MX2013003825A - Anticuerpos especificos de tumores y usos para los mismos. - Google Patents

Anticuerpos especificos de tumores y usos para los mismos.

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Abstract

Se proporcionan los anticuerpos aislados y los fragmentos y derivados de los mismos, los cuales se enlazan a los antígenos tumorales. También se proporcionan las composiciones y los agentes de distribución que incluyen los anticuerpos descritos y los fragmentos y derivados de los mismos; las células que producen los mismos; los métodos para producir los mismos; los métodos para utilizar los mismos para detectar, dirigirse a y/o tratar tumores y/o células metatásticas derivadas de los mismos y/o las células de la línea tumoral; y los métodos para predecir la recurrencia del cáncer en un sujeto.

Description

ANTICUERPOS ESPECIFICOS DE TUMORES Y USOS PARA LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCION I La materia de interés actualmente descrita se refiere a los anticuerpos aislados, o los fragmentos o los i derivados de los mismos, los cuales se enlajan a los antígenos presentes en los tumores, y los métodos de uso para 1 los mismos. En algunas modalidades, la materia cié interés actualmente descrita se refiere a los anticuerpos aislados, o los fragmentos o los derivados de los mismos, que se enlazan al miembro MUC1 de la familia de mucina epitelial, y a los métodos para utilizar los mismos, para detectar, dirigirse, y tratar los tumores, y las células tum no limitadas a las células tumorales sus siglas en inglés) y las células por sus siglas eninglés) . , ANTECEDENTES DE LA INVENCION ¡ El cáncer pancreático es la cuarta y quinta causa i principal de muerte relacionada al cáncer para hombres y mujeres, respectivamente, después de lo cánceres dé pulmón, colon, y próstata, en hombres y pulmón, mama, colonj y ovario I en mujeres. Los pacientes usualmente presentan enfermedad avanzada, haciendo difícil el tratamiento. La cirugía es la única terapia curativa, incluso la recurrencia local de la enfermedad con o sin dispersión a órganos distantes ocurre en RiEF. 240403 más de 80% de los pacientes. Los intentos para mejorar las modalidades terapéuticas son necesarios con el fin de mejorar el resultado en esta enfermedad.
Frecuentemente, la transformación heoplásica conduce a alteraciones en la expresión de ' diversos polipéptidos en las células tumorales. Por ejemplo, ciertas mucinas y formas mutadas de los polipéptidos del oncogen leras son sobre-expresados en 90% de los adenocarcinomas de los conductos pancreáticos (de aquí en adelante denominados como "PDA", por sus siglas en inglés), y han sido objetivos para las intervenciones terapéuticas. A la fecha, no obstjante, las i vacunas que se dirigen a estos polipéptidos no ¡han sido i particularmente exitosas clínicamente. Las vacunas han fallado en generar memoria inmunitaria a largo plazjo, debido • i al menos en parte a los tumores que se adaptan en fprmas que les permite escapar del reconocimiento inmunitario; y de la muerte. Varios agentes que pueden tolerar la tolerancia inmunitaria han sido probados clínicamente, pero únicamente con respuestas modestas, quizás debido a una ¡cantidad i insuficiente de los agentes que llegan al sitio del tumor y/o i debido a que los agentes mismos han estado asociados con efectos colaterales no deseados, tal como puede resultar de su enlace a las células normales.
Además, es un reto mayor en oncología no solamente tratar un trastorno primario del paciente, sino i! también prevenir la aparición de metástasis. Se cree actualmente que la enfermedad metastática podría resultar de la migración de las células tumorigénicas , principalmente denominadas como células madre tumoral o células madre cancerosa, desde el sitio del tumor primario hacia otros sitios, dónde éstas pueden infiltrarse al sitio y formar nuevos tumoresj (ver por ejemplo, Bonnet y Dick, 1997; Reya et al., 2001; Al-Hajj et al., 2003; Pardal et al., 2003; Dontu et al., 2004; Singh et al., 2004; Brabletz et al., 2005). Como resul , sería benéfico ser capaz de identificar y eliminar estas células si I éstas están presentes en un paciente. ' De este modo, es por lo tanto una necesidad las nuevas composiciones y los métodos para detectar, dirigirse y i tratar los tumores y las células derivadas de estos .j BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION j Este resumen lista las varias modalidades de la materia de interés actualmente descrita, y en muchos casos lista las variaciones y las permutaciones de estas i modalidades. Esta breve descripción es meramente ejemplar de las numerosas y variadas modalidades. La mención de | una o más características representativas de una modalidad dkda es de igual modo ejemplar. Tal modalidad puede existir típicamente con o sin la o las características mencionadas; ! de igual modo, estas características pueden ser aplicadas' a otras i modalidades de la materia de interés actualmente descrita, ya sea que se liste o no en esta breve descripción. Para evitar repetición excesiva, esta breve descripción no lista todas i las posibles combinaciones de tales características;. i En diversas modalidades, la materia de interés actualmente descrita proporciona lo siguiente: ' Los anticuerpos aislados, así como los fragmentos y los derivados de los mismos, que específicamente se; enlazan a los polipéptidos mucina-1 (MUC1) y/o a los polipéptidos del oncogen K-ras mutado presentes sobre los tumores epiteliales.
Los ácidos nucleicos aislados que codifican para los anticuerpos aislados de la materia de interés actualmente descrita y/o las subsecuencias de los mismos. ' Los anticuerpos, tales como los anticuerpos i monoclonales , y/o fragmentos peptídicos, y/o los derivados de los mismos, que se enlazan específicamente a los tumores tales como los tumores epiteliales, incluyendo los tumores pancreáticos, los tumores de ovario, los tumores de mama, tumores colorrectales , y lesiones metastáticas derivados de los mismos.
Los anticuerpos, así como los fragmentos y los derivados de los mismos, que se enlazan específicamente a un epitopo presente dentro de un polipéptido MUC1' y/o un polipéptido K-rasG12D mutado, en algunas modalidades a un epitopo presente dentro de un polipéptido MUC1 humano. En algunas modalidades, el epitopo está presente dentro de cualquiera de las SEQ ID Nos.: 1-3.
Los anticuerpos, así como los fragmentos y los antígenos asociados al tumor. ' Las moléculas quiméricas que 'comprenden I anticuerpos, así como los fragmentos y los derivados de los mismos, enlazados a agentes efectores y/o inmunoduladores, en donde los anticuerpos, o los fragmentos o derivados de los i mismos, se enlazan específicamente a los epitopos | presentes dentro de un polipéptido MUC1 y/o un K-ras mutado. En algunas modalidades, los efectores son seleccionados del | grupo que consiste de etiquetas de epitopos, segundos anticuerpos (o los fragmentos o los derivados de los mismos) , marcadores, citotoxinas, liposomas, radionúclidos, fármacos, profármacos y quelatos, y además, en donde el agente inmunomodulador se selecciona de, por ejemplo, los agentes listados eri la Tabla 3. j Los anticuerpos, así como los fragmentos y los derivados de los mismos, acoplados a un agente inmunomodulador; por ejemplo, los agentes inmunomoduladores listados en la Tabla 3. i Los anticuerpos, así como los fragmentos y los derivados de los mismos, acoplados a los agentes de diagnóstico. ¡ i Los anticuerpos, así como los fragmentaos y los i derivados de los mismos, preparados en composiciones que comprenden uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.
Los métodos para inducir las respuestas inmunitarias , que en algunas modalidades comprenden la introducción de los anticuerpos, fragmentos, y/o derivados de los mismos, y/o las composiciones descritas en la ,presente, dentro de un sujeto tales como, pero no limitadas a, un humano .
Los métodos para detectar las células cancerosas, que comprenden introducir dentro de un sujeto tal cpmo, pero no limitado a un humano, un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo, acoplados a un marcador detectable que se enlaza específicamente a un polipéptido MUC1 1 y/o un polipéptido K-ras mutado.
Las células hibridomas que producen los anticuerpos, fragmentos, y/o derivados de la materia de interés actualmente descrita, tales como, pero no limitados a anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente a un polipéptido MUC1, un polipéptido K-rasG12D mutado, o a: ambos.
Las vacunas contra los cánceres epiteliales que comprenden los anticuerpos, fragmentos, y/o derivados de la materia de interés actualmente descrita, y uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptados, que comprenden además opcionalmente uno o más agentes inmunomoduladores .
Más particularmente, en algunas modalidades la materia de interés actualmente descrita proporciona los anticuerpos aislados, o los fragmentos o los derivakos de los mismos, que comprenden las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs, por sus siglas en inglés) del i anticuerpo monoclonal TAB-004. En algunas modalidades, los I anticuerpos aislados, o los fragmentos o derivados de los mismos, son policlonales . En algunas modalidades, los anticuerpos aislados, o los fragmentos o derivados de los mismos, son monoclonales . En algunas modalidades, los anticuerpos aislados, o los fragmentos o derivados de los mismos, son humanos o humanizados. En algunas modalidades, i 1 los anticuerpos aislados, o los fragmentos o derivados de los mismos, son seleccionados del grupo que consiste ele (a) un anticuerpo monoclonal producido por la línea de células hibridomas TAB-004 depositada con la American Typje Culture I Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, ¡Manassas, Virginia, 201 10-2209, Estados Unidos de América, cómo Acceso No. PTA-1 1550 el 16 de Diciembre del 2010; (b) anticuerpos quiméricos, o los fragmentos o los derivados de lo(s mismos; (c) anticuerpos humanizados, o los fragmentos o los (derivados i i de los mismos; (d) anticuerpos humanos, o los fragmentos o los derivados de los mismos; (e) anticuerpos die cadena simple, o los fragmentos o los derivados de los mismos; y (f) fragmentos Fab, en donde los anticuerpos quiméricos, los anticuerpos humanizados, los anticuerpos los anticuerpos de cadena simple, o los fragmentos Fab comprenden las CDRs del anticuerpo monoclonal TAB-004. Eri algunas modalidades de los anticuerpos aislados, o los fragmentos o i derivados de los mismos, las CDRs comprenden una o niás de las í siguientes: (i) la CDR1 de cadena pesada que comprende SEQ ID No.: 8; (ii) la CDR2 de cadena pesada que comprende ¡la SEQ ID No. : 9; (iii) la CDR3 de cadena pesada que ID No.: 10; (iv) la CDR1 de cadena ligera SEQ ID No.: 11; (v) la CDR2 de cadena ligera SEQ ID No.: 12; y (vi) la CDR3 de cadena ligera que comprende la SEQ ID No. : 13. En algunas modalidades de los anticuerpos aislados, o los fragmentos o derivados de los mismos, la región variable de cadena pesada comprende la SEQ I 5 es codificada por una molécula de ácido nucleico que i comprenden SEQ ID No.: 4; y/o la región variable de cadena i ligera que comprende la SEQ ID No. : 7 o es codificada por una I molécula de ácido nucleico que comprenden la SEQ ID No. : 6.
I La materia de interés actualmente descrita también proporciona las composiciones que comprenden los anticuerpos actualmente descritos, o los fragmentos o derivados de los i mismos, y uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables son aceptables para el uso en un humano. j La materia de interés actualmente descrita también proporciona las composiciones que comprenden los anticuerpos i actualmente descritos, o los fragmentos o derivados de los mismos, conjugados a un agente activo. En i algunas i modalidades, el agente activo se selecciona del grupo que I consiste de un molécula radioactiva, un radionúcíido, una i molécula sensibilizadora, un reactivo de formación de imagen, í un radioisótopo, una toxina, una citotoxina, un agente antiangiogénico, un agente anti-tumoral , unj agente quimioterapéutico, un inmunomodulador, una citocina, j un grupo reportero, y combinaciones de los mismos. En | algunas modalidades, el radioisótopo se selecciona del grupo que consiste de 10B, 211At, 212Pb, 212Bi, 125I, 131I, 35S, 3H. En i algunas modalidades, el inmunomodulador se selecciona del grupo que consiste de un inhibidor de la indolamina 2,3-dioxigenasa (IDO) , opcionalmente , 1-metil-DL- triptofano (1 T) ; un antagonista del receptor de EP2/EP4; un inhibidor de la ciclo-oxigenasa, opcionalmente la indometacina; y un activador de las células dendriticás, opcionalmeinte los oligodesoxinucleótidos CpG (CpG ODN) . i i La materia de interés actualmente también proporciona los kits que comprenden los anticuerpos actualmente descritos, o los fragmentos o derivados de los mismos. En algunas modalidades, los kits actualmente descritos comprenden las instrucciones para el uso de los anticuerpos actualmente descritos, o los fragmentos o I derivados de los mismos. ! i La materia de interés actualmente descrita también proporciona los vehículos de distribución para el luso en la i distribución dirigida de los agentes activos hacia las i células tumorales. En algunas modalidades, los vehículos de distribución comprenden uno o más agentes de dirjección al objetivo, que comprenden los anticuerpos actualmente descritos, o los fragmentos o derivados de los mismos. En algunas modalidades, el agente activo que comprende una molécula radioactiva, un radionúclido, una I molécula I sensibilizadora, un reactivo de formación de imagen, un radioisótopo, una toxina, una citotoxina, un agente i antiangiogénico, un agente antitumoral, un¡ agente I quimioterapéutico, un inmunomodulador, una citocina,| un grupo reportero, o una combinación de los mismos.
La materia de interés actualmente también proporciona las células aisladas que producen los anticuerpos actualmente descritos, o los fragmentos o los derivados del mismo. En algunas modalidades, la célula aislada es un ¡ hibridoma que produce los anticuerpos actualmente descritos.
En algunas modalidades, el hibridoma es la línea de células i hibridomas ATCC Acceso No. PTA-1 1550 depositada con la American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, Estados Unidos de América, el 16 de Diciembre del 2010 bajo los términos del i Tratado de Budapest. j I La materia de interés actualmente descrita también proporciona los métodos para detectar la presencia de un epitopo al cual se enlaza un anticuerpo monoclonal TAB-004 en i una muestra biológica. En algunas modalidades, los métodos comprenden: poner en contacto la muestra biológica con uno o más anticuerpos aislados actualmente descritos,! o los ! fragmentos o los derivados de los mismos; y detjectar la presencia de un epitopo al cual se enlaza el anticuerpo i monoclonal TAB-004 en la muestra biológica. En, algunas modalidades, los anticuerpos aislados, o los fragmentos o derivados de los mismos, se enlazan a un epitopo que está I presente dentro de un polipéptido de mucina (MUC1) y/o un i epitopo que está presente dentro de un polipéptido de K-ras, i opcionalmente un polipéptido K-ras mutante . j La materia de interés actualmente descrital también proporciona los métodos para elaborar un anticuerpo o un fragmento o derivado del mismo. En algunas modalidades, los métodos comprenden cultivar una célula aislada de laj materia I de interés actualmente descrita o un hibridoma de lai materia I de interés actualmente descrita bajo condiciones tales que el anticuerpo, el fragmento, o el derivado del i mismo es expresado; y recuperando el anticuerpo o el fragmento o el derivado del mismo a partir de la célula o el hibridoma y/o el ambiente en el cual la célula o el hibridoma está I creciendo. i i La materia de interés actualmente describa también i proporciona los métodos para detectar un tumor y/o una célula i cancerosa en un sujeto. En algunas modalidades, lojs métodos comprenden poner en contacto una muestra biológica en el sujeto o aislada del sujeto con la composición que comprende un anticuerpo actualmente descrito, o un fragmento oj derivado del mismo, bajo condiciones suficientes para j que el anticuerpo actualmente descrito, o el fragmento o el¡ derivado del mismo, se enlace a un epitopo presente sobre un y/o una célula cancerosa, si está presente, en la muestra biológica; y detectar el enlace del anticuerpo actualmente i descrito, o el fragmento o el derivado del mismo, all epitopo, en donde la detección es indicadora de un tumor ¡ y/o una célula cancerosa que está presente en el sujeto. Eri algunas i modalidades, el tumor y/o la célula cancerosa es un tumor del i páncreas, mama, ovarios, colon, o recto, y/o una célula metástica derivada de éstos, la cual expresa opcionalmente i MUC1, un K-ras mutante, o ambos. En algunas modalidades, el anticuerpo actualmente descrito, o el fragmento o ¡derivado del mismo, es conjugado a un marcador detestable que comprende un agente de formación de imagen, e'.. cual en algunas modalidades se selecciona del grupo que consiste de iones paramagnéticos , radioactivos, y fluorogénicos . En algunas modalidades, el agente de formación lie imagen radioactiva se selecciona del grupo que consiste de emisores gamma, emisores de positrones y emisores de ra†os x. En i algunas modalidades, el agente de formación de imagen radioactivo se selecciona del grupo que consiste de¡ 43K, 52Fe, i 57Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/81MKr, 87MSr, 99MTc, "fin, 113In, I 123If 125I; 127CS; 129^ # 131-^ 132^ !97Hg ^ 203pb( y | 206Bi En algunas modalidades, la muestra biológica es una muestra de sangre, o una fracción derivada de la misma.
La materia de interés actualmente descrita también proporciona los métodos para tratar un tumor en un sujeto. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrarle al sujeto una composición que comprende un anticuerpo ! actualmente descrito, o un fragmento o derivado del mismo, conjugado a un agente activo, con lo cual el activo hace contacto con el tumor para tratar con esto el jtumor. En algunas modalidades, el agente activo que comprende ¡un agente terapéutico, opcionalmente un agente quimioterapeutico, una toxina, un agente radioterapéutico, o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, el agente quimiotérapéutico i se selecciona del grupo que consiste de un fármaco anti- tumoral, una citocina, un antiraetabolito, un agente alquilante, una hormona, metotrexato, doxorrubicina, i daunorrubicina, arabinósido de citosina, etopósido, 5- i fluorouracilo, melfalan, clorambucilo, una mostaza de nitrógeno, ciclofosfamida, cis-platino, vindesina, alcaloides de vincapervinca, mitomicina, bleomicina, purotionina, macromomicina, derivados de 1 , 4 -benzoquinona, trenimon, esteroides, aminopterina, antraciclinas , demecolcina, etopósido, mitramicina, doxorrubicina, daünomicina, I vinblastina, neocarzinostatina, macromicina, a-am nitina, y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, la toxina se selecciona del grupo que consiste de Veneno de Víbora de Russell, Factor IX activado, Factor X 'activado, i trombina, fosfolipasa C, factor de veneno de cobra, ricina, cadena A de ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de la difteria, ribonucleasa pancreática bovina, proteína antiviral de hierba Carmín, abrina, cadena A de abrina, gelonina, saporina, modeccina, viscumina, volkensina, y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, el agente radioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de 47Sc, 67Cu, 90Y, 109Pd, 123I, 125I, 131I, 186Re, 188Re, 199Au, 211At, 212Pb, 212Bi, 32P, 33P, 71Ge, 77As, 103Pb, 105Rh, xllAg, 119Sb, 121iSn, 131Cs, 143Pr, 161Tb, 1 7Lu, 1910s, 193MPt, y 197Hg.
La materia de interés actualmente descrita también i proporciona los métodos para suprimir el crecimiento tumoral i i i en un sujeto. En algunas modalidades, los métodos comprenden I administrarle a un sujeto que posee un tumor, una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado, o un fragmento o derivado del mismo, que comprende las regiones de determinación de la i complementariedad (CDRs) del anticuerpo monoclonal TAB-004.
I En algunas modalidades, el tumor es un tumor del (páncreas, i mama, ovario, colon, o recto, y/o una célula m tastática derivada de éste, que expresa opcionalmente UC1, j un K-ras mutante, o ambos. En algunas modalidades, las CDRs TAB-004 comprenden uno o más de las siguientes: la CDR1 cadena pesada que comprende la SEQ ID No. : 8; la CDR2 cié cadena pesada que comprende la SEQ ID No.: 9; la CDR3 Le cadena pesada que comprende la SEQ ID No.: 10; la CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID No. : 11; la CDR2 jje cadena ligera que comprende la SEQ ID No. : 12; y/o la CDR3 ¡de cadena ligera que comprende la SEQ ID No.: 13. En¡ algunas i modalidades, la región variable de cadena pesada comprende la SEQ ID No. : 5 o es codificada por una molécula !de ácido nucleico que comprende la SEQ ID No.: 4, y/o la región i variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID No|. : 7 o es codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende i la SEQ ID No. : 6. ¡ Con respecto a los métodos de tratamiento Rescritos I en la presente, en algunas modalidades los métodos comprenden i además administrar al sujeto uno o más tratamientos anti- turaorales adicionales. En algunas modalidades, úno o más tratamientos anti-tumorales adicionales se seleccionan del i grupo que consiste de radioterapia, quimioterapia, una inmunoterapia adicional, una terapia antiinflamatoria, y combinaciones de las mismas. En algunas modalidades, la i terapia anti-inflamatoria que comprende administrar ! al sujeto un inhibidor de ciclo-oxigenasa, opcionalmente un | inhibidor I específico de ciclooxigenasa-2. Una o más terapias anti-tumorales adicionales comprenden la administración de i gemcitabina (4-amino-l- (2-desoxi-2 , 2-difluoro-P-jü-eritro-pentofuranosil) pirimidin-2 (1H) -on-21 , 2 ' -difluoro-21 -¡ desoxicitidina) y celecoxib (4- [5- (4 -metilfenil) -3- i (trifluorometil) irazol-l-il] bencensulfonamida) , o las sales farmacéuticamente aceptables de uno o ambos de los mismos, al sujeto. j La materia de interés actualmente descrita , también proporciona los métodos para purificar las células madre cancerosa. En algunas modalidades, los métodos comprenden proporcionar una población de células sospech iosas de i comprender las células madre cancerosa; identificar una I subpoblación de las células que se enlazan a un anticuerpo, o I un fragmento o derivado del mismo, que comprende las 1 CDRs del anticuerpo monoclonal TAB-004; y purificar la subpoblación.
En algunas modalidades, la población de células comprenden i las células circulantes aisladas de un sujeto que ¡tiene un I tumor y/o un cáncer. En algunas modalidades, los métodos actualmente descritos comprenden además el retiro de las células positivas a la linea (lin+) proveniente de la población de células antes del paso de identificación y/o después del paso de purificación.
La materia de interés actualmente descrita también i proporciona los métodos para dirigir los agentes activos hacia las células madre cancerosa en circulación en los sujetos. En algunas modalidades, los métodos comprenden poner en contacto las células madre cancerosa en circulación, con una composición que comprende un anticuerpo actualmente descrito, o un fragmento o derivado del mismo, que 1 comprende las CDRs del anticuerpo monoclonal TAB-004 y u o o más agentes activos, opcionalmente en donde uno o májs agentes activos comprenden un agente terapéutico, opcionalmente un agente quimioterapéutico, una toxina, un , radioagente terapéutico, o una combinación de los mismos. En algunas modalidades, el agente terapéutico comprende un i inmunomodulador, opcionalmente en donde el inmunomodulador se selecciona del grupo que consiste de inmunomodulador de una indolamina 2 , 3 -diox genasa (IDO), opcionalmente, 1-metil-DL-triptofano ( 1MT) ; un antagonista del receptor de EP2/EP4; y un activador de células dendríticas, opcionalmente los oligodesoxinucleótidos CpG (CpG ODN) . I La materia de interés actualmente descrita también proporciona los métodos para pronosticar la recurrencia del cáncer en un sujeto previamente tratado para el cáncer. En algunas modalidades, los métodos comprenden aislar una muestra biológica que comprende las células circulantes de un sujeto con un cáncer; poner en contacto la muestra ¡biológica con los anticuerpos actualmente descritos, o los fragmentos o derivados de los mismos, bajo condiciones suficientes para i que los anticuerpos, o los fragmentos o derivadqs de los mismos, se enlacen a un epitopo presente sobre un Jtumor y/o una célula cancerosa, si está presente, en la| muestra i biológica; e identificar en la muestra biológica una o más i células circulantes que se enlazan al anticuerpo, o el fragmento o derivado del mismo, con lo cual es pronosticada la recurrencia de un cáncer en el sujeto. Enl algunas i modalidades, la muestra biológica que comprende una muestra de sangre, una muestra de linfa, o una fracción de las mismas. En algunas modalidades, el cáncer es un cáncer pancreático o un cáncer de mama. En algunas modalidades, los I anticuerpos, o los fragmentos o derivados de los mismos, se seleccionan del grupo que consiste de anticuerpos monoclonales producidos por línea de células hibridomas TAB- i 004 depositada con la American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, Estados Unidos de América, el 16 de Diciembre del i 2010 bajo los términos del Tratado de Budapest, como Acceso No. PTA-l 1550; los anticuerpos quiméricos, o los fragmentos o los derivados de los mismos; los anticuerpos humanizados, o los fragmentos o los derivados de los mismos; los anticuerpos humanos, o los fragmentos o los derivados de los mismos; los anticuerpos de cadena simple, o los fragmentos o los derivados de los mismos; y fragmentos Fab, y además en donde los anticuerpos quiméricos, los anticuerpos humanizados, los anticuerpos humanos, los anticuerpos de cadena simple, o los fragmentos Fab comprenden las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) del anticuerpo monoclonaL TAB-004.
En algunas modalidades, las CDRs del anticuerpo monoclonal TAB-004 comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos: la CDR1 de cadena pesada que comprende la SEQ ID No.: 8; la i CDR2 de cadena pesada que comprende la SEQ ID No. : 9; la CDR3 de cadena pesada que comprende la SEQ ID No. : 10; la CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID No. : 11; la CDR2 de cadena ligera que comprende la SEQ ID No.: 12; y lá CDR3 de cadena ligera que comprende la SEQ ID No. : 13. En algunas modalidades, la región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID No. : 5 o es codificada por una1 molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. : 4; y/o la región variable de cadena ligera comprende la SEQ ID No. : 7 o es codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. : 6.
La materia de interés actualmente descrita también proporciona los métodos para pronosticar la progrejsión de un cáncer en un sujeto. En algunas modalidades, los métodos comprenden el aislamiento de una muestra biológica que comprenden células circulantes de un sujeto con un cáncer; poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo, de la materia de interés actualmente descrita bajo condiciones suficientejs para el anticuerpo, o el fragmento o derivado del mismo, se enlace a un epitopo presente sobre un tumor y/o una célula cancerosa, si está presente, en la muestra biológica; e iden Lti¦ficar en la muestra biológica una o más células circulantes que se enlazan al anticuerpo, o el fragmento o derivado del mismo, con lo cual la progresión de un cáncer es pronostijcada en el sujeto. En algunas modalidades, la muestra ( biológica comprende una muestra de sangre, una muestra de linfa, o una fracción de las mismas. En algunas modalidades, elj cáncer es un cáncer pancreático o un cáncer de mama. En algunas modalidades, el anticuerpo, o el fragmento o derivado del mismo, se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal producido por la línea de células hibridomas TAB-004 depositada con la American Type Culture Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, j Virginia, 20110-2209, Estados Unidos de América, el 16 de Diciembre del 2010 bajo los términos del Tratado de Budapest c¡omo Acceso No. PTA-1 1550 el 16 de Diciembre del 2010; un ¡anticuerpo quimérico, o un fragmento o derivado del mismo; un anticuerpo humanizado, un fragmento o derivado del mismo; un anticuerpo humano, o un fragmento o derivado del mismo un anticuerpo de cadena simple, o un fragmento o derivado del mismo; y un fragmento Fab, y además en donde el ¡anticuerpo i quimérico, el anticuerpo humanizado, el anticuerpo humano, el anticuerpo de cadena simple, o el fragmento Fab comprende las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) del i anticuerpo monoclonal TAB-004. En algunas modalidades, las CDRs del anticuerpo monoclonal TAB-004 comprenden las siguientes secuencias de aminoácidos: la CDR1 de cadena pesada que comprende la SEQ ID No. : 8; la CDR2 de cadena pesada que comprende la SEQ ID No. : 9; la CDR3 de cadena pesada que comprende la SEQ ID No. : 10; la CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID No. : 11; la CDR2 de cadena ligera que comprende la SEQ ID No.: 12; y la CDR3 ;de cadena ligera que comprende la SEQ ID No. : 13. En algunas modalidades, la región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID No. : 5 o es codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. : 4 ,- y/o la región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID No.: i 7 o es codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID No. : 6. En algunas modalidades, la progresión del cáncer comprende metástasis del cáncer en el sujeto. , La materia de interés actualmente describa también proporciona las moléculas aisladas de ácido ico que comprenden cualquiera de las SEQ ID ID Nos . : 4 y/o que codifican para cualquiera de las SEQ ID Nos.: 5 y 7-13. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico aislada 1 está presente dentro de un vector, que en algunas modalidades i es un vector de expresión. En algunas modalidades, la i i molécula de ácido nucleico aislada está presente dentro de un vector de expresión operablemente enlazados a ulna o más i secuencias nucleotídicas adicionales que codificanl para las subsecuencias de las moléculas de anticuerpo tal qüe después de la introducción del vector de expresión dentjro de un i hospedero apropiado, un anticuerpo recombinante intacto que comprende una o más de las SEQ ID Nos.: 5 y 7-|l3, o un i fragmento o derivado del mismo, es expresado por la célula hospedera.
De este modo, un objetivo de la materia de interés i actualmente descrita es proporcionar los aislados, y los fragmentos y los derivados de los se enlazan a los antígenos presentes en los tumores . i Un objetivo de la materia de interés actualmente í descrita ha sido establecido anteriormente, y que es logrado i total o parcialmente por las composiciones y ' métodos descritos en la presente, otros objetivos se | volverán I evidentes conforme proceda la descripción, cubando se considere en conexión con las figuras anexas,) como se describen mejor en seguida.
BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A y IB son una serie de fotomicrografías que describen el enlace específico de un anticuerpo ejemplar de la materia de interés actualmente i descrita a los tumores pancreáticos humanos y de j ratón. La tinción oscura en los paneles positivo del anticuerpo ejemplar la muestra. 1 La Figura 1A es una serie de fotomicrografías que describen el enlacé del anticuerpo ejemplar a los tumores humanos en las Etapas 0 (tejido pancreático normali como un control negativo) y 2-4. j La Figura IB es una serie de fotomicrografías que describen el enlace de un anticuerpo ejemplar de la materia de interés actualmente descrita a los tumores espontáneos presentes en el páncreas de ratones transgéni , 16, 26, y 34 semanas de edad, que llevaban un MUC1 humano y una mutación K-rasG12D.
Las Figuras 2A-2C son una serie de fotomicrografías que describen el enlace específico de un anticuerpo ejemplar I de la materia de interés actualmente descrita ají tejido tumoral de mama humano (Figuras 2A y 2B) pero no al tejido de I mama normal adyacente (Figura 2C) . ¡ La Figura 3 es un esquema (panel izquierdo superior) que muestra un procedimiento para crear' una línea i de ratón transgénico triple que expresa la recombinasa Cre a todo lo largo del páncreas, un polipéptido del oncogen K-ras mutado, un polipéptido MUC1 humano. Este ratón 'desarrolla adenocarcinoma pancreático, células del cual fueron utilizadas para generar la línea celular de tumor primario KCM (panel inferior) . La línea celular KCM fue utilizada para probar el enlace de un anticuerpo ejemplar de la materia de interés actualmente descrita (denotado en la Figura 3 como "TAB" y en la presente descripción como "TAB-004j") ya sea solo o bien conjugado a los oligodesoxinucleótidos CpG (CpG ODN) . Se determinó que los anticuerpos no conjugados y I conjugados se enlazaban a la línea de células pancreáticas KCM con afinidad igual (panel superior derecho) .
Las Figuras 4A y 4B son gráficas que muestran que un anticuerpo ejemplar de la materia de interés actualmente descrita (TAB-004) aumentó la citotoxicidad de lás células Asesinas Naturales (NK, por sus siglas en inglés) para matar las células tumorales. La conjugación del anticuerpo al CpG ODN aumentó además este efecto, con lo cual se demuestra que el anticuerpo ejemplar fue capaz de aumentar una respuesta inmunitaria anti-tumoral in vivo.
La Figura 4A es una gráfica lineal que muestra que el anticuerpo TAB-004 ejemplar aumentó la lisis específica de I las células tumorales KCM en diversas proporciones jde efector (células NK) a objetivo (proporción E:T) con relación a un control negativo (anticuerpos TAB-004 menos) .
La Figura 4B es una gráfica de barras que muestra que la conjugación del anticuerpo TAB-004 ejemplar al ODN CpG aumentó además la lisis específica de las células tjumorales a diversas proporciones de E:T con relación al anticuerpo no conjugado. j Las experimentos anticuerpo ej descrita (TAB-004) , y conjugados del mismo, para reducir el i volumen tumoral de un tumor KCM establecido, ejn ratones transgénicos MUC1 (MUC1 Tg) . j La Figura 5A es una gráfica lineal que muestra los volúmenes tumorales medidos (medidos en mm por calibradores digitales) en ratones tratados con solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) sola (control negativo; cuadros rellenos),' CpG ODN solos (X's), el anticuerpo TAB-004 no conjugado (círculos abiertos) , o el conjugado TAB-004-CpG ODN (círculos rellenos) .
La Figura 5B es una gráfica de barras que muestra los cambios en los volúmenes tumorales en ratones á los 19 y 27 días después de que fue administrado el tratamiento final. Hay que hacer notar la observación de que a los 19 ¡y 27 días I después del tratamiento, los volúmenes tumorales en los ratones tratados con TAB-004 -CpG ODN no se había incrementado en comparación a los ratones control (es decir, PBsj sola, CpG ODN solo, o TAB-004 solo). *: p < 0.5. PBS sola (control negativo; barras blancas) ; CpG ODN solo (barras sombreadas) ; anticuerpo TAB-004 no conjugado (barras negras) ; | conjugado TAB-004-CpG ODN (barras sombreadas cruzadas) . 1 I La Figura 6 es una descripción esquemática de las composiciones ejemplares de la materia de interés actualmente descrita, y los usos ejemplares para las mismas. 'La ADCC - i citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo; CDC - citotoxicidad dependiente del complemento; ADEPT - terapia con profármaco enzimático dirigida al anticuerpo. I Las Figuras 7A y 7B son histogramas de las separaciones por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de CD133+ (Figura 7A) versus lás células CD24+/CD44+/EpCAM+ (Figura 7B) y el grado al I cual el I anticuerpo TAB-004 descrito en la presente se enlazó a estas poblaciones. El trazo izquierdo en cada panel corresponde a la clasificación con un anticuerpo control , y el trazo derecho en cada panel corresponde a icación con el anticuerpo TAB-004. ' Las Figuras 8A-8D son gráficas de dispersión de FACS que muestran el enlace del anticuerpo TAB-004 a un tumor pancreático ("Tumorl") y el tejido normal adyacente ("Normal") utilizando el anticuerpo TAB-004 y un (anticuerpo dirigido contra el receptor 4 de quimiocina CXC (CXCR4) .
MUC1: anticuerpo TAB-004; CXCR4 : anticuerpo anti-CXCR4; FL1-H: altura de la mancha flourescente 1 (Fluorescejína-FITC) ; FL2-H: altura de la mancha fluorescente 2 (Ficoeri¡trina-PE) ; i SSC-H: altura de dispersión lateral; FSC-H: altura de dispersión delantera; FL4-H: mancha fluorescente 4 - altura i (Aloficocianina-APC) . j La Figura 8A es una gráfica de dispejrsión que i muestra las distribuciones de células en ausencia de cualquier anticuerpo. La Figura 8B es una gráfica de dispersión que muestra las distribuciones de las células í teñidas con un control de isotipo. La Figura 8C es juna serie i de gráficas de dispersión que muestran las distribuciones de I las células en el tejido normal, teñidas con el anticuerpo TAB-004 versus un anticuerpo CXCR4. La Figura 8D es una serie i de gráficas de dispersión que muestran las distribuciones de las células en el tejido de adenocarcinoma pancreático tejido i con el anticuerpo TAB-004 versus un anticuerpo CXCR4j.
Las Figuras 9A-9C son una serie de gráficas de FACS i que muestran que el anticuerpo TAB-004 de la materia de interés actualmente descrita es superior a un Anticuerpo EpCAM estándar en la detección de las células tumórales en circulación en pacientes con cáncer pancreático. Las células no teñidas (líneas negras más a la izquierda) ; células teñidas con EpCAM-PE (0.1 mg/ml) (líneas grises oscuras); células teñidas con TAB-004-PE (0.1 mg/ml) (líneas ¡negras más a la derecha) ; células teñidas con TAB-004-PE (?'?2 mg/ml) i (líneas gris claro) ; células teñidas con TAB-004jpE (0.004 mg/ml) (líneas gris medio) . "-PE" indica que. los anticuerpos i fueron marcados con ficoeritrina para los propósitos de I i clasificación. , i En la Figura 9A, las células madre de células pancreáticas PANC1 fueron detectadas por el TAB- 004 -PE. En las Figuras 9B y 9C, las células ¡tumorales I circulantes presentes en la sangre de dos pacientes | (paciente número 1 y paciente número 2, respectivamente)) fueron detectadas por el anticuerpo TAB-004-PE (ver la línea negra más a la derecha en la Figura 9B y las líneas negra y gris claro más a la derecha en la Figura 9C) pero no el anticuerpo i EpCAM-PE (ver las líneas gris claro en las Figuras ¡ 9B y 9C) que está actualmente en uso. 1 La Figura 10 es una gráfica de barra^ de una comparación del desempeño de un anticuerpo específico para el antígeno CA 15-3 con TAB-004 en un inmunoensayo ehzimático i (EIA) para detectar las células cancerosas en j plasma. i Recuadros blancos: anticuerpo TAB-004. Recuadros I negros: CA15-3. Línea discontinua: corte normal de línea discontinua: corte normal de CA 15-3.
La Figura 11 es una gráfica de barras de una comparación del desempeño de TAB-004 en un inmunoensayo i enzimático (EIA) para detectar los niveles de MUClj difundido en el plasma de pacientes pancreáticos como una furición de la etapa comparada a un EIA basado en CA15-3. Recuadros blancos: anticuerpo TAB-004. Recuadros negros: CA15-3.
BREVE DESCRIPCION DEL LISTADO DE SECUENCIAS La SEQ ID No.: 1 es una secuencia de aminoácidos de un producto del gen MUC1 humano. Ésta corresponde a GENBANK® i Acceso No. AAA60019.
La SEQ ID No. : 2 es una secuencia de aminoácidos de un producto oncogen K-ras humano. Ésta corresponde á GENBANK® 1 Acceso No. NP_004976.
La SEQ ID No. : 3 es una secuencia de aminoácidos del péptido al cual el anticuerpo TAB-004 descrito en la presente puede enlazarse en un ensayo de ELISA. El péptido incluye de este modo un epitopo al cual se enlaza específicamente el anticuerpo TAB-004.
Las SEQ ID Nos . : 4 y 5 son las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos codificados, respectivamente, de la cadena pesada del anticuerpo TAB-004 descrito en la presente .
Las SEQ ID Nos . : 6 y 7 son las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos codificados, respectivamente, de la cadena ligera del anticuerpo TAB-004 descrito en la I presente .
Las SEQ ID Nos.: 8-10 son las secuencias de aminoácidos de CDR1, CDR2 , y CDR3 , respectivamente , de la cadena pesada del anticuerpo TAB-004 descrito en la 'presente.
I Las SEQ ID Nos.: 11-13 son las secuencias de i aminoácidos de CDR1, CDR2, y CDR3 , respectivamente, de la i cadena ligera del anticuerpo TAB-004 descrito en la ¡presente.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION , I La materia de interés actualmente descrita será i ahora descrita más de aguí en adelante con referencia a las ¡ Figuras anexas y a los EJEMPLOS, en los cuales sej muestran i las modalidades representativas de la materia dé interés I actualmente descrita. La materia de interés descrita puede, no obstante, ser encarnada en formas, y no debe ser considerada como limitada a las modalidades descritas en la presente. Más bien, estas modalidades son proporcionadas de modo que esta descripción sea íntegra y completa, y transferirá completamente el alcance de la materia de interés actualmente descrita a aquellos expertos en la técnica.
I . Definiciones La terminología empleada en la presente es para el propósito de describir las modalidades particulares únicamente y no está destinada a ser limitante de lá materia i de interés actualmente descrita. i i Mientras que se cree que los siguientes términos son bien entendidos por una persona de experiencia ordinaria en la técnica, las siguientes definiciones son descritas para facilitar la explicación de la materia de interés actualmente descrita.
Todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente, a no ser que se definan de otro modo más adelante, están destinados a tener i el mismo significado que el que es comúnmente entendidoi por una persona de experiencia ordinaria en la técnica. Las referencias a las técnicas empleadas en la presente, están destinadas a referirse a las técnicas como son comúnmente j entendidas en la materia, incluyendo variaciones sobre esas técnicas o sustituciones de técnicas equivalentes qúe podrían ser aparentes para una persona experta en la técnica. Mientras que se cree que los siguientes términos son bien entendidos por una persona de experiencia ordinaria en la técnica, las siguientes definiciones son descritas para facilitar la explicación de la materia de interés actualmente i descrita.
En la descripción de la materia de interés actualmente descrita, se entenderá que se describen un número de técnicas y pasos. Cada uno de éstos tienen beneficio individual y cada uno pueden también ser utilizados en conjunto con una o más, o en algunos casos todas, las otras I I I técnicas descritas. I En consecuencia, para fines de claridad, esta descripción se abstendrá de repetir cada posible combinación de los pasos individuales de una manera innecesaria. No obstante, la especificación y las reivindicaciones ! deben ser I leídas con el entendimiento de que tales combinaciones están I completamente dentro del alcance de la materia de interés actualmente descrita y reclamada. I i Siguiendo la convención de leyes de patentes de larga permanencia, los términos "un", "uno", "una"i, y "el", "la", "los", "las" se refieren a "uno o más" se utilizan en esta solicitud, incluyendo las reivindicaciones. Por ejemplo, la frase "un anti se refiere a uno o más anticuerpos, incluyendo una dad del mismo anticuerpo. De manera similar, la frase |"al menos uno", cuando se emplea en la presente para referirse a una entidad, se refiere a, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5,¡ 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, o más de esa entidad, incluyendo pero no limitada a los valores de números enteros entre 1 y 100 y mayores de 100. j A no ser que se indique de otro modo, todos los números que expresan cantidades de los ingredientes, condiciones de reacción, y similares utilizados en la i especificación y en las reivindicaciones debe entenderse que son modificados en todos los casos por el! término "aproximadamente". El término "aproximadamente" ,| como se utiliza en la presente, cuando se hace referencia a un valor mensurable tal como una cantidad de masa, peso, tiempo, volumen, concentración, o porcentaje, se entiende que abarca las variaciones en algunas modalidades de ± 20%, en algunas modalidades de ± 10%, en algunas modalidades de ! ± 5%, en i algunas modalidades de ± 1%, en algunas modalidades de + 0.5%, y en algunas modalidades de ± 0.1% de la cantidad especificada, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos descritos y/o emplear las composiciones descritas. En consecuencia, a no ser que se indique de otro modo, los parámetros numéricos descritos ¡en esta especificación y las reivindicaciones anexas son aproximaciones que pueden variar dependiendo J de las propiedades deseadas que se buscan obtener por la materia de interés actualmente descrita.
I Como se utiliza en la presente, el término "y/o" cuando se utiliza en el contexto de una lista de entidades, i I se refiere a las entidades que están presentes solas o en combinación. De este modo, por ejemplo, la frase f'A, B, C, y/o D" incluye A, B, C, y D individualmente, pero también incluye cualesquiera y todas las combinaC|iones y subcombinaciones de A, B, C, y D. I El término "que comprende", que es sinónimo con "que incluye" "que contiene", o "caracterizado ipor", es incluyente o de terminales abiertos y no excluye los elementos y/o pasos del método no indicados, adicionales.
"Que comprende" es un término de la técnica que significa que los elementos y/o pasos nombrados están presentes„ pero que otros elementos y/o pasos pueden ser agregados y todavía caer dentro del alcance de la materia de interés relevante.
Como se utiliza en la presente, la frase "que consiste de" excluye cualquier elemento, paso, o ingrediente no específicamente indicado. Se nota que, cuando la frase "consiste de" aparece en una cláusula del cuerpo de una reivindicación, en vez de seguir inmediatamente el preámbulo, éste limita únicamente el elemento descrito en esa cláusula; otros elementos no son excluidos de la reivindicación como un todo .
Como se utiliza en la presente, la frase "que consiste esencialmente de" limita el alcance de la descripción relacionada o la reivindicación al material y/o pasos especificados, más aquellos que no ' afectan materialmente la o las características básicas y novedosas de la materia de interés descrita y/o reclamada. Por 'ejemplo, una composición farmacéutica puede "consistir esencialmente de" un agente activo farmacéuticamente o una pluralidad de agentes farmacéuticamente activos, lo cual significa que el o los agentes farmacéuticamente activos indicados es/son el o los únicos agentes farmacéuticamente activos presentes en la composición farmacéutica. No obstante, se nota| que los i portadores, excipientes, y/u otros agentes inactivos pueden y probablemente estarían presentes en tal composición farmacéutica. 1 i Con respecto a los términos "que comprende", "que consiste de", y "que consiste esencialmente de", donde uno de i i estos tres términos es utilizado en la presente, la materia de interés actualmente descrita y reclamada puede incluir el i uso de cualquiera de los otros dos términos. Por ej¡emplo, en algunas modalidades, la materia de interés actualmente descrita se refiere a las composiciones que cjomprenden anticuerpos. Podría ser comprendido por una persona de I experiencia ordinaria en la técnica después de la revisión de la presente descripción, que la materia de | interés i actualmente descrita abarca de este modo las composiciones que consisten esencialmente de los anticuerpos de la materia de interés actualmente descrita, así como las composiciones que consisten de los anticuerpos de la materia del interés actualmente descrita. ! i El término "sujeto" como se utiliza en la ¡presente I se refiere a un miembro de cualquiera de las especies de I invertebrados o vertebrados. En consecuencia, el j término I I "sujeto" está destinado a abarcar en algunas modalidades cualquier número del Reino Animal incluyendo, pero no limitado al filum Chordata (por ejemplo, miembros de las Clase Osteichythyes (peces óseos) , Amphibia (janfibios) , Reptilia (reptiles) , Aves (pá ros) , y Mam alia (mamíferos) , -y todos los Órdenes y Familias abarcados en éstos. ' Las composiciones y métodos de la materia de i interés actualmente descrita son particularmente útiles para vertebrados de sangre caliente. De este modo, n algunas modalidades, la materia de interés actualmente de iscrita se refiere a mamíferos y aves. Más en particular, se Ii proporcionan las composiciones y los métodos derivados de y/o para el uso en mamíferos tales como humanos y otros primates , así como aquellos mamíferos de importancia debido a que están mascotas o en zoológicos) para los humanos, por¡ ejemplo, carnívoros diferentes de los humanos (tales comoi gatos y I perros) , cerdos (puercos, verracos y jabalís silvestres) , rumiantes (tales como reces, bueyes, ovejas, j irafas, I venados, cabras, bisontes y camellos), roedores (tales como ratones, ratas y conejos), marsupiales, y caballos: También i se proporciona el uso de los métodos y las composiciones descritas en pájaros incluyendo aquellos tipos de pájjaros que i están en peligro, mantenidos en zoológicos, así como¡ las aves de corral, y más particularmente aves de corral domesticadas, por ejemplo, aves de corral tales como pavos, pollos, patos, gansos, gallina de guinea, y similares, ya también de importancia económica para humanos también se proporciona el uso de los métodos descritas en ganado, incluyendo pero no limitadol a cerdos i domesticados (cerdos y verracos) , rumiantes, caballos, aves I de corral, y similares.
De manera similar, todos los genes, nombres de genes, y productos génicos descritos en la presente están destinados a corresponder a los homólogos y/u j ortólogos provenientes de cualquier especie para la cual sean aplicables las composiciones y métodos descritos en la presente. De este modo, los términos incluyen, pero no están limitados a los genes y productos humanos y ratones. Se entiende que génico proveniente de una especie particular es | descrito, i ¦ esta descripción está destinada a ser ejemplar únicamente, y no debe ser interpretada como una limitación a no ser que el contexto en el cual aparezca lo indique claramentej. De este modo, por ejemplo, para los genes Accesos Nos: AAA60019 y NP_004976, aminoácidos descritas están destinadas a abarcar los genes I homólogos y los productos génicos homólogos provenientes de otros animales incluyendo, pero no limitados ! a otros i mamíferos, peces, anfibios, reptiles, y aves. También son I abarcadas cualesquiera y todas las secuencias de nucleótidos que codifiquen para las secuencias de incluyendo pero no limitadas a aque entradas correspondientes de GENBA K® NM_004985, respectivamente). j I Los términos "cáncer" y "tumor" son ¡utilizados i intercambiablemente en la presente y pueden referirse a i tumores sólidos primarios y metastatizados y carcinomas de i cualquier tejido en un sujeto, incluyendo pero no limitados a i cánceres de mama; colon; recto; pulmón; oirofaringe; i femenino incluyendo el cérvix, útero, ovarios (por ejemplo, i coriocarcinoma y trastorno trofoblástico gestacional) ; tracto I genital masculino incluyendo próstata, vesículas seminales, testículos y tumores de células germinales, ¡glándulas endocrinas incluyendo tiroides, adrenales y pituitarias; piel i (por ejemplo, hemangiomas y melanomas) , hueso o tejidos blandos; vasos sanguíneos (por ejemplo, sarcoma dej Kaposi) ; cerebro, nervios, ojos y meninges (por ejemplo, astr' citomas , gliomas, glioblastomas , retinoblastomas , neuromas, neuroblastomas , Schwanomas y meningiomas) . Como se utiliza en la presente, los términos "cáncer" y "tumor" están también destinados a referirse a tumores multicelulares así como a células neoplásicas o preneoplásicas individuales . En algunas modalidades, un cáncer o un tumor que comprende n cáncer o tumor de un tejido epitelial tal como, pero no limitado a un carcinoma. En algunas modalidades, un tumor es un adenocarcinoma, el cual en algunas modalidades es un adenocarcinoma del páncreas, mama, ovario, colon, o recto, y/o una célula metastática derivados de éstos.
Como se utiliza en la presente en el contexto de las moléculas, el término "efector(a)" se refiere a cualquier molécula o combinación de moléculas cuya actividad sea deseada para distribuir/dentro y/o localizarse en una célula. Las efectoras o efectores incluyen, pero no están limitados a marcadores, citotoxinas, enzimas, factores de crecimiento, factores de transcripción, fármacos, etc.
Como se utiliza en la presente en el contexto de las células del sistema inmunitario, el término "efector" se refiere a una célula del sistema inmunitario que puede ser inducida a realizar una función específica asociada con una respuesta inmunitaria hacia un estímulo. Las células efectoras ejemplares incluyen, pero no están limitadas a las células asesinas naturales (NK) y las células T citotóxicas (células Tc) . ' Como se utiliza en la presente, el término "vector de expresión" se refiere a una secuencia de ADN capaz de dirigir la expresión de una secuencia nucleotídica particular en una célula hospedera apropiada, que comprende un promotor I operativamente enlazado a la secuencia nucleótídica de interés que es operativamente enlazada a las señales de terminación. Ésta comprende también típicamente las secuencias requeridas para la traducción adecuada de la i secuencia de nucleótidos. La construcción que comprende la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérica. La construcción puede también ser una que sea de origen natural i pero ha sido obtenida en una forma recombinante útil para la I expresión heteróloga. En algunas modalidades, el ¡vector de expresión comprende una molécula aislada de ácido nucleico de en ID 7- 13. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico i aislada presente dentro de un vector de expresión, está operablemente enlazada a una o más secuencias nucleotídicas i adicionales que codifican para las subsecuencias de las moléculas de anticuerpo tal que, después de la introducción del vector de expresión dentro de un hospedero apropiado, un anticuerpo recombinante intacto que comprende una lo más de las SEQ ID Nos.: 5 y 7-13, o un fragmento o derivado del i mismo, es expresado por la célula hospedera. j Como se utiliza en la presente, el, término "hibridoma" se refiere a una célula o línea celular que es producida en el laboratorio a partir de la fusión de un linfocito productor de anticuerpo y una célula cancerosa no productora de anticuerpo, usualmente una célula dJ mieloma o de -linfoma. Como podría ser conocido por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, un hibridoma puede proliferar y producir un suministro continuo de un ¡anticuerpo I monoclonal específico. Los métodos para generar Jhibridomas son conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Harlpw y Lañe, 1988) . I Como se utilizan en la presente, los( términos "operablemente enlazado" y "operativamente enlazado" se i refieren a los elementos regulatorios de la transcripción (tales como, pero no limitados a secuencias promotoras, secuencias terminadoras de la transcripción, etc.) ¡que están i conectadas a una secuencia de nucleótidos (por ejemplo, una secuencia de codificación o estructura de lectura a¿ierta) de una manera tal que la transcripción de la i secuencia i nucleotídica sea controlada y regulada por ese j elemento i regulatorio transcripcional . De manera similar, se i dice que una secuencia nucleotídica está bajo el "control transcripcional" de un promotor al cual ésta está I-operablemente enlazada. Las técnicas para ¡ enlazar operativamente una secuencia promotora a una de nucleótidos, son conocidas en la materia.
Como se utiliza en la presente, el, término "profármaco" se refiere a un análogo y/o un precursor de un fármaco (por ejemplo, un agente citotóxico) que sustancialmente carece de la actividad biológica del fármaco (por ejemplo, una actividad citotóxica) hasta que és sometido a un paso de activación. Los pasos de activación pueden incluir la escisión enzimática, pasos de activacipn química tales como la exposición a un agente reductor pasos de activación física tales como la fotolisis. algunas modalidades, la activación ocurre in vivo dentro kel cuerpo de un sujeto, II. Anticuerpos, Fragmentos y Derivados de los ¡Mismos, y Métodos de Producción de los Mismos II. A. Generalidades La materia de interés actualmente ¡ descrita proporciona en algunas modalidades los anticuerpos aislados , I así como los fragmentos y los derivados de los mismos, que se i enlazan a los antígenos presentes dentro de los tumores tales como, pero no limitados a los antígenos presentes 'dentro de los polipéptidos MUC1. | Í Como se utiliza en la presente, los i términos "anticuerpo" y "anticuerpos" se refieren a las protieínas que i comprenden uno o mas polipéptidos sustancialmente codificados por los genes de inmunoglobulina o fragmentos de los genes de I inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina j incluyen i típicamente los genes de la región constante kappa ( ) , lambda (?) , alfa (a), gamma (?) , delta (d) , épsilon ( e ) , y mu (µ), así como una miríada de genes de la región variable de inmunoglobulin . Las cadenas ligeras son clasificadas ya sea como o ?. En mamíferos, las cadena pesadas son clasificadas I como y, µ, OÍ, d, o e, las cuales a su vez definen |las clases de inmunoglobulina, IgG, IgM, IgA, IgD, j e IgE, respectivamente. Otras especies tienen otros genjes de las cadenas ligeras y pesadas (por ejemplo, ciertas ave's producen I la que es denominada como la IgY, que es urí tipo de i inmunoglobulina que las gallinas depositan en las yemas de sus huevos) , que son similarmente abarcados por la materia de interés actualmente descrita. En algunas modalidades, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo que se enlaza específicamente a un epitopo que está presente sobre un antígeno tumoral que incluye, pero no limitadas al polipéptido MUCl y/o un polipéptido K-ras mutante. En algunas modalidades, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo que se enlaza específicamente a un epitopo i ¦ presente dentro de cualquiera de las SEQ ID Nos.: 1-13. i Una unidad estructural de inmunoglobulina típica (anticuerpo) se sabe que comprende un tetráméro. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos dje cadenas polipeptídicas , teniendo cada par una cadena "lige'ra" (peso molecular promedio de aproximadamente 25 kiloDaltones (kDa) ) I y una cadena "pesada" (peso molecular promedio de 1 aproximadamente 50-70 kDa) . Los dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas son mantenidos juntos en forma aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígenos (algunas veces denominados como el "parát'opo") . Los i términos cadena ligera variable (VL) y cadena pesada variable (VH) se refieren a estas cadenas ligeras pesadas, respectivamente. i Los anticuerpos existen típicamente como unas i inmunoglobulinas intactas o como un número de fragmentos bien i caracterizados que pueden ser producidos por digestión con i diversas peptidasas. Por ejemplo, la digestión de una molécula de anticuerpo con papaína rompe el anticuerpo en la posición N-terminal a los enlaces disulfuro. Esto produce tres fragmentos: dos fragmentos "Fab" idénticos, los cuales tienen una cadena ligera y el terminal N de la caderia pesada, y un fragmento "Fe" que incluye el terminal C de las cadenas pesadas mantenidas juntas por los enlaces disuífuro. La I pepsina, por otra parte, digiere un anticuerpo C-terminal al i enlace disulfuro en la región de bisagra para producir un fragmento conocido como el fragmento "F(ab) '2", que es un i dímero de los fragmentos Fab unidos por el enlace disulfuro.
El fragmento F(ab) 12 puede ser reducido bajo condiciones leves para romper el enlace disulfuro en la de bisagra, con lo cual se convierte el dímero F(ab')2 en dos monómeros de "Fab" . El raonómero Fab' es esencialmente un fragmento Fab con parte de la región de bisagra (ver por ejemplo, Paul, 1993, para una descripción más detallada de los otros fragmentos de anticuerpo) . Con respectio a estos diversos fragmentos, los fragmentos Fab, F(ab')j2, y Fab' incluyen al menos un dominio de enlace al antígeno, intacto (parátopo) , y de este modo son capaces de enlazarse a los antígenos . I Mientras que son definidos diversos fragmentos de anticuerpo en términos de la digestión de un ¡anticuerpo intacto, una persona de experiencia apreciará que varios de estos fragmentos (incluyendo, pero no limitados a fragmentos Fab') pueden ser sintetizados de novo ya sea químicamente o mediante la utilización de metodología de ADN recombinante .
I De este modo, el término "anticuerpo" como se utiliza en la ¡ presente, también incluye los fragmentos de ¡anticuerpo producidos por la modificación de los anticuerpos completos y/o sintetizados de novo utilizando las metodologías de ADN recombinante . En algunas modalidades, el término "anticuerpo" comprende un fragmento que tiene al menos un de enlace al antígeno (parátopo) . j Los anticuerpos pueden ser policlpnales o monoclonales . Como se utiliza en la presente, el término "policlonal" se refiere a los anticuerpos que estánl presentes i juntos en una colección dada de anticuerpos y que son I derivados de diferentes células productoras de ¡anticuerpo (por ejemplo, células B) . Los anticuerpos lonales ejemplares incluyen, pero no están limitados á aquellos anticuerpos que se enlazan a un antígeno particular, y que son encontrados en la sangre de un animal después de que ese animal ha producido una respuesta inmunitaria ¡contra el antígeno. No obstante, se entiende que la preparación policlonal de los anticuerpos puede también ser preparada artificialmente mediante el mezclado de al menos dos anticuerpos no idénticos. De este modo, los anticuerpos i póliclonales incluyen típicamente diferentes anticuerpos que son dirigidos contra (por ejemplo, se enlazan a) el1 mismo y/o I diferentes epitopos (algunas veces denominados . como un "determinante antigénico" o solo "determinante") de¡ cualquier antígeno dado.
Como se utiliza en la presente, el término "monoclonal" se refiere a una especie de anticuerpo simple y/o a una población sustancialmente homogénea de una especie de anticuerpo simple. Dicho de otra manera, "monoclonal" se refiere a los anticuerpos individuales o de las poblaciones de anticuerpos individuales en los cuales los anticuerpos son idénticos en especificidad y afinidad, excepto ¡ por las posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Típicamente, un anticuerpo í monoclonal (mAb o raoAb) es generado por una célula jB simple o una célula de progenie de la misma (aunque la materia de interés actualmente descrita también abarca los anticuerpos "monoclonales" que son producidos mediante téjcnicas de biología molecular como se describen en la presente) . Los i anticuerpos monoclonales (mAbs o moAbs) son j altamente específicos, siendo dirigidos típicamente contraj un sitio antigénico simple. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpo policlonal, un mAb dado es típicamente dirigido contra un epitopo simple sobre el antígeno. j i Además de su especificidad, los mAbs pueden ser ventajosos para algunos propósitos ya que éstos pueden ser sintetizados no contaminados por otros anticuerpos . El modificador "monoclonal" no debe ser construido como que requiere producción del anticuerpo por algún método particular, no obstante. Por ejemplo, en algunas modalidades, i los mAbs de la materia de interés actualmente descrita son í preparados utilizando la metodología de hibridoma, I primeramente descrita por Kohler et al., 1975, y ejn algunas modalidades son elaboradas utilizando los métodos de ADN recombinante en células procarióticas o eucarióticas (ver por I ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4, 816; 567, los contenidos completos de la cual se incorporan por referencia en la presente) . Los mAbs pueden también ser aislados a partir de bibliotecas de anticuerpos fagos utilizando las técnicas descritas en, por ejemplo, Clackson et al., 1991 y arks et al . , 1991.
Los anticuerpos, fragmentos, y derivakos de la materia de interés actualmente descrita pueden también incluir anticuerpos quiméricos. Como se utiliza en la presente en el contexto de los anticuerpos, él término "quimérico", y variantes gramaticales del mismo, se refiere a los derivados de anticuerpo que tienen regiones | constantes derivadas sustancial o exclusivamente de las¡ regiones constantes de anticuerpo provenientes de una especie y las regiones variables derivadas sustancial o exclusi amente de la secuencia de la región variable de otra especie.1 La región variable permite que un , janticuerpo reconozca selectivamente y se enlace específicamente a los epitopos sobre los antígenos. Es decir, el dominio VL y el dominio VH, o los subgrupos de las regiones determinación de la complementariedad (CDRs) dentro de estos I dominios variables, de un anticuerpo se combinan para formar la región variable que define un sitio de enlace al' antígeno tridimensional . Esta estructura de anticuerpo cuaternario forma el sitio de enlace al antígeno, presente en el terminal de cada brazo del anticuerpo. Más específicamente ¡ el sitio de enlace al antígeno es definido por tres CDRs sobre cada una de las cadenas VH y VL. En algunos casos (por ejemplo, ciertas moléculas de inmunoglobulina derivadas de especies de .
I i camélidos o manipuladas por ingeniería con | base en inmunoglobulinas de camélidos) , una molécula de inmunoglobulina completa puede consistir de cadenjas pesadas únicamente sin cadenas ligeras (ver por ejemplo, Hamers-Casterman et al., 1993) . J En los anticuerpos de origen natural, existen seis i CDRs presentes en cada dominio de enlace al antígeno que son i secuencias no contiguas, cortas, de aminoácidos que son específicamente colocadas para formar el domino del enlace al I antígeno ya que el anticuerpo asume su conjfiguración tridimensional en un ambiente acuoso. El restjo de los aminoácidos en el domino de enlace al antígeno, denominadas como regiones "estructurales", muestran menos variabilidad inter-molecular . Las regiones estructurales adoptan en gran i medida una conformación de lámina ß y las CDRs forman rizos i que conectan, y en algunos casos forman parte de, la i estructura de lámina ß. De este modo, las ¡ regiones i estructurales actúan para formar un andamiaje que proporciona el posicionamiento de las CDRs en la orientaciónj correcta mediante interacciones inter-catenarias, no . El domino de enlace al antígeno formado CDRs posicionadas , define una superficie complementaria al epitopo i sobre el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie i complementaria promueve el enlace no covalente del anticuerpo a su epitopo cognado. Los aminoácidos que comprenden las CDRs ., ; , ; n y u, .
Un tipo particular de anticuerpo quimérico es un anticuerpo "humanizado", en el cual los son producidos por la sustitución de las CDRs de, un anticuerpo de ratón, para las CDRs de un anticuerpo humano (ver por ejemplo, Solicitud de Patente Internacional del PCT 1 Publicación No. O 1992/22653) . De este modo, en algunas I modalidades, un anticuerpo humanizado tiene 1 regiones constantes y regiones variables diferentes de CDRs que son I derivadas sustancialmente o exclusivamente de las regiones correspondientes de un anticuerpo humano, y las CDRs que son derivadas sustancialmente o exclusivamente de un 1 mamífero I diferente de un humano. , Los anticuerpos, fragmentos, y derivado's de la materia de interés actualmente descrita pueden también ser anticuerpos de cadena simple y fragmentos de anticuerpo de cadena simple. Los fragmentos de anticuerpo de cadena simple contienen secuencias de aminoácidos que tienen al menos una 1 de las regiones variables y/o las CDRs de los anticuerpos I . completos descritos en la presente, pero están carecjiendo de 1 1 I I I algunos o de todos los dominios constantes de esos anticuerpos. Estos dominios constantes no son necesarios para el enlace al antígeno, pero constituyen una porción mayor de I la estructura de los anticuerpos completos .
Los fragmentos de anticuerpo de cadena simple pueden superar algunos de los problemas asociados con el uso de los anticuerpos que contienen una parte o todo de un dominio constante. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo de cadena simple tienden a estar libres de interacciones no deseadas entre las moléculas biológicas y la región constante de cadena pesada, y/u otras actividades biológicas no i deseadas. Además, los fragmentos de anticuerpo de cadena simple son considerablemente más pequeños que los anticuerpos i completos y pueden por lo tanto ser caracterizados por mayor permeabilidad capilar que los anticuerpos completos, permitiendo que los fragmentos de anticuerpo de cadena simple se localicen y se enlacen a los sitios de enlace al antígeno, objetivo, de manera más eficiente. También, los fragmentos de anticuerpo pueden ser producidos a una escala relativamente grande en células procarióticas , facilitando de este modo su producción. Además, el tamaño relativamente pequeño de los fragmentos de anticuerpo de cadena simple hace menos probable que los anticuerpos completos provoquen una respuesta inmunitaria en un recipiente (paciente) . Los fragmentos de anticuerpo de cadena simple de la materia de interés actualmente descrita incluyen, pero no están limitados a anticuerpos variable de fragmento de cadena simplje (scFv) y derivados de los mismos tales como, pero no limit dos a di-scFv en tándem, tri-scFv en tándem, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos , minianticuerpos, y minicuerpos. j Los fragmentos Fv corresponden a los (fragmentos i variables en los terminales N de las cadenas .pesadas y ligeras de inmunoglobulina . Los fragmentos Fv parfecen tener menor energía de interacción de sus dos cadenas que los fragmentos Fab. Para de los dominios del VH y VL, és péptidos (ver por ejemplo, Bird et al., 1988; Huston et al., 1988), puentes disulfuro (ver por ejemplo, Glockshubeij- et al., 1990) , y/o mutaciones de "perilla en hoyo" (ver por ejemplo, Zhu et al., 1997). Los fragmentos de ScFv pueden ser producidos por métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica (ver por ejemplo, hitlow et al., 19¡91; Huston et al. , 1993) . j El scFv puede ser producido en células bacterianas ¡ tales como E. coli o en células eucarióticas . Una ventaja potencial del scFv es la monovalencia del producto, la cual puede excluir una avidez incrementada debido al enlace polivalente, y su vida media corta. Los intentos para superar I estos problemas incluyen el (scFv bivalente producido a partir del scFv que contiene una cisteína C-terminal adicional mediante acoplamiento químico (ver por ejemplo, Adams et al., 1993; McCartney et al., 1995) o por dimerización espontánea específica del sitio de' scFv que contiene un residuo de cisteína C-terminal no apareado (ver por ejemplo, Kipriyanov et al., 1995). j Alternativamente, el scFv puede ser I forzado a I formar multímeros mediante el acortamiento del j enlazador I peptídico a 3 a 12 residuos para formar "diacuerpos" (ver por ejemplo, Holliger et al., 1993). La reducción del ligador todavía puede dar como resultado además trímeros de scFv ( " triacuerpos" ; ver por ejemplo, Kortt et al . ,j 1997) y tetrámeros ( " tetracuerpos" ; ver por ejemplo, Le Gall et al., 1999) . La construcción de scFv bivalentes puede también ser lograda mediante fusión genética con pordiones de I dimerización de proteína para formar "minianticuerpos" (ver por ejemplo, Pack et al., 1992) y "minicuerpos" ; (ver por I ejemplo, Hu et al., 1996). Los tándems scFv-scFv¡ ((scFv)2) pueden ser producidos mediante el por un tercer ligador peptídico al. , 1995) . j Los diacuerpos biespecíficos pueden ser producidos I a través de la asociación no covalente de dos productos de fusión de cadena simple que consisten del dominio VH i proveniente de un anticuerpo conectado por un ligádor corto i al dominio de VL de otro anticuerpo (ver por j ejemplo, Kipriyanov et al., 1998). La estabilidad de tales diacuerpos biespecífieos puede ser mejorada por la introducción de i puentes disulfuro o mutaciones de "perilla en hoyó" como se describe anteriormente en la presente o por la formación de los diacuerpos de cadena simple (scDb, por sus siglas en inglés) en donde dos fragmentos de scFv híbridos son conectados a través de un ligador peptídico (ver por ejemplo, Kontermann et al., 1999) .
Las moléculas biespecíficas tetravalentes pueden ser producidas, por ejemplo, mediante la fusión de un fragmento scFv al dominio CH3 de una molécula de IgG o a un fragmento Fab a través de la región de bisagra ; (ver por ejemplo, Coloma et al., 1997). Alternativamente, las moléculas biespecíficas tetravalentes han sido ' creadas mediante la fusión de diacuerpos de cadena simple biespecíficos (ver por ejemplo, Alt et al., 1999). Las moléculas biespecíficas tetravalentes más pequeñas pueden también ser formadas mediante la dimerización de cualquiera de los tándems scFv-scFv con un ligador que contiene una porción de hélice-rizo-hélice (minianticuerpos DiBi; ver por ejemplo, Muller et al., 1998) o una molécula de cadena simple que comprende cuatro dominios variables de anticuerpo (VH y VL) en una orientación que previene el apareamiento intramolecular (diacuerpo en tándem; ver por ejemplo, Kipriyanov et al., 1999).
Los fragmentos F(ab' )2 biespecífieos ser creados mediante el acoplamiento químico de los | fragmentos Fab' o por heterodimerización a través de cremalleras de leucina (ver por ejemplo, Shalaby et al., 1992; Kostelny et al., 1992). También están disponibles los dominaos VH y VL aislados (ver Patentes de los Estados Unidos Nos . j 6 , 172 , 197 ; 6, 248, 516; y 6, 291, 158) . I I La materia de interés actualmente descrita también incluye equivalentes funcionales de los de la materia de interés actualmente descrita. Como se jutiliza en la presente, la frase "equivalente funcional" conforme ésta se refiere a un anticuerpo, se refiere a una mJlécula que tiene características de enlace que son comparables a aquellas de un anticuerpo dado. En algunas modalidades, los anticuerpos de cadena simple quimerizados, y humanizados, así como los fragmentos de los mismos, son considerados equivalentes funcionales de los anticuerpos sobre los cuales éstos están basados. En algunas modalidades, la materia de interés actualmente descrita proporciona i equivalentes funcionales del TAB-004 mAb descrito en la I presente. i Los equivalentes funcionales tambiénj incluyen polipéptidos con secuencias de aminoácidos sustancialmente iguales que la secuencia de aminoácidos de las regiones variables o hipervariables de los anticuerpos de la materia de interés actualmente descrita. Como se utiliza i en algunas modalidades al menos 91%, en algunas I modalidades al menos 92%, en algunas modalidades al menos i 93%, en algunas modalidades al menos 94%, en algunas I modalidades al menos 95%, en algunas modalidadesj al menos 96%, en algunas modalidades al menos 97%, en algunas modalidades al menos 98%, y en algunas modalidades al menos aproximadamente 99% de identidad secuencial a otra i secuencia de ácido nucleico y/o de aminoácidos,1 como se I determina por el método de búsqueda FASTA de acuerdo con Pearson y Lipman, 1988. En algunas modalidades, ejl cálculo de identidad porcentual es realizado sobre la j longitud completa de la secuencia de ácido nucleico' y/o de í aminoácidos de un anticuerpo de la materia dé interés actualmente descrita.
En algunas modalidades, un equivalente funcional de una secuencia nucleotídica es una secuencia que codifica para i la misma secuencia de aminoácidos (es decir, que iricluye uno o más codones funcionalmente equivalentes) . Un de codones funcionalmente equivalente se presenta en 1.
Tabla 1 Codones Funcionalmente Equivalentes Aminoácidos Codones Alanina (Ala o A) GCA; GCC; GCG; GCU Cisteína (Cys o C) UGC; UGU Ácido Aspártico (Asp o D) GAC; GAU Ácido glutámico (Glu o E) GAA; GAG Fenilalanina (Phe o F) UUC; UUU Glicina (Gly o G) GGA; GGC; GGG; GGU Histidina (His o H) CAC; CAU Isoleucina (lie o I) AUA; AUC; AUU Lisina (Lys o K) AAA; AAG Metionina (Met o M) AUG Asparagina (Asn o N) AAC; AAU Prolina (Pro o P) CCA; CCC; CCG; CCU Glutamina (Gln o Q) CAA; CAG Treonina (Thr o T) ACA; ACC; ACG; ACU Valina (Val o V) GUA; GUC; GUG; GUU Triptofano (Trp o W) UGG Tirosina (Tyr o Y) UAC; UAU Leucina (Leu o L) UUA; UUG; CUA; CUC; Arginina (Arg o R) AGA; AGG; CGA; CGC; Serina (Ser o S) ACG; AGU; UCA; UCC; En algunas modalidades, un equivalente de una secuencia dada de aminoácidos es un aminoácido icón una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos. La sustitución conservadora de aminoácido se refiere a la sustitución de un aminoácido clase (por ejemplo, valina lisina) . Los polipéptidos que a los fragmentos prouroguanilina y/o fragmentos de prouroguanilina pueden ser elaborados utilizando mutagénesis aleatoria sobre los ácidos nucleicos de codificación mediante técnicas bien conocidas por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Es más probable, sin embargo, 'que tales polipéptidos serán generados mediante mutagénesis dirigida al sitio (utilizando nuevamente técnicas bien conocidas por aquellos que tengan experiencia ordinaria en laj técnica) .
Estos polipéptidos pueden tener funcionalidad incrementada o I funcionalidad disminuida. j ,i„ Los equivalentes funcionales pueden también incluir i fragmentos de anticuerpos que tienen las mismas o comparables i características de enlace a aquellas de un ¡anticuerpo completo de la materia de interés actualmente descrita. Tales fragmentos pueden contener uno o ambos fragmentojs Fab, el fragmento F(ab')2, el fragmento F(ab'), un fragm nto Fv, o cualquier otro fragmento que incluya al menos un kominio de enlace al antígeno. En algunas modalidades, los fragmentos de anticuerpo contienen las seis CDRs de un anticuerpo completo i de la materia de interés actualmente descrita (por ejemplo, comprenden las CDRs que comprenden cada una de las SEQ ID Nos.: 8-13), aunque los fragmentos que contienenl menos que todas las regiones, tales como tres, cuatro o cjinco CDRs, pueden también ser equivalentes funcionales como 'se definen en la presente. Ademas, los equivalentes funcionales pueden ser o pueden combinar miembros de cualquiera de las siguientes clases de inmunoglobulinas : IgG, igM, IgA, IgD, e IgE, y las subclases de las mismas, así como otras subclases como pueden ser apropiadas para los sujetos no mamíferos (por i ejemplo, IgY para pollos y otras especies de aves) ,1 Los equivalentes funcionales también 1 incluyen aptameros y otras moléculas no anticuerpos, con la condición de que tales moléculas tengan las mismas o comparables características de enlace a aquellas de un anticuerpo completo de la materia de interés actualmente descrita.
En algunas modalidades, los anticuerpos, fragmentos, y derivados de los mismos se seleccionan del grupo que consiste del anticuerpo monoclonal' TAB-004 producido por la línea de células hibridomas ATCC: No. PTA-11550, así como los anticuerpos quiméricos o los fragmentos o los derivados de los mismos, los anticuerpos humanizados o los fragmentos o los derivados de los mismos, los anticuerpos de cadena simple o los fragmentos o los derivados de los mismos, los fragmentos Fab de los mismos, los fragmentos F(ab' ) 2 de los mismos, los fragmentos Fv de los mismos, y los fragmentos mismos. En algunas modalidades, los fragmentos, y derivados de la materia actualmente descrita tienen las características j de enlace del anticuerpo monoclonal TAB-004. En algunas mo'dalidades , i los anticuerpos, fragmentos, y derivados de la materia de i interés actualmente descrita tienen al menos algunos y en i algunos casos todas las características de enlace del anticuerpo monoclonal TAB-004. En algunas modalidades, los i anticuerpos, fragmentos, y derivados de la interés actualmente descrita se enlazan a presente dentro de cualquiera de las SEQ ID Nos.j: 1-3, en algunas modalidades un epitopo presente dentro ele la SEQ ID No. : 3. I i Como se utiliza en la presente, el término "TAB- 004" se refiere a un mAb que es producid línea de células hibridomas designada "TAB-0 ue fue depositada con la American Type Culture (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, 20110- 2209, Estados Unidos de América, el 16 de Diciembre del 2010 bajo el Acceso No. PTA-11550 de conformidad a los i términos del Tratado de Budapest. TAB-004 es unj mAb del I isotipo IgG que se ha encontrado que se enla'za a un epitopo presente sobre un polipéptido de mucina-!l humana (MUC1) . Más particularmente, en algunas modalidades, TAB- 004 puede enlazarse a un epitopo presente dentro de la SEQ i ID No.: 3. TAB-004 mismo comprende las secuencias de CDR i descritas en las SEQ ID Nos. 8-13. i I Como se utiliza en la presente, el término "MUC1" se refiere a una molécula definida como sigue. MUC1 es una de la familia de moléculas de mucina epiteliales. MUC1 es ampliamente expresada sobre un número grande de cánceres epiteliales y está aberrantemente glucosilada, haciéndola estructural y antigénicamente distinta de aquella expresada i por las células no malignas (ver por ejemplo, Barratt-Boyes , 1996; Price et al., 1998; Peterson et al., 1991). La forma i dominante de MUC1 es una molécula de alto peso¡ molecular comprendida de un dominio similar a la mucina extracelular, altamente inmunogénica, con un número grande de repeticiones en tándem de veinte aminoácidos, una región transmembranal , y una cola citoplásmica (Quin et al., 2000; cGucken et al., 1995; Dong et al., 1997).
MUC1 es sobre-expresado y aberrantemente glucosilado en la mayoría de los adenocarcinomas epiteliales incluyendo de mama y de páncreas. El adenocarcinoma de mama y de páncreas no solamente sobre-expresa MUC1 sino también dispersa a MUC1 hacia la circulación. Los altos niveles en suero de MÜC1 están asociados con la enfermedad progresiva. MUC1 ha sido explotado como un biomarcador prospecto debido a la I I I naturaleza compleja y heterogénea de los| epitopos I expresados dentro del antígeno. MUC1 sintetizado por los tejidos cancerosos usualmente muestra un perfil de oligosacárido aberrante, el cual dio origen a expresión de los neomarcadores tales como sialil-Lea (evaluado en la prueba CA19-9) , sialil-Lex, y sialil-Tn (TAG-72)',, así como I los epitopos crípticos tales como Tn. | i Además, debido a la superglucosiláción, el i núcleo peptídico de la mucina se llega a exponer tal que i los epitopos dentro del núcleo que no son accesibles I dentro del MUC1 derivado de tejido normal, pueden servir como biomarcadores potenciales. De este modo, las diferencias entre el tejido normal versus el maligno pueden proporcionar epitopos distintos que pueden mostrar más alta especificidad por los tejidos ¡malignos. í Actualmente, las pruebas para varios de estos¡ epitopos i están disponibles en forma comercial para el uso en el manejo de pacientes incluyendo CA15-3 ¡ (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinoise, Estados Unidos de i América) , CA 27-29 (Bayer Diagnostics, TarrytLown, New York, Estados Unidos de América) , y CA19-9 (Panojmics Inc, Redwood City, California, Estados Unidos de América) .
Hasta ahora, ninguno ha probado ser de valor diagnóstico i particular, probablemente debido al menos en parte a la baja especificidad como se muestra en la Tabla 2 Tabla 2 1 I * adaptado de Perkins et al., 3002.
Recientemente, otro anticuerpo MUCl conocido como PAM4 ha ganado atención para el uso en el diagnóstico de cáncer pancreático debido a su alta sensibilidad y especificidad para el cáncer pancreático, 1 pero no cualesquiera otros cánceres epiteliales tales como cánceres de mama y ovario (Gold et al., 2007) .
El tejido epitelial normal, MUCl está localizado hacia la región apical de las células. La transformación maligna da como resultado la regulación de MUCl por amplificación del gen y/o la activación transcripcional incrementada y la distribución de MUCl sobre la superficie celular ya no está confinada a la región apical ¡ (Bieche y Lidereau, 1997) . Mientras que la función de MUCl todavía espera aclaración, la alta expresión citoplásmica de MUCl ha estado asociada con el pobre pronóstico en pacientes con cánceres de mama y/u ovario.
MUCl ha demostrado también que juega un papel en la adhesión celular, la señalización celular, y las respuestas inmunitarias (Quin et al., 2000; McGucken et al., 1995; Dong et al., 1997; Henderson et al., 1998) . Un ejemplo no limitante de una secuencia de aminoácidos de un producto MUCl proveniente de humanos, es presentada en la SEQ ID No.: 1. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de los (productos del gen MUCl provenientes de otras especies incluyen GENBA K® Acceso Nos.: AAA39755, Q02496, y NP_038633 (ratón), NP_036734 (rata) , NP_001 181906 (perro) , AA063589 (cerdo) , y NP_776540 I I (vaca) .
Además, se ha determinado que TAB- a los polipéptidos K-ras, y en particular, los K- ras mutantes. Como se utiliza en la presente, el término "K-ras" se refiere a un gen del oncongen K-ras y los productos génicos del mismo (ver por ejemplo, Kahn et al. J 1987) . Un producto de gen K-ras ejemplar es el producto delj gen K-ras humano que incluye, pero no está limitado a aquél descrito como la SEQ ID No. : 2, que corresponde a GENBANK® | Acceso No. NP_004976.
Como se utiliza en la presente, el término "K-ras" también abarca las formas mutadas de K-ras. Como se utiliza en la presente, los términos "K-ras imitados", "polipéptido de K-ras mutado", y "proteína K-ras mutante" sé utilizan intercambiablemente para referirse a un polipéptido K-ras que comprende al menos una mutación K-ras en comparación a la SEQ I ID No. : 2. En algunas modalidades, un polipéptido K-ras mutante comprende una mutación ya sea en el j número de aminoácido 12 ó 13 del polipéptido maduro (es j decir, la posición de aminoácido 13 ó 14 de la SEQ ID No. : 2> ya que el polipéptido maduro podría no incluir el residuo de metionina en la posición 1 de la SEQ ID No. : 2) . Én algunas modalidades, un polipéptido K-ras mutante comprende una i mutación seleccionada de entre una mutación de glicina- 12 a serina (denominada en la presente como "G12S"), G12V, G12D, G12A, G12C, G13A, y G13D. Un ejemplo representativo de un polipéptido K-rasG12D mutante al cual se enlazan los anticuerpos de la materia de interés actualmente descrita en parte es mostrado en la SEQ ID No. : 2 y descrito en Kahn et al., 1987. En algunas modalidades, los anticuerpos , y los fragmentos y los derivados de los mismos, de la 'materia de interés actualmente descrita se enlazan a una porción de un i polipéptido K-ras que comprende una mutación G12D (denominada ¡ en la presente como " K-ras G12D mutante" o "K-rasG12D" ) . Los i polipéptidos de K-ras mutante ejemplares, adicionales, incluyen, pero no están limitados a, variantes ! alélicas, variantes de empalme, variantes . derivadas, variantes de i sustitución, variantes de supresión, variantes de inserción, polipéptidos de fusión, ortólogos y homólogos interespecies . i En algunas modalidades, un polipéptido K-ras mutante puede incluir uno o más residuos adicionales en el terminal C o N, tal como, pero no limitados a, los residuos de la 1 secuencia i guía, residuos de dirección al objetivo, residuos de metionina amino-terminal, residuos de lisina, residuos de etiqueta, y/o residuos de proteína de fusión. I II . B . Composiciones Que Comprenden Los Anticuerpos, La materia de interés actualmente descrita también I proporciona composiciones que comprenden los anticuerpos actualmente descritos, los fragmentos, y/o derivados de los mismos. Una descripción esquemática de las composiciones ejemplares de la materia de interés actualmente ¡descrita y los usos ejemplares para las mismas, se proporcionan en la Figura 6.
En algunas modalidades, una composición de la materia de interés actualmente descrita comprende los anticuerpos actualmente descritos, los fragmentos, y/o derivados de los mismos, y uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. En algunas modalidades, el o los portadores y/o el o los excipientes son farmacéuticamente aceptables para ¡ el uso en humanos. Las formulaciones adecuadas incluyen formulac'iones para inyección estériles, acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos, bactericidas, antibióticos, y solutos que hacen a la formulación isotónica con los fluidos corporales del paciente pretendido! y las suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes suspensores y agentes espesantes. Las formulaciones pueden ser presentadas en dosis unitaria o en dosis múltiple, por ejemplo ampolletas selladas y viales, y pueden ser almacenadas en una condición congelada o secada por congelamiento (liofilizada) que requiere únicamente la adición de un portador líquido estéril, por ejemplo agua para inyecciones, inmediatamente antes del uso. Algunos ingredientes ejemplares son dodecilsulfato de sodio (SDS) en el intervalo de en algunas modalidades, 0.1 a 10 mg/ml, en algunas 'modalidades aproximadamente 2.0 mg/ml; y/o manitol u otro azúcar en el intervalo, en algunas modalidades de 10 a 100 mg/ml, en algunas modalidades aproximadamente 30 mg/ml; y/o solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Cualesquiera convencionales en la técnica con respecto al tipo en cuestión, pueden ser utilizados.
Las composiciones de la materia de interés í actualmente descrita pueden también comprender ¡un agente activo, en donde el agente activo comprende una porción I terapéutica, una porción de diagnóstico, y/o una porción i biológicamente activa. Como se utiliza en la presente, la i frase "agente activo" se refiere de este modo a un componente de las composiciones actualmente descritas que proporcionan un beneficio terapéutico a un sujeto, que permite la visualización de las células o tejidos en las cuales las composiciones de la materia de interés actualmente^ descrita í se acumulan, la detección de los epitopos a los cuales se enlazan los anticuerpos actualmente , los fragmentos, y derivados de los mismos, y/o aumenta cualquiera i de estas actividades. En algunas modalidades, un agente activo de la materia de interés actualmente desjcrita se i selecciona del grupo que consiste de un molécula radioactiva i (incluyendo, pero no limitada a radionúclidos y i radioisótopos) , una molécula sensibilizadora, un agente de i formación de imagen u otro agente detectable, una toxina, una citotoxma, un agente antiangiogemco, un age Inte anti-tumoral, un agente quimioterapéutico, un inmunomodulador, una citocina, un grupo reportero, y combinaciones de los mismos. Se entiende que estas categorías no están destinadas a ser i mutuamente exclusivas, ya que algunas moléculas radioactivas, por ejemplo, son también agentes quimioterapéuticos , algunos inmunomoduladores son citocinas, etc.
En algunas modalidades, un agente activo comprende un agente quimioterapéutico. Diversos agentes quimioterapéuticos son conocidos para una persona experta en la técnica e incluyen, pero no están limitados a agentes alquilantes tales como las mostazas de nitrógeno (por ejemplo, Clorambucilo, Ciclofosfamida, isofamida, Mecloretamina, Melfalan, mostaza de Uracilo) , aziridinas (por ejemplo, Tiotepa) , ésteres de metansulfonato (por ejemplo, Busulfan) , nitrosoureas (por ejemplo, Carmustina, Lomustina, Estreptozocina) , complejos de platino (por ejemplo, Cisplatino, Carboplatino) , y alquilantes biorreductores (por ejemplo, Mitomicina C, Procarbazina) ; agentes de rompimiento de la hebra de ADN (por ejemplo, Bleomicina) ; inhibidores de la ADN-topoisomerasa (por ejemplo, camptotecina y derivados de la misma que incluyen, pero no limitados a 10-hidroxicamptotecina) , inhibidores de la ADN-topoisomerasa (por ejemplo, Amsacrina, Dactinomicina, Daunorrubicina, Doxorrubicina, Idarrubicina, Mitoxantrona, Etopósido, Tenipósido, Podofilotoxina) ; enlazadores de la muesca menor de ADN (por ejemplo, Plicamicina) ; anti-metabolitos tales como los antagonistas del folato (por ejemplo, Metotrexato y trimetrexato) , antagonistas de pirimidina (por ejemplo, j Fluorouracilo, Fluorodesoxiuridina, CB3717, A¿acitidina, Citarabina, Floxuridina) , antagonistas de purina (por ejemplo, Mercaptopurina, 6-Tioguanina, Fludarabina, Pentostatina) , análogos modificados con azúcar (por ejemplo, Citrabina, Fludarabina) , e inhibidores de la ribonucleótido-reductasa (por ejemplo, Hidroxiurea) ; agentes interactivos agentes bloqueadores hormonales tales como estírógenos y compuestos relacionados (por ejemplo, Etinil-jEstradiol , Dietilestilbestrol, Clorotrianisena, Idenestrol) , progestinas (por ejemplo, caproato de Hidroxiprogesterona, Medroxiprogesterona, Megestrol) , andrógenos (por¡ ejemplo, Testosterona, propionato de testosterona; Fluoxijmesterona, Metiltestosterona) , agentes hormonales de liberación de la hormona leutinizante y/o antagonistas de la hprmona de liberación de gonadotropina (por ejemplo, Acetato de i leuprólido; acetato de goserelina) , agentes anti-es(trogénicos (por ejemplo, Tamoxifeno) , agentes anti-andrógenos (por ejemplo, Flutamida) , y agentes anti-adrenales (por ejemplo, Mitotano, Aminoglutetimida) . Otros agentes quimiotérapéuticos incluyen, pero no están limitados a Taxol, ácido :retinoico y derivados de los mismos (por ejemplo, el ácido 13-cis-retinoico, el ácido todo-trans-retinoico, y el ácido 9-cis-retinoico) , sulfatiazol, mitomicina C, ácido micofenólico, sulfadietoxano, y gemcitabina (4 -amino- 1- (2 -kesoxi-2 , 2-difluoro-p-D-eritro-pentofuranosil) pirimidin-2 (1H) -on-2 ' , 2 ' -difluoro-21 -desoxicitidina) .
En algunas modalidades, un agente activo comprende un agente antiangiogénico . Diversos agentes antiangiogénicos son conocidos para una persona experta en la técnica e incluyen, pero no están limitados a inhibijdores y/o antagonistas de la familia del factor de ¿recimiento endotelial vascular (VEGF, por sus siglas en inglés) y sus receptores (por ejemplo, Bevacizumab y otros anticuerpos factor de crecimiento endotelial antivascular ; (VEGF) ) y antagonistas de neuropilina-1. i En algunas modalidades, las composiciones de la materia de interés actualmente descrita pueden ser utilizadas con adyuvantes y/o inmunomoduladores adicionales. Como se utiliza en la presente, las frases "agente inmunomédulador" y "agente inmunomodulador inmunitario" se refieren a las moléculas capaces de modular las respuestas inmunizarías. Los inmunomoduladores ejemplares incluyen, pero I no están limitados a citocinas (incluyendo, pero no limitadas a, citocinas IFN-OC, IFN-?, IL-2, IL-4, IL-6, TNF, y otras citocinas que afectan las células inmunitarias) , oligodesoxinucleótidos de CpG (CpG ODN) , que funcionan como un activador de células dendríticas (Rothenfusser et al., 2002), y los inmunomoduladores descritos en la Tablja 3.
I Tabla 3 I Inmunomoduladores Ejemplares* * ver Muller y Scherie, 2006 y las referencias en ésta. MTH-TRP; metil-tioidantoin-triptofano; ABH: ácido 2 (S) -amino-6-boronohexanoico; BEC: S- (2-boronoetil) -L-cisteína; | L-NMMA: L- I Iv^-monometil-arginina; NCX-4016: nitroaspirina; ver Emanueli i et al., 2004; CP-533536: ver Caraeron et al., 2009 ; ¡ SB-505124 : i ver DeCosta Byfield et al., 2004; SD-505124: ver Muller y I Scherie, 2006; LY580276: ver Sawyer et al., 2004¡; JSI-124: ver Blaskovich et al., 2003; CPA-7: ver Littlefield et al., i 2008; SU5416: ver Fong et al., 1999; AG-013736 (¡Axitinib) ; ver Rugo et al., 2005; IC-487892: Bothell, Washington, Estados Unidos de América; Donzella et al. , 1998. i i Para las solicitudes terapéuticas, una| cantidad i terapéuticamente efectiva de una composición de la materia de interés actualmente descrita es administrada a un sujeto. Una i "cantidad terapéuticamente efectiva" es una cantidad de una i composición suficiente para producir una respuesta tumoral biológica mensurable (tal como, pero no respuesta inmunoestimuladora, una respuesta una respuesta citotóxica, la regresión del tumorl, y/o la i inhibición del crecimiento tumoral) . Los niveles ¡de dosis efectiva de los ingredientes activos en una composición de la materia de interés actualmente descrita pueden serj variados para administrar así una cantidad del o de los agentes I activos que es efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un sujeto particular. El nivel I de dosis seleccionado dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad de la composición, la formulación, la vía de administración, la combinación con otros jfármacos o tratamientos, el tamaño del tumor y la longevidad, y la condición física y la historia médica previa del ¡sujeto que i se trata. En algunas modalidades de la materia de interés actualmente descrita, es administrada una dosis mínima, y la I dosis es elevada de escala en ausencia de toxicidad limitante de las dosis. La determinación y el ajuste de l una dosis terapéuticamente efectiva, así como la evaluación de cuándo y cómo realizar tales ajustes, son conocidas para aquellas personas de experiencia ordinaria en la técnijca de la medicina .
Para aplicaciones de diagnóstico, una! cantidad detectable de una composición de la materia de interés actualmente descrita es administrada a un suíjeto. Una I "cantidad detectable", como se utiliza en la presente se refiere a una composición, se refiere a una dos'is de tal composición en la que puede ser determinada la presencia de la composición in vivo o in vitro. Una cantidad detectable variará de acuerdo a una variedad de factores, incluyendo pero no limitados a las características químicas de la composición que es marcada, el marcador detectable, los métodos de marcación, el método de formación de imagen y los parámetros relacionados a éste, el metabolismo del fármaco marcado en el sujeto, la estabilidad del marcador (incluyendo, pero no limitado a la vida media un marcador radionúclido) , el tiempo transcurrido la administración de la composición después de de la imagen, la vía de administración, la condición física y la historia médica previa del sujeto, y el tamaño y la longevidad del tumor o el tumor sospechoso. De este modo, una cantidad detectable puede variar y ser diseñada para una aplicación particular. Después del estudio de la presente descripción, está dentro de la habilidad que alguien con experiencia en la técnica, determinar tal! cantidad detectable .
Como se utilizan en la presente, los términos "porción detectable", "marcador detectable", y "agente i detectable" se refiere a cualquier molécula que ', ueda ser detectada por cualquier porción que pueda ser agregada a un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo, que permita i la detección del anticuerpo, el fragmento, o el djerivado in i vitro y/o in vivo. Las porciones detectables representativas i incluyen, pero no están limitadas a, cromóforos, j porciones fluorescentes, enzimas, antígenos, grupos con r'eactividad j específica, porciones quimioluminiscentes, y | porciones electroquímicamente detectables, etc. En algunas modalidades, los anticuerpos están biotinilados . ] En algunas modalidades, una porción detectable comprende un fluoróforo. Cualquier fluoróforo puede ser empleado con las composiciones de la materia de interés actualmente descrita, con la condición de que la conjugación del fluoróforo de como resultado una composición que sea detectable ya sea in vivo (por ejemplo, después de la i administración a un sujeto) y/o in vitro, y además que no i impacte de manera negativa la habilidad del anticuerpo, o el fragmento o el derivado epitopo. Los fluoróforos están limitados al ácido 7 cloruro de dansilo, nitrobenzodiazolamina (NBD) , cloruro de dabsilo, ácido cinámico, ácido fluoresceína-carboxílico, Azul i Nilo, tetrametilcarboxirrodamina, tetraetilsulforrodamina, 5- i carboxi-X-rodamina (5-ROX) , y 6-carboxi-X-rodamina (6-ROX) . Se entiende que estos fluoróforos representativos son ejemplares únicamente, y pueden ser también fluoróforos i adicionales. Por ejemplo, la serie de colorantes ALEXA FLUOR® i incluye al menos están caracterizados por Estos colorantes incluyen , 500, 514, 532, 546, 555, 0, 680, 700, y 750 (disponibles de Invitrogen Corp., Garlsbad, California, Estados Unidos de América) , y la elección; de cuyo colorante para su empleo puede ser realizada por persona experta después de la consideración de |la actual especificación, con base en los criterios pero no están limitadas a las composiciones ALEXA FLUOR® específico, ya sea que se empleen j porciones detectables múltiples y los espectros de emisión cada uno, la técnica de detección que va a ser empleada, etc.1 i En algunas modalidades, una porción detectable comprende un colorante de cianina. Los ejemplos no limitantes de colorantes de cianina que pueden ser conjugados a los anticuerpos, fragmentos, y/o derivados de la materia de interés actualmente descrita, incluyen los élsteres de succinimida Cy5, Cy5.5, y Cy7, suministrados por Amersham Biosciences (Piscataway, New Jersey, Estados ¡Unidos de América) .
En algunas modalidades, una porción detectable comprende un colorante de infrarrojo cercano (NIR,: por sus siglas en inglés) . Los ejemplos no limitantes de 'colorantes de infrarrojo cercano que pueden ser conjugados a los i anticuerpos, fragmentos, y/o derivados de la materia de interés actualmente descrita, incluyen NIR641 NIR664, NIT7000, y NIT782.
I En algunas modalidades, los anticuerpos biotinilados son detectados utilizando un anticuerpo I secundario que comprende un grupo avidina o estreptavidina y es también conjugado a un marcador fluorescente qué incluye, pero no está limitado a Cy3, Cy5, serie de ALEXA FLUOR®® de los disponibles de I VITROGENMR (Carlsbad, Californija, Estados Unidos de América) . En algunas modalidades, el anticuerpo, el fragmento, o el derivado del mismo es directamente marcado con un marcador fluorescente y las células que se ¡enlazan al i anticuerpo son separadas mediante clasificación celular I activada por fluorescencia. Las estrategias de | detección adicionales son conocidas para la persona experta.
Para aplicaciones de diagnóstico (incluyendo, pero no limitadas a las aplicaciones de detección y aplicaciones de formación de imágenes) , los anticuerpos de la materia de interés actualmente descrita pueden ser marcados con una porción detectable. La porción detectable puede ser i cualquiera que sea capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, una i porción detectable puede ser un radioisótopo, tal como, pero no limitado a 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, o 131l; un j compuesto fluorescente o quimioluminiscente tal como, pero nói limitado i a isotiocianato de fluoresceína, rodamina, o lucijferina; o una enzima, tal como, pero no limitada a fosfatasa ¡alcalina, ß-galactosidasa, o peroxidasa de rábano. ¡ La materia de interés actualmente ! descrita proporciona además los métodos para diagnosticar un ¡tumor, en donde una muestra tumoral o biopsia es evaluada in vitro. En algunas modalidades, un ligando de dirección al objetivo de la materia de interés actualmente descrita comprende un marcador detectable tal como un marcador fluorescente, una. etiqueta de epitopo, o un marcador radioactivo,, cada uno descrito brevemente más adelante en la presente.
Fluorescencia . Cualquier colorante fluorescente detectable puede ser utilizado, incluyendo pero no limitado a FITC (isotiocianato de fluoresceína) , FLUOR XMR, ALEXA FLUOR®, OREGON GREEN®, TMR (tetrametilrodamina) , ROX (X-rodamina) , TEXAS RED®, BODIPY® 630/650, y Cy5 (disponibles dé Amersham Pharmacia Biotech de Piscataway, New Jersey, Estados Unidos i de América, o de Molecular Probes Inc. de Eugene, Oregon, i Estados Unidos de América) . ¡ Un marcador fluorescente puede ser 1 detectado directamente utilizando espectros de emisión y absorción que son apropiados para el marcador particular utilizado. El equipo de investigación común ha sido desarrollado para la detección in vitro de la fluorescencia, incluyendo los instrumentos disponibles de GSI Lumonics ( atertown, Massachusetts , Estados Unidos de América) y Genetic Microsystems Inc. (Woburn, Massachusetts, Estados Unidos de América) . La mayoría de los sistemas comerciales utilizan alguna forma de tecnología de barrido con detección por tubo fotomultiplicador . Los criterios para consideración cuando se analizan las muestras fluorescentes son resumidos por Alexay I I I et al. , 1996. j i Detección de un Marcador de Epitopo. Si ha sido utilizado un marcador de epitopo, una proteína o compuesto que se enlaza al epitopo puede ser utilizada para detectar el I epitopo. Un marcador epitopo representativo es la biotina, la cual puede ser detectada mediante el enlace de un| fluoróforo i conjugado a la avidina, por ejemplo avidina-FITC . Alternativamente, el marcador puede ser detectado mediante el enlace de un conjugado de estreptavidina de avidina-peroxidasa de rábano (HRP) , seguido por la detección colorimétrica de un producto enzimático de HRP. La producción de un producto/conjugado colorimétrico o luminiscente, es mensurable utilizando un espectrofotométro o liiminómetro, respectivamente. j i Detección Autorradiográfica . En el caso de un marcador radioactivo (por ejemplo, 131I o 99mTc) la! detección puede ser lograda mediante la autorradiográfía convencional, i o mediante el uso de un formador de imagen fosforescente como i es conocido para una persona experta en la técnica, i Un método autobiográfico preferido emplea las placas de formación de imagen por luminiscencia fotoestimulables (Fuji Medical Systems de Stamford, Connecticut, Estados Unidos del América) . En resumen, la luminiscencia fotoestimulable es la cantidad de luz emitida de las placas de fósforo irradiadas después de la estimulación con un láser durante el barrido. L ¡respuesta luminiscente de las placas es linealmente proporcional a la actividad (Amemiya et al., 1988; Hallahan et al., 2001a).
Cualquier método conocido en la técnica para conjugar un anticuerpo a una porción detectable1 puede ser empleado (ver por ejemplo, Hunter et al., 1962; David et al., 1974; Pain et al., 1981); y Nygren, 1982.
Portadores de Fármacos . Las composiciones de la 1 materia de interés actualmente descrita pueden , comprenden además un portador de fármaco para facilitar la preparación del fármaco y la administración del mismo. Cualquier vehículo i o portador de distribución de fármaco adecuado, . puede ser utilizado, incluyendo, pero no limitado a un vector para terapia génica (por ejemplo, un vector viral o un plásmido) , una microcápsula, por ejemplo un micróforo o una nanoesfera (Manóme et al., 1994; Hallahan et al., 2001 b; Saltzman y Fung, 1997), un péptido (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,127,339 y 5,574,172), un glucosaminoglucano (Patente de los Estados Unidos No. 6,106,866), un ácido graso (Patente de los Estados Unidos No. 5,994,392), una emulsión grasa (Patente de los Estados Unidos No. 5,651 ,991), un lípido o derivado de lípido (Patente de los Estados Unidos No. 5,786,387), colágeno (Patente de los Estados Unidos No. 5,922,356), un polisacárido o derivado del mismo (Patente de los Estados Unidos No. 5,688,931), una nanosuspensión (Patente de los Estados Unidos No. 5,858,410), una micela o , conjugado i i I polimérico (Goldman et al., 1997; Patentes de ios Estados Unidos NOS. 4,551 ,482; 5,714,166; 5,510,103; 5 490,840; y 5,855,900), y un polisoma (Patente de los Estados Unidos No. 5, 922, 545) .
Conjugación de Ligandos de Dirección al Objetivo.
Los anticuerpos, fragmentos, o derivados pueden también ser acoplados a fármacos o portadores de fármacos utilizando métodos conocidos en la técnica, incluyendo,¦ pero no 1 limitados a conjugación con carbodiimida, esterificación, I oxidación con peryodato de sodio seguido por alquilación reductiva, y reticulación con glutaraldehído i (ver por ejemplo, Goldman et al., 1997; Cheng, 1996; Neri et al., 1997; Nabel, 1997; Park et al., 1997; Pasqualini et al., 1997; Bauminger y Wilchek, 1980; Patente de los Estados Unidos No. 6,071 ,890; y Patente Europea No. 0 439 095.
Administración . Los métodos adecuados para administración de una composición de la materia de interés actualmente descrita incluyen, pero no están limitados a la administración intravascular, subcutánea, intramuscular, e intratumoral . En algunas modalidades, es empleada la administración intravascular. Como se utiliza en la ¡presente, las frases "administración intravascular" y "provisión intravascular" se refieren a la administración de una composición directamente hacia la red vascular de un sujeto. Las técnicas que pueden ser empleadas para la administración I I i ! intravascular de las composiciones, son conojcidas para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, je incluyen, pero no están limitadas a la administración intra enosa y la i administración intraarterial . Se entiende que cualquier sitio y método para la administración intravascular j puede ser i elegido, dependiendo al menos en parte de la é.specie del sujeto al cual va a ser administrada la composición. Para la ! distribución de las composiciones a las vías pulmonares, las i composiciones pueden ser administradas como un ! aerosol o rocío grueso. I III . de los mismos, de la materia de- interés actualmente descrita también son útiles para la formación de imágenes i vivo, en ! donde un anticuerpo marcado con una porción detectable tal como un agente radio-opaco y/o un radioisótopo es administrado a un sujeto, en algunas modalidades pojr medio de i la administración intravenosa, y la presencia y la i localización del anticuerpo marcado en el hospedero, es I evaluada. Esta técnica de formación de imagen puede ser útil en la clasificación y tratamiento de los tumores malignos.
De este modo, en algunas modalidades, una i composición de la materia de interés actualmente] descrita comprende un marcador que puede ser detectado in vivo. El término " in vivo" como se utiliza en la presente para describir los métodos de formación de imagen o de' detección, i se refiere en general a los métodos no invasores tales como los métodos cintigráficos , formación de imagen de resonancia magnética, ultrasonido, o fluorescencia, cada uno descrito en la presente más adelante. El término "métodos no 1 invasores" no excluye los métodos que emplean la administración de un agente de contraste para facilitar la formación de imagen in vivo.
En algunas modalidades, la porción detectable puede ser conjugada o de otro modo asociada con un anticuerpo, fragmento, o derivado de la materia de interés actualmente descrita, un agente terapéutico, un agente de diagnóstico, un portador de fármaco o combinaciones de los mismos como se describe con más detalle anteriormente en la presente. Después de la administración de la composición marcada a un sujeto, y después de un tiempo suficiente para el enlace, la biodistribución de la composición puede ser visualizada. El término "tiempo suficiente para el enlace" se refiere a una duración temporal que permite el enlace del agente , marcado a una molécula objetivo inducida por radiación.
Formación de Imagen Cintigráfica . Los métodos de formación de imagen cintigráficos incluyen SPECT (Tomografía Computarizada de Emisión Simple de Fotones) , PET (Tomografía de Emisión de Positrones) , formación de imagen por cámara gamma, y barrido rectilíneo. Una cámara gamma y un explorador í I rectilíneo cada uno radioactividad en un SPECT están basados son rotadas alrededor del sujeto de análisis, y de este modo integran la radioactividad en más de una dimensión. Los sistemas PET comprenden un anillo que también detectan múltiples dimensiones . i I Los instrumentos de formación de imagen, ! adecuados para practicar los métodos de detección y/o de formación de Unidos de América, y Siemens of Hoffman Estates, ¡Illinois, Estados Unidos de América. Los dispositivos relacionados para la formación de imagen cintigráfica pueden ser¡ también utilizados, tales como un dispositivo de radio formación de i imagen que incluye una pluralidad de sensores con estructuras de colimación que tienen un foco de fuente común. ! Cuando es empleada la formación de¡ imagen i cintigráfica, el marcador detectable comprende enj algunas modalidades un marcador radionúclido, en algunas modalidades un marcador radionúclido seleccionado del grupo que ¡consiste de 18F, 64Cu, 65Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 80mBr, 95Ru, 97Ru, 1C3Ru, 105RU ( 99mTC ; 107Hg j 203¾ ( 123 ^ 124 ^ 125 -j. ^ 126 -^ 131 -^ 133 ^ 111 -^ 113mln, 99mRe, 105Re, 101Re, 186Re, 188Re, 121mTe, 12 Te, 125raTe, 165Tm, 167Tm, 168Tm, y las formas nitruro u óxido derivadas de los mismos. En algunas modalidades, el marcador radionúclido comprende 131I o 99mTc.
Los métodos para la marcación con radionúclidos de una molécula, para ser utilizada con los métodos descritos son conocidos en la técnica. Por ejemplo, una molécula de dirección al objetivo puede ser derivatizada de modo que un 1 radioisótopo puede ser enlazado directamente a ésta (Yoo et al., 1997). Alternativamente, un ligador puede ser agregado a ésta para hacer posible la conjugación. Los i ligadores representativos incluyen el pentaacetato de dietilentriamina I (DTPA) -isotiocianato, clorhidrato del nicotínato de succinimidil 6-hidrazino (SHNH) , y la oxima de la hexametilpropilenamina (HMPAO; Chattopadhyay et al., 2001; Sagiuchi et al., 2001; y Patente de los Estados Unidos No. 6,024,938). Los métodos adicionales pueden ser encontrados en la Patente de los Estados Unidos No. 6,080,384; Hnatowich et i al., 1996; y Tavitian et al., 1998.
Cuando la porción de marcación es un radionúclido, pueden ser agregados estabilizadores para prevenir o reducir al mínimo el daño radiolítico, tales como ácido ascórbico, ácido gentísico, u otros antioxidantes apropiados, a la composición que comprende la molécula marcada de dirección al objetivo.
Formación de Imagen de Resonancia Magnética (MRI) .
Las técnicas basadas en imágenes de resonanciaj magnética crean imágenes con base en las velocidades de j relajación relativa de los protones de agua en ambientes químicos únicos. Como se utiliza en la presente, el término j "formación de imagen de resonancia magnética" se refiere a las técnicas de fuente magnética que incluyen la formación del imagen de resonancia magnética convencional, la formación de imagen de transferencia de magnetización (MTI) , la espectroscopia de resonancia magnética de protones (MRS) , la formación de imagen ponderada por difusión (DWI) y la formaciónj de imagen MR funcional ( fMRI ; ver por ejemplo, Rovaris et al., 2001; Pomper y Port, 2000; y referencias citadas en la presente) .
Los agentes de contrastes para la formación de imagen de fuente magnética incluyen, pero no están limitados a iones paramagnéticos o superparamagnéticos , partículas de óxido de hierro (Weissleder et al., 1992; Shen et al., 1993), y agentes de contrastes solubles en agua. Lós iones paramagnéticos y superparamagnéticos pueden ser seleccionados del grupo.de metales que incluyen hierro, cobre, manganeso, cromo, erbio, europio, disprosio, holmio y gadolinio. Los metales preferidos son hierro, manganeso y gadol!inio; más i preferidos es el gadolinio. ¡ Aquellos expertos en la técnica de la marcación de diagnóstico reconocen que los iones metálicos pueden ser enlazados por porciones quelantes, las cuales a su| vez pueden ser conjugadas a un agente terapéutico de acuerdo con los métodos de la materia de interés actualmente descrita. Por ejemplo, los iones de gadolinio son quelados por el ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) . Los iones de j lantánidos I son quelados por los compuestos de tetraazaciclododecano . Ver í las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,|738,837 y I 5,707,605. Alternativamente, como un agente de i contraste I puede ser llevado en un liposoma (Schwendener, 1992j) .
Las imágenes derivadas por el uso de una fuente magnética pueden ser adquiridas utilizando, por e emplo, un magnetrómetro de dispositivo de interferencia! cuántica superconductor (SQUID, disponible con instrucciones de Quantum Design de San Diego, California, Estados 'Unidos de América; ver también Patente de los Estados No. 5, 738, 837) .
Ultrasonido . La formación de imagen por ultrasonido puede ser utilizada para obtener información cuantitativa y i estructural de un tejido objetivo, incluyendo un !tumor. La administración de un agente de contraste, tales como microburbu as de gas, puede mejorar la del tejido objetivo durante un examen de ultrasonido. En algunas i modalidades, el agente de contraste puede ser selectivamente i dirigido al tejido objetivo de interés, por ejemplo mediante I el uso de un péptido para la distribución guiada ' de fármaco (por ejemplo, distribución de fármaco guiada por¡ radiación) como se describe en la presente. Los agentes representativos para proporcionar microburbujas in vivo incluyen, pero no están limitados a burbujas lipofílicas rellenas con gas y basadas en lípido (por ejemplo, Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,245,318; 6,231,834; 6,221,018; y 5,088,499). Además, el gas o líquido pueden ser atrapados en partículas inorgánicas porosas que facilitan la liberación de microburbujas después de la distribución a un sujeto (Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,254,852 y 5,147,631).
Los gases, líquidos, y combinaciones de los mismos, adecuadas para el uso con la materia de interés actualmente descrita incluyen aire,- nitrógeno; oxígeno; dióxido de carbono; hidrógeno; óxido nitroso; un gas inerte tal como helio, argón, xenón o kriptón; fluoruro de azufre tal como hexafluoruro de azufre, decafluoruro de diazufre o pentafluoruro de trifluorometilazufre; hexafluoruro de selenio; un silano opcionalmente halogenado tal como tetrametilsilano; un hidrocarburo de bajo peso molecular (por ejemplo, que contiene hasta 7 átomos de carbono) , por ejemplo un alcano tal como metano, etano, propano, butano o pentano, un cicloalcano tal como ciclobutano o ciclopentano, un alqueno tal como propeno o un buteno, o un alquino tal como acetileno; un éter; una cetona; un éster; un hidrocarburo de bajo peso molecular halogenado (que contiene jj>or ejemplo hasta 7 átomos de carbono) ; o una mezcla de cualquiera de los anteriores. Los gases hidrocarburos halogenados pueden mostrar longevidad prolongada, y de este modo son preferidos para algunas aplicaciones. Los gases representativos de este grupo incluyen decafluorobutano, octafluorociclobutano, I decafluoroisobutano, octaflujoropropano, octafluorociclopropano, dodecaflu'oropentano, decafluorociclopentano, decafluorojisopentano, perfluoropexano, perfluorociclohexano, perfluorpisohexano, hexafluoruro de azufre, y perfluorooctanos , perflujorononanos ; perfluorodecanos , opcionalmente bromados. , El acoplamiento de ligandos de dirección al objetivo a las burbujas lipofílicas puede ser logrado por medio de agentes de reticulación química de acue†do con los métodos de acoplamiento proteína-polímero o proteína- lípido estándares (por ejemplo, vía la carbodiimida (EDC) o tiopropionato (SPDP) ) . Para mejorar la de dirección al objetivo, las burbujas rellenas con gas grandes pueden ser acopladas a un ligando de dirección al objetivo utilizando un brazo espaciador flexible, tal como un polímero sintético ramificado o lineal (Patente de los Estados Unidos No. 6,245,318) . Un ligando de dirección al objetivp puede ser acoplado a las partículas inorgánicas porosas mediante recubrimiento, adsorción, formación de capas o reapción de la superficie externa de la partícula con el ligando de dirección al objetivo (Patente de los Estados 'Unidos No. 6, 254, 852) .
Una descripción del equipo ultrasónico y los métodos técnicos para adquirir un equipo de i datos de ultrasonido puede ser encontrado en Coatney, 2'001; Lees, i 2001; y referencias citadas en éste. i Formación de Imagen de Fluorescencia. Los métodos de formación de imagen no invasores pueden también¡ comprender la detección de un marcador fluorescente. Un fármaco que I comprende un componente lipofílico (agente terapéutico, agente de diagnóstico, vector, o portador de fármaco) pueden ser marcados con cualquiera de una variedad de i colorantes lipofílicos que son adecuados para la formación de imágenes in vivo (ver por ejemplo, Heredia et al., 1991; Ragnarson et al., 1992; Fraser, 1996). Los marcadores representativos pueden incluir pero no están limitados a colorantes de carbocianina y aminostirilo, preferentemente carbocianinas de dialquilo de cadena larga (por ejemplo, Dil, Dio, y DiD disponibles de Molecular Probes Inc. de Eugene, Oregon, Estados Unidos de América) y colorantes de dialquilaminostirilo . Los marcadores fluorescentes lipofílicos pueden ser incorporados utilizando métodos conocidos para una persona experta en la materia. Por ejemplo, las soluciones de marcación celular VYBRANTR son efectivas para la marcación de las soluciones cultivadas de otros componentes lipofílicos (Molecular Probes Inc. de Eugene, Oregon, Estados Unidos de América) . ' Un marcador fluorescente puede también ' comprender colorantes de cianina sulfonatada, incluyendo Cy5.5 y Cy5 (disponibles de Amersham de Arlington Heights, Illinois, Estados Unidos de América) , IRD41 e IRD700 (disponibles de Li-Cor, Inc. de Lincoln, Nebraska) , NIR-1 (disponible de Dejindo de Kumamoto, Japan) , y Azul LaJolla (disponible de Diatron de Miami, Florida, Estados Unidos de América; ver también Licha et al., 2000; Weissleder et ¿1. , 1999; Vinogradov et al., 1996).
Además, un marcador fluorescente puede 'comprender un quelato orgánico derivado de iones de lantánidos, por ejemplo quelatos fluorescentes de terbio y europio (Patente de los Estados Unidos No. 5,928,627). Tales marcadores pueden ser conjugados o covalentemente enlazados a un fármaco como se describe en la presente. > Para la detección in vivo de un marcador fluorescente, es creada una imagen utilizando espectros de emisión y absorbancia que son apropiados para el marcador particular empleado. La imagen puede ser visualizada, por ejemplo, mediante espectroscopia óptica difusa. Los métodos adicionales y los sistemas de formación de imagen son descritos en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,865,754; 6,083,486; y 6,246,901, entre otros sitios.
IV. Métodos para Detectar y Tratar Tumores En algunas modalidades, los fragmentos, y/o derivados de la materia actualmente descrita son empleados para la formación de imágenes in vivo de los tumores, en donde una composición de i la materia de interés actualmente descrita que ha sido I marcada con una porción de formación de imagen tal como un agente radio opaco, un radioisótopo, u otro !agente de I formación de imagen es administrado a un sujeto, y es i evaluada la presencia y la localización de la composición detectablemente marcada, en el sujeto. Esta t'écnica de formación de imagen puede ser útil en la clasificación y tratamiento de las malignidades. En algunas modalidades, un anticuerpo es marcado con cualquier porción i que sea detectable in si tu en un sujeto, por ejemplo1, mediante resonancia magnética nuclear, radiología, u otros métodos de i detección conocidos en la técnica. j Como tal, la materia de interés actualmente i descrita también proporciona los métodos para tumores en sujetos. En algunas modalidades, actualmente descritos comprenden (a) administrarle ¡al sujeto una composición que comprende el anticuerpo, o el fragmento o i derivado del mismo, de la materia de interés actualmente descrita, conjugado a un marcador detectable; y (b)¡ detectar i I el marcador detectable para detectar con esto el tumor. En algunas modalidades, el tumor es un tumor del páncreas, mama, ovario, colon, o recto, y/o una célula metastática derivada del mismo, que opcionalmente expresa MUC1, un K-ras mutante, o ambos .
En algunas modalidades de la materia de interés actualmente descrita, el marcador detectable comprende un agente de formación de imagen seleccionado del 1 grupo que consiste de iones paramagnéticos , radioactivos, y fluorogénicos que incluyen, pero no están limitados a aquellos descritos con más detalle anteriormente en la presente. En vista de la descripción anterior, el agente de formación de imagen radioactiva puede ser, por1 ejemplo, emisores gamma, emisores de positrones, emisores dé rayos x, o cualesquiera otros agentes para los cuales está disponible un método de detección. Ejemplares de tales agentes de formación de imagen radioactiva incluyen 43K, S2Fe, ?7Co, S7Cu, e7Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/81MKr, 87MSr, 99MTc, ^In, 113In, ll23I, 125I, 127Cs, 129Cs, 131I, 13 I, 197Hg, 203Pb, y 206Bi, pero la materia de interés actualmente descrita no está limitada solo a estos radioisótopos . < La materia de interés actualmente descrita también proporciona los métodos para tratar tumores. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrarle ál sujeto una composición que comprende un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo de la materia de ínteres a ictualmente I descrita, conjugado a un agente activo, con lo cual el agente activo hace contacto con el tumor para tratar con esto el tumor. Agentes activos ejemplares son descrieos en la presente, e incluyen pero no están limitados ja agentes i terapéuticos, opcionalmente agentes quimioterapéuticos , toxinas, agentes radioterapéuticos y combinaciones de i cualquiera de los anteriores. 1 Por ejemplo, una composición de la materia de interés actualmente descrita puede comprender o un fragmento o derivado del mismo como se presente, conjugado a un agente quimioterapéutico . En algunas I modalidades, el agente quimioterapéutico se selecciona de i entre un fármaco antitumoral, una citocina, un i antimetabolito, un agente alquilante, una > hormona, metotrexato, doxorrubicina, daunorrubicina, arabinósido de citosina, etopósido, 5-fluorouracilo, melfalán, clorjambucilo, í una mostaza de nitrógeno, ciclofosfamida, cisj-platino, i vindesina, alcaloides de vincapervinca, mitomicina, bleomicina, purotionina, macromomicina, derivados de 1,4-benzoquinona, trenimon, esteroides, aminópterina, i antraciclinas, demecolcina, etopósido, mitramicina, j doxorrubicina, daunomicina, vinblastina, neocarzinóstatina, i macromicina, -amanitina y combinaciones de los mismOjS .
Además, una composición de la materia del interés actualmente descrita puede comprender un anticuerpo, o un 1 fragmento o derivado del mismo como se describe en la ! presente, conjugado a una toxina. Las toxinas i ejemplares incluyen, pero no están limitadas a veneno de i víbora de I I Russell, Factor IX activado, Factor X activado, trombina, fosfolipasa C, factor de veneno de cobra, ricina, cadena A de ricina, endotoxina de Pseudomonas, la toxina de la difteria, ribonucleasa pancreática bovina, proteína antiviraí de hierba carmín (pokeweed) , abrina, cadena A de abrina, , gelonina, saporina, modeccina, viscumina, volkensina y combinaciones de los mismos. I Las composiciones de la materia de interés actualmente descrita pueden también comprender un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo como se describe en la presente, conjugado a un agente radioterapéutico . Los agentes radioterapéuticos ejemplares incluyen, pero no están limitados a 47Sc, 67Cu, 90Yf 109pdí 123T / 125I f 131^ 18éRe, 188Re, 199Au, 211At, 212Pb, 12Bi, 32P, 33P, 71Ge, 77As, 103Pb, 105Rh, iAg, 119Sb, 121Sn, 131CS, 143Pr, 161Tb, 177Lu, 1910s, 193 Pt, y 1¾Hg.
La materia de interés actualmente descrita también proporciona métodos para suprimir el crecimiento tumoral en un sujeto. En algunas modalidades, los métodos comprenden administrarle a un sujeto que posee un tumor una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado, el fragmento o el derivado de la materia de interés actualmente descrita. En algunas i í ! I modalidades, el anticuerpo, el fragmento o el derivado de la materia de interés actualmente descrita se a un epitopo presente dentro de cualquiera de la SEQ : 1-3.
En algunas modalidades, el tumor es un tumor del! páncreas, i i mama, ovario, colon o recto, y/o una célula metastática derivada de los mismos, que en algunas modalidades expresa MUCl, una K-ras mutante, o ambas. ' La materia de interés actualmente describa también abarca el empleo de las composiciones y métodos descritos en la presente como parte de una terapia en combinación. Como tal, la materia de interés actualmente descrita proporciona en algunas modalidades, la administración al sujeto de uno o más tratamientos antitumorales adicionales. Los tratamientos antitumorales ejemplares incluyen, pero no están limitados a radioterapia, quimioterapia, una inmunoterapia adicional, una terapia anti-inflamatoria y combinaciones de las mismas.
Por ejemplo, una terapia anti- inflamatoria puede comprender administrarle al sujeto un agente anti-inflamatorio tal como, pero no limitado a un fármaco anti- I inflamatorio no esteroide (NSAID, por sus siglas eni inglés) . Los NSAIDs ejemplares incluyen, pero no están limitados a inhibidores de ciclooxigenasa (por ejemplo, indometacina) , particularmente inhibidores específicos de ciclooxigenasa- 2 tales como, pero no limitados a celecoxib y rofecoxibl.
Las terapias en combinación pueden también' incluir I la administración de una o más terapias adicionales tales como, pero no limitadas a la de gemcitabina, la cual es la 4-amino-l i difluoro-p-D-eritropentofuranosil) pirimidin-2 (1H) -ón-21 , 2 ' -difluoro-2 ' -desoxicitidina; celecoxib, el cual es 4- [5- (4-metifenil) -3- (trifluorometil) pirazol-l-il] benzenesulfonamida, I las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos y/o las I I combinaciones de los mismos al sujeto. j Las terapias en combinación pueden tambi'én incluir la administración de radiación ionizante al sujeto, antes, i durante y/o después del curso de administración de !cualguiera i I de las composiciones de la materia de interés actualmente ¡ descrita. 1 I I Para aplicaciones terapéuticas, los anticuerpos, I fragmentos, derivados y/o conjugados de los mismos pueden ser administrados a un sujeto, por ejemplo en una forma de dosis i farmacéuticamente aceptable. Estas pueden ser administradas peritumoral, intralesional o perilesional, paraj ejercer i efectos terapéuticos locales así como sistémicos, 1 como se desee .
Los portadores, diluyentes y/o excipientes f rmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos y pueden ser empleados por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica como lo garantice la situación clínica. Los ejemplos de portadores, diluyentes y/o excipientes adecuados incluyen: (1) solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco, pH de aproximadamente 7.4, que, contiene aproximadamente 1 mg/ml de albúmina sérica humana a 25 mg/ml, (2) solución salina al 0.9 % (NaCl al 0.9 % p/v) y (3) dextrosa al 5 % (p/v) .
Cuando está presente en una forma de dosis acuosa, en vez de estar liofilizado, el anticuerpo típicamente será formulado a una concentración de aproximadamente ¡0.1 mg/ml hasta 100 mg/ml, aunque es permitida una variación amplia fuera de estos intervalos. , Para una guía adicional respecto a la formulación y a la dosis, ver las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,326,902; 5,234,933; Publicación Internacional de PCT WO 1993/25521; Gennaro, 1990; Goodman et al., 1996; Berkow et al., 1997; Speight et al., 1997; Duch et al., 1998; Ebadi , 1998; Katzung, 2001; Gennaro, 2003.
Las composiciones y los métodos de la materia de interés actualmente descrita pueden ser empleados in vitro, in vivo o ex vivo.
Las composiciones y métodos de la materia de interés actualmente descrita pueden ser utilizados para la selección y/o el tratamiento de un cáncer en el cual está elevada la expresión de MUC1 o K-ras mutada. Los ejemplos de tales cánceres incluyen, pero no están limitados á, cánceres i de ovario, mama, pulmón, páncreas y próstata. | Para el tratamiento de la enfermedad, |una dosis apropiada de un anticuerpo, fragmento, o derivadoj del mismo y/o un conjugado del mismo de la materia de interés actualmente descrita puede depender del tipo de trastorno que se trate de la severidad y el curso de la enfermedad o I trastorno, ya sea que se administren los anticuerpos y/o los conjugados para fines preventivos o terapéuticos, eli curso de la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta a los anticuerpos y/o conjugados y la discreción del médico que atiende. Los anticuerpos y/o conjugados de la materia de interés actualmente descrita puéden ser administradas a un sujeto de una sola vez o en un ¡ curso de I varios o muchos tratamientos .
V. Métodos para Detectar, Purificar y Dirigirse a las Células Tumorales y las Células Madre Cancerosa i La materia de interés actualmente descrita también proporciona los métodos para detectar, purificar y a las células tumorales, las células madre cancerosa, o ambas, presentes en un sujeto, o aisladas de uri sujeto utilizando los anticuerpos, o los fragmentos o sus derivados de los mismos, descritos en la presente. En algunas modalidades, la materia de interés actualmente descrita proporciona los métodos para detectar las células 1 tumorales , las células madre cancerosa, o ambas mediante la1 detección del enlace de anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo a las células tumorales, las células madre cancerosa o ambas presentes en las muestras biológicas aisladas de los sujetos quienes tenían y/o actualmente tienen un cáncer. Las composiciones descritas en la presente que emplean marcadores detectables pueden ser empleadas para este propósito.
Además, la materia de interés actualmente descrita proporciona los métodos para purificar las células madre cancerosa. En algunas modalidades, los métodos comprenden (a) proporcionar una población de células sospechosas de comprender las células madre cancerosa; (b) identificar una subpoblación de las células que se enlazan a un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo, que se enlaza a un epitopo presente dentro de cualquiera de las SEQ ID Nos.: l÷-3; y (b) purificar la subpoblación. Con respecto a los métodos de purificación, en algunas modalidades la población de células comprende las células en circulación aisladas de un sujeto que tiene un cáncer .
En algunas modalidades, los métodos comprenden además el retiro de las líneas positivas al linaje (lin+) provenientes de la población de las células antes del paso de i identificación o removiendo las células lin+ de la I subpoblación purificada. Los métodos para remover las células i lin+ de poblaciones celulares son conocidos en la tiécnica. Un método ejemplar es como sigue: ' Suspensiones celulares simples son ya aisladas de un sujeto (por ejemplo, de la sangre, los fluidos i linfáticos, los aspirados de médula ósea, etcj. ) o son i preparadas a partir de los tejidos. En el caso de los i tejidos, las secciones provenientes de un tejido sospechoso de tener células madre cancerosa (por ejemplo, ¡tejido de i adenocarcinoma pancreático) pueden ser mecánicamente I homogeneizadas y digeridas con colagenasa IV y ADNása por 30 minutos a 37 °C. La sangre completa y la suspensión de células i simples provenientes del tumor pueden ser sometidas al i agotamiento de células del linaje utilizando, porj ejemplo, i uno de los Kits de Agotamiento de Células de Linaje específicos de especie, vendidos por Miltenyl Biotec i (Bergisch Gladbach, Alemania) , el cual retira las células que i expresan los siguientes antígenos del linaje: GD2 , CD3 , CDllb, CD14, CD15, CD16, CD19, CD56, CD123 y CD235a| a partir de las suspensiones celulares. La subpoblación negativa al linaje puede ser luego seleccionada utilizando citometría de i flujo para las células que expresan MUC1 utilizando, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal TAB-004 de la materia de interés actualmente descrita. Se entiende que los ¡pasos de las diversas selecciones pueden ser realizados en | cualquier orden. Si se desea, los anticuerpos dirigidos contra los marcadores de células madre CD133 (AC133) y/o GD24+/CD44+ pueden ser también empleados .
La materia de interés actualmente descrita también proporciona los métodos para dirigir un agente actjivo hacia una célula madre cancerosa en circulación, en un sjujeto. En algunas modalidades, el método comprende poner enj contacto una célula madre de cáncer, (opcionalmente una cél'ula madre de cáncer en circulación) con una composición que comprende un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo, de la materia de interés actualmente descrita y un agente activo. La composición distribuye de este modo el agente acjtivo a la célula madre cancerosa. Cualquiera de los agentes activos descritos en la presente pueden ser dirigidos a las células madre cancerosas mediante el empleo de las s y métodos actualmente descritos. En algunas el agente activo comprende un agente terapéutico, un agente quimioterapéutico, una toxina, un agente radioterapéutico o una combinación de los mismos.
Por ejemplo, en algunas modalidades el agente terapéutico comprende un inmunomodulador, el cual eb algunas modalidades podría ser uno o más de un inhibidor de indolamina 2 , 3 -dioxigenasa (IDO) (por ejemplo, 1-jmetil-DL-triptofano ( 1MT) ) ; un antagonista del receptor de EP¡2/EP4; un antagonista de CXCR4 , un antagonista del receptor 1 del factor de crecimiento endotelial vascular, Celebrex, un antagonista de TGF Rl, y un activador de células den|dríticas . Los ejemplos no limitantes de estos inmunomoduladores son proporcionados en la tabla 3 anterior.
VI . Métodos para Predecir la Recurrencia y/o la Progresión del cáncer en un Sujeto Hasta el año 2010, el cáncer de mama y él cáncer pancreático eran la tercera y cuarta causas principales de muertes relacionadas al cáncer, respectivamente. El cáncer de mama es el cáncer más comúnmente diagnosticado entre las mujeres, pero mientras que el cáncer pancreático esjel menos común, éste tiene el peor pronóstico de todos los cánceres. El pobre pronóstico asociado con el cáncer pancreático resulta al menos en parte de una falta de métodos de detección temprana que den como resultado el diagnostico de la enfermedad en una etapa avanzada. Aunque la mamografía ha mejorado significativamente la detección temprana en el cáncer de mama, esto no es sin inconvenientes. Hastá 20 % de ios cánceres de mama son resultados ausentes o falsos i positivos que pueden conducir a ansiedad y pruebas adicionales costosas. La falta de especificidad en la selección por mamografía puede conducir al "sobrediagnóstico" i de tumores benignos y a un tratamiento innecesario. otro problema es la presencia de metástasis I provenientes de tumores primarios hacia sitios pacientes, la presencia de los cuales correlaciona con el pobre pronóstico y como drásticamente el curso de la terapia administrada a los i pacientes. Los métodos actuales que pueden ser ujtilizados para detectar las metástasis incluyen la tjomografía computarizada (CT) , las exploraciones de tomogírafía de emisión de positrones (PET) , y la formación de imagen de resonancia magnética (MRI) . Estas modalidades son costosas, potencialmente peligroso para el individuo, pueden carecer de la especificidad y la sensibilidad y en general son incapaces de detectar las micrometástasis . j El monitoreo de la recurrencia también ser necesario para diseñar tratamientos farmacéuticos particulares. en sangre para los antígenos tumorales, I limitados a los antígenos tumorales CA 19-9, CA 15-3 y CA 27-29, pueden ser empleadas para estos propósitos. Sin! embargo, i estas pruebas también frecuentemente carecen de especificidad ya que las condiciones diferentes al cáncer pueden conducir a la elevación de estos y otros "antígenos asociados al tumor" putativos. También frecuentemente, los niveles de expresión de estos marcadores son insuficientemente altos durante las etapas tempranas del cáncer, y lo suficientemente en la progresión de un cáncer para detectar el cáncer antes de que los síntomas aparezcan. El desarrollo de las metodologías para detectar específicamente el cáncer en una etapa temprana, así como para detectar las micrometástasis y la recurrencia, podrían ser benéficas para mejorar los resultados en los pacientes con cáncer pancreático y de mama. VI .A. Métodos para Predecir la Recurrencia del cáncer En algunas modalidades, la materia de interés actualmente descrita también proporciona los métodos para predecir la recurrencia de cáncer en un sujeto. En algunas modalidades, los métodos comprenden (a) aislar un muestra biológica que comprende las células circulantes de ün sujeto con un cáncer; (b) poner en contacto la muestra biológica con uno o más de los anticuerpos, fragmentos o derivados de la materia de interés actualmente descrita; y (c) identificar en la muestra biológica una o más células circulantes que se enlazan a uno o más de los anticuerpos, fragmentos o derivados de la materia de interés actualmente descrita, con lo cual es predicha la recurrencia de un cáncer en el sujeto. Con respecto a estos métodos, la identificación de las células circulantes que se enlazan a los anticuerpos, fragmentos y/o derivados de la materia de interés actualmente descrita, pueden ser indicadoras de una recurrencia del cáncer de un sujeto, cuando el sujeto había sido previamente negativo para tales células circulantes . En algunas modalidades, la presencia de las células circulantes que se enlazan a uno o más de los anticuerpos, fragmentos, o derivados de la materia de interés actualmente i descrita indica que el sujeto está en riesgo aumentado de énfermedad metastásica con relación a un sujeto que es negativo para tales células circulantes.
VI .B . Métodos para Pronosticar la Progresión del Cáncer La materia de interés actualmente descrita también proporciona los métodos para pronosticar la progresión de un cáncer en sujetos. En algunas modalidades, los métodos comprenden el aislamiento de una muestra biológica que comprende las células circulantes provenientes de ün sujeto con un cáncer; poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo o el fragmento o el derivado del mismo, de la materia de interés actualmente descrita bajo condiciones suficientes para que el anticuerpo o el fragmento o1 derivado del mismo, se enlacen a un epitopo presente sobre un tumor y/o una célula cancerosa, si está presente en la muestra biológica; identificar en la muestra biológica una o más células circulantes que se enlazan al anticuerpo, o al fragmento o derivado del mismo, con lo cual es pronosticada la progresión de un cáncer en el sujeto. En algunas modalidades, la muestra biológica comprende una muestra de sangre, una muestra de linfa, o una fracción de las mismas. En algunas modalidades, el cáncer es un cáncer pancreático o cáncer de mama.
En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por la línea de células hibridomas TAB-004 depositada con la American Type Culture i Collection (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 201 10-2209, Estados Unidos de América, el 16 de diciembre de 2010 bajo los términos del Tratado dej Budapest como acceso No. PTA-11550. En algunas modalidades, el fragmento o derivado del mismo se selecciona del grupo que I consiste de un anticuerpo quimérico, o un fragmento o derivado del mismo; un anticuerpo humanizado, o un fragmento o derivado del mismo; un anticuerpo humano, o un fragmento o derivado del mismo; un anticuerpo de cadena simple, o un fragmento o derivado del mismo; y un fragmento Fab, ! en donde el anticuerpo quimérico, el anticuerpo humanizado, el anticuerpo humano, el anticuerpo de cadena simple o el fragmento Fab comprende los CDRs del anticuerpo monoclonal TAB-004, y además en donde el anticuerpo quiméjrico, el anticuerpo humanizado, el anticuerpo humano, el anticuerpo de ! cadena simple o el fragmento Fab comprende las ¡CDRs del anticuerpo monoclonal TAB-004. En algunas modalidades, las CDRs del anticuerpo monoclonal TAB:004 comprenden la CDR1 de cadena pesada que comprende la SEQ ID No.: 8; la! CDR2 de cadena pesada que comprende la SEQ ID No. : 9; laj CDR3 de cadena pesada que comprende la SEQ ID No.: 10; la CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID No.: 11; la CDR2 de cadena ligera que comprende la SEQ ID No.: 12; y la CDR3 de cadena ligera que comprende la SEQ ID No.: 13.
Como se utiliza en la presente, ía frase "pronóstico de la progresión de un cáncer" se refiere a la evaluación de los indicios de una enfermedad cancerosa en un punto de tiempo dado, y la comparación de los mismos con los indicios de la enfermedad cancerosa tomados en un punto de tiempo más temprano, en donde la comparación es indicadora de una progresión del cáncer en el sujeto. En algunas modalidades la progresión del cáncer comprende la metástasis del cáncer en el sujeto. ¡ Como tal, el anticuerpo o el fragmento o derivado del mismo, de la materia de interés actualmente ¡ descrita puede ser empleado para detectar la presencia de las células tumorales en circulación (CTCs) en la sangre u otras' muestras biológicas de los pacientes con cáncer, ya que la presencia de las CTCs puede ser un indicador importante del potencial para la enfermedad metastática y el pronóstico pobre. Actualmente, el sistema CELLSEARCH® (Veridex, LLC, Raritan, New Jersey, Estados Unidos de América) es el único método aprobado por la administración de alimentos y fármacos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés) para medir CTCs en pacientes con cáncer metastásico de mama, colorrectal y de próstata. Este sistema está basado en la detección del marcador de la superficie de las células epiteliales EpCAM en CTCs. En el cáncer de mama metastático, la detección de las CTCs antes del inicio de la terapia de primera línea ha mostrado que es altamente predictiva de la supervivencia libre de progresión y de la supervivencia genéral . Los pacientes con >5 CTC por 7.5 mi de sangre en el valor inicial y en el primer seguimiento (4 semanas) tuvieron un pronóstico peor que los pacientes con menos de cinco CTCs (Cris^tof nilli et al., 2005). Similarmente, en el cáncer de páncreas, >1 CTCs/7.5 mi de sangre correlacionó con pobre pronóstico (Kurihara et al., 2008).
No obstante, la habilidad de la CTCs paira formar lesiones metastáticas reales permanece en cuestión. Ya que las células tumorales con fenotipos invasores pierdjen varios antígenos epiteliales en un proceso de transformación llamado transición epitelial-mesenquimal (EMT) , las CTC quej expresan EpCAM son actualmente mínimamente predictivas j de las metástasis. De hecho, la baja expresión de EpCAMj por las micrometástasis ha sido reportada, y los intentos pa|ra aislar las CTCs utilizando anticuerpos contra EpCAM, no ha tenido éxito hasta la fecha. Ya que las células que expresan MUC1 tienen alto potencial metastástico y se ha encontrado que MUC1 va a ser expresado sobre las CTC, los anticuerpos actualmente descritos y los fragmentos y derivados de los mismos, incluyendo pero no limitados al anticuerpol TAB-004, pueden servir como un predictor altamente confiable y mejorado de la metástasis, en comparación a las estrategias basadas en intento de detectar las CTCs que expresan EpCAM. VII. Otros Usos Los anticuerpos de la materia de ! interés actualmente descrita pueden también ser empleados en! diversos métodos de ensayo, tales como pero no limitados a ensayos de enlace competitivo, ensayos de emparedado directo e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación (ver por ejemplo, Zola, 1987; Harlow & Lañe, 1988).
Los anticuerpos de la materia de interés actualmente descrita son también útiles como agentes de purificación por afinidad. En este proceso, uno o más anticuerpos son inmovilizados sobre un soporte adecuado (tales como, pero no limitado a la resina de Sephádex o el papel filtro) utilizando métodos bien conocidos en la técnica, ver por ejemplo, Harlow y La e, 1988. \ EJEMPLOS ¡ Los siguientes ejemplos proporcionan modalidades ilustrativas. A la luz de la presente descripción el nivel general de experiencia en la técnica, aquellas personas expertas apreciarán que los siguientes ejemplos estarán destinados a ser ejemplares únicamente y que pueden ser empleados numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin apartarse del alcance de la materia de j interés actualmente descrita.
EJEMPLO 1 I Generación de Ratones con Adenocarcinoma Pancreático que Expresan MUC1 Humano j Una estrategia para generar una línea jde ratón transgénico triple que exprese MUC1 humano y desarrolle adenocarcinoma pancreático, se describe en la Figura 3. En resumen, los ratones P48Cre +, que expresaron la recombinasa Cre a todo lo largo del desarrollo y el páncreas del adulto (Kawaguchi et al., 2002) fueron cruzados con ratones LSL-KrasG12D +, los cuales contenían un alelo ; K-rasG12D transcripcionalmente inactivo que fue activado en la células que expresan Cre (Jackson et al., 2001; Kawaguchi et al., 2002) . La progenie que fue positiva para P48Cre + y LSL-KrasG12D/+ y LSL-KrasG1 D + (designados "ratones PDA") fueron cruzados con una línea de ratón transgénico (MUCl.Tg) que llevaba un transgen de MUC1 humano y fueron mantenidos como heterocigotos (ver Figura 3). Los ratones MUC1. TG expresaron MUC1 humano, mostraron tolerancia de compartimentos de células T y B y fueron refractarios a la inmunización con la proteína codificada por el transgen (Rowse et al., 1998). Ya que el transgen de MUC1 humano fue impulsado por su propio promotor en estos ratones, sus niveles de expresión fueron específicos de tejido y apropiados. Las superficies luminales de bajo nivel del tejido epitelial simple y expresión incrementada en los tumores , fueron observas .
Los ratones que fueron positivos a P48Cre +, LSL-KrasG12D/+ y MUC1 humano (denominados en el presente como ratones "PDA. MUCl.Tg" ) llevaron tres transgenes. Todos los ratones PDA x MUCl.Tg desarrollaron neoplasia intr^epitelial pancreática (PanINs) de diferentes etapas, incluyen o PanlN-IA, PanIN-IB, PanIN-2, PanIN-3 y adenocarcinoma (Amadou et al., 2008; Mukherjee et al., 2009). Las secciones representativas de diversas edades del páncreas PDA jx MUCl.Tg se muestran en la Figura IB. Aproximadamente 80 % | de estos ratones desarrollaron adenocarcinoma por las 26 semanas de i edad y casi el 100 % de los ratones desarrollaron adenocarcinoma por las 34 semanas de edad. | A partir de los ratones PDA. MUCl.Tg (Figura 3) que expresaron los antígenos tumorales MUC1 humano yj K-rasG12D mutado, los lisados proteicos fueron preparados con jel fin de producir antisueros para los antígenos asociados al tumor, expresados por ratones transgénicos triples. En resumen, 5 mgs del lisado de proteínas se mezclaron con jadyuvante incompleto de Freund (IFA, por sus siglas en inglés) y utilizados para inmunizar ratones Balb/c. Los hjibridomas fueron generados mediante fusión de las células jdel bazo provenientes de ratones inmunizados con células de mieloma, y ¡ el anticuerpo TAB-004 fue identificado por de hibridomas . Se determinó que este anticuerpo era del isotipo IGg. El anticuerpo purificado se enlazó a MUC1 i glucosilado, asociado al tumor.
I La selección de epitopo determinó que el anticuerpo monoclonal (mAb) TAB-004 descrito en la presente, se enlazó a un epitopo presente dentro de la SEQ ID No. : 3. El anticuerpo reaccionó fuertemente con el tejido tumoral aislado del páncreas humano (Figura IB) , mama humana (Figuras 2A y 2B) , pero no se enlazó apreciablemente al páncreas normal o al tejido de mama normal (ver Figuras 1A y 2C) . ! De manera interesante, el anticuerpo I TAB-004 reaccionó cruzadamente con K-ras mutado tal que los tejidos tumorales que expresan la mutación K-ras pero no MUC1 humano también mostraron tinción positiva con el anticuerpo. Todas las lesiones metastáticas mostraron reactividad positiva, y j parecía que TAB-004 pudo enlazarse a un epitopo presente dentro de un polipéptido de K-ras mutado.
EJEMPLO 2 Clasificación por FACS de Células Tumorales El anticuerpo TAB-004 fue probado con diversas muestras para determinar su habilidad para enlazarse a y i clasificar las células tumorales que estaban presentes en diferentes ambientes, y bajo diferentes condiciones utilizando Clasificación Celular de Activación por Fluorescencia (FACS) .
En un primer experimento, el anticuerpo TAB-004 fue empleado para teñir las células provenientes ¡ de las poblaciones purificadas de las células GD133+ y CD24+/CD44+/EpCAM+ . Las secciones provenientes de adenocarcinomas pancreáticos son mecánicamente homogeneizadas y digeridas en colagenasa IV y ADNasa por 30 minutos a 37 °C. La sangre completa y la suspensión de célulasj simples provenientes del tumor fueron sometidas a agotamiento de células madre utilizando el it de agotamiento de células de linaje (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, ¡Alemania, catálogo No. 130-092-211), removiendo de este modo las células que expresan los siguientes antígenos de lin je: CD2, CD3, CDllb, CD14, CD15 , CD16, CD19, CD56, CD123 y CD235a provenientes de las suspensiones celulares . Las! células negativas al linaje (lin~) provenientes de las muestras de sangre o de las muestras de tumores provenientes de jpacientes con cáncer pancreático fueron luego seleccionadas Jtilizando i citometría de flujo para las células que expresan MUC1, utilizando el anticuerpo TAB-004 y los siguientes marcadores I de la línea pancreática CD133 (AC133) o CD24+/CD44+.
Las Figuras 7A y 7B son histogramas j de las separaciones por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de las células CD133+ (Figu†a 7A) y CD24+/CD44+/EpCAM+ (Figura 7B) y el grado al ^ cual el anticuerpo TAB-004 descrito en la presente, se enlazó a estas poblaciones. j Enseguida, el análisis FACS fue empleado para i comparar la expresión de MUC1 utilizando el anticuerpo TAB-004 en células tumorales normales y pancreáticas aisladas de tejidos tumorales pancreáticos, y también la expresión de CXCR4 , un polipéptido que se ha asociado con la movilidad de las células incluyendo las células del cáncer. Los resultados i son mostrados en las Figuras 8A-8D.
En las Figuras 8A-8D, se compararon las distribuciones de las células en el tejido pancreático histológicamente normal (Figura 8C) versus el ¿ejido de adenocarcinoma pancreático adyacente (Figura 8D) teñido con el anticuerpo de TAB- 004 versus un anticuerpo CXCR4j. Como se puede observar, las células que fueron positivas paira MUCl o para CXCR4 fueron más abundantes en el tejido de ¡ adenocarcinoma pancreático que en el tejido pancreático adyacente histológicamente normal. Las Figuras 8A y 8B muestran los resultados de los controles negativos (Figura 8A - sin anticuerpo; Figura 8B - anticuerpo de control isotipo) .
Y finalmente, el anticuerpo TAB- 004 fue comparado a un anticuerpo EpCAM que está actualmente en uso para detectar los cánceres epiteliales. Las Figuras 9A-9C proporcionan una serie de gráficas de FACS que muestran que el anticuprpo TAB-004 fue superior a un anticuerpo EpCAM estándar en la detección de las células tumorales en circulación en pacientes con cáncer pancreático.
Primeramente, la sangre completa proveniente de un individuo control normal fue adicionada con 250 células madre celular de cáncer pancreático PANCl por 700 mi de sangre, y las células PANCl fueron teñidas utilizando el ajnticuerpo TAB-004. La comparación de las líneas negra más a laj derecha, gris claro y gris medio, que corresponden a tres diferentes concentraciones del anticuerpo TAB-004 están en el ¡intervalo de 0.1 mg/ml hasta 0.004 mg/ml, hasta la línea gris oscuro, la cual corresponde al anticuerpo EpCAM, muestra] que las cuatro de estas preparaciones fueron capaces de detjectar las células PANCl en estas preparaciones razonablemente bien.
Enseguida, fueron probadas las habilidades de los i anticuerpos TAB-004 y EpCAM para detectar lasi células tumorales circulantes presentes en la sangre proveniente de dos pacientes (paciente número 1 y paciente número 2, respectivamente) fue probado. Como se muestra en las Figuras 9B y 9C, existió una diferencia claramente observable entre el anticuerpo TAB-004 y el anticuerpo EpCAM para detectar las células tumorales circulantes en la sangre de los pjacientes . Particularmente, el anticuerpo TAB-004-PE (ver la líjnea negra m s a la derecha en la Figura 9B y la líneas negra! más a la derecha y gris claro en la Figura 9C) pero no el Jnticuerpo EpCAM-PE (ver la línea gris oscuro en las Figuras y 9C) fue capaz de detectar estas células circulantes en sangre de pacientes, sugiriendo que la TAB-004 fue muy superior al anticuerpo EpCAM actualmente utilizado para este propósito.
EJEMPLO 3 Producción de Conjugados de TAB-004 El anticuerpo de TAB-004 de la materia dé interés actualmente descrita fue conjugado a l-metil-DL-tjriptofano (1MT) , el inhibidor de la indolamina-2 , 3-dioxigenasa (IDO); un antagonista del receptor EP2/EP4; los oligodesoxinucleótidos de CpG (CpG ODN) , que funcionan como activadores de células dendríticas (Rothenfusser et al. , 2002) . Los datos sobre el papel funcional del anticuerpo TAB-004 conjugado a CpG ODN son proporcionados con la presente como un ejemplo no limitante de la funcionalidad de los anticuerpos y conjugados de la materia de interés actualmente descrita no limitantes.
El anticuerpo TAB-004 solo o conjugado i CpG ODN se enlazó a una línea de células tumorales (denominada en la presente como la línea celular de "KCM" ; ver Figura 3) generada a partir de los ratones transgénicos; triples PDA.MUCl.Tg. Mientras que los solicitantes n¿ desean estar comprometidos por ninguna teoría particular de operación, parece que las células asesinas naturales activadas por el anticuerpo (células NK) y la conjugación con CpG ODN mejoró adicionalmente la actividad ijítica de las células NK contra sus objetivos tales como las células YAC, así como las líneas de células KCM (ver i Figuras 4A-4B) . ! EJEMPLO 4 Actividad Antitumoral in vivo del Conjugado TAB-004;-CpG ODN I Diez (10) ratones fueron inyectados con la línea celular de cáncer pancreático establecida CM, generada a partir de los ratones transgénicos triples PDA.MUCl.Tg. Los grupos de tratamiento, programa y la dosis fueron como se ilustra en las Figuras 5A y 5B. En resumen, 3 x 106 células tumorales KCM fueron administradas subcutáneamente dentro de la región del flanco de los ratones (n = 10 ratones) en el día 0. En los días 4, 10 y 16, 50 µg de un conjugado de TAB-004-CpG ODN fueron administrados intratumoralmente (sin adyuvante) a cada ratón. Las misma cantidades de anticuerpo fueron administradas a un grupo de anticuerpo solo' (TAB-004 no conjugado) para la comparación. Los ratones fueron sacrificados en el día 20 y los tumores recuperados.
Como se muestra en la Figura 5, el tratamiento con el anticuerpo conjugado detuvo completamente el crecimiento de un tumor establecido lo que condujo a la erradicación completa. Los datos también mostraron que incluso después del cese del tratamiento, los i ratones tratados con el conjugado TAB-004 -CpG ODN no desarrollaron nuevamente los tumores (Ver Figura 5) apoyando el uso del conjugado TAB-004 -CpG ODN como una vacuna para el cáncer tales como, pero no limitados a los cánceres epiteliales, particularmente cánceres pancreáticos.
Recombinante, Conformación de Enlace al Antigerio y j Secuenciamiento de (CDRs) j Con el fin de confirmar la habilidad del ánticuerpo TAB-004 para enlazarse a MUC1 y para determinar las secuencias de aminoácidos de la CDRs, el AR fue extraído de la línea de células de hibridomas ATCC No. PTA 11550 y la PCR de transcripción inversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés) fue realizada utilizando los grupos de cebadores específicos de la cadena pesada y y un Kit de RT-PCR Qiagen® iples reacciones de RT-PCR de cadena pesada y de cadena ligera fueron realizadas utilizando mezclas de cebadores delanteros degenerados que cubren las secuencias guía de las¡ regiones variables. Los cebadores delanteros fueron utilizados a I , diferentes concentraciones, mientras que los ¡cebadores inversos (localizados en las regiones constantes de los genes I de cadena pesada o ligera) fueron de 50 ng por eacción. Fueron empleadas las siguientes condiciones de RT-PCR: Transcripción inversa: 30 minutos a 50°C; j Paso de Activación de PCR inicial: 15 rjiinutos a 95°C; I Ciclos: 20 ciclos de 94 °C por 25 segundos; 54 °C por 30 segundos ¡ 72°C por 30 segundos; Extensión final: 10 minutos a 72 °C. ! Enseguida, fue empleada una PCR semianidada de segunda ronda. Los cebadores delanteros fueron idénticos a aquellos utilizados en la RT-PCR de la primera ronda, aunque i la cantidad de cada cebador fue duplicada con relación a las condiciones de RT-PCR descritas anteriormente. Los ^cebadores inversos semianidados, específicos para las secuencias la cadena pesada fueron utilizados a 100 ng por reacción, Las ¡ i condiciones de PCR empleadas fueron como sigue: Desnaturalización inicial de 5 minutos a 95°C; Ciclos: 25 ciclos de 95°C por 25 segundos; 57°C por 30 segundos 68 °C por 30 segundos; ' Extensión final: 10 minutos a 68 °C.
Después de que se completó la PCR, las muestras de los productos PCR fueron separadas sobre geles de agarosa y los productos fueron visualizados. Varios productos de PCR de cadena pesada y cadena ligera fueron subclonados y las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras fueron secuenciadas . Las secuencias nucleotídicas resultantes y las secuencias de aminoácidos codificadas por estas, son mostradas en la SEQ ID No. : 4-7, y las secuencias de aminoácidos de las CDRs deducidas a partir de las mismas son resumidas en la tabla 4.
Tabla 4 Secuencias de Aminoácidos de las CDRs de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo Monoclonal TAB-004 En seguida, los anticuerpos recombinantes fueron producidos por otra ronda más de amplificación de RT-PCR del i ARN total aislado de la línea de células hibridomas | ATCC No.
I PTA-11550 seguida por una PCR semi -anidada, de segunda ronda, como se describe anteriormente en la presente. Las secuencias de cadena pesada amplificadas y las secuencias de cadena ligera fueron individualmente subclonadas dentroj de los vectores de expresión de anticuerpo plásmido. j Enseguida, los plásmidos fueron tran fectados dentro de las células CHO, y la IgG recombinante que tenía i una cadena principal de IgGl humana fue producida. Los sobrenadantes de células CHO transfectadas fueron j probados para el enlace al antígeno en el formato de ELISA de 96 pozos. Varias muestras de sobrenadante mostraron enlace muy fuerte, aunque las concentraciones de la IgG recombjinante en los sobrenadantes fueron bajas (es decir, aproximadamente 10 ng/ml) . Dada la concentración relativamente baja del anticuerpo del sobrenadante, los resultados de ELISA indicaron que los anticuerpos recombinantes fueron muy potentes .
Las secuencias de los insertos de los plásmidos de anticuerpos recombinantes fueron determinadas I mediante secuenciamiento de ADN. Todas correspondieron a una Secuencia única de cadena pesada simple y una secuencia de cadena ligera simple. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada y ligera fueron determinadas, y las secuencias de CDR deducidas a partir de éstas fueron como se describe en la SEQ ID Nos.: 8-13.
EJEMPLO 6 Las pruebas clínicas basadas en sangre para los antígenos tumorales actualmente disponibles, incluyen CA 15-3 y CA 27-29 para cáncer de mama y CA 19-9 parja cáncer pancreático. Las condiciones no cancerosas o la enfermedad benigna pueden conducir a niveles elevados de estos ántígenos tumorales, impactando de este modo de manera negativa la habilidad de estos anticuerpos para ser utilizados para detectar de manera exacta los cánceres. Como resultado de esta baja especificidad, estas pruebas todavía no han sido probadas para ser de valor de diagnóstico significativo.
Para ese fin, la habilidad de TAB-004 para( detectar los niveles de MUCl disperso en el plasma de pacientes, fue comparada con los desempeños de estos anticuerpos en las i muestras de plasma. Un inmunoensayo enzimático (EIA) ha sido optimizado utilizando el anticuerpo TAB-004 para capturar y detectar los niveles de MUCl disperso, presentes en circulación. Brevemente, una placa de ELISA de 96 pozos fue recubierta con 100 µ? del anticuerpo TAB-004 a 50 ( µg/mL en PBS, y se incubaron toda la noche a 4°C. Después de la incubación, el anticuerpo de captura TAB-004 en exceso fue i removido de la placa. La placa fue bloqueada con 200 µ? de leche en polvo al 1 % en PBS para evitar el enlace no específico y se incubó por 1 hora a 4°C. Las placas fueron lavadas extensamente (3 veces) con 250 µ? de PBS que contenía 0.05 v/v de TWEEN ®-2 utilizando un lavador de placas de ELISA. Un estándar de MUCl utilizando una preparación de polipéptido 25-mer proveniente de MUCl TR fue preparado en el intervalo de 0 a 2000 U/ml . El plasma de prueba fué diluido 1:2, y 1:10 en leche al 0.1 % en PBS, y se agregaron; 100 µ? a los pozos apropiados por triplicado, y las placas fueron incubadas por 2 horas a 37 °C.
Placas fueron luego lavadas y se 100 µ? de un anticuerpo policlonal de conejo anti-MUCl (Genway) a una dilución de 1:3000.000 en leche al 0.1 % en PBS a cada pozo, y la placa fue incubada por 1 hora a 37° C. El anticuerpo policlonal fue lavado de los pozos y la IgG de cabra anti-conejo, marcada con peroxidasa de rábano, fue agregada a una dilución de 1:1000 en leche al 0.1 % en PBS e incubada a 37°C por 1 hora. Después de lavar las , se agregaron a los pozos 100 µ?? de una solución que consistió de sustrato de peroxidasa (TMB) , y las placas se incubaron a temperatura ambiente por 30 minutos en la oscuridad. La reacción fue detenida por la adición de 25 µ? ácido sulfúrico 4.0 N y la densidad óptica leída a una longitud onda de 450 nm utilizando un espectrofotómetro ESPECTRA-MAX 250. i Fueron generadas curvas estándares con análisis de regresión para determinar las concentraciones de las ; muestras desconocidas .
Fueron elegidas unidades arbitrarias (U[) /mi con base en un estándar de referencia inicial de Lucí. Se determinó que un intervalo lineal era de 50-800 unidades/mi de antígeno de MUC1. Las variaciones Intra- e Inter-ensayo fueron controladas mediante la inclusión de muestras! normales I y anormales para asegurar el equipo, el técnico, y los reactivos utilizados en la prueba estuvieran funcionando como se esperaba.
El ensayo de EIA TAB-004 fue comparado contra CA15-3 (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, Estados Unidos de América) que son muestras de cáncer de mama. La comparación a CA27-29 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY) para el cáncer de mama y CA19-9 (Panomics Inc, Redwo;od City, California, Estados Unidos) para las muestras de cáncer pancreático utilizando los ensayos de EIA, fueron también realizados. Los análisis estadísticos fueron conducidos para evaluar la sensibilidad y la especificidad de EIA de TAB-004 versus los EIAs comercialmente disponibles El EIA de TAB 004 fue empleado utilizando plasma proveniente de 36 pacientes con cáncer de mama, 24 pacientes de cáncer de próstata, 4 pacientes con cáncer pancreático, 13 pacientes con cáncer esofágico, 12 controles normales, 3 pacientes con pancreatitis y 1 paciente diabético (la pancreatitis y la diabetes son dos condiciones conocidas por detectarse como falsos positivos utilizando los ensayos que prueban la presencia de los antígenos CA 15-3, CA 27-29 y CA 19-9) . La mayoría de las muestras de cáncer que fueron probadas fueron provenientes de cánceres de etapa final.
El valor de corte de < 40 U/ml fue alcanzado a partir de los datos preliminares para los pacientes; normales (n = 12) . Los valores de la media y la desviación estándar de j i ? 17.42 y 7.07 unidades/ml de plasma, respectivamente, fueron encontrados (ver Figura 10) . Entrando en este estudio, se planeo utilizar un valor de menos de 40 unidades/ml de plasma como normal. Esto podría cubrir más del 99.8 % de la población, asumiendo una distribución normal. Se planeó la 1 refinación del valor de corte como parte de este estudio, dado que se tenían únicamente 12 muestras en nuestros datos preliminares que probablemente habían inflado artificialmente la desviación estándar. i En este valor de corte de <40U/ml, ninguno de los plasmas saludables o con pancreatitis fueron positivos, mientras que todos los plasmas provenientes de las( muestras con cáncer fueron > 40U/ml (ver Figura 10) . Los datos demostraron que en comparación a un ensayo que está diseñado i para detectar el antígeno CA 15-3, el ensayo de EIA de TAB-004 fue superior en la detección más específicamente y con mayor sensibilidad del antígeno tumoral en el plasma proveniente de pacientes con cáncer de mama versus el plasma proveniente de voluntarios normales . Mientras l que no existieron falsos positivos con TAB-004, 5 dei los 12 pacientes normales producen resultados falsos positivos con el ensayo basadas en CA15-3 (p = 0.031, utilizando la prueba de una sola cola < 31 U/ml, es el valor de corte publicado para el ensayo basado en CA15-3) . Todo el plasma de los pacientes de cáncer fue positivo para TAB-004 pero 3 de 36 I muestras de plasma demostradas falso negativo con CA-15-3 (< 31 U/ml) . En general, la diferencia entre el plasma de cáncer versus normal fue mucho mayor con TAB-004 cuando se comparó con la prueba de CA15-3 en los pacientes de cáncerj de mama. Existe también un traslape considerable entre el plasma normal y de cáncer cuando la prueba de CA 15-3 fue utilizada, mientras que no hubo traslape cuando la prueba de TAB-004 fue utilizada (ver Figura 10) . j Para evaluar adicionalmente el desempeño del anticuerpo TAB-004 para evaluar el estado de enfermedad, la EIA de TAB-004 fue realizada sobre muestras de plasma desde n = 5 etapas 0, 2, 3 y 4 pacientes con cáncer de pancreático . La Figura 11 muestra que las diferencias medias entre los ensayos de TAB-004 y el CA 15-3 fueron estadísjticamente significativas para las 4 etapas de cáncer (etapja 0 p = 0.049; etapa 2 p = 0.008; 3 p = 0,017; y la etapa 4 p = 0.008). El ensayo de TAB-004 proporcionó valores que fueron más altos que CA 15-3 para las 20 muestras. Además, los niveles de ensayo de la TAB-004 fueron dependientes de la I etapa tumoral, ya que estos se incrementaron ! con la í progresión de la enfermedad (p < 0.0001) de manera contraria al ensayo de CA 15-3, el cual fue incapaz de predecir las diferencias entre las etapas 0, 2 y 3. Por comparación de los datos de etapa recolectados al intervalo normal encontrado en la Figura 10 (< 40U/ml) , parece que TAB-004 fue superior a CA 15-3 para diagnosticar la etapa 2 y 3, ya que los pacientes de etapa 2 y etapa 3 mostraron valores de ensayo de TAB-004 por arriba del intervalo normal, mientras que únicamente 2 de los 10 pacientes estuvieron por arriba de lo normal para el ensayo de CA 15-3 ensayo.
EJEMPLO 7 Niveles de Correlación de MUC1 Circulante con la Progresión y la Recurrencia de la Enfermedad TAB-004 es empleado para evaluar su potencial en predecir de manera exacta la recurrencia y la progresión de la enfermedad. El plasma proveniente de n = 100 pacientes en las etapas II y III/IV del cáncer de mama son evaluados antes del tratamiento y 6, 12 y 18 meses después del final de la I terapia de cuidados . La recurrencia en este grupo es j evaluada después de 24 meses. El plasma proveniente de \ n = 50 pacientes pancreáticos en las etapas 2, 3 y 4 es evaluado antes del tratamiento, y 3, 6, 9 y 12 meses después de la terapia estándar de cuidados.
Recolección de las muestras. El plasma es recolectado en las visitas rutinarias de seguimiento. La etapa de la enfermedad es confirmada por evaluación I patológica y la recurrencia es confirmada por ! técnicas estándares de formación de imagen. Las bases de datos son mantenidas detallando cualesquiera quimioterapias o terapias adjuntas administradas a los pacientes con cáncer pancreático. ¡ Para el cáncer de mama, la proporción de recurrencia es en general mucho más baja en comparación al cáncer pancreático, y por lo tanto son empleados números más bajos de pacientes con cáncer de páncreas (estadísticamente justificado más adelante) . Los tiempos para la recolección del plasma también difieren entre el cáncer de mama y de páncreas debido a la sincronización de la visita de seguimiento estándar.
Para pacientes con cáncer pancreático, pocos pacientes de etapa 3 y 4 en general sobreviven más dé 6 meses a un año, y de este modo no es posible esperar para el final del tratamiento para recolectar las muestras nuevamente, debido a la alta tasa de mortalidad después del diagnóstico. j Las muestras son recolectadas mientras que los pacientes están sufriendo terapia. Para los pacientes que sufren terapia, las muestras son recolectadas antes de la cirugía y 3, 6 y 9 meses después de la cirugía, no obstante de su régimen de tratamiento. Para pacientes que tienen cáncer no resectable, las muestras son recolectadas en el diagnóstico antes del inicio de la terapia y luego a los 3, 6, 9 y 12 meses después del diagnóstico, no obstante del régimen de tratamiento. Ya que la mayoría de los pacientes podría esperarse que recurran dentro de un año, la prueba es detenida a los 12 meses. Para pacientes con cáncer de mama, únicamente la etapa III/IV se espera en general que recurra dentro de 2 años. No obstante para comparación, son incluidos los pacientes de etapa II. El plasma es recolectado previamente al tratamiento y luego a los 6, 12 y 18 meses después del final del tratamiento.
Análisis y Estadísticas: Los análisis son realizados para determinar la habilidad de los erisayos de i TAB-004 para predecir la recurrencia y/o la muerte de los pacientes con cáncer de mama. Los pacientes son divididos en aquellos que tienen recurrencia durante el periodo de estudio y aquellos que no la tienen. Las Curvas de Operación del Receptor (ROCs) son construidas para determinar si existe un punto de corte natural TAB- 004 para predecir la recurrencia. Para pacientes con una recurrencia, el nivel previo de TAB-004 es utilizado en el análisis, mientras que los valores de TAB-004 finales son utilizados para aquellos sin una recurrencia. Por ¡ejemplo, si la recurrencia ocurre a los 15 meses, entonces es utilizado el nivel de TAB-004 a los 12 meses. Los modelos de riesgo proporcional de Cox son realizados con el tiempo para la recurrencia como la variable dependiente (resultados) . El modelo de Cox es un procedimiento multivariado que explica correctamente los datos de perdido al seguimiento y censurado. La edad, la etapa del cáncer y el grado del cáncer y los valores del TAB-004 son introducidos como predictores independientes. Si el ROC determina un punto de corte natural para la predicción de la recurrencia, entonces otro modelo de Cox es corrido con esta variable dicotómica (por arriba y por debajo del corte) remplazando el valor real de TAB-004 en el modelo. Un valor de p estadísticamente significativo para la variable de TAB 004 indica que TAB-004 es un predictor í independiente de la recurrencia cuando se ajusta; para la edad del paciente, la etapa del cáncer, y el girado del tumor. El grupo previo del análisis es repetido con el tiempo para la recurrencia o la muerte como la variable dependiente. Para pacientes con cáncer en la etapa 0, I y II, este mismo procedimiento es utilizado para predecir el tiempo para la etapa III/IV del cáncer (metastático) .
Este grupo de análisis es también realizado utilizando los datos provenientes de los pacientes con cáncer pancreático. Con la tasa de muerte extremadamente alta para el cáncer pancreático, la obtención de estimaciones estables de los coeficientes en el modelo de Cox cuando se predice el tiempo para la recurrencia o el tiempo para la enfermedad en etapa 4, puede ser J difícil. Como tales, pocas recurrencias del cáncer o pocos ¡casos de pacientes que progresa desde la etapa 2 ó 3 hasta! la etapa 4 de los cánceres metastáticos , pueden ocurrir durante el periodo de estudio.
EJEMPLO 8 Niveles de Correlación de las CTCs Positivas a TAB- 004 con Pronóstico de Enfermedad y Niveles Plasmáticos de TAB-004, y Comparación de los Números y el Potencial Metastático de la único método aprobado por la FDA para medir CTCs en los í pacientes con cáncer de mama, colon rectal y j próstata metastáticos . Utilizando este sistema, CTCs en pacientes con cáncer pancreático mostraron una correlación entre las CTC < 1 y la supervivencia. De manera interesante, en este mismo estudio, se mostró que la presencia de CTCs correlaciona con niveles incrementados en suero del antígeno tumoral CA 19-9, indicando que los niveles en suero de los antígenos tumorales también pueden ser predictivos de las células tumorales en circulación. En los pacientes de cáncer de mama metastásico, se encontró que < 5 CTCs fue un predictor independiente de supervivencia libre de progresión y la supervivencia^ general. Además, los niveles de la CTC en los pacientes de cáncer de mama metastásico son una indicación más temprana, más reproducible de estado de enfermedad que los actuales métodos i actuales de formación de imágenes. método aprobado para la evaluación de CTC involucra el aislamiento de las células que expresan EpCAM provenientes de la sangre y luego validando estasj células como CTCs con la presencia de la tinción de citoqueratina específica epitelial, tinción apropiada del núcleo, y la ausencia de CD45 específica de leucocitos. Una advertencia para este método es la restricción de las células que expresan EpCAM . Los estudios han sugerido que las células que adquieren un fenotipo migratorio pierden sus características epiteliales y adquieran características mesenquimales , las cuales fenotípicamente han sido mostradas como células responsables de la progresión agresiva del tumor. Como tal, es aparente que el aislamiento de EpCAM de las CTC podría "soslayar" la CTCs más potentes - aquellas que poseen un j fenotipo mesenquimal.
Los tumores primarios y metastáticos de mama y pancreáticos expresan altos niveles de MUC1 asociado al tumor, reconocido por nuestro anticuerpo TAB-004. Por lo tanto, la CTCs en estos pacientes debe ser reconocida por el anticuerpo TAB-004. En experimentos preliminares, los niveles de MUC1 fueron evaluados utilizando el anticuerpo TAB-004. Primeramente, se probó la habilidad para utilizar el sistema Veridex CELLSEARCH® para medir las CTCs que expresan MUC1 utilizando muestras de sangre de 7.5 ML (análogas a las i muestras humanas) adicionadas con células PANC1, las cuales son una línea celular de cáncer pancreático1 humano.
Aproximadamente 90 % de la CTC (células EpCAM+) expresaron UCl . Además las muestras de pacientes fueron recolectadas, y se encontró que TAB-004 reconoce las CTcjs desde aproximadamente 33 % hasta 100 % de eficiencia. Por lo tanto, el uso del anticuerpo TAB-004 parece detectar maneara precisa las micrometástasis en los pacientes cáncer pancreático y de mama. j REFERENCIAS j Todas la referencias listadas más adelante, así como todas las referencias citadas en la presente descripción, incluyendo pero no limitadas a todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones de las mismas, artículos de revistas científicas y entradas de bases de datos (por ejemplo, las entradas de bases de datos de GENBANK® y todas las anotaciones disponibles en esta) son incorporadas por referencia en la presente en su totalidad, al grado en que éstas suplementan, explican, proporcionan un antecedente para, o enseñan la metodología, las técnicas y/o las composiciones empleadas en la presente.
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SECUENCIAS SEQ ID NO . : 3 : STAPPVH VTSAPDTRPAPGSTAPP SEQ ID NO: 4: gaggtccagctgcagcagtctgggggtgaacgggcaacacctg gggcctcagtgaagatgtcctgcaagacttctggctacacctttactaactactgga tgcactgggtaaaacagaggcctggacagggtctggaatggattggatacattaatc aagggactctggtcactgtctctgca , I SEQ ID NO . : 5 : EVQLQQSGGERATPGASVKMSCKTSGYTFTNYWMHWVKQRPGQ GLEWIGYINPSSGYTQYNQKFKDKATLTADKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCSTYY GDYLFPY GQGTLVTVSA SEQ ID NO. : 6 : gatgttttgatgacccaaactccactctccctgc^tgtcagtc ttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcaggacattgtatatggtaatg gaaacacctatttagaatggtacctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctga tctacaaagtttccaaccggttttctggggtcccagacaggttcagtggcagtggat cagggacagatttcacactcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggágttt attactgctttcaaggttcacatgttccgtacacgttcggaggggggaccaagctgg aaataaaacgg SEQ ID NO. : 7 : DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQDIVYGNGNTYLEWYLQ KPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVP YTFGGGTKLEIKR SEQ ID NO. : 8 : GYTFTNYW SEQ ID NO. : 9 : INPSSGYT SEQ ID NO. : 10 : : STYYGDYLFPY SEQ ID NO. : 11: : QDIVYGNGNTY SEQ ID NO. : 12 : : KVS SEQ ID NO. : 13 : : FQGSHVPYT Se entenderá que diversos detalles de la materia de interés actualmente descrita pueden ser cambiados sin I apartarse del alcance de la materia de interés actualmente descrita. Además, la descripción anterior es para fines de ilustración únicamente, y no para fines de limitación.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llejvar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. ¡

Claims (20)

I REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se i i reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un anticuerpo aislado, o un fragmento o derivado del mismo, que comprende las regiones de determinación de la complementariedad (CDRs) del anticuerpo monoclonal TAB-004, caracterizado porque el anticuerpo i aislado, o un fragmento o derivado del mismo es poljiclonal o monoclonal, y opcionalmente en donde el anticuerpo aislado, o un fragmento o derivado del mismo es humano o humanizado.
2. El anticuerpo aislado, o el frajgmento o derivado del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo monoclonal producido por la línea de células hibridomas TAB-004 depositada con la American Type Culture Collection (ATCC) como número de acceso PTA-11550 el 16 de Diciembre del 2010; un anticuerpo quimérico, o un fragmento o derivado del mismo; un anticuerpo humanizado, o un ¡fragmento o derivado del mismo; un anticuerpo humano, o un fragmento o derivado del mismo; un anticuerpo de cadena simple o un fragmento o derivado del mismo; un fragmento Fab, eri donde el anticuerpo quimérico, el anticuerpo humanizado, el anticuerpo humano, el anticuerpo de cadena simple, o el fragmento Fab comprende las CDRs del anticuerpo monoclonal TAB-004, y I 147 ! opcionalmente en donde además : (i) las CDRs del anticuerpo monoclonal TAB-004 comprenden la CDR1 de cadena pesada que comprende la SEQ ID No. : 8; la CDR2 de cadena pesada que comprende la I SEQ ID No. : 9; la CDR3 de cadena pesada que comprende la SEQ ID No. : 10; la CDR1 de cadena ligera que comprende la SEQ ID No. : 11; la CDR2 de cadena ligera que comprende la SEQ ID No. :, 12; y la CDR3 de cadena ligera que comprende la SE ID No. : 13: y/o ! (ii) ligera que comprende la SEQ ID No.: 7 o codificada por una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID No . : 6.
3. Una composición, caracterizada porque comprende el anticuerpo, o el fragmento derivado del mismo de conformidad con la reivindicación 1 y un j portador farmacéuticamente aceptable, opcionalmente, en konde el portador farmacéuticamente aceptable es aceptable para el uso i en un humano . j
4. La composición que comprende el anticuerpo, o el fragmento derivado del mismo de conformidad con la reivindicación 1, conjugado a un agente activo, caracterizada porque el agente activo se selecciona opcionalmente del grupo que consiste de una molécula radiactiva; un radionúclido ; una molécula sensibilizadora; un reactivo de formación de imagen; un radioisótopo, opcionalmente 10B, ¾ 21111A,t, 212 Pb, 212 Bi, 125 I, 131l, 35S, y 3H; una toxina; una citotoxina; un agente antiangiogénico; un agente anti-tumoral, un agente quimioterapéutico; un inmunomodulador, opcionalmente un inhibidor de la indoleamina-2 , 3 -dioxigenasa (IDO) opcionalmente, 1-metil-DL-triptofano (1MT) ; un del receptor de EP2/EP4; un inhibidor de cic opcionalmente la indometacina; y un activador de las células dendríticas, opcionalmente los oligodeoxinucleótidos CPG (CpG ODN) ; una citocina, un grupo reportero; o una combinación de los mismos .
5. Un kit, caracterizado porque comprende el anticuerpo, o el fragmento o derivado de mismo, de conformidad con la reivindicación 1, y las instrucciones para su uso. i
6. Un vehículo de distribución para el üso en la distribución dirigida de un agente activo hacia una célula tumoral, el vehículo de distribución comprende un agente de dirección al objetivo que comprende el anticuerpo ajislado, o el fragmento o el derivado del mismo, de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente activo comprende una molécula radioactiva, un radionúclido, una molécula sensibilizadora, un reactivo de formación de imagen, un radioisótopo, una toxina, una citotoxina, un agente anti-angiogénico, un agente anti-tumoral, un agente quimioterapéutico, un inmunomodulador, una citocina,; un grupo reportero, o una combinación de los mismos. j
7. Una célula aislada, caracterizada porque produce el anticuerpo, o el fragmento o el derivado del mismo, de conformidad con la reivindicación 1.
8. Un hibridoma, caracterizado porque produce el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, opcionalmente en donde el hibridoma es la línea de células hibridomas ATCC acceso No. PTA-1 1550 depositada con la American Type Culture Collection el 16 de Diciembrej del 2010 bajo los términos del Tratado de Budapest. 1
9. Un método para detectar la presencia de un epitopo al cual se enlaza el anticuerpo monoclonal TAB-004 en una muestra biológica, caracterizado porque comprendé: (a) poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo aislado, o el fragmento derivado del mismo, de conformidad con la reivindicación 1; y (b) detectar la presencia de un epitopo al cual se enlaza el anticuerpo monoclonal TAB-00,4 en la muestra biológica, opcionalmente en donde el epitopo está presente sobre un polipéptido de mucina (MUC1) o un polipéptido K-ras.
10. Un método para elaboración de un antjicuerpo o un fragmento o derivado del mismo, caracterizado porque comprende : (a) cultivar la célula aislada de conformidad con la reivindicación 7 o el hibridoma de conforjmidad con la reivindicación 8, bajo condiciones tales que el anticuerpo, el fragmento o el derivado del mismo es expresado; y (b) recuperar el anticuerpo o el el derivado del mismo de la célula o y/o del ambiente en el cual se está la célula o el hibridoma.
11. Un método para detectar un tumor I y/o una célula cancerosa en un sujeto, caracterizado porque comprende : (a) poner en contacto una muestra biológica, opcionalmente una muestra de sangre o una; fracción de la misma, en el sujeto o aislada del sujeto, con la composición que comprende el anticuerpo, o el fragmento o el derivado del mismo de conformidad con la reivindicación 1, bajo las condiciones i suficientes para que el anticuerpo, o el fragmento o el derivado del mismo, de conformidad con la reivindicación 1, se enlace a un epitopo, presente sobre el tumor y/o una célula cancerosa] si está presente, en la muestra biológica; y (b) detectar el enlace del anticuerpo, o el fragmento o el derivado del mismo, de conformidad con la reivindicación 1, al epitopo, en donde la detección es indicadora de un tumor y/o una célula cancerosa que está presente en el sujeto; y opcionalmente en donde: (i) el tumor y/o la célula cancerosa es un ¡tumor del páncreas, mama, ovario, colon o recto, y/o una célula metastática derivada de los mismos, que expresa opcionalmente MUC1, un K-ras militante, o ambos ; o j (ii) el anticuerpo, o el fragmento derivado del mismo es conjugado a un marcador detectable que comprende un agente de formación de imagen seleccionado del grupo que consiste de iones i ' paramagnéticos, radiactivos y fluorogénicos , en donde los iones radiactivos; ó ! (iii) el agente de formación de imagen radiactiva se selecciona del grupo que consiste de 3K, 52Fe, 57, Co, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 77Br, 81Rb/81MKr, 87MSr, 99M, Te, 111 In, 113 In, 123 125 127 I, I, Cs, 129 Cs , 131 132 197 I, I, Hg, 203 Pb, y 206Bi
12. Un método para tratar un tumor en un sujeto, caracterizado porque comprende administrarle al composición que comprende el anticuerpo, o el derivado del mismo de conformidad con la reivindicación 1, conjugado a un agente activo, opcionalmente un agente quimioterapéutico, una toxina, un agente radíoterapéutico, o una combinación de los mismos, mediante el cual el agente activo hace contacto con el tumor para tratar con esto el tumor, y opcionalmente además en donde: (i) el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de un fármaco antitumoiral, una citocina, un anti-metabolito, un agente alquilante, una hormona, metotrexato, doxorrubiciña, daunorrubicina, arabinósido de citosina, etopósido, vindesina, alcaloides de vincapervinca, mitomicina, bleomicina, purotionina, macromomicina, derivados de 1, 4-benzoquinona, trenimon, esteroides, I aminopterina, antraciclinas, denjecolcina, etopósido, mitramicina, doxorrubicina, daunomicina, vinblastina, neocarzinostatina, macromicina, oc- amantina, y combinaciones de los mismos; o (ii) la toxina se selecciona del grupo que consiste de veneno de víbora de ussell, Factor IX activado, Factor X activado, trombina, fosfolipasa C, factor de veneno de cobra, ricina, cadena A de ricina, exotoxina de Pseudomonas, toxina de la ¡difteria, ribonucleasa pancreática bovina, proteína antiviral de hierba carmín (pokeweed) , abrina, cadena A de abrina, gelonina, saporina, modeccina, yiscumina, volquensina, y combinaciones de los mismos,; o el agente radioterapéutico se seleccioña de un grupo que consiste de 47Sc, 67Cu, 90Y, 1(j9Pd, 123I, 125 - , I, 186rRe, 188 ,Re, 199A,u, 211A,t , 212,Pb, 212, 32 , i Bl, P, 33P, 71Ge, 77As, 103Pb, 105Rh, xllAg, 119Sb, 12}sn, 131Cs, 143Pr, 161Tb, 177Lu, 1910s, 193MPt, y 197Hg. ¡
13. Un método para suprimir el crecimienlo tumoral en un sujeto, caracterizado porque comprende administrarle a un sujeto que posee un tumor, una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado, o un fragmento o derivado de mismo, que comprende las regiones de determinación de la i complementariedad (CDRs) del anticuerpo monoclonalj TAB-004, en donde el tumor es un tumor del páncreas, mama, ovario, colon o recto, y/o una célula metastática derivada del mismo, que opcionalmente expresa MUC1, un K-ras mutante, o ambos.
14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12 y 13, caracterizado porque J comprende además administrarle al sujeto uno o más tratamientos antitumorales adicionales, opcionalmente en donde o más tratamientos antitumorales adicionales se seleccionan de un grupo que consiste de radioterapia, quimioterapia, que comprende opcionalmente administrar gemcitabina (4-amino-l- ( 2 -deoxi-2 , 2 -difluoro-p-D-eritro-pentofuranosil) pirimidin-2 (1H) -on-21 , 2 ' -difluoro-2 ' -desoxicitidina) y celecoxib (4- [5-(4 -metilfenil) -3- (trifluorometil) pirazol-1-il] bencensulfonamida) , o las sales farmacéuticamente aceptables de uno o ambos de los mismos; una inmunoterapia adicional; una terapia antiinflamatoria, que comprende opcionalmente administrar al sujeto un inhibidor de ciclooxigenasa, opcionalmente un inhibidor específico de ciclooxigenasa-2 , y combinaciones de los mismos.
5. Un método para purificar una célula de la línea cancerosa, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar una población de células sospechosas de comprender células de la línea cancerosa; i opcionalmente células circulantes aisladas de un sujeto que tiene un tumor y/o un cáncer; j i (b) identificar una subpoblación de las células que se enlazan a un anticuerpo, o un fragmento derivado del mismo, que comprende la CDRs del anticuerpo monoclonal TAB-004; (c) purificar la subpoblación, y opcionalmente (d) el retiro de las células positivas al linaje (lin+) de la población de células antes del paso de identificación y/o después del paso de purificación.
16. Un método para dirigir un agente activo a una célula de la línea cancerosa circulante en un sujeto, caracterizado porque comprende poner en contacto la célula de la línea cancerosa circulante con una composición que t comprende un anticuerpo, o un fragmento o derivado del mismo, que comprende la CDRs del anticuerpo monoclonal TAB-004 y un agente activo, opcionalmente en donde el agente activo comprende un agente terapéutico, opcionalmente un agente quimioterapéutico, una toxina, un agente radioterapéutico o una combinación de los mismos. j
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el agente terapéutico un inmunomodulador, opcionalmente donde el inmunomodulador se selecciona de un grupo que consiste de un inhibidor de indolamina 2 , 3 -dioxigenasa {IDO) opcionalmente, 1-^metil-DL-triptofano (1MT) ,· un antagonista del receptor de EP2/EP4; y un activador de células dendríticas, opcionalmente los oligodeoxinucleótidos de CpG (CpG ODN) . ¡ ! i
18. Un método para pronosticar la recur^encia y/o progresión del cáncer en un sujeto previamente tratado para 1 el cáncer, caracterizado porque comprende: (a) aislar una muestra biológica que comprende las células circulantes provenientes de un sujeto con un cáncer, opcionalmente en donde: (i) la muestra biológica comprende una muestra de I sangre, una muestra de linfa, o una fracción de las I I mismas, y/o i (ii) el cáncer es un cáncer pancreático o unj cáncer de I mama . I I (b) poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo o el fragmento derivado del mismo de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, bajo condiciones suficientes para que el anticuerpo, o el fragmento derivado del mismo de conformidad con la reivindicación 1, se enlace a un epitopo presente sobre un tumor y/o una célula cancerosa, si esta presente, en la muestra biológica; y (c) identificar en la muestra biológica una o más células circulantes que se enlazan al anticuerpo, o el fragmento derivado del mismo de conformidad con I la reivindicación 1 o la reivindicación 2, con lo cual se pronostica la recurrencia o la progresión de un cáncer en el sujeto.
19 Una molécula aislada de ácido caracterizada porque comprende cualquiera de las Nos: 4 y 6, o que codifica para cualquiera de Nos . : 5 y 7-13. !
20. La molécula aislada de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la molécula aislada de ácido nucleico está presente dentro de un expresión dentro de un hospedero apropiado, un anticuerpo j recombinante intacto que comprende una o más de la SEQ ID Nos.: 5 y 7-13, o un fragmento derivado del mismo, es expresado por la célula hospedera.
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