MXPA00011773A - Quinazolinas para tratar tumores en el cerebro. - Google Patents

Abstract

Se describen compuestos y conjugados novedosos de quinazolina substutida utiles para inhibir el crecimiento de celulas tumorales en el cerebro y para inhibir la adhesion y migracion de celulas tumorales en el cerebro. Los compuetos de la invencion incluyen 4-(3'-bromo-4'-hidroxifenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolinz y este compuesto covalentemente unido a EGF.

Description

QUINAZOLINAS PARA TRATAR TUMORES EN EL CEREBRO CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a derivados novedosos de quinazolina efectivos para inducir apoptosis de células tumorales en el cerebro. En particular, la invención incluye derivados novedosos de hidroxiquinazolina que tienen potente citotoxicidad contra células tumorales en el cerebro humano, incluyendo glioblastoma. Los compuestos novedosos de la invención además inhiben la adhesión de células tumorales en el cerebro a proteínas de matriz extracelular e inhiben la migración de células tumorales del cerebro a través de la matriz extracelular, actividades requeridas para la metástasis del tumor.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Como los tumores de sistemas nerviosos centrales primarios más malignos, la astrocitoma anaplástica y glioblastoma multiforme de alto grado responde pobremente a programas de tratamiento de modalidades múltiples contemporáneos empleando resección quirúrgica, terapia de radiación y quimioterapia con una supervivencia media de menos de un año después del diagnóstico Pardos, y otros, 1997, Cáncer Medicine, 1:1471-1514; Brandes y otros, 1996, Cáncer Invest. 14:551-559; Finlay, J. L., 1992, Pediatric --..._.,- --»-», üiHpa,! -¡ Neuro-Oncology, 278-297; Pardos y otros, 1998, Sem. Surgical Oncol., 14-88-95). Consecuentemente, el desarrollo de nuevos agentes efectivos y modalidades novedosas de tratamiento contra estos tumores en el cerebro de prognosis muy pobre permanece siendo un punto focal principal en la búsqueda de oncología de translación. El glioblastoma multiforme también es un tumor en el cerebro primario altamente invasivo con un régimen y mortalidad de recurrencia desafortunadamente alto local. Los nuevos agentes capaces de inhibir la infiltración de parénquima de cerebro normal a través de células de glioblastoma son urgentemente necesarios.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN En un esfuerzo sistémico para identificar un agente citotóxico con potente antiviral anti-tumoral contra células de glioblastoma, se sintetizaron varios derivados de quinazolina hidroxi-substituidos y se examinaron sus efectos in vitro e in vivo en células de glioblastoma humanas. Se encontró que los derivados de quinazolina hidroxi- y halo-hidroxi novedosos exhiben una potente actividad citotóxica contra células de glioblastoma humanas a concentraciones micromolares. El objetivo de estos compuestos para las superficies de las células tumorales en el cerebro, por ejemplo, conjugando los compuestos hidroxi- y halo-hidroxi para una porción de objetivo tal como el factor de crecimiento epidérmico (EGF), además mejoró la M actividad citotóxica (a concentraciones nanomolares). El conjugado demostró una actividad tumoral anti-cerebro más rápida y más potente, incluyendo muerte apoptótica de células de glioblastoma in vitro, mejorando significativamente la supervivencia libre de tumor en modelo de xenoinjerto de glioblastoma de ratón SCID in vivo, la inhibición de la adhesión de célula tumoral a proteinas SM y la inhibición de migración de célula tumoral y actividad de invasión. Por consiguiente, la presente invención incluye compuestos y composiciones novedosas que tienen potente actividad citotóxica contra células tumorales del cerebro. Las composiciones de la invención contienen una cantidad citotóxica o inhibidora efectiva de un compuesto de quinazolina hidroxi-substituida, más particularmente de un derivado de quinazolina hidroxi- o halo-hidroxi-substituida. Los compuestos de la invención incluyen aquellos que tienen la siguiente fórmula: en donde X es HN, RnN, S, O, CH2 o R CH, y uno o más de Ri. R2, R3, R4, Rs es OH, SH o NH2. Las modalidades preferidas incluyen aquellas en donde X es NH; R3 es OH; R2 y/o R es un * halógeno, preferiblemente Br. En una modalidad preferida, uno o más de R1-R5 forman un segundo anillo fusionado al anillo fenilo, por ejemplo, formando un anillo naftilo y teniendo por lo menos una substitución hidroxi. Los compuestos citotóxicos preferidos de la invención incluyen 4-(3'-bromo-4'-hidroxilfenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina [WHI- P154], 4-(4'-hidroxilfenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina [WHI-P131], y 4-(2'-hidroxi-naftil-3')-amino-6,7-dimetoxiquinazolina [WHI-P292]. Los compuestos de la invención pueden ser formulados para suministrarse a un sujeto como una composición farmacéutica, y de preferencia pueden ser modificados para la aniquilación selectiva de células tumorales en el cerebro a través de la conjugación a una porción objetivo específica de célula, tal como un antígeno- anticuerpo superficial anti-célula, o una porción conocida por cegar un receptor superficial de célula, tal como EGF. Los compuestos de la invención preferiblemente están covalentemente unidos a la porción objetivo. Una porción objetivo ilustrativa es EGF, la cual, cuando se conjuga con el compuesto de la invención rápida y específicamente dirige el compuesto hacia las células tumorales en el cerebro expresando el receptor EGF, dando como resultado una citotoxicidad específica, rápida y mejorada. Los compuestos de la invención son administrados a un sujeto para inhibir el crecimiento de células tumorales en el cerebro, para inducir apoptosis de células tumorales en el cerebro, reduciendo así la masa del tumor. Los compuestos de la invención también son administrados para inhibir la adhesión y migración de células tumorales del cerebro, por ejemplo, inhibiendo la infiltración de parénquima de cerebro normal a través de células de glioblastoma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras 1A y 1B son gráficas de supervivencia de células demostrando la actividad citotóxica de WHI-154 y otros compuestos de la invención contra células de glioblastoma U373. Las Figuras 2A y 2B son fotografías de células inmunoteñidas analizadas mediante el láser demostrando la expresión superficie de la célula del receptor EGF en células de glioblastoma humanas U373 y U87. Las Figuras 3A, 3A', 3B, 3B', 3C, 3C\ 3D y 3D' son fotografías de células inmunoteñidas mostrando la captación mediada por EGF-R de EGF-P154 a través de células de glioblastoma humanas U373. Las Figuras 4A y 4B son fotografías que muestran la captación de WHI-P154 por células de glioblastoma humanas. La Figura 5A es una gráfica que demuestra la actividad citotóxica de EGF-P154 contra células tumorales en el cerebro. La Figura 5B muestra la actividad de WHI-P154 y EGF-P154 no conjugados sobre células de leucemia negativas EGF-R. Las Figuras 6A-6E son fotografías que muestras aspectos morfológicos de células de glioma tratadas con EGF y EGF-P154. Las Figuras 7A y 7B son gráficas que muestran el volumen del tumor y veces la supervivencia libre del tumor en un modelo de glioblastoma humano de ratón SCID tratado con WHI-P154 y EGF-P154. La Figura 8 es una gráfica de barras que muestra la adhesión de glioblastoma y células de meduloblastoma en placas revestidas con varias proteínas ECM. Las Figuras 9A-9D son gráficas de barra mostrando la inhibición de la adhesión de célula a proteínas ECM en presencia de los compuestos de la invención. La Figura 10 es una gráfica que muestra la inhibición de la adhesión de célula inducida por EGF en presencia de los compuestos de la invención. Las Figuras 11A y 11 B son gráficas que demuestran la inhibición de la migración de células tumorales en el cerebro a través de la matriz extracelular MATRIGEL Matrix en presencia de los compuestos de la invención. Las Figuras 12A-C y 14A'-C son fotografías de células inmunoteñidas demostrando la inhibición de la formación de complejo de adhesión focal en células de glioblastoma en presencia de los compuestos de la invención. Las Figuras 13A-13C son fotografías de células inmunoteñidas mostrando la inhibición de la formación de fibra de tensión de actina en células de glioblastoma en contacto con los compuestos de la invención. Las Figuras 14A-D son fotografías que muestran la inhibición del desarrollo de célula tumoral de esferoides de glioblastoma en presencia de los compuestos de la invención. La Figura 15 es una gráfica demostrando el efecto citotóxico de WHI-P292 en células de glioblastoma.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye derivados novedosos de quinazolina hidroxi-substituidos teniendo potente actividad como agentes citotóxicos contra células tumorales en el cerebro, incluyendo células de glioblastoma. Además, los compuestos de quinazolina hidroxi-substituidos de la invención son potentes inhibidores de la adhesión y migración de célula tumoral, actividades requeridas para la metástasis de célula tumoral.

Definiciones Todos los términos científicos y técnicos utilizados en esta solicitud tienen los significados comúnmente utilizados en la técnica, a menos que se indique otra cosa. Como se utiliza en esta solicitud, las frases o palabras que siguen tienen los significados especificados. Como se utiliza en la presente, "alquilo" incluye grupos de hidrocarburo alifático saturado tanto de cadena recta como de cadena ramificada teniendo el número específico de átomos de carbono. Como una modalidad preferida, se incluyen cadenas de 1 a -¿uiiaiHud-ai-iM 4 átomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, butilo secundario, t-butilo, y similares. Como se utiliza en la presente, "alqueno" incluye grupos de hidrocarburo alifático insaturados tanto de cadena ramificada como recta teniendo el número específico de átomos de carbono, preferiblemente cadenas de 1 a 4 átomos de carbono. Como se utiliza en la presente, "acilo" incluye-C(O)R, en donde R es H, alquilo o arilo conteniendo de 1 a 4 átomos de carbono. Como se utiliza en la presente, "halógeno" incluye fluoro, cloro, bromo y yodo. Un halógeno preferido o substituyente halógeno es Br.

Como se utiliza en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier material que, cuando se combine con un compuesto de la invención, permita que el compuesto retenga la actividad biológica, tal como la habilidad para inducir apoptosis de células tumorales en el cerebro, y sea no reactivo con el sistema inmune del sujeto. Los ejemplos incluyen pero no se limitan a, cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándares tales como una solución salina regulada en su pH con fosfato, agua, emulsiones tales como emulsiones de aceite/agua y varios tipos de agentes humectantes. Las composiciones que comprenden dichos vehículos son formuladas a través de métodos bien conocidos convencionales (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Capítulo 43, 14th Ed. Mack Publishing Co., Easton, PA).

Compuestos de la Invención Las quinazolinas substituidas novedosas de la invención tienen la estructura general representada por la siguiente fórmula I: en donde X se selecciona del grupo que consiste de HN, RuN, S, O, CH2, y Rn-CH. Rn es H, alquilo, teniendo de 1 a 4 átomos de carbono, o acilo. Preferiblemente, X es NH; y de preferencia R1( es H. Ri, R2, R3, R4. Rs, e, R7 y Rß cada uno independientemente se seleccionan del grupo que consiste de H, OH, SH, NH2, NO2, alcoxi, alquiltio y halógeno. Rg y R10 cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alquilo o acilo, conteniendo hasta 4 átomos de carbono. Preferiblemente, Rg y R10 son metilo. Por lo menos uno de R,, R2, R3, R5 es OH. Alternativamente, por lo menos uno de R1-R5 es un compuesto tal como SH o NH2. En una modalidad alternativa, uno o más de R1-R5 forma un segundo anillo fusionado al anillo fenilo. Por ejemplo, los siguientes compuestos incluyen segundos anillos fusionados al anillo fenilo a través de uno o más de R^Rs: Compuestos Ilustrativos Algunos compuestos ilustrativos de la invención se listan a continuación con sus datos de caracterización: 4-(3 ',5 '-IMbromo-4'-hc^oxilf(^l)-amino-6,7-dimetoxiqinazolina [WHI-P97] ). S m/z456(M* +1,54.40), 455(M\100.00).454(M*- 1.78.01), 439(NT -OH, 7.96), 376(M* +1 - Br, 9.76), 375(M* -Br, 10.91), 360(5.23 ). Anal. (Cl6Hl3Br,N3O3) C. H. N. -(3'-Bromo-4'-metilfenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina [WHI-Pl 11] , IRCKB ?^: 3431, 3248, 2835, 1633, 1517, 1441, 1281, 1155 cm-1. GC/MS m/z 375(Mt + 1, 76.76), 374(M~, 100.00). 373(M* -1, 76.91). 358(MT + 1- OH, 11.15). 357(1.42), 356(6.31). Anal. (C17H16BrN3O2HCl) C, H, N. 4-(4'-Hidroxiferdl)-anüno-6,7-dimetoxiquinazoUna WHI-P131] rend. 84.29%; p.f. 245.0-248.0. °C. UV(MeOH)? 203.0, 222.0, 251.0, 320.0 nm: IR(KBr)?max: 3428, 2836, 1635, 1516, 1443, 1234 cm 1; ? NMRfMSO-d*): d 11.21(s, 1H, -NH), 9.70(s, 1H, -OH), 8.74(s, 1H, 2-H), 8.22(s, 1H, 5- H), 7.40(d, 2H, J= 8.9 Hz, 2',6'-H), 7.29(s, 1H, 8- H), 6.85(d, 2H,J= 8.9 Hz, 3',5'-H), 3.98(s, 3H, - OCH3), 3.97(s, 3H, -OCH3). GC/MS m/z 298 (M+ +1, 100.00), 297(M\ 26.56), 296( MM, 12.46). Anal. (C16H15N3O3HCl) C, H, N. 2'-ffidroxifenü)-apmo^,7-^ [WHI-P132] 1H. nm. IR(KBr)?m?x: 3500 (br), 3425. 2833, 1625. 1512, 1456, 1251. 1068 cm 1. GC/MS m/z 298(tvT +1, 8.91), 297(M+, 56.64). 281 (M* +1- OH. 23.47), 280(M"- OH, 100.00). Anal. (Cl6H„N,O3HCl) C, H. N. -(3'-Bromo-4'-hidroxifenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina [WHI-P154] GC/MS m/z 378( M+ +2, 90.68), 377(M* +1, 37.49), 376(M\ 100.00), 360(M\ 3.63), 298(18.86), 282 (6.65). Anal. (CI6H14N3O3HCl) C, H, N. 4-(3'-Hidroxifeaúl)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina [WHI-P180] rend.71.55 %; p.f. 256.0- 258.0 °C. 1HNMR(DMSO-d6): d 9.4 l(s, 1H, -NH), 9.36(s, 1H, -OH), 8.46(s, 1H, 2-H), 7.84(s, 1H , 5-H), 7.84- 6.50(m, 4H, 2', 4', 5', 6' -H), 7.20(s, 1H, 8-H), 3.96(s, 3H, -OCH3), 3.93(s, 3H, -OCH3). UV(MeOH)?m„(e): 204.0, 224.0, 252.0, 335.0 nm. IR(KBr)?mlx: 3394, 2836, 1626, 1508, 1429, 1251 cm1. GM/MS m/z: 297(MT, 61.89), 296(M+, 61.89), 296(M* -1, 100.00), 280(M* - OH, 13.63). Anal. (C16Hl5N3O3.HCl) C, H, N. 4-(3'-Cloro-4'-lü(koxifenil)-amino-6,7-<iimetoxiquinazolina pApHI-P197] 330.0 nm. IR(KBr)?m„: 3448, 2842, 1623. 1506, 1423, 1241 cm 1. GC/MS m/z: 341(M\ 100.00), 326(M+-CH3 98.50), 310(M )CH3 12.5), 295(9.0), 189(13.5), 155(13.8). Anal. (C16HHCIN303.HC1 ) C, H, N. 4-(2,-ffidrox-naftíl-3 -a?nino^,7-dimetoxiquinazolina [WHI-P292] : (C20H17N3O3.HC1)C,H,N.

Compuestos Citotóxicos Como se muestra en los ejemplos a continuación, un substituyente hidroxilo sobre el anillo fenilo (Ri - R5) parece ser necesario para efectos citotóxicos de los compuestos substituidos novedosos de la invención, aunque una segunda substitución en este anillo, por ejemplo con un halógeno tal como bromo (Br), mejora el efecto citotóxico del compuesto. En el método de la invención, los efectos citotóxicos de estos compuestos se logran poniendo en contacto células tumorales del cerebro con cantidades micromolares del compuesto inhibidor. Los compuestos citotóxicos particularmente útiles incluyen WHI-P154 (3-Br-4-OH substituido) y WHI-P131 (4-OH substituido), y WHI-P292 (1-OH naftalen-substituido). Los más particularmente útiles son los conjugados de estos compuestos con una porción objetivo tal como EGF, teniendo actividad citotóxica a concentraciones nanomolares. Como se describió anteriormente, los compuestos útiles en el método de la invención también incluyen aquellos substituidos con SH o NH2 en lugar de las substituciones hidroxi demostradas.

Compuestos para Inhibir la Adhesión/Migración Los Ejemplos que siguen además demuestran la efectividad de los compuestos de quinazolina hidroxi-substituida de la invención como inhibidores de adhesión de células tumorales del cerebro a la matriz extracelular y de la migración de células tumorales. Cada uno de los compuestos probados que tiene un substituyente hidroxi sobre el anillo fenilo, demostró actividad inhibidora contra la adhesión/migración de célula de glioblastoma. Los compuestos inhibidores particularmente potentes útiles incluyen WHI-P154, WHI-P131 y WHI-P292. Los compuestos útiles de la invención son probados para la habilidad para evitar adhesión/migración de células tumorales del cerebro a través de los análisis descritos en los ejemplos más adelante. Dichos análisis incluyen la inhibición de la unión de célula a proteínas de matriz extracelulares en presencia del compuesto inhibidor según comparado con un control no inhibidor; la inhibición de la invasión de células tumorales del cerebro hacia la matriz Matrigel de acuerdo con el método publicado por Albini y otros, 1987, Cáncer Res. 47:3239; y la inhibición de placas de adhesión focales y polimerización de actina en presencia del compuesto inhibidor según comparado con un control no inhibidor. La conjugación de los compuestos inhibidores a una porción objetivo, EGF, mejoró la actividad inhibidora del compuesto WHI-P154. En el método de la invención, las células tumorales del cerebro se pusieron en contacto con concentraciones aproximadamente micromolares de los compuestos inhibidores para inhibir la adhesión e invasión/migración de células tumorales hacia tejido no enfermo. Esto es importante, por ejemplo, durante la cirugía de ablación cuando las células pueden ser dispersadas. La adhesión de células ECM acopladas con la naturaleza maligna adhesiva de las células tumorales del cerebro puede dar como resultado un desarrollo de un nuevo tumor en el sitio de adhesión. La inhibición de la adhesión y migración administrando los compuestos de la invención de esta manera inhibe el desarrollo de un nuevo tumor.

Síntesis de Derivados Novedosos de Quinazolina Hidroxi-Substituida Los derivados de q^uinazolina hidroxi-substituida de la invención pueden ser sintetizados a partir de un material de partida clave, 4-cloro-6,7-dimetoxiquinazolina, preparada utilizando procedimientos publicados (Nomoto, y otros, 1990, Chem. Pharm. Bull., 38:1591-1595; Thomas, C. L., 1970, Academic Press, New York, NY, "I. Synthesis of quinazoline derivates") como se presenta a continuación en el Esquema 1 y como se describe completamente más adelante en los Ejemplos que siguen: Esquema 1 Los compuestos de la invención después son preparados a través de la condensación de 4-cloro-6,7-dimetoxiquinazolina con la anilina substituida apropiada presentada a continuación en el Esquema 2: Esquema 2 R = substituyente; n = número En una forma similar, los compuestos de la invención, en donde X es S u O, o en donde X es alquilo, tal como CH2, son sintetizados a partir de un compuesto precursor, haciendo reaccionar la porción de anillo con la substitución deseada para producir el producto deseado. Estos métodos sintéticos son conocidos por aquellos expertos en la técnica, e incluye, por ejemplo, aquellos mostrados en el Esquema 3 a continuación: Esquema 3 Conjugados de la Invención El término "conjugado" significa que incluye un compuesto formado como un material compuesto entre dos o más moléculas Más específicamente, en la presente invención, los derivados novedosos de quinazolina hidroxi-substituida son unidos, por ejemplo, covalentemente unidos, a porciones objetivo de célula específica formando un compuesto conjugado para el suministro eficiente y específico del agente a una célula de interés.

Porción objetivo La frase "porción objetivo" significa que incluye una molécula que sirve para suministrar los compuestos de la invención a un sitio específico para la actividad deseada. Las porciones objetivo incluyen, por ejemplo, moléculas que específicamente unen moléculas sobre una superficie celular específica. Dichas porciones objetivo útiles en la invención incluyen anticuerpos de antígeno superficial anti-célula, factores de crecimiento que se unen a receptores superficiales de célula tales como EGF y su receptor EGF-R. Las citocinas, incluyendo interleucinas y factores tales como el factor de estimulación de granulocito/macrófago (GMCSF) también son porciones objetivo específicas, que se sabe que se unen a células específicas que expresan altos niveles de sus receptores.

Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y su Receptor (EGF-Rc) El Factor de Crecimiento Epidérmico Humano (hEGF) está comercialmente disponible en una forma altamente purificado, por ejemplo, de Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY) (Lote No. 01-107C). Este ligando de proteína se sabe que une específicamente y con alta afinidad a receptores localizados sobre la superficie de células sensibles a EGF. La expresión del EFG-Rc es incrementada f i' rniTirirnr en las células sensibles a EGF, incluyendo células de neoíntima hiperplásticas. Para utilizarse en los conjugados de la presente invención, se prefiere el EGF (hrEGF) humano recombinante, aunque se anticipa 5 que hEGF y los análogos de hEGF que específicamente unen hEGF- Rc en células de neoíntima inhibirán similarmente la migración de células basculares en la formación del crecimiento de célula de neoíntima hiperplástica cuando se conjugan. El factor de crecimiento epidérmico humano (EGF) es una 10 cadena individual de 53 aminoácidos, un polipéptido de 6216 daltons, el cual ejerce efectos biológicos uniéndose a un receptor de factor de crecimiento epidérmico de membrana celular de 170 kDa específico (receptor EGF/ErbB-1) (Fix, S. B., 1994, Breast Cáncer Research & Treatment, 29:41-49; Earp y otros, 1995, Breast Cáncer 15 Research & Treatment, 35:115-132; Whight y otros, 1995, J. Biol. Chem., 270:12085-12093; Broome and Hunter, 1996, J. Biol. Chem, 271:16798-16806). El receptor de EGF humano consiste de un dominio extracelular con un alto contenido de cisteína y glicosilación N-enlazada, un dominio de transmembrana individual, y un dominio 20 citoplásmico con actividad de tirosina-cinasa de proteína (PTK). La unión de EGF al receptor de EGF/ErbB-1 da como resultado la dimerización del receptor consigo mismo u otras membranas de la familia de PTK de la transmembrana Erb-B (subtipo I) (por ejemplo, Erb-B2, Erb-B3), dando como resultado la activación con 25 autofosforilación del dominio de PTK (Muthuswamy, S. K., 1994, Molecular & Cellular Biology, 14:735-743); Ottenhiff-Kalff y otros, 1992, Cáncer Research, 52:4773-4778). El receptor de EGF está física y funcionalmente asociado con PTK de la familia de protooncogen Src incluyendo p60stc (Muthuswamy, S. K., 1994, Molecular & Cellular Biology, 14:735-743; Ottenhoff-Kalff y otros, 1992, Cáncer Research, 52:4773-4778; Aikyama y otros, 1987, J. Biol. Chem., 262:5592-5595). Se cree que esta asociación puede ser una parte integral de los eventos de señalización mediados por el receptor de EGF (Ottenhoff-Kalff y otros, 1992, Cáncer Research. 52:4773-4778.

Formación del Conjugado Para formar los conjugados de la presente invención, las porciones objetivo son covalentemente unidas a sitios sobre los compuestos de quinazolina hidroxi-substituida. La porción objetivo, la cual por lo general es una molécula de polipéptido, está unida a compuestos de la invención en sitios reactivos, incluyendo NH2, SH, CHO, COOH, y similares. Se utilizan agentes de enlace específicos para enlazar los compuestos. Los agentes de enlace preferidos se seleccionan de acuerdo con el sitio reactivo en donde la porción objetivo va a ser unida. Los métodos para seleccionar un agente de enlace apropiado y sitio reactivo para la unión de la porción objetivo al compuesto de la invención son conocidos, y se describen en, por ejemplo, Hermanson, y otros, Bioconjugate Techniques, Academic Press, 1996; Hermanson y otros, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, 1992; y Pierce Catalog and Handbook 1996, pág. T155-T202. Un método ilustrativo para conjugar EGF se describe en los siguientes ejemplos.

Métodos de Administración Los conjugados de la presente invención pueden ser formulados como composiciones farmacéuticas y administrarse a un huésped mamífero, incluyendo un paciente ser humano en una variedad de formas adaptadas para la ruta de administración seleccionada y adecuadas para la administración de la pequeña molécula o su conjugado. Las rutas de administración preferidas incluyen oral, parenteral, así como rutas intravenosa, intramuscular o subcutánea.

Se prefiere que el conjugado de la presente invención sea administrado parenteralmente, es decir intravenosa o intraperitonealmente, a través de infusión o inyección. En una modalidad de la invención, los compuestos pueden ser administrados directamente a un tumor a través de inyección de tumor; inyectando el compuesto en el cerebro, por ejemplo en el fluido ventricular; o a través de suministro sistémico a través de inyección intravenosa. Los compuestos de la invención, incluyendo los conjugados, son de un tamaño y composición que se espera que tengan fácil acceso al cerebro a través de la barrera hematoencefálica. Las soluciones o suspensiones de los conjugados pueden ser preparadas en agua, salina isotónica (PBS) y opcionalmente mezclarse con un agente tensoactivo no tóxico. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietileno líquido, glicoles, ADN, aceites vegetales, triacetina y mezclas de los mismos. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservador para evitar el desarrollo de microorganismos. La forma de dosis farmacéutica adecuada para inyección o uso de infusión puede incluir soluciones o dispersiones estériles, acuosas o polvos estériles que comprenden un ingrediente activo, los cuales están adaptados para la preparación extemporánea de las soluciones o dispersiones inyectables o de infusión estériles. En todos los casos, La última forma de dosis debe ser estéril, fluida o estable bajo las condiciones de fabricación de almacenamiento. El portador o vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión líquido comprendiendo, por ejemplo, agua, etanol, poliol tal como glicerol, glicol propilénico, o glicoles polietilénicos líquidos y similares, aceites vegetales, esteres glicerílicos no tóxicos, y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede ser mantenida, por ejemplo, a través de la formación de liposomas, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido, en el caso de dispersión, o a través del uso de agentes tensoactivos no tóxicos. La prevención de la acción de microorganismos puede lograrse a través de varios agentes antimicrobianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenes, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, puede ser deseable incluir agentes ßßmuM isotónicos, por ejemplo, azúcares, reguladores de pH, o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser producida a través de la inclusión en la composición de agentes de retraso de absorción, por ejemplo, hidrogeles de monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando conjugados en la cantidad requerida en el solvente apropiado con otros ingredientes enumerados anteriormente y, según se requiera, seguido por esterilización mediante filtro. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío y de secado por congelación, las cuales producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional presente en las soluciones filtradas previamente estériles.

Tratamiento del Tumor Para los propósitos de esta invención, un método de tratamiento para el tumor incluye poner en contacto las células tumorales del cerebro con un compuesto de la invención con el fin de tener una inhibición del crecimiento de células tumorales, una aniquilación de células tumorales, y/o un tiempo de supervivencia del paciente incrementado. El tratamiento de tumores a través del método de la invención, también incluye la prevención de la adhesión y migración de células tumorales, inhibiendo así la metástasis. Los compuestos citotóxicos e inhibidores de adhesión/migración de la invención son adecuados para utilizarse en mamíferos. Como se utiliza en la presente, "mamífero" representa cualquier clase de vertebrados superiores que se alimentan en su niñez con leche secretada por las glándulas mamarias, incluyendo, por ejemplo, seres humanos, conejos y monos.

Apoptosis La apoptosis, o muerte celular programada, es un proceso activo que requiere de nueva síntesis de proteína. Típicamente, el proceso requiere ATP, que involucra nueva síntesis de ARN y proteína, y culmina en la activación de endonucleasas endógenas que degradan el ADN de la célula, destruyendo así la plantilla genética requerida para la homeostasis celular. La apoptosis es observada en la eliminación controlada de células durante metamorfosis, diferenciación y rotación general de células y parece normalmente ser regulada por eventos acoplados al receptor. Por estas razones, la apoptosis ha sido denominada como "muerte de célula programada " o "suicidio de célula". Aunque cada célula probablemente tiene el programa genético para cometer suicidio, usualmente es suprimida. Bajo circunstancias normales, solamente aquellas células que ya no son requeridas por el organismo activan este programa de autodestrucción. La muerte de célula apoptótica es caracterizada por la formación de glóbulos de la membrana de plasma, pérdida de volumen de la célula, condensación nuclear, y degradación endonucleótica del ADN a intervalos de nucleosoma. La pérdida de la integridad de la membrana de plasma es un evento relativamente tardío en apoptosis, a diferencia de la forma de muerte de célula denominada necrosis, la cual puede ser ocasionada por hipoxia y exposición a ciertas toxinas y que típicamente se caracteriza al principio por permeabilidad incrementada de membrana y ruptura de célula.

Adhesión/Migración La adhesión significa incluir esa actividad de una célula, tal como una célula tumoral, a través de la cual se adhiere a proteínas de matriz extracelular, incluyendo laminina, fribonectina y colágeno. Los ensayos de adhesión son conocidos e incluyen, para los propósitos de esta invención, la adherencia de células tumorales a placas cubiertas con proteínas de matriz extracelular. La migración significa incluir esa actividad de células tumorales a través de la cual emigran a través de la matriz extracelular e invaden tejidos. Los ensayos para la migración incluyen la habilidad de las células para emigrar a través de una matriz formada de matriz extracelular, tal como una matriz de MATRIGEL, así como la evaluación de la organización citoesquelética de la célula incluyendo la disposición citoesquelética de actina y cambios en adhesiones focales como se describe en los siguientes Ejemplos.

Dosis Util Cuando se utiliza in vivo para aniquilar selectivamente células tumorales en el cerebro o para inhibir la adhesión/migración de células tumorales en el cerebro, la dosis administrada es aquella efectiva que tiene el efecto deseado, por ejemplo, suficiente para reducir o eliminar tumores en el cerebro, o suficiente para inhibir la adherencia/migración de células tumorales. Las cantidades apropiadas pueden ser determinadas por aquellos expertos en al técnica, mediante extrapolación utilizando métodos y relaciones conocidas, de los datos in vitro e in vivo proporcionados en los ejemplos. Con base en los datos de farmacología de ratón SCID contenidos en esta solicitud, se espera lograr niveles efectivos de exposición. En general, la dosis de las quinazolinas novedosas substituidas efectivas para obtener la apoptosis de célula tumoral en el cerebro, reducción de tumores y tiempo incrementado de supervivencia, es aquella que administra cantidades micromolares del compuesto a las células, preferiblemente 100 micromolares o más. La dosis requerida en reducida a través de la conjugación del compuesto a una porción objetivo, por ejemplo, preferiblemente a 100 nanomolares o concentraciones mayores. Para las actividades inhibidoras de adhesión y migración de la célula, el compuesto es administrado generalmente a dosis más bajas, en la escala de 100 micromolares o menos. La dosis efectiva que va a ser administrada variará con las condiciones específicas de cada paciente. En general, factores tales como la gravedad de la enfermedad, ubicación del tumor (expuesto o lejano), edad del huésped, metabolismo, enfermedades, exposición anterior a fármaco, y aspectos similares, contribuyen a la efectividad esperada de un fármaco. Un experto en la técnica utilizará procedimientos estándares y análisis de pacientes para calcular la dosis apropiada, extrapolando de los datos provistos en los ejemplos. En general, una dosis que suministra aproximadamente 1-100 mg/kg del peso del cuerpo se espera que sea efectiva, aunque más o menos puede ser útil. Además, las composiciones de la invención pueden ser administradas en combinación con otras terapias antitumorales. En dicha terapia de combinación, la dosis administrada de los derivados de quinazolina hidroxi-substituida puede se menor para terapia de fármaco individual.

EJEMPLOS La invención además puede ser aclarada haciendo referencia a los siguientes ejemplos, los cuales sirven para ilustrar algunas de las modalidades preferidas y no para limitar la invención de ninguna manera.

Ejemplo 1 Síntesis de Derivados de Quinazolina Todos los productos químicos fueron comprados en Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsín, y se utilizaron directamente para síntesis. Los solventes anhidro tales como acetonitrilo, metano, etanol, acetato de etilo, tetrahidrofurano, cloroformo, y cloruro de metileno se obtuvieron de Aldrich en botellas selladas con seguridad bajo nitrógeno y fueron transferidos a vasos de reacción a través de canulación. Todas las reacciones se realizaron bajo una atmósfera de nitrógeno. El material de partida clave, 4-cloro-6,7-dimetoxiquinazolina, se preparó utilizando procedimientos publicados (Nomoto, y otros, 1990, Chem. Pharm. Bull, 38:1591-1595; Thomas, C. L., 1970, Academic Press, New York, NY, "I. Synthesis of Quinazolina Derivates"), como se presenta en el Esquema 1 a continuación: Esquema 1 W Específicamente se trató ácido 4,5-dimetoxi-2-nitrobenzoico (compuesto 1) con cloruro de tionilo para formar cloruro ácido, seguido por la reacción con amoniaco para producir 4,5-dimetoxi-2-nitrobenzamida (compuesto 2). El compuesto 2 fue reducido con borohidruro de sodio en presencia de cantidades catalíticas de sulfato de cobre para dar 4,5-dimetoxi-2-aminobenzamida (compuesto 3), la cual se llevó a reflujo directamente con ácido fórmico para producir 6,7-dimetoxiquinazolin-4-(3H)-ona (compuesto 4). El compuesto 4 se llevó a reflujo con oxitricloruro de fósforo para dar 4-cloro-6,7-dimetoxi quinazolina (compuesto 5) en un buen rendimiento. Los derivados de quinazolina substituida se prepararon a través .-^..•^^- de la condensación de 4-cloro-6,7-dimetoxiquinazolina con anilina substituida como se presenta en el Esquema 2 a continuación: Esquema 2 R = substituyente; n = número Específicamente, una mezcla de 4-cloro-6,7- 10 dimetoxiquinazolina (448 mg, 2 mmoles) y la anilina substituida (2.5 mmoles) en 20 ml de EtOH se calentó a reflujo. Después de llevar a reflujo durante 4-24 horas, se agregó una cantidad en exceso de Et3N, y el solvente se concentró para dar el producto crudo el cual se recristalizó a partir de DMF. 15 Como se discutió anteriormente, los derivados de quinazolina hidroxi-substituida de la invención fueron creados haciendo reaccionar anilinas substituidas con el material de partida clave, 4- cloro-6,7-dimetoxiquinazolina. Cada una de las anilinas para sintetizar los compuestos es mostrada en el siguiente cuadro. 20 ^Ékd-fea-ÉÜMÉ-?HÉáttü.

Ejemplo 2 Caracterización de Derivados de Quinazolina Substituida Los derivados de quinazolina substituida fueron sintetizados como se describió en el Ejemplo 1 y caracterizados. Cada estructura se muestra a continuación, junto con sus resultados de prueba analítica de identificación. Se registraron los espectros de resonancia magnética nuclear de protón y carbono (1H y 3CNMR) en un espectrómetro de Mercury 2000 Varian operando a 300 MHz y 75 MHz, respectivamente, utilizando una sonda de banda ancha automática. A menos que se indique otra cosa, todos los espectros de NMR fueron registrados en CDCI2 a temperatura ambiente. Los desplazamientos químicos de H son citados en partes por millón (d de ppm) campo abajo del tetrametil silano (TMS), el cual fue utilizado como un estándar interno a 0 ppm y s, d, t, q, m designan bandas individuales, dobletes, tripletes, bandas cuádruples y multipletes, respectivamente. Los puntos de fusión fueron determinados utilizando un aparato de fusión de Fisher-Johns y están sin corregir. Los espectros de UV fueron registrados utilizando un espectrómetro UV/V modelo #DU 7400 de Beckmann con una longitud de trayectoria de celda de 1 cm. Se utilizó metanol como el solvente para los espectros de UV. Se registraron los espectros infrarrojos de transformación de Fourier utilizando un instrumento de Nicolet, modelo Protege #460. Los espectros infrarrojos y las muestras se operaron como líquidos netos utilizando discos de KBr. Se utilizó el método de pella de KBr para todas las muestras sólidas Se condujo el análisis de GC/espectro de masa utilizando un espectrómetro de GC/masa de Hewlett-Packard modelo #6890 equipado con detector de ion en masa y software de Chem Station. La temperatura del horno fue establemente incrementada de 70°C a 250°C y el gas portador fue helio. 4-(3 '-Bromofenil)-a ino-6,7-dimetoxiquinazolina [WHI-P79] 344(11.34), 222(10.87), 140(13.65). Anal. (C,6HMBGN3Q2) C, H. N. 4-(3'-Bromc)-4'-Wdroxifenil)-amino-6,7-dimetoxiqiJÍnazolina [WHI-Pl 11] Br rend. 82.22 %; p.f. 225.0-228°C. lH , IROCBr ^: 3431, 3248, 2835, 1633, 1517, 1441, 1281, 1155 cm-'. GC/MS m/z 375(MT + 1, 76.76), 374(M+, 100.00), 373(M+ -1, 76.91), 358(M* + 1- OH, 11.15), 357(1.42), 356(6.31). Anal. (C,7H,6BGN,O;HC1) C. H, N. 4-(4'-Hidroxifenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina [WHI-P131] - H), 6.85(d, 2H, J= 8.9 Hz, 3',5'-H), 3.98(s, 3H, - OCHj), 3.97(s, 3H, -OCH3). GC/MS m/z 298 (M+ +1, 100.00), 297(M+, 26.56), 296( MM, 12.46). Anal. (C,6H,;NAHC1) C, H, N. 4^2'-Hidroxifenü)-amino^,7-dimetoxiquinazolina [WHI-P132] rend.82.49%; p.f. 255.0-258.0 °C. ? NMRíDMSO-dé): d 9.78(s, 1H, -NH), 9.29(s, 1H. - OH), 8.33(s, 1H, 2-H), 7.85(s, 1H. 5-H), 7.41- 6.83(m, 4H, 3', 4', 5', 6'-H), 7.16(s, 1H, 8-H), 3.93(s, 3H, -OCH3). 3.92(s, 3H, -OCH3). UV(mEoh)?m„(e ): 203.0. 224.0. 245.0, 335.0 nm. IRÍKBr ^: 3500 (br), 3425. 2833. 1625. 1512, 1456. 1251, 1068 cm '. GC/MS m/z 298(M* +1, 8.91), 297(M\ 56.64), 281(M* +1- OH. 23.47), 280(M+- OH. 100.00). Anal. (C16H15N3O3HCl) C, H. N. 4-(3 '-Bromo-4'-Wdroxife?«l)-amino-6,7-dimetoxiqu Qazolina [WHI-P 154] 7.14(s, 1H, 8-H), 6.97(d, 1H, J5.6. = 9.0 Hz, 5'- H), 3.92(s, 3H, -OCHj), 3.90(s, 3H, -OCH3). GC/MS m/z 378( M* +2, 90.68), 377(M* +1, 37.49), 376(M , 100.00), 360(M+. 3.63), 298(18.86), 282 (6.65). Anal. (C16H„N3O,HCl) C, H, N. 4-(3 '-Hidroxifenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina [WHI-P 180] 61.89), 296(M* -1, 100.00), 280(M* - OH, 13.63). Anal. (C,6H,;N3O HCl) C, H, N. -**•- 4-(3 '-Cloro-4'-Hidroxiferdl)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina [WHI-P197] 330.0 nm. IR(KBr)?miX: 3448.2842. 1623. 1506, 1423, 1241 cm"1. GC/MS m/z: 341(M\ 100.00), 326(M*-CH3 98.50), 310(M )CH3 12.5), 295(9.0), 189(13.5), 155(13.8). Anal. (CI6HMCIN .HC1) C. H, N. 4-(fenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina [WHI-P258] *, 280(M"-1, 100.00), 264(16.00), 207(8.50). Anal. (C16H„NA) C, H. N. 4-(2^Hidrox-naftíl)-3'-amino-6,7-dimetoxiqx?inazolina [WHI-P292] rend. 87.41%; p.f. 277.0-279.0°C. IR( Br)?m„: 3479. 3386, 3036, 2901, 1632, 1581, 1504, 1437, 1281 cm'1. 'H NMR(DMSO-d6): dl 1.38(s, 1H, - NH), 10.35(s„ 1H, -OH), 8.73(s, 1H, 2-H), 8.25(s, 1H, 5-H), 7.93-7.30(m,6H, 1', 4', 5', 6', 7, 8'-H), 7.37(s, 1H. 8H), 4.00(s, 6H, -OCH3). GC/MS m/a: 281(41.0). 253(11.0), 207(100.0). AnaL (CjoHpN?.HCl) C, H, N. 10 JS&?^MUl**^ Ejemplo 3 Citotoxicidad de Derivados de Quinazolina Substituida La citotoxicidad de los compuestos de derivado de quinazolina substituida contra células de glioblastoma humanas fue evaluada. La importancia relativa del grupo substituyente regular en los compuestos también fue estudiada. Los compuestos de derivados de quinazolina substituida, preparados como se describió anteriormente en el Ejemplo 1, fueron probados junto con DMSO y Genisteína como 10 controles.

Ensayo de Toxicidad El ensayo de citotoxicidad de varios compuestos contra líneas de célula tumoral de cerebro humano se realizó utilizando el ensayo 15 MTT (bromuro de (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolio), (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN). En resumen, se sembraron células tumorales de cerebro exponencialmente en desarrollo en una placa de 96 cavidades a una densidad de 2.5 x 104 células/cavidad y se incubaron durante 36 horas a 37°C antes de la 20 exposición al fármaco. En el día del tratamiento, el medio de cultivo fue cuidadosamente aspirado de las cavidades y reemplazado con un medio fresco conteniendo los compuestos de quinazolina WHI-P79, WHI-P97, WHI-P111, WHI-P131, WHI-P132, WHI-P154, WHI-P180, WHI-P197, WHI-P258, EGF no conjugado, o EGF-P154, así como la 25 genisteína de isoflavona inhibidora de tirosina-cinasa (GEN) a concentraciones que varían de 0.1 A 250 µM. Se utilizaron cavidades por triplicado para cada tratamiento. La línea de célula de glioblastoma humana U373 se obtuvo de American Type Culture Collection (Rockville, MD) y se mantuvo como 5 una línea de célula continua en un medio de Eagle modificado con Dulbecco suplementado con suero de bovino fetal al 10% y antibióticos. La línea de célula de leucemia linfoblástica aguda de linaje B Nalm-6, fue utilizada como un control negativo. Las células fueron incubadas con los varios compuestos 10 durante 24-36 horas a 37°C en una atmósfera humedecida de CO2 al 5%. A cada cavidad, se agregaron 10 µl de MTT (0.5 mg/ml de concentración final) y las placas fueron incubadas a 37°C durante 4 horas y se dejó que el MTT formara cristales de formazan reaccionando con células metabólícamente activas. Los cristales de 15 formazan fueron solubilizados durante la noche a 37°C en una solución conteniendo SDS al 10% en 0.01 M HCl. La absorbancia de cada cavidad fue medida en un lector de microplaca (Labsystems) a 540 nm y una longitud de onda de referencia de 690 nm. Para traducir los valores de OD5 0 en el número de células vivas en cada 20 cavidad, los valores de OD540 fueron comparados con aquellos en OD540 estándar contra curvas de número de célula generadas para cada línea de célula. El porcentaje de supervivencia fue calculado utilizando la fórmula: 25 % de Supervivencia = número de célula viva [pruebal 100 número de célula viva [control] aüdMiateMi-u^u Los valores de IC50 fueron calculados a través de análisis de regresión no lineal.

Detección de Apoptosis in situ La demostración de apoptosis se realizó a través de un método de marcación de muesca-extremo, in situ, utilizando un equipo de detección in situ ApopTag (Oncor, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se sembraron células exponencialmente en desarrollo en placas de cultivo de 6 cavidades a una densidad de 50 x 104 células/cavidad y se cultivaron durante 36 horas a 37°C en una atmósfera humedecida de CO2 al 5%. El medio de cultivo de sobrenadante fue cuidadosamente aspirado y reemplazado con un medio fresco conteniendo EGF o EGF-P154 no conjugado a una concentración de 10.25 o 50 µg/ml. Después de una incubación de 36 horas a 37°C en un incubador humedecido con CO2 al 5%, los sobrenadantes fueron cuidadosamente aspirados y las células fueron tratadas durante 1-2 minutos con 0.1% de tripsina. Las células separadas se recogieron en un tubo de centrifuga de 5 ml, se lavaron con el medio y se formaron en pellas a través de centrifugación a 1000 rpm durante 5 minutos. Las células se volvieron a suspender en 50 µl de PBS, se transfirieron a cubreobjetos cubiertos con poli-L-lisina y se dejaron unir durante 15 minutos. Las células se lavaron una vez con PBS y se incubaron con regulador de pH de equilibrio durante 10 minutos a temperatura ambiente.

— — — - „ ^*M£ Después de la remoción del regulador de pH de equilibrio, las células fueron incubadas durante 1 hora a 37°C con la mezcla de reacción conteniendo desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) y digoxigenina-11-UTP para la marcación de extremos 3'-hidroxilo expuestos del ADN nuclear fragmentado. Las células fueron lavadas con PBS y se incubaron con anticuerpo anti-digoxigenina conjugado a FITC durante 1 hora a temperatura ambiente para detectar el dUTP incorporado. Después de lavar las células con PBS, los cubreobjetos fueron montados sobre portaobjetos con Vectashield conteniendo ioduro de propidio (Vector Labs, Burlingame, CA) y se vio con un microscopio de exploración láser con focal. Las células no apoptóticas no incorporan cantidades importantes de dUTP debido a la falta de extremos 3-hidroxilo expuestos, y ' consecuentemente tienen mucho menos fluorescencia que las células apoptóticas que tienen una abundancia de extremos 3'-hidroxilo expuesto. En reacciones de control, la enzima TdT fue omitida de la mezcla de reacción.

Resultados La identidad de los substituyentes específicos en cada porción de anilina se resume a continuación: Derivados de Quinazolina Identidad de Substituyentes WHI-P79 3-Br WHI-P97 3-Br, 5-Br, 4-OH WHI-P111 3-Br, 4-CH3 WHI-P131 4-OH WHI-P132 2-OH WHI-P154 3-Br, 4-OH WHI-P180 3-OH WHI-P197 3-CI, 4-OH WHI-258 H WHI-292 1-OH Naftilo Los resultados del ensayo de citotoxicidad contra células tumorales en el cerebro se muestran en las Figuras 1A y 1B. En resumen, aquellos compuestos que tienen substituciones hidroxi sobre el anillo fenilo, fueron efectivos para aniquilar células tumorales del cerebro. El compuesto no substituido P-258 y el potente inhibidor TK 3-Br-substituido. P79, no fueron efectivos para aniquilar células tumorales en el cerebro. Tampoco fueron efectivos los controles de genisteína y DMSO. Aquellos derivado de quinazolina substituida que tienen un grupo hidroxilo sobre la porción anilina demostraron actividad citotóxica. Cuatro compuestos probados poseyeron un grupo hidroxilo individual; en la posición 4 (WHI-P131 ), en la posición 2 (WHI-P132), en la posición 3 (WHI-P180), y en la posición 1 (WHI-P292). Los cuatro exhibieron citotoxicidad importante, con el compuesto WHI-P180 (3-OH) demostrando efectos ligeramente más fuertes que los otros dos. Los compuestos que tienen tanto un substituyente hidroxilo como un substituyente halógeno también fueron potentes agentes citotóxicos. La estructura de WHI-P197 (3-CI, 4-OH) difiere de aquella de WHI-P131 (4-OH) solamente en el átomo de cloro en la posición 3. Como se muestra en las Figuras 1A y 1B, además el átomo de cloro no afectó la citotoxicidad de este compuesto. La estructura de WHI-P154 (3-Br, 4-OH) difiere de WHI-P131 (4-OH), solamente en el átomo de bromo en la posición 3. Como se muestra en las Figuras 1A y 1B, la adición del átomo de bromo a este compuesto incrementó significativamente la citotoxicidad del compuesto. La estructura de WHI-P97 difiere de aquella de WHI-P154, solamente en el átomo de átomo adicional agregado en la posición 5. La Figura 1 muestra que no existe esencialmente ningún beneficio del segundo átomo de bromo agregado.

-*. WHI-P154, 4-(3'-bromo-4'-hidroxilfenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina exhibió una citotoxicidad importante contra la línea de célula de glioblastoma humana U373 en 3 de 3 experimentos independientes con un valor medio de (+_ SE) IC50 de 167.4 +_ 26.9 µM y un valor de IC50 de curva de supervivencia mixto de 158.5 µM. En contraste, WHI-P79, un potente inhibidor de EGF-R y tirosina cinasa de la familia Src (Bos, y otros, 1997, Clin. Cáncer Res. 3:2099-2106; Fry, y otros, 1994, Science (Washington, D. C.) 265:1093-1095) fallaron para ocasionar cualquier citotoxicidad detectable para las células de glioblastoma U373. De esta manera, la citotoxicidad de WHI-P154 a células U373 no puede ser explicada a través de sus propiedades inhibidoras de tirosina-cinasa. Esta noción además es apoyada por la incapacidad de la genisteína inhibidora PTK (incluida como controles) para ocasionar una citotoxicidad detectable para células U373 (valor de IC50 >250 µM; Figura 1A).

Ejemplo 4 Citotoxicidad Mejorada de WHI-P154 Conjugada Contra Células de Glioblastoma Humanas En contraste a las células y neuronas guales normales, números importantes de células de glioblastoma expresan el receptor EGF (EGF-R) a niveles altos. Por lo tanto, el EGF-R es un objetivo potencial para suministrar agentes citotóxicos a células de glioblastoma con eficiencia mayor (Mendelsohn, J. y Baselga, J., 1995, Biologic Therapy of Cáncer: Principies and Practice, pág. 607-23).

Expresión de EGF a Través de Células de Glioblastoma Dicha expresión del EGF-R en las líneas de célula de glioblastoma humanas U373 y U87 (obtenidas y mantenidas como se describió en el Ejemplo 3) se confirmó con el microscopio de exploración láser de inmunofluorescencia y confocal utilizando anticuerpos monoclonales para el dominio extracelular de EGF-R. La tinción de inmunofluorescencia con el anticuerpo anti-a-tubulina y el colorante nuclear Toto-3 se utilizó en combinación con el microscopio de exploración láser confocal para examinar las características morfológicas de células de glioma U373 tratadas ya sea con EGF o EGF-P154 no conjugado. Las células fueron fijadas en paraformaldehído, inmunoteñidas con anticuerpo monoclonal para EGF-R (fluorescencia verde) y contrateñidas con TOTO-3 (fluorescencia azul). Las células inmunoteñidas fueron analizadas con un microscopio confocal de exploración láser. La fluorescencia azul representa los núcleos. Ambas líneas de célula mostraron una inmunorreactividad granular difusa con el anticuerpo anti-EGF-R (ver Figuras 2A y 2B).

Preparación del Conjugado EGF-P154 En un intento para mejorar la actividad anti-tumoral demostrada de 4-(3'-Bromo-4,-hidroxilfenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina (WHI- P154 contra células de glioblastoma, mejorando su activación y captación celular por células de glioblastoma, el compuesto fue conjugado a EGF humano recombinante, como se describe más adelante. Se produjo EGF humano recombinante (rhEGF) en E. coli alojando un plásmido genéticamente diseñado por ingeniería que contiene un gen sintético para EGF humano, fusionado, en el término N a una secuencia líder hexapéptido para la expresión óptima de proteína y plegado. La proteína de fusión rhEGF se precipitó en la forma de cuerpos de inclusión y la proteína madura fue recuperada a través de escisión de tripsina seguido por purificación utilizando cromatografía de intercambio de iones y HPLC. El rhEGF recuperado fue 99% puro a través de HPLC de fase inversa y SDS-PAGE con un punto isoeléctrico de 4.6 +.0.2. El nivel de endotoxina fue de 0.172 EU/mg. El método de conjugación fotoquímica recientemente publicado utilizando el agente de entrelazamiento fotoreactivo etero-bifuncional, 6-[4'-azido2'-nitrofenilamino]hexanoato de sulfosuccinimidilo, (sulfo-SANPAH) (Pierce Chemical Co., Rockford, IL), fue empleado para la síntesis del conjugado EGF-P154, como se describe por Uckum y otros, 1995, Science, 267-886-891. El rhEGF modificado con sulfo-SANPAH fue mezclado con una relación molar de 10:1 de WHI-P154 [solución de 50 mN en sulfóxido de dimetilo (DMSO)] y después fue irradiado con mezclado moderado durante 10 minutos con luz UV a longitudes de onda de 254-366 nm con un emisor de luz UV de bandas múltiples (Modelo UVGL-15 Mineralight; UVP, San Gabriel, CA). La generación fotolítica de un nitreno de banda individual reactivo sobre el otro término de EGF-SANPAH en presencia de un exceso molar de 10 veces con WHI-P154 dio como 5 resultado la unión de WHI-P154 a EGF. El exceso de WHI-P154 en la mezcla de reacción fue removido mediante el paso a través de una columna PD-10 pre-empacada, y homoconjugados de EGF-EGF de 12 kDa con o sin WHI-P154 conjugado así como productos de reacción de peso molecular más 10 alto, fueron removidos a través de cromatografía de líquido de alto rendimiento de exclusión de tamaño (HPLC). La HPLC de fase inversa utilizando un instrumento de HPLC serie 1100 Hewlett- Packard (HP) se utilizó- para la separación de EGF-P154 de EGF- SANPAH. Después de la purificación final, se realizó la HPLC 15 analítica utilizando una columna de fase inversa Spherisorb ODS-2 (250 x 4 mm, Hewlett-Packard, Cat. #79992402-584). Antes de las operaciones de HPLC, se utilizó un espectrofotómetro Beckman DU 7400 para generar un espectro UV para cada una de las muestras para determinar la ?max para EGF-P154, EGF-SANPAH, y EGF no 20 modificado. Cada cromatograma de HPLC fue subsecuentemente corrido a longitudes de onda de 214, 265 y 480 nm utilizando la opción de detector de longitud de onda múltiple suministrado con el instrumento para asegurar la detección óptima de los picos 25 individuales en el cromatograma. El análisis de logró utilizando un j&¡^^gf¡¡^ flujo de gradiente consistiendo de 0% a 100% de eluyente en un intervalo de 0 a 30 minutos. Se operaron muestras de 5 µl aplicadas a la columna anterior utilizando el siguiente programa de gradiente: 0-5 minutos: 0-20% de eluyente; 5-20 minutos: 20-100% de eluyente; 25-30 minutos: 100% de eluyente; y 30-35 minutos: 100-0% de eluyente. El eluyente fue una mezcla de 80% de acetonitrilo (CH3CN), 20% de H2O y 0.1% de TFA. Se realizó la espectrometría en masa de ionización de electroaspersión (Freng, y otros, 1991, J. Am. Soc. Mass Spectrometry 2:387-401; Covery, y otros, 1988, Rapid Communications in Mass Spectrometry 2:249-256 utilizando un espectrómetro de masa triple-cuádruple (Norwalk, CT) para determinar la estequiometría de P154 y EGF en EGF-P154.

Captación e Internacionalización de EGF-P154 La cinética de captación y citotoxicidad del conjugado EGF- P154 en células de glioblastoma U-373 fue analizada utilizando inmunofluorescencia y microscopía láser con focal para permitir las moléculas de EGF-R y EGF-P154 internalizadas, así como cambios morfológicos en células tratadas. Se utilizó inmunofluorescencia para (i) examinar la expresión superficial del receptor EGF (EGF-R) sobre células tumorales en el cerebro, (ii) evaluar la captación de EGF-P154 a través de células tumorales en el cerebro y (iii) examinar las características morfológicas de células tumorales en el cerebro tratadas con EGF-P154. Para el análisis de la expresión de EGF-R y la captación celular de EGF-P154, se coloraron en placas células de glioblastoma U87 y U373 sobre cajas de Petri de 35 mm con fondo de vidrio cubiertas con poli-L-lisina (Mattek Corp., Ashland, MA) y se mantuvieron durante 48 horas. En estudios de captación, el medio de 5 cultivo fue reemplazado con un medio fresco conteniendo 5 µg/ml de EGF, EGF-P154, o WHI-P154 y las células fueron incubadas a 37°C durante 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 60 minutos, y 24 horas. Al final de la incubación, las células se lavaron dos veces con 10 PBS y se fijaron en paraformaldehído al 2%. Las células fueron permeabilizadas y los sitios de unión no específica fueron bloqueados con BSA al 2.5% en PBS conteniendo 0.1% de Tritón X- 100 durante 30 minutos. Para detectar los complejos de EGF-R/EGF- P154, las células fueron incubadas con una mezcla de un anticuerpo 15 monoclonal (1:10 de dilución en PBS conteniendo BSA y Tritón X- 100) dirigida hacia el dominio extracelular del EGF-R humano (Santa Cruz Biotechnologies Inc., Santa Cruz, CA) y un anticuerpo de anti- P153 de conejo policlonal (dilución 1:500) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de enjuagar con PBS, las células 20 fueron incubadas durante 1 hora con una mezcla de un anticuerpo de IgG de anti-ratón de cabra conjugado a FITC (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) e IgG de anti-conejo de burro conjugado a Texas Red (Amersham Corp.) a una dilución de 1:40 en PBS. Similarmente, se examinó la expresión de tubulina a través de 25 inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo monoclonal contra a- AI^.,»»^^ 'v -Hd&.i-ítíi tubulina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a una dilución de 1:1000 y un IgG de anti-ratón conjugado a FITC. Las células se lavaron en PBS y se contratiñeron con toto-3 (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) a una dilución de 1:1000. Las células se lavaron de nuevo con PBS y se montaron cubreobjetos con Vectashield (Vector Labs, Burlingame, CA) y se vieron un microscopio confocal (bio-Rad MRC 1024) montado en un microscopio recto Nikon Labhophor.

Actividad Citotóxica Para determinar si el suministro mejorado de WHI-P154 a células de glioblastoma a través de la conjugación a EGF dio como resultado la potenciación de su actividad anti-tumoral, las actividades citotoxicas .de EGF-P154 y WHI-P154 no conjugado contra líneas de célula de glioblastoma humanas U373 y U87 fueron analizadas en estudios de respuesta de dosis utilizando ensayos de MTT in vitro, como se descubrió anteriormente para el Ejemplo 3. La apoptosis también fue evaluada utilizando el ensayo de marcación de muesca-extremo, como se describió en el Ejemplo 3. Los datos se discuten más adelante.

Resultados La expresión superficial de EGF-R sobre líneas de célula de glioblastoma humana U373 y U87 se confirmó con inmunofluorescencia y microscopio de exploración láser confocal utilizando anticuerpos monoclonales al dominio extracelular del EGF- . --ü^r-mi R. Como se muestra en las Figuras 2A y 2B, ambas líneas de célula mostraron una inmunorreactividad granular difusa con el anticuerpo anti-EGF-R. La cinética de captación y citotoxicidad del conjugado EGF-P154 en células de glioblastoma U373 fueron analizadas utilizando inmunofluorescencia y microscopio láser confocal después de las moléculas EGF-R y EGF-P154 internalizadas, así como cambios morfológicos en células tratadas. El EGF-P154, similar al EGF no conjugado (no mostrado), fue capaz de unirse a y entrar a células de glioblastoma objetivo a través de endocitosis mediadas por receptor induciendo la internalización de las moléculas EGF-R. Como se muestra en las Figuras 3A-C, 13', 3D, y 3D' en 10 minutos después de la exposición a EGF-P154, los complejos de EGF-R/EGF-P154 comenzaron a quedar internalizados, según determinado a través de co-localización del EGF-R (detectado a través del anticuerpo anti-EGF-R, fluorescencia verde) y EGF-P154 (detectado por el anticuerpo anti-P154, fluorescencia roja) en el citoplasma de células tratadas. En 30 minutos, los complejos de EGF-R/EGF-P154 internalizados fueron detectados en la región perinuclear de las células de glioblastoma tratadas. En contraste, las células tratadas con solamente WHI-P154 no conjugado (Figuras 3B, 3B') no revelaron ninguna redistribución detectable del EGF-R superficial o tinción citoplásmica con el anticuerpo anti-P154 (fluorescencia roja). A las 24 horas (pero no a las 6 o 12 horas), solo se pudieron detectar moléculas de WHI-154 en células tratadas con WHI-154 no conjugado (Figuras 4A, 4A', 4B, 4B'). De esta manera, la conjugación de WHI-P154 a EGF dio como resultado la captación incrementada de este derivado de quinazolina citotóxico a través de células de glioblastoma positivas de EGF-R. Para determinar si el suministro mejorado de WHIP154 a células de glioblastoma a través conjugación con EGF dio como resultado la potenciación de su actividad anti-tumoral, las actividades citotóxicas de EGF-P154 y WHI-P154 no conjugado contra líneas de célula de glioblastoma humanas U373 y U87 fueron analizadas en estudios de respuesta de dosis utilizando ensayos de MTT in vitro, como se describió en el Ejemplo 3. Como se muestra en la Figura 5A, el EGF-P154 aniquiló estas células de glioblastoma en cada uno de los tres experimentos independientes a concentraciones nanomolares con valores medios de IC50 de 813 +.139 nM (Escala: 588-950 nM) para células U373 y 620 + 97 nM (Escala: 487-761 nM) para células U87. Los calores de Ic50 derivados de las curvas de supervivencia de célula mixta fueron de 881 nM para células U373 y 601 nM para células U87. En comparación, WHI-P154 aniquiló células U373 o U87 solamente a concentraciones micromolares. EGF-P154 fue 206 veces más potente que WHI-P154 no conjugado contra células U373 (valores IC50: 167.4 +_ 26.9 µM contra 811 + 139 nM, P>0.003) y 288 veces más potente que WHI-P154 no conjugado contra células U87 (valores IC50: 178.62 + 18.46 µM contra 620 + 97 nM, P<0.001) (Figura 5A). A diferencia de WHI-P154, el cual mostró una toxicidad marcada contra células de leucemia NALM-6 negativas de EGF-R, EGF-P154 produjo citotoxicidad selectiva a líneas de célula de gtioblastoma EGF-R positivas solamente (Figuras 5A y 5B). De esta manera, la conjugación a EGF incrementó la potencia de WHI-P154 contra el glioblastoma humano y al mismo tiempo restringió su citotoxicidad a objetivos positivos EGF-R. A diferencia del conjugado EGF-P154, EGF-GEN, un potente inhibidor de la tirosina-cinasa de EGF-R y EGF-R asociada con PTK de la familia Src, falló para aniquilar células de glioblastoma (Figura 5A). De esta manera, la potente citotoxicidad de EGF-P154 no puede ser explicada a través de las propiedades inhibidoras de tirosina-cinasa de su porción WHI-P154. La tinción de inmunofluorescencia con el anticuerpo anti-a-tubilina y el colorante nuclear TOTO-3 se utilizó en combinación con microscopio de exploración láser confocal para examinar las características morfológicas de las células de glioma U373 tratadas ya sea con EGF o EGF-P154 no conjugado. Como se muestra en las Figuras 6A-6C, después de 24 horas de exposición a 25 µ/ml EGF-P154, (pero 25 µg/ml de EGF no conjugado), la mayoría de las células de glioma mostraron una arquitectura anormal con separación completa de microtúbulos, encogimiento marcado, fragmentación nuclear e incapacidad para adherirse al subestrato. Estos cambios morfológicos en células de glioma tratados con EGF-P154 fueron consistentes con apoptosis. Para confirmar la fragmentación de ADN apoptótico en los núcleos de célula de glioblastoma tratadas con EGF-P154, se utilizó un ensayo de apoptosis y situ, el cual permite la detección de grupos 3'-hidroxilo expuestos en ADN fragmentado a través de marcación de muesca-extremo dUPT mediado por TdT. Como se evidenció a través de las imágenes del microscopio de exploración láser confocal ilustradas en las Figuras 6D y 6C, las células de glioma tratadas con EGF-P154 (pero no tratadas con EGF) examinadas para la incorporación de digoxigenina-dUTP utilizando anti-digoxigenina conjugada con FITC (fluorescencia verde) y contra tinción de yoduro de propidio (fluorescencia roja) mostraron muchos núcleos amarillos apoptóticos con fluorescencia verde y roja superimpuesta a 36 horas después del tratamiento. En resumen, estos datos demuestran una actividad citotóxica específica y mejora de P154 cuando se activó en células tumorales del cerebro a través de la conjugación a EGF.

Ejemplo 5 Actividad Antitumoral de EGF-P154 en un Modelo de Ratón SCID Los efectos antitumorales de EGF-P154 conjugado in vivo se demostraron en un modelo de ratón SCID. Ratones CB.17 SCID desarrollaron rápidamente tumores crecientes después de inoculación subcutánea de 0.5 x 106 U373. La actividad antitumoral in vivo de EGF-P154 en este modelo de xenoinjerto de ratón SCID multiforme de glioblastoma humano, fue examinada.

Mantenimiento de la Colonia de Ratón SCID Los ratones SCID se alojaron en un cuarto libre de patógenos específico ubicado en una instalación interior segura con niveles controlados de temperatura, humedad y ruido. Los ratones SCID fueron alojados en jaulas microaisladoras, las cuales se les colocó el autoclave con comida de roedor. El agua también se colocó en autoclave y fue suplementada con trimetorppma/sulfometaxol, 3 días/semana.

Modelo de Xenoinjerto de Ratón SCID de Glioblastoma Humano Las patas traseras derechas de los ratones CB. 17 SCID fueron inoculadas subcutáneamente (s.c.) con 0.5 x 106 células de glioblastoma humanas U373 en 0.2 ml de PBS. Los ratones SCID atacados con células tumorales del cerebro fueron tratados con EGF-P154 (0.5 mg/kg/dosis o 1 mg/kg/dosis en 0.2 ml de PBS) como dosis diarias i.p. para un tratamiento de 10 días empezando el día de la inoculación de las células de glioblastoma. Los tratamientos diarios con PBS, EGF no conjugado (1 mg/kg/dosis) y WHI-P154 (mg/kg/dosis) fueron utilizados como controles. Los ratones fueron supervisados diariamente para el estado de salud y crecimiento del tumor, y fueron sacrificados si quedaban moribundos, desarrollaban tumores que impidieran su habilidad para obtener comida o agua, al final del período de observación de 3 meses. Los tumores fueron medidos utilizando calibres de Vernier dos veces por semana, y se calcularon los volúmenes del tumor de acuerdo con la siguiente fórmula, (Friedman, S. H., mDolan, M. E., Pegg, A. E., Marcelli, S., Keir, S., Catino, J. J., Binger, D. D., Schold, S. C, Jr., 1995, Cáncer Res., 55:2853-2857): Volumen = Anchura2 * Longitud Para estudios histopatológicos, los tejidos fueron fijados en formalina regulada en su pH neutra al 10%, deshidratados y embebidos en parafina a través de métodos de rutina. Se prepararon portaobjetos de vidrio con secciones de tejido de 6 mieras fijas y se tiñeron con hematoxilina/eosina. Los puntos extremos primarios de interés fueron crecimiento de tumor y resultado de supervivencia libre de tumor. Las estimación del resultado de tabla de vida y comparaciones del resultado entre grupos fue realizada, como se reportó previamente (Waurzyniak y otros, 1997, Clinical Cáncer Research 3:881-890; Anderson, y otros, 1995. Cáncer Res. 55:1321-1327; Uckun y otros, 1997, J. Clin. Oncol. 15:2214-2221).

Resultados El EGF-P154 de quinazolina conjugado significativamente mejoró la supervivencia libre de tumores en una forma dependiente de dosis, cuando se administró 24 horas después de la inoculación de las células tumorales. Las Figuras 7A y 7B muestran el crecimiento de tumor y el resultado de supervivencia libre de tumor de ratones SCID tratados con EGF-p154 (500 µg/kg/día x 10 días o 1 '~'"" mg/kg/día por 10 días), EGF no conjugado (1 mg/kg/día x 10 días), WHI-P154 no conjugado (1 mg/kg/día x 10 días), o PBS después de la inoculación con células de glioblastoma U373. Ninguno de los 15 ratones de control tratados con PBS (N = 5; supervivencia libre de tumor media = 19 días), EGF (N = 5; supervivencia libre de tumor media = 23 días), o WHI-P154 no conjugado (N = 5; supervivencia libre de tumor media = 19 días) permaneció libre de tumor vivo más allá de 33 días (supervivencia libre de tumor media = 19 días) (Figura 7A). Los 5 ratones tratados con EGF-P154 al nivel de dosis de 500 µg/kg/día desarrollaron tumores en 40 días, con una supervivencia libre de tumor media mejorada de 33 días (Figura 7B). Estos tumores fueron mucho más pequeños que aquellos en los ratones de control (Figura 7A). Los tumores alcanzaron un tamaño de 50 mm3 por 37.5 +_ 3.3 días en ratones tratados con PBS, 34.0 + 3.0 días en ratones tratados con EGF y 36.0 +.35.1 días en ratones tratados con WHI-P154. Los tumores que se desarrollaron en ratones tratados con EGP-P154 (500 ug/kg/día x 10 días) alcanzaron un tamaño de tumor de 50 mm3 aproximadamente 11 días posteriores a los tumores en ratones de control tratados con PBS, EGF, o WHI-P154 (47.4 + 7.1 días contra 35.8 = 1.8 días). El tamaño promedio (± SE medio) de tumores a los 20 días y 40 días fueron de 10.2 +_ 1.4 mm3 y 92.3 +_ 6.0 mm3, respectivamente para ratones en los grupos de control (es decir, los grupos combinados de PBS más EGF). En comparación, el tamaño promedio (+_ SE medio) de tumores a los 20 días y 40 días ^^d^dM. ^Ma^Arib^-ttaai-u-iikCiai fue significativamente más pequeño a 1.0 +_ 1.1 mm3 (P = 0.002) y 37.6 + 10.7 mm3 (P = 0.0003) para ratones tratados con EGF-P154 al nivel de dosis de 500 µg/kg/día. Notablemente, el 40% de los ratones tratados durante 10 días consecutivos con 1 mg/kg/día de EGF-P154 permanecieron vivos y libres de tumores detectables durante >58 días (PBS + EGF + WHI-P154 contra EGF-P154, P<0.00001, por la prueba de registro-rango). Los tumores que se desarrollaron en el 60% restante de los ratones no alcanzaron un tamaño de >50 mm3 durante el período de observación de 58 días. De esta manera, EGF-P154 produjo una actividad importante anti- tumoral in vivo a los niveles de dosis no tóxicos aplicados. La incapacidad de 1 mg/kg/día x 10 días del WHI-P154 no conjugado (53.2 nmoles) y EGF no conjugado para conferir supervivencia libre de tumor en esté modelo de ratón SCID en contraste a la potencia de 1 mg/kg/día x 10 días, EGF-P154 (correspondiendo a 2.9 nmoles de WHI-P154) demuestra que la actividad antitumoral in vivo de EGF-P154 no puede ser atribuida a su porción EGF solamente y tampoco esa conjugación a EGF mejora la actividad antitumoral in vivo de WHI-P154 contra células de glioblastoma por >18 veces. En conjunto, los hallazgos de los Ejemplos 3-5 proporcionan evidencia sin precedente que la quinazolina substituida, 3-bromo-4'-hidroxifenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina (WHI-P154), exhibe citotoxicidad importante contra células de glioblastoma humanas y que su actividad antitumoral puede ser substancialmente mejorada a través de la conjugación a EGF como una molécula objetivo. Aunque WHI-P154 es un potente inhibidor de la cinasa de EGF-R así como de tirosina-cinasas de la familia Src su citotoxicidad en células de glioblastoma no puede ser atribuida solamente a sus propiedades inhibidoras de tirosina-cinasa, ya que 4-(3'-bromofenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina (WHI-P79) con actividad inhibidora de PTK igualmente potente, falló para aniquilar células de glioblastoma sensibles a WHI-P154 similarmente, varios inhibidores de PTK capaces de aniquilar células cancerosas de leucemia y de pecho humanas carecieron de citotoxicidad detectable contra células de glioblastoma. Las células de glioblastoma expuestas a WHI-P154 conjugado con EGF sufrieron apoptosis. Aunque EGF fue utilizado para activar WHI-P154 en células de glioblastoma en este estudio, otros agentes biológicos incluyendo diferentes citocinas tales como IGF y anticuerpos reactivos con antígenos asociados con glioblastoma también se espera que sean moléculas objetivo efectivas para este derivado novedoso de quinazolina.

Ejemplo 6 Quinazolinas Substituidas Inhiben la Adhesión de Célula de Glioblastoma Durante el proceso de pasos múltiples de invasión de tejido, las células tumorales inicialmente se adhieren a las proteínas de matriz extracelular a través de receptores de integrina superficiales de célula y después ganan capacidad migratoria para entrar a los tejidos circundantes. Se cree que las proteínas SM tales como laminina, fibronectina y colágeno de tipo IV, juegan un papel importante en la unión y migración de célula tumoral. La laminina, 5 fibronectina y colágeno se han encontrado en la lámina basal de vasos sanguíneos y en los limitantes guales externos en el cerebro que promueven la adhesión e invasión de células tumorales in situ (Carbonetto, S., 1984, Trends Neurosci., 7:382-287-387; Rutka, J. T., Apodaca, G., Stern, R., J. Neurosurg., 69:155-170; Venstrom, K. A. y 10 Reichard, L. F., 1993, FASEB J., 7:996-1003). Los efectos de estas proteínas SM sobre la adhesión de célula de glioblastoma mediada por integrina fueron examinados utilizando cuatro diferentes glioblastomas humanos (U87, U373, T98, y U138) y una línea de célula de meduloblastoma (Daoy). 15 Líneas de Célula Las líneas de célula tumoral de cerebro humanas derivadas de pacientes adultos con glioblastoma, U-87 MG (Cat. #HTB-14), U-118 MG (Cat.#HTB-15), U-138 MG (Cat. #HTB-16), U-373 MG (Cat.#HTB- 20 17). T98-G (Cat.#CRL-1690), y meduloblastoma Daoy (Cat.#HTB- 186), fueron obtenidas de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) y se mantuvieron en un cultivo líquido utilizando DMEM suplementado con suero de bovino fetal al 10% y antibióticos. Se utilizó un medio acondicionado de fibroblasto como una fuente de 25 quimioatrayente en ensayos de invasión in vitro. Se preparó un -*-*— •**"*• -- - -• medio acondicionado como se describió previamente (Albini, A., Iwamoto, Y., Kleinman, H.K., Martin, G.R., Aaronson, S.A., Klozlowski, J.M., y McEwan, R.N., 1987, Cáncer Res., 47:3239-3245). Para la preparación de este medio acondicionado, se desarrollaron fibroblastos embriónicos NIH/3T3 (AATCC cat.#CRL-1658) a una confluencia de un 80% de DMEM suplementado con FBS al 10% y se cultivó durante 24 horas en un medio libre de suero conteniendo 0.5 µg/ml de albuminutas de suero de bovino. Los sobrenadantes del cultivo, se centrifugaron a 1000 x g durante 15 minutos para remover el desperdicio celular y se utilizaron como un medio acondicionado.

Ensayos de Adhesión Se realizaron ensayos de adhesión in vitro para (a) estudiar las propiedades adhesivas de línea de base de varias líneas de célula de glioblastoma y (b) evaluar los efectos de los derivados de quinazolina sobre las propiedades adhesivas de células de glioblastoma. Las placas para los ensayos de adhesión fueron precubiertas con las proteínas de matriz extra celular, laminina, fibronectina o colágeno tipo IV (cada una a una concentración final de 1 µg/ml en PBS) durante la noche a 4°C, y se secaron. En el día del experimento, las cavidades fueron rehidratadas y bloqueadas con albúmina de suero de bovino al 10% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente y se utilizaron para los ensayos de adhesión, como se describe mas adelante.

Para estudiar los efectos de derivados de quinazolina en la adhesión de célula de glioblastoma, se incubaron células exponencialmente en desarrollo en DMEM con los compuestos WHI- P79, WHI-P97, WHI-P31, WHI-154, WHI-P258 o genisteína a 5 concentraciones que varían de 1 µM a 100µM durante 16 horas en una atmósfera humedecida con CO2 al 5%. Se incluyó DMSO (0.1%) como un control de vehículo. Después del tratamiento, las células fueron separadas de los matraces con tripsina al 0.05% (Life Technologies) se volvieron a suspender en DMEM, se incubaron a 10 37°C durante 2 horas para permitir que se recuperaran de la tensión de tripsinización y se examinaron para su capacidad para adherirse a placas precubiertas con proteínas ECM. En ensayos de adhesión, las células fueron centrifugadas, lavadas dos veces con DMEM libre de suero, contadas y se volvieron 15 a suspender en DMEM libre de suero a una concentración final de 2.5 x 105 células/ml. Se agregaron 100 µl de la suspensión de células conteniendo 2.5 x 104 células, a cada cavidad, y las células se dejaron adherir durante 1 hora a 37°C en una atmósfera humedecida con CO2 al 5%. La fracción adherente fue cuantificada utilizando 20 ensayos de MTT bromuro de (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5- difeniltetrazolio). En resumen, después de lavar las células, se agregaron 10 µl de MTT (0.5 mg/ml de concentración final) (Boehringer Mannheim Corp., Indianapolis, IN) a cada cavidad y las placas fueron incubadas a 37°C durante 4 horas para permitir que 25 MTT formara cristales de formazán reaccionando con células ?Í??¡ ?t¡s^a m?¿f metabólicamente activas. Los cristales de formazán fueron solubilizados durante la noche a 37°C en una solución conteniendo 10% SDS en 0.01 M HCl. La absorbancia de cada cavidad fue medida en un lector de microplaca (Labsystems) a 540 nm y una longitud de onda de referencia de 690 nm. Para traducir los valores de OD540 al número de células en cada cavidad, los valores de OD5 0 fueron comparados con aquellos en curvas estándares de OD5 0 contra número de célula generadas para cada línea de célula. Las fracciones adherentes de las células tratadas con derivados de quinazolina se compararon con aquellas de células de control tratadas con DMSO y el porcentaje de inhibición de adhesión fue determinado utilizando la siguiente fórmula: % de inhibición = 100 * 1 Fracción adherente de células tratadas con fármaco Fracción adherente de células de control Cada condición de tratamiento fue evaluada por duplicado en 3 experimentos independientes. Los valore de IC50 fueron calculados a través de análisis de regresión no lineal.

Resultados Como se muestra en la Figura 8, una fracción significativamente mayor de células de glioblastoma y de meduloblastoma se adhirieron a placas recubiertas con laminina, colágeno tipo IV o fibronectina que a placas de control no revestidas o revestidas con pol i-L-lisi na . De las cuatro líneas de célula de glioblastoma examinadas, las células U373 fueron las más adhesivas, por lo tanto, las células U373 fueron utilizadas en experimentos subsecuentes que fueron diseñados para examinar los efectos de varios derivados de qinazolina en la adhesión de célula de glioblastoma mediada por integrina. Como se muestra en las Figuras 9A-9D, el derivado novedoso de quinazolina 4-(-3'-Bromo-4'-hidroxifenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina (WHI-P154) (pero no el compuesto de origen no substituido, WHI-P258) inhibió la adhesión de células U373 a placas revestidas con laminina, fibronectina y colágeno, en una forma dependiente de dosis que representa valores de IC50 de 29.8 + 3.1 µM (N = 3) para adhesión a placas cubiertas con fibronectina, 36.1±3.5 µM (N = 3) para adhesión a placas cubiertas con laminina, y 4.2±2.5 µM (N = 3) para adhesión a placas cubiertas con colágeno. La substitución 3'-bromo sobre el anillo fenilo probablemente contribuye a la actividad de WHI-P154, ya que 4-(4'-hidroxilfenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina [WHI-P131] que carece de este substituyente de bromo fue menos potente que WHI-P154 (todos los valores de IC50:>50 µM). El substituyente 4'-hidroxilo sobre el anillo fenilo también contribuyó a la actividad inhibidora de WHI-P154 ya que 4-(3'-Bromofenil)-amino-6,7-dimetoxiquinazolina [WHI-P79] el cual difiere de WHI-P154 solamente por la falta del grupo 4'-hidroxilo sobre el anillo fenilo fue menos potente (todos los valores de IC50:>50 µM). La introducción de un segundo grupo de bromo en la posición 5' del anillo de fenilo no dio como resultado una actividad inhibidora mejorada:4-(3',5'-Dibromo-4'-hidroxifenil)-amino-6,7- dimetoxiquinazolina [WHI-P97] no fue más potente que WHI-P154.

Ejemplo 7 Efecto de WHI-P154 en adhesión de célula inducida por EGF. Además de la unión de receptores de superficie de célula a proteínas ECM y agrupación de integrina, también se reguló la formación de placas de adhesión focal a través de la activación de cinasa de adhesión focal mediante ciertos factores de crecimiento después de la unión a sus receptores (Hatai. M., Hashi., Mogi, A., Soga, H., Yokota, J., Yaoi, Y., 1994. FEBS Lett., 350:113-116; Ouwens, D.M., Mikkers, H.M., van der Zon, G.C., Stein Gerlach, M., Ullrich, A., Maasen, J.A., 1996, Biochem J., 318:609-614; Scaller, M.D., Parsons, J.T., Curr. Opin. Cell; Zachary, I., 1997, Int. J. Biochem., Cell Biol., 29:929-934). El EGF es un mitógeno potente para varias células tumorales en el cerebro que expresa el receptor EGF y también muestra la modulación de la expresión de la superficie de célula. Para estudiar los efectos de los derivados de quinazolina sobre la adhesión de célula estimulada por EGF, se incubaron células tripsinizadas y recuperadas con concentraciones variables, que van de 1 µM a 50 µM de quinazolinas durante 4 horas a 37°C, después se estimularon con 250 ng/ml de EGF y se examinaron para su habilidad para adherirse a placas cubiertas con poli-L-lisina. Para los experimentos de estimulación de EGF, las células fueron colocadas en placas en presencia de 250 ng/ml de EGF y se dejaron adherir durante 1 hora. Las células no adherentes fueron removidas lavando moderadamente las células con PBS y después la fracción adherente fue cuantificada como se describió en el Ejemplo 6. La estimulación de células U373 con EGF significativamente incrementó la fracción capaz de adherirse a placas cubiertas con poli-L-lisina a partir de 33.2 ± 5.2% a 58.48 ± 4.7% (P<0.02). Un pretratamiento de 4 horas U373 con WHI-P154 no solo previno completamente la adhesión inducida por EGF sino que también redujo la fracción adhesiva de células U373 en una forma dependiente de dosis muy por abajo de los niveles de la línea de base a pesar de la presencia de EGF (Figura 10). Se observaron efectos inhibidores similares, pero menos potentes, cuando las células fueron pretratadas con WHI-P131.

Ejemplo 8 Quinazolinas substituidas inhiben la invasión de célula de glioblastoma Invasión de Célula de Glioblastoma a través de la Matriz de Matrigel El aspecto invasivo in vitro de células de glioblastoma fue analizado utilizando un método previamente publicado que emplea cámaras de cultivo de célula de trans-cavidad, de 24 cavidades Costar cubiertas con Matrigel ("Cámaras de Boyden") con insertos de filtro de policarbonato con un tamaño de poro de 8.0 µM (Albini, A., Iwamoto, Y., Kleinman, H.K., Martin, G.R., Aaronson, S.A., Kozlowski, J.M. y Me. Ewan, R.N., 1987, Cáncer Res., 47:3239-3245). Los filtros de cámara fueron cubiertos con 50 µg/ml de la matriz Matrigel, se incubaron durante la noche a temperatura ambiente bajo una cubierta de flujo laminar y se almacenaron a 4°C. la matriz de Matrigel se hizo de varios componentes de la matriz extracelular (ECM), incluyendo, colágenos, laminina y proteoglicanos. En el día de experimento, los insertos cubiertos fueron rehidratados con 0.5 ml de DMEM libre de suero conteniendo albúmina de suero de bovino al 0.1% durante 1-2 horas. Para estudiar los efectos de los derivados de quinazolina en el aspecto invasivo de células de glioblastoma, se incubaron células exponencialmente en desarrollo durante la noche con WHI-P97,WHI-P131 y WHI-P154 a varias concentraciones variando de 1 µM a 50 µM. Las células fueron tripsinizadas, lavadas dos veces con BSA, conteniendo DMEM libre de suero, se contaron y se volvieron a suspender a 1 x 105 células/ml. Se agregaron 0.5 ml de suspensión de célula conteniendo 5 x 104 células en un medio DMEM libre de suero conteniendo compuestos de quinazolina o vehículo, a los insertos de filtro cubiertos con Matrigel y rehidratados. Después, se colocaron 750 µl de un medio acondicionado de fibroblasto NIH como un quimioatrayente en placas de 24 cavidades y los insertos fueron colocados en las cavidades y se incubaron a 37°C durante 48 horas. Después del periodo de incubación, los insertos de filtro fueron removidos, el medio fue decantado y las células sobre el lado superior del filtro que no emigraron fueron raspadas con un aplicador con punta de algodón. Las células invasivas que emigran al lado inferior del filtro se fijaron, se tiñeron con soluciones Hema-3 y se contaron bajo el microscopio. Se contaron de 5 a 10 campos aleatorios por filtro para determinar los valores medios (±SE) para la fracción invasiva. Las fracciones invasivas de células tratadas con derivados de quinazolina fueron comparadas con aquellas de células de control tratadas con DMSO y el porcentaje de inhibición de aspecto invasivo fue determinado utilizando la fórmula: 10 % de inhibición=100 [F racción adherente de células tratadas con fármaco! Fracción adherente de células de control 15 Cada condición de tratamiento fue evaluada por duplicado en 3 experimentos independientes. Los valores de IC50 fueron calculados a través de análisis de regresión no lineal utilizando software Graphpad Prisin Versión 2.0 (Graphpad Software Inc., San Diego, CA). 20 Resultados Como se muestra en la Figura 11, las células de glioblastoma U373 fueron altamente invasivas en cámaras Boyden cubiertas con Matrigel. WHI-P154 inhibió la invasión de células U373 a través de 25 la matriz de Matrigel en una forma dependiente de dosis y fue mas potente que WHI-P131 o WHI-P97 (Figura 11). Los valores medios de IC50 obtenidos de tres elementos independientes fueron 10.59 ± 1.8 µM (escala:9.57-11.64 µM) para WHI-P97. 7.07± 1.8 µM (escala: HüaaUU^iiMtiÉte *^ 5.08-8.59 µM) para WHI-P131, y 4.46 ± 0.8 µM (escala: 3.53-5.01) para WHI-P154. Los valores de IC50 derivados de los valores promedio de los tres experimentos fueron 9.58 µM para WHI-P97, 7.95 µM para WHI-P131 y 5.2 µM para WHI-P154.

Ejemplo 9 Quinazolinas Substituidas Inhiben Placas de Adhesión Focales y Polimerización de Actina La organización citoesquelética y adhesión celular son dos 10 determinantes cruciales de la movilidad de célula y estos procesos son controlados a través de la coordinación compleja de la redisposición citoesquelética de actina y cambios en adhesiones focales (Symons. M.H., y Mitchison, T.J., 1991, J. Cell Biol., 114:503-513; Wang, Y.L., 1984, J. Cell Biol., 99:1478-1485; 15 Bretcher, M.S., 1996, Cell, 87:601-606; Machesky, L.M., y Hall, A., 1997, J. Cell Biol., 138:913-926). La polimarización de filamentos de actina, formación de lamelopodíos y filapodios en los bordes anteriores son esenciales para la unión y separación de células de la ECM y juegan papeles pivotales en la movilidad y migración de 20 células (Burridge, K., Fath, K., Kelly, G., y Turner, C, 1988, Ann. Rev. Cell Biol., 4:487-525; Burridge, K., Nuckolls, C, Otey, F., Pavalko, K., Simón, K., y Taurner, C, 1990, Cell Differ, Dev., 32:337-342). La formación de placas de adhesión también es importante en este proceso, ya que las fibras de actina polimerizadas 25 son atadas y enlazadas a la ECM en estas uniones y el movimiento MaiM^ifci^MM de la célula es dependiente de la resistencia de estas adhesiones focales. Se cree que el nivel de resistencia adhesiva celular es necesario para la migración de células (Burridge, K., Fath, K., Kelly, G., y Turner, C, 1988, Ann. Rev. Cell Biol., 4:487-525; Burridge, K., y Fath, K., 1989, Bioessays, 10:104-108; Schwarzbauer, J E., 1997, Curr. Biol., 7:292-294). Las adhesiones que son muy fuertes pueden dañar la movilidad de la célula y las adhesiones que son demasiado débiles pueden no proporcionar un momento suficiente para mover a la célula hacia adelante. La adhesión de célula inducida por EGF es producida a través de la formación mejorada de placas de adhesión focales de FAK+/Actina + , la cual es activada por la redistribución de FAK activado. La formación inducida por EGF de adhesiones focales en células U373 carentes de suero fue examinada a través de inmunofluorescencia de colores múltiples y microscopio de exploración láser con focal utilizando un anticuerpo anti-FAK monoclonal de murino (fluorescencia verde) y faloidina marcada con rodamina que tiñe actina (fluorescencia roja). Para evaluar el proceso de polimerización de actina, las células colocadas en placas sobre placas cubiertas con poli-L-lisina primero fueron carentes de suero para despolimerizar las fibras de tensión de actina. Subsecuentemente, las células fueron estimuladas con suero de bovino fetal para inducir de nuevo la formación de fibra de tensión.

Microscopía de Fluorescencia Se utilizó inmunofluorescencia para estudiar los efectos de los derivados de quinazolina sobre la formación de placas de adhesión focales y polimerización de actina. Las células (obtenidas y 5 mantenidas como se describió en el Ejemplo 6) fueron colocadas sobre placas en cajas de Petri de 35 mm con fondo de vidrio cubiertas con poli-L-lisina (Mattek Corp. Ashland, MA) o cubreobjetos cubiertos con fibronectina y mantenidos en DMEM suplementado con FBS al 10% durante 24 horas. El medio fue removido y las células se 10 lavaron dos veces con DMEM libre de suero y se incubaron en el mismo medio durante 16 horas. Después de esta falta de suero las células fueron incubadas con concentraciones variables de WHI- P131, WHI-P154 o vehículo (DMSO al 0.1%) durante 4-16 horas a 37°C y después se estimularon ya sean con 250 ng/ml de EGF 15 recombinante humano o FBS al 10% durante 15, 30, 60, 120 o 180 minutos a 37°C. Al final de la estimulación de EGF, las células fueron lavadas con PBS, fijadas en paraformaldehído al 2% en PBS (pH 7.2), permeabilizadas y se bloquearon los sitios de unión no específicos con BSA al 1.5% y Tritón X-100 al 0.1% en PBS durante 20 30 minutos. Para detectar las placas de adhesión focales y actina, las células fueron incubadas con una mezcla de un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra la cinasa de adhesión focal a 1:100 y faloidina marcada con rodamina a una dilución de 1:1000 25 durante 1 hora a temperatura ambiente. Las células se lavaron con * - •*» -• PBS y se incubaron con IgG de antiratón de FITC conjugado (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) durante 1 hora (dilución final 1:40). Las células se lavaron con PBS, se contratiñeron con TOTO-3 (Molecular Probes, INC) a una dilución de 1:1000 durante 10 5 minutos a temperatura ambiente, se lavaron de nuevo con PBS y los cubreobjetos fueron contados con Vectashield (Vector Labs, Burlíngame, CA). Subsecuentemente, las células fueron vistas con un microscopio de exploración láser con focal (Bio-Rad MRC 1024) montado en un microscopio recto Nikon Lanhophot. Las imágenes 10 digitales fueron grabadas en un disco Jaz y procesadas con software Adobe Photoshop (Adobe systems, Mountain View, CA), Prism software. Cada experimento fue repetido tres veces.

Resultados 15 Como se muestra en las Figuras 12A, 12A', 12B, 12B', 12C, 12C, una estimulación de dos horas de células U373 carentes de suero con EGF dio como resultado una reducción importante de la tinción difusa perinuclear/FAK citoplásmico acompañada por la emergencia de placas de adhesión focales con tinción FAK de alta 20 intensidad (Fluorescencia verde brillante). Estas placas de adhesión FAK+ mostraron una fuerte tinción de faloidina (Fluorescencia rojo brillante) confirmando la colocalización de actina. Notablemente, la preincubación de células U373 con WHI-P154 (Figura 12B) o WHI- P131 (datos no mostrados) a una concentración de 10µM evitó la 25 formación de placas de adhesión focales de FAK+/Actina+ después de ^^¡^^^^^^^^^^^^^ la estimulación con EGF. Para evaluar el proceso de polimerización de actina, las células colocadas en placas sobre placas cubiertas con poli-L-lisina primero fueron desprovistas de suero para despolimerizar las fibras de tensión de actina. Subsecuentemente, las células fueron estimuladas con suero de bovino fetal para inducir de nuevo la formación de fibra de tensión. Como se muestra en las Figuras 13A-C, una estimulación de dos horas de células U373 carentes de suero con suero de bovino fetal (10% v/v) dio como resultado un incremento marcado en fibras de tensión de actina polimerizada. El pretratamiento de células U373 carente de suero con WHI-P154 inhibió la polimerización de actina inducida por suero (Figura 13C). Se obtuvieron resultados similares con WHI-P131 pero no con el compuesto de dimetoxiquinazolina no substituido WHI-P258 (datos no mostrados). En resumen, los datos provistos en los Ejemplos 6-9 demuestran la efectividad de las quinazolinas substituidas en la inhibición de adhesión y migración de célula de glioblastoma, factores clave para la metástasis de célula tumoral. Los agentes inhibidores mas potentes fueron WHI-P154 y WHI-P131. Ambos compuestos inhibieron la adhesión y migración a concentraciones micromolares. Una red compleja de moléculas intracelulares incluyendo tirosina-cinasas de receptor y tirosina-cinasas de la familia Src en cooperación con varios factores intracelulares tale como el subestrato a los cuales las células se adhieren y factores externos, regula la adhesión y movilidad de célula (Finchman, V.J., y Frame, M.C., 1998, EMBO J. , 17:81 -92). La activación de receptores de adhesión de la familia de integrina después de la unión a proteínas de matriz extracelular específicas ha mostrado mejorar la fosforilación de integrinas y la activación de varias proteínas de señalización intracelulares incluyendo la cinasa de proteína activada por mitógeno, FAK, tirosina-cinasas de la familia Src, así como p130cas, talina, paxilina y contartina, las cuales fueron identificadas como substratos para ia tirosina-cinasa de la familia Src (Cobb, B.s., Schaller, M.D., Leu. T.H., y Parsons, J.T., 1994, Mol Cell Biol., 14:147-155; Chen, Q., Lin, T.H., Der, C.J., Juliano, R.L., 1996, J. Biol. Chem., 271 : 18122-18127;Klemke, R.L., Cai, S., Gianniní, A.L., Gallagher, P.J., Lanerolle, P.D., y Cheresh, D.A., 1997. J. Cell Biol., 137:481-492; Petch, L.A., Bockholt, S.M., Bouton, A., Parsons, J.T., Burridge, K., 1995, J. Cell Sci., 108:1371-1379; Chrzanowska- Wodnicka, M., y Burridge. K., 1996, J. Cell Biol., 133(6): 1403-15; Miyamoto, S., Akiyama, S.K., Yamada, K.M., 1995, Science, 267:883-5; Miyamoto. S., Teramoto, H., Gutkind, J.S., y Yamada, K.M. 1996, J. Cell Biol., 135:1633-1642; Chen, H.C., Appedu. P.A., Parsons. J.T., Hildebrand, J.D., Schaller, M.D., y Guan, J.L., 1995, J. Biol. Chem. 1, 16995-16999). Subsecuentemente, la adhesión de célula es reforzada por la redistribición de cinasa Src activada y la cinasa de adhesión focal a adhesiones focales, reclutamiento y agregación de proteínas intracelulares activadas tales como paxilina, talina, viniculina y agrupación de integrinas (Burridge, K., Fath , K., Kelly, G., y Turner, C, 1988. Ann. Rev. Cell Biol., 4:487-525; Burridge, K., y Fath, K., 1989, Bioessays, 10:104-108; Finchman, V.J., y Frame, M-C, 1998, EMBO J., 17:81-92). FAK también se activa a través de la unión de ciertos factores de crecimiento a sus receptores en un mecanismo que es dependiente de la activación de integrina (Hatai, M., Hashí, H., Mogi, A., Soga, H., Yokota, J., Yaoi, Y., 1994, FEBS Lett., 350:113-116; Ouwens, D.M., Mikkers, H.M., van der Zon, G.C., Stein Gerlach, M., Ullrich, A., Maasen, J.A., 1996, Biochem J., 318:609-614). En experimentos no mostrados aquí, se encontró WHI-P154 es un potente inhibidor de la tirosina-cinasa de EGFR así como de la tirosina-cinasas de la familia Src (Liu y Uckun, manuscrito en preparación). Por lo tanto, inicialmente se postuló que los efectos de WHI-P154 en células de glioblastoma se deben a sus propiedades inhibidoras de tirosina-cinasa. Sorprendentemente, sin embargo, WHI-P79 y WHI-P131, los cuales son inhibidores igualmente potentes de EGF-R y tirosina-cinasas de la familia Src, no fueron tan efectivos como WHI-P154 y la ginesteína de inhibidor de tirosina-cinasa de amplio espectro no afectó la adhesión y movilidad de la célula de glioblastoma a concentraciones que anulan la actividad enzimática de la cinasa EGF-R y la tirosina-cinasas de la familia Src. De esta manera, los efectos de WHI-P154 sobre células U373 no pueden ser explicados solamente a través de sus propiedades inhibidoras de tirosina-cinasa. aMUH Ejemplo 10 WHI-P154 Inhibe la Migración de Célula de Glioblastoma de Esferoides Los esferoides de glioblastoma U373 con un diámetro de 200 a 400 micrómetros se trataron con WHI-P154 en DMSO al 0.1% a concentraciones variables. Las células se incubaron con el inhibidor o con DMSO de control en ausencia del compuesto inhibidor durante 2 horas, y después se transfirieron a cubreobjetos cubiertos con fibronectina. Los esferoides después fueron incubados en DMEM conteniendo WHI-P154 a 37°C durante 48 horas. Como se muestra en ias Figuras 14A-14D, el tratamiento de esferoides de glioblastoma con WHI-P154 significativamente inhibió la migración de célula del esferoide según comparado con el control no tratado y en una forma dependiente de dosis. La Figura muestra los siguientes tratamientos de dosis: A: control, B: 2.5 µM; C: 4.5 µM; y D: 10 µM.

Ejemplo 11 Actividad Citotóxica de WHI-P292 El compuesto novedoso WHI-P292 fue analizado para actividad citotóxica en el ensayo de supervivencia de célula MTT como se describió anteriormente en el Ejemplo 3. Como se muestra en la Figura 15, este compuesto demostró una potente actividad citotóxica contra células de glioblastoma, con un IC50 de 38.22 µM. Todas las publicaciones, patentes y documentos de patente aquí descritos son incorporados aquí por referencia en su totalidad. La invención aquí descrita puede ser modificada para incluir modalidades alternativas. Todas estas alternativas obvias están dentro del espíritu y alcance de la invención, como se reclama a continuación. "*-*"""- '--*•*

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que tiene la fórmula: Br y. -OH HN-

2. Un compuesto que tiene la fórmula estructural: 10

3. Un compuesto que tiene la fórmula estructural: 15

4. Un compuesto que tiene la fórmula estructural:

5. Una composición que comprende el compuesto de acuerdo con la reivindicación 1 y un vehículo isotónico.

6. Una composición que comprende el compuesto de acuerdo con la reivindicación 2 y un vehículo isotónico.

7. Una composición que comprende el compuesto de acuerdo con la reivindicación 3 y un vehículo isotónico.

8. Una composición que comprende el compuesto de acuerdo con la reivindicación 4 y un vehículo isotónico.

9. Un método para inducir apoptosis de células tumorales en el cerebro, dicho método comprende poner en contacto las células tumorales del cerebro con una cantidad de inducción de apoptosis efectiva de un compuesto de la fórmula: en donde X se selecciona del grupo que consiste de HN, RuN, CH2, y RnCH; Rn es H, alquilo que tiene hasta cuatro átomos de carbono, o acilo, en donde acilo es C(OR) y R es H o alquilo que tiene hasta cuatro átomos de carbono; 5 Ri es halógeno; R2 es OH; Re, R7 y Re son iguales o diferentes y cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, OH, SH, NH2, NO2, halógeno, alcoxi que tiene hasta cuatro átomos de carbono, alquiltio

10 que tiene hasta cuatro átomos de carbono, y acilo, en donde acilo es -C(OR) y R es H o alquilo teniendo hasta cuatro átomos de carbono; y R9 y R10 son iguales o diferentes y cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alquilo teniendo 15 hasta cuatro átomos de carbono y acilo, en donde el acilo es -C(OR) y R es H o alquilo teniendo hasta cuatro átomos de carbono, o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo. 10. El método de acuerdo con la reivindicación 9, en donde X es HN. 20

11. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el compuesto tiene la fórmula: Br •u ^Miau^i-í-Éj-h

12. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el compuesto tiene la fórmula:

13. El método de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el compuesto tiene la fórmula:

14. Un método para prevenir la adhesión o migración de células tumorales en el cerebro, dicho método comprende poner en contacto las células tumorales del cerebro con un compuesto que comprende la fórmula: en donde X se selecciona del grupo que consiste de HN, RnN, CH2, y RnCH; Rn es H, alquilo que tiene hasta cuatro átomos de carbono, o acilo, en donde acilo es C(OR) y R es H o alquilo que tiene hasta cuatro átomos de carbono; R-i es halógeno; R2 es OH; R6, R7 y Re son iguales o diferentes y cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, OH, SH, NH2, NO2, halógeno, alcoxi que tiene hasta cuatro átomos de carbono, alquiltio que tiene hasta cuatro átomos de carbono, y acilo, en donde acilo es -C(OR) y R es H o alquilo teniendo hasta cuatro átomos de carbono; y R9 y R10 son iguales o diferentes y cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alquilo teniendo hasta cuatro átomos de carbono y acilo, en donde el acilo es -C(OR) y R es H o alquilo teniendo hasta cuatro átomos de carbono, o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo.

15. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde X es HN.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el compuesto tiene la fórmula: Br

17. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el compuesto tiene la fórmula:

18. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el compuesto tiene la fórmula: - - "»-' -t"-*®®^"— --

19. Un método para inducir apoptosis de células tumorales en el cerebro, dicho método comprende poner en contacto las células tumorales en el cerebro con una cantidad efectiva de inducción de apoptosis de un compuesto que comprende las fórmulas: 10 en donde X se selecciona del grupo que consiste de HN, RnN, CH2, y RnCH; Rn es H, alquilo que tiene hasta cuatro átomos de carbono, o acilo, en donde acilo es C(OR) y R es H o alquilo que tiene hasta cuatro átomos de carbono; son iguales o diferentes y cada uno se 15 selecciona independientemente del grupo que consiste de H, OH, SH, NH2, NO2, halógeno, alcoxi que tiene hasta cuatro átomos de carbono, alquiltio que tiene hasta cuatro átomos de carbono, y aciio, MuMHÜÉ^MaMía en donde acilo es -C(OR) y R es H o alquilo teniendo hasta cuatro átomos de carbono; y R6, R7 y Re son iguales o diferentes y cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, OH, SH, NH2, NO2, halógeno, alcoxi que tiene hasta cuatro átomos de carbono, alquiltio que tiene hasta cuatro átomos de carbono, y acilo, en donde acilo es -C(OR) y R es H o alquilo teniendo hasta cuatro átomos de carbono; y R9 y R10 son iguales o diferentes y cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alquilo teniendo hasta cuatro átomos de carbono, y acilo, en donde el acilo es C(OR) y R es H o alquilo teniendo hasta cuatro átomos de carbono, o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde X es NH.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el compuesto tiene la fórmula:

22. Un método para evitar la adhesión o migración de células tumorales en el cerebro, dicho método comprendiendo poner en contacto las células tumorales en el cerebro con un compuesto que comprende las fórmulas: en donde X se selecciona del grupo que consiste de HN, RnN, CH2, y RnCH; Rn es H, alquilo que tiene hasta cuatro átomos de carbono, o 10 acilo, en donde acilo es -C(OR) y R es H o alquilo que tiene hasta cuatro átomos de carbono; son iguales o diferentes y cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, OH, SH, NH2, NO2, halógeno, alcoxi que tiene hasta cuatro átomos de carbono, alquiltio que tiene hasta cuatro átomos de carbono, y acilo, 15 en donde acilo es -C(OR) y R es H o alquilo teniendo hasta cuatro átomos de carbono; y R6, R7 y Re son iguales o diferentes y cada uno se selecciona ^^^Mfa ^ independientemente del grupo que consiste de H, OH, SH, NH2, NO2, halógeno, alcoxi que tiene hasta cuatro átomos de carbono, alq ui It io que tiene hasta cuatro átomos de carbono, y acilo, en donde acilo es -C(OR) y R es H o alquilo teniendo hasta cuatro átomos de carbono; y R9 y R10 son iguales o diferentes y cada uno se selecciona independientemente del grupo que consiste de H, alquilo teniendo hasta cuatro átomos de carbono, y acilo, en donde el acilo es -C(OR) y R es H o alquilo teniendo hasta cuatro átomos de carbono, 10 o una sal de adición de ácido farmacéuticamente aceptable del mismo.

23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde X es NH.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde 15 el compuesto tiene la fórmula: 20