JP6371427B2 - ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ酵素およびその使用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、米国エネルギー省により裁定された契約DE−AR0000006の下で政府支援により行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
本出願は、参照によって本明細書中に援用される2011年7月28日に出願された米国仮特許出願第61/512,866号明細書に関連し、それに対する優先権の権利を主張する。
本方法は、(a)(i)配列番号51、52、53、55、56、58、59、61もしくは63またはこれらの活性断片に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の同一性、あるいは(ii)α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性、約1よりも大きいα−ケトイソバレレートのピルベートに対する特異性比、および約20μM以下のチアミン二リン酸補因子活性化定数(Kc)のうちの少なくとも1つを含むポリペプチドを提供するステップと、(b)イソブチルアルデヒドが産生される条件下で、前記ポリペプチドをα−ケトイソバレレートと接触させるステップとを含む。実施形態において、ポリペプチドは、配列番号51、52、53、55、56、58、59、61または63のアミノ酸配列を含む。実施形態において、ポリペプチドは、リステリア・グレイ(Listeria grayi)またはマクロコッカス・カセオリチクス(Macrococcus caseolyticus)からの配列を含む。実施形態において、ポリペプチドは、配列番号58または61のアミノ酸配列を含む。実施形態において、接触は、約30mg/L未満、約20mg/L未満、または約10mg/L未満のチアミンの存在下で生じる。実施形態において、接触は組換え宿主細胞内で生じ、ポリペプチドは組換え宿主細胞にとって異種である。実施形態において、組換え宿主細胞は、クロストリジウム(Clostridium)属、ザイモモナス(Zymomonas)属、エシェリキア(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、セラチア(Serratia)属、エルウィニア(Erwinia)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、シゲラ(Shigella)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、バチルス(Bacillus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、パエニバチルス(Paenibacillus)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、イサタケンキア(Issatchenkia)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ピキア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、またはサッカロミセス(Saccharomyces)属の一員である。実施形態において、組換え宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、基質から産物への変換:(a)ピルベートからアセトラクテートへの変換、(b)アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、および(c)2,3−ジヒドロキシイソバレレートから2−ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、宿主細胞はさらに、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、低下または除去されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子において少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はfra2の欠失を含む。実施形態において、組換え宿主細胞は、低下または除去されたグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を含む。
および約20μM以下のチアミン二リン酸補因子活性化定数(Kc)のうちの少なくとも1つを含むステップと、(b)イソブタノールが産生される条件下で、組換え宿主細胞を炭素基質と接触させるステップとを含む、イソブタノールの製造方法も提供されている。実施形態において、ポリペプチドは、配列番号51、52、53、55、56、58、59、61または63のアミノ酸配列を含む。実施形態において、ポリペプチドは、リステリア・グレイ(Listeria grayi)またはマクロコッカス・カセオリチクス(Macrococcus caseolyticus)からの配列を含む。実施形態において、ポリペプチドは、hmmsearchプログラムを用いるKIVDクラスタープロファイルHMMのE値が1E−223未満である。実施形態において、本方法はさらにイソブタノールを単離するステップを含み、実施形態では、単離は液液抽出を含む。実施形態において、液液抽出のための抽出剤は、C12〜C22脂肪アルコール、C12〜C22脂肪酸、C12〜C22脂肪酸のエステル、C12〜C22脂肪アルデヒド、およびこれらの混合物を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。実施形態において、本明細書において提供されるイソブタノールの製造方法は、(a)配列番号52または61に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の同一性を有するポリペプチドを含むイソブタノール生合成を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、(b)イソブタノールが産生される条件下で、組換え宿主細胞を炭素基質と接触させるステップとを含む。実施形態において、接触は、約30g/L未満のチアミンの存在下で生じる。
本明細書と共に電子出願され、参照によってその全体が本明細書中に援用される表Zは、本明細書において記載されるKIVDクラスタープロファイルHMMである。表Zは本明細書の一部を形成する。
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本出願が支配するであろう。また、文脈によって他に要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書において言及される全ての刊行物、特許および他の参考文献は、全ての目的のためにその全体が参照によって援用される。
たは「からなる(consist of)」もしくは「からなっている(consisting of)」などの変化形は、本明細書および特許請求の範囲を通じて使用される場合、列挙される任意の完全体または完全体のグループの包含を示すが、指定の方法、構造、または組成物に付加的な完全体または完全体のグループを追加することはできない。
Nomenclature 1992,Academic Press,San Diego)。
指す。本明細書では、特定のアミノ酸を同定するために以下の略語が使用される。
片が同一のターミネーター活性を有し得ることが認識される。例えば、「CYC1ターミネーター」は、CYC1遺伝子のターミネーター領域に由来する断片を指すために使用可能であることが理解されるであろう。
。
Packageにおける「EditSeq」機能、InforMax,Inc.(Bethesda,MD)から入手可能なVectorNTI Suiteにおける折り返し翻訳(backtranslation)機能、およびAccelrys,Inc.(S
an Diego,CA)から入手可能なGCG−Wisconsin Packageにおける「backtranslate」機能である。所与の頻度に基づいてコドンを割り当てるために基本的なアルゴリズムを構築することも、基本的な数学関数を用いて当業者により容易に達成され得る。コドン最適化コード領域は、「synthetic gene designer」(userpages.umbc.edu/〜wug1/codon/sgd/、2012年3月19日訪問)などのソフトウェアパッケージを含む、当業者に知られている種々の方法によって設計することができる。
ポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、このような配列のストリング間の一致によって決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、1.)Computational Molecular Biology(Lesk,A.M.,Ed.)Oxford University:NY(1988)、2.)Biocomputing:Informatics and Genome Projects(Smith,D.W.,Ed.)Academic:NY(1993)、3.)Computer Analysis of Sequence Data,Part
I(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,Eds.)Humania:NJ(1994)、4.)Sequence Analysis in Molecular Biology(von Heinje,G.,Ed.)Academic(1987)、および5.)Sequence Analysis Primer(Gribskov,M.and Devereux,J.,Eds.)Stockton:NY(1991)に記載される方法を含むが、これらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる。
e Publishing Assoc.and Wiley−Interscienceによる出版)(1987)によって記載されている。本明細書で使用される付加的な方法は、Methods in Enzymology,Volume 194,Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology(Part A,2004,Christine Guthrie
and Gerald R.Fink(Eds.),Elsevier Academic Press,San Diego,CA)中にある。その他の分子手段および技術は当該技術分野において既知であり、重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるスプライシング(Yu,et al.(2004)Fungal Genet.Biol.41:973−981)、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)のURA3座位における突然変異の正の選択(Boeke,J.D.et al.(1984)Mol.Gen.Genet.197,345−346、M A Romanos,et al.Nucleic Acids Res.1991
January 11;19(1):187)、cre−lox部位特異的組換え系ならびに突然変異体lox部位およびFLP基質突然変異(Sauer,B.(1987)Mol Cell Biol 7:2087−2096、Senecoff,et al.(1988)Journal of Molecular Biology,Volume 201,Issue 2,Pages 405−421、Albert,et al.(1995)The Plant Journal.Volume 7,Issue
4,pages 649−659)、「シームレス」遺伝子欠失(Akada,et al.(2006)Yeast;23(5):399−405)、およびギャップ修復法(Ma et al.,Genetics 58:201−216;1981)が含まれる。
ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ(KIVD)のタンパク質ファミリーのメンバーは、L.ラクティス(L.lactis)KivD(アルファ−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ)(配列番号68)、L.ラクティス(L.lactis)KDCA(分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ)(配列番号66)、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)IPDC(インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ)(配列番号257)のアミノ酸配列を用いて、NCBI非冗長性(nr)タンパク質データベースのNational Center for Biotechnology Information(NCBI、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、2012年7月27日訪問)BLAST検索により、以下の検索パラメータ:E値=10、ワードサイズ=3、マトリックス=Blosum62、ならびにギャップオープニング=11およびギャップエクステンション=1、10−3のE値カットオフで同定した。3回のblastの結果セットを結合し、同一であるか、またはその長さが712を超えるかもしくは583未満である配列を除去した。次に、プログラムCD−Hit(ダウンロード2007年1月、weizhong−lab.ucsd.edu/cd−hit/で入手可能、2012年7月25日訪問)を用いて、この結合した配列セットを配列間の最大同一性が65%であるセット(「nr65セット」)に縮小した。1184のKIVD配列のセットが得られた。
03、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、または416を含むポリペプチド(またはこれらもしくはその活性断片に対する少なくとも80%、85%、90%、95%、または98%の同一性を有するポリペプチド)を提供するステップと、イソブチルアルデヒドが産生される条件下で、前記ポリペプチドをα−ケトイソバレレートと接触させるステップとを含む。いくつかの実施形態では、前記接触は組換え宿主細胞内で生じる。いくつかの実施形態では、前記宿主細胞は、イソブタノール生合成経路を含む。いくつかの実施形態では、組換え宿主細胞は、表4のポリペプチド、またはこれらもしくはその活性断片に対する少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書にはイソブタノールを製造するための方法が提供されており、本方法は、配列番号51、52、53、55、56、58、59、61、63、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、または416を含むポリペプチド(またはこれらもしくはその活性断片に対する少なくとも80%、85%、90%、95%、または98%の同一性を有するポリペプチド)を含む組換え宿主細胞を提供するステップと、イソブチルアルデヒドが産生される条件下で、前記ポリペプチドをα−ケトイソバレレートと接触させるステップとを含む。
HMMER(Janelia Farm Research Campus,Ashb
urn,VA)から利用可能であるユーザーガイドに従い、HMMERソフトウェアパッケージ(プロファイルHMMの背後にある理論は、R.Durbin,S.Eddy,A.Krogh,and G.Mitchison,Biological sequence analysis:probabilistic models of proteins and nucleic acids,Cambridge University Press,1998、Krogh et al.,1994、J.Mol.Biol.235:1501−1531に記載されている)を用いて、上記のそして表Zで提供される170配列のアミノ酸配列を分析した。HMMERソフトウェアプログラムの出力は、入力配列を特徴付けるプロファイル隠れマルコフモデル(プロファイルHMM)である。ユーザーガイドに記載されるように、プロファイルHMMは多重配列アライメントのコンセンサスの統計的記述である。これらは、アミノ酸(またはヌクレオチド)のための位置特異的なスコアと、挿入または欠失をオープンおよび伸長するための位置特異的なスコアとを使用する。他のプロファイルベースの方法と比較して、HMMは形式的な確率論的基準(formal probabilistic basis)を有する。多数のタンパク質ファミリーのためのプロファイルHMMは、PFAMデータベース(Janelia Farm Research Campus,Ashburn,VA)において公的に入手可能である。
デフォルトパラメータでClustal W(Thompson,J.D.,Higgins,D.G.,and Gibson T.J.(1994)Nuc.Acid Res.22:4673 4680)を用いて、上記のようなクラスター内の170の配列を整列させた。
デフォルトパラメータを用いて、整列された配列のセットにおいてhmmbuildプログラムを実行した。hmmbuildは多重配列アライメントファイルを読み込み、新しいプロファイルHMMを構築し、プロファイルHMMをファイルにセーブする。このプログラムを用いて、ステップ1に記載される170配列の多重配列アライメントから非較正プロファイルを発生させた。
ノ酸の出力確率は0.81であり得るが、他の19のアミノ酸のそれぞれに対しては0.01であり得る。
hmmcalibrateを用いてプロファイルHMMを読み込み、プロファイル(使用される合成配列のデフォルト数は5,000である)により多数の合成ランダム配列をスコア化し、これらのスコアのヒストグラムに極値分布(EVD)を適合させ、この時点でEVDパラメータを含んでいるHMMファイルを再度セーブする。これらのEVDパラメータ(μおよびλ)を使用して、プロファイルがタンパク質配列データベースに対して検索される場合に、ビットスコアのE値を計算する。hmmcalibrateは、「EVD」とラベル化されたラインにおいてHMMファイルに2つのパラメータを書き込み、これらのパラメータは、SWISS−PROTとほぼ同じ長さおよび残基組成のランダムに発生された配列において計算されたスコアのヒストグラムに最良適合する極値分布(EVD)のμ(位置)およびλ□(スケール)パラメータである。この較正は、プロファイルHMMに対して1回行った。
hmmfileからプロファイルHMMを読み込み、有意に類似の配列一致について配列ファイルを検索するhmmsearchを用いてプロファイルHMMを評価した。検索された配列ファイルは601の配列を含有していた(上記を参照)。検索の間、データベース(Zパラメータ)のサイズを10億に設定した。このサイズ設定は、現在のデータベースに対して有意なE値が、予測可能な将来において有意なままであり得ることを保証する。E値カットオフを10に設定した。
の配列全てを1E−223未満のE値と一致させた。この結果は、KIVDクラスターのメンバーが有意な配列類似性を共有することを示す。E値のカットオフE−223によるhmmer検索を用いて、KIVDを他のタンパク質から分離した。従って、hmmer検索を用いてKIVDクラスタープロファイルHMMのE値<1E−223を有するポリペプチドは、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を含む方法および組換え宿主細胞などの、本明細書において提供される実施形態のための適切な候補であると考えられる。
Chemistry、34(2006)325−336)は、基質結合ポケットを形成すると思われる残基として残基Ser286、Phe381、Val461、およびMet358を同定する、L.ラクティス(L.lactis)からのKdcAの構造の相同性モデルを開発し、Smitら(Appl.Environ.Microbiol.(2005)71:303−311)は、KdcAのアミノ酸配列を、2つの脱炭酸酵素、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)のインドールピルビン酸デカルボキシラーゼおよび酵母ピルビン酸デカルボキシラーゼ(X線結晶構造解析によって研究されている)と整列させた。
発酵培地などの反応媒体中に補充され得るビタミン形態である。細胞内に輸送されると、チアミンはチアミン二リン酸へ変換されるであろう。さらに、本明細書中で開示されるケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性を有する特定のポリペプチドは、配列番号68を有するラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)ポリペプチドと比べて増大したTPPに対する親和性を有し、従って、利点を提供し得る。例えば、本明細書において提供されるポリペプチドは、コストおよびプロトコルの複雑さを低下させる可能性のある、少量または低下したチアミンの条件下で、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒するために有用であり得る。実施形態において、このようなポリペプチドは、配列番号51、52、53、55、56、58、59、61、もしくは63またはこれらの活性断片のいずれか1つに対して、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約99%の同一性を含む。いくつかの実施形態では、このようなポリペプチドは、それぞれリステリア・グレイ(Listeria grayi)、マクロコッカス・カセオリチクス(Macrococcus caseolyticus)、またはラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)からのkivD81、Mca、もしくはkdcAの配列またはこれらの活性断片を含む。いくつかの実施形態では、このようなポリペプチドは、配列番号52、61、もしくは66またはこれらの活性断片に対して少なくとも約80%の同一性を含む。いくつかの実施形態では、このようなポリペプチドは、配列番号52もしくは61またはこれらの活性断片に対して少なくとも約80%の同一性を含む。
本明細書に記載される宿主細胞の遺伝子操作は、標準的な遺伝子技術およびスクリーニングを用いて実施することができ、遺伝子操作に適した任意の宿主細胞において行うことができる(Methods in Yeast Genetics,2005,Cold
Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.201−202)。実施形態において、本明細書中で開示される組換え宿主細胞は、遺伝子修飾および組換え遺伝子発現に有用な任意の細菌、酵母または真菌宿主であり得る。他の実施形態では、組換え宿主細胞は、クロストリジウム(Clostridium)属、ザイモモナス(Zymomonas)属、エシェリキア(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、セラチア(Serratia)属、エルウィニア(Erwinia)属、クレブシエラ(Kleb
siella)属、シゲラ(Shigella)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、バチルス(Bacillus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、パエニバチルス(Paenibacillus)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、イサタケンキア(Issatchenkia)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ピキア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、またはサッカロミセス(Saccharomyces)属の一員であり得る。他の実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、クルイベロミセス・サーモトレランス(Kluyveromyces thermotolerans)、クルイベロミセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、ピキア・スティピティス(Pichia stipitis)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、大腸菌(E.coli)、またはL.プランタルム(L.plantarum)であり得る。さらに他の実施形態では、宿主細胞は酵母宿主細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はサッカロミセス(Saccharomyces)属の一員である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)またはシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)である。いくつかの実施形態では、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。S.セレビシエ(S.cerevisiae)酵母は当該技術分野において知られており、American Type Culture Collection(Rockville,MD)、Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal
Biodiversity Centre、LeSaffre、Gert Strand AB、Ferm Solutions、North American Bioproducts、Martrex、およびLallemを含むがこれらに限定されない様々な供給元から入手可能である。S.セレビシエ(S.cerevisiae)としては、BY4741、CEN.PK113−7D、Ethanol Red(登録商標)酵母、Ferm ProTM酵母、Bio−Ferm(登録商標)XR酵母、Gert Strand Prestige Batch Turboアルコール酵母、Gert Strand Pot Distillers酵母、Gert Strand Distillers Turbo酵母、FerMaxTMgreen酵母、FerMaxTMGold酵母、Thermosacc(登録商標)酵母、BG−1、PE−2、CAT−1、CBS7959、CBS7960、およびCBS7961が挙げられるが、これらに限定されない。
and Molecular and Cell Biology(Part A,2004,Christine Guthrie and Gerald R.Fink(Eds.),Elsevier Academic Press,San Diego,
CAを参照)。実施形態において、発現されるα−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ酵素のコード領域は、当業者によく知られているように、標的宿主細胞のためにコドン最適化され得る。組換え宿主細胞(酵母細胞を含むが、これに限定されない)における遺伝子の発現は、対象のコード領域に作動可能に連結されたプロモーター、および転写ターミネーターを必要とし得る。酵母における使用に適した以下の構成的プロモーター:FBA1、TDH3(GPD)、ADH1、およびGPM1、ならびに酵母における使用に適した以下の誘導性プロモーター:GAL1、GAL10およびCUP1を含むがこれらに限定されないいくつかのプロモーターを、遺伝子の発現カセットの構築において使用することができる。その他の酵母プロモーターとしては、ハイブリッドプロモーターUAS(PGK1)−FBA1p(配列番号228)、UAS(PGK1)−ENO2p(配列番号229)、UAS(FBA1)−PDC1p(配列番号230)、UAS(PGK1)−PDC1p(配列番号231)、およびUAS(PGK)−OLE1p(配列番号232)が挙げられる。発現のためのキメラ遺伝子構築物において使用可能な適切な転写ターミネーターには、FBA1t、TDH3t、GPM1t、ERG10t、GAL1t、CYC1t、およびADH1tが含まれるがこれらに限定されない。
線化ベクターの3’端部との間には、少なくとも21bpのオーバーラップ配列が存在する。次に、「ギャップ」ベクターおよび挿入DNAは酵母株に同時形質転換され、プラスミド上の栄養選択マーカーの相補性を可能にする適切な化合物の混合物を含有する培地にプレーティングされる。正しい挿入断片の組み合わせの存在は、選択された細胞から調製されるプラスミドDNAを用いて、PCRマッピングにより確認することができる。次に、酵母(通常、低濃度)から単離されたプラスミドDNAを、大腸菌(E.coli)株、例えばTOP10に形質転換した後、ミニプレップおよび制限酵素マッピングを行い、プラスミド構築物をさらに検証することができる。最後に、構築物を配列分析によって検証することができる。
本明細書中で開示される組換え宿主細胞におけるα−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性の存在は、当該技術分野において既知のルーチン方法を用いて確認することができる。非限定的な実施例において、そして本明細書中の実施例において記載されるように、形質転換体は、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ遺伝子に対するプライマーを用いるPCRによってスクリーニングすることができる。別の非限定的な例では、そして本明細書中の実施例において記載されるように、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性は、本明細書中で開示される内因性α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性が欠けている組換え宿主細胞において、本明細書中で開示されるα−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ酵素を発現させることによってアッセイされ得る。別の非限定的な例では、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性は、生合成経路内のイソブチルアルデヒドの下流の産物を測定するなどのより間接的な方法によって確認することができる。別の非限定的な例では、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性は、補因子の消失を測定することによって、あるいは生合成経路内のイソブチルアルデヒドの下流のステップのための補因子の消失を測定することによって、例えば、本明細書および/または当該技術分野において記載される結合アッセイ(例えば、Zhang et al.,PNAS(2008)105(52):20653−20658を参照)によって確認することができる。別の非限定的な例では、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性は、本明細書に記載されるアルデヒド特異的Purpald(登録商標)比色酵素アッセイにより、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換率を決定することによって確認することができる。別の非限定的な例では、α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性は、当該技術分野において既知の方法を用いてα−ケトイソバレレートの消失を測定することによって確認することができる(例えば、de la Plaza,et al.FEMS Mi
crobiol Letters(2004)238:367−374を参照)。
al.(Adv.Synth.Catal.2007,349,1425−1435)において記載されている種々のTPP濃度で実行されるウマ肝臓ADH(hADH)結合酵素アッセイにおいて測定され得る。比活性は次にTPP濃度に対してプロットされる。得られた曲線は次に、Kaleidagraph(Synergy)などのソフトウェアを用いて、飽和式SA=(SAmax *[TPP])/(Kc+[TPP])+C(式中、SAは比活性であり、SAmaxは最大比活性であり、Kcは補因子活性化定数であり、[TPP]はTPPの濃度であり、そしてCはTPPが添加されない場合の活性である)に当てはめられ、補因子活性化定数(Kc)を決定することができる。ポリペプチドのTPP親和性は、Changら(Biochem.J.(1999)339:255−260)で記載されるように、蛍光消光法によって測定することもできる。
0よりも大きい、約150よりも大きい、または約200よりも大きいα−ケトイソバレレートのピルベートに対する特異性比、および約100μM、約50μM、または約20μM以下のチアミン二リン酸補因子活性化定数(Kc)のうちの少なくとも1つを含むポリペプチドを提供するステップと、(b)イソブチルアルデヒドが産生される条件下で、前記ポリペプチドをα−ケトイソバレレートと接触させるステップとを含む。実施形態において、本方法は、(a)配列番号51、52、53、55、56、58、59、61もしくは63またはこれらの活性断片に対する少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性、およびα−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を含むポリペプチドを提供するステップと、(b)イソブチルアルデヒドが産生される条件下で、前記ポリペプチドをα−ケトイソバレレートと接触させるステップとを含む。実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号52もしくは61またはこれらの活性断片に対する少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性を含む。実施形態において、本方法は、(a)α−ケト酸デカルボキシラーゼ活性、約1よりも大きい、約10よりも大きい、約100よりも大きい、約150よりも大きい、約200よりも大きいα−ケトイソバレレートのピルベートに対する特異性比、および約100μM、約50μM、または約20μM以下のチアミン二リン酸補因子活性化定数(Kc)を含むポリペプチドを提供するステップと、(b)イソブチルアルデヒドが産生される条件下で、前記ポリペプチドをα−ケトイソバレレートと接触させるステップとを含む。実施形態において、接触は、約10mg/L未満のチアミンの存在下で生じる。実施形態において、接触は、約30mg/L未満のチアミン、約20mg/L未満のチアミン、または約5mg/L未満のチアミンの存在下で生じる。実施形態において、接触は、約1〜約10mg/Lのチアミン、約5〜約20mg/Lのチアミン、約10〜約15mg/Lのチアミン、約5〜約15mg/Lのチアミン、約5〜約10mg/Lのチアミン、または約1〜約5mg/Lのチアミンの存在下で生じる。実施形態において、接触は組換え宿主細胞内で生じ、ポリペプチドは、組換え宿主細胞にとって異種である。実施形態において、組換え宿主細胞は、クロストリジウム(Clostridium)属、ザイモモナス(Zymomonas)属、エシェリキア(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、セラチア(Serratia)属、エルウィニア(Erwinia)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、シゲラ(Shigella)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、バチルス(Bacillus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、パエニバチルス(Paenibacillus)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、イサタケンキア(Issatchenkia)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ピキア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、またはサッカロミセス(Saccharomyces)属の一員である。実施形態において、組換え宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、基質から産物への変換:(a)ピルベートからアセトラクテートへの変換、(b)アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、および(c)2,3−ジヒドロキシイソバレレートから2−ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、宿主細胞はさらに、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、低下または除去されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子
において少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はfra2の欠失を含む。実施形態において、組換え宿主細胞は、低下または除去されたグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を含む。
本明細書には、イソブタノールの製造方法が提供されている。実施形態において、本方法は、(a)イソブタノール生合成経路およびポリペプチドを含む宿主細胞を提供するステップであって、前記ポリペプチドが、i)配列番号51、52、53、55、56、58、59、61、もしくは63またはこれらの活性断片に対する少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の同一性同一性、およびα−ケト酸デカルボキシラーゼ活性、あるいは(ii)α−ケト酸デカルボキシラーゼ活性、約1よりも大きい、約10よりも大きい、約100よりも大きい、約150よりも大きい、または約200よりも大きいα−ケトイソバレレートのピルベートに対する特異性比、および約100μM、約50μM、または約20μM以下のチアミン二リン酸補因子活性化定数(Kc)のうちの少なくとも1つを含むステップと、(b)イソブタノールが産生される条件下で、宿主細胞を発酵性炭素基質と接触させるステップとを含む。実施形態において、接触は、約10mg/L未満のチアミンまたは約1mg/L未満のチアミンの存在下で生じる。実施形態において、組換え宿主細胞は、クロストリジウム(Clostridium)属、ザイモモナス(Zymomonas)属、エシェリキア(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、セラチア(Serratia)属、エルウィニア(Erwinia)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、シゲラ(Shigella)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、バチルス(Bacillus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、パエニバチルス(Paenibacillus)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、イサタケンキア(Issatchenkia)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ピキア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、またはサッカロミセス(Saccharomyces)属の一員である。実施形態において、組換え宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、基質から産物への変換:(a)ピルベートからアセトラクテートへの変換、(b)アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、および(c)2,3−ジヒドロキシイソバレレートから2−ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、宿主細胞はさらに、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、低下または除去されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらに、Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子において少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む。実施形態において、組換え宿主細胞はさらにfra2の欠失を含む。実施形態において、組換え宿主細胞は、低下または除去されたグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を含む。実施形態において、イソブタノールは、配列番号68を含むが(i)も(ii)も含まないポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む類似の宿主細胞によって産生されるよりも高い有効収率で産生される。
61もしくは63またはこれらの活性断片に対する少なくとも約80%の同一性を含む、α−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの基質から産物への変換を触媒する異種ポリペプチド、あるいは(i)の異種ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞も提供される。実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号51、52、53、55、56、58、59、61もしくは63またはこれらの活性断片に対する少なくとも約95%の同一性を含む。実施形態において、宿主細胞はさらに、基質から産物への変換:(a)ピルベートからアセトラクテートへの変換、(b)アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、(c)2,3−ジヒドロキシイソバレレートから2−ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、宿主細胞はさらに、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から産物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。実施形態において、基質から産物への変換を触媒するポリペプチドはそれぞれ、宿主細胞にとって天然ではない。実施形態において、組換え宿主細胞は、低下または除去されたピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を含む。実施形態において、組換え宿主細胞は、Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内因性遺伝子において少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む。実施形態において、組換え宿主細胞は、クロストリジウム(Clostridium)属、ザイモモナス(Zymomonas)属、エシェリキア(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、セラチア(Serratia)属、エルウィニア(Erwinia)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、シゲラ(Shigella)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、バチルス(Bacillus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、パエニバチルス(Paenibacillus)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、イサタケンキア(Issatchenkia)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ピキア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、またはサッカロミセス(Saccharomyces)属の一員である。実施形態において、組換え宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である。
使用され得るイソブタノールの産生のための生合成経路は、米国特許第7,851,188号明細書、米国特許第7,889,993号明細書、および米国特許第8,178,328号明細書(全て、参照によって本明細書中に援用される)に記載されるものを含む。1つのイソブタノール生合成経路は、以下の基質から産物への変換を含む:
− 例えばアセト乳酸シンターゼによって触媒され得るピルベートからアセトラクテートへの変換、
− 例えばアセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒され得るアセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、
− 例えばアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒され得る2,3−ジヒドロキシイソバレレートからα−ケトイソバレレートへの変換、
− 例えば分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒され得るα−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換、および
− 例えば分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒され得るイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換。
ピルベート利用生合成経路におけるステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドの組込みが含まれる。その他の修飾には、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換が含まれる。実施形態において、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisae)のYMR226C(配列番号236)またはその相同体である。付加的な修飾には、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよび/またはアルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける欠失、突然変異、および/または置換が含まれる。実施形態において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)からのALD6(配列番号233)またはその相同体である。酵母産生宿主細胞がpdc−である場合にグルコース抑制を低減する効果を有する遺伝子修飾は、参照によって本明細書中に援用される米国特許出願公開第20110124060号明細書に記載されている。
本明細書に開示される組換え宿主細胞は、適切な炭素基質を含有する発酵培地中で増殖される。追加的な炭素基質は、グルコースやフルクトースなどの単糖、ラクトース、マルトース、ガラクトース、もしくはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンもしくはセルロースなどの多糖類、またはこれらの混合物と、チーズ乳清透過物、コーンスティープリカー、サトウダイコン糖蜜、および大麦モルトなどの再生可能な原料からの未精製混合物とを含むことができるが、これらに限定されない。その他の炭素基質としては、エタノール、ラクテート、スクシネート、またはグリセロールが挙げられる。
通常、細胞は、適切な培地中、約20℃〜約40℃の範囲の温度で増殖される。本発明における適切な増殖培地は、Luria Bertani(LB)ブロス、Sabouraud Dextrose(SD)ブロス、Yeast Medium(YM)ブロス、または酵母窒素ベース、硫酸アンモニウム、およびデキストロース(炭素/エネルギー源として)を含むブロス、またはYPD培地(ほとんどのサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株を増殖させるために最適な割合のペプトン、酵母抽出物、およびデキストロースのブレンド)などの一般的な市販の培地を含む。その他の定義された増殖培地または合成増殖培地も使用することができ、特定の微生物の増殖のための適切な培地は、微生物学または発酵科学の当業者には分かるであろう。異化産物抑制を直接または間接的に調節することが知られている薬剤、例えば環状アデノシン2’:3’−一リン酸塩の使用も発酵培地中に組み込むことができる。
イソブタノールまたは他の産物は、バッチ発酵方法を用いて産生することができる。古典的なバッチ発酵は閉鎖系であり、培地の組成は発酵の最初に設定され、発酵は人為的な変更を受けない。標準的なバッチ系の変化形は、流加系である。流加発酵プロセスも本発明において適切であり、発酵が進行するにつれて基質が徐々に添加される点以外は典型的なバッチ系を含む。流加系は、異化産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にある場合、および培地中の基質の量が制限されることが望ましい場合に有用である。バッチ発酵および流加発酵は一般的であり、当該技術分野においてよく知られており、その例は、Thomas D.Brock in Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology,Second Edition(1989)Sinauer Associates,Inc.,Sunderland,MA.,or Deshpande,Mukund V.,Appl.Biochem.Biotechnol.,36:227,(1992)において見出すことができる。
バイオ産生されたイソブタノールは、ABE発酵のための当該技術分野において既知の方法を用いて、発酵培地から単離することができる(例えば、Durre,Appl.Microbiol.Biotechnol.49:639−648(1998),Groot et al.,Process.Biochem.27:61−75(1992)、およびその中の参考文献を参照)。例えば、固体は、遠心分離、ろ過、デカンテーションなどによって発酵培地から除去され得る。次に、イソブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸発、またはパーベーパレイションなどの方法を用いて発酵培地から単離され得る。
レイン酸メチル、ウンデカナール、ラウリン酸アルデヒド、20−メチルウンデカナール、およびこれらの混合物などの外因性有機抽出剤であり得る。
pYZ090(配列番号69)は、ALSの発現のために、酵母CUP1プロモーター(nt2−449)、続いてCYC1ターミネーター(nt2181−2430)から発
現されるバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)からのalsS遺伝子のコード領域(nt位置457−2172)を有するキメラ遺伝子と、KARIの発現のために、酵母ILV5プロモーター(2433−3626)、続いてILV5ターミネーター(nt4682−5304)から発現されるラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)(nt3634−4656)からのilvC遺伝子のコード領域を有するキメラ遺伝子とを含有するように構築した。
cerevisiae)BY4741(Research Genetics Inc.)株のゲノムDNAから、上部プライマー5’−catcatcacagtttaaacagtatgttgaagcaaatcaacttcggtgg−3’(配列番号248)および下部プライマー5’−ggacgggccctgcaggccttattggttttctggtctcaactttctgac−3’(配列番号249)を用いてPCR産物を増幅し、PmeIおよびSfiI酵素により消化した。pYZ058を配列決定により確認した。pLH550(pHR81−PCUP1−AlsS−PILV5−Pf5.KARI)はpYZ058に由来した。野生型Pf5.KARI遺伝子をOT1349(5’−catcatcacagtttaaacagtatgaaagttttctacgataaagactgcgacc−3’(配列番号250))およびOT1318(5’−gcacttgataggcctgcagggccttagttcttggctttgtcgacgattttg−3’(配列番号251))によりPCR増幅し、PmeIおよびSfiI酵素により消化し、PmeIおよびSfiIにより切断されたpYZ058ベクターと連結させた。生成されたベクターpLH550を配列決定により確認した。pLH556は、SpeIおよびNotI酵素によりベクターを消化し、SpeIおよびNotI部位のためのオーバーラップ配列を含有するOT1383(5’−ctagtcaccggtggc−3(配列番号252))およびOT1384(5’−ggccgccaccggtga−3’(配列番号253))からアニーリングされたリンカーと連結させることによって、pLH550から得た。このクローニングステップは、機能性でない配列の上流160bp残基と共に、alsS遺伝子およびPCUP1プロモーターの大型断片をプラスミドから除去する。pLH556を配列決定により確認した。pLH702はpLH556に由来した。PmeIおよびSfiI酵素を用いて、K9D3突然変異体KARI遺伝子を別のベクターから切除し、PmeIおよびSfiI部位でpLH556と連結させ、Pf5.KARI遺伝子をK9D3遺伝子で置換した。構築されたベクターpLH702を配列決定により確認した。
に構築した。pBP915は、kivD遺伝子およびkivDの上流のTDH3プロモーターの957塩基対を欠失させることによって、pLH468から構築した。pLH468をSwaIにより消化し、大型断片(12896bp)をアガロースゲルにおいて精製した後、Gel Extractionキット(Qiagen、Valencia,CA)により精製した。DNAの単離断片をT4DNAリガーゼにより自己連結させ、エレクトロコンピテントなTOP10エシェリキア・コリ(Escherichia coli)(Invitrogen、Carlsbad,CA)を形質転換するために使用した。形質転換体からのプラスミドを単離し、SwaI制限酵素による制限分析によって適切な欠失について検査した。また単離物は欠失部位にわたって配列決定した。適切な欠失を有するクローンをpBP915(pLH468ΔkivD、配列番号166)と命名した。
生物多様性検索(本明細書において上記で記載される)に基づいて、大腸菌(E.coli)(DNA2.0,Menlo Park,Calif)における発現のために最適化されたコドンを用いて9個の酵素をコードする遺伝子を合成した。ベクターpJexpress404(DNA2.0,Menlo Park,Calif)においてT5プロモーターの制御下で各遺伝子をクローン化し、大腸菌(E.coli)Top10(Invitrogen,San Diego,Calif)中で発現させた。100ugのアンピシリン/mLが補充され、30mg/Lのチアミンが補充されるか補充されないLB培地において37CでOD600nm=0.5まで振とうフラスコで増殖させた後、1mMのIPTGを添加し、培養物をさらに14〜16時間増殖させた。遠心分離によって細胞を回収し、SDS−PAGEによって異種タンパク質発現を確認した。
1回目の生物多様性検索からの酵素アッセイ結果に基づいて、大腸菌(E.coli)(DNA2.0,Menlo Park,Calif)における発現のために最適化されたコドンを用いて13個の付加的な酵素をコードする遺伝子(表6)を合成した。さらに、L.ラクティス(L.lactis)kivD(対照、配列番号1)をコードするコドン最適化遺伝子を調製した。ベクターpJexpress404(DNA2.0,Menlo Park,Calif)においてT5プロモーターの制御下で各遺伝子をクローン化し、大腸菌(E.coli)Top10(Invitrogen,San Diego,Calif)中で発現させた。100ugのアンピシリン/mLが補充され、30mg/Lのチアミンが補充されるか補充されないLB培地において37CでOD600nm=0.5まで振とうフラスコで増殖させた後、1mMのIPTGを添加し、培養物をさらに14〜16時間増殖させた。遠心分離によって細胞を回収し、SDS−PAGEによって異種タンパク質発現を確認した。
以下に記載される大腸菌(E.coli)無細胞抽出物の酵素アッセイによって、所望のα−ケトイソバレレート(αKIV)デカルボキシラーゼ活性を有する推定KIVD酵素を同定した。大腸菌(E.coli)における推定酵素の発現は、実施例1および2において詳述される。
大腸菌(E.coli)細胞を、3mLの100mMのHEPES、pH6.8、10mMのMgCl2中に懸濁させ、0℃において超音波処理により破壊した。マイクロチッププローブを用いて細胞を10秒間超音波処理し、25秒間静止させた。全部で2分間の超音波処理のためにこのサイクルを12回繰り返した。破壊細胞からの粗抽出物を遠心分離して、細胞片をペレット状にした。上清を除去し、アッセイされるまで氷上で貯蔵した。
無細胞抽出物中の全タンパク質濃度を、Coomassie Plus(Thermo
Scientific#23238、Rockford,Ill.)を用いてBradford Assayにより測定した。標準としてBSAを用いた。Cary 300分光光度計(Agilent Technologies,Wilmington Del.)を用いて595nmにおける吸光度を追跡することによってタンパク質の濃度を測定した。
Gocke,D.et al.(Adv.Synth.Catal.2007,349,1425−1435)において記載されているウマ肝臓ADH(hADH)共役酵素アッセイにおいてα−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒドへの変換率を測定した。無細胞抽出物のアッセイは、100mMのHEPES pH6.8、10mMのMgCl2、200μMのNADH、500μMのTPP、30mMのα−KIV(Sigma)、および0.45UのhADH(1mg=1.5U)(Sigma)を含有する緩衝液において30℃で実施した。Cary 300分光光度計(Agilent Technologies,Wilmington Del.)において1cm経路長キュベット中340nmで、NADHの酸化をモニターした。NADHに対して6220M−1cm−1のモル吸光係数を用いて酵素速度を計算した。種々の濃度のhADHおよび無細胞抽出物における対照によって、測定される速度がKIVD酵素活性によって決定されることを保証した。
高KIVD活性を有する3つの酵素のα−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド(isobutryaldehyde)への変換率は、DuPont−DurstおよびGokel(J.Chem Edu.1978,55,206)によって記載されているアルデヒド特異的Purpald(登録商標)(Sigma)比色酵素アッセイによっても測定した。無細胞抽出物のアッセイは、100mMのHEPES pH6.8、10mMのMgCl2、500μMのTPPおよび30mMのα−KIVを含有する緩衝液において30℃で実施した。全反応容積は1mLであった。固定された時点(0、10、20および30分)で200μLのアリコートを除去し、1mLのPurpald(登録商標)ストック溶液(2MのNaOH中5mg/mLのPurpald)中で反応を停止させることによって、イソブチルアルデヒドの形成をモニターした。次に、混合物を室温で20分間インキュベートして、発色を可能にした。インキュベーション工程中、混合物を5分ごとに混合した。0〜10mMのイソブチルアルデヒドの標準曲線を用いて、酵素により発生されるイソブチルアルデヒドの濃度を決定した。200μLの各標準物を作り、ゼロ時点で1mLのPurpald(登録商標)ストック溶液に添加した。標準物を室温で20分間インキュベートし、5分毎に混合した。Cary 300分光光度計(Agilent Technologies,Wilmington Del.)を用いて535nmにおける吸光度を測定した。測定された酵素活性および全タンパク質濃度から、大腸菌(E.coli)中で発現される推定KIVD酵素の比活性を計算した。
1回目および2回目からの最高活性を有する3つの推定KIVD酵素(KivD80、KivD81、およびMca)、L.ラクティス(L.lactis)KivDおよびKdcAを、大腸菌(E.coli)細胞の粗溶解物におけるTPP補因子活性化定数について評価した。大腸菌(E.coli)におけるこれらの酵素の発現は、実施例1および2で記載される。粗溶解物の生成およびタンパク質の定量化は、実施例3に記載されるように実施した。
Zeba Desalt Spin Columns(VWR PI89889)を用いてタンパク質を脱塩し、緩く結合したTPPを除去した。カラム調製は、製造業者の使用説明書に従って実施した。全ての遠心分離ステップは、1000xgで2分間実行した。最初の遠心分離ステップにより製造業者の貯蔵緩衝液を除去した。2mLの100mMのHEPES、pH6.8のカラムへの添加と、その後の遠心分離とからなる4回の洗浄ステップにより、細胞溶解物を脱塩するためにカラムを調製した。洗浄ステップが終了したら、カラムを新しい15mLのCorning管(VWR、21008−670)に入れ、600μLの細胞溶解物を脱塩カラムに添加し、遠心分離した。流出液を捕集し、TPP依存性のKivD活性について分析した。
Gocke,D.et al.(Adv.Synth.Catal.2007,349,1425−1435)において記載されているウマ肝臓ADH(hADH)共役酵素アッセイにおいてα−ケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド(isobutryaldehyde)への変換率を測定した。無細胞抽出物のアッセイは、100mMのHEPES pH6.8、10mMのMgCl2、200μMのNADH、30mMのα−KIV(Sigma)、および0.45UのhADH(1mg=1.5U)(Sigma)を含有する緩衝液において30℃で実施した。TPP濃度を変化させた。Cary 300分光光度計(Agilent Technologies,Wilmington Del.)において1cm経路長キュベット中340nmで、NADHの酸化をモニターした。NADHに対して6220M−1cm−1のモル吸光係数を用いて酵素速度を計算した。種々の濃度のhADHおよび無細胞抽出物における対照によって、測定される速度がKIVD酵素活性によって決定されることを保証した。
KIVD活性を有する酵素に対する配列相同性に基づいて、2回目の候補のうちの5つをさらに分析した。挿入のないベクターおよびMcaをそれぞれ負および正の対照として使用した。大腸菌(E.coli)における発現は、増殖培地に30mg/Lのチアミン塩酸塩(Sigma)を補充することを変更して実施例2に記載されるように実施した。粗抽出物を調製し、実施例3に記載されるようにアッセイした。SDS−PAGE分析により、大腸菌(E.coli)において不溶性タンパク質としてNpuが発現されることが示された。
2つの推定KIVD酵素(KivD81、Mca)、KdcAおよびLactis KivDを基質選択性について評価した。酵素のそれぞれをコードするプラスミド(例えば、プラスミドの説明については実施例1および2を参照)を単離し、大腸菌(E.coli)のエレクトロコンピテントなKEIOΔldh株(Open Biosystems,Huntsville,AL)に形質転換した。100ugのアンピシリン/mLが補充されたLB培地において30℃でOD600nm=0.5まで振とうフラスコで増殖させた後、1mMのIPTGを添加し、培養物をさらに14〜16時間増殖させた。粗細胞溶解物を以下のように生成させ、aKivおよびピルベートとの活性に関して推定KivD酵素を分析した。
大腸菌(E.coli)細胞を、3mLの100mMのHEPES、pH6.8、10mMのMgCl2中に懸濁させ、0℃において超音波処理により破壊した。プローブを用いて細胞を10秒間超音波処理し、25秒間静止させた。全部で2分間の超音波処理のた
めにこのサイクルを12回繰り返した。破壊細胞からの粗抽出物を遠心分離して、細胞片をペレット状にした。上清を除去し、アッセイされるまで氷上で貯蔵した。
無細胞抽出物中の全タンパク質濃度を、Coomassie Plus(Thermo
Scientific#23238、Rockford,Ill.)を用いてBradford Assayにより測定した。標準としてBSAを用いた。Cary 50分光光度計(Agilent Technologies,Wilmington Del.)を用いて595nmにおける吸光度を追跡することによってタンパク質の濃度を測定した。
Gocke,D.et al.(Adv.Synth.Catal.2007,349,1425−1435)において記載されているウマ肝臓ADH(hADH)共役酵素アッセイにおいてケトイソバレレートからイソブチルアルデヒド(isobutryaldehyde)への変換率を測定した。無細胞抽出物のアッセイは、100mMのHEPES pH6.8、10mMのMgCl2、200μMのNADH、500μMのTPP、および0.45UのhADH(1mg=1.5U)(Sigma)を含有する緩衝液において30℃で実施した。基質、ピルベート(Sigma)またはαKIV(Sigma)を種々の濃度で添加した。Cary 300分光光度計(Agilent Technologies,Wilmington Del.)において1cm経路長キュベット中340nmで、NADHの酸化をモニターした。NADHに対して6220M−1cm−1のモル吸光係数を用いて酵素速度を計算した。種々の濃度のhADHおよび無細胞抽出物における対照によって、測定される速度がKIVD酵素活性によって決定されることを保証した。
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株BP1064(PNY1503)の構築
株BP1064は、CEN.PK113−7D(CBS8340、Centraalbureau voor Schimmelcultures(CBS)Fungal B
iodiversiry Centre,Netherlands)に由来し、以下の遺伝子:URA3、HIS3、PDC1、PDC5、PDC6、およびGPD2の欠失を含有する。
内因性URA3コード領域を欠失させるために、ura3::loxP−kanMX−loxPカセットを、pLA54テンプレートDNA(配列番号72)からPCR増幅した。pLA54は、K.ラクティス(K.lactis)TEF1プロモーターおよびkanMXマーカーを含有し、loxP部位によって隣接されて、Creリコンビナーゼによる組換えおよびマーカーの除去を可能にする。PCRは、Phusion DNAポリメラーゼならびにプライマーBK505およびBK506(配列番号73および74)を用いて行った。各プライマーのURA3部分は、loxP−kanMX−loxPマーカーの組込みがURA3コード領域の置換をもたらすように、URA3プロモーターの上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域に由来した。標準遺伝子技術(Methods in Yeast Genetics,2005,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.201−202)を用いてPCR産物をCEN.PK113−7Dに形質転換し、G418(100μg/ml)を含有するYPDにおいて30℃で形質転換体を選択した。形質転換体をスクリーニングして、プライマーLA468およびLA492(配列番号75および76)を用いるPCRによって正しい組込みを検証し、CEN.PK113−7DΔura3::kanMXと命名した。
Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs,Ipswich,MA)と、Gentra Pu
regene Yeast/Bactキット(Qiagen,Valencia,CA)により調製したテンプレートとしてのCEN.PK113−7DゲノムDNAとを用いて、痕跡のないHIS3欠失のためのPCRカセットの4つの断片を増幅した。プライマーoBP452(配列番号77)と、HIS3断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP453(配列番号78)とを用いて、HIS3断片Aを増幅した。HIS3断片Aの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP454(配列番号79)と、HIS3断片Uの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP455(配列番号80)とを用いて、HIS3断片Bを増幅した。HIS3断片Bの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP456(配列番号81)と、HIS3断片Cの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP457(配列番号82)とを用いて、HIS3断片Uを増幅した。HIS3断片Uの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP458(配列番号83)と、プライマーoBP459(配列番号84)とを用いて、HIS3断片Cを増幅した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。HIS3断片AおよびHIS3断片Bを混合し、プライマーoBP452(配列番号77)およびoBP455(配列番号80)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりHIS3断片ABを作成した。HIS3断片UおよびHIS3断片Cを混合し、プライマーoBP456(配列番号81)およびoBP459(配列番号84)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりHIS3断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Gel Extractionキット(Qiagen)により精製した。HIS3断片ABおよびHIS3断片UCを混合し、プライマーoBP452(配列番号77)およびoBP459(配列番号84)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりHIS3ABUCカセットを作成した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。
Frozen−EZ Yeast Transformation IIキット(Zymo Research)を用いて、CEN.PK113−7DΔura3::kanMXΔhis3::URA3を、pRS423::PGAL1−cre(配列番号71)で形質転換し、2%のグルコースが補充されたヒスチジンおよびウラシルを欠いた合成完全培地において30℃でプレーティングすることによって、KanMXマーカーを除去した。1%のガラクトースが補充されたYP中、30℃で約6時間、形質転換体を増殖させて、CreリコンビナーゼおよびKanMXマーカーの切除を誘発させ、回収のために30℃でYPD(2%のグルコース)プレートにプレーティングした。分離株をYPD中で一晩増殖させ、5−フルオロ−オロト酸(0.1%)を含有する合成完全培地に30℃でプレーティングして、URA3マーカーを失った分離株を選択した。pRS423::PGAL1−creプラスミドの除去のために、5−FOA耐性分離株をYPDにおいて増殖
およびプレーティングした。YPD+G418プレート、ウラシルを欠いた合成完全培地プレート、およびヒスチジンを欠いた合成完全培地プレートにおける増殖をアッセイすることによって、KanMXマーカー、URA3マーカー、およびpRS423::PGAL1−creプラスミドの損失について分離株を検査した。G418に対して感受性があり、ウラシルおよびヒスチジンに対して栄養要求性である正しい分離株を、株CEN.PK113−7DΔura3::loxPΔhis3として選択し、BP857と命名した。欠失およびマーカー除去は、Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen)により調製されたゲノムDNAを用いて、Δura3のためのプライマーoBP450(配列番号87)およびoBP451(配列番号88)、ならびにΔhis3のためのプライマーoBP460(配列番号85)およびoBP461(配列番号86)によるPCRおよび配列決定によって確認した。
Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs)と、Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen)により調製したテンプレートとしてのCEN.PK113−7DゲノムDNAとを用いて、痕跡のないPDC6欠失のためのPCRカセットの4つの断片を増幅した。プライマーoBP440(配列番号89)と、PDC6断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP441(配列番号90)とを用いて、PDC6断片Aを増幅した。PDC6断片Aの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP442(配列番号91)と、PDC6断片Uの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP443(配列番号92)とを用いて、PDC6断片Bを増幅した。PDC6断片Bの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP444(配列番号93)と、PDC6断片Cの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP445(配列番号94)とを用いて、PDC6断片Uを増幅した。PDC6断片Uの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP446(配列番号95)と、プライマーoBP447(配列番号96)とを用いて、PDC6断片Cを増幅した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。PDC6断片AおよびPDC6断片Bを混合し、プライマーoBP440(配列番号89)およびoBP443(配列番号92)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC6断片ABを作成した。PDC6断片UおよびPDC6断片Cを混合し、プライマーoBP444(配列番号93)およびoBP447(配列番号96)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC6断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Gel Extractionキット(Qiagen)により精製した。PDC6断片ABおよびPDC6断片UCを混合し、プライマーoBP440(配列番号89)およびoBP447(配列番号96)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC6ABUCカセットを作成した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。
て選択した。
PDC1遺伝子を欠失させ、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)ATCC#700610からのilvDコード領域で置換した。Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs)と、Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen)により調製したテンプレートとしてのNYLA83(参照によってその全体が本明細書中に援用される米国特許出願公開第20110124060号明細書に記載される)ゲノムDNAとを用いて、PDC1欠失−ilvDSm組込みのためのPCRカセットのA断片とその後のストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)からのilvDコード領域を増幅した。(NYLA83は、参照によってその全体が本明細書中に援用される米国特許出願公開第2009/0305363号明細書に記載されるPDC1欠失ilvDSm組込みを有する菌株である。)プライマーoBP513(配列番号102)と、PDC1断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP515(配列番号103)とを用いて、PDC1断片A−ilvDSm(配列番号101)を増幅した。Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs)と、Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen)により調製したテンプレートとしてのCEN.PK113−7DゲノムDNAとを用いて、PDC1欠失−ilvDSm組込みのためのPCRカセットのB、U、およびC断片を増幅した。PDC1断片A−ilvDSmの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP516(配列番号104)と、PDC1断片Uの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP517(配列番号105)とを用いて、PDC1断片を増幅した。PDC1断片Bの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP518(配列番号106)と、PDC1断片Cの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP519(配列番号107)とを用いて、PDC1断片Uを増幅した。PDC1断片Uの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP520(配列番号108)と、プライマーoBP521(配列番号109)とを用いて、PDC1断片Cを増幅した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。PDC1断片A−ilvDSmおよびPDC1断片Bを混合し、プライマーoBP513(配列番号102)およびoBP517(配列番号105)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC1断片A−ilvDSm−Bを作成した。PDC1断片UおよびPDC1断片Cを混合し、プライマーoBP518(配列番号106)およびoBP521(配列番号109)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC1断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Gel Extractionキット(Qiagen)により精製した。PDC1断片A−ilvDSm−BおよびPDC1断片UCを混合し、プライマー
oBP513(配列番号102)およびoBP521(配列番号109)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりPDC1A−ilvDSm−BUCカセットを作成した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。
PDC5遺伝子を欠失させ、アクロモバクター・キシロスオキシダンス(Achromobacter xylosoxidans)からのsadBコード領域で置換した(sadB遺伝子は、参照によってその全体が本明細書中に援用される米国特許出願公開第2009/0269823号明細書に記載されている)。PDC5欠失−sadB組込みのためのPCRカセットのセグメントをまずプラスミドpUC19−URA3MCSにクローン化した。
ioLabs)を用いて、BamHI、AscI、PmeI、およびFseI制限部位を含有するプライマーoBP438(配列番号114)と、XbaI、PacI、およびNotI制限部位を含有するoBP439(配列番号115)により増幅した。Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen)を用いてゲノムDNAを調製した。PCR産物およびpUC19(配列番号116)を、BamHIおよびXbaIによる消化の後、T4DNAリガーゼと連結させ、ベクターpUC19−URA3MCSを作成した。ベクターは、プライマーoBP264(配列番号117)およびoBP265(配列番号118)によるPCRおよび配列決定によって確認した。
553(配列番号133)に特異的なプライマーを用いて、ネガティブPCR結果によって実証した。正しい形質転換体を株CEN.PK113−7DΔura3::loxPΔhis3Δpdc6Δpdc1::ilvDSmΔpdc5::sadB−URA3として選択した。
内因性GPD2コード領域を欠失させるために、loxP−URA3−loxPPCR(配列番号135)をテンプレートDNAとして用いて、gpd2::loxP−URA3−loxPカセット(配列番号134)をPCR増幅した。loxP−URA3−loxPは、loxPリコンビナーゼ部位に隣接される(ATCC♯77107)からのURA3マーカーを含有する。Phusion DNAポリメラーゼならびにプライマーLA512およびLA513(配列番号136および137)を用いてPCRを行った。loxP−URA3−loxPマーカーの組込みがGPD2コード領域の置換をもたらすように、各プライマーのGPD2部分は、GPD2コード領域の上流の5’領域およびコード領域の下流の3’領域に由来した。PCR産物をBP913に形質転換し、形質転換体を1%のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地(グルコースなし)において選択した。形質転換体をスクリーニングして、プライマーoBP582およびAA270(配列番号138および139)を用いるPCRによって正しい組込みを検証した。
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株BP1135(PNY1505)およびPNY1507ならびにイソブタノール産生誘導体の構築
この実施例の目的は、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)株BP1135およびPNY1507を構築することであった。これらの株はPNY1503(BP1064)に由来した。PNY1503(BP1064)の構築は上記に記載される。BP1135は、FRA2遺伝子の付加的な欠失を含有す
る。PNY1507はBP1135に由来し、ADH1遺伝子の付加的な欠失を有し、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)における発現のためにコドン最適化されたラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)からのkivD遺伝子のADH1座位への組込みを有した。
FRA2の欠失は、FRA2コード配列の最初の113個のヌクレオチドはインタクトのままにして、コード配列の3’端部から250個のヌクレオチドを欠失するように設計した。インフレームの終止コドンは欠失の7ヌクレオチド下流に存在した。Phusion High Fidelity PCR Master Mix(New England BioLabs,Ipswich,MA)と、Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen,Valencia,CA)により調製したテンプレートとしてのCEN.PK113−7DゲノムDNAとを用いて、痕跡のないFRA2の欠失のためのPCRカセットの4つの断片を増幅した。プライマーoBP594(配列番号141)と、FRA2断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP595(配列番号142)とを用いて、FRA2断片Aを増幅した。FRA2断片Aの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP596(配列番号143)と、FRA2断片Uの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP597(配列番号144)とを用いて、FRA2断片Bを増幅した。FRA2断片Bの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP598(配列番号145)と、FRA2断片Cの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP599(配列番号146)とを用いて、FRA2断片Uを増幅した。FRA2断片Uの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP600(配列番号147)と、プライマーoBP601(配列番号148)とを用いて、FRA2断片Cを増幅した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。FRA2断片AおよびFRA2断片Bを混合し、プライマーoBP594(配列番号141)およびoBP597(配列番号144)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりFRA2断片ABを作成した。FRA2断片UおよびFRA2断片Cを混合し、プライマーoBP598(配列番号145)およびoBP601(配列番号148)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりFRA2断片UCを作成した。得られたPCR産物をアガロースゲルにおいて精製した後、Gel Extractionキット(Qiagen)により精製した。FRA2断片ABおよびFRA2断片UCを混合し、プライマーoBP594(配列番号141)およびoBP601(配列番号148)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりFRA2ABUCカセットを作成した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。
によって確認した。分離株からのFRA2遺伝子の欠損は、FRA2のコード配列、oBP605(配列番号151)およびoBP606(配列番号152)に特異的なプライマーを用いて、陰性PCR結果によって実証した。正しい分離株を株CEN.PK113−7DMATa ura3Δ::loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]−DHAD|ilvD_Sm−PDC1t pdc5Δ::P[PDC5]−ADH|sadB_Ax−PDC5t gpd2Δ::loxP fra2Δとして選択し、PNY1505(BP1135)と命名した。この菌株をイソブタノール経路プラスミド(pYZ090、配列番号69)およびpLH468(配列番号70)で形質転換させ、1つのクローンをBP1168(PNY1506)と命名した。
ADH1遺伝子を欠失させ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)における発現のためにコドン最適化されたラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)からのkivDコード領域で置換した。ADH1欠失−kivD_Ll(y)の組込みのための痕跡のないカセットを、まずプラスミドpUC19−URA3MCSにクローン化した。
S.セレビシエ(S.cerevisiae)株PNY2211およびPNY2209の構築
PNY2211は、以下の段落に記載されるように、S.セレビシエ(S.cerevisiae)株PNY1507から、いくつかのステップで構築した。まず、ホスホケトラーゼ(phosophoketolase)遺伝子を含有するように菌株を修飾した。次に、ホスホケトラーゼ遺伝子に隣接する配列に標的化された組込みベクターを用いて、アセト乳酸シンターゼ遺伝子(alsS)を菌株に付加した。最後に、相同組換えを用いてホスホケトラーゼ遺伝子および組込みベクター配列を除去し、pdc1Δ::ilvDと、染色体XIIの天然TRX1遺伝子との間の遺伝子間領域におけるalsSの痕跡のない挿入を得た。PNY2211の得られた遺伝子型は、MATa ura3Δ::loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]−DHAD|ilvD_Sm−PDC1t−P[FBA1]−ALS|alsS_Bs−CYC1t pdc5Δ::P[PDC5]−ADH|sadB_Ax−PDC5t gpd2Δ::loxP fra2Δadh1Δ::UAS(PGK1)P[FBA1]−kivD_Ll(y)−ADH1tである。
のPCR産物、ならびにプライマーN822(配列番号170)およびN1178(配列番号171)により酵母ゲノムDNA(ENO1プロモーター領域)から生成された0.8kbのPCR産物DNAと結合させ、S.セレビシエ(S.cerevisiae)株BY4741(ATCC#201388)に形質転換した(ギャップ修復クローニング法、Ma et al.Gene 58:201−216(1987)を参照)。ヒスチジンを含まない合成完全培地に細胞をプレーティングすることによって形質転換体を得た。PCR(プライマーN821(配列番号173)およびN1115(配列番号174))および制限消化(BglI)によって、予想されるプラスミド(pRS423::TEF(M4)−xpk1+ENO1−eutD、配列番号172)の適切な構築物を確認した。続いて、2つのクローンを配列決定した。3.1kbのTEF(M4)−xpk1遺伝子を、SacIおよびNotIによる消化によって単離し、pUC19−URA3::ilvD−TRX1ベクターにクローン化した(クローンA、AflIIで切断)。クローニング断片をKlenow断片で処理して、連結のための平滑断端を生成した。連結反応物を大腸菌(E.coli)Stbl3細胞に形質転換し、アンピシリン耐性について選択した。PCR(プライマーN1110(配列番号175)およびN1114(配列番号176))によってTEF(M4)−xpk1の挿入を確認した。ベクターをAflIIにより直線化し、Klenow断片で処理した。1.8kbのKpnI−HincIIジェネテシン耐性カセットを、Klenow断片処理の後、連結によりクローン化した。連結反応物を大腸菌(E.coli)Stbl3細胞に形質転換して、アンピシリン耐性について選択した。PCR(プライマーN160SeqF5(配列番号183)およびBK468(配列番号178))によってジェネテシンカセットの挿入を確認した。プラスミド配列は、配列番号179(pUC19−URA3::pdc1::TEF(M4)−xpk1::kan)として提供される。
Shaker中、30℃、250rpm)の後、2%のグルコースおよび0.05%のエタノールを含有する合成完全培地(125mLの堅くフタをしたErlenmeyerフラスコ(VWRカタログ番号89095−260)内に20mlの培地)において、培
養物を0.2OD(Eppendorf BioPhotometer測定)に希釈して戻した。48時間のインキュベーション(Innova(登録商標)40 New Brunswick Scientific Shaker中、30℃、250rpm)の後、米国特許出願公開第20070092957号明細書に記載される方法によるHPLCによって培養の上清(Spin−X遠心管フィルタユニット、Costarカタログ番号8169を用いて捕集)を分析した。)。2つのクローンのうちの1つは陽性であり、PNY2218と命名した。
PNY1528(PNY2211におけるhADHの組込み)
標的領域の上流および下流の相同性領域ならびに形質転換体の選択のためのURA3遺伝子を含有するPCR産物による相同組換えによって、欠失/組込みを作成した。URA3遺伝子を相同組換えにより除去して、痕跡のない欠失/組込みを作成した。
YPRCΔ15座位を欠失させ、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)からのPDC5プロモーター領域(538bp)およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)からのADH1ターミネーター領域(316bp)と共に、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)における発現のためにコドン最適化されたウマ肝臓adh遺伝子で置換した。YPRCΔ15欠失−P[PDC5]−adh_HL(y)−ADH1tの組込みのための痕跡のないカセットを、まずプラスミドpUC19−URA3MCSにクローン化した。
w England BioLabs,Ipswich,MA)と、Gentra Puregene Yeast/Bactキット(Qiagen,Valencia,CA)により調製したテンプレートとしてのCEN.PK113−7DゲノムDNAとを用いて、断片A−B−U−Cを増幅した。KpnI制限部位を含有するプライマーoBP622(配列番号184)と、YPRCΔ15断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP623(配列番号185)とにより、ゲノムDNAからYPRCΔ15断片Aを増幅した。YPRCΔ15断片Aの3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP624(配列番号186)と、FseI制限部位を含有するプライマーoBP625(配列番号187)とにより、ゲノムDNAからYPRCΔ15断片Bを増幅した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。YPRCΔ15断片AおよびYPRCΔ15断片BのPCR産物を混合し、プライマーoBP622(配列番号184)およびoBP625(配列番号187)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりYPRCΔ15断片A−YPRCΔ15断片Bを作成した。得られたPCR産物をKpnIおよびFseIにより消化し、適切な酵素による消化の後、pUC19−URA3MCSの対応する部位にT4DNAリガーゼにより連結させた。NotI制限部位を含有するプライマーoBP626(配列番号188)と、PacI制限部位を含有するプライマーoBP627(配列番号189)とにより、ゲノムDNAからYPRCΔ15断片Cを増幅した。YPRCΔ15断片CのPCR産物をNotIおよびPacIにより消化し、YPRCΔ15断片ABを含有するプラスミドの対応する部位にT4DNAリガーゼにより連結させた。AscI制限部位を含有するプライマーHY21(配列番号190)と、dh_Hl(y)の5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーHY24(配列番号191)とにより、CEN.PK113−7DゲノムDNAからPDC5プロモーター領域を増幅した。P[PDC5]の3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーHY25(配列番号192)と、PmeI制限部位を含有するHY4(配列番号193)とにより、pBP915(配列番号166)からadh_Hl(y)−ADH1tを増幅した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen)により精製した。P[PDC5]およびadh_HL(y)−ADH1tのPCR産物を混合し、プライマーHY21(配列番号190)およびHY4(配列番号193)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりP[PDC5]−adh_HL(y)−ADH1tを作成した。得られたPCR産物をAscIおよびPmeIにより消化し、YPRCΔ15断片ABCを含有するプラスミドの対応する部位にT4DNAリガーゼにより連結させた。プライマーoBP622(配列番号184)およびoBP627(配列番号189)を用いて、得られたプラスミドから組込みカセット全体を増幅した。
[PDC1]−DHAD|ilvD_Sm−PDC1t−P[FBA1]−ALS|alsS_Bs−CYC1t pdc5Δ::P[PDC5]−ADH|sadB_Ax−PDC5t gpd2Δ::loxP fra2Δadh1Δ::UAS(PGK1)P[FBA1]−kivD_Ll(y)−ADH1typrcΔ15Δ::P[PDC5]−ADH|adh_Hl−ADH1t。
サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)からのPDC1プロモーター領域(870bp)およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)からのADH1ターミネーター領域(316bp)と共に、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)における発現のためにコドン最適化されたウマ肝臓adh遺伝子をfra2の欠失部位に組み込んだ。fra2Δ−P[PDC1]−adh_HL(y)−ADH1tの組込みのための痕跡のないカセットを、まずプラスミドpUC19−URA3MCSにクローン化した。
ンピテント細胞を作り、Frozen−EZ Yeast Transformation IIキット(Zymo Research)を用いて、fra2Δ−P[PDC1]−adh_HL(y)−ADH1t組込みカセットPCR産物で形質転換した。形質転換混合物を、1%のエタノールが補充されたウラシルを欠いた合成完全培地において30Cでプレーティングした。形質転換体を、プライマーURA3−end F(配列番号194)およびoBP731(配列番号206)によるPCRによってスクリーニングした。正しい形質転換体をYPE(1%のエタノール)中で増殖させ、1%のEtOHが補充され、5−フルオロ−オロト酸(0.1%)を含有する合成完全培地において30Cでプレーティングして、URA3マーカーを失った分離株を選択した。YeaStar Genomic DNA(Zymo Research)により調製されたゲノムDNAを用いて、内部プライマーHY31(配列番号207)および外部プライマーoBP731(配列番号155)によるコロニーPCRと、外部プライマーoBP730(配列番号208)およびoBP731(配列番号206)によるPCRとによって、P[PDC1]−adh_HL(y)−ADH1tの組込みを確認した。以下の遺伝子型の正しい分離株をPNY1528と命名した:CEN.PK113−7D MATa ura3Δ::loxP his3Δpdc6Δpdc1Δ::P[PDC1]−DHAD|ilvD_Sm−PDC1t−P[FBA1]−ALS|alsS_Bs−CYC1t pdc5Δ::P[PDC5]−ADH|sadB_Ax−PDC5t gpd2Δ::loxP fra2Δ::P[PDC1]−ADH|adh_Hl−ADH1tadh1Δ::UAS(PGK1)P[FBA1]−kivD_Ll(y)−ADH1typrcΔ15Δ::P[PDC5]−ADH|adh_Hl−ADH1t。
この実施例の目的は、adh1Δ座位におけるPNY1528中のkivD_Ll(y)の染色体コピーをkivD_Lg(y)またはkivD_Mc(y)で置換するために使用される構築物の組み立て、ならびにkivD遺伝子を発現するイソブタノロゲン株PNY1549、PNY1550、およびPNY1551の構築を説明することである。
(y)をADH1座位に組み込むために使用されるプラスミドの構築は以下で説明される。プラスミドは、pUC19−URA3MCSにおいて構築した。
pLH468(配列番号70)をテンプレートとして用いて、PmeI制限部位を含有するプライマーoBP562(配列番号153)と、ADH1断片Bの5’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP563(配列番号154)とにより、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)における発現のためにコドン最適化されたラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)からのkivDコード領域、kivD_Ll(y)を増幅した。kivD_Ll(y)の3’端部に対する相同性を有する5’尾部を含有するプライマーoBP564(配列番号155)と、FseI制限部位を含有するプライマーoBP565(配列番号156)とにより、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)CEN.PK113−7DゲノムDNAからADH1断片Bを増幅した。PCR産物をPCR Purificationキット(Qiagen,Valencia,CA)により精製した。kivD_Ll(y)およびADH1断片BのPCR産物を混合し、プライマーoBP562(配列番号153)およびoBP565(配列番号156)により増幅することによって、オーバーラップPCRによりkivD_Ll(y)−ADH1断片Bを作成した。得られたPCR産物をPmeIおよびFseIにより消化し、適切な酵素による消化の後、pUC19−URA3MCSの対応する部位にT4DNAリガーゼにより連結させた。SacI制限部位を含有するプライマーoBP505(配列番号157)と、AscI制限部位を含有するプライマーoBP506(配列番号158)とにより、ゲノムDNAからADH1断片Aを増幅した。ADH1断片AのPCR産物をSacIおよびAscIにより消化し、kivD_Ll(y)−ADH1断片Bを含有するプラスミドの対応する部位にT4DNAリガーゼにより連結させた。PacI制限部位を含有するプライマーoBP507(配列番号159)と、SalI制限部位を含有するプライマーoBP508(配列番号160)とにより、ゲノムDNAからADH1断片Cを増幅した。ADH1断片CのPCR産物をPacIおよびSalIにより消化し、ADH1断片A−kivD_Ll(y)−ADH1断片Bを含有するプラスミドの対応する部位にT4DNAリガーゼにより連結させた。AscI制限部位を含有するプライマーoBP674(配列番号162)と、PmeI制限部位を含有するプライマーoBP675(配列番号163)とにより、ベクターpRS316−UAS(PGK1)−PFBA1−GUSから、ハイブリッドプロモーターUAS(PGK1)−PFBA1(配列番号161)を増幅した。UAS(PGK1)−PFBA1のPCR産物をAscIおよびPmeIにより消化し、kivD_Ll(y)−ADH1断片ABCを含有するプラスミドの対応する部位にT4DNAリガーゼにより連結させて、pBP1181を生成した。
ADH1欠失/UAS(PGK1)P[FBA1]−kivD_Ll(y)組込みプラスミドpBP1181からkivD_Ll(y)を除去した。プラスミドをPmeIおよびFseIにより消化し、大型DNA断片をアガロースゲルにおいて精製した後、Gel
Extractionキット(Qiagen)により精製した。PmeI制限部位を含有するプライマーoBP821(配列番号210)と、FseI制限部位を含有するプライマーoBP484(配列番号211)とにより、pBP1181からADH1断片Bを増幅した。ADH1断片BのPCR産物をPmeIおよびFseIにより消化し、ゲル精製した大型DNA断片の対応する部位にT4DNAリガーゼにより連結させた。kivD_Ll(y)の3’の500bpに相当するPCR断片を、PNY1528におけるkivD_Ll(y)の標的化欠失のために、得られたベクターにクローン化した。NotI
制限部位を含有するプライマーoBP822(配列番号212)と、PacI制限部位を含有するoBP823(配列番号213)により、pBP1181から断片を増幅した。NotIおよびPacIにより断片を消化し、適切な制限酵素による消化の後、kivD_Ll(y)欠失を有する上記プラスミドにおいてURA3の下流の対応する部位へT4DNAリガーゼにより連結させた。得られたプラスミドをpBP1716と命名した。
菌株PNY1528をプラスミドpLH702およびpYZ067ΔkivDΔhADHで形質転換した。形質転換体をPNY1549と命名した。
方法:
播種材料の調製
各菌株に対して、単一の凍結バイアルを解凍し、125mLの通気口のある振とうフラスコ内の10mLの種培地へ移し、一晩の増殖させるために30℃および300rpmで振とうさせてインキュベートした。次に、5mLの一晩培養物を、75mLの種培地を入れた250mLの通気口のある振とうフラスコに移し、30℃および300rpmで振とうさせながら一晩増殖させた。培養物がOD600 1−2に達したら、フラスコ培養物を用いて1Lの発酵槽を播種した。種培地の組成は次の通りである:アミノ酸を含まない酵母窒素塩基(Difco)、6.7g/L;ヒスチジン、ロイシン、トリプトファンおよびウラシルを含まないYeast Synthetic Drop−out Medium Supplements(Sigma)、2.8g/L;L−ロイシン、20mg/L;L−トリプトファン、4mg/L;チアミンHCl、20mg/L;ナイアシン、20mg/L;エタノール、3g/L;グルコース10g/L。20%の水酸化カリウムによりpHを5.2に調整し、培地を0.22μフィルタによりろ過滅菌した。
発酵は1LのBiostat B DCU3発酵槽(Sartorius,USA)内で行った。Prima DB質量分析計(Thermo Electron Corp.,USA)によりオフガスの組成をモニターした。オフガス中のイソブタノールおよびエタノールを測定するために、氷水浴に入れた、0.5Lの水を含む1リットルのShottボトルにまずガスを通した後、質量分析計に送った。発酵全体を通して、発酵槽の温度を30℃に保持し、pHを20%のKOHにより5.2に調節した。エアレーションを0.2標準リットル/分に調節し、攪拌を100rpmに調節した。溶解酸素は調節せず、発酵の大部分の間検出されなかった。サンプルを抜き取り、YSI Select Biochemisty Analyzer(YSI,Inc.,Yellow Springs,Ohio)によって、600nmにおける光学濃度およびグルコース濃度について分析した。この分析を用いる際、50%(w/w)溶液を手で添加することによりグルコースを過剰(5〜20g/L)に保持した。
モニウムを含む520mLの水、2.2gの一塩基性リン酸カリウム、1.5gの硫酸マグネシウム七水和物、および0.2mLのSigma Antifoam 204を発酵槽に移した。発酵槽を121℃で30分間滅菌した。30℃の設定点まで冷却した後、後滅菌成分をポンプにより無菌で添加した。後滅菌成分を200mLの全容積で作った:4.8mLの微量ミネラル溶液(1Lの水中で調製:15gのEDTA、4.5gの硫酸亜鉛七水和物、0.8gの塩化マンガン無水物、0.3gの塩化コバルト六水和物、0.3gの硫酸銅五水和物、0.4gのモリブデン二ナトリム(disodium molybdenum)無水物、4.5gの塩化カルシウム二水和物、3gの硫酸鉄七水和物、1gのホウ酸、0.1gのヨウ化カリウム)、0.8mLのビタミン混合物(1Lの水中、50mgのビオチン、1gのパントテン酸Ca、1gのニコチン酸、25gのミオイノシトール、1gのピリドキソール(pyridoxol)塩酸塩、0.2gのp−アミノ安息香酸)、16gのグルコース、3mLのエタノール、12.8mgのL−ロイシン、3.2mgのL−トリプトファン、2.2gのヒスチジン、ロイシン、トリプトファンおよびウラシルを含まないYeast Synthetic Drop−out Medium
Supplements(Sigma)、チアミンHClを、特定の発酵に対して表1に示される量で添加し、容積が200mLになるように脱イオン水を添加し、発酵槽へ添加する前に溶液をろ過滅菌した。播種後の発酵槽の最終容積は800mLであった。
Claims (10)
- (i)配列番号52または61のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列、および
(ii)α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ活性、1よりも大きいα−ケトイソバレレートのピルベートに対する特異性比、および20μM以下のチアミン二リン酸補因子活性化定数(Kc)
を有するポリペプチドを含む、組換え宿主細胞。 - ポリペプチドが組換え宿主細胞にとって異種である、請求項1に記載の組換え宿主細胞。
- 組換え宿主細胞が、クロストリジウム(Clostridium)属、ザイモモナス(Zymomonas)属、エシェリキア(Escherichia)属、サルモネラ(Salmonella)属、セラチア(Serratia)属、エルウィニア(Erwinia)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、シゲラ(Shigella)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、バチルス(Bacillus)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、エンテロコッカス(Enterococcus)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、クレブシエラ(Klebsiella)属、パエニバチルス(Paenibacillus)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、イサチェンキア(Issatchenkia)属、クルイベロミセス(Kluyveromyces)属、ヤロウイア(Yarrowia)属、ピキア(Pichia)属、カンジダ(Candida)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、またはサッカロミセス(Saccharomyces)属の一員である、請求項1に記載の組換え宿主細胞。
- 組換え宿主細胞がサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項3に記載の組換え宿主細胞。
- 組換え宿主細胞がさらに、基質から生成物への変換:(a)ピルベートからアセトラクテートへの変換(b)アセトラクテートから2,3−ジヒドロキシイソバレレートへの変換、および(c)2,3−ジヒドロキシイソバレレートから2−ケトイソバレレートへの変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、請求項2〜4のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
- 組換え宿主細胞がさらに、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質から生成物への変換を触媒するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、請求項5に記載の組換え宿主細胞。
- 組換え宿主細胞は、さらに、低下したピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を備えるか、または該活性が排除される、請求項2〜6のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
- 組換え宿主細胞がさらに、Fe−Sクラスター生合成に影響を与えるポリペプチドをコードする内在性遺伝子において少なくとも1つの欠失、突然変異、および/または置換を含む、請求項2〜7のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
- 組換え宿主細胞がfra2の欠失を含む、請求項2〜8のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
- 組換え宿主細胞は、低下したグリセロール−3−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を備えるか、または該活性が排除される、請求項2〜9のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
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