MX2014010379A - Biomarcador predictivo para tratamiento de cancer con anticuerpos mejorados en adcc. - Google Patents

Abstract

La presente invención está dirigida a métodos para identificar cuales pacientes diagnosticados con cáncer, se beneficiarán más del tratamiento con una terapia anticancerígena, que comprende un anticuerpo con ADCC mejorada.

Description

BIOMARCADOR PREDICTIVO PARA TRATAMIENTO DE CÁNCER CON ANTICUERPOS MEJORADOS EN ADCC CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a métodos para identificar cuales pacientes diagnosticados con cáncer se beneficiarán más del tratamiento con una terapia anticancerígena que comprende un anticuerpo con ADCC mejorada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los anticuerpos con ADCC mejorada son una especie emergente en el campo de la terapia para el cáncer. Se ha reconocido que las llamadas funciones efectoras de un anticuerpo, que están mediadas por su región Fe, son un mecanismo importante de acción en la terapia para el cáncer basada en anticuerpos. De particular importancia en este contexto, es la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC), la destrucción de las células objetivo recubiertas por el anticuerpo (por ejemplo, células del tumor) por NK y otras células efectoras, que es desencadenada cuando el anticuerpo unido a la superficie de la célula interactúa con los receptores Fe activantes en la célula efectora.

Por lo tanto, la mejora de la actividad ADCC de los anticuerpos terapéuticos se ha vuelto de gran interés, y se han descrito varios métodos para la mejora de la ADCC. Por ejemplo, Shields et al. (J Biol Chem 9(2), 6591-6604 (2001)), mostraron que las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 298, 333 y/o 334 de la región Fe (numeración de EU de los residuos), mejora la ADCC. De manera alterna, la unión y la función efectora del receptor Fe, incrementadas, pueden obtenerse alterando la glucosilación de un anticuerpo. Los anticuerpos del tipo IgGl, los anticuerpos utilizados más comunes en la inmunoterapia para el cáncer, tienen un sitio de glucosilación enlazado a N conservado en Asn 297 en cada dominio CH2 de la región Fe. Los dos oligosacáridos biantenares complejos unidos a Asn 297, están enterrados entre los dominios CH2, formando contactos extensos con la cadena principal del polipéptido, y su presencia es esencial para que el anticuerpo medie las funciones efectoras incluyendo la ADCC (Lifely et al., Glycobiology 5, 813-822 (1995); Jefferis et al., Immunol Rev 163, 59-76 (1998); Wright y Morrison, Trends Biotechnol 15, 26-32 (1997)). Umaña et al. (Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999) y la Patente de los Estados Unidos No. 6,602,684 (WO 99/54342), el contenido de las cuales se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad), mostraron que la sobreexpresión de la b(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), una glucosiltransferasa que cataliza la formación de los oligosacáridos bisectados en las células de ovario de hámster chino (CHO), incrementan de manera significativa la actividad de la ADCC in vitro de los anticuerpos producidos en estas células. La sobreexpresión de GnTIII en la producción de líneas celulares, conduce a anticuerpos enriquecidos en los oligosacáridos bisectados, que generalmente también están no fucosilados y son del tipo híbrido. Si además de GnTIII, la manosidasa II (Manll) se sobreexpresa en las líneas de las células de producción, se obtienen anticuerpos enriquecidos en los oligosacáridos bisectados, no fucosilados del tipo complejo (Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)). Ambos tipos de anticuerpos muestran una ADCC incrementada en gran medida, en comparación con los anticuerpos con glucanos no modificados, pero sólo los anticuerpos en los cuales la mayoría de los N-glucanos son del tipo complejo, son capaces de inducir una citotoxicidad dependiente del complemento significativa (Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)). La eliminación de la fucosa del residuo de N-acetilglucosamina más interno de núcleo del oligosacárido, parece ser un factor crítico para el incremento de la actividad de la ADCC (Shinkawa et al., J Biol Chem 278, 3466-3473 (2003)). Por lo tanto, se desarrollaron métodos adicionales para producir anticuerpos con fucosilación reducida, incluyendo por ejemplo, la expresión en las células hospederas deficientes de la a(l,6)-fucosiltransferasa (Yamane-Ohnuki et al., Biotech Bioeng 87, 614-622 (2004); Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151-160 (2006)).

Varios anticuerpos con ADCC mejorada, incluyendo el anticuerpo anti-EGFR manipulado mediante glucoingeniería <ge-huMabEGFR>, así como el anticuerpo anti-CD20 manipulado mediante glucoingeniería obinutuzumab, están actualmente en desarrollo clínico, y han mostrado resultados promisorios. Sin embargo, a pesar del gran potencial de los anticuerpos con ADCC mejorada, en particular para la terapia para el cáncer, nada se conoce hasta ahora de cómo seleccionar a los pacientes que se beneficiarán más del tratamiento con tales anticuerpos. En vista de los efectos adversos potenciales asociados con las terapias inefectivas para el cáncer, se reconoce generalmente que existe la necesidad de individualizar el tratamiento del cáncer.

Por lo tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar métodos para determinar cuales pacientes responderán particularmente bien a la terapia con anticuerpos con ADCC mejorada.

SUMARIO DE LA INVENCION Las investigaciones del estado de los biomarcadores relacionados con las respuestas inmunes antitumorales, revelaron que el nivel de infiltración del tumor por las células CD16+ antes del tratamiento con los anticuerpos con ADCC mejorada, se correlacionaba con un desenlace mejorado del tratamiento en varios tipos de cáncer.

La presente invención está relacionada por lo tanto, con un método para predecir la respuesta de un paciente con cáncer a un tratamiento con un anticuerpo con ADCC mejorada, que comprende determinar el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor del paciente antes del tratamiento, y comparar el nivel de la infiltración de las células CD16+ con un nivel de referencia, en donde un nivel mayor de infiltración de las células CD16+ en comparación con el nivel de referencia, es indicativo para un paciente que derivará beneficio clínico del tratamiento.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo con ADCC mejorada para utilizarse en el tratamiento del cáncer en un paciente, en donde i) el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor del paciente se determina antes del tratamiento, ii) el nivel de infiltración de las células CD16+ se compara a un nivel de referencia, y iii) el anticuerpo con ADCC mejorada se administra a un paciente que tiene un nivel infiltración de las células CD16+ más alto en comparación con el nivel de referencia.

La presente invención también proporciona un método para el tratamiento del cáncer en un paciente, en donde i) el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor del paciente se determina antes del tratamiento, ii) el nivel de infiltración de las células CD16+ se compara con un nivel de referencia, y iii) un anticuerpo con ADCC mejorada se administra a un paciente que tiene un nivel de infiltración de las células CD16+ más alto en comparación con el nivel de referencia.

Se proporciona además, un método para tratar el cáncer en un paciente, que comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo con ADCC mejorada al paciente, con la condición de que el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor del paciente antes del tratamiento, sea más alto que un nivel de referencia.

La presente invención también se relaciona con una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo con ADCC mejorada para el tratamiento de un paciente con cáncer, que tiene un nivel incrementado de infiltración de las células CD16+ en el tumor, antes del tratamiento, con relación a un nivel de referencia.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con un equipo para detectar el nivel de infiltración de las células CD16+ en un tumor, el equipo comprende i) uno o más compuestos para detectar el nivel de infiltración de las células CD16+.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 1. Definiciones Los términos "administración" o "administrar", como se utilizan en el presente documento, significan la administración de una composición farmacéutica, tal como un anticuerpo con ADCC mejorada, a un paciente en necesidad de tal tratamiento o la intervención médica mediante cualquier medio adecuado conocido en la téenica. Las rutas de administración no limitantes incluyen, mediante administración oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, tópica, intradérmica, intranasal o intrabronquial (por ejemplo, como se efectúa mediante inhalación). Particularmente preferida en el contexto de esta invención es la administración parenteral, por ejemplo, administración intravenosa.

El término "cáncer", se refiere a la condición fisiológica en los mamíferos, que está caracterizada típicamente por la proliferación celular no regulada. Los ejemplos de cáncer incluyen, de manera no exclusiva, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia Los ejemplos más particulares de tales cánceres, incluyen cáncer de las células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de las células pequeñas, cáncer de pulmón de las células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso del pulmón), cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal), cáncer pancreático (incluyendo cáncer pancreático metastásico), glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama (incluyendo el cáncer de mama negativo a HER-2 localmente avanzado, recurrente o metastásico y el cáncer de mama positivo a HER2 recurrente localmente o metastásico), cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de las glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de las células B (incluyendo linfoma no de Hodgkin de bajo grado/folicular (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de grado alto; NHL linfoblástico de grado alto; NHL de las células no escindidas pequeñas de grado alto; NHL de la enfermedad voluminosa; linfoma de las células del manto; linfoma relacionado con el SIDA; y Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de las células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo postransplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como la asociada con tumores cerebrales), y síndrome de Meigs.

El término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un fármaco, solo o en combinación con otro fármaco o régimen de tratamiento, efectivo para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva de un fármaco puede reducir el número de células cancerosas; reducir el tamaño del tumor; inhibir (es decir, hacer más lenta a algún grado, y de manera preferida detener) la infiltración de las células cancerosas en los órganos periféricos; inhibir (es decir, hacer más lenta a algún grado, y de manera preferida detener) la metástasis del tumor; inhibir, a algún grado, el crecimiento del tumor y/o aliviar a algún grado uno o más de los síntomas asociados con el trastorno. Al grado en que el fármaco pueda evitar el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia para el cáncer, la eficacia in vivo puede, por ejemplo, medirse valorando la duración de la supervivencia, duración de la supervivencia libre de progresión (PFS), las proporciones de respuesta (RR), la duración de la respuesta y/o la calidad de vida.

El término "supervivencia general (OS)", se refiere al tiempo durante y después del tratamiento que el paciente sobrevive. Como apreciará la persona con experiencia, una supervivencia general del paciente se mejora o aumenta, si el paciente pertenece a un subgrupo de pacientes que tiene un tiempo de supervivencia medio significativamente más largo, de manera estadística, en comparación con otro subgrupo de pacientes.

El término "paciente" se refiere a cualquier animal único, de manera más específica, un mamífero (incluyendo animales no humanos, tales como, por ejemplo, perros, gatos, caballos, conejos, animales de zoológico, vacas, cerdos, ovejas y primates no humanos), para los cuales se desea el tratamiento. Aún de manera más específica, el paciente en el presente documento es un humano.

El término "composición farmacéutica", se refiere a una preparación estéril que está en tal forma, que permite que la actividad biológica del medicamento sea efectiva, y que no contiene componentes adicionales que sean tóxicos de manera inaceptable a un sujeto al cual se administraría la formulación.

El término "supervivencia libre de progresión (PFS)", se refiere al tiempo durante y después del tratamiento durante el cual, de acuerdo con la valoración del médico tratante o el investigador, la enfermedad del paciente no empeora, es decir, no progresa. Como apreciará la persona con experiencia, una supervivencia libre de progresión del paciente se mejora o aumenta si el paciente pertenece a un subgrupo de pacientes que tiene un tiempo más largo durante el cual la enfermedad no progresa, en comparación con el tiempo de supervivencia libre de progresión promedio o medio de un grupo de control de pacientes situados de manera similar.

Como se utiliza en el presente documento, "terapia" o "tratamiento" (y las variaciones gramaticales de los mismos tales como "tratar" o "tratando"), se refiere a la intervención clínica en un intento para alterar el curso natural de una enfermedad en el individuo siendo tratado, y puede realizarse ya sea para profilaxis o durante el curso de la patología clínica. Los efectos del tratamiento deseables incluyen, de manera no exclusiva, evitar la aparición o recurrencia de la enfermedad, alivio de los síntomas, disminución de cualesquier consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, evitar la metástasis, disminución de la velocidad de progresión de la enfermedad, alivio o paliación del estado de la enfermedad y remisión o pronóstico mejorados.

Un "valor representativo del nivel de infiltración de las células CD16+ en los tumores de una población de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento", se refiere a un estimado de un nivel de infiltración medio de las células CD16+ en los tumores de una población de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento.

"Beneficio clínico", se define como tener una respuesta objetivo (por ejemplo, de acuerdo con el criterio RECIST) o estabilización de la enfermedad durante al menos 12 semanas.

El antígeno CD16 es un antígeno de la superficie celular expresado en ciertas células inmunes. Existe tanto en forma transmembranal (CD16a, receptor Illa de Fcy), que se expresa, por ejemplo, en los linfocitos citolíticos naturales (NK) y los macrófagos activados, y como una forma anclada al glucosilfosfatidil-inositol (GPI) (CD16b, FcyRIIIb) expresada en los neutrófilos. "CD16" como se utilizan en el presente documento, se refiere particularmente al antígeno CD16a, también conocido como el receptor Illa de Fcy (véase el no. de acceso de UniProt P08637 [versión 136], y el no. de acceso de NCBI NP_000560 [versión NP_000560.5] para la proteína humana). En consecuencia, el término "células CD16 positivas" o "células CD16+", se refiere a células que expresan el antígeno CD16, particularmente el antígeno CD16a.

Las células CD16+ son detectables en una muestra de tejido, por ejemplo, mediante inmunohistoquímica utilizando un anticuerpo anti-CD16, tal como la clona del anticuerpo anti-CD16 2H7 (disponible de Biogenex).

El "nivel de infiltración de las células CD16+", se refiere al número de células CD16+ presentes en un tejido dado, por ejemplo, un tumor. En una modalidad particular, el nivel de infiltración de las células CD16+ se refleja por el número de células CD16+ por m2 de una sección de tejido (por ejemplo, una sección preparada de una biopsia de un tumor para el propósito del análisis inmunohistoquímico). En otra modalidad, el nivel de infiltración de las células CD16+ se refleja por el número de células CD16+ por número total de células en una muestra de tejido (por ejemplo, una biopsia de un tumor (parte de) procesada para el análisis citométrico de flujo). En aún otra modalidad, el nivel de infiltración de las células CD16+ se refleja por la cantidad de proteína CD16 o ARNm presente en una muestra de tejido (por ejemplo, una biopsia de un tumor (parte de) procesada para el análisis con ELISA o una muestra de tejido procesada para el análisis con RT-PCT).

Por "antes del tratamiento", se quiere decir antes de la primera administración del anticuerpo con ADCC mejorada al paciente. "<ge-huMabEGFR>", se refiere a un anticuerpo EGFR anti-humano de la subclase de IgGl, humanizado, manipulado mediante glucoingeniería (Número de Registro CAS 959963-46-3), basado en el anticuerpo ICR62 de rata (Modjtahedi et al. (1996), Br J Cáncer 73, 228-235). El anticuerpo se produce en las células hospederas que sobreexpresan los polipéptidos que tienen actividad de la b(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) y manosidasa II (Manll) (véase Umaña et al. (1999) Nat Biotechnol 17, 176-180 y la Patente de los Estados Unidos No. 6,602,684 (WO 99/54342), Ferrara et al. (2006) Biotechn Bioeng 93, 851- 861), y tiene al menos aproximadamente 50% de oligosacáridos no fucosilados en su región Fe.

El término "anticuerpo", se utiliza en el presente documento en el sentido más amplio y abarca varias estructuras de anticuerpos, incluyendo de manera no exclusiva, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos), y fragmentos de anticuerpo, siempre que exhiban la actividad de unión al antígeno deseada y comprendan una región Fe o una región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto", y "anticuerpo completo", se utilizan en el presente documento de manera indistinta, para referirse a un anticuerpo que tiene una estructura sustancialmente similar a la estructura del anticuerpo nativo o que tiene cadenas pesadas que contienen una región Fe como se define en el presente documento.

"Anticuerpos nativos", se refieren a moléculas de inmunoglobulina con varias estructuras. Por ejemplo, los anticuerpos de IgG nativos son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas que tienen un enlace de disulfuro. Del término N a C, cada cadena pesada tiene una región variable (VH), también llamada un dominio pesado variable o un dominio variable de la cadena pesada, seguido por tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3), también llamados la región constante de la cadena pesada. De manera similar, del término N a C, cada cadena ligera tiene una región variable (VL), también llamada un dominio ligero variable o un dominio variable de la cadena ligera, seguida por un dominio ligero constante (CL), también llamado una región constante de la cadena ligera. La cadena ligera de un anticuerpo puede asignarse a uno de dos tipos, llamados kappa (K) y lambda (l), basándose en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante.

Un "fragmento de anticuerpo" se refiere a una molécula diferente a un anticuerpo intacto, que comprende una porción de un anticuerpo intacto que se une al antígeno al cual se une el anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, de manera no exclusiva, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo de una sola cadena (por ejemplo, scFv), anticuerpos de un solo dominio y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos. Para una revisión de ciertos fragmentos de anticuerpos, véase Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Para una revisión de los fragmentos scFv, véase por ejemplo, Plückthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); véase también el documento WO 93/16185 y las Patentes de los Estados Unidos Nos.5,571,894 y 5,587,458. Para una discusión de los fragmentos Fab y F(ab')2 que comprenden los residuos del epitopo que se unen al receptor de rescate que tiene una vida media in vivo incrementada, véase la Patente de los Estados Unidos No. 5,869,046. Los diacuerpos son fragmentos de anticuerpo con dos sitios que se unen al antígeno que pueden ser bivalentes o biespecíficos. Véase, por ejemplo, los documentos EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al,, Nat Med 9, 129-134 (2003) y Hollinger et al., Proc Nati Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Los triacuerpos y tetracuerpos también se describen en Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Los anticuerpos de un solo dominio son fragmentos de anticuerpo que comprenden toda o una porción del dominio variable de la cadena pesada o toda o una porción del dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo. En ciertas modalidades, un anticuerpo de un solo dominio es un anticuerpo de un solo dominio humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; véase por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,248,516 Bl). Los fragmentos de anticuerpo pueden hacerse mediante varias téenicas, incluyendo de manera no exclusiva, la digestión proteolítica de un anticuerpo intacto, así como la producción mediante las células hospederas recombinantes (por ejemplo, E. coli o fago), como se describe en el presente documento.

El término "región variable" o "dominio variable", se refiere al dominio de la cadena pesada o ligera del anticuerpo que está involucrado en la unión del anticuerpo al antígeno. Los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera (VH y VL, respectivamente) de un anticuerpo nativo, generalmente tienen estructuras similares, con cada dominio que comprende cuatro regiones de marco conservadas (FR) y tres regiones hipervariables (HVR). Véase, por ejemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman and Co., página 91 (2007). Un solo dominio VH o VL puede ser suficiente para conferir especificidad de unión al antígeno.

El término "región hipervariable" o "HVR", como se utiliza en el presente documento, se refiere a cada una de las regiones de un dominio variable del anticuerpo, que son hipervariables en secuencia y/o forman espiras definidas estructuralmente ("espiras hipervariables"). Generalmente, los anticuerpos nativos de cuatro cadenas comprenden seis HVR; tres en VH (Hl, H2, H3), y tres en VL (Ll, L2, L3). Las HVR comprenden generalmente residuos de aminoácidos de las espiras hipervariables y/o de las regiones que determinan la complementariedad (CDR), las últimas son de una variabilidad de la secuencia más alta y/o están involucradas en el reconocimiento del antígeno. Con la excepción de la CDR1 en VH, las CDR comprenden generalmente los residuos de aminoácidos que forman las espiras hipervariables. Las regiones hipervariables (HVR) también son referidas como las "regiones que determinan la complementariedad" (CDR), y estos términos se utilizan en aquí de manera indistinta, con referencia a las porciones de la región variable que forman las regiones que se unen al antígeno. Esta región particular se ha descrito por Kabat et al., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico (1983) y por Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987), en donde las definiciones incluyen residuos de aminoácidos que se superponen o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan unos con otros. Sin embargo, la aplicación de cualquier definición para referirse a una CDR de un anticuerpo o variantes del mismo, pretende estar dentro del alcance del término como se define y utiliza en el presente documento. Los residuos de aminoácidos apropiados que abarcan las CDR definidas por cada una de las referencias citadas anteriormente, se exponen a continuación en la Tabla 1 como una comparación. Los números del residuo exacto que abarcan una CDR particular, variarán dependiendo de la secuencia y tamaño de la CDR. Aquellos con experiencia en la téenica pueden determinar de manera rutinaria qué residuos comprenden una CDR particular, dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

TABLA.1. Definiciones de la CDR1 i La numeración de todas las definiciones de la CDR en la Tabla 1 es de acuerdo con las convenciones de numeración expuestas por Kabat et al. (véase a continuación). 2 "AbM" con un superíndice "b" como se utiliza en la Tabla 1, se refiere a las CDR definidas por el programa de modelado del anticuerpo "AbM" de Oxford Molecular.

Kabat et al., también definieron un sistema de numeración para las secuencias de la región variable, que es aplicable a cualquier anticuerpo. Alguien con experiencia ordinaria en la téenica puede asignar de manera no ambigua este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de la región variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la secuencia misma. Como se utiliza en el presente documento, la "numeración de Kabat", se refiere al sistema de numeración expuesto por Kabat et al., Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, "Secuencia de Proteínas de Interés Inmunológico" (1983). A menos que se especifique de otra manera, las referencias a la numeración de las posiciones específicas de los residuos de aminoácidos en una región variable del anticuerpo, son de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Las secuencias polipeptídicas del listado de la secuencia (es decir, SEQ ID NO 1-9), no están numeradas de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Sin embargo, está dentro de la experiencia ordinaria de alguien en la técnica, convertir la numeración de las secuencias del Listado de Secuencias a la numeración de Kabat.

"Marco" o "FR", se refiere a los residuos de un dominio variable diferentes a los residuos de la región hipervariable (HVR). El FR de un dominio variable consiste generalmente de cuatro dominios FR: FR1, FR2, FR3 y FR4. En consecuencia, las secuencias del HVR y el FR generalmente aparecen en la siguiente secuencia en VH (o VL): FRl-Hl(Ll)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

La "clase" de un anticuerpo, se refiere al tipo de dominio constante o región constante poseída por su cadena pesada. Existen cuatro clases principales de anticuerpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varios de estos pueden dividirse además en subclases (isotipos), por ejemplo, igGi, lgG2, lgG3, IgG4, IgAx e IgA2. Los dominios constantes de la cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas, son llamados a, d, e, g y m, respectivamente.

El término "región Fe" en el presente documento, se utiliza para definir una región C terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. El término incluye las regiones Fe de la secuencia nativa y las regiones Fe de la variante. Aunque los límites de la región Fe de una cadena pesada de IgG pueden variar ligeramente, la región Fe de la cadena pesada de IgG humana, se define usualmente como que se extiende de Cys226, o de Pro230, al término carboxilo de la cadena pesada. Sin embargo, la lisina C terminal (Lys447) de la región Fe puede o no estar presente. A menos que se especifique de otra manera en el presente documento, la numeración de los residuos de aminoácidos en la región Fe o la región constante, es de acuerdo con el sistema de numeración EU, también llamado el índice EU, como se describe en Kabat et al., Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico, 5a Ed. Servicios de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, 1991.

Una "región equivalente a la región Fe de una inmunoglobulina", pretende incluir las variantes alélicas naturales de la región Fe de una inmunoglobulina, así como las variantes que tienen alteraciones que producen sustituciones, adiciones o supresiones, pero que no disminuyen sustancialmente la capacidad de la inmunoglobulina para mediar las funciones efectoras (tales como la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo). Por ejemplo, uno o más aminoácidos pueden suprimirse del término N o el término C de la región Fe de una inmunoglobulina, sin una pérdida sustancial de la función biológica. Tales variantes pueden seleccionarse de acuerdo con las reglas generales conocidas en la téenica, para tener un efecto mínimo en la actividad (véase, por ejemplo, Bowie et al., Science 247, 1306-10 (1990)).

Los términos "anticuerpo anti-[antígeno] " y "un anticuerpo que se une a un [antígeno]", se refieren a un anticuerpo que es capaz de unirse al antígeno respectivo con una afinidad suficiente, de manera que el anticuerpo es útil como un agente de diagnóstico y/o terapéutico para seleccionar el antígeno. En una modalidad, el grado de expresión de un anticuerpo anti-[antígeno] con una proteína no relacionada, es menor que aproximadamente 10% de la unión del anticuerpo al antígeno, medida, por ejemplo, mediante un radioinmunoensayo (RIA). En ciertas modalidades, un anticuerpo que se une a un [antígeno] tiene una constante de disociación (KD) de £ 1 mM, £ 100 nM, £ 10 nM, £ 1 nM, £ 0.1 nM, £ 0.01 nM, o £ 0.001 nM (por ejemplo, 108M o menos, por ejemplo, de 108M a 1013M, por ejemplo, de 10~9M a 1013 M).

Como se utiliza en el presente documento, se considera que los términos "manipular mediante ingeniería, manipulado mediante ingeniería, manipulando mediante ingeniería", incluyen cualquier manipulación de una cadena principal del péptido o las modificaciones postraduccionales de un polipéptido natural o recombinante o fragmento del mismo. La manipulación mediante ingeniería incluye modificaciones de la secuencia de aminoácidos, del patrón de glucosilación, o del grupo de la cadena lateral de los aminoácidos individuales, así como combinaciones de estos enfoques. "Manipulado mediante ingeniería", particularmente con el prefijo "gluco", así como el término "manipulación mediante ingeniería de la glucosilación", incluye la manipulación metabólica mediante ingeniería de la maquinaria de la glucosilación de una célula, incluyendo las manipulaciones genéticas de las trayectorias de la síntesis de oligosacáridos para lograr la glucosilación alterada de las glucoproteínas expresadas en las células. Además, la manipulación mediante ingeniería de la glucosilación incluye los efectos de las mutaciones y el medio celular en la glucosilación. En una modalidad, la manipulación mediante ingeniería de la glucosilación es una alteración en la actividad de la glucosiltransferasa. En una modalidad particular, la manipulación mediante ingeniería resulta en una actividad alterada de la glucosaminiltransferasa y/o la actividad de la fucosiltransferasa. La manipulación mediante ingeniería de la glucosilación puede utilizarse para obtener una "célula hospedera que tiene una actividad de GnTIII incrementada" (por ejemplo, una células hospedera que se ha manipulado para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que tienen actividad de la b(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)), una "célula hospedera que tiene actividad de Manll incrementada" (por ejemplo, una célula hospedera que se ha manipulado para expresar niveles incrementados de uno o más polipéptidos que tienen actividad de la a-manosidasa II (Manll)), o una "célula hospedera que tiene una actividad de la a(1,6) fucosiltransferasa disminuida" (por ejemplo, una célula hospedera que se ha manipulado para expresar niveles disminuidos de la a(1,6) fucosiltransferasa). Una célula hospedera es cualquier tipo de sistema celular que puede utilizarse para generar anticuerpos con ADCC mejorada. Las células hospederas incluyen células cultivadas, por ejemplo, células cultivadas de mamífero, tales como células CHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de ratón P3X63, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células de plantas, por nombrar sólo unas cuantas, pero también las células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o planta o tejido animal cultivado.

Las células hospederas que contienen la secuencia codificante de un anticuerpo, útil en el contexto de la invención y/o la secuencia codificante de los polipéptidos que tienen actividad de la glucosiltransferasa, y que expresan los productos génicos biológicamente activos, pueden identificarse, por ejemplo, mediante hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN; la presencia o ausencia de las funciones del gen "marcador"; valorando el nivel de transcripción medido por la expresión de los transcriptos de ARN, respectivos en la célula hospedera; o la detección del producto génico, medida mediante inmunoensayo o su actividad biológica, métodos que son bien conocidos en la téenica. La actividad de GnTIII o Man II, puede detectarse, por ejemplo, empleando una lectina que se une a los productos de la biosíntesis de GnTIII o Manll, respectivamente. Un ejemplo de tal lectina es la lectina E4-PHA que se une de manera preferencial a los oligosacáridos que contienen GlcNAc bisectante. Los productos de la biosíntesis (es decir, las estructuras de oligosacáridos específicos) de los polipéptidos que tienen actividad de GnTIII o Manll, también pueden detectarse mediante análisis espectrométricos de masas de los oligosacáridos liberados de las glucoproteínas producidas por las células que expresan los polipéptidos. De manera alterna, puede utilizarse un ensayo funcional que mide la función efectora incrementada, por ejemplo, ADCC incrementada, mediada por los anticuerpos producidos por las células manipuladas mediante ingeniería con el polipéptido que tiene actividad de GnTIII o Manll.

Como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido que tiene actividad de GnTIII", se refiere a polipéptidos que son capaces de catalizar la adición de un residuo de N-acetilglucosamina (GlcNAc) en el enlace b-1,4 de manósido enlazado a b del núcleo de trimanosilo de los oligosacáridos enlazados a N. Esto incluye los polipéptidos de fusión que exhiben actividad enzimática similar, pero no necesariamente idéntica a una actividad de la b(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III, también conocida como b-l,4-manosil-glucoproteína 4-beta-N-acetilglucosaminil-transferasa (EC 2.4.1.144), de acuerdo con el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB), medida en un ensayo biológico particular, con o sin dependencia de la dosis. En el caso en donde exista dependencia de la dosis, no necesita ser idéntica a aquélla de GnTIII, sino en su lugar, sustancialmente similar a la dependencia de la dosis en una actividad dada, en comparación con GnTIII (es decir, el polipéptido candidato exhibirá mayor actividad o no más que aproximadamente 25 veces menos, y de manera preferida, no más que aproximadamente diez veces menos actividad, y de manera más preferida, no más que aproximadamente tres veces menos actividad con relación a GnTIII) . En ciertas modalidades, el polipéptido que tiene actividad de GnTIII es un polipéptido de fusión que comprende el dominio catalítico de GnTIII y el dominio de localización del aparato de Golgi de un polipéptido residente en el aparato de Golgi, heterólogo. Particularmente, el dominio de localización del aparato de Golgi es el dominio de localización de la manosidasa II o GnTI, más particularmente, el dominio de localización de la manosidasa II. De manera alterna, el dominio de localización del aparato de Golgi se selecciona del grupo que consiste de: el dominio de localización de la manosidasa I, el dominio de localización de GnTII, y el dominio de localización del núcleo al,6 de la fucosiltransferasa. Los métodos para generar tales polipéptidos de fusión y utilizarlos para producir los anticuerpos con funciones efectoras incrementadas, se describen en los documentos W02004/065540, Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. 60/495,142 y Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2004/0241817, el contenido total de las cuales se incorpora de manera expresa en el presente documento como referencia.

Como se utiliza en el presente documento, el término "dominio de localización del aparato de Golgi", se refiere a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido residente en el aparato de Golgi, que es responsable de anclar el polipéptido a una ubicación dentro del complejo de Golgi. Generalmente, los dominios de localización comprenden "colas" aminoterminales de una enzima.

Como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido que tiene actividad de Manll", se refiere a polipéptidos que son capaces de catalizar la hidrólisis de los residuos de a-D-manosa enlazados a 1,3 y 1,6, terminales, en el intermediario de mañosa GlcNAcMan5GlcNAc2 ramificado de los oligosacáridos enlazados a N. Esto incluye polipéptidos que exhiben actividad enzimática similar, pero no necesariamente idéntica a la actividad de la a-manosidasa II del aparato de Golgi, también conocida como el oligosacárido de la manosil 1,3-1,6-a-manosidasa II (EC 3.2.1.114), de acuerdo con el Comité de Nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (NC-IUBMB).

La citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC), es un mecanismo inmune que conduce a la lisis de las células objetivo, recubiertas con el anticuerpo por las células efectoras inmunes. Las células objetivo son células a las cuales los anticuerpos o fragmentos de los mismos que comprenden una región Fe se unen de manera específica, generalmente vía la parte de la proteína que es N terminal a la región Fe. Como se utiliza en el presente documento, el término "ADCC incrementada", se define como un incremento en el número de células objetivo que son lisadas en un tiempo dado, a una concentración dada del anticuerpo en el medio que circunda las células objetivo, mediante el mecanismo de ADCC definido anteriormente, y/o una reducción en la concentración del anticuerpo, en el medio que rodea las células objetivo, requerida para lograr la lisis de un número dado de células objetivo en un tiempo dado, mediante el mecanismo de ADCC. El incremento en la ADCC es relativo a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células hospederas, utilizando los mismos métodos estándar de producción, purificación, formulación y almacenamiento (que son conocidos por aquellos con experiencia en la téenica), pero que no se han manipulado mediante ingeniería. Por ejemplo, el incremento en la ADCC mediada por un anticuerpo producido por las células hospederas manipuladas mediante ingeniería para tener un patrón alterado de la glucosilación (por ejemplo, para expresar la glucosiltransferasa, GnTIII, u otras glucosiltransferasas), mediante los métodos descritos en el presente documento, es relativo a la ADCC mediada por el mismo anticuerpo producido por el mismo tipo de células hospederas no manipuladas mediante ingeniería.

Por "anticuerpo que tiene citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC), incrementada", se quiere decir un anticuerpo que tiene una ADCC incrementada, determinada mediante cualquier método adecuado conocido por aquellos con experiencia ordinaria en la técnica. Un ensayo de la ADCC in vitro aceptado es como sigue : 1) el ensayo utiliza las células objetivo que son conocidas por expresar el antígeno objetivo reconocido por la región que se une al antígeno del anticuerpo; 2) en ensayo utiliza células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), aisladas de sangre de un donador sano, elegido de manera aleatoria, como las células efectoras; 3) el ensayo se lleva a cabo de acuerdo con el siguiente protocolo: i) las PBMC son aisladas utilizando procedimientos estándar de centrifugación en gradiente de densidad y son suspendidas a 5 x 106 células/ml en medio de cultivo celular RPMI; ii) las células objetivo son cultivadas mediante métodos de cultivo de tejido estándar, recolectadas de la fase de crecimiento exponencial con una viabilidad mayor que 90%, lavadas en medio de cultivo celular RPMI, etiquetadas con 100 micro-Curies de 51Cr, lavadas dos veces con el medio de cultivo celular, y resuspendidas en el medio de cultivo celular a una densidad de 105 células/ml; iii) 100 microlitros de la suspensión de células objetivo final anterior, se transfieren a cada pozo de una placa de microtitulación de 96 pozos; iv) el anticuerpo se diluye serialmente de 4000 ng/ml a 0.04 ng/ml en el medio de cultivo celular y 50 microlitros de las soluciones del anticuerpo resultante se agregan a las células objetivo en la placa de microtitulación de 96 pozos, probando por triplicado varias concentraciones del anticuerpo que cubren todo el intervalo de concentración anterior; v) para los controles de liberación máxima (MR), 3 pozos adicionales en la placa que contiene las células objetivo marcadas, reciben 50 microlitros de una solución acuosa al 2% (Volumen/Volumen) de detergente no iónico (Nonidet, Sigma, St. Louis), en lugar de la solución del anticuerpo (punto iv anterior); vi) para los controles de la liberación espontánea (SR), 3 pozos adicionales en la placa que contiene las células objetivo marcadas, reciben 50 microlitros de medio de cultivo celular RPMI en lugar de la solución del anticuerpo (punto iv anterior); vii) la placa de microtitulación de 96 pozos se centrifuga a continuación a 50 x g durante 1 minuto, y se incuba durante 1 hora a 4°C; viii) 50 microlitros de la suspensión de PBMC (punto i anterior), se agregan a cada pozo para proporcionar una relación de efector:célula objetivo de 25:1, y las placas se colocan en una incubadora bajo una atmósfera de CO2 al 5% a 37°C durante 4 horas; ix) el sobrenadante libre de células de cada pozo se recolecta y la radioactividad liberada experimentalmente (ER) se cuantifica utilizando un contador gamma; x) el porcentaje de lisis específica se calcula para cada concentración del anticuerpo de acuerdo con la fórmula (ER-MR)/(MR-SR) x 100, en donde ER es la radioactividad promedio cuantificada (véase el punto ix anterior) para esa concentración del anticuerpo, MR es la radioactividad promedio cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles MR (véase el punto v anterior), y SR es la radioactividad promedio cuantificada (véase el punto ix anterior) para los controles SR (véase el punto vi anterior); 4) La "ADCC incrementada" se define como un incremento en el porcentaje máximo de lisis específica observada dentro del intervalo de concentración del anticuerpo probado anteriormente, y/o una reducción en la concentración del anticuerpo requerida para lograr la mitad del porcentaje máximo de la lisis específica observada con el intervalo de concentración del anticuerpo probado anteriormente. El incremento en la ADCC es relativo a la ADCC, medida con el ensayo anterior, mediada por el anticuerpo mismo, producido por el mismo tipo de células hospederas, utilizando los mismos métodos estándar de producción, purificación, formulación y almacenamiento, que son conocidos por aquellos con experiencia en la téenica, pero que no se han manipulado mediante ingeniería.

Otros ejemplos de ensayos in vitro para valorar la actividad de la ADCC de un anticuerpo, se describen en la Patente de los Estados Unidos No.5,500,362; Hellstrom et al. Proc Nati Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) y Hellstrom et al., Proc Nati Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); la Patente de los Estados Unidos No.5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). De manera alterna, pueden emplearse métodos de ensayos no radioactivos (véase, por ejemplo, ensayo de la citotoxicidad no radioactivo ACTI™ para citometría de flujo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); y ensayo de la citotoxicidad no radioactivo CytoTox 96® (Promega, Madison, WI)). Las células efectoras útiles para tales ensayos, incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y linfocitos citolíticos naturales (NK). De manera alterna o adicional, la actividad de la ADCC del anticuerpo puede valorarse in vivo, por ejemplo, en un modelo animal, tal como aquél descrito en Clynes et al., Proc Nati Acad Sci USA 95, 652-656 (1998). 2. Modalidades Detalladas En un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con un anticuerpo con ADCC mejorada, que comprende determinar el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor del paciente, antes del tratamiento, y comparar el nivel de infiltración de las células CD16+ con un nivel de referencia, en donde un nivel mayor de infiltración de las células CD16+ en comparación con el nivel de referencia, es indicativo para un paciente que derivará un beneficio clínico del tratamiento.

En ciertas modalidades, el método es un método in vitro. En una modalidad tal, el nivel de infiltración de las células CD16+ se determina en una muestra del tumor tomada del paciente antes del tratamiento. En una modalidad, el nivel de referencia es un valor representativo del nivel de infiltración de las células CD16+ en los tumores de una población de pacientes, que no derivan un beneficio clínico del tratamiento. En una modalidad, el nivel de referencia se determina in vitro en muestras del tumor tomadas antes del tratamiento, de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento. En una modalidad, el nivel de infiltración de las células CD16+, que es indicativo para un paciente que derivará un beneficio clínico del tratamiento, es al menos 1.2 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces o al menos 3 veces mayor que el nivel de referencia.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo con ADCC mejorada para utilizarse en el tratamiento del cáncer en un paciente, en donde i) el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor del paciente se determina antes del tratamiento, ii) el nivel de infiltración de las células CD16+ se compara con un nivel de referencia, y iii) el anticuerpo con ADCC mejorada se administra a un paciente que tiene un nivel más alto de infiltración de las células CD16+ en comparación con el nivel de referencia.

En una modalidad, el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor se determina in vitro en una muestra del tumor tomada del paciente antes del tratamiento. En una modalidad, el nivel de referencia es un valor representativo del nivel de infiltración de las células CD16+ en los tumores de una población de pacientes que no derivan beneficio clínico del tratamiento. En una modalidad, el nivel de referencia se determina in vitro en las muestras del tumor tomadas antes del tratamiento de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento. En una modalidad, el anticuerpo con ADCC mejorada se administra a un paciente que tiene al menos 1.2 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces o al menos 3 veces un nivel mayor de infiltración de las células CD16+ en comparación con el nivel de referencia.

La presente invención también proporciona un método para el tratamiento del cáncer en un paciente, en donde i) el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor del paciente se determina antes del tratamiento, ii) el nivel de infiltración de las células CD16+ se compara con un nivel de referencia, y iii) un anticuerpo con ADCC mejorada se administra a un paciente que tiene un nivel de infiltración de las células CD16+ más alto en comparación con el nivel de referencia.

En una modalidad, el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor se determina in vitro en una muestra del tumor tomada del paciente antes del tratamiento. En una modalidad, el nivel de referencia es un valor representativo del nivel de infiltración de las células CD16+ en tumores de una población de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento. En una modalidad, el nivel de referencia se determina in vitro en muestra del tumor tomadas antes del tratamiento de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento. En una modalidad, el anticuerpo con ADCC mejorada se administra a un paciente que tiene al menos 1.2 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces o al menos 3 veces un nivel mayor de infiltración de las células CD16+ en comparación con el nivel de referencia.

Se proporciona además, un método para tratar el cáncer en un paciente, que comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo con ADCC mejorada al paciente, con la condición de que el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor del paciente antes del tratamiento sea mayor que un nivel de referencia.

En una modalidad, el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor es el nivel determinado in vitro en una muestra del tumor tomada del paciente antes del tratamiento. En una modalidad, el nivel de referencia es un valor representativo del nivel de infiltración de las células CD16+ en tumores de una población de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento. En una modalidad, el nivel de referencia se determina in vitro en muestras del tumor tomadas antes del tratamiento, de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento. E? una modalidad, el nivel de infiltración de las células CD16+ es de al menos 1.2 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces o al menos 3 veces mayor en comparación con el nivel de referencia.

En un aspecto, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo con ADCC mejorada para el tratamiento de un paciente con cáncer, que tiene un nivel incrementado de infiltración de las células CD16+ en el tumor antes del tratamiento, con relación a un nivel de referencia.

En una modalidad, el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor se determina in vitro en una muestra del tumor tomada del paciente antes del tratamiento.

En una modalidad, el nivel de referencia es un valor representativo del nivel de infiltración de las células CD16+ en tumores de una población de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento. En una modalidad, el nivel de referencia se determina in vitro en muestras del tumor tomadas antes del tratamiento, de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento. En una modalidad, el paciente tiene al menos 1.2 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces o al menos 3 veces un nivel incrementado de infiltración de las células CD16+ con relación al nivel de referencia.

En un aspecto adicional, la invención se relaciona con un equipo para detectar el nivel de infiltración de las células CD16+ en un tumor, el equipo comprende i) uno o más compuestos para detectar el nivel de infiltración de las células CD16+. En ciertas modalidades, el equipo comprende además ii) instrucciones para utilizar el equipo para predecir la sensibilidad de un paciente con cáncer al tratamiento con un anticuerpo con ADCC mejorada, en donde un nivel mayor de infiltración de las células CD16+ en el tumor del paciente antes del tratamiento, en comparación con un valor de referencia, es indicativo de un paciente que derivará un beneficio clínico del tratamiento.

En ciertas modalidades, el equipo es para uso in vitro. En una de tales modalidades, el nivel de infiltración de las células CD16+ se detecta en una muestra del tumor tomada de un paciente con cáncer antes del tratamiento con un anticuerpo con ADCC mejorada. En una modalidad, el nivel de referencia es un valor representativo del nivel de infiltración de las células CD16+ en tumores de una población de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento. En una modalidad, el nivel de referencia se determina in vitro en muestras del tumor tomadas antes del tratamiento de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento. En una modalidad, el nivel de infiltración de las células CD16+ que es indicativo de un paciente que derivará un beneficio clínico del tratamiento, es al menos 1.2 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces o al menos 3 veces mayor que el nivel de referencia. 3. Anticuerpos con ADCC mejorada Un anticuerpo con ADCC mejorada como se define en el presente documento para los varios aspectos de la presente invención, es un anticuerpo manipulado mediante ingeniería que tiene actividad de la ADCC incrementada, en comparación con un anticuerpo no manipulado mediante ingeniería correspondiente. En las modalidades particulares, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo manipulado mediante glucoingeniería que comprende una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en su región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado mediante glucoingeniería. En una modalidad tal, el anticuerpo se produce en una célula hospedera manipulada mediante ingeniería para tener actividad incrementada de b(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), en comparación con una célula hospedera no manipulada mediante ingeniería. En una modalidad más específica, la célula hospedera se manipula mediante ingeniería además, para tener una actividad incrementada de a-manosidasa II (Manll), en comparación con una célula hospedera no manipulada mediante ingeniería. Una célula hospedera puede manipularse mediante ingeniería para tener una actividad incrementada de b(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII), mediante la sobreexpresión de uno o más polipéptidos que tiene actividad de la b(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII). De igual manera, una célula hospedera puede manipularse mediante ingeniería para tener una actividad incrementada de la a-manosidasa II (Manll), mediante la sobreexpresión de uno o más polipéptidos que tienen actividad de la a-manosidasa II (Manll). Esta metodología de glucoingeniería se ha descrito con mayor detalle en Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342 (Patente de los Estados Unidos No.6,602,684; EP 1071700); WO 2004/065540 (Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No.2004/0241817; EP 1587921), WO 03/011878 (Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0175884), el contenido total de cada una de las cuales se incorpora en el presente documento con referencia en su totalidad.

En una modalidad alternativa, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo manipulado mediante glucoingeniería que comprende una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en su región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado mediante glucoingeniería, en donde el anticuerpo se produce en una célula hospedera que tiene un actividad disminuida de la a (1,6)-fucosiltransferasa. Una célula hospedera que tiene una actividad disminuida de la a(1,6)-fucosiltransferasa, puede ser una célula en la cual el gen de la a (1,6)-fucosiltransferasa se ha alterado o desactivado de otra manera, por ejemplo, anulado (véase, Yamane-Ohnuki et al., Biotech Bioeng 87, 614 (2004); Kanda et al. , Biotechnol Bioeng, 94(4), 680-688 (2006); Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151-160 (2006)).

En una modalidad, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo que tiene al menos aproximadamente 50% de oligosacáridos no fucosilados en su región Fe. En una modalidad, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo que tiene al menos aproximadamente 75% de oligosacáridos no fucosilados en su región Fe. En otra modalidad, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo que tiene al menos aproximadamente 50% de oligosacáridos bisectados en su región Fe. En una modalidad, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo que tiene al menos aproximadamente 50% de oligosacáridos bisectados, no fucosilados en su región Fe. Las estructuras de oligosacáridos en la región Fe del anticuerpo pueden analizarse mediante métodos bien conocidos en la téenica, por ejemplo, mediante espectrometría de masas MALDI TOF, como se describe en Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999) o Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006). El porcentaje de oligosacáridos no fucosilados es la cantidad de oligosacáridos que carecen de residuos de fucosa, con relación a todos los oligosacáridos unidos a Asn 297 (por ejemplo, estructuras de mañosa complejas, híbridas y superiores), e identificados en una muestra tratada con N-glucosidasa F mediante MALDI TOF MS. Asn 297 se refiere al residuo de asparagina localizado aproximadamente en la posición 297 en la región Fe (numeración EU de los residuos de la región Fe); sin embargo, Asn297 también puede localizarse aproximadamente ± 3 aminoácidos corriente arriba o corriente debajo de la posición 297, es decir, entre las posiciones 294 y 300, debido a variaciones menores de la secuencia en los anticuerpos. El porcentaje de oligosacáridos bisectados, o bisectados no fucosilados, se determinada de manera análoga.

En una modalidad, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo de longitud completa de la clase IgG. En una modalidad particular, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo de IgGl. En una modalidad, el anticuerpo con ADCC mejorada comprende una región Fe humana, más particularmente una región Fe de la IgG humana, más particularmente, una región Fe de la IgGl humana. Los anticuerpos con ADCC mejorada pueden comprender una región constante de cadena pesada gamma-1 de Ig humana, como se expone en la SEQ ID NO: 1 (es decir, los anticuerpos son de la subclase de IgGl humana).

En ciertas modalidades, el anticuerpo con ADCC mejorada está dirigido a un antígeno presentado en una célula del tumor. Los antígenos objetivo particulares de los anticuerpos con ADCC mejorada en el contexto de la presente invención, incluyen antígenos expresados en la superficie de las células del tumor, incluyendo, de manera no exclusiva, receptores de la superficie celular tales como el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), receptores del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFR) y receptores del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGFR), antígeno de la membrana específica de la próstata (PSMA), antígeno carcinoembriónico (CEA), dipeptidil peptidasa IV (CD26, DPPIV), proteína de activación del fibroblasto (FAP), HER2/neu, HER-3, E-cadherina, CD20, proteoglucano de sulfato de condroitina asociado con el melanoma (MCSP), c-Met, proteína 1 que contiene el dominio CUB (CDCP1), y antígeno del carcinoma de las células escamosas (SCCA).

En una modalidad, el anticuerpo con ADCC mejorada está dirigido a un antígeno seleccionado del grupo de CD20, EGFR, HER2, HER3, IGF-1R, CEA, c-Met, CDCP1, FAP y MCSP. En una modalidad, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo multiespecífico dirigido a dos o más antígenos seleccionados del grupo de CD20, EGFR, HER2, HER3, IGF-IR, CEA, c-Met, CDCP1, FAP y MCSP.

En una modalidad particular, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo anti-EGFR, más particularmente, un anticuerpo EGFR anti-humano. Los anticuerpos anti-EGFR con ADCC mejorada se describen en los documentos WO 2006/082515 y WO 2008/017963, cada uno de los cuales se incorpora como referencia en el presente documento como referencia en su totalidad.

En una modalidad especifica, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo anti-EGFR de la subclase de la IgGl, humanizado, que comprende a) en el dominio variable de la cadena pesada una CDR1 de la SEQ ID NO: 2, una CDR2 de la SEQ ID NO: 3, y una CDR3 de la SEQ ID NO: 4, y b) en el dominio variable de la cadena ligera, una CDR1 de la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la SEQ ID NO: 6, y una CDR3 de la SEQ ID NO: 7.

En una modalidad aún más específica, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo anti-EGFR de la subclase de la IgGl humanizado, que comprende el dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 8 y el dominio variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 9.

En otra modalidad específica, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo anti-EGFR de la subclase de la IgGl, humanizado, que comprende a) en el dominio variable de la cadena pesada, una CDR1 de la SEQ ID NO: 2, una CDR2 de la SEQ ID NO: 3, y una CDR3 de la SEQ ID NO: 4, y b) en el dominio variable de la cadena ligera, una CDR1 de la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la SEQ ID NO: 6, y una CDR3 de la SEQ ID NO: 7, en donde el anticuerpo está manipulado mediante glucoingeniería para tener una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en su región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado mediante glucoingeniería correspondiente.

En una modalidad más específica, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo anti-EGFR de la subclase de la IgGl, humanizado, que comprende el dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 8, y el dominio variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 9, en donde el anticuerpo está manipulado mediante glucoingeniería para tener una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en su región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado mediante glucoingeniería correspondiente.

En aún otra modalidad específica, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo anti-EGFR de la subclase de la IgGl, humanizado, que comprende a) en el dominio variable de la cadena pesada, una CDR1 de la SEQ ID NO: 2, una CDR2 de la SEQ ID NO: 3, y una CDR3 de la SEQ ID NO: 4, y b) en el dominio variable de la cadena ligera, una CDR1 de la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la SEQ ID NO: 6, y una CDR3 de la SEQ ID NO: 7, y e) en la región Fe, al menos 50% de oligosacáridos no fucosilados.

En una modalidad más específica, el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo anti-EGFR de la subclase de la IgGl, humanizado, que comprende el dominio variable de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 8, el dominio variable de la cadena ligera de la SEQ ID NO: 9, la región constante de la cadena pesada de la SEQ ID NO: 1, y al menos 50% de oligosacáridos no fucosilados en la región Fe.

En [una modalidad, el anticuerpo con ADCC mejorada es <ge-huMabEGFR>. 4. Tipos de cáncer La presente invención es útil en diferentes tipos de cáncer. En las modalidades particulares de acuerdo con la invención, el cáncer es un tumor sólido. En una de tales modalidades, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer renal, cáncer de ovario, cáncer gástrico y cáncer de la piel. En una modalidad, el cáncer es carcinoma de pulmón de las células no pequeñas (NSCLC). En una modalidad más específica, el cáncer es NSCLC no escamoso. En otra modalidad, el cáncer es carcinoma colorrectal (CRC). En aún otra modalidad, el cáncer es carcinoma de las células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC). En una modalidad, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de NSCLC, CRC y HNSCC. 5. Combinaciones de marcadores El biomarcador de la presente invención, es decir, el nivel de infiltración de las células CD16+ antes del tratamiento, puede combinarse con otros biomarcadores para conjuntos de biomarcadores. Los conjuntos de biomarcadores pueden construirse de cualquier combinación de biomarcadores predictivos para hacer predicciones sobre el efecto del tratamiento con el anticuerpo con ADCC mejorada en pacientes con cáncer. Por ejemplo, el nivel de infiltración de las células CD16+ antes del tratamiento, puede combinarse con el nivel de expresión del antígeno objetivo del anticuerpo con ADCC mejorada para un conjunto de biomarcadores. 6. Determinación de los niveles de infiltración de las células CD16+ El nivel de infiltración de las células CD16+ puede valorarse mediante cualquier método conocido en la téenica, adecuado para visualizar las células en tejidos de pacientes, tales como métodos inmunohistoquímicos o inmunofluorescentes, utilizando anticuerpos anti-CD16. En una modalidad particular, el nivel de infiltración de las células CD16+ se determina mediante inmunohistoquímica. Un anticuerpo anti-CD16 adecuado que puede utilizarse para la detección de la célula CD16+ mediante inmunohistoquímica, es la clona 2H7 del anticuerpo anti-CD16.

En una modalidad alternativa, el nivel de infiltración de las células CD16+ se determina mediante citometría de flujo. Los métodos citométricos de flujo (FACS), son bien conocidos en la téenica para la cuantificación de células en muestras de tejido. En particular, permiten determinar el número de células que expresan un antígeno específico (por ejemplo, células CD16+), entre un número total definido de células en una muestra de tejido (por ejemplo, una biopsia de tumor (parte de)).

El nivel de infiltración de las células CD16+ ta bién puede determinarse de manera indirecta, mediante cuantificación de los niveles de la proteína CD16 o el ARNm en los tejidos del paciente. Los métodos adecuados conocidos en la técnica para la determinación de los niveles de la proteína específica, incluyen métodos de inmunoensayo tales como ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA), los métodos para la determinación de los niveles del ARNm incluyen, por ejemplo, RT-PCR cuantitativa y tecnologías de microarreglo.

Todos los métodos y tecnologías mencionados anteriormente son bien conocidos en la téenica, y puede deducirse de los libros de texto estándar, tales como Lottspeich (Bioanalytik, Spektrum Akademisher Verlag, 1998) o Sambrook and Russell (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press, Coid Spring Harbor, NY, E.U.A., 2001). 7. Métodos de tratamiento En el contexto de la presente invención, <ge-huMabEGFR>, se va a administrar solo o además de, o como una coterapia o cotratamiento con uno o más agentes quimioterapéuticos administrados como parte del régimen de quimioterapia estándar conocido en la técnica. Los ejemplos de agentes incluidos en tales regímenes de quimioterapia estándar incluyen 5-fluorouracilo, leucovorina, irinotecano, gemcitabina, erlotinib, capecitabina, taxanos, tales como docetaxel y paclitaxel, interferón alfa, vinorelbina y agentes quimioterapéuticos basados en platino, tales como carboplatino, cisplatino y oxaliplatino.

Los modos de administración comunes incluyen administración parenteral, como una dosis de bolo o como una infusión durante un periodo de tiempo fijo, por ejemplo, administración de la dosis diaria total durante 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 40 minutos, 50 minutos, 60 minutos, 75 minutos, 90 minutos, 105 minutos, 120 minutos, 3 horas, 4 horas, 5 horas o 6 horas. Por ejemplo, 2.5 mg/kg de peso corporal a 25 mg/kg de peso corporal de <ge-huMabEGFR>, pueden administrarse cada semana, cada 2 semanas o cada 3 semanas, dependiendo del tipo de cáncer siendo tratado. Los ejemplos de dosificaciones incluyen 2.5 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal, 7.5 mg/kg de peso corporal, 10 mg/kg de peso corporal, 15 mg/kg de peso corporal, 20 mg/kg de peso corporal y 25 mg/kg de peso corporal, dados cada semana, cada 2 semanas o cada 3 semanas. Los ejemplos adicionales de dosificaciones son 700 mg cada 2 semanas, 1000 mg cada 2 semanas, 1400 mg cada dos semanas, 700 mg cada 3 semanas, 1000 mg cada 3 semanas, y 1400 mg cada 3 semanas.

La persona con experiencia reconocerá que los modos de administración y dosificaciones adicionales de <ge-huMabEGFR>, están abarcados por la invención, como se determina por un paciente y el régimen de quimioterapia específicos, y que el modo de administración y la dosificación terapéutica, específicos, se determinan mejor por el médico tratante de acuerdo con los métodos conocidos en la téenica. 8. Equipo La presente invención también se relaciona con una composición o equipo de diagnóstico que comprende uno o más compuestos para detectar el nivel de infiltración de las células CD16+. Como se detalla en el presente documento, los anticuerpos anti-CD16 pueden utilizarse para detectar la proteína CD16, y por lo tanto, pueden estar comprendidos en un equipo de acuerdo con la invención. Tales anticuerpos pueden estar marcados (por ejemplo, con una marca fluorescente, una radiomarca, una marca enzimática o un complejo de biotina/avidina), para permitir su detección directa, o pueden utilizarse en combinación con anticuerpos secundarios marcados (es decir, anticuerpos que se unen de manera específica a otros anticuerpos específicos, tales como anticuerpos de una especie de hospedero particular). Los anticuerpos secundarios apropiados pueden así, también estar comprendidos en el equipo. Los componentes adicionales pueden ser reactivos para llevar a cabo la detección, por ejemplo, amortiguadores, fijadores, reactivos de bloqueo, diluyentes, cromógenos, enzimas, etc., para la inmunohistoquímica, inmunofluorescencia, ELISA, Transferencia Western o cualquiera que sea el método de detección de elección. De manera alterna, si el ARNm de CD16 se va a detectar, el equipo puede comprender oligonucleótidos tales como cebadores y sondas fluorescentes para la PCR en tiempo real, enzimas para la preparación del ADNc, tales como transcriptasa inversa y lo similar.

En un aspecto adicional de la invención, el equipo de la invención puede utilizarse de manera ventajosa para llevar a cabo un método de la invención y podría, nter alia, emplearse en una variedad de aplicaciones, por ejemplo, el campo de diagnóstico o como una herramienta de investigación. Las partes del equipo de la invención pueden empacarse de manera individual en viales o en combinación en recipientes o unidades con múltiples recipientes. La fabricación del equipo sigue de manera preferida, los procedimientos estándar, que son conocidos por la persona con experiencia en la téenica. El equipo o las composiciones de diagnóstico pueden utilizarse para la detección del nivel de infiltración de las células CD16+ en tumores, de acuerdo con los métodos de la invención descritos aquí, empleando, por ejemplo, técnicas inmunohistoquímicas descritas en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIGURA 1. La Figura 1 muestra la correlación entre el por ciento de cambio de la suma del diámetro más largo (SLD) en la línea basal a la primera valoración del tumor postlínea basal a las 8 semanas y la tinción en la línea basal en nuevas biopsias del tumor obtenidas en la línea basal para las células CD16+.

FIGURA 2. La Figura 2 muestra la correlación entre el por ciento de cambio de la suma del diámetro más largo (SLD) en la línea basal a la segunda valoración del tumor postlínea basal a las 12 semanas y la tinción en la línea basal en biopsias del tumor obtenidas en la línea basal para las células CD16+ FIGURA 3. La Figura 3 muestra la correlación entre la reducción de SUVmax en la línea basal a la valoración del tumor postlínea basal a las 2 semanas y la tinción en la línea basal en nuevas biopsias de tumor obtenidas en la línea basal para las células CD16+.

Ejemplos La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos ilustrativos no limitantes.

Ejemplo 1: Carcinoma colorrectal (CRC) Diseño del estudio Esta fue la segunda parte de un estudio al descubierto, en múltiples centros, no aleatorizado, de escalamiento de la dosis, de fase I de <ge-huMabEGFR> en pacientes con tumores sólidos. En esta parte del estudio, 25 pacientes con carcinoma colorrectal (CRC) con la mutación KRAS, se trataron basándose en el perfil de seguridad y la eficacia demostrada en la primera parte del estudio (Paz Ares et al. (2011), J Clin Oncol 29, 3783-90), con una dosis simple de 1400 mg de <ge-huMabEGFR>, administrados de manera intravenosa (i.v.) en los días 1 y 8, seguido por una dosificación cada 2 semanas (q2W).

Selección del paciente Los pacientes elegibles eran de >18 años de edad con un estado de desempeño del Grupo Oncológico Cooperativo del Este de <1 y hematología, química sanguínea, función renal y hepática adecuadas. Los pacientes tenían CRC con mutación KRAS y positivo a EGFR, metastásico, confirmado de manera histológica/citológica (codones 12/13/61), con una enfermedad progresiva (PD) mensurable radiológicamente. Los pacientes con más de dos regímenes citotóxicos previos para la enfermedad metastásica se excluyeron. Todos los pacientes proporcionaron un consentimiento informado por escrito y se obtuvo la aprobación de los Comités de Ética locales. El estudio se realizó de acuerdo con los lineamientos de las Buenas Prácticas de Laboratorio.

Administración del fármaco La primera dosis de <ge-huMabEGFR>, se administró a una velocidad de infusión inicial de 10 mg/hora. Después de una hora, las velocidades de la infusión se aumentaron cada 30 minutos hasta 800 mg/hora. Las infusiones subsiguientes empezaron a 20 mg/hora si la primera infusión se toleró bien. Se proporcionó premedicación con paracetamol, antihistamina y corticosteroides para las primeras dos infusiones, para reducir al mínimo el riesgo de reacciones relacionadas con la infusión (IRR).

Biopsias del tumor Las biopsias opcionales del tumor para la inmunohistoquímica (HistoGeneX), se tomaron pretratamiento en la línea basal. Once pacientes reclutados en el programa del biomarcador opcional, proporcionaron una biopsia del tumor antes (generalmente no más de dos semanas) de la primera infusión de <ge-huMabEGFR>. Las biopsias se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina, y se analizaron para los infiltrados de las células efectoras inmunes mediante inmunohistoquímica (IHC). Las células efectoras inmunes que se infiltran en el tumor se graduaron contando el número de células con tinción positiva/mm2.

Análisis in unohistoquímico La IHC se realizó en un sistema Ventana Benchmark XT. Los portaobjetos sin parafina se incubaron durante 1 hora con la clona 2H7 del anticuerpo anti-CD16 (Biogenex) diluido a 1:10 en diluyente del anticuerpo (Ventana #251-018). Se utilizó el equipo de detección ultra view™ Universal DAB (Ventana) para la detección, seguido por 4 minutos de incubación con hematoxilina II (Ventana #790-2208) y 4 minutos de blanqueamiento posteriores a la contratinción (Ventana #760-2037). Se utilizó una IgG de ratón con el isotipo coincidente (Ventana #760-2014) para los controles negativos.

Cuantificación de los infiltrados de las celulas inmunes en los tumores Las células CD16+ se contaron en los campos de visión bajo un microscopio óptico que tiene una rejilla (5x5 campos) en el ocular. Las células se contaron en hasta 25 campos seleccionados de manera aleatoria a una amplificación de 400x y se calculó la densidad de las células, es decir, el número de células por mm2 de área de tejido. Las células se contaron en el tumor central, así como en el tejido en proximidad cercana a las células del tumor.

Valoración de la respuesta del tumor La valoración del tumor se realizó mediante exploración con CT o MRI en la selección, y cada 8 semanas empezando en el ciclo 4 de acuerdo con el criterio RECIST modificado (Criterio de Evaluación de la Respuesta en Tumores Sólidos) vi.0.

Consideraciones estadísticas La correlación del por ciento de cambio de la suma del diámetro más largo (SLD) en la línea basal a la primera valoración del tumor postlínea basal a las 8 semanas y la tinción de las células CD16+ en las biopsias del tumor obtenidas en la línea basal, se evaluó con el coeficiente de correlación de rangos de Spearman.

Resultados El análisis correlativo de los biomarcadores en la línea basal con la respuesta del tumor a las 8 semanas (4 ciclos), mostró que un número incrementado de células que se infiltran en el tumor con tinción positiva para CD16, fue proporcional a un incremento menor en el tamaño del tumor (r2=-0.58, p=0.088, n=l0; véase la Figura 1).

Ejemplo 2: Cáncer de pulmón de las células no pequeñas (NSCLC) Diseño del estudio Este fue un estudio en múltiples centros, al descubierto, de fase Ib, de <ge-huMabEGFR>, en combinación con cisplatino y gemcitabina/pemetrexed en pacientes con cáncer de pulmón de las células no pequeñas (NSCLC) positivo a EGFR avanzado o recurrente.

Los pacientes se agruparon en dos grupos de acuerdo con la histología de sus tumores (escamosos o no escamosos), que se evaluaron de manera separada. Hasta ahora, el estudio se ha terminado para el grupo de la histología no escamosa que se reporta aquí.

Los pacientes en este grupo (un total de 14 pacientes), se trataron con <ge-hu abEGFR> en combinación con cisplatino y pemetrexed, de acuerdo con el siguiente regimen de dosificación: Cohorte 1: • Para un máximo de 6 ciclos de quimioterapia (18 semanas): Cisplatino 75 mg/m2 i.v. en el día 1 q3 (cada tres semanas) y pemetrexed 500 mg/m2 i.v. en el día 1 q3W durante un máximo de 6 ciclos. <ge-huMabEGFR> 1000 mg i.v. (día 1, 8), seguido por 1000 mg q2W (cada dos semanas) i.v.

· Seguido por: <ge-huMabEGFR> 1400 mg q2W i.v. hasta la progresión de la enfermedad, toxicidad inaceptable o retiro del consentimiento.

Cohorte 2: • Para un máximo de 6 ciclos de quimioterapia (18 semanas): Cisplatino 75 mg/m2 i.v. en el día 1 q3W y pemetrexed 500 mg/m2 i.v. en el día 1 q3W durante un máximo de 6 ciclos. <ge-huMabEGFR> 1400 mg i.v. (día 1, 8) seguido por 1400 mg q2W i.v.

• Seguido por: <ge-huMabEGFR> 1400 mg q2W i.v. hasta la progresión de la enfermedad, toxicidad inaceptable o retiro del consentimiento.

Selección del paciente Los pacientes elegibles tenían >18 años de edad con un estado de desempeño del Grupo Oncológico Cooperativo del Este de <1 y hematología, química sanguínea, función renal y hepática adecuadas. Los pacientes tenían NSCLC inoperable documentado histológicamente, avanzado localmente (etapa Illb), metastásico (etapa IV) o recurrente. Los pacientes con quimioterapia o tratamiento previo con otro agente anticancerígeno sistémico se excluyeron. Todos los pacientes proporcionaron un consentimiento informado por escrito y se obtuvo la aprobación de los Comités de Ética locales. El estudio se realizó de acuerdo con los lineamientos de las Buenas Prácticas Clínicas.

Administración del fármaco La velocidad de infusión para <ge-huMabEGFR>, fue 10 mg/hora para la primera hora. Posteriormente, si se tolera por el paciente, la velocidad de infusión se aumentó a intervalos de 30 minutos hasta un máximo de 400 mg/hora. Si la primera infusión se toleró bien (es decir, no se observaron reacciones serias relacionadas con la infusión), la segunda infusión empezó a 20 mg/hora durante 30 minutos, seguido por el aumento de la velocidad de la infusión a intervalos de 30 minutos hasta 800 mg/hora. Las infusiones subsiguientes empezaron a una velocidad de la infusión de 50 mg/hora, seguido por el aumento a intervalos de 15 minutos hasta 800 mg/hora, con la condición de que la infusión previa fuera bien tolerada por el paciente. De otra manera, se aplicó el mismo programa de infusión que para la primera infusión.

El cisplatino y el pemetrexed se administraron de acuerdo con la información para prescribir local. En general, el pemetrexed debe administrarse a 500 mg/m2 i.v. durante 10 minutos, seguido por un descanso de 30 minutos antes de la administración del cisplatino, y el cisplatino debe administrarse a 75 mg/m2 i.v. durante 2 horas.

Se proporcionó como premedicación vitamina B12 y ácido fólico de acuerdo con la información para prescribir local para la administración del pemetrexed (día -7 a día -1). Se administró como premedicación paracetamol, antihistamina y corticosteroides para la primera (día -1 a día 2) y segunda infusión de <ge-huMabEGFR> (en el día de la segunda infusión).

Biopsias del tumor Se recolectaron los especímenes del tumor archivados para el diagnostico o biopsias de tumor frescas tomadas en el transcurso de 21 días antes de la primera administración de cualquier fármaco del estudio. Las biopsias se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina, y se analizaron para los infiltrados de las células efectoras inmunes mediante inmunohistoquímica (IHC). Las células efectoras inmunes que se infiltran al tumor se graduaron contando el número de células con tinción positiva/mm2. El análisis inmunohistoquímico y la cuantificación de los infiltrados de las células inmunes se realizó como se describió anteriormente (véase el Ejemplo 1).

Valoración de la respuesta del tumor La valoración del tumor en la línea basal se hizo en el transcurso de 21 días antes de la primera administración de cualquier fármaco del estudio mediante una exploración con CT pectoral-abdominal (o MRI). Las valoraciones postlínea basal se realizaron cada seis semanas después de la línea basal, es decir, en el ciclo 3 día 1, ciclo 5 día 1, etc., hasta la progresión o retiro del consentimiento.

La respuesta del tumor se evaluó de acuerdo con RECIST (Criterio de Valoración de la Respuesta en Tumores Sólidos) versión 1.1 (Eisenhauer et al. (2009), Eur J Cáncer 45, 228-247).

Consideraciones estadísticas La correlación del por ciento de cambio de la suma del diámetro más largo (SLD) en la línea basal a la segunda valoración del tumor postlínea basal a las 12 semanas y la tinción de las células CD16+ en las biopsias del tumor obtenidas en la línea basal, se evaluó con el coeficiente de correlación de rangos de Spearman.

Resultados El análisis correlativo de los biomarcadores en la línea basal con la respuesta del tumor a las 12 semanas, mostró que un número incrementado de células que se infiltran en el tumor con tinción positiva para CD16, fue proporcional a una mayor disminución en el tamaño del tumor (r2=-0.52, p=0.10, n=ll; véase la Figura 2).

Ejemplo 3: Carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) Diseño de estudio Este fue un estudio exploratorio, al descubierto, en múltiples centros, para investigar la farmacodinámica de <ge-huMabEGFR>, en comparación con cetuximab, en pacientes no tratados previamente con carcinoma de las células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC) operable.

Los tratamientos para este estudio se realizaron durante el periodo de espera del paciente antes de la cirugía (entorno neoadyuvante). Los pacientes se trataron con 700 mg de <ge-huMabEGFR> en los días 1 y 8, o con 400 mg de cetuximab por m2 de área de superficie corporal en el día 1 y 250 mg/m2 de cetuximab en el día 8, seguido por el retiro quirúrgico de los tumores 7 días después de la última infusión.

Selección del paciente Los pacientes elegibles tenían >18 años de edad con un estado del desempeño del Grupo Oncológico Cooperativo del Este de <2 y hematología, química sanguínea, función renal y hepática adecuadas. Los pacientes tenían carcinoma de las células escamosas confirmado histológicamente de la cavidad oral, orofaringe, hipofaringe o laringe. Los tumores tenían que considerarse resecables con una escisión quirúrgica planeada, y los pacientes tenían que estar sin exposición previa a quimio y radioterapia. Todos los pacientes proporcionaron un consentimiento informado por escrito y se obtuvo la aprobación de los Comités de Ética locales. El estudio se realizó de acuerdo con los lineamientos de las Buenas Prácticas Clínicas.

Administración del fármaco La velocidad de la infusión para <ge-huMabEGFR> fue 10 mg/h para la primera hora. Posteriormente, si se tolera por el paciente, la velocidad de la infusión se aumentó a intervalos de 30 minutos hasta un máximo de 300 mg/hora. Si la primera infusión fue bien tolerada (es decir, no se observaron reacciones serias relacionadas con la infusión), las infusiones subsiguientes empezaron a 20 mg/hora durante 30 minutos, seguido por aumento de la velocidad de la infusión en intervalos de 30 minutos hasta 300 mg/hora. De otra manera, se aplicó el mismo programa de infusión que para la primera infusión.

El cetuximab se administró de acuerdo con la información para prescribir local. El periodo de infusión recomendado fue de 120 minutos para la primera dosis, y 60 minutos para la segunda dosis. La velocidad de infusión máxima fue de 10 mg/minuto.

Para las infusiones de <ge-huMabEGFR>, se proporcionó premedicación con paracetamol, antihistamina y corticosteroides, para las infusiones de cetuximab, se proporcionó premedicación con antihistamina y corticosteroides, de acuerdo con la información para prescribir local.

Biopsias del tumor Las biopsias del tumor (3-5 mm), se tomaron en el transcurso de 21 días antes de la primera dosificación, después de la primera exploración con FDG-PET/CT. Las biopsias se fijaron en formalina y se incluyeron en parafina, y se analizaron para los infiltrados de las células efectoras inmunes mediante inmunohistoquímica (IHC). Las células efectoras inmunes que se infiltran al tumor se graduaron contando el número de células con tinción positiva/mm2. El análisis inmunohistoquímico y la cuantificación de los infiltrados de las células inmunes se realizó como se describió anteriormente (véase el Ejemplo 1).

Valoración de la respuesta del tumor Los tumores se valoraron mediante formación de imágenes radiológicas (exploraciones con 2-18F-fluoro-2-desoxi-D-glucosa(FDG)-PET/CT) antes de cualquier intervención (incluyendo la biopsia del tumor) en los días -21 a -1, así como antes de la cirugía (no más que 3 días antes de la cirugía).

Exploraciones con FDG-PET Los pacientes tenían que ayunar durante al menos 4-6 horas antes de la exploración con FDG-PET. El nivel de glucosa en sangre se verificó (típicamente en el centro de la PET) en el día de la exploración con FDG-PET, y los resultados se valoraron antes de la administración de FDG. El paciente debe tener un nivel de glucosa en sangre < 180 mg/dL (< 10 mmoles/mL), con el fin de tener la exploración con FDG-PET. El intervalo entre la administración de FDG y la exploración fue de 60 minutos ± 10 minutos, y se tuvo cuidado de mantener el intervalo de tiempo entre la inyección y el inicio de la exploración igual en el seguimiento, en comparación con la línea basal.

Adquisición de la Exploración Se realizaron las exploraciones con FDG-PET corregidas con atenuación (de la base del cráneo a la mitad del muslo). Se le administraron al paciente 370-740 MBq (10-20 mCi) de FDG de manera intravenosa (la actividad inyectada fue dependiente de la práctica local y del tipo de explorador) (Shankar et al. (2006), J Nucí Med 47, 1059-66).

La actividad administrada y el tiempo de la administración de la FDG y el peso corporal en el día de la exploración, se registraron para el cálculo subsiguiente del valor de captación estandarizado máximo del tumor (SUVmax). Aproximadamente una hora después de la administración de FDG, se realizó una exploración con PET del cuerpo completo (base del cráneo a los muslos) y/o una vista separada de la cabeza y el cuello. Las exploraciones inicial y de seguimiento se hicieron el mismo día, tomando cuidado particular de mantener el intervalo entre la administración de la FDG y la exploración tan consistente como sea posible.

Cada vez que fuera posible, se utilizó el explorador con PET/CT (en oposición a un explorador para PET dedicado), para permitir la corrección de la exploración de emisión mediante una exploración de transmisión CT de dosis baja.

Interpretación de la Exploración Las exploraciones con PET/CT se analizaron visualmente y se interpretaron y compararon cualitativamente por un lector experimentado. Un paciente tenía que tener al menos dos exploraciones PET para la valoración de la respuesta FDG-PET exploratoria. La captación del tumor se analizó de manera semicuantitativa mediante SUVmax de acuerdo con la siguiente ecuación: SUVraax = [concentración máxima del radiotrazador en el tumor (kBq/mL; pCi/mL) x peso corporal (kg)] / dosis inyectada (MBq; mCi) Se valoró el cambio en SUVmax. Se empleó el criterio de respuesta de la Organización Europea para la Investigación y el Tratamiento del Cáncer (EORTC) para la evaluación de la respuesta del tumor (Young et al. (1999), Eur J Cáncer 35, 1773-82).

Consideraciones estadísticas La correlación del por ciento de cambio del SUV en la línea basal a la valoración del tumor postlínea a las 2 semanas y la tinción de las células CD16+ en las biopsias del tumor obtenidas en la línea basal, se evaluó con el coeficiente de correlación de rangos de Spearman.

Resultados El análisis correlativo de los biomarcadores de la línea basal con la respuesta del tumor a las 2 semanas, mostró que un número incrementado de células que se infiltran en el tumor con tinción positiva para CD16, fue proporcional a una reducción mayor en SUVmax en el grupo de pacientes tratados con <ge-huMabEGFR> (r2=-0.57, p=0.04, n=13; véase la Figura 3). No se observó correlación en el grupo de pacientes tratados con cetuximab (Figura 3).

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para predecir la respuesta de un paciente con cáncer al tratamiento con un anticuerpo con ADCC mejorada, que comprende determinar el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor del paciente, antes del tratamiento, y comparar el nivel de infiltración de las células CD16+ con un nivel de referencia, en donde un nivel más alto de infiltración de las células CD16+ en comparación con el nivel de referencia, es indicativo de un paciente que derivará un beneficio clínico del tratamiento.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el método es un método in vitro, y el nivel de infiltración de las células CD16+ se determina en una muestra del tumor tomada del paciente antes del tratamiento.

3. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el nivel de referencia es un valor representativo del nivel de infiltración de las células CD16+ en tumores de una población de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento.

4. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde el nivel de referencia se determina in vitro en muestras del tumor tomadas antes del tratamiento, de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el nivel de infiltración de las células CD16+ que es indicativo de un paciente que derivará un beneficio clínico del tratamiento, es al menos 1.2 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces o al menos 3 veces mayor que el nivel de referencia.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de carcinoma colorrectal, cáncer de pulmón de las células no pequeñas y carcinoma de las células escamosas de cabeza y cuello.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo manipulado mediante glucoingeniería que comprende una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en su región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado mediante glucoingeniería correspondiente.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo anti-EGFR de la subclase de IgGl, humanizado, que comprende a) en el dominio variable de la cadena pesada, una CDR1 de la SEQ ID NO: 2, una CDR2 de la SEQ ID NO: 3, y una CDR3 de la SEQ ID NO: 4, y b) en el dominio variable de la cadena ligera, una CDR1 de la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la SEQ ID NO: 6, y una CDR3 de la SEQ ID NO: 7.

9. Un equipo para detectar el nivel de infiltración de las células CD16+ en un tumor, el equipo comprende i) uno o más compuestos para detectar el nivel de infiltración de las células CD16+, y ii) instrucciones para utilizar el equipo en el método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 8.

10. El equipo de conformidad con la reivindicación 9, en donde el equipo es para el uso in vitro y el nivel de infiltración de las células CD16+ se detecta en una muestra del tumor tomada de un paciente con cáncer, antes del tratamiento con un anticuerpo con ADCC mejorada.

11. Un anticuerpo con ADCC mejorada para utilizarse en el tratamiento del cáncer en un paciente, en donde i) el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor del paciente se determina antes del tratamiento, ii) el nivel de infiltración de las células CD16+ se compara con un nivel de referencia, y iii) el anticuerpo con ADCC mejorada se administra a un paciente que tiene un nivel más alto de infiltración de las células CD16+ en comparación con el nivel de referencia.

12. El anticuerpo con ADCC mejorada de conformidad con la reivindicación 11, en donde el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor se determina in vitro, en una muestra del tumor tomada del paciente antes del tratamiento.

13. El anticuerpo con ADCC mejorada de conformidad con las reivindicaciones 11 ó 12, en donde el nivel de referencia es un valor representativo del nivel de infiltración de las células CD16+ en los tumores de una población de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento.

14. El anticuerpo con ADCC mejorada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde el nivel de referencia se determina ín vítro, en muestras del tumor tomadas antes del tratamiento de pacientes que no derivan un beneficio clínico del tratamiento.

15. El anticuerpo con ADCC mejorada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, en donde el anticuerpo con ADCC mejorada se administra a un paciente que tiene al menos 1.2 veces, al menos 1.5 veces, al menos 2 veces o al menos 3 veces un nivel mayor de infiltración de las células CD16+ en comparación con el nivel de referencia.

16. El anticuerpo con ADCC mejorada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de carcinoma colorrectal, cáncer de pulmón de las células no pequeñas y carcinoma de las células escamosas de cabeza y cuello.

17. El anticuerpo con ADCC mejorada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16, en donde el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo manipulado mediante glucoingeniería que comprende una proporción incrementada de oligosacáridos no fucosilados en su región Fe, en comparación con un anticuerpo no manipulado mediante glucoingeniería correspondiente.

18. El anticuerpo con ADCC mejorada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 17, en donde el anticuerpo con ADCC mejorada es un anticuerpo anti-EGFR de la subclase de la IgGl, humanizado, que comprende a) en el dominio variable de la cadena pesada, una CDR1 de la SEQ ID NO: 2, una CDR2 de la SEQ ID NO: 3, y una CDR3 de la SEQ ID NO: 4, y b) en el dominio variable de la cadena ligera, una CDR1 de la SEQ ID NO: 5, una CDR2 de la SEQ ID NO: 6, y una CDR3 de la SEQ ID NO: 7.

19. Un método para el tratamiento del cáncer en un paciente, en donde i) el nivel de infiltración de las células CD16+ en el tumor del paciente, se determina antes del tratamiento, ii) el nivel de infiltración de las células CD16+ se compara con un nivel de referencia, y iii) un anticuerpo con ADCC mejorada se administra a un paciente que tiene un nivel de infiltración de las células CD16+ más alto en comparación con el nivel de referencia.

20. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo con ADCC mejorada para el tratamiento de un paciente con cáncer, que tiene un nivel incrementado de infiltración de las células CD16+ en el tumor antes del tratamiento, con relación a un nivel de referencia.

21. La invención como se describe en el presente documento.