MX2014000966A - Enzimas cetoisovalerato descarboxilasa y metodos de uso de las mismas. - Google Patents

Abstract

En la presente invención se proporcionan polipéptidos y polinucleótidos que codifican estos polipéptidos que tienen actividad cetoisovalerato descarboxilasa. Se proporcionan, además, células huésped recombinantes que comprenden tales polipéptidos y polinucleótidos, y métodos para convertir acetoisovalerato en isobutiraldehído o métodos para producir isobutanol mediante el uso de los polipéptidos descritos.

Description

ENZIMAS CETOISOVALERATO DESCARBOXILASA Y METODOS DE USO DE LAS MISMAS CAMPO DE LA INVENCION La invención se relaciona con polipéptidos que tienen actividad descarboxilasa adecuada para rendimiento en rutas de producción de ANTECEDENTES DE LA INVENCION El butanol es una sustancia química industrial útil como aditivo para como sustancia química usada como materia prima en la industria de plásticos y como agente extractor de grado alimenticio en la industria de alimentos y saborizantes Cada año se producen de a g 10 a 12 mil millones de de butanol por medios petroquímicos y la necesidad de este producto químico básico en el futuro Se conocen métodos para la síntesis química del isómero de tales como síntesis de hidrogenación catalítica de monóxido de carbono of Industrial Chemistry de VCH Verlag GmbH y Vol págs y la condensación de Guerbet de metanol con et Catal Estos procedimientos usan materias primas derivadas de 245636 petroquímicos La producción de isobutanol a partir de materias primas de origen vegetal podría minimizar el uso de combustibles fósiles y representaría un avance en la La patente de los EE describe rutas enzimáticas para la producción de isobutanol en microorganismos recombinantes La penúltima etapa en una ruta metabólica descrita en esta patente para la producción de isobutanol es la conversión de en isobutiraldehído Persiste la necesidad en la técnica de identificar otras enzimas que sean adecuadas para usarse en las rutas biosintéticas de BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION En la presente descripción se proporcionan células huésped recombinantes y métodos para convertir cetoisovalerato en isobutiraldehído mediante el uso de los polipéptidos En los métodos proporcionar un en donde el comprende al menos uno al menos 80 al menos 85 al menos 90 al menos 95 o al menos 98 de identidad con la sec con de ident 61 o 63 o un fragmento activo de o actividad una relación de especificidad para con respecto a piruvato mayor que aproximadamente 1 y constante de activación del cofactor tiamina difosfato de aproximadamente 20 µ? o y poner en contacto el polipéptido con cetoisovalerato en condiciones para producir isobutiraldehído En el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de sec con de ident 61 o En el polipéptido comprende una secuencia de Listeria grayi o Macrococcus caseolyticus En el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de con de 58 o En el contacto se produce en presencia de menos de aproximadamente 30 menos de aproximadamente 20 o menos de aproximadamente 10 de En el contacto se produce dentro de una célula huésped recombinante y en donde el polipéptido es heterólogo en la célula huésped En la célula huésped recombinante es un miembro de los géneros Escherichia Salmonella Shigella Klebsiella Yarrowia Candida o En la célula huésped recombinante es Saccharomyces cerevisiae En la célula huésped recombinante polinucleótidos heterólogos que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustratos en piruvato en acetolactato en 2 3 y 2 3 en 2 En la célula huésped un polinucleót ido heterólogo que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de sustratos en productos de isobutiraldehído en En la célula huésped recombinante actividad piruvato descarboxilasa reducida o En la célula huésped recombinante al menos una mutación sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros En la célula huésped recombinante comprende la supresión de En la célula huésped recombinante comprende actividad glicerol deshidrogenasa reducida o En la presente se métodos para producir los métodos proporcionar una célula huésped recombinante que comprende una ruta de producción de la ruta de producción comprende un polipéptido en donde el polipéptido comprende al menos uno al menos 80 al menos 85 al menos 90 al menos 95 o al menos 98 de identidad con la con de 61 o 63 o un fragmento activo de o actividad una relación de especificidad para cetoisovalerato con respecto a piruvato mayor que y una constante de activación del cofactor de tiamina difosfato de aproximadamente 20 µ? o y poner en contacto la célula huésped recombinante con un sustrato de carbono en condiciones mediante las cuales se produce En el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de sec con de ident 61 o En el polipéptido comprende una secuencia de Listeria grayi o Macrococcus caseolyticus En el polipéptido tiene un valor E del perfil del grupo KIVD menor que mediante el uso del programa En los métodos aislar el isobutanol en aislar comprende la extracción En el agente extractor para la extracción líquido comprende alcoholes grasos de C12 a ácidos grasos de C12 a esteres de ácidos grasos de C12 a aldehidos grasos de C12 a y mezclas de En la célula huésped recombinante es Saccharomyces cerevisiae En el método para producir isobutanol proporcionado en la presente descripción proporcionar una célula huésped recombinante que comprende un isobutanol biosintético que comprende un polipéptido que tiene al menos 80 al menos 85 al menos 90 al menos 95 o al menos 98 de identidad con la sec con de ident 52 o y poner en contacto la célula huésped recombinante con un sustrato de carbono en condiciones mediante las cuales se produce En el contacto se produce en presencia de menos de aproximadamente 30 de En los métodos y las células huésped recombinantes proporcionadas en la presente descripción comprenden polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 80 85 90 95 o 98 de identidad con la sec con de ident sec con de ident 52 53 61 273 274 282 283 302 303 304 316 353 376 383 392 394 412 414 o o un activo de BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra los datos de relaciones de especificidad para los sustratos y por polipéptidos KIVD izquierda a La Figura 2 demuestra los rendimientos de cetoisovalerato y piruvato en presencia de 0 1 y 30 de tiamina para células huésped como se describe en los La Figura 3 muestra la concentración de cetoisovalerato con respecto al tiempo de fermentación para células huésped recombinantes en presencia de y 30 de como se describe en los La Tabla Z es el Perfil HMM del grupo KIVD descrito en la presente La Tabla Z forma parte de la descripción DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se defina lo todos los términos científicos y técnicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado como el entendido comúnmente por una persona con conocimiento ordinario en la técnica a la que pertenece esta En caso de prevalecerá la presente solicitud junto con las definiciones a menos que se requiera lo los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el Todas las patentes y otras referencias mencionadas en la presente descripción se incorporan como referencia en su totalidad para todo propósito Para definir adicionalmente esta se proporcionan en la presente descripción los siguientes términos y Como se usa en la presente los términos o o cualquier otra variación de harán referencia a la inclusión de un número entero o grupo de números enteros pero no a la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números Por una una un un un artículo o un aparato que comprende una lista de elementos no se solo a esos sino que puede incluir otros que no estén expresamente listados o sean inherentes a tal artículo o a menos que se especifique expresamente en la disyunción se relaciona con un incluyente y no con un Por una condición A o B se satisface mediante cualquiera de los siguientes A es verdadero y B es falso no A es falso no y B es verdadero y tanto A como B son verdaderos Como se usa en la presente el término o variaciones tales como o consiste tal como se usa en toda la descripción y las indica la inclusión de cualquier número entero o grupo de números enteros pero que no se puede añadir ningún número entero o grupo de números enteros adicionales al la estructura o la composición especificados Como se usa en la presente el término prácticamente o variaciones tales como prácticamente o consiste prácticamente como se usa en toda la descripción y las indica la inclusión de cualquier número entero o grupo de números enteros y la inclusión opcional de cualquier número entero o grupo de números enteros mencionados que no cambian sustancialmente las propiedades básicas o novedosas del la estructura o la composición Ver los artículos indefinidos y que preceden un elemento o componente de la invención están previstos para ser no restrictivos con respecto a la cantidad de es las apariciones del elemento o Por consiguiente o deben interpretarse para incluir uno o al menos y la forma singular de la palabra del elemento o componente el a menos que el indique que es El término o tal como se usa en la presente es un término no limitante y no está previsto para referirse a cualquier modalidad individual de la invención sino que abarca todas las modalidades posibles según se describe en la Como se usa en la presente el término que modifica la cantidad de un ingrediente o reactivo usado en la se refiere a la variación que puede producirse en la cantidad por a través de procedimientos de manejo de líquidos y de mediciones típicos usados para preparar concentrados o soluciones en el mundo a través de errores inadvertidos en estos a través de diferencias en la procedencia o pureza de los ingredientes usados para preparar las composiciones o llevar a cabo los y El término cantidades que difieren debido a condiciones de equilibrio diferentes para una composición que resulta de una mezcla inicial Estén o no modificadas por el término las reivindicaciones incluyen equivalentes para las En una el término significa una cantidad dentro del 10 del valor numérico dentro del 5 del valor numérico El término biosintética de se refiere a la ruta enzimática para producir biosintética de se usa como sinónimo de de producción de El término de o de carbono se refiere a una fuente de carbono capaz de ser metabolizada por las células huéspedes recombinantes descritas en la presente Se proporcionan ejemplos no limitantes de sustratos de carbono en la presente descripción e pero no se limitan oligosacáridos polisacáridos dióxido de sustratos de un solo carbono o mezclas de Como se usa en la presente el término se refiere a la cantidad total de isobutanol producida por fermentación por cada litro de medio de La cantidad total de isobutanol la cantidad de isobutanol en el medio de la cantidad de isobutanol recuperada del medio de por por contacto con un agente extractor y la cantidad de isobutanol recuperada de la fase si se usa extracción por arrastre con El término como se usa en la presente se refiere a la cantidad total de isobutanol producida por fermentación por litro de medio de fermentación por hora de El término como se usa en la presente se refiere a la cantidad de isobutanol producida por unidad de sustrato de carbono fermentable consumido por el biocatalizador El término se refiere a una enzima que cataliza la conversión de piruvato en acetolactato y El acetolactato tiene dos estereoisómeros y la enzima prefiere el isómero que se elabora por sistemas Las acetolactato sintasas pueden clasifcarse como número EC Nomenclature Academic San El término abreviatura es y isómero se usan indistintamente y se refieren a enzimas capaces de catalizar la reacción de en dihidroxiisovalerato Las enzimas KARI pueden clasificarse como número EC Nomenclature Academic San Los términos y se refieren a una enzima que cataliza la conversión de 2 3 en cetoisovalerato Las acetohidroxiácido deshidratasas pueden clasificarse como número EC y están disponibles a partir de una amplia gama de El término descarboxilasa de cadena o o o cetoisovalerato en la presente descripción se cetoisovalerato descarboxilasa se refiere a una enzima que cataliza la conversión de cetoisovalerato en isobutiraldehído y Las secuencias de cetoisovalerato descarboxilasa están disponibles a partir de varias fuentes de que incluyen las que se describen en la presente El término deshidrogenasa de cadena se refiere a una enzima que cataliza la conversión de isobutiraldehído en Las alcohol deshidrogenasas de cadena ramificada pueden clasificarse como número EC pero pueden bajo otras alcohol deshidrogenasas EC o El término del grupo se refiere al modelo de perfiles ocultos de Markov preparado como se describe en la presente El Perfil HMM del grupo KIVD se proporciona como Tabla Los términos de ácido nucleico de ácido nucleico y se usan indistintamente y se refieren a un polímero de ARN o ADN raonocatenario o bicatenario que bases nucleotídicas no naturales o Un fragmento aislado de ácido nucleico en la forma de un polímero de ADN puede comprender uno o más segmentos de ADN genómico o ADN El término se refiere a la unidad estructural química básica de una proteína o Las siguientes abreviaturas se usan en la presente descripción para identificar aminoácidos Tabla Aminoácidos El término se refiere a un fragmento de ácido nucleico que es capaz de expresarse como una proteína específica que opcionalmente secuencias reguladoras antes no codificantes no codificantes de la secuencia se refiere a un gen tal como se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias se refiere a cualquier gen que no sea un gen que comprende secuencias reguladoras y codificantes que no se encuentran juntas en la En un gen quimérico puede comprender secuencias regulatorias y secuencias codificantes que se derivan de fuentes diferentes o secuencias regulatorias y secuencias codificantes que se derivan de la misma pero que están organizadas en una forma diferente a la encontrada en la se refiere a un gen nativo en su lugar natural en el de un Un se refiere a un gen que no se en el microorganismo pero que es introducido en el microorganismo huésped por transferencia de Por los genes extraños pueden comprender genes naturales insertados en un microorganismo no o genes Los genes extraños pueden por genes nativos con mutaciones que cambian un residuo de aminoácidos de un polipéptido Un es un gen que ha sido introducido en el por medio de un procedimiento de Como se usa en la presente el término se refiere a una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos Las reguladoras se refieren a las secuencias de nucleótidos que están ubicadas dirección no codificantes dentro o dirección no codificantes de una secuencia codificante y que influyen en la el procesamiento o la estabilidad del ARN o la traducción de la secuencia codificante Las secuencias reguladoras pueden incluir secuencias líderes de secuencias de reconocimiento de sitio de procesamiento del sitio de unión a efectores y estructura de El término cuando se usa con referencia a un un gen o un se refiere a un polinucleótido o gen nativo en su localización natural en el genoma de un organismo para un polipéptido se transcribe y traduce desde ese lugar en el El término cuando se usa con referencia a un un gen o un se refiere a un gen o polipéptido que no se encuentra normalmente en el organismo una región codificante o parte de que se reintroduce en el organismo de origen en una forma que es diferente del gen nativo por no en su lugar natural en el genoma del El polinucleótido o gen heterólogo puede introducirse en el organismo por por transferencia de Un gen heterólogo puede incluir una región codificante nativa con regiones reguladoras no nativas que se reintroduce en el huésped Un es un gen que se ha introducido en el genoma por medio de un procedimiento de La frase recombinante para expresión se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una o más proteínas que incluyen las secuencias reguladoras antes no codificantes y después de terminación de las secuencias codificantes para las Un gen quimérico es un elemento recombinante de expresión Las regiones codificantes de un operón pueden formar un elemento recombinante de expresión junto con una región promotora y de terminación operativamente se refiere a las secuencias de nucleótidos que se localizan dirección no codificantes o dirección no codificantes de una secuencia codificante y que influyen en la el procesamiento o la estabilidad del o la traducción de la secuencia codificante Las secuencias reguladoras pueden incluir potenciadores señales de terminación de secuencias líderes de secuencias de reconocimiento de sitio de procesamiento del sitio de unión a efectores y la estructura de tallo y El término se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos capaz de controlar la expresión de una secuencia codificante o ARN En una secuencia de codificación se localiza en dirección con respecto a una secuencia Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos por elementos diferentes derivados de promotores diferentes que se encuentran en la o incluso comprender segmentos sintéticos de ácidos Los experimentados en la técnica comprenderán que los distintos promotores pueden dirigir la expresión de un gen en tejidos o tipos de células o en distintas etapas del o en respuesta a condiciones ambientales o fisiológicas Los promotores que hacen que un gen se exprese en la mayoría de tipos de células la mayor parte de las veces se Por otra los hacen que un gen se exprese cuando el promotor está inducido o activado por una señal o molécula específica para el Se que dado que en la mayoría de los casos los límites precisos de las secuencias reguladoras no se han definido los fragmentos de ADN de diferentes longitudes pueden tener una actividad promotora Por se entenderá que de puede usarse para hacer referencia a un fragmento derivado de la región promotora del gen El término como se usa en la presente se refiere a secuencias de ADN ubicadas dirección de una secuencia Estas incluyen secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican las señales reguladoras que tienen la capacidad de afectar el procesamiento de ARNm o la expresión La señal de poliadenilación se habitualmente porque afecta la adición de cadenas de ácido poliadenílico al extremo del precursor de La región puede influir la el procesamiento o estabilidad de ARN o la traducción de la secuencia codificante Se reconoce que ya que en la mayoría de los casos los límites exactos de las secuencias reguladoras no han sido completamente los fragmentos de ADN de longitudes diferentes podrían tener una actividad del terminador Por se entenderá que de puede usarse para hacer referencia a un fragmento derivado de la región del terminador del gen El término se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un solo fragmento de ácido nucleico para que la función de una se vea afectada por la Por un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia codificante que la secuencia codificante está bajo el control transcripcional del Las secuencias codificantes pueden estar unidas operativamente a secuencias reguladoras en orientación codificante o no Como se usa en la presente el término se refiere a la transcripción y acumulación estable de codificante o no codificante derivado del fragmento de ácido nucleico de la La expresión se puede a la traducción de ARNm en un Como se usa en la presente el término se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico en el de un microorganismo lo que produce una herencia genéticamente Los microorganismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformado se denominan microorganismos o Los términos y se refieren a un elemento extracromosómico que genes que no forman parte del metabolismo central de la célula están en la forma de fragmentos de ADN bicatenario Estos elementos pueden ser secuencias que se replican secuencias integradoras de secuencias de nucleótidos o lineales o de un ARN o ADN mono o derivadas de cualquier en donde varias de las secuencias de nucleótidos se han unido o recombinado en una construcción única capaz de introducir un fragmento de un promotor y secuencia de ADN para un producto de gen seleccionado junto con la secuencia no traducida apropiada en una de se refiere a un vector específico que contiene un gen exógeno y tiene otros además del gen que facilitan la transformación de una célula huésped de se refiere a un vector específico que contiene un gen exógeno y que tiene otros además del gen que permiten una expresión mejorada del gen en un huésped El término se usa para describir la relación entre bases nucleotídicas que son capaces de hibridarse entre Por con respecto al la adenina es complementaria de la y la citosina es complementaria de la guanina con respecto al la adenina es complementaria del uracilo y la citosina es complementaria de la Las desviaciones en la secuencia de nucleótido que comprende los codones que codifican los de la cadena de polipéptido permiten las variaciones en la secuencia que codifica el Dado que cada codón consiste en tres y los nucleótidos que comprenden el ADN se encuentran restringidos a cuatro bases existen 64 combinaciones posibles de 61 de estos codifican los aminoácidos tres codones restantes codifican la traducción que termina las El que muestra cuales son los codones que codifican ciertos aminoácidos se reproducen en la presente descripción como Tabla Como muchos aminoácidos se designan por más de un Por los aminoácidos alanina y prolina se encuentran codificados por cuatro serina y arginina por en tanto que triptófano y metionina se codifican por solo un Esta degeneración permite que la composición de la base de ADN varíe en una amplia variedad sin alterar la secuencia de aminoácido de las proteínas codificadas por el Tabla Código genético estándar Muchos organismos muestran una parcialidad de uso de codones particulares para codificar la inserción de un aminoácido particular en una cadena de péptido La selección de codón o la preferencia las diferencias en el uso de codones entre se logra por degeneración del código y está documentado con respecto a muchos La preferencia codónica se con la eficacia de traducción del mensajero el cual se a su que es dependiente las propiedades de los codones que se traducen y la disponibilidad de las moléculas del ARN de transferencia La predominancia de los seleccionados en una célula una reflexión de los codones más en síntesis de En los genes pueden adaptarse para una expresión óptima de gen en un organismo dado en función de la optimización por El término por en lo que se refiere a genes o regiones codificantes de moléculas de ácido nucleico para transformación de diversos se refiere a la alteración de codones en el gen o regiones codificantes de las moléculas de ácido nucleico para reflejar el uso de codones típicos del organismo huésped sin alterar el polipéptido codificado por el la optimización incluye reemplazar al menos uno o más que uno o un número significativo de codones con uno o más codones que son más en los genes de ese Dado el gran número de secuencias de gen disponibles para una amplia variedad de planta y especies es posible calcular las frecuencias relativas de uso de Las tablas de uso de codones se encuentran fácilmente disponibles en la por en la de datos de uso de disponible en el 20 de marzo de y estas tablas pueden adaptarse de muchas Ver et Acids Las tablas de uso de codones para calculadas a partir de la publicación de GenBank de febrero de se reproducen más adelante en la Tabla Esta tabla usa la nomenclatura en lugar de que se encuentra en el las tablas usan uracilo que se encuentra en el La Tabla IB se ha adaptado de tal manera que las frecuencias se calculan para cada en vez de que se calcule para los 64 codones Tabla Tabla del uso de codones para Saccharomyces cerevisiae Al usar esta tabla o tablas las personas con conocimiento ordinario en la técnica pueden aplicar las frecuencias a cualquier secuencia dada de polipéptido y producir un fragmento de ácido nucleico de una región codificante optimizada por codón que codifica el si bien usa codones óptimos para una especie La asignación aleatoria de codones en una frecuencia optimizada para codificar una secuencia dada de polipéptido puede realizase manualmente al calcular frecuencias de codones para cada y asignar los codones a la secuencia de polipéptido varios algoritmos y programas de software se encuentran fácilmente disponibles para las personas con conocimiento ordinario en la Por la función en el Paquete disponible de la función de traducción inversa en el paquete de programas VectorNTI disponible de y la función en el Paquete disponible de San Al construir un algoritmo rudimentario para asignar codones basados en una frecuencia dada puede llevarse a con funciones matemáticas básicas por una persona con conocimiento ordinario en la Las regiones codificantes optimizadas por codones pueden diseñarse con varios métodos conocidos para aquellos con experiencia en la técnica que incluyen paquetes de programas tales como gene sintético de visitada el 19 de marzo de Como se usa en la presente el término está previsto para abarcar un singular y el plural y se refiere a una molécula compuesta de monómeros unidos linealmente con enlace amídico como enlace de El término se refiere a una cadena o cadenas de dos o más y no se refiere a una longitud específica del De esta los oligopéptidos de o cualquier otro término usado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos se incluyen dentro de la definición de y el término puede usarse en vez o indistintamente con cualquiera de estos Un polipéptido puede derivarse de una fuente biológica natural o ser producido por tecnología pero no traducido de una secuencia de ácido nucleico Puede generarse de cualquier inclusive mediante síntesis Por un polipéptido o un o derivado de este se entiende un polipéptido que no se encuentra en su medio natural No se requiere ningún nivel de purificación Por un polipéptido aislado puede eliminarse de su ambiente natural o de Los péptidos producidos recombinantemente y proteínas expresadas en células huéspedes se consideran aislados para los propósitos de la dado que son nativos o polipéptidos recombinantes que se han fraccionado o parcial o prácticamente purificados por cualquiera técnica adecuada Una de una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos es aquella porción que comprende una cantidad suficiente de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido o la secuencia de nucleótidos de un gen para identificar putativamente ese polipéptido o ya sea por evaluación manual de la secuencia por parte de una persona con experiencia en la técnica o por comparación e identificación de secuencias automatizada por computadora mediante el uso de tales como BLAST Basic Local Alignment Search Tool eü se necesita una secuencia de diez o más aminoácidos contiguos o treinta o más nucleótidos para identificar putativamente una secuencia de polipéptidos o de ácidos nucleicos como homologa de una proteína o un gen con respecto a las secuencias de las sondas de oligonucleótidos específicas para genes que comprenden de 20 a 30 nucleótidos contiguos pueden usarse en métodos dependientes de secuencias para identificación de genes hibridación y aislamiento ej in situ de colonias bacterianas o placas los oligonucleótidos cortos de bases pueden usarse como cebadores para la amplificación por PC con el fin de obtener un fragmento específico de ácido nucleico que comprende los Por sustancial de una secuencia de nucleótidos comprende una cantidad suficiente de la secuencia para identificar aislar específicamente un fragmento de ácido nucleico que comprende la La presente descripción instruye sobre la secuencia completa de aminoácidos y de nucleótidos que codifican proteínas El técnico con con el beneficio de las secuencias como se reportan en la presente puede usar ahora todas o una porción sustancial de las secuencias descritas para propósitos conocidos para los experimentados en la Por lo la invención instantánea comprende las secuencias completas como se reportan en el listado de secuencias así como las porciones sustanciales de aquellas secuencias tal como se definieron La frase de como se conoce en la es una relación entre dos o más secuencias de polipéptidos o dos o más secuencias de polinucleótidos según lo determinado al comparar las En la el grado de relación de secuencia entre las secuencias de polipéptido o según sea el como lo determina la coincidencia entre las cadenas de las La y la pueden calcularse fácilmente mediante métodos conocidos que pero no se limitan aquellos descritos Computational Molecular Biology Oxford NY Biocomputing and Genome Projects NY Computer Analysis of Sequence Part I y Eds NJ Sequence Analysis in Molecular Biology Academic y Sequence Analysis Primer and NY Los métodos preferidos para determinar la identidad están diseñados para dar la mejor coincidencia entre las secuencias sometidas a Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas informáticos públicamente Los cálculos de alineamientos de secuencia y de porcentajes de identidad pueden realizarse con el programa del conjunto de programas bioinformáticos LASERGENE Los alineamientos múltiples de las secuencias se realizan con el de alineamiento que abarca distintas variedades del algoritmo que incluyen el de alineamiento Clustal que corresponde al método de alineamiento identificado como Clustal V por Higgins y et Appl Biosci e incluido en el programa del conjunto de programas bioinformáticos LASERGENE Para alineamientos los valores predeterminados corresponden a PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN10 y PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE Los parámetros predeterminados para alineamientos en pares y cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias de proteínas con el uso del método Clustal son PENALIZACIÓN DE INTERRUPCIÓN3 y DIAGONALES En el caso de los ácidos estos parámetros son PENALIZACIÓN DE y DIAGONALES Después del alineamiento de las secuencias por medio del uso del programa Clustal es posible obtener un de al ver la tabla de de la en el mismo el de alineamiento Clustal se encuentra disponible y corresponde al método de alineamiento identificado como Clustal W por Higgins y et Appl e incluido en el programa del conjunto de programas bioinformáticos LASERGENE Parámetros predeterminados para alineamiento múltiple DE PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE retardo de las secuencias divergentes peso de transición del matriz de pesos para de matriz de pesos para el Después del alineamiento de las secuencias mediante el uso del programa Clustal es posible obtener un de al ver la de de en el mismo Un experimentado en la técnica comprenderá muy bien que muchos niveles de identidad de secuencias son útiles para identificar como a partir de otras en donde los polipéptidos tienen una función o actividad igual o o para describir los polinucleótidos Los ejemplos útiles de porcentajes de identidades pero no se limitan a 55 60 65 70 75 80 85 90 o 95 o cualquier porcentaje entero desde 55 a 100 puede ser útil para describir la presente tales como 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 o 99 Los fragmentos de polinucleótidos adecuados no solo tienen las homologías mencionadas sino que un polinucleótido que tiene por lo menos 50 por lo menos 100 por lo menos 150 por lo menos 200 o por lo menos 250 los fragmentos de polinucleótidos adecuados que tienen las homologías mencionadas anteriormente codifican un polipéptido que tiene por lo menos 50 por lo menos 100 por lo menos 150 por lo menos 200 o por lo menos 250 El término para el análisis de se refiere a cualquier programa de software o algoritmo computacional que resulta útil para el análisis de secuencias de nucleótido o El de análisis de puede estar comercialmente o desarrollado El software típico para el análisis de secuencia pero no se limita el conjunto de programas GCG Package Versión Genetics Computer Group BLASTX et Biol DNASTAR Sequencher Codes Ann y el programa FASTA que incorpora el algoritmo Comput Methods Genome Meeting Date New Dentro del contexto de esta aplicación se entenderá que cuando el análisis se realiza con el programa de análisis de los resultados del análisis estarán basados en los del programa de la a menos que se especifique de cualquier otra Como se usa en la presente los valores predeterminados se refieren a cualquier conjunto de valores o parámetros que se cargan originalmente con el programa la primera vez que se Las técnicas estándar de clonación molecular y de ADN recombinante usadas en la presente son muy conocidas en la técnica y se describen en y Molecular A Laboratory segunda Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring NY aquí en y en y Experimente with Gene Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring NY y en et Current Protocole in Molecular publicado por Greene Publishing y Interscience Otros métodos que se usan aquí están en Methods in Volumen Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology Christine Guthrie y Gerald Fink Elsevier Academic San En la técnica se conocen otras técnicas y herramientas moleculares e incluyen la escisión y empalme por reacción en cadena de la polimerasa de extensión traslapada et Fungal Biol selección positiva para mutaciones en el locus URA3 de Saccharomyces cerevisiae et M A et Nucleic Acids Enero el sistema de específica en así como los sitios mutantes de lox y mutaciones de sustrato FLP Mol Cell Biol et Journal of Molecular Volumen Ejemplar págs et The Plant Volumen Ejemplar supresión de genes et 23 y metodología de reparación de interrupciones et Genetics Como se describe en la presente los solicitantes han descubierto polipéptidos que no han sido registrados anteriormente como polipéptidos descarboxilasas capaces de catalizar la conversión de sustrato en productos de en isobutiraldehído Los polinucleótidos que codifican las descarboxilasas putativas se expresaron en y sometieron a ensayo para actividad descarboxilasa Como se muestra en los ciertos polipéptidos se usaron en células huésped recombinantes que comprenden una ruta biosintética de Polipéptidos KIVD Los miembros de la familia de proteínas de cetoisovalerato descarboxilasa se identificaron a través del centro nacional para información de biotecnología http ncbi nih visitado el 27 de julio de búsquedas BLAST de proteínas no redundantes en la base de datos del NCBI mediante el uso de secuencias de aminoácidos de lactis KivD cetoisovalerato con de ident lactis KDCA descarboxilasa de cadena con de cloacae IPDC piruvato con de con los siguientes parámetros de valor E tamaño de palabra matriz y apertura de interrupción y extensión de interrupción valor de corte de E de Se combinaron los tres conjuntos de resultados de BLAST y se eliminaron las secuencias idénticas o con longitudes mayores que 712 o menores que este conjunto combinado de secuencias se redujo a un conjunto en donde la identidad máxima entre secuencias es 65 con el programa en enero de disponible en visitado el 25 de julio de Esto produjo un conjunto de 1184 secuencias Las 1184 secuencias se alinearon mediante el uso de Clustal con todos los parámetros se construyó un árbol filogenético a partir del alineamiento múltiple de secuencias con el programa de unión de vecinos mediante el uso de El árbol filogenético se visualizó con el programa iTOL itol embl visitado el 27 de julio de Se seleccionó un subárbol de 180 secuencias que abarcó Lactis cloacae cerevisiae PDC y PDC y sus homólogos este subconjunto se expandió para incluir todos los miembros del grupo en el conjunto nr65 de estas 180 El conjunto final consistió en 60 secuencias y se usó para construir la red de similitudes de secuencias como se describe a La red de similitudes de secuencias consistió en una colección de bordes que corresponden a relaciones por pares que son mejores que un umbral definido HJ et PLoS Para el análisis en este las relaciones por pares corresponden a alineamientos BLAST asociados con un valor El conjunto de 601 secuencias se usó para crear una base de datos BLAST personalizada mediante el uso de ncbi html visitado el 26 de julio de con se buscó cada secuencia del conjunto en esta base de Dado que los valores E de BLAST no son se mantuvo el mejor valor E y se asoció con cada comparación por Todos los alineamientos por pares que fueron mejores que el umbral del valor E de se cargaron en el programa Cytoscape cytoscape visitado el 27 de julio de y se generó una gráfica con el algoritmo de diseño Después de la estas 601 secuencias quedaron dentro de grupos discernibles Un grupo que contiene 170 secuencias se identificó que contenía lactis lactis KDCA y cloacae Dado que lactis KivD y lactis KDCA son descarboxilasas se seleccionaron varios candidatos de este grupo para la selección de Ciertas secuencias de este grupo se verificaron experimentalmente como se muestra en la presente descripción por tener actividad descarboxilasa los Ejemplos 3 y Dado que se verificó que el grupo contenía polipéptidos con actividad se generó un perfil para el grupo KIVD a partir del conjunto de 170 secuencias descritas anteriormente y proporcionadas en la Tabla El de según lo determinado a partir del alineamiento múltiple de secuencias de Clustal de las secuencias del grupo con secuencias verificadas experimentalmente por tener actividad descarboxilasa se proporciona en la Tabla Una persona de experiencia en la técnica comprenderá que los polipéptidos proporcionados en la Tabla 4 son polipéptidos candidato para modalidades proporcionadas en la presente descripción y podrá preparar y evaluar fácilmente los polipéptidos para actividad los organismos fuente proporcionados en la Tabla 4 pueden ser organismos fuente para polipéptidos adecuados para modalidades proporcionadas en la presente Por lo en la presente descripción se proporcionan métodos para convertir en los métodos comprenden proporcionar un polipéptido que comprende la con de ident 258 o 416 un polipéptido que tiene al menos 80 85 90 95 o 98 de identidad con ella o un fragmento activo de y poner en contacto el polipéptido con cetoisovalerato en condiciones en donde se produce En algunas este contacto se produce dentro de una célula huésped recombinante En algunas la célula huésped comprende una ruta biosintética de isobutanol En algunas las células huésped recombinantes comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido de Tabla 4 o un polipéptido que tiene al menos 80 al menos 85 al menos 90 al menos 95 o al menos 98 de identidad con esta o un fragmento activo de En la presente invención se proporcionan métodos para producir los métodos comprenden proporcionar una célula huésped recombinante que comprende un polipéptido que comprende la sec con de ident o 416 un polipéptido que tiene al menos 80 85 90 95 o 98 de identidad con ella o un fragmento activo de y poner en contacto el polipéptido con en condiciones en donde se produce isobutiraldehído Tabla A Porcentaje de identidad de secuencias del grupo 5 10 15 5 10 5 10 15 5 10 15 2 5 15 5 10 15 Identidad con la con 5 10 15 1 5 10 15 5 10 5 15 5 15 5 10 15 5 10 15 Preparación del perfil HMM Las secuencias de aminoácidos de las 170 secuencias descritas anteriormente y proporcionadas en la Tabla Z se analizaron con el paquete de software HMMER base teórica de los HMM se describe en y Biological sequence probabilistic models of proteins and nucleic Cambridge University Krogh et que sigue la guía del disponible de HMMER Farm Research La salida del programa informático HMMER es un perfil de modelos ocultos de que caracteriza las secuencias de Como se menciona en la guía del los perfiles HMM son descripciones estadísticas del consenso de un alineamiento múltiple de Usan los puntajes específicos por posición para aminoácidos y puntajes específicos por posición para abrir y extender una inserción o En comparación con otros métodos basados en los HMM tienen una base de probabilidad El perfil de los HMM para un gran número de familias de proteínas está públicamente disponible en la base de datos PFAM Farm Research El perfil HMM se construyó de la siguiente Etapa Creación de un alineamiento de secuencias Las 170 secuencias del como se describió se alinearon mediante el uso de Clustal W y Gibson Nuc Acid 4673 con los parámetros Etapa Creación de un Perfil HMM Se ejecutó el programa hmmbuild en el conjunto de secuencias alineadas mediante el uso de los parámetros El programa hmmbuild lee el archivo de alineamiento múltiple de crea un perfil HMM nuevo y guarda el perfil HMM en un Con este se generó un perfil sin calibrar a partir del alineamiento múltiple de secuencias de las 170 como se describe en la Etapa La siguiente información basada en la guía del usuario del programa HMMER proporciona una descripción de la forma en que el programa hmmbuild prepara un perfil Un perfil HMM es una máquina de estado lineal que consiste de una serie de cada uno de los cuales corresponde aproximadamente a una posición en el alineamiento múltiple de secuencias para el cual se Si se ignoran las la correspondencia es es el perfil HMM tiene un nodo para cada columna en el y cada nodo puede existir en un solo un estado de La palabra en este que hay una posición en el modelo para cada posición en la secuencia que se alineará con el Las interrupciones se modelan con los estados de inserción y de supresión Todas las columnas que contienen más de una cierta fracción x de caracteres de la interrupción se asignarán como una columna de El valor predeterminado para x se define en Cada estado de coincidencia tiene asociado un estado I y un estado llama a un grupo de tres estados en la misma posición de consenso en el Un perfil tiene varios tipos de probabilidades asociadas con Un tipo es la probabilidad de transición la probabilidad de efectuar una transición de un estado a probabilidades de emisiones asociadas con cada estado de que se basan sobre la probabilidad de que exista un residuo dado en esa posición del Por para una columna bastante bien conservada en un la probabilidad de emisiones para el aminoácido más común puede ser en tanto que para cada uno de los otros 19 Un perfil HMM se describe completamente en un archivo que guarda el perfil HMMER2 que contiene todas las probabilidades que se usan para parametrizar el Las probabilidades de emisiones de un estado de coincidencia o un estado de inserción se almacenan como una relación de logaritmo de posibilidades con respecto a un modelo log2 En donde es la probabilidad de un residuo amino en una posición particular del de conformidad con el perfil y es la probabilidad de conformidad con el modelo El modelo Nulo es un modelo de probabilidad simple de un solo estado con un conjunto precalculado de probabilidades de emisión para cada uno de los 20 aminoácidos derivados de la distribución de aminoácidos en la versión 24 de Los puntajes de transiciones de estado se como parámetros logarítmicos de posibilidades y son proporcionales a En donde es la probabilidad de transición de transitar de un estado a otro Etapa Calibración del perfil HMM El perfil HMM se leyó con hmmcalibrate que asigna un puntaje a un gran número de secuencias aleatorias sintetizadas con el perfil cantidad predeterminada de secuencias sintéticas usadas es ajusta una distribución de valor extremo por sus siglas en al histograma de esos puntajes y vuelve a guardar el archivo HMM que ahora incluye los parámetros Estos parámetros EVD y se usan para calcular los valores E de los puntajes de bits cuando el perfil se busca en una base de datos de secuencias de El programa hmmcalibrate escribe dos parámetros en el archivo HMM en una línea identificada como estos parámetros son los parámetros de µ y ? de la distribución de valores extremos por sus siglas en que mejor se ajusta a un histograma de puntajes calculados sobre secuencias generadas aleatoriamente de aproximadamente la misma longitud y composición de residuos que Esta calibración se realizó una sola vez para el perfil El perfil HMM calibrado para el conjunto de secuencias KIVD se proporciona en la Tabla Z y se denomina en la presente descripción perfil HMM del grupo En la sección principal del modelo que comienza a partir de la línea de señal de el modelo tiene tres líneas por para M nodos donde M es el número de estados de según lo proporcionado por la línea La primera línea informa los puntajes de coincidencias de logaritmos de posibilidades para la relación logarítmica de posibilidades de emitir cada aminoácido de ese estado y del modelo El primer número es el número de nodo Los números K siguientes son para puntajes de emisión para uno por El aminoácido de puntaje más alto se indica en los paréntesis después del número de Estos puntajes de logaritmos de posibilidades pueden convertirse nuevamente a probabilidades HMM mediante el uso de la probabilidad del modelo El último número de la línea representa el índice de columna de alineamiento para este estado de La segunda línea informa los puntajes de emisión de y la tercera línea informa los puntajes de transiciones de Etapa Evaluación de la especificidad y sensibilidad de los perfiles HMM creados El perfil HMM se evaluó con que lee un perfil HMM del archivo y busca un archivo de secuencias con coincidencias de secuencias significativamente El archivo de secuencias buscado contenía 601 secuencias lo mencionado Durante la el tamaño de la base de datos se definió en mil Esta configuración de tamaño asegura que los valores E significativos contra la base de datos actual seguirán siendo significativos en un futuro El punto de corte para el valor de E se definió en Una búsqueda de hmmer con el perfil HMM del grupo KIVD incorporada en la presente descripción como generado a partir del alineamiento de los 170 homólogos de KIVD coincidió con las 601 secuencias con un valor E Este resultado indica que los miembros del grupo KIVD comparten una similitud de secuencias Se usó una búsqueda hmmer con un valor de corte de E de para separar las KIVD de otras Por lo se cree que los polipéptidos que tienen un valor E del perfil HMM del grupo KIVD con la búsqueda hmmer son candidatos adecuados para las modalidades proporcionadas en la presente tales como para métodos y células huésped recombinantes que comprenden la conversión de sustrato a producto de a isobutiraldehído Se comprenderá con esta descripción y al usar una combinación de información estructural y de secuencias disponible en la técnica y proporcionada en la presente pueden construirse polipéptidos que comprenden actividad cetoisovalerato descarboxilasa y menos de 100 de identidad con las secuencias ejemplificadas en las Tablas 5 y 6 para usarse en células huésped y métodos proporcionados en la presente Por dado que los solicitantes han demostrado que los polipéptidos proporcionados en la presente descripción tienen actividad cetoisovalerato una persona de experiencia en la técnica puede usar la información molecular y estructural provista en la presente descripción por medio de la información de secuencias y del Perfil HMM así como la información disponible en la técnica con respecto a cetoisovalerato descarboxilasas Por et proporcionan la estructura de de lactis Crys D63 et 34 desarrollaron un modelo de homología de la estructura para KdcA de que identifica los residuos Val461 y Met358 como residuos que aparecían para dar forma a la cavidad de unión al et Microbiol alinearon la secuencia de aminoácidos de KdcA con dos enzimas descarboxilantes indolpiruvato descarboxilasa de Enterobacter cloacae y piruvato descarboxilasa de que se han estudiado con cristalografía de rayos Con la presente una persona de experiencia ordinaria en la técnica puede fragmentos activos de los polipéptidos proporcionados en la presente por por truncamiento de los polipéptidos proporcionados en la presente descripción según los alineamientos de secuencias en el extremo o terminal y por confirmación de actividad de descarboxilasa Por los polipéptidos capaces de catalizar la conversión de sustrato a producto de a isobutiraldehído descritos en la presente descripción pero no se limitan polipéptidos que comprenden al menos aproximadamente 80 al menos aproximadamente 85 al menos aproximadamente 90 al menos aproximadamente 95 o al menos aproximadamente 99 de identidad con cualquiera de con de o 63 o un fragmento activo de En el polipéptido tiene un valor E del perfil H M del grupo KIVD menor que mediante el uso del programa De manera en la presente los solicitantes proporcionan polinucleótidos que codifican estos polipéptidos y que pero no se limitan polinucleótidos que comprenden al menos aproximadamente 80 al menos aproximadamente 85 al menos aproximadamente 90 al menos aproximadamente 95 o al menos aproximadamente 99 de identidad con cualquiera de sec con de iden o o secuencias de esta que están optimizadas por codones para expresión en una célula huésped particular tal por coli o cerevisiae La tiamina difosfato como tiamina pirofosfato o o es una coenzima usada por como Tiamina es la forma que puede complementarse en el medio de tal como un medio de Una vez transportada en una la tiamina se convierte en tiamina ciertos polipéptidos que tienen actividad cetoisovalerato descarboxilasa descritos en la presente descripción tienen afinidad incrementada por TPP en comparación con el polipéptido de Lactococcus lactis que tiene con de como pueden proporcionar Por los polipéptidos proporcionados en la presente descripción pueden ser útiles para catalizar la conversión de sustrato a producto de a en condiciones de tiamina baja o disminuida y potencialmente los costos y la complejidad del En estos polipéptidos tienen al menos aproximadamente 80 al menos aproximadamente 85 al menos aproximadamente 90 al menos aproximadamente 95 o al menos aproximadamente de identidad con cualquiera de con de ident o 63 o un fragmento activo de En algunas estos polipéptidos comprenden las secuencias de Mea o kdcA de Listeria grayi Macrococcus o Lactococcus o un fragmento activo de En algunas estos polipéptidos comprenden al menos aproximadamente 80 de identidad con la con de o 66 o un fragmento activo de En algunas estos polipéptidos comprenden al menos aproximadamente 80 de identidad con la con de 52 o 61 o un fragmento activo de Los polipéptidos y los polinucleóticos que los codifican proporcionados en la presente descripción son para expresión en células huésped recombinantes tales como células huésped recombinantes que comprenden una ruta biosintética de isobutanol que incluye la conversión de sustrato a producto de a isobutiraldehído los solicitantes han demostrado que los polipéptidos proporcionados en la presente descripción son al menos capaces de convertir en isobutiraldehído como una secuencia del polipéptido de Lactococcus lactis que tiene la sec con de ident 68 en una célula huésped recombinante según lo medido por la acumulación de cetoisovalerato durante una fermentación Ejemplo De manera los polipéptidos proporcionados en la presente descripción pueden proporcionar un rendimiento incrementado de isobutanol en células huésped recombinantes en comparación con el rendimiento de isobutanol observado en células que usan una secuencia de polipéptidos de Lactococcus lactis que tienen la con de 68 Ejemplo Por lo en la presente descripción se proporcionan células huésped recombinantes que comprenden polipéptidos que comprenden al menos aproximadamente 80 al menos aproximadamente 85 al menos aproximadamente 90 al menos aproximadamente 95 o al menos aproximadamente 99 de identidad con cualquiera de con de o 63 o un fragmento activo de o un polinucleótido que codifica a un polipéptido de este Construcción de células huésped recombinantes Las manipulaciones genéticas de las células huésped descritas en la presente descripción pueden llevarse a cabo mediante el uso de técnicas genéticas y de selección y pueden realizarse en cualquier célula huésped que sea adecuada para manipularse genéticamente in Yeast Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring págs En las células huésped recombinantes descritas en la presente descripción pueden ser cualquier huésped de levaduras u hongos útil para ingeniería genética y expresión del gen recombinante En otras una célula huésped recombinante puede ser un miembro de los géneros Zymomonas Escherichia Klebsiella Shigella Rhodococcus Bacillus Lactobacillus Enterococcus Paenibacillus Schizosaccharomyces o Saccharomyces En otras la célula huésped puede ser Saccharomyces cerevisia Schizosaccharomyces Kluyveromyces Kluyveromyces Kluyveromyces marxianus Candida Candida Pichia stipitis Yarrowia o En otras la célula huésped es una célula huésped de En algunas la célula huésped es un miembro del género En algunas la célula huésped es Kluyveromyces Candida glabrata o Schizosaccharomyces En algunas la célula huésped es Saccharomyces cerevisiae Las levaduras de cerevisiae son conocidas en la técnica y están disponibles de una gran variedad de que pero no se limitan American Type Culture Collection Centraalbureau voor Schimmelcultures Fungal Biodiversity Gert Strand North American y Las levaduras de cerevisiae pero no se limitan levadura Ethanol levadura Ferm levadura levadura de alcohol Gert Strand Prestige Batch levadura Gert Strand Pot levadura Gert Strand Distillers levadura levadura levadura CBS7960 y Se conocen en la técnica métodos para expresión del gen en la célula huésped recombinante que pero no se limitan células de levadura por Methods in Enzy Volumen Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology Christine Guthrie y Gerald Fink Elsevier Academic San En la región codificante para las enzimas descarboxilasa por expresarse pueden optimizarse por codones para la célula huésped como conoce bien una persona con experiencia en la La expresión de genes en las células huésped recombinantes que incluyen pero no se limitan células de pueden requerir un promotor unido operablemente a una región codificante de interés y un terminador transcripcional Pueden usarse varios promotores para construir casetes de expresión para que pero no se limitan los siguientes promotores constitutivos adecuados para uso en levaduras TDH3 ADH1 y y los siguientes promotores inducibles adecuados para uso en GALIO y Otros promotores de levaduras incluyen los promotores híbridos UAS con de ident UAS con de UAS con de PDClp con de y UAS con de Los terminadores transcripcionales adecuados que pueden usarse en un constructo génico híbrido para expresión pero no se limitan ERGIOt CYClt y ADHlt Los vectores útiles para la transformación de una variedad de células huésped son comunes y se describen en la el vector contiene un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicación autónoma o integración cromosómica en el huésped los vectores adecuados pueden comprender una región promotora que alberga controles de iniciación transcripcional y una región de control de terminación transcripcional entre las que puede insertarse un fragmento de ADN de región codificante para proporcionar la expresión de la región codificante Ambas regiones de control pueden derivarse de genes homólogos a la célula huésped aunque debe entenderse que estas regiones de control pueden de genes que no son nativos para las especies específicas seleccionadas como huésped de producción En los terminadores de transcripción y las regiones codificantes de cetoisovalerato descarboxilasa que son adecuados pueden clonarse en vectores lanzadera de levadura y transformarse en células de Estos vectores permiten la propagación de cepas en ambas cepas de coli y levadura y pueden contener un marcador seleccionable y secuencias que permiten la replicación autónoma o la integración cromosómica en el huésped los plásmidos usados en levaduras pero no se limitan vectores lanzadera pRS425 y pRS426 Type Culture que contienen un origen de replicación de coli un origen de replicación de levadura de 2 micrones y un marcador para selección nutricional Los marcadores de selección para estos cuatro vectores son His3 Trpl Leu2 y Ura3 En la construcción de vectores de expresión con un gen quimérico que codifica las enzimas descritas puede llevarse a cabo mediante el método de recombinación de reparación de interrupciones en En un vector de levadura de ADN se digiere en su sitio de clonación para crear una en su Se generan varios insertos de los ADN de interés que contienen una secuencia de aproximadamente 21 pb en ambos extremos y que se entre y con la terminal y del ADN del Por para construir un vector de expresión en levadura para el se seleccionan un promotor de levadura y un terminador de levadura para el cásete de El promotor y el terminador se amplifican a partir del ADN genómico de la y el Gen X se amplifica o bien por PCR a partir de su organismo de origen o se obtiene de un vector de clonación que comprende la secuencia del Gen Por lo menos hay una secuencia de superposición de 21 pb entre el extremo del vector linealizado y la secuencia entre el promotor y el Gen entre el Gen X y la secuencia y entre el terminador y el extremo del vector el vector con y los insertos de ADN se en una cepa de levadura y se siembran en una placa en el medio que contiene las mezclas de compuestos apropiados que permiten la complementación de los marcadores de selección nutricional en los La presencia de las combinaciones correctas de insertos puede confirmarse con mapeo por PCR mediante el uso del ADN plasmídico preparado a partir de las células el ADN plasmídico aislado de levaduras bajo en puede transformarse en una cepa de por seguido de minipreparaciones y cartografía de restricción para verificar adicionalmente el constructo del el constructo puede verificarse por análisis de Al igual que la técnica de reparación de la la integración en el genoma de la levadura también aprovecha el sistema de recombinación homologa en En un cásete que contiene una región codificante más elementos de control y y un marcador auxotrófico se amplifica por PCR con una ADN polimerasa de alta fidelidad mediante el uso de cebadores que se hibridizan con el cásete y contienen de 40 a 70 pares de bases de homología de secuencias para las regiones y del área genómica en donde se desea la el producto de la PCR se transforma en levadura y se siembra en una placa con un medio que contiene las mezclas de compuestos apropiados que permiten la selección del marcador auxotrófico Por para integrar el en la ubicación cromosómica el constructo de codificante se amplifica por PCR a partir de un constructo de ADN plasmídico y se une a un marcador autotrófico como por medio de SOE PCR o por métodos comunes de clonación y digestión por El cásete que contiene el egión codificante de URA3 se amplifica por PCR con secuencias de cebadores que contienen de 40 a 70 pb de homología para las regiones y 3 de la ubicación en el cromosoma de la El producto de la PCR se transforma en levadura y se selecciona en medios de crecimiento sin Los transformantes pueden verificarse o bien por PCR de colonias o por secuenciación directa del ADN Actividad KIVD La presencia de descarboxilasa en las células huésped recombinantes descritas en la presente descripción puede confirmarse mediante el uso de métodos de rutina conocidos en la En un ejemplo no y como se describe en los ejemplos de la presente los transformantes pueden seleccionarse por PCR con cebadores para genes de En otro ejemplo no y como se describe en los ejemplos en la presente la actividad descarboxilasa puede evaluarse mediante la expresión de enzimas descarboxilasa descritas en la presente descripción en una célula huésped recombinante descrita en la presente descripción que carece de actividad descarboxilasa En otro ejemplo no la actividad descarboxilasa se puede confirmar por métodos más tal como al medir los productos dirección de isobutiraldehído en una ruta biosintética En otro ejemplo no la actividad cetoisovalerato descarboxilasa se puede confirmar al determinar la desaparición de cofactores o al determinar la desaparición de cofactores para una etapa dirección de isobutiraldehído en una ruta por un ensayo como se describe en la presente descripción en la por Zhang et PNAS En otro ejemplo no la actividad descarboxilasa se puede confirmar al determinar las velocidades para la conversión de en isobutiraldehído con el ensayo colorimétrico para enzimas específico para descrito en la presente En otro ejemplo no la actividad descarboxilasa se puede confirmar al determinar la desaparición de mediante el uso de métodos conocidos en la técnica por de la et FEMS Microbiol Letters La constante de activación del cofactor que proporciona una medida de la afinidad de la enzima por se describe en Chang et La constante de activación del cofactor TPP de polipéptidos proporcionados en la presente invención se puede determinar realizando una gráfica de las actividades específicas observadas como una función de la concentración de Las velocidades para la conversión de cetoisovalerato en isobutiraldehído pueden medirse en un ensayo acoplado de enzimas ADH de hígado de caballo descrito en et Catal 1425 ejecutado con concentraciones diferentes de se realiza la gráfica de las actividades específicas contra la concentración de las curvas resultantes se pueden ajustar para la ecuación de saturación en donde SA es la actividad es la actividad específica es la constante de activación del es la concentración de y C es la actividad en ausencia de TPP mediante el uso de un tal como Kaleidagraph para determinar la constante de activación del cofactor La afinidad de TPP por polipéptidos se puede por vía de inhibición por como se describe en Chang et En los polipéptidos proporcionados en la presente descripción tienen una constante de activación del cofactor TPP menor que aproximadamente 5 menor que aproximadamente 10 menor que aproximadamente 20 menor que aproximadamente 30 menor que aproximadamente 40 µ menor que aproximadamente 50 menor que aproximadamente 70 o menor que aproximadamente 90 La relación de especificidad del sustrato proporciona una medida de la capacidad de una enzima para discriminar entre las reacciones de los sustratos que y se describe en Structure and 1985 Freeman and New La relación de especificidad entre y piruvato para un polipéptido dado puede determinarse al medir los valores y para la conversión de en isobutiraldehído y los valores y para la conversión de piruvato en acetaldehído Las velocidades para la conversión de en isobutiraldehído y para piruvato en acetaldehído pueden medirse en un ensayo enzimático acoplado de ADH de hígado de caballo descrito en et Catal ejecutado con concentraciones diferentes del se realiza una gráfica de las actividades específicas contra la concentración del las curvas resultantes se pueden ajustar para la ecuación de mediante el uso de un programa tal como Kaleidagraph para determinar los valores Vraax y para cada de como se usa en la presente es el cociente de determinado para dividido por el de determinado para En la relación de para polipéptidos descritos en la presente descripción is mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente o mayor que aproximadamente En la presente se proporcionan métodos para convertir en isobutiraldehído que usan los polipéptidos En los métodos proporcionar un polipéptido en donde el polipéptido comprende al menos uno al menos 80 al menos 90 al menos 95 o al menos 99 de identidad con la con de ident 61 o 63 o un fragmento activo de esta y actividad o actividad una relación de especificidad entre y piruvato mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente o mayor que aproximadamente y una constante de activación del cofactor tiamina difosfato de aproximadamente 100 aproximadamente 50 o aproximadamente 20 µ? o y poner en contacto el polipéptido con en condiciones para producir isobutiraldehído En los métodos proporcionar un polipéptido en donde el polipéptido comprende al menos 80 al menos 90 al menos 95 o al menos 99 de identidad con la sec con de ident 61 o 63 o un fragmento activo de esta y actividad descarboxilasa y poner en contacto el polipéptido con en condiciones para producir En el polipéptido comprende al menos 80 al menos 90 al menos 95 o al menos 99 de identidad con la con de 52 o 61 o un fragmento activo de En los métodos proporcionar un polipéptido en donde el polipéptido comprende actividad cetoácido una relación de especificidad para con respecto a piruvato mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente o mayor que aproximadamente y una constante de activación del cofactor tiamina difosfato de aproximadamente 100 aproximadamente 50 o aproximadamente 20 µ o y poner en contacto el polipéptido con en condiciones para producir En el contacto se produce en presencia de menos de aproximadamente 10 de En el contacto se produce en presencia de menos de aproximadamente 30 de menos de aproximadamente 20 de o menos de aproximadamente 5 de En el contacto se produce en presencia de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 de de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 de de aproximadamente 10 a aproximadamente 15 de de aproximadamente 5 a aproximadamente 15 de de aproximadamente 5 a aproximadamente 10 de o de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 de En el contacto se produce dentro de una célula huésped recombinante y en donde el polipéptido es heterólogo en la célula huésped En la célula huésped recombinante es un miembro de los géneros o En la célula huésped recombinante es En la célula huésped recombinante polinucleótidos heterólogos que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustratos a piruvato a acetolactato a 2 y 2 3 a 2 En la célula huésped un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de sustratos en productos de isobut iraldehído en isobutanol En la célula huésped recombinante actividad piruvato descarboxilasa reducida o En la célula huésped recombinante al menos una mutación sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la bioslntesis de centros En la célula huésped recombinante comprende la supresión de En la célula huésped recombinante comprende actividad glicerol deshidrogenasa reducida o Producción de isobutanol En la presente descripción se proporcionan métodos para producir En los métodos proporcionar una célula huésped que comprende una ruta biosintética de isobutanol y un polipéptido en donde el polipéptido comprende al menos uno al menos 80 al menos 90 o al menos 99 de identidad con la con núms de o 63 o un fragmento activo de esta y actividad descarboxilasa o actividad una relación de especificidad para con respecto a piruvato mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente mayor que aproximadamente o mayor que aproximadamente y una constante de activación del cofactor difosfato de aproximadamente 100 aproximadamente 50 o aproximadamente 20 o y poner en contacto la célula huésped con un sustrato de carbono fermentable en condiciones mediante las cuales se produce En el contacto se produce en presencia de menos de aproximadamente 10 de tiamina o menos de aproximadamente 1 de En la célula huésped recombinante es un miembro de los géneros o Saccharomy es En la célula huésped recombinante es Saccharomyces En la célula huésped recombinante polinucleótidos heterólogos que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustratos a piruvato a acetolactato a 2 3 y 2 3 a cetoisovalerato En la célula huésped un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de sustratos a productos de isobutiraldehído a isobutanol En la célula huésped recombinante actividad piruvato descarboxilasa reducida o En la célula huésped recombinante al menos una mutación sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros En la célula huésped recombinante la supresión de En la célula huésped recombinante comprende actividad glicerol fosfato deshidrogenasa reducida o En el isobutanol se produce con un rendimiento efectivo mayor que producido por la célula huésped análoga que comprende un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que comprende la sec con de ident 68 y no o en la presente descripción se células huésped recombinantes que comprenden un polinucleótido heterólogo que cataliza la conversión de sustratos a productos de a en donde el polipéptido comprende al menos aproximadamente 80 de identidad con la con de 61 o 63 o un fragmento activo de o un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido heterologo de En el polipéptido comprende al menos aproximadamente 95 de identidad con la con de ident 61 o 63 o un fragmento activo de En las células huésped polinucleótidos heterólogos que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustratos a piruvato a acetolactato a 3 a cetoisovalerato En las células huésped un polinucleótido heterologo que codifica un polipéptido que cataliza las conversiones de sustratos a producto de isobutiraldehído a En cada uno de los polipéptidos que catalizan las conversiones de sustratos a productos son no nativos para la célula En algunas la célula huésped recombinante comprende actividad piruvato descarboxilasa reducida o En la célula huésped recombinante comprende al menos una mutación sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de grupos En la célula huésped recombinante es un miembro de los géneros Escherichia Salmonella Serratia Klebsiella Lactobacillus o En la célula huésped recombinante es Saccharomyces cerevisiae Ruta biosintética del isobutanol Las rutas biosintéticas para la producción de isobutanol que pueden usarse incluyen las descritas en las patentes de los y todas ellas incorporadas en la presente descripción como Una ruta biosintética del isobutanol comprende las siguientes conversiones de sustrato en piruvato en que puede por por acetolactato acetolactato en 2 3 que puede por por acetohidroxiácido reductoisomerasa 2 3 en que puede por por acetohidroxiácido en que puede por por una cetoácido descarboxilasa de cadena y isobutiraldehído en que puede por por una alcohol deshidrogenasa de cadena En algunas la ruta biosintética de isobutanol comprende al menos un al menos dos polinucleótidos al menos tres polinucleótidos o al menos cuatro polinucleótidos heterólogos a la célula En cada conversión de sustrato en producto de una ruta biosintética de isobutanol en una célula huésped recombinante se cataliza por un polipéptido En el polipéptido que cataliza las conversiones de sustrato en producto de acetolactato en dihidroxiisovalerato el polipéptido que cataliza la conversión de sustrato en producto de isobutiraldehído en isobutanol son capaces de usar NADH como Los genes y polipéptidos que pueden usarse para las conversiones de sustratos en productos descritos en la presente así como los métodos para identificar tales genes y se describen en la presente descripción en la por para en los ejemplos y en las patentes de los EE y Los ejemplos de enzimas cetoácido reductoisomerasa se describen en laspatentes de los núms y y en las publicaciones de solicitudes de patentes de los EE 20080261230 20100197519 y la publicación de la solicitud de patente del PCT todas ellas incorporadas como Los ejemplos de las KARI descritos allí son los de Lactococcus Vibrio Pseudomonas aeruginosa y variantes de Pseudomonas fluorescens Las KARI incluyen las variantes de KARI de Anaerostipes caccae y con de ident 235 y La publicación de solicitud de patente de los EE 20100081154 y la patente de los EE describen dihidroxiácido deshidratasas que incluyen una DHAD de Streptococcus de con de La patente de los EE incorporada en la presente descripción como describe una alcohol deshidrogenasa de Achromobacter Las alcohol deshidrogenasas ADH de hígado de caballo y ADH de Beijerinkia indica de con de descrita en la publicación de la solicitud de patente de los EE incorporada en la presente descripción como Se apreciará que las células huésped que comprenden una ruta biosintética de como se proporciona en la presente pueden una o más modificaciones La publicación de la solicitud de patente de los EE 20090305363 como describe la conversión incrementada de piruvato a acetolactato al modificar genéticamente la levadura para expresión de una acetolactato sintasa localizada en el citosol y la eliminación sustancial de la actividad piruvato Las modificaciones para reducir la actividad deshidrogenasa la interrupción de al menos un gen que codifica un polipéptido que tiene actividad piruvato descarboxilasa o una interrupción en al menos un gen que codifica un elemento regulador que controla la expresión del gen de piruvato tal como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos 20090305363 en la presente descripción como modificaciones a una célula huésped que posibilitan un flujo incrementado de carbono a través de una ruta de o la reducción del balance de como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los EE 20100120105 en la presente descripción como Otras modificaciones incluyen la integración de al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido que cataliza una etapa en una ruta biosintética que usa Otras modificaciones incluyen al menos una mutación sustitución en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido con actividad acetolactato En el polipéptido que tiene actividad acetolactato reductasa es YMR226C con de ident de Saccharomyces cerevisae o un homólogo de Las modificaciones adicionales incluyen una mutación sustitución en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido con actividad aldehido deshidrogenasa aldehido En el polipéptido que tiene actividad aldehido deshidrogenasa es ALD6 con de de Saccharomyces cerevisiae o un homólogo de Una modificación genética que tiene el efecto de reducir la represión de en donde la célula huésped de producción de levadura es se describe en la publicación de solicitud de patente de los incorporada en la presente descripción como referencia las células huésped recombinantes pueden comprender al menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad dihidroxiácido deshidratasa y al menos una mutación sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de grupos al menos un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de grupos En el polipéptido que afecta la biosíntesis de grupos está codificado por AFT1 nucleico con con de aminoácidos con con de AFT2 con núms de 239 y FRA2 con de 241 y GRX3 con de 243 y o CCC1 con de iden 245 y En el polipéptido que afecta la biosíntesis de grupos es un mutante constitutivo AFT1 AFT1 AFT1 o AFT1 Cultivo para producción Las células huésped recombinantes descritas en la presente descripción se cultivan en medios de fermentación que contienen sustratos de carbono Los sustratos de carbono adecuados pueden pero no se limitan monosacáridos tales como tales como galactosa o polisacáridos tales como almidón o o mezclas de y mezclas no purificadas de materias primas tales como perraeato de suero de líquido de maceración de de betabel azucarero y malta de Otros sustratos de carbono pueden incluir succinato o los sustratos de carbono pueden sustratos de un solo tal como dióxido de carbono o para los que se ha demostrado la conversión metabólica en productos intermedios bioquímicos Adicionalmente a los sustratos de uno y de dos los organismos metilotróficos son por usar muchos otros compuestos que contienen tales como glucosamina y una variedad de aminoácidos para la actividad Por se conoce que las levaduras metilotróficas usan el carbono de la metilamina para formar trehalosa o glicerol et Growth Cl Don Reino Unido de Gran De manera varias especies de Candida metabolizan alanina u ácido oleico et Microbiol Por lo se contempla que la fuente de carbono usada en la presente invención puede abarcar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono y solo estará limitada por la elección del Aunque se contempla que todos los sustratos de carbono mencionados anteriormente y las mezclas de estos son adecuados en la presente en algunas los sustratos de carbono son fructosa y o mezclas de estos con azúcares de C5 tales como xilosa arabinosa para células de levadura modificadas para usar azúcares de La sacarosa puede derivarse de fuentes de azúcar tales como caña de betabel sorgo y mezclas de La glucosa y la dextrosa pueden derivarse de fuentes de granos renovables a través de la sacarificación de materias primas a base de almidón que incluyen tales como y mezclas de Adicionalmente los azúcares fermentables pueden derivarse de biomasa celulósica o lignocelulósica renovable a través de procesos de pretratamiento y como se por en la publicación de solicitud de patente de los 20070031918 La biomasa se refiere a cualquier material celulósico o lignocelulósico e incluye materiales que comprenden celulosa y que opcionalmente hemicelulosa oligosacáridos monosacáridos La biomasa puede otros tales como proteínas La biomasa puede derivarse de una sola fuente o puede comprender una mezcla derivada de más de una por la biomasa puede comprender una mezcla de mazorcas del maíz y rastrojos del o una mezcla de pastos y La biomasa pero no se limita cultivos bionergéticos residuos residuos sólidos residuos sólidos sedimentos de la fabricación del residuos residuos forestales y de Los ejemplos de biomasa pero no se limitan granos de mazorcas de residuos de tales como cáscaras de granos de rastrojos del paja del semilla de paja de la paja de pasto papel de bagazo de caña de componentes obtenidos de la molienda de astillas de matas y flores girasoles y y mezclas de Adicionalmente a una fuente de carbono los medios de fermentación deben contener soluciones reguladoras y otros conocidos para los experimentados en la adecuados para el crecimiento de los cultivos y la promoción de una ruta enzimática descrita en la presente Condiciones de cultivo las células se cultivan a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 40 en un medio Los medios de crecimiento adecuados en la presente invención incluyen los medios comunes preparados tales como el caldo Luria Bertani el caldo Sabouraud Dextrose caldo de medio de levadura o caldo que incluye una base nitrogenada de sulfato de amonio y dextrosa fuente de o medio una combinación de extracto de levadura y dextrosa en proporciones óptimas para cultivar el mayor número de cepas de Pueden otros medios de crecimiento definidos o y el medio adecuado para crecimiento del microorganismo específico será conocido para una persona con experiencia en la técnica de la ciencia de microbiología o Puede el uso de agentes conocidos para modular la represión de catabolitos directa o por adenosina cíclica 2 en el medio de Los intervalos adecuados de pH para la fermentación se encuentran entre aproximadamente un pH de a aproximadamente un pH de En una se usa de aproximadamente un pH de a aproximadamente un pH de para la condición Los intervalos adecuados de pH para la fermentación de levadura se entre aproximadamente un pH de a aproximadamente un pH de En una se usa aproximadamente un pH de a aproximadamente un pH de para la condición Los intervalos adecuados de pH para la fermentación de otros microorganismos se encuentran entre aproximadamente un pH de a aproximadamente un pH de En una se usa aproximadamente de un pH de a aproximadamente un pH de para la condición inicial Las fermentaciones pueden realizarse en condiciones aerobias o En una se usan condiciones anaerobias o microaerobias para la Fermentaciones industriales continuas y discontinuas Puede producirse u otros al usar un método de fermentación Una fermentación discontinua clásica es un sistema en donde la composición del medio se define al comienzo de la fermentación y no está sujeta a alteraciones artificiales durante la Una variación del sistema discontinuo estándar es el sistema de alimentación semicontinua los procesos de fermentación semicontinua o por lote alimentado son adecuados en la presente invención y comprenden un sistema discontinuo con la excepción de que el sustrato se agrega en incrementos a medida que avanza la Los sistemas de alimentación por lotes son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células y en donde es conveniente contar con cantidades limitadas de sustrato en los Las fermentaciones discontinuas y de alimentación por lotes son comunes y muy conocidas en la y se pueden encontrar ejemplos en Thomas en A Textbook of Industrial segunda edición Sinauer o en Mukund Appl Biotechnol Puede producirse u otros al usar un método de fermentación La fermentación continua es un sistema en donde un medio de fermentación definido se agrega continuamente a un biorreactor y se una cantidad igual de medio acondicionado para la fermentación continua mantiene los cultivos a una densidad elevada constante en las que las células están principalmente en la fase de crecimiento La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afectan el crecimiento celular o concentración del producto Los métodos para modular nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación así como las técnicas para maximizar la velocidad de la formación del son muy conocidos en la técnica de la microbiología industrial y se detalla una variedad de métodos en Se contempla que la producción de u otros puede practicarse al usar procesos discontinuos o de alimentación y que será adecuado cualquier otro modo de fermentación se contempla que las células pueden inmovilizarse sobre un sustrato como catalizadores de células enteras y someterse a condiciones de fermentación para la producción de isobutanol Métodos para aislar isobutanol del medio de fermentación El isobutanol producido biológicamente puede aislarse del medio de fermentación mediante el uso de métodos conocidos en la técnica para fermentaciones ABE por Appl Biotechnol Groot et y las referencias incluidas Por los sólidos pueden extraerse del medio de fermentación por o el isobutanol puede aislarse del medio de fermentación mediante el uso de métodos tales como destilación extracción extracción por arrastre con evaporación de membrana o Dado que el isobutanol forma una mezcla azeotrópica con agua y de bajo punto de puede usarse la destilación para separar la mezcla hasta su composición La destilación puede usarse en combinación con otro método de separación para obtener la separación alrededor del Los métodos que pueden usarse en combinación con la destilación para aislar y purificar el butanol pero no se limitan extracción adsorción y técnicas basadas en Adicionalmente el butanol puede aislarse mediante el uso de destilación azeotrópica con un agente de arrastre por Doherty y Conceptual Design of Distillation McGraw New La mezcla de forma un azeótropo heterogéneo para que la destilación pueda usarse en combinación con decantación para aislar y purificar el En este el caldo de fermentación que contiene isobutanol se destila hasta acercarse a la composición se condensa la mezcla y el isobutanol se separa del medio de fermentación por La fase acuosa decantada puede retornarse a la primera columna de destilación como La fase orgánica decantada rica en isobutanol puede purificarse aún más por destilación en una segunda columna de el isobutanol puede aislarse del medio de fermentación mediante el uso de extracción en combinación con En este el isobutanol se extrae del caldo de fermentación al usar una extracción líquido con un solvente la fase orgánica que contiene butanol se destila para separar el butanol del solvente puede usarse la destilación en combinación con la adsorción para aislar el isobutanol del medio de En este el caldo de fermentación que contiene el isobutanol se destila hasta casi la composición azeotrópica el agua restante se elimina con el uso de un tal como tamices moleculares et Lignocellulosic Biomass to Ethanol Process Design and Economics Utilizing Dilute Acid Prehydrolysis and Enzymatic Hydrolysis for Corn Report National Renewable Energy junio puede usarse la destilación en combinación con pervaporación para aislar y purificar el isobutanol del medio de En este el caldo de fermentación que contiene el isobutanol se destila hasta acercarse a la composición azeotrópica se extrae el resto del agua por pervaporación a través de una membrana hidrófila et Puede usarse la remoción in situ de producto fermentación para eliminar el butanol otro alcohol del recipiente de fermentación a medida que se produce y permitir que el microorganismo produzca butanol en grandes cantidades Un método de ISPR para extraer el alcohol fermentativo que se ha descrito en la técnica es la extracción líquido en relación con la fermentación de por el medio de que incluye el se pone en contacto con un agente extractor orgánico antes de que la concentración de butanol alcance un nivel El extractor orgánico y el medio de fermentación forman una mezcla El butanol se divide en la fase del agente extractor orgánico de esta se reduce la concentración en la fase acuosa que contiene el por lo que se limita la exposición del microorganismo al butanol La extracción líquido puede por de conformidad con los procesos descritos en la publicación de la solicitud de patente de los EE cuya descripción se incorpora en su totalidad por este La publicación de la solicitud de patente de los EE describe métodos para producir y recuperar el butanol de un caldo de fermentación mediante el uso de la extracción los métodos comprenden la etapa de poner en contacto el caldo de fermentación con un agente extractor inmiscible en agua para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase el agente extractor puede ser un agente extractor orgánico seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a ácidos grasos de a ásteres de ácidos grasos de C22 aldehidos grasos de a C22 monoinsaturados o poliinsaturados mezclas de y mezclas de Los agentes extractores para ISPR pueden ser agentes extractores no El agente extractor ISPR puede ser un agente extractor orgánico tales como alcohol alcohol alcohol alcohol alcohol alcohol ácido ácido ácido ácido miristato de oleato de aldehido y mezclas de En algunas puede formarse un éster al poner en contacto el alcohol en un medio de fermentación con un ácido ácidos y un catalizador capaz de esterificar el alcohol con el cido En algunas el ácido orgánico puede actuar como un agente extractor ISPR en los que se dividen los ásteres de El ácido orgánico puede suministrarse en el recipiente de fermentación derivarse de biomasa que suministra carbono fermentable al recipiente de Los lípidos presentes en la materia prima pueden hidrolizarse catalíticamente en ácido y el mismo catalizador puede esterificar el ácido orgánico con el El catalizador puede suministrarse a la materia prima antes de la o puede suministrarse en el recipiente de fermentación antes o al mismo tiempo que la materia Cuando el catalizador se suministra en el recipiente de los ásteres de alcohol pueden obtenerse mediante la hidrólisis de los lípidos en ácido orgánico la esterificación simultánea del ácido orgánico con el butanol presente en el recipiente de puede introducirse ácido orgánico aceite nativo no derivado de la materia prima en el recipiente de en donde el aceite nativo se hidroliza en ácido Cualquier ácido orgánico no esterificado con el alcohol puede servir como parte del agente extractor El extractor que contiene esteres de alcohol puede separarse del medio de fermentación y el alcohol puede recuperarse del El extractor se puede reciclar al recipiente de Por lo en el caso de la producción de por la conversión de butanol en un éster reduce la concentración de butanol libre en el medio de lo que brinda una protección al microorganismo frente al efecto tóxico de aumentar la concentración de se puede usar grano no fraccionado como materia prima sin separación de los lípidos en ya que los lípidos pueden hidrolizarse catalíticamente en ácido orgánico y de esta el índice de acumulación de lípidos en el agente extractor La sustracción in situ de producto puede realizarse en un modo discontinuo o En un modo continuo de sustracción in situ de el producto se elimina continuamente del En un modo discontinuo de la sustracción in situ de se agrega un volumen de extractor orgánico en el recipiente de fermentación y el agente extractor no se elimina durante el Para la sustracción in situ de el extractor orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación al inicio de la fermentación y forma un medio de fermentación el agente extractor orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación después de que el microorganismo ha alcanzado la cantidad deseada de que se puede determinar al medir la densidad óptica del el extractor orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación en un momento en el cual el nivel del producto de alcohol en el medio de fermentación alcanza un nivel preseleccionado En el caso de la producción de butanol de conformidad con las modalidades de la presente el agente extractor de ácido orgánico puede entrar en contacto con el medio de fermentación en un momento anterior a que la concentración de butanol alcance un nivel de manera de esterificar el butanol con el ácido orgánico para producir ésteres de butanol reducir la concentración de butanol en el recipiente de la fase orgánica que contiene éster puede extraerse del recipiente de fermentación separarse del caldo de fermentación que constituye la fase después de alcanzar un título efectivo deseado de En algunas la fase orgánica que contiene éster se separa de la fase acuosa una vez que la fermentación del azúcar fermentable disponible en el recipiente de fermentación prácticamente se haya El título de isobutanol en cualquier fase puede determinarse por métodos conocidos en la tales como por vía de cromatografía líquida de alto rendimiento o cromatografía tal como se por en la patente de los EE incorporada en la presente descripción como EJEMPLOS Plásmidos Se construyó pYZ090 con de ident para contener un gen quimérico que tiene la región codificante del gen alsS de Bacillus subtilis de nucleótidos expresado a partir del promotor CUPl de levadura y seguido por el CYC1 para expresión de y un gen quimérico que tiene la región codificante del gen ilvC de Lactococcus lactis expresado a partir del promotor ILV5 de levadura y seguido por el terminador ILV5 para expresión de KARI pYZ090 se digirió con Spel y Notl para eliminar la mayor parte del promotor de CUPl y toda la secuencia codificante de alsS y el terminador de se realizó la autoligación del vector después del tratamiento con el fragmento de Klenow y se transformó en células Stbl3 de coli y se seleccionó la resistencia a la La eliminación de la región de ADN se confirmó para dos clones independientes por secuenciación de ADN a través de la unión de ligación por El plásmido resultante se denominó con de El plásmido pLH702 con de se construyó en una serie de etapas a partir de pYZ090 como se describe en los siguientes Este expresa la variante K9D3 de KARI con de ident a partir del promotor de levadura pYZ058 de se derivó de pYZ090 de pYZ090 se cortó con enzimas y y se unió con un producto de PCR de KARI en El producto de PCR se amplificó a partir del ADN genómico de la cepa BY4741 de Saccharomyces cerevisiae Genetics con el cebador superior con de y el cebador inferior con de y se digirió con las enzimas Pmel y pYZ058 se confirmó por secuenciación pLH550 se derivó de El gen de tipo silvestre se amplificó por PCR con OT1349 con de y OT1318 con de se digirió con las enzimas Pmel y Sfil y se unió con el vector pYZ058 cortado con Pmel y El vector se confirmó por pLH556 se derivó de pLH550 por digestión del vector con las enzimas Spel y y se unió con un adaptador apareado de OT1383 con de ident y OT1384 con de que contiene secuencias salientes para sitios Spel y Esta etapa de clonación elimina el gen alsS y un fragmento grande del promotor PCUP1 del con una secuencia dirección residual de 160 pb que no es pLH556 se confirmó por pLH702 se derivó de El gen mutante de KARI K9D3 se extrajo de otro vector mediante el uso de las enzimas Pmel y Sfil y se ligó con pLH556 en los sitios Pmel y Sfil para reemplazar el gen con el gen El vector construido pLH702 se confirmó por El plásmido pLH468 se construyó para expresión de KivD y HADH en pBP915 se construyó a partir de pLH468 por supresión del gen kivD y 957 pares de bases del promotor TDH3 dirección de pLH468 se digirió con y el fragmento grande se purificó sobre un gel de agarosa con un estuche de extracción en gel El fragmento de ADN aislado se autoligó con ADN ligasa T4 y se usó para transformar TOP10 de Escherichia coli electrocompetente Se aislaron plásmidos a partir de transformantes y se controlaron para determinar la supresión apropiada por análisis de restricción con la enzima de restricción los aislados se secuenciaron a través del sitio de Un clon con la supresión apropiada se designó como pBP915 con de ident pYZ067 con de se construyó para contener los siguientes genes la región codificante del gen ilvD de UA159 de mutans con un marcador Lumio expresado a partir del promotor FBA1 de levadura seguido por el terminador FBA1 para la expresión de dihidroxi ácido la región codificante para ADH de hígado de caballo expresada a partir del promotor GPMl de levadura seguido por el terminador ADH1 para la expresión de alcohol y la región codificante del gen KivD de Lactococcus lactis expresado a partir del promotor TDH3 de levadura seguido por el terminador TDH3 para la expresión de cetoisovalerato descarboxilasa El plásmido pYZ067AkivDAhADH se construyó a partir de pYZ067 por supresión de los casetes de terminador para y pYZ067 se digirió con BamHI y SacI England y el fragmento de 7934 pb se purificó en un gel de agarosa con un estuche de extracción en gel El fragmento de ADN aislado se trató con ADN polimerasa Large Fragment England BioLabs se autoligó con ADN ligasa de T4 y se usó para transformar TOP10 de Escherichia coli competente Los plásmidos de los transformantes se aislaron y revisaron para analizar la supresión correcta por análisis de Un aislado correcto del plásmido se designó pYZ067AkivDAhADH con de ident Ejemplo Expresión de enzimas candidato en coli Basándose en una búsqueda de biodiversidad anteriormente en la presente los genes que codifican 9 enzimas se sintetizaron mediante el uso de codones optimizados para expresión en coli Menlo Cada gen se clonó bajo el control del promotor T5 en el vector pJexpress404 Menlo y se expresó en ToplO de coli San Después del crecimiento en agitación de matraces a 37 a una OD600 nm en medio LB complementado con 100 ug de con o sin el complemento de 30 de se agregó IPTG 1 mM y se realizó el crecimiento de los cultivos por otras Las células se recolectaron por y la expresión de la proteína heteróloga se confirmó por Tabla Enzimas Ejemplo Expresión de enzimas candidato en coli Según los resultados del ensayo enzimático de la primera ronda de búsqueda de los genes que codifican otras 13 enzimas se sintetizaron mediante el uso de codones optimizados para expresión en coli Menlo Adicionalmente se preparó un gen optimizado por codones que codifica el kivD de lactis con de Cada gen se clonó bajo el control del promotor T5 en el vector pJexpress404 Menlo y se expresó en ToplO de coli San Después del crecimiento en agitación de matraces a 37 a una OD600 nm en medio LB complementado con 100 ug de con o sin el complemento de 30 de se agregó IPTG 1 y se realizó el crecimiento de los cultivos por otras Las células se recolectaron por y la expresión de la proteína heteróloga se confirmó por Tabla Segunda ronda de selección de enzimas KIVD candidato Ejemplo Identificación de enzimas que exhiben actividad KIVD cuando se expresan en coli Se identificaron enzimas KIVD putativas con la actividad descarboxilasa deseada por ensayo de extracto libre de células de coli que se describe a La expresión de las enzimas putativas en coli se detalla en los E 1 y Preparación del extracto libre de células Las células de coli se suspendieron en 3 mi de HEPES 100 pH de MgCl2 10 y se rompieron por sonicación a 0 Las células se sometieron a un baño de ultrasonido con una sonda de micropunta durante 10 con 25 segundos de Este ciclo se repitió 12 por un total de 2 minutos de baño de El extracto crudo de la ruptura de células se centrifugó para granular los restos Se eliminaron los sobrenadantes y se almacenaron en hielo hasta el momento del Cuantificación de proteínas La concentración total de proteínas en los extractos libres de células se determinó con el ensayo de Bradford mediante el uso de Coomassie Plus Scientific Se usó BSA como La concentración de proteína se midió al seguir la absorbancia a 595 con un espectrofotómetro Cary 300 Protocolo de ensayo de enzimas KIVD acoplado Los índices de conversión de en isobutiraldehído se determinaron en un ensayo acoplado de ADH en hígado de caballo descrito en et Catal 1425 Los ensayos de extractos libres de células se realizaron a 30 en solución reguladora de Ph que contenía HEPES 100 con un pH de MgCl2 10 200 µ? de 500 µ? de 30 de IV y U de hADH mg La oxidación de NADH se controló a 340 en una cubeta con una longitud de trayecto de un 1 en un espectrofotómetro Cary 300 La velocidad enzimática se calculó con el coeficiente de extinción molar de 6220 para Los controles con varias concentraciones de hADH y el extracto libre de células aseguraron que la velocidad medida estaba determinada por actividad de la enzima Las actividades específicas de las enzimas KIVD putativas expresadas en coli se calcularon a partir de las actividades enzimáticas y la concentración total de proteína Los resultados de la ronda 1 y 2 se muestran en las Tablas 7 y Tabla Actividades KIVD para putativas de la Ronda 1 Tabla Actividad KIVD para putativas de la Ronda 2 Protocolo de ensayo enzimático de KIVD se determinaron los índices de conversión de cetoisovalerato en isobut iraldehído de tres enzimas con actividad KIVD alta mediante el uso del ensayo enzimático colorimétrico específico para aldehido de descrito por y Gokel Chem Los ensayos de extractos libres de células se realizaron a 30 en solución reguladora de Ph que contenía HEPES 100 a un pH de gCl2 10 500 µ? de TPP y 30 de El volumen total de reacción fue de 1 mi La formación de se controló por medio de retirar alícuotas de 200 µ? en puntos fijos de tiempo 20 y 30 e inhibir la reacción en 1 mi de solución madre de Purpald en NaOH 2 la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir que se desarrollara el La mezcla se mezcló cada 5 minutos durante el proceso de Se generó una curva estándar de isobutiraldehído de 0 a 10 mM para determinar la concentración de isobutiraldehído generada por la Se preparó 200 µ? de cada estándar y se agregó a un 1 mi de solución madre a lo largo del punto de tiempo El estándar se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos y se mezcló cada 5 Se determinó la absorbancia a 535 nm con un espectrofotómetro Cary 300 Las actividades específicas de las enzimas KIVD putativas expresadas en coli se calcularon a partir de las actividades enzimáticas y la concentración total de proteína Las actividades equivalentes específicas se determinaron con los ensayos acoplados continuos y colorimétricos como se muestra en la Tabla Tabla Comparación de ensayos acoplados y colorimétricos Ejemplo Determinación de la constante de activación del cofactor de TPP de enzimas KIVD Se evaluaron las tres enzimas KIVD putativas con la actividad más alta de las Rondas 1 y 2 KivD81 y lactis KivD y KdcA para determinar las constantes de activación del cofactor TPP en lisados crudos de las células de La expresión de estas enzimas en coli se describe en los Ejemplos 1 y La generación de lisados crudos y la cuantificación de proteínas se realizó como se describe en el Ejemplo Desalado del extracto libre de células Se usaron columnas giratorias de desalado Zeba R para desalar la proteína y eliminar la TPP no firmemente La preparación de las columnas se realizó de conformidad con las instrucciones del Todas las etapas de centrifugación se realizaron a 1000 xg durante 2 La primera etapa de centrifugación eliminó la solución reguladora de Ph de almacenamiento del Cuatro etapas de que consistieron en la adicion de 2 de HEPES 100 pH de a la columna y seguidas de prepararon la columna para desalado del lisado Finalizadas las etapas de la columna se colocó en un tubo nuevo de 15 Corning y se agregó 600 µ? del lisado de células a la columna de desalado y se Se recolectó el efluente y se analizó para determinar la actividad KivD dependiente de Protocolo de ensayo de enzimas KIVD acoplado Las velocidades de la conversión de en isobutiraldehído se determinaron en un ensayo enzimático acoplado de ADH de hígado de caballo descrito en et Catal 1425 Los ensayos de extractos libres de células se realizaron a 30 en solución reguladora de Ph que contenía HEPES 100 mM con un pH de MgCl2 10 200 µ? de 30 de y U de hADH Se varió la concentración de La oxidación de NADH se controló a 340 en una cubeta con una longitud de trayecto de un 1 cm en un espectrofotómetro Cary 300 La velocidad enzimática se calculó con el coeficiente de extinción molar de 6220 para Los controles con varias concentraciones de hADH y el extracto libre de células aseguraron que la velocidad medida estaba determinada por actividad de la enzima Las actividades específicas de las enzimas KIVD putativas expresadas en coli se calcularon a partir de las actividades enzimáticas y la concentración total de proteína Se realizó la gráfica de estas actividades específicas contra la concentración de Con Kaleidagraph las curvas resultantes se ajustaron para la ecuación de saturación Se determinaron las constantes de activación del cofactor TPP y los valores se presentan en la Tabla Tabla Constantes de activación del cofactor de TPP para KivD putativas Ejemplo Actividad KIVD de enzimas seleccionadas de la Ronda 2 después de la expresión en coli con medios complementados con tiamina Con base en la homología de secuencias con las enzimas que tienen actividad se analizaron más exhaustivamente cinco de los candidatos de la Ronda Se usaron un vector sin un inserto y Mea como controles negativo y La expresión en coli se realizó como se describe en el Ejemplo con la modificación del complemento de 30 de clorhidrato de tiamina en el medio de Los extractos crudos se prepararon y evaluaron como se describe en el Ejemplo El análisis de indicó la expresión de Npu en coli como proteína insoluble Tabla Actividades para enzimas expresadas con medios complementados con tiamina Ejemplo Medición de las relaciones de especificidad de los sustratos Se evaluaron dos enzimas KIVD putativas KdcA y KivD de Lactis para determinar la preferencia del Los plásmidos los Ejemplos 1 y 2 para descripción de los que codifican para cada una de las enzimas se aislaron y transformaron en la cepa electrocompetente KEIO Aldh de coli Después del crecimiento en agitación de matraces a 30 a una OD600 nm en medio LB complementado con 100 ug de se agregó 1 y se desarrollaron cultivos por otras Se generaron lisados celulares crudos de la manera y se analizaron las enzimas KivD putativas con respecto a actividad con aKiv y Preparación del extracto libre de células Las células de coli se suspendieron en 3 mi de HEPES 100 pH de MgCl2 10 Mm y se rompieron por sonicación a 0 Las células se sometieron a un baño de ultrasonido con una sonda durante 10 con 25 segundos de Este ciclo se repitió 12 por un total de 2 minutos de baño de El extracto crudo de la ruptura de células se centrifugó para granular los restos Se eliminaron los sobrenadantes y se almacenaron en hielo hasta el momento del Cuantificación de proteínas La concentración total de proteínas en los extractos libres de células se determinó con el ensayo de Bradford mediante el uso de Coomassie Plus Scientific Se usó BSA como La concentración de proteína se midió al seguir la absorbancia a 595 con un espectrofotómetro Cary 50 Protocolo de ensayo de enzimas acoplado Las velocidades de la conversión de cetoisovalerato en isobutiraldehído se determinaron en un ensayo enzimático acoplado de ADH de hígado de caballo descrito en et Catal 1425 Los ensayos de extractos libres de células se realizaron a 30 en solución reguladora de Ph que contenía HEPES 100 mM con un pH de MgCl2 10 200 µ? de 500 µ? de y U de hADH mg Se agregó el piruvato o en varias La oxidación de NADH se controló a 340 nm en una cubeta con una longitud de trayecto de un 1 en un espectrofotómetro Cary 300 Wilmington La velocidad enzimática se calculó con el coeficiente de extinción molar de 6220 para Los controles con varias concentraciones de hADH y el extracto libre de células aseguraron que la velocidad medida estaba determinada por actividad de la enzima Las actividades específicas de las enzimas KIVD putativas expresadas en coli se calcularon a partir de las actividades enzimáticas y la concentración total de proteína Se trazó una gráfica de estas actividades específicas contra el sustrato Con Kaleidagraph las curvas resultantes se ajustaron a la ecuación de y se determinaron Km y Los valores cinéticos y la relación de especificidad se presentan en la Tabla Tabla Valores cinéticos de KivD putativas Ejemplo Construcción de PNY1503 Construcción de la cepa BP1064 de Saccharomyces cerevisiae La cepa BP1064 se derivó de 113 Centraalbureau voor Schimmelcultures Fungal Biodiversity Países y contiene supresiones de los siguientes URA3 PDC5 PDC6 y Las que eliminaron completamente toda la secuencia se crearon mediante recombinación homologa con fragmentos de PCR que contenían regiones de homología dirección y dirección del gen objetivo y un marcador de resistencia de G418 o gen URA3 para la selección de El marcador de resistencia flanqueado por los sitios se eliminó con el uso de Cre recombinasa con de ident El gen URA3 se eliminó por recombinación homologa para crear una supresión sin marcas en el caso de estar flanqueado por sitios se eliminó con recombinasa El procedimiento de supresión sin cicatrices se adaptó de Akada et el cásete de PCR para cada supresión sin cicatrices se obtuvo mediante la combinación de cuatro por PCR de traslapamiento El cásete de PCR contenía un marcador URA3 que consistía en el gen nativo URA3 de junto con el promotor bp dirección del gen y el terminador bp dirección del gen Los Fragmentos A y C correspondieron a los 500 pb inmediatamente dirección 5 del gen objetivo y los 500 pb del extremo del gen objetivo Los fragmentos A y C se usaron para la integración del cásete en el cromosoma mediante recombinación El fragmento B bp de correspondía a los 500 bp inmediatamente dirección del gen objetivo y se usó para la escisión del marcador URA3 y el fragmento C del cromosoma mediante recombinación ya que se creó una repetición directa de la secuencia que correspondía al fragmento B cuando el cásete se integró en el Con el cásete ABUC producto de la primero se integró el marcador URA3 se realizó la escisión del cromosoma mediante recombinación La integración inicial suprimió el excepto la región de 500 Después de la se la región de 500 bp del Para la integración de los genes con este el gen por integrarse se incluyó en el cásete de PCR entre los fragmentos A y Supresión de URA3 Para eliminar la región codificante URA3 un cásete ura3 se amplificó por PCR a partir de la plantilla pLA54 con de pLA54 contiene el promotor TEF1 de lactis y el marcador y está flanqueado por los sitios loxP para permitir la recombinación con recombinasa Cre y la eliminación del Se realizó un análisis de PCR mediante el uso de ADN polimerasa Phusion y los cebadores BK505 y BK506 con núms de ident 73 y La porción URA3 de cada cebador se derivó de la región dirección del promotor URA3 y la región dirección de la región codificante de manera que la integración del marcador generó el reemplazo de la región codificante de El producto de PCR se transformó en 113 mediante el uso de técnicas genéticas estándar in Yeast Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring págs y los transformantes se seleccionaron en YPD que contenía G418 a 30 Se analizaron los transformantes para verificar su integración correcta por PCR mediante el uso de los cebadores LA468 y LA492 con de ident 75 y y se designaron Aura3 Supresión de HIS3 Los cuatro fragmentos del cásete de la PCR para la supresión sin marcas de HIS3 se amplificaron con la mezcla Master Mix Phusion de alta fidelidad para PCR England y el ADN genómico de 113 como preparado con un conjunto de reactivos para Gentra Puregene El Fragmento A de HIS3 se amplificó con el cebador oBP452 con de y el cebador ???453 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del Fragmento B de El Fragmento B de HIS3 se amplificó con el cebador OBP454 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del fragmento A de y el cebador OBP455 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del Fragmento U de El Fragmento U de HIS3 se amplificó con el cebador OBP456 con de que contenía una cola en con homología con el extremo 3 del Fragmento B de y el cebador OBP457 con de que contenía una cola en con homología con el extremo 5 del Fragmento C de El Fragmento C de HIS3 se amplificó con el cebador oBP458 con de que contenía una cola de con homología con el extremo 3 del fragmento U de y el cebador OBP459 con de Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR El fragmento AB de HIS3 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento A de HIS3 y el fragmento B de HIS3 y la amplificación con cebadores OBP452 con de y ???455 con de El fragmento UC de HIS3 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento U de HIS3 y el fragmento C de HIS3 y la amplificación con cebadores oBP456 con de y ???459 con de Los productos resultantes de la PCR se purificaron sobre un gel de agarosa se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel El cásete ABUC de HIS3 se creó mediante PCR de superposición por el mezclado del fragmento AB de HIS3 y el fragmento UC de HIS3 y la amplificación con cebadores oBP452 con de ident y oBP459 con de El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR Se prepararon células competentes de y se transformaron con el cásete de PCR ABUC con HIS3 al usar un conjunto de reactivos para transformación de levaduras Yeast Transíormation Las mezclas para la transformación se cultivaron en placas sobre medios sintéticos completos sin uracilo complementados con 2 de glucosa a 30 Los transformantes con his3 inactivado se analizaron mediante PCR con cebadores OBP460 con de y oBP461 con de al usar el ADN genómico preparado con un estuche de Gentra Puregene Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa 7D Aura3 Eliminación del marcador KanMX del sitio Aura3 y eliminación del marcador URA3 del sitio El marcador KanMX se eliminó mediante la transformación de con pRS423 cre con de con el uso de un estuche de de levadura II y el cultivo en placas sobre medio completo sintético sin histidina ni uracilo com lementado con glucosa al 2 a 30 Los transformantes se cultivaron en YP complementado con 1 de galactosa a 30 por horas para inducir la recombinasa Cre y la escisión del marcador KanMX y se cultivaron en placas sobre YPD de a 30 para Se cultivó un aislado durante toda la noche en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido a 30 para seleccionar los aislados que perdieron el marcador Los aislados resistentes a se crecieron y colocaron en placas sobre YPD para remover el plásmido pRS423 Los aislados se controlaron para identificar la eliminación del marcador el marcador URA3 y el plásmido pRS423 mediante el ensayo del crecimiento en placas medio sintético completo sin placas de uracilo y medio sintético completo sin placas de Un aislado adecuado sensible a G 18 y auxotrófico para uracilo e histidina se seleccionó como la cepa Aura3 loxP Ahis3 y se designó como Las supresiones y la eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR y secuenciación con cebadores ???450 con de ident y oBP451 con de para ñura3 e cebadores oBP460 con de y oBP461 con de para Ahis3 al usar el ADN genómico preparado con un conjunto de reactivos para Gentra Puregene Supresión de PDC6 Los cuatro fragmentos del cásete de PCR para la supresión sin marcas de PDC6 se amplificaron al usar la mezcla Master Mix Phusion de alta fidelidad para PCR England y el ADN como preparado con un conjunto de reactivos para Gentra Puregene El fragmento A de PDC6 se amplificó con el cebador ???440 con de ident y el cebador OBP441 con de ident que contenía una cola en con homología con el extremo 5 del Fragmento B de El Fragmento B de PDC6 se amplificó con el cebador ???442 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del Fragmento A de PDC6 y el cebador oBP443 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del Fragmento U de El Fragmento U de PDC6 se amplificó con el cebador OBP444 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del Fragmento B de PDC6 y el cebador OBP445 con de que contenía una cola en 5 con homología con el extremo 5 del Fragmento C de El Fragmento C de PDC6 se amplificó con el cebador OBP446 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del Fragmento U de y el cebador oBP447 con de Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR El fragmento AB de PDC6 se creó mediante PCR de traslapamiento por el mezclado del fragmento A de PDC6 y el fragmento B de PDC6 y la amplificación con cebadores OBP440 con de y OBP443 con de El fragmento UC de PDC6 se creó mediante PCR de traslapamiento por el mezclado del fragmento U de PDC6 y el fragmento C de PDC6 y la amplificación con cebadores OBP444 con de y OBP447 con de Los productos resultantes de la PCR se purificaron sobre un gel de agarosa se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel El cásete ABUC de PDC6 se creó mediante PCR de traslapamiento por el mezclado del fragmento AB de PDC6 y el fragmento UC de PDC6 y la amplificación con cebadores OBP440 con de y OBP447 con de El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR Se prepararon células competentes de 113 y se transformaron con el cásete ABUC con PDC6 preparado por PCR al usar el conjunto de reactivos para transformación de levaduras Yeast Transí ormat ion Las mezclas para la transformación se cultivaron en placas sobre medios sintéticos completos sin uracilo complementados con 2 de glucosa a 30 Los transformantes con inactivado se analizaron mediante con cebadores OBP448 con de y OBP449 con de al usar el ADN genómico preparado con un estuche de Gentra Puregene Se seleccionó un transformante adecuado como cepa Aura3 loxP Ahis3 La cepa loxP Ahis3 se cultivó durante toda la noche en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido orótico a 30 para seleccionar los aislados que perdieron el marcador La supresión y eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR y secuenciación con cebadores ???448 con de y oBP449 con de al usar el ADN genómico preparado con un estuche de Gentra Puregene La ausencia del gen PDC6 del aislado se demostró mediante un resultado negativo de la PCR con cebadores específicos para la secuencia codificante de oBP554 con de y oBP555 con de Se seleccionó el aislado adecuado como cepa 113 Aura3 loxP ñhis3 ñpdc6 y se designó como Supresión de PDCl de ilvDSm El gen PDCl se eliminó y se reemplazó con la región codificante de ilvD de Streptococcus mutans de la ATCC El fragmento A seguido por la región codificante de ilvD de Streptococcus mutans del cásete de PCR para la supresión de integración de ilvDSm se amplificó con la mezcla Master Phusion de alta fidelidad para PCR England y NYLA83 describe en la publicación de la solicitud de patente de los EE incorporada en su totalidad en la presente descripción como ADN genómico como preparado con un estuche de Gentra Puregene es una cepa que incluye la integración de ilvDSm con supresión de PDCl descrita en la publicación de la solicitud de patente de los EE que se incorpora en su totalidad en la presente descripción como El fragmento de PDCl con de se amplificó con el cebador oBP513 con de y el cebador OBP515 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del Fragmento B de Los fragmentos U y C del cásete de PCR para la supresión de integración de ilvDSm se amplificaron con la mezcla Master Mix Phusion de alta fidelidad para PCR England y el ADN genómico CE como preparado con el conjunto de reactivos para Gentra Puregene El fragmento B de PDCl se amplificó con el cebador oBP516 con de que contenía una cola en 5 con homología con el extremo 3 del fragmento de y el cebador OBP517 con de que contenía una cola en con homología con el extremo 5 del Fragmento U de PDCl El Fragmento U de PDCl se amplificó con el cebador oBP518 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del fragmento B de y el cebador oBP519 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del Fragmento C de El Fragmento C de PDCl se amplificó con el cebador oBP520 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del fragmento U de y el cebador oBP521 con de Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR El fragmento de PDCl se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el fragmento de PDCl y el fragmento B de PDCl y amplificar con los cebadores oBP513 con de y OBP517 con de El fragmento UC de PDCl se creó mediante PCR de traslapamiento por el mezclado del fragmento U de PDCl y el fragmento C de PDCl y la amplificación con cebadores oBP518 con de y OBP521 con de Los productos resultantes de la PCR se purificaron sobre un gel de agarosa se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel El cásete de PDC1 se creó por PCR de traslapamiento al mezclar el fragmento de PDC1 y el fragmento UC de PDC1 y al amplificar con los cebadores oBP513 con de ident y oBP521 con de El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR Se prepararon células competentes de Aura3 loxP Ahis3 Apdc6 y se transformaron con el cásete PDC1 preparado por PCR al usar el conjunto de reactivos para transformación de levaduras Yeast Transíormation Las mezclas para la transformación se cultivaron en placas sobre medios sintéticos completos sin uracilo com lementados con 2 de glucosa a 30 Los transformantes con pdcl inactivado e integración de ilvDSm se analizaron por PCR con cebadores oBP511 con de y oBP512 con de al usar el ADN genómico preparado con un estuche de Gentra Puregene La ausencia del gen PDC1 de la cepa aislada se demostró con un resultado negativo de PCR mediante el uso de cebadores específicos para la secuencia codificante de oBP550 con de y oBP551 con de Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa Aura3 loxP Apdcl La cepa 113 Aura3 loxP Apdc6 Apdcl se cultivó durante toda la noche en YPD y se colocó en placas sobre medio sintético completo que contenía ácido a 30 para seleccionar las cepas aisladas que perdieron el marcador La supresión de integración de y eliminación del marcador se confirmaron por PCR y secuenciación con los cebadores OBP511 con de y oBP512 con de ident mediante el uso del ADN genómico preparado con un estuche de Gentra Puregene Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa ñura3 loxP Ahis3 ilvDSm y se designó como Supresión de PDC5 integración de sadB El gen PDC5 se eliminó y se reemplazó con la región codificante de sadB de Achromobacter xylosoxidans gen sadB se describe en la publicación de la solicitud de patente de los que se incorpora en su totalidad en la presente descripción como Un segmento del cásete de PCR para la supresión de integración de sadB se clonó primero en el plásmido URA3MCS está basado en pUC19 y contiene la secuencia del gen URA3 de Saccharomyces cerevisiae ubicado dentro de un sitio de clonación múltiple por sus siglas en pUC19 contiene el replicón de y un gen que codifica la para la replicación y selección en Escherichia Adicionalmente a la secuencia codificante para URA3 se incluyeron las secuencias dirección y dirección de este gen para la expresión del gen URA3 en El vector puede usarse para propósitos de clonación y como un vector de integración de El ADN que abarcaba la región codificante U A3 junto con 250 bp dirección y 150 bp dirección de la región codificante URA3 del ADN genómico de 113 de Saccharomyces cerevisiae se amplificó con cebadores oBP438 con de ident que contiene los sitios de restricción y y ???439 con de que contenía los sitios de restricción Pací y al usar la mezcla maestra para PCR de alta fidelidad Phusion England El ADN genómico se preparó con el conjunto de reactivos para Gentra Puregene El producto de PCR y pUC19 con de se ligaron con T4 ADN ligasa después de la digestión con BamHI y Xbal para crear el vector El vector se confirmó mediante PCR y secuenciación con cebadores oBP264 con de y oBP265 con de La secuencia codificante de sadB y el fragmento B de PDC5 se clonaron en para crear la porción BU del cásete de PCR de PDC5 La secuencia codificante de sadB se amplificó con con de ident como plantilla con el cebador oBP530 con de que contenía un sitio de restricción de AscI y el cebador OBP531 con de que contenía una cola en con homología con el extremo 5 del Fragmento B de El Fragmento B de PDC5 se amplificó con el cebador oBP532 con de que contenía una cola en con homología con el extremo de y el cebador ???533 con de que contenía un sitio de restricción Pmel Los productos de PCR se purificaron con un estuche de purificación de PCR El fragmento B de se creó por PCR de traslapamiento al mezclar los productos de PCR sadB y el fragmento B de PDC5 y amplificar con los cebadores ???530 con de y OBP533 con de Se realizó la digestión del producto de PCR resultante con AscI y y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes de después de la digestión con las enzimas El plásmido resultante se usó como plantilla para la amplificación de fragmento U con cebadores ???536 con de y oBP546 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del Fragmento C de El Fragmento C de PDC5 se amplificó con el cebador OBP547 con de que contenía una cola en con homología con el extremo de U de PDC5 y el cebador ???539 con de Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR El fragmento C de PDC5 se creó mediante PCR de traslapamiento por el mezclado de fragmento U de PDC5 y el fragmento C de PDC5 y la amplificación con cebadores ???536 con de y oBP539 con de El producto resultante de la PCR se purificó sobre un gel de agarosa se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel El cásete PDC5 con de se creó mediante amplificación de fragmento C de PDC5 con cebadores OBP542 con de que contiene una cola en con homología con los 50 nucleótidos inmediatamente dirección de la secuencia codificante nativa de y el cebador OBP539 con de El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR Se prepararon células competentes de 113 Aura3 loxP Ahis3 ilvDSm y se transformaron con el cásete PDC5 preparado por PCR al usar el conjunto de reactivos para transformación de levaduras Yeast Las mezclas de transformación se cultivaron en placas sobre medios sintéticos completos sin uracilo complementados con 1 de etanol a 30 Los transformantes con pdc5 inactivado e integración de sadB se analizaron mediante PCR con cebadores ???540 con de ident y OBP541 con de al usar el ADN genómico preparado con un kit de Gentra Puregene La ausencia del gen PDC5 del aislado se demostró mediante un resultado negativo de la PCR con cebadores específicos para la secuencia codificante de OBP552 con de y OBP553 con de Se seleccionó un transformante adecuado como la cepa Aura3 loxP Ahis3 Apdcl ilvDSm Apdc5 La cepa ilvDSm Apdc5 se cultivó durante toda la noche en YPE de y se colocó en placas sobre medio sintético completo complementado con etanol y que contenía ácido a 30 para seleccionar los aislados que perdieron el marcador La supresión de PDC5 integración de sadB y eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR con cebadores oBP540 con de y OBP541 con de al usar el ADN genómico preparado con un estuche de Gentra Puregene Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa loxP Ahis3 Apdc6 ilvDSm sadB y se designó como Supresión de GPD2 Para suprimir la región codificante del GPD2 un cásete gpd2 con de se amplificó por PCR al usar el producto de PCR loxP con de como plantilla de El contiene el marcador URA3 ATCC flanqueado por sitios loxP para Se realizó la PCR con ADN polimerasa Phusion y los cebadores LA512 y LA513 con núms de 136 y La porción GPD2 de cada cebador se derivó de la región dirección de la región codificante de GPD2 y de la región dirección de la región codificante de manera que la integración del marcador generó el reemplazo de la región codificante de El producto de PCR se transformó en y los transformantes se seleccionaron sobre un medio sintético completo sin uracilo complementado con etanol al 1 Se analizaron los transformantes para verificar su integración correcta por PCR mediante el uso de los cebadores oBP582 y ??270 con de 138 y El marcador URA3 se recicló por transformación con pRS423 con de y se cultivó en placas sobre medios sintéticos completos sin histidina complementados con 1 de etanol a 30 Los transformantes se sembraron con técnica de estriado en placas sobre medio sintético completo complementado con 1 de etanol y que contenía ácido 5 e incubaron a 30 para seleccionar los aislados que perdieron el marcador Los aislados resistentes a se cultivaron en YPE al 1 para la eliminación del plásmido pRS423 La supresión y la eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR con los cebadores oBP582 con de y OBP591 con de Se seleccionó el aislado adecuado como la cepa Apdcl ilvDSm y se designó como PNY1503 Ejemplo 8 Construcción de PNY1507 Construcción de cepas BP1135 de Saccharomyces cerevisiae y PMY1507 y derivados que producen isobutanol El propósito de este ejemplo fue construir las cepas BP1135 y PNY1507 de Saccharomyces cerevisiae Estas cepas se derivaron de PNY1503 La construcción de PNY1503 se describió BP1135 contiene una supresión adicional del gen PNY1507 se derivó de BP1135 con la supresión adicional del gen ADH1 con integración del gen kivD de Lactococcus optimizado por codones para la expresión en Saccharomyces en el locus Supresión de La supresión de FRA2 se diseñó para suprimir 250 nucleótidos del extremo de la secuencia codificante de manera que los primeros 113 nucleótidos de la secuencia codificante de FRA2 quedaron Un codón de terminación dentro del marco estuvo presente en 7 nucleótidos dirección de la Los cuatro fragmentos del cásete de PCR para la supresión sin marcas de FRA2 se amplificaron al usar la mezcla Master Mix Phusion de alta fidelidad para PCR England y el ADN genómico de 113 como preparado con un conjunto de reactivos para Gentra Puregene El fragmento A de FRA2 se amplificó con el cebador OBP594 con de y el cebador OBP595 con de que contenía una cola en 5 con homología con el extremo 5 del Fragmento B de El Fragmento B de FRA2 se amplificó con el cebador oBP596 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del fragmento A de FRA2 y el cebador oBP597 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del Fragmento U de El Fragmento U de FRA2 se amplificó con el cebador oBP598 con de que contenía una cola en con homología al extremo 3 del fragmento B de FRA2 y el cebador OBP599 con de que contenía una cola en con homología con el extremo 5 del Fragmento C de El Fragmento C de FRA2 se amplificó con el cebador 0BP6OO con de que contenía una cola en con homología con el extremo del fragmento U de FRA2 y el cebador 0BP6OI con de Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR El fragmento AB de FRA2 se creó mediante PCR de traslapamiento por el mezclado del fragmento A de FRA2 y el fragmento B de FRA2 y la amplificación con cebadores OBP594 con de y oBP597 con de El fragmento UC de FRA2 se creó mediante PCR de traslapamiento por el mezclado del fragmento U de FRA2 y el fragmento C de FRA2 y la amplificación con cebadores OBP598 con de y 0BP6OI con de Los productos resultantes de la PCR se purificaron sobre un gel de agarosa se usó un conjunto de reactivos para extracción en gel El cásete ABUC de FRA2 se creó mediante PCR de traslapamiento por el mezclado del fragmento AB de FRA2 y el fragmento UC de FRA2 y la amplificación con cebadores oBP594 con de y 0BP6OI con de El producto de la PCR se purificó con un conjunto de reactivos para purificación por PCR Se prepararon células competentes de PNY1503 y se transformaron con el cásete ABUC preparado por PCR con FRA2 al usar el conjunto de reactivos para transformación de levaduras Yeast Transíormat ion Las mezclas de transformación se cultivaron en placas en medios sintéticos completos sin uracilo complementados con 1 de etanol a 30 Los transformantes con una inactivación de se seleccionaron para PCR con los cebadores OBP602 con de y ???603 con de ident al usar el ADN genómico preparado con un estuche de Gentra Puregene Un transformante correcto se cultivó en YPE de etanol al 1 y se colocó en placas con medio completo sintético que contiene ácido a 30 para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de La supresión y la eliminación del marcador se confirmaron mediante PCR con cebadores oBP602 con de y ???603 con de al usar el ADN genómico preparado con un estuche de Gentra Puregene La ausencia del gen FRA2 del aislado se demostró con un resultado negativo de PCR al usar cebadores específicos para la secuencia codificante suprimida de FRA2 OBP605 con de y 0BP6O6 con de ident El aislado correcto se seleccionó como la cepa MATa ura3A loxP his3A pdc6A PDC5t fra2A y se designó como PNY1505 Esta cepa se transformó con plásmidos de la ruta de isobutanol sec con de y pLH468 con de y un clon se denominó BP1168 Supresión de ADHl e integración de kivD El gen ADHl se suprimió y reemplazó con la región codificante de kivD de Lactococcus lactis optimizada por codones para la expresión en Saccharomyces El cásete para la supresión de ADHl integración de se clonó primero en el plásmido La región codificante de kivD de Lactococcus lactis optimizada por codones para expresión en Saccharomyces cerevisiae se amplificó mediante el uso de pLH468 con de como plantilla con el cebador OBP562 con de que contenía un sitio de restricción de y el cebador oBP563 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del Fragmento B de ADHl El Fragmento B de ADHl se amplificó a partir del ADN genómico preparado como se mencionó anteriormente con el cebador oBP564 con de iden que contenía una cola en con homología con el extremo de y el cebador oBP565 con de que contenía un sitio de restricción de Los productos de PCR se purificaron con un estuche de purificación para PCR El Fragmento B de se creó mediante PCR de traslapamiento por el mezclado de los productos de PCR del fragmento B de y ADH1 y la amplificación con cebadores ???562 con de y oBP565 con de Se realizó la digestión del producto de PCR resultante con y Fsel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes de pUC19 después de la digestión con las enzimas El fragmento A de ADH1 se amplificó a partir de ADN genómico con el cebador ???505 con de que contenía un sitio de restricción y el cebador ???506 con de que contenía un sitio de restricción de Se realizó la digestión del producto de PCR del fragmento A de ADH1 con SacI y Ascl y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contenía el fragmento B de El fragmento C de ADH1 se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador oBP507 con de que contenía un sitio de restricción de Pací y el cebador OBP508 con de que contenía un sitio de restricción de El producto de PCR del fragmento C de ADH1 se digirió con Pací y Salí y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contiene fragmento A de B de El promotor híbrido UAS se amplificó a partir del vector UAS con de ident con el cebador oBP674 con de que contenía un sitio de restricción de AscI y el cebador oBP675 con de que contenía un sitio de restricción de Pmel Se realizó la digestión del producto de PCR PFBAI con AscI y y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contenía fragmentos ABC de El cásete de integración completo se amplificó a partir del plásmido resultante con los cebadores OBP505 con de y ???508 con de y se purificó con un estuche de purificación para PCR Las células competentes de PNY1505 se prepararon y transformaron con el cásete de PCR construido anteriormente mediante el uso del kit Yeast Transíormation Las mezclas de transformación se cultivaron en placas en medios sintéticos completos sin uracilo complementados con 1 de etanol a 30 Los transformantes se cultivaron en YPE al 1 y se colocaron en placas con medio completo sintético que contiene ácido a 30 para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de La supresión de ADH1 y la integración de se confirmaron por PCR con los cebadores externos oBP495 con de y oBP496 con de ident y con el cebador específico de OBP562 con de y el cebador OBP496 externo con de al usar el ADN genómico preparado con un kit de Gentra Puregene El aislado correcto se seleccionó como la cepa MATa his3A pdc6A pdclA adhlA UAS y se designó como PNY1507 Ejemplo Construcción de PNY2211 Construcción de la cepa PNY2211 y PNY2209 de cerevisiae PNY2211 se construyó en varias etapas a partir de la cepa PNY1507 de como se describe en los siguientes se modificó la cepa para que contuviera un gen de fosfocetolasa se agregó un gen acetolactato sintasa a la cepa mediante el uso de un vector de integración específico para la secuencia adyacente al gen fosfocetolasa se usó recombinación homologa para eliminar el gen fosfocetolasa y las secuencias del vector de lo que produce una inserción sin cicatrices de alsS en la región intergénica entre y el gen nativo TRX1 del cromosoma El genotipo resultante de PNY2211 es MATa pdc6A pdc5A P fra2A P Un cásete génico de fosfocetolasa se introdujo en PNY1507 por recombinación El constructo de integración se generó de la siguiente El plásmido pRS423 anteriormente en la patente de los EE que se incorpora en su totalidad en la presente descripción como se digirió con y para eliminar la secuencia de budA de y el vector se ligó nuevamente después del tratamiento con el fragmento de el promotor CUP1 se reemplazó con una variante del promotor TEF1 descrita anteriormente por Nevoigt et Appl Microbiol que se incorpora en su totalidad en la presente descripción como por medio del servicio de síntesis de ADN y construcción de vectores de El plásmido pRS423 se cortó con Stul y la porción de kb que contiene parte del gen alsS y el terminador y se combinó con el producto de 4 kb de PCR generado a partir de pRS426 con de ident con los cebadores N1176 con de y N1177 con de y un ADN de kb producto de PCR generado a partir del ADN genómico de levadura promotora con los cebadores N822 con de y N1178 con de y se transformó en la cepa BY4741 de cerevisiae ATCC metodología de clonación por reparación de ver et Gene Se obtuvieron los transformantes al colocar en placas las células sobre un medio sintético completo sin El ensamblaje adecuado del plásmido esperado TEF sec con de se confirmó por PCR N821 con de y N1115 con de y por digestión de restricción se secuenciaron dos El gen de kb se aisló por digestión con y y se clonó en el vector que se cortó con Se trataron los fragmentos de clonación con el fragmento de Klenow para generar los extremos romos para la Las reacciones de ligación se transformaron en las células Stbl3 de para selección de resistencia a la La inserción de se confirmó por PCR N1110 con de y N1114 con de El vector se linearizó con AflII y se trató con el fragmento de El cásete de kb de resistencia a la geneticina se clonó por ligación después del tratamiento del fragmento de Las reacciones de ligación se transformaron en las células Stbl3 de para selección de resistencia a la La inserción del cásete para geneticina se confirmó por PCR N160SeqF5 con de ident y BK468 con de La secuencia de plásmidos se proporciona como la con de 179 URA3 El cásete de integración resultante TEF xpkl TRX1 se aisló digestión de y iVael generó una banda de kb que se purificó con y se transformó en PNY1507 con el uso del kit de transformación de levadura Zymo Research Los transformantes se seleccionaron al colocarlos en placas con YPE más 50 de La integración del locus previsto se confirmó por PCR N886 con de y N1214 con de el plásmido pRS423 con de que codifica la recombinasa se usó para eliminar el cásete KanMX flanqueado por La eliminación adecuada del se confirmó por PCR oBP512 con de y N160SeqF5 con de Por el plásmido de integración alsS con de clon se transformó en esta cepa al usar el marcador de selección de geneticina Se evaluaron dos integrantes para determinar la actividad acetolactato sintasa por transformación con los plásmidos pYZ090AalsS con de y pBP915 con de con el uso del protocolo 2 en Burke y Strathern in Yeast y la evaluación del crecimiento y producción de isobutanol en medios que contienen glucosa métodos para medición del crecimiento e isobutanol son los todas las cepas se cultivaron en un medio sintético menos histidina y que contenía de glucosa y de etanol como fuentes de carbono mi de medio en matraces Erlenmeyer ventilados de 125 mi de cat Después de la incubación durante la noche 250 rpm en un agitador científico New se volvieron a diluir los cultivos a OD de Eppendorf en un medio sintético completo que contenía 2 de glucosa y de etanol mi de medio en matraces Erlenmeyer de 125 mi herméticamente cerrados de Después de 48 horas de incubación 250 rpm en un agitador científico New los sobrenadantes del cultivo con unidades de filtrado del tubo de centrífuga se analizaron por HPLC por métodos descritos en la publicación de solicitud de patente de los EE Uno de los dos clones fue positivo y se denominó PNY2218 se trató con recombinasa y se evaluaron los clones resultantes para la pérdida del gen xpkl y las secuencias del vector de integración pUC19 por PCR N886 con de ident y N160SeqR5 con de Esto dejó únicamente el gen alsS integrado en la región intergénica después de la recombinación del ADN dirección de xpkl y el ADN homólogo introducido durante la inserción del vector de integración inserción dado que el el gen marcador y las secuencias loxP se han Aunque esta recombinación podría haberse producido en cualquier la integración del vector pareció ser estable aun sin la selección de y el evento de recombinación se observó solamente después de la introducción de la recombinasa Un clon se designó Ejemplo Construcción de PNY1528 PNY1528 de hADH en Las se crearon por recombinación homologa con los productos de PCR que contienen regiones de homología dirección y dirección de la región objetivo y el gen URA3 para selección de El gen URA3 se eliminó por recombinación homologa para crear una sin El procedimiento de sin marcas se adaptó de Akada et El cásete de PCR para cada se preparó al combinar cuatro y el gen a integrarse por clonación de los fragmentos individuales en un plásmido antes de amplificar el cásete completo por PCR para el procedimiento de El gen para integrarse se incluyó en el cásete entre los fragmentos A y El cásete de PCR contenía un marcador URA3 que consistía en el gen nativo URA3 junto con las regiones promotora pb dirección del gen URA3 y terminadora pb dirección del gen Los fragmentos A y C uno de aproximadamente 100 a 500 pb de correspondían a la secuencia inmediatamente dirección de la región objetivo y se secuencia de la región objetivo Los fragmentos A y C se usaron para la integración del cásete en el cromosoma mediante recombinación El fragmento B pb de correspondía a las 500 pb inmediatamente dirección de la región objetivo y se usó para la excisión del marcador de URA3 y el fragmento C del cromosoma por recombinación ya que una repetición directa de la secuencia correspondiente al fragmento B se creó con la integración del cásete en el Supresión de YPRCA15 e integración de adh de hígado de caballo El locus YPRCA15 se eliminó y se reemplazó con el gen de ADH de hígado de se optimizó por codones para la expresión en Saccharomyces junto con la región promotora de PDC5 de Saccharomyces cerevisiae y la región terminadora de de Saccharomyces cerevisiae El cásete sin cicatrices para la supresión de YPRCA15 de P HL se clonó primero en el plásmido Los fragmentos se amplificaron con el uso de la mezcla Master ix Phusion de alta fidelidad para PC England y el genómico de 113 como preparado con un conjunto de reactivos para Gentra Puregene El fragmento A de YPRCA15 se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador oBP622 con de ident que contenía un sitio de restricción Kpnl y el cebador oBP623 con de que contenía una cola en 5 con homología con el extremo 5 del Fragmento B de El Fragmento B de YPRCA15 se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador OBP624 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del Fragmento A de y el cebador OBP625 con de ident que contenía un sitio de restricción de Fsel Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR Fragmento A Fragmento B se creó por PCR de traslapamiento al mezclar los productos de la PCR Fragmento con Fragmento y amplificar con los cebadores oBP622 con de y oBP625 con de El producto resultante de la PCR se digirió con Kpnl y Fsel y se ligó con T4 ADN ligasa en los sitios correspondientes de después de la digestión con las enzimas El Fragmento C de YPRCA15 se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador ???626 con de que contenía un sitio de restricción y el cebador OBP627 con de que contenía un sitio de restricción de El producto de la PCR Fragmento se digirió con Notl y Pací y se ligó con T4 ADN ligasa en los sitios correspondientes del plásmido que contenía los Fragmentos AB de La región promotora de PDC5 se amplificó del ADN genómico de 113 HY21 con el cebador con de que contenía un sitio de restricción de HY24 y el cebador con de que contenía una cola en con homología con el extremo de se amplificó a partir de pBP915 con de ident con los cebadores HY25 con de que contenía una cola en con homología con el extremo de y HY4 con de que contenía un sitio de restricción de Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR P se creó por PCR de traslapamiento al mezclar los productos de PCR y y al amplificar con los cebadores HY21 con de y HY4 con de El producto de PCR resultante se digirió con AscI y Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contiene los fragmentos ABC de Todo el cásete de integración se amplificó a partir del plásmido resultante con los cebadores oBP622 con de y oBP627 con de Se preparó células competentes de PNY2211 y se transformaron con el producto de PCR de la supresión de YPRC cásete de integración de P con el uso de un estuche de transformación de levadura II EZ Las mezclas de transformación se colocaron en placas con medio sintético completo sin uracilo complementado con etanol al 1 a 30 Los transformantes se evaluaron por PCR con los cebadores extremo F con de ident y OBP637 con de Los transformantes correctos se cultivaron en YPE al 1 y se colocaron en placas con medio completo sintético complementado con EtOH al 1 y que contiene ácido a 30 para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de La supresión de YPRCA15 y la integración de se confirmaron por PCR con los cebadores externos oBP636 con de y ???637 con de con el uso de ADN genómico preparado con un estuche de ADN genómico YeaStar Se seleccionó un aislado correcto del genotipo siguiente para modificación MATa pdc6A CYClt PDC5t fra2A UAS P Integración de adh de hígado de caballo en fra2A El gen de adh de hígado de optimizado por codones para la expresión en Saccharomyces junto con la región promotora PDC1 de Saccharomyces cerevisiae y la región terminadora ADH1 de Saccharomyces se integró en el sitio de la supresión de El sin cicatrices para la integración de P se en el plásmido Los fragmentos se amplificaron con el uso de la mezcla Master Mix Phusion de alta fidelidad para PCR England y el ADN genómico de como preparado con un conjunto de reactivos para Gentra Puregene El fragmento C de fra2A se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador OBP695 con de ident que contenía un sitio de restricción oBP696 y el cebador con de que contenía un sitio de restricción de El producto de PCR del fragmento C de fra2A se digirió con Notl y Pací y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes de El fragmento B de fra2A se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador oBP693 con de que contenía un sitio de restricción de OBP694 y el cebador con de que contenía un sitio de restricción de Fsel El producto de PCR resultante se digirió con Pmel y Fsel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contiene el fragmento C de fra2A después de la digestión con las enzimas El fragmento A de fra2A se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador oBP691 con de que contiene los sitios de restricción BamHI y y el cebador OBP692 con de que contiene los sitios de restricción y SwaI El producto de PCR del fragmento A de fra2ñ se digirió con y AscI y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contienen fragmentos BC de fra2A después de la digestión con las enzimas La región promotora de PDC1 se amplificó del ADN genómico de con el cebador HY16 con de ident que contenía un sitio de restricción de AscI HY19 y el cebador con de que contenía una cola en con homología con el extremo de se amplificó a partir de pBP915 con los cebadores HY20 con de que contenía una cola en con homología con el extremo de y HY4 con de que contenía un sitio de restricción de Los productos de la PCR se purificaron con un conjunto de reactivos para purificación por PCR P se creó por superposición de PCR al mezclar los productos de PCR y y al amplificar con los cebadores HY16 con de y HY4 con de El producto de PCR resultante se digirió con AscI y y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contiene los fragmentos ABC de El cásete de integración completo se amplificó a partir del plásmido resultante con los cebadores oBP691 con de y OBP696 con de ident Las células competentes de la variante PNY2211 con integrado en YPRCA15se prepararon y se transformaron con el producto de PCR del cásete de integración con el uso de un estuche de transformación de levadura II Las mezclas de transformación se colocaron en placas con medio sintético completo sin uracilo complementado con etanol al 1 a 30 Los transformantes se evaluaron por PCR con los cebadores F con de y OBP731 con de Los transformantes correctos se cultivaron en YPE al 1 y se colocaron en placas con medio completo sintético complementado con EtOH al 1 y que contiene ácido orótico a 30 para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de La integración de se confirmó por PCR de la colonia con el cebador interno HY31 con de y el cebador externo OBP731 con de y PCR con los cebadores externos oBP730 con de y OBP731 con de con el uso de ADN preparado con un kit de ADN genómico YeaStar Un aislado correcto del siguiente genotipo se denominó MATa his3A CYClt PDC5t adhlA P Ejemplo Construcción de las cepas PNY1550 y P El propósito de este ejemplo es describir el ensamblaje de los constructos usados para reemplazar la copia cromosómica de en PNY1528 en el sitio adhlA con o y la construcción de cepas de genes para isobutanol PNY1550 y PNY1551 que expresan los genes Las se crearon por recombinación homologa con los productos de PCR que contienen regiones de homología dirección y dirección de la región objetivo y el gen URA3 para selección de El gen URA3 se eliminó por recombinación homologa para crear una sin El procedimiento de sin marcas se adaptó de Akada et El cásete de PCR para cada integración se preparó al combinar cuatro y el gen a integrarse por clonación de los fragmentos individuales en un plásmido antes de amplificar el cásete completo por PCR para el procedimiento de El gen para integrarse se incluyó en el cásete entre los fragmentos A y El cásete de PCR contenía un marcador URA3 que consistía en el gen nativo URA3 junto con las regiones promotora pb dirección del gen y terminadora pb dirección del gen Los fragmentos A y C 500 pb de correspondían a la secuencia inmediatamente dirección de la región objetivo y secuencia de la región Los fragmentos A y C se usaron para la integración del cásete en el cromosoma mediante recombinación El fragmento B pb de correspondía a las 500 pb inmediatamente dirección de la región objetivo y se usó para la excisión del marcador de URA3 y el fragmento C del cromosoma por recombinación ya que una repetición directa de la secuencia correspondiente al fragmento B se creó con la integración del cásete en el Los plásmidos para integrar y se derivaron de un plásmido construido para integrar UAS P en el sitio de ADH1 de Saccaromyces cerevisiae La construcción del plásmido usado para integrar UAS en el locus ADH1 se describe a Los plásmidos se construyeron en Construcción del plásmido de supresión de de UAS P Ll La región codificante de kivD de Lactococcus lactis optimizada por codones para la expresión en Saccharomyces se amplificó con el uso de pLH468 con de ident como plantilla con el cebador oBP562 con de que contenía un sitio de restricción de y el cebador OBP563 con de que contenía una cola en con homología con el extremo del Fragmento B de El Fragmento B de ADHl se amplificó a partir del ADN genómico 113 de Saccharomyces cerevisiae con el cebador oBP564 con de que contenía una cola en con homología con el extremo de y el cebador OBP565 con de que contenía un sitio de restricción de Los productos de PCR se purificaron con un estuche de purificación por PCR El fragmento B de se creó por PCR de traslapamiento al mezclar los productos de PCR del fragmento B de y ADHl y la amplificación con los cebadores oBP562 con de y OBP565 con de Se realizó la digestión del producto de PCR resultante con Pmel y Fsel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes de después de la digestión con las enzimas El fragmento A de ADHl se amplificó a partir de ADN genómico con el cebador oBP505 con de ident que contenía un sitio de restricción y el cebador oBP506 con de que contenía un sitio de restricción de Se realizó la digestión del producto de PCR del fragmento A de ADH1 con SacI y Ascl y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contenía el fragmento B de El fragmento C de ADH1 se amplificó a partir del ADN genómico con el cebador oBP507 con de que contenía un sitio de restricción de Pací y el cebador oBP508 con de que contenía un sitio de restricción de El producto de PCR del fragmento C de ADH1 se digirió con Pací y Salí y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contiene fragmento A de fragmento B de El promotor híbrido UAS PGK1 con de se amplificó del vector UAS PGK1 con el cebador oBP674 con de que contenía un sitio de restricción de Ascl y el cebador OBP675 con de que contenía un sitio de restricción de El producto de PCR UAS PGK1 se digirió con Ascl y Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del plásmido que contiene los fragmentos ABC de para generar Construcción de pBP1719 y pBP2019 se eliminó del plásmido de supresión de de UAS El plásmido se digirió con y Fsel y el fragmento de ADN grande se purificó en un gel de agarosa con un estuche de extracción con gel El fragmento B de ADHl se amplificó a partir del pBP1181 con el cebador oBP821 con de ident que contenía un sitio de restricción de Pmel y el cebador oBP484 con de que contenía un sitio de restricción de El producto de PCR del Fragmento B de ADHl se digirió con Pmel y Fsel y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes del fragmento grande de ADN purificado con Un fragmento de PCR correspondiente a las 500 pb de de se clonó en el vector resultante para la supresión específica de en El fragmento se amplificó a partir de pBP1181 con los cebadores oBP822 con de que contenía un sitio de restricción y oBP823 con de que contenía un sitio de restricción de El fragmento se digirió con y Pací y se ligó con ADN ligasa de T4 en los sitios correspondientes dirección de URA3 en el plásmido mencionado anteriormente con la supresión de después de la digestión con las enzimas de restricción El plásmido resultante se denominó La región codificante de de Listeria grayi optimizada por codones para la expresión en Saecharo yees cerevisiae con de ident se sintetizó por se amplificó con los cebadores oBP828 con de que contenía un sitio de restricción y OBP829 con de que contenía un sitio de restricción de Pmel El producto de PCR resultante se digirió con Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en el sitio correspondiente en pBP1716 después de la digestión con la enzima La orientación del gen clonado se revisó por PCR con los cebadores con de y oBP829 con de Un aislado con en la orientación correcta se denominó La región codificante de kivD de Macrococcus caseolyticus optimizada por codones para expresión en cerevisiae con de se sintetizó por se amplificó con los cebadores oBP900 con de que contenía un sitio de restricción y oBP901 con de que contenía un sitio de restricción de El producto de PCR resultante se digirió con Pmel y se ligó con ADN ligasa de T4 en el sitio correspondiente en pBP1716 después de la digestión con la enzima La orientación del gen clonado se revisó por PCR con los cebadores con de y OBP901 con de Un aislado con en la orientación correcta se designó Construcción de las cepas PNY1550 y PNY1551 La cepa PNY1528 se transformó con los plasmidos pLH702 y Un transformante se designó El cásete de supresión de de se amplificó a partir de pBP1719 con los cebadores ???505 con de y oBP823 con de Las células competentes del PNY1528 se produjeron y se transformaron con el producto de PCR con el uso de un estuche de transformación de levadura II Las mezclas de transformación se colocaron en placas con medio sintético completo sin uracilo complementado con etanol al 1 a 30 Los transformantes se cultivaron en YPE al 1 y se colocaron en placas con medio completo sintético complementado con EtOH al 1 y que contiene ácido a 30 para seleccionar los aislados que perdieron el marcador La supresión de y la integración de se confirmó por PCR con los cebadores OBP674 con de y OBP830 con de con el uso de ADN genómico preparado con un estuche de ADN genómico YeaStar Un aislado correcto contenía en el mismo locus y se expresó a partir del mismo promotor que en Un aislado se transformó con los plásmidos pLH702 y pYZ067AkivDAhADH Un transformante se designó El cásete de supresión de de se amplificó a partir de pBP2019 con los cebadores OBP505 con de ident y OBP823 con de Las células competentes del PNY1528 se produjeron y se transformaron con el producto de PCR mediante el uso de un estuche Yeast Transíormation II kit Las mezclas de transformación se colocaron en placas con medio sintético completo sin uracilo complementado con etanol al 1 a 30 Los transformantes se evaluaron por PCR con los cebadores HY51 con de y oBP906 con de Los transformantes correctos se cultivaron en YPE al 1 y se colocaron en placas con medio completo sintético complementado con EtOH al 1 y que contiene ácido orótico a 30 para seleccionar los aislados que perdieron el marcador de La supresión de y la integración de se confirmó por PCR con los cebadores HY50 con de y HY51 con de con el uso de ADN genómico preparado con un estuche de ADN genómico YeaStar Un aislado correcto contenía en el mismo locus y se expresó a partir del mismo promotor que en Un aislado se transformó con los plásmidos pLH702 y Un transformante se designó Ejemplo Fermentaciones Métodos Preparación del inoculo Para cada se descongeló un solo vial se transfirió a un medio de 10 mi de semillas en un matraz de agitación ventilado de 125 mi y se incubó a 30 con agitación a 300 rpm para cultivo durante la se transfirió 5 mi del cultivo de toda la noche a un matraz de agitación ventilado de 250 mi con 75 mi del medio de semillas del crecimiento durante toda la noche a 30 y agitación a 300 Cuando el cultivo alcanzó una OD600 de el matraz de cultivo se usó para inocular termentador de 1 La composición del medio de semillas es la base de nitrógeno de levadura sin aminoácidos suplementos de medio selectivo deficiente sintético para levaduras sin triptófano y uracilo 20 4 HCl de 20 20 3 glucosa 10 El pH se ajustó a con 20 de hidróxido de y el medio se esterilizó por filtración a través de un filtro de Preparación y funcionamiento del Las fermentaciones se llevaron a cabo en fermentadores Biostat B DCU3 de 1 litro EE La composición de gas residual se controló con un espectrómetro de masas Prima DB Electron EE Para determinar el isobutanol y etanol en el gas el gas pasó primero a través de una botella Shott de un litro con litros de colocada en un baño de antes de enviarse al espectrómetro de masas La temperatura del termentador se mantuvo en 30 y se controló el pH a con 20 de KOH durante toda la La aireación se controló con estándares de litros por y la agitación se controló a 100 No se controló el oxígeno que fue no detectable durante la mayor parte de la Se extrajeron muestras y se analizaron para densidad óptica a 600 y para la concentración de glucosa con un analizador Select Biochemisty de YSI Yellow Con este la glucosa se mantuvo en exceso con adiciones manuales de una solución al 50 El medio usado para las fermentaciones se preparó de la siguiente antes de la se transfirió al termentador 520 mi de agua con g de sulfato de g de fosfato monobásico de g de sulfato de magnesio heptahidratado y mi de Antifoam 204 de Los termentadores se esterilizaron a 121 durante 30 Después del enfriado al punto definido de 30 se agregaron ingredientes posteriores a la esterilización de manera aséptica por medio de una Los ingredientes posteriores a la esterilización se preparan en un volumen total de 200 mi de una solución de minerales traza en 1 litro de 15 g de g de sulfato de zinc g de cloruro de manganeso g de cloruro de cobalto g de sulfato de cobre g de disódico g de cloruro cálcico 3 g de sulfato de hierro 1 g de ácido g de yoduro de una mezcla vitamínica 1 litro de 50 mg de 1 g de pantotenato de 1 g de ácido 25 g de 1 g de clorhidrato de g de ácido 16 g de 3 mi de mg de mg de g de suplementos de medio selectivo deficiente sintético de levadura sin triptófano y uracilo y clorhidrato de se agregaron en las cantidades indicadas en la Tabla 1 para una fermentación y agua desionizada para llevar el volumen a 200 la solución se esterilizó por filtración antes de adicionarse al El volumen final del después de la fue 800 Las mediciones de isobutanol y otros subproductos de fermentación en el sobrenadante del cultivo se realizaron por con el uso de una columna ad Aminex Estados con detectores del índice de refracción y una matriz de diodos con un HPLC de la serie 1100 de Agilent EE Se logró la separación cromatográfica mediante el uso de N como fase móvil con un índice de flujo de y una temperatura de columna de 40 Se extrajeron muestras de la trampa de agua al final de la fermentación y se analizaron con el mismo método de Se el peso de agua en la trampa para determinar la cantidad total de isobutanol y etanol extraídos del La concentración de glucosa en la botella de alimentación se determinó con un refractómetro RE 40 de Mettler Toledo EE a 20 Los rendimientos informados se basan sobre la glucosa El rendimiento de isobutanol incluye isobutanol en el caldo de fermentación y en la trampa de agua en la última La Figura 2 muestra los rendimientos molares de isobutanol y cetoisovalerato para cada cepa en cada concentración de La Figura 3 muestra la concentración de cetoisovalerato sobre el tiempo de fermentación para cada cepa en cada concentración de Tabla Diseño Todos los fermentadores se prepararon como se describió con las siguientes adiciones de tiamina y cepas Los resultados se dan para el final de la muestra de transcurridas horas del tiempo de fermentación a a 9 i 9 1 99 9 9 s fs 3 33 3 98 3 S s I 1 f fs S B 9B i 1 o o a S 3 3 9 3 3 8 5 S s s I f 99 M 99 9 f 39 99 39 1 II 99 99 99 9 S2 9 2 i s g 9 S n 9i 9 9 s 19 9 9 99 99 99 99 9 99 9 9 99 9 9 9 9 8 3 8 ?5 8 O O O ft s g 3 s s s 8 S S P s 9 S9 i 9 19 1 1 1 19 9 19 19 9 1 19 li 1 19 2 5 2 s 9 8 a s s 1 1 la la n la a la 3 fi lt E 1 19 19 9 99 1 P 99 19 i9 1 Is s J 3 S 5 3 s s a o o o 99 1 I 9 99 99 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Claims (18)

REIVINDICACIONES : Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para convertir -cetoisovalerato en isobutiraldehído, caracteruizado porque comprende a. proporcionar un polipéptido, donde el polipéptido comprende al menos uno de: (i) al menos 80 % de identidad con la sec . con núm. de ident . : 51, 52, 53, 55, 56, 58, 59, 61 o 63 o un fragmento activo de esta; o (ii) actividad a-cetoisovalerato descarboxilasa, una relación de especificidad para a-cetoisovalerato con respecto a piruvato mayor que 1, y una constante de activación del cofactor de tiamina difosfato (Kc) de aproximadamente 20 µ? o menor; y b. poner en contacto el polipéptido con a-cetoisovalerato en condiciones para producir isobutiraldehído.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además el polipéptido tiene un valor E del perfil HMM del grupo KIVD menor que 1E-223 mediante el uso del programa hmmsearch.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque además el contacto se produce dentro de una célula huésped recombinante y dondeel polipéptido es heterólogo para la célula huésped recombinante.

4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque además la célula huésped recombinante es un miembro de los géneros Clostridium, Zymomonas, Escherichia , Salmonella, Serrati , Erwinia, Klebsiella, Shigella , Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrojbacter, Corynejbacterium, Brevibacterium, Schizosaccharomyces, Issatchenkia, Kluyveromyces, Yarrowia, Pichia, Candida, Hansen la, o Saccharomyces .

5. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque además la célula huésped recombinante es Saccharomyces cerevisiae .

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, caracterizado porque además la célula huésped recombinante comprende, polinucleótidos heterólogos que codifican polipéptidos que catalizan las conversiones de sustratos en productos: (a) piruvato en acetolactato; (b) acetolactato en 2 , 3 -dihidroxiisovalerato ; y (c) 2,3-dihidroxiisovalerato en 2 -cetoisovalerato .

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque además la célula huésped comprende un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido que cataliza la conversión de sustratos en productos de isobutiraldehído a isobutanol.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-7, caracterizado porque además la célula huésped recombinante comprende, actividad piruvato descarboxilasa reducida o eliminada.

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-8, caracterizado porque además la célula huésped comprende, al menos una supresión, mutación y/o sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis de centros Fe-S.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-9, caracterizado porque además la célula huésped recombinante comprende la supresión de fra.2.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3-10, caracterizado porque además la célula huésped recombinante comprende actividad glicerol-3 -fosfato deshidrogenasa .

12. Un método para producir isobutanol; caracterizado porque comprende: a. proporcionar una célula huésped recombinante que comprende una ruta de producción de isobutanol; la ruta de producción comprende un polipéptido, donde el polipéptido comprende al menos uno de : (i) al menos 80 % de identidad con la sec. con núm. de ident . : 51, 52, 53, 55, 56, 58, 59, 61 o 63 o un fragmento activo de esta; o (ii) actividad a-cetoisovalerato descarboxilasa, una relación de especificidad para a-cetoisovalerato con respecto a piruvato mayor que 1, y una constante de activación del cofactor de tiamina difosfato (Kc) de aproximadamente 20 µ? o menor; y b. poner en contacto la célula huésped recombinante con un sustrato de carbono en condiciones mediante las cuales se produce isobutanol.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque además el polipéptido tiene un valor E del perfil HMM del grupo KIVD menor que 1E-223 mediante el uso del programa hmmsearch.

14. El método de conformidad con la reivindicación 12 o 13, caracterrizado porque además comprende, aislar el isobutanol con extracción líquido-líquido.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque además el agente extractor se selecciona del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a 22i ácidos grasos de C12 a C22, ásteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de C12 a C22; y mezclas de estos.

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado porque además la célula huésped recombinante es Saccharomyces cerevisiae.

17. Un método para producir isobutanol, caracterizado porque comprende a. proporcionar una célula huésped recombinante que comprende un isobutanol biosintético que comprende un polipéptido que tiene al menos 80 % de identidad con la sec. con núm. de ident . : 52 o 61; y b. poner en contacto la célula huésped recombinante con un sustrato de carbono en condiciones mediante las cuales se produce isobutanol .

18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque además el contacto se produce en presencia de menos de aproximadamente 30 g/1 de tiamina.