MXPA00011770A - Inhibidores de cinasas de proteina de 2-indolinona sustituida por pirrol - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a novedosos compuestos de 2-indolinona sustituida por pirrol, y a sales fisiológicamente aceptables y profármacos de los mismos, que modulan la actividad de las cinasa de proteína, y por consiguiente, se espera que seanútiles en la prevención y el tratamiento de desórdenes celulares relacionados con cinasa de proteína , tales como cáncer.

Description

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INHIBIDORES DE CINASAS DE PROTEINA DE 2-INDOLINONA SUSTITUIDA POR PIRROL SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud está relacionada con, y reivindica prioridad de, la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos de Norteamérica con Número de Serie 60/087,310, presentada el 29 de mayo de 1998, y la Solicitud de Patente 10 Provisional de los Estados Unidos de Norteamérica con número de serie 60/116,106, presentada el 15 de enero de 1999, ambas de las cuales se incorporan como referencia como si se estipularan completamente en la presente.

INTRODUCCIÓN La presente invención se refiere en general a química orgánica, bioquímica, farmacología y medicina. De una manera más particular, se refiere a novedosos compuestos de 2- indolinona sustituida por pirrol, y sus sales fisiológicamente aceptables y profármacos, que modulan la actividad de las cinasas de proteína ("PKs"), y por lo tanto, se espera que exhiban un efecto saludable contra desórdenes relacionados con la actividad anormal de la cinasa de proteína.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Lo siguiente se ofrece solamente como información de >-»--»"*- ----" * ¿? •*» 2 antecedentes, y no se admite como técnica anterior para la presente invención. Las cinasas de proteína son enzimas que catalizan la fosforilación de los grupos hidroxilo sobre los residuos de 5 tirosina, serina y treonina de las proteínas. Las consecuencias de esta actividad aparentemente simple son asombrosas: crecimiento celular, diferenciación y proliferación, es decir, virtualmente todos los aspectos de la vida celular de una manera ó de otra dependen de la actividad de la cinasa de proteína. Además, la actividad anormal de la cinasa de proteína se ha relacionado con una gran cantidad de desórdenes, desde enfermedades que relativamente no amenazan la vida, tales como psoriasis, hasta enfermedades extremadamente virulentas, tales como glioblastoma (cáncer del cerebro) . 15 Las cinasas de proteina se pueden descomponer convenientemente en dos clases, las cinasas de proteína tirosina (PTKs) , y las cinasas de serina-treonina (STKs) . Uno de los principales aspectos de la actividad de PTK es su involucramiento con los receptores del factor de crecimiento. Los receptores del factor de crecimiento son proteínas de superficie celular. Cuando se enlazan con un ligando de factor de crecimiento, los receptores de factor de crecimiento se convierten a una forma activa que interactúa con las proteinas sobre la superficie interna de una membrana celular. Esto conduce a la fosforilación sobre los residuos de Z5« 3 tirosina del receptor y otras proteínas, y a la formación adentro de la célula de complejos con una variedad de moléculas de señalización citoplásmica que, a su vez, efectúan numerosas respuestas celulares, tales como división celular 5 (proliferación) , diferenciación celular, crecimiento celular, expresión de efectos metabólicos hacia el m cro-medioambiente extracelular, etc. Para una discusión más completa, ver Schlessinger y Ullrich, Neuron, 9:303-391 (1992), que se incorpora como referencia, incluyendo los dibujos, como si se estipulara completamente en la presente. Los receptores del factor de crecimiento con actividad de PTK se conocen como cinasas de tirosina receptoras ("RTKs"). Comprenden una gran familia de receptores transmembrana con diversa actividad biológica. En el presente, se han identificado cuando menos diecinueve (19) subfamilias distintas de RTKs. Un ejemplo de éstas, es la subfamilia designada como las RTKs "HER" , que incluyen EGFR (receptor del factor de crecimiento epitelial), HER2 , HER3 y HER4. Estas RTKs consisten en un dominio de enlace de ligando glicosilado extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio catalítico citoplásmico intracelular que puede fosforilar los residuos de tirosina sobre las proteínas. Otra subfamilia de RTK consiste en el receptor de insulina (IR) , el receptor del factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-1R), y el receptor relacionado con el receptor s. de insulina (IRR) . IR e IGF-1R interactúan con la insulina, IGF-I e IGF-II forman un heteroterámero de dos subunidades y dos subunidades ß glicosiladas enteramente extracelulares que cruzan la membrana celular y que contienen el dominio de cinasa de tirosina. Una tercera subfamilia de RTK es referida como el grupo del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas ("PDGFR"), que incluye PDGFR , PDGFRß, CASFIR, c-kit y c-fms. Estos receptores consisten en dominios extracelulares glicosilados compuestos de números variables de ciclos de tipo inmunoglobulina y un dominio intracelular, en donde el dominio de cinasa de tirosina está interrumpido por secuencias de aminoácidos no relacionadas. Otro grupo que, debido a su similitud con la subfamilia PDGFR, algunas veces es asumido como el último grupo, es la subfamilia del receptor de cinasa de hígado de feto ("flk") . Se cree que este grupo está formado de cinasa de higado fetal-1 del receptor de dominio de Inserto de cinasa (KDR/FLK-1) , flk-lR, flk-4 y cinasa de tirosina 1 tipo fms-1 (flt-1) . Un miembro adicional de la familia del receptor del factor de crecimiento de cinasa de tirosina es el subgrupo del receptor factor de crecimiento de fibroblastos ("FGF") . Este grupo consiste en cuatro receptores, FGR1-4, y siete ligandos, FGF1-7. Aunque todavía no están bien definidos, parece que los % receptores consisten en un dominio extracelular glicosilado que contiene un número variable de ciclos de tipo inmunoglobina, y un dominio intracelular en donde la secuencia de cinasa de tirosina esté interrumpida por regiones de secuencias de 5 aminoácidos no relacionadas. Todavía otro miembro de la familia del receptor de factor de crecimiento de cinasa de tirosina es el subgrupo del receptor de factor de crecimiento endotelial vascular ("VEGF") . VEGF es una glicoproteína dimérica similar a PDGF, pero tiene diferentes funciones biológicas y especificidad de células blanco en vivo. En particular, actualmente se piensa que el VEGF tiene un papel esencial en la vasculogénesis y en la angiogénesis. Un listado más completo de las subfamilias RTK conocidas se describe en Plowman y colaboradores, DN&P, 7(6):334-339 (1994), que se incorpora como referencia, incluyendo cualesquiera dibujos, como si estipulara completamente en la presente. En adición a las RTKs, también existe una familia de PTKs enteramente intracelulares, denominadas "cinasas de tirosina no receptoras" ó "cinasas de tirosina celulares". Esta última designación, abreviada como "CTK", se utilizará en la presente. Las CTKs no contienen dominios extracelulares ni transmembrana. En el presente, se han identificado más de 24 CTKs en 11 subfamilias (Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes, Fps, Fak, Jak y Ack) . La subfamilia Src parece ser hasta ahora el grupo más grande de CTKs, e incluye Src, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Bik, Hck, Fgr y Yrk. Para una discusión más detallada de la CTKs, ver Bolen, Oncoaene, 8:2025-2031 (1993), que se incorpora como referencia, incluyendo cualesquiera dibujos, como si se estipulara completamente en la presente. Las cinasas de serina/treonina, STKs, como las CTKs, son predominantemente intracelulares, aunque existen unas cuantas cinasas receptoras del tipo STK. Las STKs son las más comunes de las cinasas citosólicas; es decir, las cinasas que realizan su función en la parte del citoplasma diferente de los organelos citoplásmicos y del citoesqueleto. El citosol es la región adentro de la célula en donde ocurre muchas de la actividad metabólica intermediaria de las células y biosintética; por ejemplo, es en el citosol en donde se sintetizan la proteínas sobre los ribosomas. Las RTKs, CTKs y STKs se han implicado todas en una gran cantidad de condiciones patógenas, incluyendo, de una manera significativa, cáncer. Otras condiciones patógenas que se han asociado con las PTKs incluyen, sin limitación, psoriasis, cirrosis hepática, diabetes, angiogénesis, restenosis, enfermedades oculares, artritis reumatoide y otros desórdenes inflamatorios, desórdenes inmunológicos, tales como enfermedad autoinmune, enfermedad cardiovascular, tal como ateroesclerosis, y una variedad de desórdenes renales. > 7 Con respecto al cáncer, dos de las principales hipótesis avanzadas para explicar la proliferación celular excesiva que impulsa el desarrollo de tumor, se relacionan con funciones que se sabe que están reguladas por la cinasa de 5 proteína. Es decir, se ha sugerido que el crecimiento celular maligno resulta de un rompimiento en los mecanismos que controlan la división y/ó diferenciación celular. Se ha demostrado que los productos de proteína de un número de proto- oncógenos están involucrados en las rutas de transducción de señales que regulan el crecimiento y la diferenciación celular. Estos productos de proteína de los proto-oncógenos incluyen los factores de crecimiento extracelular, los receptores de PTK del factor de crecimiento transmembrana (RTKs) , PTKs citoplásmicas (CTKs) y STKs citosólicas, discutidas anteriormente. 15 En vista del enlace aparente entre las actividades celulares relacionadas con la cinasa de proteína y una amplia variedad de desórdenes humanos, no es sorprendente que se esté haciendo un gran esfuerzo en un intento por identificar las maneras de modular la actividad de la cinasa de proteína.

Algunos de éstos han involucrado planteamientos biomiméticos utilizando moléculas grandes en patrones sobre aquéllas involucradas en los procesos celulares reales (por ejemplo, ligandos mutantes (Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 4,966,849), receptores y anticuerpos solubles (Solicitud de Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número WO 94/10202, Kendall y Thomas, Proc. Nat ' 1 Acad. Sci.. 90:10705-09 (1994), Kim y colaboradores, Nature, 362:841-844 (1993)); ligandos de ARN (Jelinek , y colaboradores, Biochemistry, 33:10450-56); Takano y colaboradores, Mol. Bio. Cell 4:358A (1993); Kinsella y colaboradores, Exp. Cell. Res 199:56-62 (1992); Wright y colaboradores, J. Cellular Phys.. 152:448-57)) e inhibidores de cinasa de tirosina (Publicaciones Internacionales Números WO 94/03427; WO 92/21660; WO 91/15495; WO 94/14808; Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,330,992; Mariani y colaboradores, Proc. Am. Assoc. Cáncer Res. , 35:2268 (1994)). En adición a los anteriores, se han intentos por identificar las moléculas pequeñas que actúan como inhibidores de cinasa de proteína. Por ejemplo, los compuestos de arilo bis-monocíclicos, biciclicos y heterocíclicos (Publicación del TCP Número WO 92/20642) , los derivados de vinileno-azaindol (Publicación del TCP Número WO 94/14808) , y l-ciclopropil-4-piridilquinolonas (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,330,992) se han descrito como inhibidores de cinasa de tirosina. Los compuestos de estirilo (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,217,999), los compuestos de piridilo sustituido por estiriLo (Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,302,606) , los derivados de quinazolina (Solicitud de Patente Europea Número 0 566 266 Al) , los selenaindoles y selénidos (Publicación del TCP Número WO 94/03427) , los compuestos polihidroxí lieos tricíclicos (Publicación del TCP Número WO 92/21660) , y los compuestos del ácido bencilfosfónico (Publicación del TCP Número WO 91/15495) han sido todos descritos como inhibidores de PTK útiles en el tratamiento de cáncer.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se espera que ' nuestros propios esfuerzos por identificar las moléculas orgánicas pequeñas que modulan la actividad de cinasas de proteína y que, por consiguiente, son útiles en el tratamiento y la prevención de desórdenes que involucren una actividad anormal de la cinasa de proteína, nos han conducido al descubrimiento de una familia de novedosos compuestos de 2-indolinona sustituida por pirrol que exhiben actividad moduladora de la cinasa de proteína y, por consiguiente, se espera que tengan un efecto saludable contra los desórdenes relacionados con una actividad anormal de la cinasa de proteína; son estos compuestos los que son el objeto de esta invención. Por consiguiente, la presente invención se refiere en general a novedosas 2-indolinonas sustituidas por pirrol que modulan la actividad de las cinasas de tirosina receptoras (RTKs) , de las cinasas de tirosina de prot€sína no receptoras (CTKs) , y de las cinasas de proteína serina/treonina (STKs) . En adición, la presente invención se refiere a la preparación y uso de composiciones farmacéuticas de los compuestos dados a conocer, y sus sales fisiológicamente aceptables y profármacos, en el tratamiento ó en la prevención de desórdenes impulsados por cinasa de proteína, tales como, a manera de ejemplo y no de limitación, cáncer, diabetes, cirrosis hepática, enfermedad cardiovascular, tal como ateroesclerosis, angiogénesis, enfermedad inmunológica, tal como enfermedad autoinmune, y enfermedad renal. Los términos "2-indolinona" , " indolin-2-ona" y "2-oxindol" se utilizan de una manera intercambiable en la presente para referirse a una molécula que tiene la estructura química: Un "pirrol" se refiere a una molécula que tiene la estructura química: "2-indolinona sustituida por pirrol" y "3-pirrolidenil-2-indolinona" se utilizan de una manera intercambiable en la presente para referirse a un compuesto químico que tiene la estructura general mostrada en la Fórmula 1. Una "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla de uno ó más de los compuestos descritos en la presente, ó sales fisiológicamente aceptables ó profármacos de los mismos, con otros componentes químicos, tales como vehículos y excipientes fisiológicamente aceptables. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo. Un "profármaco" se refiere a un agente que se convierte en el fármaco progenitor en vivo. Los profármacos son con frecuencia útiles, debido a que, en algunas situaciones, pueden ser más fáciles de administrar que el fármaco progenitor. Por ejemplo, pueden estar biodisponibles mediante administración oral, mientras que el fármaco progenitor no. El profármaco también puede tener una mejor solubilidad en composiciones farmacéuticas sobre el fármaco progenitor. Un ejemplo, sin limitación, de un profármaco, sería un compuesto de la presente invención que se administre como un éster (el "profármaco") , para facilitar la transmisión a través de una membrana celular, en donde la solubilidad en agua sea perjudicial para la movilidad, pero luego se hidrolice metabólicamente hasta el ácido carboxílico,. la entidad activa, una vez adentro de la célula, en donde la solubilidad en agua sea benéfica. Un ejemplo adicional de un profármaco podría ser un polipéptido corto, por ejemplo, sin limitación, un polipéptido de 2 a 10 aminoácidos, enlazado a través de un grupo amino terminal con un grupo carboxilo de un compuesto de esta invención, en donde el polipéptido se hidroliza ó se metaboliza en vivo para liberar la molécula activa. Un "aldehido de pirrol" se refiere a una molécula que tiene la estructura química: Como se utiliza en la presente, un "vehículo fisiológicamente aceptable" se refiere a un vehículo ó diluyente que no ocasiona una irritación significativa a un organismo, y no abroga la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Un "excipiente" se refiere a una sustancia inerte agregada a una composición farmacéutica para facilitar > 13 adicionalmente la administración de un compuesto. Los ejemplos, sin limitación, de los excipientes, incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diferentes azúcares y tipos de almidones, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, 5 y polietilenglicoles. 1. QUÍMICA A. Características Estructurales Generales En un aspecto, la presente invención se refiere a 2- 10 indolinonas sustituidas por pirrol que, en adición a estar de otra manera opcionalmente sustituidas tanto sobre el pirrol como sobre la porción de 2-indolinona del compuesto, están necesariamente sustituidas sobre la fracción de pirrol con una ó más cadenas de hidrocarburo, que el Las mismas están sustituidas con cuando menos un grupo polar. Las sales fisiológicamente aceptables y los profármacos de los compuestos reivindicados también están dentro del alcance de esta invención. Una "cadena de hidrocarburo" se refiere a un grupo alquilo, alquenilo ó alquinilo, como se define en la presente. Un grupo "polar" se refiere a un grupo en donde los núcleos de los átomos covalentemente enlazados unos con otros para formar el grupo, no comparten los electrones de los enlaces covalentes que los unen igualmente; es decir, la nube de electrones es más densa alrededor de un átomo que de otro.

Esto da como resultado que un extremo de los enlaces covalentes sea relativamente negativo, y el otro extremo sea relativamente positivo; es decir, hay un polo negativo y un polo positivo. Los ejemplos de los grupos polares incluyen, sin limitación, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, nitro, ciano, amino, amonio, amido, ureído, sulfonamido, sulfinilo, sulfonilo, fosfono, morfolino, piperazinilo y tetrazolo. Aunque no desean obligarse por ninguna teoría en particular, los solicitantes esta vez creen que los grupos polares pueden interactuar electrónicamente, por ejemplo, pero sin limitación, a través de los enlaces de hidrógeno, las fuerzas de Van der Walls y/ó los enlaces iónicos (pero no el enlace covalente) , con los aminoácidos en un sitio activo de PTK. Estas interacciones pueden ayudar a las moléculas de esta invención a fijarse a un sitio activo con suficiente tenacidad para interferir con, ó impedir que el sustrato natural entre al sitio. Los grupos polares también pueden contribuir a la selectividad de los compuestos; es decir, un grupo polar puede tener mayor afinidad para un dominio de enlace de PTK que otros grupos polares, de tal manera que el compuesto que contenga al primer grupo polar particular, es más potente que los compuestos que contengan los otros grupos polares. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a compuestos que tienen la siguiente estructura química: V R se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxilo, alcoxilo, C-carboxilo, 0-carboxilo, acetilo, C- a ido, C-tioamido, sulfonilo y trihalo etansulfonilo. R2 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo y heteroalicíclico. 20 R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, mercapto, tioalquilo, tioarilo, sulfinilo, sulfonilo, S- 25 sulfonamido, N-sulfonamido, trihalometansulfonamido, carbonilo, C-carboxilo, O-carboxilo, C-amido, N-amido, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, amino y -NR11R12. R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, carbonilo, acetilo, sulfonilo, trifluormetansulfonilo y, combinados, un anillo heteroalicíclico de cinco ó seis miembros . R3 y R4, R4 y R5, ó R4 y R5, pueden combinarse para formar un anillo de arilo de seis miembros, un grupo metilendioxilo ó un grupo etilendioxilo. R7 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, carbonilo, acetilo, C-amido, C-tioamido, amidino, C-carboxilo, O-carboxilo, sulfonilo y trihalometansulfonilo. R8, R9 y R10 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, tri aloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, mercapto, tioalquilo, tioarilo, sulfinilo, sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbonilo, C-carboxilo, 0-carboxilo, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, 0-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, amino y -NR R , en el entendido, sin embargo, de que cuando menos uno de R8, R9 ó R10 sea un grupo que tenga la fórmula -(alkx)Z. Alk-L se selecciona a partir del grupo que consiste en alquilo, alquenilo ó alquinilo. Z es un grupo polar. Como se utiliza en la presente, el término "alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático saturado, incluyendo los grupos de cadena recta y de cadena ramificada. De preferencia, el grupo alquilo tiene de 1 a 20 átomos de carbono (siempre que se mencione en la presente un rango numérico, por ejemplo, "1 a 20", significa que el grupo, en este caso el grupo alquilo, puede contener 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., hasta e incluyendo 20 átomos de carbono. De una manera más preferible, es un alquilo de tamaño mediano que tiene de 1 a 10 átomos de carbono. Más preferiblemente, es un alquilo inferior que tiene de 1 a 4 átomos de carbono. El grupo alquilo puede estar sustituido ó insustituido. Cuando está sustituido, los grupos sustituyentes de preferencia son uno ó más seleccionados individualmente a partir de cicloalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, mercapto, tioalquilo, tioarilo, ciano, halógeno, carbonilo, tiocarbonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, C-carboxilo, O-carboxilo, nitro, sililo, amino y -NR1:LR12, con R11 y R12 como se definieron anteriormente. Un grupo "cicloalquilo" se refiere a un anillo todo de carbono monocíclico ó condensado (es decir, los anillos que comparten un par adyacente de átomos de carbono) , en donde uno ó más de los anillos no tiene un sistema de pi-electrones completamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de los grupos cicloalquilo, son ciclopropano, ciclobutano, ciclopentano, ciclopenteno, ciciohexano, ada antano, ciclohexadieno, cicloheptano y cicloheptatrieno. Un grupo cicloalquilo puede estar sustituido ó insustituido. Cuando está sustituido, los grupos sustituyentes de preferencia son uno ó más seleccionados individualmente a partir del alquilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, mercapto, tioalquilo, tioarilo, ciano, halógeno, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxilo, O-carboxilo, O-carbamilo, N-carbamilo, C-amido, N-amido, nitro, amino y -NR1:Lr12, con R11 y R12 como se definieron anteriormente. Un grupo "alquenilo" se refiere a un grupo alquilo, como se define en la presente, que consiste en cuando menos dos átomos de carbono, y cuando menos un doble enlace de carbono-carbono. Un grupo "alquinilo" se refiere a un grupo alquilo, como se define en la presente, que consiste en cuando menos dos átomos de carbono, y cuando menos un triple enlace de carbono-carbono. Un grupo "arilo" se refiere a un grupo todo de carbono monocíclico ó policíclico de anillo condensado (es decir, los anillos que comparten pares adyacentes de átomos de carbono) , que tiene un sistema de pi-electrones completamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de los grupos arilo, son fenilo, naftalenilo y antracenilo. El grupo arilo puede estar sustituido ó insustituido. Cuando está sustituido, los grupos sustituyentes de preferencia son uno ó más seleccionados a partir de halógeno, trihalometilo, alquilo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, mercapto, tioalquilo, tioarilo, ciano, nitro, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxilo, O-carboxilo, 0-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, sulfinilo, sulfonilo, amino y -NR1:LR12, con R11 y R12 como se definen en la presente. Como se utiliza en la presente, un grupo "heteroarilo" se refiere a un anillo monocíclico ó condensado (es decir, los anillos que comparten un par de átomos adyacentes) , que tiene en el anillo uno ó más átomos seleccionados a partir del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre y, en adición, que tiene un sistema de pi-electrones completamente conjugado. Los ejemplos, sin limitación, de los grupos heteroarilo, son pirrol, furano, tiofeno, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, piridina, pirimidina, quinolina, isoquinolina, purina y carbazol. El grupo heteroarilo puede estar sustituido ó insustituido. Cuando está sustituido, los grupos sustituyentes de preferencia son uno ó más seleccionados a partir de alquilo, cicloalquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, mercapto, tioalquilo, tioarilo, ciano, nitro, carbonilo, tiocarbonilo, sulfonamido, C-carboxilo, O-carboxilo, sulfinilo, sulfonilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, amino y -NR1:LR12, con R11 y R12 como se definieron anteriormente. Un grupo "heteroalicíclico" se refiere a un grupo de anillo monocíclico ó condensado que tiene en el anillo uno ó más átomos seleccionados a partir del grupo que consiste en nitrógeno, oxígeno y azufre. Los anillos también pueden tener uno ó más dobles enlaces. Sin embargo, los anillos no tienen un sistema de pi-electrones completamente conjugado. El anillo heteroalicíclico puede estar sustituido ó insustituido. Cuando está sustituido, los grupos sustituyentes de preferencia son uno ó más seleccionados a partir de alquilo, cicloalquilo, halógeno, trihalometilo, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, mercapto, tioalquilo, tioarilo, ciano, nitro, carbonilo, tiocarbonilo, C-carboxilo, O-carboxilo, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, sulfinilo, sulfonilo, C-amido, N-amido, amino y -NR1:LR12, con R11 y R12 como se definieron anteriormente. Un grupo "hidroxilo" se refiere a un grupo -OH. Un grupo "alcoxilo" se refiere tanto a un grupo -O-alquilo como a un grupo -O-cicloalquilo, como se definen en la presente.

Un grupo "ariloxilo" se refiere tanto a un grupo -0-arilo como a un grupo -O-heteroarilo, como se definen en la presente. Un grupo "mercapto" se refiere a un grupo -SH. Un grupo "tioalquilo" se refiere tanto a un grupo S-alquilo como a un grupo S-cicloalquilo, como se definen en la presente. Un grupo "tioarilo" se refiere tanto a un grupo S-arilo como a un grupo S-heteroarilo, como se definen en la presente. Un grupo "carbonilo" se refiere a un grupo -C(=0)-R", en donde R" se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo (enlazado a través de un átomo de carbono del anillo) , y heteroalicíclico (enlazado a través de un átomo de carbono del anillo) , como se definen en la presente. Un grupo "aldehido" se refiere a un grupo carbonilo, en donde R" es hidrógeno. Un grupo "tiocarbonilo" se refiere a un grupo -C(=S)-R" , con R" como se define en la presente. Un grupo "C-carboxilo" se refiere a un grupo -C(=0)0-R" , con R" como se define en la presente. Un grupo "O-carboxilo" se refiere a un grupo -0C(=0)R", con R" como se define en la presente. Un grupo "éster" se refiere a un grupo -C(=0)0-R", con R" como se define en la presente, excepto que R" no puede ser hidrógeno. Un grupo "acetilo" se refiere a un grupo -C(=0)CH3. Un grupo "ácido carboxílico" se refiere a un grupo C-carboxilo, en donde R" es hidrógeno. Un grupo "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo ó yodo. Un grupo "trihalometilo" se refiere a un grupo -CX3 , en donde X es un grupo halógeno como se define en la presente. Un grupo "trihalometansulfonilo" se refiere a grupo X3CS(=0)2-, con X como se define anteriormente. Un grupo "ciano" se refiere a un cfrupo -C=N. Un grupo "sulfinilo" se refiere a un grupo -S(=0)-R", en donde, en adición a ser como se define anteriormente, R" también puede ser un grupo hidroxilo. Un grupo "sulfonilo" se refiere a un grupo -S(=0)2R", en donde, en adición a ser como se define anteriormente, R" también puede ser un grupo hidroxilo. Un grupo "metilendioxilo" se refiere a un grupo -0CH20-, en donde los dos átomos de oxígeno están enlazados con los átomos de carbono adyacentes. Un grupo "etilendioxilo" se refiere a un grupo -0CH2CH20-, en donde los dos átomos de oxígeno están enlazados con los átomos de carbono adyacentes. Un grupo "S-sulfonamido" se refiere a un grupo -S(=0) 2NR"l-LR"L,í, con R11 y R1¿ como se definen en la presente. Un grupo "N-sulfonamido" se refiere a un grupo -NR1:LS(=0) 2R12, con R11 y R12 como se definen en la presente. Un grupo "O-carbamilo" se refiere a un grupo -OC(=0)NR11R12, con R11 y R12 como se definen en la presente. Un grupo "N-carbamilo" se refiere a un grupo R120C(=0)NR?:L, con R11 y R12 como se definen en la presente. Un grupo "O-tiocarbamilo" se refiere a un grupo -OC(=S)NR1:LR12, con R11 y R12 como se definen en la presente. Un grupo "N-tiocarbamilo" se refiere a un grupo R120C(=S)NR1:L-, con R11 y R12 como se definen en la presente. Un grupo "amino" se refiere a un grupo -NR1:LR12, en donde R11 y R12 son ambos hidrógeno. Un grupo "C-amido" se refiere a un grupo -C(=0)NR11R12, con R11 y R12 como se definen en la presente. Un grupo "N-amido" se refiere a un grupo R12C(=0)NR11- con R11 y R12 como se definen en la presente. Un grupo "amonio" se refiere a un grupo -+NHR1:LR12, en donde R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en alquilo, cicloalquilo, arilo y heteroarilo. Un grupo "ureído" se refiere a un grupo -NR1:LC(=0)NR12R13, con R11 y R12 como se definen en la presente, y R13 definido igual que R11 y R12. Un grupo "guanidino" se refiere a un grupo -R NC(=N)NR12R13, con R11, R12 y R13 co o se definen en la presente. Un grupo "amidino" se refiere a un grupo -R1:LR12NC(=N) , con R11 y R12 como se definen en la presente. Un grupo "nitro" se refiere a un grupo -N02. Un grupo "fosfonilo" se refiere a un grupo -0P(=0)20R", con R" como se define en la presente. Un grupo "morfolino" se refiere a un grupo que tiene la estructura química: Un grupo "piperazinilo" se refiere a un grupo que tiene la estructura química: Un qrupo "tetrazolo" se refiere a un grupo que tiene la estructura química.

B. Características Estructurales Preferidas Es una característica actualmente preferida de esta invención, que R1 sea hidrógeno. También es una característica actualmente preferida de esta invención, que R sea hidrógeno. De la misma manera, es una característica actualmente preferida de esta invención, que R7 sea hidrógeno. Es una característica actualmente preferida de esta invención, que las tres limitaciones anteriores existan en la misma molécula; es decir, que, en un compuesto de esta invención, R1 , R2 y R7 sean hidrógeno. También se prefiere actualmente que R3, R4, R5 y R6 se seleccionen a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior insustituido, alquilo inferior sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en hidroxilo, halógeno, C-carboxilo sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo inferior insustituido, amino, ó -NR11R12; alquilo inferior insustituido, alcoxilo, alcoxilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno, alcoxilo inferior sustituido con un grupo que consiste en arilo insustituido, ó arilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo inferior insustituido, hidroxilo, alquilo inferior insustituido, alcoxilo, halógeno, amino, alquilo inferior-S-sulfonamido insustituido, ó -NR1:1R12, arilo insustituido ó arilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo inferior insustituido, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, alcoxilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno, alcoxilo inferior sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en arilo insustituido, ó arilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo inferior insustituido, hidroxilo, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, halógeno, amino, alquilo inferior-S-sulfonamido insustituido, ó -NR12R12, hidroxilo, amino, alquilo inferior-sulfonamido insustituido, C-carboxilo sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en hidrógeno ó alquilo inferior insustituido, morfolino, -NR1:LR12, trihalometilo, arilo, arilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en hidroxilo, halógeno, trihalometilo, amino, -NR11R12, sulfonamido, C-carboxilo sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en hidrógeno ó alquilo inferior insustituido, alquilo inferior insustituido ó alquilo inferior sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en hidroxilo, halógeno, C-carboxilo sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en hidrógeno ó alquilo inferior insustituido, amino ó -NR1:LR12, heteroalicíclico insustituido, Aeronave eteroalicíclico sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, alquilo inferior insustituido, alquilo inferior-carbonilo insustituido, hidroxilo, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, ó alcoxilo sustituido con uno ó más grupos halógeno, ariloxilo insustituido, ariloxilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo inferior insustituido, trihalometilo, halógeno, hidroxilo, amino ó -NR1:1R12, mercapto, alquilo inferior-tioalquilo insustituido, tioarilo insustituido, tioarilo sustituido con uno ó más grupos seleccionados a partir del grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, amino ó -NR1:LR12, C-carboxilo sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo inferior insustituido, alquilo inferior insustituido, O-carboxilo, alquilo inferior-S-sulfonamido insustituido, nitro, alquilo inferior-C-amido insustituido, alquilo inferior-N-amido insustituido, amino y -R1:LR12. En otras modalidades actualmente preferidas de esta invención, R3 , R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente a partir del grupo, que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo inferior insustituido, alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos seleccionados a partir del grupo que consiste en hidroxilo, halógeno, C-carboxilo sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en hidrógeno ó alquilo inferior insustituido, amino ó -NR1:LR12, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, alquilo inferior-alcoxilo sustituido con uno ó más grupos halógeno, ariloxilo insustituido, ariloxilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo inferior insustituido, alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno, hidroxilo, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, halógeno, amino ó -NR11R12, S-sulfonamido, en donde R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo inferior insustituido, arilo insustituido, arilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en halógeno, alquilo inferior insustituido, alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, amino ó -NR11R12, heteroarilo insustituido, heteroarilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en alquilo inferior insustituido, alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, hidroxilo, halógeno, amino ó -NR1:LR12, heteroalicíclico insustituido, heteroalicíclico sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, alquilo inferior insustituido, alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, amino, ó -NR1:1"R12, alquilo inferior-O-carboxilo insustituido, C-amido, en donde R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior insustituido, y arilo insustituido, y, N-amido, en donde R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior insustituido, y arilo insustituido. Es una característica actualmente preferida de esta invención que uno de R8, R9 y R10 sea -(alkx)Z, mientras que los otros dos se seleccionen independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, hidroxilo, alquilo inferior insustituido, alquenilo inferior insustituido, alquinilo inferior insustituido, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, alcoxilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno, arilalcoxilo insustituido, amino, -NR12Ri2 , halógeno, C-carboxilo sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en hidrógeno ó alquilo inferior insustituido, alquilo inferior-O-carboxilo insustituido, alquilo inferior-C-amido insustituido, alquilo inferior-N-amido insustituido, acetilo, alquilo inferior-S-sulfonamido insustituido, arilo insustituido ó arilo sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, alcoxilo sustituido con uno ó más grupos halógeno, C-carboxilo sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en hidrógeno ó alquilo inferior ineustituido, alquilo inferior-O-carboxilo insustituido, amino, alquilo inferior-S-sulfonamido insustituido y -NR11R12. Es una característica actualmente preferida de esta invención que R8 y R10 se seleccionen a partir de los grupos que consisten en hidrógeno y alquilo inferior insustituido. También es una característica actualmente preferida de esta invención que alkx sea un grupo alquilo inferior insustituido. En todavía otra característica actualmente preferida de esta invención, Z se selecciona a partir del grupo que consiste en hidroxilo, amino, -NR"L1R12, amonio cuaternario, C-carboxilo sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en hidrógeno ó alquilo inferior insustituido, C-amido sustituido con grupos seleccionados a partir del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo inferior insustituido, morfolino, piperadinilo, tetrazolo y fosfonilo. Una característica actualmente preferida adicional de esta invención es que alk-j^ sea un grupo alquilo inferior insustituido de dos a cuatro átomos de carbono, y Z sea un ácido carboxílico. Es una característica actualmente preferida de esta invención, que R9 sea alk1Z. De la misma manera, es una característica actualmente preferida de esta invención, que R11 y R12 se seleccionen independientemente a partir del grupo que comprende hidrógeno, alquilo inferior insustituido, hidroxilo, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, alquilo inferior-carbonilo insustituido, alquilo inferior-O-carboxilo insustituido y acetilo. En otra modalidad actualmente preferida de esta invención, R1, R2 , R3 , R4, R5 , R6 y R7 son hidrógeno, R8 y R10 son metilo, y R9 es -CH2CH2C (=0) OH. También es una modalidad actualmente preferida de esta invención que R1, R2 , R3, R4, R5 , R6, R7 y R8 sea hidrógeno, R10 sea metilo, y R9 sea -CH2CH2C (=0) OH. En todavía otra modalidad actualmente preferida de esta invención, R7 se selecciona a partir del grupo que consiste en: hidrógeno, alquilo inferior insustituido, y alquilo inferior sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en cicloalquilo insustituido, arilo insustituido, y arilo sustituido con un grupo seleccionado a partir de hidroxilo, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, y halógeno. También es una modalidad actualmente preferida de esta invención que Z se seleccione a partir del grupo que consiste en -C(=0)NR11R14, en donde R13 y R14 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior insustituido, alquilo inferior sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en amino y -NR1:LR12, arilo insustituido, arilo sustituido con uno ó más grupos seleccionados a partir del grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, y trihalometilo, heteroarilo insustituido, heteroalicíclico insustituido, y, combinados, un heterocíclico insustituido de cinco miembros ó de seis miembros, y -NR1:LR12, en donde R11 y R~2 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en alquilo inferior insustituido, y, combinados, un anillo heteroalicíclico insustituido de cinco miembros ó de seis miembros . Todavía otra modalidad actualmente preferida de esta invención es que R7 se seleccione a partir del grupo que consiste en alquilo inferior insustituido, alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos seleccionados a partir del grupo que consiste en cicloalquilo insustituido, arilo insustituido, arilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en halógeno y alquilo inferior-alcoxilo insustituido, y alquilo inferior-carboxialquilo insustituido, y Z se selecciona a partir del grupo que consiste en C-carboxilo insustituido, y alquilo inferior-C-carboxilo insustituido. Finalmente, es una modalidad actualmente preferida de esta invención, que R3, R4, R5 y R6 se seleccionen independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo inferior insustituido, alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos hidroxilo, alcoxilo inferior insustituido, arilo insustituido, arilo sustituido con uno ó más grupos alcoxilo inferior insustituidos, y -S(0)2NR11R12, R5 es hidrógeno, R6 es -NR11R12, y R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior insustituido, y, combinados, un anillo heteroalicíclico insustituido de cinco miembros ó de seis miembros. Las fórmulas químicas referidas en la presente pueden exhibir los fenómenos de tautomerismo e isomerismo estructural. Por ejemplo, los compuestos descritos en la presente pueden adoptar una configuración E ó Z alrededor del doble enlace que conecte la fracción de 2-indolinona con la fracción de pirrol, ó pueden ser una mezcla de E y Z. Esta invención abarca cualquier forma isomérica estructural ó tautomérica, y mezclas de las mismas, que posean la capacidad para modular la actividad de RTK, CTK y/ó STK, y no se limita a cualquier forma isomérica estructural ó tautomérica. 2. SÍNTESIS/BIBLIOTECAS DE COMBINACIÓN Un aspecto adicional de esta invención es una biblioteca de combinación de cuando menos diez compuestos de 3-pirrolidinil-2-indolinona que se pueden formar mediante la reacción de oxindoles de la estructura 2 con aldehidos de la estructura 3. en donde R1 a R10 tienen los significados estipulados anteriormente. Como se utiliza en la presente, una "biblioteca de combinación" se refiere a todos los compuestos formados mediante la reacción de cada compuesto de una dimensión con una compuesto en cada una de las otras dimensiones en un arregle de multidimensional de compuestos. En el contexto de la presente invención, el arreglo es bidimensional,, y una dimensión representa todos los oxindoles de la invención, y la segunda dimensión representa todos los aldehidos de la invención. Cada oxindol se puede hacer reaccionar con cada uno y todo aldehido, con el objeto de formar un compuesto de 3-pirrolidinil-2- indolinona. Todos los compuestos de 3-pirrolidinil-2-indolinona formados de esta manera están dentro del alcance de la presente invención. También están dentro del alcance de la presente invención las bibliotecas de combinación más pequeñas formadas mediante la reacción de algunos de los oxindoles con todos los aldehidos, todos los oxindoles con algunos de los aldehidos, ó algunos de los oxindoles con algunos de los aldehidos. El oxindol en la biblioteca de combinación anterior de preferencia se selecciona a partir del grupo que consiste en el oxindol mismo y oxindoles sustituidos, tales como, sin limitación, 6-bromo-oxindol, 5-hidroxioxindol, 5-metoxioxindol, 6-metoxioxindol , 5-fenila inosulfoniloxindol , 4-[2-(2-isopropilfenoxi) -etil] oxindol , 4- [2- (3- isopropilfenoxi) -etil] oxindol, 5-fluoro-oxindol, 6-fluoro-oxindol, 7-fluoro-oxindol, 6-trifluorometiloxindol, 5-cloro-oxindol, 6-cloro-oxindol, ácido indol-4-carboxílico, 5-bromo-oxindol, 6-(N-acetamido) -oxindol, 4-metiloxindol, 5-metiloxindol, 4-metil-5-cloro-oxindol , 5-etiloxindol , 6-hidroxioxindol , 5-acetiloxindol, ácido oxindol-5-carboxílico, 5-metoxioxindol, 6- etoxioxindol , 5-amino-oxindol, 6-amino-oxindol, 4-(2-N-morfolinoetil) oxindol, 7-azaoxindol, t-butiléster del ácido oxindol-4-carabámico, t-butiléster del ácido oxindol-6-carbámico, 4- (2-carboxietil) oxindol, 4-n-butiloxindol, 4,5-dimetoxioxindol, 6- (metansulfonamido) oxindol , 6- (benzamido) -oxindol, 5-etoxioxindol , 6-feniloxindol, 6- (2-metoxifen-1- il) oxindol, 6-(3-metoxifen-l-il) oxindol, 6- (4-metoxifen-1-il) oxindol, 5-aminosulfoniloxindol, 5-isopropilamino-sulfoniloxindol , dimetilaminosulfoniloxindol , 5-(n-morfolinosulfonil) oxindol y 4- (2-hidroxietil) oxindol . El aldehido en la biblioteca de combinación anterior, de preferencia se selecciona a partir del grupo que consiste en, sin limitación, ácido 3- (5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il) propiónico, ácido 3- (5-formil-4-metil-lH-pirrol-3-il) propiónico, ácido 3- (2-bencil-5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il) propiónico, ácido 3- (5-formil-1-metoxicarbonil-metil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il) propiónico, ácido3- (5-formil-1, 2 , 4-trimetil-lH-pirrol-3-il)propiónico, metiléster del ácido 3-[5-formil-l-( 3 -metoxibenc i 1 ) -2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il]propiónico, metiléster del ácido 3- (l-ciclohexilmetil-5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il) propiónico, metiléster del ácido 3-[l-(2,2-dimetil-propil) -5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-i1] propiónico, 1,3, 5-trimeti1-4- ( 3-morfolin-4-i1-3-oxopropil) -lH-pirrol-2-carbaldehído, 3- (5-formil-1, 2 , 4-trimetil-lH-pirrol-3-il) -N- (2-morfolin-4-il) etil) propionamida, 3- (5-formi1-1, 2 , 4-trimetil-lH-pirrol-3-il) -N-f nilpropionamida, 1,3, 5-trimetil-4- (3-oxo-3-piperidin-l-il-propil) -lH-pirrol-2-carbaldehído, 1,3, 5-trimeti1-4- ( 3-oxo-3-pirrolidin-1-il-propil) -lH-pirrol-2-carbaldehido, 3- (5-formil-1 , 2 , 4-trimetil-lH-pirrol-3-il) -N- (4-metoxi-fenil) propionamida, 3- (5-formi1-1,2 , 4-trimetil-lH-pirrol-3-il) -N- (4-metoxi-fenil) propionamida, N- (4-fluoro-fenil) -3- (5-formi1-1, 2 , 4-trimetil-lH-pirrol-3-il) propionamida, 3- (5-formil-1, 2 , 4-trimetil-lH-pirrol-3-il) -N- (4-trifluorometil-fenil) propionamida, ácido 3-[5-formil-l- (3-metoxi-bencil) -2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il]propiónico, ácido 3- (l-ciclohexilmetil-5-formil-2, 4-dimetil-lH-pirrol-3-il) -propiónico, metiléster del ácido 3- [ 1- (3-fluorobencil) -5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il]propiónico, ácido 3-(l-bencil-5-formil-2, 4-dimetil-lH-pirrol-3-il) propiónico, metiléster del ácido 3-[l- (4-flurobencil) -5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il]propiónico, ácido 3- [ 1- (4-fluorobencil) -5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il]propiónico, ácido 3-[l-(3-fluorobencil) -5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il]propiónico, 3 , 5-dimetil-4-(3-morfolin-4-il) propil) -lH-pirrol-2-carbaldehído, 4- (3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-carbaldehído, ácido 5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxílico, 3 , 5-dimetil-4- (4-metil-piperazin-l-carbonil) -1H-pirrol-2-carbaldehído, (2-dimetilaminoetil) amida del ácido 5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxílico. Otro aspecto de esta invención proporciona un método para la síntesis de una 3-pirrolidinil-2-indolinona de la Fórmula 1, el cual comprende hacer reaccionar un oxindol de la Fórmula 2 con un aldehido de la Fórmula 3 en un solvente, de preferencia en la presencia de una base. Los ejemplos de los oxindoles de la Fórmula 2 que se pueden hacer reaccionar con un aldehido de la Fórmula 3 para dar la 3-pirrolidinil-2-indolinonas de la Fórmula 1, son el oxindol mismo, y oxindoles sustituidos, tales como, sin limitación, 6-bromo-oxindol , 5-hidroxioxindol, 5-metoxioxindol, 6-metoxioxindol, 5-fenilaminosulfoniloxindol , 4- [2- (2-isopro-pilfenoxi) -etil] oxindol, 4- [2- (3-isopropilfenoxi) etil] oxindol, 4- [2- (4-isopropilfenoxi) etil]oxindol, 5-fluoro-oxindol, 6-fluoro-oxindol, 7-fluoro-oxindol, 6-trifluorometiloxindol, 5-cloro-oxindol, 6-cloro-oxindol, ácido indol-4-carboxílico, 5-bromo-oxindol, 6- (N-acetamido) -oxindol, 4-metiloxindol, 5-metiloxindol, 4-metil-5-cloro-oxindol, 5-etiloxindol, 6-hidroxioxindol, 5-acetiloxindol, ácido oxindol-5-carboxílico, 5-metoxioxindol, 6-metoxioxindol, 5-amino-oxindol , 6-amino-oxindol, 4- (2-N-morfolinetil) oxindol, 7-azaoxindol, t-butiléster del ácido oxindol 4-carbámico, t-butiléster del ácido oxindol-5-carbámico, 4- (2-carboxietil) oxindol , 4-n-butiloxindol , 4 , 5-dimetoxioxindol , 6- (metansulfonamido) oxindol , 6- (benzamido) oxindol, 5-etoxioxindol, 6-feniloxindol, 6-(2-metoxifen-1-il) oxindol, 6- (3-metoxifenil-1-il) oxindol, 6- (4-metoxifenil-1-il) oxindol , 5-aminosulfoniloxindol , 5-isopropilaminosulfoniloxindol, dimetilaminosulfoniloxindol, 5-(N-morfolinsulfonil) oxindol, y 4- (2-hidroxietil) oxindol. Los ejemplos de los aldehidos de la estructura 3 que se pueden hacer reaccionar con los oxindoles de la estructura 2 son, sin limitación, ácido 3- (5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il) propiónico, ácido 3- (5-formil-4-metil-lH-pirrol-3- il) propiónico, ácido 3- (l-bencil-5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il) propiónico, ácido 3- ( 5-formil-1-metoxicar-bonilmetil-2 ,4-dimetil-lH-pirrol-3-il) propiónico, ácido 3- (5-formil-1, 2 , 4-trimetil-lH-pirrol-3-il) propiónico, metilésterdel ácido 3- [5-formil-l-(3-metoxibencil) -2 , 4-di:metil-lH-pirrol-3-il]propiónico, metiléster del ácido 3-[l-ciclohexilmetil-5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il]propiónico, metiléster del ácido 3-[l-(2 , 2-dimetilpropil) -5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-i1] propiónico, 1,3, 5-trimeti1-4- ( 3-morfolin-4-il-3-oxo-propil) -lH-pirrol-2-carbaldehído, 3- (5-formil-1, 2 , 4-trimetil-lH-pirrol-3-il) -N- (2-morfolin-4-il-etil) ropionamida, 3- (5-formi1-1, 2 , 4-trimetil-lH-pirrol-3-il) -N-fenilpropionamida, 1,3, 5-trimetil-4- (3-oxo-3-piperidin-l-il-propil) -lH-pirrol-2-carbaldehído, 1, 3 , 5-trimeti1-4- ( 3-oxo-3-pirrolidin-l-il-propil) -lH-pirrol-2-carbaldehído, 3- (5-formil-1 , 2 , 4-trimetil-lH-pirrol-3-il) -N- (4-metoxifenil) propionamida, 3- (5-formil-1,2, 4-trimetil-lH-pirrol-3-il) -N- (4-metoxif nil) propionamida, N- (4-fluorofenil) -3- (5-formil-1 , 2, 4-trimetil-lH-pirrol-3-il) propionamida, 3- (5-formil-l, 2 , 4-trimetil-lH-pirrol-3-il) -N-(4-trifluorometilfenil) propionamida, ácido 3- [5-formil-1- (3-metoxibencil) -2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il]propiónico, ácido 3-( l-ciclohexilmetil-5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il) propiónico, metiléster del ácido 3-[l- (3-fluorobencil) -5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il]propiónico, ácido 3-(l-bencil-5-formil-2, 4-dimetil-lH-pirrol- -il) propiónico, metiléster del ácido 3- [ 1- (4-fluorobencil) -5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il] propiónico, ácido 3- [ 1- (4-fluorobencil) -5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il]propiónico, ácido 3-[l-(3-fluorobencil) -5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il]propiónico, 3 , 5-dimetil-4-(3-morfolin-4-il-propil) -lH-pirrol-2-carbaldehído, 4- (3-dimetilaminopropil) -3, 5-dimetil-lH-pirrol-2-carbaldehído, ácido 5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxílico, 3 , 5-dimetil-4- (4-metilpiperazin-l-carbonil) -1H-pirrol-2-carbaldehído, (2-dimetilaminoetil) amida del ácido 5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxilico. La reacción se puede realizar en la presencia de una base. La base puede ser una base orgánica ó inorgánica. Si se utiliza una base orgánica, de preferencia, es una base de nitrógeno. Los ejemplos de las bases de nitrógeno orgánicas incluyen, pero no se limitan a, di-isopropila ina, trimetilamina, trietilamina, anilina, piridina, 1,8-diazabiciclo[5.4. l]undec-7-eno, pirrolidina y piperidina. Los ejemplos de las bases inorgánicas son, sin limitación, amoniaco, hidróxidos, fosfatos, carbonatos, bicarbonatos, bisulfatos y amidas de metal alcalino ó alcalinotérreo. Los metales alcalinos incluyen litio, sodio y potasio, mientras que los alcalinotérreos incluyen calcio, magnesio y bario. En una modalidad actualmente preferida de esta invención, cuando el solvente es un solvente prótico, tal como agua ó alcohol, la base es una base inorgánica de metal alcalino ó alcalinotérreo, de preferencia un hidróxido de metal alcalino ó alcalinotérreo. Quedará claro para los expertos en la materia, basándose en los principios generales conocidos de la síntesis orgánica, y en las divulgaciones de la presente, cual base sería la más apropiada para la reacción contemplada. El solvente en donde se realiza la reacción puede ser un solvente prótico ó aprótico, de preferencia es un solvente prótico. Un "solvente prótico" es un solvente que tiene átomos de hidrógeno covalentemente enlazados con los átomos de oxígeno ó nitrógeno, lo cual hace a los átomos de hidrógeno apreciablemente ácidos, y por lo tanto, capaces de ser "compartidos" con un soluto a través del enlace de hidrógeno. Los ejemplos de los solventes próticos incluyen, sin limitación, agua y alcoholes. Un "solvente aprótico" puede ser polar ó no polar, pero en cualquier caso, no contiene hidrógenos ácidos, y por consiguiente, no es capaz de tener enlace de hidrógeno con solutos. Los ejemplos, sin limitación, de los solventes apróticos no polares, son pentano, hexano, benceno, tolueno, cloruro de metileno y tetracloruro de carbono. Los ejemplos de los solventes apróticos polares son cloroformo, tetrahidrofurano, sulfóxido de dimetilo y dimetilformamida. En una modalidad actualmente preferida de esta invención, el solvente es un solvente prótico, de preferencia agua ó un alcohol, tal como etanol. La reacción se realiza a temperaturas mayores que la temperatura ambiente. La temperatura es en general de aproximadamente 30°C a aproximadamente 150°Cf de preferencia de aproximadamente 80°C a aproximadamente 100°C, más preferiblemente de aproximadamente 75°C a aproximadamente 85°C, que es aproximadamente el punto de ebullición del etanol. "Aproximadamente" significa que el rango de temperatura de preferencia está dentro de 10 grados Celsius de la temperatura indicada, más preferiblemente dentro de 5 grados Celsius de la temperatura indicada y, más preferiblemente, dentro de 2 grados Celsius de la temperatura indicada. Por consiguiente, por ejemplo, "aproximadamente 75°C" significa 75°C + 10°C, de preferencia 75°C ± 5°C, y más preferiblemente 75°C + 2°C. 3. BIOQUIMICA/FARMACOTERAPIA Otro aspecto de esta invención se refiere a un método para la modulación de la actividad catalítica de una cinasa de proteína, poniendo en contacto una cinasa de proteína con un compuesto de esta invención ó una sal fisiológicamente aceptable ó profármaco del mismo. Como se utiliza en la presente, "cinasa de proteína" se refiere a la cinasa del proteína tirosina receptora (RTKs) , la cinasa de tirosina no receptor ó "celular" (CTKs) , y las cinasas de serina-treonina (STKs) . El término "método" se refiere a las maneras, medios, técnicas y procedimientos para realizar una tarea dada, incluyendo, pero no limitándose a, las maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos para, ó fácilmente desarrollados a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por, los practicantes de las técnicas química, farmacéutica, biológica, bioquímica y médica. Como se utiliza en la presente, el término "modulación" ó "modular" se refiere a la alteración de la actividad catalítica de las RTKSs, CTKs y STKs. En particular, modular se refiere a la activación de la actividad catalítica de la RTKs, CTKs y STKs, de preferencia a la activación ó inhibición de la actividad catalítica de las RTKs, CTKs y STKs, dependiendo de la concentración del compuesto ó de la sal a la que se exponga la RTK, CTK ó STK, ó más preferiblemente, a la inhibición de la actividad catalítica de las RTKs, CTKs y STKs. El término "actividad catalítica", como se utiliza en la presente, se refiere a la velocidad de fosforilación de la tirosina bajo la influencia, directa ó indirecta, de las RTKs y/ó CTKs, ó la fosforilación de serina y treonina bajo la influencia, directa ó indirecta, de las STKs . El término "poner en contacto", como se utiliza en la presente, se refiere a poner un compuesto de esta invención y una cinasa de proteína blanco juntos, de tal manera que el compuesto pueda afectar la actividad catalítica de la cinasa de proteína, ya sea directamente, es decir, mediante su interacción con la cinasa misma, ó indirectamente, es decir, mediante su interacción con otra molécula de la que dependa la actividad catalítica de la cinasa. Este "contacto" se puede realizar "in vitro", es decir, en un tubo de ensayo, una caja Petri ó similar. En un tubo de ensayo, el contacto puede involucrar solamente un compuesto y una cinasa de proteina de interés, ó puede involucrar células enteras. Las células también se pueden mantener ó cultivar en platos de cultivo celular, y se pueden poner en contacto con un compuesto en ese medio ambiente. En este contexto, la capacidad de un compuesto particular para afectar un desorden relacionado con cinasa de proteína, es decir, la IC50 del compuesto, definida más adelante, se puede determinar antes de utilizar los compuestos en vivo con organismos vivos más complejos. Para las células afuera del organismo, existen múltiples métodos, y son bien conocidos por los expertos en la material, para poner las cinasas de proteína en contacto con los compuestos, incluyendo, pero no limitándose a, microinyección celular directa, y numerosas técnicas de portadores transmembrana. Un aspecto adicional de esta invención es que se puede realizar la modulación de la actividad catalítica de las cinasas de proteína utilizando un compuesto de esta invención in vitro ó in vivo . "in vitro" se refiere a los procedimientos realizados en un medio ambiente artificial, tal como, por ejemplo, sin limitación, en un tubo de ensayo ó en un medio de cultivo. Como se utiliza en la presente, "in vivo" se refiere a los procedimientos realizados adentro de un organismo vivo, tal como, sin limitación, un ratón, rata ó conejo. Un aspecto todavía adicional de esta invención, es que la cinasa de proteina cuya actividad catalítica se está modulando mediante un compuesto de esta invención, se selecciona a partir del grupo que consiste en cinasas de tirosina de proteína receptoras, cinasas de tirosina celulares, y cinasas de serina-treonina. Es un aspecto de esta invención que la cinasa de proteína receptora, cuya actividad catalítica sea modulada por un compuesto de esta invención, se seleccione a partir del grupo que consiste en EGF, HER2 , HER3 , HER4 , IR, IGF-1R, IRR, PDGFRQ!, PDGFRß, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-IR, Flk4 , KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R y FGFR-4R. En adición, es un aspecto de estci invención que la cinasa de tirosina celular, cuya actividad catalítica sea modulada por un compuesto de esta invención, se seleccione a partir del grupo que consiste en Src, Fr , Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Bik, Hck, Fgr y Yrk. Otro aspecto de esta invención es que la cinasa de proteína serina-treonina, cuya actividad catalítica sea modulada por un compuesto de esta invención, se seleccione a partir del grupo que consiste en CDK2 y Raf, Una composición farmacéutica de un compuesto de esta invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable, es todavía otro aspecto de esta invención. Esta composición farmacéutica puede contener también excipientes. Un método para el tratamiento ó la prevención de un desorden relacionado con cinasa de proteína en un organismo, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto, sal ó profármaco que sea una 3-pirrolidenil-2-indolinona de la presente invención al organismo, es otro aspecto de esta invención. Como se utiliza en la presente, "desorden relacionado con cinasa de proteína", "desorden impulsado por cinasa de proteína" y "actividad anormal de cinasa de proteína" se refieren todos a una condición caracterizada por una actividad catalítica de cinasa de proteína inapropiada, es decir, baja, ó más comúnmente alta, en donde la cinasa de proteína particular puede ser una RTK, una CTK ó una STK. La actividad catalítica inapropiada puede presentarse como el resultado de cualquiera de: (1) la expresión de cinasa de proteína en células que normalmente no expresan cinasas de proteína, (2) mayor expresión de cinasa de proteína que conduce a una proliferación, diferenciación y/ó crecimiento celular indeseados, ó (3) menor expresión de cinasa de proteína que conduce a una reducción indeseada en La proliferación, diferenciación y/ó crecimientos celulares. Una sobre-actividad de una cinasa de proteína se refiere a la amplificación del gen que codifica una cinasa de proteína particular, ó a la producción de un nivel de actividad de cinasa de proteína que puede correlacionarse con un desorden en la proliferación, diferenciación y/ó crecimiento celular (es decir, a medida que se incrementa el nivel de cinasa de proteína, se incrementa la severidad de uno ó más de los síntomas del desorden celular) . La sub-actividad, por supuesto, es el inverso, en donde se incrementa la severidad de uno ó más síntomas de un desorden celular a medida que disminuye el nivel de actividad de la cinasa de proteína. Como se utilizan en la presente, los términos "prevenir", "previniendo" y "prevención" se refieren a un método para evitar que un organismo adquiera un desorden relacionado con cinasa de proteína en primer lugar. Como se utilizan en la presente, los términos "tratar", "tratando" y "tratamiento" se refieren a un método para aliviar ó abrogar un desorden celular mediado por cinasa de proteína, y/ó sus síntomas aunados. Con respecto particularmente al cáncer, estos términos simplemente significan que se incrementará la esperanza de vida de un individuo afectado con un cáncer, ó que se reducirán uno ó más de los síntomas de la enfermedad. El término "organismo" se refiere a cualquier entidad viva comprendida de cuando menos una célula. Un organismo vivo puede ser tan simple como, por ejemplo, una sola célula eucariótica, ó como un complejo como un mamífero, incluyendo un ser humano. El término "cantidad terapéuticamente efectiva", como se utiliza en la presente, se refiere a la cantidad del compuesto que se está administrando que aliviará hasta algún grado uno ó más de los síntomas del desorden que se esté tratando. Con referencia al tratamiento de cáncer, una cantidad terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad que tiene el efecto de: (1) reducir el tamaño del tumor, (2) inhibir (es decir, hacer más lento hasta algún grado, de preferencia detener) la metástasis tumoral, (3) inhibir hasta algún grado (es decir, hacer más lento hasta algún grado, de preferencia detener) el crecimiento tumoral, y/ó, (4) aliviar hasta algún grado (ó de preferencia, eliminar) uno ó más síntomas asociados con el cáncer. Es un aspecto de esta invención que el desorden relacionado con cinasa de proteína anteriormente referenciado, se seleccione a partir del grupo que consiste en un desorden relacionado con cinasa de proteína tirosina receptora, un desorden de cinasa de tirosina celular, y un desorden relacionado con cinasa de serina-treonina .

En todavía otro aspecto de esta invención, el desorden relacionado con cinasa de proteína anteriormente referenciado, se selecciona a partir del grupo que consiste en un desorden relacionado con EGFR, un desorden relacionado con PDGFR, un desorden relacionado con IGFR y un desorden relacionado con flk. El desorden relacionado con cinasa de proteína anteriormente referenciado es un cáncer seleccionado a partir del grupo que consiste en carcinoma de células escamosas, sarcomas, tales como sarcoma de Kaposi, astrocito a, glioblastoma, cáncer del pulmón, cáncer de la vejiga, cáncer colorrectal, cáncer gastrointestinal, cáncer de la cabeza y el cuello, melanoma, cáncer del ovario, cáncer de la próstata, cáncer del pecho, cáncer del pulmón de células pequeñas y glioma en un aspecto adicional de esta invención. El desorden relacionado con cinasa de proteína anteriormente referenciado se selecciona a partir del grupo que consiste en diabetes, un desorden de hiperproliferación, enfermedad de von Hippel-Lindau, restenosis, fibrosis, psoriasis, osteoartritis, artritis reumatoide, un desorden inflamatorio y angiogénesis en todavía otro aspecto de esta invención. Los desórdenes adicionales que se pueden tratar ó prevenir utilizando los compuestos de esta invención son desórdenes inmunológicos, tales como enfermedad autoinmune (SIDA) y desórdenes cardiovasculares, tales como ateroesclerosis . Es un aspecto de esta invención, que se puede identificar un compuesto químico que modula la actividad catalítica de una cinasa de proteína, poniendo en contacto las células que expresen esta cinasa de proteína con un compuesto, sal ó profármaco que sea una 3-pirrolidenil-2-indolinona de la presente invención, y luego monitorear estas células para determinar un efecto. "Monitorear" significa observar ó detectar el efecto de poner en contacto un compuesto con una célula que exprese una cinasa de proteína particular. El efecto observado ó detectado puede ser un cambio en el fenotipo celular, en la actividad catalítica de una cinasa de proteína, ó un cambio en la interacción de una cinasa de proteína con un componente de enlace natural. Las técnicas para observar ó detectar estos efectos son bien conocidos en la material. El efecto anteriormente referenciado se selecciona a partir de un cambio ó una ausencia de cambio en un fenotipo celular, un cambio ó una ausencia de cambio en la actividad catalítica de la cinasa de proteína, ó un cambio ó una ausencia de cambio en la interacción de la cinasa de proteína con un componente de enlace natural en un aspecto final de esta invención. Un "fenotipo celular" se refiere a la apariencia externa de una célula ó tejido, ó a la función biológica de la célula ó tejido. Los ejemplos, sin limitación, de un fenotipo celular, son el tamaño de la célula, el crecimiento celular, la proliferación celular, ,1a diferenciación celular, la sobrevivencia de la célula, apoptosis, y recuperación y uso de nutrientes. Estas características fenotípicas se pueden medir mediante técnicas bien conocidas en la materia. Un "componente de enlace natural" se refiere a un polipéptido que se enlaza con una cinasa de proteína particular en una célula. Los componentes de enlace naturales pueden tener un papel en la propagación de una señal en un proceso de transducción de señal mediado por cinasa de proteína. Un cambio en la interacción del componente de enlace natural con la cinasa de proteína puede manifestarse como una mayor ó menor concentración del complejo de cinasa de proteína/componente de enlace natural, y como resultado, un cambio observable en la capacidad de la cinasa de proteína para mediar la transducción de señales. También es un aspecto de esta invención que un compuesto descrito en la presente, ó su sal ó profármaco, se podría combinar con otros agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de las enfermedades y desórdenes mencionados anteriormente. Por ejemplo, un compuesto, sal ó profármaco de esta invención se podría combinar con agentes alquilantes, tales como fluorouracilo (5-FU) solo ó en una combinación adicional con leucovorina; u otros agentes alquilantes, tales como, sin limitación, otros análogos de pirimidina, tales como UFT, capecitabina, gemcitabina y citarabina, los sulfonatos de alquilo, por ejemplo, bisulfano— (utilizado en el tratamiento de leucemia granulocítica crónica) , improsulfano y piposulfano; aziridinas, por ejemplo, benzodepa, carbocuona, meturedepa y uredepa; etileniminas y metilmelaminas, por ejemplo, altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; y las mostazas de nitrógeno, por ejemplo, clorambucil (utilizado en el tratamiento de leucemia linfocítica crónica, macroglobulinemia primaria y linfoma que no es de Hodgkin) , ciclofosfamida (utilizada en el tratamiento de enfermedad de Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer del pecho, cáncer del ovario, cáncer del pulmón, tumor de Wilm y rabdomiosarcoma) , estramustina, ifosfamida, novembriquina, prednimustina y mostaza de uracilo (utilizada en el tratamiento de trombocitosis primaria) , linfoma que no es de Hodgkin, enfermedad de Hodgkin y cáncer del ovario) ; y triazinas, por ejemplo, dacarbazina (utilizada en el tratamiento de sarcoma del tejido blando) . De la misma manera, se podría esperar que un compuesto, sal ó profámaco de esta invención tenga un efecto benéfico en combinación con otros agentes guimioterapéuticos anti-metabolitos, tales como, sin limitación, análogos de ácido fólico, por ejemplo, metotrexato (utilizado en el tratamiento de leucemia linfocitica agua, coriocarcinoma, micosis fungiodes, cáncer del pecho, cáncer de la cabeza y el cuello y sarcoma osteogénico) y pteropterina; y los análogos de purina, tales como mercaptopurina y tioguanina, que encuentran uso en el tratamiento de leucemias granulocíticas agudas, linfocíticas agudas y granulocíticas crónicas. También se podría esperar que un compuesto, sal ó profármaco de esta invención sea eficaz en combinación con agentes quimioterapéuticos basados en productos naturales, tales como, sin limitación, los alcaloides vinca, por ejemplo, vinblastina (utilizada en el tratamiento de cáncer del pecho y testicular) , vincristina y vindesina; las epipodofilotoxinas, por ejemplo, etoposida y teniposida, ambas de las cuales son útiles en el tratamiento de cáncer testicular y sarcoma de Kaposi; los agentes quimioterapéuticos antibióticos, por ejemplo, daunorrubicina, doxorrubicina , epirrubicina, mitomicina (utilizada para el tratamiento de cáncer del estómago, cérvix, colon, pecho, vejiga y pancreático), dactinomicina, temozolomida, plica icina, bleomicina (utilizada en el tratamiento de cáncer de la piel, esófago y tracto genitourinario) ; y los agentes quimioterapéuticos enzimáticos, tales como L-asparaginasa. En adición a lo anterior, se podría esperar que un compuesto, sal ó profármaco de esta invención tenga un efecto benéfico utilizado en combinación con los complejos de coordinación de platino (cisplatina, etc.); ureas sustituidas, tales como hidroxiurea; derivados de metilhidrazina, por ejemplo, procarbazina; supresores adrenocorticales, por ejemplo, mitotano, aminoglutetimida, y hormonas y antagonistas de hormonas, tales como adrenocorticosteroides (por ejemplo, prednisona) , progestinas (por ejemplo, caproato de hidroxiprogesterona ) ; estrógenos (Por ejemplo, dietilestilbesterol) ; antiestrógenos, tales como tamoxifeno; andrógenos, por ejemplo, propionato de testosterona; e inhibidores de aromatasa (tales como anastrozol) . Finalmente, se podría esperar que la combinación de un compuesto de esta invención sea particularmente efectiva en combinación con mitoxantrona ó paclitaxel para el tratamiento de cánceres tumorales sólidos ó leucemias, tales como, sin limitación, leucemia mielógena aguda (no linfocítica) . Un compuesto actualmente preferido de esta invención, que se podría esperar que tenga un efecto benéfico en combinación con uno ó más de los agentes quimioterapéuticos anteriores, es el ácido 3- [2 , 4-dimetil-5- (2-oxo-l, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-i1] ropiónico.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS TABLAS La Tabla 1 muestra las estructuras químicas y la actividad biológica de algunos compuestos de ejemplo de esta invención. Los números de compuestos corresponden a los números de ejemplos en la sección de Ejemplos. Es decir, la síntesis del Compuesto 1 en la Tabla 1 se describe en el Ejemplo 1. Los bioensayos utilizados se describen con detalle más adelante. Los resultados se reportan en términos de IC50, la concentración micromolar (µM) del compuesto que se esté probando que ocasione un cambio del 50 por ciento en la actividad de la PTK blanco, comparándose con la actividad de la PTK en un control al que no se le haya agregado ningún compuesto de prueba. De una manera específica, los resultados mostrados indican la concentración de un compuesto de prueba necesaria para ocasionar una reducción del 50 por ciento de la actividad de la PTK blanco. Los compuestos presentados en la Tabla 1 son solamente de ejemplo, y no deben interpretarse para limitar el alcance de esta invención de ninguna manera.

TABLA 1 TABLA 2 La Tabla 2 muestra las estructuras químicas de algunos compuestos adicionales de esta invención. Como en la Tabla 1, los números de compuestos corresponden a los números de Ejemplos. La descripción general de los bioensayos anteriores también se aplica a los bioensayos mostrados en la Tabla 2. 2. INDICACIONES/ENFERMEDADES BLANCO Las cinasas de proteína, cuya actividad catalítica es modulada por los compuestos de esta invención, incluyen cinasas de proteína tirosina, de las cuales hay dos tipos, cinasas de tirosina receptoras (RTKs) y cinasas de tirosina celulares (CTKs) , y las cinasa de serina-treonina (STKs) . La transducción de señales mediada por RTK es iniciada por la interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando) , seguida por dimerización del receptor, estímulo transitorio de la actividad de cinasa de proteína tirosina intrínseca, y fosforilación. De esta manera se crean sitios de enlace para las moléculas de transducción de señales intracelulares, y conducen a la formación de complejos con un espectro de moléculas de señalización citoplásmica que facilitan la respuesta celular apropiada (por ejemplo, división celular, efectos metabólicos sobre el micro-medio ambiente extracelular, etc.). Ver, Schlessinger y Ullrich, 1992, Neuron 9:303-391. Se ha demostrado que los sitios de fosforilación de tirosina sobre los receptores del factor de crecimiento funcionan como sitios de enlace de alta afinidad para los dominios SH2 (homología src) de las moléculas de señalización. (Fantl y colaboradores, 1992, Cell 69:413-423, Songyang y colaboradores, 1994, Mol. Cell. Biol. 14:2777-2785; Songyang y colaboradores, 1993, Cell 72:767-778; y Koch y colaboradores, 1991, Science 252:668-678). Se han identificado varias proteínas de sustrato intracelular que se asocian con las RTKs. Se pueden dividir en dos grupos principales: (1) los sustratos que tienen un dominio catalítico, y (2) los sustratos que carecen de ese dominio, pero que sirven como adaptadores y se asocian con las moléculas catalíticamente activas. Songyang y colaboradores, 1993, Cell 72:767-778. La especificidad de las interacciones entre los receptores y los dominios SH2 de sus sustratos, se determina mediante los residuos de aminoácidos que rodean inmediatamente al residuo de tirosina fosforilado. Las diferencias en las afinidades de enlace entre los dominios SH2 y las secuencias de aminoácidos que rodean a los residuos de fosfotirosina sobre los receptores particulares, son consistentes con las diferencias observadas en sus perfiles de fosforilación del sustrato. Songyang y colaboradores, 1993, Cell 72:767-778. Estas observaciones sugieren que la función de cada RTK es determinada no solamente por su patrón de expresión y disponibilidad de ligando, sino también por el arreglo de las rutas de transducción de señales corriente abajo que son activadas por un receptor particular. Por consiguiente, la fosforilación proporciona un paso regulador importante que determina la selectividad de las rutas de señalización reclutadas por receptores de factor de crecimiento específicos, así como por los receptores de factores de diferenciación. Las STKs, que son primariamente citosólicas, afectan a la bioquímica interna de la célula, con frecuencia como una respuesta de línea descendente para un evento de PTK. Las STKs se han implicado en el proceso de señalización que inicia la síntesis del ADN, y la subsecuente mitosis, conduciendo a la proliferación celular. Por consiguiente, la transducción de señales de cinasas de proteína da como resultado, entre otras respuestas, proliferación, diferenciación, crecimiento y metabolismo celulares. La proliferación celular anormal puede dar como resultado un amplio conjunto de desórdenes y enfermedades, incluyendo el desarrollo de neoplasia, tal como carcinoma, sarcoma, glioblastoma y hemangioma, desórdenes, tales como leucemia, psoriasis, arterioesclerosis, artritis y retinopatía diabética, y otros desórdenes relacionados con la angiogénesis y/ó vasculogénesis no controladas. No se requiere un entendimiento preciso del mecanismo mediante el cual los compuestos de esta invención inhiben las cinasas de proteína con el objeto de practicar la presente invención. Sin embargo, aunque no pretendemos mediante la presente obligarnos a ningún mecanismo ó teoría en particular, se cree que los compuestos interactúan con los aminoácidos en la región catalítica de las cinasas de proteína. Las cinasas de proteína normalmente poseen una estructura bi-lobada, en donde el ATP parece fijarse en la hendidura entre los dos lóbulos en una región en donde los aminoácidos están conservados entre las cinasas de proteína. Se cree que los inhibidores de cinasas de proteína se enlazan mediante interacciones no covalentes, tales como enlace de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, e interacciones iónicas, en la misma región general en donde el ATP anteriormente mencionado se enlaza con las cinasas de proteína. De una manera más específica, se piensa que el componente de 2-indolinona de los compuestos de esta invención se fija en el espacio general normalmente ocupado por el anillo de adenina del ATP. La especificidad de una molécula particular para una cinasa de proteína particular se puede presentar entonces como el resultado de interacciones adicionales entre los diferentes sustituyentes sobre el núcleo de 2-indolinona y los dominios de aminoácidos específicos para las cinasas de proteína particulares. Por consiguiente, diferentes sustituyentes de indolinona pueden contribuir al enlace preferencial con cinasas de proteína particulares. La capacidad para seleccionar los compuestos activos en diferentes sitios de enlace de ATP (u otro nucleótido) , hace que los compuestos de esta invención sean útiles para dirigir cualquier proteína a dicho sitio. Los compuestos dados a conocer en la presente, por lo tanto, pueden tener utilidad como ensayos in vitro para estas proteínas, así como exhiben efectos terapéuticos en vivo a través de su interacción con estas proteínas. En otro aspecto, la cinasa de proteína, cuya actividad catalítica es modulada mediante el contacto con un compuesto de esta invención, es una cinasa de proteína tirosina, más particularmente una cinasa de proteína tirosina receptora. Entre las cinasas de proteína tirosina receptoras cuya actividad catalítica se puede modular con un compuesto de esta invención, ó una sal del mismo, están, sin limitación, EGF, HER2, HER3 , HER4 , IR, IGF-1R, IRR, PDGFRa , PDGFRß, CSFIR, C-Kit, C-fms, Flk-IR, Flk4, KDR/Flk-1, Flt-1, FGFR-1R, FGFR-2R, FGFR-3R y FGFR-4R. La cinasa de proteína tirosinei cuya actividad catalítica se modula mediante el contacto con un compuesto de esta invención, ó una sal ó profármaco del mismo, también puede ser una cinasa de proteína tirosina celular (CTK) ó no receptora. Por lo tanto, la actividad catalítica de las CTKs, tales como, sin limitación, Src, Frk, Btk, Csk, Abl, ZAP70, Fes, Fps, Fak, Jak, Ack, Yes, Fyn, Lyn, Lck, Bik, Hck, Fgr y Yrk, se puede modular mediante el contacto con un compuesto ó sal de esta invención. Todavía otro grupo de cinasas de proteína a las que se les puede modular su actividad catalítica mediante el contacto con un compuesto de esta invención, son las cinasas de proteína serina-treonina, tales como, sin limitación, CDK2 y Raf. En otro aspecto, esta invención se refiere a un método para el tratamiento ó la prevención de un desorden relacionado con cinasa de proteína, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de esta invención, ó una sal ó un profármaco del mismo, a un organismo. También es un aspecto de esta invención, que se administre una composición farmacéutica que contenga un compuesto de esta invención, ó una sal ó profármaco del mismo, a un organismo, para el propósito de prevenir ó tratar un desorden relacionado con cinasa de proteína. Por consiguiente, esta invención se refiere a compuestos que modulan la transducción de señales de cinasa de proteína, afectando la actividad enzimática de las RTKs, CTKs y/ó STKs, interfiriendo de esta manera con las señales transducidas por estas proteínas. De una manera más particular, la presente invención se refiere a compuestos que modulan las rutas de transducción de señales mediadas por RTK, CTK y/ó STK, como un planteamiento terapéutico para curar muchas clases de tumores sólidos, incluyendo, pero no limitándose a, carcinomas, sarcomas, incluyendo sarcoma de Kaposi, eritroblastoma, glioblastoma, meningioma, astrocitoma, melanoma y mioblasto a.

El tratamiento ó la prevención de cánceres tumorales no sólidos, tales como leucemia, también es contemplado por esta invención. Las indicaciones pueden incluir, pero no se limitan a, cánceres del cerebro, cánceres de la vejiga, cánceres del ovario, cánceres gástricos, cánceres del páncreas, cánceres del colon, cánceres de la sangre, cánceres del pulmón y cánceres óseos. Los ejemplos adicionales, sin limitación, de los tipos de desórdenes relacionados con una actividad inapropiada de la cinasa de proteína en donde los compuestos descritos en la presente pueden ser útiles para prevenir, tratar y estudiar, son los desórdenes proliferativos celulares, los desórdenes fibróticos y los desórdenes metabólicos. Los desórdenes proliferativos celulares, que pueden ser prevenidos, tratados ó estudiados adicionalmente por la presente invención, incluyen cáncer, desórdenes proliferativos de los vasos sanguíneos, y desórdenes proliferativos de las células mesangiales. Los desórdenes proliferativos de los vasos sanguíneos se refieren a desórdenes relacionados con una vasculogénesis anormal (formación de vasos sanguíneos) y angiogénesis (extensión de vasos sanguíneos) . Aunque la vasculogénesis y la angiogénesis tienen papeles importantes en una variedad de procesos fisiológicos normales, tales como el desarrollo embriónico, la formación del corpus luteum, el sanado de heridas, y la regeneración de órganos, también tienen un papel pivotal en el desarrollo de cáncer, en donde dan como resultado la formación de nuevos capilares necesarios para mantener un tumor vivo. Otros ejemplos de desórdenes de proliferación de los vasos sanguíneos incluyen artritis, en donde los nuevos vasos sanguíneos capilares invaden la articulación y destruyen el cartílago, y enfermedades oculares, como retinopatía diabética, en donde los nuevos capilares en la retina invaden el humor vitreo, sangran y ocasionan ceguera. Se han identificado dos RTKs estructuralmente relacionadas que fijan el VEGF con una alta afinidad: el receptor de tirosina tipo fms 1 (fit-1) (Shibuya y colaboradores, 1990, Oncogene, 5:519-524; De Vries y colaboradores, 1992, Science, 255:989-991) y el receptor de KDR/FLK-1, también conocido como VEGF-R2. Se ha reportado que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es un mitógeno específico de las células endoteliales, con actividad promotora del crecimiento celular endotelial in vitro . Ferrara y Henzel, 1989, Biochein. Biophys. Res. Comm. , 161:851-858; Vaisman y colaboradores, 1990, J. Biol. Chem. , 265:19461-19566. La información estipulada en las solicitudes de los Estados Unidos de Norteamérica con Números de Serie 08/193,829, 08/038,596 y 07/975,750, sugiere fuertemente que el VEGF no solamente es responsable de la proliferación de células endoteliales, sino que también es el regulador primario de la angiogénesis normal y patológica. Ver en general, Klagsburn y Soker, 1993, Current Biolosy. 3(10) 699-702; Houck y colaboradores, 1992, J. Biol. Chem. , 267:26031-26037. La vasculogénesis y la angiogénesis normales tienen importantes papeles en una variedad de procesos fisiológicos, tales como el desarrollo embriogénico, el sanado de heridas, la regeneración de órganos y los procesos reproductivos femeninos, tales como el desarrollo de folículos en el corpus luteum durante la ovulación, y el crecimiento placentario después del embarazo. Folkman y Shing, 1992, J_. Biological Chem.. 267 (16) : 10931-34. La vasculogénesis y/ó angiogénesis incontrolada se ha asociado con enfermedades, tales como diabetes, asi como con tumores sólidos malignos que se apoyan en la vascularización para el crecimiento. Klagsburn y Soker, 1993, Current Bioloqy. 3 (10) : 699-702 ; Folkham, 1991, J. Nati. Cáncer Inst. , 82:4-6; Wiedner y colaboradores, 1991, New Engl. J. Med.. 324:1-5. El papel supuesto del VEGF en la proliferación y emigración de las células endoteliales durante la angiogénesis y la vasculogénesis, indica un papel importante para el receptor de KDR/FLK-1 en estos procesos. Las enfermedades tales como diabetes mellitus (Folkman, 1998, en Xlth Conqress of Thrombosis and Haemostasis (Verstraeta, y colaboradores, editores), páginas 583-596, Leuven University Press, Leuven) , y la artritis, así como el crecimiento tumoral maligno, pueden resultar de una angiogénesis incontrolada. Ver, por ejemplo, Folkman, 1971, N. Enal. J. Med. , 285:1182-1186. Los receptores a los que se fija el VEGF específicamente son un blanco terapéutico importante y poderoso para la regulación y modulación de la vasculogénesis y/ó angiogénesis, y una variedad de enfermedades severas que involucran crecimiento celular anormal ocasionado por estos procesos. Plowan y colaboradores, 1994, DN&P, 7 (6) : 334-339. De una manera más particular, el papel altamente específico del receptor de KDR/FLK-1 en la neurovascularización, lo convierten en un blanco de elección para los planteamientos terapéuticos para el tratamiento de cáncer y otras enfermedades que involucran la formación incontrolada de los vasos sanguíneos. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención se refiere a compuestos capaces de regular y/ó modular la transducción de señales de cinasa de tirosina, incluyendo la transducción de señales del receptor de KDR/FLK-1, con el objeto de inhibir ó promover la angiogénesis y/ó la vasculogénesis, es decir, compuestos que inhiben, previenen, ó interfieren con la señal transducida por KDR/FLK-1 cuando se activa mediante ligandos, tales como VEGF. Aunque se cree que los compuestos de la presente invención actúan sobre un receptor u otro componente a lo largo de la ruta de transducción de señales de la cinasa de tirosina, también pueden actuar directamente sobre las células tumorales que resultan de una angiogénesis incontrolada. Aunque la nomenclatura de las contrapartes humana y murina del receptor "flk-I" genérico difieren, en muchos aspectos son intercambiables. El receptor de murino, Flk-1, y su contraparte humana, KDR, comparten una homología de secuencias del 93.4 por ciento dentro del dominio intracelular. De la misma manera, el FLK-I de murino se enlaza con el VEGF humano con la misma afinidad que el VEGF de ratón, y de acuerdo con lo anterior, se activa mediante el ligando derivado de cualquier especie. Millauer y colaboradores, 1993, Cell, 72:835-846; Quinn y colaboradores, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 90:7533-7537. FLK-1 también se asocia con, y subsecuentemente fosforila con tirosina los sustratos de RTK humanos (por ejemplo, PLC-? ó p85) cuando se co-expresa en las células 293 (fibroblastos de riñon embriónico humano) . Los modelos que se apoyan en el receptor FLK-1, por consiguiente, son directamente aplicables al entendimiento del receptor KDR. Por ejemplo, el uso del receptor de FLK-1 de murino en los métodos que identifican compuestos que regulan la ruta de transducción de señales de murino, es directamente aplicable a la identificación de compuestos que se pueden utilizar para regular la ruta de transducción de señales humana, es decir, que' regula la actividad relacionada con el receptor de KDR. Por consiguiente, los compuestos químicos identificados como inhibidores de KDR/FLK-1 in vitro , se pueden confirmar en modelos adecuados en vivo. Se ha demostrado que tanto el modelo de ratón en vivo como el modelo animal de rata, son de un excelente valor para el examen del potencial clínico de los agentes que actúan sobre la ruta de transducción de señales inducida por KDR/FLK-1. Por consiguiente, en un aspecto, esta invención se refiere a compuestos que regulan, modulan y/ó inhiben la vasculogénesis y/ó la angiogénesis, afectando la actividad enzimática del receptor de KDR/FLK-1, e interfiriendo con la señal transducida por KDR/FLK1. En otro aspecto, la presente invención se refiere a compuestos que regulan, modulan y/ó inhiben la ruta de transducción de señales mediada por KDR/FLK-1 como un planteamiento terapéutico para el tratamiento de muchas clases de tumores sólidos, incluyendo, pero no limitándose a, glioblastoma, melanoma y sarcoma de Kaposi, y carcinoma del ovario, del pulmón, mamario,, de la próstata, pancreático, del colon y epidermoide. En adición, los datos sugieren que la administración de compuestos que inhiban la ruta de transducción de señales mediada por KDR/Flk-1 también se puede utilizar en el tratamiento de hemangioma, restenosis y retinopatía diabética. Un aspecto adicional de esta invención se refiere a la inhibición de vasculogénesis y angiogénesis mediante otras rutas mediadas por receptores, incluyendo la ruta que comprende al receptor de flt-1.

La transducción de señales mediada por cinasa de tirosina receptora es iniciada por la interacción extracelular con un factor de crecimiento específico (ligando) , seguida por dimerización del receptor, estímulo transitorio de la actividad de cinasa de proteína tirosina intrínseca, y autofosforilación. De esta manera se crean sitios de enlace para las moléculas de transducción de señales intracelulares, lo cual conduce a la formación de complejos con un espectro de moléculas de señalización citoplásmicas que facilitan la respuesta celular apropiada, por ejemplo, efectos de división celular y metabólicos en el micro-medioambiente extracelular. Ver, Schlessinger y Ullrich, 1992, Neuron, 9:1-20. La estrecha homología de las regiones intracelulares de KDR/FLK-1 con aquélla del receptor de PDGF-ß (homología del 50.3 por ciento), y/ó el receptor de flt-1 relacionado, indica la inducción de rutas de transducción de señales traslapadas. Por ejemplo, para el receptor de PDGF-ß, se ha demostrado que los miembros de la familia src (Twamley y colaboradores, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA. 90:7696-7700), fosfatidilinositol-3 ' -cinasa (Hu y colaboradores, 1992, Mol. Cell. Biol. , 12:981-990), fosfolipasa c? (Kashishian y Cooper, 1993, Mol. Cell. Biol . , 4:49-51), proteína activadora de ras-GTPasa (Kashishian y colaboradores, 1992, EMBO J .. 11:1373-1382), PTP-ID/syp (Kazlauskas y colaboradores, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 10 90:6939-6943), Grb2 (Arvidsson y colaboradores, 1994, Mol.

Cell. Biol. , 14:6715-6726), y las moléculas adaptadoras Shc y Nck (Nishimura y colaboradores, 1993, Mol. Cell. Biol.. 13:6889-6896), se enlazan con regiones que involucran diferentes sitios de autofosforilación. Ver en general, Claesson-Welsh, 1994, Prog. Growth Factor Res., 5:37-54. Por consiguiente, es posible que las rutas de transducción de señales activadas por KDR/FLK-1 incluyan la ruta ras (Rozakis y colaboradores, 1992, Nature, 360:689-692) , la PI-3 ' -cinasa, y las rutas mediadas por src y por plc?. Cada una de estas rutas puede tener un papel crítico en el efecto angiogénico y/ó vasculogénico de KDR/FLK-1 en las células endoteliales. En consecuencia, un aspecto todavía adicional de esta invención se refiere al uso de los compuestos orgánicos descritos en la presente para modular la angiogénesis y la vasculogénesis, como estos procesos son controlados por estas rutas. Inversamente, también están implicados los desórdenes relacionados con el encogimiento, contracción ó cierre de los vasos sanguíneos, tales como restenosis, y se pueden tratar ó prevenir mediante los métodos de esta invención. Los desórdenes fibróticos se refieren a la formación anormal de matrices extracelulares. Los ejemplos de los desórdenes fibróticos incluyen cirrosis hepática y desórdenes proliferativos celulares mesangiales. La cirrosis hepática se caracteriza por el incremento en los constituyentes de la matriz extracelular que dan como resultado la formación de una cicatriz hepática. Una matriz extracelular incrementada que dé como resultado una cicatriz hepática, también puede ser ocasionada por una infección viral, tal como hepatitis. Los lipocitos parecen tener un papel importante en la cirrosis hepática. Otros desórdenes fibróticos implicados incluyen ateroesclerosis . Los desórdenes proliferativbs celulares mesangiales se refieren a desórdenes provocados por la proliferación anormal de las células mesangiales. Los desórdenes proliferativos mesangiales incluyen diferentes enfermedades renales humanas, tales como glomerulonefritis, nefropatía diabética y nefroesclerosis maligna, así como desórdenes, tales como síndromes de microangiopatía trombótica, rechazo de trasplante, y glomerulopatías. El RTK PDGFR se ha implicado en el mantenimiento de la proliferación celular mesangial. Floege y colaboradores, 1993, Kideny International 43 : 47S-54S. Muchos cánceres son desórdenes proliferativos celulares, y como se observó anteriormente, las cinasas de proteína se han asociado con los desórdenes proliferativos celulares. Por consiguiente, no es sorprendente que las cinasas de proteina, tales como, por ejemplo, los miembros de la familia RTK, se hayan asociado con el desarrollo de cáncer. Algunos de estos receptores, como EGFR (Tuzi y colaboradores, 1991, Br. J. Cáncer 63:227-233, Torp y colaboradores, 1992, APMIS 100:713-719) HER2/neu (Slamon y colaboradores, 1989, Science 244:707-712) y PDGF-R (Kumabe y colaboradores, 1992, Oncogene, 7:627-633) son sobre-expresados en muchos tumores y/ó son persistentemente activados por los ciclos autócrinos. De hecho, en los cánceres más comunes y severos, estas sobre-expresiones del receptor (Akbasak y Suner-Akbasak y colaboradores, 1992, J. Neurol. Sci. , 111:119-133, Dickson y colaboradores, 1992, Cáncer Treatment Res. 61:249-273, Korc y colaboradores, 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) y los ciclos autócrinos (Lee y Donoghue, 1992, J. Cell. Biol.. 118:1057-1070, Korc y colaboradores, supra, Akbasak y Suner-Akbasak y colaboradores, supra) ya se han demostrado. Por ejemplo, el EGFR se ha asociado con carcinoma de células escamosas, astrocitoma, glioblastoma, cáncer de la cabeza y el cuello, cáncer del pulmón y cáncer de la vejiga. HER2 se ha asociado con cáncer del pecho, del ovario, gástrico, del pulmón, del páncreas y de la vejiga. PDGFR se ha asociado con glioblastoma y melanoma, así como cáncer del pulmón, del ovario y de la próstata. RTK c-met se ha asociado también con la formación de tumor maligno. Por ejemplo, c-met se ha asociado con, entre otros cánceres, carcinomas y linfomas colorrectales, de tiroides, pancreáticos, gástricos y hepatocelulares. Adicionalmente, c-met se ha ligado con leucemia. La sobre-expresión del gen c-met también se ha detectado en pacientes con enfermedad de Hodgkins y enfermedad de Burkitts. El IGF-IR, en adición a estar implicado en el soporte nutricional y en diabetes tipo II, también se ha asociado con varios tipos de cáncer. Por ejemplo, el IGF-I se ha implicado como un estimulante del crecimiento autócrino para varios tipos de tumores, por ejemplo, células de carcinoma de cáncer de pecho humanas (Arteaga y colaboradores, 1989, J. Clin. Invest. , 84:1418-1423) y células tumorales de pulmón pequeñas (Macauley y colaboradores, 1990, Cáncer Res. , 50:2511-2517). En adición, el IGF-I, aunque está integralmente involucrado en el crecimiento y diferenciación normales del sistema nervioso, también parece ser un estimulante autócrino de los glio as humanos. Sandberg-Nordqvist y colaboradores, 1993, Cáncer Res. 53:2475-2478. La importancia del IGF-IR y sus ligandos en la proliferación celular además es apoyada por el hecho de que muchos tipos de células en cultivo (fibroblastos, células epiteliales, células de músculo liso, linfocitos T, células ieloides, condrocitos y osteoblastos (las células de tallo de la médula ósea)) son estimuladas por IGF-I para crecer. Goldring y Goldring, 1991, Eukaryotic Gene Expression, 1:301-326. En una serie de publicaciones recientes, Baserga sugiere que el IGF-IR tiene un papel central en el mecanismo de la transformación y, como tal, podría ser un blanco preferido para las intervenciones terapéuticas para un amplio espectro de malignidades humanas. Baserga, 1995, Cáncer Res. , 55:249-252, Baserga, 1994, Cell 79:927-930, Coppola y colaboradores, 1994, Mol. Cell. Biol.. 14:4588-4595.

Las STKs se han implicado en muchos tipos de cáncer, incluyendo notoriamente cáncer del pecho (Canee, y colaboradores, Int. J. Cáncer, 54:571-77 (1993)). La asociación entre la actividad anormal de la cinasa de proteína y la enfermedad no está restringida al cáncer. Por ejemplo, las RTKs se han asociado con enfermedades tales como psoriasis, diabetes mellitus, endometrios Ls, angiogénesis, desarrollo de placa ateromatosa, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de von Hippel-Lindau, hiperproliferación epidérmica, enfermedades neurodegenerativas, degeneración macular relacionada con la edad y hemangiomas. Por ejemplo, el EGFR se ha indicado en el sanado de heridas córneas y dérmicas. Los defectos en la Insulina-R e IGF-1R, se indican en diabetes mellitus tipo II. Una correlación más completa entre las RTKs específicas y sus indicaciones terapéuticas se estipula en Plowman y colaboradores, 1994, DN&P 7:334-339. Como se observó anteriormente, no solamente las RTKs, sino las CTKs, incluyendo, pero no limitándose a, src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, bik, hck, fgr y yrk (revisadas en Bolen y colaboradores, 1992, FASEB J. , 6:3403-3409) están involucradas en la ruta de transducción de señales proliferativa y metabólica, y por consiguiente, se podría esperar, y se ha demostrado, que están involucradas en muchos desórdenes mediados por PTK a los que se dirige la presente invención. Por ejemplo, se ha demostrado que la src mutada (v- src) es una oncoproteína (pp60v_src) en pollos. Más aún, su homóloqo celular, el proto-oncógeno pp60c-srcI) transmite señales oncogénicas de muchos receptores. La sobre-expresión de EGFR ó HER2/neu en tumores, conduce a la activación constitutiva de pp60c-src, que es característica de las células malignas, pero está ausente en las células normales. Por otra parte, los ratones deficientes en la expresión de c-src exhiben un fenotipo osteopetrótico, indicando una participación clave de c-src en la función de los osteoclastos, y un posible involucramiento en desórdenes relacionados. De una manera similar, se ha implicado Zap70 en las señalización de células T, que puede relacionarse con los desórdenes autoinmunes. Las STKs se han asociado con inflamación, enfermedad autoinmune, inmunorrespuestas , y desórdenes de hiperproliferación, tales como restenosis, fibrosis, psoriasis, osteoartritis y artritis reumatoide. Las cinasas de proteína también se han implicado en la implantación de embriones. Por consiguientes, los compuestos de esta invención pueden proporcionar un método efectivo para prevenir esta implantación de embriones, y por lo mismo, pueden ser útiles como agentes de control de nacimiento. Finalmente, actualmente se sospecha que tanto las RTKs como las CTKs están involucradas en desórdenes hiperinmunes.

Otro aspecto de la invención es un método para identificar un compuesto químico que modula la actividad catalítica de una ó más de las cinasas de proteína anteriormente discutidas. El método involucra poner en contacto células que expresen la cinasa de proteína deseada, con un compuesto de esta invención (ó su sal ó profármaco) , y monitorear las células para determinar cualquier efecto que tenga el compuesto sobre ellas. El efecto puede ser cualquier cambio ó ausencia de cambio observable, ya sea a simple vista ó a través del uso de instrumentación, en un fenotipo celular. El cambio ó ausencia de cambio en el fenotipo celular monitoreado, puede ser, por ejemplo, sin limitación, un cambio ó ausencia de cambio en la actividad catalítica de la cinasa de proteína en las células, ó un cambio ó ausencia de cambio en la interacción de la cinasa de proteína con un componente de enlace natural. Los ejemplos del efecto de un número de compuestos de ejemplo de esta invención sobre varias PTKs se muestran en las Tablas 1 y 2, y en la sección de Ejemplos Biológicos, más adelante. Los compuestos y datos presentados no deben interpretarse para limitar el alcance de esta invención de ninguna manera.

. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y USO Un compuesto de la presente invención, un profármaco del mismo ó una sal fisiológicamente aceptable del compuesto ó su profármaco, se puede administrar como tal a un paciente humano, ó se puede administrar en composiciones farmacéuticas en donde se mezclen los materiales anteriores con vehículos ó excipientes adecuados. Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington's Pharmacological Sciences, "Mac Publishing Co., Easton, PA, última edición.

Vías de Administración Como se utiliza en la presente, "administrar" ó "administración" se refiere al suministro de un compuesto, sal ó profármaco de la presente invención, ó de una composición farmacéutica que contenga un compuesto, sal ó profármaco de esta invención, a un organismo, para el propósito de prevenir ó tratar un desorden relacionado con cinasa de proteína. Las vías de administración adecuadas pueden incluir, sin limitación, administración oral, rectal, transmucosa ó intestinal, ó inyecciones intramusculares, subcutáneas, intramedulares, intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intravítreas, intraperitoneales, intranasales ó intraoculares. Las vías de administración preferidas son oral y parenteral. De una manera alternativa, se puede administrar el compuesto de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante inyección del compuesto directamente en un tumor sólido, con frecuencia en una formulación de depósito ó de liberación sostenida. Además, se puede administrar el fármaco en un sistema de suministro de fármaco dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico del tumor. Los liposomas se dirigirán y serán recuperados selectivamente por el tumor.

Composición/Formulación Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, e ulsionamiento, encapsulación, atrape ó liofilización. Las composiciones farmacéuticas para utilizarse de conformidad con la presente invención se pueden formular de una manera convencional, utilizando uno ó más vehículos fisiológicamente aceptables que comprendan excipientes y auxiliares que faciliten el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se puedan utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada depende de la via d administración elegida. Para inyección, los compuestos de; la invención se pueden formular en soluciones acuosas, de preferencia en reguladores fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hanks, solución de Ringer, ó regulador de suero fisiológico. Para la administración transmucosa, se utilizan penetrantes apropiados para que se permee la barrera e.n la formulación. Estos penetrantes son generalmente conocidos en este campo. Para la administración oral, los compuestos se pueden formular mediante la combinación de los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la materia. Estos vehículos hacen posible que los compuestos de la invención se formulen como tabletas, pildoras, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para ser ingeridos oralmente por un paciente. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden hacer utilizando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y procesando la mezcla de granulos, después de agregar otros auxiliares adecuados, si se desea, para obtener tabletas ó núcleos de grageas. Los excipientes útiles son, en particular, rellenos, tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol ó sorbitol, preparaciones de celulosa, tales como, por ejemplo, almidón de maiz, almidón de trigo, almidón de arroz y almidón de papa, y otros materiales, tales como gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, caboximetilcelulosa de sodio, y/ó polivinilpirrolidona (PVP) . Si se desea, se pueden agregar agentes desintegrantes, tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar, ó ácido algínico. También se puede utilizar una sal, tal como alginato de sodio. A los núcleos de gragea se les proporcionan recubrimientos adecuados. Para este propósito, se pueden utilizar soluciones de azúcar concentradas, que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidiona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/ó dióxido de titanio, soluciones de laca, y solventes ó mezclas de solventes orgánicos adecuados. Se pueden agregar colorantes ó pigmentos a las tabletas ó recubrimientos de grageas para identificación ó para caracterizar diferentes combinaciones de dosis del compuesto activo. Las composiciones farmacéuticas que se pueden utilizar oralmente incluyen cápsulas de ajuste por empuje hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol ó sorbitol. Las cápsulas d ajuste por empuje pueden contener los ingredientes activos mezclados con un relleno, tal como lactosa, un aglutinante, tal como almidón, y/ó un lubricante, tal como talco ó estearato de magnesio, y opcionalmente estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver ó suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, ó polietilenglicoles líquidos. Se pueden agregar estabilizantes en estas formulaciones también. Para administrarse mediante inhalación, los compuestos para utilizarse de conformidad con la presente invención convenientemente se suministran en la forma de un rocío en aerosol, utilizando un paquete presurizado ó un nebulizador y un propelente adecuado, por ejemplo, sin limitación, diclorodifluorometano, tricolorofluorometano, diclorotetrafluoroetano ó dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede controlar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas; y cartuchos, por ejemplo, de gelatina, para utilizarse en un inhalador ó insuflador, que contengan una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, tal como lactosa ó almidón. Los compuestos también se pueden formular para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección de bolo ó infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolletas ó en recipientes de múltiples dosis, con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones ó emulsiones en vehículos oleosos ó acuosos, y pueden contener materiales de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilización y/ó dispersión. Las composiciones farmacéuticas para administración parental incluyen soluciones acuosas de una forma soluble en agua, tales como, sin limitación, una sal, del compuesto activo. Adicionalmente, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos en un vehículo lipofílico. Los vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de ajonjolí, esteres de ácido graso sintéticos, tales como oleato de etilo y triglicéridos, ó materiales tales como liposomas. Las suspensiones para inyección acuosas pueden contener sustancias que incrementen la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, ó dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes y/ó agentes adecuados que incrementen la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. De una manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constituirse con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril exenta de pirógeno, antes de usarse. Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales, tales como supositorios ó enemas de retención, utilizando, por ejemplo, bases de supositorio convencionales, tales como manteca de cacao u otros glicéridos. En adición a las formulaciones descritas anteriormente, los compuestos también se pueden formular como preparaciones de depósito. Estas formulaciones de larga acción se pueden administrar mediante implantación (por ejemplo, subcutáneamente ó intramuscularmente) , ó mediante inyección intramuscular. Un compuesto de esta invención se puede formular para esta vía de administración con materiales poliméricos ó hidrofóbicos adecuados (por ejemplo, en una emulsión con un aceite farmacológicamente aceptable) , con resinas de intercambio de iones, ó como un derivado escasamente soluble, tal como, sin limitación, una sal escasamente soluble. Un ejemplo no limitante de un vehículo farmacéutico para los compuestos hidrofóbicos de la invención es un sistema de cosolvente que comprende alcohol bencílico, un tensoactivo no polar, un polímero orgánico miscible en agua, y una fase acuosa, tal como un sistema de cosolvente VPD. VPD es una solución del 3 por ciento en peso/volumen de alcohol bencílico, el 8 por ciento en peso/volumen del tensoactivo no polar Polysorbate 80MR, y el 65 por ciento en peso/volumen de polietilenglicol 300, rellenado hasta el volumen en etanol absoluto. El sistema de cosolvente VPD (VPD:D5W) consiste en VPD diluido a 1:1 con una solución de dextrosa al 5 por ciento en agua. Este sistema de cosolvente disuelve bien los compuestos hidrofóbicos, y él mismo produce una baja toxicidad después de su administración sistémica. Naturalmente, las proporciones de este sistema de cosolvente se pueden variar considerablemente sin destruir sus características de solubilidad y toxicidad. Además, la identidad de los componentes del cosolvente se pueden variar: por ejemplo, se pueden utilizar otros tensoactivos no polares de baja toxicidad en luqar de Polysorbate 80MR, se puede variar el tamaño fraccional del polietilenglicol, otros polímeros biocompatibles pueden reemplazar al polietilenglicol, por ejemplo, polivinilpirrolidona, y otros azúcares ó polisacáridos pueden sustituir a la dextrosa. De una manera alternativa, se pueden emplear otros sistemas de suministro para los compuestos farmacéuticos hidrofóbicos. Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos ó portadores de suministro para los fármacos hidrofóbicos. En adición, se pueden emplear ciertos solventes orgánicos, tales como sulfóxido de dimetilo, aunque con frecuencia al costo de una mayor toxicidad. Adicionalmente, los compuestos se pueden suministrar utilizando un sistema de liberación sostenida, tal como en matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contengan al agente terapéutico. Se han establecido diferentes materiales de liberación sostenida, y son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida, dependiendo de su naturaleza química, pueden liberar los compuestos durante unas cuantas semanas hasta más de 100 días. Dependiendo de la naturaleza química y de la estabilidad biológica del reactivo terapéutico, se pueden emplear estrategias adicionales para la estabilización de la proteína.

Las composiciones farmacéuticas de la presente también pueden comprender vehículos ó excipientes sólidos ó en fase de gel adecuados. Los ejemplos de estos vehículos ó excipientes incluyen, pero no se limitan a, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diferentes azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros, tales como polietilenglicoles. Muchos de los compuestos moduladores de cinasa de proteína de la invención se pueden proporcionar como sales fisiológicamente aceptables, en donde el compuesto reivindicado puede formar la especie negativamente ó positivamente cargada. Los ejemplos de las sales en donde el compuesto forma la fracción positivamente cargada incluyen, sin limitación, amonio cuaternario (definido en cualquier otra parte de la presente) , sales, tales como el clorhidrato, sulfato, carbonato, lactato, tartrato, maleato, succinato, en donde el átomo de nitrógeno del grupo amonio cuaternario es un nitrógeno del compuesto seleccionado de esta invención, que ha reaccionado con el ácido apropiado. Las sales en donde un compuesto de esta invención forma la especie negativamente cargada incluyen, sin limitación, las sales de sodio, potasio, calcio y magnesio formadas mediante la reacción de un grupo ácido carboxílico en el compuesto con una base apropiada (por ejemplo, hidróxido de sodio (NaOH) , hidróxido de potasio (KOH) , hidróxido de calcio (Ca(OH)2) , etc. ) .

Dosificación Las composiciones farmacéuticas adecuadas para utilizarse en la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad suficiente para lograr el propósito pretendido, es decir, la modulación de la actividad de cinasa de proteína ó el tratamiento ó la prevención de un desorden relacionado con cinasa de proteína. De una manera más específica, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad del compuesto efectiva para prevenir, aliviar ó aminorar los síntomas de la enfermedad, ó prolongar la sobrevivencia del sujeto que se esté tratando. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está bien dentro de la capacidad de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en la presente. Para cualquier compuesto utilizado en los métodos de la invención, la cantidad ó dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Entonces, la dosificación se puede formular para utilizarse en modelos animales, con el fin de lograr un rango de concentración circulante que incluya la IC50 determinada en el cultivo celular (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logre una inhibición media-máxima de la actividad de la cinasa de proteína) . Entonces se puede utilizar esta información para determinar más precisamente las dosis útiles en seres humanos. La toxicidad y la eficacia terapéutica de los compuestos descritos en la presente se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares ó en animales experimentales, por ejemplo, mediante la determinación de la IC50 y de la LD50 (ambas de las cuales se discuten en cualquier otra parte de la presente) para un compuesto objeto. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivos celulares y estudios animales, se pueden utilizar en la formulación de un rango de dosificaciones para utilizarse en seres humanos. \La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación, pueden ser elegidas por el médico individual en vista de la condición del paciente (ver, por ejemplo, Fingí y colaboradores, 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Capítulo 1, página 1). La cantidad e intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles en plasma de la especie activa que sean suficientes para mantener los efectos moduladores de cinasa. Estos niveles en plasma son referidos como las concentraciones efectivas mínimas (MECs) . La MEC variará para cada compuesto, pero se puede estimar a partir de los datos in vitro , por ejemplo, la concentración necesaria para lograr una inhibición del 50 al 90 por ciento de una cinasa se puede aseverar utilizando los ensayos descritos en la presente. Las dosificaciones necesarias para lograr la concentración efectiva mínima dependerán de las características individuales y de la vía de administración. Se pueden utilizar ensayos de HPLC ó bioensayos para determinar las concentraciones en plasma. También se pueden determinar los intervalos de dosificación utilizando el valor de la concentración efectiva mínima. Los compuestos se deben administrar utilizando un régimen que mantenga niveles en plasma arriba de la concentración efectiva minima durante el 10 al 90 por ciento del tiempo, de preferencia entre el 30 y el 90 por ciento, y más preferiblemente entre el 50 y el 90 por ciento. En los casos de administración local ó recuperación selectiva, la concentración local efectiva de:l fármaco puede no estar relacionada con la concentración en plasma, y se pueden emplear otros procedimientos conocidos en la materia para determinar la cantidad de dosificación correcta y el intervalo. La cantidad de una composición administrada, por supuesto, dependerá del sujeto que se esté tratando, de la severidad de la aflicción, de la manera de administración, del juicio del médico que prescriba, etc.

Empaque Si se desea, las composiciones se pueden presentar en un dispositivo de paquete ó dosificador, tal como un estuche aprobado por la FDA, que puede contener una ó más formas de dosificación unitaria que contengan al ingrediente activo. Por ejemplo, el paquete puede comprender lámina metálica ó de plástico, tal como un paquete de ampolla. El paquete ó dispositivo dosificador puede estar acompañado por instrucciones para su administración. El paquete ó dosificador también puede estar acompañado por una notificación asociada con el recipiente en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regule la fabricación, uso ó venta de productos farmacéuticos, cuya notificación refleje la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones ó de la administración humana ó veterinaria. Esta notificación, por ejemplo, puede ser de la etiqueta aprobada por la U.S. Food and Drug Administration para los fármacos de prescripción, ó de un inserto del producto aprobado. También se pueden preparar composiciones que comprendan un compuesto de la invención formulado en un vehículo farmacéutico compatible, colocado en un recipiente apropiado, y etiquetado para el tratamiento de una condición indicada. Las condiciones adecuadas indicadas en la etiqueta pueden incluir el tratamiento de un tumor, la inhibición de angiogénesis, el tratamiento de fibrosis, diabetes y similares. 6. SÍNTESIS Los compuestos de esta invención, así como los 2-oxindoles y aldehidos precursores, se pueden sintetizar fácilmente utilizando técnicas bien conocidas en el campo químico. Será apreciado por los expertos en la materia, que están disponibles otras rutas sintéticas para formar los compuestos de la invención, y que lo siguiente se ofrece a manera de ejemplo y no de limitación.

A. Procedimiento sintético general Se puede emplear la siguiente metodología general para preparar los compuestos de esta invención: El 2-oxindol apropiadamente sustituido (1 equivalente), el aldehido apropiadamente sustituido (1.2 equivalentes), y piperidina (0.1 equivalentes) se mezclan con etanol (1-2 mililitros/milimol de 2-oxindol) , y luego la mezcla se calienta a 90°C durante 3 a 5 horas. Después de enfriarse, la mezcla de reacción se concentra y se acidifica hasta un pH de 3. El precipitado que se forma se filtra, se lava con agua hasta un pH de 7 , y luego con etanol frío, acetato de etilo y/ó hexano, y se seca al vacío para dar el compuesto blanco. El producto opcionalmente se puede purificar además mediante cromatografía .

B. 2-oxindoles Los siguientes ejemplos son representativos de las síntesis de los precursores de 2-oxindol pam los compuestos de esta invención. Estos 2-oxindoles formarán los compuestos reivindicados mediante su reacción con un aldehido de pirrol apropiadamente sustituido, utilizando el procedimiento sintético general anterior, ó los procedimientos ejemplificados en la sección C, más adelante. Se debe entender que las siguientes síntesis no deben interpretarse como limitantes, ya sea con respecto al planteamiento sintético ó a los oxindoles cuyas síntesis se ejemplifican. 5-Amino-2-oxindol El 5-nitro-2-oxindol (6.3 gramos) se hidrogenó en metanol sobre paladio al 10 por ciento sobre carbón, para dar 3.0 gramos (rendimiento del 60 por ciento) del compuesto del título como un sólido blanco. 5-Bromo-2-oxindol El 2-oxindol (1.3 gramos) en 20 mililitros de acetonitrilo se enfrió a -10°C, y se agregaron lentamente 2.0 gramos de N-bromosuccinimida con agitación. La reacción se agitó durante 1 hora a -10°C, y durante 2 horas a 0°C. El precipitado se recolectó, se lavó con agua, y se secó para dar 1.9 gramos (rendimiento del 90 por ciento) del compuesto del título. 4-Metil-2-oxindol Se agregó oxalato de dietilo (30 mililitros) en 20 mililitros de éter seco con agitación a 19 gramos de etóxido de potasio suspendido en 50 mililitros de éter seco. La mezcla se enfrió en un baño de hielo, y se agregaron lentamente 20 mililitros de 3-nitro-o-xileno en 20 mililitros de éter seco. La mezcla roja oscura espesa se calentó a reflujo durante 0.5 horas, se concentró hasta obtener un sólido rojo oscuro, y se trató con hidróxido de sodio al 10 por ciento, hasta que se disolvió casi todo el sólido. La mezcla roja oscura se trató con peróxido de hidrógeno al 30 por ciento, hasta que el color rojo cambió a amarillo. La mezcla se trató eilternadamente con hidróxido de sodio al 10 por ciento y peróxido de hidrógeno al 30 por ciento, hasta que ya no estuvo presente el color rojo oscuro. El sólido se filtró, y el filtrado se acidificó con ácido clorhídrico 6N. El precipitado resultante se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua, y se secó al vacío para dar 9.8 gramos (rendimiento del 45 por ciento) del ácido 2-metil-6-nitrofenilacético como un sólido blanco. El sólido se hidrogenó en metanol sobre paladio al 10 por ciento sobre carbón, para dar 9.04 gramos del compuesto del título como un sólido blanco. 7-Bromo-5-cloro-2-oxindol Se suspendieron 5-cloro-2-oxindol (16.8 gramos) y 19.6 gramos de N-bromosuccinimida en 140 mililitros de •w* * 98 acetonitrilo, y se pusieron a reflujo durante 3 horas. La cromatografía de capa delgada (sílice, acetato de etilo) a las 2 horas del reflujo, mostró 5-cloro-2-oxindol ó N- bromosuccinimida (Rf 0.8), producto (Rf 0.85), y un segundo 5 producto (Rf 0.9), cuyas proporciones no cambiaron después de otra hora de reflujo. La mezcla se enfrió a 10°C, el precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 25 mililitros de etanol, y se succionó hasta secarse durante 20 minutos en el embudo, para dar 14.1 gramos del producto húmedo (rendimiento del 56 por ciento) . El sólido se suspendió en 200 mililitros de etanol desnaturalizado, y se lavó en pasta mediante agitación y reflujo durante 10 minutos. La mezcla se enfrió en un baño de hielo a 10 °C. El producto sólido se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 25 mililitros de etanol y se secó al vacío a 40°C para dar 12.7 gramos (rendimiento del 51 por ciento) de 7-bromo-5-cloro-2- oxindol . 5-Fluoro-2-oxindol Se disolvió 5-fluoroisatina (8.2 gramos) en 50 mililitros de hidrato de hidrazina, y se pusieron a reflujo durante 1 hora. Luego las mezclas de reacción se vertieron en agua helada. El precipitado entonces se filtró, se lavó con agua, y se secó en un horno al vacío para proporcionar el compuesto del título. 25 5-Nitro-2-oxindol Se disolvió 2-oxindol (6.5 gramos) en 25 mililitros de ácido sulfúrico concentrado, y la mezcla se mantuvo de -10°C a -15 °C mientras se agregaban por goteo 2.1 mililitros de ácido nítrico en vaporización. Después de la adición del ácido nítrico, la mezcla de reacción se agitó a 0°C durante 0.5 horas, y se vertió sobre agua helada. El precipitado se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y se cristalizó a partir de ácido acético al 50 por ciento. El producto cristalino entonces se filtró, se lavó con agua, y se secó al vacío para dar 6.3 gramos (70 por ciento) de 5-nitro-2-oxindol. 5-Yodo-2-oxindol Se suspendió 2-oxindol (82.9 gramos) en 630 mililitros de ácido acético con agitación mecánica, y la mezcla se enfrió a 10°C en un baño de agua helada. Se agregó N-yodosuccinimida sólida (175 gramos) en porciones durante 10 minutos. Después de que se terminó la adición, la mezcla se agitó durante 1 hora a 10°C. El sólido suspendido, que siempre había estado presente, llegó a ser muy espeso en este momento. El sólido se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 100 mililitros de ácido acético al 50 por ciento en agua, y luego con 200 mililitros de agua, y se succionó hasta secarse durante 20 minutos en el embudo. El producto se secó al vacío para dar 93.5 gramos (36 por ciento) de 5-yodo-2-oxindol conteniendo aproximadamente el 5 por ciento de 2-oxindol «>r» 100 mediante resonancia magnética nuclear de protones. 5-Metil-2-oxindol Se calentaron 5-metilisatina (15.0 gramos) y 60 mililitros de hidrato de hidrazina de 140°C a 160°C durante 4 5 horas. La cromatografía de capa delgada (acetato de etilo: hexano, 1:2, gel de sílice) no mostró material de partida restante. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se vertió en 300 mililitros de agua helada, y se acidificó a un pH de 2 con ácido clorhídrico 6N. Después de reposar a la temperatura ambiente durante 2 días, el precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua, y se secó al vacío para dar 6.5 gramos (rendimiento del 47 por ciento) de 5-metil-2-oxindol . 5-Bromo-4-metiloxindol y 5/7-dibromo-4-metiloxindol 15 El 4-metil-2-oxindol (5 gramos) en 40 mililitros de acetonitrilo se trató con 7.26 gramos de N-bromosuccinimida, y se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. La cromatografía de capa delgada (acetato de etilo:hexano, 1:2, gel de sílice) mostró una mezcla de 5-bromo (Rf 0.3) y 5.7 dibromo (Rf 0.5) como productos. Se agregaron otros 7.26 gramos de N-bromosuccinimida, y la mezcla se agitó durante 4 horas adicionales. El sólido se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 20 mililitros de acetonitrilo, y se secó para dar una mezcla de 1:1 de compuestos mono y dibromo. El filtrado se concentró y se pasó por cromatografía sobre gel de sílice (acetato de etilo:hexano (1:2)) para dar 1.67 gramos de 5-bromo-4-metil-2-oxindol como un sólido beige. La mezcla de 1:1 restante de sólidos se recristalizó dos veces a partir de ácido acético glacial para dar 3.2 gramos de 5, 7-dibromo-4-metil-2-oxindol como un sólido naranja claro. Los filtrados a partir de este material se pasaron por cromatografía como anteriormente para dar 0.6 gramos de 5-bromo-4-metil-2-oxindol y 0.5 gramos de 5 , 7-dibromo-4-metil-2-oxindol . 6-Fluoro-2-oxindol El hidruro de sodio (2.6 gramos) y 14.5 gramos de malonato de dimetilo se agitaron y se calentaron a 100°C en 160 mililitros de sulfóxido de dimetilo durante 1 hora. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se agregaron 7.95 gramos de 2 , 5-difluoronitrobenceno, y la mezcla se agitó durante 30 minutos. Luego la mezcla se calentó a 100°C durante 1 hora, se enfrió a temperatura ambiente y se vertió en 400 mililitros de una solución saturada de cloruro de amonio. La mezcla se extrajo con 200 mililitros de acetato de etilo, y la capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró al vacío. El residuo se cristalizó a partir de metanol para dar 24.4 gramos (rendimiento del 80 por ciento) 4-fluoro-2-nitrofenilmalonato de dimetilo como un sólido blanco, Rf 0.2 en cromatografía de capa delgada (acetato de etilo:hexano, 1:6, gel de sílice). El filtrado se concentró y se pasó por cromatografía sobre una columna de gel se sílice (acetato de etilo:hexano, 1:8) para dar 5.03 gramos adicionales de 4-fluoro-2-nitrofenilmalonato de dimetilo, para un total de 29.9 gramos (rendimiento del 96 por ciento). El 4-fluoro-2-nitrofenilmalonato de dimetilo (5.0 gramos) se puso a reflujo en 20 mililitros de ácido clorhídrico 6N durante 24 horas. La reacción se enfrió, y el sólido blanco se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua y se secó para dar 3.3 gramos (rendimiento del 87 por ciento) del ácido 4-fluoro-2-nitrofenilacético, Rf 0.6 en cromatografía de capa delgada (acetato de etilo:hexano, 1:2, gel de sílice). El ácido 4-fluoro-2-nitrofenilacético (3.3 gramos) disuelto en 15 mililitros de ácido acético se hidrogenó sobre 0.45 gramos de paladio al 10 por ciento sobre carbón a 60 psi de H2 durante 2 horas. El catalizador se removió mediante filtración, y se lavó con 15 mililitros de metanol. Los filtrados combinados se concentraron y se diluyeron con agua. El precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua, y se secó, para dar 1.6 gramos (rendimiento del 70 por ciento) de 6-fluoro-2-oxindol, Rf 0.24 en cromatografía de capa delgada. El filtrado se concentró para dar un sólido púrpura con un espectro de resonancia magnética nuclear similar al primer cultivo. La cromatografía del sólido púrpura (acetato de etilo: hexano, 1:2, gel de sílice) dio un segundo cultivo de 6-fluoro-2-oxindol como un sólido blanco.

-Aminosulfoni1-2-oxindol A un matraz de 100 mililitros cargado con 27 mililitros de ácido clorosulfónico, se le agregaron lentamente 13.3 gramos de 2-oxindol. La temperatura de la reacción se mantuvo debajo de 30°C durante la adición. Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 horas, se calentó a 68°C durante 1 hora, se enfrió, y se vertió en agua. El precipitado se lavó con agua y se secó en un horno al vacío para dar 11.0 gramos de 5-clorosulfonil-2-oxindol (rendimiento del 50 por ciento) , el cual se utilizó sin mayor purificación. Se agregó 5-clorosulfonil-2-oxindol (2.1 gramos) a 10 mililitros de hidróxido de amonio en 10 mililitros de etanol, y se agitaron a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se concentró, y el sólido se recolectó mediante filtración al vacío para dar 0.4 gramos (rendimiento del 20 por ciento) del compuesto del título como un sólido blanco. 5-Metilaminosulfonil-2-oxindol Una suspensión de 3.38 gramos de 5-clorosulfonil-2-oxindol en 10 mililitros de metilamina 2M en tetrahidrofurano, se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, durante cuyo tiempo se formó un sólido blanco. El precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó dos veces con 5 mililitros de agua, y se secó al vacío a 40°C durante la noche para dar 3.0 gramos (rendimiento del 88 por ciento) de 5-metilaminosulfonil-2-oxindol. 5- (4-Trifluorometilfenilaminosulfonil) -2-oxindol Una suspensión de 2.1 gramos de 5-clorosulfonil-2-oxindol, 1.6 gramos de 4-trifluorometilanilina, y 1.4 gramos de piridina en 20 mililitros de diclorometano, se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas. El precipitado que se formó se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó dos veces con 5 mililitros de agua, y se secó al vacío a 40°C durante la noche, para dar 2.4 gramos del producto crudo que contenía algunas impurezas mediante cromatografía de capa delgada. El producto crudo se pasó por cromatografía sobre gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo:hexano (1:2), para dar 1.2 gramos (rendimiento del 37 por ciento) de 5- (4-trifluorometilfenil-aminosulfonil) -2-oxindol . 5- (Morfolinosulfonil) -2-oxindol Una suspensión de 2.3 gramos de 5-clorosulfonil-2-oxindol y 2.2 gramos de morfolina en 50 mililitros de diclorometano, se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. El precipitado blanco se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con acetato de etilo y hexano, y se secó al vacío a 40°C durante la noche para dar 2.1 gramos (rendimiento del 74 por ciento) de 5- (morfolinosulfonil) -2-oxindol. 6-Trifluorometil-2-oxindol Se agregó sulfóxido de dimetilo (330 mililitros) a 7.9 gramos de hidruro de sodio, seguido por adición por goteo de 43.6 gramos de oxalato de dietilo. La mezcla se calentó a 100 °C durante 1 hora, y se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó 2-nitro-4-trifluorometiltolueno (31.3 gramos), la reacción se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente, y luego se calentó a 100 °C durante 1 hora. La reacción se enfrió y se vertió en una mezcla de cloruro de amonio acuoso saturado, acetato de etilo y hexano. La capa orgánica se lavó con cloruro de amonio saturado, agua y salmuera, se secó, y se concentró para dar 2- (2-nitro-4-trifluorometil) malonato de dimetilo. El diéster se disolvió en una mezcla de 6.4 gramos de cloruro de litio y 2.7 mililitros de agua en 100 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y se calentó a 100°C durante 3 horas. La reacción se enfrió y se vertió en una mezcla de acetato de etilo y salmuera. La fase orgánica se lavó con salmuera, se secó con sulfato de sodio, se concentró y se pasó por cromatografía sobre gel de sílice (acetato de etilo al 10 por ciento en hexano) . Las fracciones que contenían el producto se evaporaron para dar 25.7 gramos de 2-nitro-4-trifluorometil-fenilacetato de metilo. El 2-nitro-4-trifluorometilfenilacetato de metilo (26 miligramos) se hidrogenó sobre paladio al 10 por ciento sobre carbón, y luego se calentó a 100 °C durante 3 horas. El catalizador se removió mediante filtración, y el solvente se evaporó para dar el compuesto del título. - (2-Cloroetil) oxindol El 5-cloroacetil-2-oxindol (4.18 gramos) en 30 mililitros de ácido trifluoroacético en un baño de hielo, se trató con 4.65 gramos de trietilsilano, y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla se vertió en 150 mililitros de agua, y el precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 50 mililitros de agua, y se secó para dar 2.53 gramos (rendimiento del 65 por ciento) de 5- (2-cloroetil) -2-oxindol como un sólido castaño rojizo. 5-Metoxicarbonil-2-oxindol El 5-yodo-2-oxindol (17 gramos) se puso a reflujo con 2 gramos de diacetato de paladio, 18.2 gramos de trietilamina, 150 mililitros de metanol, 15 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y 2.6 gramos de DPPP en una atmósfera saturada con monóxido de carbono. Después de 24 horas, la reacción se filtró para remover el catalizador, y se concentró el filtrado. El concentrado se pasó por cromatografía sobre gel de sílice (acetato de etilo al 30 por ciento en hexano) . Las fracciones que contenían el producto se concentraron y se dejaron reposar. El producto precipitado se recolectó mediante filtración al vacío para dar 0.8 gramos (7 por ciento) del compuesto del título como un sólido blanco. 4-Carboxi-2-oxindol Una solución de trimetilsilildiazometano en hexano (2M) se agregó por goteo a una solución de 2.01 gramos de 2-cloro-3-carboxi-nitrobenceno en 20 mililitros de metanol a temperatura ambiente, hasta que ya no se presentó ningún desprendimiento de gas adicional. El exceso de trimetilsilil-diazometano se apagó con ácido acético. La mezcla de reacción se secó mediante bomba giratoria, y el residuo se secó adicionalmente en un horno al vacío durante la noche. El producto (2-cloro-3-metoxicarbonil-nitrobenceno) fue suficientemente puro para la siguiente reacción. Se agregó malonato de dimetilo (6.0 mililitros) a una suspensión helada de 2.1 gramos de hidruro de sodio en 15 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla de reacción se agitó entonces a 100 °C durante 1 hora, y luego se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó 2-cloro-3-metoxicarbonil-nitrobenceno (2.15 gramos) a la mezcla anterior en una porción, y la mezcla se calentó a 100 °C durante 1.5 horas. Luego la mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, y se vertió en agua helada, se acidificó a un pH de 5 , y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró para dar 3.0 gramos del 2-metoxicarbonil-6-nitrofenilmalonato de dimetilo. El 2-metoxicarbonil-6-nitrofenilmalonato de dimetilo (3.0 gramos) se puso a reflujo en 50 mililitros de ácido clorhídrico 6 N durante la noche. La mezcla se concentró a sequedad, y se puso a reflujo durante 2 horas con 1.1 gramos de cloruro de estaño (II) en 20 mililitros de etanol. La mezcla se filtró a través de Celite, se concentró, y se pasó por cromatografía sobre gel de sílice (acetato de etilo: hexano: ácido acético), para dar 0.65 gramos (rendimiento del 37 por ciento) de 4-carboxi-2-oxindol como un sólido blanco. 5-Carboxi-2-oxindol Se agregó 2-oxindol (6.7 gramos) a una suspensión agitada de 23 gramos de cloruro de aluminio en 30 mililitros de dicloroetano en un baño de hielo. Se agregó lentamente cloruro de cloroacetilo (11.3 gramos), y se desprendió gas de cloruro de hidrógeno. Después de diez minutos de agitación, la reacción se calentó de 40°C a 50°C durante 1.5 horas.. La cromatografía de capa delgada (acetato de etilo, gel de sílice) no mostró material de partida restante. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, y se vertió en agua helada. El precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua y se secó al vacío para dar 10.3 gramos (98 por ciento) de 5-cloroacetil-2-oxindol como un sólido blanco. Una suspensión de 9.3 gramos de 5-cloroacetil-2-oxindol se agitó en 90 mililitros de piridina de 80°C a 90°C durante 3 horas, y luego se enfrió a temperatura ambiente. El precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, y se lavó con 20 mililitros de etanol. El sólido se disolvió en 90 mililitros de hidróxido de sodio 2.5N, y se agitó de 70°C a 80°C durante 3 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, y se acidificó a un pH de 2 con ácido clorhídrico 0.5 N. El precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, y se lavó completamente con agua, para dar el 5-carboxi-2-oxindol crudo como un sólido castaño oscuro. Después de reposar durante la noche, el filtrado produjo 2 gramos de 5-carboxi-2-oxindol como un sólido amarillo. El producto castaño oscuro crudo se disolvió en metanol caliente, el material insoluble se removió mediante filtración, y el filtrado se concentró para dar 5.6 gramos de 5-carboxi-2-oxindol como un sc>lido castaño. El rendimiento combinado fue del 97 por ciento. 5-Carboxietil-2-oxindol El 5—cianoetil-2-oxindol (4.02 gramos) en 10 mililitros de agua conteniendo 25 mililitros de ácido clorhídrico concentrado, se puso a reflujo durante 4 horas. La mezcla se enfrió, se agregó agua, y el sólido resultante se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua, y se secó, para dar 1.9 gramos (rendimiento del 44 por ciento) del compuesto del título como un sólido amarillo. 5-Yodo-4-metil-2-oxindol A 2 gramos de 4-metil-2-oxindol en 40 mililitros de ácido acético glacial en un baño de hielo, se le agregaron 3.67 gramos de N-yodosuccinimida. La mezcla se agitó durante 1 hora, se diluyó con 100 mililitros de ácido acético al 50 por ciento en agua, y se filtró. El sólido blanco resultante se secó bajo un alto vacío para dar 3.27 gramos (rendimiento del 88 por ciento) del compuesto del título como un sólido blanco. 5-Cloro-4-metil-2-oxindol Una suspensión de 3.0 gramos de 4-metil-2-oxindol se agitó en 50 mililitros de acetonitrilo a temperatura ambiente, mientras que se agregaban 3.3 gramos de N-clorosuccinimida en porciones. Luego se agregó ácido trifluoroacético (1 mililitro) . La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 3 días, durante cuyo tiempo, siempre estuvo presente el sólido. El sólido blanco se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con una pequeña cantidad de acetona fria, y se secó durante la noche en un horno al vacío a 40°C, para dar 2.5 gramos (68 por ciento) de 5-cloro-4-metil-2 -oxindol. 5-Butil-2-oxindol Se agregó trietisilano (2.3 gramos) a 2 gramos de 4-butanoíl-2-oxindol en 20 mililitros de ácido trifluoroacético a temperatura ambiente, y la solución se agitó durante 3 horas. La reacción se vertió en agua helada para dar un aceite rojo, el cual se solidificó después de reposar. El sólido se recolectó mediante filtración al vacio, se lavó con agua y hexano, y se secó, para dar 1.7 gramos (rendimiento del 91 por ciento) del compuesto del título como un sólido blanco. 5-Eti1-2-oxindol A 5-acetil-2-oxindol (2 gramos) en 15 mililitros de ácido trifluoroacético en un baño de hielo, se le agregaron lentamente 1.8 gramos de treitilsilano; luego la reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. Se agregó 1 mililitro de trietilsilano, y la agitación se continuó durante la noche. La mezcla de reacción se vertió en agua helada, y el precipitado resultante se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó copiosamente con agua, y se secó al vacío para dar 1.3 gramos (rendimiento del 71 por ciento) del compuesto del título como un sólido amarillo. 5-Morfolin-4-etil-2-oxindol El 5-cloroetil-2-oxindol (2.3 gramos), 1.2 mililitros de morofolina, y 1.2 mililitros de di-isopropiletilamina se calentaron durante la noche a 100°C en 10 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla se enfrió, se vertió en agua, y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó, y se evaporó. El residuo se pasó por cromatografía sobre gel de sílice (metanol al 50 por ciento en cloroformo) para dar 0.9 gramos (31 por ciento) del compuesto del título como un sólido blanco. 5- (4-Metoxicarbonilbenzamido) -2-oxindol Una mezcla de 82.0 miligramos de 5-amino-2-oxindol y 131.0 miligramos de cloruro de 4-metoxicarbonilbenzoílo en piridina, se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas, y se vertió en agua helada. El precipitado se filtró, se lavó con agua, y secó en un horno al vacío, para dar 138.0 miligramos de 5- (4-metoxicarbonilbenzamido) -2-oxindol (rendimiento del 81 por ciento) . - (4-Carboxibenzamido) -2-oxindol El 5-(4-metoxicarbonilbenzamido) -2-oxindol (0.9 gramos) y 0.4 gramos de hidróxido de sodio en 25 mililitros de metanol se pusieron a reflujo durante 3 horas. La mezcla se concentró, se agregó agua, y la mezcla se acidificó con ácido clorhídrico 6N. El precipitado se recolectó mediante filtración al vacío para dar 0.75 gramos (87 por ciento) del compuesto del título como un sólido blanco. 5-Metoxi-2-oxindol Se disolvió hidrato cloral (9.6 gramos) en 200 mililitros de agua conteniendo 83 gramos de sulfato de sodio. La solución se calentó a 60°C, se agregó una solución de 11.4 gramos de clorhidrato de hidroxilamina en 50 mililitros de agua, y la mezcla se mantuvo a 60°. En un matraz separado, se calentaron a 80°C 6.4 gramos de 4-anisidina y 4.3 mililitros de ácido clorhídrico concentrado en 80 mililitros de agua. La primera solución se agregó a la segunda, y la mezcla se puso a reflujo durante dos minutos, después de lo cual se enfrió lentamente a temperatura ambiente, y luego se enfrió en un baño de hielo. El precipitado bronceado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua, y se secó al vacío para dar 8.6 gramos (rendimiento del 85 por ciento) de N-(2-hidroximino-acetil) anisidina. El ácido sulfúrico concentrado (45 mililitros) conteniendo 5 mililitros de agua, se calentó a 60°C, y se agregaron 8.6 gramos de N- (2-hidroxiaminoacetil) anisidina en una porción. La mezcla agitada se calentó a 93 °C durante 10 minutos, y luego se dejó enfriar a tempereitura ambiente. La mezcla se vertió 500 gramos de hielo, y se extrajo tres veces con acetato de etilo. Los extractos combinados se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar 5.1 gramos (rendimiento del 65 por ciento) de 5 metoxi-isatina como un sólido rojo oscuro. La 5-metoxi-isatina (5.0 gramos ) y 30 mililitros de hidrato de hidrazina, se calentaron a reflujo durante 15 minutos. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, y se agregaron 50 mililitros de agua. La mezcla se extrajo 3 veces con 25 mililitros de acetato de etilo cada vez, las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar un sólido amarillo. El sólido se agitó en acetato de etilo, y se removieron 1.1 gramos de material insoluble mediante filtración al vacío y se guardó. Este material fue 2-hidrazinocarbonilmetil-4-anisidina. El filtrado se concentró y se pasó por cromatografía sobre gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo:hexano (1:1), para dar 0.7 gramos de 5-metoxi-2-oxindol como un sólido amarillo. Los 1.1 gramos de 2-hidrzinocarbonilmetil-4-anisidina se pusieron a reflujo durante 1 hora en 20 mililitros de hidróxido de sodio ÍN. La mezcla se enfrió, se acidificó a un pH de 2 con ácido clorhídrico concentrado, y se extrajo 3 veces con 25 mililitros de acetato de etilo cada vez. Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar 0.8 gramos de 5-metoxi-2-oxindol como un sólido amarillo. El rendimiento combinado fue de 1.5 gramos ó del 33 por ciento. 7-Azaoxindol El 3 , 3-dibromo-7-azaoxindol (2.9 gramos) se disolvió en una mezcla de 20 mililitros de ácido acético y 30 mililitros de acetonitrilo. A la solución se le agregaron 6.5 gramos de polvo de zinc. La mezcla se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. El sólido se filtró a partir de la mezcla, y se evaporó el solvente. El residuo se formó en una pasta con acetato de etilo. La solución de acetato de etilo que contenía el sólido insoluble, se pasó a través de una columna corta de gel de sílice. La solución de acetato de etilo recolectada se evaporó, y el residuo se secó al vacío para dar 1.8 gramos (rendimiento del 91 por ciento) de sal de ácido 7-azaoxindol-acético. 5-Dime ilaminosulfonil-2-oxindol Una suspensión de 2.3 gramos de 5-clorosulfonil-2-oxindol en 10 mililitros de dimetilamina 2M en metanol, se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, en cuyo tiempo se formó un sólido blanco. El precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 5 mililitros de hidróxido de sodio ÍN, y 5 mililitros de ácido clorhídrico ÍN, y se secó al vacío a 4°C durante la noche para dar 1.9 gramos (rendimiento del 79 por ciento) de 5-dimetilaminosulfonil-2-oxindol. 6-Feni1-2-oxindol Se agregó por goteo malonato de dimetilo (10 mililitros) en 25 mililitros de sulfóxido de dimetilo, a 3.5 gramos de hidruro de sodio suspendidos en 25 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y la mezcla se calentó a 100 °C durante 10 minutos. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, y se agregaron 4.7 gramos de 4-fluoro-3-nitrobifenilo en 25 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla se calentó a 100°C durante 2 horas, se enfrió, y se apagó con 300 mililitros de una solución saturada de cloruro de amonio. La mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo, y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, y se evaporaron para dar, como un sólido amarillo, el 3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo. El 3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo se puso a reflujo en 30 mililitros de ácido clorhídrico 6N durante 24 horas. El precipitado se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y se secó para dar 4.5 gramos de ácido 3- nitrobifenil-4-acético como un sólido color crema. Se agregó polvo de hierro (2.6 gramos) todo a la vez a 4.5 gramos de ácido 3-nitrobifenil-4-acético en 40 mililitros de ácido acético. La mezcla se puso a reflujo durante 2 horas, se concentró a sequedad, y se recuperó en acetato de etilo. Los l¿-,- y*' sólidos se removieron mediante filtración, y el filtrado se lavó dos veces con ácido clorhídrico ÍN y salmuera, y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro. El filtrado se concentró para dar 3.4 gramos (rendimiento del 93 por ciento) de 6-fenil-2-oxindol como un sólido castaño claro. 6-2-Metoxifenil) -2-oxindol Se agregó tetraquis (trifenilfosfina) paladio (1 gramo) a una mezcla de 5 gramos de ácido 2-metoxifenil-borónico, 6.6 gramos de 5-bromo-2-fluoronitrobenceno, y 300 mililitros de solución de carbonato de sodio 2 M en 50 mililitros de tolueno y 50 mililitros de etanol. La mezcla se puso a reflujo durante 2 horas, se concentró, y el residuo se extrajo dos veces con acetato de etilo. La capa de acetato de etilo se lavó con agua y salmuera, luego se secó, y se concentró para dar un aceite verde oscuro, el cual se solidificó al reposar, de 4-fluoro-2' -metoxi-3-nitrobifenilo crudo. Se agregó por goteo malonato de dimetilo (14 mililitros) a 2.9 ramos de hidruro de sodio suspendidos en 50 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla se calentó a 100°C durante 15 minutos, y se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó el 4-fluoro-2' -metoxi-3-nitrobifenilo crudo en 60 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y la mezcla se calentó a 100 °C durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se apagó con 300 mililitros de una solución saturada de cloruro de sodio, y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Los extractos se combinaron, se lavaron con cloruro de amonio saturado, agua y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se concentraron para dar el 2' -metoxi-3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo como un aceite amarillo. El 2' -metoxi-3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo se calentó a 100°C en 50 mililitros de ácido clorhídrico 6 N durante 24 horas, y se enfrió. El precipitado se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y hexano, y se secó para dar 9.8 gramos del ácido 2' -metoxi-2-nitrobifenil-4-acético como un sólido bronceado claro. Se agregó polvo de hierro (5 gramos) en una porción a 9.8 gramos de ácido 2' -metoxi-3-nitrobifenil-4-acético en 50 mililitros de ácido acético glacial, y se calentó a 100°C durante 3 horas. La mezcla de reacción se concentró a sequedad, se sónico en acetato de etilo, y se filtró para remover los insolubles. El filtrado se lavó dos veces con ácido clorhídrico ÍN, agua y luego salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró. El residuo se pasó por cromatografía sobre gel de sílice en acetato de etilo: hexano (1:2) para dar 5.4 gramos de 6- (2-metoxifenil) -2-oxindol como un sólido color rosado. 6- (3-Metoxifenil) -2-oxindol Se agregó tetraquis (trifenilfosfina) paladio (0.8 gramos) a una mezcla de 5 gramos de ácido 3-metoxifenil-borónico, 5 gramos de 5-bromo-2-fluoro-nitrobenceno, y 11 mililitros de una solución de carbonato de sodio 2 M en 100 mililitros de tolueno. La mezcla se puso a reflujo durante 2 horas, se diluyó con agua y se extrajo con aceato de etilo. El acetato de etilo se lavó con bicarbonato de sodio saturado y salmuera, y luego se secó y se concentró para dar un sólido oleoso. El sólido se pasó por cromatografía sobre gel de sílice (acetato de etilo: hexano) (1:6) para dar 4.3 gramos (rendimento del 77 por ciento) de 4-fluoro-3' -metoxi-3-nitrobifenilo. Se agregó por goteo malonato de dimetilo (9.7 mililitros) a 2.0 gramos de hidruro de sodio suspendidos en 50 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla se calentó a 100°C durante 35 minutos y se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó 4-fluoro-2' -metoxi-3-nitrobenfenilo (4.2 gramos) en 50 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y la mezcla se calentó a 100°C durante una hora. La mezcla de reacción se enfrió y se apagó con 300 mililitros de una solución saturada de cloruro de amonio, y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Los extractos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar el 3' -metoxi-3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo como un sólido amarillo pálido. El 3' -metoxi-3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo se calentó a 110°C en 45 mililitros de ácido clorhídrico 6 N durante 4 días, y luego se enfrió. El precipitado se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y hexano, y se secó para dar 5.3 gramos de ácido 3' -metoxi-2-nitrobifenil-4-acético como un sólido bronceado claro. Se disolvió ácido 3' -metoxi-3-nitrobifenil-4-acético (5.2 gramos) en metanol, y se hidrogenó sobre 0.8 gramos de paladio al 10 por ciento sobre carbón durante 3 horas a temperatura ambiente. El catalizador se removió mediante filtración, se lavó con metanol, y los filtrados se combinaron y se concentraron para dar un sólido castaño. El sólido se pasó por cromatografía sobre gel de sílice en acetato de etilo:hexano:ácido acético (33:66:1) para dar 3.0 gramos de 6- (3-metoxifenil-2-oxindol como un sólido rosado. 6- (4-Metoxifenil) -2-oxindol Se agregó tetraquis (trifenilfosfina) paladio (1 gramo) a una mezcla de 5 gramos de ácido 4-metoxifenilborónico, 6.6 gramos de 5-bromo-2-fluoronitro-benceno, y 30 mililitros de una solución de carbonato de sodio 2 M en 50 mililitros de tolueno y 50 mililitros de etanol. La mezcla se puso a reflujo durante 2 horas, se concentró, y el residuo se extrajo dos veces con acetato de etilo. La capa de acetato de etilo se lavó con agua y salmuera, se secó, y se concentró para dar un sólido castaño oleoso. El sólido se pasó por cromatografía sobre gel de sílice (acetato de etilo al 5 por ciento en hexano) para dar el 4-fluoro-4' -metoxi-3-nitrobifenilo crudo como un sólido amarillo pálido. Se agregó por goteo malonato de dimetilo (10 mililitros) a 2.0 gramos de hidruro de sodio suspendidos en 60 mililitros en sulfóxido de dimetilo. La mezcla se calentó a 100 °C durante 10 minutos, y se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó 4-fluoro-2' -metoxi-3-nitrobifenilo crudo (5.2 gramos) en 50 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y la mezcla se calentó a 100°C durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se apagó con 300 mililitros de una solución saturada de cloruro de sodio, y se extrajo 3 veces con acetato de etilo. Los extractos se combinaron, se lavaron con cloruro de amonio de saturado, agua y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar 4' -metoxi-3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo como un aceite amarillo. El 4-metoxi-3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo se calentó a 100°C en 60 mililitros de ácido clorhídrico 6N durante 15 horas, y se enfrió. El precipitado se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y hexano, y se secó para dar 7.2 gramos de ácido 4' -metoxi-3-nitrobifenil-4-acético crudo como un sólido bronceado claro. Se agregó polvo de hierro (3.6 gramos) en una porción a 7.2 gramos de ácido 4' -metoxi-3-nitrobifenil-4-acético en 50 mililitros de ácido acético glacial, y se calentaron a 100°C durante la noche. La mezcla de reacción se concentró a sequedad, se sónico en acetato de etilo, y se filtró para remover los insolubles. El filtrado se lavó dos veces con ácido clorhídrico ÍN y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró para dar 2.7 jramos de 6- (4-metoxifenil) -2-oxindol como un sólido color rosado. 6-(3-Etoxifenil) -2-oxindol Se agregó tetraquis (trifenilfos ina) paladio (0.8 gramos) a una mezcla de 4.2 gramos de ácido 3-etoxifenilborónico, 5.0 gramos de 5-bromo-2-fluoronitrobenceno y 22 mililitros de una solución de carbonato de sodio 2 M en 50 mililitros de tolueno y 50 mililitros de etanol. La mezcla se puso a reflujo durante 2 horas, se concentró, se agregó agua y la mezcla se extrajo dos veces con acetato de etilo. La capa de acetato de etilo se lavó con agua y salmuera, luego se secó, y se concentró. El residuo se pasó por cromatografía sobre gel de sílice 8acetato de etilo al 5 por ciento en hexano) , para dar 5.3 gramos (rendimiento del 90 por ciento) de 4-fluoro-3' -etoxi-3-nitrobifenilo como un aceite amarillo. Se agregó por goteo malonato de dimetilo (11.4 mililitros) a 4.0 gramos de hidruro de sodio suspendidos en 20 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla se calentó a 100°C durante 10 minutos, y luego se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó 4-fluoro-3' -etoxi-3-nitrobifenio crudo (5.3 gramos) en 25 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y la mezcla se calentó a 100°C durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se apagó con 300 mililitros de una solución saturada de cloruro de amonio, y se extrajo tres veces con acetato de etilo. Los extractos se combinaron, se lavaron con agua y salmuera, y luego se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar el 3' -etoxi-3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo como un aceite amarillo. El 3' -etoxi-3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo se calentó a 100°C en 60 mililitros de ácido clorhídrico 6N durante 4 días, y luego se enfrió. El precipitado se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y hexano, y se secó para dar 4.7 gramos del ácido 3' -etoxi-3-nitrobifenil-4-acético crudo como un sólido bronceado claro. Se agregó polvo de hierro (2.4 gramos) en una porción a 4.6 gramos del ácido 3' -etoxi-3-nitrobifenil-4-acético en 40 mililitros de ácido acético glacial, y se puso a reflujo durante 2 horas. La mezcla de reacción se concentró a sequedad, se trató repetidamente con acetato de etilo y se filtro para remover los insolubles. El filtrado se lavó dos veces con ácido clorhídrico ÍN y salmuera, y luego se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró para dar 3.5 gramos (rendimiento del 91 por ciento) de 6- (3-etoxifenil) -2-oxindol como un sólido castaño claro. 6-Bromo-2-oxindol Se agregó por goteo malonato de dimetilo (13 mililitros) a 2.7 gramos de hidruro de sodio suspendidos en 20 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla se calent{o a 100°C durante 10 minutos, y luego se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó 5-bromo-2-fluoronitrobenceno (5.0 gramos) en 25 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y la mezcla se calentó a 100°C durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se apagó con 300 mililitros de una solución saturada de cloruro de amonio, y se extrajo 3 veces con acetato de etilo. Los extractos se combinaron, se lavaron con cloruro de amonio saturado, agua y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar el 4-bromo-2-nitrofenilmalonato de dimetilo crudo como un aceite amarillo pálido. El 4-bromo-2-nitrofenilmalonato e dimetilo crudo se calentó a 110°C en 40 mililitros de ácido clorhídrico 6N durante 24, y luego se enfrió. El precipitado se recolectó mediante filtración, se lavó con agua, y se secó para dar 5.3 gramos (rendimiento del 89 por ciento) del ácido 4-bromo-2-nitro-fenilacético como un sólido blanco. El ácido 4-bromo-2-nitrofenilacético (0.26 gramos), 0.26 gramos de polvo de zinc, y 3 mililitros de ácido sulfúrico al 50 por ciento en 5 mililitros de etano, se calentaron a 100°C durante la noche. La mezcla de reacción se filtró, se diluyó con un poco de ácido acético, se concentró para remover el etanol, se diluyó con agua, y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar 0.19 gramos (rendimiento del 90 por ciento) de 6-bromo-2-oxindol como un sólido amarillo.

-Aceti1-2-oxindol El 2-oxindol (3 gramos) se suspendió en 1,2-dicloroetano, y se agregaron lentamente 3.2 mililitros de cloruro de acetilo. La suspensión resultante se calentó a 50 °C durante 5 horas, se enfrió, y se vertió en agua. El precipitado resultante se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó copiosamente con agua, y se secó al vacío para dar 2.9 gramos (rendimiento del 73 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño. 5-Butanoil-2-oxindol A 15 gramos de cloruro de aluminio suspendidos en 30 mililitros de 1, 2-dicloroetano en un baño de hielo, se les agregaron 7.5 gramos de 2-oxindol, y luego 12 gramos de cloruro de butanoílo. La suspensión resultante se calentó a 50°C durante la noche. La mezcla se vertió en agua helada, y se extrajo 3 veces con acetato de etilo. Las capas de acetato de etilo combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio, y se concentraron a sequedad para dar un sólido castaño. El sólido se pasó por cromatografía sobre gel de sílice (acetato de etilo al 50 por ciento en hexano) , para dar 3 gramos (25 por ciento) del compuesto del título como un sólido amarillo. 5-Cianoetil-2-oxindol Se agregó cianuro de potasio (2.0 gramos) a 15 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y se calentó a 90°C. Se agregó lentamente 5-cloroetil-2-oxindol (3.0 gramos) disuelto en 5 mililitros de sulfóxido de dimetilo con agitación, y la reacción se calentó a 150°C durante 2 horas. La mezcla se enfrió, se vertió en agua helada, y el precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua, se secó y luego se pasó por cromatografía sobre gel de sílice (metanol al 5 por ciento en cloroformo), para dar 1.2 gramos (rendimiento del 42 por ciento) del compuesto del título. 6-Morfolin-4-il-2-oxindol El 6-amino-2-oxindol (2.2 gramos), 4.0 gramos de 2 , 2' -dibromoetiléter , y 7.9 gramos de carbonato de sodio, se pusieron a reflujo en 20 mililitros de etanol durante la noche, se concentraron y se diluyeron con 50 mililitros de agua. La mezcla se extrajo tres veces con 50 milililitros de acetato de etilo, y los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con 20 mililitros de salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron a sequedad. El sólido se pasó por cromatografía sobre una columna de gel de sílice (acetato de etilo: hexano (1:1) conteniendo ácido acético al 0.7 por ciento), para dar 1.2 gramos (rendimiento del 37 por ciento) del compuesto del título como un sólido beige. 6- (3-Trifluoroacetilfenil) -2-oxindol El ácido 3-aminofenilborónico (3.9 gramos), 5 gramos de 5-bromo-2-f luoronitrobenceno , 0.8 gramos de tetraquis (trifenilfosfina) paladio, y 23 mililitros de una solución de bicarbonato de sodio 2 M en 50 mililitros de tolueno, se pusieron a reflujo bajo nitrógeno durante 2.5 horas. La mezcla de reacción se vertió en 200 mililitros de agua helada, y la mezcla se extrajo tres veces con 50 mililitros de acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con 50 mililitros de agua y 20 mililitros de salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar 9.7 gramos (rendimiento del 92 por ciento) de 2-fluoro-5- (3-aminofenil) nitrobenceno como un aceite castaño oscuro. Se agregó lentamente anhídrido trifluoroacético (5.4 mililitros) a una solución agitada de 9.7 gramos de 2-fluoro-5- (3-aminofenil) -nitrobenceno y 5.3 mililitros de trietilamina en 50 mililitros de diclorometano a 0°C, y la mezcla se agitó durante 20 minutos adicionales. La mezcla se concentró, y el residuo se pasó por cromatografía sobre una columna de gel de sílice (acetato de etilo al 10 por ciento en hexano) para dar 8.6 (rendimiento del 65 por ciento) de 2-fluoro-5-(3-trifluoroacetamidofenil) nitrobenceno como un aceite naranja pálido, el cual se solidificó al reposar. Se agregó por goteo malonato de dimetilo (9.6 mililitros) a una suspensión agitada de 3.2 gramos de hidruro de sodio al 60 por ciento en aceite minera en 40 mililitros de sulfóxido de dimetilo anhidro bajo nitrógeno. La mezcla se agitó durante 10 minutos, y se agregó 2-fluoro-5- (3-trifluoroacetamido-fenil) nitrobenceno en 20 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla roja oscura resultante se calentó a 100 °C durante 2 horas. La reacción se apagó vertiendo en 100 mililitros de una solución saturada de cloruro de amonio, y se extrajo dos veces con 50 mililitros de acetato de etilo. La fase orgánica se lavó con 50 mililitros de cada uno de solución saturada de cloruro de amonio, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró hasta obtener un aceite amarillo. El aceite se pasó por cromatografía sobre una columna de gel de sílice (acetato de etilo: hexano (1:4)) para dar 4.4 gramos (rendimiento del 50 por ciento) de 2-[2-nitro-4-(3-trifluoroacetamidofenil) fenil) - malonato de dimetilo como un sólido amarillo pálido. El 2-[2-nitro-4-(3-trifluoroacetamidofenil)-fenil]malonato de dimetilo (4.4 gramos) se puso a reflujo durante la noche en 50 mililitros de ácido clorhídrico 6N. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, y los sólidos se recolectaron mediante filtración al vacío, se lavaron con agua, y se secaron al vacío pcira dar 2.7 gramos (rendimiento del 73 por ciento) del ácido 2-[2-nitro-4-(3-trifluoroacetamidofenil) fenil] acético. El ácido 2-[2-nitro-4-(3-trifluoroacetamidofenil) -fenil]acético (100 miligramos), y 50 miligramos de polvo de hierro en 3 mililitros de ácido acético se calentaron a 100°C durante 2 horas. La mezcla de reacción se concentró, y el residuo se sónico en 5 mililitros de acetato de etilo. Los sólidos insolubles se removieron mediante filtración al vacío, y el filtrado se lavó con ácido clorhídrico ÍN, agua y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar 10 miligramos (rendimiento del 14 por ciento) del compuesto del título como un sólido color rosado.

B. Aldehidos Acido 5-Formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxílico Se disolvió 3-oxobutirato de butilo terciario (158 gramos, 1 mol) en 200 mililitros de ácido acético en un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 500 mililitros, equipado con un termómetro, embudo de adición y agitador mecánico. La mezcla se enfrió en un baño de hielo a aproximadamente 10°C. Se agregó nitrito de sodio (69 gramos, 1 mol) durante 75 minutos, manteniendo la temperatura debajo de 15°C. El baño frío se removió, y la mezcla se agitó durante 30 minutos, y luego se dejó reposar durante 3.5 horas para dar 2-hidroximino-3-oxobutirato de butilo terciario. El 3-oxobutirato de etilo (130 gramos, 1 mol) se disolvió en 400 mililitros de ácido acético, en un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 2 litros, equipado con un termómetro, un embudo de adición, agitador mecánico, y se colocó en un baño de aceite. Se agregó polvo de zinc (50 gramos, 0.76 moles), y la mezcla se calentó a 60°C con agitación. La solución de 2-hidroximino-3-oxobutirato de butilo terciario preparada anteriormente se agregó lentamente, manteniéndose la temperatura de la mezcla de reacción a aproximadamente 65°C. Luego se agregó más polvo de zinc (4 x 50 gramos, 3.06 moles), agregándose la última porción después de que se hubo agregado todo el t-butiléster. Al final de las adiciones, la temperatura era de 64 °C. La temperatura se incrementó a 70-75°C, se agitó durante una hora, y luego se vertió en 5 litros de agua. El precipitado gris flotante se recolectó mediante filtración al vacío, y se lavó con 2 litros de agua para dar 354 gramos de un producto crudo húmedo. El producto crudo se disolvió en 1 litro de metanol caliente, y se filtró caliente para remover el zinc. El filtrado se enfrió, sobre lo cual se formó un precipitado. El precipitado que se recolectó mediante filtración al vacío, se secó para dar 118 gramos del producto. El filtrado se puso en el refrigerador durante la noche, sobre lo cual se precipitó producto adicional. Se obtuvo un total de 173.2 gramos de 4-etiléster de 2-terbutiléster del ácido 3,5-dimetil-lH-pirrol-2 , 4-dicarboxílico. El 4-etiléster de 2-terbutiléster del ácido 3,5-dimetil-lH-pirrol-2 , 4-dicarboxílico (80.1 gramos, 0.3 moles), y 400 mililitros de ácido trifluoroacético, se agitaron durante 5 minutos en un matraz de fondo redondo de 3 cuellos de 2 litros, equipado con agitador mecánico, y se calentaron a 40°C en un baño de aceite. Luego la mezcla se enfrió a -5°C, y se agregó ortoformato de trietilo (67.0 gramos, 0.45 moles) todo a la vez. La temperatura se incrementó a 15°C. La mezcla se agitó durante aproximadamente 1 minuto, se removió del baño frío, y luego se agitó durante 1 hora. El ácido trifluoroacético se removió mediante evaporación giratoria, y el residuo se puso en el refrigerador, en donde se solidificó. El sólido se disolvió calentando y vertiendo en 500 gramos de hielo. La mezcla se extrajo con 800 mililitros de diclorometano para dar una solución roja y un precipitado castaño, ambos de los cuales se guardaron. El precipitado se aisló y se lavó con 150 mililitros de una solución saturada de bicarbonato de sodio. La fase de diclorometano también se lavó con 150 mililitros de bicarbonato de sodio. Luego la solución de diclorometano se lavó tres veces más con 100 mililitros de agua. La solución de diclorometano se evaporó a sequedad. El residuo oscuro que quedó se recristalizó dos veces a partir de acetato de etilo conteniendo negro de humo Darco, para dar agujas amarillas doradas. El precipitado castaño se recristalizó a partir de 350 mililitros de acetato de etilo que contenía de la misma manera Darco, para dar un sólido amarillo-rojo. Todos los sólidos recristalizados se combinaron y se recristalizaron a partir de 500 mililitros de etanol para dar 37.4 gramos (63.9 por ciento) de etiléster del ácido 5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxílico como agujas amarillas (p.f. 165.6 - 166.3°C, lit. 163 - 164°C. Los residuos obtenidos después de la evaporación de los licores madre de acetato de etilo y etanol, se combinaron y se recristalizaron a partir de 500 mililitros de etanol, para dar un segundo cultivo (10.1 gramos) ó producto, como agujas amarillas sucias. Se agregó etiléster del ácido 5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxílico (2 gramos, 10 milimoles) a una solución de hidróxido de potasio (3 gramos, 53 milimoles) disuelto en metanol (3 mililitros) y agua (10 mililitros) . La mezcla se puso a reflujo durante 3 horas, se enfrió a temperatura ambiente, y se acidificó con ácido clorhídrico 6 N a un pH de 3. El sólido que se formó se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y se secó en un horno al vacío durante la noche, para dar 1.6 gramos (93 por ciento) del ácido 5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxílico. ?H NMR (300 MHz, DMS0-d6)?: 12.09 (s, br, 2H, Nh & COOH), 9.59 (s, ÍH, CHO), 2.44 (s, 3H, CH3) , 2.40 (s, 3H, CH3) . 2-Dimetilaminoetil) amida del ácido 5-formil-2,4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxílico A una mezcla del ácido 5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxilico (1.67 gramos, 10 milimoles) en dimetilformamida (10 mililitros) , se le agregó hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitris (dimetilamino) -fosfonio (reactivo BOP, 6 gramos, 13.5 milimoles) , seguido por 3 mililitros de di-isopropiletilamina. Después de agitar durante 5 minutos, se agregó 1 mililitro de N,N-dimetiletilendiamina, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. A la mezcla de reacción se le agregaron 25 mililitros de hidróxido de sodio ÍN y 25 mililitros de salmuera. Después de agitar durante 30 minutos, la mezcla de reacción se vertió en agua (100 mililitros) , y se extrajo (3 x 200 mililitros) con el metanol al 10 por ciento en diclorometano. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se evaporaron utilizando un evaporador giratorio. El residuo que quedó se purificó mediante cromatografía (columna de gel de sílice, metanol al 5-10 por ciento en diclorometano) , para dar 1 gramo (42 por ciento) de (2-dimetilaminoetil) -amida del ácido 5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-carboxílico.

XH NMR (360 MHz, DMSO-d6) d: 11.77 (s, ÍH, NH) , 9.53 (s, ÍH, CHO) , 7.34 (t, J - 5.6 Hz, ÍH, CONH) , 3.27 (m, 2H, CONCI^CH,), 2.37 (t, J - 6.8 Hz, 2H, CONCHjCH,) , 2.35 (s, 3H, CH,) , 2.3 (s, 3H, CH,) , 2.17 (s, 6H, 2 X CH,) . MS m/z 238.3 [M+l]*. 3 , 5-Dimeti1-4- (4-metil-piperazin-l-carbonil) -lH-pirrol-2-carboxaldehído A una mezcla de ácido 5-formil-2 , 4-dimetil-lH-pirrol- 3-carboxílico (1.67 gramos, 10 milimoles) en dimetilformamida (10 mililitros) , se le agregó hexafluorofosfato de benzotriazol-i-iloxitris(dimetilamino) -fosfonio (reactivo BOP, 6 gramos, 13.5 milimoles), seguido por 3 mililitros de di-isopropiletila ina. Después de agitar durante 5 minutos, se agregaron 2 mililitros de 1-metilpiperaz na, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 24 horas. Entonces a la reacción se le agregaron 25 mililitros de hidróxido de sodio ÍN y 25 mililitros de salmuera. Después de agitar durante 30 minutos, la mezcla de reacción se vertió en agua (100 mililitros) , y se extrajo (3 x 200 mililitros) con metanol al 10 por ciento en diclorometano. Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se evaporaron sobre un evaporador giratorio. El residuo que quedó se purificó mediante cromatografía (columna de gel de sílice, metanol al 5-10 por ciento en diclorometano) para dar 1 gramo (40 por ciento) de 3 , 5-dimetil-4- (4-metilpiperazin-l-carbonil) -lH-pirro1-2-carboxaldehído.

*H NMR (360 MHz, DMS0-d6)d: 1* ÍH, CHO), 3.14 (br m, 4H, 2xCH2) , (S,-3H, CH,) , 2.17 (s, 3H, CH,) , 2.1-» MS El 249 [MI*.

C. Ejemplos - Síntesis de 2-indolinonas sustituidas or pirrol Las siguientes síntesis de los compuestos representativos de esta invención se muestran a manera de ejemplo solamente, y no deben interpretarse para limitar el alcance de esta invención al planteamiento sintético ó a los compuestos que comprende esta invención.

Ejemplo 1 Acido 3-[5-cloro-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenme-til) -4-metil-iH-pirrol-3-il] -propiónico El 4- (2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (4.5 gramos), 4.2 gramos de 5-cloro-2-oxindol, y 2.9 mililitros de piperidina en 50 mililitros de etanol, se calentaron a 95°C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en acetona, y el precipitado amarillo se filtró, se lavó con etanol frío, ácido clorhídrico acuoso 2 N, y agua a un pH de 6, luego se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 7.2 gramos del compuesto del título (88 por ciento) como un sólido amarillo. *HNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 13.31 (S, br, ÍH, NH-1'), 12.06 (s, br, ÍH, COOH), 10.88 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.93 (d, J « 1.88Hz, ÍH, H-4), 7.75 (a, ÍH, H-vim'lo), 7.19 (d, J « 3.1 Hz, ÍH, H-2'), 7.1 (dd, b, J - 1.88,8.40 Hz, ÍH, H-6) , 6.84 (d, J = 8.40 Hz, ÍH, H-7) , 2.65 (t, J - 7.44 Hz, 2H, CH-CH.COOH) , 2.46 (t, J » 7.44 Hz, 2H, CH,CH,C0OH) , 2.28 (s, 3H, CH,) . Ejemplo 2 Acido 3- [5- (6-metoxi-2-oxo-l 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico El 4-(2-carboxietil)-2-formil-3-metilpirrol (190 miligramos) , 163 miligramos de 6-metoxi-2-oxindol , y 2 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 90°C durante 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío para dar 140 miligramos del compuesto del título (43 por ciento) como un sólido castaño.

JHNMR (360 MHz, DMSO-dd) : d 13.1 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.04 (s, br, ÍH, COOH), 10.76 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.63 (d, J = 8.2.9Hz, ÍH, H-4), 7.46 (s, ÍH, H-vini?Q), 7.07 (d, J - 3.03 Hz, ÍH, H-2'), 6.55 (dd, J - 2.32, 8.29Hz, ÍH, H-5) , 6.43 (d, J = 2.32 Hz, ÍH, H-7), 3.74 (s, 3H, OCH,), 2.63 (t, J =. 7.31 Hz, 2H, CHjCHjCOOH), 2.45 (t, J - 7.31 Hz, 2H, CH^COOH) , 2.23 (s, 3H, Oí,) ; MS m/z (.intensidad relativa , %) 327 ([M+l]*, 100).

Ejemplo 3 Acido 3- [5- (5-cloro-2-oxo-l, 2 -dihidroindol-3-ilidenmetil) -2, 4-dimetil-lH-pirrol-3-il] -propiónico El 3-(2-carboxietil) -2 , 4-dimetil-5-formilpirrol (220 miligramos) , 147 miligramos de 5-cloro-2-oxindol, y 2 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 90°C durante 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío para dar 172 miligramos del compuesto del título (50 por ciento) como un sólido castaño.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.42 ( s, br, ÍH, NH-1') , 12.03 (s, br, ÍH, COOH), 10.80 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.87 (d, J - 2.06Hz, ÍH, H-4), 7.67 (s, ÍH, H-VÍnil°), 7.06 (dd, J » 2.06, 8.3Hz, ÍH, H-6), 6.83 (d, J » 8.3 Hz, ÍH, H-7) , 2.64 (t, J * 7.6 Hz, 2H, CHjCH,COOH) , 2.34 (t, J = 7.6 Hz„ 2H, CH,CH,COOH) , 2.29 (s, 3H, CH,) , 2.27 (s, 3H, CH,) ; MS m/z (intensidad relativa - *) 345 ([M+l]*, 64) .

Ejemplo 4 Acido 3- [4-meti1-5- (2-oxo-l, 2-dicloroindo1-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico Se colocó metal de sodio (1.5 gramos) en un matraz de fondo redondo de 3 cuellos, de 3 litros, equipado con un termómetro, condensador de reflujo y agitador mecánico, y se colocó en un baño de aceite. Se agregó etanol absoluto (1 litro) con agitación. Cuando se disolvió el sodio, se agregaron 350 gramos de pentan-2 , 4-diona, todo a la vez, y luego se agregaron 310 gramos de acrilato de etilo durante 30 minutos. La mezcla se puso a reflujo durante 2.5 horas, y luego se dejó enfriar a temperatura ambiente durante la noche. Se agregó ácido acético glacial (3 mililitros) , y el solvente se removió mediante evaporación giratoria. El residuo se filtró a través de un cojín de tierra diatomácea, y se destiló en una película limpiada a 0.1 milímetros. El destilado se volvió destilado utilizando una columna Vigreux encamisada al vacío de 25.4 centímetros para dar 518 gramos de 5-acetil-4-oxohexanoato de etilo, punto de ebullición: 84-92°C a 0.2 - 0.7 milímetros.

A un matraz de tres cuellos de 5 litros, equipado con un termómetro y agitador mecánico, y calentado sobre un baño de vapor, se agregaron 350 gramos de 5-acetil-4-oxohexanoato de etilo, 329 gramos de clorhidrato de aminomalonato de etilo, 133 gramos de acetato de sodio, y 1.2 litros de ácido acético. La mezcla se calentó a 99 °C durante 37 minutos. A los 62 °C, el desprendimiento de dióxido de carbono ya fue rápido. Después de un total de 35 minutos a 99 °C, se hizo muy lento el desprendimiento de gas de C02. Después de otra hora, la mezcla se enfrió, se removió el cloruro de sodio mediante filtración al vacío, y se evaporó el solvente. El residuo se mezcló con 1 litro de agua fría. El precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 400 mililitros de agua, y se disolvió en 1 litro de etanol caliente al 95 por ciento. La solución se trató con 20 gramos de Darco G-60, se filtró caliente, y se enfrió a temperatura ambiente. El sólido cristalino se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó dos veces sobre el filtro con 200 mililitros de etanol al 50 por ciento, y se secó al vacío a 70°C para dar 265 gramos (rendimiento del 64 por ciento) de 2-etoxicarbonil-4-(2-etoxicarboniletil) -3 , 5-dimetilpirrol. El filtrado se refrigeró durante la noche para dar otros 53.1 gramos (rendimiento del 11.9 por ciento) del producto, para un rendimiento total del 75.9 por ciento. El 2-etoxicarbonil-4- (2-etoxicarboniletil) -3 , 5-dimetilpirrol (285 gramos), y 3,500 mililitros de etiléter, se colocaron en un matraz de tres cuellos, de cinco litros, equipado con un agitador mecánico, un condensador de reflujo, y un embudo de adición, y se enfriaron en un baño de hielo. Se agregó por goteo cloruro de sulfurilo (435 gramos) durante 145 minutos. A medida que procedía la adición, la mezcla se hizo nebulosa y verde, y luego se aclaró. Al final de la adición, la mezcla era transparente y ligeramente amarilla. La mezcla se agitó durante una hora adicional, y luego se calentó a reflujo durante 1 hora. La mezcla se enfrió en un evaporador giratorio, se diluyó con 1,500 mililitros de éter, y se evaporó giratoriamente de nuevo. La dilución y la evaporación se repitieron nuevamente. El residuo se agregó a 8 litros de agua conteniendo 802 gramos de ácido acético y 535 gramos de hidróxido de sodio. La mezcla se calentó brevemente a 85 °C, y luego se dejó enfriar durante la noche con agitación. La capa acuosa, que contenía sólidos, se separó y ee extrajo con 800 mililitros de éter. Los sólidos y la capa de éter se agregaron a 2.5 litros de agua, conteniendo 300 gramos de carbonato de sodio, se agitaron durante 1 hora, y se filtraron para remover una pequeña cantidad (aproximadamente 7 gramos) de un sólido. Se agregó ácido sulfuroso (137 gramos) a la mezcla, y el precipitado resultante se lavó dos veces con 250 mililitros de agua, y se secó al vacío para dar 56.4 gramos del producto. Se agregó ácido sulfuroso (92 gramos) al filtrado, y el precipitado resultante se lavó dos veces con 0.5 litros de agua, y se secó al vacío para dar 220 gramos del producto, para un total de 276.4 gramos (rendimiento del 86.8 por ciento) de 2-carboxi-5-etoxicarbonil-3- (2-etoxicarboniletil) - 4 -metilpirrol. El 2-carboxi-5-etoxicarbonil-3- (2-etoxicarbonil-etil) -4-metilpirrol (50.5 gramos), y 400 mililitros de una solución de hidróxido de sodio al 10 por ciento, se calentaron a 180 °C en una autoclave Parr durante 90 minutos. Este proceso se repitió cuatro veces más, hasta que se hubo tratado un total de 252.5 gramos de 2-carboxi-5-etoxicarbonil-3- (2-etoxicarboniletil) -4-metilpirrol. Las cinco soluciones se combinaron y se evaporaron giratoriamente hasta un volumen de aproximadamente 1.8 litros de un residuo negro espeso. La mezcla se enfrió a 10°C en un baño de agua, y se agregó lentamente ácido sulfúrico al 50 por ciento para mantener la temperatura a < 20°C, hasta que el pH fue de 2. Se agregó etiléter (1,400 mililitros), la mezcla se filtró, y se guardó el precipitado. El precipitado se extrajo en un extractor Soxhlet con 500 mililitros de éter. Las capas de éter combinadas se lavaron con 250 mililitros de agua, seguidos por 150 mililitros de agua. Las capas de agua combinadas se retroextrajeron con 150 mililitros de éter. Todas las capas de éter se evaporaron giratoriamente, y el residuo se secó para dar 123.5 gramos de 3- (2-carboxietil-4-metilpirrol .

El 3-(2-carboxietil) -4-metilpirrol (123 gramos) se mezcló con 1,500 mililitros de etiléter y 250 mililitros de metanol en un matraz receptor magnéticamente agitado. Un matraz de fondo redondo de 3 cuellos, de 3 litros, separado, se equipó con agitador magnético, una cabeza de destilación, y un condensador que conducía a la entrada del matraz receptor, y se calentó en un baño de agua. En el matraz de 3 litros se colocaron 240 gramos de Diazald disueltos en 1,800 mililitros de etiléter, y una solución de 73 gramos de hidróxido de potasio disueltos en 360 mililitros de etanol al 95 por ciento, y 112 mililitros de agua. El matraz de 3 litros se agitó y se calentó a 65-75°C en un baño de agua, y la mezcla de diazometano-éter se destiló en el matraz receptor agitado durante aproximadamente 2.5 horas. Se agregó etiléter (200 mililitros) al matraz de 3 litros, y la destilación continuó hasta terminar. El matraz receptor se agitó durante otros 30 minutos, y luego se agregaron 10 mililitros de ácido acético. La mezcla se extrajo dos veces con 500 mililitros de agua, luego dos veces con 200 mililitros de bicarbonato de sodio saturado. La capa de éter se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se destiló para dejar un residuo fluido oscuro. El resido se destiló dos veces a través de una columna Vigreux de 10.16 centímetros, y una vez a través de una columna Vigreux encamisada al vacío de 25.4 centímetros para dar 108 gramos (rendimiento del 80.6 porciento) de 3- (2-etoxicarboniletil) -4-metilpirrol. Punto de ebullición: 108-113°C a 0.5 milímetros. Se cargó dimetilformamida a un matraz de fondo redondo de 3 cuellos, de 500 mililitros, equipado con agitador mecánico, un termómetro, y un embudo de goteo, y se mantuvo bajo una atmósfera de nitrógeno. El matraz se enfrió a 0°C y se agregaron por goteo 58.4 mililitros de oxicloruro de fósforo durante 80 minutos. Se agregó dicloroetano (280 mililitros) , y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente, y luego se enfrió a -10°C. Se agregó por goteo 3- (2-metoxicarbonil-etil) -4-metilpirrol (55.7 gramos) disuelto en 80 mililitros de dicloroetano durante 1 hora, y la mezcla se agitó durante otros 35 minutos. La mezcla se evaporó giratoriamente a < 30°C. El residuo fluido se vertió en 2,700 mililitros de una solución de hidróxido de sodio 2 N helada. La solución resultante se calentó a 88°C durante 20 minutos, y luego se mantuvo a esta temperatura durante 30 minutos adicionales. La solución se enfrió a temperatura ambiente, y se extrajo con 200 mililitros de etiléter. La solución acuosa se enfrió a 0°C, y se acidificó a un pH de 3.5, agregando lentamente aproximadamente 1,350 mililitros de ácido clorhídrico 5 N. El precipitado amarillo se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó cuatro veces con 100 mililitros de agua, y se secó en un horno al vacío a temperatura ambiente, para dar 54.4 gramos (rendimiento del 90.2 por ciento) de 4- (2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol crudo.

El material crudo se colocó en una mezcla a reflujo de 425 mililitros de etanol y 700 mililitros de etiléter, y se filtró caliente para remover un residuo insoluble, el cual se retuvo. El filtrado se puso en el congelador, y el precipitado resultante se recolectó mediante filtración al vacío, y se lavó con 50 mililitros de éter. El filtrado se utilizó para extraer nuevamente el residuo insoluble, se filtró caliente, y se puso en el congelador. El precipitado resultante y el primer precipitado se combinaron para dar 26.1 gramos de 4- (2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol como un polvo castaño, p.f. 149.0 - 150.3 °C. El filtrado se combinó con el filtrado a partir de la preparación anterior, y se concentró para dar 43 gramos de un sólido castaño. El sólido se puso en una mezcla a reflujo de 500 mililitros de éter y 100 mililitros de etanol, y se filtró. El filtrado se trató con Norit a reflujo, y se filtró caliente de nuevo. El filtrado se puso en el congelador para dar 3 cultivos adicionales de 4- (2-carboxietil) -2-formil-3-etilpirrol, 7.7 gramos, p.f. 148-151°C, 3.2 gramos, p.f. 128-134°C, y 4.1 gramos, p.f. 148.2-150.0°C. El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (9.0 gramos), y 6.0 gramos de 2-oxindol en 50 mililitros de etanol, se calentaron a 70°C en un matraz de fondo redondo de 3 cuellos, de 250 mililitros, equipado con un termómetro, un condensador de reflujo, y agitador magnético. Cuando se disolvieron la mayoría de los sólidos, se agregaron lentamente 4.5 gramos de piperidina, y la mezcla se puso a reflujo durante 4 horas. Se agregó lentamente ácido acético (12 mililitros), dando como resultado un precipitado copioso. La mezcla se puso a reflujo durante 5 minutos, se enfrió a temperatura ambiente, y el precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, y se lavó con 30 mililitros de etanol. El precipitado se lavó en pasta a reflujo en 30 mililitros de etanol, se enfrió a temperatura ambiente, se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 20 mililitros de etano, y se secó al vacío para dar 11.9 gramos (rendimiento del 80 por ciento) de 3-[4- (2-carboxietil) -3-metilpirrol-2-metilindenil] -2-indolinona, SU6663, como un sólido naranja.

*HNMR (360 MHZ, DMS0-d6) : d 13.29 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.05 (s, br, ÍH, COOH), 10.78 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.73 (d, J = 7.43Hz, ÍH, H-4), 7.61 (s, ÍH, H-Vinilq, ? 3 {d > j n 2 15 Hz, ÍH, H-2'), 7.10 (t, J - 7.43 Hz, ÍH, H-6) , 6.97 (t, J - 7.43 Hz, ÍH, H-5), 6.85 (d, J- 7.43 Hz, ÍH, H-7) , 2.64 (t, J - 7.38 Hz, 2H, CHjCHjCOOH), 2.46 (t, J- 7.38 Hz, 2H, CH2CHJCOOH) , 2.25 (s, 3H, CH,) ; MS m/z (.intensidad relativa t %) 297 ([M+l]*, 100) .

Ejemplo 5 Acido 3- [2, 4-dimetil-5-(2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico El 2-4-dimetil-5-etoxicarbonil-3-(2-etoxicarbonil-etil) -pirrol (1.07 kilogramos) y 3.2 litros de hidróxido de sodio 5 N, se agitaron mecánicamente en un matraz de fondo redondo de tres cuellos de 12 litros, equipado con un condensador de reflujo y un embudo de adición, y se calentaron en un baño de aceite. La mezcla se puso a reflujo durante 3 horas, después de cuyo tiempo la temperatura interna era de 96°C, se disolvieron todos los sólidos, y la cromatografía de capa delgada mostró que estaba completa la hidrólisis. El baño de calentamiento se removió, y la mezcla se enfrió a 50°C en un baño de agua. Se agregó lentamente ácido clorhídrico 12N (aproximadamente 1.3 litros). Después de que se agregó aproximadamente el 50 por ciento del ácido, se inició el desprendimiento de gas, y la temperatura alcanzó 60°C. A medida que se agregaba más ácido, se incrementaba el desprendimiento de gas, y se formaba un precipitado amarillo. El pH final se ajustó a 3.5 con ácido clorhídrico. La mezcla se enfrió en un baño de hielo a 8°C. Los sólidos se recolectaron mediante filtración al vacío, se lavaron dos veces con 0.5 litros de agua destilada, y se secaron durante 48 horas en un horno al vacío a 55-60°C, para dar 677 gramos (rendimiento del 101 por ciento) de 3- (2-carboxietil) -2 , 4-dimetilpirrol. lHNMR (d4-DMSO) d 11.9 (s, ÍH, COOH), 9.9(s, ÍH, NH) , 6.2(s. ÍH, aromático ) , 2.5 (t, 2H, CH2) , 2.2 (t, 2K, CH,) , 2.0 (s, 3H, CH,) , 1.9,(8, 3H, . CH,) ; MP 134-136 °C .

La dimetilformamida (28.5 gramos) en 250 mililitros de diclorometano en un matraz de fondo redondo de tres cuellos, de 1 litro, equipado con agitador magnético, un termómetro y un embudo de goteo, se enfrió en un baño de hielo-sal a -1°C. Se colocó oxicloruro de fósforo (59.3 gramos) en el embudo de goteo, y se agregó lentamente a la mezcla de reacción. El embudo se inundó con 25 mililitros de diclorometano para asegurarse de todo el oxicloruro de fósforo. La máxima temperatura alcanzada por la mezcla fue de 5°C. La mezcla se agitó durante 15 minutos, en cuyo tiempo la temperatura fue de -3°C. Se agregó 3-(2 carboxietil) -2 , 4-dimetilpirrol sólido (32.6 gramos) en porciones durante 15 minutos. La máxima temperatura alcanzada por la mezcla fue de 7°C. La mezcla negra rojiza se agitó durante 30 minutos más, y luego se calentó a reflujo durante 1 hora. La mezcla se enfrió a 15°C, y se agregaron 300 mililitros de agua, conduciendo a una reacción vigorosa, durante la cual se incrementó la temperatura. La mezcla se agitó y se enfrió a 22 °C, y las capas se separaron y se guardaron. La capa orgánica se extrajo con 100 mililitros de agua, y las capas acuosas se combinaron y se lavaron con 50 mililitros de diclorometano. Las capas orgánicas se desecharon. La capa acuosa se ajustó a un pH de 11, con aproximadamente 180 mililitros de hidróxido de sodio 10 N. La temperatura se incrementó a 40°C. La mezcla se agitó durante 30 minutos, en cuyo tiempo la temperatura fue de 27 °C. La mezcla se acidificó a un pH de 2, con aproximadamente 120 mililitros de ácido clorhídrico 10 N, lo cual incrementó la temperatura a 30°C. Se agregó acetato de etilo (150 mililitros) , y la mezcla se agitó para extraer el producto. Durante la agitación, apareció una cantidad considerable de sólido negro encima de la capa de agua. La capa de acetato de etilo se separó, y la capa acuosa y el sólido se extrajeron dos veces con 100 mililitros de acetato de etilo. El sólido todavía presente se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó completamente con agua, y se secó al vacío a 40°C para dar 12 gramos (rendimiento del 31 por ciento) de 3- (2-carboxietil) -2 , 4-dimetil-5-formilpirrol como un sólido negro castaño. La cromatografía de capa delgada (diclorometano: ácido acético, 95:5, gel de sílice) mostró una mancha en Rf 0.7, y una mancha coloreada en el origen. Las capas de acetato de etilo se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se evaporaron para obtener un sólido nec_.ro castaño, el cual se secó al vacío a 40°C para dar 21 gramos (rendimiento del 55 por ciento, rendimiento total del 86 por ciento) de 3- (2-carboxietil) -2 , 4-dimetil-5-formilpirrol, de una apariencia idéntica al sólido anterior, mediante cromatografía d capa delgada. De una manera alternativa, la dimetilformamida (124 mililitros) en 750 mililitros de diclorometano, en un matraz de fondo redondo de tres cuellos, de 5 litros, equipado con agitador mecánico, un termómetro, y un embudo de goteo, se enfrió en un baño de hielo-sal a -9°C. Se agregó rápidamente oxicloruro de fósforo (114 mililitros) por medio del embudo de goteo, el cual se inundó en la mezcla de reacción con 50 mililitros de diclorometano. La máxima temperatura alcanzada por la mezcla fue de -4°C. Se agregó 3- (2-carboxietil) -2 , 4-dimetilpirrol sólido (133.6 gramos) en porciones durante 20 minutos. La máxima temperatura alcanzada por la mezcla fue de 3°C. La mezcla rojiza oscura se calentó a reflujo durante 1 minuto, y luego se enfrió a -1°C. La mezcla se enfrió a 1°C, y se agregaron rápidamente 800 mililitros de agua helada. La máxima temperatura alcanzada fue de 15 °C. La capa orgánica se separó y se desechó. La capa acuosa se ajustó lentamente a un pH de 12-13 con aproximadamente 800 mililitros de hidróxido de potasio 10 N, agregando hielo para controlar la temperatura. La temperatura se incrementó a 37 °C. La mezcla se agitó durante 90 minutos a temperatura ambiente, en cuyo tiempo la cromatografía de capa delgada mostró solamente una traza de material de color claro en el origen, con el producto en Rf 0.3. La mezcla se enfrió a 0°C. La mezcla se acidificó a un pH de 3 con aproximadamente 600 mililitros de ácido clorhídrico 10 N, agregándose hielo para controlar la temperatura. La máxima temperatura alcanzada fue de 10°C. La mezcla se agitó durante 1 hora en frío. El sólido se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó 4 veces con 100 mililitros de agua, y se secó al vacio a 50-60°C, para dar 140.6 gramos (rendimiento del 90 por ciento) de 3- (2-carboxietil) -2 , 4-dimetil-5--formilpirrol como un sólido castaño. lHNMR (dj-DMSO) : d 12.0 (s, ÍH, COOH), 11.3 (s, ÍH, NH) , 9.4(s, ÍH, CHO), 2.6 (t, 2H, CH2) , 2.3 (t, 2H, CH,) , 2.2(s, 3H, CH,), 2.1(s, 3H, CH,) . MP 145-147 °C.

El 3- (2-carboxietil) -2, 4-dimetil-5-formilpirrol (18.2 gramos), y 11.7 gramos de 2-oxindol, se disolvieron en 100 mililitros de etanol, calentando en un matraz de fondo redondo de 250 mililitros, equipado con un agitador magnético y un condensador de reflujo en un baño de aceite. Se agregó pirrolidina (7.0 gramos), y la mezcla de reacción se puso a reflujo durante 2 horas, en cuyo tiempo estuvo presente una gran cantidad de sólido negro castaño. La cromatografía de capa delgada (acetato de etilo: etanol: ácido acético, 96:2:2, gel de sílice) mostró la ausencia del material de partida de oxindol. Se agregaron 8 mililitros de ácido acético, y la mezcla se puso a reflujo durante 15 minutos. La mezcla espesa se diluyó con 50 mililitros de etanol, y se enfrió a 10°C. El sólido se recolectó mediante filtración al vacío, y se lavó con 50 mililitros de etanol. El sólido se agitó en 125 mililitros de etanol a reflujo durante 10 minutos, se enfrió a 10°C, se recolectó mediante filtración al vacío, y se lavó con 50 mililitros de etanol. El producto se secó durante la noche a 45°C al vacío, para dar 25.5 gramos (rendimiento del 88 por ciento) de 3- [2 , 4-dimetil-3- (2-carboxietil) pirrol-5-metilinde-nil] -2-indolinona como un sólido naranja. De una manera alternativa, una mezcla de ácido 3- (5-formil-2 ,4-dimetil-lH-pirrol-3-il) -propiónico (10 gramos, 51 milimoles) , 2-oxindol (6.5 gramos, 49 milimoles), e hidróxido de sodio (40 gramos, 58 milimoles) disuelto en 50 mililitros de agua, se agitó a 50 °C durante 4 horas. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se filtró, y el filtrado se acidificó a un pH de 3, con ácido clorhídrico 12 N. El sólido que se precipitó se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 10 mililitros de agua, y se secó al vacío durante la noche. La pasta sólida cruda se lavó con etanol caliente dos veces. Luego el sólido se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 10 mililitros de etanol, y se secó al vacío para dar 13.8 gramos (91 por ciento) de ácido 3-[2 , 4-dimetil-5-(2-oxo-l , 2-dihidro-indol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il]-propiónico. lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.38 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.05 (s, br, ÍH, COOH), 10.70 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.69 (d, J = 7.39Hz, ÍH, H-4), 7.53 (s, ÍH, H-vinyl), 7.06 (t, J - 7.39 Hz, 1H, H-6) , 6.95 (t, J- 7.39 Hz, ÍH, H-5), 6.85 (d, J = .7.39 Hz, ÍH, H-7), 2.63 (t, J - 7.45 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.34 (t, J = 7.45 Hz, 2H, CHjCH,C0OH), 2.28 (s, 3H, CH,) , 2.24 (s, 3H, CH, ) ; MS m/z intensidad relativa , %) 31.1 ([M+l]*, 100).

Ejemplo 6 Acido 3-[5-(5-bromo-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-iliden-metil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico El 2-oxindol (53.3 gramos) se suspendió en 640 mililitros de acetonitrilo, y la mezcla se enfrió a 7°C en un baño de hielo con agitación mecánica. Se agregó N-bromosuccinimida sólida (74.8 gramos) en porciones durante 20 minutos . Después de que se hubo agregado aproximadamente una tercera parte de la N-bromosuccinimida (durante 5 minutos) , la temperatura se incrementó a 12 °C. La adición se detuvo hasta que la temperatura de la mezcla había caído hasta 10°C. La adición se reasumió manteniendo la temperatura debajo de 12 °C. Después de terminarse la adición, la mezcla se agitó durante 1 hora a 10°C, y luego durante 1 hora adicional, durante lo cual, la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente. El precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 80 mililitros de etanol, y se succionó para secarse durante 20 minutos en el embudo de filtración para dar el producto que contenía el 6.4 por ciento de 2-oxindol mediante HPLC. El sólido se suspendió en 1,440 mililitros de etanol desnaturalizado, y se lavó en pasta mediante agitación y poniendo a reflujo durante 5 minutos, en cuyo tiempo se disolvió la mayor parte del sólido. La mezcla se enfrió en un baño de hielo a 13 °C. El producto sólido se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 80 mililitros de etanol, y se secó al vacío para dar 57.7 gramos (68.0 por ciento) de 5- bromo-2-oxindol conteniendo el 1.13 por ciento de 2-oxindol mediante HPLC. El lavado en pasta con 30 por ciento menos de etanol dio un mejor rendimiento (88 por ciento) , pero contenía más 2-oxindol (1.76). lHNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 10.44 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.32- 7.36 (m, 2H) , 6.76 (d, J - 8.50 Hz, ÍH, H-7) , 3.5 (s, 2H, CH,) ; MS /z 212.1/ 214.1 (M* / [M+2]*).

El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90 miligramos) , 106 miligramos de 5-bromo-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 95 °C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 2 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío para dar 120 miligramos (64 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño.

'HNMR (360 MHZ, DMS0-d6) : d 13.31 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.06 (a, br, ÍH, COOH), 10.90 (s, br, ÍH, NH-1), 8.06 (s, br, ÍH, H-4) , 7.75 (s, ÍH, H-vinild» 7.23 (d, br, J « 8.50 Hz, ÍH, H-6) , 7.19 (d, J - 2.84 Hz, ÍH, H-2'), 6.80 (d, br, J - 8.50 Hz, ÍH, H-7), 2.65 (t, J- 7.65 Hz, 2H, CH,CH,C00H) , 2.46 (t, J - 7.65 Hz, 2H, CHjCH,C0OH) , 2.28 (s, 3H, CH,) ; MS m/z 375.1/ 377.2 (M* / [M+2]*).

Ejemplo 7 Acido 3- [5- (5-yodo-2-oxo-l, 2 -dihidroindol-3- ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico El 2-oxindol (82.9 gramos) se suspendió en 630 mililitros de ácido acético y la mezcla se agitó mecánicamente y se enfrió a 10 °C en un baño de agua helada. Se agregó N-yodosuccinimida sólida (175 gramos) en porciones durante 10 minutos. Después de que se terminó la adición, la mezcla se agitó durante 1 hora a 10 °C. El sólido suspendido que siempre estuvo presente llegó a ser muy espeso en este momento. El sólido se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 100 mililitros de ácido acético al 50 por ciento en agua, y luego con 200 mililitros de agua, y se succionó para secarse durante 20 minutos en el embudo de filtración. El producto se secó al vacío para dar 93.5 gramos (36 por ciento) de 5-yodo-2-oxindol conteniendo aproximadamente el 5 por ciento de 2-oxindol mediante resonancia magnética nuclear de protones.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 10.45 (s, ÍH, NH-1) , 7.49 (s, 1H, H-4), 7.48 (d, J « 8.10 Hz, ÍH, H-6) , 6.64 (d, J- 8.10 Hz, ÍH, H-7), 3.46 (s, 2H, CH,-3) ; MS m/z 258 [M-l]*. El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90 miligramos), 130 miligramos de 5-yodo-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 95°C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 2 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío para dar 162 miligramos (77 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño.

XHNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 13.30 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.06 (s, br, ÍH, COOH), 10.88 (s, br, ÍH, NH-1), 8.18 (s, br, ÍH, H-4), 7.73 (s, ÍH, H--vinil9( 7.40 (d, br, J = 8.03 Hz, ÍH, H-6), 7.19 (d, J » 2.94 Hz, ÍH, H-2'), 6.69 (d, br, J - 8.03 Hz, ÍH, H-7) , 2.65 (t, J- 7.40 Hz, 2H, CHjCH,COOH) , 2.46 (t, J =» 7.40 Hz, 2H, CHjCHjCOOH) , 2.28 (s, 3H, CH,) / MS m/z 423 [M+l]*.

Ejemplo 8 Acido 3-[4-metil-5-(4-metil-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico Se agregó oxalato de dietilo (30 mililitros) en 20 mililitros de éter seco con agitación, a 19 gramos de etóxido de potasio suspendidos en 50 mililitros de éter seco. La mezcla se enfrió en un baño de hielo, y se agregaron lentamente 20 mililitros de 3-nitro-o-xileno en 20 mililitros de éter seco. La mezcla roja oscura espesa se calentó a reflujo durante 0.5 horas, se concentró hasta obtener un sólido rojo oscuro, y se trató con hidróxido de sodio al 10 por ciento, hasta que se disolvió casi todo el sólido. La mezcla roja oscura se trató con peróxido de hidrógeno al 30 por ciento hasta que el color rojo cambió a amarillo. La mezcla se trató alternadamente con hidróxido de sodio al 10 por ciento y peróxido de hidrógeno al 30 por ciento, hasta que ya no estuvo presente el color rojo oscuro. El sólido se filtró, y el filtrado se acidificó con ácido clorhídrico 6 N. El precipitado resultante se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua, y se secó al vacío para dar 9.8 gramos (rendimiento del 45 por ciento) del ácido 2-metil-6-nitrofenilacético como un sólido blanco. El sólido se hidrogenó en metanol sobre paladio al 10 por ciento sobre carbón para dar 9.04 gramos de 4-metil-2-oxindol como un sólido blanco.

XHNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 10.27 (s, br, ÍH, NH-1), 7.06 (t , J = 7.71 Hz, ÍH, H-6) , 6.74 (d, J - 7.73 Hz, H-5) , 6.63 (d, J - 7.73 Hz, ÍH, H-7) , 3.36 (s, 2H, CH,) , 2.18 (s, 3H, CH,) .

El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90 miligramos), 74 miligramos de 4-metil-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a. 95°C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 -N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío para dar 80 miligramos (52 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.33 (s, br, 1H, NH-1'), 10-84 (s, br, 1H, H-1), 7.54 (s, 1H, H-Vinilr* , 7.12 (d, J -2-0 HZ, 1H, H-2') , 7.01 (t, J « 7.75 Hz, 1H, H-6) , 6.79 (d, J = 7.75 Hz, H-5) , 6.74 (d, J - 7.75 Hz, ÍH, H-7) , 2.64 (t, J -7-S5 Hz, 2H, CHjCHjCOOH), 2.57 (s, 3H, CH3) , 2.42 (t, J - 7.65 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.19 (s, 3H, CH,) ; MS /z (-intensidad relativa ., %) 311 ([M+l]*, 100) .

Ejemplo 9 Acido 3-[4-metil-5-(5-metil-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -iH-pirrol-3-il]propiónico La 5-metilisatina (15.0 gramos), y 60 mililitros de hidrato de hidrazina se calentaron a 140-160°C durante 4 horas. La cromatografía de capa delgada (acetato de etilo: hexano 1:2, gel de sílice) no mostró material de partida restante. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, se vertió en 300 mililitros de agua helada, y se acidificó a un pH ' de 2 con ácido clorhídrico 6 N. Después de reposar a temperatura ambiente durante 2 días, el precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua, y se secó al vacío para dar 6.5 gramos (rendimiento del 47 por ciento) de 5-metil-2-oxindol. lHNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 10.20 (s, br, ÍH, NH-1) , 6.99 (s, 1H, H-4), 6.94 (d, J- 8.11 Hz, ÍH, H-6) , 6.68 (d, Ja 8.11 Hz, 1H, H-7), 3.39 (s, 2H, CH,-3), y 2.22 (s, 3H, CH,- 5) .

El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90 miligramos) , 74 miligramos de 5-metil-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 2 mililitros de etanol se calentaron a 95 °C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6 , y se secó en un horno al vacío para dar 65 miligramos (42 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño.

'HNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 13.30 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.05 (s, br, 1 H, COOH), 10.67 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.57 (s, 2H, H-'Vi'tilo H-4), 7.12 (d, J- 2.65 Hz, 1H„ H-2'), 6.91 (d, J - 7.82 Hz, ÍH, H-6), 6.74 (d, J - 7.82 Hz, 1H, H-7) , 2.65 (t, J = 6.94 Hz, 2H, CHjCHjCOOH) , 2.46 (t, J a 6.94 Hz, 2H, CHjCH,COOH), 2.30 (s, 3H, CH,) , 2.25 (s, 3H, CH,) ; MS m/z (intensidad relativa . %) 311 ([M+l]*, 100).

Ejemplo 10 Acido 3-[5-(5,6-dimetoxi-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90 miligramos), 97 miligramos de 5, 6-dimetoxi-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 95°C durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío para dar 104 miligramos (58 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño.

*HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.19 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.05 (s, br, 1 H, COOH), 10.53 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.46 (s, ÍH) , 7.41 (3, ÍH ), 7.02 (s, ÍH, H-2'), 6.45 (s, ÍH) , 3.74 (s, 3H, OCH,), 3.70 (s, 3H, OCH,), 2.59 (t, J - 7.43 Hz, 2H, CH,CH,COOH), 2.44 (t, Ja 7.43 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.22 (s, 3H, CH,) ; MS /z 357 [M+l]*.

Ejemplo 11 Acido 3- [5- (6-cloro-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico El 4- (2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (200 miligramos), 167.6 miligramos de 6-cloro-2-oxindol, y 166 microlitros de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 95 °C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío para dar 246 miligramos (74 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño. lHNMR (360 MHZ, DMSO-d6) : d 13.22 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.09 (s, br, 1 H, COOH), 10.95 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.78 (d, J = 7.95 Hz, ÍH, H-4), 7.66 (s, ÍH, H-vinilo), 7.18 (d, J - 2.64 Hz, ÍH, H-2'), 7.01 (dd, J - 1.90, 7.95 Hz, ÍH, H-5) , 6.86 (d, J a 1.90Hz, ÍH, H-7), 2.65 (t, J - 7.14Hz, 2H, , 2.45 (t, J a 7.14 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.26 (s, 3H, CH,) .

Ejemplo 12 Metiléster del ácido 3-[4-(2-carboxietil) -3-metil-lH-pirrol-2-ilmetilen]-2-oxo-2,3-dihidro-lH-indol-5-carboxílico Se puso a reflujo 5-yodo-2-oxindol (17 gramos) con 2 gramos de diacetato de paladio, 18.2 de trietilamina, 150 mililitros de metanol, 15 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y 2.6 gramos de DPPP en una atmósfera saturada con monóxido de carbono. Después de 24 horas, la mezcla de reacción se filtró para remover el catalizador, y se concentró el filtrado. El concentrado se paso por cromatografía sobre gel de sílice utilizando acetato de etilo al 30 por ciento en hexano. Las fracciones que contenían el producto se concentraron y se dejaron reposar. El producto se precipitó y se recolectó mediante filtración al vacío para dar 0.8 gramos (7 por ciento) de 5-metoxicarbonil-2-oxindol como un sólido blanco.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) d 10.70 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.83 (dd, J - 1.77, 8.29 Hz, ÍH, H-6) , 7.77 (s, br, ÍH, H-4) , 6.89 (d, J» 8.29 (Hz, ÍH, H-7) , 3.80 (s, 3H, COOCH,-5), 3.51 (s, 2H, CH,-3) .

El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90.6 miligramos), 88.6 miligramos de 5-metoxicarbonil-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 95 °C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío para dar 123 miligramos (69 por ciento) del compuesto del título como un sólido amarillo.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.27 (s, br, ÍH, NH-1') , 12.0 (s, vbr, 1H, COOH), 11.16 (s, br, ÍH, NH-1) , 8.36 (s, br, ÍH, H-4) , 7.80 (s, ÍH, H-Vim'lq, 7.40 (dd, J - 1.80, 8.14 Hz, ÍH, H-6) , 7.20 (d, J - 2.91 Hz, ÍH, H-5'), 6.96 (d, J = 8.14 Hz, ÍH, H-7), 3.84 (s, 3H, COOCH,) , 2.66 (t, J == 7.55 Hz, 2H, CH2CH,COOH) , 2.46 (t, J = 7.55 Hz, 2H, CHjCH;,COOH) , 2.30 (s, 3H, CH,) ; MS m/z (intensidad relativa %) 355 ([M+l]*, 100) .

Ejemplo 13 Acido 3-[4-(2-carboxietil) -3-metil-lH-pirrol-2-ilmetilen) -2-0x0-2, 3-dihidro-lH-indol-5-carboxílico El 2-oxindol (6.7 gramos) se agregó a una suspensión agitada de 23 gramos de cloruro de aluminio en 30 mililitros de dicloroetano en un baño de hielo. Se agregó lentamente cloruro de cloroacetilo (11.3 gramos), y se desprendió gas de cloruro de hidrógeno. Después de diez minutos de agitación, la reacción se calentó a 40-50°C durante 1.5 horas. La cromatografía de capa delgada (acetato de etilo, gel de sílice) no mostró material de partida restante. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, y se vertió en agua helada. El precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua, y se secó al vacío para dar 10.3 gramos (98 por ciento) de 5-cloroacetil-oxindol como un sólido blanco.

Una suspensión de 9.3 gramos de 5-cloroacetil-oxindol se agitó en 90 mililitros de piridina a 80-90°C durante 3 horas, y luego se enfrió a temperatura ambiente. El precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, y se lavó con 20 mililitros de etanol. El sólido se disolvió en 90 mililitros de hidróxido de sodio 2.5 N, y se agitó a 70-80°C durante 3 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, y se acidificó a un pH de 2 con ácido clorhídrico 0.5 N. El precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, y se lavó completamente con agua para dar el 5-carboxi-2-oxindol crudo como un sólido castaño oscuro. Después de reposar durante la noche, el filtrado produjo 2 gramos de 5-carboxi-2-oxindol como un sólido amarillo. El producto castaño oscuro crudo se disolvió en metanol caliente, el material insoluble se removió mediante filtración, y el filtrado se concentró para dar 5.6 gramos de -carboxi-2-oxindol como un sólido castaño. El rendimiento combinado fue del 97 por ciento, HNMR (360 MHZ, DMSO-d6) d 12.56 (s, br, ÍH, C00H-5), .70 (s, ÍH, NH-1) , 7.82 (dd, J = 1.57, 7.79 Hz, ÍH, H-6) , 7.74 (s, br, ÍH, H-4), 6.87 (d, J- 7.79 Hz, ÍH, H-7) , ^ . .. . 3 . 53 (s , 2H, CHj-3 ) . MS m/z ( i ntensi dad rel ati va % ) 178 ( [M+?-] \ 100 ) .

El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3 -metilpirrol (90.6 miligramos), 88.6 miligramos de 5-carboxi-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 95°C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío. El producto crudo se purificó mediante cromatografía sobre una columna de gel de sílice utilizando acetato de etilo-hexano-ácido acético como eluyente, para dar 51 miligramos (30 por ciento) del compuesto del título como un sólido amarillo. 1KNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.27 (s, br, ÍH, NH-1) , 12.28 (s, vbr, 2H, 2XC00H) , 11.11 (s, br, ÍH, NH-1) , 8.34 (d, J = 1.36Hz, ÍH, H-4), 7.78 (s, ÍH, H-VÍM'l?), 7.40' (dd, J = 1.36, 8.20 Hz, ÍH, H-6) , 7.19 (d, J » 3.07 Hz, ÍH, H-5') , 6.93 (d, J = 8.20 Hz, ÍH, H-7), 2.65 (t, J - 7.56 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , .2.46 (t, J -7.56 Hz, 2H, CH2CH,COOH) , 2.29 (s, 3H, CH,) ; MS m/z 341.0 [M+l]*.

Ejemplo 14 Acido 3- [4 -metil-5- ( 2 -oxo- 5 -sulfamo í 1-1, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-lH-pirrol-3-il]|propiónico A un matraz de 100 mililitros cargado con 27 mililitros de ácido clorosulfónico, se le agregaron lentamente 13.3 gramos de 2-oxindol. La temperatura de la reacción se mantuvo debajo de 30°C durante la adición. Después de la adición, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1.5 horas, se calentó a 68°C durante 1 hora, se enfrió, y se vertió en agua. El precipitado se lavó con agua y se secó en un horno al vacío para dar 11.0 gramos de 5-clorosulfonil-2- oxindol (rendimiento del 50 por ciento) , el cual se utilizó sin mayor purificación. El 5-clorosulfonil-2-oxindol (2.1 gramos) se agregó a 10 mililitros de hidróxido de amonio en 10 mililitros de etanol, y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se concentró, y el sólido se recolectó mediante filtración al vacío para dar 0.4 gramos (rendimiento del 20 por ciento) de 5-aminosulfonil-2-oxindol como un sólido blanco. -. rHNMR (360 MHz, DMS0-d6) ; d 10.67 (s, ÍH, NH-1), 7.63 - 7.66 (m, 2H, H-4,6), 7.13 (s, 2H, 5-S0,NH,) , 6.91 (d, J =• 8.04 Hz, ÍH, H-7), Y 3.56 (3, 2H, CH,-3); MS m/z '(intensidad relativa, %) 211 ( [M-l] ', 100) .

El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90.6 miligramos) , 106 miligramos de 5-aminosulfonil-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 2 mililitros de etanol se calentaron a 95°C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío para dar 132 miligramos (70 por ciento) del compuesto del título como un sólido amarillo. lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) ; d 13.28 (s, br, ÍH, NH-1') , 12.0 (s, vbr, ÍH, COOH), 11.15 (s, br, ÍH, NH-1) , 8.20 (d, J = .60Hz, ÍH, H-4), 7.73 (3, ÍH, H-vinÜO) , 7.59 (dd, J = 1.60, .17 Hz, ÍH, H-6), 7.22 (d, J - 2.85 Hz, ÍH, H-2') , 7.10 (s, H, NH,) , 6.98 (d, J - 8.17 Hz, ÍH, H-7) , 2.67 (t, J = 7.41 Hz, H, CHjCH,COOH) , 2.46 (t, J « 7.41 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.29 (s, 3H, CH,) .

Ejemplo 15 Acido 3-[4-metil-5- (5-metilsulfamoíl-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il ] -propiónico Una suspensión de 3.38 gramos de 5-clorosulfonil-2-oxindol en 10 mililitros.de metilamina 2 M en tetrahidrofurano, se agitó a temperatura ambiente durante 4 horas, en cuyo tiempo estuvo presente un sólido blanco. El precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó dos veces con 5 mililitros de agua, y se secó al vacío a 40°C durante la noche para dar 3.0 gramos (rendimiento del 88 por ciento) de 5-metilaminosulfoni1-2-oxindol.

XHNMR (300 MHz, DMSO-d6) : d 10.87 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.86 (3, br, ÍH, 5-SO,NHCH,), 7.61 (d, J = 7.80 Hz ÍH, H-6) , 7.32 (d, J w 4.67 Hz, ÍH, H-4) , 6.97 (d, Ja 7.80 Hz, ÍH, H-7) , 2.53 (s, 2H, CH2-3) , and 2.36 (s, 3H, 5-SO,NHCH,) ; MS /z (.intensidad relativa v %) 226 (M*, 100) .

El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90.6 miligramos) , 113 miligramos de 5-metilaminosulf onil-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 2 mililitros de etanol se calentaron a 95°C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacio para dar 163 miligramos (83 por ciento) del compuesto del título como un sólido amarillo.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.30 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.0 (s, vbr, ÍH, COOH), 11.19 (s, br, ÍH, NH-1) , 8.18 (d, J = 1.64Hz, ÍH, H-4) , 7.80 (s, ÍH, H-vinilo), 7.53 (dd, J - 1.64, 8.17 Hz, 1H, H-6) , 7.23 (d, J - 2.80 Hz, ÍH, H-2'), 7.13 (q, J = 5.15Hz, ÍH, NHCH,), 7.02 (d, J - 8.17 Hz, ÍH, H-7) , 3.84 (s, 3H, COOCH,), 2.66 (t, J a 7.54 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.47 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CHjCHjCOOH) , 2.41 (d, J = 5.15Hz, 3H, NCH,), 2.30 (s, 3H, CH3) ; MS m/z 390 [M+l]*.

Ejemplo 16 Acido 3-{3-[4-(2-carboxietil) -3-metil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -2-oxo-2, 3-dihidro-lH-indol-5-il} -propiónico El 5-cloroacetil-2-oxindol (4.18 gramos) en 30 mililitros de ácido trifluoroacético en un baño de hielo, se trató con 4.65 gramos de trietilsilano, y se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla se vertió en 150 mililitros de agua, y el precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con 50 mililitros de agua, y se secó para dar 2.53 gramos (rendimiento del 65 por ciento) de 5- (2-cloroetil) -2-oxindol como un sólido castaño rojizo. Se agregó cianuro de potasio (2.0 gramos) a 15 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y se calentó a 90°C. Se agregó lentamente 5-cloroetil-2-oxindol (3.0 gramos) disuelto en 5 mililitros de sulfóxido de dimetilo con agitación, y la reacción se calentó a 150°C durante 2 horas. La mezcla se enfrió, se vertió en agua helada, y el precipitado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua, y se secó para dar el producto crudo. El material crudo se pasó por cromatografía sobre gel de sílice utilizando metanol al 5 por ciento en cloroformo para dar 1.2 gramos (rendimiento del 42 por ciento) del compuesto del título. El 5-cianoetil-2-oxindol (4.02 gramos) en 10 mililitros de agua conteniendo 25 mililitros de ácido clorhídrico concentrado, se puso a reflujo durante 4 horas. La mezcla se enfrió, se agregó agua, y el sólido resultante se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua, y se secó para dar 1.9 gramos (rendimiento del 44 por ciento) de 5- carboxietil-oxindol como un sólido amarillo. lHNMR (360 MHZ, DMSO-d6) : d 12.00 (s, br, ÍH, 5-CH,CH,COOH), 10.21 (s, 1H. NH-1) . 7.05 (s, 1H, H-4) , 6.99 (d, J = 8.68 Hz, 1H, H-6), 6.69 (d, J - 8.68 Hz, 1H, H-7) , 3.40 (s, 2H, CH,-3), 2.74 (t. J« 7.44 Hz, 2H, 5-CH,CH,COOH) , Y 2.46 (t, J = 7.44 Hz, 2H, -CHjCHjCOOH) .

El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90.6 miligramos), 102.6 miligramos de 5-carboxietil-2-oxindol y 75 microlitros de piperidina en 2 mililitros de etanol se calentaron a 95°C durante 5 horas. La mezcla se reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche. El sólido crudo se purificó mediante cromatografía sobre una columna de sílice, eluyendo con acetato de etilo-hexano-ácido acético, para dar 121 miligramos (66 por ciento) del compuesto del título como un sólido amarillo. 'HNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 13.30 (d, J » 2.38Hz, ÍH, NH- 1'), 12.0 3 (s, vbr, 2H, 2xC00H) , 10.68 ( s, br, ÍH, NH-1) , 7.63 (s, ÍH, H-4), 7.59 (s, ÍH, H-VÍnÜO , 7.12 (d, J= 2.64 Hz, 1H, H-2'), 6.96 ( dd, J= 1.22, 7.93Hz, ÍH, H-6) , 6.75 (d, J -'7.93 Hz, ÍH, H-7), 2.81 (t, J = 7.75Hz, 2H, CH,CH,C00H ), 2.65 (t, Ja 7.75Hz, 2H, CH,CH,C00H) , 2.55 (t, J = 7.75Hz, 2H, CH,CH,COOH ), 2.46 (t, J- 7.42 Hz, CH,CH,C00H) , y 2.26 (s, 3H, CH,) .

Ejemplo 17 Acido 3- [5- ( 5-eti1-2 -oxo-l, 2 -dihidro-indo1-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico El 2-oxindol (3 gramos) se suspendió en 1,2-dicloroetano, y se trató lentamente con 3.2 mililitros de cloruro de acetilo. La suspensión resultante se calentó a 50°C durante 5 horas, se enfrió, y se vertió en agua. El precipitado resultante se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó copiosamente con agua, y se secó al vacío para dar 2.9 gramos (rendimiento del 73 por ciento) de 5-acetil-2-oxindol como un sólido castaño. El 5-acetil-2-oxindol (2 gramos) en 15 mililitros de ácido trifluoroacético en un baño de hielo, se trató lentamente con 1.8 gramos de trietilsilano, y luego se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas. Se agregó 1 mililitros de trietilsilano, y la agitación se continuó durante la noche. La mezcla de reacción se vertió en agua helada, y el precipitado resultante se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó copiosamente con agua, y se secó al vacío para dar 1.3 gramos (rendimiento del 71 por ciento) del compuesto del título como un sólido amarillo. lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 10.25 (s, br, NH-1) , 7.03 (s, ÍH, H-4), 6.97 (d, J » 8.05 Hz, ÍH, H-6) , 6.69 (d, J = 8.05 Hz, 1H, H-7) , 3.40 (s, 2H, CH,-3), 2.51 (q, J - 7.69 Hz , 2H, CH,CH,-5) , y 1.12 (t, J - 7.42 Hz, 3H, CH,CH,-5) .

El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90.6 miligramos), 80.5 miligramos de 5-etil-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 95 °C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró, el residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6 , y se secó en un horno al vacío durante la noche. El sólido crudo se purificó mediante cromatografía sobre una columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo-hexano-ácido acético para dar 52 miligramos (32 por ciento) del compuesto del título. lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.31 (3, br, ÍH, NH-1'), 12.0 4 (s, vbr, ÍH, COOH), 10.66 (s, ÍH, NH-1) , 7.59 (s, 2H, H-4 and H-vinilo) , 7.11 (d, J- 3.29 Hz, ÍH, H-2'), 6.94 (d, J =• 7.85Hz, ÍH, H-6), 6.75 (d, J a 7.85 Hz, ÍH, H-7) , 2.65 (t, J = 7.66Hz, 2H, CH,CH,COOH), 2.57 (q, J . 7.83Hz, 2H, CH,CH,) , 2.46 (t, J = 7.66Hz, CH,CH,COOH) , 1.20 (t, J - 7.83, 3H, CH,CH,) , 2.26 (s, 3H, CH,; ; MS m/z 325 [M+l]*.

Ejemplo 18 3-[5-(5-metoxi-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)- 4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico Se disolvió hidrato de cloral (9.6 gramos) en 200 mililitros de agua conteniendo 83 gramos de sulfato de sodio. La solución se calentó a 60°C, se agregó una solución de 11.4 gramos de clorhidrato de hidroxilamina en 50 mililitros de agua, y la mezcla se mantuvo a 60°C. En un matraz separado, 6.4 gramos de 4-anisidina y 4.3 mililitros de ácido clorhídrico concentrado en 80 mililitros de agua se calentaron a 80°C. La primera solución se agregó a la segunda, y la mezcla resultante se puso a reflujo durante 2 minutos, se enfrió lentamente a temperatura ambiente, y luego se enfrió en un baño de hielo. El precipitado bronceado se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con agua, y se secó al vacío para dar 8.6 gramos (rendimiento del 85 por ciento) de N-(2-hidroximinoacetil) anisidina. El ácido sulfúrico concentrado (45 mililitros) conteniendo 5 mililitros de agua, se calentó a 60°C, y se agregaron 8.6 gramos de N- (2-hidroximinoacetil) anisidina en una porción. La mezcla agitada se calentó a 93 °C durante 10 minutos, y luego se dejó enfriar a temperatura ambiente. La mezcla se vertió en 500 gramos de hielo, y se extrajo 3 veces con acetato de etilo. Los extractos combinados se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar 5.1 gramos (rendimiento del 65 por ciento) de 5-metoxi-isatina como un sólido rojo oscuro. La 5-metoxi-isatina (5.0 gramos) y 30 mililitros de hidrato de hidrazina, se calentaron a reflujo durante 15 minutos. La mezcla de reacción se enfrió a temperatura ambiente, y se agregaron 50 mililitros de agua. La mezcla se extrajo 3 veces con 25 mililitros de acetato de etilo, las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar un sólido amarillo. El sólido se agitó en acetato de etilo, y se removieron 1.1 gramos del material insoluble mediante filtración al vacío, y se guardaron. Este material fue 2-hidrazino-carbonilmetil-4- anisidina. El filtrado se concentró y se pasó por cromatografía sobre gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo: hexano, 1:1, para dar 0.7 gramos de 5-metoxi-2-oxindol como un sólido amarillo sucio. Los l.l gramos de 2-hidrazinocarbonilmetil-4-anisidina se pusieron a reflujo durante 1 hora en 20 mililitros de hidróxido de sodio l N. La mezcla se enfrió, se acidificó a un pH de 2 con ácido clorhídrico concentrado, y se extrajo 3 veces con 25 mililitros de acetato de etilo. Los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar 0.8 gramos de 5-metoxi-2-oxindol como un sólido amarillo sucio. El rendimiento combinado fue de 1.5 gramos ó del 33 por ciento.

'HNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 10.13 (s, ÍH, NH-1) , 6.84 (s, ÍH, H-4), 6.72 (d, J . 8.68 Hz, ÍH, H-6) , 6.69 (d, J - 8.68 Hz, ÍH, H-7) , 3.68 (s, 3H, 0CH,-5) , 3.41 (s, 2H, CH,-3). MS m/z (intensidad relativa , %) 163 ([M+l]*, 100).

El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90 miligramos), 82 miligramos de 5-metoxi-2-oxindol , y 2 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 95°C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 110 miligramos (67 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño. • lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.38 (S, br, ÍH, NH-1') , 12.03 (3, vbr, ÍH, COOH) , 10.57 (s, ÍH, NH-1) , 7.63 (s, ÍH, H-vinilo) , 7.42 (d, J » 2.46Hz, ÍH, H-4) , 7.12 (d, J - 3.08 Hz, ÍH, H-2') , 6.74 (d, J - 8.26Hz, ÍH, H-6) , 6.75 (dd, J » 2.46, 8.26 HZ, ÍH, H-7) , 3.77 (s, 3H, OCH,) , 2.65 (t, J » 7.40Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.46 (t, J » 7.40Hz, CH2CH2COOH) , 2.27 (s, 3H, CH,) ; MS m/z (intensidad relativa , %) 327 ([M+l]*, 100) .

Ejemplo 19 Acido 3- [5- (5-bromo-2-oxo-l, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -2, 4-dimetil-lH-pirrol-3-il] -propiónico El 3- (2-carboxietil) -2, 4-dimetil-4-formilpirrol (97.5 miligramos) , 106 miligramos de 5-bromo-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 3 mililitros de etanol se calentaron a 95°C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 171 miligramos (88 por ciento) del compuesto del título como un sólido naranja. 1HNMR (360 MHZ, DMS0-d6) : d 12.04 (s, vbr, ÍH, COOH) , 10.80 (s, br, ÍH, NH-1) , 8.0 (d, J « 2.06Hz, ÍH, H-4) , 7.67 (s, ÍH, H-vinilO), 7.19 (dd, J - 2.06, 8.40 Hz, ÍH, H-6) , 6.79 (d, J - 8.40 Hz, ÍH, H-7) , 2.65 (t, J - 7.63 Hz, 2H, CH2CH2COOH) , 2.35 (t, J - 7.63 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.29 (s, 3H, CH,) , 2.27 (s, 3H, CH,) ; MS m/z (intensidad relativa , %) 389 ( [M+l]*, 100) .

Acido 3-[5-(5-yodo-2-oxo-l„ 2 -dihidro indo1-3- ilidenmetil) -2 , 4-dimetil-iH-pirrol-3-il] -propiónico. El 3- (2-carboxietil) -2, 4-dimetil-5-formilpirrol (97.5 miligramos),. 130 miligramos de 5-yodo-2-oxindol , y 75 microlitros de piperidina en 3 mililitros de etanol, se calentaron a 95 °C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6 , y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 155 miligramos (71 por ciento) del compuesto del título como un sólido naranja.

HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.41 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.03 (s, br, ÍH, COOH), 10.79 (s, br, ÍH, H-1) , 8.12 (d, J = 1.70 Hz, ÍH, H-4), 7.65 (s, ÍH, H-'Vinilq, 7-3ß (dd/ J a 1.70, 7.93 Hz, ÍH, H-6) , 6.79 (d, J - 7.93 Hz, ÍH, H-7) , 2.64 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.34 (t, J= 7.76 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.29 (s, 3H, CH,) , 2.27 (s, 3H, CH,) ; MS m/z (i-ntensiaad relativa - %) 437 ([M+l]*, 100).

Ejemplo 20 Acido 3-[5- (5-yodo-2-oxo-l, 2 -dihidroindol-3-ilidenmetil) -2, 4-dimetil-lH-pirrol-3-il] -propiónico El 3- (2-carboxietil) -2, 4-dimetil-5-formilpirrol (97.5 miligramos) , 130 miligramos de 5-yodo-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 3 mililitros de etanol, se agitaron a 95°C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 155 miligramos del compuesto del título (71 por ciento) como un sólido naranja. lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) d 13.41 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.03 (s, br, ÍH, COOH), 10.79 (s, br, ÍH, NH-1) , 8.12 (d, J - 1.70 Hz, ÍH, H-4), 7.65 (s, ÍH, H-vinilo), 7.36 (dd, J a 1.70, 7.93 Hz, ÍH, H-6), 6.79 (d, J a 7.93 Hz, ÍH, H-7) , 2.64 (t, J -7.76 Hz, 2H, CHjCH2COOH), 2.34 (t, Ja 7.76 Hz, 2H, CH,CH,COOH), 2.29 (s, 3H, CH,) , 2.27 (s, 3H, CH,) . MS m/z (i tensidad relativa . ) 437 ([M+?]\ íoo) .

Ejemplo 21 Acido 3-[2,4-dimetil-5- (4-metil-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-iliden-metil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico El 3- (2-carboxietil) -2 ,4-dimetil-5-formilpirrol (97.5 miligramos) , 74 miligramos de 4-metil-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 3 mililitros de etanol, se calentaron a 95 °C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6 , y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 60 miligramos (37 por ciento) del compuesto del título como un sólido verde.

JHNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 13.41 (s, br, ÍH, H-1') , 12.03 (s, br, ÍH, COOH), 10.72 (a, br, ÍH, NH-1) , 7.50 (s, 1H, H-Vipilo) , 7.01 (t , j . 7.82 Hz, 1H, H-6) , 6.79 (d, J . 7.82 ' Hz, H-5) , 6.74 (d, J » 7.82 Hz, ÍH, H-7) , 2.64 (t, J - 7.76 Hz, 2H, CH2CH2COOH), 2.56 (s, 3H, CH,) , 2.34 (t, J a 7.76 Hz, 2H, CHjCH,COOH), 2.29 (3, 3H, CH,) , 2.18 (s, 3H, CH,) ; MS /z ( iritensiaacL elativa %). 325 ([M+l]*, 100) .

Ejemplo 22 Acido 3- [2 , 4-dimetil-5- ( 5-met il-2 -oxo-l , 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico El 3- (2-carboxietil) -2, 4-dimetil-5-formilpirrol (97.5 miligramos) , 74 miligramos de 5-metil-2-oxindol, y 75 microlitros de piperidina en 3 mililitros de etanol, se calentaron a 95 °C durante 5 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6 , y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 104 miligramos (64 por ciento) del compuesto del título como un sólido amarillo. lHNMR (360 MHZ, DMSO-d6) : d 13.38 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.02 (s, br, ÍH, COOH), 10.57 (3, br, ÍH, NH-1) , 7.52 (s, br, 1H, H-4), 7.50 (s, ÍH, H-vinil ), 6.87 (d, J - 7.86 Hz, 1H, H- 6) , 6.73 (d, J- 7.86 Hz, ÍH, H-7) , 2.63 (t, J - 7.49 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.34 (t, J a 7.49 Hz, 2H, CH,CH,C00H) , 2.29 (s, 3H, CH,) , 2.28 (s, 3H, CH,) , y 2.24 (s, 3H, CH,) ; MS m/z ( intensidad.. elativa.... %) 325 ([M+l]*, 66) .

Ejemplo 23 Acido 3-[5- (6-hidroxi-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -2, 4-dimetil-lH-pirrol-3-il] -propiónico 3.26 gramos de 6-metoxi-2-oxindol en 60 mililitros de diclorometano se enfriaron a -2°C, y se agregaron por goteo 40 mililitros de una solución de tribromuro de boro 1 M en diclorometano. La mezcla de reacción se agitó en un baño de hielo durante una hora, y luego a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego se vertió en agua helada, y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se concentró, el precipitado que se formó se filtró, y luego se secó en un horno al vacio durante la noche para dar 2.46 gramos del 6-hidroxi-2-oxindol (rendimiento del 86 por ciento) .

XHNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 10.13 (s, ÍH, NH-1) , 9.22 (s, 1H, 0H-6) , 6.93 (d, J a 7.76 Hz, ÍH, H-4), 6.27-6.31 (m, 2H, H-5,7), y 3.29 (s, 2H, CH,-3) ; MS /z 150 [M+l]*.

El 3- (2-carboxietil) -2, 4-dimetil-5-formilpirrol (82 miligramos, 63 miligramos de 6-hidroxi-2-oxindol, y 48 microlitros de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 90°C durante 2 días. La mezcla de reacción se enfrió, se concentró, y se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo-hexano-ácido acético, para dar 55 miligramos (40 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño oscuro. lHNMR (360 MHZ, DMS0-d6) : d 13.10 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.0 (s, vbr, ÍH, COOH), 10.51 (s, br, ÍH, NH-1) , 9.41 (s, ÍH, OH), 7.44 (d, Ja 7.83, ÍH, H-4) , 7.29 (s, ÍH, H-vinilo), 6.37 (dd, J = 2.16, 7.83 Hz, ÍH, H-5) , 6.33 (d, Ja 2.16 Hz, ÍH, H-7) , 2.62 (t, J a 7.75 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.32 (t, J a 7.75 Hz, 2H, CH,CH,COOH), 2.25 (s, 3H, CH, ), 2.20 ( S, 3H, CH,) ; MS m/z 325 [M+l]*.

Ejemplo 24 Acido 3- [5- ( 6-metoxi-2-oxo-1,2-dihidroindo1-3-ilidenmetil) -2, 4-dimetil-lH-pirrol-3-il] -propiónico El 3-(2-carboxietil) -2, 4-dimetil-5-formilpirrol (97.5 miligramos) , 82 miligramos de 6-metoxi-2-oxindol, y 2 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 95°C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 2 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 130 miligramos (76 por ciento) del compuesto del título como un sólido amarillo. 1HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.15 (a, br, ÍH, NH-1'), 11.75 (s, vbr, ÍH, COOH), 10.65 (s, br, ÍH, NH-1), 7.58 (d, J = 8.27, ÍH, H-4) , 7.29 (s, ÍH, H-Vinilo), 6.37 (dd, J a 2.26, 8.27 Hz, ÍH, H-5) , 6.33 (d, J - 2.26 Hz, ÍH, H-7) , 3.74 (s, 3H, OCH,) , 2.62 (t, J a 7.67 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.33 (t, J a 7.67 Hz, 2H, CHjCHjCOOH), 2.26 (s, 3H, CH,) , . y 2.22 (s, 3H, CH,); MS m/z (intensidad relativa , %) 341 ([M+l]*, 100) .

Ejemplo 25 Acido 3-[5-(6-hidroxi-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (543 miligramos) , 450 miligramos de 6-hidroxi-2-oxindol, y 450 microlitros de piperidina en 10 mililitros de etanol, se calentaron a 90°C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 2 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar un sólido castaño. lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.05 (s, br, ÍH, NH-1'), 10.60 (s, br, ÍH, NH-1), 9.4 (s, ÍH, OH), 7.49 (d, J = 8.08, 1H, H-4), 7.35 (s, ÍH, H-vinilo), 7.02 (d, J = 3.22 Hz, ÍH, H-2'), 6.38 (dd, J = 2.28, 8.08 Hz, ÍH, H-5) , 6.32 (d, J = 2.28 Hz, ÍH, H-7), 2.62 (t, J - 7.67 Hz, 2H, CHjCHjCOOH) , 2.44 (t, J = 7.67 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.21 (s, 3H, CH,) ; MS /z í intensidad relativa , %) 313 ([M+l]*, 60).

Ejemplo 26 3,5-dimetoxi-benciléster del ácido 3- [5- (6-hidroxi-2- oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil)-4-metil-lH-pirrol-3-il]- propiónico El ácido 3-[5-(6-hidroxi-2-oxo-l,2-dihidroindol-3- ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il ] -propiónico (100 miligramos), 56 miligramos de cloruro de 3 , 5-dimetoxibencilo, y 207 miligramos de carbonato de potasio en 2 mililitros de dimetilformamida anhidra, se calentaron a 90°C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió, se vertió en agua, y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró. El producto crudo se purificó mediante cromatografía sobre una columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo-hexano-ácido acético, para dar 39 miligramos del compuesto del título como un sólido castaño. lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.06 (s, br, ÍH, NH-1'), 10.60 (S/ br, ÍH, NH-1) , 9.4 (s, br, ÍH, OH), 7.49 (d, J= 8.03, ÍH, H-4), 7.35 (s, ÍH, H-vinild, 7.01 (d, J- 3.08 Hz, ÍH, H- 2'), 6.47 (d, J = 2.29Hz, 2H, aromático), 6.42 (t, J = 2.29Hz, ÍH, aromático), 6.38 (dd, J- 2.15, 8.03 Hz, ÍH, H-5) , 6.33 (d, J -2.15 Hz, ÍH, H-7) , 5.01 (s, 2H, CH,-Ph) , 3.70 (s, 6H, 2xOCH,) , 2.59-2.72 (m, 4H, CH2CH,COOH) , 2.20 (s, 3H, CH,) .

Ejemplo 27 Acido 3-{5-[3-metoxifenil) -2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2,4-dimetil-iH-pirrol-3-il}-propiónico Se agregó tetraquis (trifenilfos ina) paladio (0.7 gramos) a una mezcla de 5 gramos de ácido 3-metoxifenil-borónico, 3.8 gramos de 5-bromo-2-fluoronItrobenceno, y 11 mililitros de una solución de carbonato de sodio 2 M en 100 mililitros de tolueno. La mezcla se puso a reflujo durante 2 horas, se diluyó con agua, y se extrajo con acetato de etilo. El acetato de etilo se lavó con bicarbonato de sodio saturado y luego con salmuera, se secó, y se concentró para dar un sólido oleoso. El sólido se pasó por cromatografía sobre gel de sílice utilizando acetato de etilo:hexano (1:6), para dar 4.3 gramos (rendimiento del 77 por ciento) de 4-fluoro-3 • -metoxi-3-nitrobifenilo. Se agregó por goteo malonato de dimetilo (9.7 mililitros) a 2.0 gramos de hidruro de sodio suspendidos en 50 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla se calentó a 100 °C durante 35 minutos, y luego se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó 4-fluoro-2 ' -metoxi-3-nitrobifenilo (4.2 gramos) en 50 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y la mezcla se calentó a 100°C durante 1 hora. La mezcla de reacción se enfrió y se apagó con 300 mililitros de una solución saturada de cloruro de amonio, y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Los extractos se combinaron, se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar el 3 ' -metoxi-3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo como un sólido amarillo pálido. El 3 ' -metoxi-3-nitrobifenil-4-malonato crudo se calentó a 110°C en 45 mililitros de ácido clorhídrico 6 N durante 4 días, y se enfrió. El precipitado se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y etano, y se secó para dar 5.3 gramos del ácido 3 ' -metoxi-2-nitrobifenil-4-acético como un sólido bronceado claro. El ácido 3 ' -metoxi-3-nitrobifenil-4-acético (5.2 gramos) se disolvió en metanol, y se hidrogenó sobre 0.8 gramos de paladio al 10 por ciento sobre carbón durante 3 horas a temperatura ambiente. El catalizador se removió mediante filtración, se lavó con metanol, y los filtrados se combinaron y se concentraron para dar un sólido castaño. El sólido se pasó por cromatografía sobre gel de sílice en acetato de etilo:hexano:ácido acético, 33:66:1 para dar 3.0 gramos (rendimiento del 75 por ciento basándose en el 4-fluoro-3'-metoxi-3-nitrobifenilo) de 6-(3-metoxifenil) -2-oxindol como un sólido rosado. ;HNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 10.39 (s, br, ÍH, NH) , 7.35 (t, J » 7.85Hz, ÍH) , 7.26 (d, J a 7.78Hz, ÍH) , 7.19 (dd, J - 1.22, 7.8HZ, ÍH) , 7.13-7.16 (m, ÍH) , 7.09-7.1 (m, ÍH) , 7.01 (d, J - 1.48Hz, ÍH) , 6.90-6.93 (m, ÍH) , 3.8 (s, 3H, 0CH3) , 3.49 (s, 2H, CH2) ; MS m/z (intensidad relativa „ %) 240.0 ([M+l]*, 100) .

El 3- (2-carboxietil) -2, 4-dimetil-5-formilpirrol (117 miligramos), 120 miligramos de 6- (3-metoxifenil) -2-oxindol y 3 gotas de piperidina en 3 mililitros de etanol, se calentaron a 90 °C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 190 miligramos (91 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño.

XHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.38 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.04 (s, br, ÍH, COOH), 10.79 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.77 (d, J = 8.05, ÍH, H-4), 7.58 (s, ÍH, H-vinilO), 7.27 (dd, J = 1.49, 8.05 Hz, ÍH, H-5), 7.09 (d, Ja 1.49 Hz, ÍH, H-7) , 6.89-7.59 (m, 4H) , 3.81 (s, 3H, OCH,), 2.65 (t, J = 7.62 Hz, 2H, CH,CH2C0OH) , 2.35(t, J- 7.62 Hz, 2H, CH,CH2COOH) , 2.30 (s, 3H, CH,) , y 2.27 (s, 3H, CH,); MS m/z ("intensidad relativa , %) 417 ([M+l]*, 75) .

Ejemplo 28 Acido 3-[5-(6-bromo-2-oxo-i„2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico Se agregó por goteo malonato de dimetilo (13 mililitros) a 2.7 gramos de hidruro de sodio suspendidos en 20 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla se calentó a 100°C durante 10 minutos, y se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó 5-bromo-2-fluoronitrobenceno (5.0 gramos) en 25 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y la mezcla se calentó a 100°C durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se apagó con 300 mililitros de una solución saturada de cloruro de amonio, y se extrajo tres veces con acetato de etilo. Los extractos se combinaron, se lavaron con cloruro de amonio saturado, agua y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar el 4-bromo-2-nitro-fenilmalonato de dimetilo crudo como un aceite amarillo pálido. El 4-bromo-2-nitrofenilmalonato de dimetilo crudo se calentó a 110°C en 40 mililitros de ácido clorhídrico 6 N durante 24 horas, y se enfrió. El precipitado se recolectó mediante filtración, se lavó con agua, y se secó para dar 5.3 gramos (rendimiento del 89 por ciento) del ácido 4-bromo-2-nitrofenilacético como un sólido blanco. El ácido 4-bromo-2-nitrofenilacético (0.26 gramos), 0.26 gramos de polvo de zinc, y 3 mililitros de ácido sulfúrico al 50 por ciento en 5 mililitros de etanol, se calentó a 100°C durante la noche. La mezcla de reacción se filtró, se diluyó con un poco de ácido acético, se concentró para remover el etanol, se diluyó con agua, y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Los extractos combinados se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar 0.19 gramos (rendimiento del 90 por ciento) de 6-bromo-2- oxindol como un sólido amarillo. 1HNMR (360 MHZ, DMS0-d6) : d 10.45 (a, br, ÍH, NH-1), 7.14 (d, J - 7.89 HZ, ÍH, H-4) , 7.09 (dd, J - 1.53, 7.89 Hz, ÍH, H-5), 6.93 (d, J - 1.53 HZ, ÍH, H-7) , y 3.43 (s, 2H, CH2-3) ; MS m/z (intensidad relativa , %) 210 ([M-2]\ 100) y 212 (M*. 100) .

El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90 miligramos), 106 miligramos de 6-bromo-2-oxindol, y 3 gotas de piperidina en 3 mililitros de etanol, se calentaron a 90°C durante 4 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 172 miligramos (92 por ciento) del compuesto del título como un sólido amarillo. j HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.22 (a, br, ÍH, NH-1'), 12.04 (a, br, ÍH, COOH), 10.92 (a, br, ÍH, NH-1), 7.73 (d, J = 8.37, 1H, H-4), 7.67 (3, ÍH, H-vTnilo), 7.18 (d, J - 3.22 Hz, 1H, H- 2'), 7.14 (dd, J= 1.33, 8.37 Hz, ÍH, H-5) , 6. 99 id, J = 1.33 Hz, 1H, H-7), 2.64 (t, J= 7.39 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2-46 (t, J a 7.39 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.25 (s, 3H, CH,) ; MS (APCl) w./z 375.0 [M+l]*.

Ejemplo 29 Acido 3-{5-[6-(3-metoxifenil) -2-oxo-l,2-dihidroindol- 3-ilidenmetil] -4-metil-iH-pirrol-3-il} -propiónico El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90.5 miligramos), 120 miligramos de 6- (3-metoxifenil) -2-oxindol, y 3 gotas de piperidina en 3 mililitros de etanol, se calentaron a 90°C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 195 miligramos (97 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño.

XHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.29 (s, br, ].H, NH-1'), 12.07 (s, br, ÍH, COOH), 10.88 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.82 (d, J - 7.77, ÍH, H-4), 7.65 (3, ÍH, H-yinÜC* , 7.27 (dd, J = 1.41, 7.77 Hz, 1H, H-5), 7.09 (d, J - 1.41 Hz, ÍH, H-7) , 6.89-7.36 (m, 5H) , 3.82 (s, 3H, OCH,), 2.65 (t, J- 7.55 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.47 (t, J = 7.55 Hz, 2H, CH,CH,C0OH) , 2.27 (a, 3H, CH,) ; MS (APCl) m/z 401 [M-l]*.

Ejemplo 30 Acido 3-{5-[6-(3-etoxifenil) -2-oxo-?/2-dihidroindol-S-ili enmeti^-s^- imetil-iH-pirrol-S-ilj-propi^i^ Se agregó tetraquis (trifenilfosf ina) paladio (0>8 gramos) a una mezcla de 4.2 gramos de ácido 3_ etoxifenilborónico, 5.0 gramos de 5-bromo-2-fluoronitrobenceno, y 22 mililitros de una solución de carbonato de sodio 2 M en 50 mililitros de tolueno y 50 mililitros de etanol. La mezcla se puso a reflujo durante 2 horas, y luego se concentró. Se agregó agua, y la mezcla se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas de acetato de etilo combinadas se lavaron con agua y salmuera, y luego se secaron y se concentraron. El residuo se pasó por cromatografía sobre gel de sílice utilizando acetato de etilo al 5 por ciento en hexano, para dar 5.3 gramos (rendimiento del 90 por ciento) del 4-fluoro-3 ' -etoxi-3-nitrobifenilo crudo como un aceite amarillo. Se agregó por goteo malonato de dimetilo (11.4 mililitros) a 4.0 gramos de hidruro de sodio suspendidos en 20 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla se calentó a 100°C durante 10 minutos, y se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó el 4-fluoro-3 '-etoxi-3-nitrobifenilo crudo (5.3 gramos) en 25 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y la mezcla se calentó a 100°C durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió, se apagó con 300 mililitros de una solución saturada de cloruro de amonio, y se extrajo tres veces con acetato de etilo. Los extractos se combinaron, se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar el 3 '-etoxi-3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo como un aceite amarillo. El 3 '-etoxi-3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo se calentó a 100°C en 60 mililitros de ácido clorhídrico 6 N durante un total de 4 días, y se enfrió. El precipitado se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y hexano, y se secó para dar 4.7 gramos (rendimiento del 77 por ciento, basándose en 5-bromo-2-fluoronitrobenceno) del ácido 3'-etoxi- 3-nitrobifenil-4-acético crudo como un sólido bronceado claro. Se agregaron pedacitos de hierro (2.4 gramos) en una porción a 4.6 gramos del ácido 3 ' -etoxi-3-nitrobifenil-4- acético en 40 mililitros de ácido acético jlacial, y la mezcla se puso a reflujo durante 2 horas. La mezcla de reacción se concentró a sequedad, se trató repetidam€ te con acetato de etilo, y se filtró para remover el material insoluble. El filtrado se lavó dos veces con ácido clorhídrico 1 N, luego con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró para dar 3.5 gramos (rendimiento del 91 por ciento) de 6- (3-etoxifenil) -2-oxindol como un sólido castaño claro. HNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 10.4 (s, br, ÍH, NH) , 7.33 (t, J = 8.4Hz, ÍH, H-3'), 7.35 (d, J= 7.77Hz, ÍH) , 7.19 (dd, J -1.3, 7.66HZ, ÍH) , 7.13 (d, J - 7.69Hz, ÍH) , 7.07-7.08 (m, ÍH) , 7.0 (s, br, ÍH) , 6.9 (dd, J = 2.82, 8.08Hz, ÍH) , 4.08 (q, J = 7Hz, 2H, OEt), 3.49 (s, 2H, CH2 ) , 1.34 (t, J - 7Hz, 3H, OEt) ; MS m/z (-intensidad reT-ativa -t %) 254.2 ([M+l]*, 100).

El 3- (2-carboxietil) -2, 4-dimetil-5-formilpirrol (97.6 miligramos), 127 miligramos de 6-(3-etoxifenil) -2-oxindol, y 2 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 90°C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 227 miligramos del compuesto del título (aproximadamente el 100 por ciento) como un sólido castaño. lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.38 ( s, br, 1H, NH-1'), 12.06 (s, br, ÍH, COOH), 10.81 (a, br, ÍH, NH-1) , 7.77 (d, J= 7.97, ÍH, H-4), 7.58 (s, ÍH, H-vinilo)» ?.26 (dd, J = 1.35, 7.97 Hz, ÍH, H-5), 7.08 (d, J = 1.35 Hz, ÍH, H-7) , 6.87-7.36 (m, 4H) , 4.09 (q, J - 7.0 Hz, 2H, CH,CH,), 2.65 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH2CH2COOH) , 2.47 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.30 (s, 3H, CH,) , 2.26 (a,, 3H, CH,) , 1.34 (t, J = 7.0 Hz, 3H, CHjCH,) ; MS m/z (intensidad .re idti va , %) 431 ([M+l]*, 21).

Ejemplo 31 Acido 3-{5- [6- (3-etoxifenil) -2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil] -4-metil-lH-pirrol-3-il}-propiónico El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90.5 miligramos), 127 miligramos de 6- (3-etoxifenil) -2-oxindol, y 2 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 90°c durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 200 miligramos (96 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño.

:HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.29 (s, br, ÍH, NH-1'), 12.07 (s, vbr, ÍH, COOH), 10.88 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.82 (d, J = 7.97, ÍH, H-4), 7.65 (a, ÍH, H-vinilo), 7.23 (dd, a 1.20, 7.97 Hz, ÍH, H-5), 7.08 (d, J = 1.20 Hz, ÍH, H-7) , 6.87-7.36 (m, 5H) , 4.09 (q, J = 6.98Hz, 2H, CH,CH,) , 2.65 (t, J = 7.47 Hz, 2H> CH,CH,COOH) , 2.47 (t, J = 7.47 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.27 (s, 3H, CH,), 1.34 (t, J = 6.98Hz, 3H, Ctf,CH,) .

Ejemplo 32 Acido 3-[2,4-dimetil-5- (2-oxo-6-fenil-1, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico Se agregó tetraquis (trifenilfosfina) paladio (0.8 gramos) a una mezcla de 3.1 gramos de ácido bencenborónico, 5 gramos de 5-bromo-2-fluoronitrobenceno, y 22 mililitros de una solución de carbonato de sodio 2 M en 50 mililitros de tolueno y 50 mililitros de etanol. La mezcla se puso a reflujo durante 2 horas, se concentró, y el residuo se extrajo dos veces con acetato de etilo. La capa de acetato de etilo se lavó con agua y salmuera, se secó, y se concentró para dar un aceite amarillo. El aceite se pasó por cromatografía sobre gel de sílice utilizando acetato de etilo al 5 por ciento en hexano para dar 4.75 gramos (rendimiento del 96 por ciento) de 4-fluoro-3-nitrobifenilo como un aceite amarillo.

Se agregó por goteo malonato de dimetilo (10 mililitros) en 25 mililitros de sulfóxido de dimetilo, a 3.5 gramos de hidruro de sodio suspendidos en 25 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y la mezcla se calentó a 100°C durante 10 minutos. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, y se agregaron 4.7 gramos de 4-fluoro-3-nitrobifenilo en 25 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla se calentó a 100°C durante 2 horas, se enfrió y se apagó con 300 mililitros de una solución saturada de cloruro de amonio. La mezcla se extrajo tres veces con acetato de etilo, y las capas orgánicas combinada se lavaron con agua y salmuera, y se evaporaron para dar un aceite amarillo, de 3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo. El 3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo se puso a reflujo en 30 mililitros de ácido clorhídrico 6 N durante 24 horas. El precipitado se recolectó mediante filtración, se lavó con agua, y se secó para dar 4.5 gramos (80 por ciento, basándose en el 4-fluoro-3-nitrobifenilo) del ácido 3-nitrobifenil-4-acético como un sólido color crema. Se agregaron pedacitos de hierro (2.6 gramos) todos a la vez a 4.5 gramos de! ácido 3-nitrobifenil-4-acético en 40 mililitros de ácido acético. La mezcla se puso a reflujo durante 2 horas, se concentró a sequedad, y se recuperó en acetato de etilo. Los sólidos se removieron mediante filtración, y el filtrado se lavó dos veces con ácido clorhídrico 1 N y salmuera, y se secaron sobre sulfato de sodio anhidro. El filtrado se concentró para dar 3.4 gramos (rendimiento del 93 por ciento) de 6-fenil-2-oxindsl como un sólido castaño claro.

JHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 10.4 (s, br, 1H, NH-1), 7.57-7.6 (m, 2H) , 7.42-7.46 (m, 2H) , 7.32-7.37 (m, ÍH) , 7.27 (d, J = 7.7, ÍH, H-4), 7.19 (dd, J» 1.6, 7.7Hz, ÍH, H-5) , 7.01 (d, J = 1.6Hz, 1H, H-7) , 3.49(s, 2H, CH,) ,- MS m/z (intensidad relativa / %) 210 ( [M+l]*, 100) . 3- (2-carboxietil) -2 , 4-dimetil-5- ormilpirrol (97.6 miligramos), 105 miligramos de 6-fenil-2-oxindol , y 2 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 90°C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 138 miligramos (71 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño.

HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.38 (a, br, ÍH, NH-1') , 12.05 (3, br, ÍH, COOH), 10.81 (a, br, ÍH, NH-1) , 7.78 (d, J = 7.84, ÍH, H-4), 7.58 (s, ÍH, H-vinilo), 7.25-7.63 (m, 6H) , 7.09 (s, br, ÍH, H-7), 2.64 (t, J - 7.71 Hz, 2H, CHjCHjCOOH) , ' 2.35 (t, J = 7.71 Hz, 2H, CHjCHjCOOH), 2.30 (a, 3H, CH,) , y 2.26 (3, 3H, CH,) ; MS m/z (intensidad relativa . %) 387 ([M+l]*, 100) .

Ejemplo 33 Acido3-[4-metil-5-(2-oxo-6-fenil-l,2-dihidro-indol- 3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (90.5 miligramos), 105 miligramos de 6-fenil-2-oxindol, y 2 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 90°C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 146 miligramos (78 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño. 1HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.29 (a, br, ÍH, NH-1') , 12.01 (s, vbr, ÍH, COOH) , 10.89 (a, br, ÍH, NH-1) , 7.83 (d, J = 7.92, ÍH, H-4) , 7.65 (a, 1H/ H-vimlo) , 7.30-7.65 (m, 5H) , 7.16 (d, J = 2.83 Hz, ÍH, H- 2'), 7.28 (dd, J = 1.58, 7.92 Hz, ÍH, H-5) , 7.09 (d, J = 1.58Hz, ÍH, H-7) , 2.66 (t, J = 7.76 Hz, 2H, CH,CH,COOH), 2.45 (t, J - 7.76 Hz, 2H, CH,CH,C00H) , y 2.27 '(a, 3H, CH,) ; MS m/z (i.ntens i dad relativa . %) 373 ([M+l]*, 100) .

Ejemplo 34 Acido 3-{5-[l6-(4-metoxifenil) -2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-4-metil-iH-pirrol-3-il} -propiónico Se agregó tetraquis (trifenilfosfina) paladio (1 gramo) a una mezcla de 5 gramos del ácido 4-metoxifenil-borónico, 6.6 gramos de 5-bromo-2-fluoronitrobenceno, y 30 mililitros de una solución de carbonato de sodio 2 M en 50 mililitros de tolueno y 50 mililitros de etanol. La mezcla se puso a reflujo durante 2 horas, se concentró, y el residuo se extrajo dos veces con acetato de etilo. La capa de acetato de etilo se lavó con agua y salmuera, se secó, y se concentró para dar un sólido castaño oleoso. El sólido se pasó por cromatografía sobre gel de sílice utilizando acetato de etilo al 5 por ciento en hexano para dar el 4-fluoro-4 ' -metoxi-3-nitrobifenilo crudo como un sólido amarillo pálido. Se agregó por goteo malonato de dimetilo (10 mililitros) a 2.0 gramos de hidruro de sodio suspendidos en 60 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla se calentó a 100°C durante 10 minutos, y se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó 4-fluoro-2 ' -metoxi-3-nitrobifenilo crudo (5.2 gramos) en 50 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y la mezcla se calentó a 100°C durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se apagó con 300 mililitros de una solución saturada de cloruro de amonio, y se extrajo tres veces con acetato de etilo. Los extractos se combinaron, se lavaron con cloruro de amonio saturado, agua y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar el 4'-metoxi-3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo como un aceite amarillo.

El 4 ' -metoxi-3-nitrobifenil-4-malonato crudo se calentó a 100°C en 60 mililitros de ácido clorhídrico 6 N durante 15 horas, y se enfrió. El precipitado que se formó se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y hexano, y se secó para dar 7.2 gramos del ácido 4 '-metoxi-3-nitrobifenil-4-acético crudo como un sólido bronceado claro. Se agregaron pedacitos de hierro (3.6 gramos) en una porción a 7.2 gramos del ácido 4 • -metoxi-3-nitrobifenil-4-acético en 50 mililitros de ácido acético glacial, y se calentaron a 100°c durante la noche. La mezcla de reacción se concentró a sequedad, se sónico en acetato de etilo, y se filtró para remover los insolubles. El filtrado se lavó dos veces con ácido clorhídrico 1 N, luego con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró para dar 2.7 gramos (rendimiento del 54 por ciento, basándose en 5-bromo-2-fluoronitrobenceno) de 6- (4-metoxifenil) -2-oxindol como un sólido color rosado.

XHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 10.38 (s, br, ÍH, NH-1), 7.52 (d, J - 9Hz, 2H,), 7.23 (d, J= 7.3Hz, ÍH, H-4), 7.14 (d,d, J = 1.38, 7.3Hz, ÍH, H-5) , 7.0 (d, J = 9Hz, 2H) , 6.96 (d, J = 1.38Hz, ÍH, H-7), 3.78 (a, 3H, OCH, ), 3.47 (a, 2H, CH,) ; MS m/z (intensidad relativa , %) 214.0 ( [M+l]*, 100).

El 4- (2-carboxietil ) -2 -f ormil-3 -metilpirrol ( 90. 5 miligramos), 120 miligramos de 6- (4-metoxifenil) -2-oxindol, y 3 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 90 °C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 118 miligramos (59 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño.

. 'HNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 13.26 (s, br, ÍH, NH-1'), 10.83 (s, br, ÍH, NH-1), 7.78 (d, J =* 8.07 Hz, ÍH, H-4), 7.61 (s, ÍH, H-vinilO), 7.56 (d, J - 8.97 Hz, 2H) ,7.22 (dd, J = 1.44, 8.07 Hz, ÍH, H-5) , 7.13 (d, J» 3.09 Hz, ÍH, H- 2 ' ) , 7.04 (d, J » 1.44 HZ, ÍH, H-7) , 7.0 (d, J > 8.97 Hz, 2H) , 3.79 (a, 3H, OCH, ), 2.65 (t, J- 7.54 Hz, 2H, CH,CH2COOH) , 2.44 (t, J = 7.54 Hz, 2H, CH2CH,COOH) , and 2.27 (s, 3H, CH,) ; MS m/z. (intensidad relativa %) 404 ([M+l]*, 100).

Ejemplo 35 Acido 3-{5-[6-(4-metoxifenil)-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil] -2, 4-dimetil-lH-pirrol-3-il} -propiónico El 3- (2-carboxietil) -2, 4-dimetil-5-formilpirrol (98 miligramos), 120 miligramos de 6- (4-metoxifenil) -2-oxindol, y 3 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 90°C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 118 miligramos (57 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño. lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.35 (a, br, ÍH, NH-1'), 12.02 (a, br, ÍH, COOH), 10.75 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.73 (d, J = 6.75Hz, ÍH, H-4), 7.56 (d, J» 9.01Hz, 2H) , 7.54 ( s, ÍH, H- v?ml<3 ,7.21 (dd, J- 1.59, 6.75 Hz, ÍH, H-5) , 7.04 (d, J = 1.59Hz, ÍH, H-7) , 7.01 (d, J = 9.01 Hz, 2H) , 3.79 ( a, 3H, OCH, ), 2.65 (t, J a 7.54 Hz, 2H, CH2CH2COOH) , 2.35 (t, J - 7.54 Hz, 2H, CH2CH2COOH) , 2.29 (a, 3H, CH,) , and 2.26 (s, 3H, CH,) ; MS m/z (intensidad relativa %) 417 ([M+l]*, 100).

Ejemplo 36 Acido 3-{5- [2-metoxifenil) -2-oxo-l, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-4-metil-lH-pirrol-3-il}-propiónico Se agregó tetraquis (trifenilfosfina) paladio (1 gramo) a una mezcla de 5 gramos del ácido 2-metoxifenilborónico, 6.6 gramos de 5-bromo-2-fluoronitrobenceno, y 30 mililitros de una solución de carbonato de sodio 2 M en 50 mililitros de tolueno y 50 mililitros de etanol. La mezcla se puso a reflujo durante 2 horas, se concentró, y el residuo se extrajo dos veces con acetato de etilo. Las capas combinadas de acetato de etilo se lavaron con agua y salmuera, se secaron, y se concentraron para dar un aceite verde oscuro, el cual se solidificó al reposar para dar 4-fluoro-2 ' -metoxi-3-nitrobifenilo crudo. Se agregó por goteo malonato de dimetilo (14 mililitros) a 2.9 gramos de hidruro de sodio suspendidos en 50 mililitros de sulfóxido de dimetilo. La mezcla se calentó a 100°C durante 15 minutos, y se enfrió a temperatura ambiente. Se agregó el 4-fluoro-2 '-metoxi-3-nitrobifenilo crudo en 60 mililitros de sulfóxido de dimetilo, y la mezcla se calentó a 100 °C durante 2 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se apagó con 300 mililitros de una solución saturada de cloruro de amonio, y se extrajo dos veces con acetato de etilo. Los extractos se combinaron, se lavaron con cloruro de amonio saturado, agua y salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron para dar el 2'-metoxi-3-nitrobifenil-4-malonato de dimetilo crudo como un aceite amarillo. El 2 ' -metoxi-3-nitrobifenil-4-malonato crudo se calentó a 100°C en 50 mililitros de ácido clorhídrico 6 N durante 14 horas, y se enfrió. El precipitado se recolectó mediante filtración, se lavó con agua y hexano, y se secó para dar 9.8 gramos del ácido 2 ' -metoxi-2-nitrobifenil-4-acético como un sólido bronceado claro. Se agregaron pedacitos de hierro (5 gramos) en una porción a 9.8 gramos del ácido 2 ' -metoxi-3-nitrobifenil-4-acético en 50 mililitros de ácido acético glóicial, y la mezcla se calentó a 100°C durante 3 horas. La mezcla de reacción se concentró a sequedad, se sónico en acetato de etilo, y se filtró para remover los insolubles. El filtrado se lavó dos veces con ácido clorhídrico 1 N, agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró. El residuo se pasó por cromatografía sobre gel de sílice utilizando acetato de etilo: hexano, 1:2, para 5.4 gramos (rendimiento del 69 por ciento, basándose en 5-bromo-2-fluoronitrobenceno) del 6- (2-metoxifenil) -2-oxindol como un sólido de color rosado. lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 10.32 (s, br, ÍH, NH) , 7.29- 7.34 (m, ÍH) , 7.19-7.25 (m, 2H) , 7.08 (d, J = 8Hz, 1H, H-4), 6.97-7.02 (m, 2H) , 6.91 (d, J => 1.05Hz, ÍH, H-7) , 3.8 (s, 3H, OCH,), 3.47 (s, 2H, CH2) ; MS m/z (intensidad relativa %) 239.8 (100, [M+l]*) .

El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (217 miligramos), 239 miligramos de 6- (2-metoxifenil) -2-oxindol, y 3 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 90 °C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 348 miligramos (86 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño.

*HNMR ( 360 MHz , DMSO-d6 ) : d 13 . 29 (s , br , ÍH , NH- 1 ' ) , 11 . 59 ( s , br, ÍH, COOH) , 10 . 78 (s , br, ÍH, NH- 1 ) , 7 . 75 (d, J 8.13Hz, ÍH, H-4) , 7.62 (s, ÍH, H-vinilc) , 7.0-7.34 (m, 7H) , 3.76 (a, 3H, OCH,) , 2.56 (t, J - 7.46 Hz, 2H, CHjCHjCOOH) , 2.46 (t," J - 7.46 Hz, 2H, CH,CHjCOOH), and 2.27 (a, 3H, CH,) ; MS m/z ( intensidad relativa , %) 401 ([M+l]*, 100) .

Ejemplo 37 Acido 3-{5-[6-(2-metoxifenil)-2-oxo-l,2-dihidroindol- 3-ilidenmetil] -2, 4-dimetil-iH-pirrol-3-il} -propiónico El 3- (2-carboxietil) -2, 4-dimetil-5-formilpirrol (234 miligramos), 239 miligramos de 6-(2-metoxifenil) -2-oxindol, y 3 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 90 °C durante la noche. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche. El sólido crudo se purificó mediante cromatografía sobre una columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo:hexano, 1:1, conteniendo ácido acético al 0.1 por ciento, para dar 182 miligramos (44 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño. lHNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 13.38 (a, br, ÍH, NH-1'), 12.0 (a, br, ÍH, COOH), 10.7 (a, br, ÍH, NH-1) , 7.71 (d, Ja 7.74Hz, ÍH, H-4), 7.55 (s, ÍH, H-vinilcJ, 7.0-7.33 (m, 6H) , 3.76 (a, 3H, OCH,), 2.65 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH,CH,C00H) , 2.35 (t, J = 7.6 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.3 (s, 3H, CH,) , and 2.26 (s, 3H, CH,) ; MS (APCl neg) m/z (intensidad relativa , %) 415 ([M-l], 100).

Ejemplo 38 Acido 3-[2,4-dimetil-5-(6-morfolin-4-il-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico Se agregó dihidrato de cloruro de estaño (225 gramos) a una solución de ácido 2 , 4-dinitrofenilacético (22.6 gramos) en etanol (450 mililitros). La mezcla se calentó a 90°C durante 10 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se basificó a un pH de 11 con hidróxido de sodio 12M. Los sólidos se removieron mediante filtración, y el filtrado se concentró. El residuo se trató con etanol (300 mililitros) . Los insolubles se filtraron y se lavaron con etanol (60 mililitros cinco veces) . Los lavados en metanol combinados se evaporaron y se secaron al vacío para dar 15 gramos de 6-amino-2-oxindol como un polvo castaño. lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 10.03 (s, br, NH) , 6.78 (d, J = 8.55Hz, ÍH, H-4), 6.09-6.11 (m, 2H) , 4.95 (s, br, 2H, NH,) , 3.22 (a, 2H, H-3) ; MS (+ APCI) m/z (intensidad relativa -, %) 147 ([M-l]*, 100) .

El 6-amino-2-oxindol (2.2 gramos), 4.0 gramos de 2 , 2 ' -dibromoetiléter, y 7.9 gramos de carbonato de sodio, se pusieron a reflujo durante la noche en 20 mililitros de etanol, se concentraron y se diluyeron con 50 mililitros de agua. La mezcla se extrajo tres veces con 50 mililitros de acetato de etilo, los extractos orgánicos se combinaron, se lavaron con 20 mililitros de salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentraron a sequedad. El sólido se pasó por cromatografía sobre una columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo:hexano, 1:1, conteniendo ácido acético al 0.7 por ciento, para dar 1.2 gramos (rendimiento del 37 por ciento) de 6- (morfolin-4-il) -2-oxindol como un sólido beige.

' XHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 10.2 (a, br, ÍH, NH-1) , 7.02 (d, J = 7.87Hz, ÍH, H-4), 6.47 (dd, J - 2.11, 7.87Hz, ÍH, H- 5), 6.37 (d, J = 2.11HZ, ÍH, H-7) , 3.69-3.72 (m, 4H) , 3.32 (a, 2H, CH,), 3.01-3.04 (m, 4H) ; MS m/z (intensidad .relativa %) 219 ([M+l]*, 100) .

El 3- (2-carboxietil) -2 , 4-dimetil-5-formilpirrol (3.3 gramos), 4 gramos de 6- (morfolin-4-il) -2-oxindol, y 1.8 mililitros de piperidina en 60 mililitros de etanol, se calentaron a 90°C durante 7 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche. El sólido resultante se purificó mediante cromatografía sobre una columna de gel de sílice, eluyendo con acetato de etilo-hexano-ácido acético, para dar 2.78 gramos (rendimiento del 38 por ciento) del compuesto del título como un sólido castaño. lHNMR (360 MHZ, DMSO-d6) : d 13.13 (a, br, ÍH, NH-1'), 12.02 (s, br, ÍH, COOH), 10.57 (a, br, ÍH, NH-1) , 7.52 (d, J a 8.46Hz, ÍH, H-4), 7.32 (a, ÍH, H^ini]0), 6.58 (dd, J « 1.99, 8.46Hz, ÍH, H-5) , 6.41 (d, J = 1.99Hz, ÍH, H-7) , 3.71-3.74 (m, 4H) , 3.06-3.09 (m, 4H) , 2.62 (t, J - 7.57 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.33 (t, J = 7.57Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.26 (a, 3H, CH,) , and 2.21 (a, 3H, CH,) ; MS m/z (intensidad relativa , %) 396 ([M+l]*, 100).

Ejemplo 39 Acido 3-[5-(5-cloro-4-metil-2-oxo-l,2-dihidroindol-3- ilidenmetil) -2,4-dimetil-lH-pirrol-3-il]-propiónico Una suspensión de 3.0 gramos de 4-metil-2-oxindol se agitó en 50 mililitros de acetonitrilo a temperatura ambiente, mientras que se agregaban en porciones 3.3 gramos de N-clorosuccinimida. Luego se agregó ácido trifluoroacético (1 mililitro) . La suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 3 días, durante cuyo tiempo siempre estuvieron presentes los sólidos. El sólido blanco se recolectó mediante filtración al vacío, se lavó con una pequeña cantidad de acetona fría, y se secó durante la noche en un horno al vacío a 40°C para dar 2.5 gramos (68 por ciento) de 5-cloro-4-metil- 2-oxindol. lHNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 10.38 (s, br, ÍH, NH) , 7.19 (d, J = 8Hz, lH, aromático), 6.64 (d, J = 8Hz, ÍH, aromático^ 3.46 (s, 2H', H-3)», 2.19 (a, 3H, CH,) .

El 3-(2-carboxietil) -2, 4-dimetil-5-formilpirrol (98 , 202 miligramos) , 91 miligramos de 5-cloro-4-metil-2-oxindol, y 2 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 90 °C durante 4 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 100 miligramos del compuesto del título.

*HNMR (360 MHz, DMS0-d6) : d 13.47 (a, br, ÍH, NH-1'), 12.03 (s, br, ÍH, COOH), 10.83 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.61 (a, ÍH, H??nilo), 7.14 (d, J = 8.17 Hz, ÍH, aromático), 6.74 ( d, J = 8.17 Hz, ÍH, aromático), 2.64 (3, 3H, CH,) , 2.64 (t, J- 7.62 Hz, 2H, CHjCHjCOOH), 2.34 (t, J - 7.62 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.3 (s, 3H, CH,) , and 2.20 (s, 3H, CH,) .

Ejemplo 40 Acido 3-[5-(5-cloro-4-metil-2-oxo-l,2-dihidroindol-3- ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico El 4-(2-carboxietil) -2-formil-3-metilpirrol (91 miligramos) , 92 miligramos de 5-cloro-4-metil-2-oxindol, y 2 gotas de piperidina en 2 mililitros de etanol, se calentaron a 90 °C durante 4 horas. La mezcla de reacción se enfrió y se concentró. El residuo se suspendió en ácido clorhídrico acuoso 6 N. El precipitado se filtró, se lavó con agua a un pH de 6, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 95 miligramos del compuesto del título.

'HNMR (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.36 (s, br, ÍH, NH-1') , 11.98 (s, br, ÍH, COOH) , 10.92 (s, br, ÍH, NH-1) , 7.68 (s, ÍH) , 7.19 (d, j - 7.i4Hz, H, aromática, 7.17 (S> 1H) # 6-75 (d, J = 7.14 Hz, ÍH, aromático ) , 2.66 (s, 3H„ CH,-4) , 2.66 (t, J = 7.51 Hz, 2H, CH,CH,COOH) , 2.45 (t, J a 7.51 Hz, 2H, CHjCHjCOOH), 2.21 (s, 3H, CH,) ; MS m/z (intensidad relativa _ , %) 345 ( [M+l]*, 100) .

Ejemplo 41 Acido 3-[2,4-dimetil-5-(2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -iH-pirrol-3-il] -propiónico, sal sódica Una suspensión de 8 gramos del ácido 3-[2,4-dimetil-5- (2-oxo-l, 2-dihidroindol-3 -ilidenmetil )-lH-pirrol-3 -il] propiónico en 60 mililitros de agua, se agregó a 0.98 gramos de hidróxido de sodio en 10 mililitros de agua. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, y se filtró. El filtrado se congeló y se liofilizó para dar 8 gramos del compuesto del título. De una manera alternativa, una suspensión de 117 gramos del 318-005 en 470 mililitros de agua, se agregó a 16.57 gramos de hidróxido de sodio en 74 mililitros de agua. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, y se filtró. El filtrado se agregó a 210 mililitros de etanol, y el precipitado resultante que se formó se recolectó mediante filtración con succión. Después de secarse,, se obtuvo un total de 106 gramos del compuesto del título. lH R (360 MHz, DMSO-d6) : d 13.34 (a, br, 1H, NH-1<) 10'82 (s, br, 1H, NH-1) , 7.65 (d, J a 7.52Hz, 1H, H-4) , 7 5 <•• 1H, H-vinilo), 7.04 (t, J a 7.52 Hz, 1H, H-6) , 6.93 (t, J - 7-52 HZ, 1H, H-5) , 6.85 (d, J a 7.52 Hz, 1H, H-7) , 2.55 (t, J - 6.95 Hz, 2H, CH,CH,COOH), 2.28 (s, 3H, CH,) , 2.24 (s, 3H, CH,) , '.y 1.99 (t/ J ß 6-95 RZf 2H? CHjCH C00H) # Ejemplo 42 3-[3,5-dimetil-4-(3-morfolin-4-ilpropil)-lH-pirrol-2-ilmetilen]-l,3-dihidroindol-2-ona Paso 1: A una suspensión del ácido 3- (2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il) -propiónico (10 gramos, 60.8 milimoles) en 60 mililitros de diclorometano, se le agregó 1, 1 '-carbonildiimidazol (11.6 gramos, 71.8 milimoles), seguido por morfolina (5.5 mililitros, 60.8 milimoles), y N, N-di-isopropiletilamina (base de Hunig, 10 mililitros, 60.8 milimoles). La mezcla de reacción roja oscura se agitó a temperatura ambiente durante la noche, y se vertió en agua helada. La capa orgánica se lavó con salmuera hasta que el lavado tuvo un pH de aproximadamente 6, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró. El producto crudo se purificó sobre una columna de gel de sílice, eluyendo con diclorometano-metanol (92:2), para dar 13.84 gramos (96 por ciento) de 3- (2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il) -1-morfolin-4-il-propan-l-ona. Paso 2: A una suspensión de hidruro de litio y aluminio (2.67 gramos, 70 milimoles) en tetrahidrofurano (100 mililitros), se le agregó por goteo una solución de 3- (2, 4-dimetil-lH-pirrol-3-il) -1-morfolin-4-il-propan-l-ona (13.84 gramos, 59 milimoles) en tetrahidrofurano (50 mililitros) . La mezcla de reacción se agitó a 80 °C durante 1 hora, y se enfrió en un baño de hielo. Se agregó hielo a la mezcla de reacción lentamente, hasta que cesó el desprendimiento de gas. Se agregaron unas cuantas gotas de hidróxido de sodio 2 N, y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego la mezcla de reacción se extrajo con acetato de etilo, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró para dar 10.37 gramos (79 por ciento) de 4-[ 3- (2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il) -propil] -morfolina como un aceite castaño claro, el cual se utilizó sin mayor purificación. Paso 3: A una solución helada de N,N-dimetilformamida (5.5 mililitros, 70 milimoles) en diclorometano (30 mililitros) , se agregó por goteo oxicloruro de fósforo (6.5 mililitros, 70 milimoles). Cuando se terminó la adición, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, después de lo cual se agregó por goteo una soluciónde3 , 5-dimetil-4- (3-morfolin-4-il-propil) -lH-pirrol-2-carboxaldehído (10.37 gramos, 46.6 milimoles) en diclorometano (20 mililitros) a 0°C. La mezcla de reacción final se puso a reflujo a 60°C durante 4 horas, y luego se enfrió en un baño de hielo. Se agregó lentamente hielo a la mezcla de reacción, seguido por la adición de hidróxido de sodio 2 N, hasta que se alcanzó un pH de 12. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, y luego se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, y se concentró para dar el producto crudo, el cual se purificó sobre una columna de gel de sílice, eluyendo con diclorometano-metanol-hidróxido de amonio (9.5:0.5), para dar 4.57 gramos (39 por ciento) de 3,5-dimetil-4- (3-morfolin-4-il-propil) -iH-pirrol-2-carbaldehído como un aceite rojo oscuro: HNMR (360 MHz, DMSO-d,) d 11.34 (s, br, ÍH, NH-1), 9.40 (s, ÍH, CHO-2), 3.55 (t, J - 4.68 Hz, 4H, O (CH,CH2) ,NCH,CHjCHj- 4), 2.28-2.34 (m, 6H, 0 (CHjCH,) jNCH,CH,CH,-4) , 2.21 (t, 2H, J » 7.10 Hz, 2H, 0(CHjCHj)2NCHaCHjCHj-4) CH,-3), 2.19 (s, 3H, CH,-5) , 2.14 (a, 3H, CH,-3), 1.51 (quint., J a 7.10 Hz, 2H, 0 (CHjCHj) JNCHJCHJCHJ-4) , MS m/z (intensidad -relativa , %) 251 ([M+l]*-, 100) .

Paso 4: Una mezcla de 1, 3-dihidroindol-2-ona (133 miligramos, 1.0 milimoles), 3 , 5-dimetil-4- (3-morfolin-4-il) -propil) -lH-pirrol-2-carboxaldehído (250 miligramos, 1.0 milimoles), y 3 gotas de pirrolidina en 2.0 mililitros de etanol, se puso a reflujo a 90°C durante 4 horas, y luego se enfrió a temperatura ambiente. El precipitado se filtró, se lavó con etanol frío y hexano, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 308.9 miligramos (85 por ciento) de 3-[3,5-dimetil-4-(3-morfolin-4-il-propil)-lH-pirrol-2' il etilen] -1, 3-dihidroindol-2-ona como un sólido amarillo: rHNMR (300 MHz, DMS0-dt) d 13.37 (s, ÍH, NH-1'), 10.71 (s, ÍH, NH-1), 7.68 (d, Ja 7.47 Hz, ÍH, H-4), 7.53 (s, 1H, H-•V'^M, 7.06 {dt, J = 7.47 Hz, lH,H-6), 6.94 (dt, J a 7.74 Hz, ÍH, H-5) , 6.84 (d, J a 7.47 Hz, ÍH, H-7) , 3.55 (t, J - 4.37 Hz, 4H, 0(CH,CH2),NCH,CH,CH,-4'), 2.40 (t, J a 7.31 Hz, 2H, 0(CH,CH,),NCH,CH,CH,-4'), 2.31 (t, J = 4.37 Hz, 4H, 0(CH,CH,),NCH,CH,CH2-4'), 2.28 (a, 3H, CH,-3'), 2.23 (s, 3H, CH3-5'), 2.23 (t, J= 7.31 Hz, 2H, 0 (CH,CH,) ,NCH,CH5CH,-4 ' ) , 1.56' (quint., J = 7.31 Hz, 2H, 0(CH,CH2) ,NCH,CH,CHj-4 ' ) , MS m/e (intensidad relativa'/ %) 365 ( M*' , 100) .

Ejemplo 43 5-Bromo-3-[3,5-dimetil-4-(3-morfolin-4-il-propil)-lH- pirrol-2-ilmetilen] -1, 3-dihidroindol-2-ona Una mezcla de 5-bromo-l, 3-dihidroindol-2-ona (212 miligramos, 1.0 milimoles), 3 , 5-dimetil-4- (3-morfolin-4-il- propil) -lH-pirrol-2-carbaldehido (250 miligramos, 1.0 milimoles), y 3 gotas de pirrolidina en 2.0 mililitros de etanol, se puso a reflujo a 90°C durante 4 horas, y luego se enfrió a temperatura ambiente. El precipitado se filtró, se lavó con etanol frío y hexano, y se secó en un horno al vacío durante la noche para dar 399.8 miligramos (90 por ciento) de 5-bromo-3-[3 , 5-dimetil-4- (3-morfolin-4-il-propil) -lH-pirrol-2- ilmetilen]-l, 3-dihidroindol-2-ona como un sólido rojo. lHNMR (300 MHz, DMS0-dß) d 13.43 (s, ÍH, NH-1'), 10.81 (s ÍH, NH-1), 7.99 (d, J= 2.07 Hz, ÍH, H-4), 7.66 (a, ÍH, H-vinyl), 7.18 (dd, J = 2.07, 7.58 Hz, lH,H-6), 6.79 (d, J a 7.58 Hz, ÍH, H-7) , 3.55 (t, J = 4.39 Hz, 4H, 0(CH,CH2)2NCH2CH,CH2-4'), 2.40 (t, J = 7.32 Hz , 2H, 0(CH,CH,),NCH,CH,CHJ-4'), 2.31 (t, J = 4.39 Hz, 4H, 0(CH,CH,)2NCH,CH,CH,-4'), 2.29 (a, 3H, CH,-3'), 2.26 (a, 3H, CH, 5'), 2.23 (t, J = 7.32 Hz, 2H, O (CH,CH,) ,NCH,CH,CH2-4 ' ) , 1.56 (quint., J = 7.32 Hz, 2H, .0 (CH,CH,) ,NCH,CH.,CH,-4 ' ) , MS m/e (intensidad relativa , %) 443 (M*', 1.00) , 445 ([M+2]*', 100) .

Ejemplo 44 3-[3,5-Dimetil-4-(3-morfolin-4-il-propil) -lH-pirrol- 2-ilmetilen]-6-fenil-l,3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 88 por ciento del compuesto del título como un sólido amarillo: 'HNMR (300 MHz, DMS0-dß) d ,13.37 (a, ÍH, NH-1') , 10.81 (a, 1H, NH-1) , 7.77 (d, J - 8.20 Hz, 1H, H-4) , 7.62 (d, J - 7.39 Hz, 2H, H-2»,6«) , 7.58 (3, 1H, H-vini.lo, , 7.44 (t, J - 7.39 Hz, 2H, H-3",5») , 7.32 (t, br, J - 7.39 Hz, ÍH, H-4") , 7.26 (dd, J = 1.49, 8.29 HZ, ÍH, H-5) , 7.09 (d, J - 1.49 Hz, ÍH, H-7) , 3.56 (t, J - 4.48 Hz, 4H, O (CH,CH,) ,NCH,CHjCHj-4 ' ) , 2.41 (t, J - 7.18 HZ, 2H, 0(CHjCHj),NCHjCHjCíia-4') < 2.31 (t, J - 4.48 Hz, 4H, 0(CHjCHj),NCH,CH,CH,-4') , 2.29 (a, 3H, CH,-3') , 2.26 (s, 3H, CH,- 5') , 2.24 (t, J = 7.18 Hz, 2H, O (CH,CH,) ,NCE:!CH,CH2-4 ' ) , 1.56 (quint., J = 7.18 Hz, 2H, O (CH,CHa) 2NCHjCH_jCHj - 4 ' ) , MS m/e (iní nsTdad'' relativa ", %) 441 (M*', 100) .

Ejemplo 45 3-[3,5-Dimetil-4-(3-morfolin-4-il-propil) -lH-pirrol- 2-ilmetilen] -6- (2-metoxif enil) -1, 3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 86 por ciento del compuesto del título como un sólido amarillo: lHNMR (300 MHz, DMSO-df) d 13.37 (a, ÍH, NH-1') , 10.72 (a, ÍH, NH-1) , 7.71 (d, J « 7.79 Hz, ÍH, H-4) , 7.55 (a, ÍH, H- 7.27-7.34 (m, 2H) , 6.98-7.10 (m, 4H) , 3.76 (a, 3H, OCH,-2"), 3.56 (t, J - 4.50 Hz, 4H, O (CH,CH2) :?NCH2CH2CH,-4 ' ) , 2.41 (t, J - 7.12 Hz, 2H, O (CHjCHj) jNCH2CH,CH,--4 ' ) , 2.21-2.31 (m, 6H, OÍCHJCHJJJNCHJCHJCÜJ^' ) , 2.29 (a, 3H, CH,-.3') , 2.25 (a, 3H, CH,-5<) , 1.57 (quint., J « 7.12 Hz , 2H, O (CH2CH2) ,NCHjCH,CH,-4 ' ) , MS m/e (.intensidad ..rel tiva -, %) 471 (M*'„ 100) .

Ejemplo 46 3-[3,5-Dimetil-4-(3-morfolin-4-il-propil) -lH-pirrol-2-ilmetilen]-6-(3-metoxifenil) -l,3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 87 por ciento del compuesto del título como un sólido amarillo: 'HNMR (300 MHz, DMSO-d,) d 13.38 (s, 1H, NH-1') , 10.80 (s, ÍH, NH-1) , 7.76 (d, J = 7.93 Hz, ÍH, H-4) , 7.57 (s, ÍH, H- vinyl) , 7.35 (t, J = 8.08 Hz, ÍH, H-5") , 7.26 (dd, J = 1.73, 7.93 Hz, ÍH, H-5) , 7.18 (d, br, J = 8.08 Hz, ÍH, H-4") , 7.13 (t, br, J = 1.94 Hz, ÍH, H-2") , 7.08 (d, J = 1.73 Hz, ÍH, H- 7) , 6.90 (dd, J = 1.94, 8.08 Hz, ÍH, H-6") , 3.81 (s, 3H, OCH,- 3") , 3.56 (t, J = 4.38 Hz, 4H, O (C CH,) ,NCH,CHjCHj-4 ' ) , 2.41 (t, J = 7.19 Hz, 2H, 0(CH,CHj)jNCH,CH,CH,-4') , 2.31 (t, J = 4.38 Hz, 4H, 0(CH,CH,),NCH,CH,CSj-4') , 2.29 (3, 3H, CH,-3') , 2.26 (a, 3H, CH,-5') , 2.24 (t, J = 7.19 Hz, 2H, 0(CH,CH2) ,NCH2CHjCH,-4' ) , 1.56 (quint., J a 7.19 Hz, 2H, O (CH,CH2) jNCHjCIijCHj-4 ' ) , MS m/e (intensidad relativa .. %) 471 (m*. ?oo) .

Ejemplo 47 3-[3,5-Dimetil-4-(3-morfolin-4-il-propil)-lH-pirrol-2-ilmetilen]-6-(4-metoxifenil) -l,3-dihidroindol-2-ona Utilizando el método del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 52 por ciento del compuesto del título como un sólido amarillo: XHNMR (300 MHz, DMSO-d,) d 13.35 (a, ÍH, NH-1'), 10.77 (a, ÍH, NH-1), 7.72 (d, J a 7.97 Hz, ÍH, H-4) , 7.55 (d, J = 8.57 Hz, 2H, H-2",6"), 7.54 (a, ÍH, H-vinyl) , 7.20 (dd, J = 1.35, 7.97 Hz, ÍH, H-5), 7..04 (d, J» 1.35 Hz, ÍH, H-7) , 6.99 (d, J = 8.57 Hz, ÍH, H-3',5"), 3.78 (a, 3H, OCH,-4"), 3.55 (t, J - 4.57 Hz, 4H, 0(Ca,CHj)jNCHaCHjCHj-4') , 2.40 (t, J - 6.97 Hz, 2H, O(CH,CHJ)JNCH,CH,CÜJ-4') , 2.30 (t, J - 4.57 Hz, 4H, 0(CHJCÜJ),NCHJCHJCHJ-4' ) , 2.28 (s, 3H, CH,-3') , 2.24 (s, 3H, CH, 5') , 2.23 (t, J = 6.97 Hz, 2H, 0 (CH,CH,) ,Nqí,CH,CH,-4 ' ) , 1.55 (quine, J = 6.97 Hz, 2H, O (CH,CH,) ,NCH,CH,CH,-4 ' ) , MS m/e (intensidad 'relativa , %) 471 (M' , 100) .

Ejemplo 48 3-[4-(3-Dimetilaminopropil) -3, 5-dimetil-lH-pirrol-2- ilmetilen] -l, 3-dihidroindol-2-ona Utilizando los Pasos 1, 2 y 3 del Ejemplo 1, se obtuvo un rendimiento del 63 por ciento de 4- (3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-carboxaldehído como un aceite rojo oscuro: 1HNMR (360 MHz, DMSO-d,) d 11.33 (a, br, H, NH-1) , 9.40 (a, ÍH, CHO-2) , 2.30 (t, J - 7.42 Hz, 2H, (CH,) 5NCH2CH,CH2-4) , 2.18 (s, 3H, CH,-3) , 2.15 (t, J - 7.42 Hz, 2H, ( CH, ) :NCHjCH,CH, - 4 ) , 2.14 (a, 3H, CH3-5) , 2.10 (3, 6H, (CH,) ,NCH,CH,CH, - 4 ) , 1.47 (quint., J =» 7.42 Hz, 2H, (CH,),NCH,CHjCH,-4) , MS ÍTI/Z ( intensidad' relativa -, %) 208 ([M+l]*', 100) .

Utilizando el Paso 4 del Ejemplo 1, se obtuvo un rendimiento del 52 por ciento del compuesto del título como un sólido amarillo: 'HNMR (360 MHz, DMSO-d,) d 13.38 (a, ÍH, NH-1' ) , 10.70 (a, ÍH, NH-1) , 7.68 (d, J a 7.54 Hz, ÍH, H-4), 7.53 (a, ÍH, H- vinyl), 7.06 (t, J a 7.54 Hz, ÍH, H-6) , 6.94 (t, J = 7.54 Hz, ÍH, H-5) , 6.85 (d, J . 7.54 Hz, ÍH, H-7) , 2.38 (t, J a 7.25 Hz, 2H, (CH,)jNCH2CHjCHj-4')f 2.27 (a, 3H, CH,-3') , 2.23 (a, 3H, CH,-5') , 2.17 (t, J - 7.25 Hz, 2H, (CH,) ,NC??,CHaCH2-4 ' ) , 2.11 (s, 6H, (CH,)jNCHjCH,CHj-4'), 1.52 (quint., J = 7.25 Hz, 2H, (CH,),NCHjCHjCH,-4'), MS m/z (intensida'd relativa -, %) 323 (M*-, 100) .

Ejemplo 49 5-Bromo-3-[4-(3-dimetilaminopropil) -3,5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen]-l,3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 71 por ciento del compuesto del título como un sólido rojo: lHNMR (360 MHz, DMSO-d,) d 13.42 (s, ÍH, NH-1') , 10.81 (a, ÍH, NH-1) , 7.98 (d, J - 1.89 Hz, ÍH, H-4), 7.66 (a, ÍH, H- vinilt)), 7.17 (dd, J - 1.89, 8.23 Hz, ÍH, H-6), 6.79 (d, J = 8.23 Hz, ÍH, H-7) , 2.38 (t, J - 7.23 Hz, 2H, (CH,) ,NCH,CH,CH,- 4') , 2.27 (a, 3H, CH,-3'), 2.25 (s, 3H, CH,-5') , 2.16 (t, J = 7.23 Hz, 2H, (CH,)2NCHaCH,CH,-4') , 2.10 (s, 6H, (CH,) ,NCH,CH:CH,- 4'), 1.51 (quint., J a 7.23 Hz, 2H, (CH,) 2NCH,CH,CH,-4 ' ) , MS m/z (inte?is?dad eVativa , %) 401 ([M-l]*-, 100) and 403 ([M+l]*-, 100) .

Ejemplo 50 3-[4-(3-Dimetilaminopropil) -3, 5-dimet il-lH-pirrol-2- ilmetilen]-6-fenil-?,3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 83 por ciento del compuesto del título como un sólido naranja: 'VHNMR (360 MHz, DMSO-d,) d 13.38 (a, ÍH, NH-1') , 10.81 (a, 1H, NH-1) , 7.77 (d, J a 7.82 Hz, ÍH, H-4) , 7.62 (d, J = 7.59 Hz, 2H, H-2",6") , 7.58 (s, ÍH, H-V.i?lljc) , 7.44 (t, J = 7.59 Hz, 2H, H-3",5"), 7.32 (t, J = 7.59 Hz, ÍH, H-4") , 7.27 (dd, J = 1.11, 7.82 Hz, ÍH, H-5) , 7.09 (d, J = 1.11 Hz, ÍH, H-7) , 2.39 (t, J = 7.18 Hz, 2H, (CH,),NCH2CH2CHa-4') , 2.29 (a, 3H, CH,-3'), 2.25 (3, 3H, CH,-5'), 2.17 (t, J = 7.18 Hz, 2H, (CH,) ,NCH2CH2CH2- 4') , 2.11 (s, 6H, (Qi,),NCH,CH,CH,-4') , 1.53 (quint., J = 7.18 Hz, 2H, (CH,)jNCH,CH2CHj-4') , MS m/z (i:ntdnsi'uaa re>a- iv?i , %) 399 (M*\ 100) .

Ejemplo 51 3-[4-(3-Dimetilaminopropil) -3, 5-dimetil-lH-pirrol-2- ilmetilen]-6-(2-metoxifenil)-l,3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 83 por ciento del compuesto del título como un sólido amarillo: XHNMR (360 MHz, DMSO-d,) d 13.38 (s, ÍH, NH-1'), 10.72 (s, ÍH, NH-1), 7.70 (d, J a 8.06 Hz, ÍH, H-4) , 7.55 (s, ÍH, H- vinilc), 7.28-7.36 (m, 2H, H-4",5"), 7.14 (d, J - 8.32 Hz, ÍH, -H-6"), 7.04 (dd, J » 1.21, 8.06 Hz, ÍH, H-5) , 6.99 (d, J = 7.42 Hz, ÍH, H-3"), 6.99 (d, J = 1.21 Hz, ÍH, H-7) 3.76 (s, 3H, 0CH,-2") , 2.39 (t, J - 7.24 Hz, 2H, (CH,) ,NCH,CH2CH2-4 ' ) , 2.28 (s, 3H, CH,-3') , 2.25 (s, 3H, CH,-5'), 2.,18 (t, J = 7.24 Hz, 2H, (CH,)jNCH,CH2CH,-4')r,2.11 (a, 6H, (CE,) 2NCH2CH2CH,-4 ' ) , 1.53 (quint., J - 7.24 Hz, 2H, (CH,) 2NCH,CH,CH2-4 ' ) , MS m/z (tnt&ns?dad relativa -,, %) 429 (M*\ 100) .

Ejemplo 52 3-[4-(3-Dimetilaminopropil) -3, 5-dimetil-lH-pirrol-2- ilmetilen]-6-(3-metoxifenil)-i,3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 83 por ciento del compuesto del título como un sólido rojo: 'HNMR (360 MHZ, DMSO-d,) d 13.38 (a, ÍH, NH-1') , 10.80 (s, IH, NH-1), 7.60 (d, J - 8.06 Hz, ÍH, H-4) , 7.57 (a, ÍH, H- vinyl) , 7.35 (t, J - 8.15 Hz, ÍH, H-5»), 7.26 (dd, J = 1.39, 8.06 Hz, 1H, H-5) , 7.19 (d, br, J - 8.15 Hz, H-6") , 7.13 (m, ÍH, H-2") , 7.09 (d, J » 1.39 Hz, ÍH, H-7) , 6.90 (dd, J - 2.57, 8.15 Hz, ÍH, H-4") , 3.81 (a, 3H, 0CH,-3") , 2.39 (t, J - 7.17 Hz, 2H, (CH,),NCH,CH,CH,-4') , 2.29 (s, 3H, CH,-3') , 2.25 (3, 3H, CH,-5') , 2.17 (t, J » 7.17 Hz, 2H, (CH,) ,NCHjCH,CH,-4 ' ) , 2.11 (a, 6H, (CHj) jNCHjCH,CH,-4') , 1.53 (quint., J = 7.17 Hz, 2H, (CH,),NCHjCH,CH,-4') , MS m/z (intensidad relativa , %) 429 (M*'„ 100) .

Ejemplo 53 3-[4-(3-Dimetiiaminopropil)-3,5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen]-6-(4-metoxifenil) -?,3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 83 por ciento del compuesto del título como un sólido castaño: 'HNMR (360 MHz, DMSO-d,) d 13.35 (a, ÍH, NH-1'), 10.77 (a, ÍH, NH-1), 7.73 (d, J = 7.82 Hz, ÍH, H-4), 7.56 (d, J = 8.83 Hz, 2H, H-2-,6"), 7.54 (a, ÍH, H-vinilo), 7.20 (dd, J a 1.64, 7.82 Hz, ÍH, H-5) , 7.04 (d, J - 1.64 Hz, H-7) , 7.00 (d, J - 8.83 Hz, 2H, H-3»,5), 3.78 (s, 3H, OCH,-4"), 2.39 (t, J = 7.24 HZ, 2H, (CH,)jNCHjCHjCHa,-4'), 2.28 (a, 3H, CH,-3'), 2.25 (s, 3H, CH,-5'), 2.17 (t, J- 7.24 Hz, 2H, (CH,) jNCH.!CH,CH,-4 ' ) , 2.11 (s, 6H, (CHJ),NCH1CHaCHj-4'), 1.52 (quint., J - 7.24 Hz, 2H, (CHj),NCHjCHaCHj-4') , MS m/z (intensidad elativa -t %j 42'9 ^ t 100) # Ejemplo 54 5-Cloro-3-[4-(3-dimetilaminopropil) -3, 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -1, 3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 53 por ciento del compuesto del título como un sólido castaño: 'HNMR (360 MHz, DMSO-d,) d 13.43 (a, ÍH, NH-1'), 10.84 (s, ÍH, NH-1), 7.87 (d, J» 1.85 Hz, ÍH, H-4) , 7.66 (s, 1H, H- vinyl), 7.05 (dd, J a 1.85, 8.15 Hz, ÍH, H-6) , 6.83 (d, J = 8 . 15 Hz , ÍH , H- 7 ) , 2 . 36 -2 . 45 (m, 4H , (CH, ) ¡NCHjCHjCH, ^ ' ) , 2 . 30 (s, 6H, (CH,)2NCH2CH2CHj-4'), 2.28 (s, 3H, CH,-3'), 2 '.26 (s, 3H, CH,-5') , 1.58 (quint., J = 7.52 Hz, 2H, (CH,) 2NCH2CH2CH2-4 ' ) , MS m/z ( intensidad- relativa ,, %) 357 ([M-l]* , 100) .

Ejemplo 55 6-Cloro-3-[4-(3-dimetilaminopropil) -3,5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen]-l,3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 77 por ciento del compuesto del título: MS El 357 [M-l]+. Ejemplo 56 3-[4-(3-Dimetilaminopropil) -3,5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -5-metoxi-l, 3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 77 por ciento del compuesto del título: MS El 353 [M]+. Ejemplo 57 3-[4-(3-Dimetilaminopropil) -3, 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -6-metoxi-l, 3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 74 por ciento del compuesto del título. Ejemplo 58 3-[4-(3-Dimetilaminopropil)-3,5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -5-metil-l, 3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 45 por ciento del compuesto del título: MS El 337 [M]+. Ejemplo 59 3-[4-(3-Dimetilaminopropil)-3,5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen]-4-metil-l,3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 99 por ciento del compuesto del título: lHNMR (300 MHz, DMSO-d,) d 13.45 (a, br, ÍH, NH) , 10.78 (s, br, 1H, NH) , 7.50 (a, ÍH, H-vinilo), 6 . 98 (t, J « 8.1 Hz, ÍH, H-6), 6.76 (t, J a 8.1 Hz, 2H, H-5 & H-7) , 2.88 (m, 2H, CH,) , 2.64 (s, 6H, 2x H,), 2.56 (s, 3H, CH,) , 2.43 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CHj), 2.29 (s, 3H, CH,) , 2.19 (a, 3H, CH,) , 1.65-1.75 (m, 2H, CH,) , MS El 337 [M]*.

Ejemplo 60 3-[4-(3-Dimetilaminopropil) -3,5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -4- (2-hidroxi-etil) -1, 3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 98 por ciento del compuesto del título. Ejemplo 61 Amida del ácido 3-[4-(3-dimetilaminopropil)-3,5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -2-oxo-2,3-dihidro-lH-indol-5-sulfónico Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 59 por ciento del compuesto del título: lHNMR (300 MHz, DMSO-d,) d 13.41 (a, ÍH, NH-1'), 11.12 (a, ÍH, NH-1) , 8.16 (d, J - 1.78 Hz, ÍH, H-4) , 7.66 (a, ÍH, H- vinyl) , 7.55 (dd, a 1.78, 8.18 Hz, ÍH, H-6) , 7.11 (a, br, 2H, H,NSO,-5) , 6.98 (d, J » 8.18 Hz, ÍH, H-7) , 2.47-2.50 (m, 2H, (CHJ)JNCHJCHJQ?J-4' ) , 2.41 (t, J - 7.37 Hz, 2H, (CH,)2NCHaCH2CHj-4' ) , 2.36 (a, 6H, (CH,) JNCHJCHJCHJ-4 ' ) , 2.30 (s, 3H, CHj-3') , 2.28 (s, 3H, CH,-5'), 1.61 (quint., J = 7.37 Hz, 2H, (CH,)2NCH,CHaCH,-4' ) . . . .

Ejemplo 62 Isopropilamida del ácido 3-[4-(3-dimetilaminopropil)-3,5-dimetil-iH-pirrol-2-ilmetilen]-2-oxo-2,3-dihidro-lH-indol-5-sulfónico Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 64 por ciento del compuesto del título: MS El 444 [M]+. Ejemplo 63 3-[4-(3-Dimetilaminopropil) -3,5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen]-5-(morfolin-4-sulfonil) -l,3-dihidroindol-2-ona Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 90 por ciento del compuesto del título. MS El 472 [M]+. Ejemplo 64 Dimetilamida del ácido 3-[4-(3-dimetilaminopropil) - 3,5-dimetil-iH-pirrol-2-ilmetilen]-2-oxo-2,3-dihidro-lH-indol-5-sulfónico Utilizando el procedimiento del Ejemplo 2, se obtuvo un rendimiento del 92 por ciento del compuesto del título: lHNMR (300 MHz, DMSO-d,) d 13.5 (s, br, ÍH, NH) , 12.21 (s, br, ÍH, NH) , 8.18 (d, J - 1.8 Hz, ÍH, H-4) , 7.84 (s, ÍH, H- vmyl), 7.44 (dd, J a 1.8, 8.4 Hz, ÍH, H-6) , 7.05 (d, J » 8.4 Hz, ÍH, H-7) , 2.59 (s, 6H, 2xCH,) , 2.59-2.64 (m, 2H, CH,) , 2.44 (3, 6H, 2xCH,) , 2.38-2.44 (m, 2H, CHa) , 2.31 (s, 6H, 2xCH,) , 1.59-1.69 (m, 2H, CH2) , MS El 430 [M]*. 7. EVALUACIÓN BIOLÓGICA Se apreciará que, en cualquier serie dada de compuestos, se proporcionará un espectro de actividad biológica. En sus modalidades actualmente preferidas, esta invención se refiere a novedosas 2-indolinonas sustituidas por pirrol, que demuestran la capacidad para modular la actividad de RTK, CTK y STK. Los siguientes ensayos se emplean para seleccionar los compuestos que demuestren el grado óptimo de la actividad deseada.

A. Procedimientos de Ensayo Se pueden utilizar los siguientes ensayos in vitro para determinar el nivel de actividad y el efecto de los diferentes compuestos de la presente invención sobre una ó más de las cinasas de proteína. Se pueden diseñar ensayos similares a lo largo de las mismas líneas para cualquier cinasa de proteína, utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Los ensayos celulares/catalíticos descritos en la presente se realizan en un formato ELISA. El procedimiento general es como sigue: se introduce un compuesto a las células que expresen la cinasa de prueba, ya sea naturalmente ó de una manera recombinante, durante un período de tiempo seleccionado, después del cual, si la cinasa de prueba es una receptora, se agrega un ligando que se sepa que activa a la receptora. Las células se lisan, y el lisado se transfiere a los pozos de una placa ELISA previamente recubierta con un anticuerpo específico que reconozca al sustrato de la reacción de fosforilación enzimática. Los componentes que no sean sustrato del lisado celular se lavan, y se detecta la cantidad de fosforilación sobre el sustrato con un anticuerpo que reconozca específicamente la fosfotirosina, comparándose con las células de control que no se pusieron en contacto con un compuesto de prueba. Los ensayos celulares/biológicos descritos en la presente miden la cantidad de ADN formado en respuesta a la activación de una cinasa de prueba, que es una medida general de una respuesta proliferativa. El procedimiento general para este ensayo es como sigue: se introduce un compuesto a las células que expresen la cinasa de prueba, ya sea naturalmente ó de manera recombinante, durante un período de tiempo seleccionado, después del cual, si la cinasa de prueba es una receptora, se agrega un ligando que se sepa que activa a la receptora. Después de una incubación cuando menos durante la noche, se agrega un reactivo marcador de ADN, tal como bromodesoxiuridina (BrdU) ó 3H-timidina. La cantidad de ADN marcado se detecta con, ya sea un anticuerpo anti-BrdU, ó midiendo la radioactividad, y se compara con las células de control que no hicieron contacto con un compuesto de prueba. Ensayos Celulares/Catalíticos Se pueden utilizar ensayos inmunosorbentes enlazados con enzima (ELISA) para detectar y medir la presencia de actividad de cinasa de proteína. El ELISA se puede conducir de acuerdo con los protocolos conocidos, los cuales se describe, por ejemplo, en Voller y colaboradores, 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay", en Manual of Clinical Immunology, 2a edición, editado por Rose y Friedman, páginas 359-371, Am. Soc. of Microbiology, Washington, D.C. El protocolo dado a conocer se puede adaptar para determinar la actividad con respecto a una cinasa de proteína específica. Es decir, los protocolos preferidos para conducir los experimentos ELISA para cinasas de proteína específicas, se proporcionan más adelante. Sin embargo, la adaptación de estos protocolos para determinar la actividad de un compuesto para otros miembros de la familia RTK, así como para CTKs y STKs, está bien dentro del alcance del conocimiento de los expertos en este campo. Ensavo de FLK-l Se conduce un ensayo ELISA para medir la actividad de cinasa del receptor FLK-l, y más específicamente, la inhibición ó activación de la actividad de TK sobre el receptor FLK-l. Específicamente, se puede conducir el siguiente ensayo para medir la actividad de cinasa del receptor FLK-l en células genéticamente diseñadas para expresar Flk-1. Materiales y Reactivos a. Placas ELISA de 96 pozos Corning (Corning, Catálogo No. 25805-96) , b. IgG de cabra anti-conejo Cappel (Catálogo No. 55641) , c. PBS (Gibco, Catálogo No. 450-1300EB) , d. Regulador TBSW (Tris 50 mM (pH de 7.2), NaCl 150 mM, y Tween 20 al 0.1 por ciento), e. Suministro de etanolamina (etanolamina al 10 por ciento (pH de 7.0) , almacenada a 4°C) . f. Regulador HNTG (regulador HEPES 20mM (pH de 7.5), NaCl 150mM, Tritón X-100 al 0.2 por ciento, y glicerol al 10 por ciento) , g. EDTA (0.5 M (pH de 7.0) como un suministro 100X) , h. Ortovanadato de sodio (0.5 M, como un suministro 100X) , i. Pirofosfato de sodio (0.2 M, como un suministro 100X) , j . Placas de polipropileno de fondo en V de 96 pozos NUNC (Applied Scientific, Catálogo No. AS-72092), k. Células NIH3T3 C7#3 (células que expresan FLK- 1) , 1. DMEM con L-glutamina alta en glucosa IX (Catálogo No. 11965-050), m. FBS, Gibco (Catálogo No. 16000-028) , n. L-glutamina, Gibco (Catálogo No. 25030-016) , o. VEGF, PeproTech, Inc. (Catálogo No. 100-20) (mantenido como 1 microgramo/ 100 microlitros de suministro en Milli-Q dH20, y almacenado a -20°C) , p. Antisuero anti-FLK-1 purificado por afinidad, q. Anticuerpo monoclonal UB40 específico para fosfotirosina (ver, Fendley y colaboradores 1990, Cáncer Research 50:1550-1558), r. IgG de cabra anti-ratón-POD de grado EIA (BioRad, Catálogo No. 172-1011) , s. Solución de ácido 2 , 2-azino-bis (3-etilbenz-tiazolin-6-sulfónico (ABTS) ) (ácido cítrico lOOmM (anhidro) , Na2HP04 250 mM (pH de 4.0), 0.5 miligramos/mililitro de ABTS (Sigma, Catálogo No. A-1888)), la solución se debe almacenar en la oscuridad a 4°C hasta que esté lista para usarse, t. H202 (solución al 30 por ciento) (Fisher, Catálogo No. H325) , u. ABTS/H202 (15 mililitros de solución ABTS, 2 microlitros de H202) preparada 5 minutos antes de usarse, y dejada a temperatura ambiente, v. Suministro de HCl 0.2 M en H20, w. Sulfóxido de dimetilo (100 por ciento) (Sigma, Catálogo No. D-8418) , e y. Tripsina-EDTA (Gibco BRL, Catálogo No. 25200-049) . Protocolo 1. Se recubren las placas ELISA de 96 pozos Corning con 1.0 microgramos por pozo de anticuerpo IgG anti-conejo Cappel en Na2C03 O.lM, pH de 9.6. Se lleva el volumen final hasta 150 microlitros por cavidad. Se recubren las placas durante la noche a 4°C. Las placas se pueden mantener hasta dos semanas cuando se almacenen a 4°C. 2. Se cultivan células en un medio de cultivo (DMEM, complementado con L-glutamina 2.0 mM, FBS al 10 por ciento) en platos de cultivo adecuados, hasta quedan confluentes a 37°C, C02 al 5 por ciento. 3. Se cosechan las células mediante tripsinización, y se siembran en placas de células de fondo redondo de 96 pozos de poliestireno Corning 25850, en 25,000 células/pozo, en 200 microlitros de medio de cultivo. 4. Se cultivan las células cuando menos un día a 37°C, C02 al 5 por ciento. 5. Se lavan las células con D-PBS IX. 6. Se agregan 200 microlitros/pozo de medio de inanición (DMEM, l-glutamina 2.0 mM, FBS al 0.1 por ciento). Se incuban durante la noche a 37 °C, C02 al 5 por ciento. 7. Se diluyen los compuestos a 1:20 en placas de 96 pozos de polipropileno, utilizando el medio de inanición. Se diluyen sulfóxido de dimetilo a 1:20 para utilizarse en los pozos de control. 8. Se remueve el medio de inanición de las placas de cultivo celular de 96 pozos, y se agregan 162 microlitros de medio de inanición fresco a cada pozo. 9. Se agregan 18 microlitros de una dilución de compuestos diluida a 1:20 (a partir del Paso 7) a cada pozo, más la dilución de sulfóxido de dimetilo a 1:20 a los pozos de control (+/- VEGF), para una dilución final de 1:200 después del estímulo celular. El sulfóxido de dimetilo final es el 0.5 por ciento. Se incuba la placa a 37°C, C02 al 5 por ciento, durante dos horas. 10. Se remueve el anticuerpo no enlazado de las placas ELISA invirtiendo la placa para remover el líquido. Se lava tres veces con TBSW + etanolamina al 0.5 por ciento, pH de 7.0. Se golpea ligeramente la placa sobre una toalla de papel para remover el exceso de líquido y las burbujas. 11. Se bloquean las placas con TBSW + etanolamina al 0.5 por ciento, pH de 7.0, 150 microlitros por pozo. Se incuba la placa treinta minutos mientras se agita sobre un agitador de placas de microtitulación. 12. Se lava la placa 3 veces como se describe en el Paso 10. 13. Se agregan 0.5 microgramos/pozo de antisuero de conejo policlonal anti-FLU-1 purificado por afinidad. Se lleva el volumen final hasta 150 microlitros/pozo con TBSW + etanolamina al 0.5 por ciento, pH de 7.0. Se incuba la placa durante 30 minutos con agitación. 14. Se agregan 180 microlitros de medio de inanición a las células, y se estimulan las células con 20 microlitros/cavidad de ortovanadato de sodio 10.0 mM, y 500 nanogramos/mililitro de VEGF (dando como resultado una concentración final de 1.0 mM de ortovanadato de sodio y 50 nanogramos/mililitro de VEGF por pozo) durante ocho minutos a 37°C, C02 al 5 por ciento. Los pozos de control negativo reciben solamente medio de inanición. 15. Después de ocho minutos, se debe remover el medio de las células, y se lavan una vez con 200 microlitros/pozo de PBS. 16. Se lisan las células en 150 microlitros/pozo de NHTG con agitación a temperatura ambiente durante cinco minutos. La formulación HNTG incluye ortovanadato de sodio, pirofosfato de sodio y EDTA. 17. Se lava la placa ELISA tres veces como se describe en el Paso 10. 18. Se transfieren los lisados celulares desde la placa de células hasta la placa ELISA, y se incuban con agitación durante dos horas. Para transferir el lisado celular, se pasa por pipeta hacia arriba y hacia abajo mientras se raspan los pozos. 19. Se lava la placa tres veces como se describe en el Paso 10. 20. Se incuba la placa ELISA con 0.02 microgramos/pozo de UB40 en TBSW + etanolamina al 0.5 por ciento. Se lleva el volumen final hasta 150 microlitros/pozo. Se incuba con agitación durante 30 minutos. 21. Se lava la placa tres veces como se describe en el Paso 10. 22. Se incuba la placa ELISA con 1:10,000 de peroxidasa de rábano conjugada con IgG de cabra anti-ratón de grado EIA diluida en TBSW + etanolamina al 0.5 por ciento, pH de 7.0. Se lleva el volumen final hasta 150 microlitros/pozo. Se incuba con agitación durante treinta minutos. 23. Se lava la placa como se describe en el Paso 10. 24. Se agregan 100 microlitros de una solución de ABTS/H202 al pozo. Se incuba durante diez minutos con agitación. 25. Se agregan 100 microlitros de HCl 0.2 M para una concentración final de HCl 0.1 M, para detener la reacción de desarrollo de color. Se agita durante 1 minuto a temperatura ambiente. Se remueven las burbujas con una corriente de aire lenta, y se lee la placa ELISA en un lector de placas ELISA a 410 nanómetros. Ensayo de Receptor EGF-Receptor Quimérico HER2 en Células Enteras Se mide la actividad de cinasa HER2 en células EGFR-NIH3T3 enteras como se describe enseguida: Materiales y reactivos a. EGF: concentración de suministro: 16.5 ILM, EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd., Japón. b. 05-101 (UBI) (un anticuerpo monoclonal que reconoce un dominio extracelular de EGFR) . c. Anticuerpo anti-fosfotirosina (anti-Ptyr) (policlonal) (ver Fendley y colaboradores, supra) . d. Anticuerpo de detección: conjugado de peroxidasa de rábano con IgG de cabra anti-conejo, TAGO, Inc., Burlingame, CA. e. Regulador TBST: Tris-HCl, pH de 7.2 50 mM NaCl 150 Mm Tritón X-100 0.1 f. Suministro HNTG 5X: HEPES 0.1 M NaCl 0.75 M Glicerol 50% Tritón X-100 1.0% g. Suministro ABTS: Acido cítrico 100 mM Na2HP04 250 mM HCl, conc. 0.5 mM ABTS* 0.5 mg/ml * (ácido 2,2 '-azinobis(3-etilbenzo-tiazolinsulfónico) ) . Se mantiene la solución en la oscuridad a 4°C hasta usarse. h. Reactivos de suministro de: EDTA 100 mM, pH 7.0 Na3V04 0.5 M Na4(P207) 0.2 M Procedimiento Pre-recubrimiento de Placa ELISA 1. Se recubren las placas ELISA (Corning, 96 pozos, Catálogo No. #25805-96) con anticuerpo 05-101 a 0.5 microgramos por pozo en PBS, 100 microlitros de volumen final/pozo, y se almacenan durante la noche a 4°C. Las placas recubiertas son buenas durante hasta 10 días cuando se almacenan a 4°C. 2. En el día de uso, se remueve el regulador de recubrimiento, y se reemplaza con 100 microlitros de regulador de bloqueo (Lecha Seca Descremada Instantánea Carnation al 5 por ciento en PBS) . Se incuba la placa, agitando a temperatura ambiente (de aproximadamente 23 °C a 25°C) durante 30 minutos. Justo antes del uso, se remueve el regulador de bloqueo, y se lava la placa 4 veces con regulador TBST. Siembra de Células 1. Se puede utilizar una línea celular NIH3T3 que sobreexprese un receptor quimérico que contenga el dominio extracelular EGFR, y el dominio de cinasa intracelular HER2 para este ensayo. Se seleccionan los platos que tengan una confluencia del 80 al 90 por ciento para el experimento. Se tripsinizan las células y se detiene la reacción mediante la adición de suero bovino fetal al 10 por ciento. Se suspenden las células en un medio DMEM (medio CS DMEM al 10 por ciento) , y se centrifugan una vez a 1,500 rpm, a temperatura ambiente durante 5 minutos. 3. Se vuelven a suspender las células en el medio de siembra (DMEM, suero bovino al 0.5 por ciento, y se cuentan las células utilizando azul de tripano. La viabilidad arriba del 90 por ciento es aceptable. Se siembran las células en un medio DMEM (suero bovino al 0.5 por ciento) , en una densidad de 10,000 células por pozo, 100 microlitros por pozo, en una placa de microtitulación de 96 pozos. Se incuban las células sembradas en C02 al 5 por ciento a 37 °C durante aproximadamente 40 horas. Procedimientos de Ensayo 1. Se verifican las células sembradas para determinar la contaminación, utilizando un microscopio invertido. Se diluye el suministro de fármaco (10 miligramos/mililitro en sulfóxido de dimetilo) a 1:10 en un medio DMEM, luego se transfieren 5 microlitros a un pozo TBST para una dilución de fármaco final de 1:200, y una concentración de sulfóxido de dimetilo final del 1 por ciento. Los pozos de control reciben solamente sulfóxido de dimetilo. Se incuban en C02 al 5 por ciento a 37 °C durante 2 horas. 2. Se prepara el ligando EGF: se diluye el EGF de suministro en DMEM, de tal manera que, al transferir 10 microlitros de EGF diluido (dilución de 1:12), se obtenga una concentración final de 100 nM. 3. Se prepara HNTG* fresco suficiente para 100 microlitros por pozo, y se coloca sobre hielo. HNTG* (10 mililitros) : Suministro HNTG 2.0 ml Milli-Q H20 7.3 ml EDTA, 100 mM, pH 7.0 0.5 ml Na3V04 (0.5 M) 0.1 ml Na4(P207) (0.2 M) 0.1 ml 4. Después de 120 minutos de incubación con el fármaco, se agrega el ligando SGF preparado a las células, 10 microlitros por pozo, hasta una concentración final de 100 nM. Los pozos de control reciben DMEM solamente. Se incuban con agitación, a temperatura ambiente, durante 5 minutos. 5. Se remueve el fármaco, el EGF, y el DMEM. Se lavan las células dos veces con PBS. Se transfiere el HNTG* a las células, 100 microlitros por pozo. Se colocan sobre hielo durante 5 minutos. Mientras tanto, se remueve el regulador de bloqueo de otra placa ELISA, y se lava con TBST como se describió anteriormente. 6. Con una punta de pipeta seguramente adaptada a un micropipetador, se raspan las células de la placa, y se homogeneiza el material celular aspirando y dosificando repetidamente el regulador de lisis HNTG*. Se transfiere el lisado a una placa ELISA recubierta, bloqueada y lavada. Se incuba agitando a temperatura ambiente durante una hora. 7. Se remueve el lisado y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere el anticuerpo anti-Ptyr recién diluido a la placa ELISA en 100 microlitros por pozo. Se incuba agitando a temperatura ambiente durante 30 minutos en la presencia del anticuerpo anti-Ptyr (dilución de 1:3000 en TBST). 8. Se remueve el anticuerpo anti-Ptyr, y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere el anticuerpo IgG TAGO anticonejo recién diluido a la placa ELISA en 100 microlitros por pozo. Se incuba agitando a temperatura ambiente durante 30 minutos (anticuerpo IgG anti-conejo: dilución de 1:3000 en TBST) . 9. Se remueve el anticuerpo de detección TAGO, y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere la solución de ABTS/H202 recién preparada a la placa ELISA, 100 microlitros por pozo. Se incuba agitando a temperatura ambiente durante 20 minutos. (Solución de ABTS/H202: 1.0 microlitros de H202 al 30 por ciento en 10 mililitros de suministro ABTS) . 10. Se detiene la reacción agregando 50 microlitros de H2S045N (opcional), y se determina la O.D. a 410 nanómetros. 11. La señal de fosfotirosina máxima se determina sustrayendo el valor de los controles negativos a partir de los controles positivos. El porcentaje de inhibición del contenido de fosfotirosina para los pozos que contienen extracto se calcula entonces, después de la sustracción de los controles negativos. Ensayo de PDGF-R Todo el medio de cultivo celular, glutamina, y suero bovino fetal, se pueden adquirir en Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) , a menos que se especifique de otra manera. Todas las células se cultivan en una atmósfera húmeda del 90-95 por ciento de aire, y del 5 al 10 por ciento de C02 a 37°C. Todas las líneas celulares se subcultivan rutinariamente dos veces a la semana, y son negativas para micoplasma, determinado mediante el método Mycotect (Gibco) . Para los ensayos ELISA, se cultivan células (U1242, obtenidas con Joseph Schlessinger, NYU) hasta una confluencia del 80 al 90 por ciento en el medio de cultivo (MEM con FBS al 10 por ciento, NEAA, NaPyr 1 mM, y GLN 2 mM) , y se siembran en placas de cultivo de tejido de 96 pozos en suero al 0.5 por ciento, en 25,000 a 30,000 células por pozo. Después de la incubación durante la noche en un medio que contiene suero al 0.5 por ciento, las células se cambian a un medio exento de suero, y se tratan con el compuesto de prueba durante 2 horas en una incubadora con C02 al 5 por ciento, a 37°C. Luego se estimulan las células con ligando durante 5 a 10 minutos, seguido por lisis con HNTG (Hepes 20 mM, NaCl 150 M, glicerol al 10 por ciento, EDTA 5 mM, Na3V04 5 mM, Tritón X-100 al 0.2 por ciento, y NaPyr 2 mM) . Los lisados celulares (0.5 miligramos/pozo en PBS) se transfieren a placas ELISA previamente recubiertas con anticuerpo específico del receptor, y que se habían bloqueado con leche al 5 por ciento en TBST (Tris-HCl 50 mM, pH de 7.2, NaCl 150 mM, y Tritón X-100 al 0.1 por ciento) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los lisados se incuban con agitación durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan con TBST cuatro veces, y luego se incuban con anticuerpo policlonal anti-fosfotirosina a temperatura ambiente durante 30 minutos. El exceso de anticuerpo anti-fosfotirosina se remueve enjuagando la placa con TBST cuatro veces. Se agrega anticuerpo IgG de cabra anticonejo a la placa ELISA durante 30 minutos a temperatura ambiente, seguido por enjuague con TBST cuatro veces más. Se agrega ABTS (ácido cítrico 100 mM, Na2HP04 250 mM, y 0.5 miligramos/mililitro de ácido 2 , 2 ' -az ino-bis ( 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico) ) más H202 (1.2 mililitros de H202 al 30 por ciento para 10 mililitros de ATBS) a las placas ELISA para iniciar el desarrollo de color. La absorbencia a 410 nanómetros con una longitud de onda de referencia de 630 nanómetros, se registra de aproximadamente 15 a 30 minutos después de la adición de ABTS. Ensavo de RECEPTOR IGF-1 Se puede utilizar el siguiente protocolo para medir el nivel de fosfotirosina sobre el receptor IGF-1, que indica la actividad de cinasa de tirosina receptora de IGF-1. Materiales y Reactivos a. La línea celular usada en este ensayo es 3T3/IFG-1R, una línea celular genéticamente diseñada para sobreexpresar el receptor IGF-1. b. Se cultiva NIH3T3/IGF-1R en una incubadora con C02 al 5 por ciento a 37 °C. El medio de cultivo es DMEM + FBS al 10 por ciento (inactivado por calor) + L-glutamina 2 mM. c. Anticuerpo anti-IGF-lR 17-69 purificado por afinidad. d. D-PBS: KH2P04 0.20 g/1 KH2P04 2.16 g/1 KCl 0.20 g/1 NaCl 8.00 g/1 (pH 7.2) e. Regulador de Bloqueo: TBST más leche al 5 por ciento (Leche Seca Descremada Instantánea Carnation) . f. Regulador TBST: Tris-HCl 50 mM NaCl 150 mM (pH 7.2/HC1 10 N) Tritón X-100 0.1% Se prepara la solución de suministro de TBS (10X) , y se agrega Tritón X-100 al regulador durante la dilución. g. Regulador HNTG: HEPES 20 mM NaCl 150 mM (pH 7.2/HC1 ÍN) Glicerol 10% Tritón X-100 0.2% Se prepara la solución de suministro (5X) , y se guarda a 4°C. h. EDTA/HC1: 0.5 M, pH de 7.0 (NaOH) como un suministro 100X. i. Na3V04: 0.5 M como un suministro 100X, y se guardan las alícuotas a 80°C. j. Na4P207: 0.2 M como un suministro 100X. k. Factor de crecimiento de tipo insulina-1 de Promega (Cat# G5111) . 1. Antisuero anti-fosfotirosina policlonal de conejo. m. IgG de cabra anti-conejo, conjugado POD (anticuerpo de detección) , Tago (Cat. No. 4520, Lote No. 1802) : Tago, Inc., Burlingame, CA. n. Solución ABTS (ácido 2 , 2 ' -azinobis (3-etilbenzotiazolinsulfónico) ) . Acido cítrico 100 mM Na2HP04 250 mM (pH 4.0/1 N HCl) ABTS 0.5 mg/ml La solución ABTS se debe mantener en la oscuridad y a 4°C. La solución se debe desechar cuando se haga verde . o. Peróxido de hidrógeno: la solución al 30 por ciento se mantiene en la oscuridad y a 4°C. Procedimiento Todos los siguientes pasos se conducen a temperatura ambiente, a menos que se indique especí icamente de otra manera. Todos los lavados de placa ELISA se realizan enjuagando la placa con agua del grifo tres veces, seguido por un enjuague con TBST. Se seca la placa con toallas de papel. Siembra Celular: Las células, cultivadas en un plato de cultivo de tejido (Corning 25020-100) hasta una confluencia del 80 al 90 por ciento, se cosechan con tripsina-EDTA (0.25 por ciento, 0.5 mililitros/D-100, GIBCO) . 2. Se vuelven a suspender las células en DMEM fresco + FBS al 10 por ciento + L-glutamina 2 mM, y se transfieren a una placa de cultivo de tejido de 96 pozos (Corning, 25806-96) en 20,000 células/pozo (100 microlitros/pozo) . Se incuban durante 1 día, luego se reemplaza el medio por un medio exento de suero (90 microlitros) y se incuban en C02 al 5 por ciento y a 37 °C durante la noche. Recubrimiento y Bloqueo de la Placa ELISA: 1. Se recubre la placa ELISA (Corning 25805-96) con anticuerpo anti-IGF en 0.5 microgramos/pozo en 100 microlitros de PBS cuando menos durante 2 horas. 2. Se remueve la solución de recubrimiento, y se reemplaza con 100 microlitros de regulador de bloqueo, y se agita durante 30 minutos. Se remueve el regulador de bloqueo, y se lava la placa justo antes de agregar el lisado. Procedimientos de Ensayo: 1. Los fármacos se prueban bajo condiciones exentas de suero. 2. Se diluye el suministro de fármaco (en sulfóxido de dimetilo al 100 por ciento) a 1:10 con DMEM en una placa de polipropileno de 96 pozos, y se transfieren 10 microlitros/pozo de esta solución a las células para lograr la dilución final del fármaco de 1:100, y la concentración final de sulfóxido de dimetilo del 1.0 por ciento. Se incuban las células en C02 al 5 por ciento a 37°C durante 2 horas. 3. Se prepara el regulador de lisis celular fresco (HNTG*) HNTG 2 ml EDTA 0.1 ml Na3V04 0.1 ml Na4(P207) 0.1 ml H20 7.3 ml 4. Después de la incubación del fármaco durante dos horas, se transfieren 10 microlitros/pozo de ligando IGF-1 200nM en PBS a las células (la concentración final es de 20 nM) , y se incuban en C02 al 5 por ciento a 37 °C durante 10 minutos. 5. Se remueve el medio, y se agregan 100 microlitros/pozo de HNTG*, y se agitan durante 10 minutos. Se ven las células bajo el microscopio, para ver si están adecuadamente lisadas. 6. Se utiliza una pipeta de 12 canales para raspar las células de la placa, y se homogeneiza el lisado mediante aspiración y dosificación repetidas. Se transfiere todo el lisado a la placa de ELISA recubierta con anticuerpo, y se agita durante 1 hora. 7. Se remueve el lisado, se lava la placa, se transfiere el anti-pTyr (1:3,000 con TBST), 100 microlitros/ pozo, y se agita durante 30 minutos. 8. Se remueve el anti-pTyr, se lava la placa, se transfiere el TAGO (1:3,000 con TBST), 100 microlitros/pozo, y se agita durante 30 minutos. 9. Se remueve el anticuerpo de detección, se lava la placa, y se transfiere el ABTS fresco/H202 (1.2 microlitros de H202 para 10 mililitros de ABTS) , 100 microlitros/pozo a la placa, para iniciar el desarrollo de color. Se mide la OD a 410 nanómetros con una longitud de onda de referencia de 630 nanómetros en el Dynatec MR5000. Ensayo de EGFR La actividad de cinasa receptora de EGF en células genéticamente diseñadas para expresar EGF-R humano, se puede medir como se describe enseguida: Materiales y Reactivos a. Ligando EGF: concentración de suministro = 16.5 µM, EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd., Japón. b. 05-101 (UBI) (un anticuerpo monoclonal que reconoce un dominio extracelular de EGFR) . c. Anticuerpo-antifosfotirosina (anti-Ptyr) (policlonal) . d. Anticuerpo de detección: conjugado de peroxidasa de rábano con IgG de cabra-anti-conejo, TAGO, Inc. , Burlingame, CA. e. Regulador TBST: Tris-Hcl, pH 7 50 mM NaCl 150 mM Tritón X-100 0.1 Suministro de HNTG 5X: HEPES 0.1 M NaCl 0.75 M Glicerol 50 Tritón x-100 1.0% Suministro ABTS: Acido Cítrico 100 M Na3V04 250 Mm HCl, conc. 4.0 pH ABTS* 0.5 mg/ml Se guarda la solución en la. oscuridad a 4°C hasta que se utilice. h. Los reactivos de suministro son: EDTA 100 nM pH 7.0 Na3V04 0.5 M Na4(P207) 0.2 M Procedimiento Pre-recubrimiento de Placa ELISA 1. Se recubren las placas ELISA (Corning, 96 pozos, Catálogo #25805-96) con anticuerpo 05-101 en 0.5 microgramos por pozo en PBS, 150 microlitros de volumen final/pozo, y se almacenan durante la noche a 4°C. Las placas recubiertas son buenas durante hasta 10 días cuando se almacenan a 4°C. 2. En el día de uso, se remueve el regulador de recubrimiento, y se reemplaza con regulador de bloqueo (Leche Seca Descremada Instantánea Carnation al 5 por ciento en PBS) . Se incuba la placa, se agita a temperatura ambiente (de aproximadamente 23 °C a 25°C) durante 30 minutos. Justo antes de usarse, se remueve el regulador de bloqueo y se lava la placa 4 veces con regulador TBST. Células de Siembra 1. Se puede utilizar la línea celular NIH 3T3/C7 (Honegger y colaboradores Cell 51:199-209, 1987) para este ensayo. 2. Se seleccionan platos que tencjan una confluencia del 80 al 90 por ciento para el experimento. Se tripsinizan las células y se detiene la reacción mediante la adición de un medio CS DMEM al 10 por ciento. Se suspenden las células en un medio DMEM (medio CS DMEM al 10 por ciento) , y se centrifugan una vez a 1,000 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos. 3. Se vuelven a suspender las células en el medio de siembra (DMEM, suero bovino al 0.5 por ciento) , y se cuentan las células utilizando azul de tripano. La viabilidad arriba del 90 por ciento es aceptable. Se siembran las células en el medio DMEM (suero bovino al 0.5 por ciento) en una densidad de 10,000 células por pozo, 100 microlitros por pozo, en una placa de microtitulación de 96 pozos. Se incuban las células sembradas en C02 al 5 por ciento a 37°C durante aproximadamente 40 horas.

Procedimientos de Ensayo 1. Se verifican las células sembradas para determinar la contaminación utilizando un microscopio invertido. Se diluye el suministro de los compuestos de prueba (10 miligramos/mililitro en sulfóxido de dimetilo) a 1:10 en un medio DMEM, luego se transfieren 5 microlitros a un pozo de ensayo para probar una dilución de los compuestos y el fármaco de 1:200, y una concentración final de sulfóxido de dimetilo del 1 por ciento. Los pozos de control reciben solamente sulfóxido de dimetilo. Se incuba en C02 al 5 por ciento a 37 °C durante 1 hora. 2. Se prepara el ligando IGF: se diluye el EGF de suministro en DMEM, de tal manera que después de transferir 10 microlitros de EGF diluido (dilución de 1:12), se alcanza una concentración final de 25 nM. 3. Se preparan 10 mililitros de HNTG* fresco suficiente para 100 microlitros por pozo, en donde HNTG* comprende: suministro de HNTG (2.0 .mililitros), Milli-Q H20 (7.3 mililitros), EDTA, 100 mM, pH de 7.0 (0.5 mililitros), Na3V04 0.5 M (0.1 mililitros) y Na4(P207), 0.2 M (0.1 mililitros) . 4. Se coloca sobre hielo. 5. Después de dos horas de incubación con el fármaco, se agrega el ligando EGF preparado a las células, 10 microlitros por pozo, para producir una concentración final de y se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos. 6. Se remueve el compuesto de prueba, EGF, y la DMEM. Se lavan las células dos veces con PBS. Se transfiere el HNTG* a las células, 100 microlitros por pozo. Se coloca sobre hielo durante 5 minutos. Mientras tanto, se remueve el regulador de bloqueo de otra placa ELISA, y se lava con TBST como se describió ante.riormente. 7. Con una punta de pipeta seguramente adaptada a un micropipetador, se raspan las células de la placa, y se homogeneiza el material celular aspirando y dosificando repetidamente el regulador de lisis HNTG*. Se transfiere el lisado a una placa ELISA recubierta, bloqueada y lavada. Se incuba agitando a temperatura ambiente durante 1 hora. 8. Se remueve el lisado y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere el anticuerpo anti-Ptyr recién diluido a la placa ELISA en 100 microlitros por pozo. Se incuba agitando a temperatura ambiente durante 30 minutos en la presencia del antisuero anti-Ptyr (dilución de 1:3000 en TBST). 9. Se remueve el anticuerpo anti-Ptyr y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere el anticuerpo de IgG TAGO 30 anti-conejo recién diluido a la placa ELISA en 100 microlitros por pozo. Se incuba agitando a temperatura ambiente durante 30 minutos (anticuerpo IgG anti-conejo: dilución de 1:3000 en TBST) . 10. Se remueve el anticuerpo de detección y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere la solución de ABTS/H202 recién preparada a la placa ELISA, 100 microlitros por pozo. Se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos. Solución de ABTS/H202: 1.2 microlitros de H202 al 30 por ciento en 10 mililitros de suministro ABTS. 11. Se detiene la reacción mediante la adición de 50 microlitros de H2S045N (opcional) , y se determina la O.D. a 410 nanómetros . 12. La máxima señal de fosfotirosina se determina sustrayendo el valor de los controles negativos a partir de los controles positivos. Entonces se calcula el porcentaje de inhibición del contenido de fosfotirosina para los pozos que contienen extracto, después de la sustracción de los controles negativos. Ensayo de Autofosforilación de Met Este ensayo determina la actividad de cinasa de tirosina Met mediante el análisis de los niveles de cinasa de proteína tirosina Met sobre el receptor de Met. Reactivos a. HNTG (solución de suministro 5X) : Se disuelven 23.83 gramos de HEPES y 43.83 gramos de NaCl en aproximadamente 350 mililitros de dH20. Se ajusta el pH a 7.2 con HCl ó NaOH, se agregan 500 mililitros de glicerol y 10 mililitros de Tritón X-100, se mezclan, se agrega dH20 hasta 1 litro de volumen total. Para hacer 1 litro de solución de trabajo IX, se agregan 200 mililitros de solución de suministro 5X a 800 mililitros de dH20, se verifica y se ajusta el pH como sea necesario, y se almacena 4°C. b. PBS (Solución Regulada con Fosfato de Dulbecco) , Gibco, Catálogo # 450-1300EB (solución IX) . c. Regulador de Bloqueo: en 500 mililitros de dH20, se colocan 100 gramos de BSA, 12.1 gramos de Tris-pH de 7.5, 58.44 gramos de NaCl, y 10 mililitros de Tween-20, y se diluyen hasta 1 litro de volumen total. d. Regulador de Cinasa: A 500 mililitros de dH20 se les agregan 12.1 gramos de TRIS (pH de 7.2), 58.4 gramos de NaCl, 40.7 gramos de MgCl2, y 1.9 gramos de EGTA, y se lleva hasta un volumen total de 1 litro con dH20. e. PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo) , Sigma, Número de Catálogo # P-7626, hasta 435.5 miligramos, se agrega etanol al 100 por ciento hasta un volumen total de 25 mililitros, se pone en vórtex. f . ATP (Fuente Bacteriana) , Sigma, Catálogo # A-7699, se almacena el polvo a -20°C, para, reconstituir la solución para su uso, se disuelven 3.31 miligramos en 1 mililitro de dH20. g. Anti-fosfotirosina conjugada con RC-20H HRPO, Tansduction Laboratories, Catálogo # E120H. h. Pierce l-StepMR Turbo TMB-ELISA (3, 3', 5,5'-tetrametilbencidina, Pierce, Catálogo # 34022) . i. H2S04, se agrega 1 mililitro concentrado (18 N) a 35 mililitros de dH20. J. TRIS HCl, Fischer, Catálogo # BP152-5, a 121.14 gramos del material, se les agregan 600 mililitros de MilliQ H20, se ajusta el pH a 7.5 (ó a 7.2) con HCl, y se lleva el volumen hasta 1 litro con MilliQ H20. k. NaCl, Fischer, Catálogo # S271-10, se forma una solución 5M. 1. Tween-20, Fischer, Catálogo # S337-500. m. Na3V04, Fischer, Catálogo # S454-50, a 1.8 gramos del material se les agregan 8 mililitros de MilliQ H20, se ajusta el pH a 10.0 con HCl ó NaOH, se hierve en microondas, se enfría, se verifica el pH, se repite el procedimiento hasta alcanzar un pH estable en 10.0, se agrega MilliQ H20 hasta un volumen total de 100 mililitros, se hacen alícuotas de 1 mililitro, y se almacenan a -80°C. n. MgCl2, Fischer, Catálogo # M33-500, se forma una solución 1 M. o. HEPES, Fischer, Catálogo # BP310-500, a 200 mililitros de MilliQ H20, se les agregan 59.6 gramos del material, se ajusta el pH a 7.5, se lleva el. volumen hasta un total de 250 mililitros, se filtra estéril. p. Albúmina, Bovina (BSA) , Sigma, Catálogo # A- 4503, a 30 gramos del material se les agrega agua destilada estéril para llevar el volumen total a 300 mililitros, y se almacena a 4°C. q. Regulador TBST: a aproximadamente 900 mililitros de dH20 en un cilindro graduado de 1 litro, se les agregan 6.057 gramos de TRIS y 8.766 gramos de NaCl; cuando se disuelven, se ajusta el pH a 7.2 con HCl, se agrega 1 mililitro de Tritón X-100, y se lleva hasta un volumen total de 1 litro con dH20. r. IgG de cabra anti-conejo purificada por afinidad (molécula entera), Cappel, Catálogo # 55641. s. Anticuerpo IgG policlonal de conejo anti-h-Met (C-28) , Santa Cruz Chemical, Catálogo # SC-161. t. Células quiméricas EGFR/Met transfectadas transitoriamente (EMR) (Komada y colaboradores Oncogene, 8:2381-2390 (1993) . u. Regulador de Carbonato de Sodio (Na2C04, Fischer, Catálogo # S495) : a 10.6 gramos del material, se les agregan 800 mililitros de MilliQ H20; cuando se disuelven, se ajusta el pH a 9.6 con NaOH, se lleva hasta un volumen total de 1 litro con MilliQ H20, se filtra, y se almacena a 4°C. Procedimiento Todos los siguientes pasos se conducen a temperatura ambiente, a menos que se indique específicamente de otra manera. Todo el lavado de placa ELISA es enjuagando cuatro veces con TBST.

Lisis de EMR Este procedimiento se puede realizar la noche anterior ó inmediatamente antes del inicio de la captura del receptor. 1. Se descongelan rápidamente los lisados en un baño de agua a 37 °C con un movimiento oscilatorio, hasta que desaparezcan los últimos cristales. 2. Se lisa el granulo celular con HNTG IX conteniendo PMSF lmM. Se utilizan 3 mililitros de HNTG por plato de 15 centímetros de células. Se agrega la mitad del volumen calculado de HNTG, se pone en vórtice el tubo durante 1 minuto, se agrega la cantidad restante de HNTG, se pone en vórtice durante otro minuto. 3. Se equilibran los tubos, se centrifugan a 10,000 x g durante 10 minutos a 4°C. 4. Se agrupan los sobrenadantes, se remueve una alícuota para la determinación de la proteína. 5. Se congela rápidamente la muestra agrupada en un baño de hielo seco/etanol. Este paso se realiza independientemente de si se va a almacenar el lisado durante la noche, ó si se va a utilizar inmediatamente enseguida de la determinación de la proteína. 6. Se realiza la determinación de la proteína utilizando el método de ácido bicinconínico estándar (BCA) (Estuche de Reactivo de Ensayo BCA de Pierce Chemical, Catálogo # 23225) . Procedimiento ELISA 1. Se recubren las placas ELISA Corning de 96 pozos con 5 microgramos por pozo de anticuerpo de cabra anti-conejo en regulador de carbonato para un volumen total del pozo de 50 microlitros. Se almacenan durante la noche a 4°C. 2. Se remueve el anticuerpo de cabra anti-conejo no enlazado, invirtiendo la placa para remover el líquido. 3. Se agregan 150 microlitros de regulador de bloqueo a cada pozo. Se incuban durante 30 minutos con agitación. 4. Se lava 4 veces con TBST. Se seca la placa con toalla de papel para remover el exceso de líquido y las burbujas. 5. Se agrega 1 microgramo por pozo de anticuerpo de conejo anti-Met diluido en TBST para un volumen total del pozo de 100 microlitros. 6. Se diluye el lisado en HNTG (90 microgramos del lisado/100 microlitros) . 7. Se agregan 100 microlitros de lisado diluido a cada pozo. Se agita durante 60 minutos. 8. Se lava 4 veces con TBST. Se seca con toalla de papel para remover el exceso de líquido y las burbujas. 9. Se agregan 50 microlitros de regulador de lisado IX por pozo.

. Se diluyen los compuestos/extractos a 1:10 en regulador de cinasa IX en una placa de polipropileno de 96 pozos. 11. Se transfieren 5.5 microlitros del compuesto diluido a los pozos de la placa ELISA. Se incuban a temperatura ambiente con agitación durante 20 minutos. 12. Se agregan 5.5 microlitros de solución ATP 60 µM por pozo. Los controles negativos no reciben ATP. Se incuban durante 90 minutos, con agitación. 13. Se lava 4 veces con TBST. Se seca la placa con toalla de papel para remover el exceso de líquido y las burbujas. 14. Se agregan 100 microlitros por pozo de RC20 (dilución de 1:3000 en regulador de bloqueo). Se incuban durante 30 minutos con agitación) . 15. Se lava 4 veces con TBST. Se seca la placa con toalla de papel para remover el exceso de líquido y las burbujas. 16. Se agregan 100 microlitros por pozo de Turbo-TMB. Se incuba con agitación durante 30 a 60 minutos. 17. Se agregan 100 microlitros por pozo de H2S04 1M para detener la reacción. 18. Se lee el ensayo en el lector de ELISA Dynatech MR7000. Filtro de prueba = 450 nanómetros, filtro de referencia = 410 nanómetros.

Ensayo Bioquímico de src Este ensayo se utiliza para determinar la actividad de cinasa de proteína src, midiendo la fosforilación de un péptido biotinilado como la lectura. Materiales y Reactivos: a. Levadura transformada con src (Sugen, Inc., Redwood City, California) . b. Lisados celulares: Las células de levadura que expresan src se granulan, se lavan una vez con agua, se vuelven a granular, y se almacenan a -80 °C hasta usarse. c. Se prepara EEEYEEYEEEYEEEYEEEY biotinilada del término N mediante procedimientos convencionales bien conocidos por los expertos en este campo. d. Sulfóxido de dimetilo: Sigma, St. Louis, MO. e. Placa ELISA de 96 pozos: Plcica Corning de 96 pozos de fácil lavado, fondo plano modificado, Corning, Catálogo # 25805-96. f. Placa de polipropileno de fondo V NUNC de 96 pozos para la dilución de los compuestos: Applied Scientific, Catálogo # A-72092. g. Reactivo de Vecastaína ÉLITE ABC: Vector, Burlingame, CA. h. Anti-src (327) mab: Se utiliza Schizosaccharo-myces Pombe para expresar la Src recombinante (Superti-Furga y colaboradores, EMBO J. , 12:2625-2634, Superti-Furga y colaboradores, Nature Biochem.. 14:600-605). Se cultiva la S . Pombe cepa SP200 (h-s leul.32 ura4 ade210) como se describe, y se hacen las transformaciones de los plásmidos de expresión pRSP mediante el método de acetato de litio (Superti-Furga, supra) . Las células se cultivan en la presencia de tiamina 1 µM para reprimir la expresión desde el promotor nmtl, ó en ausencia de tiamina para inducir la expresión. i. Anti-fosfotirosina monoclonal, UBI 05-321 (se puede utilizar UB40 en su lugar) . j. Sustrato de peroxidasa turbo TMB-ELISA: Pierce Chemical. Soluciones Reguladoras a. PBS (Suero Regulado con Fosfato de Dulbecco) : GIBCO PBS, GIBCO, Catálogo # 450-1300EB. b. Regulador de Bloqueo: Lecha descremada al 5 por ciento (Carnation) en PBS. c. Regulador de Carbonato: Na2C04 de Fischer, Catálogo # S495, se rellena hasta una solución de suministro 100 nM. d. Regulador de Cinasa: 1.0 mililitros (a partir de una solución de suministro 1M) de MgCl2, 0.2 mililitros (a partir de una solución de suministro 1M) de MnCl2 , 0.2 mililitros (a partir de una solución de suministro 1M) DTT, 5.0 mililitros (a partir de una solución de suministro 1M) de HEPES, 0.1 mililitros de TX-100, se lleva hasta un volumen total de 10 mililitros con MilliQ H20. e. Regulador de Lisis: HEPES 5.0 (a partir de una solución de suministro 1M) , 2.74 mililitros de NaCl (a partir de una solución de suministro 5M) , 10 mililitros de glicerol, 1.0 mililitros de TX-100, 0.4 mililitros de EDTA (a partir de una solución de suministro 100 mM) , 1.0 mililitros de PMSF (a partir de una solución de suministro 100 mM) , 0.1 mililitros de Na3V04 (a partir de una solución de suministro 0.1 M), se lleva hasta un volumen total de 100 mililitros con MilliQ H20. f. ATP: Sigma, Catálogo # A-7699, se rellena hasta una solución de suministro 10 mM (5.51 miligramos/mililitro). f. TRIS-HC1: Fischer, Catálogo # BP 152-5, a 660 mililitros de MilliQ H20 se les agregan 121.14 gramos del material, se ajusta el pH a 7.5 con HCl, y se lleva hasta un volumen total de 1 litro con MilliQ H20. h. NaCl: Fischer, Catálogo # S271-10, se rellena hasta una solución de suministro 5M con MilliQ H20. i. Na3V04: Fischer, Catálogo # S454-50, a 80 mililitros de MilliQ H20, se les agregan 1.8 gramos del material, se ajusta el pH a 10.0 con HCl ó NaOH, se hierve en microondas, se enfría, se verifica el pH, se repite el ajuste del pH, hasta que el pH permanezca estable después del ciclo de calentamiento/enfriamiento, se lleva hasta un volumen total de 100 mililitros con MilliQ H20, se forman alícuotas de 1 mililitro, y se almacenan a -80°C. j. MgCl2: Fischer, Catálogo # M33-500, se rellena hasta una solución de suministro 1M con MilliQ H20. k. HEPES: Fischer, Catálogo # BP 310-500, a 200 mililitros de MilliQ H20, se les agregan 59.6 gramos del material, se ajusta el pH a 7.5, se lleva hasta un volumen total de 250 mililitros con MilliQ H20, se filtra estéril (solución de suministro 1M) . 1. Regulador TBST: A 900 mililitros de dH20 se les agregan 6.057 gramos de TRIS y 8.766 gramos de NaCl, se ajusta el pH a 7.2 con HCl, se agrega 1 mililitro de Tritón X-100, se lleva hasta un volumen total de 1 litro con dH20. m. MnCl2: Fischer, Catálogo # M87-100, se lleva hasta una solución de suministro 1M con MilliQ H20. n. DTT: Fischer, Catálogo # BP172-5. o. TBS (Suero Regulado con TRIS) : a 900 mililitros de MilliQ H20 se les agregan 6.057 gramos de TRIS y 8.777 gramos de NaCl, se lleva hasta un volumen total de 1 litro con MilliQ H20. p. Mezcla de Reacción de Cinasa: Cantidad por placa de ensayo (100 pozos): 1.0 mililitros de Recfulador de Cinasa, 200 microgramos de GST- , se lleva hasta un volumen final de 8.0 mililitros con MilliQ H20. q. EEEYEEYEEEYEEEYEEEY marcada con biotina: Se forma la solución de suministro del péptido (1 mM, 2.98 miligramos/mililitro en agua fresca justo antes de usarse. r. Reactivo de vectastaína ÉLITE ABC: Para preparar 14 mililitros de reactivo de trabajo, se agrega 1 gota de reactivo a 15 mililitros de TBST, y se invierte el tubo varias veces para que se mezclen. Luego se agrega 1 gota del reactivo B. Se pone el tubo en un agitador orbital a temperatura ambiente, y se mezcla durante 30 minutos. Procedimientos: Preparación de placa ELISA recubierta con src 1. Se recubre la placa ELISA con 0.5 microgramos/pozo de anticuerpo monoclonal anti-src en 100 microlitros de regulador de carbonato de sodio a un pH de 9.6, y se mantiene a 4°C durante la noche. 2. Se lavan los pozos una vez con PBS. 3. Se bloquea la placa con 0.15 mililitros de leche al 5 por ciento en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. 4. Se lava la placa 5 veces con PBS. 5. Se agregan 10 microlitros/pozo de lisados de levadura transformados con src diluidos en regulador de lisis (volumen total de 0.1 mililitros por pozo). (La cantidad del lisado puede variar entre los lotes) . Se agita la placa durante 20 minutos a temperatura ambiente. Preparación de placa ELISA recubierta con anticuerpo de fosfotirosina. 1. Placa 4G10: se recubren 0.5 microgramos/pozo de 4G10 en 100 microlitros de PBS durante la noche a 4°C, y se bloquean con 150 microlitros de leche al 5 por ciento en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Procedimiento de ensayo de cinasa 1. Se remueven las proteínas no enlazadas de las placas, y se lavan las placas 5 veces con PBS. 2. Se agregan 0.08 mililitros de mezcla de reacción de cinasa por pozo (conteniendo 10 microlitros de regulador de cinasa 10X) , y biotina-EEEYEEYEEEYEEEYEEEY 10 µM (concentración final) por pozo, diluida en agua. 3. Se agregan 10 microlitros del compuesto diluido en agua que contiene sulfóxido de dimetilo al 10 por ciento, y se incuba previamente durante 15 minutos a temperatura ambiente. 4. Se inicia la reacción de cinasa agregando 10 microlitros/pozo de ATP 0.05 mM en agua (ATP 5 µM final). 5. Se agita la placa ELISA durante 15 minutos a temperatura ambiente. 6. Se detiene la reacción de cinasa agregando 10 microlitros de EDTA 0.5 M por pozo. 7. Se transfieren 90 microlitros de sobrenadante a una placa ELISA recubierta con 4G10 bloqueada. 8. Se incuba durante 30 minutos con agitación a temperatura ambiente. 9. Se lava la placa 5 veces con TBST.

. Se incuba con reactivo de vectastaína ÉLITE ABC (100 microlitros/pozo) durante 30 minutos a temperatura ambiente. 11. Se lavan los pozos 5 veces con TBST. 12. Se desarrolla con Turbo TMB. Ensayo Bioquímico de lck Este ensayo se utiliza para determinar las actividades de cinasa de proteína lck, midiendo la fosforilación de GST- como la lectura. Materiales y Reactivos: a. Se utiliza levadura transformada con lck de Schizosaccharomyces Pombe , para expresar la Lck recombinante (Superti-Furga, y colaboradores, EMBO J, 12:2625-2634, Superti-Furga, y colaboradores, Nature Biotech. , 14:600-605). Se cultiva la S . Pombe , cepa SP200 (h-s leul.32 ura4 ade210) como se describe, y se hacen las transformaciones con los plásmidos de expresión pRSP mediante el método de acetato de litio (Superti-Furga, supra) . Las células se cultivan en la presencia de tiamina 1 µM para inducir la expresión. b. Lisados celulares: Las células de levadura que expresan lck se granulan, se lavan una vez en agua, se vuelven a granular, y se almacenan congeladas a -80°C hasta usarse. c. GST- : ADN que codifica para la proteína de fusión GST-C para la expresión en bacterias, obtenido de Arthur Weiss del Instituto Médico Howard Hughes en la Universidad de California, San Francisco. Las bacterias transformadas se cultivan durante la noche con agitación a 25°C. El GST-f se purifica mediante cromatografía por afinidad de glutationa, Pharmacia, Alameda, CA. d. Sulfóxido de dimetilo: Sigma, St. Louis, MO. e. Placa ELISA de 96 pozos: Placa Corning de 96 pozos, de fácil lavado, fondo plano modificado, Corning, Catálogo # 25805-96. f . Placas de polipropileno de fondo en V NUNC de 96 pozos para la dilución de los compuestos: Applied Scientific, Catálogo # AS-72092. g. Antisuero de conejo anti-GST purificado: Amrad Corporation (Australia), Catálogo # 90001605. h. IgG de cabra anti-conejo-HRP: Amersham, Catálogo # V010301. i. IgG de oveja anti-ratón (H+L) : Jackson Labs., Catálogo # 5215-005-003. j. Anticuerpo monoclonal anti-Lck (3A5) : Santa Cruz Biotechnology, Catálogo # sc-433. k. UBI 05-321 monoclonal anti-fosfotirosina (en su lugar se puede utilizar UB40) . Soluciones reguladoras: a. PBS (Suero Regulado con Fosfato de Dulbecco) solución IX: GIBCO PBS, GIBCO, Catálogo # 450-1300EB. b. Regulador de Bloqueo: 100 gramos de BSA, 12.1 gramos de TRIS (ph de 7.5), 58.44 gramos de NaCl, 10 mililitros de Tween-20, se lleva hasta un volumen total de 1 litro con MilliQ H20: c. Regulador de Carbonato: Na2C04 de Fischer, Catálogo # S495, se lleva hasta una solución 100 mM con MilliQ H2?. d. Regulador de Cinasa: 1.0 mililitros (a partir de una solución de suministro 1M) de MgCl2, 0.2 mililitros (a partir de una solución de suministro 1M) de MnCl2, 0.2 mililitros (a partir de una solución de suministro 1M) de DTT, 5.0 mililitros (a partir de una solución de suministro 1M) de HEPES, 0.1 mililitros de TX-100, se lleva hasta un volumen total de 10 mililitros con MilliQ H20. e. Regulador de Lisis: HEPES 5.0 (a partir de una solución de suministro 1M) , 2.74 mililitros de NaCl (a partir de una solución de suministro 5M) , 10 mililitros de glicerol, 1.0 mililitros de TX-100, 0.4 mililitros de EDTA (a partir de una solución de suministro 100 mM) , 1.0 mililitros de PMSF (a partir de una solución de suministro 100 mM) , 01 mililitros de Na3V04 (a partir de una solución de suministro 0.1 M) , se lleva hasta un volumen total de 100 mililitros con MilliQ H20. f. ATP: Sigma, Catálogo # A-7699, se lleva hasta una solución de suministro 10 mM (5.51 miligramos/mililitro). g. TRIS-HC1: Fischer, Catálogo # BP 152-5, a 600 mililitros de MilliQ H20, se les agregan 121.14 gramos del material, se ajusta el pH a 7.5 con HCl, se lleva hasta un volumen total de 1 litro con MilliQ H20. h. NaCl: Fischer, Catálogo # S271-10, se lleva hasta una solución de suministro 5M con MilliQ H20. i. Na3V04: Fischer, Catálogo # S454-50, a 80 mililitros de MilliQ H20, se les agregan 1.8 gramos del material, se ajusta el pH a 10.0 con HCl ó NaOH, se hierve en microondas, se enfría, se verifica el pH, se repite el ajuste del pH hasta que el pH permanezca estable después del ciclo de calentamiento/enfriamiento, se lleva hasta un volumen total de 100 mililitros con MilliQ H20, se hacen alícuotas de 1 mililitro, y se almacenan a -80°C. j. MgCl2: Fischer, Catálogo # M33-500, se lleva hasta una solución de suministro 1M con MilliQ H20. k. HEPES: Fischer, Catálogo # BP 310-500, a 200 mililitros de MilliQ H20, se les agregan 59.6 gramos del material, se ajusta el pH a 7.5, se lleva hasta un volumen total de 250 mililitros con MilliQ H0, se filtra estéril (solución de suministro 1M) . 1. Albúmina, Bovina (BSA), Sigma, Catálogo # A4503 , a 150 mililitros de MilliQ H20, se les agregan 30 gramos del material, se lleva hasta un volumen total de 300 mililitros con MilliQ H20, se filtra a través de un filtro de 0.22 mieras, se almacena a 4°C. m. Regulador TBST: A 900 mililitros de dH20 se les agregan 6.057 gramos de TRIS y 8.766 gramos de NaCl, se ajusta el pH a 7.2 con HCl, se agrega 1 mililitro de Tritón X-100, se lleva hasta un volumen total de 1 litro con dH20. n. MnC12: Fischer, Catálogo # M87-100, se lleva hasta una solución de suministro 1M con MilliQ H20. 0. DTT: Fischer, Catálogo # BP172-5. p. TBS (Suero Regulado con TRIS) : a 900 mililitros de MilliQ H20 se les agregan 6.057 gramos de TRIS y 8.777 gramos de NaCl, se lleva hasta un volumen total de 1 litro con MilliQ H20. q. Mezcla de Reacción de Cinasa: Cantidad por placa de ensayo (100 pozos): 1.0 mililitros de regulador de cinasa, 200 microgramos de GST-C , se lleva hasta un volumen final de 8.0 mililitros con MilliQ H20. Procedimientos: Preparación de placa ELISA recubierta con Lck 1. Se aplican 2.0 microgramos/pozo de IgG de oveja anti-ratón en 100 microlitros de regulador de carbonato de sodio con un pH de 9.6 a 4°C durante la noche. 2. Se lava bien una vez con PBS. 3. Se bloquea la placa con 0.15 mililitros de regulador de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente. 4. Se lava la placa 5 veces con PBS: 5. Se agregan 0.5 microgramos/pozo de anti-lck (mab 3A5) en 0.1 mililitros de PBS a temperatura ambiente durante 1 a 2 horas. 6. Se lava la placa 5 veces con PBS. 7. Se agregan 20 microgramos/pozo de lisados de levadura transformados con lck diluidos en regulador de lisis (volumen total de 0.1 mililitros por pozo). Se agita la placa a 4°C durante la noche para prevenir la pérdida de actividad. Preparación de la placa ELISA recubierta con anticuerpo de fosfotirosina. 1. Placa UB40: 1.0 microgramos/pozo de UB40 en 100 microlitros de PBS durante la noche a 4°C, y se bloquea con 150 microlitros de regulador de bloqueo durante cuando menos 1 hora. Procedimiento de ensayo de cinasa 1. Se remueven las proteínas no enlazadas de las placas, y se lavan las placas 5 veces con PBS. 2. Se agregan 0.8 mililitros de mezcla de reacción de cinasa por pozo (conteniendo 10 microlitros de regulador de cinasa 10X, y 2 microgramos de GST-C por pozo diluido con agua) . 3. Se agregan 10 microlitros del compuesto diluido en agua conteniendo sulfóxido de dimetilo al. 10 por ciento, y se incuba previamente durante 15 minutos a temperatura ambiente. 4. Se inicia la reacción de cinasa agregando 10 microlitros/pozo de ATP 0.1 mM en agua (ATP 10 µM final).

. Se agita la placa ELISA durante 60 minutos a temperatura ambiente. 6. Se detiene la reacción de cinasa agregando 10 mililitros de EDTA 0.5 M por pozo. 7. Se transfieren 90 mililitros del sobrenadante a una placa ELISA recubierta con 4G10 bloqueada de las sección B anterior. 8. Se incuba con agitación durante 30 minutos a temperatura ambiente. 9. Se lava la placa 5 veces con TBST. 10. Se incuba con anticuerpo de conejo anti-GST en una dilución de 1:5000 en 100 microlitros de TBST durante 30 minutos a temperatura ambiente. 11. Se lavan los pozos 5 veces con TBST. 12. Se incuba con IgG de cabra anti-conejo-HRP en una dilución de 1:20,000 en 100 microlitros de TBST durante 30 minutos a temperatura ambiente. 13. Se lavan los pozos 5 veces con TBST. 14. Se desarrolla con Turbo TMB. Ensayo aue mide la función fosforilante de RAF El siguiente ensayo reporta la cantidad de fosforilación catalizada por RAF de su proteína blanco MEK, así como la MAPK blanco de la MEK. La secuencia del gen RAF se describe en Bonner y colaboradores, 1985, Molec. Cell. Biol., 5:1400-1407, y está fácilmente accesible en múltiples bancos de datos de secuencias genéticas. La construcción del vector de ácido nucleico y de las líneas celulares utilizadas para esta porción de la invención, se describen completamente en Morrison y colaboradores, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 85:8855-8859. Materiales y Reactivos 1. Células Sf9 (Spodoptera frugiperda ) , GIBO-BRL, Gaithersburg, MD. 2. Regulador RIPA: Tris 20 M/HCl, pH de 7.4, NaCl 137 mM, glicerol al 10 por ciento, PMSF 1 mM, 5 miligramos/litro de proteína A, Tritón X-100 al 0.5 por ciento. 3. Proteína de fusión de tiorredoxina-MEK (T-MEK) : Se realiza la expresión y purificación de T-MEK mediante cromatografía por afinidad de acuerdo con los procedimientos del fabricante. Catálogo # 350-01 y R 350-40, Invitrogen Corp., San Diego, CA. 4. His-MAPK (ERK 2): La MAP marcada con His se expresa en células XLl Blue transformadas con el vector pUC18 que codifica His-MAPK. La His-MAPK se purifica mediante cromatografía por afinidad de Ni. Catálogo # 27-4949-01, Pharmacia, Alameda, CA, como se describe en la presente. 5. IgG de oveja anti-ratón: Jackson Laboratories, West Grove, PA, Catálogo # 515-006-008, Lote # 28563. 6. Anticuerpo específico de cinasa de proteína RAF-1: URP2653 de UBI. 7. Regulador de recubrimiento: P.BS, suero regulado con fosfato, GIBO-BRL, Gaithersburg, MD. 8. Regulador de lavado: TBST (Tris 50 M/HCl, pH de 7.2, NaCl 150 mM, Tritón X-100 al 0.1 por ciento). 9. Regulador de bloqueo: TBST, etanolamina al 0.1 por ciento, pH de 7.4. 10. Sulfóxido de dimetilo: Sigma, St. Louis, MO. 11. Regulador de cinasa (KB) : HEPES 20 mM/HCl, pH de 7.2, NaCl 150 mM, Tritón X-100 al 0.1 por ciento, PMSF 1 mM, 5 miligramos/litro de proteína A, ortovanadato de sodio 75 mM, DTT 0.5 mM y MgCl2 10 mM. 12. Mezcla de ATP: MgCl2 100 mM, ATP 300 mM, 10 mCi V33P ATP (Dupont-NEN) /mililitro. 13. Solución de paro: ácido fosfórico al 1 por ciento, Fisher, Pittsburg, PA. 14. Esteras de Filtro de Fosfato de Celulosa Wallac, Wallac, Truku, Finlandia. 15. Solución de lavado de filtro: ácido fosfórico al 1 por ciento, Fisher, Pittsburg, PA. 16. Cosechador de placas Tomtec, Wallac, Turku, Finlandia. 17. Lector de placas beta Wallac # 1205, Wallac, Turku, Finlandia. 18. Placas de polipropileno de fondo en V NUNC de 96 pozos para los compuestos, Applied Scientific, Catálogo # AS- 72092. Procedimiento Todos los siguientes pasos se conducen a temperatura ambiente, a menos que se indique específicamente de otra manera. 1. Recubrimiento de placa ELISA: Los pozos ELISA se recubren con 100 mililitros de antisuero purificado por afinidad de oveja anti-ratón (1 miligramo/100 mililitros de regulador de recubrimiento) durante la noche a 4°C. Las placas ELISA se pueden utilizar durante dos semanas cuando se almacenan a 4°C. 2. Se invierte la placa y se remueve el líquido. Se agregan 100 mililitros de solución de bloqueo, y se incuban durante 30 minutos. 3. Se remueve la solución de bloqueo, y se lava 4 veces con regulador de lavado. Se seca la placa con toalla de papel para remover el exceso de líquido. 4. Se agrega 1 miligramo de anticuerpo específico para RAF-1 a cada pozo, y se incuba durante 1 hora. Se lava como se describe en el Paso 3. 5. Se descongelan los lisados a partir de las células Sf9 infectadas con RAS/RAF, y se diluyen con TBST hasta 10 miligramos/ 100 mililitros. Se agregan 10 miligramos de lisado diluido a los pozos, y se incuban durante 1 hora. Se agita la placa durante la incubación. Los controles negativos no reciben lisado. Los lisados de las células de insecto Sf9 infectadas con RAS/RAF se preparan después de que se infectan las células con baculovirus recombinantes en una MOI de 5 para cada virus, y se cosechan 48 horas después. Las células se lavan una vez con PBS, y se lisan en regulador RIPA. El material insoluble se remueve mediante centrifugación (5 minutos a 10,000 x g) . Las alícuotas de los lisados se congelan en hielo seco/etanol, y se almacena a -80°C hasta utilizarse. 6. Se remueve el material no enlazado, y se lava como se ilustró anteriormente (Paso 3) . 7. Se agregan 2 miligramos de T-MEK y 2 miligramos de His-MAEPK por pozo, y se ajusta el volumen a 40 mililitros con regulador de cinasa. Los métodos para purificar T-MEK y MAPK a partir de los extractos celulares se proporcionan en la presente como ejemplo. 8. Se diluyen previamente los compuestos (solución de suministro de 10 miligramos/mililitro de sulfóxido de dimetilo) , ó los extractos 20 veces en TBST más sulfóxido de dimetilo al 1 por ciento. Se agregan 5 mililitros de los compuestos/extractos previamente diluidos a los pozos descritos en el Paso 6. Se incuban durante 20 minutos. Los controles no reciben fármaco. 9. Se inicia la reacción de cinasa mediante la adición de 5 mililitro de mezcla de ATP, se agitan las placas sobre un agitador de placas ELISA durante la incubación.

. Se detiene la reacción de cinasa después de 60 minutos mediante la adición 30 mililitros de solución de paro a cada pozo. 11. Se coloca la estera de fosfocelulosa y la placa ELISA en el cosechador de placas Tomtec. Se cosecha y se lava el filtro con la solución de lavado de filtro de acuerdo con la recomendación del fabricante. Se secan las esteras del filtro. Se sellan las esteras del filtro, y se colocan en el sujetador. Se inserta el sujetador en el aparato de detección radioactiva, y se cuantifica el fósforo radioactivo sobre las esteras del filtro. De una manera alternativa, se pueden transferir alícuotas de 40 mililitros de los pozos individuales de la placa de ensayo a las posiciones correspondientes sobre la estera del filtro de fosfocelulosa. Después de secar con aire los filtros, se ponen los filtros en una charola. Se balancea suavemente la charola, cambiando la solución de lavado a intervalos de 15 minutos durante 1 hora. Se secan con aire las esteras del filtro. Se sellan las esteras del filtro y se colocan en un sujetador adecuado para medir el fósforo radioactivo en las muestras. Se inserta el sujetador en un dispositivo de detección, y se cuantifica el fósforo radioactivo sobre las esteras del filtro. Ensayo de Inhibición de CDK2/Ciclina A Este ensayo analiza la actividad de cinasa de proteína de CDK2 en un sustrato exógeno. Reactivos: A. Regulador A: (Tris 80 mM) (pH de 7.2), MgCl 40 mM) , 4.84 gramos de Tris (F.W. = 121.1 gramos/mol), 4.07 gramos de MgCl2 (F.W. = 203.31 gramos/mol) disueltos en 500 mililitros de H20. Se ajusta el pH a 7.2 con HCl. B. Solución de Histona Hl (0.45 miligramos/ mililitro de Histona Hl) , y HEPES 20 M, pH de 7.2: 5 miligramos de Histona Hl (Boehringer Mannheim) en ll.lll mililitros DE HEPES 20 mM, pH de 7.2 (477 miligramos de HEPES (F.W. = 238.3 gramos/mol) disueltos en 100 mililitros de ddH20, almacenados en alícuotas de 1 mililitro a -80°C. C. Solución de ATP (ATP 60 µM, 300 microgramos/ mililitro de BSA, DTT 3 mM) : 120 microlitros de ATP 10 mM, 600 microlitros de BSA en 10 miligramos/mililitro para 20 mililitros, almacenados en alícuotas de 1 mililitro a -80°C. D. Solución de CDK2 : cdk2/ciclina A en HEPES 10 mM, pH de 7.2, NaCl 25 mM, DTT 0.5 mM, glicerol al 10 por ciento, se almacenan en alícuotas de 9 microlitros a -80°C. Protocolo 1. Se preparan soluciones de inhibidores en tres veces la concentración de ensayo final deseada en ddH20/DMSO al 15 por ciento por volumen. 2. Se dosifican 20 microlitros de inhibidores a los pozos de las placas de polipropileno de 96 pozos (ó 20 microlitros de sulfóxido de dimetilo al 15 por ciento para los controles positivos y negativos) . 3. Se descongela la solución de Histona Hl (1 mililitro/placa) , la solución de ATP (1 mililitro/placa más 1 alícuota para el control negativo) , y la solución de CDK2 (9 microlitros/placa) . Se mantiene la CDK2 sobre hielo hasta que se use. Se hacen alícuotas de la solución de CDK2 apropiadamente para evitar ciclos de congelación-descongelación repetidos. 4. Se diluyen 9 microlitros de solución de CDK2 en 2.1 mililitros de Regulador A (por placa). Se mezclan. Se dosifican 20 microlitros en cada pozo. 5. Se mezcla 1 mililitro de solución de histona Hl con 1 mililitro de solución de ATP (por placa) en un tubo de tapa de rosca de 10 mililitros. Se agrega ?33P ATP hasta una concentración de 0.15 µCi/20 microlitros (0.15 µCi/pozo en el ensayo) . Se mezclan cuidadosamente para evitar que haga espuma la BSA. Se agregan 20 microlitros a los pozos apropiados. Se mezclan las placas en el agitador de placas. Para el control negativo/ se mezcla la solución de ATP con una cantidad igual de HEPES 20 mM, pH de 7.2, y se agrega ? 3P ATP hasta una concentración de 0.15 µCi/20 microlitros de solución. Se agregan 20 microlitros a los pozos apropiados. 6. Se deja que las reacciones procedan durante 60 minutos. 7. Se agregan 35 microlitros de TCA al 10 por ciento a cada pozo. Se mezclan las placas en el agitador de placas. 8. Se ponen 40 microlitros de cada muestra sobre cuadros de estera de filtro P30. Se deja que las esteras se sequen (de aproximadamente 10 a 20 minutos) .. 9. Se lavan las esteras de filtro 4 x 10 minutos con 250 mililitros de ácido fosfórico al 1 por ciento (10 mililitros de ácido fosfórico por litro de ddH20) . 10. Se cuentan las esteras del filtro con el lector de placas beta. Ensayos Celulares/Biológicos Ensavo de Incorporación de BrdU Inducido por PDGF Materiales y Reactivos: (1) PDGF: PDGF B/B humano, 1276-956, Boehringer Mannheim, Alemania. (2) Reactivo Marcador de BrdU: 10 mM, en PBS (pH de 7.4), Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (3) FixDenat: solución de fijación (lista para usarse), Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (4) Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (5) Solución de Sustrato TMB: tetrametilbencidina (TMB), lista para usarse, Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (6) Solución de Lavado de PBS: PBS IX, pH de 7.4 (Sugen, Inc. , Redwood City, California) . (7) Albúmina, Bovina (BSA) : polvo de la fracción V, A-8551, Sigma Chemical Co. , EUA. (8) Línea celular 3T3 genéticamente diseñada para expresar el PDGF-R humano Protocolo (1) Las células se siembran en 8000 células/pozo en DMEM, CS al 10 por ciento, Gln 2 mM, en una placa de 96 pozos.

Las células se incuban durante la noche a 37 °C en C02 al 5 por ciento. (2) Después de 24 horas, las células se lavan con PBS, y luego se les agota el suero, en un medio exento de suero (CS DMEM al 0 por ciento con BSA al 0.1 por ciento) durante 24 horas. (3) En el día 3, se agregan el ligando (PDGF, 3.8 nM, preparado en DMEM con BSA al 0.1 por ciento) y los compuestos de prueba a las células simultáneamente. Los pozos de control negativos reciben DMEM exento de suero con BSA al 0.1 por ciento solamente, y las células de control positivo reciben el ligando (PDGF) , pero ningún compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan en DMEM exento de suero con ligando en una placa de 96 pozos, y se diluyen en serie para 7 concentraciones de prueba. (4) Después de 20 horas de activación del ligando, se agrega el reactivo marcador de BrdU diluido (1:100 en DMEM, BSA al 0.1 por ciento) y las células se incuban con BrdU (concentración final = 10 µM durante 1.5 horas. (5) Después de la incubación con el reactivo marcador, se remueve el medio decantando y dando golpecitos a la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega solución FixDenat (50 microlitros/pozo) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos sobre un agitador de placas. (6) Se remueve completamente la solución FixDenat decantando y dando golpecitos a la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega leche (leche deshidratada al 5 por ciento en PBS, 200 microlitros/pozo) como una solución de bloqueo, y la placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas. (7) La solución de bloqueo se remueve decantando, y los pozos se lavan una vez con PBS. Se agrega solución anti-BrdU-POD (dilución de 1:100 en PBS, BSA al 1 por ciento) (100 microlitros/pozo) , y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas. (8) Se remueve completamente el anticuerpo conjugado decantando y enjuagando los pozos 5 veces con PBS, y la placa se seca invirtiendo y dando golpecitos sobre una toalla de papel. (9) Se agrega la solución de sustrato TMB (100 microlitros/pozo) , y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas, hasta que el desarrollo de color sea suficiente para la detección fotométrica. (10) Se mide la absorbencia de las muestras en 410 nanómetros (en el modo de "longitud de onda doble" con una lectura del filtro a 490 nanómetros, como una longitud de onda de referencia) en un lector de placas ELISA Dynatech. Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por EGF Materiales y Reactivos (1) EGF: EGF de ratón, 201, Toyobo, Co. , Ltd., Japón. (2) Reactivo Marcador BrdU: 10 mM, en PBS (pH de 7.4), Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (3) FixDenat: solución de fijación (lista para usarse), Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (4) Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (5) Solución de Sustrato TMB: tetrametilbencidina (TMB), lista para usarse, Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (6) Solución de Lavado de PBS: PBS IX, pH de 7.4 (Sugen, Inc., Redwood City, California). (7) Albúmina, Bovina (BSA) : polvo de la fracción V, A-8551, Sigma Chemical Co., EUA. (8) Línea celular 3T3 genéticamente diseñada para expresar EGF-R humano. Protocolo (1) Las células se siembran en 8,000 células/pozo en CS al 10 por ciento, Gln 2 mM en DMEM, en una placa de 96 pozos. Las células se incuban durante la noche a 37 °C en C02 al 5 por ciento. (2) Después de 24 horas, las células se lavan con PBS, y luego se les agota el suero en un medio exento de suero (CS DMEM al 0 por ciento con BSA al 0.1 por ciento) durante 24 horas. (3) En el día 3, se agregan el ligando (EGF, 2 nM, preparado en DMEM con BSA al 0.1 por ciento) y los compuestos de prueba a las células simultáneamente. Los pozos de control negativos reciben DMEM exento de suero con BSA al 0.1 por ciento solamente, y las células de control positivo reciben el ligando (EGF) , pero ningún compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan en DMEM exento de suero con ligando en una placa de 96 pozos, y se diluyen en serie para 7 concentraciones de prueba. (4) Después de 20 horas de activación del ligando, se agrega el reactivo marcador BrdU diluido (1:100 en DMEM, BSA al 0.1 por ciento), y las células se incuban con BrdU (concentración final = 10 µM durante 1.5 horas. (5) Después de la incubación con el reactivo marcador, se remueve el medio decantando y dando golpecitos a la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega la solución FixDenat (50 microlitros/pozo) , y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos sobre un agitador de placas. (6) Se remueve completamente la solución FixDenat decantando y dando golpecitos a la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega leche (leche deshidratada al 5 por ciento en PBS, 200 microlitros/pozo) como una solución de bloqueo, y la placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas. (7) Se remueve la solución de bloqueo decantando, y los pozos se lavan una vez con PBS. Se agrega la solución anti-BrdU-POD (dilución de 1:100 en PBS, BSA al 1 por ciento) (100 microlitros/pozo) , y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas. (8) El anticuerpo conjugado se remueve completamente decantando y enjuagando los pozos 5 veces con PBS, y la placa se seca invirtiendo y dando golpecitos sobre una toalla de papel. (9) Se agrega la solución de sustrato TMB (100 microlitros/pozo) , y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas, hasta que el desarrollo de color es suficiente para la detección fotométrica. (10) Se mide la absorbencia de las muestras a 410 nanómetros (en el modo de "longitud de onda doble", con una lectura del filtro a 490 nanómetros, como una longitud de onda de referencia) , en un lector de placas ELISA Dynatech. Incorporación de BrdU Impulsada por Her2 Inducida por EGF Materiales y Reactivos (1) EGF: EGF de ratón, 201, Toyobo, Co., Ltd., Japón. (2) Reactivo Marcador de BrdU: 10 M, en PBS (pH de 7.4), Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (3) FixDenat: solución de fijación (lista para usarse), Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (4) Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (5) Solución de Sustrato TMB: tetrametilbencidina (TMB) , lista para usarse, Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (6) Solución de Lavado de PBS: PBS IX, pH de 7.4, hecha en casa. (7) Albúmina, Bovina (BSA) : polvo de la fracción V, A-8551, Sigma Chemical Co., EUA. (8) Línea celular 3T3 diseñada para expresar un receptor quimérico que tiene el dominio extricelular de EGF-R, y el dominio intracelular de Her2. Protocolo (1) Las células se siembran a 8,000 células/pozo en DMEM, CS al 10 por ciento, Gln 2 mM, en una placa de 96 pozos. Las células se incuban durante la noche a 37 °C en C02 al 5 por ciento. (2) Después de 24 horas, las células se lavan con PBS, y luego se les agota el suero en un medio exento de suero (CS DMEM al 0 por ciento con BSA al 0.1 por ciento) durante 24 horas. (3) En el día 3, se agregan el ligando (EGF = 2 nM, preparado en DMEM con BSA al 0.1 por ciento) y los compuestos de prueba a las células simultáneamente. Los pozos de control negativo reciben DMEM exento de suero con BSA al 0.1 por ciento solamente, y las células de control positivo reciben el ligando (EGF), pero ningún compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan en DMEM exento de suero con ligando en una placa de 96 pozos, y se diluyen en serie para 7 concentraciones de prueba. (4) Después de 20 horas de activación del ligando, se agrega el reactivo marcador BrdU diluido (1:100 en DMEM, BSA al 0.1 por ciento), y las células se incuban con BrdU (concentración final = 10 µM) durante 1.5 horas. (5) Después de la incubación con el reactivo marcador, se remueve el medio decantando y dando golpecitos a la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega la solución FixDenat (50 microlitros/pozo) , y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos sobre un agitador de placas. (6) Se remueve completamente la solución FixDenat decantando y dando golpecitos a la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega leche (leche deshidratada al 5 por ciento en PBS, 200 microlitros/pozo) , como una solución de bloqueo, y la placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas. (7) La solución de bloqueo se remueve decantando, y los pozos se lavan una vez con PBS. Se agrega la solución anti-BrdU-POD (dilución de 1:100 en PBS, BSA al 1 por ciento) (100 microlitros/pozo) , y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas. (8) El anticuerpo conjugado se remueve completamente decantando y enjuagando los pozos 5 veces con PBS, y la placa se seca invirtiendo y dando golpecitos sobre una toalla de papel . (9) Se agrega la solución de sustrato TMB (100 microlitros/pozo) , y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas, hasta que el desarrollo de color es suficiente para la detección fotométrica. (10) Se mide la absorbencia de las muestras a 410 nanómetros (en el modo de "longitud de onda doble", con una lectura del filtro a 490 nanómetros, como una longitud de onda de referencia) , en un lector de placas ELISA Dynatech. Ensavo de Incorporación de BrdU Inducida por IGF1 Materiales y Reactivos (1) Ligando IGF1: humano, recombinante, G511, Promega Corp, EUA. (2) Reactivo Marcador BrdU: 10 mM, en PBS (pH de 7.4), Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (3) FixDenat: solución de fijación (lista para usarse, Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (4) Anti-BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (5) Solución de Sustrato TMB: tetrametilbencidina (TMB), lista para usarse, Catálogo No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (6) Solución de Lavado de PBS: PBS IX, pH de 7.4 (Sugen, Inc., Redwood City, California). (7) Albúmina, Bovina (BSA) : polvo de la fracción V, A-8551, Sigma Chemical Co. , EUA. (8) Línea celular 3T3 genéticamente diseñada para expresar el receptor IGF-1 humano. Protocolo (1) Las células se siembran a 8,000 células/pozo en DMEM, CS al 10 por ciento, Gln 2 mM en una placa de 96 pozos.

Las células se incuban durante la noche a 37 °C en C02 al 5 por ciento. (2) Después de 24 horas, las células se lavan con PBS, y luego se les agota el suero en un medio exento de suero (CS DMEM al 0 por ciento con BSA al 0.1 por ciento) durante 24 horas. (3) En el día 3, se agregan el ligando (IGF1 = 3.3 nM, preparado en DMEM con BSA al 0.1 por ciento), y los compuestos de prueba a las células simultáneamente. Los pozos de control negativos reciben DMEM exento de suero con BSA al 0.1 por ciento solamente, y las células de control positivo reciben el ligando (IGF1) , pero ningún compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan en DMEM exento de suero con ligando en una placa de 96 pozos, y se diluyen en serie para 7 concentraciones de prueba. (4) Después de 16 horas de activéición del ligando, se agrega el reactivo marcador de BrdU diluido (1:100 en DMEM, BSA al 0.1 por ciento), y las células se incuban con BrdU (concentración final = 10 µM) durante 1.5 horas. (5) Después de la incubación con el reactivo marcador, se remueve el medio decantando y dando golpecitos a la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega solución FixDenat (50 microlitros/pozo) , y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos sobre un agitador de placas. (6) La solución FixDenat se remueve completamente decantando y dando golpecitos a la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega leche (leche deshidratada al 5 por ciento en PBS, 200 microlitros/pozo) como una solución de bloqueo, y la placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas. (7) La solución de bloqueo se remueve decantando, y los pozos se lavan una vez con PBS. Se agrega la solución anti-BrdU-POD (dilución a 1:100 en PBS, BSA al 1 por ciento) (100 microlitros/pozo) y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas. (8) El anticuerpo conjugado se remueve completamente decantando y enjuagando los pozos 5 veces con PBS, y la placa se seca invirtiendo y dando golpecitos sobre una toalla de papel. (9) Se agrega la solución de sustrato TMB (100 microlitros/pozo) , y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas, hasta que el desarrollo de color es suficiente para la detección fotométrica. (10) Se mide la absorbencia de las muestras a 410 nanómetros (en el modo de "longitud de onda doble" con una lectura del filtro a 490 nanómetros, como una longitud de onda de referencia) en un lector de placas ELISA Dynatech. Ensayo de Incorporación de BrdU Inducida por FGF Este ensayo mide la síntesis del ADN inducida por FGF en células 3Tc7/EGFr que expresan los receptores de FGF endógenos. Materiales y reactivos: (1) FGF: FGF2/bFGF humano (Gibco BRL, No. 13256-029). 2. Reactivo Marcador BrdU (PBS 10 mM (pH de 7.4), Boehringer Mannheim, Catálogo No. 1 647 229) . 3. Solución de Fijación Fixdenat (Boehringer Mannheim, Catálogo No. 1 647 229) . 4. Anti-BrdU-POD (anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, Boehringer Mannheim, Catálogo No. 1 647 229) . 5. TMB (tetrametilbencidina, Boehringer Mannheim, Catálogo No. 1 647 229) . 6. Solución de Lavado de PBS, pH de 7.4 (Sugen, Inc. ) . 7. Albúmina, bovina (BSA), polvo de la fracción V (Sigma Chemical Co. , Catálogo No. A-8551) . Procedimiento 1. Línea celular diseñada 3T3: 3T3c7/EGFr. 2. Las células se siembran a 8,000 células/pozo en DMEM, CS al 10 por ciento, y Gln 12 mM en una placa de 96 pozos. Se incuban durante 24 horas a 37 °C en C02 al 5 por ciento. 3. Después de 24 horas, se lavan las células con PBS, luego se les agota el suero en un medio exento de suero (DMEM al 0 por ciento, BSA al 0.1 por ciento) durante 24 horas. 4. Se agrega el ligando (FGF2 (1.5 nM en DMEM con BSA al 0.1 por ciento), y el compuesto de prueba simultáneamente. Los pozos de control negativo reciben DMEM exento de suero con BASA al 0.1 por ciento solamente, y los pozos de control positivos reciben el ligando FGF2 , pero ningún compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan en DMEM exento de suero con ligando en una placa de 96 pozos, y se diluyen en serie para hacer siete (7) concentraciones de prueba. 5. Después de 20 horas, se agrega el reactivo marcador BrdU diluido (1:100, BrdU:DMEM, BSA al 0.1 por ciento, la concentración final es de 10 µM) a las células, y se incuban durante 1.5 horas. 6. Medio de decantación. Se remueven las trazas del material con toalla de papel. Se agrega FixDenat (50 microlitros/pozo) , y se incuba a temperatura ambiente durante 45 minutos sobre un agitador de placas. 7. Se remueve la solución Fixdenat. Se agrega la solución de bloqueo (leche deshidratada al 5 por ciento en PBS (200 microlitros/pozo)), y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas. 8. Se decanta la solución de bloqueo, se lavan los pozos una vez con PBS. Se agrega la solución anti-BrdU-POD (dilución de 1:100 en PBS, BSA al 0.1 por ciento), se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas. 9. Se decanta el anticuerpo conjugado, se enjuagan los pozos 5 veces con PBS. Se seca la placa invirtiendo sobre una toalla de papel y dando ligeros golpecitos. 10. Se agrega la solución TMB (100 microlitros/ pozo) , se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente sobre un agitador de placas, hasta que el desarrollo de color es suficiente para la detección fotométrica. 11. Se mide la absorbencia a 410 nanómetros sobre un lector de placas ELISA Dynatech utilizando el modo de "longitud de onda doble", con un filtro a 490 nanómetros . Ensavo Bioquímico de EGFR Este ensayo mide la actividad de cinasa in vitro de EGFR utilizando ELISA. Materiales y Reactivos 1. Placas ELISA Corning de 96 pozos (Corning, Catálogo No. 25805-96) . 2. Anticuerpo monoclonal SUMOl anti-EGFR (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.). 3. PBS (Suero Regulado con Fosfato de Dulbecco, Gibco, Catálogo No. 450-1300EB) . 4. Regulador TBST Reactivo Peso Molecular Concentración Cantidad de Trabajo por litro Tris 121.14 50 mM 6.057 g NaCl 58.44 150 mM 8.766 g Tritón X-100 NA 0.1% 1.0 ml Regulador de Bloqueo: Reactivo Peso Molecular Concentración Cantidad por de Trabajo 100 ml Leche descremada instantánea Carnation 5% 5.0 g PBS NA NA 100 ml 6. Lisado celular A431 (Screening Lab, SUGEN, Inc. ) . 7. Regulador TBS: Reactivo Peso Molecular Concentración Cantidad de Trabajo por litro Tris 121.14 50 mM 6.057 g NaCl 58.44 150 mM 8.766 g 8. TBS + 10% DMSO Reactivo Peso Molecular Concentración Cantidad de Trabajo por litro Tris 121.14 50 mM 1.514 g NaCl 58.44 150 mM 2.192 g DMSO NA 10% 25 ml 9. 5 '-Trifosfato de adenosina (ATP, de músculo equino, Sigma, Catálogo No. A-5394) . Se prepara una solución 1.0 mM en dH20. Este reactivo se debe formar inmediatamente antes de usarse, y se mantiene sobre hielo. 10. MnCl2. Se prepara una solución de suministro 1.0 M en dH20. 11. Mezcla de fosforilación de ATP/MnCl2.

Reactivo Solución de Cantidad por Concentración Suministro 10 ml de trabajo ATP 1.0 mM 300 µl 30 µM MnCl. 1.0 M 500 µl 50 mM dH20 9.2 ml Este reactivo se debe preparar inmediatamente antes de usarse, y se mantiene sobre hielo. 12. Placas de polipropileno de fondo V NUNC de 96 pozos (Applied Scientific, Catálogo No. AS-72092) . 13. Acido etilendiaminatetra-acético (EDTA). Se prepara la solución de trabajo 200 mM en dH20. Se ajusta a un pH de 8.0 con NaOH 10 N. 14. Suero policlonal de conejo anti-fosfotirosina (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.). 15. Conjugado de peroxidasa con IgG de cabra anticonejo (Biosource, Catálogo No. ALI0404) . 16. ABTS ácido 2 , 2 ' -azino-bis (3-etilbenzotiazolin-5-sulfónico) , Sigma, Catálogo No. A-1888) . Reactivo Peso Molecular Concentración Cantidad de Trabajo por litro Acido Cítrico 192.12 100 mM 19.21 g Na2HP04 141.96 250 mM 35.49 g ABTS NA 0.5 mg/ml. 500 mg Primero se mezclan dos ingredientes en aproximadamente 900 mililitros de dH20, se ajusta el pH a 4.0 con ácido fosfórico. Se agrega ABTS, se cubre, se deja asentar durante aproximadamente 0.5 horas, y se filtra. La solución debe mantenerse en la oscuridad a 4°C hasta que esté lista para usarse. 17. Solución de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento (Fisher, Catálogo No. H325) . 18. ABTS/H202. Se mezclan 15 mililitros de solución ABTS y 2.0 microlitros de H202. Se prepara 5 minutos antes de usarse. 19. HCl 0.2 M Procedimiento 1. Se recubren las placas ELISA Corning de 96 pozos con 0.5 microgramos de SUMOl en 100 microlitros de PBS por pozo, y se almacenan durante la noche a 4°C. 2. Se remueve el SUMOl no enlazado de los pozos invirtiendo la placa para remover el líquido. Se lava una vez con dH 0. Se dan golpecitos a la placa sobre una toalla de papel para remover el exceso de líquido. 3. Se agregan 150 microlitros de Regulador de Bloqueo a cada pozo. Se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. 4. Se lava la placa 3 veces con agua desionizada, luego una vez con TBST. Se dan golpecitos a la placa sobre una toalla de papel para remover el exceso de líquido y las burbujas. 5. Se diluye el lisado en PBS (7 miligramos de lisado/100 microlitros de PBS) . 6. Se agregan 100 microlitros de lisado diluido a cada pozo. Se agita a temperatura ambiente durante 60 minutos. 7. Se lavan las placas como se describe en el 4 anterior. 8. Se agregan 120 microlitros de TBS a la placa ELISA conteniendo el EGFR capturado. 9. Se diluye el compuesto de pruebas a 1:10 en TBS, en placas de polipropileno de 96 pozos (es decir, 10 microlitros del compuesto más 90 microlitros de TBS. 10. Se agregan 13.5 microlitros del compuesto de prueba diluido a la placa ELISA. A los pozos de control (los pozos que no reciban ningún compuesto de prueba) , se les agregan 13.5 microlitros de TBS + sulfóxido de dimetilo al 10 por ciento. 11. Se incuban durante 30 minutos con agitación a temperatura ambiente. 12. Se agregan 15 microlitros de mezcla de fosforilación directamente a todos los pozos, excepto al pozo de control negativo, el cual no recibe ATP/MnCl2 (el volumen final del pozo debe ser de aproximadamente 150 microlitros con ATP 3 µM/MnCl2 5 mM de concentración final en cada pozo) . Se incuban durante 5 minutos con agitación. 13. Después de 5 minutos, se detiene la reacción mediante la adición de 16.5 microlitros de EDTA 200 mM (pH de 8.0) a cada pozo, agitando continuamente. Después de que se ha agregado todo el EDTA, se agita durante 1 minuto. 14. Se lava 4 veces con agua desionizada, dos veces con TBST. 15. Se agregan 100 microlitros de anti-fosfotirosina (dilución de 1:3000 en TBST) por pozo. Se incuba durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente, con agitación. 16. Se lava como se describe en el 4 anterior. 17. Se agregan 100 microlitros de conjugado de peroxidasa con IgG de cabra anti-conejo Biosource (dilución de 1:2000 en TBST) a cada pozo. Se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación. 18. Se lava como se describe en el 4 anterior. 19. Se agregan 100 microlitros de solución de ABTS/H202 a cada pozo. 20. Se incuban durante 5 a 10 minutos con agitación. Se remueven cualesquiera burbujas. 21. Si es necesario, se detiene la reacción con la adición de 100 microlitros de HCl 0.2 M por pozo. 22. Se lee en ensayo en el lector ELISA Dynatech MR7000. Filtro de Prueba: 410 nanómetros. Filtro de Referencia: 630 nanómetros. Ensayo Bioquímico de PDGFR Este ensayo mide la actividad de cinasa in vitro de PDGFR utilizando ELISA. Materiales y Reactivos A menos que se observe de otra manera, la preparación de la solución de trabajo de los siguientes reactivos es la misma que aquélla para el ensayo bioquímico de EGFR anterior. 1. Placas ELISA Corning de 96 pozos (Corning, Catálogo No. 25805-96) . 2. Anticuerpo monoclonal 28D4C10 anti-PDGFR (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.). 3. PBS (Suero Regulado con Fosfato de Dulbecco, Gibco, Catálogo No. 450-1300EB) . 4. Regulador TBST. 5. Regulador de Bloqueo 6. Lisado celular NIH 3T3 que expresa PDGFR-ß (Screening Lab, SUGEN, Inc.). 7. Regulador TBS. 8. TBS + sulfóxido de dimetilo al 10 por ciento 9. 5 '-Trifosfato de adenosina (ATP, de músculo equino, Sigma, Catálogo No. A-5394) . 10. MnCl2. 11. Mezcla de fosforilación de regulador de cinasa Reactivo Solución de Cantidad por Concentración Suministro 10 ml de trabajo T Trriiss 1 1 MM 250 µl 25 mM NaCl 5 M 200 µl 100 mM MnCl2 1 M 100 µl 10 mM TX-100 100 mM 50 µl 0.5 mM 12. Placas de polipropileno de fondo en V NUNC de 96 pozos (Applied Scientific, Catálogo No. AS-72092) . 13. Acido etilendiaminatetra-acético (EDTA). 14. Suero policlonal de conejo cinti-fosfotirosina (Biochemistry Lab, SUGEN, Inc.). 15. Conjugado de peroxidasa con IgG de cabra anti-conejo (Biosource, Catálogo No. ALI0404) . 16. Acido 2,2 ' -azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico (ABTS, Sigma, Catálogo No. A-1888) . 17. Solución de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento (Fisher, Catálogo No. H325) . 18. ABTS/H202. 19. HCl 0.2 M Procedimiento 1. Se recubren las placas ELISA Corning de 96 pozos con 0.5 microgramos de 28D4C10 en 100 microlitros de PBS por pozo, y se almacenan durante la noche a 4°C. 2. Se remueve el 28D4C10 no enlazado de los pozos, invirtiendo la plaza para remover el líquido. Se lava una vez con dH20. Se dan golpecitos a la placa sobre una toalla de papel para remover el exceso de líquido. 3. Se agregan 150 microlitros de Regulador de Bloqueo a cada pozo. Se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitación. 4. Se lava la placa 3 veces con agua desionizada, luego una vez con TBST. Se dan golpecitos a la placa sobre una toalla de papel para remover el exceso de liquido y las burbujas. 5. Se diluye el lisado en HNTG (10 microgramos de lisado/ 100 microlitros de HNTG) . 6. Se agregan 100 microlitros de lisado diluido a cada pozo. Se agita a temperatura ambiente durante 60 minutos.

. Se lavan las placas como se describe en el 4 anterior. 8. Se agregan 80 microlitros de mezcla de regulador de cinasa de trabajo a la placa ELISA conteniendo el PDGFR capturado. 9. Se diluye el compuesto de prueba a 1:10 en TBS en placas de polipropileno de 96 pozos (es decir, 10 microlitros de compuesto + 90 microlitros de TBS) . 10. Se agregan 10 microlitros de compuesto de prueba diluido a la placa ELISA. A los pozos de control (los pozos que no reciben ningún compuesto de prueba) , se les agregan 10 microlitros de TBS + sulfóxido de dimetilo al 10 por ciento. 11. Se incuban durante 30 minutos con agitación a temperatura ambiente. 12. Se agregan 10 microlitros de ATP directamente a todos los pozos, excepto al pozo de control negativo (el volumen final del pozo debe ser de aproximadamente 100 microlitros con ATP 20 µM en cada pozo) . Se incuban durante 30 minutos con agitación. 13. Después de 20 minutos, se detiene la reacción mediante la adición de 10 microlitros de EDTA 200 mM (pH de 8.0) a cada pozo) . 14. Se lava 4 veces con agua desionizada, 2 veces con TBST. 15. Se agregan 100 microlitros de anti-fosfotirosina (dilución de 1:3000 en TBST (por pozo). Se incuban durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente, con agitación. 16. Se lava como se describe en el 4 anterior. 17. Se agregan 100 microlitros de conjugado de peroxidasa con IgG de cabra anti-conejo Biosource (dilución de 1:2000 en TBST) a cada pozo. Se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente, con agitación. 18. Se lava como se describe en el 4 anterior. 19. Se agregan 100 microlitros de solución de ABTS/H202 a cada pozo. 20. Se incuban durante 10 a 30 minutos con agitación. Se remueven las burbujas. 21. Si es necesario, se detiene la reacción con la adición de 100 microlitros de HCl 0.2 M por pozo. 22. Se lee el ensayo en el lector ELISA Dynatech MR700: filtro de prueba: 410 nanómetros; filtro de referencia: 630 nanómetros. Ensayo Bioquímico de FGFR Este ensayo mide la actividad de cinasa in vitro de la proteína de fusión Myc-GyrB-FGFR utilizando ELISA. Materiales y Reactivos 1. HNTG • T 297 Reactivo Peso MoConcentración Cantidad por Conc. de lecular de Suministro 5x Litro trabajo 1> HEPES 238.3 100 mM 23.83 g 10 mM NaCl 58.44 750 mM 43.83 g 150 mM Glicerol NA 50% 500 ml 10% Tritón X--100 NA 5% 10 ml 1.0% Para hacer un litro de solución de suministro 5x, se disuelve éter y NaCl en aproximadamente 350 mililitros de dH20, se ajusta el pH a 7.2 con HCl ó NaOH (dependiendo del HEPES que se utilice, se agrega glicerol, Tritón X-100, y luego dH20 hasta el volumen. 2. PBS (Suero Regulado con Fosfato de Dulbecco, Gibco, Catálogo # 450-1300EB9. 15 3. Regulador de Bloqueo 4. Regulador de Cinasa Reactivo Peso Molecular Concentración Concentración de Suministro lOx de trabajo lx HEPES (pH 7.2) 238.3 500 mM 50 mM MnCl. 203.32 20 Mm 2 mM MgCl2 200 Mm 10 mM Tritón X-100 1 % 0.1% DTT 380.35 5 Mm 0.5% mM 5. Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, Sigma, Catálogo No. P-7626) . • i 298 Solución de trabajo: 100 mM en etanol. 6. ATP (fuente bacteriana, Sigma, Catálogo No. A- 7699) . Se utilizan 3.31 miligramos por mililitro de 5 MilliQ H20 para una concentración de suministro de 6 mM. 7. Anticuerpo monoclonal anti-fosfotirosina conjugado con biotina (clona a 4G10, Upstate Biotechnology Inc., Catálogo No. 16-103, No. de Serie 14495). 8. Reactivo de vectastaína Élite ABC (conjugado de 10 peroxidasa de avidina, Vector Laboratories, Catálogo No. PK-6 100) . 9. Solución de ABTS. 10. Solución de peróxido de hidrógeno al 30 por ciento (Fischer, Catálogo # H325) . 15 11. ABTS/H202. 12. HCl 0.2 M. 13. TRIS-HC1 (Fischer, Catálogo No. BP 152-5). Se prepara una solución 1.0 mM en MilliQ H20, se ajusta el pH a 7.2 con HCl. 20 14. NaCl (Fisher, Catálogo No. S271-10). Se prepara una solución 5 M en MilliQ H20. 15. MgCl2 (Fischer, Catálogo No. M33-500) . Se prepara una solución 1 M en MilliQ H20. 16. HEPES (Fisher, Catálogo No. BP310-500) . 25 Se prepara una solución 1 M en MilliQ H20, se < t 299 ajusta el pH a 7.5, se filtra estéril. 17. Regulador TBST. 18. Regulador de Carbonato de Sodio (Fischer, Catálogo No. S495) . 5 Se prepara una solución 0.1 M en MilliQ H20, se ajuste el pH a 9.6 con NaOH, se filtra. 19. Ditioeritritol (DTT, Fischer, Catálogo No. BP172-25) . Se prepara una solución de trabajo 0.5 mM en 10 MilliQ H20 justo antes de usarse. Se almacena a -20°C hasta que se utilice, y se desecha cualquier sobrante.. 20. MnCl2. 21. Tritón X-100. 22. IgG de cabra anti-conejo (Cappel). 15 23. GST GyrB de anti-conejo purificado por afinidad (Biochemistry Lab., SUGEN, Inc.). Procedimiento Todos los siguientes pasos se conducen a temperatura ambiente, a menos que se indique de otra manera. 20 1. Se recubren las placas ELISA Corning de 96 pozos con 2 microgramos de anticuerpo de cabra anti-conejo por pozo en Regulador de Carbonato, de tal manera que el volumen total del pozo sea de 100 microlitros. Se almacena durante la noche a 4°C. 25 2. Se remueve al anticuerpo de cabra anti-conejo no í 300 enlazado invirtiendo la placa para remover el líquido. Se dan golpecitos a la placa sobre una toalla de papel para remover el exceso de liquido y las burbujas. 3. Se agregan 150 microlitros de Regulador de 5 Bloqueo (Lecha Baja en Grasa al 5 por ciento en PBS) a cada pozo. Se incuba con agitación sobre un agitador de placas de microtitulación durante 30 minutos. 4. Se lava 4 veces con TBST. Se dan golpecitos a la placa sobre una toalla de papel para remover el exceso de líquido y las burbujas. 5. Se agregan 0.5 microgramos de anticuerpo de conejo contra anti-GyrB por pozo. Se diluye el anticuerpo en DPBS hasta un volumen final de 100 microlitros por pozo. Se incuba con agitación sobre un agitador de placas de microtitulación a temperatura ambiente durante una hora. 6. Se lava 4 veces con TBST como se describe en el Paso 4. 7. Se agregan 2 microgramos de COS/FGFR de lisado celular (fuente Myc-GyrB-FGFR) en HNGT a cada pozo, para dar un volumen final de 100 microlitros por pozo. Se incuba con agitación sobre un agitador de placas de microtitulación durante 1 hora. 8. Se lava 4 veces con TBST como se describe en el Paso 4. 25 9. Se agregan 80 microlitros de regulador de cinasa lx por pozo. 10. Se diluye el compuesto de prueba a 1:10 en regulador de cinasa lx + sulfóxido de dimetilo al 1 por ciento en una placa de polipropileno de 96 pozos. 11. Se transfieren 10 microlitros de la solución del compuesto de prueba diluido, y de los pozos de control a partir de los pozos de la placa de polipropileno a los pozos de la placa ELISA correspondientes, se incuban con agitación sobre un agitador de placas de microtitulación durante 20 minutos. 12. Se agregan 10 microlitros de ATP 70 µM diluido en regulador de cinasa para a los pozos de control positivo y de prueba (la concentración final de ATP es de 7 µM/pozo) . Se agregan 10 microlitros de regulador de cinasa lx a los pozos de control negativo. Se incuban con agitación sobre un agitador de placas de microtitulación durante 15 minutos. 13. Se detiene la reacción de cinasa mediante la adición de 5 microlitros de EDTA 0.5 M a todos los pozos. 14. Se lava 4 veces con TBST como se describe en el Paso 4. 15. Se agregan 100 microlitros de anticuerpo monoclonal de a-fosfotirosina conjugada con biotina (b4G10) diluido en TBST a cada pozo. Se incuba con agitación sobre un agitador de placas de microtitulación durante 30 minutos. 16. Se prepara el reactivo de vectastaína ABC. Se agrega 1 gota de reactivo A a 15 mililitros de TBST. Se mezcla invirtiendo el tubo varias veces. Se agrega 1 gota del reactivo B y se mezcla nuevamente. 17. Se lava 4 veces con TBST como se describe en el Paso 4. 18. Se agregan 100 microlitros de reactivo ABC HRP a cada pozo. Se incuba con agitación sobre un agitador de placas de microtitulación durante 30 minutos. 19. Se lava cuatro veces con TBST como se describe en el Paso 4. 20. Se agregan 100 microlitros de solución de ABTS/H202 a cada pozo. 22. Se incuba durante 5 a 15 minutos con agitación. Se remueven las burbujas. 23. Si es necesario, se detiene la reacción mediante la adición de 1 microlitro de HCl 0.2M/pozo. 24. Se lee el ensayo en un Lector de Placas ELISA Dynatech MR7000; filtro de prueba: 410 nanómetros; filtro de referencia: 630 nanómetros. Ensayo Bioquímico de FLK-l Este ensayo evalúa la actividad de autofosforilación de flk-1 in vitro utilizando ELISA. Materiales y Reactivos 1. Platos de cultivo de tejido de 15 centímetros. 2. Células flk-1/NIH: línea de fibroblastos NIH que sobreexpresa El clon 3 de flk-1 humano (SUGEN, Inc. , obtenido en MPI, Martinsried, Alemania) . 3. Medio de cultivo: DMEM más FBS al 10 por ciento inactivado por calor y glutamina 2 mM (Gibco-BRL) . 4. Medio de inanición: DMEM más FBS inactivado por calor al 0.5 por ciento, glutamina 2 mM (Gibco-BRL). 5. Placas ELISA Corning de 96 pozos (Corning, Catálogo No. 25805-96) . 6. Anticuerpo monoclonal L4 ó E38 específico para flk-1, purificado, mediante cromatografía por afinidad de agarosa de proteína-A (SUGEN, Inc.). 7. PBS (Suero Regulado con Fosfato de Dulbecco) Gibco, Catálogo No. 450-1300EB) . 8. HNTG (ver FGFR BIOQUÍMICO para la preparación). 9. Se perfora el estuche de determinación de proteina de BCA. 10. Regulador de bloqueo. 11. TBST (ph de 7.0) 12. Regulador de Cinasa 13. Solución de Paro de Cinasa: EDTA 200 mM 14. 4G10 biotinilado, específico para fosfotirosina (UBI, Catálogo No. 16-103). 15. Estuche AB (Vecotor Laboratories, Catálogo No. PK 4000) . 16. Sulfóxido de dimetilo 17. Placas de polipropileno de fondo en V NUNC de 96 pozos (Applied Scientific, Catálogo No. AS-72092) . 18. Turbo-TMB (Pierce) 19. Solución de paro Turbo-TMB: HB2S04 1 M 20. ATP (Sigma, Catálogo No. A-7699 21. Sulfóxido de dimetilo al 20 por ciento en TBS (pH de 7.0) . Procedimiento Preparación de Cultivo y Lisado Celular 1. Se siembran las células en el medio de cultivo, y se cultivan durante 2 a 3 días hasta una confluencia del 90 al 100 por ciento a 37°C y con C0 al 5 por ciento. No se excede el pasaje #20. 2. Se remueve el medio, y se lavan las células dos veces con PBS. Se lisan con regulador de lisis HNTG. Se recolectan todos los lisados, y se ponen en vórtex durante 20 a 30 segundos. 3. Se remueve el material insoluble mediante centrifugación (5 a 10 minutos a aproximadamente 10,000 xg) . 4. Se determina la concentración de proteína utilizando el estuche BCA. 5. Se divide el lisado en alícuotas de 1 miligramo, y se almacenan a -80°C. Procedimiento de Ensayo 1. Se recubren las placas ELISA Corning de 96 pozos con 2 miligramos/pozo de L4 purificado (ó E 38) en 100 microlitros de PBS. Se almacenan durante la noche a 4°C. 2. Se remueven las proteínas no enlazadas de los pozos, invirtiendo la placa para remover el líquido. Se lava una vez con dH20, se dan golpecitos a la placa sobre una toalla de papel para remover el exceso de líquido. 3. Se bloquean las placas con 150 microlitros de regulador de bloqueo por pozo. Se incuban durante 45 a 60 minutos con agitación a 4°C. 4. Se remueve el regulador de bloqueo, y se lava la placa ELISA tres veces con dH20, y una vez con TBST. Se dan golpecitos a la placa sobre una toalla de papel para remover el exceso de líquido. 5. Se diluye el lisado en PBS para dar una concentración final de 50 microgramos/100 mililitros. Se agregan 100 microlitros de lisado diluido a cada pozo. Se incuban con agitación a 4°C durante la noche. 6. Se remueven las proteínas no enlazadas de los pozos invirtiendo la placa. Se lavan como en el Paso 4. 7. Se agregan 80 microlitros de regulador de cinasa a los pozos (90 microlitros a los pozos de control negativo) . 8. Se diluyen los compuestos de prueba (normalmente 10 veces) en los pozos de una placa de polipropileno que contiene sulfóxido de dimetilo al 20 por ciento en TBS. 9. Se aqregan 10 microlitros de los compuestos diluidos a los pozos ELISA que contienen flk-1 inmovilizado, y se agitan. Los pozos de control no reciben compuestos. 10. A partir del ATP lmM de suministro, se prepara una solución de ATP 0.3 mM en dH20 (alternativamente, se puede utilizar regulador de cinasa) . 11. Se agregan 10 microlitros de ATP 0.3 mM a todos los pozos, excepto a los controles negativos. Se incuban durante 60 minutos a temperatura ambiente con agitación. 12. Después de 1 hora, se detiene la reacción de cinasa agregando 11 microlitros de EDTA 200 mM. Se agitan durante 1 a 2 minutos. 13. Se lava la placa ELISA 4 veces con dH20, y dos veces con TBST. 14. Se agregan 100 microlitros de 1:5000 de 4G10 biotinilado: TBST a todos los pozos. Se incuban durante 45 minutos con agitación a temperatura ambiente. 15. Mientras se está incubando lo anterior, se agregan 50 microlitros de las soluciones A y B del estuche ABC a 10 mililitros de TBST. Estas soluciones se deben combinar aproximadamente 30 minutos antes de usarse. 16. Se lavan las placas como en el Paso 4. 17. Se agregan 100 microlitros del complejo A y B preformado a todos los pozos. Se incuban durante 30 minutos con agitación a temperatura ambiente. 18. Se lavan las placas como en el Paso 4. 19. Se agregan 100 microlitros de turbo-TMB. Se agitan a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. 20. Cuando el color en los pozos de control positivo alcanza una absorbencia de aproximadamente 0..35-0.4, se detiene la reacción con 100 microlitros de la solución de paro turbo-TMB. 21. Se leen las placas en el lector ELISA Dynatech MR7000; filtro de prueba: 450 nanómetros; filtro de referencia: 410 nanómetros. Ensayo de HUV-EC-C Se puede utilizar también el siguiente protocolo para medir la actividad de un compuesto contra PDGF-R, FGF-R, VEGF, aFGF ó Flk-1/KDR, todos los cuales son naturalmente expresados por las células HUV-EC. DÍA O 1. Se lavan y se tripsinizan las células HUV-EC-C (células endoteliales de la vena umbilical humana) (American Type Culture Collection, Catálogo No. 1730 CRL) . Se lava con suero regulado con fosfato de Dulbecco (D-PBS, obtenido en Gibco BRL, Catálogo No. 14190-029) dos veces a aproximadamente 1 mililitro/10 cm2 del matraz de cultivo de tejido. Se tripsinizan con tripsina-EDTA al 0.5 por ciento en solución de disociación celular no enzimática (Sigma Chemical Company, Catálogo No. C-1544). La tripsina al 0.05 por ciento se hace diluyendo tripsina al 0.25 por ciento/EDTA 1 mM (Gibco, Catálogo No. 25200-049) en la solución de disociación celular.

Se tripsiniza con aproximadamente 1 mililitro/25-30 cm2 del matraz de cultivo de tejido durante aproximadamente 5 minutos a 37 °C. Después de que se separan las células del matraz, se agrega un volumen igual de medio de ensayo, y se transfiere a un tubo centrífugo estéril de 50 mililitros (Fisher Scientific, Catálogo No. 05-539-6) . 2. Se lavan las células con aproximadamente 35 mililitros de medio de ensayo en el tubo centrífugo estéril de 50 mililitros, mediante la adición del medio de ensayo, se centrifuga durante 10 minutos a aproximadamente 200x g, se aspira el sobrenadante, y se vuelve a suspender con 35 mililitros de D-PBS. Se repite el lavado dos veces más con D-PBS, se vuelven a suspender las células en aproximadamente 1 mililitro de medio de ensayo/ 15 cm2 del matraz de cultivo de tejido. El medio de ensayo consiste en un medio F12K (Gibco BRL, Catálogo No. 21127-014) y suero bovino fetal inactivado por calor al 0.5 por ciento. Se cuentan las células con un Coulter Counter® (Coulter Electronics, Inc.), y se agrega el medio de ensayo a las células para obtener una concentración de 0.8-1.0 x 105 células/mililitro. 3. Se agregan las células a las placas de fondo plano de 96 pozos, a 100 microlitros/pozo, ó 0.8-1.0 x 104 células/pozo, se incuban durante aproximadamente 24 horas a 37 °C, con C02 al 5 por ciento.

DÍA 1 1. Se forman titulaciones del compuesto de prueba dobles en placas de 96 pozos separadas, generalmente 50 µM hacia abajo hasta 0 µM. Se utiliza el mismo medio de ensayo que se mencionó en el día 0, Paso 2 anterior. Las titulaciones se hacen mediante la adición de 90 microlitros/pozo del compuesto de prueba a 200 µM (4 veces la concentración final de pozo) al pozo superior de una columna de placa particular. Debido a que el compuesto de prueba de suministro normalmente es 20 mM en sulfóxido de dimetilo, la concentración del fármaco de 200 µM contiene sulfóxido de dimetilo al 2 por ciento. Se utiliza un diluyente hecho en sulfóxido de dimetilo al 2 por ciento en el medio de ensayo (F12K + suero bovino fetal al 0.5 por ciento) como diluyente para las titulaciones del compuesto de prueba, con el objeto de diluir el compuesto de prueba, pero mantener la concentración de sulfóxido de dimetilo constante. Se agrega este diluyente a los pozos restantes de la columna a 50 microlitros/pozo. Se toman 60 microlitros de los 120 microlitros de la dilución del compuesto de prueba de 200 µM en el pozo superior de la columna, y se mezclan con los 60 microlitros del segundo pozo de la columna. Se toman 60 microlitros de este pozo, y se mezclan con los 60 microlitros del tercer pozo de la columna, y así sucesivamente, hasta que se terminen las titulaciones dobles. Cuando se mezcla el pozo siquiente al último, se toman 60 microlitros de los 120 microlitros de este pozo y se desechan. Se deja el último pozo con 60 microlitros de diluyente de sulfóxido de dimetilo/medio como un control que no contiene compuesto de prueba. Se hacen 9 columnas del compuesto » de prueba titulado, suficientes para triplicar los pozos, cada una para: (1) VEGF (obtenido en Pepro Tech Inc., Catálogo No. 100-200) , (2) factor de crecimiento celular endotelial (ECGF) (también conocido como factor de crecimiento de fibroblastos ácido, ó aFGF) (obtenido en Boehringer Mannheim Biochemica, Catálogo No. 1439 600), ó, (3) PDGF B/B humano (1276-956, Boehringer Mannheim, Alemania) , y un control de medio de ensayo. El ECGF viene como una preparación con heparina de sodio. 2. Se transfieren 50 microlitros/pozo de las diluciones del compuesto de prueba a las placas de ensayo de 96 pozos que contienen las 0.8-1.0xl04 células/100 microlitros/pozo de las células HUV-EC-C a partir del día 0, y se incuban durante aproximadamente 2 horas a 37 °C, con C02 al 5 por ciento. 3. Por triplicado, se agregan 50 microlitros/pozo de 80 microgramos/mililitro de VEGF, 20 nanogramos/mililitro de ECGF, ó un control del medio para cada condición del compuesto de prueba. Como con los compuestos de prueba, las concentraciones del factor de crecimiento son 4 veces la concentración final deseada. Se utiliza el medio de ensayo a partir del Día O, Paso 2, para hacer las concentraciones de los factores de crecimiento. Se incuban durante aproximadamente 24 horas a 37°C, con C02 al 5 por ciento. Cada pozo tendrá 50 microlitros de dilución del compuesto de prueba, 50 microlitros de factor de crecimiento ó medio, y 100 microlitros de células, lo cual se calcula para un total de 200 microlitros/pozo. Por consiguiente, las concentraciones 4X del compuesto de prueba y de los factores de crecimiento llegan a ser IX cuando se ha agregado todo a los pozos. DÍA 2 1. Se agrega 3H-timidina (Amersham, Catálogo No. TRK-686) en 1 µCi/pozo (10 microlitros/pozo de una solución de 100 µCi/mililitro hecha en un medio RPMI + suero bovino fetal inactivado por calor al 10 por ciento) , y se incuba durante aproximadamente 24 horas a 37°C, con C02 al 5 por ciento. El RPMI se obtiene en Gibco BRL, Catálogo No. 11875-051. DÍA 3 1. Se congelan las placas durante la noche a -20°C. DÍA 4 Se descongelan las placas y se cosechan con el cosechador de placas de 96 pozos (Tomtec Harvester 96®) sobre ceras de filtro (Wallac, Catálogo No. 1205-401) , se leen los conteos en un contador de cintilación de líquidos Wallac BetaplateMR. Modelos Animales en Vivo Modelos Animales de Xenoinierto La capacidad de los tumores humanos para crecer como xenoinjertos en ratones atímicos (por ejemplo, Balb/c, nu/nu) proporciona un modelo útil en vivo para estudiar la respuesta biológica a las terapias para los tumores humanos. Debido al primer xenotrasplante de éxito de tumores humanos en ratones atímicos (Rygaard y Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760) , se han trasplantado muchas líneas celulares tumorales humanas diferentes (por ejemplo, melanomas mamarios, de pulmón, genitourinarios, gastrointestinales, de la cabeza y el cuello, de glioblastoma, de hueso, y mcilignos) , y se han cultivado con éxito en ratones sin pelo. Se pueden utilizar los siguientes ensayos para determinar el nivel de actividad, la especificidad, y el efecto de los diferentes compuestos de la presente invención. Son útiles tres tipos generales de ensayos para evaluar los compuestos: celular/catalítico, celular/ biológico y en vivo. El objeto de los ensayos celulares/ catalíticos es determinar el efecto de un compuesto sobre la capacidad de una TK para fosforilar las tirosinas sobre un sustrato conocido en una célula. El objeto de los ensayos celulares/biológicos es determinar el efecto de un compuesto sobre la respuesta biológica estimulada por una TK en una célula. El objeto de los ensayos en vivo es determinar el efecto de un compuesto en un modelo animal de un desorden particular, tal como cáncer.

Las líneas celulares adecuadas para los experimentos de xenoinjerto subcutáneo incluyen las células C6 (glioma, ATCC # CCL 107); las células A375 (melanoma, ATCC # CRL 1619), las células A431 (carcinoma epidermoide, ATCC # CRL 1555) , las células Calu 6 (pulmón, ATCC # HTB 56) , las células PC3 (próstata, ATCC # CRL 1435) , las células SKOV3TP5 y los fibroblastos NIH 3T3 genéticamente diseñados para sobreexpresar EGFR, PDGFR, IGF-1R, y cualquier otra cinasa de prueba. Se puede utilizar el siguiente protocolo para realizar experimentos de xenoinjerto: Se obtienen ratones atímicos hembras (BALB/c, nu/nu) en Simonsen Laboratories (Gilroy, CA) . Todos los animales se mantienen bajo condiciones limpias en jaulas micro-aislantes con camas Alpha-dri. Reciben alimento para roedores estéril y agua al gusto. Las líneas celulares se cultivan en un medio apropiado (por ejemplo, MEM, DMEM, FIO de Ham, ó F12 de Ham más suero bovino fetal al 5-10 por ciento (FBS) , y glutamina 2 M (GLN) ) . Todos los medios de cultivo celular, la glutamina y el suero bovino fetal se adquieren en Gibco Life Technologies (Grand Island, NY) , a menos que se especifique de otra manera. Todas las células se cultivan en una atmósfera húmeda del 90 al 95 por ciento de aire, y del 5 al 10 por ciento de C02 a 37°C. Todas las líneas celulares se subcultivan rutinariamente dos veces a la semana, y son negativas para micoplasma, determinado mediante el método de Mycotect (Gibco) . Las células se cosechan en ó casi la confluencia con tripsina al 0.5 por ciento-EDTA, y se granulan a 450 x g durante 20 minutos. Los granulos se vuelven a suspender en PBS estéril ó en el medio (sin FBS) hasta una concentración particular, y las células se implantan en el flanco posterior de los ratones (8 a 10 ratones por grupo, 2-10 x 106 células/animal) . El crecimiento tumoral se mide durante 3 a 6 semanas utilizando calibres venier. Los volúmenes tumorales se calculan como un producto de la longitud por el ancho por la altura, a menos que se indique de otra manera. Los valores P se calculan utilizando la prueba t del Estudiante. Los compuestos de prueba en 50-100 microlitros de excipiente (sulfóxido de dimetilo, ó VPD:D5W) se pueden suministrar mediante inyección intraperitoneal en diferentes concentraciones, empezando en general en el día uno después de la implantación. Modelo de Invasión Tumoral Se ha desarrollado el siguiente modelo de invasión tumoral, y se puede utilizar para la evaluación del valor terapéutico y de la eficacia de los compuestos identificados por inhibir selectivamente el receptor KDR/FLK-l. Procedimiento Se utilizan ratones sin pelo de 8 semanas de edad (hembras) (Simonsen Inc.) como animales experimentales. La implantación de las células tumorales se puede realizar en una campana de flujo laminar. Para la anestesia, se administra intraperitonealmente un coctel de xilazina/cetamina (100 miligramos/kilogramo de cetamina, y 5 miligramos/kilogramo de xilazina) . Se hace una incisión de la línea media para exponer la cavidad abdominal (de aproximadamente 1.5 centímetros de longitud) para inyectar 107 células tumorales en un volumen de 100 microlitros del medio. Las células se inyectan, ya sea en el lóbulo duodenal del páncreas, ó debajo de la serosa del colon. El peritoneo y los músculos se cierran con una sutura continua de seda 6-0, y la piel se cierra utilizando sujetadores de heridas. Los animales se observan diariamente. Análisis Después de 2 a 6 semanas, dependiendo de las observaciones de los animales, los ratones se sacrifican, y se cortan y se analizan las metástasis tumorales locales en diferentes órganos (pulmón, hígado, cerebro, estómago, bazo, corazón, músculos) (medición del tamaño del tumor, grado de invasión, inmunoquímica, determinación de hibridación in situ , etc. ) . Medición de la Toxicidad Celular Los compuestos terapéuticos deben ser más potentes para inhibir la actividad de cinasa de tirosina receptora que para ejercer un efecto citotóxico. Se puede obtener una medida de la efectividad y de la toxicidad celular de un compuesto, determinando el índice terapéutico, es decir, IC50/LD50. La IC50, la dosis requerida para alcanzar una inhibición del 50 por ciento, se puede medir utilizando técnicas convencionales, tales como las descritas en la presente. La LD50, la dosificación que da como resultado una toxicidad del 50 por ciento, también se puede medir mediante técnicas convencionales (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65:55-63), midiendo la cantidad de LDH liberada (Korzeniewski y Callewaert, 1983, J. Immunol. Methods, 64:313, Decker y Lohmann-Matthes , 1988, J. Immunol. Methods, 115:61), ó midiendo la dosis letal en los modelos animales. Se prefieren los compuestos con un índice terapéutico grande. El índice terapéutico debe ser mayor de 2, de preferencia de cuando menos 10, y más preferiblemente de cuando menos 50. B. Ejemplos - Actividad Biológica Los ejemplos de la potencia in vitro de los compuestos de esta invención se muestran en las Tablas 1 y 2. Los datos muestran que los compuestos son en general muy potentes contra una variedad de PTKs in vitro . Los compuestos también mantienen una excelente actividad cuando se prueban en vivo. Por ejemplo, varios compuestos de la presente invención, cuando se administran oralmente, exhiben tamaño promedio reducido notorio de los tumores de glioma C6 subcutáneamente implantados en ratones. Sin embargo, el compuesto 5 fuer notoriamente superior a los otros compuestos de esta invención. En un experimento, se implantaron subcutáneamente células de glioma humanas C6 (3 x 106 células, n = 10 - 20 animales/grupo) en el flanco posterior de ratones BALB/c nu/nu hembras en el día 0. La administración oral de los compuestos 3, 5, 19 y 20 en labrasol acuoso a 200 miligramos/kilogramo/día, comenzó un día después de la implantación. El crecimiento del tumor se midió utilizando calibres vernier, y se calcularon los volúmenes de los tumores como el producto de la longitud por el ancho por la altura.

Como se muestra en la siguiente gráfica, todos los compuestos probados muestran una notoria inhibición comparándose con el control de vehículo solamente. Sin embargo, el compuesto 5 claramente, y considerando la estrecha similitud estructural de los compuestos probados, resalta de una manera sorprendente del resto. Es decir, mientras que los compuestos 3, 19 y 21 se arraciman alrededor de una inhibición del 40 al 45 por ciento del crecimiento tumoral en el día 18 después de la implantación, el compuesto 5 inhibe el crecimiento tumoral por el 80 al 85 por ciento en ese punto.

Días después de la implantación La eficacia inesperada del compuesto 5 en vivo, particularmente después de su administración oral, se demuestra adicionalmente cuando se compara con el compuesto 65: &1 El compuesto 65 manifiesta casi un orden de magnitud más potencia in vitro que el compuesto 5 (no se muestran los datos) . Sin embargo, cuando se prueba interperitonealmente en ratones contra dos diferentes líneas celulares tumorales, SF763T y SF767T, el compuesto 5 es desde ligeramente (una inhibición mayor del 5 por ciento a los 21 días) hasta notoriamente (una inhibición mayor del 14 por ciento a los 21 días) más eficaz que el compuesto 65. La diferencia en la actividad entre el compuesto 5 y el compuesto 65 es todavía mayor cuando los dos compuestos se administran oralmente. La eficacia oral del compuesto 65 y varios de sus análogos, los compuestos 66-69, se muestra gráficamente enseguida: £2 Como se puede ver en la gráfica, el compuesto 65, administrado oralmente en 200 miligramos/kilogramo/día, muestra una inhibición de aproximadamente el 65 por ciento de los tumores C6 a los 18 días después de la implantación subcutánea en ratones, lo cual es claramente es superior a sus propios análogos, que promedian una inhibición de aproximadamente el 14 al 16 por ciento del crecimiento del tumor. De una manera sorprendente, sin embargo, la eficacia oral del compuesto 65 todavía es notoriamente menor que aquélla del compuesto 5, que, como se observó anteriormente, demuestra una inhibición del 80 al 85 por ciento al mismo tiempo en el mismo modelo de tumor. Al compararse con el compuesto 70, el compuesto 5 muestra K?s (constantes de inhibición) significativamente más pequeñas (es decir, mayor potencia) contra FGF-R1 (1.2 para el compuesto 5, contra 19.49 para el compuesto 70) y PDGFR (no se muestran los datos) .

. La superioridad inesperada del compuesto 5 se demuestra adicionalmente cuando se compara su eficacia oral con aquélla de un análogo cercano, el compuesto 71: 71 A pesar de la similitud estructural, cuando se prueba oralmente en 200 miligramos/kilogramo/día contra los tumores de melanoma humanos C6 subcutáneamente implantados en ratones BALB/c nu/nu, a los 18 días después de la implantación, el compuesto 71 muestra solamente una inhibición del 57 por ciento del crecimiento del tumor (no se muestran los datos) , comparándose nuevamente con la inhibición del 80 al 85 por ciento demostrada por el compuesto 5.

Basándose en la sorprendente eficacia anterior del compuesto 5 cuando se administra oralmente, el compuesto 5 es actualmente una modalidad preferida de esta invención.

CONCLUSIÓN Por consiguiente, se apreciará que los compuestos, métodos y composiciones farmacéuticas de la presente invención, son efectivos para modular la actividad de cinasa de proteína, y por consiguiente, se espera que sean efectivos como agentes terapéuticos contra desórdenes relacionados con RTK, CTK y STK. Un experto en la materia apreciaría fácilmente que la presente invención se adapta bien para realizar los objetivos y obtener los fines y ventajas mencionados, así como aquellos inherentes en la presente. Los complejos moleculares y los métodos, procedimientos, tratamientos, moléculas, compuestos específicos descritos en la presente, son actualmente representativos de las modalidades preferidas, son de ejemplo, y no se pretenden como limitaciones sobre el alcance de la invención. Los expertos en la materia pensarán en cambios en los mismos y en otros usos, que están abarcados dentro del espíritu de la invención, como se define por el alcance de las reivindicaciones . Será fácilmente aparente para un experto en la técnica, que se pueden hacer variaciones, sustituciones y modificaciones a la invención dada a conocer en la presente, sin apartarse del alcance y espíritu de la invención. Todas las patentes y publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas de los niveles de los expertos en la materia a la que pertenece la invención. Todas las patentes y publicaciones se incorporan a la presente como referencia hasta el mismo grado que si cada publicación individual fuera específicamente e individualmente indicada como incorporada como referencia. La invención descrita de una manera ilustrativa en la presente, se puede practicar adecuadamente en ausencia de cualquier elemento ó elementos, limitación ó limitaciones que no sean específicamente dadas a conocer en la presente. Por consiguiente, por ejemplo, en cada caso, en la presente, cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente en", y "consistente en", pueden ser reemplazados con cualquiera de los otros dos términos. Los términos y las expresiones que sean empleados se utilizan como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención de que, en el uso de estos términos y expresiones, se excluyan cualesquiera equivalentes de las características mostradas y descritas, ó porciones de las mismas, sino que se reconoce que son posibles diferentes modificaciones dentro del alcance de la invención reivindicada. Por consiquiente, se debe entender que, aunque la presente invención se ha dado a conocer específicamente mediante las modalidades preferidas y las características opcionales, los expertos en la técnica pueden recurrir a modificaciones y variaciones de los conceptos dados a conocer en la presente, y estas modificaciones y variaciones se consideran dentro del alcance de esta invención, como se definen por las reivindicaciones adjuntas. En adición, en donde se describan características ó aspectos de la invención en términos de grupos Markush, los expertos en este campo reconocerán que la invención también se describe mediante lo mismo en términos de cualquier miembro individual ó subgrupo de miembros del grupo Markush. Por ejemplo, si X se describe como seleccionado a partir del grupo que consiste en bromo, cloro y yodo, se describen completamente las proclamaciones de que X sea bromo, y de que X sea bromo y cloro. Otras modalidades están dentro de las siguientes reivindicaciones .

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Una 2-indolinona sustituida por pirrol que tiene la estructura química: en donde: R1 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, hidroxilo, alcoxilo,, C-carboxilo, 0-carboxilo, acetilo, C-amido, C-tioamido, sulfonilo y trihalometansulfonilo. R2 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, halógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo y heteroalicíclico. R3, R4, R5 y R5 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, mercapto, tioalquilo, tioarilo, sulfinilo, sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, trihalometansulfonamido, carbonilo, C-carboxilo, O-carboxilo, C-amido, N-amido, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, O-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, amino y -NR1:LR1

2. R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalquilo, arilo, carbonilo, acetilo, sulfonilo, trifluormetansulfonilo y, combinados, un anillo heteroalicíclico de cinco ó seis miembros. R3 y R4, R4 y R5, ó R4 y R5, pueden combinarse para formar un anillo de arilo de seis miembros, un grupo metilendioxilo ó un grupo etilendioxilo. R7 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, cicloalc[uilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, carbonilo., acetilo, C-amido, C-tioamido, amidino, C-carboxilo, O-carboxilo, sulfonilo y trihalometansulfonilo. R , R y Rx? se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo, trihaloalquilo, cicloalquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heteroarilo, heteroalicíclico, hidroxilo, alcoxilo, ariloxilo, mercapto, tioalquilo, tioarilo, sulfinilo, sulfonilo, S-sulfonamido, N-sulfonamido, carbonilo, C-carboxilo, 0-carboxilo, ciano, nitro, halógeno, O-carbamilo, N-carbamilo, 0-tiocarbamilo, N-tiocarbamilo, C-amido, N-amido, amino y -NR1;LR12, en el entendido, sin embargo, de que cuando menos uno de R8, R9 ó R10 sea un grupo que tenga la fórmula -(alk1)Z, en donde : Alk-L se selecciona a partir del grupo que consiste en alquilo, alquenilo ó alquinilo; y Z es un grupo polar. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R1, R2 y R7 son hidrógeno.

3. El compuesto de la reivindicación 2, en donde uno de R8, R9 ó R10 es alk^, en donde: alk-L se selecciona a partir del grupo que consiste en alquilo inferior insustituido, alquenilo inferior insustituido, y alquinilo inferior insustituido; y Z es un grupo polar seleccionado a partir del grupo que consiste en hidroxilo, alcoxilo, C-carboxilo, carbonilo, nitro, ciano, amino, amonio, -NR1:LR12, C-amido, S-sulfonamido, sulfinilo, sulfonilo, fosfonilo, ureído, amidino, guanidinilo, morfolino, piperidinilo y tetrazolo.

4. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en: hidrógeno; halógeno; alquilo inferior insustituido; alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos seleccionados a partir del grupo que consiste en: hidroxilo; halógeno; C-carboxilo sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en: hidrógeno; ó, alquilo inferior insustituido; amino; ó, -NR1:1R12; alquilo inferior-alcoxilo insustituido; alquilo inferior-alcoxilo sustituido con uno ó más grupos halógeno; ariloxilo insustituido; ariloxilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en: alquilo inferior insustituido; alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno; hidroxilo; alquilo inferior-alcoxilo insustituido; halógeno; amino; ó, -NR1:LR12; S-sulfonamido, en donde R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo inferior insustituido; arilo insustituido; arilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en: halógeno; alquilo inferior insustituido; alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno; alquilo inferior-alcoxilo insustituido; amino; o, -NR?:LR12; heteroarilo insustituido; heteroarilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en: alquilo inferior insustituido; alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno; alquilo inferior-alcoxilo insustituido; hidroxilo; halógeno; amino; ó, -NR11R12; heteroalicíclico insustituido; heteroalicíclico sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en: halóqeno; hidroxilo; alquilo inferior insustituido; alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno; alquilo inferior-alcoxilo insustituido; amino; ó, R11R12; alquilo inferior-O-carboxilo insustituido; C-amido, en donde R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior insustituido, y arilo insustituido; y N-amido, en donde R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior insustituido, y arilo insustituido.

5. El compuesto de la reivindicación 3, en donde R3, R4, R5 y R6 se seleccionan a partir del grupo que consiste en: hidrógeno; halógeno; alquilo inferior insustituido; alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos seleccionados a partir del grupo que consiste en: hidroxilo; halógeno; C-carboxilo sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en: hidrógeno; o, alquilo inferior insustituido; amino; ó, -NR1:LR12; alquilo inferior-alcoxilo insustituido; alquilo inferior-alcoxilo sustituido con uno ó más grupos halógeno; ariloxilo insustituido; ariloxilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en: alquilo inferior insustituido; alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno; hidroxilo; alquilo inferior-alcoxilo insustituido; halógeno; amino; ó, -NR11R12; S-sulfonamido, en donde R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo inferior insustituido; arilo insustituido; arilo sustituido con uno ó más qrupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en: halógeno; alquilo inferior insustituido; alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno; alquilo inferior-alcoxilo insustituido; amino; ó, -NR^R12; heteroarilo insustituido; heteroarilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en: alquilo inferior insustituido; alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno; alquilo inferior-alcoxilo insustituido; hidroxilo; halógeno; amino; ó, heteroalicíclico insustituido; heteroalicíclico sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en: halógeno; hidroxilo; alquilo inferior insustituido; alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos halógeno; alquilo inferior-alcoxilo insustituido; amino; ó, R^R12; alquilo inferior-O-carboxilo insustituido; C-amido, en donde R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior insustituido, y arilo insustituido; y, N-amido, en donde R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del qrupo que consiste en hidróqeno, alquilo inferior insustituido, y arilo insustituido:

6. El compuesto de la reivindicación 1, en donde: R1, R2, R3, R4, R5, R6 y R7 son hidrógeno; R8 y R10 son metilo; y R9 es -(CH2) (CH2)C(=0)0H.

7. Una composición farmacéutica, la cual comprende: el compuesto de la reivindicación 6; y un vehículo ó excipiente fisiológicamente aceptable.

8. El compuesto de la reivindicación 1, en donde: R1, R2 y R7 son hidrógeno; R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en: hidrógeno; hidroxilo; halógeno; alquilo inferior insustituido; alquilo inferior sustituido con un ácido carboxílico; alcoxilo inferior insustituido; ácido carboxílico; arilo insustituido; arilo sustituido con uno ó más de alquilo inferior-alcoxilo insustituido; ó, morfolino; R8 se selecciona a partir del grupo que consiste en hidrógeno y alquilo inferior insustituido; R9 es -(CH2) (CH2)C(=0)OH; y, R10 es alquilo inferior insustituido.

9. El compuesto de la reivindicación 2, en donde R7 se selecciona a partir del grupo que consiste en: hidrógeno; alquilo inferior insustituido; y, alquilo inferior sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en: cicloalquilo insustituido; arilo insustituido, y, arilo sustituido con un grupo seleccionado a partir de hidroxilo, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, y halógeno.

10. El compuesto de la reivindicación 2, en donde Z se selecciona a partir del grupo que consiste en: -C(=0)NR13R14, en donde R13 y R14 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en: hidrógeno, alquilo inferior insustituido, alquilo inferior sustituido con un grupo seleccionado a partir del grupo que consiste en amino y -NR1:LR12, arilo insustituido, arilo sustituido con uno ó más grupos seleccionados a partir del grupo que consiste en halógeno, hidroxilo, alquilo inferior-alcoxilo insustituido, y trihalometilo, heteroarilo insustituido, heteroalicíclico insustituido, y, combinado, un heterocíclico insustituido de cinco miembros ó de seis miembros, y, -NR1:LR12, en donde: R11 y R 2 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en alquilo inferior insustituido, y combinados, un anillo heteroalicíclico insustituido de cinco miembros ó de seis miembros.

11. El compuesto de la reivindicación 1, en donde: R7 se selecciona a partir del grupo que consiste en alquilo inferior insustituido; alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos seleccionados a partir del grupo que consiste en: cicloalquilo insustituido, arilo insustituido, arilo sustituido con uno ó más grupos independientemente seleccionados a partir del grupo que consiste en halógeno, y alquilo inferior-alcoxilo insustituido, y alquilo inferior-carboxilalquilo insustituido, y, Z se selecciona a partir del grupo que consiste en C-carboxilo insustituido, y alquilo inferior-C-carboxilo insustituido.

12. El compuesto de la reivindicación 1, en donde: R3, R4, R5 y R6 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en: hidrógeno, halógeno, alquilo inferior insustituido, alquilo inferior sustituido con uno ó más grupos hidroxilo, alcoxilo inferior insustituido, arilo insustituido, arilo sustituido con uno ó más grupos alcoxilo inferior insustituido, y, S(0)2NR1:LR12, R5 es hidrógeno, R6 es -NR11R12, y, R11 y R12 se seleccionan independientemente a partir del grupo que consiste en hidrógeno, alquilo inferior insustituido, y combinados, un anillo heteroalicíclico insustituido de cinco miembros ó de seis miembros.

13. Un método para la modulación de la actividad catalítica de una cinasa de proteína, el cual comprende poner en contacto esta cinasa de proteína con un compuesto, sal ó profármaco de la reivindicación 1.

14. El método de la reivindicación 13, en donde la cinasa de proteína se selecciona a partir del grupo que consiste en una cinasa de tirosina receptora, una cinasa de tirosina no receptora, y una cinasa de serina-treonina.

15. Una composición farmacéutica, la cual comprende: un compuesto, sal ó profármaco de la reivindicación 1; y, un vehículo ó excipiente fisiológicamente aceptable.

16. Un método para el tratamiento ó la prevención de un desorden relacionado con cinasa de proteína en un organismo, el cual comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto, sal ó profármaco de la reivindicación 1, a este rganismo.

17. El método de la reivindicación 16, el cual comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del ácido 3- [2 , 4-dimetil-5- (2-oxo-l , 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico a este organismo.

18. El método de la reivindicación 16, en donde el desorden relacionado con cinasa de proteína se selecciona a partir del grupo que consiste en un desorden relacionado con cinasa de tirosina receptora, un desorden relacionado con cinasa de tirosina no receptora, y un desorden relacionado con cinasa de serina-treonina.

19. El método de la reivindicación 16, en donde el desorden relacionado con cinasa de proteina se selecciona a partir del grupo que consiste en un desorden relacionado con EGFR, un desorden relacionado con PDGFR, un desorden relacionado con IGFR, y un desorden relacionado con flk.

20. El método de la reivindicación 16, en donde el desorden relacionado con cinasa de proteína es un cáncer seleccionado a partir del grupo que consiste en carcinoma de células escamosas, astrocitoma, sarcoma de Kaposi, glioblastoma, cáncer del pulmón, cáncer de la vejiga, cáncer de la cabeza y el cuello, melanoma, cáncer del ovario, cáncer de la próstata, cáncer del pecho, cáncer del pulmón de células pequeñas, glioma, cáncer colorrectal, cáncer genitourinario y cáncer gastrointestinal.

21. El método de la reivindicación 16, en donde el desorden relacionado con cinasa de proteína se selecciona a partir del grupo que consiste en diabetes, un desorden autoinmune, un desorden de hiperproliferación, restenosis, fibrosis, psoriasis, osteoartritis, artritis reumatoide, angiogénesis, un desorden inflamatorio, un desorden inmunológico y un desorden cardiovascular.

22. El método de la reivindicación 16, en donde el organismo es un ser humano.

23. Un compuesto a partir del grupo que consiste en: ácido 3- [5- ( 5-cloro-2 -oxo-1 , 2 -dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3- [ 5- ( 6-metoxi-2 -oxo-1 , 2 -dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3-[5- (5-cloro-2-oxo-l , 2 -dihidroindol-3-ilidenmetil) -2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3- [4-meti1-5- (2-oxo-l , 2 -dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3- [2 , 4-dimetil-5- (2-oxo-l , 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3- [5- (5-bromo-2 -oxo-1, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3- [ 5- (5-yodo-2 -oxo-1 ,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3-[4-metil-5-(4-metil-2-oxo-l, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3-[4-metil-5-(5-metil-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3- [5- (5, 6-dimetoxi-2-oxo-l, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3- [5- (6-cloro-2-oxo-1, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, metiléster del ácido 3-[2-carboxietil) -3-metil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -2-OXO-2 , 3-dihidro-lH-indol-5-carboxílico, ácido 3-[4- (2-carboxietil) -3-metil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -2-OXO-2 , 3-dihidro-lH-indol-5-carboxílico, ácido 3-[4-metil-5-(2-oxo-5-sulfamoíl-l,2-dihidroindol-3-iliden-metil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3- [4-meti1-5- (5-metilsulfamoíl-2-oxo-l , 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3-{3-[4-2-carboxietil) -3-metil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -2-oxo-2 , 3-dihidro-lH-indol-5-il}-propiónico, ácido 3- [5- (5-eti1-2-oxo-1, 2-dihidro-indol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3-[5- (5-metoxi-2-oxo-l, 2-dihidroindol-3- ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3- [5- (5-bromo-2-oxo-l, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3- [5- (5-yodo-2-oxo-l, 2 -dihidroindol-3-ilidenmetil) -2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3-[2,4-dimetil-5-(4-metil-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3-[2,4-dimetil-5-(5-metil-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3-[5- (6-hidroxi-2-oxo-l, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3- [5- (6-metoxi-2-oxo-l , 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3- [5- ( 6-hidroxi-2-oxo-1, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, 3 , 5-dimetoxibenciléster del ácido 3- [5- (6-hidroxi-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3.-{5-[6-(3-metoxifenil)-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil] -2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il}-propiónico, ácido 3-[5- (6-bromo-2-oxo-l, 2 -dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3-{5-[6-metoxifenil) -2-oxo-l, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil] -4-metil-lH-pirrol-3-il}-propiónico, ácido 3-{5-[3-etoxifenil) -2-oxo-l, 2-dihidroindol-3- ilidenmetil] -2, 4-dimetil-lH-pirrol-3-il}-propiónico, ácido 3-{5-[6-(3-etoxifenil) -2-oxo-l, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil ] -4-metil-lH-pirrol-3-il}-propiónico, ácido 3-[2,4-dimetil-5-(2-oxo-6-fenil-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3-[4-metil-5-(2-oxo-6-fenil-l , 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3-{5-[6-(4-metoxifenil) -2-oxo-l, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil] -4-metil-lH-pirrol-3-i1}-propiónico, ácido 3-{5-[6-(4-metoxifenil) -2-oxo-l,2-dihidroindol- 3-ilidenmetil] -2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il}-propiónico, ácido 3-{5- [ 6- (2-metoxifenil) -2-oxs-l , 2-dihidroindol-3-ilidenmetil] -4-metil-lH-pirrol-3-il} -propiónico, ácido 3-{5-[6-(2-metoxifenil) -2-oxo-l, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil]-2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il}-propiónico, ácido 3-[2,4-dimetil-5-(6-morfolin-4-il-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3- [5- (5-cloro-4-metil-2-oxo-l , 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -2 , 4-dimetil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3-[5-(5-cloro-4-metil-2-oxo-l,2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -4-metil-lH-pirrol-3-il] -propiónico, ácido 3-[2 , 4-dimetil-5- (2-oxo-l, 2-dihidroindol-3-ilidenmetil) -lH-pirrol-3-il] -propiónico, sal sódica.

24. Un compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste en: 3- [ 3 , 5-dimetil-4- (3-morfolin-4-ilpropil) -lH-pirrol-2-ilmetilen]-l, 3-dihidroindol-2-ona, 5-bromo-3-[3 , 5-dimetil-4- (3-morfolin-4-ilpropil) -1H-pirrol-2-ilmetilen] -1, 3-dihidroindol-2-ona, 3-[3,5-dimetil-4-(3-morfolin-4-ilpropil) -lH-pirrol-2-ilmetilen]-6-fenil-l, 3-dihidroindsl-2-ona, 3-[3,5-dimetil-4-(3-morfolin-4-ilpropil) -lH-pirrol-2-ilmetilen] -6- (2-metoxifenil) -1 , 3-dihidroindol-2-ona, 3- [ 3 , 5-dimetil-4- (3-morfolin-4-ilpropil) -lH-pirrol-2-ilmetilen] -6- (3-metoxifenil) -1, 3-dihidroindol-2-ona, 3- [ 3 , 5-dimetil-4- (3-morfolin-4-ilpropil) -lH-pirrol-2-ilmetilen] -6- (4-metoxifenil) -1, 3-dihidroindol-2-ona, 3-[4-(3-dimetilaminopropil) -3, 5-dimetil-lH-pirrol-2-il etilen] -1, 3-dihidroindol-2-ona, 5-bromo-3- [ 4- (3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -1, 3-dihidroindol-2-ona, 3-[4-(3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -6-fenil-l, 3-dihidroindol-2-ona, 3-[4-(3-dimetilaminopropil) -3, 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -6- (2 -metoxifenil) -1, 3 -dihidroindol-2-ona, 3-[4-(3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -6- (3-metoxifenil) -1, 3-dihidroindol-2-ona, 3-[4-(3-dimetilaminopropil) -3, 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -6- (4-metoxifenil) -1 , 3-dihidroindol-2-ona, 5-cloro-3-[ 4- (3-dimetilaminopropil) -3, 5-dimetil-ÍH-pirrol-2-ilmetilen]-l, 3-dihidroindol-2-ona, 6-cloro-3- [4- (3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -1, 3-dihidroindol-2-ona, 3-[4-(3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -5-metoxi-l, 3-dihidroindol-2-ona, 3-[4-(3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -6-metoxi-l, 3-dihidroindol-2-ona, 3-[4-(3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -5-metil-l, 3-dihidroindol-2-ona, 3-[4-(3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -4-metil-l, 3-dihidroindol-2-ona, 3-[4- (3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -4- (2-hidroxietil) -1, 3-dihidroindol-2-ona, amida del ácido 3- [4- (3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen-2-oxo-2 , 3-dihidro-lH-indol-5-sulfónico, isopropilamida del ácido 3- [4- (3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -2-oxo-2 , 3-dihidro-lH-indol-5-sulfónico, 3-[4-(3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -5- (morfolin-4-sulfonil) -1, 3-dihidroindol-2-ona, dimetilamida del ácido 3- [4- (3-dimetilaminopropil) -3 , 5-dimetil-lH-pirrol-2-ilmetilen] -2-OXO-2 , 3-dihidro-lH-indol-5-sulfónico.