CN104136042B

CN104136042B - 使用抗假单胞菌Psl和PcrV结合分子的联合治疗

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Publication number: CN104136042B
Application number: CN201280054651.8A
Authority: CN
Inventors: A·迪吉安多门尼克; P·沃伦纳; C·斯托弗; B·塞尔曼; R·敏特尔; S·吉拉德; S·拉斯特; M·托米奇; V·范卡彻曼; R·瓦尔肯; 彭莉; M·达姆思克洛德; P·乔杜里; N·迪马斯; R·弗莱明; B·贝萨贝; 高长寿; G·莱尼; 高翠华
Original assignee: MedImmune Vaccines Inc
Current assignee: MedImmune Vaccines Inc
Priority date: 2011-11-07
Filing date: 2012-11-06
Publication date: 2017-08-18
Anticipated expiration: 2032-11-06
Also published as: US20220177554A1; KR102184343B1; US11203633B2; NZ722379A; HUE050985T2; HRP20201370T1; US10597439B2; JP2015504421A; PT2776065T; AU2017219081A1; HK1201453A1; PL2776065T3; ES2859323T3; RU2014122990A; US20150023966A1; AU2019226205A1; US20200317757A1; WO2013070615A1; KR20140091736A; CA2854817C

Abstract

本披露涉及包括抗假单胞菌Psl和PcrV结合分子以及相关的组合物的联合治疗，用于预防和治疗假单胞菌感染。

Description

使用抗假单胞菌Psl和PcrV结合分子的联合治疗

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背景

披露领域

本披露涉及使用抗假单胞菌Psl和PcrV结合域的联合治疗，用于预防和治疗假单胞菌感染。此外，本披露提供了在这类治疗中有用的组合物。

披露背景

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa)是导致受损个体的急性和慢性感染两者的革兰氏阴性机会病原体(马(Ma)等人，《细菌学杂志》(Journal ofBacteriology)189(22)：8353-8356(2007))。这部分是由于细菌对于临床使用的抗生素的高先天抗性，并且部分是由于高度抗生素抗性生物膜的形成(德伦柯克(Drenkard)E，《微生物与感染》(Microbes Infect)5：1213-1219(2003)；汉柯克(Hancokc)&斯伯特(Speert)，《耐药性新资讯》(Drug Resist Update)3：247-255(2000))。

铜绿假单胞菌是西方世界中的医院获得性感染的常见病因。它是烧伤受害者和免疫受损个体的菌血症的常见致病因子(莱克扎克(Lyczak)等人，《微生物与感染》(Microbes Infect)2：1051-1060(2000))。它还是医院性革兰氏阴性肺炎尤其是在机械通气患者中的最常见病因(克莱汶(Craven)等人，《呼吸道感染研讨会》(Semin RespirInfect)11：32-53(1996))，并且是患有囊性纤维化的个体的肺中的最普遍病原体(皮埃尔(Pier)等人，《美国微生物学新闻杂志》(ASM News)6：339-347(1998))。

假单胞菌Psl外泌多糖据报告可锚定于铜绿假单胞菌的表面、并且被认为在促进定殖于宿主组织和建立/维持生物膜形成方面是重要的(杰克逊(Jackson)K.D.等人，《细菌学杂志》(J Bacteriol)186，4466-4475(2004))。它的结构包括富含甘露糖的重复五糖(伯德(Byrd)M.S.等人，《分子微生物学杂志》(Mol Microbiol)73，622-638(2009))。

PcrV是III型分泌***的一种相对保守的成分。PcrV显示是一种介导将III型分泌毒素递送进入靶真核细胞的III型分泌***的易位装置的主要成分(萨瓦(Sawa)T.等人，自然-医学(Nat.Med.)5，392-398(1999))。抗PcrV的主动和被动免疫可改善细胞毒性的铜绿假单胞菌感染的小鼠的肺部损伤和死亡率(萨瓦(Sawa)等人，2009)。抗PcrV免疫的主要作用是阻断III型分泌毒素易位进入真核细胞。

由于多药耐药性不断增加，在本领域中仍然需要开发用于鉴别新的假单胞菌特异性预防和治疗剂的新颖策略。

简要概述

本披露提供了一种与假单胞菌PcrV特异性地结合的结合分子或其抗原结合片段，包括：(a)包含SYAMN(SEQ ID NO：218)的重链CDR1，或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的该重链CDR1的变体；包含AITISGITAYYTDSVKG(SEQ ID NO：219)的重链CDR2，或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的该重链CDR2的变体；以及包含EEFLPGTHYYYGMDV(SEQ ID NO：220)的重链CDR3，或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的该重链CDR3的变体(；b)含有RASQGIRNDLG(SEQ ID NO：221)的轻链CDR1，或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的该轻链CDR1的变体；包含SASTLQS(SEQ ID NO：222)的轻链CDR2，或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的该轻链CDR2的变体；以及含有LQDYNYPWT(SEQ ID NO：223)的轻链CDR3，或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的该轻链CDR3的变体；或(a)与(b)的组合。在一个实施例中，该结合分子或其抗原结合片段与假单胞菌PcrV特异性地结合，并且包含：(a)包含SYAMN(SEQ ID NO：218)的重链CDR1、包含AITISGITAYYTDSVKG(SEQ ID NO：219)的重链CDR2、以及包含EEFLPGTHYYYGMDV(SEQ ID NO：220)的重链CDR3；以及(b)包含RASQGIRNDLG(SEQ ID NO：221)的轻链CDR1、包含SASTLQS(SEQ ID NO：222)的轻链CDR2、以及包含LQDYNYPWT(SEQ ID NO：223)的轻链CDR3。在一个实施例中，该分离的结合分子或其抗原结合片段与假单胞菌PcrV特异性地结合，并且包含(a)与SEQ ID NO：216具有至少90％的序列一致性的重链可变区；(b)与SEQ IDNO：217具有至少90％的序列一致性的轻链可变区；或(a)与(b)的组合。在另一个实施例中，该结合分子或其片段包含：(a)与SEQ ID NO：216具有至少95％的序列一致性的重链可变区；(b)与SEQ ID NO：217具有至少95％的序列一致性的轻链可变区；或(a)与(b)的组合。在另一个实施例中，该结合分子或其片段是V2L2，并且包含：(a)包含SEQ ID NO：216的重链可变区；以及(b)包含SEQ ID NO：217的轻链可变区。

在一个实施例中，本披露提供了一种如包含了V2L2的VH和VL区的抗体或其抗原结合片段一样与同一种假单胞菌PcrV表位特异性地结合的分离的结合分子或其抗原结合片段。在另一个实施例中，本披露提供了一种分离的结合分子或其抗原结合片段，它可与假单胞菌PcrV特异性地结合，并且竞争性地抑制假单胞菌PcrV与包含V2L2的VH和VL的抗体或其抗原结合片段的结合。在一个实施例中，该结合分子或其片段是一种重组抗体。在一个实施例中，该结合分子或其片段是一种单克隆抗体。在一个实施例中，该结合分子或其片段是一种嵌合抗体。在一个实施例中，该结合分子或其片段是一种人源化抗体。在一个实施例中，该结合分子或其片段是一种人类抗体。在一个实施例中，该结合分子或其片段是一种双特异性抗体。

在一个实施例中，该结合分子及其片段抑制III型分泌毒素递送进入靶细胞。

在一个实施例中，本披露提供了一种双特异性抗体，该双特异性抗体包含一个与假单胞菌Psl结合的结合域以及一个与假单胞菌PcrV结合的结合域。在一个实施例中，该Psl结合域包含一个scFv片段，并且该PcrV结合域包含一个完整的免疫球蛋白。在一个实施例中，该Psl结合域包含一个完整的免疫球蛋白，并且所述PcrV结合域包含一个scFv片段。在一个实施例中，该scFv与该完整的免疫球蛋白的VH区的氨基末端是相融合的。在一个实施例中，该scFv与该完整的免疫球蛋白的CH3区的羧基末端是相融合的。在一个实施例中，该scFv是***在该完整的免疫球蛋白的铰链区中的。

在一个实施例中，如一种包含了与WapR-004的相应区至少90％一致的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域的抗体或其抗原结合片段一样，该抗Psl结合域与同一种假单胞菌Psl表位特异性地结合。在一个实施例中，该抗Psl结合域与假单胞菌Psl特异性地结合，并且竞争性地抑制假单胞菌Psl与一种抗体或其抗原结合片段的结合，该抗体或其抗原结合片段包含与WapR-004的相应区至少90％一致的VH和VL区。在一个实施例中，WapR-004的VH和VL分别包含SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12。在一个实施例中，WapR-004序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229和SEQ ID NO：235。在一个实施例中，如一种包含了V2L2的VH和VL区的抗体或其抗原结合片段一样，该抗PcrV结合域与同一种假单胞菌PcrV表位特异性地结合。在一个实施例中，该抗PcrV结合域与假单胞菌PcrV特异性地结合，并且竞争性地抑制假单胞菌PcrV与一种包含V2L2的VH和VL的抗体或其抗原结合片段的结合。在另一个实施例中，如一种包含了与V2L2的相应区至少90％一致的VH和VL区的抗体或其抗原结合片段一样，该抗PcrV 结合域与同一种假单胞菌PcrV表位特异性地结合。在一个实施例中，V2L2的VH和VL分别包含SEQ ID NO：216和SEQ ID NO：217。在一个实施例中，WapR-004的VH和VL(分别是SEQ ID NO：11和12)以及V2L2的VH和VL(分别是SEQ IDNO：216和217)。在一个实施例中，该双特异性抗体包含一种选自下组的氨基酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229和SEQ ID NO：235。

在一个实施例中，本披露提供了一种包含氨基酸序列SEQ ID NO：216或SEQ IDNO：217的多肽。在一个实施例中，该多肽是一种抗体。

在一个实施例中，本披露提供了一种细胞，该细胞包含或产生在此披露的结合分子或多肽。

在一个实施例中，本披露提供了一种分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含一种对在此所述的结合分子或多肽进行编码的多核苷酸。在一个实施例中，该多核苷酸分子包含一种选自下组的多核苷酸序列，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：238和SEQ ID NO：239。在另一个实施例中，本披露提供了一种载体，该载体包含一种在此所述的多核苷酸。在另一个实施例中，本披露提供了一种细胞，该细胞包含一种多核苷酸或载体。

在一个实施例中，本披露提供了一种组合物，该组合物包含一种在此所述的结合分子、双特异性抗体或多肽以及一种药学上可接受的载体。

在一个实施例中，本披露提供了一种组合物，该组合物包含一个与假单胞菌Psl结合的结合域以及一个与假单胞菌PcrV结合的结合域。在一个实施例中，如一种包含了与WapR-004、Cam-003、Cam-004、Cam-005、WapR-001、WapR-002、WapR-003、或WapR-016的相应区至少90％一致的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域的抗体或其抗原结合片段一样，该抗Psl结合域与同一种假单胞菌Psl表位特异性地结合。在一个实施例中，该抗Psl结合域与假单胞菌Psl特异性地结合，并且竞争性地抑制假单胞菌Psl与一种抗体或其抗原结合片段的结合，该抗体或其抗原结合片段包含与WapR-004、Cam-003、Cam-004、Cam-005、WapR-001、WapR-002、WapR-003或WapR-016的相应区至少90％一致的VH和VL区。在一个实施例中，WapR-004的VH和VL分别包含SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，Cam-003的VH和VL分别包含SEQID NO：1和SEQ ID NO：2，Cam-004的VH和VL分别包含SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：2，Cam-005的VH和VL分别包含SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：2，WapR-001的VH和VL分别包含SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，WapR-002的VH和VL分别包含SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8，WapR-003的VH和VL分别包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，并且WapR-016的VH和VL分别包含SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。在一个实施例中，如一种包含了V2L2的VH和VL区的抗体或其抗原结合片段一样，该抗PcrV结合域与同一种假单胞菌PcrV表位特异性地结合。在一个实施例中，该抗PcrV结合域与假单胞菌PcrV特异性地结合，并且竞争性地抑制假单胞菌PcrV与一种包含V2L2的VH和VL的抗体或其抗原结合片段的结合。在一个实施例中，如一种包含了与V2L2的相应区至少90％一致的VH和VL区域的抗体或其抗原结合片段一样，该抗PcrV结合域与同一种假单胞菌PcrV表位特异性地结合。在一个实施例中，V2L2的VH和VL分别包含SEQ IDNO：216和SEQ ID NO：217。在一个实施例中，该抗Psl结合域包含WapR-004的VH和VL区，并且所述抗PcrV结合域包含V2L2的VH和VL区，或其抗原结合片段。

在一个实施例中，该组合物包括一种包含所述抗Psl结合域的第一结合分子、以及一种包含PcrV结合域的第二结合分子。在一个实施例中，该第一结合分子是一种抗体或其抗原结合片段，并且所述第二结合分子是一种抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，这些抗体或抗原结合片段独立地选自下组，该组由以下各项组成：单克隆的、人源化的、嵌合体的、人类的、Fab片段、Fab′片段、F(ab)2片段以及scFv片段。在一个实施例中，这些结合域、结合分子或其片段与两种或更多种的、三种或更多种的、四种或更多种的、或五种或更多种的不同的铜绿假单胞菌血清型相结合。在一个实施例中，这些结合域、结合分子或其片段与至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的从感染患者中分离的铜绿假单胞菌株相结合。在一个实施例中，铜绿假单胞菌菌株是从肺、痰液、眼睛、脓汁、粪便、尿、窦、伤口、皮肤、血液、骨或膝关节液中的一种或多种中分离。在一个实施例中，该抗体或其抗原结合片段被轭合至选自下组的试剂，该组由以下各项组成：抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药剂、淋巴因子、异源抗体或其片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)，以及任何所述试剂中的两种或更多种的组合。在一个实施例中，该可检测标记选自下组，该组由以下各项组成：酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记，或任何所述可检测标记中的两种或更多种的组合。

在一个实施例中，本披露提供了一种在有需要的受试者中对假单胞菌感染进行预防或治疗的方法，该方法包括向受试者给予有效量的在此所述的组合物，其中所述给予可在所述受试者中提供了对于假单胞菌感染的预防或治疗的协同治疗效应，并且其中所述协同效应大于给予等摩尔量的单独结合域的单独效应的总和。在一个实施例中，该协同治疗效应导致了其存活百分比大于只被给予一种结合域的受试者的累加存活百分比。在一个实施例中，给予该组合物持续两个或更多个预防/治疗周期。在一个实施例中，这些结合域或结合分子被同时给予。在一个实施例中，这些结合域或结合分子被序贯给予。在一个实施例中，假单胞菌感染是铜绿假单胞菌感染。在一个实施例中，受试者是人类。在一个实施例中，感染是眼部感染、肺感染、烧伤感染、伤口感染、皮肤感染、血液感染、骨感染、或所述感染中的两种或更多种的组合。在一个实施例中，受试者患有急性肺炎、烧伤、角膜感染、囊性纤维化或其组合。

在一个实施例中，本披露提供了一种在有需要的受试者中对假单胞菌感染进行预防或治疗的方法，该方法包括向该受试者给予有效量的该结合分子及其片段、一种双特异性抗体、一种多肽、或在此所述的一种组合物。

在一个实施例中，本披露提供了一种包含在此所述的组合物的试剂盒。

附图简述

图1(A-F)：使用人类抗体噬菌体文库来进行的表型全细胞筛选鉴别了铜绿假单胞菌功能活性特异性抗体。(A)完整抗体选择策略的概述。(B)描述从最近暴露于铜绿假单胞菌的患者分离抗体可变区基因的过程的流程图。(C)scFv噬菌体展示文库的特征，指示了所克隆的抗体谱的大小和多样性。(D)在悬浮的铜绿假单胞菌3064ΔWapR(¹)或铜绿假单胞菌PAO1MexAB OprMΔWapR(²)上选择时，对于使用患者抗体文库或天然抗体文库的噬菌体展示选择效率的比较。条形指示每一轮选择的输出滴度(以CFU计)，并且圆形指示重复的VHCDR3序列的比例，是克隆富集的指示。(E)scFv从噬菌体展示的ELISA筛选，以用于测试与多种铜绿假单胞菌菌株的结合。示出了来自选择的八个单独噬菌体scFv和一个不相关的噬菌体scFv的ELISA数据(在450nm处的吸光度)。(F)铜绿假单胞菌特异性抗体与来自独特铜绿假单胞菌血清型的代表性菌株的FACS结合。对于所测试的每一种抗体，人IgG阴性对照抗体示出为带有阴影的峰。

图2(A-B)：对于mAb促进铜绿假单胞菌OPK的评价(A)使用从噬菌体淘筛中得到的纯化单克隆抗体的稀释物，对于发光铜绿假单胞菌血清组O5菌株(PAO1.lux)的调理吞噬测定。(B)使用从噬菌体淘筛中得到的纯化WapR-004和Cam-003单克隆抗体的稀释物，对于发光铜绿假单胞菌血清组O11菌株(9882-80.lux)的调理吞噬测定。在A与B两者中，将R347，一种不结合铜绿假单胞菌抗原的同种型匹配的人类单克隆抗体用作阴性对照。

图3(A-I)：鉴别从表型筛选中得到的抗体的铜绿假单胞菌Psl外泌多糖靶标。抗体的反应性在用以下所指示的铜绿假单胞菌菌株涂布的板上通过间接ELISA来确定：(A)野生型PAO1、PAO1ΔwbpL、PAO1ΔrmlC和PAO1ΔgalU。(B)PAO1ΔpslA。基因纬(Genway)抗体对于铜绿假单胞菌外膜蛋白具有特异性并且用作阳性对照。(C)Cam-003与PAO1和PAO1ΔpslA的FACS结合分析。Cam-003由黑色实线和透明峰来指示；同种型匹配的非铜绿假单胞菌特异性人IgG1抗体用作阴性对照并且由灰线和带有阴影的峰来指示。(D)将从PAO1和PAO1ΔpslA纯化的LPS通过SDS-PAGE来解析并且使用从以PAO1ΔwapRΔalgD(在O-抗原运输至外膜和褐藻酸盐产生方面有缺陷的一种突变菌株)接种的小鼠得到的抗血清来进行免疫印迹。(E)与PAO1的同基因突变体的Cam-003ELISA结合数据。Cam-003只能与表达Psl的菌株进行结合。pPW145是含有pslA的pUCP表达载体。(F和G)调理吞噬测定指示，Cam-003只介导对于能够产生Psl的菌株(野生型PAO1和PAO1ΔpslA(与pslA基因反式互补))的杀伤。(H和I)ELISA数据指示了抗Psl抗体WapR-001、WapR-004和WapR-016与PAO1ΔwbpLΔalgD和PAO1ΔwbpLΔalgDΔpslA的反应性。R347在所有实验中用作阴性对照。

图4：抗Psl mAb抑制发光铜绿假单胞菌菌株PAO1.lux与A549细胞的细胞附着。将对数期PAO1.lux在10的MOI下添加至A549细胞的汇合单层，随后在重复洗涤以便去除未结合的铜绿假单胞菌之后进行RLU分析。结果代表针对每个抗体浓度重复两次执行的三个独立实验。

图5(A-C)：体内传代的铜绿假单胞菌菌株保持/增加Psl的表达。Cam-003抗体通过黑色实线和透明峰来示出；人IgG阴性对照抗体示出为灰线和带有阴影的峰。(A)对于阳性对照，测定Cam-003与从过夜培养物(约5x10⁸/ml)生长至对数期的菌株的结合。(B)将每一种菌株的接种物从生长为菌苔的过夜TSA板制备成5x10⁸CFU/ml并且通过流式细胞术来测试与Cam-003的反应性。(C)腹膜内激发四小时后，通过腹腔灌洗从小鼠体内收获细菌并且通过流式细胞术使用Cam-003来测定Psl的存在。

图6(A-F)：在铜绿假单胞菌急性肺炎模型中用抗Psl单克隆抗体Cam-003或WapR-004处理的动物的存活率。(A-D)在用以下各项来使鼻内感染之前24小时，将动物用45、15以及5mg/kg的Cam-003和45mg/kg的R347或PBS来处理：(A)PAO1(1.6x10⁷CFU)、(B)33356(3x10⁷CFU)、(C)6294(7x10⁶CFU)、(D)6077(1x10⁶CFU)。(E-F)如指示的，将动物用5和1mg/kg的WapR-004来处理，随后用(E)(8x10⁵CFU)或(F)(6x10⁵CFU)的6077来感染。仔细监测动物的存活率长达72小时(A-D)或120小时(E-F)。在所有实验中，PBS和R347充当阴性对照。结果表示为卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线；Cam-003相比于R347的存活的差异通过对数秩检验来计算。(A)Cam-003(45mg/kg–P<0.0001；15mg/kg–P＝0.0003；5mg/kg–P＝0.0033)。(B)Cam-003(45mg/kg–P＝0.0012；15mg/kg–P＝0.0012；5mg/kg–P＝0.0373)。(C)Cam-003(45mg/kg–P＝0.0007；15mg/kg–P＝0.0019；5mg/kg–P＝0.0212)。(D)Cam-003(45mg/kg –P<0.0001；15mg/kg–P<0.0001；5mg/kg–P＝0.0001)。结果代表至少两个独立实验。(E)[Cam-003(5mg/kg)相比于R347(5mg/kg)：P＝0.02；Cam-003(1mg/kg)相比于R347(5mg/kg)：P＝0.4848；WapR-004(5mg/kg)相比于R347(5mg/kg)：P<0.0001；WapR-004(1mg/kg)相比于R347(5mg/kg)：P＝0.0886；WapR-004(5mg/kg)相比于Cam-003(5mg/kg)：P＝0.0017；WapR-004(1mg/kg)相比于Cam-003(1mg/kg)：P＝0.2468；R347(5mg/kg)相比于PBS：P＝0.6676](F)[Cam-003(5mg/kg)相比于R347(5mg/kg)：P＝0.0004；Cam-003(1mg/kg)相比于R347(5mg/kg)：P<0.0001；WapR-004(5mg/kg)相比于R347(5mg/kg)：P<0.0001；WapR-004(1mg/kg)相比于R347(5mg/kg)：P<0.0001；WapR-004(5mg/kg)相比于Cam-003(5mg/kg)：P＝0.0002；WapR-004(1mg/kg)相比于Cam-003(1mg/kg)：P＝0.2628；R347(5mg/kg)相比于PBS：P＝0.6676]。结果代表五个独立实验。

图7(A-F)：在诱导急性肺炎之后，抗Psl单克隆抗体Cam-003和WapR-004减少器官负荷。在用(A)PAO1(1.1x10⁷CFU)、(B)33356(1x10⁷CFU)、(C)6294(6.25x10⁶CFU)、(D)6077(1x10⁶CFU)感染之前24小时，将小鼠用Cam-003抗体处理，并且在用(E)6294(约1x10⁷CFU)和(F)6206(约1x10⁶CFU)感染之前24小时，用WapR-004抗体处理。感染后24小时，将动物安乐死，随后收获器官以便鉴别有生存力的CFU。Cam-003或WapR-004相比于R347的有生存力的CFU的差异通过曼-惠特尼U检验来确定。(A)肺：Cam-003(45mg/kg–P＝0.0015；15mg/kg–P＝0.0021；5mg/kg–P＝0.0015)；脾：Cam-003(45mg/kg–P＝0.0120；15mg/kg–P＝0.0367)；肾：Cam-003(45mg/kg–P＝0.0092；15mg/kg–P＝0.0056)；(B)肺：Cam-003(45mg/kg–P＝0.0010；15mg/kg–P<0.0001；5mg/kg–P＝0.0045)；(C)肺：Cam-003(45mg/kg–P＝0.0003；15mg/kg–P＝0.0039；5mg/kg–P＝0.0068)；脾：Cam-003(45mg/kg–P＝0.0057；15mg/kg–P＝0.0230；5mg/kg–P＝0.0012)；(D)肺：Cam-003(45mg/kg–P＝0.0005；15mg/kg–P＝0.0003；5mg/kg–P＝0.0007)；脾：Cam-003(45mg/kg–P＝0.0015；15mg/kg–P＝0.0089；5mg/kg–P＝0.0089)；肾：Cam-003(45mg/kg–P＝0.0191；15mg/kg–P＝0.0355；5mg/kg–P＝0.0021)。(E)肺：WapR-004(15mg/kg–P＝0.0011；5mg/kg–P＝0.0004；1mg/kg–P＝0.0002)；脾：WapR-004(15mg/kg–P<0.0001；5mg/kg–P＝0.0014；1mg/kg–P<0.0001)；F)肺：WapR-004(15mg/kg–P<0.0001；5mg/kg–P＝0.0006；1mg/kg–P＝0.0079)；脾：WapR-004(15mg/kg–P＝0.0059；5mg/kg–P＝0.0261；1mg/kg–P＝0.0047)；肾：WapR-004(15mg/kg–P＝0.0208；5mg/kg–P＝0.0268。

图8(A-G)：抗Psl单克隆抗体Cam-003和WapR-004在铜绿假单胞菌角膜炎模型和热损伤模型中有活性。在用6077(O11-细胞毒性-2x10⁶CFU)感染之前24小时，将小鼠用45mg/kg(A，B)或15mg/kg(C，D)的对照IgG1抗体或Cam-003、或PBS或45mg/kg的对照IgG1抗体或Cam-003、或45mg/kg或15mg/kg或5mg/kg的WapR-004(F，G)来处理。在感染之前不久，在每个动物的左角膜上作出三个1mm划痕，随后局部施用处于5μl接种物中的铜绿假单胞菌。在感染之后24小时，计算角膜病理学评分，随后去除眼睛以便确定有生存力的CFU。病理学评分和有生存力的CFU的差异是通过曼-惠特尼U检验来确定。(A)P＝0.0001，(B)P<0.0001，(C)P＝0.0003，(D)P＝0.0015。(F)和(G)Cam-003(45mg/kg)相比于WapR-004(45mg/kg)：P＝0.018；Cam-003(45mg/kg)相比于WapR-004(15mg/kg)：P＝0.0025；WapR-004(45mg/kg)相比于WapR-004(15mg/kg)：P＝0.1331；WapR-004(5mg/kg)相比于Ctrl：P<0.0001。结果代表五个独立实验。(E)6077感染(2x10⁵CFU)后的Cam-003和R347处理的CF-1小鼠铜绿假单胞菌热损伤模型的存活分析(对数秩：R347相比于Cam-00315mg/kg，P＝0.0094；R347相比于Cam-0035mg/kg，P＝0.0017)。结果代表至少三个独立实验。(n)是指每个组中的动物的数目。图8(H)：在铜绿假单胞菌小鼠眼角膜炎模型中，抗Psl和抗PcrV单克隆抗体是活性的。在用6077(O11-细胞毒性-1x10⁶CFU)进行感染之前16个小时，小鼠腹膜内注射(IP)PBS或对照IgG1抗体(R347)45mg/kg、或WapR-004(α-Psl)5mg/kg、或V2L2(α-PcrV)5mg/kg。感染之前，立即将小鼠麻醉，随后使用27号针在解剖显微镜下在各小鼠的一只眼睛的角膜和浅层基质上形成三个划痕，随后局部施用处于5μl接种物中的铜绿假单胞菌6077菌株。

图9(A-C)：Cam-003Fc突变体抗体Cam-003-TM具有降低的OPK和体内功效，但是维持抗细胞附着活性。(A)使用Cam-003和Cam-003-TM 进行的PAO1.lux OPK测定，Cam-003-TM在Fc域中具有突变以便防止Fc与Fcγ受体相互作用(奥加尼西安(Oganesyan)V.等人，《晶体学报D部分：生物晶体》(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr)64，700-704(2008))。R347用作阴性对照。(B)用Cam-003和Cam-003-TM进行的PAO1细胞附着测定。(C)将Cam-003与Cam-003-TM的功效进行比较的急性肺炎模型。

图10(A-C)：A：抗Psl单克隆抗体的相对结合亲和力的表位作图和鉴别。表位作图通过竞争ELISA来执行并且使用流动***以得自铜绿假单胞菌株PAO1的过夜培养物的上清液的Psl来证实。相对结合亲和力是在384仪器上测量。还示出其中细胞附着被最大限度地抑制的抗体浓度和每一种抗体的OPK EC50值。B，C.如在 384仪器上测量的不同WapR-004突变体的相对结合亲和力。还示出不同突变体的OPK EC50值。

图11(A-M)：克隆在铜绿假单胞菌调理吞噬杀灭(OPK)测定(A-M)中对WapR-004(W4)突变体的评价，用发光绿假单胞菌血清组O5菌株(PAO1.lux)进行OPK测定，使用scFv-Fc形式的不同W4突变体克隆的稀释物。在一些情况下，W4IgG1被包括于测定中并且以W4-IgG1来指示。W4-RAD-Cam和W4-RAD-GB代表在此描述的相同WapR-004RAD序列。“W4-RAD”是WapR-004Rad的简略名称，并且图D至图M中的W4-RAD-Cam和W4-RAD-GB名称代表WapR-004RAD的两种不同制剂。(N-Q)：在铜绿假单胞菌OPK测定中对从先导物(WapR-004)优化得到的优化抗Psl mAb的评估。(N-O)用发光PAO1.lux的OPK测定，使用纯化的先导物优化单克隆抗体的稀释物。(P-Q)用PAO1.lux的重复OPK测定，使用纯化mAb的稀释物来对结果进行确认。(N-Q)：W4-RAD用作对比阳性对照。在所有实验中，R347，一种不结合铜绿假单胞菌抗原的人类IgG1单克隆抗体用作阴性对照。

图12(A-H)：(A)PcrV表位多样性。(B)亲本V2L2mAb、mAb166(阳性对照)和R347(阴性对照)的细胞毒性分析的抑制百分比(C)对V2L2mAb、mAb166(阳性对照)和R347(阴性对照)的防止RBC溶胞的能力的评价(D)对于V2L2种系化mAb(V2L2-GL)和优化V2L2-GL mAb(V2L2-P4M、V2L2-MFS、V2L2-MD和V2L2-MR)防止RBC溶胞的评价。(E)对于mAb1E6、1F3、11A6、29D2、PCRV02和V2L7防止RBC溶胞的评价。(F)对于mAb V2L2和29D2防止RBC溶胞的评价。(G-H)V2L2-GL和V2L2-MD抗体的相对结合亲和力。

图13(A-I)：抗PcrV抗体处理的小鼠的体内生存研究。(A)在感染之前24小时，将小鼠用以下进行处理：1.03x10⁶CFU6077(exoU⁺)，含有R347(阴性对照)45mg/kg、mAb166(阳性对照)45mg/kg、15.0mg/kg、5.0mg/kg或1.0mg/kg、或者V2L215mg/kg、5.0mg/kg、1.0mg/kg或0.2mg/kg。监测存活持续96小时。(B)在感染之前24小时，将小鼠用以下进行处理：2.1x10⁷CFU6294(exoS⁺)，含有R347(阴性对照)15mg/kg、mAb166(阳性对照)15.0mg/kg、5.0mg/kg或1.0mg/kg、或者V2L215mg/kg、5.0mg/kg或1.0mg/kg。监测存活持续168小时。在感染之前24小时，将小鼠用以下进行处理：(C)6294(O6)或(D)PA103A，含有R347(阴性对照)、PcrV抗体PcrV-025mg/kg、或者V2L25mg/kg、1.0mg/kg、0.2mg/kg或0.04mg/kg。在用菌株6077感染小鼠之前24小时，用下列对小鼠进行处理：R347(阴性对照)，5mg/kg PcrV抗体PcrV-02，V2L7(5mg/kg或1mg/kg)、3G5(5mg/kg或1mg/kg)、或11A6(5mg/kg或1mg/kg)(E)，或25mg/kg的V2L7、1E6、1F3、29D2、R347或1mg/kg的PcrV抗体PcrV-01(F)，或25mg/kg的21F1、V2L2、2H3、4A8、SH3、LE10、R347或1mg/kg的PcrV-02(G)，或29D2(1mg/kg、3mg/kg或10mg/kg)、V2L2(1mg/kg，3mg/kg或10mg/kg)R347或1mg/kg的PcrV-02(H)。在感染之前24小时将小鼠用以下进行处理：6294(O6)或PA103A，含有V2L2(0.04mg/kg、0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg)、R347、或者PcrV-025mg/kg。在急性肺炎模型中对存活百分比进行测定。

图14：V2L2处理的小鼠的器官负荷分析。在用6206感染小鼠之前24小时，用以下对小鼠进行处理：(A)R347(阴性对照)，1mg/kg、0.2mg/kg或0.07mg/kg V2L2以及(B)15mg/kgR347(阴性对照)；15.0mg/kg、5.0mg/kg或1.0mg/kg mAb166(阳性对照)；或5.0mg/kg、1.0mg/kg或0.2mg/kg V2L2。鉴定在肺、脾和肾中的每克组织中的集落形成单位。

图15：用V2L2和WapR-004(W4)处理的小鼠的器官负荷分析。在用6206(O11-ExoU+)感染小鼠之前24小时，用R347(阴性对照)、单用V2L2、或用V2L2(0.1mg/kg)与浓度递增的W4(0.1，0.5，1.0，or2.0mg/kg)的组合对小鼠进行处理。鉴定在肺、脾和肾中的每克组织中的集落形成单位。

图16(A-G)：在铜绿假单胞菌急性肺炎模型中，用抗PcrV单克隆抗体V2L2进行处理的动物的存活率。在代表不同的V2L2制剂的图A至G中，V2L2-GL、V2L2-MD、V2L2-PM4、V2L2-A和V2L2-MFS的命名。(A-C)在用(A)6077(9.75x10⁵CFU)、(B，C)6077(9.5x10⁵CFU)鼻内感染动物之前，用V2L21mg/kg、0.5mg/kg或R3470.5mg/kg对动物进行处理。(D-F)用V2L20.5mg/kg、0.1mg/kg或R3470.5mg/kg对动物进行处理，随后用6077(D)(1x10⁶CFU)、(E)(9.5x10⁵CFU)或F(1.026x10⁶CFU)进行感染。(G)用V2L2-MD(0.04mg/kg、0.2mg/kg、1mg/kg或5mg/kg)、mAb166(阳性对照)(0.2mg/kg、1mg/kg、5mg/kg或15mg/kg)或者R347(0.5mg/kg)对动物进行处理，随后用6206(2x10⁷⁺CFU)进行感染。

图17(A-B)：(A)Bs1-TNFα/W4、Bs2-TNFα/W4、Bs3-TNFα/W4和(B)Bs2-V2L2/W4-RAD、Bs3-V2L2/W4-RAD和Bs4-V2L2-W4-RAD Psl/PcrV双特异性抗体的示意性图示。(A)对于Bs1-TNFα/W4，W4scFv与TNFαVL的氨基末端通过(G4S)2接头进行融合。对于Bs2-TNFα/W4，W4scFv与TNFαVH的氨基末端通过(G4S)2接头进行融合。对于Bs3-TNFα/W4，W4scFv与CH3的羧基末端通过(G4S)2接头进行融合。(B)对于Bs2-V2L2-2C，W4-RAD scFv与V2L2VH的氨基末端通过(G4S)2接头进行融合。对于Bs2-W4-RAD-2C，V2L2scFv与W4-RAD VH的氨基末端通过(G4S)2接头进行融合。对于Bs3-V2L2-2C，W4-RAD scFv与CH3的羧基末端通过(G4S)2接头进行融合。对于Bs4-V2L2-2C，W4-RAD scFv***到铰链区中，通过(G4S)2接头在scFv 的N端和C端进行连接。

图18：对WapR-004(W4)scFv在图17A中所描绘的双特异性构建体中的活性的评价。W4scFv是连接在两个不同的双特异性构建体上的(处于交替的N端或C端定向)，这些构建体具有TNFα结合臂。各W4-TNFα双特异性构建体(Bs1-TNFα/W4、Bs2-TNFα/W4和Bs3-TNFα/W4)保留了与W4相似的抑制细胞附着的能力，使用PAO1.lux(O5)测定，表明该W4scFv保留了其双特异性形式的活性。R347用作阴性对照。

图19(A-C)：通过用V2L2替换图17B中的TNF抗体，将抗Psl和抗PcrV结合域以双特异性形式进行结合。α这些构建体与图17B中所描绘的那些构建体相同，除了使用非稳定化的W4-scFv代替稳定化的W4-RAD scFv之外。W4和W4-RAD两者靶向相同的表位，并且具有相同的功能活性。使用(A)6206和(B)6206ΔpslA处理的A549细胞，对BS2-V2L2和BS3-V2L2进行细胞毒性抑制百分比的分析。(C)与亲本对照相比较，对BS2-V2L2、BS3-V2L2和BS4-V2L2的防止RBC溶胞的能力进行评估。所有的双特异性构建体保留了与使用6206和6206ΔpslA感染细胞的亲本V2L2抗体相似的抗细胞毒性活性，并且其类似于亲本对照组(V2L2)防止RBC溶胞。R347在所有实验中用作阴性对照。

图20(A-C)：对促进铜绿假单胞菌OPK的抗Psl/抗PcrV双特异性构建体的评价。用发光铜绿假单胞菌血清组O5菌株(PAO1.lux)显示调理吞噬测定，使用纯化的Psl/TNFα双特异性抗体(Bs2-TNFα和Bs3-TNFα)的稀释物；W4-RAD或V2L2-IgG1亲本抗体；Psl/PcrV双特异性抗体Bs2-V2L2或Bs3-V2L2，或Bs2-V2L2-2C、Bs3-V2L2-2C、Bs4-V2L2-2C或Bs4-V2L2-2C抗体，具有YTE突变(Bs4-V2L2-2C-YTE)。(A)在Bs2-V2L2抗体显示出与亲本W4-RAD抗体相比相似的杀伤力时，对于Bs3-V2L2抗体的杀伤力是下降的。(B)在Bs2-V2L2-2C和Bs4-V2L2-2C抗体显示出与亲本W4-RAD抗体相比相似的杀伤力时，对于Bs3-V2L2-2C抗体的杀伤力是下降的。(C)W4-RAD和W4-RAD-YTE的命名代表不同的W4-RAD制剂。Bs4-V2L2-2C(旧批次)和Bs4-V2L2-2C(新批次)的命名代表不同的Bs4-V2L2-2C制剂。在Bs4-V2L2-2C-YTE中的YTE修饰是使得抗体可增加抗体半衰期而作出的修饰。Bs4抗体的不同制剂(旧批次与新批次相比)显示了与亲本W4-RAD抗体相比相似的杀伤力，然而，与Bs4-V2L2-2C相比，Bs4-V2L2-2C-YTE抗体的OPK活性呈3倍下降(见EC50表)。R347在所有实验中用作阴性对照。

图21(A-I)：用Bs2-V2L2、Bs3-V2L2、Bs4-V2L2-2C和Bs4-V2L2-2C-YTE对6206急性肺炎模型***中的小鼠进行处理的体内生存研究。将小鼠(n＝10)用以下进行处理：(A)：R347(阴性对照，0.2mg/kg)、Bs2-V2L2(0.28mg/kg)、Bs3-V2L2(0.28mg/kg)、V2L2(0.2mg/kg)或W4-RAD(0.2mg/kg)；(B-C)：R347(阴性对照，1mg/kg)、Bs2-V2L2(0.5mg/kg或1mg/kg)或Bs4-V2L2-2C(0.5mg/kg或1mg/kg)；(D)：R347(阴性对照，1mg/kg)、Bs3-V2L2(0.5mg/kg或1mg/kg)或Bs4-V2L2-2C(0.5mg/kg或1mg/kg)；(E)：R347(阴性对照，2mg/kg)、单独的W4 与V2L2抗体的组合(各0.5mg/kg或1mg/kg)或Bs4-V2L2-2C(1mg/kg或2mg/kg)；以及(F)：R347(阴性对照，1mg/kg)、单独的W4与V2L2抗体的混合物(各0.5mg/kg或1mg/kg)或Bs4-V2L2-2C(1mg/kg或0.5mg/kg)。处理之后二十四小时，对所有小鼠用～(6.25x10⁵-1x10⁶CFU/动物)6206(O11-ExoU+)进行感染。对所有小鼠监测120小时。(A)：在感染后大约30小时，所有对照小鼠均患有感染。所有的Bs3-V2L2动物连同接受V2L2对照的动物均存活。大约90％的W4-RAD免疫的动物存活。相比之下，大约50％的Bs2-V2L2动物患有感染，持续120小时。(B-F)：在感染后大约48小时，所有对照小鼠均患有感染。(B)：与Bs2-V2L2相比，Bs4-V2L2-2C在1.0和0.5mg/kg均具有更大的活性。(C)：与Bs2-V2L2相比，Bs4-V2L2-2C在1.0mg/kg显现更大的活性(其结果不是统计学上显著的)。(D)：与Bs3-V2L2相比，Bs4-V2L2-2C在0.5mg/kg具有更大的活性。(E)：与抗体混合物1.0和0.5mg/kg相比，Bs4-V2L2-2C在2mg/kg和1mg/kg均具有更大的活性。(F)：Bs4-V2L2(1mg/kg)在1.0和0.5mg/kg均具有相似的活性。(G-H)：Bs4-V2L2-2C和Bs4-V2L2-2C-YTE在1.0和0.5mg/kg均具有相似的活性。结果由卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线来表示；由对数秩检验针对以下计算存活的差异：(B)Bs4-V2L2-2C相比于Bs2-V2L2(1mg/kg–P＝0.034；0.5mg/kg–P＝0.0002)；(D)Bs4-V2L2-2C相比于Bs3-V2L2(0.5mg/kg–P<0.0001)；(E)：Bs4-V2L2-2C(2mg/kg)相比于抗体混合物(各1mg/kg)-P＝0.0012；Bs4-V2L2-2C(1mg/kg)相比于抗体混合物(各0.5mg/kg)-P＝ 0.0002.(G-H)：用R347(阴性对照，1mg/kg)、Bs4-V2L2-2C(1和0.5mg/kg)和Bs4-V2L2-2C-YTE(1和0.5mg/kg)以及6206(9e5CFU)对小鼠(n＝8)进行处理。通过对数秩观察到，在任一剂量下的Bs4-V2L2-2C与Bs4-V2L2-2C-YTE之间没有差异。(I)：为了对各抗体构建体的功效进行分析，用0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg或15mg/kg对小鼠进行处理，并在6206致死肺炎模型中对其存活进行分析。表中指明了存活百分比，各组比较的动物数在圆括号中标出。

图22：使用6206急性肺炎模型对于抗Psl/PcrV双特异性抗体处理的动物进行的器官负荷分析。在用6206(O11-ExoU+)对小鼠进行感染之前24小时，用R347(阴性对照)、单用V2L2或W4-RAD(0.2mg/kg)、Bs2-V2L2(0.28mg/kg)或BS3-V2L2(0.28mg/kg)对小鼠进行处理。鉴定在肺、脾和肾中的每克组织中的集落形成单位。在测试浓度下，Bs2-V2L2和Bs3-V2L2均可显著降低肺中的器官负荷。然而，与亲本抗体相比，双特异性构建体均不能显著影响脾或肾中的器官负荷。

图23(A-B)：使用6294模型***，对于抗Psl/PcrV双特异性抗体处理的小鼠的器官负荷分析。在用6294感染之前24小时，用R347(阴性对照)、单用V2L2或W4-RAD(0.5mg/kg)、Bs2-V2L2(0.7mg/kg)或Bs3-V2L2(0.7mg/kg)(A)、或者单用V2L2或W4-RAD alone(0.2mg/kg)、Bs2-V2L2(0.2mg/kg)、Bs3-V2L2(0.2mg/kg)或单独的W4-RAD与V2L2抗体的组合(各0.1mg/kg)(B)对小鼠进行处理。给予抗体后二十四小时，用含有2.5 x10⁷CFU6294(A)或1.72x10⁷CFU6294(B)的接种物对所有小鼠进行感染。鉴定在肺、脾和肾中的每克组织中的集落形成单位。使用6294模型***，(A)BS2-V2L2和BS3-V2L2两者均可将所有组织中的器官负荷显著降低至一个可与V2L2亲本抗体相比的水平。W4-RAD亲本抗体对于降低器官负荷没有效果。(B)Bs2-V2L2、Bs3-V2L2以及W4-RAD+V2L2组合可将所有组织中的器官负荷显著降低至一个可与V2L2亲本抗体相比的水平。

图24：在6294模型***中用Bs2-W4/V2L2和Bs3-W4/V2L2处理的小鼠的体内生存研究。用R347(阴性对照，0.2mg/kg)、Bs2-V2L2(0.28mg/kg)、Bs3-V2L2(0.28mg/kg)、V2L2(0.2mg/kg)或W4-RAD(0.2mg/kg)对小鼠进行处理。处理后二十四小时，用6294对所有小鼠进行感染。对所有小鼠监测120小时。在感染后大约75小时，所有对照组小鼠均患有感染。60％的Bs3-V2L2以及50％的Bs2-V2L2动物在接种后120小时仍存活。如在器官负荷研究中所看到的，W4-RAD免疫不能对存活产生影响，所有小鼠在与对照组大约相同的时间均出现感染。

图25(A-D)：在6206模型***中，抗Psl/PcrV双特异性抗体或W4+V2L2组合疗法的器官负荷分析。抗体的次优浓度(A-C)用于使得对抗体活性进行解释成为可能。(D)使用高浓度Bs4。在用6206感染小鼠之前24小时，单用R347(阴性对照)V2L2或W4-RAD(0.2mg/kg)、Bs2-V2L2(0.2mg/kg)、Bs3-V2L2(0.2mg/kg)、Bs4(15.0、5.0and1.0mg/kg)或单独的W4与V2L2抗体的组合(各0.1mg/kg)对小鼠进行处理。抗体给予后二十四小时，用含有(A)、(B)4.75x10⁵CFU6206(O11-ExoU+)或(C)7.75x10⁵CFU6206(O11-ExoU+)或(D)9.5x10⁵CFU6206(O11-ExoU+)的接种物对所有小鼠进行感染。鉴定在肺、脾和肾中的每克组织中的集落形成单位。使用6206模型***，BS2-V2L2与BS3-V2L2两者均可使肺、脾和肾的器官负荷降低至一个与W4+V2L2组合具有可比性的水平。在肺中，使用克鲁斯卡尔-瓦利斯(Kruskal-Wallis)和邓恩事后检验(Dunn’s post test)，该组合显著降低了细菌CFUs Bs2-以及Bs3-V2L2和V2L2。观察到脾和肾中的细菌负荷没有显著差异，尽管注意到有降低的趋势。(D)当使用Bs4-V2L2-2C的最佳浓度(15.0，5.0，和1.0)时，从肺中观察到了快速和高效的细菌清除。此外，还消除了向脾和肾的细菌散播。星号表示，使用克鲁斯卡尔-瓦利斯(Kruskal-Wallis)和邓恩事后检验(Dunn’s post test)，与R347对照进行比较具有统计学显著性。

图26(A-J)：治疗助剂疗法：Bs4-V2L2-2C+抗生素。(A)-(B)在用1x10⁶CFU6206感染小鼠之前24小时用0.5mg/kg R347(阴性对照)或Bs4-V2L2-2C(0.2mg/kg或0.5mg/kg)对小鼠进行处理、或在感染之后1小时用环丙沙星(CIP)(20mg/kg或6.7mg/kg)对小鼠进行处理，或在感染前24小时用Bs4-V2L2-2C、并且在感染后1小时用CIP(分别为0.5mg/kg+20mg/kg或0.5mg/kg+6.7mg/kg或0.2mg/kg+20mg/kg或0.2mg/kg+6.7mg/kg)的组合对小鼠进行处理。(C)用9.5x10⁵CFU6206对小鼠进行感染之后1小时，用5mg/kg R347或CIP(20mg/kg或6.7mg/kg)或Bs4-V2L2-2C (1mg/kg或5mg/kg)对小鼠进行处理，或用Bs4-V2L2-2C和CIP(分别为5mg/kg+20mg/kg或5mg/kg+6.7mg/kg或1mg/kg+20mg/kg或1mg/kg+6.7mg/kg)的组合对小鼠进行处理。(D)用9.5x10⁵CFU6206对小鼠进行感染之后2小时，用5mg/kg R347或CIP(20mg/kg或6.7mg/kg)或Bs4-V2L2-2C(1mg/kg或5mg/kg)对小鼠进行处理，或用Bs4-V2L2-2C和CIP(分别为5mg/kg+20mg/kg或5mg/kg+6.7mg/kg或1mg/kg+20mg/kg或1mg/kg+6.7mg/kg)的组合对小鼠进行处理。(E)用9.75x10⁵CFU6206对小鼠进行感染之后2小时用5mg/kg R347或Bs4-V2L2-2C(1mg/kg或5mg/kg)对小鼠进行处理、或在感染后1小时用CIP(20mg/kg或6.7mg/kg)对小鼠进行处理，或在感染后2小时用Bs4-V2L2-2C、并在感染后1小时用CIP(分别为5mg/kg+20mg/kg或5mg/kg+6.7mg/kg或1mg/kg+20mg/kg或1mg/kg+6.7mg/kg)的组合对小鼠进行处理。(C)用9.5x10⁵CFU6206对小鼠进行感染之后1小时，用5mg/kg R347或美罗培南(MEM)(0.75mg/kg或2.3mg/kg)或Bs4-V2L2-2C(1mg/kg或5mg/kg)对小鼠进行处理，或用Bs4-V2L2-2C与MEM(分别为5mg/kg+2.3mg/kg或5mg/kg+0.75mg/kg或1mg/kg+2.3mg/kg或1mg/kg+0.75mg/kg)的组合对小鼠进行处理。(G)用9.75x10⁵CFU6206对小鼠进行感染之前2小时，用5mg/kg R347或Bs4-V2L2-2C(1mg/kg或5mg/kg)对小鼠进行处理、或在感染后1小时用MEM(0.75mg/kg或2.3mg/kg)对小鼠进行处理，或在感染后2小时用Bs4-V2L2-2C、并且在感染后1小时用MEM(分别为5mg/kg+2.3mg/kg或5mg/kg+0.75mg/kg或1mg/kg+ 2.3mg/kg或1mg/kg+0.75mg/kg)的组合对小鼠进行处理。(H)用1x10⁶CFU6206对小鼠进行感染之后2小时，用5mg/kg R347或Bs4-V2L2-2C(1mg/kg或5mg/kg)或MEM(0.75mg/kg或2.3mg/kg)对小鼠进行处理，或用Bs4-V2L2-2C和MEM(各5mg/kg+2.3mg/kg或5mg/kg+0.75mg/kg或1mg/kg+2.3mg/kg或1mg/kg+0.75mg/kg)的组合对小鼠进行处理。(I)用9.25x10⁵CFU6206对小鼠进行感染后4小时，用5mg/kg R347或CIP(6.7mg/kg)或Bs4-V2L2-2C(1mg/kg或5mg/kg)或Bs4-V2L2-2C与CIP(分别为5mg/kg+6.7mg/kg或1mg/kg+6.7mg/kg)的组合对小鼠进行处理。(J)用1.2x106CFU6206对小鼠进行感染后4小时，用5mg/kg R347+CIP(6.7mg/kg)、CIP(6.7mg/kg)或Bs4-V2L2-2C(1mg/kg或5mg/kg)或Bs4-V2L2-2C与CIP(分别为5mg/kg+6.7mg/kg或1mg/kg+6.7mg/kg)的组合对小鼠进行处理。(A-J)与CIP或MEM结合的Bs4抗体增加了抗生素治疗的效力，表明当这些分子结合时具有协同保护。此外，尽管由其自身或与铜绿假单胞菌非特异性抗体结合进行递送的抗生素可以降低或控制肺中的细菌CFU，单用抗生素不能保护小鼠免受这种设定下的杀伤。在这种设定中的最佳保护需要包括Bs4-V2L2-2C与抗生素的组合。

图27(A-C)：双特异性抗体BS4-WT、BS4-GL和BS4-GLO的功能活性的差异：调理吞噬杀灭测定(A)、抗细胞附着测定(B)以及RBC溶胞抗细胞毒性测定(C)。

图28(A-B)：对于在铜绿假单胞菌株预防性(A)或治疗性(B) 设定中激发的小鼠中的致死性肺炎的保护百分比。表中指明了存活百分比，各组比较的动物数在圆括号中标出。破折号表示未测试。

图29(A-B)：在铜绿假单胞菌致死性菌血症模型中，用双特异性抗体Bs4-GLO进行处理的动物的存活率。(A)用6294(O6)(5.58x10⁷CFU)对动物进行腹膜内感染之前24小时，用15mg/kg、5mg/kg、1mg/kg的Bs4-GLO或15mg/kg的R347对动物进行处理。(B)用6206(O11-ExoU⁺)(6.48x10⁶CFU)对动物进行腹膜内感染之前24小时，用5mg/kg、1mg/kg、0.2mg/kg的Bs4-GLO或5mg/kg的R347对动物进行处理。结果表示为卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线；各浓度的BS4-GLO相比于R347的存活的差异通过对数秩检验来计算。(A)所有浓度的Bs4-GLO相比于R347P<0.0001。(B)所有浓度的Bs4-GLO相比于R347P＝0.0003。结果代表三个独立实验。

图30(A-C)：在铜绿假单胞菌热损伤模型中，用Bs4-GLO进行预防性处理(保护)的动物的存活率。(A)在热损伤诱导以及用1.4x10⁵CFU的铜绿假单胞菌株6077(O11-ExoU⁺)直接在伤口下进行皮下感染之前24小时，用15mg/kg、5mg/kg的Bs4-GLO或15mg/kg的R347对动物进行处理。(B)在热损伤诱导以及用4.15x10⁴CFU的铜绿假单胞菌株6206(O11-ExoU⁺)直接在伤口下进行皮下感染之前24小时，用15mg/kg的Bs4-GLO或15mg/kg的R347对动物进行处理。(C)在热损伤诱导以及用7.5x10¹CFU的铜绿假单胞菌株6294(O6)直接在伤口下进行皮下感染之前24小时，用15mg/kg、5mg/kg的Bs4-GLO或15mg/kg的R347对动物进行处理。结果表示为卡普兰 -迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线；各浓度的BS4-GLO相比于R347的存活的差异通过对数秩检验来计算。(A-C)所有浓度的Bs4-GLO相比于R347P<0.0001。结果代表对于各铜绿假单胞菌株的两个独立实验。

图31(A-B)：在铜绿假单胞菌热损伤模型中，用Bs4-GLO进行治疗性处理(治疗)的动物的存活率。(A)在热损伤诱导以及用1.6x10⁵CFU的铜绿假单胞菌株6077(O11-ExoU⁺)直接在伤口下进行皮下感染之后4小时，用42.6mg/kg、15mg/kg的Bs4-GLO或45mg/kg的R347对动物进行处理。(B)在热损伤诱导以及用1.0x10⁵CFU的铜绿假单胞菌株6077(O11-ExoU⁺)直接在伤口下进行皮下感染之后12小时，用15mg/kg、5mg/kg的Bs4-GLO或15mg/kg的R347对动物进行处理。结果表示为卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线；各浓度的BS4-GLO相比于R347的存活的差异通过对数秩检验来计算。(A)两个浓度的Bs4-GLO相比于R347–P＝0.0004。(B)5mg/kg的Bs4-GLO相比于R347-P＝0.048。结果代表两个独立实验。

图32(A-B)：治疗助剂疗法：Bs4GLO+环丙沙星(CIP)：(A)在用9.5x10⁵CFU6206进行感染后4小时，用5mg/kg R347+CIP(6.7mg/kg)或Bs4-WT(1mg/kg或5mg/kg)或Bs4-WT与CIP(各5mg/kg+6.7mg/kg或1mg/kg+6.7mg/kg)的组合对小鼠进行处理。(A)在用9.5x10⁵CFU6206进行感染后4小时，用5mg/kg R347+CIP(6.7mg/kg)或Bs4-GLO(1mg/kg或5mg/kg)或Bs4-GLO与CIP(各5mg/kg+6.7mg/kg或1mg/kg+6.7mg/kg)的组合对小鼠进行处理

图33(A-B)：治疗助剂疗法：Bs4-GLO+美罗培南(MEM)：(A)在用9.5x10⁵CFU6206进行感染后4小时，用5mg/kg R347+MEM(0.75mg/kg)或Bs4-WT(1mg/kg或5mg/kg)或Bs4-WT与MEM(各5mg/kg+0.75mg/kg或1mg/kg+0.75mg/kg)的组合对小鼠进行处理。(A)在用9.5x10⁵CFU6206进行感染后4小时，用5mg/kg R347+MEM(0.75mg/kg)或Bs4-GLO(1mg/kg或5mg/kg)或Bs4-GLO与MEM(各5mg/kg+0.75mg/kg或1mg/kg+0.75mg/kg)的组合对小鼠进行处理。

图34(A-C)：治疗助剂疗法：在致死性菌血症模型中，Bs4-GLO+抗生素。在用铜绿假单胞菌株6294(O6)9.3x10⁷进行腹膜内感染之前24小时，用Bs4-GLO(0.25mg/kg或0.5mg/kg)或R347(阴性对照)对小鼠进行处理。感染后1小时，用(A)1mg/kg CIP、(B)2.5mg/kg MEM或(C)2.5mg/kg TOB对小鼠进行皮下处理。结果表示为卡普兰-迈耶(Kaplan-Meier)存活曲线；各浓度的BS4-GLO相比于R347的存活的差异通过对数秩检验来计算。

图35(A-B)下述Bs4构建体的替代形式的示意性图示：(A)抗PcrV可变区是分别存在于重链和轻链上的，而抗Psl可变区是作为重链的铰链区中的scFv而存在的，以及(B)抗Psl可变区是分别存在于重链和轻链上的，而抗PcrV可变区是作为重链的铰链区中的scFv而存在的。

详细说明

I.定义

应指出的是术语“一个”或“一种”实体是指一个或多个所述实体；例如，“一种特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的结合分子”应理解为代表特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的一种或多种结合分子。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个(一种或多种)”、以及“至少一个”在此可互换地使用。

如在此使用，术语“多肽”旨在涵盖单数“多肽”和复数“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指具有两个或更多个氨基酸的任何一个或多个链，并且不是指产物的具体长度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指具有两个或更多个氨基酸的一个或多个链的任何其他术语包含在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个、或可与其互换地使用。术语“多肽”还旨在指多肽在表达后修饰的产物，包括而不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团来进行的衍生、蛋白水解裂解或通过非天然存在的氨基酸来进行的修饰。多肽可得自天然生物来源或通过重组技术来产生，但是不是必然从一个指定的核酸序列翻译而来。它可以按任何方式、包括通过化学合成来产生。

如在此披露的多肽可以具有约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个，或2,000个或更多个氨基酸的大小。多肽可以具有一种限定的三维结构，但是它们不是必然具有这种结构。具有一种限定的三维结构的多肽被称为折叠的，并且不具有一种限定的三维结构、而是可采用很多不同构象的多肽被称为未折叠的。如在此使用，术语糖蛋白是指联接至至少一个碳水化合物部分的蛋白质，该碳水化合物部分经由一个氨基酸残基(例如一个丝氨酸残基或一个天冬酰胺残基)的一个含氧或含氮侧链来附接至该蛋白质。

一种“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物意指不存在于其天然环境中的一种多肽。不要求特定水平的纯化。例如，一种分离的多肽可以从其天然或自然环境中去除。如同已经通过任何合适的技术来分离、份化或部分地或基本上纯化的天然或重组多肽一样，如在此披露的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质也被视为是分离的。

在此披露的其他多肽是前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，以及其任何组合。在提及一种结合分子像如在此披露的特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的一种抗体时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”、以及“类似物”包括保持对应的天然抗体或多肽的至少一些抗原结合特性的任何多肽。除了在此其他处所讨论的具体抗体片段以外，多肽片段包括例如蛋白水解片段连同缺失片段。结合分子(例如如在此披露的特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的一种抗体)的变体包括如上所述的片段，而且还有由于氨基酸取代、缺失或***而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可天然地存在或非天然地存在。非天然地存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可以包括保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。结合分子(例如如在此披露的特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的一种抗体)的衍生物是已经被改变以便展现在天然多肽上未发现的另外的特征的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在此还可以称为“多肽类似物”。如在此使用，结合分子(例如特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的一种抗体)的“衍生物”是指具有通过官能侧基的反应来化学衍生的一个或多个残基的主题多肽。含有二十种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些肽也作为“衍生物”包括在内。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；并且鸟氨酸可取代赖氨酸。

术语“多核苷酸”旨在涵盖单数核酸连同复数核酸，并且是指一种分离的核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包括常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，如在肽核酸(PNA)中所发现)。术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸节段，例如DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸意指已经从其天然环境中去除的核酸分子DNA或RNA。例如，在一个载体中所包含的编码结合分子(例如特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的一种抗体)的重组多核苷酸被视为是分离的，如在此披露。分离的多核苷酸的另外实例包括维持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分地或基本上)多核苷酸。分离的RNA分子包括多核苷酸的体内或体外RNA转录物。分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的这类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调控元件如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。

如在此使用，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)未被翻译成氨基酸，它可被认为是编码区的一部分，但是任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子、以及类似序列)并非编码区的一部分。两个或更多个编码区可以存在于单一多核苷酸构建体中，例如在单一载体上，或在单独的多核苷酸构建体中，例如在单独(不同)载体上。此外，任何载体可以含有单一编码区，或可以包括两个或更多个编码区，例如单一载体可以单独地编码一个免疫球蛋白重链可变区和一个免疫球蛋白轻链可变区。另外，一个载体、多核苷酸或核酸可以编码异源编码区，这些异源编码区融合或未融合至编码特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的结合分子(例如一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的一种核酸。异源编码区包括但不限于特化的元件或基序，如分泌信号肽或异源功能域。

在一些实施例中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可以包含启动子和/或可操作地与一个或多个编码区相关联的其他转录或翻译控制元件。可操作相关联是针对基因产物(例如多肽)的编码区按以下这种方式与一个或多个调控序列相关联，该方式使得该基因产物的表达处于这种或这些调控序列的影响或控制之下。如果启动子功能的诱导导致编码所希望的基因产物的mRNA的转录，并且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调控序列引导基因产物的表达的能力或不干扰有待转录的DNA模板的能力，那么两个DNA片段(如多肽编码区和与其关联的启动子)“可操作地关联”。因此，启动子区将可操作地与编码多肽的核酸相关联，只要启动子能够实现所述核酸的转录。启动子可以是只在预定细胞中引导DNA的实质性转录的细胞特异性启动子。除了启动子以外，其他转录控制元件例如增强子、操纵子、阻遏子以及转录终止信号可以可操作地与多核苷酸相关联以便引导细胞特异性转录。在此披露了合适的启动子和其他转录控制区。

多种转录控制区是本领域技术人员已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，如但不限于来自巨细胞病毒的启动子和增强子片段(立即早期启动子，它与内含子A相结合)、猿病毒40(早期启动子)以及逆转录病毒(如劳斯(Rous)肉瘤病毒)。其他转录控制区包括得自脊椎动物基因如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素以及兔β球蛋白的那些转录控制区域，连同能够控制真核细胞中的基因表达的其他序列。另外的合适转录控制区包括组织特异性启动子和增强子，连同淋巴因子可诱导的启动子(例如可由干扰素或白介素诱导的启动子)。

类似地，多种翻译控制元件是本领域普通技术人员已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子，以及得自小核糖核酸病毒的元件(特别是内核糖体进入位点，或IRES，也称为CITE序列)。

在其他实施例中，多核苷酸可以是例如处于信使RNA(mRNA)形式的RNA。

多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌肽或信号肽的另外的编码区相关联，这些另外的编码区引导由如在此披露的多核苷酸(例如编码特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸)所编码的多肽的分泌。根据信号假设，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦已经开始将生长的蛋白质链输出横穿粗面内质网，该信号肽或分泌前导序列就从成熟蛋白质上裂解。本领域普通技术人员意识到由脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有融合至多肽的N末端的信号肽，这种信号肽从完整或“全长”多肽上裂解以便产生分泌或“成熟”形式的多肽。在一些实施例中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或保持引导与其可操作关联的多肽的分泌的能力的所述序列的功能衍生物。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽，或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原活化剂(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶的前导序列来取代。

在此披露某些结合分子，或其抗原结合片段、变体或衍生物。除非确切地提及全尺寸的抗体如天然存在的抗体，否则术语“结合分子”涵盖全尺寸抗体连同这类抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如天然存在的抗体或免疫球蛋白分子或工程化的抗体分子或以与抗体分子类似的方式结合抗原的片段。

如在此使用，术语“结合分子”在其最广泛含义上是指特异性地结合抗原决定簇的分子。如在此进一步描述的，结合分子可包含一个或多个在此所述的结合域。如在此使用的，“结合域”包括与抗原决定簇特异性地结合的位点。抗原结合分子的非限制性实例是保持抗原特异性地结合的抗体或其片段。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”在此可互换地使用。如在此披露的抗体或其片段、变体或衍生物包含至少重链的可变域和至少重链和轻链的可变域。脊椎动物***的基本免疫球蛋白结构已得到相对充分地认识。参见例如哈洛(Harlow)等人，抗体：实验室手册(抗体：A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988)。

如以下更详细地讨论，术语“免疫球蛋白”包括可在生物化学上区分的不同广泛类别的多肽。本领域技术人员将认同，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε)，它们之中有一些子类(例如γ1-γ4)。此链的性质是将抗体的“类别”相应地确定为IgG、IgM、IgA IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgG₁、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁等被充分表征，并且已知可赋予功能特化。这些类别和同种型中的每一个的修饰形式在考虑本披露的情况下对于本领域技术人员来说是可容易地辨别的，并且因此在本披露的范围内。

轻链是分类为κ或λ(κ，λ)。每个重链类别可以与κ或λ轻链结合。总体上，轻链和重链彼此共价键合，并且当免疫球蛋白由杂交瘤、B细胞或遗传工程化的宿主细胞来产生时，两个重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价键来彼此键合。在重链中，氨基酸序列从Y构型的分叉端的N末端延伸至每个链底部的C末端。

轻链与重链两者均划分到具有结构和功能同源性的区域之中。术语“恒定”和“可变”是在功能上使用。在这方面，应理解轻(VL)与重(VH)链部分的可变域决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定域赋予重要生物特性如分泌、经胎盘移动性(transplacental mobility)、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区域的编号随着它们变得更远离抗体的抗原结合位点或氨基末端而增加。N末端部分是可变区并且C末端部分是恒定区；CH3和CL域实际上相应地包括重链和轻链的羧基末端。

如上所指示，可变区允许结合分子选择性地识别并且特异性地结合抗原上的表位。即结合分子(例如抗体)的VL域和VH域或互补决定区(CDR)的子集组合以便形成限定三维抗原结合位点的可变区。这种四级结合分子结构形成了抗原结合位点，存在于Y的各臂的端部。更具体的是，该抗原结合位点是由在各VH和VL链上的三个CDR所限定的。

在天然存在的抗体中，存在于每个抗原结合域中的六个“互补决定区”或“CDR”是短的、非连续氨基酸序列，这些氨基酸被特别地定位以便当抗体在水性环境中呈现其三维构型时形成抗原结合域。被称为“框架”区的抗原结合域中的其余氨基酸展示较小分子间变化性。框架区大部分采用β片层构象，并且CDR形成多个环，这些环连接并且在一些情况下形成β片层结构的一部分。因此，框架区起作用以便形成支架，该支架提供通过链间、非共价相互作用将CDR以正确取向来进行定位。由所定位的CDR形成的抗原结合域限定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进抗体与其同族表位的非共价结合。相应地构成CDR和框架区的氨基酸可由本领域普通技术人员针对任何给定的重链或轻链可变区来容易地加以鉴别，因为它们已经得到精确地定义(参见“免疫学上关注的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”卡巴特(Kabat)E.等人，美国卫生和公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，(1983)；以及乔西亚(Chothia)&莱斯克(Lesk)，《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)，196：901-917(1987)，这些文献是通过引用以其全部内部结合在此)。

在本领域内使用和/或接受的术语存在两个或更多个定义的情况下，如在此使用的术语的定义旨在包括所有这类含义，除非明确地说明相反情形。具体实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述在重链与轻链多肽两者的可变区中所发现的非连续抗原组合位点。这一具体区已经由卡巴特等人、美国卫生和公众服务部、“免疫学上关注的蛋白质序列”(1983)、以及乔西亚等人，《分子生物学杂志》196：901-917(1987)来描述，这些文献是通过引用结合在此，其中这些定义包括在彼此相比较时的重叠氨基酸残基或氨基酸残基的子集。然而，应用任一定义来指抗体或其变体的CDR旨在处于如在此所定义并且使用的术语的范围内。构成由以上所引用的每一参考文献所定义的CDR的适当氨基酸残基在下表I中予以阐明以便进行比较。构成具体CDR的精确残基编号将取决于CDR的序列和大小而变化。在给定抗体的可变区氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可常规地确定哪些残基构成了具体CDR。

表1：CDR定义¹

¹表1中所有CDR定义的编号

均按照卡巴特(Kabat)等人提出的编号规定(如下)。

卡巴特(Kabat)等人还定义了可变域序列的可适用于任何抗体的编号***。本领域普通技术人员可明确地将此“卡巴特编号”***指派给任何可变域序列，而不需依赖超出序列本身的任何实验数据。如在此所使用，“卡巴特编号”是指由卡巴特(Kabat)等人、美国卫生和公众服务部、“免疫学上关注的蛋白序列”(1983)所阐明的编号***。除非另外规定，否则提及特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的结合分子(例如如在此披露的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)中的具体氨基酸残基位置的编号是根据卡巴特编号***。

结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫化物连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH域的片段、由Fab表达文库产生的片段。ScFv分子在本领域中是已知的并且描述于例如美国专利5,892,019之中。本披露涵盖的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、以及IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、以及IgA2)或子类。

“特异性地结合”一般是指结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物经由其抗原结合域来结合至表位，并且这种结合需要抗原结合域与表位之间有某种互补性。根据此定义，当与结合分子将结合至随机、不相关的表位相比，该结合分子更容易经由其抗原结合域来结合至一个表位时，该结合分子被认为是“特异性地结合至”该表位。术语“特异性”在此用于对某种结合分子结合至某种表位的相对亲和力进行定性。例如，与结合分子“B”相比，结合分子“A”可被视为针对给定的表位具有较高特异性，或与结合分子“A”针对相关表位“D”所具有的特异性相比，结合分子“A”可被认为以较高特异性地结合至表位“C”。

“优先结合”是指与抗体结合至相关、相似、同源或类似表位相比，该抗体更容易特异性地结合至一个表位。因此，与结合至相关表位相比，“优先结合”至给定表位的抗体将更可能结合至所述表位，即使这种抗体可以与相关表位交叉反应。

举非限制性实例来说，如果结合分子(例如抗体)结合第一表位的解离常数(K_D)小于该抗体针对第二表位的K_D，那么它可以被认为是优先结合该第一表位。在另一个非限制性实例中，如果结合分子(如抗体)结合第一表位的亲和力比该抗体针对第二表位的K_D小至少一个数量级，那么它可被认为是优先结合第一抗原。在另一个非限制性实例中，如果结合分子结合第一表位的亲和力比该抗体针对第二表位的K_D小至少两个数量级，那么它可被认为是优先结合第一表位。

在另一个非限制性实例中，如果结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)结合第一表位的解离速率(k(off))小于该抗体针对第二表位的k(off)，那么它可被认为是优先结合该第一表位。在另一个非限制性实例中，如果结合分子结合第一表位的亲和力比该抗体针对第二表位的k(off)小至少一个数量级，那么它可被认为是优先结合该第一表位。在另一个非限制性实例中，如果结合分子结合第一表位的亲和力比该抗体针对第二表位的k(off)小至少两个数量级，那么它可被认为是优先结合第一表位。

结合分子(例如在此披露的抗体或其片段、变体或衍生物)可被认为以小于或等于5X10^-2sec^-1、10^-2sec^-1、5X10^-3sec^-1或10^-3sec^-1的解离速率(k(off))来结合靶标抗原，例如在此披露的多糖或其片段或变体。在此所披露的结合分子可与靶抗原结合，该靶抗原例如是解离速率(k(off))小于或等于5x10^-4sec^-1、10^-4sec^-1、5x10^-5sec^-1或10^-5sec^-15x10^-6sec^-1、10^-6sec^-1、5x10^-7sec^-1或10^-7sec^-1的多糖。

结合分子，例如在此所披露的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可与靶抗原结合，该靶抗原例如是结合速率(k(on))大于或等于10³M^-1sec^-1、5X10³M^-1sec^-1、10⁴M^-1sec^-1或5X10⁴M^-1sec^-1的多糖。在此所披露的结合分子可与靶抗原结合，该靶抗原例如是结合速率(k(on))大于或等于10⁵M^-1sec^-1、5X10⁵M^-1sec^-1、10⁶M^-1sec^-1或5X10⁶M^-1sec^-1或10⁷M^-1sec^-1的多糖。

结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)被认为竞争性地抑制参考抗体或抗原结合片段与给定表位的结合，如果它优先结合至所述表位至它在某种程度上阻断参考抗体或抗原结合片段与该表位的结合的程度的话。竞争性地抑制可以通过在本领域中已知的任何方法、例如竞争ELISA测定来确定。结合分子可被认为是竞争性地抑制参考抗体或抗原结合片段与给定表位的结合达至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、或至少50％。

如在此使用，术语“亲和力”是指单独表位与免疫球蛋白分子的CDR的结合强度的度量。参见例如哈洛(Harlow)等人，《抗体：实验室手册》(Antibodies:A LaboratoryManual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988)，第27-28页。如在此使用，术语“亲合力”是指免疫球蛋白群体与抗原之间的复合物的总体稳定性，即免疫球蛋白混合物与抗原的功能组合强度。参见例如哈洛(Harlow)，第29-34页。亲合力与群体中的单独免疫球蛋白分子与特定表位的的亲和力相关，并且还与免疫球蛋白和抗原的效价相关。例如，二价单克隆抗体与具有高度重复表位结构如聚合物的抗原之间的相互作用将是高亲合力的相互作用。

如在此披露的结合分子或其抗原结合片段、变体或衍生物还可在它们的交叉反应性方面来描述或规定。如在此使用，术语“交叉反应性”是指对于一种抗原具有特异性的结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)与第二种抗原反应的能力；它是两种不同抗原性物质之间的关联性的度量。因此，如果结合分子结合至除了诱导其形成的表位以外的表位，那么它具有交叉反应性。交叉反应性表位一般含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下，可实际上比原始表位更合宜。

结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)还可以在它们与抗原的结合亲和力方面来描述或规定。例如，结合分子可以按不大于5x10^-2M、10^-2M、5x10^-3M、10^-3M、5x10^-4M、10^-4M、5x10^-5M、10^-5M、5x10^-6M、10^-6M、5x10^-7M、10^-7M、5x10^-8M、10^-8M、5x10^-9M、10^-9M、5x10^-10M、10^-10M、5x10^-11M、10^-11M、5x10^-12M、10^-12M、5x10^-13M、10^-13M、5x10^-14M、10^-14M、5x10^-15M或10^-15M的解离常数或KD来结合至抗原。

包括单链抗体的抗体片段可以包含单独的或与以下结构的全部或一部分相组合的一个或多个可变区：铰链区、CH1、CH2、以及CH3域。还包含一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2、以及CH3域的任何组合的抗原结合片段也包括在内。结合分子(例如在此披露的抗体或其抗原结合片段)可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。抗体可以是人类、鼠类、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡抗体。在另一个实施例中，可变区可以是软骨类动物(condricthoid)来源(例如来自鲨鱼)。如在此使用，“人类”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体、并且包括从人免疫球蛋白文库分离的抗体或来自针对一种或多种人免疫球蛋白转基因并且不表达内源性免疫球蛋白的动物，如下文和例如库彻拉帕提(Kucherlapati)等人的美国专利号5,939,598中所描述。

如在此使用，术语“重链部分”包括得自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。结合分子，例如抗体，包含一个重链部分，该重链部分包含下列所述中的至少一个：CH1域、绞链(例如上、中和/或下铰链区)域、CH2域、CH3域、或其变体或片段。例如，结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)可以包括：包含CH1域的多肽链；包含CH1域、铰链域的至少一部分、以及CH2域的多肽链；包含CH1域和CH3域的多肽链；包含CH1域、铰链域的至少一部分、以及CH3域的多肽链；或包含CH1域、铰链域的至少一部分、CH2域、以及CH3域的多肽链。在另一个实施例中，结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)包括包含CH3域的多肽链。此外，用于在本披露中使用的结合分子可以缺乏CH2域的至少一部分(例如CH2域的全部或一部分)。如以上所阐明，本领域普通技术人员应了解这些域(例如重链部分)可被修饰成使得它们在氨基酸序列上不同于天然存在的免疫球蛋白分子。

结合分子(例如如在此披露的抗体)的重链部分可得自不同免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含得自IgG1分子的CH1域和得自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包含部分地得自IgG1分子并且部分地得自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包含部分地得自IgG1分子并且部分地得自IgG4分子的嵌合铰链。

如在此使用，术语“轻链部分”包括得自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链部分包含VL或CL域中的至少一个。

结合分子(例如在此披露的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可以在抗原的一个或多个表位或一个或多个部分(例如它们识别或特异性地结合的靶标多糖)方面来描述或规定。与抗体的抗原结合域特异性相互作用的靶标多糖的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶标抗原例如多糖可以包含单一表位，但是典型地包含至少两个表位，并且取决于抗原的大小、构象以及类型，可以包含任何数目的表位。

如先前所指示，不同免疫球蛋白类别的恒定区的亚单位结构和三维构型是熟知的。如在此使用，术语“VH域”包含免疫球蛋白重链的氨基末端可变域并且术语“CH1域”包括免疫球蛋白重链的第一(最氨基末端的)恒定区域。CH1域与VH域相邻并且在免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。

如在此使用，术语“CH2域”包括重链分子的、例如使用常规编号方案从抗体的约残基244延伸至残基360的那部分(残基244至360，卡巴特编号***；并且残基231-340，EU编号***；参见卡巴特EA等人的前述文献(op.cit.)。CH2域的独特性在于它不与另一个域紧密地配对。而是，两个N连接的分支碳水化合物链***完整的天然IgG分子的两个CH2域之间。还被文献充分证明的是CH3域从CH2域延伸至IgG分子的的C末端并且包含近似108个残基。

如在此使用，术语“铰链区”包括重链分子的将CH1域接合至CH2域的那部分。这个铰链区包含近似25个残基并且是柔性的，由此允许两个N末端抗原结合区独立地移动。铰链区可细分成三个相异的域：上、中、以及下铰链域(鲁(Roux)等人，《免疫学杂志》(J.Immunol.)161：4083(1998))。

如在此使用，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可以与第二硫醇基形成二硫键或二硫桥的硫醇基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键来连接并且两个重链通过使用卡巴特编号***在对应于239和242的位置(EU编号***的位置226或229) 处的两个二硫键来连接。

如在此使用，术语“嵌合抗体”将用来指其中免疫反应区或位点从第一种类获得或得到并且恒定区(可为完整的、部分的或修饰的)从第二种类获得的任何抗体。在一些实施例中，靶标结合区或位点将来自非人来源(例如小鼠或灵长类动物)并且恒定区是来自人。

在此所使用的术语“双特异性抗体”是指在单个抗体分子中具有用于两个不同抗原的结合位点的抗体。应领会，除了标准抗体结构以外，其他分子也可被构建成具有两种结合特异性。进一步领会的是，抗原可同时地或顺序地与双特异性抗体相结合。三源杂交瘤和杂交杂交瘤是可以分泌双特异性抗体的细胞系的两个实例。还可以用重组体的方式对双特异性抗体进行构建和Heiss，《未来肿瘤学》(Future Oncol.)6：1387-94(2010)；马布里(Mabry)和Snavely，《药物调查》(IDrugs.)13(543-9；n＝2010)。

如在此使用，术语“工程化的抗体”是指重链和轻链中任一者或两者中的可变域是通过至少部分替换来自具有已知特异性的抗体的一个或多个CDR并且如果有必要通过部分框架区替换和序列变化来改变的抗体。虽然CDR可得自与Mabry框架区所得自的抗体相同的类别或甚至子类别的抗体，但是设想CDR将得自不同类别的抗体并且优选来自不同种类的抗体。其中来自具有已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”CDR被移植至人重链或轻链框架区中的工程化的抗体在此称为“人源化抗体”。可能不必用来自供体可变区的完整CDR来替换所有CDR以便将一个可变域的抗原结合能力转移至另一个。而是，可能只需要转移维持靶标结合位点的活性所必需的那些残基。考虑到例如美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762、以及6,180,370中所阐明的解释，本领域技术人员完全有能力通过进行常规实验或通过逐次逼近试验(trial and error testing)来获得功能工程化或人源化的抗体。

如在此使用，术语“正确折叠的多肽”包括其中包含多肽的所有功能域具有明显活性的多肽(例如，抗假单胞菌Psl和PcrV抗体)。如在此使用，术语“不正确折叠的多肽”包括其中多肽的至少一个功能域不具有活性的多肽。在一个实施例中，正确折叠的多肽包含通过至少一个二硫键来连接的多肽链，并且相反地，不正确折叠的多肽包含未通过至少一个二硫键来连接的多肽链。

如在此使用，术语“工程化”包括通过合成手段(例如重组技术、体外肽合成、通过肽的酶促或化学偶合、或这些技术的某种组合)来操纵核酸或多肽分子。

如在此使用，术语“连接”、“融合(fused)”或“融合(fusion)”可互换使用。这些术语是指通过包括化学轭合或重组手段的任何手段将两个更多个元件或组分连接在一起。“框内融合”是指连接两个或更多个多核苷酸开放阅读框架(ORF)以便以维持原始ORF的正确翻译阅读框架的方式来形成连续更长的ORF。因此，重组融合蛋白是含有对应于由原始ORF编码的多肽的两个或更多个节段的单一蛋白质(这些节段在天然地通常并不这样连接。)虽然阅读框架由此在整个融合节段上被致使连续，但是这些节段可以被例如框内接头序列在物理上或空间上分离。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可框内融合，但是被编码至少一个免疫球蛋白框架区或另外的CDR区的多核苷酸分离，只要“融合的”CDR作为连续多肽的一部分来共翻译即可。

在多肽的情况下，“线性序列”或“序列”是多肽中的在氨基至羧基末端方向上的氨基酸顺序，其中在多肽的一级结构中，在序列上彼此邻接的残基是连续的。

如在此使用的术语“表达”是指基因产生生物化学物质例如多肽的过程。该过程包括基因在细胞内的功能性存在的任何表现，包括但不限于基因敲除和瞬态表达与稳定表达两者。它包括而不限于将基因转录成信使RNA(mRNA)，和将这种mRNA翻译成多肽。如果最终所希望的产物是生物化学物质，那么表达包括所述生物化学物质和任何前体的产生。基因的表达产生“基因产物”。如在此使用，基因产物可以是核酸，例如通过基因转录来产生的信使RNA，或从转录物翻译的多肽。在此描述的基因产物进一步包括具有转录后修饰(例如多聚腺苷酸化)的核酸，或具有翻译后修饰(例如甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白质亚单位相关联、蛋白裂解等)的多肽。

如在此使用，术语“处理(treat)”或“治疗(treatment)”是指治疗性处理和预防(prophylactic)或预防(preventative)措施，其中目标是预防或减缓(减轻)不希望的生理变化、感染或病症。有益或所希望的临床结果包括但不限于缓解症状、减小疾病程度、疾病病况稳定化(即不恶化)、清除或减少受试者体内的感染剂如铜绿假单胞菌、延迟或减缓疾病进展、改善或缓和疾病病况、以及减轻(不论部分或完全)，不论可检测到或不可检测到。“治疗”还可意指如与未接受治疗时的预期存活相比，延长存活。需要治疗的那些包括已经患有感染、病状或病症的那些，连同倾向于患有病状或病症的那些，或病状或病症有待预防的那些，例如在易患铜绿假单胞菌感染的烧伤患者或免疫抑制患者中。

“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物，”是指希望诊断、预后或治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括人、家畜、农畜，以及动物园、体育或宠物动物如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、牛、奶牛、熊等。

如在此所使用的，例如“会受益于给予抗假单胞菌Psl和PcrV结合域或结合分子的受试者”以及“需要治疗的动物”的短语包括会受益于给予抗假单胞菌Psl和PcrV结合域或结合分子(如包含一个或更多个结合域的抗体)的受试者(如哺乳动物受试者)。这类结合域或结合分子可被用于例如对假单胞菌Psl或PcrV进行检测(例如用于诊断过程)和/或进行治疗，即用抗假单胞菌Psl和PcrV结合分子缓解或预防疾病。如在此更详细地描述，抗假单胞菌Psl和PcrV结合分子可以按未轭合的形式来使用或可以轭合至例如药物、前药或同位素。

在此所使用的术语“协同效应”是指大于由化合物的组合所产生的累加的治疗效应的效应，其中由该组合获得的治疗效应超过了以另外方式由单独给予单化合物所导致的累加效应。某些实施例包括在对假单胞菌感染的治疗中产生的协同效应的方法，其中所述效应是比相应的累加效应大至少5％、至少 10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少500％或至少1000％。

“共给药”是指给予不同的化合物，如抗Psl与抗PcrV结合域，或包含抗Ps1和抗PcrV结合域中的一个或两个的结合分子，使得这些化合物可引发抗假单胞菌免疫的协同效应。这些化合物可以按相同的或不同的组合物来给予，如果分别给予，两两相邻给予通常是在24小时内，并且更典型地是在大约1-8小时内，并且甚至更典型的是在1-4小时内或接近于同时给予。其相对量是可实现所期望的协同的剂量。

II.结合域和结合分子

与Psl结合的抗体以及使用这些抗体的形式已经在本领域中得以描述。参见，例如，在2012年6月8日提交的国际申请号PCT/US2012/041538以及在2012年11月6日提交的PCT/US2012/63639(律师案卷号AEMS-115WO1，标题为“多特异性和多价结合蛋白及其应用”)，将其通过引用以其全文结合在此。

一个实施例是针对与假单胞菌PcrV特异性地结合的结合域，其中结合可破坏III型毒素分泌***的活性。在某些实施例中，结合域具有与抗体V2L2相同的假单胞菌结合特异性。

另一个实施例是针对与假单胞菌Psl或PcrV特异性地结合的结合域，其中给予两个结合域可通过下述方式导致针对假单胞菌感染的协同效应：(a)抑制铜绿假单胞菌对上皮细胞的附着，(b)促进、介导或增强铜绿假单胞菌的调理吞噬杀灭(OPK)，(c)抑制铜绿假单胞菌对上皮细胞的附着，或(d)破坏III型毒素分泌***的活性。在某些实施例中，结合域具有与抗体Cam-003、WapR-004、V2L2或29D2相同的假单胞菌结合活性。

其他实施例是针对包含了与假单胞菌Psl和/或PcrV特异性地结合的一种或两种结合域的一种或多种分离的结合分子，其中给予结合分子可导致针对假单胞菌感染的协同效应。在某些实施例中，结合分子可包含来自抗体或其片段的结合域，这些抗体或其片段包括但不限于Cam-003、WapR-004、V2L2或29D22。

如在此使用，术语“结合域”或“抗原结合域”包括特异性地结合抗原上的表位(例如假单胞菌Psl或PcrV的表位)的位点。抗体的抗原结合域典型地包括免疫球蛋白重链可变区的至少一部分和免疫球蛋白轻链可变区的至少一部分。由这些可变区形成的结合位点决定了抗体的特异性。

本披露更具体地是针对一种包含至少两个抗假单胞菌结合域的组合物，其中一个结合域与Psl特异性地结合，而另一个结合域是与PcrV特异性地结合。在一个实施例中，该组合物包含一个结合域，如一种包含了WapR-004、Cam-003、Cam-004、Cam-005、WapR-001、WapR-002、WapR-003或WapR-016的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)区域的抗体或其抗原结合片段一样，该结合域与同一种假单胞菌Psl表位特异性地结合。在某些实施例中，如一种包含了V2L2或29D2的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段一样，该第二结合域与同一种假单胞菌PcrV表位特异性地结合。

在一个实施例中，该组合物包含一个结合域，该结合域与假单胞菌Psl特异性地结合，和/或竞争性地抑制假单胞菌Psl与包含了WapR-004、Cam-003、Cam-004、Cam-005、WapR-001、WapR-002、WapR-003或WapR-016的VH和VL的抗体或其抗原结合片段的结合。在某些实施例中，该第二结合域与相同的假单胞菌PcrV表位特异性地结合，和/或竞争性地抑制假单胞菌PcrV与包含了V2L2或29D2的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的抗体或其抗原结合片段的结合。

另一个实施例是针对一种分离的结合分子，例如，如一种包含了V2L2或29D2的VH和VL区的抗体或其抗原结合片段一样，特异性地结合至同一种假单胞菌PcrV表位的一种抗体或其抗原结合片段。

还包括一种分离的结合分子，例如，特异性地结合至假单胞菌PcrV、并且竞争性地抑制假单胞菌PcrV与包含了V2L2或29D2的VH和VL的抗体或其抗原结合片段的结合的一种抗体或其片段。

一个实施例是针对一种分离的结合分子，例如，如一种包含了WapR-001、WapR-002或WapR-003的VH和VL区的抗体或其抗原结合片段一样，特异性地结合至与同一种假单胞菌Psl表位的一种抗体或其抗原结合片段。

还包括一种分离的结合分子，例如，特异性地结合至假单胞菌Psl、并且竞争性地抑制假单胞菌Psl与包含WapR-001、WapR-002或WapR-003的VH和VL的抗体或其抗原结合片段的结合的一种抗体或其片段。

进一步包含了一种分离的结合分子，例如，如一种包含了WapR-016的VH和VL的抗体或其抗原结合片段一样，特异性地结合至同一种假单胞菌Psl表位的一种抗体或其片段。

还包括一种分离的结合分子，例如，特异性地结合至假单胞菌Psl、并且竞争性地抑制假单胞菌Psl与包含WapR-016的VH和VL的抗体或其抗原结合片段的结合的一种抗体或其片段。

制作抗体的方法在本领域中是熟知的并且在此进行描述。一旦已经产生没有信号序列的针对不同片段或全长假单胞菌Psl或PcrV的抗体，确定抗体或抗原结合片段结合假单胞菌Psl或PcrV的哪些氨基酸或表位可以通过如在此描述的表位作图方案连同在本领域中已知的方法来确定(例如如在奥苏贝尔(Ausubel)等人编著的《当代分子生物学方案》(Current Protocols in Molecular Biology)第2版，约翰&威利父子公司(John Wiley&Sons，Inc.)(1996)的“第11章-免疫学”中描述的双抗体夹心ELISA)。另外的表位作图方案可见莫理斯(Morris)G.，《表位作图方案》(Epitope Mapping Protocols)，新泽西州：Humana出版社(1996)中，这两者均通过引用以其全文结合在此。表位作图还可以通过可商购的装置(即ProtoPROBE公司(威斯康星州密尔沃基市(Milwaukee))来执行。

在某些方面，本披露是针对一种结合分子，例如以特征为解离常数(K_D)小于针对所述参考单克隆抗体的K_D的亲和力来特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的抗体或其片段、变体或衍生物。

在某些实施例中，一种抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子，例如在此所披露的一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，与Psl或PcrV中的至少一种表位特异性地结合，即与无关的或随机的表位的结合相比，其更易于与这种表位结合；与Psl或PcrV中的至少一种表位优先结合，即与相关的、相似的、同源的或同功的表位的结合相比，其更易于与这种表位结合；竞争性地抑制一种参考抗体的结合，这种参考抗体本身可与某一种Psl或PcrV表位特异性地或优先地结合；或与Psl或PcrV中的至少一种表位结合，其亲和力特征为解离常数K_D小于大约5x10^-2M、大约10^-2M、大约5x10^-3M、大约10^-3M、大约5x10^-4M、大约10^-4M、大约5x10^-5M、大约10^-5M、大约5x10^-6M、大约10^-6M、大约5x10^-7M、大约10^-7M、大约5x10^-8M、大约10^- ⁸M、大约5x10^-9M、大约10^-9M、大约5x10^-10M、大约10^-10M、大约5x10^-11M、大约10^-11M、大约5x10^- ¹²M、大约10^-12M、大约5x10^-13M、大约10^-13M、大约5x10^-14M、大约10^-14M、大约5x10^-15M或大约10^-15M。

如在结合解离常数的情况下所使用，术语“大约”允许在用于测量抗体亲和力的方法中的固有的变化性。例如，取决于所使用的仪器的精确度水平、基于所测量的样品数量的标准误差、以及舍入误差，术语“约10^-2M”可以包括例如从0.05M至0.005M。

在具体的实施例中，结合分子，例如一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，与假单胞菌Psl和/或PcrV结合，解离速率(k(off))小于或等于5x10^-2sec^-1、10^-2sec^-1、5x10^-3sec^-1或10^-3sec^-1。可替代地，一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物与假单胞菌Psl和/或PcrV结合，解离速率(k(off))小于或等于5X10^-4sec^-1、10^-4sec^-1、5X10^-5sec^-1、or10^- ⁵sec^-15X10^-6sec^-1、10^-6sec^-1、5X10^-7sec^-1或10^-7sec^-1。

在其他实施例中，一种结合分子，例如如在此披露的一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，与假单胞菌Psl和/或PcrV结合，结合速率(k(on))大于或等于10³M^-1sec^-1、5X10³M^-1sec^-1、10⁴M^-1sec^-1或5X10⁴M^-1sec^-1。可替代的，一种结合分子，例如如在此披露的一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，与假单胞菌Psl和/或PcrV结合，结合速率(k(on))大于或等于10⁵M^-1sec^-1、5X10⁵M^-1sec^-1、10⁶M^-1sec^-1、或5X106M^-1sec^-1或10⁷M^-1sec^-1。

在不同实施例中，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子，例如如在此描述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物促进假单胞菌的调理吞噬杀伤，或抑制假单胞菌结合至上皮细胞上。在在此描述的某些实施例中，假单胞菌Psl或PcrV靶标是铜绿假单胞菌Psl或PcrV。在其他实施例中，在此描述的某些结合分子可以结合至在结构上相关的多糖分子，而不论其来源如何。此类Psl样分子将预期与铜绿假单胞菌Psl相同或具有足够的结构关联性，以便允许由所披露的一种或多种结合分子来特异性识别。在其他实施例中，在此描述的某些结合分子可以结合至在结构上相关的多肽分子，而不论其来源如何。此类PcrV样分子将预期与铜绿假单胞菌PcrV相同或具有足够的结构关联性，以便允许由所披露的一种或多种结合分子来特异性识别。因此，例如在此描述的某些结合分子可以结合至由其他细菌菌种产生的Psl样和/或PcrV样分子，例如，由其他假单胞菌菌种，例如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或产碱假单胞菌产生的Psl样和/或PcrV样分子。可替代地，如在此描述的某些结合分子可以结合至以合成方式产生的或由被遗传修饰以便产生Psl样和/或PcrV样分子的宿主细胞所产生的Psl样和/或PcrV样分子。

除非确切地描述，否则如在此关于结合分子(例如抗体)所使用的“其片段”是指抗原结合片段，即，特异性地结合至抗原的抗体的一部分。

抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，可以包含介导一种或多种效应子功能的恒定区。例如，补体的C1组分与抗体恒定区的结合可以活化补体***。补体的活化在病原体的调理作用和溶解方面是重要的。补体的活化还刺激炎症应答并且还可以涉及在自身免疫性超敏反应之中。此外，抗体经由Fc区来结合至不同细胞上的受体，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合至细胞上的Fc受体(FcR)。存在许多对于不同类别的抗体具有特异性的Fc受体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)、以及IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发许多重要并且多样的生物应答，包括抗体包覆的颗粒的吞噬和破环、免疫复合物的清除、杀伤细胞溶解抗体包覆的靶标细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)、炎症介体的释放、胎盘转移、以及对免疫球蛋白产生的控制。

因此，在此披露的某些实施例包括一种抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中一个或多个恒定区域的至少一部分已经缺失或以其他方式改变以便提供所希望的生物化学特性，如在与具有近似相同免疫原性的完整、未改变的抗体相比较时，效应子功能减小、非共价二聚化的能力、定位在肿瘤位点的能力增加、血清半衰期减小，或血清半衰期增加。例如，在此描述的某些结合分子是域缺失抗体，这些抗体包含与免疫球蛋白重链类似的多肽链，但是缺乏一个或多个重链域的至少一部分。例如，在某些抗体中，所修饰抗体的恒定区的一个完整域缺失，例如，CH2域的全部或一部分将缺失。

修饰形式的抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，可以使用在本领域中已知的技术由完整前体或母体抗体来制得。示例性技术在此其他处讨论。

在某些实施例中，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或抗原结合片段)的可变区与恒定区两者是完全人的。完全人类抗体可以使用本领域中已知并且如在此描述的技术来制得。例如，针对特定抗原的完全人类抗体可以通过将抗原给予转基因动物来制备，该转基因动物已经被修饰以便应答于抗原性激发来产生这类抗体，但是其内源性基因座已经去能。可用于制作这类抗体的示例性技术被描述于美国专利6,150,584、6,458,592、6,420,140中。其他技术在本领域中是已知的。完全人类抗体可同样地通过不同展示技术来产生，例如噬菌体展示或其他病毒展示***，如在此其他处所更详细地描述。

抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如如在此披露的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可以使用本领域中已知的技术来制作或制造。在某些实施例中，结合分子或其片段是“重组产生”，即使用重组DNA技术来产生。制作抗体分子或其片段的示例性技术在此其他处更详细地讨论。

在某些抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如在此描述的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)中，Fc部分可以使用在本领域中已知的技术来突变以便降低效应子功能。例如，恒定区的缺失或失活(经由点突变或其他手段)可减少循环的修饰抗体的Fc受体结合，从而增加肿瘤定位。在其他情况下，恒定区修饰可以缓和补体结合并且因而减少轭合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性关联。恒定区的又其他修饰可以用于修饰二硫键或寡糖部分，从而允许由于抗原特异性或抗体灵活性增加而增强定位。这些修饰所产生的生理学轮廓、生物利用率、以及其他生物化学作用，如定位、生物分布、以及血清半衰期可在适当实验的情况下使用熟知免疫技术来容易地测量并且量化。

在某些实施例中，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)将不会在有待治疗的动物例如人体内引起有害免疫应答。在一个实施例中，使用本领域认识到的技术来修饰抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)以便减少它们的免疫原性。例如，抗体可人源化、去免疫化或可制作嵌合抗体。这些类型的抗体得自非人类抗体、典型地鼠类或灵长类动物抗体，保留或大致上保留母体抗体的抗原结合特性，但是在人体内免疫原性较小。这可以通过不同方法来实现，包括(a)将整个非人类可变域移植至人类恒定区上以便产生嵌合抗体；(b)在保留或不保留关键框架残基的情况下，将一个或多个非人类互补决定区(CDR)的至少一部分移植至人类框架和恒定区之中；或(c)移入整个非人类可变域，但是通过替换表面残基来用人类样部分“遮掩”这些可变域。这类方法披露于莫里森(Morrison)等人，《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.)81：6851-6855(1984)；莫里森等人，《免疫学进展》(Adv.Immunol.)44：65-92(1988)；费尔海恩(Verhoeyen)等人，《科学》(Science)239：1534-1536(1988)；巴丹(Padlan)，《分子免疫学杂志》(Molec.Immun.)28：489-498(1991)；巴丹，《分子免疫学杂志》31：169-217(1994)、以及美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,762以及6,190,370中，特此将所有文献通过引用以其全文结合。

去免疫化也可以用于降低抗体的免疫原性。如在此使用，术语“去免疫化”包括改变抗体以便修饰T细胞表位(参见，例如WO9852976A1、WO0034317A2)。例如，将来自起始抗体的VH和VL序列加以分析，并且来自每个V区的人类T细胞表位“作图”显示表位相对于互补决定区(CDR)和序列内的其他关键残基的位置。将来自T细胞表位作图的单独T细胞表位加以分析以便鉴别具有改变最终抗体的活性的低风险的替代氨基酸取代。一系列替代VH和VL序列被设计成包含氨基酸取代的组合，并且这些序列随后并入一系列结合多肽，例如在此披露的假单胞菌Psl和/或PcrV特异性抗体或其抗原结合片段中，然后对这些序列进行功能测试。然后，将包含修饰的V和人类C区的完整重链和轻链基因克隆至表达载体中并且将后续质粒引入细胞系中以便产生完整抗体。然后在合适生物化学和生物测定中比较抗体，并且鉴别最佳变体。

抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以通过在本领域中已知的任何合适方法来产生。针对所感兴趣的抗原的多克隆抗体可以通过本领域中熟知的不同程序来产生。例如，抗假单胞菌Psl和/或PcrV抗体或其抗原结合片段可以给予不同宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、鸡、仓鼠、山羊、驴等，以便诱导含有对于抗原具有特异性的多克隆抗体的血清的产生。取决于宿主种类，可以使用不同的佐剂来增加免疫应答，并且这些佐剂包括但不限于弗氏佐剂(Freund's)(完全的和不完全的)、矿物胶(如，氢氧化铝)、表面活性物质(如溶血卵磷脂)、普卢兰尼克多元醇(pluronicpolyol)、聚阴离子、肽、油乳剂、钥孔虫戚血蓝蛋白、二硝基苯酚、以及潜在有用的人用佐剂(如BCG(卡介苗))和短小棒状杆菌。此类佐剂在本领域也是已知的。

可以使用本领域已知的多种多样的技术来制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组、以及噬菌体展示技术、或其组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术来产生，包括在本领域中已知并且例如在哈洛等人，《抗体：实验室手册》(冷泉港实验室出版社，第2版(1988)中传授的那些杂交瘤技术。

DNA编码抗体或抗体片段(例如抗原结合位点)还可以得自抗体文库，如噬菌体展示文库。具体的说，这种噬菌体可用于展示从谱系或组合抗体文库(例如，人或鼠类)表达的抗原结合域。表达结合所感兴趣的抗原的抗原结合域的噬菌体可以用抗原来选择或鉴别，例如，使用标记的抗原或结合或捕获于固体表面或珠粒上的抗原。这些方法中所使用的噬菌体典型地是丝状噬菌体，该噬菌体包含从具有scFv、Fab、Fv OE DAB(来自轻链或重链的单独Fv区)的噬菌体表达的fd和M13结合域或重组融合至噬菌体基因III或基因VIII蛋白的二硫化物稳定的Fv抗体域。示例性方法阐明于例如EP368684B1；美国专利5,969,108；胡根伯姆(Hoogenboom)H.R.和查恩斯(Chames)，《当代免疫学》(Immunol.Today)21：371(2000)；纳吉(Nagy)等人，《自然：医学》(Nat.Med.)，8：801(2002)；休伊(Huie)等人，《美国国家科学院院刊》，98：2682(2001)；吕(Lui)等人，《分子生物学杂志》，315：1063(2002)，这些文献各自通过引用结合在此。一些出版物(例如迈克斯(Marks)等人，《生物技术》(Bio/Technology)10：779-783(1992))已经描述高亲和力人抗体通过链改组的产生，连同作为构建大噬菌体文库的策略的组合感染与体内重组。在另一个实施例中，核糖体展示可以用于替换噬菌体作为展示平台(参见例如哈尼斯(Hanes)等人，《自然：生物技术》(Nat.Biotechnol.)18：1287(2000)；威尔逊(Wilson)等人，《美国国家科学院院刊》98：3750(2001)；或欧文(Irving)等人，《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Methods)248：31(2001))。在又另一个实施例中，可将细胞表面文库针对抗体加以筛选(博德(Boder)等人，《美国国家科学院院刊》97：10701(2000)；多尔蒂(Daugherty)等人，《免疫学方法杂志》243：211(2000))。这类程序提供用于分离并且后续克隆单克隆抗体的传统杂交瘤细胞的替代方案。

在噬菌体展示方法中，将功能抗体域展示在噬菌体颗粒表面上，这些颗粒携带对其进行编码的多核苷酸序列。例如，编码VH和VL区的DNA序列是从动物cDNA文库(例如，淋巴组织的人或鼠类cDNA文库)或合成cDNA文库来扩增。在一些实施例中，编码VH和VL区的DNA通过PCR经由scFv接头来连接在一起并且克隆至噬菌粒载体(例如，p CANTAB6或pComb3HSS)之中。将载体电穿孔至大肠杆菌中并且大肠杆菌以辅助噬菌体来感染。这些方法中所使用的噬菌体典型地是包含fd和M13的丝状噬菌体并且VH或VL区通常重组融合至噬菌体基因III或基因VIII。表达结合所感兴趣的抗原(即假单胞菌Psl或PcrV)的抗原结合域的噬菌体可以用抗原来选择或鉴别，例如，使用标记的抗原或结合或捕获于固体表面或珠粒的抗原。

可用于制作抗体的噬菌体展示方法的另外的实例包括在以下文献中披露的那些：布林克曼(Brinkman)等人，《免疫学方法杂志》182：41-50(1995)；艾姆斯(Ames)等人，《免疫学方法杂志》184：177-186(1995)；科托博洛(Kettleborough)等人，《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)24：952-958(1994)；帕斯克(Persic)等人，《基因》(Gene)187：9-18(1997)；伯顿(Burton)等人，《免疫学进展》(Advances in Immunology)57：191-280(1994)；PCT申请号PCT/GB91/01134；PCT公开WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；以及美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743以及5,969,108；这些文献各自通过引用以其全文结合在此。

如以上参考文献和以下实例中所描述，在噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区可以被分离并且用于产生包括人类抗体的完整抗体或任何其他所希望的抗原结合片段，并且表达在任何所希望的宿主之中，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、以及细菌。例如，重组产生Fab、Fab′以及F(ab′)2片段的技术还可以使用在本领域中已知的方法来加以利用，如在以下文献中披露的那些方法：PCT公开WO92/22324；马利纳克斯(Mullinax)等人，《生物技术》12(6)：864-869(1992)；和泽井(Sawai)等人，AJRI34：26-34(1995)；以及贝特尔(Better)等人，《科学》(Science)240：1041-1043(1988)(所述参考文献通过引用以其全文结合)。

可用于产生单链Fvs和抗体的技术的实例包括在以下文献中描述的那些：美国专利号4,946,778和5,258,498；休斯顿(Huston)等人，《酶学方法》(Methods in Enzymology)203：46-88(1991)；舒(Shu)等人，PNAS90：7995-7999(1993)；以及斯盖拉(Skerra)等人，《科学》240：1038-1040(1988)。在某些实施例如治疗性给予中，可使用嵌合、人源化或人类抗体。嵌合抗体是其中抗体的不同部分来自不同动物种类的分子，如抗体具有得自鼠类单克隆抗体的可变区和人类免疫球蛋白恒定区。产生嵌合抗体的方法在本领域中是已知的。参见例如莫里森，科学229：1202(1985)；维伊(Oi)等人，《生物技术》4：214(1986)；吉利斯(Gillies)等人，《免疫学方法杂志》125：191-202(1989)；美国专利号5,807,715、4,816,567、以及4,816397，这些文献均通过引用以其全文结合在此。人源化抗体是来自非人物种抗体的、结合所希望的抗原的抗体分子，该抗体具有来自非人物种的一个或多个互补决定区(CDR)和来自人类免疫球蛋白分子的框架区。人类框架区中的框架残基将经常用来自CDR供体抗体的对应残基来取代以便改变、优选地改善抗原结合。这些框架取代是通过本领域中熟知的方法来鉴别，例如通过模拟CDR与框架残基的相互作用以便鉴别对于抗原结合重要的框架残基、和用于鉴别具***置的不寻常框架残基的序列比较。(参见例如奎因(Queen)等人的美国专利号5,585,089；里奇曼(Riechmann)等人，《自然》(Nature)332：323(1988)，这些文献通过引用以其全文结合在此。)抗体可使用在本领域中已知的多种技术来人源化，这些技术包括例如CDR移植(EP239,400；PCT公开WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；以及5,585,089)、饰面(veneering)或表面重修(resurfacing)(EP592,106；EP519,596；巴丹(Padlan)，《分子免疫学杂志》28(4/5)：489-498(1991)；斯图尼卡(Studnicka)等人，《蛋白质工程》(Protein Engineering)7(6)：805-814(1994)；罗古斯卡(Roguska)等人，PNAS91：969-973(1994))以及链改组(美国专利号5,565,332)。

完全人类抗体对于人类患者的治疗性治疗是特别希望的。人类抗体可以通过在本领域中已知的多种方法来制作，包括使用来自人类免疫球蛋白序列的抗体文库的上述的噬菌体展示方法。还参见美国专利号4,444,887和4,716,111；以及PCT公开WO98/46645、WO98/50433、WO98/24893、WO98/16654、WO96/34096、WO96/33735以及WO91/10741；这些文献各自通过引用以其全文结合在此。

人类抗体还可以使用转基因小鼠来产生，这些转基因小鼠不能表达功能内源性免疫球蛋白，但是可以表达人类免疫球蛋白基因。例如，可随机地或通过同源重组将人类重链和轻链免疫球蛋白基因复合物引入到小鼠胚胎干细胞之中。另外，不同公司可参与以便使用与以上所述类似的技术来提供在转基因小鼠中产生的针对所选定抗原的人抗体。

识别所选定表位的完全人类抗体可以使用被称为“引导选择”的技术来产生。在此方法中，将所选定的非人类单克隆抗体例如小鼠抗体用于引导对于识别相同表位的完全人类抗体的选择。(雅斯贝尔斯(Jespers)等人，《生物技术》12：899-903(1988)。还参见美国专利号5,565,332。)

在另一个实施例中，可以使用常规程序(例如，通过使用能够特异结合至编码鼠类抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)将编码所希望的单克隆抗体的DNA容易地分离并且测序。分离并且亚克隆的杂交瘤细胞或分离的噬菌体例如可充当这类DNA的来源。一旦分离，可以将DNA放置于表达载体中，然后将这些表达载体转染到不以其他方式产生免疫球蛋白的原核或真核宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞之中。更具体地说，所分离的DNA(可以如在此描述合成)可以用于克隆制造抗体的恒定和可变区序列，如1995年1月25日提交的纽曼(Newman)等人的美国专利号5,658,570中所述，该专利通过引用结合在此。表达所希望的抗体的转化细胞可以按相对较大数量来生长以便提供免疫球蛋白的临床和商业供应。

在一个实施例中，一种分离的结合分子例如抗体包含抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施例中，一种分离的结合分子包含来自一种或多种抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施例中，一种分离的结合分子包含来自一种或多种抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施例中，一种分离的结合分子包含来自一种或多种抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施例中，一种分离的结合分子包含来自一种或多种抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施例中，本说明书的一种分离的结合分子包含来自一种或多种抗体分子的至少六个CDR。

在具体实施例中，可检查重链和/或轻链可变域的氨基酸序列以便通过在本领域中熟知的方法鉴别互补决定区(CDR)的序列，例如通过与其他重链和轻链可变区的已知氨基酸序列相比较以便确定具有序列高变性的区。使用常规重组DNA技术，可以将一个或多个CDR***框架区中，例如***人类框架区中以便使非人类抗体人源化。框架区可为天然存在的或共有框架区、并且优选地人类框架区(参见例如乔西亚等人，《分子生物学杂志》278：457-479(1998)中的人类框架区列表)。通过框架区与CDR的组合所产生的多核苷酸编码特异性地结合至所希望的抗原例如Psl或PcrV的至少一个表位的抗体。可以在框架区中进行一个或多个氨基酸取代，并且氨基酸取代改进抗体与其抗原的结合。另外，这类方法可用于进行参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸取代或缺失，以便产生缺乏一个或多个链内二硫键的抗体分子。多核苷酸的其他改变由本披露所涵盖并且在本领域技术人员的能力范围内。

还提供包含在此描述的抗体分子(例如VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)、基本上由其组成或由其组成的结合分子，这些结合分子或其片段特异性地结合至假单胞菌Psl或PcrV。可使用本领域技术人员已知的标准技术来将突变引入编码特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的结合分子或其片段的核苷酸序列中，这些标准技术包括但不限于导致氨基酸取代的定点诱变和PCR介导的诱变。这些变体(包括衍生物)编码的多肽相对于参考VH区、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VL区、VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3包含少于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸取代、少于30个氨基酸取代、少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸取代、少于5个氨基酸取代、少于4个氨基酸取代、少于3个氨基酸取代、或少于2个氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是氨基酸残基被具有带有类似电荷的侧链的氨基酸残基替换的取代。具有带有类似电荷的侧链的氨基酸残基的家族已经在本领域中予以限定。这些家族包括具有以下各项的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。可替代地，可沿着编码序列的全部或一部分，如通过饱和诱变来随机引入突变，并且所得突变体可针对生物活性来筛选以便鉴别保持活性(例如，结合假单胞菌Psl或PcrV的能力)的突变体。

例如，有可能只在抗体分子的框架区或只在CDR区引入突变。所引入的突变可为沉默的或中性错义突变，即，对抗体结合抗原的能力不具有或具有极少影响。这些类型的突变可用于优化密码子使用或改进杂交瘤的抗体产生。可替代地，非中性错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默和中性错义突变的位置可能是在框架区中，而大多数非中性错义突变的位置可能是在CDR中，但这并非绝对要求。本领域技术人员将能够设计并且测试具有所希望的特性的突变分子，这些特性如没有抗原结合活性的改变或结合活性的改变(例如，抗原结合活性的改进或抗体特异性的改变)。在诱变之后，可常规地表达所编码的蛋白质，并且所编码的蛋白质的功能和/或生物活性(例如，结合假单胞菌Psl或PcrV的至少一个表位的能力)可以使用在此描述的技术或通过常规修改在本领域中已知的技术来确定。

一个实施例提供了一种包含了在此披露的抗假单胞菌Psl和PcrV结合域的双特异性抗体。在某些实施例中，该双特异性抗体含有一个第一Psl结合域以及该第二PcrV结合域。考虑具有两个以上的化合价的双特异性抗体。例如，还可采用在此所述的方法来制备三特异性抗体。(Tutt等人，《免疫学杂志》(J.Immunol)，147：60(1991))。

一个实施例提供了一种生成双特异性抗体的方法，利用了一种可与在双特异性分子中存在的两种重链可变域配对的单一轻链。为了识别这种轻链，可以采用不同的策略。在一个实施例中，可被该双特异性抗体靶向的各抗原被一系列单克隆抗体所识别，随后确定在与识别第二靶标的任何抗体的重链配对时，这些抗体中所用的哪种轻链能够起作用。以这种方式，一种轻链可与两种重链起作用，使得可识别与两种抗原的结合。在另一个实施例中，如噬菌体展示等展示技术使得可与两种或更多种重链起作用的轻链被识别。在一个实施例中，构建了噬菌体文库，包含了多种多样的重链可变域以及单一轻链可变域的谱。这种文库可被进一步地利用来识别与感兴趣的不同抗原结合的抗体。由此，在某些实施例中，被识别的抗体将共用一种通用的轻链。

在某些实施例中，该双特异性抗体包含至少一种单链Fv(scFv)。在某些实施例中，该双特异性抗体包含两种scFv。例如，scFv可与抗体中含有的包含CH3域的多肽中的一种或两种相融合。一些方法包括生成双特异性分子，其中包含至少一个CH3域的重链恒定区中的一个或两个可被利用来与单链Fv域连接而提供抗原结合。

III.抗体多肽

本披露是进一步针对构成特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的结合分子(例如抗体或其抗原结合片段)的分离的多肽和编码这类多肽的多核苷酸。结合分子(例如如在此披露的抗体或其片段)包含多肽，例如编码例如得自免疫球蛋白分子的Psl和/或PcrV特异性抗原结合区的氨基酸序列。“得自”指定蛋白质的多肽或氨基酸序列是指多肽的来源。在某些情况下，得自特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列具有基本上与起始序列或其一部分一致的氨基酸序列，其中该部分由至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸、至少30-50个氨基酸组成，或该氨基酸序列可在其他方面被本领域普通技术人员鉴别为起源于起始序列。

还披露一种分离的结合分子，例如，特异性地结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含的免疫球蛋白重链可变区(VH)氨基酸序列与以下各项中的一个或多个至少80％、85％、90％、95％或100％一致：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、或SEQ ID NO：74，如表2所示。

进一步披露一种分离的结合分子，例如，特异性地结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含的VH氨基酸序列与以下各项中的一个或多个一致或除了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代以外与以下各项中的一个或多个一致：SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、或SEQ ID NO：74，如表2所示。

一些实施例包括一种分离的结合分子，例如，特异性地结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含VH，其中VH的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％一致：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、 SEQID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、或SEQID NO：74，如表2所示。

进一步披露一种分离的结合分子，例如，特异性地结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含VH，其中VH的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VHCDR1、VHCDR2和/或VHCDR3氨基酸序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQID NO：15或SEQ ID NO：74，如表2所示。因此，根据此实施例，VH包含的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3中的一个或多个与表3中所示的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3氨基酸序列中的一个或多个一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致。

还披露一种分离的结合分子，例如，特异性地结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含的免疫球蛋白轻链可变区(VL)氨基酸序列与以下各项中的一个或多个至少80％、85％、90％、95％或100％一致：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16，如表2所示。

一些实施例披露一种分离的结合分子，例如，特异性地结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含的VL氨基酸序列与以下各项中的一个或多个一致或除了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代以外与以下各项中的一个或多个一致：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16，如表2所示。

还提供一种分离的结合分子，例如，特异性地结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含VL，其中VL的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考轻链VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％一致：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16，如表2所示。

进一步提供一种分离的结合分子，例如，特异性地结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含VL，其中VL的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VLCDR1、VLCDR2和/或VLCDR3氨基酸序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16，如表2所示。因此，根据此实施例，VL包含的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3中的一个或多个与表3中所示的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3氨基酸序列中的一个或多个序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致。

在其他实施例中，一种特异性地结合至假单胞菌Psl的分离的抗体或其抗原结合片段包含与以下序列至少80％、85％、90％、95％或100％一致的VH和VL氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成：

(a)对应地为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、(b)对应地为SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：2、(c)对应地为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：2、(d)对应地为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、(e)对应地为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、(f)对应地为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、(g)对应地为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12、(h)对应地为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14、(i)对应地为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、或(j)对应地为SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：12。在某些实施例中，上述的抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列为SEQ ID NO：11的VH以及氨基酸序列为SEQ ID NO：12的VL。在一些实施例中，上述的抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列为SEQ ID NO：1的VH以及氨基酸序列为SEQ ID NO：2的VL。在其他实施例中，上述的抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列为SEQ ID NO：11的VH以及氨基酸序列为SEQ IDNO：12的VL。

某些实施例提供了一种分离的结合分子，例如一种与假单胞菌Psl特异性地结合的抗体或其抗原结合片段，包含一个免疫球蛋白VH以及一个免疫球蛋白VL，各包含一个互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3，其中VH CDR1是PYYWT(SEQ ID NO：47)，VH CDR2是YIHSSGYTDYNPSLKS(SEQ ID NO：48)，VH CDR3选自下组，该组由以下各项组成：ADWDRLRALDI(Psl0096，SEQ ID NO：258)、AMDIEPHALDI(Psl0225，SEQ ID NO：267)、ADDPFPGYLDI(Psl0588，SEQ ID NO：268)、ADWNEGRKLDI(Psl0567，SEQ ID NO：269)、ADWDHKHALDI(Psl0337，SEQ ID NO：270)、ATDEADHALDI(Psl0170，SEQ ID NO：271)、ADWSGTRALDI(Psl0304，SEQ ID NO：272)、GLPEKPHALDI(Psl0348，SEQ ID NO：273)、SLFTDDHALDI(Psl0573，SEQ ID NO：274)、ASPGVVHALDI(Psl0574，SEQ ID NO：275)、AHIESHHALDI(Psl0582，SEQ ID NO：276)、ATQAPAHALDI(Psl0584，SEQ ID NO：277)、SQHDLEHALDI(Psl0585，SEQ ID NO：278)和AMPDMPHALDI(Psl0589，SEQ ID NO：279)，VLCDR1是RASQSIRSHLN(SEQ ID NO：50)，VL CDR2是GASNLQS(SEQ ID NO：51)，VL CDR3选自下组，该组由以下各项组成：QQSTGAWNW(Psl0096，SEQ ID NO：280)、QQDFFHGPN(Psl0225，SEQID NO：281)、QQSDTFPLK(Psl0588，SEQ ID NO：282)、QQSYSFPLT(WapR0004、Psl0567、Psl0573、Psl00574、Psl0582、Psl0584、Psl0585，SEQ ID NO：52)、QDSSSWPLT(Psl0337，SEQID NO：283)、SQSDTFPLT(Psl0170，SEQ ID NO：284)、GQSDAFPLT(Psl0304，SEQ ID NO：285)、LQGDLWPLT(Psl0348，SEQ ID NO：286)和QQSLEFPLT(Psl0589，SEQ ID NO：287)，其中VH和VL区CDR是根据卡巴特编号***(Kabat numbering system)。

某些实施例提供了一种分离的结合分子，例如一种与假单胞菌Psl特异性地结合的抗体或其抗原结合片段，包含一个免疫球蛋白VH和一个免疫球蛋白VL，各包含一个互补决定区1(CDR1)、CDR2和CDR3，其中VH CDR1是PYYWT(SEQ ID NO：47)，VH CDR2是YIHSSGYTDYNPSLKS(SEQ ID NO：48)，VL CDR1是RASQSIRSHLN(SEQ ID NO：50)，VL CDR2是GASNLQS(SEQ ID NO：51)，VH CDR3和VL CDR3各包含ADWDRLRALDI(Psl0096，SEQ ID NO：258)和QQSTGAWNW(Psl0096，SEQ ID NO：280)；AMDIEPHALDI(Psl0225，SEQ ID NO：267)和QQDFFHGPN(Psl0225，SEQ ID NO：281)；ADDPFPGYLDI(Psl0588，SEQ ID NO：268)和QQSDTFPLK(Psl0588，SEQ ID NO：282)；ADWNEGRKLDI(Psl0567，SEQ ID NO：269)，并且VLCDR3是QQSYSFPLT(WapR0004、Psl0567、Psl0573、Psl00574、Psl0582、Psl0584、Psl0585，SEQID NO：52)；ADWDHKHALDI(Psl0337，SEQ ID NO：270)和QDSSSWPLT(Psl0337，SEQ ID NO：283)；ATDEADHALDI(Psl0170，SEQ ID NO：271)和SQSDTFPLT(Psl0170，SEQ ID NO：284)；ADWSGTRALDI(Psl0304，SEQ ID NO：272)和GQSDAFPLT(Psl0304，SEQ ID NO：285)；GLPEKPHALDI(Psl0348，SEQ ID NO：273)和(Psl0348，SEQ ID NO：286)；SLFTDDHALDI(Psl0573，SEQ ID NO：274)和SEQ ID NO：52；ASPGVVHALDI(Psl0574，SEQ ID NO：275)和SEQID NO：52；AHIESHHALDI(Psl0582，SEQ ID NO：276)和SEQ ID NO：52；ATQAPAHALDI(Psl0584，SEQ ID NO：277)和SEQ ID NO：52；SQHDLEHALDI(Psl0585，SEQ ID NO：278)和SEQID NO：52；或AMPDMPHALDI(Psl0589，SEQ ID NO：279)和QQSLEFPLT(Psl0589，SEQ ID NO：287)。

某些实施例提供了一种分离的结合分子，例如一种与假单胞菌Psl特异性地结合的抗体或其抗原结合片段，包含一个免疫球蛋白VH和一个免疫球蛋白VL，其中VH包含QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKX1LELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADWDRLRALDIWGQGTMVTVSS，其中X1是G或C(Psl0096，SEQ ID NO：288)，并且VL包含DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSTGAWNWFGX2GTKVEIK，其中X2是G或C(Psl0096，SEQ IDNO：289)；其中VH包含QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARAMDIEPHALDIWGQGTMVTVSS(Psl0225，SEQ IDNO：290)，并且VL包含DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDDGFPNFGGGTKVEIK(Psl0225，SEQ ID NO：291)；其中VH包含QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADDPFPGYLDIWGQGTMVTVSS(Psl0588，SEQ ID NO：292)，并且VL包含DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSDTFPLKFGGGTKVEIK(Psl0588，SEQ ID NO：293)；其中VH包含QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADWNEGRKLDIWGQGTMVTVSS(Psl0567，SEQ ID NO：294)，并且VL包含SEQ ID NO：11；在此，VH包含QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLKLSSVTAADTAVYYCARADWDHKHALDIWGQGTMVTVSS(Psl0337，SEQ ID NO：295)，并且VL包含DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQDSSSWPLTFGGGTKVEIK(Psl0337，SEQ ID NO：296)；其中VH包含EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARATDEADHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0170，SEQ ID NO：297)，并且VL包含EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQSDTFPLTFGGGTKLEIK(Psl0170，SEQ ID NO：298)；其中VH包含EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARADWSGTRALDIWGQGTLVTVSS(Psl0304，SEQ ID NO：299)，并且VL包含EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCWASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSDAFPLTFGGGTKLEIK(Psl0304，SEQ ID NO：300)；其中VH包含EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARGLPEKPHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0348，SEQ ID NO：301)，并且VL包含EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQGDLWPLTFGGGTKLEIK(Psl0348，SEQ ID NO：302)；其中VH包含EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARSLFTDDHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0573，SEQ ID NO：303)，并且VL包含SEQ ID NO：11；其中VH包含EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARASPGVVHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0574，SEQ ID NO：304)，并且VL包含SEQ ID NO：11；其中VH包含EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARAHIESHHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0582，SEQID NO：305)，并且VL包含SEQ ID NO：11；其中VH包含EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARATQAPAHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0584，SEQ ID NO：306)，并且VL包含SEQ ID NO：11；其中VH包含EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARSQHDLEHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0585，SEQ ID NO：307)，并且VL包含SEQ ID NO：11；或其中VH包含EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKGLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARAMPDMPHALDIWGQGTLVTVSS(Psl0589，SEQ ID NO：308)，并且VL包含EIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSLEFPLTFGGGTKLEIK(Psl0589，SEQ ID NO：325)。

还披露了一种与假单胞菌Psl(一种“抗Psl ScFv”)特异性地结合的分离的抗体单链Fv(ScFv)片段，包含式VH-L-VL或可替代的VL-L-VH，其中L是一种接头序列。在某些方面，该接头可包含(a)[GGGGS]n，其中n是0、1、2、3、4或5，(b)[GGGG]n，其中n是0、1、2、3、4或5，或者是(a)与(b)的组合。例如，一种示例性的接头包含：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO：326)。在某些实施例中，该接头进一步地在接头的C端包含氨基酸ala-leu。在某些实施例中，抗Psl ScFv包含氨基酸序列SEQ ID NO：240、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242、SEQ IDNO：243、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：252、SEQ ID NO：253、SEQ IDNO：254或SEQ ID NO：262。

还披露了一种与假单胞菌Pcr(一种“抗Pcr ScFv”)特异性地结合的分离的抗体单链Fv(ScFv)片段，包含式VH-L-VL或可替代的VL-L-VH，其中L是一种接头序列。在某些方面，该接头可包含(a)[GGGGS]n，其中n是0、1、2、3、4或5，(b)[GGGG]n，其中n是0、1、2、3、4或5，或者是(a)与(b)的组合。例如，一种示例性的接头包含：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO：326)。在某些实施例中，该接头进一步地在接头的C端包含氨基酸ala-leu。

还披露了一种分离的结合分子，例如一种与假单胞菌PcrV特异性地结合的抗体或其抗原结合片段，包含的免疫球蛋白重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)氨基酸序列与SEQ ID NO：216或SEQ ID NO：217具有至少80％、85％、90％、95％或100％的一致性。

进一步披露了一种分离的结合分子，例如，特异性地结合至假单胞菌PcrV的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含VH，其中VH的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VHCDR1、VHCDR2和/或VHCDR3氨基酸序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO：218-220，如表3所示。因此，根据此实施例，VH包含的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3中的一个或多个与表3中所示的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3氨基酸序列中的一个或多个一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致。

进一步提供一种分离的结合分子，例如，特异性地结合至假单胞菌PcrV的抗体或其抗原结合片段，该结合分子包含VL，其中VL的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VLCDR1、VLCDR2和/或VLCDR3氨基酸序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO：221-223，如表3所示。因此，根据此实施例，VL包含的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3中的一个或多个与表3中所示的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3氨基酸序列中的一个或多个序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致。

还提供了一种分离的结合分子，例如一种与假单胞菌PcrV特异性地结合的抗体或其抗原结合片段，包含一个VH和一个VL，其中VH包含的氨基酸序列选自下组，该组由以下各项组成：SEQ ID NO：255和SEQ ID NO：257，并且其中VL包含氨基酸序列SEQ ID NO：256。

进一步提供了一种分离的结合分子，例如一种与假单胞菌PcrV特异性地结合的抗体或其抗原结合片段，包含一个VH和一个VL，各自包含CDR1、CDR2和CDR3，其中VH CDR1是(a)SYAMS(SEQ ID NO：311)或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的其变体，VH CDR2是AISGSGYSTYYADSVKG(SEQ ID NO：312)或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的其变体，并且VHCDR3是EYSISSNYYYGMDV(SEQ ID NO：313)或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的其变体；或者(b)其中VL CDR1是WASQGISSYLA(SEQ ID NO：314)或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的其变体，VL CDR2是AASTLQS(SEQ ID NO：315)或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的其变体，并且VL CDR3是QQLNSSPLT(SEQ ID NO：316)或包含1、2、3或4个保守氨基酸取代的其变体；或者(c)(a)与(b)的组合；其中VH和VL的CDR是根据卡巴特编号***(Kabat numberingsystem)。这个实施例的某些方面，(a)VH包含的氨基酸序列与SEQ ID NO：317是至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％99％或100％一致的，(b)VL包含的氨基酸序列与SEQ IDNO：318是至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％99％或100％一致的；或(c)(a)与(b)的组合。

还披露了一种分离的双特异性地结合分子，例如一种与假单胞菌Psl 和假单胞菌PcrV特异性地结合的双特异性抗体或其抗原结合片段，包含的免疫球蛋白重链可变区(VH)和/或轻链可变区(VL)氨基酸序列与SEQ ID NO：228、SEQ ID NO：229或SEQ ID NO：235是至少80％、85％、90％、95％或100％一致的。

在某些实施例中，如在此所披露的双特异性抗体具有如图17所示的结构BS1、BS2、BS3或BS4。在某些在此所披露的双特异性抗体中，与假单胞菌Psl特异性地结合的结合域包含抗Psl ScFv分子。在其他方面中，与假单胞菌Psl特异性地结合的结合域包含常规的重链和轻链。与在此所披露的某些双特异性抗体相似，与假单胞菌PcrV特异性地结合的结合域包含抗Pcr VScFv分子。在其他方面中，与假单胞菌PcrV特异性地结合的结合域包含常规的重链和轻链。

在某些方面中，如在此所披露的一种双特异性抗体具有BS4结构，在下述专利中进行了详细披露：2012年4月16日提交的美国临时申请号61/624,651以及2012年11月6日提交的国际申请号PCT/US2012/63639(律师案卷号AEMS-115WO1，标题为“多特异性和多价结合蛋白及其应用”)，将其通过引用以其全文结合在此。例如，这项披露提供了一种双特异性抗体，在其中抗Psl ScFv分子***抗PcrV抗体或其片段的各重链的铰链区中。

这项披露提供了一种分离的结合分子，例如一种双特异生抗体，包含一个抗体重链以及一个抗体轻链，其中抗体重链包含式VH-CH1-H1-L1-S-L2-H2-CH2-CH3，其中CH1是重链恒定区域-1，H1是第一重链铰链区片段，L1是第一接头，S是抗PcrV ScFv分子，L2是第二接头，H2是第二重链铰链区片段，CH2是重链恒定区域-2，并且CH3是重链恒定区域-3。在某些方面中，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO：255、SEQ ID NO：257或SEQ ID NO：317。在某些方面中，L1和L2是相同的或不同的，并且独立地包含(a)[GGGGS]n，其中n是0、1、2、3、4或5，(b)[GGGG]n，其中n是0、1、2、3、4或5，或者是(a)与(b)的组合。在某些实施例中，H1包含EPKSC(SEQ ID NO：320)，并且H2包含DKTHTCPPCP(SEQ ID NO：321)。

在某些方面中，S包含抗Psl ScFv分子，该抗Psl ScFv分子具有氨基酸序列SEQ IDNO：240、SEQ ID NO：241、SEQ ID NO：242、SEQ ID NO：243、SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：250、SEQ IDNO：251、SEQ ID NO：252、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：254或SEQ ID NO：262，或者是这些氨基酸序列中的两个或更多个的组合。

在另外的方面中，CH2-CH3包含(SEQ ID NO：322)，其中X1是M或Y，X2是S或T，并且X3是T或E.在另外的方面中，抗体轻链包含VL-CL，其中CL是抗体轻链κ恒定区或抗体轻链λ恒定区。在另外的方面中，VL包含氨基酸序列SEQ ID NO：256或SEQ ID NO：318。CL可以包含例如氨基酸序列SEQ ID NO：323。

进一步提供了一种分离的结合分子，例如一种与假单胞菌Psl和假单胞菌PcrV两者特异性地结合的双特异性抗体，包括含有氨基酸序列SEQ IDNO：264的VH以及含有氨基酸序列SEQ ID NO：263的VL。

在一些实施例中，本发明的双特异性抗体可以是串列的单链(sc)Fv片段，包含两个由接头(例如多肽接头)共价连接的不同的scFv片段(即V2L2和W4)(任-海登里希(Ren-Heidenreich)等人，《癌症》(Cancer)100：1095-1103(2004)；Korn等人，《基因医学杂志》(JGene Med)6：642-651(2004))。在一些实施例中，该接头可含有、或者部分地或全部地是一种重链多肽恒定区，如CH1域。在一些实施例中，两个抗体片段可通过聚甘氨酸-丝氨酸或聚丝氨酸-甘氨酸接头被共价地连接到一起，例如分别在美国专利号7,112,324和5,525,491中所述的。例如在Maletz等人《国际癌症杂志》(Int J Cancer)93：409-416(2001)以及Honemann等人《白血病》(Leukemia)18：636-644(2004)中，对用于生成双特异性串列scFv抗体的方法进行了描述。可替代地，这些抗体可以是“线性抗体”，例如在Zapata等人《蛋白质工程》(Protein Eng.)8：1057-1062(1995)中所述的。简言之，这些抗体包含形成一对抗原结合区的一对串列Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)。

本披露还包括双特异性抗体的变体形式，例如四价的双可变域免疫球蛋白(DVD-Ig)分子，在Wu等人(2007)《自然生物技术》(Nat Biotech)25(11)：1290-1297中进行了描述。采用重组DNA技术，DVD-Ig分子被设计成可使来自于两种不同的亲本抗体的两个不同轻链可变域(VL)以直接串列的方式进行连接或通过短接头进行连接，其后是轻链恒定域。例如，DVD-Ig 轻链多肽可含有串列的下列各项：(a)来自V2L2的VL；以及(b)来自WapR-004的VL。相似地，重链包含串列连接的两个不同的重链可变域(VH)，其后是恒定域CH1和Fc区。例如，DVD-Ig重链多肽可含有串列的下列各项：(a)来自V2L2的VH；以及(b)来自WapR-004的VH。在这种情况中，在一种细胞中的两种链的表达导致了含有四种抗原结合位点的异四聚体，其中两种位点与V2L2特异性地结合，而两种位点与Psl特异性地结合。在例如PCT公开号WO2008/024188和WO2007/024715中，对用于由两种亲本抗体生成DVD-Ig分子的方法进行了描述。

在某些实施例中，分离的结合分子，例如一种在此所述的与假单胞菌Psl和/或PcrV特异性地结合的抗体或其抗原结合片段，其亲和性特征为解离常数(K_D)不大于5x10^- ²M、10^-2M、5x10^-3M、10^-3M、5x10^-4M、10^-4M、5x10^-5M、10^-5M、5x10^-6M、10^-6M、5x10^-7M、10^-7M、5x10^- ⁸M、10^-8M、5x10^-9M、10^-9M、5x10^-10M、10^-10M、5x10^-11M、10^-11M、5x10^-12M、10^-12M、5x10^-13M、10^-13M、5x10^-14M、10^-14M、5x10^-15M或10^-15M。

在具体的实施例中，一种分离的结合分子，例如一种如在此所述的与假单胞菌Psl和/或PcrV特异性地结合的抗体或其抗原结合片段，其亲和性特征为解离常数(K_D)的范围是大约1x10^-10至大约1x10^-6M。在一个实施例中，一种分离的结合分子(例如如在此描述的抗体或其抗原结合片段)以一种亲和力来特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV，该亲和力的特征是K_D为约1.18x10^-7M，如通过在此描述的结合测定所确定。在另一个实施例中，一种分离的结合分子(例如如在此描述的抗体或其抗原结合片段)以一种亲和力来特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV，该亲和力的特征是K_D为约1.44x10^-7M，如通过在此描述的结合测定所确定。

一些实施例包括分离的结合分子，例如，如上所述的抗体或其片段，该结合分子(a)可抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞上、(b)可促进铜绿假单胞菌的OPK，或(c)可抑制铜绿假单胞菌附着至上皮细胞上并且可促进铜绿假单胞菌的OPK。

在一些实施例中，分离的结合分子，例如，如上所述的抗体或其片段，其中对铜绿假单胞菌附着至上皮细胞的最大抑制在约50μg/ml或更小、5.0μg/ml或更小或约0.5μg/ml或更小的抗体浓度下，或从约30μg/ml至约0.3μg/ml范围内的抗体浓度下，或约1μg/ml的抗体浓度，或约0.3μg/ml的抗体浓度下来实现。

某些实施例包括分离的结合分子，例如如上所述的抗体或其片段，其中OPK EC50小于约0.5μg/ml、小于约0.05μg/ml或小于约0.005μg/ml，或其中OPK EC50在从约0.001μg/ml至约0.5μg/ml范围内，或其中OPK EC50在从约0.02μg/ml至约0.08μg/ml范围内，或其中OPK EC50在从约0.002μg/ml至约0.01μg/ml范围内或其中OPK EC50小于约0.2μg/ml，或其中OPK EC50小于约0.02μg/ml。在一些实施例中，如单克隆抗体WapR-004、WapR-004RAD、Cam-003、Cam-004或Cam-005一样，抗假单胞菌Psl结合分子(例如在此描述的抗体或其片段、变体或衍生物)特异性地结合至同一种Ps1表位，或将竞争性地抑制这种单克隆抗体结合至假单胞菌Psl。除了SEQ ID NO：11的VH氨基酸序列的氨基酸取代G98A以外，WapR-004RAD与WapR-004相同。

一些实施例包括WapR-004(W4)突变体，这些突变体包含与以下各项中的一个或多个一致或除了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代以外与以下各项中的一个或多个一致的scFv-Fc分子氨基酸序列：SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、 SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145、或SEQ ID NO：146。

其他实施例包括WapR-004(W4)突变体，这些突变体包含与以下各项中的一个或多个至少80％、85％、90％、95％或100％一致的scFv-Fc分子氨基酸序列：SEQ ID NO：78、SEQID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ IDNO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ IDNO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ IDNO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ IDNO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO： 143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：146。

在一些实施例中，如单克隆抗体WapR-001、WapR-002或WapR-003一样，抗假单胞菌Psl结合分子(例如在此描述的抗体或其片段、变体或衍生物)特异性地结合至同一种表位，或将竞争性地抑制这种单克隆抗体结合至假单胞菌Psl。

在一些实施例中，如单克隆抗体WapR-016一样，抗假单胞菌Psl结合分子(例如在此描述的抗体或其片段、变体或衍生物)特异性地结合至同一种表位，或将竞争性地抑制这种单克隆抗体结合至假单胞菌Psl。

表2：参考VH和VL氨基酸序列*

*VH和VL CDR1、CDR2以及CDR3氨基酸序列加下划线

表3：参考VH和VL CDR1、CDR2以及CDR3氨基酸序列

在某些实施例中，如单克隆抗体V2L2一样，抗假单胞菌PcrV结合分子(例如在此描述的抗体或其片段、变体或衍生物)特异性地结合至同一种PcrV表位，和/或将竞争性地抑制这种单克隆抗体结合至假单胞菌PcrV。

例如，在某些方面，该抗假单胞菌PcrV结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物包含V2L2-GL和/或V2L2-MD。

在一些实施例中，如单克隆抗体29D2一样，抗假单胞菌PcrV结合分子(例如在此描述的抗体或其片段、变体或衍生物)特异性地结合至同一种PcrV表位，和/或将竞争性地抑制这种单克隆抗体结合至假单胞菌PcrV。

任何抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如，在此描述的抗体或其片段、变体或衍生物)可以进一步包含另外的多肽，例如，用于引导所编码的多肽分泌的信号肽、如在此描述的抗体恒定区，或如在此描述的其他异源多肽。另外，本说明书的结合分子或其片段包括如在其他处描述的多肽片段。另外，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如，在此描述的抗体或其片段、变体或衍生物)可以是融合多肽、Fab片段、scFv、或其他衍生物，如在此所述。

另外，如在此其他处更详细地描述，本披露包括包含抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如在此描述的抗体或其片段、变体或衍生物)的组合物。

本领域普通技术人员还应了解抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如，在此描述的抗体或其片段、变体或衍生物)可以被修饰成使得它们在氨基酸序列上不同于得到其的天然存在的结合多肽。例如，得自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可为相似的，例如，具有与起始序列的一定百分比的一致性，例如，它可与起始序列60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％一致。

如在本领域中所知的，在两种多肽之间的“序列一致性”是由将一种多肽的氨基酸序列与第二多肽的序列相比较而决定的。当在此讨论时，任何具体多肽是否与另一个多肽至少约70％、75％、80％、85％、90％或95％一致还可使用在本领域中已知的方法和计算机程序/软件来确定，如但不限于BESTFIT程序(《威斯康星序列分析程序包》，第8版用于Unix，遗传学计算机组，大学科技园区，575科学路，麦迪逊，威斯康星州53711(WisconsinSequence Analysis Package，Version8for Unix，Genetics Computer Group，UniversityResearch Park，575Science Drive，Madison，WI53711))。BESTFIT使用局部同源性算法(史密斯(Smith)&沃特曼(Waterman)，《应用数学进展》(Advances in Applied Mathematics)2：482-489(1981))来发现两个序列之间的最佳同源性片段。当使用BESTFIT或任何其他序列比对程序来确定一个具体序列是否与参考序列例如95％一致时，当然应将参数设定成使得在参考多肽序列的全部长度上计算一致性百分比并且允许多达参考序列中的氨基酸总数的5％的同源性空隙。

还可以通过将两个最佳比对序列在比较窗口上进行比较来确定“序列一致性”的百分比。为了对用于比较的序列进行最优化的比对，多核苷酸或多肽序列的在比较窗口中的部分可对所谓的间隙进行添加或删除，而参照序列保持不变。最佳比对是，即使存在间隙，也可在参照序列与比较序列之间生成最大可能数量的“一致的”位置。可以使用国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)截止到2004年9月1日提供的程序“BLAST2序列”的版本来确定在两个序列之间的“序列一致性”百分比，该程序可与程序BLASTN(用于核苷酸序列比较)以及BLASTP(用于多肽序列比较)结合使用，这些程序基于卡林(Karlin)和阿尔丘尔(Altschul)的算法(《美国国家科学院院刊》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90(12)：5873-5877，1993)。当利用“BLAST2序列”时，对于下述参数使用截止到2004年9月1日的当前参数：字长(3)、开放空位罚分(11)、扩展空位罚分(1)、空位急速下降(50)、期望值(10)以及任何其他需要的包括但不限于基质选项的参数。

此外，可产生导致“非必需”氨基酸区的保守取代或变化的核苷酸或氨基酸取代、缺失或***。例如，得自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列可与起始序列一致，除了一个或多个单独氨基酸取代、***或缺失以外，例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十五个、二十个或更多个单独氨基酸取代、***或缺失。在一些实施例中，得自指定蛋白质的多肽或氨基酸序列相对于起始序列具有一个至五个、一个至十个、一个至十五个，或一个至二十个单独氨基酸取代、***或缺失。

抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如，在此描述的抗体或其片段、变体或衍生物)可包含融合蛋白、基本上由其组成、或由其组成。融合蛋白是嵌合分子，包含例如具有至少一个靶标结合位点的免疫球蛋白抗原结合域，和至少一个异源部分，即，它在天然状态下未与其天然地连接的部分。氨基酸序列通常可以存在于单独蛋白质中，它们在融合多肽中结合在一起，或这些氨基酸序列通常可以存在于同一蛋白质中但是以新的安排来放置于融合多肽中。融合蛋白可以例如通过化学合成或通过产生并且翻译多核苷酸来产生，在该多核苷酸中，肽区以所希望的关系来编码。

如适用于多核苷酸、多肽或其他部分的术语“异源”是指多核苷酸、多肽或其他部分得自于与其正进行比较的实体的其余部分相异的实体。在一个非限制性实例中，有待融合至结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的“异源多肽”得自于相同种类的非免疫球蛋白多肽，或不同种类的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。

IV.融合蛋白和抗体轭合物

在一些实施例中，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)可以按轭合形式多次给予。在仍另一个实施例中，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)可以按未轭合形式、然后按轭合形式给予，或反之亦然。

在具体实施例中，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)可以轭合至一种或多种抗微生物剂，例如多粘菌素B(PMB)。PMB是被批准用于治疗多重耐药性革兰氏阴性感染的小脂肽抗生素。除了杀菌活性以外，PMB结合脂多糖(LPS)并且中和其促炎症作用。(迪克松(Dixon)·R·A&乔普拉(Chopra)·I，《抗菌化学疗法杂志》(J Antimicrob Chemother)18，557-563(1986))。LPS被认为显著造成炎症和革兰氏阴性败血症的发作。(吉戴特(Guidet)·B等人，《胸科杂志》(Chest)106，1194-1201(1994))。PMB与载体分子的轭合物已经显示在内毒素血症和感染的动物模型中中和LPS并且介导保护。(德莱比克(Drabick)·J·J等人，《抗微生物制剂与化学疗法》(Antimicrob AgentsChemother)42，583-588(1998))。还披露一种将一个或多个PMB分子附着至本披露的单克隆抗体(mAb)的Fc区中所引入的半胱氨酸残基上的方法。例如，Cam-003-PMB轭合物保持与铜绿假单胞菌的特异性、mAb介导的结合，并且还保持OPK活性。此外，mAb-PMB轭合物在体外结合并且中和LPS。在具体的实施例中，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物，可与抗生素(例如环丙沙星、美罗培南、妥布霉素、氨曲南)联合。

在一些实施例中，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如，在此描述的抗体或其片段、变体或衍生物)可以包含一个异源氨基酸序列或通常不与抗体关联的一个或多个其他部分(例如，抗微生物剂、治疗剂、前药、肽、蛋白质、酶、脂质、生物应答调节剂、药剂、淋巴因子、异源抗体或其片段、可检测标记、聚乙二醇(PEG)、以及任何所述试剂中的两种或更多种的组合)。在另外的实施例中，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)可以包含选自下组的可检测标记，该组由以下各项组成：酶、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、放射性标记或任何所述可检测标记中的两种或更多种的组合。

V.编码结合分子的多核苷酸

在此还提供编码抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如在此描述的抗体或其片段、变体或衍生物)的核酸分子。

一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成，该氨基酸序列与以下各项中的一个或多个至少80％、85％、90％、95％或100％一致：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15、SEQ IS NO：74或SEQ ID NO：216，如表2所示。

一个实施例提供了一种分离的多核苷酸，该多核苷酸包含以下成分、主要由以下成分组成或由以下成分组成：编码免疫球蛋白重链可变区(VH)氨基酸序列SEQ ID NO：257或SEQ ID NO：259的核酸。例如，分别是核酸序列SEQ ID NO：261和SEQ ID NO：259。

另一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码VH氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成，该氨基酸序列与以下各项中的一个或多个一致或除了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ IS NO：74或SEQ ID NO：216，如表2所示。

另外的实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码VH的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中VH的VHCDR1、VHCDR2 或VHCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VHCDR1、VHCDR2和/或VHCDR3氨基酸序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：15、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：216，如表2所示。

另一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码一种分离的结合分子(例如特异性地结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段)的核酸、基本上由其组成或由其组成，该结合分子包含VH，其中VH的VHCDR1、VHCDR2或VHCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VHCDR1、VHCDR2和/或VHCDR3氨基酸序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：74，如表2所示。

一个另外的实施例提供一种分离的结合分子，例如包含由多核苷酸编码的VH的、特异性或优先结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的抗体或抗原结合片段。

另一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成，该氨基酸序列与以下各项中的一个或多个至少80％、85％、90％、95％或100％一致：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：217，如表2所示。

另一个实施例提供了一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含以下成分、主要由以下成分组成或由以下成分组成：编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)氨基酸序列SEQ IDNO：256(例如核酸序列SEQ ID NO：260)的核酸。

一个另外的实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码VL氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成，该氨基酸序列与以下各项中的一个或多个一致或除了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：217，如表2所示。

另一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码VL的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中VL的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考轻链VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％或100％一致：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或 SEQ ID NO：217，如表2所示。

一个另外的实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码一种分离的结合分子(例如特异性地结合至假单胞菌Psl的抗体或其抗原结合片段)的核酸、基本上由其组成或由其组成，该分离的结合分子包含VL，其中VL的VLCDR1、VLCDR2或VLCDR3区中的一个或多个与以下各项中的一个或多个的一个或多个参考重链VLCDR1、VLCDR2和/或VLCDR3氨基酸序列一致或除了四个、三个、两个或一个氨基酸取代以外与其一致：SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：217，如表2所示。

在另一个实施例中，一种分离的结合分子(例如包含由多核苷酸编码的VL的抗体或抗原结合片段)特异性或优先结合至假单胞菌Psl和/或PcrV。

一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码包括VH和VL的scFv分子的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中scFv与以下各项中的一个或多个至少80％、85％、90％、95％或100％一致：SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ IDNO：68、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：70，如表4所示。

表4：参考scFv核酸序列

在一些实施例中，特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV上的、由以上所述的一种或多种多核苷酸所编码的一种分离的抗体或其抗原结合片段包含与以下序列至少80％、85％、90％、95％或100％一致的VH和VL氨基酸序列、基本上由其组成或由其组成：

(a)对应地为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2、(b)对应地为SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：2、(c)对应地为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：2、(d)对应地为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6、(e)对应地为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8、(f)对应地为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10、(g)对应地为SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12、(h)对应地为SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14、(i)对应地为SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16、或(j)对应地为SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：12。

在某些实施例中，一种分离的结合分子，例如一种由上述多核苷酸中的一种或更多种编码的抗体或其抗原结合片段，与假单胞菌Psl和/或PcrV特异性地结合，其亲和性特征为解离常数(K_D)不大于5x10^-2M、10^-2M、5x10^-3M、10^-3M、5x10^-4M、10^-4M、5x10^-5M、10^-5M、5x10^-6M、10^-6M、5x10^-7M、10^-7M、5x10^-8M、10^-8M、5x10^-9M、10^-9M、5x10^-10M、10^-10M、5x10^-11M、10^-11M、5x10^-12M、10^-12M、5x10^-13M、10^-13M、5x10^-14M、10^-14M、5x10^-15M或10^-15M。

在具体的实施例中，一种分离的结合分子，例如一种由上述多核苷酸中的一种或更多种编码的抗体或其抗原结合片段，与假单胞菌Psl和/或PcrV特异性地结合，其亲和性特征为解离常数(K_D)是范围是大约1x10^-10至大约1x10^-6M。在一个实施例中，一种分离的结合分子(例如由以上所述的一种或多种多核苷酸编码的抗体或其抗原结合片段)以一种亲和力来特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV，该亲和力的特征是K_D为约1.18x10^-7M，如通过在此描述的结合测定所确定。在另一个实施例中，一种分离的结合分子(例如由以上所述的一种或多种多核苷酸编码的抗体或其抗原结合片段)以一种亲和力来特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV，该亲和力的特征是K_D为约1.44x10^-7M，如通过在此描述的结合测定所确定。

在某些实施例中，如单克隆抗体WapR-004、WapR-004RAD、Cam-003、Cam-004或Cam-005一样，一种抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子，例如由上述多核苷酸中的一种或更多种编码的抗体或其片段、变体或衍生物，特异性地结合至同一种Ps1表位，或将竞争性地抑制这种单克隆抗体与假单胞菌Psl的结合；和/或如单克隆抗体V2L2一样，特异性地结合至相同的PcrV表位，或将竞争性地抑制这种单克隆抗体与假单胞菌PcrV的结合。WapR-004RAD与WapR-004相同，除了编码SEQ ID NO：11的VH氨基酸序列的VH核酸序列的核酸取代G293C以外(SEQ ID NO：71的VH编码部分中的位置317处的核苷酸取代)。编码WapR-004RAD VH的核酸序列作为SEQ ID NO76来呈现。

一些实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码W4突变体scFv-Fc分子氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成，该氨基酸序列与以下各项中的一个或多个一致，或除了一个、两个、三个、四个、五个或更多个氨基酸取代以外与其一致：SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ IDNO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ IDNO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ IDNO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQID NO： 145或SEQ ID NO：146。

其他实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码W4突变体scFv-Fc分子氨基酸序列的核酸、基本上由其组成或由其组成，该氨基酸序列与以下各项中的一个或多个至少80％、85％、90％、95％或100％一致：SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85、SEQID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQID NO：109、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQID NO：142、SEQ ID NO： 143、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：145或SEQ ID NO：146。

一个实施例提供一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码W4突变体scFv-Fc分子的核酸、基本上由其组成或由其组成，其中该核酸与以下各项中的一个或多个至少80％、85％、90％、95％或100％一致：SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：151、or SEQ ID NO：152、SEQ IS NO：153、SEQ ID NO：154、SEQID NO：155、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：165、SEQID NO：166、SEQ ID NO：167、SEQ ID NO：168、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：176、SEQID NO：177、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：179、SEQ ID NO：180、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：198、SEQID NO：199、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：204、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：207、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：209、SEQID NO：210、SEQ ID NO： 211、SEQ ID NO：212、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：214或SEQ IDNO：215。

一个实施例提供了一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码V2L2多肽的核酸，或基本上由其组成，或由其组成，其中该核酸与SEQ ID NO：238或SEQ ID NO：239中的一个或多个是至少80％，85％，90％95％或100％一致的。

在其他实施例中，如单克隆抗体WapR-001、WapR-002或WapR-003一样，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如由以上所述的一种或多种多核苷酸编码的抗体或其片段、变体或衍生物)特异性地结合至同一种表位，或将竞争性地抑制这种单克隆抗体结合至假单胞菌Psl。

在一些实施例中，如单克隆抗体WapR-016一样，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如由以上所述的一种或多种多核苷酸编码的抗体或其片段、变体或衍生物)特异性地结合至同一种表位，或将竞争性地抑制这种单克隆抗体结合至假单胞菌Psl。

本披露还包括如在此其他处所描述的多核苷酸片段。另外，还提供编码如在此所描述的融合多核苷酸、Fab片段以及其他衍生物的多核苷酸。

多核苷酸可通过在本领域中已知的任何方法来产生或制造。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，那么编码该抗体的多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸来组装(例如，如库特梅尔(Kutmeier)等人，《生物技术》(BioTechniques)17：242(1994)中所描述)，简单地说，这涉及合成含有编码该抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸，退火并且连接那些寡核苷酸，并且然后通过PCR来扩增所连接的寡核苷酸。

可替代地，编码抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)的多核苷酸可从来自合适来源的核酸产生。如果包含编码一种具体抗体的核酸的克隆是不可获得的，但是抗体分子的序列是已知的，则编码该抗体的核酸可以化学合成，或使用可杂交至序列的3′和5′端的合成引物通过PCR扩增、或者通过使用对于具体基因序列具有特异性的寡核苷酸探针来进行克隆，以便从cDNA文库鉴定编码该抗体的cDNA克隆而从适合来源(例如，抗体cDNA文库、或产生自表达该抗体的任何组织或细胞、或者如选择来表达抗体的杂交瘤细胞的cDNA文库或从它们分离的核酸、优选多聚A+RNA)获得。然后可以使用本领域熟知的任何方法，将通过PCR产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体之中。

一旦确定抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)的核苷酸序列和对应氨基酸序列，它的核苷酸序列可以使用本领域中熟知的用于操纵核苷酸序列的方法来操纵，这些方法例如重组DNA技术、定点诱变、PCR等(参见例如萨布鲁克(Sambrook)等人，《分子克隆：实验手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港实验室，冷泉港(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor)，纽约(1990)和奥苏贝尔等人编著的《当前分子生物学方案》，约翰&威利父子公司，纽约(1998)中描述的技术，这些文献均通过引用以其全文结合在此)，以便产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸取代、缺失和/或***。

编码抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)的多核苷酸可以由可为未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA的任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成。例如，编码抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)的多核苷酸可以由以下各项组成：单链和双链DNA、是单链与双链区的混合物的DNA、单链和双链RNA，以及是单链与双链区的混合物的RNA、包含可以是单链或更典型地是双链或单链与双链区的混合物的DNA和RNA的杂交分子。另外，编码抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)的多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA与DNA两者的三链区组成。编码抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)的多核苷酸还可以含有一个或多个修饰的碱基或出于稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA骨架。“修饰”的碱基包括例如三苯甲基化碱基和不常见碱基如肌苷。可对DNA和RNA进行多种修饰；因而，“多核苷酸”涵盖化学、酶促或代谢修饰形式。

可通过以下方式产生编码得自免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离的多核苷酸：将一个或多个核苷酸取代、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列以使得将一个或多个氨基酸取代、添加或缺失引入到所编码的蛋白质之中。突变可通过标准技术、如定点诱变和PCR介导的诱变来引入。保守氨基酸取代在一个或多个非必需氨基酸残基处进行。

VI.抗体多肽的表达

如所熟知的，RNA可以通过标准技术从原始杂交瘤细胞或从其他转化的细胞分离，这些技术如异硫氰酸胍提取和沉淀之后离心或色谱法。在希望时，mRNA可通过标准技术如寡聚脱氧胸苷酸纤维素(oligo dT cellulose)上色谱法从总RNA上分离。合适的技术在本领域中是熟悉的。

在一个实施例中，编码抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)的轻链和重链的cDNA可以根据熟知方法使用逆转录酶和DNA聚合酶来同时或分别地制得。PCR可以通过共有恒定区引物或通过更具有特异性的引物基于公开的重链和轻链DNA和氨基酸序列来起始。如以上所讨论，PCR还可以用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，文库可以通过共有引物或较大同源性探针(如小鼠恒定区探针)来筛选。

DNA、典型地质粒DNA可以使用在本领域中已知的技术从细胞中分离，根据例如在关于重组DNA技术的前述参考文献中详细阐明的标准、熟知技术来限制性作图并且测序。当然，DNA可以根据本披露在分离过程或后续分析过程中的任何时点合成。

在操纵所分离的遗传物质以便提供抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如本披露的抗体或其片段、变体或衍生物)之后，典型地将编码抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子的多核苷酸***表达载体中以便引入宿主细胞中，这些宿主细胞可以用于产生所希望数量的抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子。

抗体或其片段、衍生物或类似物(例如结合至在此描述的靶标分子例如Psl和/或PcrV的抗体的重链或轻链)的重组表达需要构建含有编码该抗体的多核苷酸的表达载体。一旦已经获得编码本披露的抗体分子、或抗体的重链或轻链、或其一部分(含有重链或轻链可变域)的多核苷酸，用于产生抗体分子的载体可以通过重组DNA技术使用本领域中熟知的技术来产生。因此，在此描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。可以使用本领域技术人员熟知的方法来构建含有编码抗体的序列和适当转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术、以及体内基因重组。因此，本披露提供可复制载体，这些载体包含编码本披露的抗体分子、或其重链或轻链、或重链或轻链可变域的核苷酸序列，该核苷酸序列可操作地连接至启动子。这类载体可以包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如PCT公开WO86/05807；PCT公开WO89/01036；以及美国专利号5,122,464)并且抗体的可变域可以克隆至这种载体中以便表达整个重链或轻链。

术语“载体”或“表达载体”在此用于指根据本披露用作媒介物以便将所希望的基因引入并且表达在宿主细胞中的载体。如本领域技术人员所已知，这类载体可以容易地选自下组，该组由以下各项组成：质粒、噬菌体、病毒、以及逆转录病毒。总体上，适合于本披露的载体将包括选择标记物、促进所希望的基因的克隆和进入和/或在真核或原核细胞中复制的能力的适当限制位点。

出于本披露的目的，可以使用许多表达载体***。例如，一种类别的载体利用得自动物病毒的DNA元件，这些动物病毒如牛***瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其他病毒涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子***。另外，已经将DNA整合到染色体中的细胞可以通过引入一个或多个标记物来选择，该一种或多种标记物允许选择所转染的宿主细胞。标记物可以提供针对营养缺陷型宿主的原营养、杀生物剂抗性(例如抗生素)或对于重金属如铜的抗性。可选择的标记物基因可以直接连接至有待表达的DNA序列，或通过共转化来引入同一细胞中。mRNA的最佳合成还可能需要另外的元件。这些元件可以包括信号序列、剪接信号连同转录启动子、增强子以及终止信号。

在一些实施例中，将所克隆的可变区基因与如以上所讨论合成的重链和轻链恒定区基因(例如人类)一起***到表达载体之中。当然，能够在真核细胞中引出表达的任何表达载体可以用于本披露之中。合适载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、以及pZeoSV2(可从加利福尼亚州圣迭戈市的英杰公司(Invitrogen)获得)，和质粒PCI(可从威斯康星州麦迪逊市的普落麦格公司(Promega)获得)。总体上，针对表达适当较高水平的免疫球蛋白重链和轻链的那些细胞对大量的转化细胞进行筛选是可以例如通过机器人***来执行的常规实验。

更一般来说，一旦编码抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如本披露的抗体或其片段、变体或衍生物)的单体亚单位的载体或DNA序列已经制备，可以将表达载体引入到合适宿主细胞之中。将质粒引入到宿主细胞之中可以通过本领域技术人员熟知的不同技术来完成。这些技术包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、与包膜的DNA的细胞融合、显微注射以及以完整病毒来感染。参见李奇微(Ridgway)A.A.G.，“哺乳动物表达载体(Mammalian Expression Vectors)”载体，罗德里格斯(Rodriguez)和登哈特(Denhardt)编著，巴特沃斯出伴社(Butterworths)，波士顿，马萨诸塞州，第24.2章，第470-472页(1988)。典型地，质粒引入宿主中是经由电穿孔。使具有表达构建体的宿主细胞在适合于产生轻链和重链的条件下生长，并且测定重链和/或轻链蛋白质合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光活化细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学等。

通过常规技术将表达载体转移至宿主细胞中，并且然后通过常规技术来培养所转染的细胞以便产生用于在在此所述的方法中使用的抗体。因此，本披露包括宿主细胞，这些宿主细胞含有编码抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物或其重链或轻链)的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至异源启动子。在某些用于表达双链抗体的实施例中，可以将编码重链与轻链两者的载体在宿主细胞中共表达，以用于表达整个免疫球蛋白分子，如下所详述。

某些实施例包括一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含编码上述VH和VL的核酸，其中由该多核苷酸表达的结合分子或其抗原结合片段特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV。在一些实施例中，如所描述的多核苷酸编码包含VH和VL的scFv分子，与以下各项中的一个或多个至少80％、85％、90％、95％或100％一致：SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：70，如表4中所示。

一些实施例包括包含上述多核苷酸的载体。在另外的实施例中，多核苷酸可操作地与启动子关联。在另外的实施例中，本披露提供包含这类载体的宿主细胞。在另外的实施例中，本披露提供其中多核苷酸可操作地与启动子相关联的载体，其中载体可以在合适的宿主细胞中表达特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV的结合分子。

还提供一种产生特异性地结合至假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子或其片段的方法，该方法包括培养含有包含上述多核苷酸的载体的宿主细胞，并且回收所述抗体或其片段。在另外的实施例中，本披露提供一种通过上述方法产生的分离的结合分子或其片段。

如在此使用，“宿主细胞”是指具有使用重组DNA技术构建的并且编码至少一个异源基因的载体的细胞。在从重组宿主分离抗体的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以便表示抗体来源，除非另外明确规定。换言之，从“细胞”回收多肽可指从旋转沉降的全细胞、或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物回收。

多种宿主表达载体***可用于表达用于在本文所述的方法中使用的抗体分子。此类宿主表达***代表着可以产生并随后纯化感兴趣的编码序列的载体，而且还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时，原位表达本披露的一种抗体分子的细胞。这些宿主细胞包括但不限于：微生物，如用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌、枯草杆菌)；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，毕赤酵母)；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞***；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒CaMV；烟草花叶病毒TMV)感染的植物细胞***或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞***；或具有重组表达构建体的哺乳动物细胞***(例如，COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)，这些构建体包含得生自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或得自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。尤其用于表达完整重组抗体分子的细菌细胞如大肠杆菌、或真核细胞用于表达重组抗体分子。例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，与载体如来自人巨细胞病毒的主要立即早期基因启动子元件相结合是抗体的有效表达***(福金(Foecking)等人，《基因》45：101(1986)；科克特(Cockett)等人，《生物技术》8：2(1990))。

用于蛋白质表达的宿主细胞系经常具有哺乳动物来源；本领域技术人员被认为能够确定最适合于有待在其中表达的所希望的基因产物的具体宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和 DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR减)、HELA(人***)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI的衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、293、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)、以及293(人肾)。宿主细胞系典型地可从商业服务机构(美国组织培养物保藏中心)或从公开的文献获得。

另外，可选择调节所***序列的表达、或以所希望的特定方式来修饰并且加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这类修饰(例如糖基化)和加工(例如裂解)对于蛋白质的功能可以是重要的。不同的宿主细胞针对蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特异性的机制。可选择适当细胞系或宿主***以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于初级转录物的正确加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器(cellular machinery)的真核宿主细胞。

为了长期、高产率的产生重组蛋白，稳定表达是优选的。例如，可以将稳定表达抗体分子的细胞系工程化。代替使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以使用由适当表达控制元件(例如启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)和可选择标记物来控制的DNA来转化。在引入外源DNA后，可以允许工程化的细胞在富集的培养基中生长1-2天，并且然后切换至选择性培养基。在重组质粒中的选择性标记物赋予对选择的抗性，并且允许细胞将质粒稳定地整合进它们的染色体中并且生长以形成集落(foci)，进而可以将该集落克隆并且扩充成细胞系。这种方法可有利地用于将稳定表达抗体分子的细胞系工程化。

可以使用许多选择***，包括但不限于单纯性疱疹病毒胸苷激酶(威格勒(Wigler)等人，《细胞》(Cell)11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(苏帕斯卡(Szybalska)&撒波斯基(Szybalski)，《美国国家科学院院刊》48：202(1992))、以及腺嘌呤磷酸核糖转移酶(洛伊(Lowy)等人，《细胞》22：8171980)基因可相应地用于tk-、hgprt-或aprt-细胞之中。另外，抗代谢物抗性可以用作选择以下基因的基础：dhfr，它赋予对甲氨喋呤的抗性((威格勒等人，《美国国家科学院院刊》(Natl.Acad.Sci.USA)77：357(1980)；奥黑尔(O'Hare)等人，《美国国家科学院院刊》78：1527(1981))；gpt，它赋予对霉酚酸的抗性(穆利根(Mulligan)&贝尔格(Berg)，《美国国家科学院院刊》78：2072(1981))；neo，它赋予对氨基葡糖苷G-418的抗性(《临床药学》(Clinical Pharmacy)12：488-505；吴(Wu)和吴，《生物疗法》(Biotherapy)3：87-95(1991)；托斯塔谢夫(Tolstoshev)，《药理学与毒理学年鉴》(Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.)32：573-596(1993)；穆利根(Mulligan)《科学》260：926-932(1993)；以及摩根(Morgan)&安德森(Anderson)，《生物化学年鉴》(Ann.Rev.Biochem.)62：191-217(1993)；TIB TECH11(5)：155-215(1993年5月))、以及hygro，它赋予对潮霉素的抗性(圣德尔(Santerre)等人，《基因》30：147(1984)。可使用的在重组DNA技术领域中通常已知的方法被描述于奥苏贝尔等人(编著)，《当代分子生物学方案》，约翰&威利父子公司，纽约(1993)；克里格勒尔(Kriegler)，《基因转移和表达：实验手册》(Gene Transfer andExpression，A Laboratory Manual)，斯托克顿出版社(Stockton Press)，纽约(1990)；以及德拉柯波利(Dracopoli)等人(编著)，《当前人类遗传学方案》(Current Protocols inHuman Genetics)，约翰&威利父子公司，纽约(1994)的第12和13章；库尔柏利-加拉平(Colberre-Garapin)等人，《分子生物学杂志》150：1(1981)，这些文献都通过引用以其全文结合在此。

抗体分子的表达水平可以通过载体扩增来增加(关于评论，参见贝宾顿(Bebbington)&汉切尔(Hentschel)，使用基于基因扩增的载体来在DNA克隆中在哺乳动物细胞中表达克隆的基因(The use of vectors based on gene amplification for theexpression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning)，学术出版社(Academic Press)，纽约，第3卷(1987))。当表达抗体的载体***中的标记物可扩增时，存在于宿主细胞培养物中的抑制剂的水平的增加将使标记物基因的拷贝数量增加。由于扩增的区与抗体基因相关联，因此抗体的产生将也增加(克劳斯(Crouse)等人，《分子细胞生物学杂志》(Mol.Cell.Biol.)3：257(1983))。

体外产生允许按比例扩大以便给出大量所希望的多肽。在组织培养条件下的哺乳动物细胞培养技术在本领域中是已知的，并且包括均质悬浮培养，例如在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中，或固定或截留细胞培养，例如在中空纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠粒或陶瓷筒上。在必要和/或希望时，多肽溶液可以通过常规色谱方法来纯化，例如凝胶过滤、离子交换色谱法、DEAE-纤维素上色谱法或(免疫)亲和色谱法，例如在合成铰链区多肽的优先生物合成之后或在在此描述的HIC色谱步骤之前或之后。

编码抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如如在此披露的抗体或其片段、变体或衍生物)的构建体还可表达于非哺乳动物细胞如细菌或酵母或植物细胞之中。容易吸收核酸的细菌包括以下成员：肠杆菌科(enterobacteriaceae)，如大肠杆菌(Escherichiacoli)或沙门氏菌(Salmonella)菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)，以及流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。应进一步理解在表达于细菌中时，异源多肽典型地成为包涵体的一部分。异源多肽必须被分离、纯化、然后组装成功能分子。当需要四价形式的抗体时，然后将亚单位自动组装成四价抗体(WO02/096948A2)。

在细菌***中，取决于所表达的抗体分子的预定用途，可有利地选择许多表达载体。例如，在有待产生大量的这种蛋白质以便产生抗体分子的药物组合物时，引导容易纯化的较高水平的融合蛋白产物的表达的载体可以是令人希望的。这类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(罗塞(Ruther)等人，《欧洲分子生物学学会杂志》(EMBO J.)2：1791(1983))，其中抗体编码序列可单独地与lacZ编码区同框连接至载体中以使得产生融合蛋白；pIN载体(井上(Inouye)&井上，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)13：3101-3109(1985)；凡赫克(Van Heeke)&舒斯特(Schuster)，《生物化学杂志》(J. Biol.Chem.)24：5503-5509(1989))等。pGEX载体也可以用于表达作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。总体上，这类融合蛋白可溶并且可以通过吸附并且结合至基质谷胱甘肽-琼脂糖珠粒，随后在游离谷胱甘肽的存在下洗脱来容易地从溶解的细胞中纯化。pGEX载体被设计成包含凝血酶或因子Xa蛋白酶裂解位点以使得克隆的靶标基因产物可以从GST部分上释放。

除了原核生物以外，也可以使用真核微生物。酿酒酵母或常见面包酵母在真核微生物中是最常使用的，但是许多其他菌株通常可利用，例如毕赤酵母。

为了在酵母中表达，通常使用例如质粒YRp7(斯丁奇克布(Stinchcomb)等人，《自然》(Nature)282：39(1979)；金斯曼(Kingsman)等人，《基因》7：141(1979)；彻姆柏(Tschemper)等人，《基因》10：157(1980))。此质粒已经含有TRP1基因，该基因提供缺乏在色氨酸中生长的能力的突变酵母菌株的选择标记物，该菌株例如ATCC编号44076或PEP4-1(琼斯(Jones)，《遗传学》(Genetics)85：12(1977))。然后，作为酵母宿主细胞基因组的特征的trpl缺陷区(lesion)的存在提供用于检测通过在不存在色氨酸的情况下的生长而进行的转化的有效环境。

在昆虫***中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californicanuclear polyhedrosis virus；AcNPV)典型地用作表达外源基因的载体。病毒在草地贪夜蛾细胞中生长。抗体编码序列可单独地克隆至病毒的非必需区 (例如多角体蛋白基因)中并且置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。

一旦如在此披露的抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)已经重组表达，它可以通过在本领域中已知用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法来纯化，例如通过色谱法(例如离子交换、亲和力、对于在蛋白质A之后的特定抗原特别是通过亲和力，以及尺寸分级柱色谱法(sizing column chromatography))、离心、差别溶解度或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。增加本披露的抗体的亲和力的另一种方法被披露于US20020123057A1之中。

VII.对不依赖于血清型的结合分子的鉴别

本披露包括一种鉴别不依赖于血清型的治疗结合分子、例如具有优良或所希望的治疗活性的抗体或其片段的与靶标无关的全细胞方法。该方法可用于鉴别可以拮抗、中和、清除或阻断感染剂、例如细菌病原体的不希望的活性的结合分子。如在本领域中所已知，许多感染剂在其显性表面抗原中展现出显著变化，从而允许它们规避免疫监视。在此描述的鉴别方法可以鉴别靶向在许多不同假单胞菌株类或其他革兰氏阴性病原体之间共用的抗原的结合分子，由此提供可靶向来自多个种类的多种病原体的治疗剂。例如，该方法用于鉴别一系列结合分子，这些结合分子以一种不依赖于血清型的方式结合至铜绿假单胞菌的表面，并且在结合至细菌病原体时，介导、促进或增强针对细菌细胞如细菌病原体的调理吞噬(OPK)活性，这些细菌病原体例如机会假单胞菌株类 (例如铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌、以及产碱假单胞菌)和/或抑制这类细菌细胞附着至上皮细胞。

某些实施例披露一种鉴别与血清型无关的结合分子的方法，该方法包括：(a)在噬菌体中制备天然和/或康复期抗体文库，(b)通过耗尽淘筛来从文库中去除血清型特异性抗体，(c)针对不依赖于血清型特异性地结合至全细胞的抗体来筛选文库，并且(d)针对所希望的功能特性来筛选所得抗体。

某些实施例提供一种如在此披露的全细胞表型筛选方法，其中抗体噬菌体文库得自天然或铜绿假单胞菌感染的康复患者。使用初始针对血清型特异性反应性来选择的淘筛策略，分离结合铜绿假单胞菌全细胞的不同克隆。所选定的克隆被转化成人IgG1抗体并且被证实与铜绿假单胞菌临床分离物反应，不论血清型分类或组织分离位点如何(参见实例)。在此描述的功能活性筛选指示抗体可有效预防铜绿假单胞菌附着至哺乳动物细胞并且以一种浓度依赖性和不依赖于血清型的方式来介导调理吞噬(OPK)杀伤。

在另外的实施例中，上述结合分子或其片段、抗体或其片段或组合物结合至两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、或五种或更多种不同的铜绿假单胞菌血清型，或结合至至少80％、至少85％、至少90％、或至少95％的从受感染患者体内分离的铜绿假单胞菌菌株。在另外的实施例中，铜绿假单胞菌菌株是从肺、痰液、眼睛、脓汁、粪便、尿、窦、伤口、皮肤、血液、骨或膝关节液中的一种或多种中分离。

VIII.包含抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子的药物组合物

用于本披露中的药物组合物包含本领域普通技术人员熟知的药学上可接受的载体。用于肠胃外给予的制剂包括无菌水性或非水性溶液、混悬液以及乳液。如在此披露的某些药物组合物可以按一种可接受的剂型(包括例如胶囊、片剂、水性混悬液或溶液)来口服给予。某些药物组合物也可以通过鼻气雾剂或吸入来给予。还可以存在防腐剂和其他添加剂，例如像抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、以及惰性气体等。用于在此披露的治疗方法中使用的合适配制品被描述于《雷明登氏药学全书》(Remington's PharmaceuticalSciences)，Mack出版公司，第16版(1980)。

可与载体材料相组合以便产生单一剂型的抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)的量将取决于所治疗的宿主和具体给予模式而变化。也可以调整剂量方案以便提供最佳所希望的应答(例如治疗性或预防性应答)。组合物还可以包含分散于生物相容性载体材料中的抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)，该载体材料起化合物的合适递送或支撑***的作用。

IX.使用治疗性结合分子的治疗方法

制备如在此披露的抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)并且将它给予对其有需要的受试者的方法对于本领域技术人员来说是熟知的或容易由本领域技术人员来确定。抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)的给予途径可以是例如口服、肠胃外、吸入或局部。如在此使用的术语肠胃外包括例如静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内或皮下给予。合适的给予形式将是注射用溶液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。然而，在与在此的传授内容相容的其他方法中，如在此披露的抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)可以直接递送至有害细胞群体的部位，例如感染部位，从而增加患病组织对治疗剂的暴露。例如，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子可以直接给予眼部组织、烧伤或肺组织。

如在此披露的抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)可以按药学上有效量给予以便体内治疗假单胞菌感染。在这方面，应理解所披露的结合分子将被配制成有助于给予并且促进活性剂的稳定性。出于本申请的目的，药学上有效量应被认为是指足以实现有效结合至靶标并且实现益处，例如治疗、改善、减轻、清除或预防假单胞菌感染的量。

一些实施例是针对一种在有需要的受试者中预防或治疗假单胞菌感染的方法，该方法包括向受试者给予有效量的在此描述的结合分子或其片段、抗体或其片段、组合物、多核苷酸、载体或宿主细胞。在另外的实施例中，假单胞菌感染是铜绿假单胞菌感染。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，感染是眼部感染、肺感染、烧伤感染、伤口感染、皮肤感染、血液感染、骨感染、或所述感染中的两种或更多种的组合。在另外的实施例中，受试者患有急性肺炎、烧伤、角膜感染、囊性纤维化或其组合。

某些实施例是针对一种阻断或防止铜绿假单胞菌附着至上皮细胞的方法，该方法包括使上皮细胞与铜绿假单胞菌的混合物与在此描述的结合分子或其片段、抗体或其片段、组合物、多核苷酸、载体、或宿主细胞相接触。

还披露了一种增强铜绿假单胞菌的OPK的方法，该方法包括使吞噬细胞与铜绿假单胞菌的混合物与在此描述的结合分子或其片段、抗体或其片段、组合物、多核苷酸、载体、或宿主细胞相接触。在另外的实施例中，吞噬细胞是分化的HL-60细胞或人多形核白细胞(PMN)。

与本披露的范围相一致，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)可以根据前述治疗方法以足以产生治疗效果的量来给予人或其他动物。在此披露的抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)可以按常规剂型来给予这种人或其他动物，该剂型是通过根据已知技术将本披露的抗体与常规药学上可接受的载体或稀释剂相组合来制备。

用于治疗假单胞菌感染的本披露的组合物的有效剂量取决于许多不同因素而变化，这些因素包括给予方式、靶标部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、所给予的其他药剂，以及治疗是预防性还是治疗性的。通常，患者是人，但是也可以治疗非人哺乳动物包括转基因哺乳动物。治疗剂量可以使用本领域技术人员已知的常规方法来滴定，以最优化安全性和功效。

取决于本领域技术人员已知的不同因素，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)可在多个时刻以不同频次来给予。可替代地，抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)可以作为持续释放配制品来给予，在此情况下需要较不频繁给予。剂量和频次取决于抗体在患者体内的半衰期而变化。

本披露的组合物可以通过任何合适方法来给予，例如肠胃外、心室内、口服、通过吸入喷雾剂、局部、直肠、经鼻、口腔、经***或经由植入的储槽。如在此使用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病变内以及颅内注射或输注技术。

X.协同

周(Chou)和塔拉利(Talalay)(《酶调节进展》(Adv.Enzyme Regul.)，22：27-55(1984))开发了一种数学方法，用于在定性和定量方法中对联合药物效应的实验发现进行描述。对于互斥的药物，它们显示，广义的等效线方程(isobol equation)可用于任何程度的效应(见第52页，周(Chou)和塔拉利(Talalay))。等效线(isobol)或等效应图(isobologram)是两种具有同级效应的两种药物的所有剂量组合的图解说明。在等效应图中，直线表示累加效应，凹曲线(直线下方的曲线)代表协同效应，并且凸曲线(直线上方的曲线)代表拮抗效应。这些曲线还显示，两种互斥的药物的组合在整个浓度范围中会显示出相同类型，无论该组合是累加的、协同的还是拮抗的。多数药物组合显示有累加效应。然而在某些情况下，这些组合显示出低于或高于累加效应。这些组合分别被称为拮抗或协同。如果一种组合是治疗上优于以最佳剂量使用的一种成分或另一种成分，其表现出治疗协同。参见T.H.科比特(Corbett)等人，《癌症治疗报告》(Cancer Treatment Reports)，66，1187(1982)。塔拉里达(Tallarida)RJ(《药理学与实验治疗学杂志》(J Pharmacol Exp Ther)2001年9月；298(3)：865-72)还注意到“产生显然相似的效应的两种药物在同时给药时将有时产生过大的或降低的效应。需要定量评价来区别这些情况与简单的累加作用。”

可使用周(Chou)和塔拉利(Talalay)的联合用药指数(CI)方法来对协同效应进行测量(参见Chang等人，癌症研究(Cancer Res.)45：2434-2439，(1985))，这是基于中效原理的。这种方法计算了细胞毒性水平不同的两种药物之间的协同的、累加的或拮抗的程度。当CI值小于1时，在两种药物之间有协同作用。当CI值是1时，有累加效应，但是没有协同效应。CI值大于1，指示拮抗作用。CI值越小，协同效应越大。在另一个实施例中，通过使用部分抑菌浓度(FIC)来确定协同效应。通过对在联合用药中起作用的药物的IC50进行表达来确定这个分数值，作为该药物单独作用的IC50的函数。对于两种互相作用的药物，对于各药物的FIC值的总和表示协同的相互作用的测量值。当FIC小于1时，在两种药物之间有协同作用。FIC值是1，指示累加效应。FIC值越小，协同相互作用越大。

在一些实施例中，在假单胞菌治疗中得到协同效应，其中给予一种或更多种“低剂量的”结合剂(即使用被认为在单独给药时是无治疗作用的一个或多个剂量)，其中低剂量结合剂与其他结合剂(给予低或治疗剂量)的联合给药会产生一种协同效应，超过了以另外方式由单独给予单个结合剂而产生的累加效应。在一些实施例中，可通过给予一种或多种“低剂量”结合剂来实现该协同效应，其中低剂量被提供为可降低或避免毒性或其他不希望的副作用。

XI.免疫测定

抗假单胞菌Psl和/或PcrV结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)可以通过在本领域中已知的任何方法来针对免疫特异性地结合进行测定。可使用的免疫测定包括但不限于使用如以下技术的竞争性和非竞争性测定***：蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定，仅举几个例子。这类测定是常规的并且在本领域中是熟知的(参见例如奥苏贝尔等人编著的《当前分子生物学方案》，约翰&威利父子公司，纽约，第1卷(1994)，其通过引用以其全部内容结合在此)。示例性免疫测定在下文简要地描述(但是不意图通过限制方式)。

有多种方法可供用于测量抗体-抗原相互作用的亲和力，但是用于确定速率常数的方法相对很少。大多数方法依赖于将抗体或抗原进行标记，这不可避免地使常规测量复杂化并且在所测量的数量中引入不确定性。抗体亲和力可以通过许多方法包括ELISA以及FACS来测量。

***使用96孔板形式的生物传感器来报告动力学分析。蛋白质结合和解离事件可以通过测量溶解的一种蛋白质与固定于FortéBio生物传感器上的第二蛋白质的结合来监测。在测量抗Psl或PcrV抗体与Psl或PcrV结合的情况下，将Psl或PcrV固定至尖端上，随后分析溶解的抗体的结合。然后通过仪器传感器来检测抗体与固定的Psl或PcrV的缔合以及解离。然后收集数据并且输出至GraphPad Prism以便进行亲和力曲线拟合。

如在上执行的表面等离子体共振(SPR)提供优于测量抗体-抗原相互作用的亲和力的常规方法的许多优势：(i)不需要对抗体或抗原进行标记；(ii)抗体不需要提前纯化，可直接使用细胞培养物上清液；(iii)能够进行实时测量，从而允许对不同单克隆抗体相互作用进行快速半定量比较，并且对于许多评估目的来说是足够的；(iv)可使生物特异性表面再生以使得一系列不同单克隆抗体可在相同条件下容易地比较；(v)分析程序完全自动化，并且可在没有使用者干预的情况下执行一系列广泛的测量。BIA应用手册(BIAapplications Handbook)，AB版(1998年再版)、代号BR-1001-86；BIA技术手册(BIAtechnology Handbook)，AB版(1998年再版)、代号BR-1001-84。

基于SPR的结合研究需要将结合对的一个成员固定于传感器表面上。固定的结合搭配物被称为配体。溶解的结合搭配物被称为分析物。在一些情况下，配体经由结合至被称为捕获分子的另一个固定分子来间接地附着至表面。当分析物结合或解离时，SPR应答反映了检测器表面的质量浓度的变化。

基于SPR，实时测量直接在相互作用发生时对它们进行监测。该技术完全适合于确定动力学参数。比较性亲和力分级(ranking)可极为简单地执行，并且动力学与亲和力常数两者可从传感图数据得到。

当分析物以离散脉冲来注射至配体表面上时，所得传感图可划分成三个基本相：(i)样品注射过程中分析物与配体的缔合；(ii)样品注射过程中的平衡或稳态，其中分析物结合速率通过从复合物解离来平衡；(iii)缓冲液流动期间分析物从表面上的解离。

缔合和解离相提供关于分析物-配体相互作用的动力学的信息(k_a和k_d，复合物形成和解离速率，k_d/k_a＝K_D)。平衡相提供关于分析物-配体相互作用的亲和力的信息(K_D)。

BIA评估(BIAevaluation)软件提供用于使用数值积分与全局拟合算法来进行曲线拟合的综合工具(facilities)。通过对数据进行适当分析，相互作用的单独速率和亲和力常数可以从简单的研究来获得。可通过此技术来测量的亲和力的范围非常广泛，在从mM到pM的范围内。

表位特异性是单克隆抗体的重要特性。与使用放射免疫测定、ELISA或其他表面吸附方法的常规技术相比，使用的表位作图不需要标记或纯化抗体，并且允许使用一系列多个单克隆抗体来进行多位点特异性试验。另外，大量分析可自动处理。

成对结合实验测试两个MAb同时结合至同一抗原的能力。针对单独表位的MAb将独立地结合，而针对相同或紧密相关表位的MAb干扰彼此的结合。使用进行的这些结合实验可简单地执行。

例如，可使用捕获分子来结合第一Mab，随后依序添加抗原和第二MAb。传感图解释：1.抗原结合至第一Mab的量，2.第二MAb结合至表面附着抗原的程度，3.如果第二MAb未结合，逆转成对试验的顺序是否会改变结果。

肽抑制是用于表位作图的另一种技术。这种方法可以对成对抗体结合研究进行补充，并且可在抗原的基本序列已知时，将功能表位与结构特征相关联。肽或抗原片段针对抑制不同MAb与固定抗原的结合来进行测试。干扰给定MAb的结合的肽被认为在结构上与由所述MAb限定的表位相关。

XII.给药

给予一种包含一种抗Psl结合域或抗PcrV结合域的组合物或一种包含抗Psl和抗PcrV结合域两者的组合物，其给予方式可在患者的假单胞菌治疗中提供协同效应。可以按任何合适的手段来给予，可使这种给药能够提供希望的治疗效应，即协同效应。在某些实施例中，在治疗的相同周期中给予抗体，例如在预定的时间内的一个治疗周期中，给予受试者两种抗体。在一些实施例中，可在单独治疗周期的序贯治疗期间给予抗体，例如涉及给予抗Psl抗体的第一治疗周期以及涉及给予抗PcrV抗体的第二治疗周期。给予患者的结合域的剂量还将取决于给药频次，并且可以由本领域的普通技术人员很容易地确定。

在其他实施例中，在一个治疗周期中会给予一次以上的结合域。例如，在一些实施例中，在一个三周或四周的治疗周期中，每周给予结合域一次，持续三周。

如果可提供希望的治疗效应，包含一种或更多种结合域的组合物可以在同一天或不同天给予。

本领域的普通技术人员将易于清楚的是，在本发明中也适合使用可提供希望的治疗效应的其他剂量或频次的给药。

XII.试剂盒

在另外的其他实施例中，本发明提供了试剂盒，这些试剂盒可被用于进行在此所述的方法。在某些实施例中，试剂盒包括一种在一个或多个容器中的在此披露的结合分子。本领域的普通技术人员将易于认识到，本发明披露的结合域、多肽和抗体可易于与本领域中熟知的已建立的试剂盒形式相结合。

***

除非另外指示，否则本披露的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA以及免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技能范围内。这类技术在文献中得到充分解释。参见例如《分子克隆：实验手册》，第2版，萨布鲁克等人编著，冷泉港实验室出版社，(1989)；《分子克隆：实验手册》，萨布鲁克等人编著，冷泉港实验室，纽约(1992)；《DNA克隆》(DNA Cloning)，D.N.格洛夫(Glover)编著，第I卷和第II卷(1985)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)，M.J.盖特(Gait)编著(1984)；穆利斯(Mullis)等人，美国专利号：4,683,195；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)，B.D.黑姆斯(Hames)&S.J.希金斯(Higgins)编著(1984)；《转录与翻译》，B.D.黑姆斯&S.J.希金斯)编著(1984)；《动物细胞的培养》(Culture Of Animal Cells)，R.I.弗莱士尼(Freshney)，艾伦.艾.利斯公司(Alan R.Liss，Inc.)(1987)；《固定化细胞与酶》(Immobilized Cells And Enzymes)，IRL出版社(1986)；B.帕柏尔(Perbal)，《分子克隆实用指南》(A Practical Guide To Molecular Cloning) (1984)；专题论文：《酶学方法》(Methods In Enzymology)，学术出版社公司，纽约；《哺乳动物细胞的基因转移载体》(GeneTransfer载体s For Mammalian Cells)，J.H.米勒(Miller)&M.P.卡洛斯(Calos)编著，冷泉港实验室(1987)；《酶学方法》(Methods In Enzymology)，第154卷与第155卷(Wu(吴)等人编著)；《细胞与分子生物学中的免疫化学方法》(Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology)，迈耶(Mayer)&沃克(Walker)编著，学术出版社，伦敦(1987)；《实验免疫学手册》(Handbook Of Experimental Immunology)，第I-IV卷，D.M.韦尔(Weir)&C.C.布莱克韦尔(Blackwell)编著(1986)；《操纵小鼠胚胎》(Manipulating the Mouse Embryo)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(1986)；以及奥苏贝尔等人，《当代分子生物学方案》，约翰&威利父子公司，巴尔的摩(Baltimore)，马里兰州(1989)。

在《抗体工程学》(AntibodyEngineering)第二版，C.A.K.Borrebaeck，Ed.，牛津大学出版社(Oxford Univ.Press)(1995)中提出了抗体工程的普遍原理。在《蛋白质工程学》(Protein Engineering)实用方法(A Practical Approach)赖克伍德(Rickwood)，D.等人，牛津大学出版社(Oxford Univ.Press)英文版(1995)中，提出了蛋白质工程的普遍原理。在Nisonoff，A.，《分子免疫学杂志》(Molecular Immunology)第二版，Sinauer Associates出版社，桑德兰(Sunderland)，MA(1984)以及斯图尔德，M.W.，“抗体，其结构与功能”，查普曼(Chapman)和霍尔(Hall)，纽约，NY(1984)中，提出了抗体与抗体-半抗原结合的普遍原理。此外，本领域中已知的免疫学标准方法，不再做具体的描述，大体上遵循以下如《当代免疫学实验手册》(Current Protocols in Immunology)，约翰&威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约；斯蒂茨(Stites)等人(eds)，《基础临床免疫学》(Basic and Clinical-Immunology)(第八版)，阿普尔顿(Appleton)及兰格(Lange)，诺瓦克(Norwalk)，CT(1994)以及曼特尔(Mishell)和Shiigi(eds)，《细胞免疫学方法选择》(Selected Methods inCellular Immunology)，弗里曼公司(W.H.Freeman and Co.)，纽约(1980)。

提出了免疫学一般原则的标准工具书包括：《当代免疫学实验手册》(CurrentProtocols in Immunology)，约翰&威利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约；克莱因(Klein)，免疫学杂志(J.Immunology)：《免疫学：自我-非自身辨别的科学》(Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination)，约翰&威利父子公司，纽约(1982)；肯尼特(Kennett)，R.等人(eds.)，单克隆抗体，杂交瘤：在生物分析中的一个新的层面，普莱纽姆出版社(Plenum Press)，纽约(1980)；坎贝尔(Campbell)，A.，“单克隆抗体技术(Monoclonal Antibody Technology)”伯登(Burden)，R.等人(eds.)，生物化学和分子生物学的实验室技术(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology)第13卷，Elsevere，阿姆斯特丹(1984)，《Kuby免疫学》(Kuby Immunnology)第四版，理查德(Richard)A.格士柏(Goldsby)，托马斯(Thomas)J.金特(Kindt)和芭芭拉(Barbara)A.奥斯本(Osborne)，弗里曼公司(H.Freemand&Co.)(2000)；罗义特(Roitt)，I.，博劳斯托夫(Brostoff)， J.以及迈尔(Male)D.，《免疫学》(Immunology)，第6版，伦敦：莫斯比出版社(Mosby)(2001)；阿巴斯(Abbas)·A、阿布(Abul)·A、以及李奇曼(Lichtman)·A，《细胞与分子免疫学》(Cellular and Molecular Immunology)第5版，爱思唯尔健康科学部(Elsevier Health Sciences Division)(2005)；科特曼(R.Kontermann)和迪贝尔(Dubel)，《抗体工程学》(AntibodyEngineering)，施普林格出版公司(Springer Verlag)(2001)；萨姆布鲁克(Sambrook)和拉塞尔(Russell)，分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:a Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)(2001)；列文(Lewin)，基因VIII，普伦蒂斯·霍尔出版社(Prentice Hall)(2003)；哈洛(Harlow)和莱恩(Lane)，《抗体：实验室手册》(Antibodies:A laboratory manual)，冷泉港出版社(1988)；迪芬巴赫(Dieffenbach)和Dveksler，《PCR引物》(PCR Primer)冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)(2003)。

实例

实例1：人类抗体噬菌体展示文库的构建和筛选

此实例描述与靶标无关的全细胞淘筛方法，该方法使用得自首次试验的和铜绿假单胞菌感染的康复患者的人抗体噬菌体文库，以便鉴别针对假单胞菌感染的新颖保护性抗原(图1A)。体外功能筛选中包括的测定包括调理吞噬(OPK)杀伤测定和使用上皮细胞系A549进行的细胞附着测定。基于优良体外活性的先导候选物在铜绿假单胞菌急性肺炎、角膜炎以及烧伤感染模型中进行测试。

图1B展示患者抗体噬菌体展示文库的构建。在诊断7-10天后，从6个恢复患者体内汇集全血，随后进行RNA提取和噬菌体文库构建，如先前所述(沃恩.T.J(Vaughan)等人，《自然：生物技术》(Nat Biotechnol)14，309-314(1996)；拉马特(Wrammert)J.等人，《自然》453，667-671(2008))。图1C展示最终克隆的scFv文库包含5.4x10⁸个转化子并且测序揭示79％的scFv基因是全长的并且是同框的。在文库选择之前，对于确定表位特异性来说经常重要的VH CDR3环在氨基酸水平上有84％的相异性。

除了患者文库以外，含有多达1x10¹¹个结合成员的天然人scFv噬菌体展示文库(劳埃德(Lloyd)C.等人，《蛋白质工程的设计与选择》(Protein Eng Des Sel)22，159-168(2009))用于抗体分离(沃恩(Vaughan)T.J.等人，《自然：生物技术》14，309-314(1996))。将热灭活的铜绿假单胞菌(1x10⁹)固定于IMMUNO^TM试管(能肯公司(Nunc)；MAXISORP^TM)中随后如所描述地进行噬菌体展示选择(伏恩(Vaughan)T.J.等人，《自然：生物技术》14，309-314(1996))，除了三乙醇胺(100nM)用作洗脱缓冲液以外。为了在悬浮的铜绿假单胞菌上进行选择，将热灭活的细胞阻断，随后将阻断的噬菌体添加至细胞。在洗涤之后，如所描述地将洗脱的噬菌体用于感染大肠杆菌细胞(伏恩，1996)。如所描述地来执行从大肠杆菌中救援噬菌体并且通过ELISA来结合至热灭活的铜绿假单胞菌(伏恩，1996)。

遵循全细胞亲和力选择方法的开发和验证，新的康复患者文库与先前构建的天然文库(伏恩T.J.等人，《自然：生物技术》14，309-314(1996)) 在具有完整O抗原的铜绿假单胞菌菌株3064连同缺乏O抗原的表面表达的同基因wapR突变株的悬浮液上进行亲和力选择。图1D示出与天然文库相比，对于患者文库来说，来自连续患者文库选择的输出滴度被发现以更大速率增加(在轮次3，相应地为1x10⁷对比3x10⁵)。另外，还发现VH CDR3环序列在文库中的重复(选择过程中克隆富集的度量)在患者文库中较高，在第3轮达到88％-92％，这与第3轮时天然文库中的15％-25％形成对比(图1D)。来自亲和力选择的单独scFv噬菌体接着通过ELISA针对与铜绿假单胞菌异源血清型菌株的反应性来筛选(图1E)。ELISA板(能肯公司；MAXISORP^TM)如所描述地用来自过夜培养物的铜绿假单胞菌菌株涂布(迪干多梅里科(DiGiandomenico)A.等人，《感染与免疫》(Infect Immun)72，7012-7021(2004))。将稀释抗体添加至阻断板持续1小时、洗涤并且用HRP轭合的抗人二级抗体处理1小时，随后如所描述地显影并且分析(阿尔布兰德特(Ulbrandt)N.D.等人，《病毒学杂志》(J Virol)80，7799-7806(2006))。使用两种文库从全细胞选择获得的优势种噬菌体产生血清型特异性反应(数据未示出)。选择在不存在非特异性地结合至大肠杆菌或牛血清清蛋白的情况下展现出不依赖于血清型的结合的克隆用于进一步评估。

对于IgG表达，如所描述地将所选定的抗体的VH和VL链克隆至人类IgG1表达载体中、在HEK293细胞中共表达，并且通过蛋白质A亲和色谱法来纯化(帕斯克(Persic)L.等人，《基因》187，9-18(1997))。所制得的具有来自这些选定的不依赖于血清型的噬菌体的可变区的人类IgG1抗体被针对铜绿假单胞菌特异性来加以证实，并且优先用于通过FACS分析来进行的全细胞结合至显性临床相关的血清型(图1F)的后续分析，因为这种方法比ELISA更严格。对于基于流式细胞术的结合测定，将中间对数期铜绿假单胞菌菌株在PBS中浓缩至OD₆₅₀为2.0。在4℃下伴以振荡来孵育抗体(10μg/mL)和细菌(约1x10⁷个细胞)1小时之后，洗涤的细胞用亚历克萨荧光剂(Alexa Fluor)山羊抗人IgG抗体(加利福尼亚州卡尔斯巴德市的英杰公司)在4℃下孵育0.5小时。洗涤的细胞如所推荐的用BacLight^TM绿色细菌染色剂来染色(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)。样品在LSR II流式细胞仪(碧迪生物科学(BD Biosciences))上操作并且使用BD FacsDiva(6.1.3版)以及FlowJo(9.2版；TreeStar公司)来分析。通过FACS证实展现出结合的抗体进一步优先用于在调理吞噬杀伤(OPK)测定中进行功能活性测试。

实例2：mAb促进铜绿假单胞菌的OPK的评估

此实例描述优先的人类IgG1抗体促进铜绿假单胞菌的OPK的评估。图2A示出除了WapR-007和阴性对照抗体R347以外，所有抗体均介导发光铜绿假单胞菌血清组O5菌株(PAO1.lux)的浓度依赖性杀伤。WapR-004和Cam-003展现出优良OPK活性。OPK测定如(迪干多梅里科A.等人，感染与免疫72，7012-7021(2004))所描述、加以修改来执行。简单地说，测定是在96孔板中使用0.025ml的每一种OPK组分、铜绿假单胞菌菌株、稀释的幼兔血清、分化的HL-60细胞、以及单克隆抗体来执行。在一些OPK测定中，使用如(蔡(Choi)K.H.等人，自然：方法2，443-448(2005))所描述构建的发光铜绿假单胞菌株。发光OPK测定如上所述来执行，但是相对荧光素酶单位(RLU)的确定是使用珀金埃尔默(Perkin Elmer)Envision多标记板读取器(Perkin Elmer)来进行。

评估WapR-004和Cam-003抗体介导针对另一种临床相关O抗原血清型菌株9882-80.lux的OPK活性的能力。图2B示出增强的WapR-004和Cam-003OPK活性延伸至菌株9882-80(O11)。

另外，此实例描述scFv-Fc形式的WapR-004(W4)突变体促进铜绿假单胞菌的OPK的评估。一种突变体Wap-004RAD(W4-RAD)经由定点诱变来特别地产生以便去除VH中的RGD基序。其他W4突变体制备如下。如(鲁，K.H.，PCR方法和应用(PCR Methods Appl)4，S185-194(1995))所描述，执行嵌套式PCR以从得自铜绿假单胞菌感染的康复患者的scFv文库扩增W4变体(得自体细胞高度突变)，以便进行分析。这是产生WapR-004的文库。W4变体片段使用在本领域中已知的标准程序来亚克隆并且测序。将W4突变体轻链(LC)与WapR-004重链(HC)重组以便产生scFv-Fc形式的W4突变体。另外，将WapR-004RAD重链(HC)突变体与scFv-Fc形式的M7和M8的母体LC重组。构建体使用在本领域中已知的标准程序来制备。图11(A-M)示出除了阴性对照抗体R347以外，所有WapR-004(W4)突变体介导发光铜绿假单胞菌血清组O5菌株(PAO1.lux)的浓度依赖性杀伤。

将WapR-004-RAD可变区种系化，以降低潜在的免疫原性，产生了 WapR-004-种系(“WapR-004-GL”)，并且通过定点诱变而引发先导物优化。在基于竞争的筛选中选择具有改善的Psl亲和性的克隆。按亲和力的改善进行前几个克隆的排序，并在体外功能测定中进行分析。14种先导物优化的克隆是：Psl0096、Psl0170、Psl0225、Psl0304、Psl0337、Psl348、Psl0567、Psl0573、Psl0574、Psl0582、Psl0584、Psl0585、Psl0588和Psl0589。

实例3：不依赖于血清型的抗铜绿假单胞菌抗体靶向Psl外泌多糖

这个实例描述得自表型筛选的抗铜绿假单胞菌抗体的靶标的鉴别。执行靶标分析以便测试是否不依赖于血清型的抗体靶向蛋白质或碳水化合物抗原。在ELISA中未观察到与用蛋白酶K彻底消化的PAO1全细胞提取物的结合的损失，这表明反应性靶向表面可及的碳水化合物残基(数据未示出)。在造成以下各项的基因中构建同基因突变体：O-抗原、褐藻酸盐以及LPS核心生物合成；wbpL(O-抗原缺陷)；wbpL/algD(O-抗原和褐藻酸盐缺陷)；rmlC(O-抗原缺陷和截短的外核)；以及galU(O-抗原缺陷和截短的内核)。铜绿假单胞菌突变体是基于施魏策尔(Schweizer)描述的等位基因替换策略来构建(施魏策尔，H.P.，《分子微生物学杂志》6，1195-1204(1992)；施魏策尔，H.D.，《生物技术》15，831-834(1993))。载体从大肠杆菌菌株S17.1动员至铜绿假单胞菌菌株PAO1中；重组体如(黄(Hoang)，T.T.等人，《基因》212，77-86(1998))所描述的来分离。基因缺失通过PCR来证实。铜绿假单胞菌突变体与具有野生型基因的基于pUCP30T的构建体互补。抗体的反应性在用上述所指示的铜绿假单胞菌菌株涂布的板上通过间接ELISA来确定：图 3A显示，与wbpL或wbpL/algD双重突变体结合的Cam-003未受影响，然而与rmlC和galU突变体的结合消失了。虽然这些结果与结合至LPS核心一致，但是未观察到与从PAO1纯化的LPS的反应性。最近显示rmlC和galU基因是Psl外泌多糖、即由D-甘露糖、L-鼠李糖以及D-葡萄糖组成的一种重复五糖聚合物的生物合成所必需的。测试Cam-003与同基因剔除pslA的PAO1ΔpslA的结合，因为pslA为Psl生物合成所必需(伯德(Byrd)M.S.等人，《分子微生物学杂志》73，622-638(2009))。当通过ELISA(图3B)和FACS(图3C)测试时，Cam-003与PAO1ΔpslA的结合被消除，而此突变体中的LPS分子未受影响(图3D)。Cam-003的结合在用pslA补充的PAO1ΔwbpL/algD/pslA三重突变体中得以恢复(图3E)，这如同与突变体相对照，Cam-003介导针对补充的PAO1ΔpslA的调理杀伤的能力得以恢复一样(图3F和3G)。Cam-003抗体与Pel外泌多糖突变体的结合也未受影响，从而进一步证实Psl是抗体靶标(图3E)。结合测定证实剩余抗体也结合Psl(图3H和3I)。

实例4：抗Psl mAb阻断铜绿假单胞菌附着至所培养的上皮细胞。

此实例示出抗Psl抗体阻断铜绿假单胞菌与上皮细胞缔合。将抗Psl抗体添加至在不透明96孔板(能肯公司的Nunclonδ)中生长的A549细胞(腺癌人肺泡基底上皮细胞系)的汇合单层。在10的MOI下添加对数期发光铜绿假单胞菌PAO1菌株(PAO1.lux)。将PAO1.lux与A549细胞在37℃下孵育1小时之后，将A549细胞洗涤，随后添加LB+0.5％葡萄糖。在37℃下短暂孵育之后，将细菌量化，如在实例2中描述的OPK测定中执行。来自不具有 A549细胞的孔的测量结果用于校正非特异性的结合。图4示出除了Cam-005和WapR-007以外，所有抗体均以剂量依赖性方式来减少PAO1.lux与A549细胞的缔合。在OPK测定中执行最好的mAb，WapR-004以及Cam-003(参见图2A-B，以及实例2)在抑制铜绿假单胞菌细胞附着至A549肺上皮细胞方面也是活性最大，与阴性对照相比，提供多达约80％的减少。WapR-016是第三种活性最大的抗体，示出与WapR-004和Cam-003相类似的抑制活性，但是是在高10倍的抗体浓度下。

实例5：体内传代的铜绿假单胞菌菌株保持/增加Psl的表达

为了测试是否维持Psl的体内表达，腹膜内向小鼠注射铜绿假单胞菌分离物，随后在感染后四小时，通过腹腔灌洗来收获细菌。Psl的存在使用对照抗体和Cam-003通过流式细胞术来分析，因为抗体结合的条件更严格并且允许针对对于Psl表达呈阳性或阴性的细胞进行量化。对于离体结合，从过夜TSA板来制备细菌接种物(0.1ml)并且腹膜内递送至BALB/c小鼠。激发之后4小时，将细菌收获，将RBC溶解、超声处理并且重新悬浮于补充有0.1％吐温20和1％BSA的PBS之中。将样品染色并且分析，如先前在实例1中所述。图5展示在用三种野生型铜绿假单胞菌菌株腹腔灌洗之后收获的细菌显示出强Cam-003染色，这种情况与对数期培养的细菌是可比较的(比较图5A与5C)。当与接种物相比较时，体内传代的野生型细菌展现出增强的染色(比较图5B与5C)。在接种物内，Psl未针对菌株6077检测到并且针对菌株PAO1(O5)以及6206(O11-细胞毒性)最低限度地检测到。相对于接种物，Cam-003与细菌的结合增加，这指示Psl表达在体内得以维持或增加。在体内传代之后，野生型菌株6077、PAO1以及6206表达Psl，然而具有pslA缺失的菌株PAO1(PAO1ΔpslA)不能与Cam-003反应。这些结果进一步强调Psl是单克隆抗体的靶标。

实例6：在铜绿假单胞菌急性肺炎模型中用抗Psl单克隆抗体Cam-003和WapR-004处理的动物的存活率

在每个模型中，在感染之前24小时给予抗体或PBS。铜绿假单胞菌急性肺炎、角膜炎以及热损伤感染模型如(迪干多梅里科(DiGiandomenico)·A等人，美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci U S A)104，4624-4629(2007))所描述地、加以修改来执行。在急性肺炎模型中，将BALB/c小鼠(杰克逊实验室(The Jackson Laboratory))用悬浮于0.05ml接种物中的铜绿假单胞菌菌株来感染。在热损伤模型中，CF-1小鼠(查理斯河(CharlesRiver))受到用加热至92℃的金属烙铁(brand)持续10秒产生的10％全身表面积烧伤。将动物用指示剂量的铜绿假单胞菌菌株6077来皮下感染。对于器官负荷实验，在小鼠体内诱导急性肺炎，随后在感染后24小时收获肺、脾以及肾脏以便确定CFU。

在急性致死肺炎模型中，针对代表与临床疾病相关联的最频繁血清型的铜绿假单胞菌菌株来评估单克隆抗体Cam-003和WapR-004。图6A和6C示出当与对照相比较时，用菌株PAO1和6294感染的Cam-003处理的小鼠的显著浓度依赖性存活率。图6B和6D示出45和15mg/kg的Cam-003提供抗 33356和细胞毒性菌株6077激发的完全保护，而在5mg/kg的33356和6077下相应地观察到80％和90％的存活率。图6E和6F示出在菌株6077(O11)(8x10⁵CFU)(图6E)，或6077(011)(6x10⁵CFU)(图6F)的急性肺炎模型中，WapR-004处理的小鼠的显著浓度依赖性存活率。

接着检查Cam-003和WapR-004减少肺中的铜绿假单胞菌器官负荷和扩散至远端器官的能力，并且稍后动物用不同浓度的WapR-004、Cam-003或对照抗体在若干不同浓度下来进行处理。针对所测试的所有四个菌株，Cam-003有效减少铜绿假单胞菌肺负荷。Cam-003最有效地抵抗高度致病性细胞毒性菌株6077，其中低剂量与较高剂量一样有效(图7D)。在PAO1(图7A)、6294(图7C)以及6077(图7D)感染的小鼠中，Cam-003在减少传播至脾以及肾脏方面是具有显著效果的，而在33356感染的小鼠中，未观察到传播至这些器官(图7B)。图7E和7F示出类似地，在用6294(O6)和6206(O11)诱导急性肺炎之后，WapR-004可以减少器官负荷。确切地说，在受感染小鼠中，WapR-004可有效减少铜绿假单胞菌传播至脾和肾脏。

实例7：抗PcrV单克隆抗体V2L2的构建

通过超短免疫方法用r-PcrV对小鼠(再生元制药公司(RegeneronPharmaceuticals))进行免疫，并且使血清滴度遵循用于与PcrV结合并中和铜绿假单胞菌活菌的溶血活性。将血清中显示出抗溶血活性的小鼠处死，收获脾和***(轴、腹股沟和腘)。将来自这些器官的细胞群体与生物素化r-PcrV一起放置，用来选择抗PcrV特异性B细胞。然后将选择的细胞与小鼠骨髓瘤配偶体P3X63-Ag8融合，并且以25细胞/孔接种到杂交瘤选择培养基中。10天之后，用新鲜培养基完全替换来自杂交瘤孔的培养基，并且在另外的3-4天后，测定杂交瘤上清液的抗溶血活性。将显示出抗溶血活性的集落在96孔板上进行有限稀释克隆，0.2个细胞/孔，并且重复测定抗溶血活性。将显示出抗溶血活性的克隆放在含有超低IgG的杂交瘤培养基中进行适应。将适应培养基的IgG进行纯化，并测定其体外抗溶血活性以及体内对抗铜绿假单胞菌感染的保护性。还可通过竞争测定将抗体分为不同的组。对感兴趣的抗体的可变(V)域进行亚克隆，其cDNA来源于其不同的对应的克隆。将亚克隆的V段与和哺乳动物表达质粒中的相对应恒定域的cDNA进行框内融合。从HEK293细胞中对重组IgG进行表达和纯化。在从特定的克隆中得到一个以上的cDNA V-序列的情况下，所有可变重链和轻链的组合都被表达并表征，用来鉴别功能性IgG。

实例8：在铜绿假单胞菌角膜感染模型中，用抗Psl单克隆抗体Cam-003、WapR-004和抗PcrV单克隆抗体V2L2进行处理的动物的存活率

随后在强调病原体附着并且定殖在受损组织处的能力的铜绿假单胞菌角膜感染模型中评估Cam-003和WapR-004的功效。图8A-D和图8F-G示出与在阴性对照处理的动物中所观察到的相比，接受Cam-003和WapR-004的小鼠有显著较小的病状，并且减少了总眼睛匀浆中的细菌计数。图8E示出在热损伤模型中测试时，Cam-003也是有效的，在与抗体处理的对照相比较时，在15和5mg/kg下提供显著的保护。图8(H)：在铜绿假单胞菌小鼠眼角膜炎模型中，测试抗Psl和抗PcrV单克隆抗体V2L2的活性。在用6077(O11-细胞毒性-1x10⁶CFU)进行感染之前16个小时，对C3H/HeN小鼠腹膜内注射(IP)PBS或对照IgG1抗体(R347)45mg/kg、或WapR-004(α-Psl)5mg/kg、或V2L2(α-PcrV)5mg/kg。感染之前，立即将小鼠麻醉，随后使用27号针在解剖显微镜下在各小鼠的一只眼睛的角膜和浅层基质上形成三个1mm划痕，随后局部施用铜绿假单胞菌6077菌株，接种量为5μl。在感染之后48小时，对眼睛进行拍照，随后通过在解剖显微镜下目测进行角膜评级。角膜感染的评级如普勒斯顿(Preston)等人前面所述的(普勒斯顿(Preston)，MJ.，1995，《感染与免疫》(Infect Immun)63：3497)进行。简言之，在用菌株6077进行感染之后48h，对感染的眼睛进行评级，是由与动物处理无关的研究者进行的。使用下述评级方案：0级，眼睛与未感染的眼睛目视相同；1级，轻微混浊部分地遮盖瞳孔；2级，较深的混浊遮盖了瞳孔；3级，较深的混浊遮盖了整个瞳孔；4级，角膜穿孔(眼球萎缩)。与在R347对照mAb处理的动物中观察到的情况相比，接受全身剂量(IP)Cam-003或WapR-004RAD的小鼠显示出病理显著较少，并且全眼匀浆的细菌集落形成单位(CFU)降低。当与R347处理的对照相比时，在V2L2处理的动物中观察到了相似的结果。

实例9：Cam-003Fc突变体抗体Cam-003-TM具有降低的OPK和体内功效，但是维持抗细胞附着活性。

考虑到双重作用机制的潜力，产生Cam-003Fc突变体Cam-003-TM，该突变体在Fc域中具有减少其与Fcγ受体的相互作用的突变(奥加尼西安 (Oganesyan)·V等人，晶体学报D部分：生物晶体(Acta Crystallogr D Biol Crystallogr)64，700-704(2008))，以便鉴别保护是与抗细胞附着还是与OPK活性更大相关。铜绿假单胞菌突变体是基于施魏策尔(Schweizer)描述的等位基因替换策略来构建(施魏策尔，H.P.，《分子微生物学杂志》6，1195-1204(1992)；施魏策尔，H.D.，《生物技术》15，831-834(1993))。载体从大肠杆菌菌株S17.1动员至铜绿假单胞菌菌株PAO1中；重组体如(黄(Hoang)，T.T.等人，《基因》212，77-86(1998))所描述的来分离。基因缺失通过PCR来证实。铜绿假单胞菌突变体与具有野生型基因的基于pUCP30T的构建体互补。图9A示出与Cam-003相比，Cam-003-TM展现出OPK活性的4倍降低(EC₅₀相应地为0.24和0.06)，但是在细胞附着测定中同样有效(图9B)。图9C示出Cam-003-TM抵抗肺炎的有效性也较小，表明最佳OPK活性是最佳保护所必需的。OPK和细胞附着测定相应地如实例2和4中先前所述来执行。

实例10：抗Psl抗体的表位作图和相对亲和力

表位作图通过竞争ELISA来执行并且使用流动***以得自铜绿假单胞菌菌株PAO1的过夜培养物的上清液的Psl来证实。对于竞争ELISA，将抗体使用EZ-Link磺基-NHS-生物素和生物素化试剂盒(赛默飞世尔(Thermo Scientific))来生物素化。将抗原涂布的板用与未标记抗体共孵育的EC₅₀的生物素化抗体来处理。在与HRP-轭合的链霉抗生物素蛋白(赛默飞世尔)一起孵育之后，将板如上所述来显影。抗Psl mAb之间的竞争实验确定了抗体靶向至少三个独特表位，被称为第1类、第2类以及第3类抗体(图10A)。第1类和第2类抗体不竞争结合，然而第3类抗体WapR-016部分地抑制第1类和第2类抗体的结合。

抗体亲和力通过结合测定使用得自过夜PAO1培养物的上清液的Psl来确定。抗体K_D通过将每种抗体七个浓度的结合动力学取平均值来确定。亲和力测量通过384仪器使用384倾斜孔板来进行。来自过夜PAO1培养物的上清液±pslA基因用作Psl来源。将样品负载至氨基丙基硅烷(AminoPropylSilane)(在PBS中加以水合)传感器上并且阻断，随后在若干浓度下测量抗Psl mAb结合和至PBS+1％BSA中的解离。所有程序如(王(Wang)·X等人，《免疫学方法杂志》(J Immunol Methods)362，151-160)所描述来执行。缔合和解离原始ΔnM数据使用GraphPad Prism来进行曲线拟合。图10A示出以上表征的抗Psl抗体的相对结合亲和力。第2类抗体在所有抗Psl抗体中具有最高亲和力。图10A还示出细胞附着和OPK数据实验的总结。图10B显示了通过如在实例2中所描述的定点诱变方法的Wap-004RAD(W4RAD)突变体以及其他W4先导物优化突变体的相对结合亲和力和OPK EC50值。图10C显示了Wap-004RAD(W4RAD)、Wap-004RAD-种系(W4RAD-GL)以及先导物优化的抗Psl单克隆抗体(Psl0096、Psl0170、Psl0225、Psl0304、Psl0337、Psl348、Psl0567、Psl0573、Psl0574、Psl0582、Psl0584、Psl0585、Psl0588和Psl0589)的相对结合亲和力。基于增强的OPK活性，选择突出显示的克隆Psl0096、Psl0225、Psl0337、Psl0567和Psl0588，如在下述实例10中所述。

实例11：在铜绿假单胞菌调理吞噬杀灭(OPK)测定中的对先导物优化WapR-004(W4)突变体克隆和先导物优化抗Psl单克隆抗体的评价

本实例描述了先导物优化WapR-004(W4)突变体克隆和先导物优化抗Psl单克隆抗体对于促进使用如实例2中所述的方法的铜绿假单胞菌的OPK的评价。图11A-Q示出除了阴性对照抗体R347以外，所有抗体均介导发光铜绿假单胞菌血清组O5菌株(PAO1.lux)的浓度依赖性杀伤。

实例12：抗PcrV单克隆抗体V2L2降低了多种菌株的急性肺炎的致死性

使用下述三种方法对PcrV表位多样性进行分析：基于微球的流式细胞术方法、竞争性ELISA以及片段rPcrV蛋白质印迹法。抗PcrV mAb之间的竞争实验确定了抗体靶向至少六个独特表位，被称为第1类、第2类、第3类、第4类、第5类以及第6类抗体(图12A)。2类和3类抗体部分地竞争与代表下述另一种表位分类的mAb的结合：1类(V2L7、3G5、4C3和11A6)，2类(1E6和1F3)，3类(29D2、4A8和2H3)，4类(V2L2)以及5类(21F1、LE10和SH3)，如下所述被针对体内保护来测试。

使用杂交瘤技术来分离新颖的抗PcrV mAb，并且使用兔红细胞溶胞抑制测定来选择最有效力的T3SS抑制剂。对细胞毒性分析的抑制百分比进行分析，针对亲本V2L2mAb、mAb166(阳性对照)和R347(阴性对照)，其中将这些抗体与对数期的铜绿假单胞菌株6077(exoU+)一起加入到培养的支气管上皮细胞系A549中，其MOI为大约10。通过测定释放的乳酸脱氢酶(LDH)活性来对A549溶胞作用进行测定，并且将mAb存在下的溶胞作用与没有mAb存在的孔相比较，来确定抑制百分比。对V2L2mAb、mAb166(阳性对照)和R347(阴性对照)针对它们防止RBC溶胞的能力进行评价，其中将这些抗体与对数期的铜绿假单胞菌6077(exoU⁺)以及经洗涤的兔红细胞(RBC)进行混合，并在37℃孵育2小时。将完整的RBC沉淀，通过测定无细胞上清液的OD₄₀₅来确定溶胞作用的程度。将在抗PcrV mAb存在条件下的溶胞作用与没有mAb存在的孔相比较，来确定抑制百分比。阳性对照抗体mAb166是一种以前表征的抗PcrV抗体(《国际传染病杂志》(J Infect Dis.)186：64-73(2002)，《重症护理医学》(CritCare Med.)40：2320-2326(2012))。(B)亲本V2L2mAb被证实可抑制细胞毒性，IC50是0.10μg/ml，并展现出其IC50浓度比mAb166(IC502.8μg/ml)低28倍。(C)V2L2还被证实可预防RBC溶胞，IC50是0.37μg/ml，并显示出其IC50浓度比mAb166(IC503.7μg/ml)低10倍。

将V2L2可变区完全种系化，来降低潜在的免疫原性。使用节省诱变方法对V2L2进行亲和力成熟化，针对所有六种CDR使各位置随机分布20种氨基酸，鉴别亲和力改善的单一突变。然后使用对所有可能的亲和力改善的单一突变的组合进行编码的组合文库。使用IgG形式的结合ELISA，选择具有改善的PcrV亲和力的克隆。按亲和力的改善进行前几个克隆的排序，并在体外功能测定中进行分析。对V2L2CDR进行***性致突变，在基于竞争的筛选中选择具有改善的PcrV亲和力的克隆。对克隆按亲和力升高进行排序，并在体外功能测试中进行分析。如图12D中所示的，对V2L2种系化MAb (V2L2-GL)、V2L2-GL优化mAb(V2L2-P4M、V2L2-MFS、V2L2-MD和V2L2-MR)以及阴性对照抗体R347，使用假单胞菌菌株6077感染的A549细胞对RBC溶胞进行分析。证实V2L2-GL、V2L2-P4M、V2L2-MFS、V2L2-MD和V2L2-MR可预防RBC溶胞。如图12E中所示的，证实mAb1E6、1F3、11A6、29D2、PCRV02和V2L7可预防RBC溶胞。如在图12F中所示的，对于预防RBC溶胞，V2L2比29D2更有效力。

使用Bio-Rad ProteOn^TMXPR36仪器，对V2L2-GL与V2L2-MD的结合动力学进行测量。在使用抗人IgG试剂的GLC生物传感器芯片上捕获抗体。注射多种浓度的rPcrV蛋白，并且随后是600秒的解离期。将数据捕获，并使用ProteOn Manager软件进行分析。图12(G-H)显示了(G)V2L2-GL与(H)V2L2-MD抗体的相对结合亲和力。克隆V2L2-MD的Kd比V2L2-GL升高了2-3倍。

在小鼠中使用急性肺炎模型对给予抗PcrV抗体的体内效应进行研究。各组小鼠用浓度递增的V2L2抗体、阳性对照抗PcrV抗体(mAb166)或阴性对照(R347)进行处理，如图13(A-B)中所示的。各组小鼠还用浓度递增的V2L2抗体、PcrV抗体PcrV-02或阴性对照(R347)进行处理，如图13(C-D)中所示的。治疗后二十四小时，用5x10⁷CFU(C)铜绿假单胞菌6294(O6)或(D)PA103A(O11)对所有小鼠进行感染。如图13中所示的，在感染后48小时，几乎所有对照处理的动物都出现了感染。然而，V2L2显示出甚至在感染后168小时之外仍对于提高存活具有剂量依赖效应。另外，与 mAb166相比，在相近的剂量下，V2L2提供了显著更为有效的保护(菌株6077，P＝0.025，5mg/kg；菌株6294，P<0.0001，1mg/kg)。

将各组小鼠用浓度递增的11A6、3G5或V2L7，浓度相同的29D2、1F3、1E6、V2L2、LE10、SH3、4A8、2H3或21F1，浓度递增的29D2、浓度递增的V2L2、PcrV抗体PcrV-02或阴性对照(R347)进行处理，如图13(E-H)所示的。在鼻内感染假单胞菌菌株6077(1x10⁶CFU/动物)之前24小时，对小鼠腹膜内注射(IP)mAb。如图13E所示，mAb11A6、3G5和V2L7没有提供体内保护。如图13F所示，mAb29D2提供了体内保护。如图13G所示，mAbV2L2还提供了体内保护。图13H显示了29D2与V2L2的体内比较。图13I显示，mAb V2L2可保护对抗其他假单胞菌菌株(即6294和PA103A)。

还研究了响应于V2L2给予，假单胞菌感染的小鼠的器官负荷。图14(A)用1mg/kgR347(对照)或1mg/kg、0.2mg/kg或0.07mg/kg的V2L2对小鼠进行处理，并且然后用1.2x10⁶cfu的假单胞菌6206进行鼻内感染。图14(B)用15mg/kg R347(阴性对照)；15.0mg/kg，5.0mg/kg或1.0mg/kg mAb166(阳性对照)；或5.0mg/kg、1.0mg/kg或0.2mg/kg V2L2对小鼠进行处理，并且然后用5.5x10⁶cfu的假单胞菌6206进行鼻内感染。如图14(A-B)所示，当V2L2对于肾中的清除具有较小的效应时，它可以按一种剂量依赖的方式大大降低对肺和脾两者的散播。此外，与mAb166相比，在相近的剂量下，V2L2的器官CFU是更为显著地下降的(P<0.0001，1mg/kg，肺)。

实例13：使用WapR-004(抗Psl)和V2L2(抗PcrV)抗体的联合治疗的体内活性

在使用抗体V2L2和WapR-004(RAD)的小鼠中，对于抗Psl和抗PcrV结合域的联合给药的体内效应进行了进一步的研究。用R347(2.1mg/kg-阴性对照)、V2L2(0.1mg/kg)、W4-RAD(0.5mg/kg)或V2L2/W4组合(各为0.1、0.5、1.0或2.0mg/kg)对各组小鼠进行处理。给予抗体后二十四小时，用含有5.25x10⁵cfu6206(O11-ExoU+)的接种物对所有小鼠进行感染。感染后二十四小时，收获肺、脾和肾，匀浆，并且铺板，用于鉴定每克组织中的集落形成单位(CFU)。如图15所示，在测试浓度下，V2L2和W4均有效降低器官负荷，V2L2/W4组合显示出在组织清除中的累加效应。肺组织的组织学检查揭示，与接受单独V2L2或WapR-004的小鼠相比，具有更少的出血、更少的水肿以及更少的炎性浸润(表5)。

还对接受相似免疫的动物进行了急性肺炎感染的存活率的评价。

实例14：在铜绿假单胞菌急性肺炎模型中，用抗PcrV单克隆抗体V2L2进行处理的动物的存活率

在急性致死性肺炎模型中，对于对抗铜绿假单胞菌6077菌株的单克隆抗体V2L2-GL、V2L2-MD、V2L2-A、V2L2-C、V2L2-PM4和V2L2-MFS进行评价，如在前面的实例11中所述的。图16(A-F)显示了与对照相比时，所有V2L2处理的感染菌株6077的小鼠的存活率。然而，在V2L2抗体的0.5mg/kg和1mg/kg(A-C)剂量或0.5mg/kg和0.1mg/kg(D-F)剂量之间，在存活率方面没有观察到显著的差异。显示了在较低剂量下(0.04毫克/公斤-1毫克/公斤)较高的存活百分率，相对于mAb166和对照IgG(1毫克/公斤到15毫克/公斤)。

在感染后大约48小时，所有对照小鼠均患有感染。

实例15：WapR-004/V2L2双特异性抗体的构建

图17A显示了TNFα双特异性模型构建体。对于Bs1-TNFα/W4，W4 scFv与TNFα VL的氨基末端通过(G4S)2接头进行融合。对于Bs2-TNFα/W4，W4 scFv与TNFα VH的氨基末端通过(G4S)2接头进行融合。对于Bs3-TNFα/W4，W4 scFv与CH3的羧基末端通过(G4S)2接头进行融合。

因为WapR-004+V2L2的组合提供了对抗假单胞菌激发的保护，产生了包含WapR-004 scFv(W4-RAD)和V2L2 IgG的双特异性构建体(图17B)。为了产生Bs2-V2L2-2C，W4-RADscFv与V2L2 VH的N端通过(G4S)2接头进行融合。为了产生Bs3-V2L2-2C，W4-RAD scFv与CH3的C端通过(G4S)2接头进行融合。为了产生Bs4-V2L2-2C，W4-RAD scFv***到铰链区中，通过(G4S)2接头在scFv的N端和C端进行连接。为了产生Bs2-W4-RAD-2C，V2L2 scFv与W4-RADVH的氨基末端通过(G4S)2接头进行融合。

为了产生用于Bs3构建体的W4-RAD scFv，通过PCR对W4-RAD scFv，通过PCR对W4-RAD的VH和VL进行扩增。用于对W4-RAD VH进行扩增的引物是：W4-RAD VH正向引物：包括(G4S)2接头以及22bp的VH N端序列(GTAAAGGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCGG(SEQ ID NO：224))；以及W4-RAD VH反向引物：包括部分的(G4S)4接头以及22bp的VH C端序列的(GATCCTCCGCCGCCGCTGCCCCCTCCCCCAGAGCCCCCTCCGCCACTCGAGACGGTGACCAGGGTC(SEQ IDNO：225)。相似地，使用引物通过PCR对W4-RAD VL进行扩增：W4-RAD VL正向引物：包括部分的(G4S)2接头以及22bp的VL N端序列(AGGGGGCAGCGGCGGCGGAGGATCTGGGGGAGGGGGCAGCGAAATTGTGTTGACACAGTCTC(SEQ ID NO：226))；以及W4-RAD VL反向引物：包括部分的载体序列以及22bp的VL C端序列(CAATGAATTCGCGGCCGCTCATTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAC SEQ ID NO：227))。然后重叠片段融合在一起而形成W4-RAD scFv。

在Bs3载体中的W4-RAD scFv序列：下划线的序列是G4S接头

GGGGSGGGGSEVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKCLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARADWDLLHALDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPLTFGCGTKLEIK(SEQ ID NO：228)

在W4-RAD scFv片段被扩增后，然后它被凝胶纯化并与已被BamHI/NotI消化的Bs3载体进行连接。应用内融合***进行连接，随后在Stellar感受态细胞中进行转化。对集落进行测序，以确认正确的W4-RAD scFv***片段。

为了产生Bs3-V2L2-2C，将Bs3载体中的IgG部分用V2L2IgG替换。简言之，将包含W4-RAD的Bs3载体用BssHII/SalI进行消化，并且将得到的载体带进行凝胶纯化。相似地，将含有V2L2载体的载体用BssHII/SalI进行消化，并且将V2L2***片段进行凝胶纯化。然后将V2L2***片段与Bs3-W4-RAD scFv载体进行连接，并且对集落进行测序来确认正确的V2L2IgG***片段。

采用相近的方法来产生Bs2-V2L2-2C。

在Bs2载体中的W4-RAD scFv-V2L2VH序列：下划线的序列是G4S接头

EVQLLESGPGLVKPSETLSLTCNVAGGSISPYYWTWIRQPPGKCLELIGYIHSSGYTDYNPSLKSRVTISGDTSKKQFSLHVSSVTAADTAVYFCARADWDLLHALDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEIVLTQSPSSLSTSVGDRVTITCRASQSIRSHLNWYQQKPGKAPKLLIYGASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPLTFGCGTKLEIKGGGGSGGGGSEMQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGEGLEWVSAITISGITAYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKEEFLPGTHYYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQID NO：229)

下述引物用于对W4-RAD scFv.VH(正向引物)和VL(反向引物)进行扩增：用于Bs2载体的W4-RAD VH正向引物，包括一些内含子、3'信号肽以及W4-RAD VH N端序列的22bp(TTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCGG(SEQ ID NO：230))，以及用于Bs2载体的W4-RAD VL反向引物：包括(G4S)2接头以及32bp的VL C端序列(CCCCCTCCGCCGGATCCCCCTCCGCCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCACAGCCGAAAG(SEQ ID NO：231))

为了对V2L2VH区进行扩增，使用下述引物：V2L2VH正向引物：包括(G4S)2接头以及22bp的V2L2VH N端序列(GGCGGAGGGGGATCCGGCGGAGGGGGCTCTGAGATGCAGCTGTTGGAGTCTGG(SEQ ID NO：232))，以及V2L2VH反向引物：包括一些CH1N端序列以及22bp的V2L2VH C端序列(ATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTC(SEQ ID NO：233))。

然后使用这些引物对V2L2VH进行扩增，然后通过重叠W4-RAD scFv和V2L2VH来连接以得到W4-RAD scFv-V2L2-VH。然后通过对W4-RAD scFv–V2L2VH(来自于重叠PCR)进行凝胶纯化而将W4-RAD scFv-V2L2VH连接入Bs2载体中；用BsrGI/SalI消化Bs2载体，并且对载体带进行凝胶纯化。然后通过内融合***将W4-RAD scFv-V2L2-VH与Bs2载体进行连接，并转化进入Stellar感受态细胞，并且对集落进行确认是否是正确的W4-RAD scFv-V2L2VH***片段。为了用V2L2VL替换Bs2载体中的VL，用BssHII/BsiWI对含有W4-RAD scFv-V2L2-VH的Bs2载体进行消化，并且对载体带进行凝胶纯化。然后用BssHII/BsiWI对pOE-V2L2载体进行消化，并且对V2L2VL***片段进行凝胶纯化。然后将V2L2VL***片段与Bs2-W4-RADscFv-V2L2-VH载体进行连接，并且针对正确的V2L2IgG***片段对集落进行测序。

最后，使用相似的基于PCR的方法来生成Bs4-V2L2-2C构建体。带有接头序列的铰链区如下所示：

带有接头序列的铰链区：

KVDKRVEPKSCGGGGSGGGGS-scFv的N端(SEQ ID NO：329)

CH1 铰链接头

scFv的C端-GGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELL(SEQ ID NO：330)

接头铰链 CH2

在BS4载体中的W4-RAD scFv序列：以粗斜体表示W4-RAD scFv，以下划线的粗斜体表示G4S接头；以表示铰链区

KVDKRV]EPKSC APELL

以粗斜体表示W4-RAD scFv，以下划线的粗斜体表示G4S接头

使用PCR以及下述引物产生W4-RAD scFv：Bs4载体的W4-RAD VH正向引物：包括一些接头序列以及24bp的W4-RAD VH的N端序列(GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCGGGC(SEQ ID NO：236))；以及Bs4载体的W4-RAD VL反向引物：包括一些绞链序列、接头以及21bp的W4-RAD VLC端序列(GTGTGAGTTTTGTCggatccCCCTCCGCCAGAGCCACCTCCGCCTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC(SEQID NO：237))。

然后通过对W4-RAD scFv(来自于PCR)进行凝胶纯化而将W4-RAD scFv连接入Bs4载体中而得到Bs4-V2L2-2C；用BamHI对Bs4-V2L2载体进行消化，并且对载体带进行凝胶纯化。通过内融合***将W4-RAD scFv与Bs4载体进行连接，并且将载体转化进入Stellar感受态细胞。针对正确的W4-RAD scFv***片段，对集落进行测序。

Bs4-V2L2-2C构建体的轻链和重链的序列分别被提供于SEQ ID NO：327和328中。

实例16：在肺炎模型中，Psl/PcrV双特异性抗体提高了存活率

作为一种初期物质，对Bs2和Bs3双特异性抗体进行测试来检查它们是否在双特异性形式中保留了其W4或V2L2活性。对于亲本W4scFv，产生了具有W4和TNF-α结合臂的双特异性抗体。使用发光铜绿假单胞菌株PAO1.lux，进行如上所述的细胞附着测定。如图18所示，所有的双特异性构建体都与亲本W4-IgG1构建体的表现是相似的。

如图19(A-C)所示，使用(A)6206和(B)6206ΔpslA两者感染的细胞，对Bs2-V2L2和Bs3-V2L2两者的细胞毒性抑制百分比进行分析，以及(C)使用6206感染的细胞，对Bs2-V2L2-2C、Bs3-V2L2-2C和Bs4-V2L2-2C的RBC溶胞抑制百分比进行分析。如图19(A-C)所示，使用6206和6206ΔpslA感染的细胞时，所有双特异性抗体保留了抗细胞毒性活性，并抑制RBC溶胞，其水平与亲本V2L2抗体的相近。

使用在实例2中所述的方法，对Bs2和Bs3双特异性抗体介导铜绿假单胞菌OPK的能力进行评估。尽管Bs2-V2L2抗体显示出与亲本W4-RAD抗体相比相似的杀伤力，Bs3-V2L2抗体的杀伤力是下降的(图20A)。尽管Bs2-V2L2-2C和Bs4-V2L2-2C抗体显示与亲本W4-RAD抗体的杀伤力是相似的，Bs3-V2L2-2C抗体的杀伤力是下降的(图20B)。图20C显示，Bs4抗体的不同制剂(旧批次与新批次相比)显示了与亲本W4-RAD抗体相比相似的杀伤力，然而，与Bs4-V2L2-2C相比，Bs4-V2L2-2C-YTE抗体的OPK活性呈3倍下降。YTE突变体包含下述三种“YTE突变体”的组合：M252Y、S254T和T256E，其中依照在卡巴特中提出的EU索引进行编号，被引入IgG的重链。参见美国专利号7,658,921，通过引用将其结合在此。与相同抗体的野生型相比， YTE突变体显示出增加了抗体的血清半衰期大约四倍。参见例如Dall'Acqua等人，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)281：23514-24(2006)以及美国专利号7,083,784，特此通过引用以其全文结合。

确认了W4和V2L2两者在双特异性形式中保留了活性之后，对Bs2-V2L2、Bs3-V2L2和Bs4-V2L2构建体进行急性肺炎感染存活率的评估。如图21A所示，在感染后大约30小时，所有对照组小鼠均患有感染。所有的Bs3-V2L2动物连同接受V2L2对照的动物均存活。大约90％的W4-RAD免疫动物存活。相比之下，图B-F显示大约50％的Bs2-V2L2动物患有感染，持续120小时。在感染后大约48小时，所有对照组小鼠均患有感染。图G-H显示在各剂量的Bs4-V2L2-2C和Bs4-V2L2-2C-YTE处理的小鼠的存活率没有区别。这些结果表明，在6206急性肺炎模型中，两种抗体的功能相当。图21I显示，在铜绿假单胞菌株6206(ExoU+)激发的小鼠中，Bs2-V2L2、Bs4-V2L2-2C和W4-RAD+V2L2抗体混合物对于对抗致死性肺炎的保护是最有效的。

还对如上所述的相似免疫的小鼠进行了器官负荷的评估。在进行如上的免疫之后，用2.75x10⁵CFU6206对小鼠进行激发。如图22所示，在测试浓度下，Bs2-V2L2和Bs3-V2L2两者均可显著降低肺中的器官负荷。然而，由于使用了双特异性构建体的次佳浓度，与亲本抗体相比，双特异性构建体均不能显著影响脾或肾中的器官负荷。使用次佳浓度(A-C)以使得对抗体活性进行解释成为可能。

还使用6294菌株对双特异性抗体的存活率和器官负荷效应进行了处理。使用6294模型***，BS2-V2L2和BS3-V2L2两者均可将所有组织中的器官负荷显著降低至一个与V2L2亲本抗体情况下可比的水平。W4-RAD亲本抗体对于降低器官负荷没有效果(图23A)。如图23B所示，Bs2-V2L2、Bs3-V2L2和W4-RAD+V2L2组合可将所有组织中的器官负荷显著降低至一个与V2L2亲本抗体情况下可比的水平。

被免疫的小鼠的存活率数据与在之前的6294激发的小鼠中的数据是相近的。如图24所示，BS3-V2L2显示了与单用V2L2处理的小鼠相近的生存活性，而BS2-V2L2处理的小鼠显示了略低的激发保护的水平。

在双特异性抗体处理的动物中，还与如上所述的联合处理的动物相比较，对器官负荷进行了评估。如在图25(A-C)中所示，BS2-V2L2与BS3-V2L2两者均可使肺、脾和肾的器官负荷降低至一个与W4+V2L2组合情况下可比的水平。在肺中，该组合显著降低了细菌CFUBs2-以及Bs3-V2L2和V2L2，使用克鲁斯卡尔-瓦利斯(Kruskal-Wallis)和邓恩事后检验(Dunn’s post test)。没有观察到脾和肾中的细菌负荷的显著差异，尽管注意到有降低的趋势。还在肺炎模型中使用6206用Bs4-GLO进行了器官负荷研究。如图25(D)所示，当使用较高浓度的抗体对小鼠进行预防时，观察到肺的细菌负荷水平的显著降低(克鲁斯卡尔-瓦利斯(Kruskal-Wallis)和邓恩事后检验(Dunn’s post test))。当在这个模型中使用较高浓度的Bs4-GLO时，还观察到脾和肾的细菌播散显著降低。

通过对被免疫的BALB/c小鼠的肺组织的组织学检查确认了这些结果，这些小鼠是用下述菌株进行免疫激发：1.33x10⁷CFU铜绿假单胞菌株6294(表6A)，1.7x10⁷CFU铜绿假单胞菌株6294(表6B)和9.25x10⁵CFU铜绿假单胞菌株6206(表7)。

实例17：治疗助剂疗法：Bs4-V2L2-2C+抗生素

在急性致死性肺炎模型中，对Bs4双特异性抗体和抗生素辅助治疗抗铜绿假单胞菌6206菌株的生存效应进行了评估，如先前在实例6中所述的(图26(A-J))。(A-B)用R347(阴性对照)或Bs4-V2L2-2C在6206感染之前24小时或用环丙沙星(CIP)在感染后1小时对小鼠进行处理，或在感染前24小时用Bs4-V2L2-2C以及在感染后1小时用环丙沙星(Cipro)的组合对小鼠进行处理。(C)在用6206感染后1小时，用R347或CIP或Bs4-V2L2-2C，或Bs4-V2L2-2C与CIP的组合对小鼠进行处理。(D)在用6206感染后2小时，用R347或CIP或Bs4-V2L2-2C，或Bs4-V2L2-2C与CIP的组合对小鼠进行处理。(E)用R347或Bs4-V2L2-2C在用6206感染后2小时或CIP在感染后1小时对小鼠进行处理，或在感染后2小时用Bs4-V2L2-2C并在感染后1小时用CIP的组合对小鼠进行处理。(F)在用6206感染后1小时，用R347或美罗培南(MEM)或Bs4-V2L2-2C，或Bs4-V2L2-2C与MEM的组合对小鼠进行处理。(G)用R347或Bs4-V2L2-2C在用6206感染后2小时或用MEM在感染后1小时对小鼠进行处理，或在感染后2小时用Bs4-V2L2-2C并在感染后1小时用MEM的组合对小鼠进行处理。(H)在用6206感染后2小时，用R347或Bs4-V2L2-2C或MEM，或用Bs4-V2L2-2C与MEM的组合对小鼠进行处理。(I)在用6206感染后4小时，用R347或环丙沙星或Bs4-V2L2-2C或Bs4-V2L2-2C与环丙沙星的组合对小鼠进行处理。在感染后大约24小时，所有对照组小鼠均患有感染。如图26(A-I)所示，与CIP或MEM结合的Bs4抗体增加了抗生素治疗的效力，指示当这些分子结合时具有协同保护。进一步的研究着眼于在用Bs4或CIP单独用药或联合用药(Bs4+CIP)处理的小鼠中细菌负荷的水平。如图26(J)所示，R347+CIP与Bs4+CIP在所有器官(肺、脾和肾)中的细菌负荷的水平是相似的，然而，只有Bs4被包含在与CIP的组合中的小鼠在感染后是存活的(图26(A-E，I))。总而言之，这些数据指示，抗生素对于降低这种动物模型设定中的细菌负荷很重要，然而，需要特异性抗体来降低细菌的病原性，由此保护正常的宿主免疫。

在急性致死性肺炎模型中，针对铜绿假单胞菌6206菌株，对Bs4双特异性抗体和妥布霉素抗生素辅助治疗的生存效应进行了评估，如先前在实例6中所述的。将在用6206感染之前24小时用R347(阴性对照)或Bs4-V2L2-2C对小鼠进行处理，或在感染后1小时用妥布霉素进行处理，或在感染前24小时用Bs4-V2L2-2C并且在感染后1小时用妥布霉素的组合进行处理。在用6206感染后1小时，还用R347或妥布霉素或Bs4-V2L2-2C、或用Bs4-V2L2-2C与妥布霉素的组合对小鼠进行处理。此外，在用6206感染后2小时，用R347或妥布霉素或Bs4-V2L2-2C、或用Bs4-V2L2-2C与妥布霉素的组合对小鼠进行处理。此外，用R347或Bs4-V2L2-2C在用6206感染后2小时或用妥布霉素在感染后1小时对小鼠进行处理，或在感染后2小时用Bs4-V2L2-2C并在感染后 2小时用妥布霉素的组合对小鼠进行处理。在用6206感染后4小时，用R347或妥布霉素或Bs4-V2L2-2C、或用Bs4-V2L2-2C与妥布霉素的组合对小鼠进行处理。

在急性致死性肺炎模型中，针对铜绿假单胞菌6206菌株，对Bs4双特异性抗体和氨曲南抗生素辅助治疗的生存效应进行了评估，如先前在实例6中所述的。将在用6206感染之前24小时用R347(阴性对照)或Bs4-V2L2-2C对小鼠进行处理，或在感染后1小时用氨曲南进行处理，或在感染前24小时用Bs4-V2L2-2C并且在感染后1小时用氨曲南的组合进行处理。在用6206感染后1小时，用R347或氨曲南或Bs4-V2L2-2C、或用Bs4-V2L2-2C与氨曲南的组合对小鼠进行处理。此外，在用6206感染后2小时，用R347或氨曲南或Bs4-V2L2-2C、或用Bs4-V2L2-2C与氨曲南的组合对小鼠进行处理。此外，在用6206感染后2小时用R347或Bs4-V2L2-2C或在感染后1小时用氨曲南对小鼠进行处理，或在感染后2小时用Bs4-V2L2-2C并在感染后2小时用氨曲南的组合对小鼠进行处理。在用6206感染后4小时，用R347或氨曲南或Bs4-V2L2-2C、或用Bs4-V2L2-2C与氨曲南的组合对小鼠进行处理。

实例18：BS4-GLO双特异性抗体的构建

产生BS4-GLO(种系化的先导物优化的)双特异性构建体，包含抗Psl scFv(Psl0096scfv)和V2L2-MD(VH+VL)，如图35A所示。BS4-GLO轻链包含种系化的先导物优化的抗PcrV抗体轻链可变区(即V2L2-MD)。BS4-GLO重链包式VH-CH1-H1-L1-S-L2-H2-CH2-CH3，其中CH1是重链恒定区域-1，H1是第一重链铰链区片段，L1是第一接头，S是抗PcrV ScFv分子，L2是第二接头，H2是第二重链铰链区片段，CH2是重链恒定区域-2，CH3是重链恒定区域-3。

Bs4-GLO轻链：

AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCLQDYNYPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：…)

GLO(种系化的先导物优化)V2L2(即V2L2-MD)轻链可变区是有下划线的

Bs4-GLO重链：

EMQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMNWVRQAPGEGLEWVSAITISGITAYYTDSVKGRFTISRDNSKN TLYLQMNSLRAGDTAVYYCAKEEFLPGTHYYYGMDVWGQGTTVTVSS[ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV] APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL SPGK GLO(种系化优化)V2L2(即V2L2-MD)重链可变区是用下划线表示的；CH1是用括号[]表示的；GLO(种系化优化)W4-RAD(即Psl0096)scFv是以粗斜体表示的，其G4S接头是用下划线的粗斜体表示的；铰链区是用

包含抗PcrV ScFv以及抗Psl(VH+VL)的一种可替代的Bs4-GLO双特异性构建体显示于图35B，并且是相似地产生的。

实例19：Bs4-GLO双特异性抗体的功能活性及效力的评估

双特异性抗体Bs4-WT(在此还指的是Bs4-V2L2-2C)、Bs4-GL(包含种系化的抗PcrV和抗Psl可变区)和Bs4-GLO，如在实例18中所述产生的，可在下述测定中测试其功能活性的差异性：如先前实例2中所述的调理吞噬杀灭测定(图27A)，如在先前的实例4中所述的抗细胞附着测定(图27B)，以及如在先前的实例12中所述的RBC溶胞抗细胞毒性测定(图27C)。在抗体之间没有观察到体外功能活性的差异性。

Bs4-GLO的体内效力检验如下。对于预防性评估，在用下述铜绿假单胞菌株进行感染之前24小时(6206(1.0x10⁶)、6077(1.0x10⁶)、6294(2.0x10⁷)或PA103(1.0x10⁶))，用多个浓度的Bs4-GLO(即0.007mg/kg、0.02mg/kg、0.07mg/kg、0.2mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、10mg/kg或15mg/kg)对小鼠进行预防性处理(图28A)。对于治疗性评估，在用下述铜绿假单胞菌株(6206(1.0x10⁶)、6077(1.0x10⁶)、6294(2.0x10⁷)或PA103(1.0x10⁶))进行感染之后1小时，用多个浓度的Bs4-GLO(即 0.03mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg或45mg/kg)对小鼠进行治疗性处理(图28B)。

在急性致死性肺炎模型中，对Bs4-GLO双特异性抗体的对抗不同的铜绿假单胞菌株的生存效应进行评价，如在先前实例6中所述的。图29显示了在铜绿假单胞菌致死性菌血症模型中用Bs4-GLO处理的动物的存活率。在2012年11月6日提交的美国临时申请号61/723,128详细披露了菌血症模型的多个方面(律师案卷号ATOX-500P1，标题是“治疗金黄色葡萄球菌(S.AUREUS)相关性疾病的方法”)，将其通过引用以其全文结合在此。

在用(A)6294(O6)或(B)6206进行腹膜内感染之前24小时，用Bs4-GLO或R347对动物进行处理。在用铜绿假单胞菌菌株(A)6294和(B)6206激发的小鼠中，BS4-GLO在所有测试浓度下在对抗致死性肺炎的保护方面均有效。

在铜绿假单胞菌热损伤模型中，对Bs4-GLO双特异性抗体对抗不同的铜绿假单胞菌株的生存效应进行评估。图30显示了在铜绿假单胞菌热损伤模型中用Bs4-GLO进行预防性处理的动物的存活率。在诱发热损伤以及在伤口下方直接皮下感染铜绿假单胞菌株(A)6077(O11-ExoU⁺)或(B)6206(O11-ExoU⁺)或(C)6294(O6)之前，用Bs4-GLO或R347对动物进行处理。在铜绿假单胞菌菌株(A)6077、(B)6206和(C)6294激发的小鼠的铜绿假单胞菌热损伤模型中，BS4-GLO在所有测试浓度下均可有效预防。

图31显示了在铜绿假单胞菌热损伤模型中的用双特异性抗体 Bs4-GLO进行治疗性处理的动物的存活率。(A)在诱发热损伤以及直接在伤口下方皮下感染铜绿假单胞菌株6077(O11-ExoU⁺)之后(A)4h小时或(B)12小时，用Bs4-GLO或R347对动物进行处理。在诱发热损伤以及皮下感染铜绿假单胞菌株6077(O11-ExoU⁺)之后(A)4小时或(B)12小时，在用Bs4-GLO处理的小鼠的铜绿假单胞菌热损伤模型中，Bs4-GLO在所有测试浓度下均可有效治疗。

实例20：治疗助剂疗法：Bs4-GLO+抗生素

在急性致死性肺炎模型中，对Bs4-GLO双特异性抗体和抗生素辅助治疗对抗铜绿假单胞菌6206菌株的生存效应进行了评估，如先前在实例6中所述的。

图32显示了环丙沙星(CIP)治疗助剂疗法。(A)在用铜绿假单胞菌株6206进行感染后4小时，用R347+CIP或Bs4-WT或Bs4-WT与CIP的组合对小鼠进行处理。(B)在用铜绿假单胞菌株6206进行感染后4小时，用R347+CIP或Bs4-GLO或Bs4-GLO与CIP的组合对小鼠进行处理。(A-B)Bs4-WT或BS4-GLO抗体与CIP组合可提高抗生素疗法的效力。

图33显示了美罗培南(MEM)治疗助剂疗法：(A)在用铜绿假单胞菌株6206进行感染后4小时，用R347+MEM或Bs4-WT或Bs4-WT与MEM的组合对小鼠进行处理。(B)在用铜绿假单胞菌株6206进行感染后4小时，用R347+MEM或Bs4或Bs4-GLO与MEM的组合对小鼠进行处理。(A-B)Bs4-WT或Bs4-GLO抗体与MEM组合可提高抗生素疗法的疗效。

图34显示了治疗助剂疗法：在致死性菌血症模型中的Bs4-GLO加抗生素。在用铜绿假单胞菌株6294进行腹膜内感染之前24小时，用指定浓度的Bs4-GLO对小鼠进行处理，用以事先确定在这个模型以及R347(阴性对照)中的亚治疗保护剂量。感染之后1小时，皮下给予小鼠指定浓度的抗生素，用以事先确定(A)环丙沙星(CIP)、(B)美罗培南(MEM)或(C)妥布霉素(TOB)的亚治疗保护剂量。小心监测动物的存活，直到感染后72小时。在亚保护剂量下，将Bs4-GLO抗体与CIP、MEM或TOB组合可增加抗生素疗法的效力。

***

本披露在范围不受所描述的具体实施例的限制，这些实施例意欲作为本披露的单独方面的简单说明，并且在功能上等效的任何组合物或方法均处于本披露的范围内。事实上，除了在此示出并且描述的那些，本披露的各种改变从前述说明书和附图对于本领域技术人员来说将变得清楚。这类改变旨在落入所附权利要求书的范围内。

本说明书提到的所有公开和专利申请均通过引用结合在此，引用程度就如同每个单独公开或专利申请特定地并且单独地指示通过引用结合在此一般。此外，在2011年11月7日提交的美国临时申请号61/556,645、在2012年4月16日提交的61/624,651、在2012年4月17日提交的61/625,299、在2012年9月6日提交的61/697,585、以及在2012年11月6日提交的国际申请号PCT/US2012/63639(律师案卷号AEMS-115WO1，标题为“多特异性和多价结合蛋白及其应用”)，出于所有目的通过引用以其全文结合。

Claims

1.一种双特异性抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含与假单胞菌Psl结合的结构域，所述结构域含：

氨基酸序列是SEQ ID NO：47的PYYWT的重链CDR1；

氨基酸序列是SEQ ID NO：48的YIHSSGYTDYNPSLKS的重链CDR2；

氨基酸序列是SEQ ID NO：258的ADWDRLRALDI的重链CDR3；

氨基酸序列是SEQ ID NO：50的RASQSIRSHLN的轻链CDR1；

氨基酸序列是SEQ ID NO：51的GASNLQS的轻链CDR2；

氨基酸序列是SEQ ID NO：280的QQSTGAWNW的轻链CDR3；

还包含与假单胞菌PcrV结合的结构域，所述结构域包含：

氨基酸序列是SEQ ID NO：218的SYAMN的重链CDR1；

氨基酸序列是SEQ ID NO：264中氨基酸50-66的AITMSGITAYYTDDVKG的重链CDR2；

氨基酸序列是SEQ ID NO：220的EEFLPGTHYYYGMDV的重链CDR3；

氨基酸序列是SEQ ID NO：221的RASQGIRNDLG的轻链CDR1；

氨基酸序列是SEQ ID NO：222的SASTLQS的轻链CDR2；

氨基酸序列是SEQ ID NO：223的LQDYNYPWT的轻链CDR3。

2.如权利要求1所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中：

(a)所述Psl结合域包含scFv片段，并且所述PcrV结合域包含一个完整的免疫球蛋白；或

(b)所述Psl结合域包含完整的免疫球蛋白，并且所述PcrV结合域包含scFv片段。

3.如权利要求2所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其中：

(a)所述scFv与所述完整的免疫球蛋白的VH区的氨基末端是融合；

(b)所述scFv与所述完整的免疫球蛋白的CH3区的羧基末端是融合；

(c)所述scFv***到所述完整的免疫球蛋白的铰链区中。

4.如权利要求2所述的双特异性抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述Psl结合域包含SEQ ID NO:262的scFv片段。

5.如权利要求1所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述PcrV结合结构域含有氨基酸序列SEQ ID NO:255的VH和氨基酸序列SEQ ID NO:256的VL。

6.如权利要求1所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中所述Psl结合结构域含有氨基酸序列SEQ ID NO:288的VH和氨基酸序列SEQ ID NO:289的VL。

7.如权利要求2所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中包含SEQ ID NO:264的重链。

8.如权利要求2所述的双特异性抗体或其抗原结合片段，其中包含SEQ ID NO:265的轻链。

9.一种分离的多核苷酸分子，该多核苷酸分子包含编码权利要求1-8中任一项所述双特异性抗体或其片段的核酸序列。

10.一种组合物，该组合物包含权利要求1-8中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合性片段，以及药学上可接受的载体。

11.权利要求1-8中任一项所述的双特异性抗体或其抗原结合性片段或权利要求10所述的组合物在制备在有需要的受试者中对假单胞菌感染进行预防或治疗的药物中的用途。

12.一种试剂盒，该试剂盒包括如权利要求10所述的组合物。