MXPA00007889A

MXPA00007889A - Optimizacion de las propiedades inmunomoduladoras de las vacunas geneticas.

Info

Publication number: MXPA00007889A
Application number: MXPA00007889A
Authority: MX
Inventors: Juha Punnonen
Original assignee: Maxygen Inc
Priority date: 1998-02-11
Filing date: 1999-02-10
Publication date: 2002-09-18
Also published as: EP1053312A2; AU2674299A; EP1053343A2; WO1999041369A3; MXPA00007891A; WO1999041369A2; WO1999041368A2; MXPA00007893A; JP2002507392A; AU3291099A; AU2674199A; JP2002503461A; CA2320626A1; WO1999041368A3; CA2320960A1; EP1056842A2; CA2320431A1; WO1999041402A2; JP2002503478A; WO1999041402A3

Abstract

La presente invencion, proporciona metodos para la obtencion de moleculas que pueden modular una respuesta inmunologica, y moleculas inmunomoduladoras obtenidas mediante el uso de dichos metodos. Las moleculas encuentran uso, por ejemplo, en el diseno de una respuesta inmunologica inducida por una vacuna genetica para un proposito deseado.

Description

OPTIMIZACION DE LAS PROPIEDADES INMUNOMODULADORAS DE LAS VACUNAS GENÉTICAS CampQ del Invento. La presente invención pertenece al campo de la modulación de las respuestas inmunológicas, tales como aquellas inducidas por las vacunas genéticas.

Antecedentes del Invento El procesamiento antígeno y la presentación, es solamente un factor el cual determina la efectividad de la vacunación, ya sea que se realice con vacunas genéticas o con métodos más clásicos. Otras moléculas comprendidas en la determinación de la efectividad de la vacuna, incluyen las citocinas (interleuquinas, interferonas, quimiocinas, factores hematopoiéticos del crecimiento, factores de necrosis del tumor y factores de transformación del crecimiento), los cuales son proteínas con un peso molecular pequeño que regulan la maduración, activación, proliferación y diferenciación de las células en el sistema inmunológico. Las características de las citocinas son, la pliotropía y la redundancia; esto es, que una citocina frecuentemente tiene varias funciones y una función determinada, es mediada con frecuencia, por más de una citocina. Además, varias citocinas tienen efectos aditivos o sinergísticos con otras citocinas, y una cantidad de citocinas, también tienen componentes que comparte el receptor. Debido a la complejidad de las redes de citocina, han sido difíciles los estudios a cerca del significado fisiológico de una citocina determinada, aunque en estudios recientes que utilizan los ratones con genes deficientes en citocinas han mejorado de manera significativa nuestra comprensión a cerca de las funciones de las citocinas in vivo. Además de las proteínas solubles, varias moléculas co-estimulantes del enlace de membranas, juegan un rol fundamental en la regulación de las respuestas inmunológicas. Estas moléculas ¡ncluyen el CD40, el ligando CD-40, CD27, CD80, CD86 y CD150 (SLAM), y éstos son expresados típicamente en las células linfoides después de la activación, por medio del reconocimiento antígeno o a través de las interacciones de célula a célula. Las células T auxiliares (TH), que son reguladores clave del sistema inmunológico, que tienen la capacidad de producir una gran cantidad de citocinas diferentes y basadas en su patrón de síntesis de citocina, las células TH son divididas en dos subconjuntos (Paul and Seder (1994), Cell 76: página 241 a 251 ). Las células TH 1 producen altos niveles de células I L-2 e IFN-?, y ningún nivel o niveles mínimos de IL-4, I L-5 e IL-13. En contraste las células TH2 , producen niveles altos de I L-4, IL-5 e IL-13, y la producción de I L-2 e IFN-? es mínima o está ausente. Las células TH 1 activan los macrófagos, las células dendríticas y aumentan la actividad citolítica de[ citotóxico CD8+, los linfocitos T y las células NK (Id.), mientras que las células TH2 , proporcionan una ayuda eficiente a las células B y también son mediadoras en las respuestas alérgicas debido a la capacidad de las células TH2 para inducir el cambio del isotipo IgE y la diferenciación de las células B en las células secretoras IgE (De Vries and Punnonen ( 1996) en cytokine regulation of humoral immunity: basic and clinical aspects. Editores Snapper, C.M . , John Wiley & Sons, Limited, West Sussex, UK, páginas de la 195 a la 215). Los mecanismos exactos que regulan la diferenciación de las células auxiliares T, no se comprenden de manera completa, pero se cree que las citocinas juegan un rol importante. Se ha mostrado que la I L-4, dirige la diferenciación de la T 2, mientras que la I L-12 induce el desarrollo de las células TH 1 (Paul and Seder, supra. ). Además, se ha sugerido que las moléculas co-estimulantes del enlace de membrana, tales como, las CD80, CD86 y CD150, pueden dirigir el desarrollo' de las células TH 1 y/o TH2 , y que las mismas moléculas que regulan la diferenciación de las células TH , afectan también la activación, proliferación y diferenciación de las células B en las células secretoras de plasma Ig (Cocks y Asociados ( 1995) Nature 376: páginas 260 a 263; Lenschow y Asociados (1996) Immunity 5: páginas 285 a 293; Punnonen y Asociados (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci E. U.A. 90: páginas 3730 a 3734; Punnonen y Asociados (1997) J. Exp. Med. 185: páginas 993 a 1004).

Los estudios, tanto en el hombre como en ratones, han demostrado que el perfil de síntesis de las citocinas de las células auxiliares T (TH) , juega un rol crucial en la determinación para solucionar varias infecciones ocasionadas por virus, bacterias y parásitos. La alta frecuencia de células TH 1 , protege generalmente de infecciones letales, mientras que el fenotipo T 2 dominante, frecuentemente resulta en infecciones diseminadas y crónicas. Por ejemplo, el fenotipo TH 1 se observa en su forma tuberculoide (resistente) de la lepra y el fenotipo T 2 en lesiones leprosas y multibacilares (susceptibles) (Yamamura y Asociados ( 1991 ) Science 254: páginas 277 a 279). De un modo similar, los pacientes terminales de VI H, tienen perfiles de síntesis de citocinas similares al TH2 y se ha propuesto que el fenotipo TH 1 , protege del virus del SIDA (Maggi y Asociados (1994) J. Exp. Med 180: páginas de 489 a 495). Además, la supervivencia de la septisemia meningococal es determinada genéticamente, basada en la capacidad de los leucocitos periféricos sanguíneos para producir TN F-a e I L-10. Los individuos, provenientes de familias con alta producción de IL-10, tienen un riesgo aumentado de la enfermedad fatal meningococal, mientras que los miembros de familias con una producción alta de TNF-a, es más probable que sobrevivan a la infección (Westendorp y Asociados (1997) Lancet 349: páginas 170 a 173). Los tratamientos a base de citocinas, pueden influir de manera dramática en la diferenciación de las células TH 1 /TH2 y la activación de macrófagos y, por lo tanto pueden curar enfermedades infecciosas. Por ejemplo, un ratón BALB/c infectado con Leishmanía Major, desarrollan una enfermedad diseminada fatal con un fenotipo TH2 , pero cuando son tratados con anti-I L-4 mAbs o IL-12, la frecuencia de las células TH 1 en el ratón aumenta, y por lo tanto pueden contrarrestar la invasión patógena (Chatelain y Asociados (1992) J. Immunol. 148: páginas 1 182 a 1 187). De un modo similar, el I FN-? protege a los ratones del virus letal del Herpes Simplex (HSV) y el MCP-1 evita infecciones letales por Pseudomonas aeruginosa o Salmonella typhimurium. Además, los tratamientos a base de citocinas, tales como el recombinante I L-2, han mostrado efectos benéficos en los humanos con una variable común de inmunodeficiencia (Cunningham-Rundles y Asociados ( 1994) N. Engl. J. Med. 331 : páginas 918 a 921 . La administración de citocinas y otras moléculas para modular la respuesta ¡nmunológica, de una manera más apropiada para el tratamiento de una enfermedad particular, puede proporcionar una herramienta importante para el tratamiento de la enfermedad. Sin embargo, los tratamientos inmunomoduladores disponibles en la actualidad, pueden tener varias desventajas, tales como, la actividad específica insuficiente, la inducción de respuestas inmunológicas contra, el ¡nmunomodulador que es administrado, y otros problemas potenciales. Por lo tanto, existe una necesidad de inmunomoduladores que presenten propiedades mejoradas con relación a aquellos que se encuentren disponibles en la actualidad.

La presente invención, tiene el propósito de cubrir esta y otras necesidades.

Sumario del Invento La presente invención proporciona métodos para la obtención de un polinucleótido que tiene un efecto modulador sobre una respuesta inmunológica, que es inducida por una vacuna genética, ya sea directamente (por ejemplo, en la forma de un polinucleótido inmunomodulador) o indirectamente (por ejemplo, por medio de la traslación del polinucleótido, para crear un polipéptido inmunomodulatorio). Los métodos de la presente invención comprenden: la creación de una biblioteca de polinucleótidos recombinantes; y la selección en la biblioteca para identificar por lo menos un polinucleótido recombinante optimizado, que exhiba, ya sea, por sí mismo o a través del polipéptido codificado, una capacidad aumentada para modular una respuesta ¡nmunológica que ha creado una forma de ácido nucleico a partir de la biblioteca que fue creada. Los ejemplos incluyen , las secuencias CpG ricas en polinucleótidos, las secuencias de polinucleótidos que codifican un co-estimulador (por ejemplo, B7-1 , B7-2, CD1 , CD40, CD154 (ligando para CD40), CD 150 (SLAM) o una citocina). El paso de selección usado en estos métodos, puede incluir, por ejemplo, la introducción de vectores de vacuna genética, los cuales comprenden la biblioteca de ácidos nucleicos recombinantes dentro de una célula, y la identificación de las células que exhiben una capacidad aumentada para modular una respuesta inmunológica de interés o una capacidad aumentada, para expresar una molécula inmunomodulatoria. Por ejemplo, una biblioteca de ácidos nucleicos recombinantes con codificadores de citocina, pueden ser seleccionados por medio de la prueba de la habilidad de las citocinas codificadas por los ácidos nucleicos para activar las células que contienen un receptor para la citocina. El receptor para la citocina, puede ser nativo a la célula o puede ser expresado a partir de un ácido nucleico heterólogo que codifica el receptor de citocina. Por ejemplo, los co-estimulantes optimizados, pueden ser probados para identificar aquellos por los cuales las células o el medio de cultivo, tienen la capacidad de inducir una respuesta ¡nmunológica de TH2 predominantemente, o una respuesta inmunológica predominantemente de TH 1 . En algunas modalidades, el polinucleótido que tiene un efecto modulatorio sobre una respuesta inmunológica, es obtenido por medio de: (1 ) la recombinación de, por lo menos, una primera y segunda formas de un ácido nucleico, que es, o codifica una molécula que es, comprendida en la modulación de una respuesta inmunológica, en donde la primera y segunda formas difieren una de la otra, por dos o más nucleótidos, para producir una biblioteca de polinucleótidos recombinantes; y (2) la selección de la biblioteca para identificar por lo menos un polinucleótido recombinante optimizado que exhibe, ya sea por sí mismo o a través del polipéptido codificado, una capacidad aumentada para modular una respuesta inmunológica que una forma de ácido nucleico, a partir del cual la biblioteca fue creada. Si se desea la optimización adicional, el método puede comprender adicionalmente: (3) la recombinación de, por lo menos, un polinucleótido recombinante optimizado con una forma adicional de ácido nucleico, el cual está en la misma forma o en formas diferentes a la primera y la segunda, para producir una biblioteca adicional de polinucleótidos recombinantes; (4) la selección de la biblioteca adicional, para identificar por lo menos, un polinucleótido recombinante optimizado que exhiba una capacidad aumentada para modular una respuesta inmunológica, que una forma de ácido nucleico a partir del cual fue creada la biblioteca; y (5) repetir (3) y (4), según sea necesario, hasta que el polinucleótido recombinante optimizado, exhiba una habilidad aumentada adicional para modular una respuesta inmune que una forma de ácido nucleico a partir del cual la biblioteca fue creada. En algunas modalidades de la presente invención , la biblioteca de polinucleótidos recombinantes, es seleccionada por medio de: la expresión de los polinucleótidos recombinantes de modo que los péptidos o polipéptidos codificados, sean producidos como fusiones con una proteína mostrada en la superficie de un paquete genético que se puede replicar; poniendo en contacto los paquetes genéticos que se pueden replicar con una pluralidad de células que muestran el receptor, e identificando las células que exhiben una modulación de la respuesta inmunológica mediada por el receptor.

La presente invención, también proporciona métodos para la obtención de un polinucleótido, que codifica una molécula accesoria que mejora el transporte o presentación de los antígenos por una célula. Estos métodos, comprenden la creación de una biblioteca de polinucleótidos recombinantes, sometiéndolos a ácidos nucleicos de recombinación que codifican todo o parte de la molécula accesoria; y seleccionando la biblioteca para identificar un polinucleótido recombinante optimizado que codifica una molécula accesoria recombinante que confiere a la célula una capacidad aumentada o disminuida para transportar o presentar un antígeno en la superficie de la célula comparada con una molécula accesoria codificada por el ácido nucleótido no recombinante. En algunas modalidades, el paso de selección comprende: la introducción de la biblioteca de polinucleótidos recombinantes en un vector de vacuna genética que codifica un antígeno para formar una biblioteca de vectores; la introducción de la biblioteca de vectores en células de mamíferos; y la identificación de las células de mamífero que exhiben inmunogenicidad aumentada o disminuida al antígeno. En algunas modalidades de la presente invención , la citocina que es optimizada es la interleuquina-12 y la selección es realizada, cultivando células de mamífero, las cuales contienen vectores de vacuna genética en un medio de cultivo, y detectando si la proliferación de la célula T o la diferenciación de la célula T, es inducida por el contacto con el medio de cultivo. En otra modalidad, la citocina es interferon-a y la selección es realizada, expresando el módulo del vector recombinante como una proteína de fusión, la cual es mostrada en la superficie de un bacteriófago para formar una biblioteca de muestra fago, e identificando los miembros de la biblioteca fago, los cuales tienen la capacidad de inhibir la proliferación de la línea celular B. Otra modalidad , utiliza el B7-1 (CD80) o B7-2 (CD86), como el co-estimulante y la célula o medio de cultivo, es probado para determinar su capacidad para modular una respuesta inmunológica. La presente invención, proporciona métodos para el uso del arrastre de ADN, para obtener módulos de vector recombinante optimizados que codifican las citocinas y otros co-estimulantes que exhiben inmunogenicidad reducida, comparados con un péptido correspondiente codificado por un módulo vector no optimizado. La inmunogenicidad reducida puede ser detectada, introduciendo una citocina o un co-estimulante codificado por el módulo del vector recombinante dentro de un mamífero y determinando si una respuesta inmunológica es inducida contra la citocina. La presente invención, también proporciona métodos para la obtención de secuencias inmunomodulatorias optimizadas que codifican un antagonista de citocina. Por ejemplo, los agonistas de citocina adecuados, incluyen un receptor de citocina soluble y un receptor de citocina transmembrana que tienen una secuencia de signos defectuosos. Los ejemplos incluyen ?I L-10R y ?I L-4R, y similares.

Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 , muestra un ejemplo de una secuencia de inducción de célula T citotóxica (CTIS), obtenida a partir del polipéptido HBsAg (PreS2 más regiones S). La Figura 2, muestra un CTIS que tiene epítopes heterólogos adheridos a la porción citoplásmica. La Figura 3, muestra la derivación de secuencias agonísticas inmunogénicas (IAS), tal y como se describieron en el Ejemplo 3. La muerte específica (por ciento) se muestra para un efectuador: objetivo (E:T) proporción de cinco. La Figura 4, muestra un método para la preparación de secuencias inmunogénicas agonistas (IAS). De tipo natural (WT) y formas mutadas de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido de interés, tal y como es ensamblado y sometido al arrastre de ADN con el objeto de obtener la codificación del ácido nucleico y una región poliepítope que contiene la secuencia agonista potencial. La Figura 5, muestra un esquema para mejorar las secuencias inmunoestimulantes por medio del arrastre de ADN . La Figura 6, es un diagrama de un procedimiento, por medio del cual, las bibliotecas recombinantes de genes humanos IL-12 pueden ser seleccionadas para identificar los genes I L-12 arrastrados que codifican el recombinante I L-12 que tiene una capacidad aumentada para inducir la proliferación de células T. La Figura 7, muestra los resultados de un ensayo funcional de alto rendimiento para los vectores que codifican las variantes de IL-12 obtenidas usando el método de la presente invención. La Figura 8, muestra la inducción de proliferación de células T, en la transfección de las células T, por medio de vectores individuales que codifican las variantes de IL-12. La Figura 9, muestra los resultados de un experimento, el cual demuestra que una quimera I L-1 arrastrada, obtenida usando los métodos de la presente invención, exhibe una capacidad mejorada para activar las células T humanas. La Figura 10, muestra un modelo de la forma en que la activación de la célula T o anergia puede ser inducida por medio de vectores de vacuna genética que codifican variantes diferentes de B7-1 (CD80) y/o B7-2 (CD86). La Figura 1 1 , muestra un método para usar el arrastre de ADN, con el objeto de obtener variantes de CD80/CD86, que tienen una capacidad mejorada para inducir la activación o anergia de la célula T. La Figura 12, muestra los resultados obtenidos en un ensayo de selección de la función alterada del B7. . La Figura 13, proporciona resultados experimentales, los cuales demuestran que las quimeras B7 arrastradas, producen la activación potente de la célula T. La Figura 14, presenta una alineación de secuencias de nucleótidos, para secuencias receptoras IL-10 humanas y de ratón .

La Figura 15, muestra una alineación de secuencias de nucleótidos de genes B7-1 (CD80) de humanos, monos rhesus y conejo.

Descripción Detallada del Invento. Definiciones El término "citocina" incluye, por ejemplo, interleuquinas, interferonas, quimiocinas, factores hematopoiéticos de crecimiento, factores de necrosis de tumor y factores de transformación de crecimiento. En general, estas son proteínas, con un peso molecular pequeño que regula la maduración , activación, proliferación y diferenciación de células del sistema inmunológico. El término "selección" (screening) describe, en general, un proceso que identifica las moléculas inmunomoduladoras óptimas. Se pueden usar varias propiedades de las moléculas respectivas en la selección incluyendo, por ejemplo, la capacidad para inducir una respuesta inmunológica deseada en un sistema de prueba. La selección es una forma de "screening", en la cual se logran, la identificación y separación física simultáneamente por medio de la expresión de un marcador de selección, el cual, en algunas circunstancias genéticas, permite que las células que expresan el marcador, sobrevivan, mientras otras células mueren (o viceversa). Los marcadores de selección incluyen , por ejemplo, luciferasa betagalactosidasa, y proteína fluorescente verde. Los marcadores de la selección, incluyen genes resistentes a las drogas y toxinas, y similares. Debido a las limitaciones en el estudio de las respuestas ¡nmunológicas primarias in vitro, los estudios in vivo son métodos de selección particularmente útiles. En estos estudios, las vacunas genéticas que incluyen moléculas ¡nmoduladoras, son introducidas primero para hacer pruebas en animales, y las respuestas inmunológicas son estudiadas subsecuentemente por medio de respuestas inmunológicas protectoras, las cuales son analizadas o por medio del estudio de la calidad o fuerza de la respuesta inmunológica inducida, usando células linfoides derivadas de un animal inmunizado. Aunque la selección espontánea puede y ocurre en el curso de la evolución natural, en los métodos de la presente invención, la selección es realizada por medio del hombre. Un "segmento exógeno de ADN", "secuencia heteróloga" o un "ácido nucleico heterólogo", tal y como se usan en la presente invención, es uno que se origina de una fuente externa a la célula hospedera particular, o, si proviene de la misma fuente, es modificado de su forma original. Por lo tanto, un gen heterólogo en una célula hospedera incluye un gen que es endógeno a la célula hospedera particular, pero que ha sido modificado. La modificación de la secuencia heteróloga en las aplicaciones descritas en la presente invención, ocurre generalmente a través del uso del arrastre de ADN . Por lo que, los términos se refieren a un segmento de ADN, el cual es extraño o heterólogo a la célula, u homólogo a la célula pero en una posición dentro del ácido nucleico de la célula hospedera, en la cual el elemento no es encontrado normalmente.

Los segmentos, exógenos de ADN son expresados para producir polipéptidos exógenos. El término "gen" es usado ampliamente para referirnos a cualquier segmento de ADN asociado con una función biológica. De este modo, gen incluye secuencias codificadoras y/o las secuencias reguladoras requeridas para su expresión. Los genes, también incluyen segmentos de ADN no expresados que, por ejemplo, forman secuencias de reconocimiento para otras proteínas. Los genes pueden ser obtenidos de una variedad de fuentes, incluyendo la clonación de una fuente de interés o la sintetización de información de secuencia conocida o anticipada, y puede incluir secuencias diseñadas para tener los parámetros deseados. El término "aislado", cuando es aplicado a un ácido nucleico o proteína indica que el ácido nucleico o proteína, está esencialmente libre de otros componentes celulares con los cuales está asociado en su estado natural. Es preferible un estado homógeno, aunque puede estar, ya sea en un estado seco o en solución acuosa. La pureza y homogenicidad, son determinadas normalmente, usando técnicas de química analítica, tales como, la electroforesis de gel de poliacrilamida o la cromatografía líquida de alto rendimiento. Una proteína, la cual es la especie predominante presente en una preparación es substancialmente purificada. En particular, un gen aislado es separado de los marcos de lectura abierta, los cuales flanquean el gen y codifican una proteína diferente al gen de interés. El término "purificado", indica que un ácido nucleico o proteína, origina esencialmente a una banda en un gel electroforético. Particularmente, significa que el ácido nucleico o proteína, es por lo menos aproximadamente 50% puro, más preferentemente, por lo menos aproximadamente 85% puro, y aún más preferentemente por lo menos aproximadamente 99% puro. El término "que ocurre de manera natural", es usado para describir un objeto que puede ser encontrado en la naturaleza como diferente al que es producido artificialmente por el hombre. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos que está presente en un organismo (incluyendo, viruses, bacterias, protozoarios, insectos, plantas o tejidos mamíferos) que puede ser aislado de una fuente de la naturaleza, y el cual no ha sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio, es algo que ocurre de manera natural. El término "ácido nucleico", se refiere a desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos, ya sea en la forma de trenzado simple o doble. A menos que esté específicamente limitado, el término comprende los ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales, los cuales tienen propiedades de enlace similares a las de los ácidos nucleótidos de referencia y que son metabolizados de una manera similar a los nucleótidos que ocurren de manera natural . A menos que se indique de otra manera, una secuencia de ácido nucleico particular, también comprende implícitamente las variantes del mismo, modificadas de manera conservadora (por ejemplo, substitución de degeneración de codón) y las secuencias complementarias, así como, las secuencias indicadas explícitamente. Específicamente, las substituciones degeneradas de codón pueden ser logradas por las secuencias de degeneración, en las cuales, la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos), es substituida con residuos de desoxiinosina, mezclados básicos y/o desoxiinosina (Batzer y Asociados ( 1 991 ) Nucleic Acid Res. 19: página 5081 ; Ohtsuka y Asociados (1985) J. Biol. Chem. 260: páginas 2605 a 2608; Cassol y Asociados (1992); Rossolini y Asociados (1994) Mol. Cell. Probes 8: páginas 91 a 98). El término ácido nucleico es usado de manera intercambiable con gen, cADN y mARN codificado por un gen. "Acido Nucleico Derivado de un Gen", se refiere a un ácido nucleico, para cuya síntesis el gen , o una subsecuencia del mismo, ha servido finalmente como una plantilla. De este modo, un mARN , un cADN transcrito inverso de un mARN , un ARN transcrito de aquel cADN, un ADN amplificado a partir del cADN, un ARN transcrito del ADN simplificado, etc. , son todos derivados del gen, y la detección de dicho producto derivado es indicador de la presencia y/o abundancia del gen original y/o del gen transcrito en. una muestra. Un ácido nucleico es "enlazable de manera operable", cuando es colocado dentro de una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, un promotor o aumentador es enlazado de manera operable a una secuencia codificadora, si aumenta la transcripción de dicha frecuencia codificadora. Enlazado de manera operable, significa que las secuencias de ADN que están siendo enlazadas son generalmente contiguas y, cuando es necesario para unir dos regiones codificadoras de proteína, contiguas y en el marco de lectura. Sin embargo, algunos aumentadores, funcionan generalmente cuando son separados del promotor por varios kilobases y secuencias intrónicas que pueden ser de longitud variable, algunos elementos polinucleótidos pueden ser enlazados de manera operable, pero no contiguos. Una afinidad de enlace específica entre dos moléculas, por ejemplo, un ligante y un receptor, significa un enlace preferencial de una molécula por la otra en una mezcla de moléculas. El enlace de las moléculas puede ser considerado específico, si la afinidad de enlace es desde aproximadamente 1 x 104 M"1 hasta aproximadamente 1 x 106 M"1 o mayor. El término "recombinante", cuando es usado con referencia a una célula, indica que la célula replica un ácido nucleico heterólogo, o expresa un péptido o proteína codificado por un ácido nucleico heterólogo. Las células recombinantes, pueden contener genes que no son encontrados dentro de la forma nativa de la célula (no recombinapte). Las células recombinantes, también pueden contener genes encontrados en la forma nativa de la célula en donde los genes son modificados o se vuelven a introducir en la célula, por medios artificiales. El término, también comprende células que contienen un ácido nucleico endógeno a la célula que ha sido modificada sin remover el ácido nucleico de la célula; dichas modificaciones incluyen aquellas obtenidas por el remplazo del gen, mutación especifica del sitio y técnicas relacionadas. Un "cassette recombinante de expresión" o simplemente, "un cassette de expresión" es una construcción de ácido nucleico, generada de manera recombinante o sintética, con elementos de ácido nucleico que tienen la capacidad de afectar la expresión de un gen estructural en los hosteleros compatibles con dichas secuencias. Los cassettes de expresión incluyen por lo menos promotores y opcionalmente, señales de transcripción de terminación. Generalmente, el cassette recombinante de expresión incluye un ácido nucleico que va ha ser transcrito (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptico deseado), y un promotor. También, se pueden usar, tal y como se describen en la presente invención, los factores adicionales necesarios o útiles para efectuar la expresión. Por ejemplo, un cassette de expresión, también puede incluir secuencias de nucleótidos que codifican una secuencia de señal que dirige la secreción de una proteína expresada a partir de la célula hospedera. Las señales de transcripción de terminación, aumentadores y otras secuencias de ácido nucleico que influyen en la expresión del gen , también pueden ser incluidas en un cassette de expresión. Un "polinucleótido recombinante" o un "polipéptido recombinante", es un polinucleótido o polipéptido que no ocurren de manera natural y que ¡ncluyen ácido nucleico o secuencias de amino ácidos respectivamente, de una o más fuentes de ácido nucleico o polipéptidos, cuyos ácidos nucleicos o polipéptidos de la fuente pueden ser, ácidos nucleicos o polipéptidos que ocurren de manera natural, o pueden ellos mismos haber sido sometidos a mutagénesis u otro tipo de modificación. Los polinucleótidos o polipéptidos fuente, de los cuales se derivan las secuencias diferentes de ácido nucleico o amino ácido, a veces son homólogos (por ejemplo, tienen, o codifican un polipéptido que codifica, una estructura y o función similar o la misma), y que, por ejemplo, frecuentemente son de aislados, serotipos, deformaciones, especies, de organismos o de diferentes condiciones de enfermedad. Los términos "idéntico" o "porcentaje de identidad", en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son la misma o que tienen un porcentaje especificado de residuos de amino ácido o nucleótidos que son el mismo, cuando son comparados y alineados para una correspondencia máxima, tal y como se miden usando una de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por inspección visual. La frase "substancialmente idéntico", en el contexto de dos ácidos nucleicos o polipéptidos, se refiere a dos o más secuencias o subsecuencias que tienen por lo menos el 60%, preferentemente el 80%, más preferentemente del 90 al 95% de identidad de residuos de nucleótido o amino ácido, cuando son comparados y alineados para una correspondencia máxima, según son medidos usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por inspección visual. Preferentemente, existe la identidad substancial sobre una región de las secuencias que es de, por lo menos, 50 residuos de longitud, más preferentemente sobre una región de, por lo menos, aproximadamente 100 residuos y más preferente, las secuencias son substancialmente idénticas sobre por lo menos 150 residuos. En algunas modalidades, las secuencias son substancialmente idénticas sobre toda la longitud de las regiones de codificación. Para la comparación de la secuencia, generalmente una secuencia actúa como una secuencia de referencia, con la cual son comparadas las secuencias de prueba. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencia, las secuencias de prueba y referencia son ingresadas en una computadora, son designadas las coordenadas subsecuentes, si es necesario, y también son designados los parámetros del programa del algoritmo de secuencia. El algoritmo de secuencia de comparación, entonces calcula, el porcentaje de la identidad de secuencia, para la secuencia de prueba, en relación con la secuencia de referencia basado en los parámetros designados del programa. La alineación óptima de las secuencias para comparación, puede ser conducida, por ejemplo, por el algoritmo local de homología de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: página 482 (1981 ), por el algoritmo de homología de alineación de Needleman & Wunsh, J. Mol. Biol. 48: página 443 (1970), por la búsqueda del método de similitud de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci EUA 85: página 2444 ( 1 988), por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA, en el Paquete del Software de Genética de Winsconsin, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), o por inspección visual (ver generalmente a Ausubel y Asociados, infra). Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para la determinación del porcentaje de identidad de la secuencia y la similitud de la secuencia en el algoritmo BLAST, el cual está descrito en Altschul y Asociados, J. Mol. Biol. 215: páginas 403 a 410 (1990). El software para la realización del análisis BLAST, está disponible públicamente a través del National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/). Este algoritmo comprende, primero la identificación de los pares de secuencias de alta calificación (HSPs), identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de investigación, las cuales, ya sea que coinciden o satisfacen algún umbral valuado positivamente de la calificación T cuando son alineadas con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. A la T, nos referimos como un umbral de calificación de palabra de vecindad (Altschul y Asociados, supra). Estos golpes de palabra inicial de vecindad, actúan como semillas para la iniciación de búsquedas para encontrar HSPs más grandes que las contienen. Esta palabra, se usa entonces extendida en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia, en la medida que la calificación de alineación acumulativa puede ser aumentada. Las calificaciones acumulativas son calculadas usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (calificación de premio de un par de residuos coincidentes; siempre >0) y N (calificación de penalización para los residuos que no coinciden ; siempre <0). Para las secuencias de amino ácido, una matriz de calificación es usada para calcular la calificación acumulativa. La extensión de los golpes de palabra en cada dirección, son interrumpidos cuando la calificación de alineación acumulativa falla por la cantidad X a partir de su valor máximo logrado; la calificación de acumulación va a cero o inferior, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de calificación negativa, o que se halla alcanzado el nivel de cualquiera de las secuencias. Los parámetros W, T y X del algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación . El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) se usa como defaults a la longitud de las palabras (W) de 1 1 , una expectativa (E) de 10, un corte de 100, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de amino ácidos, el programa BLASTP, utiliza como defaults la longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y una matriz de calificación BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89: página 10915). Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST, también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin & Altschul (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. E. U.A. 90: páginas 5873 a 5787). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST, es la probabilidad más pequeña de suma (P(N)), la cual proporciona una indicación de la probabilidad por medio de la cual, una unión entre dos secuencias de nucleótidos o amino ácidos, ocurriría posiblemente. Por ejemplo, un ácido nucleico, es considerado similar a una secuencia de referencia, si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación de la prueba de ácido nucleico con el ácido nucleico de referencia, es menor de aproximadamente 0.1 , más preferentemente, menor de aproximadamente 0.01 , y más preferentemente menor de aproximadamente 0.001 . Otra indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son substancialmente idénticas, es que las dos moléculas hibridan una a la otra, bajo condiciones extremas. La frase "hibridiza específicamente a", se refiere a un enlace, duplexión, o hibridación de una molécula solamente a una secuencia particular de nucleótidos, bajo condiciones severas cuando dicha secuencia está presente en una mezcla compleja (por ejemplo, celular total) ADN o ARN . "Substancialmente enlaza o se enlaza", se refiere a la hibridación complementaria entre un ácido nucleico de prueba y un ácido nucleico objetivo, y comprende disparidades menores que pueden ser acomodadas por medio de la reducción de la severidad del medio de hibridación para lograr la detección deseada de la secuencia objetivo de polinucleótido. "Condiciones severas de hibridación" y "Condiciones severas del lavado de hibridación", en el contexto de los experimentos de hibridación de ácido nucleico, tales como, las hibridaciones del norte y el sur, son secuencias dependientes, y diferentes, bajo parámetros ambientales diferentes. A secuencias más largas, y se hibridan específicamente en temperaturas más altas. Una guía extensa para la hibridación de ácidos nucleicos, se encuentra en el artículo Laboratory techniques in Biochemistry and Molecular Biology — Hybridation with Nucleic Acid Probes part 1 chapter 2 de Tijssen (1993) 'Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays", Elsevier, New York. Generalmente, la hibridación altamente severa y las condiciones de lavado son seleccionados para que sean en aproximadamente 5°C más bajos, que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica en una potencia iónica definida y pH . Generalmente, bajo "condiciones severas", una muestra se hibridará a su subsecuencia objetivo, pero no a otras secuencias. El Tm, es la temperatura (fuerza iónica definida y pH) en las cuales, el 50% de la secuencia objetivo se hibridiza a una muestra perfectamente coincidente. Las condiciones muy severas son seleccionadas para que sean iguales al Tm de una muestra particular. Un ejemplo de las condiciones de hibridación severas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios, los cuales tienen más de 100 residuos complementarios en un filtro en una mancha del sur o norte, es de 50% formamida con un miligramo de heparim a una temperatura de 42°C, siendo realizada la hibridación durante la noche. Un ejemplo de las condiciones de lavado altamente severas es 0.15M de ÑaCI, a una temperatura de 72°C, durante aproximadamente 15 minutos. Un ejemplo de condiciones de lavado severas es un lavado de 0.2 x SSC a una temperatura de 65°C, durante 15 minutos (ver, Sambrook, infra, para una descripción del regulador SSC). Con frecuencia, un lavado de alta severidad, es precedido por un lavado de baja severidad, para remover el fondo de la señal de prueba. Un ejemplo de un lavado de severidad media para un dúplex de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, es 1 x SSC a una . temperatura de 45°C, durante 15 minutos. Un ejemplo del lavado de baja severidad para un dúplex, es de, por ejemplo, más de 100 nucleótidos, 4-6 X SSC a una temperatura de 40°C, durante 15 minutos. Para muestras cortas (por ejemplo, de aproximadamente 10 a 50 nucleótidos), las condiciones severas, generalmente comprenden concentraciones de sal de menos de aproximadamente 1 .0 ¡on M Na+, generalmente aproximadamente, una concentración de 0.01 a 1 .0 ¡on M Na+ (y otras sales), a un pH de 7.0 a 8.3, y la temperatura es generalmente de, por lo menos, aproximadamente 30°C. Se pueden lograr condiciones severas con la adición de agentes desestabilizantes, tales como formamida. En general, una señal a una proporción de ruido de 2x (o mayor) que la observada para una prueba no relacionada en los ensayos particulares de hibridación, indican la detección de una hibridación específica. Los ácidos nucleicos que no se hibridan uno con el otro, bajo condiciones severas, todavía son substancialmente idénticos, si los polipéptidos que ellos codifican, son substancialmente idénticos. Esto ocurre, por ejemplo, cuando es creada una copia de ácido nucleico, usando la degeneración máxima del codón permitida por el código genético. Una indicación adicional de que dos secuencias de ácido nucleico o polipéptidos son substancialmente idénticas, es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico, es reactivo, cruzado inmunológicamente con o se enlaza específicamente al polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico. De este modo, un polipéptido es generalmente idéntico substancialmente a un segundo polipéptido, por ejemplo, cuando los dos polipéptidos difieren solamente por las sustituciones conservadoras. La frase "específicamente (o selectivamente) enlaza a un anticuerpo" o "específicamente (o selectivamente) inmunorreactivo con", cuando nos referimos a una proteína o péptidos, que se refiere a una reacción de enlace la cual es determinadora de la presencia de la proteína o a un epítope proveniente de la proteína, en la presencia de una población heterogénea de proteínas y otros agentes biológicos. De este modo, las condiciones designadas del inmunoensayo, el enlace de los anticuerpos especificados a una proteína particular y, no se enlazan en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. Los anticuerpos surgidos contra un polipéptido antigénico multivalente, generalmente se enlazarán a las proteínas de las cuales fueron obtenidos uno o más de los epítopes. El enlace específico a un anticuerpo bajo dichas circunstancias, puede requerir un anticuerpo que es seleccionado por su especificidad para una proteína particular. Se pueden usar una variedad de formatos de inmunoensayos, para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína particular. Por ejemplo, los inmunoensayos ELISA de fase sólida, manchas Occidentales, o inmunohistoquímica, son usados rutinariamente, para seleccionar anticuerpos monoclonales, específicamente inmunorreactivos con una proteína. Ver Harlow and Lañe (1988) Antibodies. A laboratory Manual, Cold. Spring Harbor Publications, New York "Harlow and Lañe"), para una descripción de formatos de ¡nmunoensayos y condiciones que pueden ser usadas para determinar la ¡nmunorreactividad específica. Generalmente, una reacción específica o selectiva, será de por lo menos, dos veces la señal o ruido del fondo y más generalmente de más de 10 a 100 veces el fondo. Las "variaciones modificadas de manera conservadora" de una secuencia de polinucleótidos particular, se refiere a aquellos polinucleótidos que se codifican con secuencias de amino ácidos idénticas o esencialmente idénticas, o en dónde el polinucleótido no se codifica con una secuencia de amino ácido, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos de funcionalidad idéntica, codifican cualquier polipéptido determinado. Por ejemplo, los codones CGU, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG, todos codifican a la arginina de amino ácido. De este modo, en cada posición, cuando una arginina es especificada por un codón , el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones del ácido nucleico son "variaciones silenciosas", las cuales son una especie de "variaciones modificadas de manera conservadora". Cada secuencia de polinucleótidos descritas en la presente invención, la cual codifica un polipéptido, también describe cada variación silenciosa posible, excepto donde se indique de otra manera. Un experto en el arte, reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, el cual es ordinariamente el único codón para la metionina) puede ser modificado para producir una molécula de funcionalidad idéntica, por medio de técnicas estándar. Consecuentemente, cada "variación silenciosa" de ácido nucleico, la cual codifica un polipéptido, está implícita en cada secuencia descrita. Además, un experto en el arte, reconocerá que las substituciones individuales, retiros o adiciones los cuales alteran, agregan, o retiran un sólo amino ácido o un pequeño porcentaje de amino ácidos (generalmente, menor del 5%, más generalmente menor del 1 %) en una secuencia codificada, son "variaciones modificadas de manera conservadora", en donde las alteraciones dan como resultado la substitución de un amino ácido por un amino ácido químicamente similar. Las tablas de substitución conservadora que proporcionan amino ácidos de funcionalidad similar son bien conocidas en el arte. Los cinco grupos siguientes, contienen cada uno, amino ácidos que son substituciones conservadoras de otro amino ácido: Alifático: Glicina (G), Aíanina (A), Valina (V), Leucina (L), Isoleucina (I); Aromático: Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); Que contienen azufre: Metionina (M), Cisteína (C) Básicos: Arginina (R), Lisina (K), Histidina (H); Ácidos: Acido Aspártico (D), Acido Glutámico (E), Asparagina (N), Glutamina (Q). Para obtener grupos adicionales de amino ácidos, ver también, Creighton (1984) Proteins, W. H. Freeman and Company. Además, las substituciones individuales, retiros o adiciones que alteran, agregan o retiran un solo amino ácido o un porcentaje pequeño de amino ácidos en una secuencia codificada son también "variaciones modificadas de manera conservadora". Una "subsecuencia", se refiere a una secuencia de ácido nucleico o amino ácidos, que comprende una parte de una secuencia más larga de ácidos nucleicos o amino ácidos (por ejemplo, polipéptido) respectivamente.

Descripción de las Modalidades Preferidas de la Presente Invención. La presente invención proporciona métodos para la obtención de secuencias de polinucleótidos que, pueden modular, ya sea directa o indirectamente (por ejemplo, a través de la codificación de un polipéptido) la respuesta inmunológica, cuando está presente en un vector de vacuna genética. En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos para la optimización del transporte y presentación de antígenos. Los polinucleótidos, inmunomoduladores optimizados obtenidos utilizando los métodos de la presente invención, son particularmente adecuados para usarse en conjunto con vacunas, incluyendo vacunas genéticas. Una de las ventajas de las vacunas genéticas, es que uno puede incorporar moléculas inmunomoduladoras que codifican genes, tales como, citocinas, moléculas co-estimulantes y moléculas que mejoran el transporte del antigen y la presentación de los vectores de vacuna genética. Esto proporciona oportunidades para respuestas inmunológicas moduladas que son inducidas contra los antigenes expresados por las vacunas genéticas.

A Creación de Bibliotecas Recombinantes. La presente invención comprende la creación de bibliotecas recombinantes de polinucleótidos que entonces son seleccionadas para identificar aquellos miembros de la biblioteca, que exhiben una propiedad deseada. Las bibliotecas recombinantes, también se pueden crear utilizando cualquiera de varios métodos. Los ácidos nucleicos de substrato, utilizados para la recombinación, pueden variar dependiendo de la aplicación particular. Por ejemplo, cuando un polinucleótido que codifica una citocina, quimiocina u otra molécula accesoria va a ser optimizado, diferentes formas de ácido nucleico que codifican todos o parte de la citocina, quimiocina u otras moléculas accesorias, son sometidas a la recombinación . Los métodos requieren, por lo menos, dos formas variantes de un substrato de partida. Las formas variantes de los substratos candidatos, pueden mostrar secuencias substanciales o similitud estructural secundaria, una con la otra, pero deben de diferir también en, por lo menos, dos posiciones. La diversidad inicial entre las formas, puede ser el resultado de variaciones naturales, por ejemplo, las formas variantes diferentes (homólogos), son obtenidas de individuos de formaciones diferentes de un organismo (incluyendo variantes geográficas) o constituir secuencias relacionadas del mismo organismo (por ejemplo, variaciones alélicas). Alternativamente, la diversidad inicial puede ser inducida, por ejemplo, la segunda forma variante puede ser generada por las transcripción del propensión por error, tal como un PCR-propensión por error, o el uso de una polimerasa, la cual carece de actividad de prueba lectura (ver Liao (1990) Gene 88: página 107 a 1 1 1 ), de una primera forma variante, o por replicación de la primera forma en una deformación mutante (las células hospederas mutantes, se discutirán con mayor detalle, más adelante). La diversidad inicial entre los substratos, es aumentada de manera considerable en los pasos subsecuentes de la secuencia de recurso de combinación . Con frecuencia, se logran mejoras después de una vuelta de recombinación y selección. Sin embargo, la recombinación recursiva de secuencia, puede ser empleada para lograr mejoras todavía adicionales en una propiedad deseada. La recombinación de secuencia puede ser lograda en muchos formatos diferentes y permutaciones de formatos, tal y como se describirá con mayor detalle a continuación. Estos formatos, comparten algunos principios comunes. La recombinación recursora de secuencia, comprende ciclos de recombinación sucesivos para generar la diversidad molecular. Es decir, uno crea una familia de moléculas de ácido nucleico que muestra alguna identidad de secuencia con otra, pero que difiere en la presencia de mutaciones. En cualquier ciclo determinado, puede ocurrir la recombinación in vivo o in vitro, e intracelular o extracelular. Además, la diversidad resultante de la recombinación, puede ser aumentada en cualquier ciclo, por medio de la aplicación de métodos anteriores de mutagénesis (por ejemplo el PCR propensión de error o la mutagénesis de cassette) a cualquiera de los substratos o productos para la recombinación. En algunos casos, se puede lograr una nueva propiedad o una propiedad mejorada o característica, después de solamente un ciclo de recombinación in vivo o in vitro, como cuando se usan diferentes formas variantes de la secuencia, como homólogos de individuos o deformaciones diferentes de un organismo, o secuencias relacionadas, provenientes del mismo organismo como variaciones alélicas. En una modalidad, actualmente preferida, las bibliotecas recombinantes son preparadas, usando el arrastre de ADN . El arrastre y screening o selección, pueden ser usados para "desarrollar" genes individuales, plásmidos o viruses completos, acumulaciones de genes múltiples, o hasta genómas completos (Stemmer (1995) Bio/Technology 13: páginas 549 a 553). Los ciclos de recombinación reiterativos y la selección, pueden ser realizadas para desarrollar adicionalmente los ácidos nucleicos de interés. Dichas técnicas, no requieren el análisis extenso y la computación requerida por los métodos convencionales para la ingeniería de los polipéptidos. El arrastre, permite la recombinación de grandes cantidades de mutaciones en un número mínimo de ciclos de selección, en contraste con los eventos de recombinación en forma de pares tradicionales. De este modo, las técnicas de recombinación de secuencia descritas en la presente invención , proporcionan ventajas particulares, en que ellas proporcionan la combinación entre mutaciones en cualquiera y todas de éstas, proporcionando por las mismas, un medio muy rápido de explorar, la manera en la cual pueden afectar las combinaciones de mutaciones diferentes, un resultado deseado. En algunos casos, sin embargo, está disponible <? la información estructural y/o funcional, la cual, aunque no es requerida para la recombinación de la secuencia, proporciona oportunidades para la modificación de la técnica. Los formatos y ejemplos de la recombinación de secuencias, a las que algunas veces nos referimos como, arrastre de ADN, evolución, cría molecular, han sido descritos por los presentes inventores y compañeros de trabajo en las solicitudes también pendientes. La solicitud de patente Norteamericana serie número 08/198,431 presentada el 17 de febrero de 1994, la patente serie número PCT/US95/02126 presentada el 17 de febrero de 1995, la patente serie número 08/425,684 presentada el 18 de abril de 1995, la patente serie número 08/537,874 presentada el 30 de octubre de 1995, ia patente serie número 08/564,995 presentada el 30 de noviembre de 1995, la patente serie número 08/621 ,859 presentada el 25 de marzo de 1996, la patente serie número 08/621 ,430 presentada el 25 de marzo de 1996, la patente número PCT/US/96/05480 presentada el 18 de abril de 1996, la patente serie número 08/650,400 presentada el 20 de mayo de 1995, la patente serie número 08/675,502 presentada el 3 de julio de 1996, la patente serie número 08/721 ,824 presentada el 27 de septiembre de 1996, la patente serie número PCT/US97/17300 presentada el 26 de septiembre de 1997 y la patente serie número PCT/US97/24239 presentada el 17 de septiembre de 1997; Stemmer, Science 270: página 1510 ( 1995); Stemmer y Asociados, Gene 164: páginas 49 a 53 (1995); Stemmer, Bio/Technology 13: páginas 549 a 553 (1995); Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. E. U.A. 91 : páginas 10747 A 10751 (1994); Stemmer, Nature 370: páginas 389 a 391 (1994); Crameri y Asociados, Nature Medicine 2 (1 ): páginas 1 a 3 (1996); Crameri y Asociados, Nature Biotechnology 14: páginas 315 a 319 ( 1996), cada una de las cuales incorporada a la presente descripción en su totalidad como referencia para todo uso. Otros métodos para la obtención de polinucleótidos recombinantes y/o para la obtención de diversidad en ácidos nucleicos usados como substratos para el arrastre, incluyen, por ejemplo, la recombinación homologa (PCT/US98/05223; publicación número W098/42727); mutagénesis de oligonucleótidos dirigida (para revisar, ver, Smith, Ann. Rev. Genet. 19: páginas 423 a 462 (1985); Botstein and Shortle, Science 229: páginas 1 193 a 1201 (1985); Cárter, Biochem. J. 237: páginas 1 a 7 (1986); el artículo de Kunkel, "La eficiencia de la mutagénesis de oligonucleótidos dirigida" en Nucleic acids & Molecular Biology, Editores Eckstein and Lilley, Springer Verlag, Berlín ( 1987)). Incluidos entre estos métodos, está la mutagénesis de oligonucleótidos dirigida (Zoler and Smith, Nucí. Acids. Res. 10: páginas 6487 a 6500 (1982), Methods in Enzymol. 100: páginas 468 a 500 (1983), y Methods in Enzymol. 154: páginas 329 a 350 (1987)) mutagénesis de ADN modificado por fosfotiato (Taylor y Asociados, Nucí. Acids Res. 13: páginas 8749 a 8764 (1985); Taylor y Asociados, Nucle. Acids. Res. 13: páginas 8765 a 8787 (1985); Nakamaye y Eckstein, Nucí. Acids. Res. 14: páginas 9679 a 9698 (1986); Sayers y Asociados, Nucí. Acids. Res. 16: - páginas 791 a 802 ( 1988); Sayers y Asociados, Nucí. Acids. Res. 16: páginas 803 a 814 (1988)), plantillas de mutagénesis usando contenido de uracil (Kunkel, Proc. Nat'l Acad. Sci. E. U.A. 82: páginas 488 a 492 (1985); y Kunkel y Asociados, Methods in Enzymol. 154: páginas 367 a 382)); mutagénesis usando ADN dúplex expuestos (Kramer y Asociados, Nucí. Acids. Res. 12; páginas 9441 a 9456 (1984); Kramer y Fritz, Methods in Enzymol. 154: páginas 350 a 367 (1987); Kramer y Asociados, Nucí. Acids Res. 16: página 7207 (1988); y, Fritz y Asociados Nucí. Acids. Res. 16: páginas 6987 a 6999 (1988)). Métodos adicionales adecuados incluyen la reparación del punto de desacoplamiento (Kramer y Asociados, Cell 38: páginas 879 a 887 (1984)), mutagénesis usando deformaciones de hospedero deficiente/reparación (Cárter y Asociados, Nucí. Acids. Res. 13: páginas 4431 a 4443 ( 1985); Cárter, Methods in Enzymol. 154: páginas 382 a 403 (1987)), mutagénesis de retiro (Eghtedarzadeh y Henikoff, Nucí. Acids. Res. 14: página 51 15 (1986)), restricción-selección y restricción-purificación (Wells y Asociados, Phil. Trans. R. Soc. Lond A 317: páginas 415 a 423 (1986)), mutagénesis por síntesis total del gen (Nambiar y Asociados, Science 223: páginas 1299 a 1301 (1984); Sakamar y Khorana, Nucí. Acids. Res. 14: páginas 6361 a 6372 ( 1988); Wells y Asociados, Gene 34: páginas 315 a 323 (1985); y Grundstrom y Asociados, Nucí. Acids. Res. 13: páginas 3305 a 3316 ( 1985)). Los equipos para la mutagénesis, se pueden conseguir en el mercado (por ejemplo, Bio-Rad, Amersham International, Anglian Biotechnology).

B. Métodos de Selección . Usualmente se sigue un ciclo de recombinación por, por lo menos un ciclo de selección de moléculas que tienen las propiedades o características deseadas. Si se realiza un ciclo de recombinación in vitro los productos de la recombinación, por ejemplo, segmentos recombinantes, algunas veces son introducidos en las células antes del paso de selección. Los segmentos recombinantes, también pueden ser enlazados a un vector apropiado u otras secuencias reguladoras antes de la selección. Alternativamente, los productos de la recombinación generada in vitro, son empacados a veces como viruses antes de la selección. Si la recombinación es realizada in vivo, los productos de la recombinación, pueden ser seleccionados algunas veces en las células en las cuales ocurrió la recombinación. En otras aplicaciones, los segmentos recombinantes son extractados de las células, y empacados como viruses opcionalmente, antes de la selección. La naturaleza de la selección depende de la propiedad o característica que va a ser adquirida o la propiedad o característica para la cual se busca la mejora, y a continuación se presentarán muchos ejemplos. Generalmente, no es necesario entender la base molecular, por cual es producto particular de la recombinación (segmentos recombinantes) han adquirido propiedades nuevas o mejoradas o características relacionadas con los substratos de partida. Por ejemplo, un vector de vacuna genética, puede tener muchas secuencias de componentes, teniendo cada una un rol pretendido diferente (por ejemplo, secuencia de codificación, secuencias regulatorias, secuencias de establecimiento de objetivo, secuencias de estabilidad-otorgamiento, secuencias ¡nmunomoduladoras, presentación antígena que afecta las secuencias e integración que afecta las secuencias). Cada una de estas secuencias componentes, pueden ser variadas y recombinadas simultáneamente. Entonces, se puede realizar la selección, por ejemplo, para segmentos recombinantes que tienen un mantenimiento episomal aumentado en una célula objetivo, sin la necesidad de atribuir dicha mejora a cualquiera de las secuencias componentes individuales del vector. Dependiendo del protocolo de selección particular usado para una propiedad deseada, la ronda inicial de selección, puede ser realizada algunas veces, en células bacterianas, debido a las altas eficiencias de transfección y la facilidad de cultivo. Las rondas posteriores, y otros tipos de selección, los cuales no son accesibles para la selección en las células bacterianas, son realizados en células de mamíferos para optimizar los segmentos recombinantes para usarse en un medio ambiente cercano al uso que se les intenta dar. Las rondas finales de selección pueden ser realizadas en el tipo preciso de la célula, para el uso que se les pretende dar (por ejemplo, una célula de presentación antigen humana). En algunos casos, esta célula puede ser obtenida de un paciente que va a ser tratado con una vista, por ejemplo, para minimizar los problemas de inmunogenicidad en este paciente. El paso de selección, identifica una subpoblación de segmentos recombinantes que se han desarrollado hacia la adquisición de una propiedad nueva o mejorada deseada o propiedades útiles en la vacunación genética. Dependiendo de la selección, los segmentos recombinantes pueden ser identificados como componentes de células, componentes de viruses o en su forma libre. Se pueden realizar más de una ronda de selección después de cada ronda de recombinación. Si se desea una mejora adicional en una propiedad, por lo menos uno, y generalmente, una colección de segmentos recombinantes sobrevivientes de la primera ronda de selección, son sometidos a una ronda adicional de recombinación. Estos segmentos recombinantes, pueden ser recombinados unos con los otros o con segmentos exógenos que representan los substratos originales o variaciones adicionales de los mismos. Nuevamente, la recombinación se puede llevar a cabo in vitro o in vivo. Si el paso de selección anterior identifica los segmentos de recombinantes deseados como componentes de células, los componentes pueden ser sometidos a una recombinación adicional in vivo, o pueden ser sometidos a una recombinación adicional in vitro o pueden ser aislados antes de realizar una ronda de recombinación in vitro. Al contrario, si el paso previo de selección, identifica segmentos recombinantes deseados en su forma desnuda o como componentes de viruses, estos segmentos pueden ser introducidos en las células, para realizar una ronda de recombinación in vivo. La segunda ronda de recombinación, independientemente de cómo se lleve a cabo, genera segmentos recombinantes adicionales, los cuales comprenden una diversidad adicional a la presente en los segmentos recombinantes que es el resultado de las rondas anteriores.

La segunda ronda de recombinación, puede ser seguida por una ronda adicional de selección, de acuerdo con los principios discutidos anteriormente de la primera ronda. - La severidad de la selección, puede ser aumentada entre las rondas. También, la naturaleza de la selección y la propiedad que está siendo seleccionada, pueden variar entre las rondas, si se desea una mejora en más de una propiedad o si se requiere que adquiera una propiedad adicional deseada. Entonces, se pueden realizar rondas de recombinación adicionales y selección, hasta que los segmentos recombinantes se hayan desarrollado lo suficiente para adquirir, la propiedad o función nueva o mejorada. En la presente invención, se describen varios métodos de selección para aplicaciones particulares. En muchos casos, la selección comprende la expresión de péptidos o polipéptidos recombinantes, codificados por los polinucleótidos recombinantes de una biblioteca, en forma de fusiones con una proteína que es mostrada en la superficie de un paquete genético que se puede replicar. Por ejemplo, se puede usar la presentación del fago. Ver, por ejemplo, Cwirla y Asociados, Proc. Natl. Acad. Sci. E. U .A. 87: páginas 6378 a 6382 ( 1990); Devlin y Asociados, Science 249: páginas 404 a 406 ( 1990); Scott & Smith, Science 249: páginas 386 a 388 (1990); Ladner y Asociados, patente Norteamericana 5,571 ,698. Otros paquetes genéticos que se pueden replicar, incluyen, por ejemplo, bacterias, viruses eucarióticos, levaduras y esporas.

Los paquetes genéticos usados más frecuentemente para las bibliotecas de pantalla son: bacteriófagos, fagos particularmente filamentosos y especialmente fagos M 13, Fd y F 1 . La mayor parte del trabajo, ha comprendido la introducción de bibliotecas que # codifican péptidos para que sean mostradas en cualquiera de las formaciones de estos "fagos y fusiones de proteínas gl l l o gVI I I .

Ver, por ejemplo, Dower, WO 91 /19818; Devlin, WO 91 /18989; MacCafferty, WO 92/01047 (gene l l l); Huse, WO 92/06204; Kang, WO 92/18619 (gene VI I I). Cada proteína de fusión, comprende una secuencia de señal, generalmente, pero no necesariamente, de la proteína de la capa del fago, un polipéptido que va a ser mostrado y, ya sea la proteína del gen l l l o el gen VI I I o un fragmento de la misma. Las secuencias codificadoras exógenas, frecuentemente son insertadas en o cerca del término N del gen l l l o el gen VI I I , aunque son posibles otros sitios de inserción. Los viruses eucarióticos, pueden ser usados para mostrar polipéptidos de una manera análoga. Por ejemplo, la muestra de una heregulina humana fusionada al gp70 del virus de leucemia murina Moloney, ha sido reportada por Han y Asociados, Proc. Natl. Acad. Sci. E. U.A. 92: páginas 9747 a 9751 (1995). Las esporas, también pueden ser utilizadas como paquetes genéticos que se pueden replicar. En este caso, los polipéptidos son mostrados desde la superficie exterior de la espora. Por ejemplo, se ha reportado que son adecuadas las esporas provenientes del B. Subtilis. Las secuencias de proteínas de recubrimiento de estas esporas, son proporcionadas por Donovan y Asociados, en J. Mol. Biol. 196, páginas del 1 al 10 (1987). También, se pueden utilizar células como paquetes genéticos que se pueden replicar. Los polipéptidos que van a ser mostrados, son insertados en un gen que codifica una proteína celular que es expresada en la superficie de las células. Las células bacterianas, incluyendo la Salmonella typhimurium, el Bacillus subtilis, la Pseudomonas aeruginosa, la Vibrio cholerae, la Klebsiella pneumonía, la Neisseria gonorrhoeae, la Neisseria meningitidis, la Bacteroides nodosus, la Moraxella bovis, y especialmente, Escherichia coli, son los preferidos. Los detalles de las proteínas de superficie exterior, son explicados por Ladner y Asociados, en la patente Norteamericana número 5,571 ,698 y en las referencias que hemos citado en la presente invención. Por ejemplo, es adecuada la proteína lamB del E. coli. Un concepto básico de los métodos de muestra que usan fago u otros paquetes genéticos que se pueden replicar, es el establecimiento de una asociación física entre el ADN que codifica un polipéptido que va a ser seleccionado y el polipéptido. Esta asociación física, es proporcionada por el paquete genético que se puede replicar, el cual muestra un polipéptido como parte de un cáspido que encierra el genoma del fago u otro paquete, en donde el polipéptido es codificado por el genoma. El establecimiento de una asociación física entre los polipéptidos y su material genético, permite la selección masiva simultánea de cantidades muy grandes de fagos que llevan polipéptidos diferentes. La exhibición del fago como un polipéptido con afinidad a un objetivo, por ejemplo, un receptor que se enlaza al objetivo y estos fagos son enriquecidos por la selección de afinidad al objetivo. La identidad de los polipéptidos mostrados, provenientes de este fago, puede ser determinada a partir de sus genomas respectivos. Mediante el uso de estos métodos, un polipéptido identificado como que tiene una afinidad de enlace para un objetivo deseado, entonces puede ser sintetizado al granel por medios convencionales, o el polinucleótido que codifica el péptido o polipéptido puede ser utilizado como parte de una vacuna genética.

C. Evolución de las Secuencias Inmunomoduladoras Mejoradas. Las citocinas pueden influir de manera dramática en la activación del macrófago en la diferenciación de las células TH 1 /TH2, y por lo tanto, en el resultado de enfermedades infecciosas.

Además, estudios recientes, sugieren de manera importante que el ADN mismo puede actuar como un adyuvante, mediante la activación de las células del sistema inmunológico. Específicamente, las secuencias de ADN ricas en CpG no metilado, fueron mostradas para mejorar la diferenciación de la célula T 1 , activar la síntesis de la citocina por medio de monocitos e inducir la proliferación de linfocitos B. La presente invención, por lo tanto, proporciona métodos para mejorar las propiedades inmunomoduladoras de las vacunas genéticas (a), desarrollando las propiedades estimulantes del ADN mismo y, (b) por medio del desarrollo de genes que codifican las citocinas y las moléculas relacionas que están involucradas en la regulación del sistema inmunológico. Entonces, estos genes son útiles en los vectores de vacunas genéticas. Son de particular interés el I FN-a y la I L-12, los cuales promueven las respuestas ¡nmunológicas hacia un fenotipo de célula auxiliar T1 (TH 1 ) y, por medio de este, mejorar la capacidad de la célula hospedera para contrarrestar las invasiones patógenas. También, se proporcionan métodos para la obtención de ácidos nucleicos inmunomoduladores mejorados, que tienen la capacidad para inhibir, o una activación aumentada, diferenciación o anergia de células T antígenas específicas. Debido a la información limitada acerca de las estructuras y los mecanismos que regulan estos eventos, las técnicas de cría molecular de la presente invención proporcionan soluciones mucho más rápidas, que el diseño racional. Los métodos de la presente invención, generalmente comprenden el uso del arrastre de ADN u otros métodos, para crear una biblioteca de polinucleótidos recombinantes. Entonces, la biblioteca es seleccionada para identificar los polinucleótidos recombinantes en la biblioteca, cuando son incluidos en un vector de vacuna genética o administrados en conjunto con una vacuna genética, tienen la capacidad de aumentar o alterar de otro modo una respuesta inmunológica inducida por el vector. El paso de selección, en algunas modalidades, puede comprender la introducción de un vector de vacuna genética, que incluye los polinucleótidos recombinantes en las células de los mamíferos y determinar si las células, o el medio de cultivo obtenido mediante el cultivo de células, tiene la capacidad de modular una respuesta inmunológica. Los módulos de vector recombinante optimizados, obtenidos a través de la recombinación de polinucleótidos, son útiles, no solamente como componentes de vectores de vacuna genética, sino también para la producción de polipéptidos, por ejemplo, citocinas modificadas y similares, que pueden ser administradas a un mamífero, para aumentar o cambiar una respuesta inmunológica. Las secuencias de polinucleótidos obtenidas usando los métodos de arrastre del ADN de la presente invención, pueden ser usados como un componente de una vacuna genética, o pueden ser usados para la producción de citocinas u otros polipéptidos inmunomoduladores que son usados, ellos mismos, como reactivos terapéuticos o profilácticos. Si así se desea, la secuencia del polinucleótido inmunomodulador optimizado que codifica el polipéptido, puede ser determinada y deducida la secuencia de amino ácido usada para producir polipéptidos que usan métodos conocidos para aquellos expertos en el arte. 1 .- Secuencias de ADN inmunoestimulantes. La presente invención, proporciona métodos para la obtención de polinucleótidos que son inmunoestimulantes cuando son introducidos en un mamífero. Los oligonucleótidos, que contienen hexámeros con un CpG central, flanqueado por dos purinas 5' (GpA o ApA), y tres pirimidinas 3' (TpC o TpT), inducen de manera eficiente la síntesis de la citocina y la proliferación de las células B (Krieg y Asociados, (1995) Nature 374: página 546; Klinman y Asociados (1996) Proc. Nat'l. Acad. Sci. E. U.A. 93: página 2879; Pisetsky (1996) Immunity 5: páginas 303 a 310), in vitro y actúan como adyuvantes in vivo. Los vectores de vacuna genética, en los cuales son insertados oligos, que contienen secuencia inmunoestimulante (ISS), tienen una capacidad aumentada para mejorar las respuestas de los anticuerpos antígenos específicos, después de la vacunación con ADN. La longitud mínima de un oligonucleotido ISS para una actividad funcional in vitro, es de 8 (Klinman y Asociados, supra). Se descubrió que los veintímeros con tres motivos CG eran significativamente más eficientes en la síntesis de inducción de citocina que un quice-mero con dos motivos CG (Id). Se ha sugerido que los GGGG tetradas, están involucradas en el enlace de ADN a las superficies celulares (receptores de macrófagos expresos, por ejemplo, receptores limpiadores, que enlazan el ADN) (Pisetsky y Asociados, supra). De acuerdo con la presente invención, una biblioteca se genera, sometiendo al ADN de recombinación aleatoria (por ejemplo, fragmentos de humanos, murina u otros ADN genómicos), u oligonucleótidos que contienen ISS conocido, secuencias poli A, C, G o T, o combinaciones de los mismos. El ADN, el cual incluye por lo menos la primera y segunda formas, que difieren una de la otra, en dos o más nucleótidos, son recombinados para producir una biblioteca de polinucleótidos recombinantes.

Entonces, la biblioteca es seleccionada para identificar aquellos polinucleótidos recombinantes que exhiben propiedades inmunoestimulantes. Por ejemplo, se puede seleccionar la producción de inducción de citocina in vitro en la introducción de la biblioteca, en un tipo celular adecuado que puede ser seleccionado. Un diagrama de este procedimiento se muestra en la Figura 5. Entre las citocinas que pueden ser usadas como un indicador de actividad inmunoestimulante, se encuentran, por ejemplo, IL-2, I L-4, I L-5, I L-6, I L-10, IL-12, I L-13, IL-15, e I FN-?. También, se pueden probar los cambios en las proporciones de IL-4/IFN-?, I L-4/I L-2, IL-5/I FN-?, IL-5/IL-2, I L-13/I FN-?, IL-13/I L-2. Un método de selección alternativo, es la determinación de la capacidad para inducir la proliferación de células, comprendida en la respuesta inmunológica, tales como las células B, células T, monocitos/macrófagos, PBL totales y similares. Otras selecciones incluyen la detección de la inducción de la activación del APC, basado en los cambios en los niveles de expresión de los antígenos de la superficie, tales como B7-1 (CD80), B7-2(CD86), MHC clase I y I I , y CD14. Otras selecciones útiles, ¡ncluyen la identificación de los polinucleótidos recombinantes, que inducen la proliferación de la célula T. Debido a que las secuencias ISS inducen la activación de la célula B, y debido a las varias homologías entre los antígenos de superficie expresados por la célula T y la célula B, se pueden obtener polinucleótidos que tengan actividades estimulantes en las células T.

Las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes, también pueden ser seleccionadas por el CTL mejorado y las respuestas de anticuerpo in vivo, y la protección mejorada de infecciones, cáncer, alergia y autoinmunidad. Los polinucleótidos recombinantes que exhiben la propiedad deseada, pueden ser recuperados de la célula, y si se desea una mejora adicional, se puede repetir el arrastre y selección , las secuencias ISS optimizadas, pueden ser utilizadas como un adyuvante separadamente de una vacuna actual, o la secuencia de ADN de interés puede ser fusionada a un vector de vacuna genética 2. Citocinas, Quimiocinas, y Moléculas Accesorias. La presente invención, también proporciona métodos para la obtención de citocinas, antagonistas de citocina, quimiocinas y otras moléculas accesorias optimizadas que dirigen, inhiben, o aumentan las respuestas inmunológicas. Por ejemplo, los métodos de la presente invención, pueden ser usados para obtener vacunas genéticas y otros reactivos (por ejemplo, citocinas optimizadas y similares), que cuando son administradas a un mamífero, mejoran o alteran una respuesta inmunológica. Estos inmunomoduladores optimizados, son útiles para el tratamiento de enfermedades infecciosas, así como otras condiciones, tales como, desórdenes inflamatorios, en una manera de antigen no específico. Por ejemplo, los métodos de la presente invención, pueden ser usados para desarrollar moléculas inmunomoduladoras optimizadas, para el tratamiento de alergias. Las moléculas inmunomoduladoras optimizadas, pueden ser usadas solas o en conjunto con vacunas genéticas de antigen específico para evitar o tratar alergias. Existen cuatro mecanismos básicos, por medio de los cuales, se puede lograr la inmunoterapia específica de la alergia. Primero, se puede administrar un reactivo que causa una disminución en las células TH2 específicas alergénicas. Segundo, se puede administrar un reactivo que causa un aumento en las células TH 1 alergénicas específicas. Tercero, se puede dirigir un aumento de las células CD8+ T supresivas. Finalmente, la alergia puede ser tratada mediante la inducción de anergia de las células T alergénicas específicas. En este ejemplo, las citocinas son optimizadas usando los métodos de la presente invención, para obtener reactivos que son efectivos para lograr una o más de estas metas inmunoterapéuticas. Los métodos de la presente invención, son usados para obtener citocinas antialérgicas que tienen una o más propiedades, tales como, la actividad específica mejorada, secreción mejorada después de la introducción en las células objetivo, son efectivas en dosis inferiores que las citocinas naturales y tienen menos efectos laterales. Los objetivos de interés particular, incluyen la interferon-a/?, I L-10, I L-12, y los antagonistas de IL-4 e IL-13. Los inmunomoduladores optimizados, o polinucleótidos recombinantes optimizados que codifican los inmunomoduladores, pueden ser administrados solos, o en combinación con otras moléculas accesorias. La inclusión de concentraciones óptimas de moléculas apropiadas, puede aumentar una respuesta inmunológica deseada, y/o conducir la inducción o represión de un tipo particular de respuesta inmunológica. Los polinucleótidos que codifican las moléculas optimizadas, pueden ser incluidos en un vector de vacuna genética, o las moléculas optimizadas codificadas por los genes pueden ser administradas como polipéptidos. En los métodos de la presente invención, se crea una biblioteca de polinucleótidos recombinantes que codifican inmunomoduladores, sometiendo ácidos nucleicos substrato a un protocolo de recombinación, tal como, un arrastre de ADN u otro método conocido por aquellos expertos en el arte. Los ácidos nucleicos substratos, son generalmente, dos o más formas de un ácido nucleico que codifica un inmunomodulador de interés. Las citocinas, se encuentran entre los inmunomoduladores que pueden ser mejorados usando los métodos de la presente invención. Los perfiles de síntesis de la citocina juegan un rol crucial en la capacidad del hospedero para contrarrestar las infecciones virales, bacteriales o por parásitos y las citocinas pueden influir dramáticamente en la eficacia de las vacunas genéticas y el resultado de enfermedades infecciosas. Se ha mostrado que varias citocinas, por ejemplo, IL-1 , IL-2, I L-3, IL-4, IL-5, IL-6, I L-7, IL-8, I L-9, IL-10, I L-1 1 , IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, I L-16, IL-17, I L-18, G-CSF, GM-CSF, I FN-a, I FN-?, TGF-ß, TN F-a, TNF-ß, IL-20 (M DA-7), y el ligando ftl-3, estimulan las respuestas inmunológicas in vitro o in vivo. Las funciones inmunológicas que pueden ser mejoradas usando las citocinas apropiadas, incluyen, por ejemplo, la proliferación de la célula B, síntesis de Ig, cambio del isotipo Ig, proliferación de célula T, y síntesis de citocina, diferenciación de células TH 1 y TH2 , activación y proliferación de CTL, activación y producción de citocina por medio de células dendríticas/monocitos/macrófagos, y diferenciación de células dendríticas a partir de monocitos/macrófagos. En algunas modalidades, la presente invención, proporciona métodos para la obtención de inmunomoduladores optimizados que pueden dirigir una respuesta inmunológica hacia una respuesta de TH1 o un TH2. La capacidad para influir la dirección de la respuesta inmunológica de esta manera, es de gran importancia en el desarrollo de las vacunas genéticas. Alterando la respuesta, del tipo de TH , se puede cambiar fundamentalmente el resultado de una enfermedad infecciosa. La alta frecuencia de células TH 1 , protege generalmente de infecciones letales con patógenos intracelulares, mientras que un fenotipo de TH2 dominante, frecuentemente resulta en infecciones diseminadas crónicas. Por ejemplo, en los humanos, el fenotipo TH 1 está presente en la forma tuberculoide (resistente) de la lepra, mientras que el fenotipo TH2 , se encuentra en las lesiones lepromatosas, de bacilos múltiples (susceptible) (Yamamura y Asociados (1991 ) Science 254: página 277). Los pacientes de SI DA en etapa terminal, tienen el fenotipo TH2. Los estudios en los miembros de la familia, indican que la supervivencia a la septisemia meningococal, depende del perfil de síntesis de citocina del PBL, estando asociada la síntesis alta de I L-10, con un alto riesgo de resultado letal, y estando asociado el alto TNF-a con un bajo riesgo.

• Se han descubierto ejemplos similares en ratones. Por ejemplo, un - ratón BALB/c, es susceptible a la infección de la leishmania major, estos ratones desarrollan enfermedades diseminadas fatales con el fenotipo TH2. El tratamiento con anticuerpos monoclonales anti-IL-4, o con I L-1 , induce una respuesta de TH 1 , resultando en una curación. Los anticuerpos monoclonales anti-interferon-?, exacerban la enfermedad. Para algunas aplicaciones, es preferible dirigir una respuesta inmunológica en la dirección de una respuesta de TH2. Por ejemplo, en donde se desea una inmunidad aumentada de la mucosa, incluyendo una inmunidad protectora, el aumento de la respuesta del TH2, puede conducir a una producción aumentada de anticuerpos, particularmente IgA. Las células auxiliares T (TH) , son probablemente los reguladores más importantes del sistema inmunológico. Las células TH , están divididas en dos subconjuntos, basados en su patrón de síntesis de la citocina (Mosmann y Coffman (1989) Adv. Immunol. 46: página 1 1 1 ). Las células TH 1 , producen niveles altos de la citocina IL-2 e IFN-?, y niveles mínimos o ninguno de IL-4, IL-5 e 1L-13. En contraste, las células TH2, producen niveles altos de IL- 4, I L-5, e IL-13, y una producción mínima o ninguna de I L-2 e IFN-?. Las células T 1 , activan los macrófagos, células dendríticas y aumentan la actividad citolítica de los linfocitos T, citotóxicos CD8+ y las células mortíferas naturales (NK) (Paul y Seder (1994) Cell 76: página 241 ), mientras que las células T 2, proporcionan una ayuda eficiente para las células B, y también son mediadoras en las respuestas alérgicas, debido a la capacidad de las células TH2 , para inducir el cambio del isotipo IgE y la diferenciación de las células B en las células secretoras de IgE (Punnonen y Asociados (1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. E. U.A. 90: página 3730). Los métodos de selección de citocinas, quimiocinas y otras moléculas accesorias mejoradas, están basados generalmente en la identificación de moléculas modificadas que exhiben una actividad específica mejorada en las células objetivo que son sensibles a la citocina, quimiocina u otra molécula accesoria respectiva. Una biblioteca de citocina, quimiocina o ácidos nucleicos de molécula accesoria recombinantes, puede ser expresada, por ejemplo, en fagos o como proteína purificada y probada usando ensayos de cultivos celular in vitro. De manera importante, cuando se analizan los ácidos nucleicos recombinantes como componentes de vacunas de ADN, se puede identificar las secuencias de ADN más óptimas (además de las funciones de los productos de la proteína) en términos de sus propiedades inmunoestimulantes, eficiencia de transfección, y su capacidad para mejorar las estabilidades de los vectores. Los ácidos nucleicos recombinantes y optimizados identificados, pueden entonces ser sometidos a nuevas rondas de arrastre y selección. En una modalidad de la presente invención, se desarrollan citocinas que dirigen la diferenciación de las células TH1 . Debido a sus capacidades para promover las respuestas inmunológicas hacia un genotipo de TH 1 , los genes codificadores de interferon-a (IFN-a.) e interleuquina-12 (I L-12), son substratos preferidos para la recombinación y selección con el objeto de obtener actividades y capacidades específicas máximas para actuar como adyuvantes en las vacunaciones genéticas. El I FN-a, es un objetivo particularmente preferido para la optimización, usando los métodos de la presente invención, debido a sus efectos en el sistema inmunológico, el crecimiento de células de tumores, y la replicación viral. Debido a estas actividades, El I FN-a fue la primera citocina en ser usada en la práctica clínica. En la actualidad se usa el I FN-a, para una amplia variedad de aplicaciones, incluyendo varios tipos de cánceres y enfermedades virales. La I FN-a, también dirige de manera eficiente la diferenciación de células T humanas en el fenotipo TH 1 (Parronchi y asociados (1992) J. Immunol 149: página 2977). Sin embargo, no se ha investigado completamente en los modelos de vacunación, debido a que en contraste con los sistemas humanos, no afecta la diferenciación de TH 1 en los ratones. La diferencia de especies, fue explicada recientemente por los datos que indican que como la IL-12, el IFN-a induce la activación del STAT4 en las células humanas, pero no en las células murinas, y el STAT4, se ha mostrado que es requerido en una diferenciación de IL-12 mediada por TH 1 (Thierfelder y Asociados (1996) Nature 382: páginas 171 ).

El arrastre de la familia de ADN, es un método preferido para la optimización del I FN-a, usando como substrato el gen IFN-a de mamíferos, los cuales son homólogos de un 85% a un 97%. Se pueden generar cantidades mayores de recombinantes distintos de 1026, a partir de la diversidad natural de estos genes. Para permitir el análisis paralelo rápido de las interferonas recombinantes, se pueden emplear métodos de alto rendimiento para su expresión y ensayo biológico como fusión de proteínas en bacteriófagos. Los recombinantes con potencia mejorada y perfiles de selectividad, están siendo cultivados de manera selectiva para obtener una actividad mejorada. Se pueden seleccionar variantes que demuestran un enlace mejorado a los receptores de I FN-a para análisis adicionales, usando una selección de mutantes con capacidad óptima para dirigir la diferenciación de la TH 1 . Mas específicamente, las capacidades de los mutantes de I FN-a para inducir la producción de IL-12 e IFN-? en los cultivos del linfocito T humano in vitro, que pueden ser estudiados por las pruebas de ELISA específicas para citocina y la de manchado de citocina citoplástico y citometría de flujo. La I L-12 es, tal vez, la citocina más potente que dirige las respuestas de la TH 1 , y también ha mostrado que actúa como un adyuvante y aumenta las respuestas del T 1 después de la vacunación genética (Kim y Asociados ( 1997) J . Immunol. 158: página 816). La l L-12, es una citocina que tiene una estructuración y funcionalidad única. Es la única citocina heterodimérica conocida a la fecha, compuesta de uña cadena ligera de 35 kD (p35) y una cadena pesada de 40 kD (p40) (Kobayashi y Asociados (1989) J. Exp. Med. 170: página 827; Estern y Asociados ( 1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. E. U.A. 87: página 6808). Recientemente, Lieschke y Asociados ((1997) Nature Biotech. 15 : página 35) demostró que una fusión entre los genes p35 y p40, da como resultado un gen único que tiene actividad comparable a la de dos genes expresados de manera separada. Estos datos indican que es posible arrastrar los genes IL-12 como una entidad, lo cual es benéfico en el diseño del protocolo de arrastre. Debido a su actividad promotora del crecimiento de la célula T, se pueden usar células T periféricas sanguíneas humanas normales, en la selección de los genes I L-1 más activos, haciendo posible la selección directa de mutantes de I L-12 con las actividades más potentes en las células T humanas. Los mutantes de IL-12, puede ser expresados en las células CHO por ejemplo, y la capacidad de los flotantes para inducir la proliferación de células T determinadas (Figura 6). Las concentraciones de I L-1 en los flotantes, pueden ser normalizadas basados en una prueba de ELISA específica que detecta la tarjeta fusionada a las moléculas I L-1 arrastradas. La incorporación de genes I FN-a y/o IL-12 desarrollada en los vectores de vacunas genéticas se espera que sea segura. La seguridad del I FN-a, ha sido demostrada en numerosos estudios clínicos y en la práctica diaria de los hospitales. Un ensayo de fase l l de I L-12 en el tratamiento de pacientes con cáncer en las células renales, dio como resultado varios efectos adversos inesperados (Tahara y Asociados (1995) Human Gene Therapy 6: página 1607. Sin embargo, el gen I L-12 como un componente de las vacunas genéticas, auxilia en los niveles altos de expresión local, mientras que los niveles observados en la circulación, son mínimos comparados con aquellos observados después de las inyecciones de bolo sistémico. Además, algunos de los efectos adversos de los tratamientos sistémicos a base de I L-1 , es probable que estén relacionados con su vida media, inusualmente larga (hasta de 48 horas en los monos). El arrastre de ADN , puede permitir la selección de una vida media más corta, reduciendo de este modo la toxicidad, aún en dosis altas de bolos. En otros casos, las vacunas genéticas que pueden inducir las respuestas del TH2 son preferidas, especialmente cuando se desea la producción mejorada de anticuerpos. Como un ejemplo, la IL-4 ha sido mostrada para dirigir la diferenciación de las células TH2 (Las cuales producen altos niveles de IL-4, I L-5 e IL-13, y las respuestas inmunológicas mediadas para las alergias). Las respuestas inmunológicas que son promovidas hacia el fenotipo TH2 , son preferidas cuando las vacunas genéticas son usadas para inmunizar contra las enfermedades autoinmunológicas de manera profiláctica. Las respuestas de TH 1 , también son preferidas cuando las vacunas son usadas para tratar y modular respuestas autoinmunológicas existentes, debido a células T autorreactivas, son generalmente del fenotipo T 1 (Libiau y Asociados (1995) Immunol.

Today 16: páginas 34 a 38). La I L-4, es también la citocina más potente en la inducción de la síntesis del IgE; los ratones con deficiencia de IL-4, carecen de la capacidad para producir el IgE. El asma y las alergias, están asociadas con una frecuencia aumentada en las células productoras de I L-4, y están enlazadas genéticamente al locus codificador de IL-4, el cual está en el cromosoma cinco (en una proximidad cercana a los genes codificadores de IL-3, I L-5, IL-9, I L-13 y GM-CSF). La I L-4, la cual es producida por las células T activadas, basofilos y células mast, es una proteína que tiene 153 amino ácidos y dos sitios potenciales de N-glicocilación. La IL-4 humana es, solamente idéntica en un 50% aproximadamente a la I L-4 del ratón, y la actividad de la IL-4, es específica de la especie. En los humanos la I L-13, tiene actividades similares a aquellas de la IL-4, pero la IL-13 es menos potente que la I L-4 en la inducción de la síntesis del IgE. La I L-4, es la única citocina conocida, que dirige la diferenciación del TH2. Los agonistas de I L-2 mejorados, también son útiles para dirigir la diferenciación de la célula TH2 , mientras que el antagonista mejorado de IL-4, puede dirigir la diferenciación de la célula TH1 . El agonista mejorado IL-4 y el antagonista, pueden ser generados por medio del arrastre de la I L-4 o el receptor soluble de I L-4. El receptor IL-4, consiste de una cadena de IL-4Ra (140 kD, unidad de enlace de alta afinidad) y una cadena de I L-2R? (estos receptores de citocina, comparten una cadena ? común). La cadena de IL-4Ra, es compartida por los complejos receptores de I L-4 e I L-13. Ambas, la 1L-4 y la I L13 inducen la fosforilación de la cadena I L-4Ra, pero la expresión de la cadena I L-4Ra sola en los transpectantes, no es suficiente para proporcionar una IL-4R funcional . El receptor IL-4 soluble, se encuentra actualmente en los ensayos clínicos para el tratamientos de las alergias. El uso de los métodos de arrastre del ADN de la presente invención, puede desarrollar un receptor soluble IL-4, que tiene una afinidad mejorada para la IL-4. Dichos receptores son útiles para el tratamiento del asma y otras enfermedades mediadas por la célula TH2 , tales como las alergias severas. Las reacciones de arrastre, pueden aprovechar la diversidad natural presente en las bibliotecas de cADN, provenientes de las células T activadas de humanos y otros primates. En una modalidad típica, una biblioteca de una cadena IL-4Ra arrastrada, es expresada en un fago, y son identificados los mutantes que enlazan a la IL-4 con una afinidad mejorada. La actividad biológica de los mutantes seleccionados, es entonces sometida a ensayo, usando ensayos basados en las células. La I L-2 y la I L-15, son también de interés particular para usarse en vacunas genéticas. La IL-2 actúa como un factor de crecimiento para las células B y T activadas, y también modula las funciones de las células NK. La IL-2 es producido predominantemente por clones TH 1 similares a la célula T y por lo tanto, es considerada principalmente para funcionar en reacciones demoradas de tipo de hipersensibilidad. Sin embargo, la I L-2 tiene efectos potentes directos en la proliferación y la síntesis del Ig por las células B. Las propiedades inmunorreguladoras complejas de la IL-2, son reflejadas en el fenotipo del ratón con deficiencia de IL-2, el cual tiene una alta mortandad a edad joven y de efectos múltiples en sus funciones inmunológicas, incluyendo el desarrollo espontáneo de la enfermedad inflamatoria del intestino. La IL-15 es una citocina identificada más recientemente, que es producida por tipos de células múltiples. La I L-15 comparte varias, pero no todas, las actividades de la IL-2. Ambas el I L-2 y la IL-1 5, inducen el crecimiento de la célula B y la diferenciación. Sin embargo, asumiendo que la producción de la IL-15 en el ratón con deficiencia IL-2 es normal, es claro que, la IL-15 no puede sustituir la función de la IL-2 in vivo, ya que estos ratones tienen inmunodeficiencias múltiples. La IL-2, ha mostrado sinergísticamente el aumento de la producción de Ig humano inducido por la I L-10 en la presencia de anti-CD40 mAbs, pero antagonizó con los efectos de la IL-4. La IL-2, también aumenta la IL-4 dependiente de la síntesis de IgE por las células B purificadas. Por otra parte, la IL-2 mostró, inhibir murina IgGI dependiente de la IL-4 y la síntesis de Ig tanto in vitro como in vivo. De un modo similar, la I L-2 inhibió la síntesis IgE humano dependiente de la IL-4, por el PBMC no fraccionado humano, pero los efectos fueron menos significativos que los del IFN-a o el IFN-? . Debido a sus capacidades para activar tanto las células B como las células T, la IL-2 y la I L-15 son útiles en la vacunación. En efecto, la IL-2, como proteína y como un componente de vacuna genética, ha demostrado que mejora la eficacia de las vacunaciones. La mejora en la actividad específica y/o niveles/sinéticas de expresión de la IL-2 y la I L-15 a través del uso de los métodos de arrastre del DNA de la presente invención, aumenta los efectos ventajosos comparados con la IL-2 y la I L-15 del tipo natural. Otra citocina de interés particular para la optimización y el uso en vacunas genéticas, de acuerdo con los métodos de la presente invención, es la interleuquina-6. La IL-6, es una citocina derivada del monocito que fue originalmente descrito como un factor de diferenciación de la célula B o un factor 2, estimulador de la célula B debido a su capacidad para aumentar los niveles de Ig secretados por las células B activadas. La I L-6, también ha mostrado aumentar la síntesis de IgE inducida por I L-4. También, se ha sugerido que la IL-6 es un factor obligatorio para la síntesis del IgE Humano, debido a que la neutralización del anti-I L-6 mAbs bloqueó, completamente la síntesis del IgE inducida por IL-4. Los ratones con deficiencia de IL-6 tienen una capacidad dispareja para producir el IgA. Debido a sus actividades potentes en la diferenciación de las células B, la IL-6 puede mejorar los niveles de anticuerpos específicos producidos después de la vacunación. Es particularmente útil como de un componente de las vacunas de ADN, debido que se pueden lograr altas concentraciones locales, proporcionando de este modo, efectos más potentes en las células adyacentes a las células transpectadas que expresan el anti-gen inmunogénico. La IL-6, con actividad específica mejorada y/o con niveles de expresión mejorado, obtenido por medio del arrastre de ADN, tendrá efectos más benéficos que la I L-6 de tipo natural. El interleuquin-8, es otro ejemplo de una citocina que, cuando es modificada de acuerdo con los métodos de la presente invención, es útil en las vacunas genéticas. La IL-8 fue identificado originalmente como un quimiotáctico neurófilo derivado de un monocito y un factor de activación. Subsecuentemente, la IL-8, también ha mostrado ser un quimiotáctico para las células T y activar los basófilos, resultando en una histamina mejorada y liberación de leucotrieno de estas células. Además, la IL-8 inhibe la adhesión de neutrófilos a las monocapas de células endoteliales activadas por citocina, y protege estas células del daño mediado por los neutrófilos. Por lo tanto las células del endotólio, derivadas de la IL-8, se sugirió que disminuyen los eventos inflamatorios que ocurren en la proximidad de las paredes de los vasos sanguíneos. La IL-8, también modula la producción de ¡nmunoglobulina, e inhibe el lgG4 inducido por la IL-4 y la síntesis de IgE por ambos, los PBMC humanos no fraccionados y las células B purificadas in vitro. Este efecto inhibitorio fue independiente del IFN-a, IFN-? prostagrandina E2. Además, la I L-8 inhibió la síntesis espontánea del IgE por el PBMC derivado de pacientes atópicos. Debido a su capacidad para atraer células inflamatorias, la I L-8, como otros agentes quimiotácticos, es útil en la potencialización de las propiedades funcionales de las vacunas, incluyendo las vacunas de ADN (que actúan como adyuvantes). Los efectos benéficos de la IL-8, pueden ser mejorados usando los métodos de arrastre de la presente invención, para obtener una IL-8 con actividad específica mejorada y/o con expresión mejorada en las células objetivo. La interleuquina 5, y los antagonistas de la misma, puede ser optimizada utilizando los métodos de la presente invención, para usarlo en vacunas genéticas. La I L-5 es producida principalmente por células T del tipo TH2 , y parece que juega un rol importante en la patogénesis de desórdenes alérgicos, debido a su capacidad para inducir eosinofilia. La IL-5, actúa como una diferenciación eusinófila y factor de supervivencia, tanto en los ratones, como en el hombre. La actividad bloqueadora de la IL-5, por el uso de anticuerpos neutralizantes monoclonales, inhibe de manera fuerte la eusinofilia pulmonar y la hiperactividad en los modelos del ratón, y los ratones con deficiencia de IL-5 no desarrollan eusinofilia. Estos datos, también sugieren que los antagonistas de I L-5 pueden tener un potencial terapéutico en el tratamiento de la eusinofilia alérgica. También se ha mostrado que la I L-5, aumenta tanto la proliferación de, y la síntesis de Ig, de las células B activadas del ratón y humano. Sin embargo, otros estudios sugirieron que la IL-5, no tiene efecto en la proliferación de las células B humanas, mientras que activa los encinófilos. La I L-5, aparentemente no es crucial para la maduración o diferenciación de las células B convencionales, debido a sus respuestas de anticuerpos en los ratones con deficiencia de I L-5, son normales. Sin embargo, estos ratones tienen un defecto de desarrollo en las células CD5+B, que indican que se requiere la IL-5 para la diferenciación normal de este subconjunto de células B en los ratones. En concentraciones subóptimas de IL-4 , se mostró que la IL-5 mejora la síntesis de IgE por las células B humanas in vitro. Además, un estudio reciente, sugirió que los efectos de la IL-5 en las células humanas dependen de la modalidad de estimulación de la célula B. La IL-5 aumento de manera considerable la síntesis del IgN por las células B estimuladas con Moraxella catarrhalis. Además, la I L-5 energizó por concentraciones subóptimas de la IL-2, pero no tuvo efecto en la síntesis de Ig por las células B activadas con SAC. Las células B humanas activadas, también expresaron la I L-5, sugiriendo el mARN que la IL-5, puede también regular la función de la célula B, incluyendo la síntesis de IgE por mecanismos autócrinos. La presente invención proporciona métodos para desarrollar un antagonista de IL-5 que se enlaza de manera eficiente a, y neutraliza la IL-5 o su receptor. Estos antagonistas, son útiles como componentes de vacunas usados para la profilaxis y tratamiento de las alergias. Los ácidos nucleicos que codifican la I L-5, por ejemplo, de humanos y otras especies de mamíferos, son arrastrados y seleccionados para su enlace a la IL-5R inmobilizado, para la selección inicial. Los polipéptidos que exhiben el efecto deseado en los ensayos de selección iniciales, entonces pueden ser seleccionados por la actividad biológica más alta, utilizando ensayos tales como, inhibición del crecimiento de la IL-5 de las líneas celulares dependientes cultivadas, en la presencia de I L-5 natural recombinante. Alternativamente, las cadenas de IL-5Ra arrastradas son seleccionadas para el enlace mejorado a la IL-5. Los factores de necrosis de tumor (a y ß.) y sus receptores, también son objetivos adecuados para la modificación y uso en vacunas genéticas. El TNF-a, el cual fue descrito originalmente como cachecttin debido a su habilidad para causar la necrosis de tumores, es una proteína de 17 kDa, que es producida en cantidades bajas en casi todas las células en el cuerpo humano después de la activación. El TNFa, actúa como un pirógeno endógeno e induce la síntesis de varias citocinas proinflamatorias, estimula la producción de proteínas de fase aguda, e induce la proliferación de fibroblastos. El TN Fa, juega un rol importante en la patogénesis del shock de endotoxina. Una forma de enlace de membranas del TNF-a, (mTNF-a.) que está involucrada en interacciones entre las células B y T, es sobrerregulado rápidamente en un periodo de 4 horas de activación de la célula T, el mTN F-a juega un rol en la activación policlonal de la célula B, observada en pacientes infectados con VIH . Los anticuerpos monoclonales específicos para el mTNFa o el receptor p55 TNFa, inhiben de manera importante la síntesis de IgE, inducida por clones de las células CD4+T activados por sus membranas. Los ratones con deficiencias de p55 TNF-aR, son resistentes al shock endotóxico, y el TNF-aR soluble, evita la diabetes melitis autoinmunológica en los ratones NOD. Se están realizando los ensayos de la fase l l l usando mTNF-aR en el tratamiento de artritis reumatoide, después de los resultados promisorios obtenidos en los ensayos de la fase I I . Los métodos de la presente invención , pueden ser usados por ejemplo, para desarrollar un TNF-aR, que tiene una afinidad mejorada, y por lo tanto, tiene la capacidad para actuar como un antagonista para la actividad del TN F. Los ácidos nucleicos que codifican el TNF-aR y exhiben la diversidad de secuencia, tales como, la diversidad natural observada en las bibliotecas de cADN de las células T humanas activadas y otros primates, son arrastrados. Los ácidos nucleicos arrastrados, son expresados, por ejemplo, en fagos, después de los cuales se seleccionan los mutantes que enlazan al TNF-a como una afinidad mejorada. Si se desea, los mutantes mejorados, pueden ser sometidos a ensayos adicionales usando actividad biológica, y los genes arrastrados pueden ser sometidos a una o más rondas de arrastre o selección. Otro objetivo de interés para la aplicación de los métodos de la presente invención, es el ¡nterferon-?, y la evolución del antagonista de esta citocina. El receptor de IFN-?, consiste de un componente de enlace de glicoproteína de 90 kD, una porción extracelular de 228 amino ácidos, una región transmembrana, y una región intracelular de 222 amino ácidos. Para la actividad funcional, no se requiere la glicolización . Una cadena simple, proporciona un enlace de alta afinidad (10"9 -10"10 M), pero no es suficiente para la señalización. Los componentes receptores dimerizan al enlace del ligante. El IFN-? del ratón es idéntico en un 53% al del ratón en el nivel de amino ácido. Los receptores de humano y ratón, solamente enlazan el IFN-? de humano y ratón, respectivamente. Los viruses de vaccinia, cowpox y camelpox, tienen homólogos de sI FN-?R, los cuales, tienen una similitud de secuencia de amino ácidos relativamente baja (-20%), pero tienen la capacidad de la neutralización eficiente del IFN-? in vitro. Estos homólogos enlazan el IFN-? del humano, bovino, rata (pero no ratón) y pueden tener actividad in vivo como antagonistas de IFN-?. Todas las ocho siteínas, son conservadas en el mixoma humano y de ratón y el virus de fibroma Shope (6 en el virus de vaccinia) los polipéptidos de I FN-?R que indican estructuras similares al 3-D. Una porción extracelular del mlFN-?R con un kD de 100 a 300 pM, ha sido expresado en células de insectos. El tratamiento del ratón NZB/W (un ratón modelo de SLE humano) con msI FN-? receptor, (100 miligramos, tres veces a la semana i.p.) inhibe la presentación de glomerolonefritis. Todos los ratones tratados con ese sIFN-? o anti-I FN-? mAbs, estuvieron vivos cuatro semanas, después de que el tratamiento fue descontinuado, comparados con un 50% del grupo de placebo y el 78% de ratones muertos tratados con IFN-?. Los métodos de la presente invención, pueden ser usados para desarrollar polipéptidos receptores de I FN-?R con afinidad mejorada, y para desarrollar IFN-? con actividad específica mejorada y capacidad mejorada para activar las respuestas inmunológicas celulares. En cada caso, los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos respectivos, y los cuales exhiben una diversidad de secuencia (por ejemplo, la observada en las bibliotecas de cADN de las células T activadas de humanos y otros primates), son sometidas a la recombinación y selección para identificar aquellos ácidos nucleicos recombinantes que codifican un polipéptido que tiene una actividad mejorada. En este caso del I FN-?R arrastrado, la biblioteca de ácido nucleico arrastrado puede ser expresada en fagos, los cuales son seleccionados para identificar los mutantes que se enlazan con el I FN-? con afinidad mejorada. En el caso del I FN-?, la biblioteca arrastrada es analizada por su actividad específica mejorada y la activación mejorada del sistema inmunológico, por ejemplo, usando la activación de monocitos/macrófagos como un ensayo. Las moléculas IFN-? desarrolladas, pueden mejorar la eficacia de las vacunaciones (por ejemplo, cuando son usadas como adyuvantes). Las enfermedades que pueden ser tratadas usando los polipéptidos de sIFN-?R de alta afinidad, usando los métodos de la presente invención, incluyen , por ejemplo, esclerosis múltiple, lupus heritomatoso sistémico (SLE), rechazo de órganos después del tratamiento, enfermedad de graft contra anfitrión. La esclerosis múltiple, por ejemplo, es caracterizada por la expresión aumentada del I FN-? en el cerebro de los pacientes, y la producción aumentada del IFN-? por las células T del paciente in vitro. El tratamiento de IFN-?, ha mostrado exacerbar de manera significativa la enfermedad (en contraste, con el EAE en el ratón). El factor de transformación del crecimiento (TGF)-ß, es otra citocina que puede ser optimizada para usarse en vacunas genéticas que usan los métodos de la presente invención. El TGF-ß, tiene actividades regulatorias del crecimiento en, esencialmente todos los tipos de células, y también ha mostrado tener efectos modulatorios complejos en las células del sistema inmunológico. El TGF-ß, inhibe la proliferación tanto de las células B, como de las células T, y también suprime el desarrollo de, y la diferenciación de las células T citotóxicas y las células NK. El TGF-ß, ha mostrado que dirige el cambio del IgA, tanto en la murina como en las células B humanas. También ha mostrado que induce la línea de gérmenes en una transcripción en la murina y las células B, apoyando la conclusión de que el TGF-ß, puede inducir el cambio de IgA específicamente. Debido a su capacidad para dirigir el cambio de IgA, el TGF-ß es útil como un componente de las vacunas de ADN, el cual ayuda en la inducción de la inmunidad potente de la mucosa, por ejemplo, vacunas para la diarrea. También , debido a sus efectos potentes antiproliferativos, el TGF-ß, es útil como un componente de vacunas terapéuticas contra el cáncer. El TGF-ß, con actividad específica mejorada y/o niveles de expresión mejorados/cinéticas, tendrá efectos benéficos crecientes, comparados con el TGF-ß natural. Las citocinas que pueden ser optimizadas usando los métodos de la presente invención, también incluyen el factor estimulante de la colonia de granulocitos (G-CSF) y el factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF). Estas citocinas, inducen diferenciación de la célula del tronco de médula ósea en granulocitos/macrófagos. La administración de G-CSF y GM-CSF, mejora de manera significativa la recuperación del trasplante de médula ósea (BM) y la radioterapia, reduciendo las infecciones y el tiempo que tienen que pasar los pacientes en el hospital. El GM-CSF, aumenta la producción de anticuerpos, después de la vacunación con ADN. El G-CSF, es una proteína de 175 amino ácidos, mientras que la GM-CSF tiene 127 amino ácidos. El G-CSF humano, es idéntico en un 73%, al nivel de amino ácido al G-CSF de murina y las dos proteínas muestran una reactividad cruzada de especies. El G-CSF, tiene un receptor homodimérico (dimérico con kD de símbolo 200 pM, monomérico ~2-4nM), y el receptor para el GM-CSF, es un complejo de tres subunidades. Las líneas celulares transfectadas con el cADN, que codifica el G-CSF R, proliferan en respuesta al G-CFS. Las líneas celulares son dependientes del GM-CSF disponible (tales como, el TF-1 ). El G-CSF no es tóxico y actualmente trabaja muy bien como una droga. Sin embargo, el tratamiento es costoso, y el G-CFS más potente, podría reducir el costo para los pacientes y para las instituciones al cuidado de la salud . Los tratamientos con estas citocinas, son generalmente de corta duración, y es probable que los pacientes, nunca necesiten el mismo tratamiento nuevamente, reduciendo la probabilidad de problemas con la inmunogenicidad . Los métodos de la presente invención, son útiles para el desarrollo del G-CSF y/o GM-CSF, los cuales tienen una actividad específica mejorada, así como otros polipéptidos que tienen G-CSF y/o actividad GM-CSF. Los ácidos nucleicos G-CSF y/o GM-CSF, que tienen diversidad de secuencia, por ejemplo, aquellos obtenidos de las bibliotecas de cADN , de especies diversas, son arrastrados para crear una biblioteca de genes G-CSF y/o GM-CSF arrastrados. Estas bibliotecas, pueden ser seleccionadas, por ejemplo, recolectando colonias, transfectación de plásmidos en células hospederas adecuadas (por ejemplo, células CHO) y ensayos de flotantes que usan líneas celulares receptoras positivas. Alternativamente, se pueden usar técnicas relacionadas o la muestra de fagos, usando nuevamente líneas celulares receptoras positivas. Todavía otro método de selección, comprende la transfectación de los genes arrastrados en las líneas celulares dependientes del G-CSF/GM-CSF. Las células, son cultivadas a razón de una célula por recipiente y/o en matraces grandes, de densidad muy baja; y se seleccionan las células que crecen más rápidamente, los genes arrastrados provenientes de estas células, son aislados; si se desea, estos genes pueden ser usados para rondas adicionales de arrastre y selección.

El factor ciliar neurotrófico (CNTF), es otro objetivo adecuado para la aplicación de los métodos de la presente invención. El CNTF, tiene 200 amino ácidos, los cuales exhiben un 80% de identidad de frecuencia entre los polipéptidos CNTF de rata y conejo. El CNTF, tiene efectos inflamatorios similares a la I L-6, e inducen la síntesis de proteínas de fase aguda. El CNTF, es una proteína citosólica, la cual pertenece a la familia-M de IL-6/IL-1 1 /LI F/oncostatina, y llega a ser biológicamente activa, solamente después de estar disponible, ya sea por lesión celular o por un mecanismo de liberación desconocido. El CNTF, es expresado por las células Schwann de mielinización, astrocitos y nervio ciático. Estructuralmente, el CNTF es una proteína dimérica, con una distribución nueva antiparalela de subunidades. Cada subunidad adopta, un doblez de as de cuatro hélices de cruce doble, en el cual, dos hélices contribuyen a la interfase dimera. Los mutantes Lys-155, pierden actividad, y algunos mutantes Glu-153, tienen una actividad biológica de 5 o 10 veces más alta. El receptor de CNTF, consiste de una cadena receptora CNTF específica, gp130 y un receptor LI F-ß. La cadena de CNTFRa, carece de una porción de dominio de transmembrana, en vez de ser un GPI anclado. En una concentración alta, el CNTF puede mediar la respuesta independiente del CNTFR. El CNTFR soluble, se enlaza con el CNTF y posteriormente, se puede enlazar al LIFR e inducir la señalización a través del gp130. El CNTF aumenta la supervivencia de varios tipos de neuronas, y protege a las neuronas en un modelo animal de la enfermedad de Huntington (eñ contraste con el NGF, el factor neurotrósico, y la neurotrofina 3). Los ratones tocados por el receptor CNTF, tienen deficiencias severas de las neuronas motoras al nacimiento, y los ratones golpeados por CNTF, exhiben dichas deficiencias después del nacimiento. El CNTF, reduce también la obesidad en los modelos de ratón. La expresión disminuida de CNTF es observada a veces en pacientes psiquiátricos. Los estudios de la fase 1 en pacientes con ALS (incidencia anual -1 /100 000, casos familiares 5%, 90% de muerte dentro de los 6 años) encontraron efectos laterales significativos después de dosificaciones mayores de 5mg/kg/día, por administración subcutánea (incluyendo anorexia, pérdida de peso, reactivación del virus de herpes simplex (HSV1 ), tos, y secreciones orales aumentadas). Se detectaron anticuerpos contra el CNTF, en casi todos los pacientes, ilustrando de este modo la necesidad de un CNTF alternativo con propiedades inmunológicas diferentes. Los métodos de recombinación y selección de la presente invención, pueden ser usados para obtener polipéptidos de CNTF modificados, que exhiben una inmunogenicidad disminuida in vivo; la actividad específica más alta, también se puede utilizar usando estos métodos. El arrastre es realizado, usando los ácidos nucleicos que codifican el CNTF. En una modalidad preferida, se obtiene una I L-6/LIF/(CNTF) híbrida por medio del arrastre, usando un exceso de oligonucléotidos que codifican los sitios de enlace del receptor del CNTF. La muestra del fago, entonces puede ser usada para probar la falta de enlace al receptor IL-6/LI F. La selección inicial, es seguida por una prueba de enlace de alta afinidad al receptor CNTF, y si se desea, pruebas funcionales, utilizando l íneas celulares que responden al CNTF. Los polipéptidos de CNTF arrastrados, pueden ser probados para identificar aquellos que exhiben una inmunogenicidad reducida al momento de su administración a un mamífero. Otro método en el cual se pueden utilizar los medios de recombinación y selección de la presente invención que pueden ser usados para optimizar CNTF, es mejorar la secreción del polipéptido. Cuando un cADN de un CNTF, es enlazado de manera operable a una secuencia líder de hNGF, sólo del 35 al 40% del CNTF producido es secretado. Las enfermedades objetivas para el tratamiento con el CNTF optimizado, que usan, ya sea el gen arrastrado en un vector de expresión en la forma de una vacuna de ADN , o una proteína purificada, incluyen la obesidad, la esclerosis amiotrófica lateral (ALS, enfermedad de Lou Gehrig), la neuropatía diabética, el shock y la cirugía del cerebro. Los polinucleótidos que codifican las quimiocinas, también pueden ser optimizados, utilizando los métodos de la presente invención y ser incluidos en los vectores de vacuna genética. Por lo menos, tres clases de quimiocinas son conocidas, basados en la estructura: las quimiocinas C (tales como limfotactín), quimiocinas C-C (tales como, MCP-1 , MCP-2, MCP-3, MCP-4, M IP- 1 a, M IP-1 b, RANTES), quimiocinas C-X-C- (tales como, IL-8, SDF-1 , ELR, Mig, IP10) (Premack y Schall (1996) Nature Med. 2: página 1 174). Las quimiocinas, pueden atraer otras células que median las funciones inmunológicas e inflamatorias, potencializando de este modo, la respuesta inmunológica. Las células que son atraídas por tipos diferentes de quimiocinas, incluyen por ejemplo, linfocitos, monocitos, y neutrófilos. Generalmente, las quimiocinas C-X-C, son quimioatractivas para los neutrófilos, pero no para los monocitos; las quimiocinas C-C, atraen monocitos y linfocitos, pero no neutrófilos; las quimiocinas C atraen linfocitos. Los vectores de vacuna genética, también pueden incluir polinucleótidos recombinantes optimizados que codifican las moléculas accesorias de enlace de superficie, tales como aquellas que comprenden la modulación y potenciación de las respuestas inmunológicas. Estas moléculas, las cuales incluyen, por ejemplo B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), CD40, ligando para CD40, CTLA-4, CD28 y CD150 (SLAM), pueden ser sometidas al arrastre de ADN para obtener variantes que tienen actividades alteradas y/o mejoradas. Los polinucleótidos recombinantes optimizados que codifican las moléculas CD1 , también son útiles en un vector de vacuna genética, para ciertas aplicaciones. Las CD 1 , son moléculas no polimórficas que están estructural y funcionalmente relacionadas con las moléculas MHC. Es importante observar que, la CD1 tiene actividades similares a la M HC, y que pueden funcionar como una molécula que presenta un antígeno (Porcelli (1995) Adv. Immunol. 59: página 1 ). El CD 1 , es expresado altamente en las células dendríticas, las cuales son células muy eficientes que presentan antígenos. La transfección simultánea de las células objetivo con los vectores de vacuna de ADN que codifican el CD 1 y un antígeno de interés, es probable que promuevan la respuesta ¡nmunológica. Debido a que las células CD1 , en contraste con las moléculas MHC, exhiben una diversidad alélica limitada en una población no cultivada (Porcelli, supra.), grandes poblaciones de individuos con antecedentes genéticos diferentes, pueden ser vacunados con un alelo de CD1 . Las propiedades funcionales de las moléculas CD1 , pueden ser mejoradas por los métodos de arrastre de ADN de la presente invención. Los genes TAP recombinantes optimizados y/o los productos del gen, también pueden ser incluidos en un vector de vacuna genética. Los genes TAP y su optimización , son explicados más adelante con mayor detalle para varios propósitos. Además, las proteínas del shock por calor (HSP), tales como la HSP70, también pueden ser desarrolladas para una presentación y procesamiento mejorado de antígenos. La HCP70, ha mostrado actuar como coadyuvante para la inducción de la activación de la célula CD8+T y aumenta la inmunogenicidad de péptidos antigénicos específicos (Blachere y Asociados (1997) J. Exp. Med 186: páginas 1315 a 1322). Cuando el HSP70, es codificado por el vector de vacuna genética, es probable que aumente la presentación y el procesamiento de péptidos antigénicos, y de este modo, mejore la eficacia de las vacunas genéticas. El arrastre de ADN , se puede usar para mejorar adicionalmente las propiedades, incluyendo la actividad adyuvante, de las proteínas de choque por calor, como la HSP70. Las citocinas, quimiocinas y polipéptidos de moléculas accesorias producidos de manera recombinante, así como los antagonistas de estas moléculas, pueden ser usados para influir el tipo de respuesta inmunológica a un estímulo determinado. Sin embargo, la administración de polipéptidos, a veces tiene desventajas, incluyendo una vida media corta, alto costo, dificultad para almacenarlo (debe ser almacenado a una temperatura de 4°C) y un requerimiento de altos volúmenes. También, las inyecciones de bolus, pueden algunas veces ocasionar efectos laterales. La administración de polinucleótidos que codifican las citocinas recombinantes y otras moléculas, resultan en la mayoría o todos de estos problemas. El ADN, por ejemplo, puede ser preparado en alta pureza, es estable, resistente a la temperatura, no infeccioso y fácil de fabricar. Además, la administración mediada por polinucleótidos de citocinas, puede proporcionar larga duración , expresión consistente, y la administración de polinucleótidos en general, se considera como segura. Las funciones de las citocinas, quimiocinas y moléculas accesorias, son redundantes y pleiotrópicas, y por lo tanto, puede ser difícil determinar cuales citocinas y combinaciones de citocinas, son las más potentes en la inducción y aumento de las respuestas antígenas específicas inmunológicas después de la vacunación.

Además, la combinación más útil de citocinas y moléculas accesorias, depende generalmente, de diferentes tipos de respuestas inmunológicas que se desean después de la vacunación. Como un ejemplo, la IL-4, ha mostrado dirigir la diferenciación de las células TH2, (la cual produce altos niveles de IL-4, I L-5 e IL-13, y respuestas inmunológicas alérgicas mediadas), mientras que el I FN-? y la I L-1 , dirigen la diferenciación de las células TH 1 (las cuales producen altos niveles de IL-2 y de IFN-?.), y respuestas ¡nmunológicas mediadas de tipo retardado. Además, la combinación más útil de citocinas y moléculas accesorias, también es probable que . dependa del antígeno utilizado en la vacunación. La presente invención proporciona una solución a este problema de la obtención de un cóctel de vacuna genética optimizado. Las combinaciones diferentes de citocinas, quimiocinas y moléculas accesorias, son ensambladas en vectores que usan los métodos de la presente invención. Estos vectores, entonces son seleccionados por su capacidad para inducir respuestas inmunológicas in vivo e in vitro. Se seleccionan las bibliotecas grandes de vectores, generados por el arrastre de genes, y por la biología molecular de combinación, para ver la máxima capacidad para dirigir las respuestas inmunológicas hacia, por ejemplo, según se desee, el fenotipo TH 1 O TH2. Se puede generar una biblioteca de vectores diferentes, ensamblando los promotores diferentes evolucionados, citocinas (evolucionados), antagonistas de citocinas (evolucionados), quimiocinas (evolucionadas), moléculas accesorias (evolucionadas) y secuencias inmunoestimulantes, y cada una de las cuales puede ser preparada usando los métodos de la presente invención. Las secuencias de ADN y los compuestos que facilitan la transfección y expresión, también se pueden incluir. Si el patógeno (s) es conocido, se pueden incorporar las secuencias de ADN específicas que codifican los antígenos inmunogénicos del patógeno en estos vectores, proporcionando una inmunidad protectora contra el patógeno (s) (como en las vacunas genéticas). La selección inicial, se lleva a cabo preferentemente in vitro. Por ejemplo, la biblioteca puede ser introducida en las células que son probadas por su habilidad de inducir la diferenciación de las células T, con capacidad de producción de citocinas que son indicadoras del tipo de respuesta inmunológica deseado. Para una respuesta TH 1 , por ejemplo, la biblioteca es seleccionada para identificar los polinucleótidos recombinantes que tienen la capacidad de inducir a las células T para producir IL-2 e IFL-?, mientras que se selecciona la inducción de producción de células T de I L-4, IL-5 e IL-13, para identificar los polinucleótidos recombinantes que favorecen la respuesta de TH2. La selección, también se puede llevar a cabo in vivo, usando modelos de animales. Por ejemplo, los vectores producidos usando los métodos de la presente invención, se pueden probar para determinar su capacidad para proteger a los animales contra infecciones letales. El otro método de selección, comprende la inyección de parásitos de Leshmania major, en etapas en los ratones BALB/c (no curativos). Se Inyectan los conjuntos de plásmidos i.v. , i.p. , o en etapas para estos ratones y el tamaño de las etapas que permanecen son seguidas. Todavía otro método de selección in vivo, comprende la detección de los niveles IgE, después de la infección con Nippostrongylus brasiliensis. Los niveles altos, indican una respuesta de TH2, mientras que los niveles bajos de IgE, indican una respuesta de TH 1 . Los resultados exitosos en los modelos de animales, son fáciles de verificar en los humanos. La selección in vitro puede ser llevada a cabo, para probar el fenotipo TH 1 O TH2 humano, o para otras respuestas inmunológicas deseadas. También se puede probar la capacidad de los vectores para inducir la protección contra infecciones en los humanos. Debido a que los principios de las funciones inmunológicas son similares en una amplia variedad de infecciones, los vectores de vacuna de ADN inmunoestimulantes, no solamente son útiles en el tratamiento de una cantidad de enfermedades infecciosas, sino también en la prevención de las infecciones, cuando los vectores son administrados a los sitios de entrada del patógeno (por ejemplo, el pulmón o el intestino). 3. Agonistas o Antagonistas de Receptores Celulares. La presente invención, también proporciona métodos para la obtención de polinucleótidos recombinantes optimizados, que codifican un péptido o polipéptido que puede interactuar con un receptor celular que está involucrado en la mediación de una respuesta inmunológica. Los polinucleótidos recombinantes optimizados pueden actuar como un agonista o un antagonista del receptor. Los antagonistas de citocina pueden ser usados como componentes de cócteles de vacuna genética. Las citocinas de bloqueo inmunosupresor, en vez de agregar citocinas simples proinflamatorias, es probable que potencien la respuesta inmunológica de una manera más general, debido a que se potencian varias trayectorias al mismo tiempo. Mediante la selección apropiada del antagonista, se puede diseñar la respuesta inmunológica inducida por una vacuna genética, con el objeto de obtener la respuesta que sea más efectiva para lograr el efecto deseado. Los antagonistas contra cualquier citocina, pueden ser usados como apropiados; las citocinas particulares de interés para incluir el bloqueo son, por ejemplo, IL-4, I L-13, IL-10 y similares. La presente invención, proporciona métodos para la obtención de antagonistas de citocina, que presentan una efectividad mayor en el bloqueo de la acción de la citocina respectiva. Los polinucleótidos que codifican los antagonistas de citocina mejorados, pueden ser obtenidos mediante el uso del rastreo de genes para generar una biblioteca recombinante de polinucleótidos, los cuales, después son seleccionados para identificar aquellos que codifican un antagonista mejorado. Se pueden usar como substratos para el rastreo de ADN, por ejemplo, los polinucleótidos que codifican receptores para la citocma respectiva. En la reacción de recombinación, estarán presentes, por lo menos, dos formas de substratos, difiriendo cada forma de la otra, en por lo menos, una posición del nucleótido. En una modalidad preferida, las formas diferentes de nucleótidos, son receptores de citocina homólogos de diferentes organismos. La biblioteca resultante de polinucleótidos recombinantes, es entonces seleccionada para identificar aquellos que codifican el antagonista de la citocina con la afinidad deseada y la actividad biológica. La I L-10, se explicará como un ejemplo del efecto que se puede lograr incluyendo un antagonista de citocina en un cóctel de vacuna genética, así de cómo la manera en que el efecto puede ser mejorado utilizando los métodos de arrastre de ADN de la presente invención. La ¡nterleuquina 10 (IL-10), es tal vez la citocina antiinflamatoria más potente, conocida hasta la fecha. La IL-10 exhibe un número de trayectorias que efectúan la potencialización de las respuestas inflamatorias. Las actividades biológicas de la I L-10 incluyen, la inhibición de la expresión M HC clase I I en los monocitos, inhibición de la producción de I L-1 , IL-6, IL-12, TNF-a por los monocitos/macrófagos y la inhibición de la proliferación y producción de IL-2 por los linfocitos T. La importancia de la I L-10, como una molécula reguladora de las respuestas inmunológicas e inflamatorias, fue demostrada de manera clara en un ratón con deficiencia de I L-10. Estos ratones son criados, retardados, anémicos y desarrollan espontáneamente la enfermedad inflamatoria del intestino (Kuhn y Asociados (1993) Cell 75: página 263). Además, tanto la inmunidad innata, como la adquirida a los monocitogenes Listeria, fueron mostradas elevadas en los ratones con deficiencia de I L-10 (Dai y Asociados (1997) J. Immunol. 158: página 2259). También se ha sugerido que las diferencias genéticas en los niveles de producción de IL-10, pueden afectar el riesgo de los pacientes de morir por infecciones meningococales. Las familias con una producción alta de I L-10, tuvieron el riesgo aumentado en una probabilidad de 20, de un resultado fatal de la enfermedad meningococal (Westendorp y Asociados (1997) Lancet 349: página 170). Se ha mostrado que la IL-10, activa las células B normales y malignas in vitro, pero no parece ser un promotor principal del crecimiento de la citocina para las células de in vivo, debido a que los ratones deficientes de I L-10, tienen niveles normales de linfocitos B y un Ig en su circulación . De hecho, existe evidencia de que la IL-10, puede regular de manera descendente indirecta, la función de la célula B, a través de la inhibición de la función accesoria de la célula de los monocitos. Sin embargo, parece que la I L-10, juega un rol en el crecimiento y expansión de las células B malignas. Se ha mostrado que los anticuerpos de IL-10 monoclonal y los oligonucleótidos antipercepción I L-10, inhiben la transformación de las células B, por las EBV in vitro. Además, los linfomas de la célula B, están asociados con EBV, y la mayoría de los linfomas EBV+ producen altos niveles de IL-10, la cual está derivada, tanto de los genes humanos, como de los homólogos de I L-10 codificados por el EBV. Los linfomas de la célula B, relacionados con el SIDA, secretan también niveles altos de I L-10. Además, los pacientes con un suero IL-10 detectable al momento del diagnóstico del linfoma, que no es de Hodgkin intermedio/de alto grado, tienen una supervivencia corta, sugiriendo adicionalmente un rol de la I L-10 en la patogénesis de las células B malignas. La antagonización de la I L-10 in vivo, puede ser benéfico en varias infecciones y en enfermedades malignas y en la vacunación. El efecto del bloqueo de la I L-10, es una mejora de la respuesta inmunológica que depende de la especificidad de la respuesta. Esta, es útil en las vacunaciones y en el tratamiento de enfermedades infecciosas serias. Además, un antagonista de I L-10, es útil en el tratamiento de enfermedades de la célula B, las cuales exhiben una producción de IL-10 e I L-10 viral, y también pueden ser útiles para promover la respuesta inmunológica general anti-tumores en pacientes de cáncer. La combinación de un antagonista I L-10 con vectores de terapia genética, puede ser útil, también en la terapia genética de las células del tumor con el objeto de obtener una respuesta inmunológica máxima contra las células del tumor. Si el arrastre de la I L-10, da como resultado una IL-10 con actividad específica mejorada, esta molécula IL-10, tendría potencial en el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas y enfermedades inflamatorias del intestino. La IL-10 con actividad específica mejorada, también puede ser útil como un componente de los vectores de terapia genética en la reducción de la respuesta inmunológica contra vectores, los cuales son reconocidos por la memoria de la célula y que también puede reducir la inmunogenicidad de estos vectores. Se ha hecho un antagonista de I L-10, por medio de la generación de una forma soluble del receptor de I L-10 (slL-10R; Tan y Asociados (1 995) J. Biol. Chem. 270: página 12906). Sin embargo, el sIL-I OR, se enlaza en I L-10 con kD de 50 pM , mientras que el receptor de superficie enlazada de tipo natural , tiene afinidad de 35 a 200 pM. Consecuentemente, el exceso molar de 151 dobleces del sIL-10R, es requerido para una inhibición media máxima de la función biológica de la I L-10. Además, la afinidad de la IL-10 viral (monólogo de I L-10 codificado por el virus de Epstein-Barr), al sIL-10R es movido de 1000 dobleces menos que del hl L-10, y en algunas situaciones, tales como cuando se están tratando las células malignas B asociadas con EBV, puede ser benéfico, si se puede bloquear la función de la IL-10 viral. Tomándolos en conjunto, esta forma soluble de I L-10R no es probable que sea efectiva en la antagonización de la I L-10 in vivo. Para obtener un antagonista de la IL-10 que tenga una afinidad suficiente y la actividad antagonista para funcionar in vivo, el arrastre de ADN puede ser realizado usando polinucléoticos que codifican el receptor I L-10. El receptor IL-10 con afinidad superior a la normal, funcionará como un antagonista de I L-10, debido a que reduce de manera importante la cantidad de la I L-10 disponible para el enlace a la I L-10R de tipo natural funcional. En una modalidad preferida, la I L-10R es arrastrada, usando un cADN homólogo que codifica la I L-10R derivado del humano y otras especies de mamíferos. Una alineación de secuencias receptoras de IL-10 de humanos y ratones, se ilustra en la Figura 14 con el objeto de ilustrar la posibilidad de arrastre de la familia de ADN cuando se desarrolla en receptores de IL-10 con afinidad mejorada. Una biblioteca de fagos de recombinantes receptores de IL-10, puede ser seleccionada para el enlace mejorado de la IL-10R arrastradas a los humanos o la IL-10 viral. La IL-10 natural y/o IL-10 viral, son agregados en concentraciones crecientes a solicitud, para tener una mayor afinidad. El fago enlazado a la I L-10 puede ser recuperado utilizando anticuerpos monoclonales anti-IL-10. Si así se desea, el arrastre puede ser repetido una o más veces, después de las cuales es analizada la I L-10R soluble desarrollado, en ensayos funcionales para determinar su capacidad para neutralizar las actividades biológicas de la IL-10/IL-10 viral. Más específicamente, la I L-10R soluble desarrollada, es estudiada para determinar su capacidad para bloquear los efectos inhibitorios de la IL-10 en la síntesis de la citocina y la expresión M HC clase I I , por los monositos, proliferación de células T, y por su capacidad para inhibir los efectos crecientes de la IL-10, en la proliferación de las células B activadas por los anticuerpos monoclonales anti-CD40. También se puede generar un antagonista de la I L-10 desarrollando la IL-10 para obtener variantes que se enlazan con la IL-10R, con afinidad mayor del tipo natural, pero sin activación del receptor. La ventaja de este método, es que se puede desarrollar una molécula I L- 0 con una actividad especifica mejorada usando los mismos métodos. En una modalidad preferida, la I L-10 es arrastrada usando cADN homólogos, que purifican la I L-10 derivado del humano y otras especies mamíferas. Además, un gen que codifica la IL-10 viral, puede ser incluido en el arrastre. Una biblioteca de recombinantes de la IL-10, es seleccionada buscando el enlace mejorado al receptor de la I L-10 humana. Los miembros de la biblioteca enlazados a la I L-10R, pueden ser recuperados por anticuerpos monoclonales anti-IL-10R. Este protocolo de selección, es probable que de cómo resultado, moléculas I L-10 con actividades tanto antagonistas o agonistas. Debido a las demandas de la selección inicial por una afinidad mayor, es probable que una proporción de los agonistas tengan una actividad específica mejorada, cuando son comparados con la IL-10 humana natural. Las propiedades funcionales de la molécula I L-10 mutante, son determinadas en ensayos biológicos similares a aquellos descritos anteriormente para los receptores I L-10 de ultra alta afinidad (síntesis de citocina y expresión MHC clase I I por monositos, proliferación de células B y T). Un antagonista IL-4 mutante, ha sido generado anteriormente, ilustrando la posibilidad general del método (Kruse y Asociados (1992) EMBO J. 1 1 : páginas 3237 a 3244 ). Una mutación del amino ácido en la IL-10, dio como resultado, una molécula que sé enlaza de manera eficiente a la cadena I L-4Ra, pero que tiene una actividad agonista mínima como la I L-4.

Otro ejemplo de un antagonista IL-10 es la I L-207/MDA-7, la cual es una proteína secretada de 206 amino ácidos. Esta proteína fue caracterizada originalmente como mda-7, la cual es un derivado de la célula del melanoma del regulador de crecimiento de las células de tumor (Jiang y Asociados ( 1995) Oncogene 1 1 : página 2477; (1996) Proc. Nat'l. Acad. Sci. E. U.A. 93: página 9160). La IL-20/mda-7, está relacionada estructuralmente con la I L-10, y antagoniza varias funciones de la I L-10 (extracto de la treceava convención europea de inmunología, Amsterdam , junio 22 al 25 de 1997). En contraste con la IL-10, la IL-20/mda-7, aumenta la expresión del CD80 (B7-1 ) y CD86 (B7-2), en monocitos humanos y regula la producción de TNF-a e I L-6. La I L-20/mda-7, también mejora la producción de I FN-?, por medio del PBMC activado por PHA. La presente invención, proporciona métodos para mejorar las vacunas genéticas, mediante la incorporación de genes I L-20/mda-7 en los vectores de vacuna genética. Los métodos de la presente invención, pueden ser usados para obtener variantes de la IL-20/mda-7 que exhiban una capacidad mejorada para la actividad antagonista IL-10. Cuando es usado una antagonista de citocina como un componente de vacuna de ADN o vectores de terapia por genes, es deseable el efecto local máximo. Por lo tanto, además de una forma soluble del antagonista de citocina, se puede generar una forma de transmembrana del antagonista. La forma soluble, puede ser proporcionada en la forma de un polipéptido purificado al paciente, mediante, por ejemplo, la inyección intravenosa. Alternativamente, un polinucleótido que codifica al antagonista de citocina, puede ser usado como componente en una vacuna genética o un vector de terapia por genes. En este caso, cualquiera de ellos o ambas de las formas, soluble y de transmembrana, pueden ser usadas. En los casos en que ambas formas, soluble y transmembrana del antagonista, son codificadas por el mismo vector, las células objetivo expresan ambas formas, dando como resultado una Inhibición máxima de la función de la citocina en la superficie de la célula objetiva y en su vecindad inmediata. Los péptidos o polipéptidos obtenidos mediante el uso de estos métodos, pueden substituir los ligandos naturales de los receptores, tales como, citocinas u otras moléculas acostumbradas en su capacidad para ejercer un efecto en el sistema inmunológico, por medio del receptor. Una desventaja potencial de la administración de citocinas u otras moléculas acostumbradas mismas, es que la reacción autoinmune, podría ser inducida contra la molécula natural, ya sea, debido a la tolerancia de rotura (si se usa una citocina natural u otra molécula) o induciendo inmunidad reactiva cruzada (humoral o celular) cuando se usan moléculas relacionadas, pero diferentes. A través del uso de los métodos de la presente invención, se pueden obtener agonistas o antagonistas que eviten estas desventajas potenciales. Por ejemplo, se pueden usar péptidos relativamente pequeños, como agonistas que pueden imitar la actividad del inmunomodulador natural, o antagonizar la actividad la actividad, sin inducir la inmunidad reactiva cruzada en la molécula natural. En una modalidad preferida de la presente invención, el agonista o antagonista optimizado obtenido por medio del uso de los métodos de la presente invención, es de aproximadamente 50 amino ácidos de longitud o menor, preferentemente de aproximadamente 30 amino ácidos o menor, y más preferentemente de aproximadamente 20 amino ácidos de longitud o menor. El péptido agonista o antagonista, es preferentemente, por lo menos de aproximadamente 4 amino ácidos de longitud, y más preferentemente, de por lo menos aproximadamente de 8 amino ácidos de longitud. Los polinucleótidos que flanquean la secuencia de codificación del péptido mimético, también pueden ser optimizados usando los métodos de la presente invención, con el objeto de optimizar la expresión , conformación o actividad del péptido mimético. Los péptidos agonistas o antagonistas optimizados o los polipéptidos, son obtenidos generando una biblioteca de polinucleótidos recombinantes y seleccionando la biblioteca para identificar a aquellos que codifican un péptido o polipéptido que exhibe una capacidad mejorada para modular una respuesta inmunológica. La biblioteca puede ser producida, utilizando métodos tales como el arrastre de ADN u otros métodos descritos en la presente invención o conocidos de otra manera para aquellos expertos en el arte. La selección se realiza de manera conveniente, expresando los péptidos codificados por los miembros de la biblioteca en la superficie de una población de paquetes genéticos replicables, e identificando aquellos miembros que se enlazan a un miembro de interés, por ejemplo, un receptor. Los polinucleótidos recombinantes optimizados que son obtenidos usando los métodos de la presente invención, pueden ser utilizados de varias maneras. Por ejemplo, el polinucleótido en un vector de vacuna genética, bajo el control de las secuencias de control de expresión apropiadas, de modo que el péptido mimético sea expresado en la introducción del vector en un mamífero. Si así se desea, el polinucleótido puede ser colocado en el vector, apoyado en la secuencia de codificación de la proteína de la superficie (por ejemplo, gen l l l o gen VI I I), con el objeto de preservar la conformación del mimético. Alternativamente, el polinucleótido que codifica el mimético, puede ser insertado directamente dentro de una secuencia antígena codificadora de la vacuna genética para formar una secuencia codificadora para una estructura "mimótope sobre antígeno". El polinucleótido que codifica el mimótope sobre la estructura del antígeno, puede ser usado dentro de la vacuna genética, o puede ser usado para expresar una proteína que es administrada por sí misma como una vacuna. Como un ejemplo de este tipo de aplicación , la secuencia de codificador de un péptido mimético es introducida en un polinucleótido que codifica el "circuito M" del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBsAg). El circuito M, es una secuencia de péptidos de seis amino ácidos enlazados por residuos de sistema, la cual es encontrada en los amino ácidos del 139 al 147 (numeración dentro de la secuencia de proteína S). El circuito M , en la proteína natural HBsAg, es reconocido por el anticuerpo RFHB7 monoclonal (Chen y Asociados, Proc. Nat'l. Acad. Sci. E. U.A. , 93: páginas 1997 a 2001 (1996)). De acuerdo con Chen y Asociados, el circuito M, forma un epítope del HBsAG, que no se traslapa y separa de, por lo menos, otros cuatro epítopes H BsAg. Debido al probable enlace de disulfuro Cys-Cys, en la parte hidrofílica de la proteína, es probable la conformación cíclica de los amino ácidos del 139 al 147. Por lo tanto, esta estructura es similar a la encontrada en las reglones de las proteínas filamentosas fago plll y pVI I I , en donde son colocadas las secuencias mimótopes. Por lo tanto, se puede insertar un mimótope, utilizando los métodos de la presente invención en esta región de la secuencia de amino ácidos HBsAg. El receptor de quimiocina CCR6, es un ejemplo de un objetivo adecuado para un mimético péptido obtenido utilizando el método. El receptor CCR6 es una proteína de dominio de 7 transmembranas (Dieu y Asociados, Biochem. Biophys. Res. Comm. 236: páginas 212 a 217 (1997) y J. Biol. Chem. 272: páginas 14893 a 14898 (1997)) que está comprendida en la quimioatracción de las células dendríticas inmaduras, las cuales se encuentran en la sangre y migran a sitios de toma antígena (Dieu y Asociados, J. Exp. Med. 188: páginas 373 a 386 (1998)). El CCR6 enlaza la quimiocina M I P-3a, de modo que un péptido mimético que tiene la capacidad de activar el CCR6, puede proporcionar una fusión adicional quimioatractiva a un antígeno determinado y, de este modo, promover la toma por medio de las células dendríticas después de la inmunización, con la fusión antigen del antígeno mimético, o un vector ADN que expresa el antígeno. Otra aplicación de este método de la presente invención, es obtener moléculas que pueden actuar como agonistas para el receptor de macrófago de limpieza (MSR; ver, Wloch y Asociados, Hum. Gene Ther. 9: páginas 1439 a 1447 (1998)). El MSR está involucrado en la mediación de los efectos de varios inmunomoduladores. Entre estos ADN bacteriales, se ¡ncluyen los plásmidos usados en la vacunación de ADN y los oligonucleótidos, los que frecuentemente son ¡nmunoestimulantes potentes. Los oligonucleótidos de cierta estructura química (por ejemplo, posfotio-oligonucleótidos) son particularmente potentes, mientras que el ADN bacteriano o plásmido, debe ser usado en cantidades relativamente grandes, para producir un efecto. La capacidad de los oligonucleótidos que contienen residuos dG para estimular las células B y aumentar la actividad de los motivos CpG inmunoestimulantes y de las lipopolisacaridas para activar los macrófagos, también es mediada por el MSR. Algunas de estas actividades son tóxicas. Cada uno de estos inmunomoduladores, junto con una variedad de ligandos polianiónicos, se enlazan al MSR. Los métodos de la presente invención , pueden ser usados para obtener miméticos de uno o más de estos inmunomoduladores que se enlazan al MSR con alta afinidad , pero que sufren de propiedades tóxicas. Dichos péptidos miméticos son útiles como inmunoestimulantes o adyuvantes. El MSR, es una glicoproteína de membrana integral trimérica. Las tres regiones extracelulares de terminal C, ricas en cisteína, son conectadas al dominio de transmembrana, por medio de una región fibrosa que está compuesta de un tubo helicoidal-a y una triple hélice similar al colágeno (ver, Kodama y Asociados, Nature 343: páginas 531 a 535 (1990)). Por lo tanto, la selección de la biblioteca de polinucleótidos recombinantes, puede ser realizada, expresando la estructura del receptor extracelular y adjuntando artificialmente la misma a superficies plásticas. Las bibliotecas pueden ser expresadas, por ejemplo, por muestra de fago, y seleccionadas para identificar aquellas que se enlazan a los receptores con una alta afinidad. Los polinucleótidos recombinantes optimizados, identificados por medio de este método, pueden ser incorporados en secuencias codificadoras antígenas para evaluar su efecto modulatorio en la respuesta inmunológica. 4.- Moléculas co-estimulantes con capacidad de inhibición o aumento de activación, diferenciación o anergia de las células T específicas de antígenos. También se proporcionan métodos para la obtención de polinucleótidos recombinantes optimizados que, cuando son expresados, tienen la capacidad de inhibir o aumentar la activación, diferenciación o anergia de las células T específicas de antígenos.

La activación de la célula T es iniciada, cuando la célula T reconoce sus péptidos específicos antigénicos en el contexto de la molécula MHC en la membrana de plasma del antígeno que presenta las células (APC), tales como monocitos, células dendríticas (DC), células Langerhands o células B. La activación de las células CD4+T, requiere el reconocimiento por el receptor de la célula T (TCR) de un péptido antigénico, en el contexto de las moléculas MHC clase I I, mientras que las células T CD8+, reconocen los péptidos, en el contexto de las moléculas MHC clase I . Sin embargo, es importante saber que, el reconocimiento de los péptidos antigénicos, no es suficiente para la inducción de la proliferación de células T y la síntesis de la citocina. Se requiere de una señal adicional coestimulante, "la segunda señal". La señal co-estimulante, es mediada por medio del CD28, el cual se enlaza a sus ligandos B7-1 (CD80) o B7-2 (CD86), expresados generalmente en el antígeno que presentan las células. En ausencia de la señal co-estimulante, no ocurre la activación de la célula T, o las células T se convierten en anérgicas. Además del CD28, la CTLA-4 (CD 152), funciona también como un ligando para la B7-1 y la B7-2. Sin embargo, en contraste con la CD28, la CTLA-4, media una señal regulatoria negativa para las células T y/o induce anergia y tolerancia (Walunas y Asociados (1994) Immunity 1 : página 405; Karandikar y Asociados (1996) J. Exp. Med. 184: página 783). Se ha mostrado que las B7-1 y las B7-2, tienen la capacidad de regular varias respuestas inmunológicas, y han sido implicadas como de importancia en la regulación inmunológica en las vacunas, alergia, autoinmunidad y cáncer. La terapia genética o los vectores de vacuna genética que expresan el B7-1 y/o B7-2, también han mostrado que tienen un potencial terapéutico en el tratamiento de las enfermedades anteriormente mencionadas y para mejorar la eficacia de las vacunas genéticas. La Figura 10, ilustra la interacción del APC y las células T CD4+, pero el mismo principio es cierto con las células T CD8+, con la excepción de que las células T reconocen los péptidos antigénicos en el contexto de las moléculas MHC clase I . Tanto las B7-1 como las B7-2, se enlazan al CD28 y CTLA-4, aún cuando las similitudes de secuencia entre estas cuatro moléculas son muy limitadas (del 20 al 30%). Es deseable obtener mutaciones en la B7-1 y la B7-2, que solamente influyan en el enlace a un ligando, pero no al otro, o mejorar la actividad a través de un ligando, mientras que se disminuye la actividad a través del otro. Además, como las afinidades de las moléculas B7 a sus ligandos parecen ser relativamente bajas, sería deseable descubrir mutaciones que mejoran/alteran las actividades de las moléculas. Sin embargo, los diseños racionales no hacen posible las predicciones de mutaciones útiles debido a la complejidad de las moléculas. La presente invención, proporciona métodos para solucionar estas dificultades, haciendo posible que se generen e identifiquen funcionalmente las moléculas B7 diferentes, con capacidades alteradas relativas para inducir la activación de la célula T, diferenciación, producción de citocina, anergia y/o tolerancia. A través del uso de los métodos de la presente invención, se pueden encontrar mutaciones en la B7-1 y B7-2, que influyen solamente en el enlace a un ligando pero no al otro, o que mejoran la actividad a través de un ligando mientras disminuyen la actividad a través del otro. Es probable que el arrastre del ADN sea el método más poderoso en el descubrimiento de nuevas variantes de la B7, con capacidades de enlace relativamente alteradas al CD28 y CTLA-4. Las variantes de la B7, las cuales actúan a través del CD28 con actividad mejorada (y con actividad disminuida a través de la CTLA-4), se espera que tengan capacidad mejorada para inducir la activación de las células T. En contraste, las variantes de la B7, las cuales se enlazan y actúan a través de la CTLA-4 con actividad mejorada (y con actividad disminuida a través del CD28) se espera que sean reguladores negativos potentes de las funciones de las células T y que induzcan la tolerancia y la anergia. El arrastre de ADN u otro método de combinación es usado para generar variantes de la B7 (por ejemplo, B7-1 /CD80 y B7-2/CD86), las cuales tienen capacidad relativa alterada para actuar a través de la CD28 y la CTLA-4, cuando son comparadas con las moléculas B7 de tipo natural. En una modalidad preferida, las formas diferentes del substrato usado en la reacción de recombinación son cÁDNs de B7, provenientes de varias especies. Dichos cADNs, pueden ser obtenidos por métodos conocidos por aquellos expertos en el arte, incluyendo el RT-PCR.

Generalmente, los genes que codifican estas moléculas variantes de la B7, son incorporadas dentro de los vectores de vacuna genética que codifican un antígeno, de modo que el vector puede ser usado para modificar las respuestas de las células T antígenas específicas. Los vectores que albergan los genes B7 que actúan eficientemente a través del CD28, son útiles en la inducción, por ejemplo, respuestas inmunes protectoras, mientras que los vectores que albergan los genes que codifican el gen B7, que actúan eficientemente a través de la CTLA-4, son útiles en la inducción, por ejemplo, tolerancia y anergia de células T específicas alergénicas o auto-antigénicas. En algunas situaciones, tales como en las células de tumores o células que inducen reacciones antoinmunológicas, el antígeno puede ya estar presente en la superficie de la célula objetivo, y las moléculas de la variante B7, pueden ser transfectadas en la ausencia de un gen antígeno exógeno adicional. La Figura 1 1 , ilustra un protocolo de selección que se puede usar para identificar las variantes B7-1 (CD80) y/o B7-2 (CD86) que tienen una capacidad / aumentada para inducir la activación o anergia de la célula T, y la aplicación de esta estrategia se describe con mayor detalle en el Ejemplo 1 . Se pueden utilizar varios métodos para la selección de esta variante. Por ejemplo, se pueden usar sistemas de selección de flujo, basados en la citometría. La biblioteca de las moléculas B7-1 y B7-2 es transfectada en células que generalmente no expresan estas moléculas (por ejemplo, células COS-7 y cualquier línea celular de especies diferentes al hombre con reactividad limitada o no cruzada, con respecto al enlace del ligando B7). Un gen interno marcador, puede ser incorporado con el objeto de analizar el número de copias por célula. Las moléculas solubles CTLA-4 y CD28, pueden ser generadas para usarse en los experimentos de flujo de citometría. Generalmente, estos serán fusionados con la porción Fc de la molécula IgG para mejorar la estabilidad de las moléculas y para hacer posible ei manchado fácil por etiquetación anti-lgG mAbs, tal y como lo describe van der Merwe y Asociados (J. xp. Med. 185 a la página 393, 1997). Las células transfectadas con la biblioteca de moléculas B7 entonces pueden ser manchadas con las moléculas solubles CTLA-4 y CD28. Serán clasificadas, las células que demuestran una proporción de enlace aumentada o disminuida de CTLA-4/CD28. Entonces, los plásmidos son recuperados, e identificadas las secuencias codificadoras de la variante B7 arrastradas. Estas variantes de la B7 seleccionadas, entonces pueden ser sometidas a nuevas rondas de arrastre y selección, y/o pueden ser analizadas adicionalmente, utilizando ensayos funcionales, tal y como se describen más adelante. Las variantes de B7, también pueden ser seleccionadas directamente, basados en sus propiedades funcionales. Para los estudios in vivo, las moléculas B7 también pueden ser desarrolladas para funcionar en células de ratones. Las colonias bacterianas con plásmidos con moléculas B7 mutantes, son seleccionadas y los plásmidos son aislados. Estos plásmidos, entonces son transfectados en las células que presentan el antígeno, tales como las células dendríticas, y las capacidades de estas mutantes, son analizadas para activar las células T. Una de las ventajas de este método, es que no se hacen suposiciones con respecto a las afinidades de enlace o las especificidades a los ligandos conocidos, y posiblemente, se pueden descubrir actividades nuevas, a través de los ligandos que van a ser identificados todavía. Además de las células dendríticas, otras células que son relativamente fáciles de transfectar (por ejemplo, U937 o COS-7), pueden ser usadas en la selección, siempre y cuando sea inducida la "primera señal de célula T" por, por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-CD3. La activación de la célula T puede ser analizada por métodos conocidos por aquellos expertos en el arte, incluyendo, por ejemplo, la medición de proliferación, producción de citocina, actividad de CTL o expresión de antígenos de activación, tales como el receptor IL-2, CD69 o las moléculas HLA-DR. Mediante el uso de los clones de células T específicas antígenas, tales como las células T específicas para el antígeno del polvo diminuto de la casa Der p I , permitirán el análisis de la activación de las células T específicas antígenas (Yssel y Asociados (1992) J. Immunol. 148: páginas 738 a 745). Se pueden identificar aquellos mutantes que aumentan o exhiben la proliferación de células T, o aumentan o exhiben la respuesta CTL. De un modo similar, se pueden identificar las variantes que han alterado la capacidad para inducir la producción de citocina o la expresión de antígenos de activación, tal y como son medidos, por ejemplo, por la prueba de ELISA específica para citocina o el flujo de citometría. Las variantes de la B7, son útiles en la modulación de las respuestas inmunológicas en las enfermedades autoinmunológicas, alergia, cáncer, enfermedades infecciosas y vacunación. Las variantes de la B7, las cuales actúan a través de la CD28 con actividad mejorada (y con actividad disminuida a través de la CTLA-4) tendrán una capacidad mejorada para inducir la activación de las células T. En contraste, las variantes de la B7, las cuales se enlazan y actúan a través de la CTLA-4 con actividad mejorada (y con actividad disminuida a través de ia CD28), serán reguladores potentes negativos de las funciones de la célula T y para inducir tolerancia y anergia. De este modo, incorporando los genes que codifican estas variantes de las moléculas B7 en los vectores de vacuna genética que codifican un antígeno, es posible modificar la respuesta de las células T específicas de antígenos. Los vectores que albergan los genes B7 que actúan eficientemente a través del CD28 son útiles para la inducción, por ejemplo, repuestas inmunológicas protectoras, mientras que los vectores que albergan genes que codifican genes B7 que actúan eficientemente a través de la CTLA-4 son útiles para la inducción, por ejemplo, tolerancia y anergia de las células T alergénicas o auto antígenas. En algunas situaciones , tales como en las células de tumores o en las células que inducen reacciones autoinmunológicas, el antígeno ya puede estar presente en la superficie de la célula objetivo, y la variante de la molécula B7 puede ser transfectada en la ausencia de un gen antígeno exógeno adicional . Los métodos de la presente invención también son útiles para la obtención de variantes de la B7 que tengan una efectividad aumentada en la conducción de la diferenciación de, ya sea las células TH1 o TH2. Se han observado roles diferenciales para las moléculas B7-1 y B7-2 en la regulación de la diferenciación de las células T auxiliares (TH) (Freeman y Asociados (1995) Immunity 2: página 523; Kuchroo y Asociados (1995) Cell 80: página 707). La diferenciación de la célula TH puede ser medida analizando los perfiles de producción de citocina inducidos por cualquier variante particular. Los niveles altos de I L-4, IL-5 y/o IL-13 son un indicativo de la diferenciación eficiente de la célula TH2 mientras que los niveles altos de I FN-? o IL-2, pueden ser usados como un marcador de diferenciación de la célula TH 1 . Las variantes de la B7, con capacidad alterada para inducir la diferenciación de las células TH 1 o TH2, son útiles, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades alérgicas, malignas, autoinmunológicas e infecciosas y en la vacunación. La presente invención, también proporciona métodos para la obtención de variantes de B7, que tienen una capacidad aumentada para inducir la producción de IL-10 por las células T antígenas específicas. La producción elevada de I L-10, es una característica de las células T reguladoras, la cual puede suprimir la proliferación de células CD4+ T antígenas específicas (Groux y Asociados (1997) Nature 389 a la página 737). El arrastre de ADN , se lleva a cabo tal y como se describió anteriormente, después del cual, los ácidos nucleicos recombinantes que codifican las variantes de B7, que tienen una capacidad aumentada de inducción de IL-10, pueden ser identificados por, por ejemplo, prueba de ELISA o flujo de citometría usando el manchado intracitoplásmico de citocina. Las variantes que inducen niveles altos de producción de I L-10, son útiles en el tratamiento de enfermedades alérgicas y autoinmunológicas.

D.- Optimización del Transporte y Presentación de Antígenos. La presente invención, también proporciona métodos para la obtención de vacunas genéticas y moléculas accesorias que pueden mejorar el transporte y la presentación de péptidos antigénicos. Se crea una biblioteca de polinucleótidos recombinantes y se selecciona para identificar aquéllos que codifican las moléculas que tienen propiedades mejoradas comparadas con sus contrapartes tipo natural . Los polinucleótidos mismos, pueden ser usados en las vacunas genéticas, o los productos del gen de los polinucleótidos, pueden ser utilizados para aplicaciones terapéuticas o profilácticas. 1. Proteasomas. Los péptidos de la clase I presentados en moléculas complejas de histocompatibilidad mayor son generados por los proteasomas celulares. La interferoma gama, puede estimular la presentación del antígeno, y parte del mecanismo de acción de la interferona puede ser debido a la inducción del proteasoma beta, subunidades LMP2 y LMP7, los cuales reemplazan a las subunidades homologas beta Y (delta) y X (épsilon). Dicho reemplazo cambia la especificidad de división del péptido del proteosoma y puede aumentar la inmunogenicidad del epítope clase I . Las subunidades Y (delta) y X (épsilon), así como otras subunidades de proteasomas recientemente descubiertas, tales como la MECL-1 homologa del MC14, son características de las células que no están especializadas en la presentación del antígeno. Por lo que, la incorporación en las células por la transferencia de ADN del LMP2, LMP7, M ECL-1 y/o otros epítopes específicos de presentación y subunidades potencialmente ¡nductoras de interferona, pueden aumentar la presentación del epítope. Es probable que los péptidos generados por el proteasoma que contiene las subunidades inductoras de interferona, sean transportadas al retículo endoplásmico, por medio de las moléculas TAP. La presente invención proporciona métodos de obtención de proteasomas, que presentan una capacidad aumentada o disminuida para procesar específicamente los epítopes MHC clase I . De acuerdo con los métodos, se usa el arrastre de ADN para obtener proteínas desarrolladas que pueden, ya sea, tener nuevas especificidades las cuales podrían aumentar la inmunogenicidad de algunas proteínas y/o aumentar la actividad de las subunidades, una vez que son enlazadas al proteasoma. Debido a que la transición de un proteasoma no específico a un proteasoma específico de epítope clase I, puede pasar a través de varias condiciones (en las cuales, algunas pero no todas, las subunidades que inducen interferona están asociadas con el proteasoma), se pueden lograr potencialmente muchas especificidades proteolíticas diferentes. Por lo tanto, el desarrollo de subunidades específicas similares al LMP, pueden crear nuevas composiciones de proteasomas, las cuales tengan funcionalidad mejorada para la presentación de epítopes. Los métodos comprenden la realización del arrastre de ADN, usando como substratos dos o más formas de polinucleótidos, los cuales codifican los componentes del proteasoma, en donde las formas de los polinucleótidos difieren en por lo menos en un nucleótido. El arrastre se lleva a cabo tal y como se describe en la presente invención, utilizando polinucleótidos que codifican cualquiera o más de los diferentes componentes de proteasoma, incluyendo, por ejemplo, el LMP2, LMP7, MECL-1 y otros componentes individuales de proteasoma que están comprendidos específicamente en la presentación del epítope clase I . Los ejemplos de los substratos adecuados, se describen en, por ejemplo, Stohwasser y Asociados (1997) Eur. J. Immunol. 27: páginas 1 182 a 1187 y Gaczynska y Asociados (1996) J. Biol. Chem. 271 : páginas 17275 a 17280. En una modalidad preferida, se utiliza el arrastre de familia, en la cual , los diferentes substratos son componentes de proteasomas que codifican polinucleótidos de diferentes especies.

Después de que se ha terminado la reacción de recombinación, la biblioteca resultante de polinucleótidos recombinantes es seleccionada para identificar aquéllos que codifican los componentes del proteasoma que tienen el efecto deseado en la producción del epítope clase I . Por ejemplo, los polinucleótidos recombinantes, pueden ser introducidos dentro de un vector de vacuna genética, el cual también codifica un antígeno "4 <*. -. particular de interés. La biblioteca de vectores, entonces puede ser introducida en células de mamífero, las cuales entonces son seleccionadas para identificar las células que exhiben una inmunogenicidad antigénica específica aumentada. Los métodos de análisis de la actividad del proteasoma, se describen en, por ejemplo, Groettrup y Asociados (1997) Proc. Nat'l. Acad Sci. E. U.A. 94: páginas 8970 a 8975 y Groettrup y Asociados (1997) Eur. J. Immunol. 26: páginas 863 a 869. Alternativamente, se pueden usar los métodos de la presente invención para desarrollar proteínas, las cuales se enlazan fuertemente con los proteasomas, pero que tienen una actividad disminuida o no tienen actividad , antagonizando de este modo con la actividad del proteasoma y disminuyendo la capacidad de las células para presentar moléculas de la clase I . Dichas moléculas, pueden ser aplicadas a los protocolos de terapia genética en los cuales es deseable disminuir la inmunogenicidad de las proteínas exógenas expresadas en las células como resultado de la terapia genética, y las cuales, de otro modo, serían procesadas para la presentación de la clase I, permitiendo que la célula sea reconocida por el sistema inmunológico. Dichas subunidades de alta afinidad y baja actividad , similares al LMP, demostrarán efectos inmunosupresores, los cuales también son útiles en otros protocolos terapéuticos, en donde las células que expresan una proteína que no es de ellas mismas, necesitan ser protegidas a partir de una respuesta inmunológica. La especificidad del proteosoma y las moléculas TAP (se explicarán a continuación), pueden haberse desarrollado juntas de manera natural. Por lo que, puede ser importante que dos trayectorias del sistema de procesamiento de la clase I sean cotejados de manera funcional. Un aspecto adicional de la presente invención, comprende la realización del arrastre de ADN simultáneamente en dos familias de genes, seguidas por las combinaciones aleatorias de las dos, con el objeto de descubrir los proteolíticos cotejados de manera apropiada y las especificidades de transporte. 2. Transporte Antígeno. La presente invención , proporciona métodos para mejorar el transporte de los péptidos antigénicos del compartimento citosólico al retículo endoplástico, y por medio de lo cual a la superficie de las células en el contexto de las moléculas MHC clase I. La expresión mejorada de los péptidos antigénicos, da como resultado la respuesta inmunológica mejorada, particularmente en la activación mejorada de los linfocitos citotóxicos CD8+. Esto es útil en el desarrollo de las vacunas de ADN y en la terapia genética. En una modalidad, la presente invención comprende el desarrollo de genes TAP (transportadores asociados con el procesamiento antígeno) para obtener genes que exhiben una presentación antígena mejorada. Los genes TAP, son miembros de la familia del cásete de enlace ATP de los transcolocadores de membrana. Estas proteínas transportan los péptidos antigénicos a las moléculas M HC clase I y están comprendidos en la expresión y estabilidad de las moléculas MHC clase I en la superficie celular. Hasta la fecha, se han clonado dos genes TAP, el TAP 1 y TAP2 (Powis y Asociados (1996) Proc. Nat'l. Acad. Sci. E. U.A. 89: páginas 1463 a 1467; Koopman y Asociados (1997) Curr. Opin. Immunol. 9: páginas 80 a 88; Monaco (1995) J. Leukocyte Biol. 57: páginas 543 a 557). Los TAP1 y TAP2, forman un heterodímero, y estos genes se requieren para el transporte de los péptidos en el retículo endoplásmico, en donde ellos se enlazan con las moléculas MHC clase I . El rol esencial de los productos del gen TAP, en la presentanción de los péptidos antigénicos, fue demostrado en los ratones con genes TAP desordenados. Un ratón deficiente de TAP1 tiene niveles drásticamente reducidos de expresión de superficie de las moléculas MHC clase I , y una selección positiva de células CD8+ T en el timo, el cual es reducido de manera importante. Por lo tanto, el número de linfocitos CD8+ T en la periferia del ratón deficiente de TAP es extremadamente bajo. El volver a transferir los genes TAP a estas células, restaura el nivel de expresión de la molécula MHC clase I . Los genes TAP, son un buen objetivo para el arrastre genético, debido al polimorfismo natural y a que estos géneros de varias especies de mamíferos han sido clonados y secuenciados, incluyendo los humanos (Beck y Asociados (1992) J. Mol. Biol. 228: páginas 433 a 441 ; Genbank Accession No. Y13582; Powis y Asociados, supra.), TAP1 del gorila (Laúd y Asociados (1996) Humman Immunol. 50: páginas 91 a 102), ratón (Reiser y Asociados (1998) Proc. Nat'l. Acad. Sci. E. U.A. 85: páginas 2255 a 2259; Marusiña y Asociados (1997) J. Immunol. 158: páginas 5251 a 5256, TAP1 : Genbank Accession números U60018, U60019, U60020, U60021 , U60022 y L76468-L67470; TAP2: Genbank Accession números U60087, U60088, U60089, U60090, U60091 y U60092), hámster (TAP1 , Genbank Accession números AF001 154 y AF001 157; TAP2, Genbank Accession números. AF001 156 y AF001 155). Además, se ha mostrado que el punto de mutaciones en los genes TAP, puede resultar en la especificidad del péptido alterada y en la presentación del péptido. También, las diferencias funcionales en los genes TAP, derivadas de especies diferentes han sido observadas. Por ejemplo, el TAP humano y el TAP de rata, que contienen el alelo rTAP2a, son más bien promiscuos, mientras que el TAP del ratón es restrictivo y selecciona contra los péptidos con pequeña terminal C, polares, hidrofóbicos o cargados positivamente con amino ácidos. La base para esta selectividad es desconocida.

Los métodos de la presente invención, comprenden la realización del arrastre del ADN de los genes TAP 1 y TAP2, utilizando como substratos, por lo menos, dos formas de secuencias de polinucleótidos de TAP 1 y/o TAP2, las cuales difieren en, por lo menos, una posición del nucleótido. En una modalidad preferida, la secuencia TAP derivada de especies mamíferas diferentes, son usadas como substratos para el arrastre. El polimorfismo natural de los genes, puede proporcionar una diversidad adicional del substrato. Si se desea, genes optimizados TAP, obtenidos de una ronda de arrastre y selección, pueden ser sometidos a rondas adicionales de arrastre/selección, para obtener nucleótidos optimizados que codifican el TAP. Para identificar los polinucleótidos optimizados que codifican el TAP de una biblioteca de genes TAP recombinantes, los genes pueden ser expresados en el mismo plásmido como un antígeno objetivo de interés. Si este paso está limitando el punto de la presentación del antígeno, entonces resultará en una presentación mejorada para CD8+ CTL. Los mutantes del TAP, pueden actuar selectivamente para aumentar la expresión de un fragmento de péptido de antígeno particular, para cuyos niveles de expresión se están limitando de otra manera o para causar el transporte de un péptido, que normalmente, nunca sería transferido dentro de un RER y puesto a disposición para enlazarse con la M HC clase I . Cuando son usados en el contexto de vectores de terapia genética en tratamientos contra el cáncer, los genes TAP desarrollados, proporcionan un medio para mejorar la expresión de las moléculas M HC clase I en las células del tumor y obtienen una presentación eficiente de los péptidos antigénicos específicos del tumor. De este modo, los vectores que contienen los genes TAP desarrollados, pueden inducir unas respuestas inmunológicas potentes contra las células malignas. Los genes TAP arrastrados, pueden ser transferidos a las líneas celulares malignas que expresan bajos niveles de molécula MHC clase I utilizando vectores o electroporación retroviral. La eficiencia de la transfección, puede ser monitoreada utilizando genes marcadores, tales como la proteína fluorescente verde, codificado por el mismo vector que los genes TAP. Las células que expresan niveles iguales de proteína verde fluorescente, pero niveles más altos de moléculas M HC clase I , como un marcador eficiente de genes TAP, entonces son clasificadas, utilizando el flujo de citometría, y los genes TAP desarrollados, son recuperados entonces de estas células, mediante, por ejemplo, PCR o por la recuperación de los vectores completos. Estas secuencias pueden ser sometidas entonces a nuevas rondas de arrastre, selección y recuperación, si se desea una optimización adicional. La evolución molecular de los genes TAP, puede ser combinada con la evolución simultánea del antígeno deseado. La evolución simultánea del antígeno deseado puede mejorar de manera adicional, la eficacia de presentación del polipéptido antigénico, después de la vacunación de ADN. El antígeno puede ser desarrollado, utilizando el arrastre del gen, para contener estructuras que permiten la presentación óptima del péptido antigénico deseado, cuando son expresados los genes TAP óptimos. Los genes TAP que son óptimos para la presentación de los péptidos antigénicos de un antígeno determinado, pueden ser diferentes a los genes TAP que son óptimos para la presentación del péptido antigénico de otro antígeno. La técnica de arrastre del gen , es un método ideal y tal vez el único para solucionar este tipo de problemas. La presentación eficiente de los péptidos antigénicos deseados, puede ser analizada utilizando linfocitos T citotóxicos específicos, por ejemplo, mediante la medición de la producción de citocina o la actividad CTL de los linfocitos T, utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en el arte.

Secuencias Inductoras de Células T Citotóxicas y Secuencias Inmunogénicas Agonistas.

Ciertas proteínas, están más posibilitadas que otras para transportar los epítopes MHC clase I , debido a que son más fácilmente usadas por la maquinaria celular, comprendida en el procesamiento necesario para la presentación del epítope clase I . La presente invención, proporciona métodos de identificación de los polipéptidos expresados, que son particularmente eficientes para ' atravesar varios pasos biosintéticos y degradadores que conducen a la presentación del epítope clase I , y el uso de estos polipéptidos para mejorar la presentación de los epítopes CTL provenientes de otras proteínas. En una modalidad, la presente invención proporciona las secuencias inductoras de células T citotóxicas (CTIS), las cuales pueden ser usadas para transportar los epítopes heterólogos de la clase I, con el propósito de vacunación contra el patógeno del cual son derivados los epítopes heterólogos. Un ejemplo del CTIS, es obtenido a partir del antígeno de la superficie de hepatitis B (HBsAg), el cual ha demostrado ser un transportador efectivo de sus propios epítopes CTL, cuando son administrados como una proteína bajo ciertas condiciones. La inmunización del ADN con plásmidos que emplean el HBsAg induce también, altos niveles de actividad del CTL. La presente invención , proporciona un fragmento más corto truncado del polipéptido de HBsAg, el cual funciona de una manera muy eficiente en la inducción de la actividad del CTL, y logra niveles de inducción de CTL que son superiores a los que se logran con la proteína HBsAg o con el plásmido codificador del polipéptido HBsAg. La síntesis de una CTIS, derivado del HBsAg se describe en el Ejemplo número 3, y en la Figura 1 , se ilustra un diagrama de un CTIS. La localización ER del polipéptido truncado, puede ser importante para lograr la liberación proteolítica adecuada del péptido que contiene los epítopes CTL (ver, Cresswell & Hughes (1997) Curr. Biol. 7: páginas R552 a R555; Craiu y Asociados ( 1997) Proc. Nat'l. Acad. Sci. E. U.A. 94: páginas 10850 a 10855). La región anterior al S2 y la región transmembrana, proporcionan epítopes auxiliares T, los cuales pueden ser importantes para la inducción de una respuesta inmunológica citotóxica fuerte. Debido a que el polipéptido CTIS truncado, tiene una estructura simple (ver Figura 1 ), es posible adherir una o más secuencias heterólogas del epítope clase I al extremo de la terminal C del polipéptido, sin tener que mantener la conformación específica de la proteína. Dichas secuencias, entonces están disponibles para los mecanismos de procesamiento del epítope clase I . El tamaño del polipéptido, no está sujeto a las restricciones normales de la estructura del HBsAg nativo. Por lo tanto, la longitud de la secuencia heteróloga, así como el número de epítopes CTL incluidos, es flexible. Esto se muestra esquemáticamente en la Figura 2. La capacidad para incluir una secuencia larga que contiene, ya sea, secuencias múltiples y distintas de la clase I o variaciones alternativas diferentes de una sola secuencia de CTL, permite que se aplique la metodología del arrastre del ADN. La presente invención, también proporciona métodos para la obtención de secuencias inmunogénicas agonistas (IAS), las cuales inducen la capacidad" del CTL de I isis específica de las células que expresan la secuencia natural del epítope. En algunos casos, la reactividad es mayor que si la respuesta del CTL es inducida por el epítope natural (ver, Ejemplo 3 y Figura 3). Dicho CTL, inducido por IAS, puede ser girado desde un repertorio de la célula T diferente del inducido por la secuencia natural. De este modo, la capacidad de respuesta deficiente a un epítope determinado, puede superarse reclutando células T de un conjunto mayor. Con el objeto de descubrir dicho IAS, el amino ácido en cada posición de un péptido que induce el CTL (incluyendo tal vez las posiciones de los residuos llamados ancla) pueden ser variados en un rango de los 19 amino ácidos que no están presentes normalmente en la posición. Se puede utilizar la metodología de arrastre de ADN, para explorar un rango grande de posibilidades de secuencias. Un segmento sintético del gen, que contiene copias múltiples de la secuencia del epítope original , puede ser preparado, de modo que, cada copia posea una cantidad pequeña de cambios del nucleótido. El segmento de gen , puede ser arrastrado para crear un rango diverso de secuencias del epítope CTL, algunas de las cuales deberán funcionar como IAS, este proceso se ilustra en la Figura 4. En la práctica, los oligonucleótidos son construidos generalmente de acuerdo con el diseño anterior, y son polimerizados enzimáticamente para formar el segmento sintético del gen de los epítopes concatenados. Los sitios de restricción, pueden ser incorporados en una fracción de los olígonucleótidos, para permitir la división y selección de rangos de tamaño determinados de los epítopes concatenados, la mayoría de los cuales, tendrán diferentes secuencias y, por lo tanto, serán un IAS potencial. El segmento del gen que contiene el epítope, puede ser unido, mediante métodos apropiados de clonación a un CTIS, así como al del HBsAg. Las construcciones plásmidas resultantes, pueden ser usadas para la inmunización basada en el ÁDN y la inducción del CTL.

E. Composiciones Farmacéuticas de Vacuna Genética y Métodos de Administración .

Los polinucleótidos y polipéptidos mejorados ínmunomodulatorios de la presente invención, son útiles para el tratamiento y/o la prevención de varias enfermedades y condiciones con las cuales están asociados los antígenos respectivos. Por ejemplo, las vacunas genéticas que emplean los reactivos obtenidos de acuerdo con los métodos de la presente invención, son útiles tanto en la profilaxis, como en la terapia de las enfermedades infecciosas, incluyendo aquellas causadas por cualquier bacteria, hongo, virus u otro patógeno de los mamíferos. Los reactivos obtenidos utilizando la presente invención, también pueden ser usados para el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas, incluyendo, por ejemplo, la artritis reumatoide, SLE, diabetes melitus, miastenia gravis, artritis reactiva, espondilitis anquilosante y esclerosis múltiple. Estas, y otras condiciones inflamatorias, incluyendo el I BD, soriasis, pancreatitis y varias inmunodeficiencias, pueden ser tratadas utilizando las vacunas genéticas que incluyen vectores y otros componentes obtenidos usando los métodos de la presente invención. Los vectores de vacuna genética y otros reactivos obtenidos utilizando los métodos de la presente invención , pueden ser utilizados para tratar alergias y asma. Además, el uso de las vacunas genéticas, es una gran promesa para el tratamiento del cáncer y la prevención de las metástasis. Por medio de la inducción de una respuesta inmunológica contra las células cancerosas, el sistema inmunológico del cuerpo, puede considerarse que está preparado para reducir o eliminar el cáncer. En las modalidades preferidas de la presente invención, los reactivos obtenidos usando los métodos de la presente invención son usados en conjunto con un vector de vacuna genética. La selección del vector y los componentes, también pueden ser optimizados para el propósito particular de tratar la alergia u otras condiciones. Por ejemplo, un antígeno asociado con el tratamiento de una condición particular, puede ser optimizado utilizando los métodos de recombinación y selección análogos a aquellos descritos en la presente descripción. Dichos métodos y los antígenos apropiados para las diferentes condiciones, se describen en la solicitud de patente Norteamericana, serie número , titulada "Inmunización de la Biblioteca de Antígenos", la cual está también pendiente, y ha sido asignada comúnmente, que fue presentada el 10 de febrero de 1999, de acuerdo con el expediente número 18097-028710US. El polinucleótido que codifica el polipéptido recombinante antigénico, puede ser colocado bajo el control de un promotor, por ejemplo, un promotor de alta actividad o específico para los tejidos. El promotor usado para expresar el polipéptido antigénico por sí mismo, puede ser optimizado utilizando los métodos de recombinación y selección análogos a los descritos en el presente documento, tal y como lo describen la solicitud Internacional número PCT/US97/17300 (Publicación Internacional Número W098/13487). Los reactivos obtenidos utilizando los métodos de la presente invención, también pueden ser usados en conjunto con vacunas genéticas de componentes múltiples, las cuales tienen la capacidad de diseñar una respuesta ¡nmunológica como la más apropiada para lograr un efecto deseado (ver, por ejemplo, la solicitud de patente Norteamericana Serie número , titulada "Diseño del Vector de Vacuna Genética", presentada el 10 de febrero de 1999, con el expediente número 18097-030100US) también pendiente y comúnmente asignada. Algunas veces, es ventajoso emplear una vacuna genética, que está elaborada para un tipo de célula objetivo particular (por ejemplo, una célula de presentación del antígeno o una célula de procesamiento del antígeno); los métodos para lograr los objetivos adecuados, se describen en la solicitud de patente Norteamericana Serie número , titulada "Preparación de Objetivos de Vectores de Vacunas Genéticas", presentada el 10 de febrero de 1999, con el expediente número18097-030200US, también pendiente y comúnmente asignada. Los vectores de vacuna genética que incluyen los polinucleótidos recombinantes optimizados, obtenidos tal y como se describe en la presente solicitud, pueden ser administrados a un mamífero (incluyendo humanos) para inducir una respuesta inmunológica terapéutica o profiláctica. Los vehículos de administración de la vacuna, pueden ser administrados in vivo, mediante la administración a un paciente individual, generalmente, por medio de administración sistémica (por ejemplo, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica, intracraneal, anal, vaginal, oral, por ruta bucal o pueden ser inhalados), o pueden ser administrados por medio de aplicación tópica. Alternativamente, los vectores pueden ser administrados a células ex vivo, tales como las células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspíratos de médula espinal, biopsia de tejidos) o a los sistemas de tronco universales del donador hematopoiético, seguidos por la reimplantación de las células en un paciente, generalmente, después de la selección de células, las cuales han sido incorporadas al vector. Una gran cantidad de métodos de administración, son bien conocidos por aquellos expertos en el arte. Dichos métodos ¡ncluyen, por ejemplo, la administración de genes basados en el liposoma (Debs y Zhu (1993) WO 93/24640; Mannino y Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6 (7): páginas 682 a 691 ; Rose, patente Norteamericana número 5,279,833; Brigham (1991 ) patente WO 91 /06309; y Felgner y Asociados (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. E. U.A. 84: páginas 7413 a 7414), así como el uso de vectores virales (por ejemplo, adenoviral (ver, por ejemplo, Berns y Asociados (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772: páginas 95 a 104; Ali y Asociados (1994) Gene Ther. 1 : páginas 367 a 384; y Haddada y Asociados (1995) Curr. Top. Microbio. Immunol. 199 (Pt 3): páginas 297 a 306 para revisión)), papalomaviral, retroviral (ver, por ejemplo, Buchscher y Asociados (1992) J. Virol. 66 (5) páginas 2731 a 2739; Johann y Asociados (1992) J. Virol 66 (5): páginas 1635 a 1640 (1992); Summerfeit y Asociados (1990) Virol. 176: páginas 58 a 59; Wilson y Asociados (1989) J. Virol. 63: páginas 2374 a 2378; Miller y Asociados, J. Virol. 65: páginas 2220 a 2224 (1991 ); Wong-Staal y Asociados, patente PCT/US/94/05700, y Rosenburg y Fauci (1993) en Fundamental Immunology, tercera edición, Paul (ed) Raven Press, Limited, New York y las referencias que se encuentran en el mismo y, Yu y Asociados, Gene Therapy ( 1994) supra), y vectores virales asociados con adeno (ver, West y Asociados, (1987) Virology 160: páginas 38 a 47; Cárter y Asociados (1989) patente Norteamericana número 4,797,368; Cárter y Asociados, patente WO 93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5: páginas 793 a 801 ; Muzyczka (1994) J. Clin. Invst. 94: página 1351 y Samulski (supra) para una vista general de los vectores AAV; ver también Lebkowski, patente Norteamericana número 5, 173,414; Tratschin y Asociados (1985) Mol. Cell. Biol. 5 (1 1 ): páginas 3251 a 3260; Tratschin y Asociados (1984) Mol. Cell. Biol. , 4: páginas 2072 a 2081 ; Hermonat y Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. E. U.A. 81 : páginas 6466 a 6470; McLaughlin y Asociados (1988) y Samulski y Asociados (1989) J. Virol. , 63: páginas 03822 a 3828) y similares.

El ADN "desnudo" y/o ARN que comprende una vacuna genética, puede ser introducido directamente en un tejido, tal como un músculo. Ver, por ejemplo, patente Norteamericana número 5,580,859. Otros métodos tales como la transformación "biolística" o mediada por partículas (ver, por ejemplo, Sanford y asociados, patente Norteamericana número 4,945,050; patente Norteamericana número 5,036,006), también son adecuados para la introducción de las vacunas genéticas en las células de un mamífero, de acuerdo con la presente invención. Estos métodos, son útiles, no solamente para la introducción in vivo del ADN en un mamífero, sino también para la modificación ex vivo de células, para la reintroducción a un mamífero. Como en los otros métodos de administración de vacunas genéticas, si es necesario, la administración de la vacuna es repetida con el objeto de mantener el nivel deseado de inmunomodulación. Los vectores de vacuna genética (por ejemplo, adenoviruses, liposomas, papilomaviruses, retroviruses, etc.) pueden ser administrados directamente al mamífero por la transducción de las células in vivo. La vacunas genéticas obtenidas utilizando los métodos de la presente invención, pueden ser formuladas como composiciones farmacéuticas para administración de cualquier modo adecuado, incluyendo la administración parenteral (por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intradermal o intravenosa), tópica, oral, rectal, ¡ntratecal, bucal (por ejemplo, sublingual), o administración local, tales como por medio de un aerosol o transdérmicamente, para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. El tratamiento previo de la piel, por ejemplo, mediante el uso de agentes removedores de cabello, puede ser útil para la administración transdérmica. Los métodos adecuados de administración, tales como ácidos nucleicos empaquetados, están disponibles y son bien conocidos para aquellos expertos en el arte, y, aunque se puede usar más de una vía para administrar una composición particular, una ruta particular, puede proporcionar frecuentemente, una reacción más inmediata y más efectiva que otra ruta. Los vehículos farmacéuticamente aceptables, son determinados en parte, por la composición particular que está siendo administrada, así como, por el método particular usado para administrar la composición . Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente invención. Se pueden usar una variedad de vehículos acuosos, por ejemplo, salina regulada y similares. Estas soluciones, son estériles y generalmente están libres de materias indeseables. Estas composiciones pueden ser esterilizadas, por medio de técnicas convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener substancias auxiliares, farmacéuticamente aceptables, según sean requeridas para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como, un ajuste de pH y agentes reguladores, agentes de ajuste de toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración del vector de vacuna genética en estas formulaciones, puede variar ampliamente, y será seleccionada, basada principalmente en los volúmenes de fluido, viscosidades, peso del cuerpo y similares, de acuerdo con la modalidad de administración particular seleccionada y , las necesidades del paciente. Las formulaciones adecuadas para la administración oral, pueden consistir de (a) soluciones líquidas, tales como una cantidad efectiva del ácido nucleico empacado, suspendida en diluyentes, tales como, agua, salinas o PEG 400; (b) cápsulas, pastillas o tabletas,* conteniendo cada una, una cantidad previamente determinada del ingrediente activo, como líquidos, sólidos, granulos o gelatina; (c) suspenciones en un líquido apropiado; y (d) emulsiones adecuadas. Las formas de tabletas, pueden incluir una o más de lactosa, sacarosa, manitol, sorbitol, fosfatos de calcio, almidón de maíz, almidón de papa, tragacanto, celulosa microcristalina, acacia, gelatina, dióxido coloidal de silicona, sodio de croscarmelosa, talco, estearato de magnesio, ácido esteárico, y otros excipientes, colorantes, rellenadores, enlazadores, diluyentes, agentes reguladores, agentes de humectación , conservadores, agentes saborizantes, tintes, agentes desintegrantes, y los vehículos farmacéuticamente compatibles. Las formas de pastillas, pueden comprender el ingrediente activo en un sabor, generalmente sacarosa y acacia o tragacanto, así como, pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia en emulsiones, gel, y similares que contienen, además del ingrediente activo, vehículos conocidos en el arte. Es reconocido que las vacunas genéticas, cuando son administradas por la vía oral, deben estar protegidas para la digestión . Esto se logra, generalmente, ya sea elaborando complejos del vector de vacuna con una composición para producir una hidrólisis enzimática resistente a los ácidos o empacando el vector en un vehículo resistente apropiadamente, tal como un liposoma. Los medios para proteger los vectores de la digestión, son bien conocidos en el arte. Las composiciones farmacéuticas, pueden ser encapsuladas, por ejemplo, en liposomas, o en una formulación que proporciona una liberación sostenida del ingrediente activo. Los ácidos nucleicos empacados, solos o en combinación con otros componentes adecuados, se pueden fabricar en formulaciones de aerosol (por ejemplo, pueden ser "nebulizados") para ser administrados por medio de la inhalación. Las formulaciones en aerosol, pueden ser colocadas en propulsores presurizados aceptables, tales como, diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y los similares. Las formulaciones adecuadas para la administración rectal, incluyen por ejemplo, supositorios, los cuales consisten del ácido nucleico empacado con una base de supositorio. Las bases de supositorio adecuadas, incluyen triglicéridos naturales o sintéticos, o hidrocarburos de parafina. Además, también es posible utilizar cápsulas rectales de gelatina, las cuales consisten de una combinación del ácido nucleico empacado con una base, incluyendo, por ejemplo, triglicéridos líquidos, glicoles polietileno e hidrocarburos de parafina. Las formulaciones adecuadas para la administración parenteral, tales como, por ejemplo, vía ¡ntraarticular (en las coyonturas), intravenosas, intramuscular, intradermal, intraperítoneal , y rutas subcutáneas, incluyen soluciones acuosas y no acuosas para inyección estéril isotónica, las cuales pueden contener antioxidantes, reguladores, bacteriostatos, y materiales disueltos que producen la formulación isotónica con la sangre en el receptor que se pretende para la misma y, suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir, agentes de suspensión, solubilizadores, agentes espesantes, estabilizadores, y conservadores. En la práctica de la presente invención, las composiciones pueden ser administradas, por ejemplo, por infusión intravenosa, por vía oral, tópica, intraperitoneal, intravesical, o ¡ntratecal. La administración parenteral y la administración intravenosa, son los métodos de administración preferidos. Las formulaciones de ácido nucleico empacado, pueden ser presentadas en recipientes de dosis unitarias o dosis múltiples, tales como ámpulas y viales. Las soluciones de inyección y suspensión, pueden ser preparadas a partir de polvos estériles, granulos y tabletas del tipo descrito anteriormente. Las células transducidas por el ácido nucleico empacado, también pueden ser administradas de manera intravenosa o parenteral.

La dosis administrada a un paciente, en el contexto de la presente invención, debe ser suficiente para efectuar una respuesta terapéutica benéfica en el paciente con el tiempo. La dosis será determinada por la eficacia del vector particular empleado y la condición del paciente, así como por el peso corporal y el área de superficie vascular del paciente que va a ser tratado. El tamaño de la dosis, también será determinado por la existencia, naturaleza, y hasta el punto de cualesquiera efectos laterales adversos que acompañan la administración de un vector particular, o tipo de célula transducido en un paciente en particular. Para determinar la cantidad efectiva del vector que va a ser administrado en el tratamiento o profilaxis de una infección u otra condición, el médico evalúa las toxicidades del vector, el progreso de la enfermedad, y la producción de anticuerpos contra el vector, si los hay. En general, la dosis equivalente de un ácido nucleico desnudo de una vector, es desde aproximadamente un µg hasta un mg, para un paciente típico de 70 kilogramos, y las dosis de los vectores usados para administrar el ácido nucleico, son calculadas para producir una cantidad equivalente de ácido nucleico terapéutico. La administración, puede ser realizada por medio de una sola dosis o dosis divididas. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones administradas a un paciente que sufre de una enfermedad (por ejemplo, una enfermedad infecciosa o un desorden autoinmunológico) en una cantidad suficiente para curar o por lo menos disminuir parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar esto, es definida como una (dosis terapéuticamente efectiva). Las cantidades efectivas para este uso, dependerán de la severidad de la enfermedad y de la condición general de la salud del paciente. Las administraciones solas o múltiples de las composiciones, pueden ser administradas dependiendo de la dosis requerida y tolerada por el paciente. En cualquier' caso, la composición, debe proporcionar una cantidad suficiente de las proteínas de la presente invención, para tratar de manera efectiva al paciente. En aplicaciones profilácticas, las composiciones son administradas a un humano u otro mamífero, con el objeto de inducir una respuesta inmunológica que pueda ayudar a protegerlo contra el establecimiento de una enfermedad infecciosa u otra condición. La toxicidad y eficacia terapéutica de los vectores de vacuna genética proporcionados por la presente invención, son determinadas utilizando los procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o animales experimentales. Se puede determinar, la LD50 (la dosis letal al 50% de la población) y la ED50 (dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población) utilizando los procedimientos presentados en la presente invención, y aquellos conocidos de otra manera por aquellos expertos en el arte. Una composición farmacéutica típica para administración intravenosa, sería de aproximadamente 0.1 a 10 mg por paciente por día. Las dosificaciones de 0.1 hasta aproximadamente 100 mg por paciente por día, pueden ser usadas. Particularmente, cuando la droga es administrada en un sitio alejado, y no en la corriente sanguínea, tal como, dentro de una cavidad del cuerpo o dentro de un lumen de un órgano. Las dosificaciones substancialmente más altas son posibles en la administración tópica. Los métodos actuales para la preparación de las composiciones que se pueden administrar por la vía parenteral, serán conocidas y las apreciarán aquellos expertos en el arte, y se describen con mayor detalle en publicaciones, tales como, Remington's Pharmaceutical Science, 15a. Edición, Mack Publishing Company, Easton , Pennsylvania (1980). Los polipéptidos antigénicos multivalentes de la presente invención, y las vacunas genéticas que expresan los polipéptidos, pueden ser empacadas en paquetes, aparatos abastecedores, y equipos para la administración de vacunas genéticas a un mamífero. Por ejemplo, los paquetes o aparatos abastecedores que contienen una o más unidades de dosificación . Generalmente, las instrucciones para la administración de los compuestos serán provistas con los paquetes, junto con una indicación adecuada en la etiqueta, de que el compuesto es adecuado para el tratamiento de una condición indicada. Por ejemplo, la etiqueta puede manifestar que el compuesto activo dentro del paquete, es útil para el tratamiento de una enfermedad infecciosa particular, desorden autoinmunológico, tumor, o para prevenir o tratar otras enfermedades o condiciones que son mediadas por, o potencialmente susceptibles a, la respuesta inmunológica del mamífero.

Ejemplos Los siguientes ejemplos, se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar la presente invención.

Ejemplo 1 . Especificidad alterada del ligando de B7-1 (CD80) y/o B7-2 (CD86), por medio del arrastre de ADN Este Ejemplo, describe el uso de los métodos de arrastre de ADN de la presente invención, con el objeto de obtener polipéptidos B7-1 y B7-2 que tienen una actividad biológica alterada.

Arrastre de ADN. El arrastre de ADN es usado, para generar un biblioteca de variantes de B7 (B7-1 /CD80 y B7-2/CD86) que tienen una capacidad relativa alterada para actuar a través del CD80 y el CTLA-4, cuando son comparados con moléculas del tipo B7 de tipo natural. Generalmente, los cADNs de B7 de diferentes especies, son generados por medio de RT-PCR, y estas secuencias son arrastradas, utilizando el arrastre de la familia de ADN. Las alineaciones de nucleótidos B7-1 de humanos, mono rhesus y conejo, son mostradas en la Figura 15, demostrando que es posible el método de arrastre de la familia de ADN, cuando se desarrollan moléculas B7.

Selección de las variantes B7. La biblioteca, entonces es seleccionada para identificar aquellas variantes que son útiles en la modulación de las respuestas inmunológicas en enfermedades autoinmunológicas, alergia, cáncer, enfermedades infecciosas y vacunación. Se puede utilizar cualquiera de los diferentes métodos de selección de las variantes.

A. Sistema de Selección Basado en el Flujo Citométrico. La biblioteca de moléculas B7-1 y B7-2, es transfectada en las células que generalmente no expresan estas moléculas (por ejemplo, células COS-7 y cualquier línea celular de diferentes especies, con una reactividad limitada o no cruzada con el hombre con respecto al enlace del ligando B7). Con el objeto de analizar el número de copias por célula, se puede incorporar un gen marcador interno. Las moléculas CTL-A y CD28 solubles, son generadas con el objeto de facilitar los experimentos de flujo citométrico. Generalmente, estos polipéptidos solubles, son fusionados con la porción Fc de la molécula IgG para mejorar la estabilidad de las moléculas y para hacer posible el manchado fácil, por medio de anticuerpos monoclonales anti-lgG, etiquetados, tal y como los describe Van der Merwe y Asociados ((1997) J. Exp. Med. 185: página 393). Las células transfectadas con la bibliotecas de moléculas B7", son entonces manchadas con las moléculas CTLA-4 y CD28 solubles. Son clasificadas las células que demuestran una proporción de enlace de CTLA-4/CD28, aumentada o disminuida. Luego, los plásmidos son recuperados y se identifican las secuencias arrastradas. Estas variantes del B7 seleccionadas, entonces pueden ser sometidas a nuevas rondas de arrastre y selección, y pueden ser analizadas adicionalmente, utilizando ensayos funcionales tal y como se describen a continuación.

B. Selección Basada en las Propiedades Funcionales. Las colonias de bacterias que contienen los plásmidos, que incluyen las moléculas B7 mutantes, son recolectadas y los plásmidos son aislados. Estos plásmidos, son transfectados entonces, en las células que presentan el antígeno, tales como las células dendríticas, y las capacidades de estos mutantes para activar las células T, son analizadas. Una de las ventajas de este método, es que no se hacen suposiciones con respecto a las afinidades o especificidades de enlace con los ligandos conocidos, y posiblemente se puedan descubrir actividades nuevas a través de los ligandos que van a ser identificados todavía. La activación de la célula T, puede ser analizada, midiendo la proliferación, producción de citocina, actividad CTL o expresión de antígenos de activación, tales como el receptor IL-2, las moléculas CD69 o HLA-DR. El uso de clones de célula T antígenos específicos, tales como las células T específicas para el antígeno de polvo minúsculo de la casa Der p I , permite el análisis de la activación de la célula T del antígeno específico. Se identifican los mutantes que pueden aumentar o inhibir la proliferación de la célula T, o aumentar o inhibir las respuestas CTL. De un modo similar, se pueden seleccionar las variantes que tienen la capacidad alterada para inducir la producción de citocina o la expresión de los antígenos de activación, tal y como fueron medidos, por ejemplo, por la prueba de ELISA específica para citocinas o el flujo de citometría. Los resultados obtenidos utilizando el ensayo basado en la proliferación, son mostrados en la Figura 13.

C. Capacidad para Dirigir la Diferenciación de las Células, ya sean TH1 O TH2. Debido a que han sido identificados los roles diferenciales para las molécula B7-1 y B7-2 en la diferenciación de la célula auxiliar T (Freeman y Asociados (1995) Immunity 2: página 523; Kuchroo y Asociados (1995) Cell 80: página 707), se pueden seleccionar las variantes de B7 que sean más efectivas en la conducción de la diferenciación de las células, ya sea TH 1 O TH2. La diferenciación de la Célula TH, puede ser medida, por medio del análisis de los perfiles de producción de citocina, inducidos por cada variante particular. Los niveles altos de IL-4, IL-5 y/o IL-13, son una indicación de la diferenciación eficiente de la célula TH2 , mientras que los niveles altos de IFN-? o IL-2, pueden ser usados como un marcador de la diferenciación de la célula TH 1 . Las variantes del B7 que tienen capacidad alterada para inducir la diferenciación de las células TH 1 O TH2, es más probable que sean útiles en el tratamiento de enfermedades alérgicas, malignas, autoinmunológicas e infecciosas y en la vacunación.

D. Producción Aumentada de IL-10. La producción elevada de I L-10, es una característica de las células T reguladoras, las cuales pueden suprimir la proliferación de células CD4+T, específicas de antígenos (Groux y Asociados (1997) Nature 389: página 737), por lo tanto, las variantes de B7 pueden ser seleccionadas para identificar aquellas que tienen una capacidad aumentada para inducir la producción de I L-10 por las células T de específicas de antígenos. La producción de IL-10, puede ser medida, por ejemplo, por el ensayo de ELISA o flujo de citometría, utilizando manchados intracitoplásmicos de citocina. Las variantes que inducen altos niveles de producción de I L-10, son útiles en el tratamiento de enfermedades alérgicas o autoinmunológicas.

Ejemplo 2. La Evolución de las Citocinas para la Actividad Específica Mejorada y/o Niveles de Expresión Mejorados.

Este Ejemplo, describe un método para desarrollar una citocina, para la actividad específica mejorada y/o niveles de expresión mejorados, cuando la vacuna genética es transfectada en células de una mamífero. La I L-12, es la citocina más potente para dirigir las respuestas de las células TH 1 , y mejora la eficacia de la vacunación genética. Las moléculas IL-12 desarrolladas, son útiles para usarse como componentes de vacunas genéticas. La IL-12, es una citocina heterodimérica, compuesta de una cadena ligera de 35 kD (p35) y una cadena pesada de 40 kD (40) (Kabayashi y Asociados (1989) J. Exp. Med. 170: página 827; Stern y Asociados (1990) Proc. Nat'l. Acad. Sci. E. U.A. 87: página 6808). Recientemente, Lieschke y Asociados (Nature Biotechnol. (1997) 15: página 35), demostró que una fusión entre los genes p35 y p40, da como resultado un sólo gen que tiene una actividad comparable a la de dos genes expresados separadamente. Por consiguiente, un gen I L-12, es arrastrado como una entidad que codifica ambas subunidades, lo cual es benéfico en el diseño del protocolo de arrastre. Las subunidades de IL-12, también pueden ser expresadas separadamente en el mismo vector de expresión, o las subunidades pueden ser expresadas separadamente y seleccionadas utilizando co-transfecciones de los dos vectores, proporcionando estrategias adicionales de arrastre. La IL-12, juega varios roles importantes en la regulación de las respuestas alérgicas, por ejemplo, la IL-12 induce la diferenciación de las células TH 1 , y regula de manera descendente la respuesta de la TH2. La IL-12, exhibe una síntesis de IgE, tanto ín vivo como in vitro, y también induce la producción de I FN-?. Por consiguiente, es deseable obtener una I L-12 optimizada que tenga una mejor capacidad para realizar estas funciones al momento de su administración a un mamífero. Los genes de citocina, incluyendo los genes I L-12, provenientes de humanos y primates no humanos, son generalmente homólogos del 93 al 99%, (Villínger y Asociados (1995) J. Immunol. 155: páginas 3946 a 3954), proporcionando un buen punto de partida para el arrastre de la familia. Una biblioteca de genes IL-12 arrastrados, fue obtenida mediante el arrastre de las subunidades p35 y p40, derivadas del humano, mono rhesus, gato, perro, vaca, cerdo y cabra, y fue incorporado en vectores, y los flotantes de estos transfectantes, son analizados para determinar su actividad biológica, tal y como se ¡lustra en la Figura 6. Debido a sus actividades promotoras del crecimiento de la célula T, es posible utilizar células T sanguíneas humanas periféricas normales, en la selección de los genes de IL-12 más activos, haciendo posible la selección directa de los mutantes de IL-12, con actividades más potentes en las células T humanas. Tal y como se ¡lustra en la Figura 7, un ensayo de selección funcional, ha sido establecido de manera exitosa. En este ensayo, las células COS-7, fueron primero transfectadas con vectores codificadores de subunidades de IL-12. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se estudió la capacidad de éstos flotantes de cultivo, para inducir la proliferación de la células T sanguíneas periféricas humanas activadas. La Figura 8, indica la consistencia del nivel de proliferación de células T, inducido en este ensayo, indicando que el ensayo puede ser usado para distinguir las actividades entre los flotantes que tienen diferentes capacidades para inducir la activación de la célula T. En otras palabras, el ensayo proporciona medios para seleccionar las actividades mejoradas, similares a las de la I L-12 en los flotantes de cultivo de las células transfectadas. Se probó la capacidad de un vector con un polinucleótido optimizado codificador de la I L-2, para inducir la activación de células T humanas. Los resultados, mostrados en la Figura 9, muestran que la IL-12 arrastrada, tiene una capacidad significativamente mejorada, para inducir la activación de la célula T, comparada con la IL-12 natural. La Figura 6, ilustra una estrategia general para la selección de genes desarrollados de citocina. El ejemplo específico es proporcionado para la I L-12, pero un método similar es aplicable para todas las citocinas, cuando se usan tipos de células sensibles para cada citocina. Por ejemplo, se puede utilizar el mismo método para desarrollar el GM-CSF utilizando en la selección el TF-1 de la línea celular sensible al GM-CSF. Además, aunque en este ejemplo, los vectores son transfectados en las células CHO, cualquier célula de mamífero que pueda ser transfectada in vitro, puede ser usada como célula hospedera. Además de la Célula CHO, otras células buenas para servir como hospederas, incluyen las líneas celulares WI-26, COS-1 , COS-7, 293, U937, y los antígenos humanos, recientemente aislados que presentan células, tales como monocitos, células B y células dendríticas.

Ejemplo 3. Células T Citotóxicas que Inducen Secuencias Derivadas del Antígeno de la Superficie de Hepatitis B y Epítopes de Células T Agonistas, Fuertemente Inmunogénicas.

Este Ejemplo, describe la preparación de una secuencia de polipéptidos con capacidad para la presentación eficiente de epítopes de célula T y una estrategia para la aplicación del arrastre de ADN, para descubrir epítopes de célula T agonísticos, fuertemente inmunogénicos. El polipéptido HBsAg (PreS2 más regiones S) fue truncado por la introducción de una detención del codón, en la posición 103 del amino ácido (contando desde el inicio de la metionina del iniciador PreS2), transformando un codón de sisteína TGT en el TGA de detención del codón. La secuencias del amino ácido de la proteína truncada, fue por lo tanto: QWNSTTFHQTLQDPRVRGLYFPAGGSSSGTVN PVLTTASPLSSIFSR IGDPALNMENITSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLG GTTV* en donde la clave de una sola letra estándar para los amino ácidos es usado. Los residuos de metionina al inicio de las regiones PreS2 y S, están subrayadas, y el epítope CTL, restringido por el Ld del ratón, está doblemente subrayado, el asterisco (*), representa el codón de detención introducido artificialmente. Una estructura similar para este polipéptido truncado, se muestra en la Figura 1 . Durante la biosíntesis de la proteína, la región de la terminal N del polipéptido HBsAg es transportada a través de la membrana del retículo endoplásmico (ER). La primera parte de la región S es una estructura transmembrana, la cual cierra el polipéptido en el ER. La región terminal C restante del polipéptido, está localizada en el compartimento citoplásmico a donde se puede tener acceso por medio del mecanismo de procesamiento del epítope de la célula. Esta estructura forma, a lo que nos referimos como la Secuencia Inductora Citotóxica de la Célula T (CTIS). Una CTIS, es usada preferentemente en conjunto con una secuencia inmunogénica agonística (IAS). Como un ejemplo de una IAS, cada posición de un epítope de la clase I , restringido por Ld de doce amino ácidos provenientes del HBsAg, fue reemplazado por un codón codificador de alanina en la secuencia de ADN del epítope. Los resultados demuestran que, en algunos casos, la reactividad es mayor que si la respuesta CTL es inducida por el epítope normal (Figura 3).

Ejemplo 4.

Tratamiento de Obesidad, Anorexia, y Cachexia, utilizando Moléculas Inmunomoduladoras Optimizadas.

Las moléculas ¡nmunomoduladoras optimizadas que son obtenidas, utilizando los métodos de la presente invención, encuentran uso en una amplia variedad de aplicaciones, además de su uso en la vacunación. Por ejemplo, existe una evidencia creciente de que ciertas formas de obesidad están asociadas con la disfunción del sistema inmunológico, y que las moléculas que regulan las respuestas inmunológicas, por ejemplo, citocinas, pueden inducir o inhibir la obesidad. La invención proporciona métodos para la optimización de moléculas reguladoras inmunológicas, para el tratamiento de la obesidad, anorexia y cachexia. El factor neurotrófico de leptin y ciliar (CNTF), son ejemplos de citocinas que se ha mostrado que juegan un rol en el desarrollo de la obesidad. La deficiencia congénita de leptin, da como resultado una presentación temprana de obesidad severa en los humanos (Montague y Asociados (1997) Nature 387: páginas 903 a 908), y se ha mostrado que el CNTF, corrige la obesidad y la diabetes asociada con la deficiencia y resistencia de leptin (Gloaguen y Asociados (1997) Proc. Nat'l. Acad. Sci. E. U.A. 94: páginas 6456 a 6461 ). Los antagonistas del CNTF y/o leptin, son útiles en el tratamiento de la anorexia y/o cachexia. Los métodos de la presente invención, son usados para generar moléculas de leptin y/o CNTF, que tienen una actividad específica mejorada. Los métodos también son útiles para la obtención de citocinas mejoradas que exhiben inmunogenicidad reducida in vivo. La inmunogenicidad es una preocupación particular para el CNTF, debido a que el CNTF natural, es altamente antigénico, lo que da como resultado la producción de altos niveles de anticuerpos anti-CNTF, cuando son administrados a los humanos. Las moléculas de citocina mejoradas preparadas utilizando los métodos de la presente invención, son administradas como polipéptidos, o los ácidos nucleicos arrastrados que codifican los polipéptidos de leptin y/o CNTF mejorados, son útiles en los vectores de vacunas genéticas. La presente invención , también proporciona métodos para la generación de vectores que inducen la producción de niveles aumentados de leptin y/o CNTF. Los métodos de la presente invención, también pueden ser utilizados para obtener reactivos que son útiles para el tratamiento de la anorexia, cachexia y enfermedades relacionadas. En esta modalidad, los antagonistas de leptin y/o CNTF, son desarrollados utilizando los métodos de arrastre del ADN . Por ejemplo, un receptor de leptin , puede ser desarrollado para obtener una forma soluble que tiene una afinidad mejorada para el leptin. El receptor de leptin en los ratones, se ha encontrado en el hipotálamo (Mercer y Asociados (1996) FEBS Lett. 387: página 1 13), una región conocida que comprende el mantenimiento del equilibrio de la energía, y en el plexo coroide y Ieptomeninges, las cuales forman parte de la barrera de sangre/cerebro.

En el entendido de que los ejemplos y modalidades descritas en la presente solicitud, son solamente con propósitos de ilustración y que varias modificaciones o cambios en vista de los mismos serán sugeridos para las personas expertas en el arte, y que están incluidos dentro del espíritu y el contenido de la presente solicitud, así como el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente descripción , están incorporadas a la misma, como referencia para todos los propósitos.

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES:

1. Un método para la obtención de un polinucleótido que tiene un efecto modulatorio en una respuesta inmunológica, o que codifica un polipéptido que tiene un efecto modulatorio en una respuesta ¡nmunológica, el cual es inducido por un vector de vacuna genética, comprendiendo dicho método: La creación de una biblioteca de polinucleótidos recombinantes; y La selección de la biblioteca para identificar un polinucleótido recombinante optimizado que tiene, o codifica un polipéptido que tiene, un efecto modulatorio en una respuesta inmunológica inducida por un vector de vacuna genética; En donde, el polinucleótido recombinante optimizado o el polipéptido codificado por el polinucleótido recombinante exhibe una capacidad aumentada para modular una respuesta inmunológica, comparado con un polinucleótido no recombinante del cual fue creada la biblioteca.

2. El método, tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido recombinante optimizado es incorporado en un vector de vacuna genética.

3. El método, tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido recombinante optimizado o un polipéptido codificado por el polinucleótido recombinante optimizado, es administrado en conjunto con un vector de vacuna genética.

4. El método, tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado además porque la biblioteca de polinucleótidos recombinantes es creada por medio de un proceso seleccionado del grupo consistente de, arrastre de ADN , PCR de propensión de error, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis mediada por uracilo, y mutagénesis de hospedero de reparación-deficiente.

5. El método, tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido tiene un efecto modulatorio en una respuesta inmunológica, que es obtenida por medio de: (1 ) La recombinación de por lo menos, la primera y segunda formas de un ácido nucleico que es, o codifica, una molécula que está comprendida en la modulación de una respuesta inmunológica, en donde, la primera y segunda formas difieren, una de la otra, en dos o más nucleótidos, para producir una biblioteca de polinucleótidos recombinantes; y (2) La selección de la biblioteca para identificar, por lo menos, un polinucleótido recombinante optimizado que exhibe, ya sea por sí mismo, o a través de la molécula codificada, una capacidad mejorada para modular una respuesta inmunológica que una forma de ácido nucleico del cual la biblioteca fue creada.

6. El método, tal y como se describe en la reivindicación 5, caracterizado además porque el método, comprende adícionalmente los pasos de: (3) La recombinación de, por lo menos, un polinucleótido recombinante optimizado, con una forma adicional de ácido nucleico, la cual es la misma o diferente de la primera y segunda formas, para producir una biblioteca adicional de polinucleótidos recombinantes; (4) La selección de la biblioteca adicional para identificar, por lo menos, un polinucleótido recombinante optimizado adicional, que exhibe una capacidad mejorada para modular una respuesta inmunológica que una forma de ácido nucleico de la cual fue creada la biblioteca; y (5) La repetición de los pasos (3) y (4), según sea necesario, hasta que el polinucleótido recombinante optimizado adicional exhibe una capacidad mejorada adicional para modular una respuesta ¡nmunológica que una forma de ácido nucleico de la cual fue creada la biblioteca.

7. El método, tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido recombinante optimizado codifica un péptido o un polipéptido que puede interactuar con un receptor celular involucrado en la mediación de una respuesta inmunológica, en donde el péptido o polipéptido actúa como un agonista o antagonista del receptor.

8. El método, tal y como se describe en la reivindicación 7, caracterizado además porque el receptor celular es un receptor de limpieza de macrófago.

9. El método, tal y como se describe en la reivindicación 7, caracterizado además porque el receptor celular, es sejeccionado del grupo consistente de un receptor de citocina y un receptor de quimiocina.

10. El método, tal y como se describe en la reivindicación 9, caracterizado además porque el receptor de quimiocina es CCR6.

1 1. El método, tal y como se describe en la reivindicación 7, caracterizado además porque el péptido o polipéptido, imita la actividad de un ligando natural para un receptor, pero no induce la reactividad ¡nmunológica al ligando natural.

12. El método, tal y como se describe en la reivindicación 7, caracterizado además porque la biblioteca es seleccionada por: La expresión de polinucleótidos recombinantes, de modo que los péptidos o polipéptidos codificados, son producidos como fusiones con una proteína mostrada en la superficie de un paquete genético replicable; El contacto de los paquetes genéticos replicables, con una pluralidad de células que muestran el receptor; y La identificación de las células que exhiben una modulación de una respuesta inmunológica mediada por el receptor.

13. El método, tal y como se describe en la reivindicación 12, caracterizado además porque el paquete genético replicable, es seleccionado del grupo consistente de, un bacteriófago, una célula, una espora y un virus.

14. El método, tal y como se describe en la reivindicación 13, caracterizado además porque el paquete genético replicable, es n bacteriófago M 13, y la proteína es codificada por el gen l l l o el gen Vi l .

15. El método, tal y como se describe en la reivindicación 7, caracterizado además porque el método comprende adicionalmente la introducción del polinucleótido recombinante optimizado en un vector de vacuna genética, y la administración del vector a un mamífero, en donde, el péptido o polipéptido es expresado, y actúa como un agonista o antagonista del receptor.

16. El método, tal y como se describe en la reivindicación 7, caracterizado además porque comprende adicionalmente la producción del péptido o polipéptido codificado por el polinucleótido recombinante optimizado, y la introducción del péptido o polipéptido en un mamífero, en conjunto con un vector de vacuna genética.

17. El método, tal y como se describe en la reivindicación 7, caracterizado además porque el polinucleótido recombinante optimizado es insertado en una secuencia nucleótida codificante del antígeno de un vector de vacuna genética.

18. El método, tal y como se describe en la reivindicación 17, caracterizado además porque el polipéptido recombinante optimizado es introducido en una secuencia de nucleótidos que codifica un circuito M de un polipéptido HBsAg.

19. El método, tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido recombinante optimizado, comprende una secuencia de nucleótidos, rica en CpG no metilados.

20. El método, tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido recombinante optimizado, codifica un polipéptido que inhibe una reacción alérgica.

21 . El método, tal y como se describe en la reivindicación 20, caracterizado además porque el polipéptido es seleccionado del grupo consistente de interferon-a, interferon-?, I L-10, IL-12, un antagonista de IL-4, un antagonista de I L-5, y un antagonista de I L-13.

22. El método, tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido recombinante optimizado codifica una antagonista de I L-10.

23. El método, tal y como se describe en la reivindicación 22, caracterizado además porque el antagonista de I L-10 es soluble o un receptor de I L-10 defectuoso o I L-20/MDA-7.

24. El método, tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido recombinante optimizado codifica un co-estimulante.

25. El método, tal y como se describe en la reivindicación 24, caracterizado además porque el co-estimulante es B7-1 (CD80) o B7-2 (CD86), y el paso de selección comprende la selección de variantes con actividad alterada a través del CD28 o CTLA-4.

26. El método, tal y como se describe en la reivindicación 24, caracterizado además porque el co-estimulante es CD 1 , CD40, CD154 (ligando para CD40) o CD 150 (SLAM).

27. El método, tal y como se describe en la reivindicación 24, caracterizado además porque el co-estimulante es una citocina.

28. El método, tal y como se describe en la reivindicación 27, caracterizado además porque la citocina es seleccionada del grupo consistente de IL-1 , I L-2, IL-3, I L-4, IL-5, I L-6, IL-7, IL-8, IL-9, I L-10, IL-1 1 , I L-12, IL-13, IL-14, IL15, I L-16, IL-17, IL-18, GM-CSF, G-CSF, TNF-a, IFN-a, IFN-?, e IL-20 (MDA-7).

29. El método, tal y como se describe en la reivindicación 28, caracterizado además porque la biblioteca de polinucleótidos recombinantes, es seleccionada por medio de la prueba de la capacidad de las citocinas codificadas por el polinucleótido recombinante para activar células, las cuales contienen un receptor para la citocina.

30. El método, tal y como se describe en la reivindicación 29, caracterizado además porque las células, contienen un ácido nucleico heterólogo que codifica el receptor para la citocina.

31 . El método, tal y como se describe en la reivindicación 28, caracterizado además porque la citocina es interleuquin-12 y la selección es realizada mediante: El cultivo de células de mamífero, las cuales contienen el vector de vacuna genética en un medio de cultivo; y La detección, si la proliferación de la célula T o la diferenciación de la célula T, es inducida por el contacto con el medio de cultivo.

32. El método, tal y como se describe en la reivindicación 28, caracterizado además porque la citocina es interferon-a y la selección se lleva a cabo mediante: La expresión de los polinucleótidos recombinantes, de modo que los péptidos o polipéptidos codificados son producidos como fusiones con una proteína mostrada en la superficie de un paquete genético replicable; El contacto de los paquetes genéticos replicables, con una pluralidad de células B; y La identificación de los miembros de la biblioteca de fagos que tienen la capacidad de inhibir la proliferación de las células B.

33. El método, tal y como se describe en la reivindicación 28, caracterizado además porque la respuesta inmunológica de interés, es diferenciación de células T a células TH 1 , y la selección es realizada por medio del contacto de la población de células T, con las citocinas codificadas por los miembros de la biblioteca de polinucleótidos recombinantes, e identificando los miembros de la biblioteca que codifican una citocina que induce la célula T para producir IL-2 e interferon-?.

34. El método, tal y como se describe en la reivindicación I 27, caracterizado además porque la citocina codificada por el pol?nucleótido recombinante optimizado, exhibe inmunogenicidad reducida comparada con una citocina codificada por un polinucleótido no optimizado, y la inmunogenicidad reducida es detectada por la introducción de una citocina codificada por el polinucleótido recombinante en un mamífero, y la determinación de si una respuesta inmunológica es inducida contra la citocina.

35. El método, tal y como se describe en la reivindicación 24, caracterizado además porque el co-estimulante es B7-1 (CD80) o B7-2 (CD86) y la célula es probada por su capacidad para coestimular una respuesta inmunológica.

36. El método, tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido recombinante optimizado, codifica un antagonista de citocina.

37. El método, tal y como se describe en la reivindicación 36, caracterizado además porque el antagonista de citocina, es seleccionado del grupo consistente de un receptor soluble de citocina y un receptor transmembrana de citocina que tiene una secuencia de señal defectuosa.

38. El método tal y como se describe en la reivindicación 36, caracterizado además porque el antagonista de citocina, es seleccionado del grupo consistente de ?I L-10R y ?IL-4R.

39. El método, tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido recombinante optimizado, codifica un polipéptido con capacidad para inducir una respuesta inmunológica predominantemente de TH 1 .

40. El método, tal y como se describe en la reivindicación 1 , caracterizado además porque el polinucleótido recombinante optimizado, codifica un polipéptido con capacidad de inducción de una repuesta inmunológica predominantemente de TH2.

41 . Un método para la obtención de un polinucleótido que codifica una molécula accesoria que mejora el transporte o presentación de antígenos por una célula, comprendiendo dicho método: Creación de una biblioteca de polinucleótidos recombinantes sometiéndola a ácidos nucleicos de recombinación que codifican todo o parte de la molécula accesoria; y Selección de la biblioteca para identificar un polinucleótido recombinante optimizado que codifica una molécula accesoria recombinante que confiere a una célula una capacidad aumentada o disminuida para transportar o presentar un antígeno en una superficie de la célula, comparada con una molécula accesoria codificada por los ácidos nucleicos no recombinantes.

42. El método, tal y como se describe en la reivindicación 41 , caracterizado además porque la selección comprende: La introducción de la biblioteca de polinucleótidos recombinantes en un vector de vacuna genética que codifica un antígeno para formar una biblioteca de vectores; La introducción de la biblioteca de vectores en células de mamíferos; y La identificación de las células de mamífero, que exhiben inmunogenicidad aumentada o disminuida al antígeno.

43. El método, tal y como se describe en la reivindicación 41 , caracterizado además porque la molécula accesoria comprende un proteasoma o un polipéptido TAP.

44. El método, tal y como se describe en la reivindicación 41 , caracterizado además porque la molécula accesoria comprende una secuencia citotóxica inductora de células T.

45. El método, tal y como se describe en la reivindicación 44, caracterizado además porque la secuencia citotóxica inductora de células T, es obtenida de un antígeno de superficie de hepatitis B.

46. El método, tal y como se describe en la reivindicación 41 , caracterizado además porque la molécula accesoria comprende una secuencia inmunogénica agonista.