MX2014002844A - Sistema y kit para preparar una muestra citologica para examen. - Google Patents
Sistema y kit para preparar una muestra citologica para examen.Info
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Abstract
La presente invención se relaciona a un sistema o kit para preparar una muestra citológica para examen, que comprende un fijador para fijar células comprendidas en dicha muestra, un modificador de superficie celular para la modificación de la superficie de células comprendidas en dicha muestra, un primer medio de soporte de muestra que tiene al menos dos lados, y, un segundo medio de soporte de muestra que tiene al menos dos lados, en donde en al menos un lado de al menos uno de los medios de soporte una mancha citoplasmática o una mancha nuclear se deposita (Fig. 1).
Description
SISTEMA Y KIT PARA PREPARAR UNA MUESTRA CITOLOGICA PARA
EXAMEN
Campo de la Invención
La invención se relaciona al campo de examen microscópico de muestras citológicas.
Antecedentes de la Invención
El cáncer de cuello uterino es el segundo cáncer más común en mujeres a nivel mundial y la principal causa de muertes por cáncer en mujeres en países en desarrollo. Alrededor de 30% de cánceres en mujeres son debido al cáncer de cuello uterino con más de 100,000 nuevos casos diagnosticados cada año, por ejemplo, en India. La tasa de crecimiento anual compuesta estimada (CAGR, por sus siglas en inglés) para casos de cáncer de cuello uterino es 2.56% y en su tasa de crecimiento aproximadamente 175,000 nuevos casos de cáncer de cuello uterino se detectarán en el año 2012.
Una de las herramientas recomendadas para la selección de cáncer de cuello uterino es detectar los precursores citológicos de cáncer en pruebas de Papanicolaou (también llamadas Papanicolaou, prueba Pap, citología cervical o frotis) , que es una prueba de selección usada en ginecología para detectar procesos premaligno y maligno en el canal cervical especialmente en la zona de transformación.
Al tomar una prueba de Papanicolaou, un espéculo se usa
Ref. 246228
para recoger las células de la abertura exterior de la cérvix del útero y endocérvix. Las células se examinan bajo un microscopio para buscar anormalidades. La prueba tiene por objeto detectar cambios potencialmente pre-cancerosos , que son, entre otros, causados por virus del papiloma humano sexualmente transmitidos. La prueba sigue siendo un método efectivo usado ampliamente para la detección temprana de pre-cáncer y cáncer de cuello uterino. La prueba también puede detectar infecciones y anormalidades en la endocérvix y el endometrio.
Este procedimiento ha sido efectivo en la reducción de la incidencia de cáncer de cuello uterino en los países desarrollados. Sin embargo, la tinción de Papanicolaou actual es tediosa y lenta. Además, el número de etapas requeridas y metodología hace muy difícil automatizar el proceso entero e implementarlo en un centro de atención al punto, que significa que las muestras no pueden analizarse en el centro de cuidado, sino que tienen que entregarse a un laboratorio.
El Documento GB 1 555 507 A enseña un portaobjetos siendo producido en una cantidad de solución viscosa de una resina transparente en una mezcla solvente que comprende un compuesto orgánico y agua se aplica a un área del portaobjetos menos que el área de un cubreobjetos, colocando un cubreobjetos con un recubrimiento de mancha biológica bajo dicha cantidad de solución viscosa en el portaobjetos con
lado recubierto de mancha en contacto con la solución viscosa, y dejando el cubreobjetos sin tocar por algún tiempo .
El Documento GB 1 557 722 A describe un método de tinción y sellado de muestra biológica secada al aire y fijada a un portaobjetos de microscopio, en donde una formulación de fluido viscoso de una resina transparente y tinción biológica en una mezcla solvente que comprende agua se proporciona, una cantidad de formulación de fluido viscoso se aplica a un área de una muestra biológica fija más pequeña que el área del cubreobjetos, el cubreobjetos se aplica a la cantidad aplicada de formulación de fluido viscoso, y el cubreobjetos se deja sin tocar hasta que la mancha disuelta en la formulación de fluido se pone en contacto con la muestra y la mancha.
La Patente de E.U.A. No. 3,796,594 enseña los portaobjetos recubiertos de mancha para sangre diferencialmente teñida.
La Patente de E.U.A. No. 3,834,874 enseña los portaobjetos de microscopio pre-teñidos que tienen una superficie cubierta con una mezcla seca de Metileno NN Azul y Acetato de Cresilo Morado para detectar los parásitos de malaria en la sangre.
El Documento EP 0 291 153 Al describe un ensamble de portaobjetos de microscopio, en donde dos portaobjetos
rectangulares se enfrentan uno al otro con sus caras frontales, pero mantienen algo de distancia el uno del otro por medio de porciones elevadas e islas elevadas de manera que una brecha capilar se proporciona entre los dos portaobj etos .
La Patente de E.U.A. 4,224,277 enseña un aparato para portaobjetos de recubrimiento y portaobjetos microscópicos pre-cubiertos producidos por dicho aparato.
Breve Descripción de la Invención
De acuerdo a un primer aspecto de la invención, un sistema o kit para preparar una muestra citológica para examen se proporciona. El sistema o kit comprende un fijador para fijar células comprendidas en dicha muestra, un modificador de superficie celular para la modificación de la superficie de células comprendidas en dicha muestra, un primer medio de soporte de muestra que tiene al menos dos lados, y un segundo medio de soporte de muestra que tiene al menos dos lados, en donde al menos un lado de al menos uno de los medios de soporte una mancha citoplásmica o una mancha nuclear se deposita.
Como se usa en la presente, una "muestra citológica" se define como cualquier espécimen de un organismo, preferiblemente un mamífero, en cantidad suficiente para caracterizarse y/o analizarse. Una muestra citológica, a modo de ejemplo no limitado, incluye muestras celulares, muestras
de la piel, muestras de tejido, y muestras de mucosa.
Como se usa en la presente, el término "fijador" se refiere a una composición, que puede o no estar en forma líquida, que fija la muestra citológica de manera que la muestra citológica se adhiere al portaobjetos por un periodo de tiempo suficiente para caracterizar y/o analizar la muestra citológica.
Como se usa en la presente, el término "modificación de la superficie de las células" se refiere a que las células se tratan de manera que no están plegadas y/o no rizadas, y/o que la superposición celular está reducida. La reducción de plegamiento y rizado celular durante la preparación de muestra resultará en visualización mejorada de detalles celulares y morfológicos que se usan para la detección subsecuente de células anormales en la muestra, por ejemplo en selección de cáncer de cuello uterino.
La reducción de superposición resultará en dispersión celular mejorada, que es una cuestión importante particularmente en suspensiones celulares, donde las células tienden a superponerse las unas con las otras, particularmente polimorfos que son muy pequeños en tamaño y tienden a agruparse y asentarse en células grandes. En general, ambos objetivos pueden alcanzarse incrementando la carga de superficie en las células, que lleva a una repulsión incrementada entre células individuales y de este modo
proporciona mejor dispersión.
La mancha nuclear sirve para teñir los núcleos de células comprendidos en la muestra cuando la muestra se deposita en dicho primer medio de soporte de muestra, o cubierta por dicho primer medio de soporte de muestra. La mancha de citoplasma sirve para teñir el citoplasma de las células comprendido en la muestra cuando la muestra se deposita en dicho segundo medio de soporte de muestra, o cubierta por dicho segundo medio de soporte de muestra.
Tal sistema o kit proporciona la opción de preparar una muestra citológica de manera que las células en la muestra estén dispersas de manera idónea para ver a través de un microscopio o para análisis por un dispositivo de análisis celular óptico automatizado. De este modo, una característica importante de la invención es que permite la tinción en el lugar de la muestra dada, esto es, en el centro de cuidado. Además, la necesidad de preparar una solución de tinción en el sitio se elimina, ya que las manchas se pre dispersan en cantidad apropiada en el medio de soporte de muestra. Además, la necesidad de ir a través de un protocolo complejo y un procedimiento de tinción de etapa múltiple se elimina, así como también problemas de ensuciar que son básicamente debido al polvo e impurezas durante la tinción. Además, las aberraciones como sobre tinción o bajo tinción se minimizan debido al hecho de que las manchas se dispersan en medición
exacta según lo requerido para la tinción óptima.
Otra ventaja es que las condiciones de pH pueden controlarse fácilmente, lo que es esencial para la tinción de citoplasma (donde el pH ácido es ventajoso bajo algunas circunstancias) y tinción nuclear (donde el pH básico es ventajoso bajo algunas circunstancias) .
El uso del medio de soporte de muestra en el que las manchas ya están depositadas hace posible llevar a cabo la tinción en un ambiente cerrado, esto es, en un cartucho, que además elimina el polvo e impurezas e incrementa la reproductibilidad del proceso de tinción.
En una modalidad preferida, sólo un lado del primero y/o segundo medio de soporte de muestra, se proporciona con la respectiva mancha. Sin embargo, puede ser ventajosos tener ambos lados del primero y/o segundo medio de soporte de muestra proporcionado con una mancha, en tal caso, la persona manejando el sistema no tiene que cuidar cual lado del soporte se enfrenta a la muestra. En tal modalidad, los defectos debido al uso del lado incorrecto del primero y/o segundo medio de soporte de muestra se evitan.
De acuerdo a un segundo aspecto de la invención, un método para preparar una muestra citológica para examen, el método comprende las etapas de :
fijar las células comprendidas en dicha muestra con un fijador,
modificar la superficie de las células comprendidas en dicha muestra con un modificador de superficie celular,
proporcionar un primer medio de soporte de muestra que tiene al menos dos lados, y, un segundo medio de soporte de muestra que tiene al menos dos lados, en donde en al menos un lado de al menos uno de los medios de soporte una mancha citoplasmática o una mancha nuclear se deposita,
depositar las células en ya sea el primero o el segundo medio de soporte de muestra, y
cubrir las células depositadas con el segundo o primer medio de soporte de muestra, respectivamente. Es importante entender que las etapas de este método no tienen que realizarse en el orden mostrado anteriormente.
De este modo, la invención comprende el uso de al menos un tipo de medio prefabricado de soporte de muestra. Estos medios prefabricados de soporte de muestra están recubiertos con una mancha nuclear o con una mancha citoplasmática. En una modalidad preferida de la presente invención, una mancha nuclear se deposita en al menos un lado del primer medio de soporte de muestra y una mancha citoplasmática se deposita en al menos uno de los segundos medios de soporte de muestra. Alternativamente, sólo uno de los dos medios de soporte de muestra está recubierto por una mancha (por ejemplo, mancha nuclear), y el otro tipo de mancha/por ejemplo, la mancha citoplasmática) se agrega a la suspensión celular, por
ejemplo junto con el fijador y/o el modificador de superficie celular.
En una modalidad preferida de la invención, los primeros medios de soporte de muestra y/o los segundos medios de soporte de muestra están en la forma de un portaobjetos y/o un cubreobjetos.
Como se usa en la presente, el término "portaob etos" se refiere a una pequeña placa transparente hecha de vidrio o plástico en la que las muestras, como células, pueden depositarse para examen bajo un dispositivo de aumento óptico, como un microscopio.
Como se usa en la presente, el término "cubreobjetos" se refiere a una pequeña placa transparente hecha de vidrio o plástico que se usa para cubrir muestras, como células, previo al examen bajo un dispositivo de aumento óptico, como un microscopio.
De acuerdo a un entendimiento común, los portaobjetos y cubreobjetos difieren los unos con los otros en tamaño y grosor. Bajo ISO 8255-2, los portaobjetos microscópicos tiene un tamaño de 26 x 76 mm, y un grosor de 1 mm, mientras que los cubreobjetos usualmente tiene un tamaño de 18 x 18 mm y un espesor de 100 - 200 pm. Sin embargo, en el contexto de la presente invención, los términos cubreobjetos y portaobjetos pueden usarse intercambiablemente. Particularmente en preparaciones de citología, los portaobjetos microscópicos se
usan tanto para el soporte de la muestra como para cubrirla, después de que el proceso de citología se ha llevado a cabo.
De acuerdo a la invención, el primer medio de soporte de muestra y el segundo medio de soporte de muestra están conectados el uno con el otro por medio de una bisagra. Esta modalidad además facilita el uso del sistema o kit de acuerdo a la presente invención. Tal bisagra puede, por ejemplo, consistir de una unión rebajada proporcionada entre dos marcos plásticos transportando el primero y el segundo medios de soporte de muestra. Otras posibilidades para proporcionar tal bisagra comprenden el uso de una pieza de cinta adhesiva conectando al primero y al segundo medios de soporte de muestra. La persona experta será capaz de encontrar otras modalidades técnicas que hacen el uso de tal bisagra sin el uso de etapa inventiva.
De acuerdo a aún otra modalidad preferida de la invención, el fijador y/o el modificador de superficie celular se proporcionan en forma líquida. Preferiblemente, el fijador comprende al menos un agente seleccionado del grupo que consiste de
• etanol
• alcohol isopropílico
• ácido acético (preferiblemente ácido acético glacial)
• formaldehído, y/o
· glutaraldehído .
Incluso más preferido, el fijador comprende una mezcla incluyendo etanol, alcohol isopropílico y ácido acético, preferiblemente en una relación de volumen de 7:2:1.
Los fijadores con base de alcohol son muy buenos para los frotis citológicos ya que actúan rápidamente y dan buen detalle nuclear. Preferiblemente, una mezcla de etanol (70% v/v) , alcohol isopropílico (70% v/v) y ácido acético glacial (10% v/v) se usa. Esta es una mezcla de pH bajo, que puede mantenerse usando ya sea solución amortiguadora o controlando la concentración de ácido acético.
De acuerdo a otra modalidad preferida, el fijador comprende glutaraldehído y solución salina amortiguada en fosfato, con preferiblemente 2% - 20% p/p de glutaraldehído en una solución salina amortiguada en fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) 0.05 M a 1 M. Preferiblemente, el fijador tiene un pH de 5 a 6.5.
De acuerdo a aún otra modalidad preferida de la invención, el modificador de superficie celular comprende al menos un agente seleccionado del grupo que consiste de
· un agente para producir una carga positiva para la superficie celular,
• un agente para producir una carga negativa para la superficie celular,
• un agente quelante,
· un agente anti-coagulante,
• un agente demulsificante,
• un agente para soportar la dispersión celular, y/o
• un agente para crear microporos en la superficie celular .
El agente para producir una carga positiva para la superficie celular es preferiblemente al menos un compuesto soluble en agua seleccionado del grupo que consiste de clorhidrato Poli-l-Lisina y Polivinilpirrolidona (PVP) .
El agente para producir una carga negativa para la superficie celular es preferiblemente al menos un compuesto soluble en agua seleccionado del grupo que consiste de sulfato dextrano, Poli sodio 4-estirenosulfonato, ácido polimetilacrílico, carboximetil celulosa y/o un poliacrilato de sodio.
Es importante entender que cualquier otra molécula que produzca carga positiva/negativa en la solución puede también usarse en el contexto de la presente invención. Sin embargo, es benéfico si dicha molécula es soluble en agua.
Los dichos polímeros pueden usarse en diferentes pesos moleculares y/o diferentes concentraciones. Los polímeros de peso molecular alto parecen funcionar bien para impartir carga alta en las células. Similarmente , la concentración alta (por ejemplo: 5-10 mg/ml de PVP en fijador de alcohol funciona bien) muestra carga incrementada en la superficie de las células (ver Fig. 5) .
El agente quelante y/o el agente anti -coagulante es preferiblemente al menos uno seleccionado del grupo que consiste de ácido etilendiamina tetra acético (EDTA) , ácido hidroxietilendiamina triacético (HEDTA) , ácido nitriolotriacético (NTA) , citrato de sodio, y/u oxalato de disodio u oxalato de dimetilo, u otros citratos u oxalatos.
El agente desmulsificante es preferiblemente al menos uno seleccionado del grupo que consiste de hidróxido de sodio, N-Acetil-L-Cisteína, e/o hipoclorato de sodio. Preferiblemente, el modificador de superficie celular comprende 2 - 5 % p/v NaOH y 0.25g/50ml N-Acetil-L-Cisteína, o 0.5 - 6 % p/v NaOCl .
El agente para respaldar la dispersión celular y/o el agente para crear microporos en la superficie celular es preferiblemente un detergente, incluso más preferiblemente al menos uno seleccionado del grupo que consiste de Ditiotreitol y/o TritonX-100. La presencia de estos agentes crea poros controlados en las membranas celulares, llevando al acceso rápido de mancha al citoplasma y el núcleo.
Los compuestos mencionados respaldan la fijación apropiada, evitan la coagulación y aumentan una buena dispersión de muestras de célula. No afectan la tinción de células con Azul de Metileno, Eosina Azure (EA) y Anaranjado G (ver Fig. 6) , y ayudan a que las células permanezcan
estables por casi una semana (ver Fig. 7) .
Se prefiere particularmente que una mezcla de preparación celular se proporcione la cual comprende al menos el fijador y el modificador de superficie celular. Alternativamente, se prefiere que en el método de acuerdo a la invención las etapas de fijación de las células comprendidas en dicha muestra y modificación de la superficie de las células comprendidas en dicha muestra se lleven a cabo simultáneamente .
En estas modalidades, la mezcla de preparación celular sirve para fijar simultáneamente las células y modificar la superficie de las células en la muestra.
En otra modalidad preferida el fijador y/o el modificador de superficie celular puede además comprender una mancha.
Además se prefiere que la mancha nuclear comprenda al menos uno seleccionado del grupo que consiste de:
• Carmín
• Azul de Metileno
· Rojo neutro/toluileno
• Hematoxilina
• Safranina
• Azul de Nilo.
Igualmente, se prefiere que la mancha de citoplasma comprenda al menos una seleccionado del grupo que consiste
de:
• Eosina
• Azul de alcian
• Ponceau de Xilidina,
• escarlata de Biebrich
• Tartazina
• mancha de Van Gieson (ácido pícrico y fucsina ácida)
• tinción de Wright .
Incluso más preferido, las combinaciones de mancha pueden usarse, como por ejemplo comprendidas en la llamada mezcla de tinción Pap, y que comprende una combinación de hematoxilina, Anaranjado G, Eosina Y, Verde Ligero SF amarillento, y a veces Café Bismarck Y.
Otra combinación de mancha idónea se usa en el tricromo de Masson, que comprende hematoxilina de Weigert, fucsina ácida, Ponceau de Xilidina, ácido fosfomolíbdico, y verde claro SF amarillento, o alternativamente Verde Fast FCF, azul de metilo, azul de agua o azul de anilina.
Aún otra combinación de mancha idónea se usa en el tricromo de Lillie, que es similar al tricromo de Masson, pero usa escarlata Biebrich en lugar de fucsina ácida y/o Ponceau de Xilidina.
Además, las manchas fluorescentes como DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindola) pueden usarse.
Además, las combinaciones de manchas particulares que
están comercialmente disponibles pueden usarse, como los kits de tinción HCS cell mask™ proporcionados por Invitrogen.
La mancha nuclear sirve para teñir los núcleos de células comprendidas en la muestra cuando la muestra se deposita en dicho primer medio de soporte de muestra, o cubierto por dicho primer medio de soporte de muestra. La mancha de citoplasma sirve para teñir el citoplasma de células comprendidas en la muestra cuando la muestra se deposita en dicho segundo medio de soporte de muestra, o cubierta por dicho segundo medio de soporte de muestra.
En otra modalidad preferida de la invención, un primero y un segundo medios de soporte de la muestra se configuran para ser recibidos por un dispositivo autónomo para la tinción de la muestra.
El método de acuerdo a la invención puede, preferiblemente, además comprender al menos una etapa seleccionada del grupo que consiste de
a) inspección detallada de la cérvix por colposcopia; b) llevar a cabo una prueba ADN HPV en dicha muestra biológica, o en una nueva muestra con propiedades comparables ;
c) llevar a cabo una prueba de Biomarcador en dicha muestra biológica, o en una nueva muestra con propiedades comparables; y/o
d) inspección visual de dicha muestra biológica, o de
una nueva muestra con propiedades comparables, por un patólogo calificado.
De acuerdo a otro aspecto de la invención, el uso de un sistema, kit o método de acuerdo a al menos un propósito seleccionado del grupo de
• selección de cáncer
• diagnóstico de cáncer
• predicción respecto a la terapia dada
• monitoreo concomitante de una terapia de cáncer dada. Preferiblemente, la muestra citológica es una muestra humana. Preferiblemente, la muestra citológica es una muestra cervical. Sin embargo, debido a que los principios del génesis de cáncer y transformación celular son ubicuos, el método también puede usarse con las muestras de otros tejidos corporales que tiene que verificarse para anomalías, como muestras de mama, muestras de próstata, muestras de hígado, muestras de pulmón, muestras de sangre, y así sucesivamente.
Se prefiere que la muestra citológica sea seleccionada del grupo que consiste de
• muestra citológica
• rebanada de tej ido
• muestra de líquido, y/o
• otras muestras de citología.
Una muestra de frotis es por ejemplo similar o idéntica a aquellas muestras usadas en las pruebas de Papanicolaou
(también llamadas citología de Papanicolaou, prueba de Papanicolaou, citología cervical o frotis) . Una rebanada de tejido es por ejemplo proporcionada por un micrótomo. Una muestra líquida puede preferiblemente consistir de una suspensión de células, por ejemplo, obtenidas por un frotis.
Otras muestras idóneas comprenden, pero no se restringen a, muestras de citología de aspiración de aguja fina (FNAC, por sus siglas en inglés) , muestras de citología abrasiva y/o muestras exfoliadas.
En muchos casos de hecho una muestra se coloca en una rebanada para hacerla disponible para investigación, por ejemplo una rebanada de tejido, o un frotis. Sin embargo, otros dispositivos también pueden usarse para transportar una muestra, por ejemplo una cubeta pequeña en el caso que la muestra sea una muestra líquida, o un cartucho en el caso que la muestra sea una muestra de cepillo. El término rebanada como se usa en los diagramas de flujo por lo tanto no debe interpretarse de ninguna manera como limitante del enfoque de la presente invención.
Breve Descripción de las Figuras
Estos y otros aspectos de la invención serán aparentes de y elucidados con referencia a las modalidades descritas de aquí en adelante. En las figuras:
La Fig. 1 muestra esquemáticamente, una modalidad de ej emplificación del sistema o kit de acuerdo a la invención.
La Fig. 2 muestra un método de ej emplificacion de preparación de un portaobjetos citológica de acuerdo a la presente invención.
Las Figs . 3A-3D muestran varios problemas los cuales ocurren bajo protocolos para preparación de la muestra de acuerdo al estado de la técnica.
La Fig. 4 muestra un flujo de trabajo de ej emplificacion, más la f ncionalidad de cada uno de los componentes de la presente invención.
La Fig. 5 muestra el incremento en el potencial zeta
(esto es, potencial de membrana celular) para células cervicales con incremento de concentración de PVP (Polivinilpirrolidona) .
Las Figs. 6A-6B muestran las células en las que los núcleos celulares (Fig. 6A) , o citoplasma celular (Fig. 6B) ha sido teñido con protocolos de acuerdo a la invención.
La Fig. 7 muestra la degradación gradual de células con el tiempo en fijador base. Esta degradación se mejora cuando pH del fijador se toma más cerca al neutro sin ningún cambio en el patrón de tinción.
La Fig. 8 muestra un proceso de tinción de ej emplificacion de células cervicales en portaobjetos.
La Fig. 9 muestra un flujo de trabajo de ej emplificación mostrando la preparación de la mancha, y un proceso de tinción de ej emplificación .
La Fig. 10 muestra una modalidad de ej emplificación que comprende el primero y segundo medios de soporte de la muestra .
Las Figs. 11A-11D muestran los resultados de un pre-dispensado en la técnica de tinción de punto de acuerdo a la invención .
Descripción Detallada de la Invención
Ejemplo: Recubrimiento de giro de cubreobjetos y portaobjetos con manchas nucleares y manchas de citoplasma Los portaobjetos y los cubreobjetos se limpiaron según el protocolo estándar de sala limpia.
1. Preparación de la mancha
a) Eosina Y-Azure (EA) : Eosina Y: 0.23% p/v, Verde Fast F: 0.08%> p/v, Café Bismark: 0.05%) p/v, Ácido fosfotúngstico ; 0.2%> p/v, disueltos en alcohol desnaturalizado;
b) Anaranjado G (OG) : OG: 0.3% p/v, Ácido fosfotúngstico : 0.01% p/v, disueltos en alcohol desnaturalizado;
c) Azul de metileno (MB) / Violeta cresil (CV) : MB :
80g/l en metanol, CV: 40g/L en metanol;
2. Recubrimiento de giro (Holmarc Spin Coater, India) a) portaobjetos MB/CV: 1000 rpm por 20 segundos (200 µ? de tinte) ;
b) cubreobjetos EA/OG : 3000 rpm por 20 segundos (70 µ?
de tinte) ;
3. Concentración de recubrimiento y velocidad de giro usada para recubrimiento como sigue:
Recubrimiento MB/CV ( l : l )
i) portaobjetos
Aunque la invención ha sido ilustrada y descrita a detalle en las figuras y descripción anterior, tal ilustración y descripción han de considerarse ilustrativas o de ej emplificación y no restrictivas; la invención no se limita a las modalidades descritas. Otras variaciones a las modalidades descritas pueden entenderse y afectarse por aquellas personas expertas en la técnica en la práctica de la invención reivindicada, de un estudio de las figuras, la descripción, y las reivindicaciones adjuntas. En las reivindicaciones, la palabra "comprende" no excluye otros elementos o etapas, y el artículo indefinido "uno" o "una" no excluye una pluralidad. El puro hecho de que ciertas mediciones se reciten en reivindicaciones dependientes mutualmente diferentes no indica que una combinación de estas mediciones no pueda usarse para aventajar. Cualquiera de las
señales de referencia en las reivindicaciones no debe de construirse como limitante del enfoque.
Aunque las modalidades del sistema descrito y las variantes del método descrito se han descrito a detalle en la descripción con referencia a las figuras, la descripción y las figuras han de considerarse de ej emplificación y no restrictivas; la invención no se limita a las modalidades descritas .
Por ejemplo, es posible practicar la invención en una configuración en donde la mezcla de preparación celular se suministra en uno o más contenedores, para mezclarse en el punto antes que la mezcla se disperse en él . Puede ser ventajoso pre-dispensar la mancha nuclear en el portaobjetos y la mancha citoplasmática en el portaobjetos, sin desviarse de la descripción. Todas tales variaciones se consideran son variantes de la presente descripción. Variaciones y combinaciones adicionales le aparecerán a un practicante y tales variaciones se considera estén dentro del enfoque de los métodos descritos .
La Fig. 1 muestra esquemáticamente, una modalidad del sistema descrito 100. El contenedor 101 contiene una mezcla de preparación celular en forma líquida. El contenedor 101 se muestra tiene una tapa 109 que cuando se cierra se configura para ser hermética y por lo tanto protege al líquido 107 contenido en el contenedor 101.
El líquido 107 se constituye para realizar una variedad de funciones simultáneamente. Puede configurarse para realizar dos grupos principales de funciones llamados fijar las células y preparación celular. La palabra fijador se usa aquí en el sentido que es para exterminar, preservar, y endurecer (tejido, células, etc.) para estudio microscópico subsecuente. La preparación celular es una función por la cual las células se prepararon para ponerse en un portaob etos. El proceso respectivo se describirá a detalle a continuación .
El portaobjetos 103 es similar a la pieza rectangular de vidrio normalmente usada en portaobjetos citológicos excepto que está recubierta con una mancha nuclear, entre otras cosas. El portaobjetos está destinado a estar cubierto con un cubreobjetos que es similar al cubreobjetos normalmente usado en portaobjetos citológicos, esto es, una pieza rectangular de vidrio excepto que está recubierta con una mancha citoplasmátic . Habiendo introducido los órganos esenciales del sistema descrito, los detalles respecto a ellos y el método pretendido para su uso se describen a continuación.
Una muestra citológica se obtiene de un sujeto del modo convencional. Como un ejemplo, la muestra puede extraerse del cuello del útero de un sujeto femenino para selección de cáncer de cuello uterino. La muestra se obtiene usando un tipo de espátula de madera o hisopo de algodón, o cepillo. La
muestra así obtenida se sumerge en la mezcla de preparación celular 107, preferiblemente dentro del contenedor 109 y se agita o sacude de manera que los constituyentes de la muestra, especialmente las células, se suspendan uniformemente en la mezcla de preparación celular.
En una modalidad la mezcla de preparación celular esencialmente contiene un fijador cuyo propósito es fijar las células para preparación adicional del portaobjetos. El componente mayor del fijador es una mezcla de etanol, alcohol isopropílico y ácido acético glacial sustancialmente en la relación de 7:2: 1 respectivamente. Aunque otras relaciones podrían usarse, la relación dicha tiene el pH apropiado para preservar las células sin degradación durante algunas longitudes de tiempo. Si la conservación a largo plazo no se prevé, en el interés de otras funciones del fijador, la relación podría variarse, con algo de experimentación. Las otras funciones podrían ser la velocidad de tinción de las células - en las etapas que siguen, por ejemplo.
En una modalidad alternativa, el componente mayor del fijador es una mezcla que contiene 2-4% por volumen de glutaraldehído en Solución Salina amortiguadora en fosfato 0.1 M (PBS) . La PBS puede ser ya sea de sales de sodio o sales de potasio.
Sin embargo, para la preparación de buenos portaobjetos, esto es, los portaobjetos que tienen una sustancialmente mono
capa de células sin superponer y uniformemente distribuidas sobre la superficie del portaobjetos, otros compuestos se agregan la fijador y estos colectivamente pueden llamarse la preparación celular. Se encuentra que las células no se agrupan juntas si tiene una carga de superficie en ellas. Para hacer que las células adquieran carga de superficie otros componentes se agregan al fijador. Clorhidrato Poli-1-Lisina (PLL) o Polivinilpirrolidona (PVP) cuando se mezcla en cantidades apropiadas proporcionan carga positiva a las células y por lo tanto se repelen las unas con las otras facilitando una mono capa de células. Alternativamente los compuestos que proporcionan carga negativa también podrían usarse. Algunos de los compuestos que podrían usarse son sulfato Dextran o Poli sodio 4 -estirenosulfonato o ácido Poli metil acrílico o Carboximetil celulosa o una sal de sodio o ácido poliacrílico . Esta lista no es de ninguna manera exhaustiva. Conocer el principio que involucra una variedad de otros compuestos puede usarse.
Adicionalmente , la coagulación de la sangre y otras células en la muestra ha de evitarse. De este modo los anticoagulantes se agregan a la mezcla de preparación celular. Uno o más de los siguientes también se agregan a la mezcla de preparación celular: ácido etilendiamina tetra acético (EDTA) , ácido hidroxietilendiamina triacético (HEDTA) , ácido nitriolotriacético (NTA) , citrato de sodio, oxalato de
disodio ( (Na+) 2C2042") , y oxalato de dimetilo (CH3)2C20 . Las diversas concentraciones de estos compuestos que pueden usarse son EDTA : 1-1.5 mg/ml de la mezcla de preparación celular; Citrato de sodio: 3.8% v/v de la mezcla de preparación celular; Oxalato: 1% v/v de la mezcla de preparación celular, etc. Las cantidades apropiadas para los otros compuestos mencionados también pueden encontrarse con algo de experimentación.
Adicionalmente los agentes desmulsificantes tal como NaOH al 1%, NaOH al 2% + 0.25g N-Acetil -L-Cisteína o NaOCl añ 3% p/v se agregan a la mezcla de preparación celular.
Además, los detergentes se agregan a la mezcla de preparación celular para mejor la dispersión de células en la mezcla de preparación celular y crear poros limitados en la membrana que ayuda en la tinción de las células. Un detergente idóneo sería Ditiotreitol (DTT) . Alrededor de 1% del p/v de la mezcla de preparación celular sería una concentración idónea del detergente en la mezcla de preparación celular. Con la concentración anterior, la muestra puede almacenarse sin mucho daño a las células por alrededor de una semana. Si no hay tal necesidad, 1-2 % p/v del detergente puede usarse.
De este modo este único componente, viz., la mezcla de preparación celular, solo prepara las células para el punto de preparación de portaobjetos para examen citológico.
El portaobjetos 103 es similar al portaobjetos citológico normal pero pre-dispensado con una mancha. En una modalidad una mancha citoplasmática se pre-dispensa en el portaobjetos. La mancha de elección es Azul de metileno (MB) o Violeta cresil (CV) o mezclas de los dos. Otras manchas nucleares equivalentes que son hidrofílicas en naturaleza pueden usarse para este propósito. Este portaobjetos se recubre con la mancha por recubrimiento de giro por el uso de un protocolo apropiado por donde una capa uniforme delgada de la mancha se forma sobre el portaobjetos. Un espesor de recubrimiento de 10 nm a 10 µp? proporciona una cantidad adecuada de la mancha.
Sin embargo, la buena tinción citoplasmática se alcanza cuando toma lugar en un medio cuyo pH está en el intervalo de 4.5 a 6.5. Para alcanzar esto, en una modalidad la mancha citoplasmática pre-dispensada en el portaobjetos tiene un pH neutro y la mezcla de preparación celular tiene un pH de 4.5 a 6.5, esto es, la mezcla de preparación celular contiene ácido acético y el pH de la mezcla de preparación celular se controla para estar en este intervalo mientras se prepara. En otra modalidad en donde la mezcla de preparación celular contiene glutaraldehído y PBS, la mancha pre-dispensada en el portaobjetos tiene un ácido idóneo mezclado con él antes de que se pre-dispense en el portaobjetos. Un ácido idóneo es ácido clorhídrico (HC1) . La cantidad de HC1 mezclada con la
mancha está tan controlada que cuando una cantidad predefinida de la mezcla de preparación celular con la muestra dispersa en ella se dispone en el portaobjetos, el pH se cambia al valor óptimo viz., 4.5 a 6.5.
El cubreobjetos 105 se pre-dispensa con manchas nucleares. Anaranjado G (OG) y Eosina Azure (EA) se mezclan y se pre-dispensan en el cubre objetos 105. El cubreobjetos también se pre-dispensa con la combinación de mancha nuclear por recubrimiento de giro, con un grosor de 10 nm a 10 µp?.
Además, la tinción nuclear es más efectiva cuando el pH del medio es básico con un pH de 7 - 10. La tinción nuclear puede ocurrir en un pH de 7, o incluso en el intervalo de 6 a 7 pero la tinción es débil o lenta. De este modo, la mancha nuclear pre-dispensada en el cubreobjetos junto con una base tal como hidróxido de sodio (NaOH) o hidróxido de amonio (NH4OH) . De este modo, cuando la mezcla de preparación celular por sí misma es ácida y se deposita en el portaobjetos que es neutro o cuando la mezcla de preparación celular es neutro (7 pH) y su pH se cambia en el portaobjetos a 4.5 a 6.5 para tinción citoplasmática, su pH se cambia de nuevo a 7 - 10 por la base mezclada con la mancha nuclear pre-dispensada en el cubreob etos.
Aunque algunas modalidades del sistema descrito se describen anteriormente, muchas otras modalidades pueden pensarse de, seguidas de los principios detrás del sistema
descrito. Por ejemplo, es posible mezclar las manchas citoplasmáticas con la mezcla de preparación celular de manera que el citoplasma de las células se tiñe cuando la muestra se dispersa en él. Una vez que un tiempo predefinido ha transcurrido después de que la muestra se introduce en la mezcla de preparación celular, una pequeña cantidad de la muestra preparada se deposita en el portaobjetos recubierta con una mancha nuclear y una base de manera que el pH de la muestra preparada se cambia en el punto y el núcleo de las células se tiñe. En una tal modalidad, el cubreobjetos no tiene recubrimiento en él y por lo tanto es un cubreobjetos normalmente usado en portaobjetos citológicos. Otra variación que puede pensarse es teñir el núcleo de las células primero teniendo una mezcla de preparación celular con un pH arriba de 7 y que contiene una mancha nuclear y entonces cambiar el pH en el punto en el portaobjetos a 5 - 6.5 con el portaobjetos siendo pre-dispensado con una mancha citoplasmática y un ácido. Todas las otras modalidades se consideran son cubiertas por esta descripción.
La Fig. 2 muestra un método de preparación de un portaobjetos citológico. La primera etapa en el descrito en el procedimiento a continuación no es una etapa en el proceso descrito pero si un proceso seguido normalmente en la obtención de una muestra citológica. Sin embargo el hecho de obtener una muestra citológica se muestra como la etapa 211 y
en un cuadro con una línea punteada y flecha punteada, para indicar que no forma, de hecho, una parte del método descrito .
Sin embargo, una vez que la muestra se obtiene de una manera conocida usando una espátula un hisopo o un cepillo o por cualquier otro medio idóneo, la muestra se dispersa en la mezcla de preparación celular especialmente preparada descrita anteriormente y dispersa en ella en una etapa de dispersión 213. La mezcla de preparación celular prepara las células en la muestra para depositarlas para preparar un portaobjetos. La dispersión puede ayudarse agitando la muestra en la mezcla de preparación celular usando los medios con los que la muestra se obtiene, la espátula por ejemplo. Alternativamente el contenedor que contiene la mezcla de preparación celular se sacude ligeramente con la muestra obteniendo medios inmersos en ella. Ha de entenderse que la parte de los medios que contiene la muestra se sumerge en la mezcla de preparación celular. Esta dispersión de la muestra en la mezcla de preparación celular puede requerir una duración mínima. Esto puede depender de la composición exacta de la mezcla de preparación celular.
En una etapa de deposición 215, una cantidad de la muestra dispersa en la mezcla de preparación celular, llamada la muestra preparada, se deposita en el portaobjetos pre-dispensado con la mancha citoplasmática y se deja extender de
manera uniforme sobre la misma. La cantidad de la mezcla preparada depositada en el portaobjetos ha de definirse ya que el pH de la mezcla preparada va a cambiarse en el punto ya sea en esta etapa o en una etapa subsecuente y puede ser desde algunas gotas a muchas gotas en diferentes ubicaciones en el portaobjetos. Una vez que la muestra preparada entra en contacto con la mancha pre-dispensada y la mancha se disuelve en la mezcla de preparación celular, comienza tiñendo el citoplasma de las células en la muestra preparada.
Después de una cantidad de tiempo idónea permitiendo la tinción del citoplasma de las células en la muestra preparada, el cubreobjetos, pre-dispensado al menos con la mancha nuclear se usa para cubrir la muestra preparada depositada en una etapa de cubrimiento 217 de manera que la superficie del cubreobjetos pre-dispensado con la mancha nuclear entra en contacto con la muestra preparada depositada al respecto. La duración del tiempo requerido para pasar antes de la colocación del cubreobjetos puede depender de la composición exacta de las modalidades diferentes de la mezcla de preparación celular descritas antes. Esto puede tener que experimentarse con y especificado como el tiempo mínimo requerido pasando antes de que el cubreobjetos pueda colocarse sobre la muestra.
Cuando el cubreobjetos pre-dispensado con mancha nuclear entra en contacto con la muestra preparada depositada en el
portaobjetos, la mancha nuclear se disuelve en la mezcla de preparación celular y comienza a teñir el núcleo de las células. Como en el caso del tiempo requerido para teñir después de la deposición de la muestra preparada en el portaobjetos, un periodo mínimo de tiempo se deja para la tinción de las células con la mancha nuclear antes de que los portaobjetos preparados puedan secarse de una manera acelerada, si se necesita, calentándolos por ejemplo.
Con esto, un portaobjetos listo para examinarse a través de un microscopio o siendo leído por un dispositivo de análisis celular óptico automatizado estará listo. Como puede verse por la descripción anterior, la preparación del portaobjetos citológico se orienta hacia la preparación del punto de portaobjetos con un pequeño número de etapas que se usan en métodos conocidos hasta ahora. Ha de entenderse que aunque una preparación de portaobjetos sencillo está referida en la descripción, el mismo sistema puede tener que usarse para la preparación de más de un portaobjetos, con la misma muestra preparada, en un tiempo, como puede ser requerido por estándares o pautas de laboratorio normales. El volumen de la mezcla de preparación celular y la cantidad de muestra obtenida del sujeto puede estandarizarse de manera que el número requerido de portaobjetos pueda prepararse en un tiempo .
Puede visualizarse que un kit práctico basado en el
sistema y método descrito puede tener una cantidad predefinida de la mezcla de preparación celular para preparar el número de portaobjetos requeridos por la práctica de laboratorio relacionada y también estandarizar la cantidad de muestra obtenida, el medio preferido para obtenerlo, el método de dispersión de la muestra para obtener la muestra preparada y el tiempo mínimo requerido en varias etapas del método de manera que el número requerido de portaobjetos buenos puede prepararse en el punto para estudio adicional.
En esencia, el método puede describirse como que tiene tres etapas. La primera siendo la dispersión de una muestra citológica en una mezcla de preparación celular en donde las funciones múltiples se realizan simultáneamente, tal como, dispersión de las células en la mezcla de preparación celular, modificación de la superficie celular, suministro de la superficie de las células con carga eléctrica de modo que se distribuyan de manera uniforme y no se agrupen juntas y la preparación de la superficie celular para tinción. Adicionalmente la mezcla de preparación celular también puede tener un pH que sea óptimo para tinción. La segunda etapa es teñir el citoplasma de las células. La tercera etapa siendo el cambio del pH de la muestra preparada, en el punto, y tiñendo el núcleo de las células en la muestra preparada. Aunque sólo esta variante del método descrito se describe anteriormente, muchas variantes de este método pueden
pensarse basándose en ella. Por ejemplo, la mezcla de preparación celular también puede contener la mancha citoplasmática de manera que aparte de las funciones ya enlistadas en la primera fase, el citoplasma también puede estar teñido al mismo tiempo. Es posible hacer cambios idóneos en la mezcla de preparación celular de manera que el núcleo de las células se tiñe primero y luego el citoplasma. Todas estas variaciones se consideran son variaciones del método descrito y por lo tanto cubiertas por esta descripción .
Las Figs . 3A-3D muestran varios problemas que ocurren bajo protocolos para preparación de muestra de acuerdo al estado de la técnica. En la Fig. 3A, un polimorfo se superpone a una célula, que impedirá inspección visual posterior de dicha célula o creará artefactos en análisis de imagen automático. La Fig. 3B muestra células que están plegadas, que llevan a problemas similares como se discute en la Fig. 3A. La Fig. 3C muestra células que están parcialmente superpuestas, de nuevo, la inspección visual posterior se obstaculizará y se crearán artefactos en análisis de imagen automática. La Fig. 3D muestra células como debe de ser para permitir el análisis de imagen propio, ya sea visualmente o con análisis de imagen automática, esto es, las células que no están plegadas y las células que están adecuadamente dispersas sin superposiciones.
La Fig. 4 muestra un flujo de trabajo de ej emplificación, más la funcionabilidad de cada uno de los componentes de la presente invención. Observe que este ejemplo no es de ninguna manera restrictivo. Además observe que los componentes I y II (esto es, fijador y modificador de superficie celular) pueden combinarse.
La Fig. 5 muestra en el incremento en potencial zeta (esto es, potencial de membrana celular) para células cervicales con incremento en concentración de PVP (Polivinilpirrolidona) . PVP afecta la carga de membranas celulares positivamente. En la muestra 1, sólo un alcohol basado en fijador se usa. En las muestras 2 - 4, el mismo fijador de alcohol se usa que contiene ya sea 2, 4, o 5 mg/ml PVP.
Las Figs . 6A-6B muestran células teñidas. En la Fig. 6A, los núcleos celulares han sido teñidos con Azul metileno, y en la Fig. 6B el citoplasma celular ha sido teñido con Eosina Azure (EA) y Anaran ado G (OG) . Es importante mencionar que la tinción no ha sido afectada por etapas previas llevadas a cabo de acuerdo a la invención, esto es, el uso de agentes de quelación y anti-coagulantes (para evitar la coagulación celular) , como ácido etilendiamina tetra acético (EDTA) , ácido hidroxietilendiamina triacético (HEDTA) , ácido Nitriolotriacético (NTA) , Citrato de sodio, Oxalatos, el uso de agentes demulsificantes , como NaOH al 1%, NaOH al 2% +
0.25g/50ml N-Acetil-L-Cisteína, NaOCl al 3%, el uso de detergentes (para mejor dispersión de células y poros limitados creados en la membrana) , como Ditiotreitol (DTT) , TritonX-100, etc.
La Fig. 7 muestra la degradación gradual de las células con el tiempo en un fijador con base de alcohol. La degradación se retrasa cuando el pH del fijador se hace más cerca a neutro (por ejemplo, 4.5 - 6.5) por la adición de una base o una solución amortiguadora respectiva.
La Fig. 8 muestra, ejemplarmente, un flujo de trabajo para la preparación de manchas en combinación con un detergente y una base (para un cambio de pH en el punto) . Un detergente (tal como Tritón X-100 o DTT se mezcla directamente en fijador (ya sea con base de alcohol o glutaraldehído) en los que las muestras se recolectan. Opcionalmente , dicha solución también puede contener una mancha, por ejemplo mancha citoplasmática (por ejemplo, Eosina Azure (EA) y/o Anaranjado G (OG) ) . El pH de la solución preferiblemente se mantiene en el intervalo de 4.5 a 6.5. Otra mancha (mancha nuclear tal como hematoxilina, azul de metileno, etc.) se recubre en el portaobjetos junto con cualquier compuesto base (tal como NaOH, NaCl, NH4OH, etc.) . La concentración de la base debe de seleccionarse de manera que el pH del volumen deseado de fijador (ácido en naturaleza) pueda cambiarse rápidamente a básico (7.5 a 9.5.
También observe que la mancha nuclear puede agregarse a la suspensión celular, y la mancha citoplasmática puede recubrirse en el portaobjetos.
La Fig. 9 muestra un flujo de trabajo de ej emplificación mostrando la preparación de la mancha, y un proceso de tinción de ej emplificación . Una mezcla de Azul de metileno (MB) y Violeta cresil (CV) se usa como una mancha nuclear. Otros tintes de mancha nuclear que son hidrofílicos pueden usarse para este propósito, también. La mancha se recubre en un portaobjetos por recubrimiento de giro por un protocolo apropiado con la finalidad de proporcionar una capa uniforme delgada de la mancha (10 nm - 10 µt?) que se forma. Para la tinción del citoplasma, Anaranjado G (OG) y Eosina Azure (EA) se mezclan juntos para formar un solvente, y entonces se recubren en un cubreob etos. Esto asegura que tanto la tinción nuclear como la tinción citoplasmática se pre-dispensan y pueden ensamblarse en un dispositivo sencillo para tinción. El portaobjetos y el cubreobjetos (esto es, el primero y el segundo medios de soporte de muestra) pueden ensamblarse de manera que estén conectados el uno con el otro con una bisagra como se muestra en la Fig. 10. Un espaciador también puede proporcionarse entre las superficies (2-100 µ?? grosor) de manera que cuando las células se colocan entre los dos medios de soporte de muestra, las células se protegen de ser exprimidas.
La Fig. 10 muestra una modalidad de ej emplificación que comprende un primer medio de soporte de muestra (portaobjetos
1001) y un segundo medio de soporte de muestra (cubreobjetos
1002) , en los que ambos medios de soporte de muestra están conectados por una bisagra 1005. Además, un espaciador 1003 se proporciona que puede tener un grosor de 2-100 pm para evitar el exprimido de las células. El espaciador puede tener propiedades de amortiguación y/o auto adhesivas. En la Fig. 10, la mancha citoplasmática ha sido pre-dispensada en el portaobjetos, y la mancha nuclear ha sido pre-dispensada en el cubreobjetos. Sin embargo, este ajuste puede voltearse (esto es, la mancha citoplasmática puede estar en el cubreobjetos, y la mancha nuclear puede estar en el portaobjetos) . Además, el cubreobjetos y el portaobjetos pueden tener tamaños similares o incluso los mismos, o diferir los unos de los otros incluso más de lo que se muestra en la Fig. 10. Como se discute anteriormente, ya sea la mancha nuclear o la mancha de citoplasma can pueden también darse a la suspensión celular más temprano.
Las Figs . 11A-11D muestran los resultados de una técnica de tinción en un punto pre-dispensada de acuerdo a la invención. Los portaobjetos y cubreobjetos han sido recubiertos con manchas por recubrimiento por giro como se describe en el ejemplo 1. Los portaobjetos pre-dispensados entonces se usaron para experimentos de tinción en células
cervicales. Para este proposito la muestra cervical recolectada en un medio se colocó en un sustrato de fondo y después el cubreobjetos se colocó en él. Los portaobjetos se examinaron en el microscopio después de 3 min de tinción, y las imágenes se obtuvieron. La Fig. 11 A muestra tinción con Anaranjado G. La Fig. 11B muestra tinción con Eosina Azure, y la Fig. 11C muestra tinción con Azul de metileno (MB) y Violeta cresil (CV) . La Fig. 11D muestra la tinción de citoplasma en células cervicales con una combinación de Anaranjado G (OG) y Eosina Azure (EA) después de 3 min.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Claims (19)
1. Un sistema o kit para preparar una muestra citológica para examen, caracterizado porque comprende: un fijador para fijar células comprendidas en dicha muest a un modificador de superficie celular para la modificación de la superficie de células comprendidas en dicha muestra, un primer medio de soporte de muestra que tiene al menos dos lados, y, un segundo medio de soporte de muestra que tiene al menos dos lados, en donde en al menos un lado de al menos uno de los medios de soporte una mancha citoplasmática o una mancha nuclear se deposita, y en donde el primer medio de soporte de muestra y el segundo medio de soporte de muestra están conectados el uno al otro por medio de una bisagra .
2. Un método para preparar una muestra citológica para examen, caracterizado porque comprende las etapas de: fijar las células comprendidas en dicha muestra con un fij ador, modificar la superficie de las células comprendidas en dicha muestra con un modificador de superficie celular, proporcionar un primer medio de soporte de muestra que tiene al menos dos lados, y, un segundo medio de soporte de muestra que tiene al menos dos lados, en donde en al menos un lado de al menos uno de los medios de soporte una mancha citoplasmática o una mancha nuclear se deposita, en donde el primer medio de soporte de muestra y el segundo medio de soporte de muestra están conectados el uno al otro por medio de una bisagra, depositar las células en ya sea el primero o el segundo medio de soporte de muestra, y cubrir las células depositadas con el segundo o primer medio de soporte de muestra, respectivamente .
3. El sistema o kit de conformidad con la reivindicación 1 o el método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque una mancha nuclear se deposita en al menos un lado del primer medio de soporte de muestra y una mancha citoplasmática se deposita en al menos uno de los segundos medios de soporte de muestra.
4. El sistema, kit o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque el primer medio de soporte de muestra y/o el segundo medio de soporte de muestra están en la forma de un portaobjetos y/o un cubreobjetos.
5. El sistema, kit o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque el fijador y/o el modificador de superficie celular se proporcionan en forma líquida.
6. El sistema, kit o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque el fijador comprende al menos un agente seleccionado del grupo que consiste de • etanol • alcohol isopropílico • ácido acético (preferiblemente ácido acético glacial) • formaldehído • glutaraldehído .
7. El sistema, kit o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque el fijador comprende una mezcla que incluye etanol, alcohol isopropílico y ácido acético glacial, preferiblemente en una relación de volumen de 7:2:1.
8. El sistema, kit o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque el fijador comprende glutaraldehído y solución salina amortiguada en fosfato, con preferiblemente 2% - 20% p/p de glutaraldehído en una solución salina amortiguada en fosfato 0.1 M a 1 M.
9. El sistema, kit o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas. caracterizado porque el fijador tiene un pH de 5 a 6.5.
10. El sistema, kit o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque el modificador de superficie celular comprende al menos un agente seleccionado del grupo que consiste de • un agente para producir una carga positiva para la superficie celular, • un agente para producir una carga negativa para la superficie celular, • un agente quelante, • un agente anti-coagulante , • un agente desmulsificante , • un agente para respaldar la dispersión celular, y/o · un agente para crear microporos en la superficie celular .
11. El sistema, kit o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque una mezcla de preparación celular se proporciona la cual comprende al menos el fijador y el modificador de superficie celular.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque las etapas del método de fijar las células comprendidas en dicha muestra y modificar la superficie de las células comprendidas en dicha muestra se llevan a cabo simultáneamente.
13. El sistema, kit o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque la mancha nuclear comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste de: • Carmín • Azul de metileno • Rojo neutro/Toluileno • Hematoxilina • Safranina • Azul de Nilo.
14. El sistema, kit o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque la mancha de citoplasma comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste de: • Eosina • Azul de alcian • Ponceau de Xilidina, • escarlata Biebrich • Tartazina • Tinción de Van Gieson • Tinción de Wright .
15. El sistema, kit o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque un primero y un segundo medios de soporte de muestra se configuran para ser recibidos por un dispositivo automatizado para tinción de la muestra.
16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque además comprende al menos una etapa seleccionada del grupo que consiste de a) inspección detallada del cuello uterino por colposcopía ,- b) llevar a cabo una prueba de ADN VPH en dicha muestra biológica, o en una nueva muestra con propiedades comparables ; c) llevar a cabo una prueba de biomarcador en dicha muestra biológica, o en una nueva muestra con propiedades comparables; y/o d) inspección visual de dicha muestra biológica, o de una nueva muestra con propiedades comparables, por un patólogo calificado.
17. Uso de un sistema, kit o método de conformidad para al menos un propósito seleccionado del grupo de · selección de cáncer • diagnóstico de cáncer • predicción con respecto a la terapia dada • monitoreo concomitante de una terapia de cáncer dada.
18. El sistema, kit o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque la muestra citológica es una muestra cervical .
19. El sistema, kit o método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones antes mencionadas, caracterizado porque la muestra citológica es seleccionada del grupo que consiste de • muestra citológica • rebanada de tej ido • muestra líquida, y/u · otras muestras de citología.
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US10126216B2 (en) | 2011-02-17 | 2018-11-13 | Ventana Medical Systems, Inc. | Method for tissue sample fixation |
WO2016041890A2 (en) * | 2014-09-17 | 2016-03-24 | Ventana Medical Systems, Inc. | Compositions, methods, and systems for tissue fixation |
CN104390832A (zh) * | 2014-11-07 | 2015-03-04 | *** | 一种适用于血细胞的快速瑞氏染液的配方及制作方法 |
AU2016323062A1 (en) * | 2015-09-14 | 2018-04-12 | Essenlix Corp. | Device and system for analyzing a sample, particularly blood, as well as methods of using the same |
RU178938U1 (ru) * | 2017-06-20 | 2018-04-23 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Амурская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Устройство для подготовки цитологического мазка биологических жидкостей к проведению экспресс-анализа клеточного состава |
CN108287240A (zh) * | 2018-01-29 | 2018-07-17 | 青岛浩铂生物科技有限公司 | 基于尿液中宫颈脱落细胞染色的检测***试剂及制备方法 |
CN108303416A (zh) * | 2018-01-29 | 2018-07-20 | 青岛浩铂生物科技有限公司 | 一种上皮组织染色液试剂盒及其制备方法 |
CN112574938B (zh) * | 2019-09-29 | 2023-02-03 | 体必康生物科技(广东)股份有限公司 | 一种用于膜过滤富集细菌的痰处理液及其应用 |
Family Cites Families (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US3796594A (en) * | 1970-10-30 | 1974-03-12 | Gen Electric | Stain coated slides for differentially staining blood |
US3834874A (en) * | 1972-10-18 | 1974-09-10 | Gen Electric | Detection of malarial parasites in blood |
DE2515869C3 (de) * | 1975-04-11 | 1979-11-08 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von vorbeschichteten Objektträgern |
GB1555507A (en) * | 1975-08-08 | 1979-11-14 | Gen Electric | Slides |
FR2320544A1 (fr) * | 1975-08-08 | 1977-03-04 | Gen Electric | Formulation et procede de coloration et de scellement d'un echantillon biologique |
JPS60159630A (ja) * | 1984-01-31 | 1985-08-21 | Hisashi Tokita | 抗癌剤感受性試験のキツト |
US5002736A (en) * | 1987-03-31 | 1991-03-26 | Fisher Scientific Co. | Microscope slide and slide assembly |
US5394913A (en) * | 1991-10-10 | 1995-03-07 | Samsonite Corporation | Hinge for personal leather goods |
GB9518129D0 (en) * | 1995-09-06 | 1995-11-08 | Zynocyte Ltd | Stain and capillary slide |
CA2335747A1 (en) * | 1998-06-30 | 2000-01-06 | Lamina, Inc. | Cytological and histological fixative composition and methods of use |
RU2184966C1 (ru) * | 2000-11-30 | 2002-07-10 | Боев Сергей Федотович | Способ анализа клеточного состава крови по мазку |
US7138226B2 (en) * | 2002-05-10 | 2006-11-21 | The University Of Miami | Preservation of RNA and morphology in cells and tissues |
CN101598731B (zh) * | 2009-05-07 | 2013-04-24 | 陈志南 | 一种用于肿瘤病理诊断用途的免疫组织化学诊断试剂盒 |
CN101852697B (zh) * | 2010-05-26 | 2012-05-02 | 福州泰普生物科学有限公司 | 一种检测脱落细胞的靶向染色试剂盒及其使用方法 |
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