento de la insulina en animales diabéticos, de forma similar a los compuestos de la presente invención (T. 20 Fujiwara y otros, Diabetes 37:1549-1558, 1988). En base a los efectos de estos compuestos similares entre sí, los inventores consideraron en primer lugar que dichos compuestos podrían tener el mismo mecanismo de acción.
Puesto que la ascoclorina y sus derivados ejercen varios efectos que no pueden ser probados como atribuibles a un ligando de PPAR?, es obvio que estos compuestos no son ligandos de PPAR?. De esta manera, los fp inventores asumieron que los compuestos de la presente invención 5 probablemente sirvan como uno de los transportadores de heterodímeros en la superfamilia de receptores nucleares, y por lo tanto también forman heterodímeros junto con PPAR?. Desde este punto de vista, por medio de experimentos con cultivos celulares y con animales, los inventores de la presente han probado que la ascoclorina y sus derivados son ligandos de f' 10 RXR, completando con ello la presente invención. Tratando células de animal, que han sido transfectadas con un plásmido en donde está ligado un vector del gen de RXR y un elemento de respuesta de hormona con un gen reportero, con los compuestos de la presente ¡nvención, es promovida la transcripción del gen reportero dependientemente de la concentración, como 15 en el caso de ácido 9-cis-retinoico (9-cRA), que es un ligando natural de RXR. Aunque los compuestos de la presente invención nunca inducen la diferenciación de adipocitos precursores en adipocitos, la diferenciación hacia adipocitos es promovida notablemente por el uso combinado de los mismos con un ligando de PPAR? a una concentración tan baja que no muestra efecto 20 de inducción de la diferenciación. De esta manera, también se ha esclarecido que los ligandos de RXR ejercen un efecto sinergístico con el ligando de PPAR?. Es decir, se ha encontrado claramente que los compuestos de la presente invención forman in vivo heterodímeros junto con otros miembros de la superfamilia de receptores nucleares, y regulan la transcripción de un gen específico con los receptores nucleares que sirven como el socio de unión. Por otra parte, los inventores confirmaron en 1970 que la administración oral de ascoclorina en roedores tales como ratón y rata, ejerce un efecto anoréxico, así como también efectos de reducción del nivel de glucosa en la sangre, el nivel de lípidos en el suero y el nivel de insulina en el suero. Cuando se administra oralmente a ratas anestesiadas y a ratas hipertensas, la ascoclorina mostró un potente efecto de reducción de la presión sanguínea. Estos efectos hacen a la ascoclorina adecuada como un remedio para el síndrome de resistencia a la insulina. En experimentos en animales, sin embargo, el efecto anoréxico es similar al efecto del incremento de la acción de insulina, lo que hace muy difícil evaluar su efecto farmacológico como un agente de mejoramiento de la insulina. De esta manera, se hicieron intentos por sintetizar derivados que tuvieran un efecto anoréxico relativamente débil, sintetizando varios derivados a través de la modificación de la estructura molecular de la ascoclorina. Como resultado, se ha encontrado que el efecto anoréxico se puede debilitar sustituyendo los átomos de hidrógeno unidos a los grupos hidroxilo en las posiciones 4 y/o 2 de orcilaldehído en la molécula de ascoclorina, con varios sustituyentes. Cuando los derivados de ascoclorina en los cuales el grupo hidroxilo en la posición 2 o 4 del anillo aromático se había sustituido con alquilo inferior, acilo, carboximetilo, etc., se administraron oralmente a animales experimentales tales como ratones, ratas y perros beagle, estos derivados mostraron efectos de reducción del nivel de glucosa en sangre y el nivel de colesterol total en el suero. Estos derivados mostraron un efecto de potenciación de la insulina en roedores normales y en modelos patológicos de diabetes. Por ejemplo, el compuesto 14, que es uno de estos derivados, 5 disminuyó el nivel de insulina en el suero en ratones normales y diabéticos, en comparación con el grupo de control, pero redujo el nivel de glucosa en la sangre y promovió la descarga de glucosa de la sangre (Hosokawa y otros, Agrículture and Biológica! Chemistry 34:2865-2869, 1982). Los compuestos de la presente invención ejercen un efecto notable de mejoramiento del fp 10 metabolismo de ratones diabéticos obesos de herencia (ratones db/db). Puesto que carecen por herencia de un receptor de leptina, que es una proteína anoréxica sintetizada y liberada en el tejido adiposo en la saciedad, tales ratones no tienen control del apetito incluso en la saciedad. Como resultado, sufren de hiperinsulinemia por sobrealimentación, y su sensibilidad 15 periférica a la insulina de reduce en gran medida. Por lo tanto, estos ratones db/db muestran poca reducción del nivel de glucosa en la sangre incluso después de la administración de una cantidad de insulina suficiente para # ocasionar coma hípoglicémico en animales normales, y también muestran una seria obesidad, hiperinsulinemia e hiperlipemia. Cuando se administra 20 oralmente a ratones db/db, el compuesto 14 alivia la resistencia a la insulina y reduce significativamente el nivel de glucosa en la sangre, el nivel de lípidos en suero y el nivel de insulina en suero (T. Hosokawa y otros, Diabetes, vol. 34:267-274, 1985). Una serie de estudios realizados por los inventores de la -Lt&«t .~*?&.i*-~*- **¿**i x-3kmA» presente estuvo dirigida a la ciglitazona, que es el TZD más antiguo correspondiente al precursor de pioglitazona. En estos estudios, sin embargo, los compuestos de la invención se administraron dentro de un período } relativamente corto antes de que la obesidad de los ratones db/db alcanzara 5 un máximo. Consecuentemente, existe el riesgo de que los resultados podrían no expresar exactamente los efectos de los compuestos de la presente invención sobre condiciones patológicas de larga duración en los humanos. f 10 Efecto de protección de células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans. Ya se ha sostenido, con los resultados de varios experimentos, que la administración oral de los compuestos de la presente invención incrementa la sensibilidad periférica a la insulina y disminuye los trastornos metabólicos en ratones db/db. Sin embargo, es de notar que los compuestos 15 de la presente invención ejercen un efecto de retención de la función de la síntesis pancreática de insulina durante un período largo, que es defectuosa f, en diabetes. Este efecto fue indicado claramente por el nivel de insulina en el suero y por la observación patológica del páncreas de ratones db/db a los cuales se había administrado el compuesto 14 durante cerca de 1 año. El 20 compuesto 14 redujo el nivel de glucosa en la sangre de los ratones db/db hasta un nivel casi comparable con la carnada normal, suprimió polidipsia y poliuria características de la diabetes, y redujo drásticamente la glucosa urinaria a 1/100 o menos en comparación con el grupo de control. Además, el compuesto 14 disminuyó la proteína urinaria durante todo el período experimental. En ratones de control, las células ß pancreáticas estaban exhaustas debido a la hiperproducción de insulina y la productividad de « insulina se redujo notablemente cuando el peso corporal alcanzó un máximo 5 (esto es, aproximadamente 20 semanas después del nacimiento). Aproximadamente 40 semanas después del nacimiento, estos ratones sufrieron de cetosis y tenían un nivel de glucosa en la sangre mayor de 700 mg/dl. Particularmente, surgió una conversión de diabetes mellitus no dependiente de insulina a diabetes mellitus dependiente de insulina, análoga a 10 la diabetes humana de tipo II. Incluso al reducir el peso corporal hasta un • nivel similar al de la carnada normal después de la 40a. semana, los ratones db/db que carecen del receptor de leptina, sufrieron sobrealimentación y la energía alimenticia que no pudo ser anabolizada debido a la pobreza de insulina, fue excretada del cuerpo en una gran cantidad. En este experimento, 15 se debe enfatizar que la función de las células-ß pancreáticas fue completamente sostenida durante 1 año, a pesar de la hiperproducción continua de insulina debido a sobrealimentación en el grupo de administración del compuesto 14. Como el compuesto 6 muestra un efecto similar, el efecto de permitir que las células-ß pancreáticas sostengan su efectividad en la 20 diabetes, es una de las principales características de los compuestos de la presente ¡nvención. El efecto de los compuestos de la presente invención para proteger la función de las céluias-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans, también se observó en un experimento en donde se administró aloxan o estreptozotocina a ratas para inducir rápidamente diabetes mellitus dependiente de insulina. Cuando se administraron a los animales, agentes inductores de diabetes tales como aloxan y estreptozotocina, desnaturalizan 5 selectivamente las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans. Una vez se consideró que este efecto destruiría las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans y a su vez. ocasionaría la terminación de la producción de insulina induciendo con ello la aparición de diabetes mellitus dependiente de insulina. Monitoreando el proceso de la aparición de diabetes mellitus f 10 dependiente de insulina ocasionada por agentes inductores de diabetes, sin embargo, se ha esclarecido que este proceso es más complicado. Particularmente, estos agentes inductores de diabetes únicamente activan el proceso; las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans que han sido desnaturalizadas por el agente inductor de diabetes, sufren inflamación y son 15 destruidas como resultado de un proceso inmunológico que toma de 1 a 2 semanas para alcanzar la terminación después de la administración del ff agente inductor de diabetes. Los linfocitos T, que controlan la inmunidad celular, reconocen a las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans que han sido desnaturalizadas y que sufren inflamación crónica como materia 20 extraña, e intentan eliminarlas inmunológicamente y matarlas, induciendo así la aparición de diabetes mellitus dependiente de insulina. Por lo tanto, la aparición de diabetes mellitus dependiente de insulina se puede prevenir administrando ciclosporina, que es capaz de inhibir la función de los linfocitos T, antes de la terminación de la destrucción inmunológica de las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans, incluso después de la administración de un agente inductor de la diabetes. f Los compuestos de la presente invención no tienen un efecto 5 como el de la ciclosporina para suprimir la función de los linfocitos T. Cuando los compuestos de la presente invención se administran oralmente antes de la destrucción completa de las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans, y de la aparición de diabetes mellitus dependiente de insulina, son capaces de interferir con el proceso de aparición de diabetes, y aliviar 10 considerablemente las condiciones patológicas resultantes. Este efecto parece derivar del efecto de disminución de la inflamación crónica ejercido por los compuestos de la presente invención. Es decir, las células macrófagos primero reconocen a las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans que han sido desnaturalizadas por el agente inductor de diabetes, y así son 15 consideradas como materia extraña, y presentan un antígeno a los linfocitos que devoran ? [sic] las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans f para eliminar con ello estas células. En macrófagos activados, los compuestos de acuerdo con la presente invención forman heterodímeros que consisten de RXR y PPAR?, y así retardan el proceso de eliminación de las 20 células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans desnaturalizadas por los íínfocitos, dando tiempo de esta maneras para la reparación de las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans. La reducción programada hereditaria de la función productora de insulina que se observa en ratón clabético obeso de herencia, y el rompimiento de células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans inducido rápidamente por un agente inductor de diabetes, tienen el punto en común de que las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans sufren autorrompimiento inmunológico debido a ^w inflamación crónica; aunque estos fenómenos difieren entre si en la rapidez de avance. Por lo tanto, es razonable suponer que los compuestos de la presente invención exhiben un efecto protector sobre las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans en dos modelos patológicos diferentes. Las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans que F 10 producen insulina son las principales células implicadas en la diabetes. El efecto protector de estas células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans en animales diabéticos es un efecto definitivo de los compuestos de ia presente invención para tratar la diabetes. 15 Similitud de estructura Química Es de interés que la ascoclorina tiene una estructura química > similar a los retinoides. La ascoclorina lleva una cadena lateral de farnesol que es más corta por una unidad de ¡sapreno que el geranilgeraniol, esto es, un precursor retinoide. El anillo ciciohexanona terminal de la ascoclorina es 20 estructuralmente similar al anillo ciciohexeno de los retinoides. Como se muestra con la estructura absoluta determinada por los inventores por medio de difractometría de rayos X, los compuestos de la presente invención llevan, como la cadena lateral unida en la posición 5' de 2,4-dihidroxi-5- clorobenzaldehído, la cadena lateral [1'(R), 2'(S), 6'(S)-trimetil-3-'oxiciclohexil- 3-metil-2,4-pentadienilo, la cadena lateral 3-metil-2-pentenilo que tiene reducción en uno de los enlaces dobles, 1'(R), 2'(S), 5'(S)-trimetil-5'- k oxociclohexilo que tiene desviación del grupo carbonilo del anillo 5 ciciohexanona a la posición 5, o el grupo [1'(R), 2'(S), 6'(S)-trimetil-3'- oxociclohexenil]. Además, el grupo carbonilo del orcilaldehído contado desde el grupo ciciohexilo, está localizado en la misma posición que el carboxilato terminal de ácido retinoico. Estos hechos indican que el esqueleto de la ascoclorina es estructuralmente similar al ácido 9-cis-retinoico que es un 10 ligando endógeno de RXR. Consecuentemente, también desde el punto de vista de la estructura molecular, la ascoclorina y sus derivados seguramente son ligandos de RXR. Los compuestos de la presente invención suprimen significativamente la arteriosclerosis en conejos blancos y codornices 15 japonesas alimentadas con una dieta alta en colesterol, e inhiben la formación de aneurisma en la arteria mesentérica de ratas a las cuales se administra corticoide mineral y se les da solución salina fisiológica? [sic] como agua para beber. Estos hallazgos indican que los compuestos de la presente invención ejercen efectos terapéuticos y/o preventivos sobre la inflamación crónica en la 20 arteria. Por otra parte, el efecto sobre artritis causada por adyuvante en ratas indica que los compuestos de la presente invención tienen un efecto de disminución, no solo de la inflamación crónica de la arteria, sino también de la inflamación crónica de la articulación. Además, los compuestos de la 4 presente invención ejercen un efecto terapéutico significativo sobre la complicación de la diabetes que es inducida clínicamente por inflamación crónica en microvasos. Surge entonces la cuestión de cómo es que los compuestos de la presente invención pueden ejercer los efectos terapéuticos y/o preventivos sobre estas inflamaciones crónicas. A este respecto, estudios sobre el receptor PPAR? activado por proliferador de peroxisoma, proveen una indicación útil. Una vez se consideró que el PPAR? podría ser un receptor nuclear que está presente en tejido adiposo, y que podría regular la expresión de la señal de gen e inducir diferenciación de células precursoras en adipocitos. En la actualidad, se ha esclarecido que el PPAR? es expresado no solo en tejido adiposo, sino también en el tracto intestinal, tejido linfático y glándula adrenal, en una gran cantidad. También, se ha determinado que la 15-desox?-?12,14-prostaglandina J2 (15d-PGJ2), que es un ligando endógeno que parece tener la más alta afinidad con el PPAR?, está presente no en tejido adiposo blanco, sino en células linfáticas tales como macrófagos. La producción y liberación de citocinas inflamatorias por parte de macrófagos, que activa la inflamación crónica, se produce cuando funciona mal la regulación de transcripción de genes inflamatorios por medio del heterodímero de PPAR? con RXR. De hecho, se ha probado que los compuestos de la presente invención, que son ligandos de RXR, son efectivos en el tratamiento y/o prevención de inflamación crónica, dependientemente de la dosis, en experimentos con animales En pruebas clínicas en sujetos con complicación de diabetes, estos compuestos también muestran un efecto .? ' *. > terapéutico sobre la inflamación crónica. El descubrimiento del efecto antiinflamatorio de los compuestos de la presente invención sobre la inflamación crónica, corresponde a uno de los principales puntos de la presente solicitud de patente, así como los efectos de mejoramiento del 5 metabolismo en la diabetes, protegiendo las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans, promoviendo la síntesis de ácido biliar en el hígado y mejorando el metabolismo de calcio. En enfermedades circulatorias, la inflamación crónica se produce en la arteria coronaria del corazón, arteria cerebral, etc. En la complicación de la diabetes, se produce en nervio lo periférico, riñon, retina, etc.. Se produce en articulaciones en artritis reumatoide, y en varios tejidos periféricos en enfermedades autoinmunes. Además, se produce inflamación crónica en la arteria de un órgano transplantado y la arteria coronaria agrandada con el uso de un balón o un stent. La inhibición de la producción de citocinas inflamatorias lograda por los 15 compuestos de la presente invención, es el mecanismo de acción común a la supresión de estas inflamaciones crónicas que ocurren en órganos y tejidos en una amplia gama. Entre varias decenas de miembros de la superfamilia de receptores nucleares, hay varios receptores huérfanos cuyos ligandos todavía 20 son desconocidos. El PPAR? forma un heterodímero junto con RXR solo, mientras que RXR forma heterodímeros con varios receptores nucleares además de PPAR?. Por lo tanto, uno de los enfoques de la biología hoy, es saber cómo afectan las funciones biológicas los heterodímeros de RXR con ,-" «^ . 49 otros receptores aparte de PPAR?. Ya es conocido que algunos de estos heterodímeros, tales como el heterodímero de RXR con receptor de hormona tiroide, no afectan la función de la hormona tiroide. Según se describe en la presente invención, el receptor de orfano de hígado (LXR) que es denominado sensor de colesterol, y el receptor de vitamina D3 activado (VDR), forman heterodímeros con RXR, afectando seguramente la transcripción del gen. Hasta ahora había sido completamente desconocido cómo es que estos heterodímeros regulan la expresión de señal de gen y afectan las funciones biológicas. Es decir, los efectos de los heterodímeros de RXR con LXR o 10 VDR sobre las funciones biológicas, han sido esclarecidos por primera vez por los inventores presentes.
Efectos Clínicos Frecuentemente se observa que un compuesto novedoso, 15 aunque se escudriña y selecciona por su eficacia sobre un modelo patológico como indicación, y que se ha visto seguro cuando se administra a sujetos 9' humanos, produce efectos inesperados, y por lo tanto los esfuerzos de investigación y desarrollo se anulan. Sin embargo, se ha confirmado la eficacia y la seguridad de algunos de los compuestos de la presente 20 invención, no sólo en experimentos en animales, sino también en una prueba clínica de fase I y en una prueba clínica de fase II. Particularmente, la administración oral del compuesto 6 reduce el nivel total de colesterol y el nivel de glucosa en la sangre de pacientes con diabetes de tipo II y reduce $PT* * - significativamente la presión sanguínea de diabéticos con hipertensión o hipertensión limítrofe. Como es capaz de disminuir significativamente los síntomas relacionados con nefropatía y neuropatía diabética, el compuesto 6 se puede decir que ejerce definitivamente un efecto antiinflamatorio en casos 5 de inflamación crónica, que se observa en pruebas de animales y también en pruebas clínicos. Además, el compuesto 6 mejora la tolerancia a la glucosa en la diabetes de tipo II y por lo tanto incrementa la sensibilidad periférica a insulina. Por otra parte, el compuesto 6, que se administra en una dosis diaria que varía de 1 mg/kg a 16 mg/kg, no muestra efecto secundario subjetivo ni 10 objetivo y no arroja datos anormales en examen biológico de suero, examen de células de la sangre, examen de orina, etc. Por lo tanto, se puede concluir que el compuesto 6 no tiene efectos secundarios dentro de la escala de administración arriba especificada. También es notable desde un punto de vista clínico, que los compuestos de la presente invención ejercen un efecto 15 notable sobre las complicaciones de la diabetes. Las complicaciones de la diabetes no se producen en un período breve. Es decir, la complicación característica de diabetes inducida por microangiopatía en riñon, nervio periférico y retina, no se produce a menos que se padezca la diabetes por 10 años o más. Por lo tanto, el efecto terapéutico de los compuestos de la 20 presente invención sobre la complicación de la diabetes, es establecido no solamente por el mejoramiento del metabolismo mediante el alivio de la resistencia a la insulina, sino por la disminución de la inflamación crónica.
Este efecto terapéutico sobre las complicaciones de la diabetes es uno de los efectos más significativos de los compuestos de la presente invención.
Anulación de efectos secundarios inherentes a retinoides 5 Hay muchos datos acumulados sobre retinoides que son vitaminas liposolubles típicas, y se han estudiado durante mucho tiempo. Además de ácido 9-cis-retinoico, se han reportado derivados que se unen específicamente a RXR, demasiados para citar cada uno de ellos. Suponiendo que los ligandos de RXR tuvieran un efecto potencial pero 9 & .< lo notable en el tratamiento de enfermedades crónicas, surge la pregunta de porqué nunca se habían aislado compuestos muy efectivos y seguros como fármacos de entre tantos derivados retinoides. La respuesta es que todos los retinoides y sus análogos conocidos hasta ahora como ligandos de RXR, son fuertemente tóxicos para el hígado y el sistema nervioso. Entonces surge la 15 pregunta de porqué los compuestos de la presente invención no muestran la toxicidad común a los retinoides en animales y humanos. Para responder a esta pregunta, es necesario ilustrar diferencias entre los retinoides y los ^Kr compuestos de la presente invención en cuanto a absorción, transporte, * distribución, metabolismo, excreción y similares. Cuando se absorbe por el 20 tracto digestivo, la vitamina A, que es una sustancia muy liposoluble, se une a la proteína sérica que se une específicamente a retinoide. Cuando se incorpora en las células objetivo, se une a una proteína de unión a retinoide en las células y se almacena en el hígado. Alternativamente, ejerce su efecto en el tejido objetivo, si es necesario. Para incorporar la vitamina A transportada hacia las células objetivo, parece ser necesario que una proteína de unión a retinoide en la sangre se una específicamente al receptor correspondiente sobre la capa de superficie de las células. Sin embargo, no se han hecho estudios detallados sobre este punto. En cualquier caso, la distribución del retinoide está estrechamente relacionada con la especificidad. En el caso de tratamiento de diabetes, los retinoides no serían distribuidos selectivamente en el tejido adiposo objetivo o los macrófagos activados, esto es, las células objetivo de inflamación crónica. Para elevar la concentración de ligando de RXR en el tejido objetivo o en las células objetivo, a un nivel que permitiera la regulación de la señal de gen administrando un retinoide a un animal, se necesitaría administrar el retinoide en exceso. Cuando se administra un retinoide en exceso, se acumula en nervio, hígado, piel, etc., a un nivel que excede el límite superior aceptable y, a su vez, ejerce efectos secundarios. Para resumir, los derivados retinoides conocidos hasta ahora no muestran especificidad de distribución hacia un órgano objetivo, y de esta manera la ocurrencia de fuertes efectos secundarios indeseables es inevitable. Cuando compuestos de acuerdo con la presente invención marcados con radioisótopos, se administran oralmente a animales, los compuestos no son detectados en el plasma aunque la radioactividad absorbida por el tracto digestivo aparece en la sangre portal. Es decir, los compuestos de la presente invención se unen fuertemente a proteína sérica.
Oe esta manera, estos compuestos no pueden ser liberados de las proteínas y recuperados en un solvente orgánico bajo las condiciones usuales empleadas para liberar fármacos unidos a proteína. Para recuperar tal compuesto del plasma en un estado libre, se requiere agregar una gran cantidad de solvente 5 orgánico miscible en agua (metanol, etanol, acetona, acetonitrilo, etc.) al plasma, acidificar la mezcla (pH 3.0 o menos) y después dejarla reposar a temperatura ambiente durante aproximadamente 1 semana. Incluso después de este tratamiento, el compuesto libre se puede recuperar a un rendimiento de aproximadamente 90% en el caso más alto, en términos de radioactividad. 10 Particularmente, es imposible recuperar 100% del compuesto libre. De esta manera, se supone que los compuestos de la presente invención se unen a la proteína, no mediante un enlace de proteína como el observado generalmente en varios fármacos, sino mediante un enlace covalente. Las estructuras de estas sustancias novedosas de los compuestos de la presente invención, y de 15 la proteína sérica presente en el suero, han sido esclarecidas por medio del siguiente experimento. Se disuelven ascoclorina, compuesto 6 o compuesto 14 en una cantidad pequeña de un solvente orgánico y se le agrega al suero. ^ r Después el compuesto libre disminuye continuamente en una vida media corta. Después de 24 horas, apenas se detecta el compuesto libre. Durante 20 este período, el suero se vuelve amarillo conforme disminuye el compuesto libre. Esto es porque el máximo de absorción de luz ultravioleta atribuible al compuesto de la invención se desvía hacia la porción visible debido a la adición del suero. Cuando un solvente orgánico (etanol, acetonitrilo, etc.) se 4 agrega al suero de color amarillo que contiene el compuesto de la presente invención, el colorante nunca se disuelve en el solvente, lo que indica claramente que el compuesto está unido estrechamente a la proteína. Se ha determinado que este enlace es un enlace covalente formado por la reacción del grupo aldehido en el compuesto de la presente invención, con el grupo amino de la proteína sérica para formar una base de Schiff. La base de Schiff formada mediante el enlace entre el compuesto de la presente invención y la proteína sérica, no sufriría transposición de Amadori, a diferencia del caso en el cual un sacárido se une a la proteína. Por lo tanto, no se forma producto final de glicación avanzado irreversible. Dicha base de Schiff es completamente reversible y se hidroliza en un solvente orgánico bajo condiciones acidas para regenerar el compuesto de la presente invención y la proteína sérica. Consecuentemente, la formación de una base de Schiff por parte del compuesto de la presente invención con la proteína sérica, tiene un efecto amortiguador por medio del cual la actividad biológica del compuesto libre absorbido por el tracto digestivo, es enmascarada transitoriamente y el compuesto activo libre es suministrado gradualmente al tejido objetivo. La base de Schiff formada por la reacción del compuesto de la presente invención con proteína sérica, es un compuesto inactivado con una actividad biológica enmascarada. El examen de la distribución de radioactividad en los órganos de ratas a las cuales se administró oralmente una vez el compuesto 6 marcado con radioisótopo, indicó que la radioactividad decayó rápidamente en la mayoría de los órganos y 3 *.» desapareció después de 3 días. Esta radioactividad fue principalmente excretada en heces. Es muy interesante que la radioactividad incorporada en tejido adiposo blanco (esto es, el tejido objetivo del tratamiento de diabetes de ' tipo 11), se elevó día con día. Sigue siendo interesante que el compuesto 5 radioactivo incorporado en el tejido adiposo era compuesto 6 libre disuelto en gotas de aceite en las células. No se sabe por qué la radioactividad se distribuye selectivamente en tejido adiposo y se acumula con el paso del tiempo. Sin embargo, esta distribución selectiva indica suficientemente que el compuesto de acuerdo con la presente invención puede disminuir el trastorno lo metabólico diabético con un alto grado de seguridad. Particularmente, el ^ compuesto de la presente invención es convertido en una base de Schiff muy estable con actividad biológica enmascarada en el paso de absorción por el tracto digestivo. Esta base de Schiff es adsorbida sobre la capa superficial de las células objetivo y se incorpora en las células mediante endocitosis. 15 Después es hidrolizada para regenerar el compuesto 6. El compuesto 6 libre se disuelve en gotas de aceite en los depósitos de grasa. En los adipocitos, se disuelve gradualmente en el citoplasma y ejerce su efecto. Cuando los depósitos de grasa en tejido adiposo blanco son transportados hacia otros .tejidos como una fuente de energía, el compuesto 6 libre es transportado junto 20 con la grasa. Esto es, también sirve como un depósito simultáneamente. El , compuesto de acuerdo con la presente invención difícilmente es incorporado en otros tejidos. Tampoco se acumula ni muestra toxicidad alguna a menos que haya gotitas de aceite de depósito de grasa. A diferencia de los retinoides, los compuestos de la presente invención pueden ejercer los efectos sin ocasionar los efectos secundarios inherentes a los retinoides. Las razones, sin duda, están relacionadas con la cinética (absorción, transporte, regeneración de compuesto activo en la capa de superficie de las células ^ 5 objetivo, etc.) de los compuestos de la presente invención, que difiere de la de los retinoides. Por ejemplo, (1 ) los compuestos de la presente invención son convertidos en bases de Schiff no tóxicas con actividad enmascarada en el paso a través de células endoteliales absorbentes en la mucosa intestinal; (2) a diferencia de los retinoides, los compuestos de la presente invención se lo unen a la proteína sérica mediante enlace covalente seguido por transporte in vivo; y (3) después de ser incorporados en la capa de superficie de las células objetivo por endocitosis, el compuesto 6 es hidrolizado, regenerado y después disuelto en gotitas de aceite en las células. La figura 1 ilustra sistemáticamente una reacción para formar una base de Schiff entre el 15 compuesto de acuerdo con la presente invención y proteína sérica. Como se explicó arriba, los compuestos de la presente invención sirven como ligandos del receptor RXR (esto es, como un miembro de la superfamilia de receptores nucleares), y de esta manera regulan la expresión de señal de gen en animales de sangre caliente. El receptor RXR forma 20 heterodímeros solo con PPAR?, pero también con el receptor de hormona tiroide (TR), LXR, BXR (un receptor de orfano que se une a ácido benzoico), VDR, etc. hasta donde se sabe hasta ahora. Se ha esclarecido además que cada heterodímero regula la transcripción de gen específica de órgano o de tejido y ejerce varios efectos sobre las funciones biológicas. Como se describe aquí, se ha esclarecido en el transcurso de la investigación del mecanismo de acción de los compuestos de la presente invención, que la * 9k: regulación transcripcional de la señal de gen dependiente del ligando RXR, 5 afecta principalmente funciones biológicas sobre una escala inesperadamente amplia. Los estudios sobre PPAR? han revelado hasta ahora que el factor de necrosis tumoral (TNFa) liberado de adipocitos agrandados debido a un incremento en el depósito de grasa, reduce la sensibilidad a la insulina en 'fi ío el hígado, y que un dímero de RXR con PPAR? suprime la producción de TNFa para restaurar con ello la sensibilidad a la insulina. Por otra parte, los compuestos de la presente ¡nvención son incorporados en macrófagos activados, acumulados en sitios de inflamación crónica inducida en pared arterial y articulación. Entonces estos compuestos sirven como ligandos de 15 RXR para formar heterodímeros con PPAR? y después se unen a un sitio específico del cromosoma, regulando con ello la expresión de la señal de gen W * relacionado con la inflamación. Así, estos compuestos bloquean el promotor transcripcional de citocina inflamatoria e inhiben la transcripción de la señal del gen, logrando así un efecto antiinflamatorio. Cuando se incorporan en el 20 hígado, los compuestos de la presente invención forman heterodímeros RXR: LXR y así promueven la transcripción del gen en la ruta de la biosíntesis de ácido biliar. Entonces, estos compuestos activan el proceso de oxidación de colesterol hacia ácido biliar y descargan el exceso de colesterol del cuerpo. 5 RXR forma un heterodímero junto con VDR, que es un receptor nuclear de vitamina D3 activada, normaliza el metabolismo del calcio in vivo, e impide una reducción de la densidad mineral de hueso. Los compuestos de la presente invención ejercen varios efectos, que parecen no estar relacionados entre sí en experimentos en animales y en pruebas clínicas. Esto es porque estos compuestos son ligandos del receptor RXR. Este es un descubrimiento que impacta no solo la biología sino también la medicina clínica.
MODALIDADES PREFERIDAS DE LA INVENCIÓN Los compuestos de la presente invención se pueden administrar por medio de cualquier vía de administración deseada y aceptable para fármacos usados para fines similares, ya sea solos o en forma de preparaciones apropiadas. Particularmente, se pueden formular en preparaciones sólidas, semisólidas, en polvo secado en congelación o preparaciones líquidas (tabletas, supositorios, pildoras, cápsulas, polvos, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, lociones, aerosoles, ungüentos, geles, etc.), y se administran por ejemplo por vía oral, nasal, parenteral o tópica, preferiblemente en una forma dosificada unitaria que permita la administración en una dosis exacta. Estas composiciones comprenden vehículos o excipientes farmacéuticos empleados comúnmente en la técnica de los compuestos de la presente invención, opcionalmente junto con otros fármacos para uso medicinal, vehículos, auxiliares de absorción, etc.
En general, las composiciones farmacéuticamente aceptables contienen aproximadamente de 1 a 99% (en peso) de los compuestos de la presente invención y aproximadamente de 99 a 1 % de aditivos medicinales apropiados, dependiendo de la forma de administración deseada. Estas composiciones contienen aproximadamente de 5 a 75% de los compuestos de la presente invención como fármaco para uso medicinal, y el resto de rellenos apropiados para uso medicinal. Para disminuir efectivamente las condiciones patológicas, los compuestos de la presente invención se administran en una dosis de 0.1 a 20 mg/kg/día, preferiblemente 0.2 a 5 mg/kg/día para adultos. Para tratar las enfermedades descritas en detalle arriba, es preferible formular preparaciones para controlar la dosis dependiendo de la severidad de la enfermedad. El factor más importante al formular las preparaciones, reside en las restricciones debidas al hecho de que los compuestos de la presente invención son solubles en grasa y por lo tanto es restringido su procesamiento. Puesto que los ligandos de la superfamilia de receptores nucleares son hormonas o vitaminas liposolubles, los compuestos de la presente invención también pueden ser liposolubles. Los aditivos farmacéuticamente aceptables para administración oral se preparan agregando rellenos arbitrarios utilizables en general, por ejemplo manitol, glucosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa o carbonato de magnesio. Estas composiciones pueden estar en la forma de soluciones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos o preparaciones de liberación sostenida. Es preferible que *^'"?- las composiciones estén en la forma de tabletas o pildoras. Estas composiciones pueden contener, junto con los compuestos de la presente invención, diluyentes (lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, etc.), agentes desintegrantes (almidón, derivados de almidón, etc.), agentes lubricantes 5 (estearato de magnesio, etc.), aglutinantes (almidón, acacia, potivinüpirrolidona, gelatina, celulosa, derivados de los mismos), agentes tensioactivos que humedecen la superficie de los granos de los compuestos de la presente invención, aditivos liposolubles, ácido biliar, fosfolípidos y similares. Se prefiere particularmente que la composición contenga agentes 10 tensioactivos sintéticos alifáticos, o auxiliares de polímero solubles en solventes orgánicos. Ejemplos de los mismos incluyen acacia, alginato de sodio, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, polivinilpirrolidona, bentonita, laurilsuifato de sodio, polisorbato 80, esteres de ácido monograso de sorbitán y polioxil 40 estearato. 15 El factor más importante al formular estas preparaciones reside en las restricciones debidas al hecho de que los compuestos de la presente invención son liposolubles y repelentes al agua. En general, la absorción de ^|P^ fármacos líposolubles en el tracto digestivo depende de la velocidad de disolución de las moléculas individuales liberadas de los granos de fármaco, 20 Una vez que un fármaco liposoluble está disuelto en el agua, alcanza el sitio de absorción de la mucosa digestiva, es absorbido rápidamente en la práctica en un estado libre de barrera. Incluso un fármaco muy poco soluble en agua puede ser absorbido rápidamente por administración oral y alcanzar una * biodisponibilidad alta, siempre que pueda disolverse rápidamente en agua. Se sabe que los compuestos de ia presente invención se disuelven muy lentamente en agua. Para formular preparaciones de estos compuestos, por lo tanto, es conveniente proveer aditivos que elevan la velocidad de disolución ^ 5 en agua y/o hacer algún tratamiento en el procedimiento de formulación. En el caso de compuestos que son muy poco solubles en agua y muestran una velocidad de disolución muy baja en agua, como los compuestos de la presente invención, uno de los tratamientos para promover disolución en agua es reducir el tamaño de grano del fármaco. Es decir, es efectivo (1) hacer 10 granos finos de los compuestos a fin de aumentar el área de contacto de los w granos con el agua. Incluso si se forman granos finos de los compuestos, la velocidad de disolución en agua no se puede elevar si estos granos no pueden entrar en contacto con el agua, debido a la existencia de una superficie repelente al agua, y por lo tanto no se pueden dispersar en el agua 15 como granos finos. Por lo tanto, para poner en contacto la superficie del grano con el agua, es preferible (2) usar los compuestos de la presente invención junto con un agente tensioactivo o una sustancia polimérica que incorpore grupos tanto liposolubles como hidrosolubles. También es de utilidad (3) acelerar la liberación de moléculas individuales desde los granos 20 de fármaco. Cuando los granos del fármaco sean cristalinos, es efectivo seleccionar una forma cristalina en donde se requiera energía libre limitada para liberar las moléculas individuales de la red cristalina. También es útil hacer amorfos los compuestos de la presente invención, a fin de promover la ' * liberación de las moléculas individuales. Las condiciones requeridas para la formulación de preparaciones que contienen los compuestos de la presente invención, son como se reclaman en las reivindicaciones relativas a las invenciones de los compuestos de la presente. • 5 Como se mencionó arriba, los compuestos de la presente invención están caracterizados porque- (1) son estrechamente similares en estructura química al ácido 9-cis-retinoico que es un ligando natural del receptor X retinoide; (2) promueven la transcripción de gen a una eficiencia más alta que el ácido 9-cis-ret?noico en un sistema experimental de cultivo de lo células para buscar ligandos de la actividad del receptor X retinoide; (3) • cuando se administran a animales, incluyendo humanos, muestran un efecto de regulación de la expresión de la señal de gen por varios receptores nucleares que forman heterodímeros junto con RXR, y (4) el grupo aldehido reacciona con proteína sérica para formar bases de Schiff con lo cual se evita 15 la toxicidad inherente de los retinoides, a pesar de que los compuestos de la presente invención son ligandos de RXR que tienen inherentemente una toxicidad alta. f Ahora se describirá la invención en más detalle con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, el alcance de la invención no se debe 20 considerar limitado a los mismos.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Para cada tableta, 63 mg de cilindroclorina, 10 mg de sesquioleato de sorbitán, 10 mg de gel de sílice en polvo, 40 mg de almidón de maíz, 50 mg de L-hidroxipropilcelulosa (PO-30), 12 mg de hidroxipropilcelulosa-SL, 46 mg de celulosa microcristalina, 10 mg de sal de sodio de carboximetilcelulosa, 3 mg de estearato de calcio y 6 mg de talco, se mezclaron, se granularon y se comprimieron de la forma convencional.
EJEMPLO 2 A 63 g de ascoclorina molida, se le agregaron 50 g de lactosa, 60 g de almidón de maíz, 30 g de L-hidroxipropilcelulosa, 12 g de hidroxipropilcelulosa-SL, 46 g de celulosa microcristalina, 10 g de sal de sodio de carboximetilcelulosa, 3 g de estearato de calcio y 6 g de talco. La mezcla obtenida se granuló y se comprimió de la forma convencional para dar tabletas con un peso de 0.25 g.
EJEMPLO 3 A 100 g de 4-O-carboximetilascoclorina (compuesto 14) se le agregaron 70 g de celulosa microcpstalina, 35 g de lactosa, 70 g de sal de calcio de carboximetilcelulosa, 70 g de almidón de maíz y 5 g de estearato de magnesio. La mezcla obtenida se comprimió de la forma convencional para dar tabletas con un peso de 0.35 g.
EJEMPLO 4 10 Un plásmido que contenía un gen reportero regulado en expresión por un elemento de respuesta a RXR y un plásmido de expresión de RXRa, se transfirieron a células COS-1. Después, estas células se trataron con compuestos de la presente invención tales como ascoclorina. De 15 esta manera, se encontró que con ello se elevó la dosis de expresión del gen reportero. Las actividades de transactivación de RXR de los compuestos de la presente invención fueron más bajas que 9-CRA, pero casi comparables a ATRA. Estos resultados indican que los compuestos de la presente invención son agonistas de RXR y regulan la expresión de gen por medio de RXR. 20 Transferencia del gen reportero de RXR (receptor X retinoide) Se transfirieron plásmidos a células COS-1. La transferencia de genes se llevó a cabo de la forma convencional usando el reactivo AMINE de Lipofect (Life Technologies). Se dispersaron 1 x 105 células en 2 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) conteniendo 10% de suero fetal de becerro, y se vació en una caja de Petri de 35 mm. Después de cultivar en una incubadora de CO2 durante 17 horas, se removió el medio y las células 5 que se adhirieron a la caja de Petri se lavaron con solución salina amortiguadora de fosfato (PBS). La transferencia del gen se llevó a cabo usando el reactivo Lipofect AMINE. Particularmente, se premezclaron 500 ml de un medio mínimo de suero OptiMEM (Life Technologies) con 4 mg de un plásmido que contenía un gen luciferasa bajo la regulación en expresión del 10 elemento de respuesta a RXR (pRXRL: RXRE-SV40 de luciferasa; un ' plásmido de gen reportero en donde RXRE se ha ligado al promotor SV40 y ADNc de luciferasa, con ello bajo regulación en expresión, ha sido localizado hacia el extremo 3' del mismo); 4 mg de un plásmido de expresión de RXRa (pRXRa; un plásmido en donde se ha ligado ADNc de RXRa humano con el 15 extremo 3' de un promotor de citomegalovirus para expresar RXRa humano en células de mamífero); y 2 mg de un plásmido del gen de ß-galactosidasa para determinar ia relación de transferencia de genes (pCH110; Pharmacia), con 500 ml de OptiMEM conteniendo 50 ml de Lipofec AMINE; la mezcla resultante se mantuvo a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se 20 combinaron 100 ml de esta mezcla líquida con 400 ml de OptiMEM, y la mezcla de medio se dividió en la caja de Petri. Después de mantener en una incubadora con CO2 a 37°C durante 3 horas, el medio de transferencia de gen se succionó de la caja de Petri y el medio DMEM que contenía una sustancia de prueba y 10% de suero (tratado con carbón activado) se agregó a la misma, seguido por cultivo a 37°C durante 20 horas. Como sustancias de prueba se usaron los compuestos 1 , 5, 6, 7, 10, 14, 19, 26 y 28 (cada uno a f 10*8, 10"7 y lO^M), mientras que se usaron como control ácido retinoico todo 5 trans, ácido 9-cis-retinoico y dexametasona. Además, se agregó sulfóxido de dimetilo (concentración final 0.1%) como el solvente para la sustancia de prueba.
Transferencia del gen reportero de RAR o GR (glucocorticoide) 10 Como un sustituto para un plásmido que contiene un gen luciferasa bajo la regulación en expresión del elemento de respuesta de RXR (pRXRL:RXRE-SV40 de luciferasa), y el plásmido de expresión de RXRa (pRXRa), se transfirió un plásmido que contenía un gen luciferasa bajo la regulación en expresión del elemento de respuesta de RXR (pRARL: RASÉIS SV40 de luciferasa), y un plásmido de expresión de GR (pRARa), en células COS-1. Se agregaron al cultivo transfectantes con estos plásmidos y el compuesto de la presente invención (concentración: 10" a 10"7 M). Como compuestos de control se agregaron ácido retinoico todo trans (10"8, 10~7 y 10' 6 M), ácido 9-cis-retinoico (10-8, 10'7 y W6 M), dexametasona (10-8, 10'7 y 10"® 20 M), etc. Después de succionar el medio de la caja de Petri, se agregaron 250 ml de una solución de lisado de células en cultivo (amortiguador Tris fosfato 25 mM (pH 7.8), N,N,N',N'-tetraacetato de 1 ,2-diaminociclohexano, Tritón X-100 1%) y las células se desprendieron con un hule y se recolectaron. Después de romper completamente las células por congelación y descongelación, las células se centrifugaron a 4°C (15,000 rpm, 2 min) y el sobrenadante así obtenido se empleó como una muestra para medición. A 20 ml del sobrenadante, se le agregaron 100 ml de una solución de substrato de luciferasa (2.14 mg de Co-A, 100 ml de D- Luciferina 470 mM, 200 ml de ATP 530 nM, 2 ml de amortiguador DTT-Tricina (pH7.8)), y se midió la intensidad de la fluorescencia con un luminómetro (Luminosensor ATTO AB-2000). Para medir la ß-galactosidasa para determinar la eficiencia de transferencia genética, usando un equipo de detección de ß-galactosidasa Luminiscent II (Clontech), se midió la intensidad fluorescente por medio de un luminómetro. Como ya se mostró en el cuadro 2, se encontró de esta manera que los compuestos de la presente invención son ligandos específicos para RXR, aunque sus actividades son un poco más bajas que el ácido 9-cis-retinoico. Aunque estos compuestos mostraron actividades para RAR correspondientes a cerca de 25 a 40% para la de RXR, no activaron GR en absoluto. De esta manera, es claro que los compuestos de la presente invención son ligandos específicos para RXR EJEMPLO 5 Efecto protector de la función del páncreas sobre ratones diabéticos obesos de herencia 5 Puesto que carecen hereditariamente del reportero de leptina, los ratones db/db no tienen control del apetito incluso en la saciedad. Como resultado, sufren de hiperinsulinemia debido a sobrealimentación y obesidad seria, sufriendo así el comienzo de diabetes. Los compuestos de la presente ¡nvención se administraron oralmente a ratones db/db durante 40 semanas 10 (de 11 a 51 semanas después del nacimiento) (figura 2). • Durante el período en el cual los ratones sufrieron obesidad seria (hasta la vigésima semana después del nacimiento), se incrementó gradualmente la resistencia a la insulina del tejido periférico y por lo tanto el nivel de insulina en la sangre se elevó gradualmente. Como la obesidad 15 alcanzó un máximo, los requerimientos de insulina excedieron los niveles de producción de insulina. De esta manera, las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans que tienen granulos de depósito de insulina, fueron • principalmente desgranulados y se produjo deficiencia del depósito de insulina. Las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans que habían 20 trabajado severamente para producir insulina en exceso, se fatigaron gradualmente. Desde el punto en el cual la obesidad alcanzó el nivel máximo, se hizo susceptible la degeneración y/o necrosis de las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans y, al mismo tiempo, se redujo rápidamente el v* y*** -" tiivel de insulina en la sangre. Desde la 23a. semana después del nacimiento, §e hizo imposible anabolizar toda la energía tomada en exceso debido a la función insuficiente de la insulina, que indujo una reducción de peso corporal, a energía del alimento que no pudo ser anabolizada se excretó como 5 glucosa urinaria. Como resultado, la glucosa urinaria aumentó, con una reducción del nivel de insulina en la sangre. Aproximadamente 50 semanas después del nacimiento, los ratones diabéticos obesos de herencia mostraron peso corporal reducido hasta un nivel comparable con el de la camada normal (esto es, 1/2 a 1/3 del peso corporal máximo), y un nivel notablemente alto de to glucosa en sangre de más de 700 mg/dl, y se excretó una gran cantidad de glucosa en la orina. En este punto, el nivel de insulina en la sangre se redujo hasta un nivel casi comparable con el de la camada normal. Particularmente, se suscitó la conversión de diabetes mellitus no dependiente de insulina en diabetes mellitus dependiente de insulina en el caso clínico de humanos. En 15 el caso de ratones db/db alimentados con una comida que contenía 0.1 % del compuesto 14, la glucosa se excretó escasamente en la orina inmediatamente después del inicio de la administración, y el nivel de glucosa en sangre se redujo gradualmente hacia el nivel normal. Aproximadamente 40 semanas después del nacimiento, los ratones db/db mostraron un nivel de glucosa en 20 sangre casi comparable con el de la camada normal. Sin embargo, el compuesto 14 no tiene función de restauración del receptor de leptina y por lo tanto no tiene efecto sobre el proceso de inducción de obesidad por hiperinsulinemia debido a sobrealimentación.
Respecto a los efectos del compuesto 14, es importante notar que su administración no produce ninguna reducción significativa de la producción de insulina debido a la fatiga de las células-ß pancreáticas de los ^É islotes de Langerhans, aunque la administración del compuesto obliga a las 5 células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans a funcionar hasta un punto de hiperinsulinemia f [sic], además de normalizar el nivel de glucosa en sangre y reducir notablemente la glucosa urinaria. Puesto que las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans son de importancia clave en varios aspectos de la diabetes, la capacidad del compuesto de la presente invención jf ío para mantener la función de estas células durante un período prolongado, es muy importante en términos del tratamiento y prevención de la diabetes.
EJEMPLO 6 15 Se dividieron al azar 18 ratas machos Wistar que pesaban aproximadamente 200 g en 3 grupos. A los animales de 2 grupos, se les f:, administraron intravenosamente 45 mg/kg de estreptozotocina. Uno de estos grupos se consideró como un grupo de control, mientras que el otro se consideró como el grupo de administración del compuesto 6. Al grupo 1 , que 20 se consideró como el grupo normal de control, se le administró intravenosamente un amortiguador de citrato 1/10 M (pH 3.5) con estreptozotocina disuelta. Inmediatamente después de la administración de estreptozotocina, se administró oralmente una suspensión del compuesto 6 en - acacia una vez al día, continuamente durante 10 días, en una dosis de 20 mg/kg/día. A los otros grupos se les administró una solución de acacia sola. Después de ayuno por 6 horas después de la administración final, se extrajo sangre del corazón de cada animal y se midió el nivel de glucosa en sangre y 5 el nivel de insulina en sangre. Como muestran los datos que se dan en el cuadro 7a, la administración oral del compuesto 6 inhibió un incremento en el nivel de glucosa en sangre y un decremento en el nivel de insulina en sangre. Se dividieron al azar 18 ratas machos SD que pesaban aproximadamente 250 g en 3 grupos. Uno de estos grupos se consideró 10 como el grupo normal de control, mientras que los dos grupos restantes se consideraron como los grupos de administración de estreptozoticina. Después de 24 horas de la administración intravenosa de 50 mg/kg de estreptozotocina, se administró oralmente 10 mg/kg/día del compuesto 5 suspendido en una solución de acacia, una vez al día (temprano en la 15 mañana), continuamente durante 14 días. Al grupo normal de control y al grupo de control de estreptozotocina, se les administró oralmente la solución de acacia sola. Después de ayuno por 6 horas posteriormente a la administración final, se extrajo sangre del corazón de cada animal y se midió el nivel de glucosa en sangre y el nivel de insulina en sangre. Como muestran 20 los datos que se dan en el cuadro 7b, la administración oral del compuesto 5 inhibió un incremento en el nivel de glucosa en sangre y un decremento en el nivel de insulina en sangre.
CUADRO 7 Alivio de la aparición de diabetes inducida por estreptozotocina con los compuestos de la invención ^^¡ a. Alivio de la diabetes con el compuesto 6 (Media ± EE) Dosis Glucosa en sangre IRI en suero (mg/kg) (mg/dl) (mU/ml) Grupo normal (control) - 159.7±3.89 21.7±2.87 Grupo diabético (control) - 672.1 ±40.76 2.7±0.88 Grupo diabético (tratado) 20 277.2±52.44* 12.3±1.65* 10 tP<0.05 (diferencia significativa del grupo diabético de control). b. Alivio de la diabetes con el compuesto 5 (Media ± EE) Dosis Glucosa en sangre IRI en suero (mg/kg) (mg/dl) (mU/ml) Grupo normal (control) - 120.5±3.50 25.2.7±2.99 15 Grupo diabético (control) - 667.8±53.71 2.1±1.12 Grupo diabético (tratado) 10 237.2±26.31* 15.5±2.16* "P<0.05 (diferencia significativa del grupo diabético de control).
EJEMPLO 7 20 Efecto de la inhibición de arteriosclerosis en conejos blancos Es conocido que los conejos blancos sufren de arteriosclerosis y de trastorno circulatorio dentro de un período relativamente corto cuando se alimentan con una dieta rica en grasas. De esta manera, se preparó un alimento de alto contenido de grasa agregando 10% de aceite de coco endurecido, 2% de colesterol, 0.5% de polvo de bilis de bovino y 0.04% o j..H?~ 0.01% de ascoclorina a un alimento normal en polvo comercial para conejo 5 blanco, y la mezcla se moldeó en pellas. Separadamente, se preparó otro alimento alto en grasa para el grupo de control, sin usar la ascoclorina. Además, se agregó 0.2% de clofibrato (esto es, un ligando de PPARa) como un fármaco de control al alimento, para dar otro alimento alto en grasa. Se dividieron al azar 24 conejos blancos que pesaban cerca de 2 f -lo , kg en 4 grupos. Uno de estos grupos se consideró como el grupo de control, mientras que los restantes 3 grupos se consideraron al azar, respectivamente, como el grupo de clofibrato, el grupo de ascoclorina 0.01 % y el grupo de ascoclorina 0.04%. Después se llevó a cabo el experimento durante 14 semanas. La figura 3 muestra los resultados. Desde aproximadamente la 15 sexta semana del experimento, los animales de los grupos de control y de clofibrato perdieron el apetito, 2 animales entre seis de cada grupo murieron de insuficiencia circulatoria debido a obstrucción en la arteria coronaria ^?> "durante el experimento. En cambio, en los animales de los grupos de ascoclorina 0.01% y ascoclorina 0.04%, las lesiones de obstrucción de la 20 arteria coronaria fueron aliviadas significativamente y todos los individuos sobrevivieron hasta la terminación del experimento. Es de hacer notar que ni la ascoclorina ni el clofibrato suprimieron el incremento del nivel de colesterol total en suero. El nivel de colesterol total en suero de los conejos blancos & (aproximadamente 50 mg/dl inmediatamente antes del inicio del experimento), mostró un incremento rápido en cada grupo y excedió 1 g/dl después de 1 mes. De esta manera, el plasma se hizo turbio como si fuera leche de vaca. Los niveles de colesterol total en suero de todos los grupos fueron casi los mismos, lo que indica que en estos grupos se incorporó en la pared arterial lipoproteína de baja densidad, casi en la misma proporción. La inhibición de arteriosclerosis por ascoclorina sugiere fuertemente que fue inhibido el proceso de la infiltración de leucocitos en la arteria dañada para arteriosclerosis por inflamación crónica. 10 EJEMPLO 8 Efecto de inhibición de arteriosclerosis en codornices japonesas Cuando se alimentan con una dieta rica en grasa, las aves 15 también presentan arteriosclerosis en poco fiempo. Se dividieron al azar 32 codornices japonesas adultas de aproximadamente 30 días de edad en 4 grupos. Uno de estos grupos se consideró como el grupo de alimentación normal, otro grupo se consideró como el grupo de control de alimentación con alto contenido de grasa y los 2 grupos restantes se consideraron 20 respectivamente como el grupo de alta dosis de compuesto 6 y el grupo de baja dosis del compuesto 6, cada uno con una alimentación de alto contenido de grasa. El alimento se preparó agregando 1% de colesterol a un alimento en polvo estándar para pollo, rico en proteína, y la mezcla se moldeó en ? ,* ' 9,-, 1 . pellas. Se agregó compuesto 6 en una canfidad de 0.16% o 0.0025% al alimento en polvo, y después te mezcla se moldeó en pellas. El experimento se llevó a cabo durante 9 meses. Durante este período, se dejó que las aves tomaran el alimento y bebieran agua libremente. El alimento empleado en 5 este experimento contenía menos grasa que el alimento empleado en los experimentos con conejos blancos, y estaba libre de ácido biliar que promueve la absorción de colesterol del tracto digestivo. Como resultado, ninguna codorniz japonesa sufrió de trastorno circulatorio serio y la ingestión de alimento no mostró diferencias entre los grupos en todo el experimento. lo Después de 9 meses, se extrajo sangre y se midió el nivel de colesterol total y el nivel de grasa neutra en el suero. En comparación con el grupo de control alimentado con el alimento estándar, el grupo de control alimentado con el alimento de alto contenido de colesterol mostró un nivel de colesterol total en suero 13 veces más alto y un nivel de grasa neutra en suero 15 4 veces más alto. Los niveles de colesterol y grasa neutra se redujeron cada uno, un 40% en el grupo de alta dosis del compuesto 6, y un 25.5% y 21.6% respectivamente, en el grupo de baja dosis del compuesto 6. Cada ave fue ^^1F disecada y se extrajo la aorta. Después se calificó la severidad en 5 grados en base a la relación de ateroma al área total de endosporio y el 20 engrasamiento de la pared arterial. Como resultado, el grupo de alimentación con alto contenido colesterol mostró lesiones de ateroma en 7/8, y la severidad del ateroma fue de 2.21 en promedio. Por otro lado, el grupo de alta dosis de compuesto 6 no mostró ateroma, mientras que el grupo de baja dosis del compuesto 6 mostró ateroma en 1/2 aves, y una puntuación de severidad considerablemente disminuida de 0.50. Estos datos experimentales indican que no solo el compuesto de partida, ascoclorina, tiene un efecto de inhibición de arteriosclerosis, sino también su derivado con la modificación del grupo hidroxilo en la posición 4, y que el efecto de inhibición de arteriosclerosis es potenciado más paralelamente a la supresión del incremento del nivel de lipoproteína de baja densidad en suero, como en este experimento.
CUADRO 8 Nivel de lípido en suero de codornices japonesas alimentadas 9 meses con alimento estándar para pollo que contenía compuesto 6 v 1% de colesterol Comp. 6 Colesterol total Grasa neutra en Grupo (%) en suero (mg/dl) suero (mg/dl) Control 0 2013±193 654.6±64.0 Baja dosis 0.0025 1499±120* 513.1±39.2 -25.5% -21.6% Alta dosis 0.16 1200±136** 392.6±46.5^ -40.4% -40.0% (Media ± EE) *P<0.05 y **P<0.01 en prueba t de Student. - -f.fi- CUADRO 9 Formación de ateroma en aorta arqueada de codornices japonesas alimentadas 9 meses con alimento estándar para pollos que contenía 1% de colesterol Individuo Grupo control Grupo baja dosis Grupo alta dosis No. 1 II 0 0 II I 0 0 lll IV 0 0 10 IV 0 I 0 V I 0 0 VI II I 0 VII lll I 0 VIII IV I 0 15 Promedio 2.12±0.52 0.50±0.199** O.OO±O.OO** ^^ Aparición de ateroma en aorta arqueada: 0: no hay ateroma. 20 I: cubierta con ateroma en una relación de 1 a 10% del área total.
II: cubierta con ateroma en una relación de 11 a 40% del área total. lll: cubierta con ateroma en una relación de 41 a 70% del área total. IV: cubierta con ateroma en una relación de 71 a 100% del área total. ^ EJEMPLO 9 Efecto de inhibición de aneurisma Los compuestos de la presente ¡nvención muestran un efecto de 10 inhibición de periarteritis nodosa en una rata modelo de hipertensión maligna • en el cual se suscita periarteritis nodosa en la arteria mesentérica que avanza hacia aneurisma. Entre los aneurismas, los formados en la arteria mesentérica pueden ser tratados cuantitativamente. De esta manera, se extrajo la arteria mesentérica y se fijó con formalina. Después se marcó la 15 grasa y se contaron arteriolas y aneurismas tres veces y se calculó la cuenta promedio de aneurismas por arteriola. A ratas con hipofunción renal debida a la extirpación de un riñon, se les dio solución salina al 0.9% que tenía una • presión osmótica ligeramente más alta que el plasma, como agua para beber, y se les administró subcutáneamente 10 mg/kg de acetato de 20 desoxicorticosterona (DOCA, un corticoide mineral) a intervalos de 1 semana. Se dividieron al azar 24 ratas machos Wistar en 4 grupos. Después de remover el riñon izquierdo, se dejó reposar al animal y se cauterizó la herida de la operación. Una semana después, uno de estos grupos se consideró como el grupo de control, mientras que se administraron continuamente 10 mg/kg/día y 40 mg/kg/día del compuesto 6, a dos de los grupos restantes. El experimento se llevó a cabo durante 7 semanas. Desde el inicio del " experimento se midieron una vez cada tres días la ingestión de alimento, la 5 ingestión de agua, la orina, el peso corporal y la presión sanguínea de cada grupo. El grupo de control mostró un rápido incremento en presión sanguínea. La presión sanguínea promedio excedió 180 mm de Hg en la tercera semana y alcanzó 200 mm de Hg en la cuarta semana. En * **, #*, lo comparación con el grupo de control, los grupos a los que se administró el compuesto de la presente invención, mostraron un efecto significativo de inhibición del incremento de presión sanguínea en la segunda y la tercera semana, aunque después no se observó diferencia significativa. Los grupos de administración mostraron efectos significativos de reducción de la ingestión 15 de agua, reducción de orina, sostenimiento de la capacidad para concentrar + electrolito urinario, disminución de la velocidad de ganancia de peso corporal, etc. En la séptima semana, cada animal se disecó y se extrajo la arteria • mesentérica. Después de tratar con formalina, la arteria se marcó por la grasa y se contaron los aneurismas. Ningún individuo del grupo normal de control 20 mostró aneurisma. Por otra parte, todos los individuos del grupo de control de hipertensión mostraron aneurismas y el conteo promedio de aneurismas por arteria mesentérica fue de 1.67 ± 0.68, indicando con ello que estaban en progreso lesiones arteriales hipertensivas. El grupo de baja dosis de compuesto 6 mostró en promedio 0.66 ± 0.41 aneurismas por arteriola. En el grupo de alta dosis del compuesto 6, el conteo promedio de aneurismas por arteriola se redujo a 0.27 ± 0.05. f Particularmente, se ha esclarecido que el compuesto de 5 conformidad con la presente invención suprime fuertemente la aparición de aneurisma inducido por lesión vascular en un sitio ramificado causada principalmente por hipertensión.
• • CUADRO 10 Efecto del compuesto 6 de inhibición de la formación de aneurisma en la arteria mesentérica de ratas DOCA hipertensas 9 Rata Conteo de Conteo de Frecuenciaa) lndiceD) de Grupo arteriolas nodos de aparición (%) lesión C 19 11.00 35.67 324.27 4 o n 20 14.67 8.00 54.53 2 t r 21 15.33 8.67 56.56 2 o 22 9.33 39.33 421.54 4 10 • 23 15.00 2.00 13.33 1 24 15.67 20.67 131.91 3 Prom. 13.50 19.06 167.02±68.12 2.67±0.49 25 9.00 2.33 25.89 1 15 26 11.33 2.33 20.56 1 10 mg/ kg 27 11.00 3.00 27.27 1 28 14.67 40.33 274.91 4 • 29 17.00 5.67 33.35 1 30 13.33 2.00 15.00 1 20 Prom. 12.72 9.27 66.16±41.83 1.50±0.50 r, CUADRO 10 (Continuación) Rata Conteo de Conteo de Frecuenciaa) lndiceb) de Grupo arteriolas nodos de aparición (%) lesión 31 12.67 1.00 7.89 1 32 10.33 0.33 3.19 1 40 mg/ kg 33 12.00 2.00 16.67 1 34 13.67 5.00 36.59 1 35 13.00 3.33 25.62 1 36 15.00 4.33 28.87 1 10 ß Prom. 12.78 2.67 26.57±5.24* LOO±O.O* Se contaron tres veces arteriolas y nodos en la arteria mesentérica y se calculó el promedio. 15 a) Frecuencia de aparición = conteo de nodos/conteo de arteriolas x 100 (%). b) índice de lesión: evaluado de la siguiente manera: 0: conteo de nodos en la arteria mesentérica; 0. I: conteo de nodos; 1 a 50%. II: conteo de nodos; 51 a 100%. 20 lll: conteo de nodos; 101 a 200%. IV: conteo de nodos; más de 201 %. ? «--^íe* EJEMPLO 10 Efecto terapéutico sobre artritis causada por adyuvante en rata Para determinar si los compuestos de la presente invención son 5 o no efectivos, no sólo contra inflamación crónica en arteria, sino también en inflamación crónica general, se examinó el efecto sobre artritis causada por adyuvante en rata, que es un modo típico de inflamación crónica. Las ratas con artritis empleadas en el experimento 1 eran individuos que sufrieron de artritis seria causada por la inyección de un lo adyuvante 45 días antes, y por tanto se arrastraban sobre sus patas delanteras ya que no podían doblar sus patas traseras. Se evaluaron los efectos farmacológicos observando su andar, observación a simple vista de la severidad de la inflamación en las patas traseras, y el volumen de hinchazón en las patas. A 19 ratas machos SD (que pesaban aproximadamente 300 g), 15 se les inyectó subcutáneamente adyuvante incompleto de Freund que contenía bacilo muerto de tubérculo cepa Aoyama B, en la raíz de la cola para inducir artritis en las patas traseras. El compuesto 6 se suspendió en una solución de goma de tragacanto y se administró oralmente en una relación de 0.5 ml/100 g de peso corporal. El compuesto 6 se administró a 3 grupos 20 incluyendo el modelo de dosis alta (HM; 50 mg/kg), el modelo de dosis media (MM; 25 mg/kg) y el modelo de dosis baja (LM; 10 mg/kg). La administración se hizo una vez al día en la mañana continuamente durante 7 veces. En este período, se midió el volumen de la pata trasera al inicio del experimento y 2, 4 » < y 7 días después. Se calculó el cambio de volumen con respecto al volumen en el inicio del experimento como 100%. El séptimo día se evaluaron a simple vista las condiciones de inflamación en las patas traseras en 5 grados. fk Después de 1 semana, el grupo de control no mostró mayor 5 diferencia en severidad de inflamación y el volumen de la pata desde inmediatamente antes del inicio del experimento. Sin embargo, fue sorprendente que todas las ratas de los grupos del compuesto 6, que se habían incapacitado hasta el punto de ser incapaces de doblar sus patas traseras debido a hinchazón en la articulación, pudieron andar nuevamente 10 debido al efecto del compuesto 6. Desde luego, también se redujo en gran medida el volumen de hinchazón en las patas. La ascoclorina y sus derivados tales como el compuesto 14 mostraron efectos similares. En base a estos resultados, se ha probado que los compuestos de la presente invención ejercen un efecto de disminución, no solo de la inflamación arterial, sino 15 también de la inflamación crónica en articulación. Inmediatamente después de la administración, los tres grupos del compuesto 6 se combinaron y dividieron nuevamente dependiendo de la ocurrencia de artritis (esto es, ^W grupos positivos y negativos). Después, los datos se compararon con los datos del grupo de control. Todos los individuos en el grupo de control 20 sufrieron de artritis. Cuando se calibró la frecuencia de aparición entre el grupo del compuesto 6 y el grupo de control, se observó una diferencia significativa con una proporción de riesgo de 5%. Este hecho indica que el compuesto 6 es obviamente efectivo en el tratamiento de artritis severa.
CUADRO 11 Ganancia de peso corporal I e inflamación en patas traseras de cada qrupo el día 7 W Cambio de peso corporal Calificación de (g/rata)* inflamación** Control (n=5) 2.9 4.4 Grupo HM (n=5) 2.2 2.2 Grupo MM (n=5) 3.9 2.8 Grupo LM (n=5) 2.0 3.2 10 * (Peso corporal inmediatamente antes del inicio de la administración) - (peso corporal inmediatamente después de terminar la administración).
** Calificación de inflamación: la severidad de la inflamación en las patas 15 traseras se evaluó de la siguiente manera: 5: incapaz de andar normalmente debido a hinchazón en ambas patas traseras. 4: incapaz de andar normalmente debido a hinchazón en una pata trasera. 20 3: capaz de andar a pesar de hinchazón en ambas patas traseras. 2: capaz de andar a pesar de hinchazón en una pata trasera. 1 : normal en ambas patas traseras.
$ Prueba de ji cuadrada Artritis (-) Artritis (+) Total Grupo MAC 7 7 14 ^^^H ^^ Grupo de control 0 5 5 Total 7 12 19 Valor teórico a 5% de diferencia significativa que corresponde al grado de libertad de 1 = 3.84. 10 Valor calibrado = 3.96. Así, P<0.05. • EJEMPLO 11 Efecto de reducción del nivel de colesterol total en suero en ratones 15 El efecto de los agentes en la reducción del colesterol en suero, varía entre animales. Particularmente, algunos agentes que son efectivos sobre un cierto animal ejercen algún efecto en otros. Por ejemplo, la compactina, que es un inhibidor de HMG-CoA reductasa, no puede reducir el nivel de colesterol total en suero cuando se administra a roedores tales como 20 rata o ratón. Esto es porque aunque la HMG-CoA reductasa es inhibida en el hígado de roedor, la enzima es biosintetizada en una cantidad que excede la cantidad para compensar la ¡nhibición, de tal manera que se anula el efecto inhibidor. Consecuentemente, es favorable calibrar el efecto de reducción del nivel de colesterol total en suero en tantos animales como sea posible. Respecto al efecto de los compuestos de la presente invención sobre el nivel de colesterol total en suero, se hizo una prueba con el uso de ratones. k Después de agregar estos compuestos a un alimento en polvo estándar para 5 rata y ratón, las mezclas resultantes se moldearon en pellas y se dieron durante 8 días a ratones machos ICR y ddY de 5 semanas de edad. En la tarde del día 8, se extrajo la sangre del corazón de cada animal y se determinó el colesterol total en el suero. Las dosis se determinaron como la . dosis máxima a la cual la ganancia de peso corporal no fue suprimida k ío después de administración oral durante 1 semana, y como 1/4 de dosis de la misma. El cuadro 12 muestra los resultados.
CUADRO 12 Efecto de reducción de colesterol en suero de ratones de los compuestos de la invención _* 10 15 ^Wt 20 Cada valor está representado en media ± EE (n=10). a) En el caso del compuesto 1 , el grupo de control consistió de 23 animales, mientras que los grupos de 0.04% y 0.01 % consistieron cada uno de 12 animales.
EJEMPLO 12 Promoción de excreción de ácido biliar v promoción de transcripción de colesterol-7a hidroxilasa en ratas 5 Se monitoreó colesterol de origen alimenticio y esterol neutro y esterol ácido en heces de ratas a las cuales se habían administrado los compuestos de la presente invención para monitorear el balance de esterol y los cambios en la composición de ácido biliar en heces. Como resultado, se esclareció que la administración de los compuestos de la presente invención - ío produjo un incremento de esteróles (en particular, ácidos biliares) excretados • en las heces. Además, se muestreó la bilis con el paso del tiempo en ratas que se habían sometido a colangiostomía, y se determinaron los ácidos biliares de la misma. De esta manera, se esclareció que la administración de los compuestos de la presente invención incrementó significativamente la 15 excreción de ácidos biliares en la bilis. Se dividieron ratas machos Wistar que pesaban aproximadamente 250 g en grupos de 6 a 8 animales. Después, estas ratas se alimentaron con un alimento estándar para rata (CE-2; Nippon f Crea Co., Ltd.) que contenía 2% de colesterol durante 10 días. Durante este período, se les administraron oralmente 10 mg/kg del compuesto 6 o del 20 compuesto 5 suspendido en una solución de acacia, de forma forzada una vez al día. Las heces se recolectaron los días 6 y 10. Después se extrajeron los esteróles de la forma convencional y se determinaron esteróles ácidos y esterales neutros. Por otra parte, también se determinó el colesterol en el alimento para calcular la cantidad de esterol de origen alimenticio.
CUADRO 13 Efecto del compuesto 6 sobre el balance de esterol en ratas Alimento Grupo Colesterol total Esterol Biosíntesis in Balance en suero (mg/200g p.) vivo (mg/200g esterol (mg/dl) peso corp.) (mg) Ingestión Excreción Cont. 77.7±3.26 7.38 8.42 1.05 0 10 Estándar Comp.6 65.0±2.98* 7.48 10.81 1.05 -2.28 # Con Cont. 91.2±3.39 310.38 255.70 0 +54.68 colesterol Comp.6 77.0±2.19* 301.45 275.52 0 +25.93 * PO.05 en la prueba t de Student (n=6).
• CUADRO 14a Alimento estándar Grupo AdminisIngestión de Esterol i sn heces (mg/día) Balance Aumento de tración colesterol esterol excreción prueba (días) (mg/día) Copros- ColesEsterol (mg/día) (mg/día) terol terol ácido Control 7.93 3.40 2.85 2.59 -0.91 - Comp. 5 16 8.28 3.98 3.51 5.19 -4.40 3.49 Control 7.83 2.15 2.67 2.66 +0.34 - Comp. 10 16 7.59 2.84 3.18 4.61 -3.04 3.39 (n=8) CUADRO 14b Alimento alto en colesterol Grupo AdminisIngestión de Esterol ( sn heces (mg/día) Balance Aumento de tración colesterol esterol excreción prueba (días) (mg/día) Copros- ColesEsterol (mg/día) (mg/día) terol terol ácido Control 302.91 42.69 229.72 6.43 +24.07 - Comp. 5 16 311.14 41.05 246.30 8.67 +15.12 8.95 Control 350.28 59.06 222.47 6.17 +62.59 - Comp. 10 16 329.80 58.27 233.08 9.93 +28.52 34.07 (n=8) Para examinar el mecanismo de acción de los compuestos de la presente invención para promover la excreción de ácido biliar, se llevó a cabo un experimento para estudiar el efecto sobre un receptor nuclear LXR. Se Jftr< supone que LXR, que es un receptor nuclear especial en el hígado, podría ser 5 un detector de colesterol que actúa con 22-hidroxicolesterol como un ligando (Bethany A. Janowski y otros, Nature 383:728-731 , 1996). Cuando el colesterol se acumula en exceso en un órgano respectivo, LXR se une al ligando, forma un heterodímero con RXR y después se une al elemento de respuesta de hormona. Esta unión sirve como una señal para promover la iO oxidación de colesterol en ácido biliar para ser excretado por el cuerpo, reduciendo con ello el colesterol depositado. Por lo tanto, el hígado es el órgano que acumula colesterol en mayor cantidad y, al mismo tiempo, libera colesterol como ácido biliar en mayor cantidad. Se estima que la capacidad de los compuestos de la presente invención para promover la excreción de 15 ácido biliar en heces sería estabilizada de la siguiente manera. En el hígado, RXR y LXR se unen a los ligandos correspondientes, formando subsecuentemente un heterodímero uno con otro, y promoviendo de esta manera la expresión de colesterol-7-a hidroxilasa, que es la enzima limitativa de velocidad en la ruta biosintética del ácido biliar. Es decir, se estima que los 20 compuestos de la presente invención, ligandos de RXR, promoverían la transcripción del gen de colesterol-7-a hidroxilasa (esto es, la enzima del estado de velocidad en la biosíntesis de ácido biliar en el hígado) y así aumentan la expresión de colesterol-7-a hidroxilasa. Cuando se midió la actividad de colesterol-7-a hidroxilasa en el hígado triturado de ratas a las cuales se había administrado oralmente el compuesto 6 de conformidad con la presente invención, se confirmó que la actividad enzimática y el rendimiento de colesterol -7-a hidroxilasa por unidad de peso de proteína se elevaron de 5 manera dependiente de la dosis. Consecuentemente, se puede concluir que la diferencia entre los efectos de clofibrato y los compuestos de la presente invención sobre el metabolismo del colesterol, reside en que el primero es un ligando de PPARa que no es capaz de formar un heterodímero con LXR, mientras que los segundos aumentan la transcripción del gen de colesterol ío oxidasa dependiente del ligando de RXR y por lo tanto promueven la excreción como ácido biliar del cuerpo. Estos hallazgos se pueden considerar como un aspecto principal de la presente invención. El experimento se llevó a cabo de la siguiente manera. Para cada compuesto, se dividieron al azar 10 ratas machos Sprague Dawley que 15 pesaban aproximadamente 200 g en 2 grupos, y se alimentaron una semana libremente con un alimento en polvo para rata (CE-2; Nippon Crea Co., Ltd.) conteniendo 1% de colesterol, y agua para beber. Los compuestos de la ^P presente ¡nvención se suspendieron en una solución de acacia al 2% y se administraron por vía oral de manera forzada una vez al día 7 veces 20 continuamente en una dosis de 5 mg/kg (compuesto 1 y compuesto 26) o 20 mg/kg (compuesto 6 y compuesto 14). En la mañana del día 8, se sacrificó a los animales por pérdida sanguínea. Después de poner a reflujo con solución salina fisiológica, se tomó el hígado inmediatamente. Después se agregó al ígado hasta 4 veces solución de sacarosa 250 mM (que contenía 75 mM de nícotinamida, 1 mM de EDTA y 0.5 mM de MgCI2), y la mezcla se trituró usando un homogeneizador de Teflon. Después, el material líquido triturado se centrifugó a 9500G durante 15 minutos a 4°C y el sobrenadante libre de mitocondrias así obtenido se centrifugó adicionalmente a 105000G durante 60 minutos para separar con ello una fracción microsomal. Usando el microscoma así separado, se midió el rendimiento de 7-a-colesterol de la manera convencional y se calculó la velocidad de conversión.
CUADR0 15 Efecto de los compuestos de la presente invención sobre la formación de 7-a -colesterol en microsoma hepático Comp. Grupo 7-a-hidroxicolesterol 7-a-hidroxicolesterol (%) (nM/hr/mg proteína) Comp.1 Control 3.88 2.56 Tratado 5.51 3.80 Comp.6 Control 4.24 2.69 Tratado 5.30 3.61 Comp.14 Control 4.33 3.06 Tratado 7.06 4.47 Comp.26 Control 2.89 2.05 Tratado 4.00 3.31 (n=5), expresado en el promedio de 5 ratas.
# * EJEMPLO 13 Efecto del compuesto 14 en reforzando la actividad de vitamina Da RXR también forma un heterodímero con un receptor nuclear, ^ 5 VDR, que actúa con vitamina D3 activa (1a,25-dihidroxivitamina D3) como un ligando. Sin embargo, hasta ahora no se había hecho ningún estudio sobre el significado de la formación in vivo de este heterodímero. De esta manera, aún se desconoce el efecto de este heterodímero sobre la transcripción del gen y a su vez su significado fisiológico. La vitamina D3 activada es esencial para el F 10 desarrollo de hueso y el crecimiento en los niños. También es esencial para prevenir la osteoporosis y la fractura de hueso en personas de edad mayor y en personas enfermas. A pesar de dichos efectos significativos, no se han realizado estudios para esclarecer la función del heterodímero de VDR con RXR. Los inventores de la presente estudiaron el metabolismo del calcio en 15 ratones db/db y el efecto del compuesto 14 sobre el metabolismo del calcio. Este estudio se reportó parcialmente en 1992 (Tomoyoshi Hosokawa, Nogei Kagaku Kai-shi (J. Agr. Chem.), 66:1221-1226, 1992). En comparación con la ^B£ camada normal de la misma edad, los ratones db/db mostraron niveles anormalmente altos de calcio en orina, calcio en sangre, calcitonina en sangre 20 y hormona paratiroide. Administrando un derivado de ascoclorina, el compuesto 14, durante 1 semana, se redujo significativamente el calcio en la orina, el calcio en la sangre y los niveles de calcitonina. Alimentando a los ratones db/db durante un período largo (4 semanas), se encontró que estos * . animales sufrieron una reducción de densidad mineral del hueso en comparación con la camada normal de la misma edad. Es de notar que la reducción de densidad mineral de hueso puede ser prevenida significativamente administrando el compuesto de conformidad con la invención durante un período prolongado. En otras palabras, el derivado de ascoclorina que es un ligando de RXR, refuerza la función de la vitamina D3 endógena activa dependientemente de la dosis para prevenir trastornos metabólicos de calcio tales como osteoporosis. Este efecto de los ligandos de RXR es un hallazgo novedoso que no se conocía hasta ahora. 10 EJEMPLO 14 Prueba clínica de fase I del compuesto 6 Se llevó a cabo una prueba clínica de fase I del compuesto 6, 15 uno de los compuestos de la presente invención, con pacientes varones y hembras de 40 a 82 años de edad que sufrían de hipercolesterolemia. El experimento se continuó durante 12 semanas y el compuesto 6 se administró en las primeras 8 semanas. La dosis se programó como sigue: 1 mg/kg hasta la segunda semana, 2 mg/kg hasta la tercera semana, 4 mg/kg hasta la cuarta 20 semana, 8 mg/kg hasta la sexta semana y 16 mg/kg hasta la octava semana. A partir de la octava semana y hasta la doceava semana, se les dio un placebo sin notificarlo a los pacientes (período de administración de placebo). El fármaco se dividió en una dosificación diaria en 3 partes tomada después I* * de los alimentos. Cada paciente visitó el hospital una vez a la semana y se sometió a examen y extracción sanguínea para analizar el suero. En esta prueba no se observaron efectos secundarios serios, ni subjetivos ni objetivos. Tampoco se observó anormalidad ocasionada por la ^^P 5 administración del fármaco en los datos del examen bioquímico del suero, porcentaje de sangre, examen de orina, etc. Aunque se suscitó vértigo en un paciente, no fue muy serio como para dejar de administrar el fármaco. Como este paciente también sufría de hipertensión, pareció que la normalización de la presión sanguínea debida a la administración del compuesto 6, indujo el ío vértigo. Tampoco se observó efecto de la administración del fármaco en electrocardiografía ni en oftalmoscopía. El cambio más grande ocasionado por la administración del fármaco, fue una reducción notable del nivel de colesterol total en suero. Esta reducción comenzó 1 semana después de la administración, y la proporción 15 de reducción se elevó al aumentar la dosis; esto es, mostró dependencia de la dosis. También es interesante que el nivel de colesterol total en suero de los pacientes permaneció más bajo que el nivel antes de la administración, incluso de 2 a 4 semanas después de suprimir la administración del fármaco. En particular, el fármaco mostró claramente un efecto persistente. Aunque 20 algunos de los pacientes sufrieron de hipertensión o hipertensión limítrofe de acuerdo con los estándares especificados por la OMS, administrando el compuesto 6 se redujo tanto la presión sistólica como la diastólica en cada grupo. Los niveles de glucosa en sangre de 5 diabéticos incluidos en los pacientes se redujeron a 100 mg/dl, es decir, el límite superior de la extensión normal. Por otra parte, el nivel de grasa neutra en suero no fue reducido de manera notable como lo fue el nivel de colesterol total en suero. Aunque se ^fc observó una reducción significativa exclusivamente en el grupo de pacientes 5 con una relación de grasa neutra/colesterol total de 1.5 o menos, los pacientes con la relación de 1.5 o más no mostraron reducción de grasa neutra (figuras 4 y 5). Estos hechos concuerdan con el mecanismo de acción según el cual los compuestos de la presente invención forman heterodímeros RXR±XR lo y así activan la ruta de excreción de colesterol como ácido biliar del cuerpo.
CUADRO 16 Efecto del compuesto 6 de reducción de colesterol en suero en humanos (media ±EE) Dosis Colesterol total en suero P (mg/kg) mg/dl Reducción (%) Antes de tratamiento - 342±61.0 - - Después de 1 semana 0.5 273±62.7 -20 PO.005 Después de 2 semanas 1 266±66.7 -22 PO.002 Después de 3 semanas 2 269±66.0 -21 P<0.005 Después de 4 semanas 4 254±65.7 -28 PO.0005 Después de 6 semanas 8 217±58.8 -36 P<0.0005 Después de 8 semanas 16 229±61.5 -33 PO.0005 Después de 10 semanas 0 256±57.6 -25 P<0.0005 Después de 12 semanas 0 264±57.7 -22 P<0.002 Sujetos: 11 varones y 6 hembras de 48 a 70 años de edad (n=17). Período de administración de placebo: de la décima a la doceava semana.
EJEMPLO 15 Prueba clínica de fase II del compuesto 6 Se llevó a cabo una prueba clínica de fase II del compuesto 6 que incluyó 30 pacientes que sufrían de diabetes no dependiente de insulina (tipo II). El compuesto 6 se administró en una dosis diaria de 6 mg/kg (esto es, administración después de cada alimento de dos tabletas que pesaban 60 mg). Se continuó la administración durante 12 semanas. Los hechos esclarecidos por esta prueba son como sigue. El compuesto 6 redujo significativamente el nivel de glucosa en sangre y el nivel de colesterol total en suero, pero mostró poco efecto de reducción del nivel de grasa neutra en el suero. En una prueba de tolerancia a la glucosa, en donde se administraron oralmente 50 g de glucosa por la mañana en ayunas, el compuesto 6 mejoró significativamente la tolerancia a la glucosa y redujo la glucosa en orina en comparación con los datos de antes de la administración (figuras 6 y 7). Consecuentemente, se ha probado que el compuesto de la presente invención tiene el efecto mejorar el metabolismo y la sensibilidad a insulina en la diabetes de tipo II. La diabetes de tipo II está asociada frecuentemente con hipertensión. En esta prueba, 7 pacientes sufrían de hipertensión mientras que 17 sufrían de hipertensión limítrofe de acuerdo con los estándares de la OMS. Sin embargo, la presión sanguínea en estos grupos se redujo significativamente administrando el compuesto 6. La troglitazona, que es un ligando de PPAR , mejora la sensibilidad a la insulina, el parámetro metabólico y la tolerancia a la glucosa en diabetes de tipo II. Sin ^ embargo, concentra sodio en el cuerpo y por lo tanto no produce efecto hipotensor. La troglitazona difiere claramente de los compuestos de la 5 presente invención en este punto (figura 8).
CUADRO 17 Efectos del compuesto 6 en la reducción del nivel de glucosa en sangre en ayunas y en nivel de colesterol total en suero en la prueba clínica de lo fase II (dosis del compuesto 6: 360 mg/día) a. Cambios del nivel de glucosa en sangre (media ±EE) n Nivel de gl ucosa en Reducción sangre en ayunas (%) (mg/dl) Antes de tratamiento 15 (Pre-Rx) 30 188±6.6 - 4a. semana 30 165±4.3** 12.37 8a. semana 30 159±2.4** 15.45 12a. semana 30 154±4.4** 18.05 (n=30), ** P< 0.01 y *** P<0.001 en la prueba t de Student de pares. 20 i - b. Cambios del nivel de colesterol total en suero (media ±EE) n Nivel de colesterol total Reducción en suero (%) (mg/dl) ^^p Antes de tratamiento (Pre-Rx) 30 319±10.2 - 4a. semana 30 265±4.4*** 16.6 8a. semana 30 240±4.4*** 24.3 12a. semana 30 231 ±4.4** 27.2 (n=30), ** P< 0.01 y *** P<0.001 en la prueba t de Student de pares. 10 En la prueba clínica del compuesto 6 como se describió arriba, es muy sobresaliente que los síntomas clínicos de complicación de la diabetes causados por nefropatía diabética y neuropatía diabética disminuyeran significativamente. La mayoría de los diabéticos, por ejemplo, experimentaron 15 sed, que es causada por nefropatía diabética, y también el síntoma de poliuria, que es causado por ingestión excesiva de agua. El compuesto 6 disminuye estos síntomas en el grupo de pacientes. Los 30 pacientes con diabetes de tipo II fueron cuestionados acerca de la sed y se evaluaron en 4 grados, a saber, mucho muy sediento 20 (+++); muy sediento (++); sediento (+); y no sediento (-). Como muestra claramente la figura 8, las condiciones mejoraron conforme procedió el tratamiento con el compuesto 6 (segunda semana: P, 0.005, cuarta semana: P<0.005, octava semana: P<0.001 , doceava semana: P<0.001 , en comparación con los datos de antes de iniciar el tratamiento). La proporción del tratamiento llegó a 100%. Puesto que la diabetes de tipo II es una enfermedad crónica típica, no es raro que los pacientes hayan sufrido esta enfermedad durante 15 a 20 años. Estos pacientes con una historia de caso prolongado no responderían a la mayoría de los fármacos. Entre los pacientes incluidos en el experimento, 8 personas habían sufrido de la enfermedad durante 15 a 20 años. Es notable que los síntomas de sed y poliuria disminuyeron en todos los casos a pesar de ese hecho. El nivel de glucosa en orina, que se midió recolectando orina durante 24 horas, también se redujo significativamente mediante la administración del compuesto 6. Además, los síntomas causados por neuropatía diabética (por ejemplo, "pesadez", "debilidad", "aburrimiento", "dolor muscular en las piernas") disminuyeron significativamente. Las complicaciones de la diabetes se pueden considerar dentro de la categoría de inflamación crónica. Se considera que los efectos de los compuestos de la presente ¡nvención de disminuir las complicaciones de la diabetes, no dependen de la acción de mejoramiento del metabolismo, sino del mecanismo de acción antiinflamatorio del fármaco sobre la inflamación crónica.
CUADRO 18a Disminución del aburrimiento de diabéticos tipo II mediante la administración del compuesto 6 ^^P^*í Aburrimiento Inmediatamen4a sem. 8a sem. 12a sem. Total te antes de la administración Si 14 10 2 0 26 No 1 5 13 15 34 Total 15 15 15 15 60 10 CUADRO 18b wß Disminución de la debilidad de diabéticos tipo II mediante la administración del compuesto 6 Debilidad Inmediatamen4a sem. 8a sem. 12a sem. Total te antes de la administración 15 Si 25 15 6 1 47 No 0 10 19 24 53 Total 25 25 25 25 100 20 CUADRO 18c Disminución de la neuralgia de diabéticos tipo II mediante la administración del compuesto 6 Neuralgia Inmediatamen4a sem. 8a sem. 12a sem. Total te antes de la administración Si 12 7 6 2 27 No 4 9 10 14 37 Total 16 16 16 16 64 * ' 10 EJEMPLO 16 Formación de bases de Schiff de los compuestos de la presente invención con proteínas séricas 15 Los compuestos de la presente invención reaccionan rápidamente con grupos amino libres de proteínas séricas para formar bases de Schiff reversibles, tanto in vivo como in vitro. Aunque los compuestos de la presente invención muestran efectos de tipo retinoide, no exhibirían toxicidad tan fuerte como los retinoides. Esto es porque los compuestos de la presente 2o invención reaccionan con proteínas séricas y son convertidos en bases de Schiff en el curso de la absorción por el tracto intestinal, de tal manera que las actividades biológicas son enmascaradas. Por otra parte, la reacción de formación de bases de Schiff entre los compuestos de la presente invención y grupos amino de proteínas, también procede rápidamente in vitro en una solución acuosa neutra o débilmente alcalina. Es conocido que el compuesto 1 y el compuesto 26, entre los compuestos de la presente invención, muestran una toxicidad fuerte cuando están presentes en un estado libre en la sangre. 5 Por ejemplo, un derivado acetilado del compuesto 1 (4-O-acetilascoclorina: compuesto 5) es insoluble en agua, pero puede ser solubilizado en agua para dar un líquido transparente usando un agente tensioactivo HCO-60. En este estado, las moléculas del compuesto 5 no están disueltas en agua sino dispersas como micelas finas más pequeñas que la longitud de onda de rayos 10 visibles. De esta manera, el líquido se hace transparente. Cuando se administra oralmente a un animal en ese estado, el compuesto 5 es absorbido rápidamente por el tracto digestivo. Cuando el compuesto 2 se administró a una rata solamente en una dosis pequeña (2 mg/kg), la presión sanguínea se redujo y el corazón de detuvo en el transcurso de 1 a 2 horas. Cuando se 15 monitoreó la cinética de absorción extrayendo sangre en el transcurso del tiempo, no estaba presente en el suero el compuesto 5, sino el compuesto 1. Esto es porque el compuesto 5 absorbido por el tracto digestivo es descompuesto inmediatamente por acilasa en la sangre. Particularmente, se entiende que la ascoclorina libre presente in vivo es fuertemente tóxica para el 20 sistema circulatorio. Sin embargo, una rata no fue muerta administrando el compuesto 5 suspendido en una solución de acacia al 2% incluso a una dosis 100 veces mayor (esto es, 200mg/kg). Cuando se extrajo sangre de la rata en el transcurso del tiempo, no se detectó en la sangre compuesto 1 libre. Sin embargo, el hecho de que no se detectara compuesto 1 libre en la sangre, no indica que el compuesto 1 no esté presente en la sangre. Por el contrario, se puede probar que el compuesto 1 está presente en la sangre de la rata a la ?k? " cual se había administrado compuesto 5 a un nivel tan alto que supera una 5 dosis letal en el caso del compuesto libre. Al suero de la rata a la cual se había administrado el compuesto 5 como una suspensión, se le agregó hasta 10 veces acetonitrilo que contenía 1% de ácido acético, y la mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 semana. En caso de que una molécula de fármaco se una a la t w proteína, la molécula de fármaco se une usualmente de manera débil a la proteína por medio de un enlace no covalente (por ejemplo, enlace hidrófobo, enlace de hidrógeno, enlace de van der Waals, enlace de momento ion-dipolo, etc.). Consecuentemente, el fármaco se puede disociar de la proteína agregando un solvente orgánico y dejándolo reposar durante 15 aproximadamente 1 hora. Sin embargo, la ascoclorina presente en el suero de la rata, a la cual se había administrado el compuesto 5, nunca sería liberado de la proteína después de 1 hora. Para recuperar casi completamente la ascoclorina unida a la proteína, fue necesario dejar que la mezcla reposara a temperatura ambiente durante 1 semana. Además, la 20 ascoclorina no se disoció solamente agregando un solvente orgánico (acetonitrilo, etanol, acetona, etc.) al suero de la rata al cual se había administrado el compuesto 5. Particularmente, no fue liberada hasta que la mezcla se acidificó agregando ácido acético. En base a estos hechos, se r- ? estima que la ascoclorina presente en la sangre podría formar una base de Schiff mediante enlace covalente con el grupo amino de la proteína sérica. En la formación de una base de Schiff por reacción entre un grupo aldehido y un grupo amino, el equilibrio se desplaza hacia la formación de la base bajo ^^(^ 5 condiciones alcalinas y hacia la disociación bajo condiciones acidas. Por lo tanto, para liberar la ascoclorina unida a la proteína sérica por enlace covalente, es necesario desplazar el equilibrio hacia el lado izquierdo por acidificación. Subsecuentemente, el compuesto 6 se agregó al suero para 10 examinar la formación de una base de Schiff in vitro. El compuesto 6 es difícilmente soluble en agua y muestra una solubilidad de 0.8 g/ml en solución salina amortiguadora de fosfato (PBS). Cuando el compuesto 6 disuelto en sulfóxido de dimetilo en una concentración alta, se agregó en porciones a suero de bovino, se disolvió en el suero en una relación de 800 15 mg/ml (esto es, 1000 veces) y el suero se volvió amarillo dependiendo de la concentración del compuesto 6. Cuando se agregó un solvente orgánico (etanol, acetonitrilo, etc.) a este suero amarillo, el material coloreado no se disolvió en el solvente orgánico sino que precipitó como proteína sérica de 'color amarillo. La capa de solvente orgánico no contenía compuesto 6. Sin 20 embargo, el compuesto 6 se recuperó cuantitativamente como una solución en acetonitrilo agregando acetonitrilo que contenía 1 % de ácido acético a dicho precipitado amarillo, y dejando la mezcla reposar 1 semana. En la reacción entre una proteína y una molécula de fármaco, no se había tomado en cuenta la conversión en un compuesto novedoso mediante la formación de un enlace covalente entre el fármaco y proteína sérica in vivo. Sin embargo, es obvio que el grupo aldehido en el anillo de benceno de los compuestos de la presente invención y el agrupo amino de la proteína sérica, forman una 5 base de Schiff basándose en los siguientes hechos. (1 ) Los compuestos de la presente invención no pueden ser detectados por ningún medio usual en el suero de animales a los cuales se habían administrado los compuestos. (2) Los compuestos de la presente invención son liberados agregando en gran cantidad un solvente orgánico acidificado al suero, y dejando reposar a 10' temperatura ambiente durante 1 semana. (3) Cuando se agregan al suero in vitro, los compuestos de la presente invención se disuelven en una relación tan alta como de 1000 veces, y se pueden recuperar con el mismo método usado en la recuperación de los compuestos de la presente invención del suero de animales a los cuales se habían administrado los compuestos. (4) El 15 suero de los animales a los cuales se habían administrado los compuestos, o el suero que contenía los compuestos de la presente ¡nvención, se vuelven amarillos (en particular, la absorción atribuible al grupo aldehido desaparece pero aparece otra absorción, atribuible a una base de Schiff). Es decir, los compuestos de la presente ¡nvención se caracterizan por formar bases de 20 Schiff con el grupo amino de proteína sérica, como requisito esencial de la invención. Las bases de Schiff formadas in vivo por los compuestos de la presente invención con proteína sérica son compuestos enmascarados que no son incorporados directamente en las células y por lo tanto no exhiben actividad biológica (efecto farmacológico ni toxicidad) rápidamente. Para establecer la actividad biológica, dicha base de Schiff debe ser incorporada en vesículas de las células por endocitosis, e hidrolizada en la porción de proteína para con ello regenerar los compuestos de la presente invención en un estado libre. Consecuentemente, la administración de los compuestos de la presente invención es equivalente a la administración de compuestos cuya actividad biológica ha sido enmascarada, y que muestran una acción lenta y no muestran efectos secundarios.
Prueba usando ratas Se emplearon ratas machos Wistar (n=4) que pesaban aproximadamente 200 g, y la concentración del compuesto 1 contenido en el suero se expresó como media ± EE (figura 9). En la figura 9, los círculos huecos muestran un caso en donde el compuesto 5 se solubilizó con HCO-60 y se administró oralmente en una dosis de 2 mg/kg. Como muestra la figura 9, el compuesto 5 fue absorbido rápidamente por el tracto digestivo e hidrolizado por acilasa en la sangre para dar el compuesto 1. Cuando el compuesto 1 libre apareció en la concentración como se muestra en la figura 9, todas las ratas murieron en el transcurso de 1 hora después de la administración. Los círculos llenos muestran un caso en donde el compuesto 5 se suspendió en una solución de acacia y se administró oralmente en una dosis de 20 mg/kg. Por partes de suero recolectado con el paso de tiempo, se les agregó etanol que contenía 1 % de ácido acético, y la mezcla se dejó reposar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 7 días. Después se determinó el compuesto 1 por medio de cromatografía de líquidos de alto 5 rendimiento. Los cuadrados huecos muestran un caso en donde el compuesto 5 se suspendió en una solución de acacia y se administró oralmente. Después se extrajo la sangre en tiempos determinados e inmediatamente después se determinó el compuesto 1 por medio de cromatografía de líquidos 10 de alto rendimiento. En este caso no se detectó compuesto 1. Separadamente, se administró compuesto 5 suspendido en una solución de acacia a ratas que se habían canalizado hacia la vena porta. Después se extrajo sangre portal en el transcurso del tiempo y se determinó el compuesto 1. Similar al caso que muestra la figura 8, no estuvo presente compuesto 1 15 libre en el suero. Particularmente, el compuesto 1 estaba todo en la forma del compuesto de tipo base de Schiff liberado después de dejar reposar durante 1 semana en etanol que contenía ácido acético. • Reacción de los compuestos de la presente invención con suero 20 El compuesto 14, el compuesto 5 y el compuesto 6, se disolvieron cada uno en polietilenglicol 400, después se agregaron a suero de bovino para dar una concentración de 500 g/ml y se dejó reposar a temperatura ambiente. En puntos definidos, se muestreó el suero y se dividió en 2 porciones. Se agregó hasta diez veces acetonitrilo a una de estas porciones y la mezcla se centrifugó. Después se determinó el compuesto libre en el suero. A la otra porción, se le agregó hasta 10 veces acetonitrilo que contenía 1% de ácido acético. Después de dejar reposar a temperatura 5 ambiente durante 1 semana, la mezcla se centrifugó y se determinó el compuesto libre (figura 10). Como indica claramente la figura 10, con el paso del tiempo se redujo cada compuesto que permanecía en el suero desprotein izado por adición de acetonitrilo. Sin embargo, esta reducción solo fue aparente. 10 Cuando se agregó al suero acetonitrilo con 1 % de ácido acético, y la mezcla • se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 semana, seguido por determinación, se recuperó cada compuesto con un rendimiento de 98 a 102%. En el caso del compuesto 5, que es un derivado acilado que se hidroliza durante el reposo a temperatura ambiente para dar el compuesto 1 , 15 el nivel se determinó calculando el nivel de conversión del compuesto 5 en base al nivel obtenido de cada uno de los dos compuestos. Por otra parte, se pudo recuperar casi cuantitativamente el compuesto 6 y el compuesto 14 en el • sobrenadante centrifugado después de agregar el acetonitrilo que contiene 1% de ácido acético y dejando reposar durante 1 semana a temperatura 20 ambiente.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o condición en un mamífero que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de ligando de receptor X retinoide (RXRL), en donde dicha enfermedad o condición en un mamífero que puede ser aliviada por medio de dicha regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, es arteriosclerosis en un humano, inducida por colesterol en suero; en donde dicha composición farmacéutica comprende un compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en una cantidad efectiva para tratar y/o prevenir dicha enfermedad o condición, junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de compuestos de fórmula (1 ) en donde 1 -CHO H H Cl H 2 -CHO H H Cl -OAc 3 -CHO H H Br H 4 -CHO H H H H 5 -CHO H CH3CO- Cl H 6 -CHO H -CH3 Cl H 7 -CHO -CH3 -CH3 Cl H 8 -CHO CH3CO- -CH3 Cl H 10 9 -CHO -CH3 CH3CO- Cl H 10 -CHO -CH3 H Cl H 11 -CHO H CH3CH2- Cl H 12 -CHO H alilo Cl H 13 -CHO H butilo Cl H 14 -CHO H -CH2COOH Cl H 15 15 -CHO H -(CH2)2COOH Cl H 16 -CHO H -(CH2)3COOH Cl H 17 -CHO H -(CH2)4COOH Cl H 18 -CHO H -CH2COOCH3 Cl H 19 -CHO H nicotinoilo Cl H 0 20 -CHO H benzoilo Cl H 21 -CHO H isonicotinoilo Cl H compuestos de fórmula (2) en donde 22 Cl H 10 • 23 H H 24 Cl -OH 25 Cl -OAc un compuesto de fórmula (3) # 26 #27 un compuesto de fórmula (5) #28 compuestos de fórmula (6) en donde 29 Cl H • 30 Cl -CH3 31 Cl CH3CO- 32 H H 33 H -CH3 34 H CH3CO- y compuestos de fórmula (7) • en donde 35 Cl H 36 Cl -CH3 37 Cl CH3CO- 38 H H 39 H -CH3 40 H CH3CO- 2.- La composición farmacéutica de conformidad con la -?j¡- 10 reivindicación 1 , en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide es un compuesto de fórmula (1 ) en donde 6 -CHO H -CH3 Cl H 20 3.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1 , en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, se selecciona del grupo que consiste de compuestos de fórmula (1) en donde 2 -CHO H H Cl -OAc 3 -CHO H H Br H 4 -CHO H H H H 5 -CHO H CH3CO- Cl H 7 -CHO -CH3 -CH3 Cl H 8 -CHO CH3CO- -CH3 Cl H 9 -CHO -CH3 CH3CO- Cl H 10 -CHO -CH3 H Cl H 12 -CHO H alilo Cl H 14 -CHO H -CH2COOH Cl H 15 -CHO H -(CH2)2COOH Cl H 16 -CHO H -(CH2)3COOH Cl H 17 -CHO H -(CH2)4COOH Cl H 18 -CHO H -CH2COOCH3 Cl H 19 -CHO H nicotinoilo Cl H 20 -CHO H benzoilo Cl H 21 -CHO H isonicotinoilo Cl H y los compuestos de las fórmulas (2)-(7) definidas en la reivindicación 1. 4.- Una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o condición en un mamífero que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, en donde dicha enfermedad o condición que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, es hipertensión, angiopatía cerebral, restenosis arterial posterior a angioplastía coronaria transluminal percutánea, o esclerosis arteriocapilar o arteriosclerosis en órganos transplantados; en donde dicha composición farmacéutica comprende un compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, seleccionado del grupo que consiste de los compuestos (1)-(7) definidos en la reivindicación 1 , o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, en una cantidad efectiva para tratar y/o prevenir dicha enfermedad o condición, junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable. 5.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 4, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, es un compuesto de fórmula (I) en donde 6 -CHO H -CH3 Cl H • 6.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 2 o 5, en donde dicho aditivo es un agente tensioactivo alifático sintético o una sustancia polimérica soluble en solventes orgánicos. 7.- La composición farmacéutica de conformidad con la 10 reivindicación 2 o 5, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, está en forma de partículas finas o en forma amorfa. 8.- Una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o condición en un mamífero, que puede ser 15 aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, en donde dicha enfermedad o condición que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, es diabetes de tipo II; en donde dicha composición farmacéutica comprende un compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, o una 20 sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en una cantidad efectiva para tratar y/o prevenir dicha enfermedad o condición, junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable, en donde dicho compuesto se selecciona del >%', grupo que consiste de los compuestos de las fórmulas (1 )-(7) definidas en la reivindicación 1. 9.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 8, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando 5 del receptor X retinoide, es un compuesto de fórmula (I) # Ri R2 Ra R4 Rs 14 -CHO H -CH2COOH Cl H 15 10.- Una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o condición en un mamífero, que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, en donde dicha enfermedad o condición que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, es 20 degeneración y/o necrosis de las células-ß pancreáticas de los islotes de Langerhans; en donde dicha composición farmacéutica comprende un compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en una cantidad efectiva para , -> % tratar y/o prevenir dicha enfermedad o condición, junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de los compuestos de las fórmulas (1 )-(7) definidas en la "^Rf reivindicación 1. 11.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, es un compuesto de fórmula (I) en donde 14 -CHO H -CH2COOH Cl H 15 12.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 10, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, se selecciona del grupo que consiste de 20 compuestos de fórmula (1) en donde 2 -CHO H H Cl -OAc 3 -CHO H H Br H 4 -CHO H H H H 5 -CHO H CH3CO- Cl H 7 -CHO -CH3 -CH3 Cl H 8 -CHO CH3CO- -CH3 Cl H 9 -CHO -CH3 CH3CO- Cl H 10 -CHO -CH3 H Cl H 12 -CHO H alilo Cl H 14 -CHO H -CH2COOH Cl H 15 -CHO H -(CH2)2COOH Cl H 16 -CHO H -(CH2)3COOH Cl H 17 -CHO H -(CH2)4COOH Cl H 18 -CHO H -CH2COOCH3 Cl H 19 -CHO H nicotinoilo Cl H 20 -CHO H benzoilo Cl H 21 -CHO H isonicotinoilo Cl H ' i ? compuestos de las fórmulas (2)-(7) definidas en la reivindicación 1. 13.- Una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o condición en un mamífero, que puede ser ^ aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de 5 RXRL, en donde dicha enfermedad o condición que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, es artritis reumatoide o enfermedad autoinmune; dicha composición farmacéutica está caracterizada porque comprende un compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, o una sal farmacéuticamente aceptable del 10 mismo, en una cantidad efectiva para tratar y/o prevenir dicha enfermedad o condición, junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de los compuestos de las fórmulas (1)-(7) definidas en la reivindicación 1. 14.- Una composición farmacéutica para el tratamiento y/o 15 prevención de una enfermedad o condición en un mamífero, que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, en donde dicha enfermedad o condición que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, es trastorno metabólico de calcio; en donde dicha composición farmacéutica 20 comprende un compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en una cantidad efectiva para tratar y/o prevenir dicha enfermedad o condición, junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable, en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de compuestos de fórmula (1 ) en donde '^ 10 1 -CHO H H Cl H 2 -CHO H H Cl -OAc 3 -CHO H H Br H 4 -CHO H H H H 5 -CHO H CH3CO- Cl H 15 6 -CHO H -CH3 Cl H 7 -CHO -CH3 -CH3 Cl H 8 -CHO CH3CO- -CH3 Cl H i 10 -CHO -CH3 H Cl H 12 -CHO H alilo Cl H 13 -CHO H butilo Cl H y compuestos de fórmulas (2)-(7) como se definen en la reivindicación 1. 15.- Una composición farmacéutica para el tratamiento y/o prevención de trastorno metabólico de calcio en un mamífero, que comprende un compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un aditivo farmacéuticamente aceptable, con la condición de que dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, no debe ser un compuesto seleccionado del grupo que consiste de: compuestos de fórmula (1) en donde 14 -CHO H -CH2COOH Cl H 15 -CHO H -(CH2)2COOH Cl H 16 -CHO H -(CH2)3COOH Cl H 17 -CHO H -(CH2)4COOH Cl H 18 -CHO H -CH2COOCH3 Cl H 19 -CHO H nicotinoilo Cl H 20 -CHO H benzoilo Cl H 21 -CHO H isonicotinoilo Cl H 16.- La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 o 15, caracterizada además porque dicho aditivo es un agente tensioactivo alifático sintético, o una sustancia polimérica soluble en solventes orgánicos. 5 17.- La composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 o 15, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, está en forma de partículas finas o en forma amorfa. 18.- El uso de un compuesto capaz de actuar como un ligando k ío del receptor X retinoide, o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable, para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o condición en un mamífero que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de ligando del receptor X 15 retinoide (RXRL), en donde dicha enfermedad o condición en un mamífero que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica fc ' dependiente de RXRL, es arteriosclerosis en un humano inducida por colesterol en el suero, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, se selecciona del grupo que consiste de: 20 compuestos de fórmula (1 ) en donde 5 -CHO H CH3CO- Cl H 6 -CHO H -CH3 Cl H 7 -CHO -CH3 -CH3 Cl H 8 -CHO CH3CO- -CH3 Cl H 9 -CHO -CH3 CH3CO- Cl H 10 -CHO -CH3 H Cl H 12 -CHO H alilo Cl H 13 -CHO H butilo Cl H • 14 -CHO H -CH2COOH Cl H 15 -CHO H -(CH2)2COOH Cl H 16 -CHO H -(CH2)3COOH Cl H 17 -CHO H -(CH2)4COOH Cl H 20 18 -CHO H -CH2COOCH3 Cl H 19 -CHO H nicotinoilo Cl H 20 -CHO H benzoilo Cl H 21 -CHO H isonicotinoilo Cl H compuestos de fórmula (2) en donde # RT R2 22 Cl H 23 H H 10 24 Cl -OH 25 Cl -OAc un compuesto de fórmula (3) # 26 un compuesto de fórmula (4) #27 un compuesto de fórmula (5) #28 compuestos de fórmula (6) - - en donde 29 Cl H 30 Cl -CH3 31 Cl CH3CO- 32 H H 33 H -CH3 34 H CH3CO- y compuestos de fórmula (7) en donde 35 Cl H 36 Cl -CH3 • 37 Cl CH3CO- 38 H H 39 H -CH3 40 H CH3CO- 20 19.- El uso de conformidad con la reivindicación 18, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, es un compuesto de fórmula (1 ) en donde 6 -CHO H -CH3 Cl H 20.- El uso de conformidad con la reivindicación 18, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, se selecciona del grupo que consiste de compuestos de fórmula (1 ) en donde 2 -CHO H H Cl -OAc 3 -CHO H H Br H 4 -CHO H H H H 5 -CHO H CH3CO- Cl H 7 -CHO -CH3 -CH3 Cl H 8 -CHO CH3CO- -CH3 Cl H 10 -CHO -CH3 H Cl H 12 -CHO H alilo Cl H 14 -CHO H -CH2COOH Cl H 15 -CHO H -(CH2)2COOH Cl H 16 -CHO H -(CH2)3COOH Cl H 17 -CHO H -(CH2)4COOH Cl H 18 -CHO H -CH2COOCH3 Cl H 19 -CHO H nicotinoilo Cl H 20 -CHO H benzoilo Cl H 21 -CHO H ¡sonicotinoilo Cl H y los compuestos de las fórmulas (2)-(7) definidas en la reivindicación 18. 21.- El uso de un compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable, para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o condición en un mamífero que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, en donde dicha enfermedad o condición que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, es hipertensión, angiopatía 10 cerebral, restenosis arterial posterior a angioplastía coronaria transluminal percutánea, o esclerosis arteriocapilar o artenosclerosis en órganos transplantados; en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide se selecciona del grupo que consiste de los compuestos de las fórmulas (1)-(7) definidas en la reivindicación 18. 15 22.- El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, es un compuesto de fórmula (I) en donde # Ri R2 Rs R4 Rs 6 -CHO H -CH3 Cl H 23.- El uso de conformidad con la reivindicación 19 o 22, en donde dicho aditivo es un agente tensioactivo alifático sintético o una sustancia polimérica soluble en solventes orgánicos. 24.- El uso de conformidad con la reivindicación 19 o 22, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, está en forma de partículas finas o en forma amorfa. 25.- El uso de un compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable, para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o condición en un mamífero que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, en donde dicha enfermedad o condición que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, es diabetes de tipo II; en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de los compuestos de las fórmulas (1)-(7) definidas en la reivindicación 18. 26.- El uso de conformidad con la reivindicación 25, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, es un compuesto de fórmula (I) en donde # Ri R2 Ra R4 Rs 14 -CHO H -CH2COOH Cl H 27.- El uso de un compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable, para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o condición en un mamífero que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, en donde dicha enfermedad o condición que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, es degeneración y/o necrosis de las células D pancreáticas de los islotes de Langerhans; en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de los compuestos de las fórmulas (1)-(7) definidas en la reivindicación 18. '"i «t 28.- El uso de conformidad con la reivindicación 27, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, es un compuesto de fórmula (I) en donde # Ri R2 R3 R4 R5 10 14 -CHO H -CH2COOH Cl H 29.- El uso de conformidad con la reivindicación 27, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, se 15 selecciona del grupo que consiste de compuestos de fórmula (1) en donde 2 -CHO H H Cl -OAc 3 -CHO H H Br H 4 -CHO H H H H 5 -CHO H CH3CO- Cl H 7 -CHO -CH3 -CH3 Cl H 8 -CHO CH3CO- -CH3 Cl H 9 -CHO -CH3 CH3CO- Cl H 10 -CHO -CH3 H Cl H 10 12 -CHO H alilo Cl H 14 -CHO H -CH2COOH Cl H 15 -CHO H -(CH2)2COOH Cl H 16 -CHO H -(CH2)3COOH Cl H 17 -CHO H -(CH2)4COOH Cl H 15 18 -CHO H -CH2COOCH3 Cl H 19 -CHO H nicotinoilo Cl H 20 -CHO H benzoilo Cl H ^BF 21 -CHO H isonicotinoilo Cl H 20 y compuestos de las fórmulas (2)-(7) definidas en la reivindicación 18. 30.- El uso de un compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable, para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o condición en un mamífero que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, en donde dicha • enfermedad o condición que puede ser aliviada por medio de regulación de 5 transcripción génica dependiente de RXRL, es artritis reumatoide o enfermedad autoinmune; en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de los compuestos de las fórmulas (1)-(7) definidas en la reivindicación 18. 31.- El uso de un compuesto capaz de actuar como un ligando # 10 del receptor X retinoide, o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, opcionalmente junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable, para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o condición en un mamífero que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, en donde dicha 15 enfermedad o condición que puede ser aliviada por medio de regulación de transcripción génica dependiente de RXRL, es trastorno metabólico de calcio; en donde dicho compuesto se selecciona del grupo que consiste de compuestos de fórmula (1) en donde 1 -CHO H H Cl H ^ 2 -CHO H H Cl -OAc 3 -CHO H H Br H 4 -CHO H H H H 6 -CHO H -CH3 Cl H 7 -CHO -CH3 -CH3 Cl H 10 8 • -CHO CH3CO- -CH3 Cl H 9 -CHO -CH3 CH3CO- Cl H 10 -CHO -CH3 H Cl H 11 -CHO H CH3CH2- Cl H 12 -CHO H alilo Cl H 13 -CHO H butilo Cl H 15 y compuestos de las fórmulas (2)-(7) como se definen en la reivindicación 18. ^¡F 32.- El uso de un compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, 20 opcionalmente junto con un aditivo farmacéuticamente aceptable, para preparar un medicamento para el tratamiento y/o prevención de trastorno metabólico de calcio en un mamífero; con la condición de que dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, no debe ser un compuesto seleccionado del grupo que consiste de: compuestos de fórmula (1 ) en donde F - 10 14 -CHO H -CH2COOH Cl H 15 -CHO H -(CH2)2COOH Cl H 16 -CHO H -(CH2)3COOH Cl H 17 -CHO H -(CH2)4COOH Cl H 18 -CHO H -CH2COOCH3 Cl H 19 oilo 15 -CHO H nicotin Cl H 20 -CHO H benzoilo Cl H 21 -CHO H isonicotinoilo Cl H • 33.- El uso de conformidad con cualquiera de las 20 reivindicaciones 18, 20, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32, en donde dicho aditivo es un agente tensioactivo alifático sintético, o una sustancia polimérica soluble en solventes orgánicos. 34.- El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18, 20, 21 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 o 32, en donde dicho compuesto capaz de actuar como un ligando del receptor X retinoide, ß está en forma de partículas finas o en forma .amorfa.
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