MX2012011910A - Compuestos de triazol como inhibidores de ksp. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona compuestos de triazol de la fórmula I: como se describen adicionalmente en la presente. La invención también proporciona una composición farmacéutica, la cual comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula I, y un método para el tratamiento de un trastorno mediado, cuando menos en parte, por la proteína de huso de cinesina (KSP) en un paciente mamífero, el cual comprende administrar a un paciente mamífero que necesite dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula I (Ver Formula).

Description

COMPUESTOS DE TRIAZOL COMO INHIBIDORES DE KSP Referencia cruzada a solicitudes relacionadas Esta solicitud reclama el beneficio bajo 35 U.S.C. §119(e) para la solicitud estadounidense provisional serial no. 61/324,651, presentada el 15 de abril de 2010, la cual es incorporada en la presente en su totalidad por referencia.

Campo de la Invención Esta invención se refiere en términos generales a compuestos de triazol y a las sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, o pro-fármacos de los mismos. Esta invención se refiere además a composiciones de estos compuestos junto con vehículos farmacéuticamente aceptables, a los usos de estos compuestos, a su preparación, y a intermediarios relacionados.

Antecedentes Las cinesinas son proteínas motoras que utilizan el trifosfato de adenosina para enlazarse con los microtúbulos y generar fuerza mecánica. Las cinesinas se caracterizan por un dominio motor que tiene aproximadamente 350 residuos de aminoácidos. Se han resuelto las estructuras de cristal de varios dominios motores de cinesina.

Actualmente, se han identificado aproximadamente cien proteínas relacionadas con cinesina (KRP). Las cinesinas están involucradas en una variedad de procesos biológicos celulares incluyendo el transporte de organelos y vesículas, y en el mantenimiento del retículo endoplásmico. Varias proteínas relacionadas con cinesina interactúan con los microtúbulos del huso mitótico o con los cromosomas directamente y parecen tener un papel pivotal durante las etapas mitóticas del ciclo celular. Estas proteínas relacionadas con cinesina mitóticas son de un interés particular para el desarrollo de la terapéutica del cáncer.

La proteína de huso de cinesina (KSP) (también conocida como Eg5, HsEg5, KNSL1, o KIF11) es una de diferentes proteínas motoras de tipo cinesina que se localizan en el huso mitótico y se sabe que son requeridas para la formación y/o función del huso mitótico bipolar.

En 1995, se demostró que el consumo de la proteína de huso de cinesina utilizando un anticuerpo dirigido contra el término C de la proteína de huso de cinesina detiene las células HeLa en la mitosis con los arreglos de microtúbulos monoastrales (Blangy y colaboradores, Cell 83: 1159-1169, 1995). Las mutaciones en los genes bimC y cut7, los cuales se consideran como homólogos de la proteína de huso de cinesina, provocan una falla en la separación del centrosoma en Aspergillus nidulans (Enos, A.P., y N.R. Morris, Cell 60: 1019-1027, 1990) y en Schizosaccharomyces pombe (Hagan, I., y M. Yanagida, Nature 347: 563-566, 1990). El tratamiento de células con ATRA (ácido retinoico todo trans), el cual reduce la expresión de la proteína de huso de cinesina al nivel de la proteína, o el consumo de la proteína de huso de clneslna, utilizando oligonucleótidos anti-sentido, reveló una inhibición del crecimiento significativa en las células de carcinoma pancreático DAN-G, indicando que la proteína de huso de cinesina podría estar involucrada en la acción anti-proliferativa del ácido retinoico todo trans (Kaiser, A. y colaboradores, J. Biol. Chem. 274, 18925-18931, 1999). Es interesante que se demostró que la cinasa de proteína relacionada con Aurora de Xenopus laevis pEg2 se asocia con, y fosforila, XIEg5 (Giet, R. y colaboradores, J. Biol. Chem. 274: 15005-15013, 1999). Los sustratos potenciales de las cinasas relacionadas con Aurora son de un interés particular para el desarrollo de fármacos para el cáncer. Por ejemplo, las cinasas Aurora 1 y 2 se sobre-expresan al nivel de la proteína y del RNA, y los genes se amplifican en los pacientes de cáncer de colon.

Se demostró que el primer inhibidor de moléculas pequeñas permeables a células para la proteína de huso de cinesina, "monastrol", detiene las células con husos monopolares sin afectar la polimerización de los microtúbulos, como lo hacen los productos quimioterapéuticos convencionales, tales como los taxanos y los alcaloides vinca (Mayer, T.U. y colaboradores, Science 286: 971-974, 1999). Se identificó el monastrol como un inhibidor en los rastreos basados en el fenotipo, y se sugirió que este compuesto puede servir como una guía para el desarrollo de los fármacos contra el cáncer. Se determinó que la inhibición no es competitiva con respecto al trifosfato de adenosina, y que es rápidamente reversible (DeBonis, S. y colaboradores, Biochemistry, 42: 338-349, 2003; Kapoor, T.M. y colaboradores, J. Cell Biol., 150: 975-988, 2000).

A la luz de la importancia de tener mejores productos quimioterapéuticos, existe una necesidad de inhibidores de la proteína de huso de cinesina que sean inhibidores in vivo efectivos de la proteína de huso de cinesina y de las proteínas relacionadas con la proteína de huso de cinesina.

Breve Descripción de la Invención En una modalidad, esta invención se refiere a compuestos de triazol sustituido y a las sales farmacéuticamente aceptables, ésteres, o pro-fármacos de los mismos, a su preparación, a composiciones farmacéuticas, y a los usos para el tratamiento de las enfermedades mediadas por la proteína de huso de cinesina (KSP), en donde los compuestos están representados por la fórmula general: en donde: R1 se puede seleccionar a partir de alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono, y -cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono; R2 se selecciona a partir de H, y alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono; R3 representa -pirrolidinilo sustituido por (CH2)0.3 o insustituido o un alquilo de 3 a 5 átomos de carbono opcionalmente sustituido; R4 se selecciona a partir de -C(0)-CH2OH, -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH(CH3)-OH, -C(0)-morfolinilo insustituido, y -C(0)-morfolinilo sustituido con hasta tres grupos alquilo; R5 se selecciona a partir de bencilo sustituido o insustituido, en donde los sustituyentes se seleccionan a partir de Cl, F, Br, y I; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta tres átomos de halógeno.

En ciertas modalidades de estos los compuestos de la fórmula I: R1 se selecciona a partir de alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono, y -cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono; R2 se selecciona a partir de H, y alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono; R3 representa -pirrolidinilo sustituido por (CH2)0-3 o insustituido; R4 se selecciona a partir de -C(0)-CH2OH, -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH(CH3)-OH, -C(0)-morfolinilo ¡nsustituido, y -C(0)-morfol¡nilo sustituido con hasta tres grupos alquilo; R5 se selecciona a partir de bencilo sustituido o ¡nsustituido, en donde los sustituyentes se seleccionan a partir de Cl, F, Br, y I; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta tres átomos de halógeno.

En otras modalidades, R es alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, tal como alquilo de 1 a 4 átomos de carbono sustituido por metoxilo y 2-metoxi-2-propilo.

La invención también proporciona métodos para la elaboración y para el uso de estos compuestos, y de composiciones farmacéuticas que contienen estos compuestos, como se describe adicionalmente en la presente.

Descripción Detallada de la Invención A. Modalidades de la Invención Los compuestos de la invención incluyen aquéllos de la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable, éster, o pro-fármaco de los mismos: en donde: R1 se selecciona a partir de alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono, y cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono; R2 se selecciona a partir de H, y alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono; R3 representa -pirrolidinilo sustituido por (CH2)o-3 o insustituido, tal como -CH2-pirrolidinilo; R4 se selecciona a partir de -C(0)-CH2OH, -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH(CH3)-OH, -C(0)-morfolinilo insustituido, y -C(O)-morfolinilo sustituido con hasta tres grupos alquilo; R5 se selecciona a partir de bencilo sustituido o insustituido, en donde los sustituyentes se seleccionan a partir de Cl, F, Br, y I; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta tres átomos de halógeno.

En los compuestos de la fórmula I, R1 es con frecuencia un alquilo de cadena ramificada o un alcoxi-alquilo, y R2 es con frecuencia H. En una modalidad preferida, el compuesto de la fórmula I puede ser este isómero: En estos compuestos, R5 es con frecuencia bencilo que está opcionalmente sustituido con hasta 3 átomos de halógeno sobre el anillo de fenilo del grupo bencilo. R5 puede estar insustituido; cuando está sustituido, está con frecuencia sustituido con uno o dos átomos de flúor.

R6 es típicamente un anillo de fenilo opcionalmente sustituido; en algunas modalidades, es fenilo sustituido por 1 a 2 grupos halógeno. En las modalidades preferidas, R6 es fluoro-fenilo o difluoro-fenilo, en particular 2,5-difluoro-fenilo.

En ciertas modalidades de estos los compuestos de la fórmula i, R1 se selecciona a partir de alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono, y -cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono.

Una modalidad especifica de la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula I, en donde: R1 se selecciona a partir de alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, de preferencia metoxi-alquilo sustituido de 1 a 4 átomos de carbono; R2 representa H; R3 representa -pirrolidinilo sustituido por (CH2)i-3¡ R4 se selecciona a partir de -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(O)- CH(CH3)-OH, -C(0)-morfolinilo sustituido con hasta tres grupos alquilo; R5 representa bencilo, o bencilo sustituido con hasta dos átomos de flúor; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta dos átomos de halógeno.

Una modalidad preferida adicional de la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula I, en donde: R1 se selecciona a partir de alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono; R2 representa H; R3 representa -pirrolidinilo sustituido por (CH2)i.3; R4 se selecciona a partir de -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(O)-CH(CH3)-OH, -C(0)-morfolinilo sustituido con hasta tres grupos alquilo; R5 representa bencilo, o bencilo sustituido con hasta dos átomos de flúor; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta dos átomos de halógeno.

Una modalidad preferida adicional de la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula I, en donde: R1 representa terbutilo; R3 representa -(CH2)-fluoro-pirrolidinilo; R4 se selecciona a partir de -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(O)-CH(CH3)-OH, -C(0)-2,6-dimetil-morfolinilo; R5 representa bencilo, o bencilo sustituido con un átomo de flúor; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta dos átomos de flúor.

Una modalidad preferida adicional de la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula I, en donde: R representa metoxi-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; R3 representa -(CH2)-fluoro-pirrolidinilo; R4 se selecciona a partir de -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(O)-CH(CH3)-OH, -C(0)-2,6-dimetil-morfolinilo; R5 representa bencilo, o bencilo sustituido con un átomo de flúor; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta dos átomos de flúor.

Otra modalidad preferida proporciona un compuesto de la fórmula I, en donde: R3 representa -(CH2)i-3-fluoro-pirrolidinilo; y R4 representa -C(0)-2-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH(CH3)-OH, -C(0)-2,6-dimetil-morfolinilo. En las modalidades particularmente preferidas, R4 se selecciona a partir de: Estos grupos R4 pueden ser racémicos u ópticamente activos; en las modalidades preferidas, R4 es un grupo ópticamente activo que tiene la estereoquímica absoluta ilustrada en la presente. Típicamente, es un enantiomero y está sustancialmente libre de su enantiomero opuesto, es decir, el grupo R4 tiene un exceso enantiomérico de cuando menos el 90 por ciento y con frecuencia de cuando menos el 95 por ciento.

Todavía otra modalidad preferida de la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula I, en donde: R3 representa un grupo ((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metilo: R4 se selecciona a partir de -C(0)-CH(CH3)-OH, y En las modalidades particularmente preferidas, R4 se selecciona a partir de: Una modalidad preferida adicional de la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula I, en donde: R5 representa: En otra modalidad, la invención proporciona los compuestos de la fórmula II: en donde: R1 se puede seleccionar a partir de alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono, y -cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono; R3 representa -pirrolidinilo sustituido por (CH2)0-3 o insustituido o alquilo de 3 a 5 átomos de carbono sustituido con hasta tres grupos seleccionados a partir de amino y halógeno; R4 se selecciona a partir de -C(0)-CH2OH, -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH(CH3)-OH, -C(0)-morfolinilo insustituido, y -C(O)- morfolinilo sustituido con hasta tres grupos alquilo; R5 se selecciona a partir de bencilo sustituido o insustituido, en donde los sustituyentes se seleccionan a partir de Cl, F, Br, y I (de preferencia F); y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta tres átomos de halógeno, de preferencia F o Cl o ambos.

En los compuestos de la fórmula II, en donde R5 o R6 está sustituido, los sustituyentes preferidos son F y Cl.

En los compuestos de la fórmula II, R1 es con frecuencia un alquilo de cadena ramificada sustituido con un grupo alcoxilo tal como metoxilo, y R2 es con frecuencia H. En una modalidad preferida, el compuesto de la fórmula II puede ser este isómero que tiene la estereoquímica absoluta mostrada: En las modalidades particularmente preferidas compuestos de la fórmula II, R4 se selecciona a partir de: De preferencia, estos grupos son ópticamente activos y tienen la estereoquímica absoluta mostrada.

Todavía otra modalidad preferida de la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula II, en donde R3 representa: ó Estos grupos R3 pueden ser racémicos u ópticamente activos; en las modalidades preferidas, R3 es un grupo ópticamente activo que tiene la estereoquímica absoluta ilustrada en la presente.

Típicamente, es un enantiomero y está sustancialmente libre de su enantiomero opuesto, es decir, el grupo R3 tiene un exceso enantiomérico de cuando menos el 90 por ciento y con frecuencia de cuando menos el 95 por ciento.

En los compuestos de la fórmula II, R5 es con frecuencia bencilo que está opcionalmente sustituido con hasta 3 átomos de halógeno sobre el anillo de fenilo del grupo bencilo. R5 puede estar insustituido; cuando está sustituido, está con frecuencia sustituido con uno o dos átomos de flúor.

En los compuestos de la fórmula II, R6 es típicamente un anillo de fenilo opcionalmente sustituido; en algunas modalidades, es fenilo sustituido por 1 a 2 grupos halógeno. En las modalidades preferidas, R es fluoro-fenilo o difluoro-fenilo, en particular 2,5-difluoro-fenilo. En ciertas modalidades de estos los compuestos de la fórmula II: R1 se selecciona a partir de alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono, y cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono; R3 representa -pirrolidinilo sustituido por (CH2)o-3 tal como un grupo ((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metilo o -CH2-CH2-CH(NH2)- CH2F, el cual es de preferencia ; R4 se selecciona a partir de -C(0)-CH2OH, -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH(CH3)-OH, -C(0)-morfolinilo insustituido, y -C(O)-morfolinilo sustituido con hasta tres grupos alquilo; R5 se selecciona a partir de bencilo sustituido o insustituido, en donde los sustituyentes se seleccionan a partir de Cl, F, Br, y I; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta tres átomos de halógeno.

En ciertas modalidades de los compuestos de la fórmula II, R1 es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono sustituido por metoxilo. En las modalidades preferidas de estos compuestos, R1 es 2-metoxi-2-propilo En los compuestos de la fórmula II, R3 pueden contener un pirrolidinilo sustituido; por ejemplo, puede representar -pirrolidinilo sustituido por (CH2)i-2 tal como un grupo ((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metilo. El pirrolidinilo se puede unir en cualquier posición del anillo, típicamente en un átomo de carbono, y de preferencia en la posición 3 cuando se cuenta el átomo de nitrógeno del anillo como la posición 1. El grupo pirrolidinilo puede estar sustituido con grupos tales como halógeno, alquilo inferior, y alcoxilo inferior. De preferencia, el anillo de pirrolidinilo está sustituido por cuando menos un halógeno sobre un átomo de carbono del anillo, en términos generales F; en adición, está opcionalmente sustituido por alquilo inferior, típicamente Me o Et, y opcionalmente el alquilo inferior está sobre N.

En las modalidades preferidas de cualquiera de los compuestos anteriormente descritos de la fórmula II, R3 representa -CH2-CH2- CH(NH2)-CH2F, tal como o -pirrolidinilo sustituido por (CH2) -2, en donde el grupo -pirrolidinilo sustituido por (CH2)1.2 puede ser, por ejemplo: en donde R" es H, Me, Et, isopropilo, o n-propilo. De preferencia, el grupo pirrolidinilo tiene la configuración estereoquímica absoluta mostrada en la presente , es decir, es u n grupo ((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metilo, en donde R" es H , Me, Et, isopropilo o n-propilo.

En las modalidades preferidas de los compuestos de la fórmula I I , R4 se selecciona a partir de -C(0)-C H(CH3)-OH , En las modalidades particularmente preferidas de estos compuestos, R4 se selecciona a partir de: y en algu nas de estas modalidades, R6 Una modalidad particularmente preferida de la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula I o II seleccionado a partir de: N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2,6-dimetil-morfolin-4-carboxamida; N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2,6-dimetil-morfolin-4-carboxamida; (S)-N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-tetrahidrofuran-2-carboxamida; (S)-N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-benc¡l)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrol¡din-3-il)-metil)-tetrahidrofuran-2-carboxamida; (S)-N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-benc¡l)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2-hidroxi-propanamida; y (S)-N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2-hidroxi-propanamida.

Otra modalidad particularmente preferida de la presente ?? y y las sales farmacéuticamente aceptables de estos compuestos.

Otro aspecto de la presente invención proporciona una composición farmacéutica, la cual comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula I o II, incluyendo cualquiera de las modalidades de estos compuestos que se dan a conocer anteriormente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una modalidad preferida de este aspecto de la invención proporciona una composición que comprende además cuando menos un agente adicional para el tratamiento de cáncer. En una modalidad preferida adicional se proporciona una composición en donde el agente adicional para el tratamiento de cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en irinotecano, topotecano, gemcitabina, imatinib, trastuzumab, 5-fluoro-uracilo, leucovorina, carboplatina, cisplatina, docetaxel, paclitaxel, tezacitabina, ciclofosfamida, alcaloides vinca, antraciclinas, rituximab, y trastuzumab.

Todavía en otro aspecto de la presente invención se proporciona un método para el tratamiento de un trastorno mediado, cuando menos en parte, por la proteína de huso de cinesina (KSP) en un paciente mamífero, el cual comprende administrar a un paciente mamífero que necesite dicho tratamiento, gna cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un compuesto de la fórmula I o II, incluyendo cualquiera de las modalidades de estos compuestos que se dan a conocer anteriormente. Una modalidad preferida proporciona un método para el tratamiento de un trastorno mediado, cuando menos en parte, por la proteína de huso de cinesina (KSP) en un paciente mamífero, el cual comprende administrar a un paciente mamífero que necesite dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un compuesto de cualquiera de las modalidades de los compuestos de la fórmula I o II descritas anteriormente, y cuando menos un agente adicional para el tratamiento de cáncer. Una modalidad preferida de este aspecto de la invención proporciona un método para el tratamiento de un trastorno mediado, cuando menos en parte, por la proteína de huso de cinesina (KSP) en un paciente mamífero, en donde el trastorno es una enfermedad proliferativa celular; de preferencia la enfermedad proliferativa celular es cáncer.

Una modalidad preferida adicional de este aspecto de la invención proporciona un método para el tratamiento de una enfermedad proliferativa celular como se da a conocer anteriormente, en donde la enfermedad proliferativa celular es cáncer seleccionado a partir de un grupo que consiste en cáncer de pulmón y bronquios; próstata; mama; páncreas; colon y recto; tiroides; estómago; hígado y conducto biliar intrahepático; riñon y pelvis renal; vejiga urinaria; cuerpo uterino; cérvix uterino; ovario; mieloma múltiple; esófago; leucemia mielógena aguda; leucemia mielógena crónica; leucemia linfocítica; leucemia mieloide; cerebro; cavidad oral y faringe; laringe; intestino delgado; linfoma no de Hodgkin; melanoma; y adenoma de colon velloso.

Todavía otra modalidad preferida de este aspecto de la invención proporciona un método en donde el agente adicional para el tratamiento de cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en irinotecano, topotecano, gemcitabina, imatinib, trastuzumab, 5-fluoro-uracilo, leucovorina, carboplatina, cisplatina, docetaxel, paclitaxel, tezacitabina, ciclofosfamida, alcaloides vinca, antraciclinas, rituximab, y trastuzumab.

Una modalidad particularmente preferida del presente aspecto proporciona un método para inhibir la proteína de huso de cinesina (KSP) en un paciente mamífero, en donde este método comprende administrar al paciente una cantidad inhibidora de la proteína de huso de cinesina (KSP) efectiva de un compuesto de la fórmula I o II de acuerdo con cualquiera de las modalidades descritas en la presente. En algunas modalidades, el método emplea un compuesto de la fórmula I o II como se describe anteriormente; por ejemplo, un compuesto de la fórmula I, en donde: R1 se selecciona a partir de alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono, y -cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono; R2 se selecciona a partir de H, y alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono; R3 representa -pirrolidinilo sustituido por (CH2)o-3 o insustituido; R4 se selecciona a partir de -C(0)-CH2OH, -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH(CH3)-OH, -C(0)-morfolinilo insustituido, y -C(O)-morfolinilo sustituido con hasta tres grupos alquilo; R5 se selecciona a partir de bencilo sustituido o insustituido, en donde los sustituyentes se seleccionan a partir de Cl, F, Br, y I; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta tres átomos de halógeno.

El paciente para estos métodos es en general un ser humano, y típicamente se ha diagnosticado por necesitar dicho tratamiento antes de iniciar estos métodos.

Otra modalidad preferida proporciona un método, el cual comprende administrar al paciente una cantidad inhibidora de la proteína de huso de cinesina (KSP) efectiva de un compuesto de la fórmula I o II de acuerdo con cualquiera de las modalidades descritas anteriormente. En algunas modalidades, el método utiliza un compuesto de la fórmula I, en donde: R1 se selecciona a partir de alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono; R2 representa H; R3 representa -pirrolidinilo sustituido por (CH2)i.3; R4 se selecciona a partir de -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(O)-CH(CH3)-OH, -C(0)-morfolinilo sustituido con hasta tres grupos alquilo; R5 representa bencilo, o bencilo sustituido con cuando menos dos átomos de flúor; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta dos átomos de halógeno.

Una modalidad particularmente preferida adicional proporciona un método, el cual comprende administrar un compuesto de la fórmula I, en donde: R1 representa terbutilo; R3 representa -(CH2)-fluoro-pirrolidinilo; R4 se selecciona a partir de -C(0)-tetrahidro-furan¡lo, -C(O)-CH(CH3)-OH, -C(0)-2,6-dimetil-morfolinilo; R5 representa bencilo, o bencilo sustituido con un átomo de flúor; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta dos átomos de flúor.

Una modalidad preferida adicional proporciona un método, el cual comprende administrar un compuesto de la fórmula II, en donde: R1 representa 2-metoxi-2-propilo; R3 representa -(CH2)-fluoro-pirrolidinilo o -CH2-CH2-CH(NH2)- CH2F; R4 se selecciona a partir de -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(O)-CH(CH3)-OH, -C(0)-2,6-d¡metil-morfolinilo; R5 representa bencilo, o bencilo sustituido con un átomo de flúor; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustitu ido con hasta dos átomos de flúor.

Todavía otra modalidad particu larmente preferida proporciona un método para administrar un compuesto de la fórmula I o I I con el fin de tratar condiciones tales como cáncer. El método puede utilizar un compuesto de acuerdo con cualquiera de las modalidades anteriormente descritas , incluyendo u n compuesto de la fórmula I o I I , en donde: R3 representa : R4 se selecciona a partir de -C(0)-C H(CH3)-OH , R5 representa : Una modalidad específicamente preferida de los métodos para el tratamiento descrito anteriormente, proporciona un método para inhibir la proteína de huso de cinesina (KSP) en un paciente mamífero, en donde este método comprende administrar al paciente, una cantidad inhibidora de la proteína de huso de cinesina (KSP) efectiva de un compuesto de la fórmula I seleccionado a partir de: N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2,6-dimetil-morfolin-4-carboxamida; N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2,6-dimetil-morfolin-4-carboxamida; (S)-N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-tetrahidrofuran-2-carboxamida; (S)-N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1,2,4- triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-tetrahidrofuran-2-carboxamida; (S)-N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2-hidroxi-propanamida; y (S)-N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-d¡fluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2-hidroxi-propanamida.

Otra modalidad específicamente preferida proporciona un método para inhibir la proteína de huso de cinesina (KSP) en un paciente mamífero, en donde este método comprende administrar al paciente, una cantidad inhibidora de la proteína de huso de cinesina (KSP) efectiva de un compuesto de la fórmula I o II seleccionado a partir de: ?? o u na sal farmacéuticamente aceptable de uno de estos compuestos.

En otro aspecto, la invención proporciona u n método para hacer ciertos compuestos de la fórmula I o I I y los intermediarios clave para su síntesis. El esquema 2 de la presente ilustra uno de estos métodos, para la elaboración de u na fracción preferida del anillo de pirrolidina para los compuestos tales como aquéllos ilustrados anteriormente. El método sintético para la elaboración de esta pirrolidina fluorada comprende la fluoración de u na pirrolidina trans-3,4-d isustituida de la fórmu la V para proporcionar un compuesto de vin il-pirrolidina cis-fluorada de la fórmu la VI , y la oxidación de la olefina del compuesto de la fórmula VI para proporcionar un aldeh ido de la fórmula VI I , como se muestra en seguida : V VI VII Estas transformaciones se pueden hacer en compuestos racémicos, o con compuestos ópticamente activos; en algunas modalidades, el compuesto de la fórmula V o VI o VII es ópticamente activo y tiene la estereoquímica absoluta mostrada en la presente, con un exceso enantiomérico de cuando menos el 90 por ciento. En los compuestos de las fórmulas V a VII, R es H o un alquilo de 1 a 6 átomos de carbono opcionalmente sustituido, o arilo, y PG representa un grupo protector adecuado para utilizarse sobre un átomo de nitrógeno alifático. En algunas modalidades, R es H, y el compuesto de la fórmula V se puede preparar a partir de un epóxido de una 3-pirrolina protegida (véase el compuesto 2.3 en el esquema 2) mediante la reacción del epóxido con un reactivo de Grignard, por ejemplo. El grupo trans-hidroxilo de la fórmula V se puede convertir en el grupo cis-flúor en la fórmula VI utilizando cualquier reactivo adecuado que proporcione un intercambio SN2 para lograr la inversión del centro quiral. En algunas modalidades, esto se lleva a cabo utilizando una fuente de fluoruro en un solvente inerte, y un reactivo que active el hidroxilo para convertirlo en un grupo saliente adecuado. Por ejemplo, se puede utilizar una sal de fluoruro, tal como trihidrofluoruro de trialquil-amina (por ejemplo, Et3N-trihidrofluoruro) o HF-piridina, en un solvente adecuado inerte para las condiciones de reacción, junto con un fluoruro de alquilo o de aril-sulfonilo, tal como fluoruro de perfluoro-alquilo de 1 a 6 átomos de carbono-sulfonilo, para convertir el hidroxilo hasta F con inversión estereoquímica.

El grupo vinilogoso de los compuestos de la fórmula VI se puede oxidar hasta u n aldeh ido empleando diferentes métodos convencionales , tales como el tratamiento con tetróxido de osmio y metaperyodato de sod io, o utiliza ndo ozono , para proporcionar el compuesto de la fórmu la VI I . Los métodos pa ra esta transformación son conocidos en la materia.

El compuesto de la fórmula VI I se puede incorporar entonces en un compuesto de la fórmula I mediante diferentes métodos, incluyendo una reacción de aminación reductiva , como se describe en la presente; o d iferentes reacciones de adición nucleofílica conocida en la materia para utilizarse con estos aldeh idos y g rupos de carbono nucleofílicos adecuados para el compuesto objetivo deseado. En u na modalidad , el compuesto de la fórmu la VI I se une por medio de aminación reductiva a un compuesto de la fórmula la como se muestra en el esquema 3, para proporcionar un compuesto de la fórmula I b, como se ilustra más adelante. El compuesto de la fórmula la en donde R3 es H opcionalmente se protege si incluye un grupo tal como una amina o h idroxilo libre que requiera de protección .

Los g rupos protectores adecuados ( PG) para utiliza rse en estas reacciones e intermediarios incluyen amidas (por ejemplo, formamida, acetamida , tricloro-acetamida) , y carbamatos (por ejemplo, carbamato de metilo, etilo, tricloro-etilo, terbutilo, o bencilo) . Las amidas y carbamatos son de la fórmula general -C(O)-L-A, en donde L es u n enlace (para las amidas) u -O- (para los carbamatos) , y A es un alquilo opcionalmente sustituido (de preferencia de 1 a 6 átomos de carbono) o arilo (de preferencia fenilo) ; o A puede ser H cuando L es u n enlace.

En algu nas modalidades , este método comprende además la aminación reductiva del compuesto de la fórmula VI I con un compuesto de la fórmu la la : en donde: R se selecciona a partir de alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de ca rbono, alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono , alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono , y -cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono; R2 se selecciona a partir de H , y alq uilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono; R5 se selecciona a partir de bencilo sustituido o insustituido, en donde los sustituyentes se seleccionan a partir de Cl , F , Br, y I ; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta tres átomos de halógeno; para proporcionar u n compuesto de la fórmula Ib: (Ib).

En algunas modalidades, cualquiera de los métodos de síntesis anteriores además comprende sintetizar el compuesto de la fórmula V a partir de un epóxido de la fórmula IV: mediante la abertura del epóxido con un reactivo organometálico de la fórmula: en donde R es H o un grupo alquilo o arilo opcionalmente sustituido, y M es un grupo metálico seleccionado a partir de Li, MgX, y ZnX, en donde X es un halógeno, para proporcionar el compuesto de la fórmula V. Para este paso, un reactivo organometálico preferido es: en donde X es Cl, Br o I.

La invención, por consiguiente, proporciona intermediarios novedosos de las fórmulas VI y VII, como se describen anteriormente, así como métodos para utilizar estos intermediarios para la elaboración de los compuestos de la fórmula I o Ib.

Los compuestos utilizados en, y producidos mediante, estos métodos, pueden ser racémicos, o cualquiera de los compuestos que tenga cuando menos un centro quiral se puede separar en los enantiómeros individuales o en los diaestereómeros individuales, como sea apropiado. En la presente invención, algunas veces es preferible separar los dos enantiómeros del compuesto de la fórmula V o VI con el objeto de utilizar un solo enantiómero para la elaboración de los compuestos de la fórmula I o Ib. En algunas modalidades, el compuesto de la fórmula V o VI se hace en una forma racémica, y entonces se separa mediante cromatografía quiral u otro medio convencional, para proporcionar un compuesto ópticamente activo, de preferencia esencialmente libre de su enantiómero. En una modalidad preferida, el compuesto de la fórmula V o VI es ópticamente activo y es de la estereoquímica absoluta específica ilustrada en la presente. En algunas de estas modalidades, está esencialmente libre del enantiómero opuesto.

Compuestos Representativos de la Invención Los compuestos específicos dentro del alcance de esta invención están ejemplificados en la Tabla 1, en la sección Experimental.

B. Definiciones y panorama Como se discute anteriormente, la presente invención se refiere en parte a nuevos compuestos de triazol sustituido.

Se debe entender que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir las modalidades particulares solamente y no pretende limitar el alcance de la presente invención. Se debe observar que, como se utiliza en la presente, y en las reivindicaciones, las formas en singular "un", "una" y "el", "ella" incluyen los referentes en plural a menos que el contexto lo dicte claramente de otra manera. En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a un número de términos que se definirán por tener los siguientes significados: Como se utiliza en la presente, "alquilo" o "alquilo de cadena recta" se refiere a los grupos hidrocarbilo alifáticos saturados monovalentes que tienen de 1 a 6 átomos de carbono, y de una manera muy preferible, de 1 a 3 átomos de carbono. Este término es ejemplificado por grupos tales como metilo, etilo, propilo normal, pentilo normal, y similares.

El término "alquilo de cadena ramificada", como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo alquilo monovalente saturado de cadena ramificada que tiene de 3 a 6 átomos de carbono. Este término es ejemplificado por grupos tales como isobutilo, isopropilo, terbutilo, y similares.

"Cicloalquilo" se refiere a un grupo alquilo que tiene de 3 a 6 átomos de carbono, y en donde tres o más átomos de carbono se conectan unos con otros para formar una estructura cíclica. Los ejemplos ilustrativos incluyen los grupos ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, y ciclohexilo.

"Alcoxi-alquilo", como se utiliza en la presente, se refiere a un grupo alquilo que está sustituido con cuando menos un grupo alcoxilo. Si no se describe de otra manera, el grupo alcoxi-alquilo comprende hasta 10 átomos de carbono en el grupo alcoxilo, y hasta 10 átomos de carbono en el grupo alquilo. Éste se une a la molécula base a través del grupo alquilo. En algunas instancias, estos grupos se describen de acuerdo con el número de átomos de carbono en el grupo alcoxilo y/o en el grupo alquilo, tal como, por ejemplo alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, el cual se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 4 átomos de carbono que está sustituido con un grupo alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono. Los grupos alcoxi-alquilo adecuados incluyen metoxi-metilo; metoxi-etilo; etoxi-metilo; etoxi-etilo; metoxi-propilo; y metoxi-isopropilo (2-metoxi-2-propilo).

"Halo" o "halógeno" se refiere a flúor, cloro, bromo y/o yodo y de preferencia es flúor o cloro.

"Actividad biológica", como se utiliza en la presente, se refiere a una concentración inhibidora cuando se prueba en cuando menos uno de los ensayos ilustrados en cualquiera de los Ejemplos 12 a 14, y como se define en cuando menos un ejemplo de los mismos.

Como se utiliza en la presente, el término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a las sales de metales alcalinotérreos o de ácido no tóxicas de los compuestos de la fórmula (I) o (II). Estas sales se pueden preparar in situ durante el aislamiento y purificación final de los compuestos de la fórmula (I) y (II) o mediante la reacción por separado de las funciones de base o del ácido con un ácido o base orgánicos o inorgánicos adecuados, respectivamente. Las sales representativas incluyen, pero no se limitan a, las siguientes: acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencen-sulfonato, bisulfato, butirato, canforato, canfor-sulfonato, digluconato, ciclopentan-propionato, dodecil-sulfato, etan-sulfonato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemi-sulfato, heptanoato, hexanoato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxi-etan-sulfonato, lactato, maleato, metan-sulfonato, nicotinato, 2-naftalen-sulfonato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenil-propionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p-toluen-sulfonato, y undecanoato. También, los grupos que contienen nitrógeno básico se pueden cuaternizar con agentes tales como haluros de alquilo, tal como cloruros, bromuros, y yoduros de metilo, etilo, propilo, y butilo; sulfatos de dialquilo como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo, y diamilo, haluros de cadena larga, tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo, haluros de aralquiío como bromuros de bencilo y fenetilo, y otros. De esta manera, se obtienen productos solubles o dispersables en agua o en aceite.

Los ejemplos de los ácidos que se pueden emplear para formar las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables incluyen los ácidos inorgánicos como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido fosfórico, y los ácidos orgánicos como ácido oxálico, ácido maleico, ácido metan-sulfónico, ácido succínico y ácido cítrico. Las sales de adición básicas se pueden preparar in situ durante el aislamiento y la purificación finales de los compuestos de las fórmulas (I) o (II), o por separado mediante la reacción de las fracciones de ácido carboxílico con una base adecuada, tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión de metal farmacéuticamente aceptable, o con amoníaco, o con una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, cationes basados en los metales alcalinos y alcalinotérreos, tales como las sales de sodio, litio, potasio, calcio, magnesio, aluminio y similares, así como los cationes de amonio, de amonio cuaternario, y de amina, incluyendo, pero no limitándose a, amonio, tetrametil-amonio, tetraetil-amonio, metil-amina, dimetil-amina, trimetil-amina, trietil-amina, etil-amina, y similares. Otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de base incluyen dietil-amina, etilen-diamina, etanolamina, dietanolamina, piperazina y similares.

Como se utiliza en la presente, el término "éster farmacéuticamente aceptable" se refiere a ésteres que se hid rolizan in vivo e incluyen aquéllos que se descomponen en el cuerpo humano para dejar el compuesto progen itor, una sal del mismo, o u n metabolito farmacéuticamente activo. Los g rupos de éster adecuados incluyen , por ejemplo, aquéllos derivados a parti r de los ácidos carboxílicos alifáticos farmacéuticamente aceptables, en particular los ácidos alcanoicos , alq uenoicos, cicloalcanoicos, y alcanodioicos, en donde cada fracción de alq u ilo o alq uenilo conven ientemente no tiene más de 6 átomos de ca rbono . Los ejemplos representativos de los ésteres particu lares incluyen , pero no se limitan a , formatos, acetatos, propionatos, butiratos, acrilatos y etil-succinatos .

El término "pro-fá rmaco farmacéuticamente aceptable", como se utiliza en la presente , se refiere a los pro-fármacos de los compuestos de la presente invención que , dentro del alcance de u n buen juicio médico, son adecuados para utilizarse en contacto con los tejidos de los seres humanos y de los animales inferiores sin una indebida toxicidad , irritación , respuesta alérgica , y simila res , de una forma conmensurada con una proporción razonable de beneficio/riesgo, y son efectivos para su uso pretendido , así como las formas zwiteriónicas, donde sea posible, de los compuestos de la invención . El término "pro-fá rmaco" se refiere a los compuestos que se transforman rápidamente in vivo para proporcionar el compuesto progenitor o un metabolito farmacéuticamente activo de la fórmula anterior, por ejemplo mediante la h idrólisis en la sangre. Se proporciona u na discusión en T. Higuchi y V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Volumen 14 de la A.C.S. Symposium Series, y en Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987, ambos de los cuales se incorporan a la presente como referencia.

Como se utilizan en la presente "agentes contra el cáncer" o "agente para el tratamiento de cáncer" se refieren a los agentes que incluyen, a manera de ejemplo solamente, los agentes que inducen apoptosis; polinucleótidos (por ejemplo, ribozimas); polipéptidos (por ejemplo, enzimas); fármacos; miméticos biológicos; alcaloides; agentes alquilantes; antibióticos anti-tumorales; anti-metabolitos; hormonas; compuestos de platino; anticuerpos monoclonales conjugados con fármacos contra el cáncer, toxinas, y/o radionúclidos; modificadores de la respuesta biológica (por ejemplo, interferones e interleucinas, etc.); agentes de inmunoterapia adoptiva; factores de crecimiento hematopoyético; agentes que inducen la diferenciación de las células tumorales (por ejemplo, ácido retinoico todo trans, etc.); reactivos de terapia genética; reactivos y nucleótidos para terapia anti-sentido; vacunas tumorales; inhibidores de angiogénesis, y similares. Otros numerosos agentes están bien dentro del alcance de un experto en este campo Se entiende que, en todos los grupos sustituidos definidos anteriormente, no se pretende que se incluyan en la presente los polímeros a los que se llega mediante la definición de los sustituyentes con sustituyentes adicionales a ellos mismos. En tales casos, el número máximo de estos sustituyentes es de tres. Por ejemplo, las sustituciones en serie de los grupos arilo sustituidos con otros dos grupos arilo sustituidos están limitadas a -arilo sustituido-(arilo sustituido)-arilo sustituido.

De una manera similar, se entiende que las definiciones anteriores no pretenden incluir patrones de sustitución no permisibles (por ejemplo, metilo sustituido con 5 grupos flúor, o un grupo hidroxilo alfa para la insaturación etilénica o acetilénica). Estos patrones de sustitución no permisibles son bien conocidos por el experto.

Los compuestos de esta invención pueden exhibir estereoisomerismo en virtud de la presencia de uno o más centros asimétricos o quirales en los compuestos. La presente invención contempla cada uno de los diferentes estereoisómeros y mezclas de los mismos. Algunos de los compuestos de la invención comprenden átomos de carbono asimétricamente sustituidos. Estos átomos de carbono asimétricamente sustituidos pueden dar como resultado los compuestos de la invención que comprenden las mezclas de estereoisómeros en un átomo de carbono asimétricamente sustituido particular, o un solo estereoisómero. Como un resultado, en la presente invención se incluyen las mezclas racémicas, las mezclas de diaestereómeros, los enantiómeros individuales, así como los diaestereómeros individuales de los compuestos de la invención. Los términos configuraciones "S" y "R", como se utilizan en la presente, son como se definen en IUPAC 1974 "RECOMMENDATIONS FOR SECTION E, FUNDAMENTAL STEREO-CHEMISTRY," Puré Appl. Chem. 45: 13-30, 1 976. Se pueden obtener los enantiómeros deseados mediante síntesis qu iral a partir de los materiales de partida quirales comercialmente disponibles, mediante los métodos bien conocidos en la materia , o se pueden obtener a partir de las mezclas de los enantiómeros, med iante la separación del ena ntiómero deseado, empleando las técnicas conocidas .

Los compuestos de esta invención también pueden exhibir isomerismo geométrico . Los isómeros geométricos incluyen las formas cis y trans de los compuestos de la invención que tienen fracciones de alquen ilo o alquenilenilo. La presente invención comprende los isómeros geométricos y estereoisomeros i nd ividuales, y mezclas de los mismos.

C. Preparación de los Compuestos Los compuestos de esta invención se pueden prepa rar a partir de los materiales de partida fácilmente dispon ibles, empleando los siguientes métodos y procedimientos generales . A menos que se indique de otra manera , los materiales de partida están comercialmente dispon ibles y son bien conocidos en la materia . Se apreciará que , cuando se den condiciones del proceso típicas o preferidas (es decir, temperatu ras de reacción, tiempos, proporciones molares de reactivos, solventes , presiones) , también se pueden emplear otras condiciones del proceso, a menos que se informe de otra manera . Las condiciones de reacción óptimas pueden variar con los reactivos o solventes particu lares utilizados, pero estas condiciones pueden ser determinadas por un experto en la materia mediante procedimientos de optimización de rutina.

Adicionalmente, como será evidente para los expertos en este campo, pueden ser necesarios los grupos protectores convencionales para impedir que ciertos grupos funcionales sufran reacciones indeseadas. Los grupos protectores adecuados para diferentes grupos funcionales, así como las condiciones adecuadas para proteger y desproteger los grupos funcionales particulares, son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, se describen numerosos grupos protectores en T. W. Greene y P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Segunda Edición, Wiley, Nueva York, 1991, y las referencias citadas en el mismo.

Adicionalmente, los compuestos de esta invención pueden contener uno o más centros quirales. De conformidad con lo anterior, si se desea, estos compuestos se pueden preparar o aislar como los estereoisómeros puros, es decir, como los enantiómeros o diaestereómeros individuales, o como mezclas enriquecidas en estereoisómeros. Todos estos estereoisómeros (y mezclas enriquecidas) se incluyen dentro del alcance de esta invención, a menos que se indique de otra manera. Los estereoisómeros puros (o mezclas enriquecidas) se pueden preparar utilizando, por ejemplo, materiales de partida ópticamente activos o reactivos estereoselectivos bien conocidos en este campo. De una manera alternativa, las mezclas racémicas de estos compuestos se pueden separar utilizando, por ejemplo, cromatografía en columna quiral, agentes de resolución quirales, y similares.

Los compuestos de la invención se pueden preparar mediante métodos conocidos en la técnica, y como se describen adicionalmente en la presente. Por ejemplo, los métodos para la elaboración de los compuestos de la fórmula (I) se describen en Solicitud del TCP Publicada Número PCT/US2007/084154 (WO 2008/063912). Los ejemplos de los métodos de síntesis adicionales aplicables a la preparación de los compuestos de la fórmula (I) se proporcionan en la presente.

Un ejemplo de la preparación de ciertos inhibidores de la proteína de huso de cinesina (KSP) de la fórmula I se muestra en seguida en el esquema 1.

Esquema 1 La butil-glicina 1.1 se trata con cloro-formato de etilo para formar un anhídrido mixto 1.2. El benzonitrilo 1.3 se trata con sulfuro de amonio para formar la tioamida 1.4, la cual se trata entonces con hidrazina para formar la hidrazida de la fórmula 1.5. La hidrazida 1.5 reacciona con el 1.2 y trietil-amina, para dar el carbamato 1.6. El carbamato 1.6 entonces se pone a reflujo con acetato de amonio (NH4OAc) en xileno para dar el triazol 1.7. La reacción del 1.7 con un bromuro de bencilo fluorado (bromuro de (2-fluoro-fenil)-metilo o bromuro de (3-fluoro-fenil)-metilo), y Cs2C03 en N,N-dimetil-formamida proporciona el 1.8 con su regioisómero (separado mediante cromatografía en columna). El tratamiento del 1.8 con ácido trifluoro-acético proporciona la sal de ácido trifluoro-acético del 1.8, la cual entonces se puede convertir hasta su base libre cuando se titula con una solución de NaOH / metanol. La formación del 1.8 a partir del 1.1 y el 1.3 procede con un alto rendimiento y una alta pureza (>97 por ciento determinada mediante HPLC), y una alta pureza óptica (>99 por ciento de exceso enantiomérico (e.e.)) en preparaciones similares utilizando bromuro de bencilo en lugar de un bromuro de bencilo fluorado.

Esquema 2.1 2.2 2.3 2.4 El compuesto 1.9 se puede hacer reaccionar con el aldehido 2.7 bajo condiciones de aminación reductiva para dar la amina secundaria 3.1, la cual entonces se puede acilar para proporcionar ios compuestos de la fórmula (I). El esquema 2 ilustra la preparación del aldehido 2.7 que se puede utilizar en el paso de aminación reductiva para preparar los compuestos de la fórmula I, en particular los compuestos de la fórmula la. La amina cíclica 2.1 se protege con el grupo Cbz para dar el compuesto 2.2. El epóxido 2.3 se obtiene a partir de la epoxidación con MCPBA del compuesto 2.2. El epóxido da la mezcla racémica del alcohol 2.4 mediante la reacción de bromuro de vinil-magnesio y bromuro de cobre. El alcohol 2.5 como un solo enantiómero se obtiene mediante cromatografía en columna quiral. El alcohol 2.5 se somete a una condición de fluoración para dar la vinil-fluoro-pirrolidina 2.6. La vinil-fluoro-pirrolidina 2.6 se somete a la subsiguiente dihidroxilación / disociación oxidativa, para dar el aldehido 2.7.

Esquema 3 Después de la unión de la fracción de fluoro-pirrolidina, se 5 emplean agentes acilantes y condiciones conocidas para acilar la amina acíclica, para proporcionar los compuestos de la fórmula (I), después de lo cual, se desprotege un grupo protector sobre el nitrógeno del anillo de pirrolidina y/o un grupo protector de la fracción acilante. El esquema 3 ilustra la aminación reductiva para Q proporcionar la amina secundaria 3.1. La acilación de la amina 3.1 seguida por la desprotección del grupo Cbz y la remoción de un grupo protector sobre el grupo hidroxilo libre proporciona el compuesto 3.4. Los grupos protectores adecuados para el nitrógeno del anillo de pirrolidina son, por ejemplo, los carbamatos de bencilo, 5 que se pueden remover mediante hidrogenólisis, y los carbamatos de terbutilo que se pueden remover selectivamente con reactivos tales como yoduro de trimetil-sililo o ácido.

Esquema 4 El esquema 4 representa la descripción general para la formación de urea a partir de la amina secundaria 3.1. La amina secundaria 3.1 reacciona con fosgeno o trifosgeno para dar el compuesto de cloro 4.1, el cual reacciona directamente con la amina, para dar los compuestos de urea de la fórmula (I), después de lo cual, se desprotege un grupo protector sobre el nitrógeno del anillo de pirrolidina. El esquema 4 ilustra la cloro-carbonilación de la amina secundaria 3.1, para dar el compuesto 4.1, el cual reacciona inmediatamente con la morfolina, seguida por la remoción del grupo Cbz, para dar el compuesto 4.2.

Observe que la estereoquímica absoluta de los centros quirales en esta molécula se identifica basándose en la quiralidad de los materiales de partida o intermediarios conocidos. Los datos de HPLC y NMR apoyan la conclusión de que el proceso anterior proporciona el compuesto como un solo isómero.

Los agentes y ácidos acilantes adecuados para el paso de acilación incluyen haluros, anhídridos, y ácidos de acilo que tengan las estructuras apropiadas (véase la fórmula I). Las condiciones de acoplamiento de amida adecuadas incluyen el uso de una variedad de reactivos de acoplamiento de amida para formar el enlace de amida, tales como las carbodiimidas de N-N'-diciclohexil-carbodiimida (DCC), N-N'-di-isopropil-carbodiimida (DIPCDI), y 1-etil-3-(3'-dimetil-amino-propil)-carbodiimida (EDCI). Las carbodiimidas se pueden utilizar en conjunto con aditivos tales como dimetil-amino-piridina (DMAP), o benzotriazoles, tales como 7-aza-1 -hidroxi-benzotriazol (HOAt), 1 -hidroxi-benzotriazol (HOBt), y 6-cloro-1-hidroxi-benzotriazol (CI-HOBt); las condiciones para estas formaciones de enlace de amida son bien conocidas en la materia.

Los reactivos de acoplamiento de amida adicionales también incluyen los reactivos basados en aminio y fosfonio. Las sales de aminio incluyen N-óxido de hexafluorofosfato de N-[(dimetil-amino)-1 H-1 ,2,3-triazolo-[4,5-b]-piridin-1 -il-met¡len]-N-metil-metanaminio (HATU), N-óxido de hexafluorofosfato de N-[(1 H-benzotriazol-1-il)-(dimetil-amino)-metilen]-N-metil-metanaminio (HBTU), N-óxido de hexafluorofosfato de N-[(1 H-6-cloro-benzotriazol-1-il)-(dimetil-amino)-metilen]-N-metil-metanaminio (HCTU), N-óxido de tetrafluoroborato de N-[(1 H-benzotriazol-1 -il)-(dimetil-amino)-metilen]-N-metil-metanaminio (TBTU), y N-óxido de tetrafluoroborato de N-[(1 H-6-cloro-benzotriazol-1 -il)-(dimetil-amino)-metilen]-N-metil-metanaminio (TCTU). Las sales de fosfonio incluyen hexafluorofosfato de benzotr¡azol-1 - il-oxi-tris-(dimetil-amino)-fosfonio (BOP), hexafluorofosfato de 7-azabenzotriazol-1 -M-N-oxi-tris-(pirrolidino)-fosfonio (PyAOP), y hexafluorofosfato de benzotriazol-1 -il-N-oxi-tris-(pirrolidino)-fosfonio (PyBOP).

El paso de formación de amida se puede conducir en un solvente polar, tal como dimetil-formamida (DMF), y también puede incluir una base orgánica, tal como di-isopropil-etil-amina (DIEA) o dimetil-amino-piridina (DMAP).

Los siguientes compuestos de la Tabla 1 se prepararon empleando uno de los métodos ilustrados anteriormente. La Tabla I también proporciona los valores IC50 para los diferentes ejemplos.

D. Formulaciones Farmacéuticas Cuando se emplean como productos farmacéuticos, los compuestos de la presente invención se administran usualmente en la forma de composiciones farmacéuticas. Estas composiciones se pueden administrar por una variedad de vías, incluyendo oral, parenteral, transdérmica, tópica, rectal, e intranasal. Estos compuestos son efectivos, por ejemplo, como composiciones tanto inyectables como orales. Estas composiciones se preparan de una manera bien conocida en la técnica farmacéutica, y comprenden cuando menos un compuesto activo.

Esta invención también incluye composiciones farmacéuticas que contienen, como el ingrediente activo, uno o más de los compuestos de la presente invención anteriores, asociados con veh ículos farmacéuticamente aceptables. En la elaboración de las composiciones de esta invención , el ingrediente activo usualmente se mezcla con u n excipiente , se diluye mediante un excipiente , o se encierra dentro de este veh ículo, el cual puede estar en la forma de una cápsula, bolsita , papel , u otro contenedor. El excipiente empleado es típicamente un excipiente adecuado para su administración a sujetos humanos u otros mamíferos. Cuando el excipiente sirve como un diluyente, puede ser un material sólido, semi-sólido, o líq uido, el cual actúa como un vehículo , portador, o medio para el ing rediente activo. Por consig u iente, las composicio nes pueden estar e n la forma de tabletas, pildoras, polvos, grageas, bolsitas, pastillas, el íxires, suspensiones, emulsiones, soluciones, jarabes , aerosoles (como u n sólido o en u n medio líqu ido) , ung üentos conteniendo, por ejemplo , hasta el 1 0 por ciento en peso del compuesto activo, cápsu las de gelatina blandas y duras, supositorios, soluciones inyectables estériles, y polvos empacados estériles.

En la preparación de una formulación , puede ser necesario moler el compuesto activo para proporcionar el tamaño de partículas apropiado antes de combinar con los otros ing redientes. Si el compuesto activo es sustancialmente insoluble, ordina riamente se muele hasta un tamaño de partículas de malla menor de 200. Si el compuesto activo es sustancialmente soluble en ag ua, el tamaño de partículas normalmente se ajusta mediante molienda para proporcionar una distribución sustancialmente uniforme en la formulación , por ejemplo, aproximadamente una malla 40.

Algunos ejemplos de excipientes adecuados incluyen lactosa , dextrosa , sacarosa , sorbitol, manitol , almidones, goma de acacia, fosfato de calcio, alginatos, tragacanto, gelati na , silicato de calcio, celulosa microcristalina, polivinil-pirrolidona , celu losa, agua estéril, jarabe, y metil-celulosa . Las formulaciones pueden incluir adicionalmente: agentes lubricantes tales como talco, estearato de magnesio, y aceite mineral ; agentes h umectantes; agentes emulsionantes y de suspensión ; agentes conservadores tales como hidroxi-benzoatos de metilo y propilo; agentes edulcorantes; y agentes saborizantes . Las composiciones de la invención se pueden formular de tal ma nera como para proporciona r una liberación rápida , sostenida , y demorada del ingred iente activo después de su administración al paciente mediante el empleo de procedimientos conocidos en este campo .

La cantidad de componente activo, es decir, el compuesto de acuerdo con la presente invención , en la composición farmacéutica , y la forma de dosificación unitaria del mismo, se pueden variar o ajustar ampliamente dependiendo de la aplicación particular, de la potencia del compuesto particular, y de la concentración deseada .

Las composiciones de preferencia se formu lan en una forma de dosificación unitaria, conteniendo cada dosificación de aproximadamente 1 a aproximadamente 500 milig ramos, usualmente de . aproximadamente 5 a aproximadamente 100 miligramos, ocasionalmente de aproximadamente 1 0 a aproximadamente 30 miligramos , del ingred iente activo. El térm ino "formas de dosificación unitaria" se refiere a u n idades físicamente sepa radas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, conten iendo cada u nidad una cantidad previamente determinada del material activo, calculada para prod ucir el efecto terapéutico deseado, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado. De preferencia , el compuesto de la presente invención anterior se emplea en no más de aproximadamente el 20 por ciento en peso de la composición farmacéutica, más preferiblemente no más de aproximadamente el 1 5 por ciento en peso , siendo el resto de veh ículos farmacéuticamente i nertes .

El compuesto activo es efectivo sobre u n amplio intervalo de dosificación , y en general se administra en una cantidad farmacéuticamente o terapéuticamente efectiva . Se entenderá, sin embargo , que la cantidad del compuesto realmente administrada será determinada por u n méd ico, a la luz de las circu nstancias relevantes, incluyendo la condición que se vaya a tratar, la gravedad de la condición que se esté tratando, la vía de administración seleccionada, el compuesto real ad min istrado, la edad , peso, y respuesta del paciente individual , la gravedad de los síntomas del paciente, y similares.

En el uso terapéutico para tratar o combatir el cáncer en mamíferos, los compuestos o composiciones farmacéuticas del mismo se admin istrarán por cualquier vía apropiada, tal como oralmente, tópicamente , transdérmicamente, y/o parenteralmente en una dosificación para obtener y mantener una concentración , es decir, una cantidad , o nivel en sangre del componente activo en el mam ífero que se someta al tratamiento, que sea terapéuticamente efectivo. En términos generales , esta cantidad de dosificación terapéuticamente efectiva del componente activo (es decir, una dosificación efectiva) estará en el intervalo de aproximadamente 0. 1 a aproximadamente 100, más preferiblemente de aproximadamente 1 .0 a aproximadamente 50 milig ramos/kilogramo de peso corporal/ día.

Para la preparación de composiciones sólidas, tales como tabletas, el i ng red ie nte a ctivo p ri nci pa l se mezcl a co n u n exci p iente farmacéutico para formar u na composición de pre-formulación sólida que contiene una mezcla homogénea de u n compuesto de la presente invención . Cuando se hace referencia a estas composiciones de pre-formulación como homogéneas, esto significa que el ingrediente activo se dispersa uniformemente a través de toda la composición , de tal manera q ue la composición se puede subdividir fácilmente en formas de dosificación unitaria igualmente efectivas , tales como tabletas, p ildoras y cápsu las. Esta pre-formulación sólida se subdivide entonces en las formas de dosificación un itaria del tipo descrito anteriormente que contienen , por ejemplo, de 0.1 a aproximadamente 500 miligramos del ingrediente activo de la presente invención.

Las tabletas o pildoras de la presente invención se pueden recubrir o mezclar de otra manera para proporcionar una forma de dosificación que proporcione la ventaja de una acción prolongada. Por ejemplo, la tableta o pildora puede comprender un componente de dosificación interno y un componente de dosificación externo, estando el último en la forma de una envoltura sobre el primero. Los dos componentes se pueden separar mediante una capa entérica, la cual sirve para resistir a la desintegración en el estómago, y para permitir que el componente interno pase intacto hasta el duodeno o se demore en su liberación. Se pueden utilizar una variedad de materiales para estas capas o recubrimientos entéricos, incluyendo estos materiales un número de ácidos poliméricos y mezclas de ácidos poliméricos con materiales tales como laca, alcohol cetílico, y acetato de celulosa.

Las formas líquidas en las que se pueden incorporar las composiciones novedosas de la presente invención para su administración oralmente o mediante inyección incluyen soluciones acuosas, de una manera adecuada jarabes saborizados, suspensiones acuosas u oleosas, y emulsiones saborizadas con aceites comestibles, tales como aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de ajonjolí, aceite de coco, o aceite de cacahuate, así como elíxires y vehículos farmacéuticos similares.

Las composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en solventes acuosos u orgánicos farmacéuticamente aceptables, o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados como se describe en lo anterior. De preferencia , las composiciones se admin istran por la vía respiratoria nasal u oral para un efecto local o sistémico. Las composiciones en preferiblemente solventes fa rmacéuticamente aceptables se pueden nebulizar med iante el uso de gases inertes. Las soluciones nebulizadas se pueden inhalar di rectamente a partir del dispositivo nebulizador o el dispositivo nebulizador se puede unir a una máscara para la cara , o una máq uina de respiración de presión positiva intermitente. Las composiciones en solución , en suspensión , o en polvo se pueden administrar, de preferencia oralmente o nasalmente, a partir de dispositivos q ue suministren la formulación de u na manera apropiada .

Los siguientes ejemplos de formulación ilustran las composiciones farmacéuticas representativas de la presente invención .

Ejem plo de Formu lación 1 Se preparan cápsulas de gelatina du ra que contienen siguientes ingred ientes: Cantidad I ngrediente (mg/cáps ula) I ngrediente activo 30.0 Almidón 305.0 Estearato de mag nesio 5.0 Los ingredientes anteriores se mezclan y se rellenan en cápsulas de gelatina dura en cantidades de 340 miligramos.

Ejemplo de Formulación 2 Se prepara una fórmula de tableta utilizando los siguientes ingredientes: Cantidad Ingrediente (mg/tableta) Ingrediente activo 25.0 Celulosa, microcristalina 200.0 Dióxido de silicio coloidal 10.0 Ácido esteárico 5.0 Los componentes se mezclan y se comprimen para formar tabletas, cada una con un peso de 240 miligramos.

Ejemplo de Formulación 3 Se prepara una formulación para inhalación de polvo seco que contiene los siguientes componentes: Ingrediente % en peso Ingrediente activo 5 Lactosa 95 El ingrediente activo se mezcla con la lactosa, y la mezcla se agrega a un aparato de inhalación de polvo seco. jemplo de Formulación 4 Se preparan tabletas, cada una conteniendo 30 miligramos igrediente activo, como sigue: Cantidad Ingrediente (mg/tableta) Ingrediente activo 30.0 mg Almidón 45.0 mg Celulosa microcristalina 35.0 mg Polivinil-pirrolidona 4.0 mg (como una solución al 10 por ciento en agua estéril) Almidón de carboxi-metilo de sodio 4.5 mg Estearato de magnesio 0.5 mg Talco 1.0 mg Total 120 mg El ingrediente activo, el almidón y la celulosa se pasan a través de un tamiz de malla U.S. No. 20 y se mezclan completamente. La solución de polivinil-pirrolidona se mezcla con los polvos resultantes, los cuales entonces se pasan a través de un tamiz de malla U.S. No. 16. Los granulos así producidos se secan de 50°C a 60°C y se pasan a través de un tamiz de malla U S. No. 16. El almidón de carboxi-metilo de sodio, el estearato de magnesio y el talco, previamente pasados a través de un tamiz de malla U.S. No. 30, se agregan entonces a los granulos, los cuales, después de mezclarse, se comprimen en una máquina de tabletas, para proporcionar tabletas, cada una con un peso de 120 miligramos.

Ejemplo de Formulación 5 Se hacen cápsulas, cada una conteniendo 40 miligramos de medicamento, como sigue: Cantidad Ingrediente (mg/cápsula) Ingrediente activo 40.0 mg Almidón 109. 0 mg Estearato de magnesio 1.0 mg Total 150. 0 mg El ingrediente activo, el almidón y el estearato de magnesio se mezclan, se pasan a través de un tamiz de malla U.S. No. 20, y se rellenan en cápsulas de gelatina dura en cantidades de 150 miligramos.

Ejemplo de Formulación 6 Se hacen supositorios, cada uno conteniendo 25 miligramos de ingrediente activo, como sigue: Ingrediente Cantidad Ingrediente activo 25 mg Glicéridos de ácidos grasos saturados hasta: 2,000 mg El ingrediente activo se pasa a través de un tamiz de malla U.S. No. 60 y se suspende en los glicéridos de ácidos grasos saturados previamente fundidos utilizando el calor mínimo necesario. La mezcla se vierte entonces en un molde de supositorios de una capacidad nominal de 2.0 gramos y se deja enfriar.

Ejemplo de Formulación 7 Se hacen suspensiones, cada una conteniendo 50 miligramos de medicamento por dosis de 5.0 mililitros, como sigue: Ingrediente Cantidad Ingrediente activo 50.0 mg Goma de xantano 4.0 mg Carboxi-metil-celulosa de sodio (11 %) / Celulosa 50.0 mg microcristalina (89 %) Sacarosa 1.75 g Benzoato de sodio 10.0 mg Saborizante y colorante c.v.

Agua purificada hasta: 5.0 ml_ El ingrediente activo, la sacarosa y la goma de xantano se mezclan, se pasan a través de un tamiz de malla U.S. No. 10, y entonces se mezclan con una solución previamente hecha de la celulosa microcristalina y carboxi-metil-celulosa de sodio en agua. El benzoato de sodio, el saborizante, y el colorante se diluyen con algo del agua, y se agregan con agitación. Entonces se agrega suficiente agua para producir el volumen requerido.

Ejemplo de Formulación 8 Cantidad Ingrediente (mg/cápsula) Ingrediente activo 15.0 mg Almidón 407.0 mg Estearato de 3.0 mg magnesio Total 425.0 mg El ingrediente activo, el almidón, y el estearato de magnesio se mezclan, se pasan a través de un tamiz de malla U.S. No. 20, y se rellenan en cápsulas de gelatina dura en cantidades de 425.0 miligramos.

Ejemplo de Formulación 9 Se puede preparar una formulación subcutánea como sigue: Ingrediente Cantidad Ingrediente activo 5.0 mg Aceite de maíz 1.0 ml_ Ejemplo de Formulación 10 Se puede preparar una formulación tópica como sigue: Ingrediente Cantidad Ingrediente activo 1-10 g Cera emulsionante 30 g Parafina líquida 20 g Parafina blanda blanca hasta 100 g La parafina blanda blanca se calienta hasta fundirse. Se incorporan la parafina líquida y la cera emulsionante, y se agitan hasta disolverse. Se agrega el ingrediente activo, y la agitación se continúa hasta dispersarse. La mezcla entonces se enfría hasta solidificarse.

Ejemplo de Formulación 11 Se puede preparar una formulación intravenosa como sigue: Ingrediente Cantidad Ingrediente activo 250 mg Suero isotónico 1000 mL Otra formulación preferida empleada en los métodos de la presente invención emplea dispositivos de suministro transdérmico ("parches"). Estos parches transdérmicos se pueden utilizar para proporcionar una infusión continua o discontinua de los compuestos de la presente invención en cantidades controladas. La construcción y el uso de parches transdérmicos para el suministro de los agentes farmacéuticos son bien conocidos en la materia. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,023,252, expedida el 11 de Junio de 1991, incorporada a la presente como referencia. Estos parches se pueden construir para el suministro continuo, pulsátil, o sobre demanda de los agentes farmacéuticos.

Con frecuencia, será deseable o necesario introducir la composición farmacéutica al cerebro, ya sea directa o indirectamente. Las técnicas directas usualmente involucran la colocación de un catéter de suministro de fármaco en el sistema ventricular del huésped para derivar la barrera hematoencefálica. Uno de estos sistemas de suministro implantables utilizados para el transporte de factores biológicos hacia regiones anatómicas específicas del cuerpo se describe en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,011,472 la cual se incorpora a la presente como referencia.

Las técnicas indirectas, las cuales se prefieren en general, usualmente involucran la formulación de las composiciones con el fin de proporcionar latenciación del fármaco mediante la conversión de los fármacos hidrofílicos en fármacos solubles en lípido. La latenciación se logra en general a través del bloqueo de los grupos hidroxilo, carbonilo, sulfato, y amina primaria presentes en el fármaco para hacer al fármaco más soluble en l ípido y susceptible al transporte a través de la barrera hematoencefálica . De una ma nera alternativa , el suministro de los fármacos hid rofilicos se puede mejorar med iante la infusión intra-arterial de soluciones hipertónicas, las cuales pueden abrir transitoriamente la barrera hematoencefálica.

Otras formulaciones adecuadas pa ra utilizarse en la presente invención se pueden encontrar en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadelfia , PA, 1 7a Edición ( 1985).

E . Dosificación y Admi n istración Como se observa anteriormente , los compuestos descritos en la presente son adecuados para uti lizarse en u na variedad de sistemas de suministro de fármacos descritos anteriormente. Adicionalmente, con el objeto de mejorar la vida media en suero in vivo del compuesto administrado, los compuestos se pueden encapsular, introd ucir en el lumen de liposomas , preparar como un coloide, o se pueden emplear otras técnicas convencionales que proporcionen una vida media en suero prolongada de los compuestos. Están disponibles una variedad de métodos para la preparación de liposomas, como se describe , por ejemplo , en Szoka y colaboradores, Patentes de los Estados U nidos de Norteamérica Números 4,235,871 , 4,501 , 728 y 4,837,028, cada una de las cuales se incorpora a la presente como referencia.

Los compuestos de la presente invención son útiles para inhibir o tratar un trastorno mediado, cuando menos en parte, por la actividad de la proteína de huso de cinesina. En un aspecto, el trastorno que es mediado, cuando menos en parte, por la proteína de huso de cinesina, es un trastorno proliferativo celular. El término "trastorno proliferativo celular" o "trastorno proliferativo de células" se refiere a las enfermedades que incluyen, por ejemplo, cáncer, tumor, hiperplasia, restenosis, hipertrofia cardíaca, trastorno inmune e inflamación. La presente invención proporciona métodos para el tratamiento de un sujeto humano o mamífero que necesite dicho tratamiento, los cuales comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula I o II, ya sea solo o bien en combinación con otros agentes contra el cáncer.

Los compuestos de la invención son útiles ¡n vitro o in vivo en la inhibición del crecimiento de las células de cáncer. El término "cáncer" se refiere a las enfermedades de cáncer, incluyendo, por ejemplo, pulmón y bronquios; próstata; mama; páncreas; colon y recto; tiroides; estómago; hígado y conducto biliar intrahepático; riñon y pelvis renal; vejiga urinaria; cuerpo uterino; cérvix uterino; ovario; mieloma múltiple; esófago; leucemia mielógena aguda; leucemia mielógena crónica; leucemia linfocítica; leucemia mieloide; cerebro; cavidad oral y faringe; laringe; intestino delgado; linfoma no de Hodgkin; melanoma; y adenoma de colon velloso.

El cáncer también incluye tumores o neoplasmas seleccionados a partir del grupo que consiste en carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, y malignidades hematológicas.

Adicionalmente, el tipo de cáncer se puede seleccionar a partir del grupo que consiste en el crecimiento de tumores sólidos/ malignidades, carcinoma de células mixoides y redondas, tumores localmente avanzados, carcinoma de tejido blando humano, metástasis de cáncer, carcinoma de células escamosas, carcinoma esofágico de células escamosas, carcinoma oral, linfoma de células-T cutáneo, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, cáncer de la corteza adrenal, tumores productores de ACTH, cánceres no microcelulares, cáncer de mama, cánceres gastrointestinales, cánceres urológicos, malignidades del tracto genital femenino, malignidades del tracto genital masculino, cáncer de riñon, cáncer de cerebro, cánceres óseos, cánceres de piel, cáncer de tiroides, retinoblastoma, neuroblastoma, efusión peritoneal, efusión pleural maligna, mesotelioma, tumores de Wilms, cáncer de vesícula biliar, neoplasmas trofoblásticos, hemangiopericitoma, y sarcoma de Kaposi.

Un compuesto o una composición de esta invención se puede administrar a un mamífero por una vía adecuada, tal como oralmente, intravenosamente, parenteralmente, transdérmicamente, tópicamente, rectalmente, o intranasalmente.

Los mamíferos incluyen, por ejemplo, seres humanos y otros primates, mascotas o animales de compañía, tales como perros y gatos, animales de laboratorio, tales como ratas, ratones y conejos, y animales de granja, tales como caballos, cerdos, ovejas, y reses.

Los tumores o neoplasmas incluyen crecimientos de células de tejido en donde la multiplicación de las células es i ncontrolada y progresiva. Algunos de estos crecimientos son benig nos, pero otros se denominan como "malignos" , y pueden conducir a la muerte del organismo. Los neoplasmas malignos o "cánceres" se distinguen de los crecimientos ben ignos en q ue, en ad ición a exhibir una proliferación celu lar agresiva , pueden invadi r los tej idos circundantes y metastatizarse. Más aún , los neoplasmas malignos se caracterizan porque muestran una mayor pérdida de d iferenciación (mayor "desdiferenciación") , y organización u nos en relación con los otros y con los tejidos circundantes. Esta propiedad se denomina como "anaplasia . " Los compuestos que tengan la actividad biológ ica deseada se pueden modificar como sea necesario para proporcionar las propiedades deseadas, tales como mejores propiedades farmacológicas (por ejemplo, estabilidad in vivo, biodisponibilidad), o la capacidad para ser detectados en las aplicaciones de d iagnóstico. La estabilidad se puede ensayar en una variedad de formas, tales como mediante la medición de la vida media de los compuestos durante la incubación con peptidasas o plasma humano o suero.

Para los propósitos de diagnóstico , se pueden enlaza r una amplia variedad de marcas a los compuestos, las cuales pueden proporcionar, directa o indirectamente , u na señal detectable . Por consiguiente, los compuestos y/o composiciones de la presente invención se pueden modificar en una variedad de formas para una variedad de propósitos finales mientras que todavía retengan su actividad biológica. En adición, se pueden introducir diferentes sitios reactivos para enlazarse a partículas, sustratos sólidos, macro-moléculas, y similares.

Los compuestos marcados se pueden utilizar en una variedad de aplicaciones in vivo o in vitro. Se pueden emplear una amplia variedad de marcas, tales como radionúclidos (por ejemplo, radioisótopos emisores de rayos gamma, tales como tecnecio-99 o indio-111), agentes fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína), enzimas, sustratos de enzimas, co-factores de enzimas, inhibidores de enzimas, compuestos quimiluminiscentes, compuestos bioluminiscentes, y similares. Aquéllos de una experiencia ordinaria en este campo sabrán de otras marcas adecuadas para enlazarse a los complejos, o podrán aseverarlo empleando experimentación de rutina. El enlace de estas marcas se logra empleando técnicas convencionales comunes para aquéllos de una experiencia ordinaria en este campo.

Las composiciones farmacéuticas de la invención son adecuadas para utilizarse en una variedad de sistemas de suministro de fármacos. Las formulaciones adecuadas para utilizarse en la presente invención se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadelfia, Pa., 17a Edición (1985).

La cantidad administrada al paciente variará dependiendo de lo que se esté administrando, del propósito de la administración, tal como profilaxis o terapia , del estado del paciente, de la manera de administración, y similares. En las aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran a un paciente que ya esté sufriendo de una enfermedad , en una cantidad suficiente para cu rar o cuando menos detener pa rcialmente el progreso o los sí ntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para llevar a cabo esto se define como "dosis terapéuticamente efectiva" . Las cantidades efectivas pa ra este uso dependerán de la condición de enfermedad que se esté tratando, así como, de acuerdo con el juicio del clínico que atienda , dependiendo de factores tales como la g raved ad de la enferm ed ad , trasto rn o o co nd ició n , l a ed ad , peso y condición general del paciente, y similares.

Los compuestos administrados a un paciente está n típicamente en la forma de las composiciones farmacéuticas descritas anteriormente. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas de esterilización convencionales, o se pueden filtrar para esterilizarse. Las soluciones acuosas resultantes se pueden empacar para utilizarse como estén , o se pueden liofilizar, combinándose la preparación liofilizada con un veh ícu lo acuoso estéril antes de la administración . El pH de las preparaciones del compuesto típicamente estará entre aproximadamente 3 y 1 1 , más preferiblemente de aproximadamente 5 a 9 , y de una manera muy preferible de aproximadamente 7 a 8. Se entenderá q ue el uso de algunos de los excipientes , veh ículos, o estabilizantes anteriores, dará como resultado la formación de sales farmacéuticas.

La dosificación terapéutica de los compuestos y/o composiciones de la presente invención variará de acuerdo con, por ejemplo, el uso particular para el cual se haga el tratamiento, la manera de administración del compuesto, la salud y condición del paciente, y el juicio del médico que prescriba. Por ejemplo, para su administración oral, la dosis típicamente estará en el intervalo de aproximadamente 5 microgramos a aproximadamente 50 miligramos por kilogramo de peso corporal al día, de preferencia de aproximadamente 1 miligramo a aproximadamente 10 miligramos por kilogramo de peso corporal al día. En la alternativa, para administración intravenosa, la dosis típicamente estará en el intervalo de aproximadamente 5 microgramos a aproximadamente 50 miligramos por kilogramo de peso corporal, de preferencia de aproximadamente 500 microgramos a aproximadamente 5000 microgramos por kilogramo de peso corporal. Las vías de administración alternativas contempladas incluyen, pero no se limitan a, intranasal, transdérmica, inhalada, subcutánea e intramuscular. La dosis efectiva se puede extrapolar a partir de curvas de respuesta a la dosis derivadas de sistemas de prueba in vitro o de modelos animales.

En general, los compuestos y/o composiciones de la presente invención se administrarán en una cantidad terapéuticamente efectiva mediante cualquiera de los modos de administración aceptados para agentes que sirvan a utilidades similares. La toxicidad y la eficacia terapéutica de estos compuestos se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celu lares o en animales experimentales, por ejemplo, para determinar la LD50 (la dosis letal para el 50 por ciento de la población) , y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50 por ciento de la población) . La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la proporción LD50/ED5o. Se prefieren los compuestos que exhiban g randes índ ices terapéuticos.

Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivo celular y de los estudios con animales, se pueden utiliza r en la formulación de un intervalo de dosificación para utilizarse en seres humanos . La dosificación de estos compuestos está de preferencia dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca a n inguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo depend iendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. Para cualqu ier compuesto y/o composición utilizada en el método de la invención , la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para alcanzar el intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la IC50 (la concentración del compuesto de prueba que log re una inhibición med ia-máxima de la actividad), como se determine en el cultivo celular. Esta información se puede utilizar para determinar más precisamente las dosis útiles en seres humanos. Los n iveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento.

Los sigu ientes ejemplos sintéticos y biológ icos se ofrecen para ilustrar esta invención , y no se deben i nterpretar de ningu na manera para limitar el alcance de esta invención .

Ejemplos Haciendo referencia a los siguientes Ejemplos, los compuestos de la presente invención se sintetizaron empleando los métodos descritos en la presente, u otros métodos , los cuales son bien conocidos en la materia . Se entiende que los compuestos no preparados o analizados se pueden preparar o analizar empleando los métodos descritos en la presente, u otros métodos que son bien conocidos en la materia .

Los compuestos y/o intermed iarios se caracterizaron mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento (H PLC) utilizando un sistema de cromatografía Waters M illen ium con u n Módulo de Separación 2690 (M ilford , MA). Las columnas a nal íticas fueron Alltima C-1 8 de fase inversa , 4.6 x 250 milímetros, de Alltech (Deerfield , I L) . Se utilizó una elución en g rad iente, típicamente empezando con el 5 por ciento de acetonitrilo/95 por ciento de agua y progresando hasta el 1 00 por ciento de acetonitrilo durante un período de 40 minutos . Todos los solventes contuvieron ácido trifluoro-acético al 0.1 por ciento (TFA) . Los compuestos se detectaron mediante absorción de luz ultravioleta (UV) a cualquiera de 220 o 254 nanómetros. Los solventes de la H PLC fueron de Burdick and Jackson (Muskegan, MI), o de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA). En algunas instancias, la pureza se evaluó mediante cromatografía de capa delgada (TLC) utilizando placas de gel de sílice con respaldo de vidrio o plástico, tales como, por ejemplo, hojas flexibles Baker-Flex Silica Gel 1B2-F. Los resultados de la TLC se detectaron fácilmente de manera visual bajo luz ultravioleta, o empleando vapor de yodo bien conocido, y otras diferentes técnicas de teñido.

El análisis espectrométrico de masas se llevó a cabo en uno de dos instrumentos de LC/MS: un Sistema Waters (Alliance HT HPLC y un espectrómetro de masas Micromass ZQ; Columna: Eclipse XDB-C18, 2.1 x 50 milímetros; sistema de solventes: del 5 al 95 por ciento (o del 35 al 95 por ciento, o del 65 al 95 por ciento, o del 95 al 95 por ciento) de acetonitrilo en agua con ácido trifluoro-acético al 0.05 por ciento; velocidad de flujo de 0.8 mililitros/minuto; intervalo de peso molecular de 500 a 1500; Voltaje del cono de 20 V; temperatura de la columna de 40°C), o un Sistema Hewlett Packard (Serie 1100 HPLC; Columna: Eclipse XDB-C18, 2.1 x 50 milímetros; sistema de solventes: del 1 al 95 por ciento de acetonitrilo en agua con ácido trifluoro-acético al 0.05 por ciento; velocidad de flujo de 0.4 mililitros/minuto; intervalo de peso molecular de 150 a 850; Voltaje del cono de 50 V; temperatura de la columna de 30°C). Todas las masas se reportaron como aquéllas de los iones progenitores protonados.

El análisis de GC/MS se lleva a cabo en un instrumento Hewlett Packard (cromatógrafo de gases Serie HP6890 con un Detector Selectivo de Masas 5973; volumen del inyector: 1 mililitro; temperatura inicial de la columna: 50°C; temperatura final de la columna: 250°C; tiempo de rampa: 20 minutos; velocidad de flujo de gas: 1 mililitro/minuto; columna: fenil-metil-siloxano al 5 por ciento, Modelo No. HP 190915-443, dimensiones: 30.0 metros x 25 metros x 0.25 metros).

El análisis de resonancia magnética nuclear (NMR) se llevó a cabo sobre algunos de los compuestos con un Varian 300 MHz NMR (Palo Alto, CA). La referencia espectral fue cualquiera de TMS o el cambio químico conocido del solvente. Algunas muestras de compuestos se ejecutaron a una temperatura elevada (por ejemplo, 75°C) para promover una mayor solubilidad de las muestras.

La pureza de algunos compuestos de la invención se evalúa mediante análisis elemental (Desert Analytics, Tucson, AZ).

Los puntos de fusión se determinan en un aparato Laboratory Devices Mel-Temp (Holliston, MA).

Las separaciones de preparación se llevaron a cabo utilizando un sistema de cromatografía Flash 40 y KP-Sil, 60A (Biotage, Charlottesville, VA), o mediante cromatografía en columna por evaporación instantánea utilizando un material de empaque de gel de sílice (malla 230-400), o mediante HPLC utilizando una columna de fase inversa C-18. Los solventes típicos empleados para el sistema Flash 40 Biotage y la cromatografía en columna por evaporación instantánea fueron dicloro-metano, metanol, EtOAc, hexano, acetona, hidroxilamina acuosa y trietil-amina. Los solventes típicos empleados para la HPLC en fase inversa fueron concentraciones variables de acetonitrilo y agua con ácido trifluoro-acético al 0.1 por ciento.

A menos que se informe de otra manera, todas las temperaturas están en grados Celsius. También, en estos ejemplos y en cualquier otra parte, las abreviaturas tienen los siguientes significados: AcOH = ácido acético ac. = acuoso ATP = trifosfato de adenosina Boc = terbutiloxi-carbonilo BSA = albúmina de suero bovino CAM = molibdato de amonio cérico DCM = dicloro-metano DIAD = azodicarboxilato de di-isopropilo DIBAL = hidruro de di-isobutil-aluminio DIEA - di-isopropil-etil-amina DIPEA - di-isopropil-etil-amina DMAP = dimetil-amino-piridina DMF = dimetil-formamida DMSO = sulfóxido de dimetilo DTT = ditioeritritol eq. = equivalentes EtzO = dietil-éter trietil-amina acetato de etilo etanol gramos horas cromatografía de líquidos de alto rendimiento litros Cromatog rafía de Líquidos / Espectroscopia de Masas mola r metros proporción de masa/carga metil-amina miligramos minutos mililitros mil ímetros milimolar milimoles moles normal nanómetros nanomolar resonancia mag nética nuclear PPh3 trifenil-fosfina PhCF3 trifluoro-metil-benceno psi (kg/cm2) libras por pulgada cuadrada (kilogramos por centímetro cuadrado) RT temperatura ambiente sat. saturado TEA trietil-amina THF tetrahidrofurano TFA ácido trifluoro-acético TLC cromatografía de capa delgada TMS trimetil-sílilo TMSCI cloruro de trimetil-sililo M9 microgramos ML microlitros µ? micromolar Uplc Cromatografía de líquidos de ultra rendimiento Ejemplo 1 (S)-N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2- dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)- tetrahidrofuran-2-carboxamida A una solución de 2,5-dihidro-1 H-pirrol (30 gramos, 434 milimoles, al 96 por ciento de Alfa Aesar) en dioxano (1000 mililitros, solución 0.43 M), se le agregó CbzOSu (130 gramos, 521 milimoles). Después de agitarse a temperatura ambiente durante 18 horas, la mezcla de reacción se concentró hasta alrededor de 300 mililitros, y se diluyó con 1000 mililitros de EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró, y se concentró al vacío. Se obtuvo el 2,5-dihidro-1 H-pirrol-1-carboxilato de bencilo deseado en un 91 por ciento de rendimiento (80.0 gramos) como un aceite incoloro, mediante cromatografía en columna por evaporación instantánea. Rf = 0.6 (EtOAc al 30 por ciento en hexanos). 1H NMR (CDCI3, 400 MHz): d 7.32 (5H, m), 5.80 (2H, m), 5.77 (2H, s), 4.22 (4H, m). LC/MS (uplc): MH+ 204.2, 160.1 (-44), 0.86 minutos.

Epoxidación de 2,5-dihidro-1 H-pirrol-1 -carboxilato de bencilo A una solución de 2, 5-dihidro-1 H-pirrol-1 -carboxilato de bencilo (33 gramos, 163 milimoles; al 90 por ciento de Aldrich) en dicloro-metano (540 mililitros, solución 0.3 M), se le agregó MCPBA (44 gramos, 340 milimoles, al 77 por ciento de Aldrich). Después de que la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 18 horas, se agregaron 500 mililitros de una solución acuosa saturada de Na2C03, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. La capa orgánica se separó, se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró, y se concentró al vacío. Se obtuvo el producto deseado como un aceite amarillo en un 83 por ciento de rendimiento (29.5 gramos) mediante cromatografía en columna por evaporación instantánea. 1H NMR (CDCI3, 400 MHz): d 3.38 (2H, m), 3.68 (2H, m), 3.87 (2H, m), 5.11 (2H, s), 7.33(5 horas, m). LC/MS (uplc): MH+ 220.0, 0.69 minutos.

Abertura de anillo de 6-oxa-3-azabiciclo-[3.1.0]-hexan-3-carboxilato de bencilo solución de 6-oxa-3-azabiciclo-[3.1.0]-hexan-3-carboxilato de bencilo (28.5 gramos, 130 milimoles), y CuBrSMe2 (26.7 gramos, 130 milimoles) en tetrahidrofurano anhidro (260 mililitros, solución 0.5 M) a -40°C, se le agregó lentamente bromuro de vinil-magnesio (520 mililitros, solución 1.0 M en tetrahidrofurano). La mezcla de reacción se calentó entonces hasta -20°C durante 2 horas. Después de apagarse con una solución acuosa saturada de NH4CI (200 mililitros), la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc (500 mililitros). La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró, y se concentró al vacío. Se obtuvo la mezcla racémica deseada de trans-(±)-3-hidroxi-4-vinil-pirrolidin-1-carboxilato de bencilo en un 48 por ciento de rendimiento (15.5 gramos) como un aceite amarillo mediante cromatografía en columna por evaporación instantánea. Rf = 0.2 (EtOAc al 30 por ciento en hexanos). H NMR (CDCI3, 400 MHz): d 2.71 (1H, m), 3.28 (2H, m), 3.72 (2H, m), 4.11 (1H, m), 5.14 (2H, s), 5.16-5.23 (2H, m), 5.69 (1H, m), 7.33 (5 horas, m). LC/MS (uplc): MH+ 248.0, 0.78 minutos.

Resolución de trans-(±)-3-hidroxi-4-vinil-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo Mezcla racémica deseada La mezcla racémica de tra ns-(±)-3-hid roxi-4-vin il-pi rrolidin- 1 -carboxilato de bencilo (14 gramos) se resolvió utilizando HPLC quiral (Chiralpak AD-H Heptano:EtOH:MeOH, 8:1:1). Se obtuvieron el (3S,4R)-3-hidroxi-4-vinil-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo enantioméricamente enriquecido deseado (6.7 minutos; 6.3 gramos, >99.5 por ciento de exceso enantiomérico (ee)), y el (3f?,4S)-3-hidroxi-4-vinil-pirrolidin-1-carboxilato de bencilo indeseado (9.3 minutos; 6.7 gramos, 99.5 por ciento de exceso enantiomérico (ee)) con una recuperación del 92 por ciento.

Fluoración de (3S,4R)-3-hidroxi-4-vinil-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo A una solución de (3S,4R)-3-hidroxi-4-vinil-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo (5.0 gramos, 20.2 milimoles) en PhCF3 (81 mililitros, solución 0.25 M), se le agregó N,N-di-isopropil-etil-amina (53 mililitros, 303 milimoles), trifluorhidrato de trietil-amina (19.8 mililitros, 121 milimoles), y fluoruro de perfluoro-1 -butan-sulfonilo (PBSF, 3.6 mililitros, 20.2 milimoles). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente. Después de 60 y 120 minutos, se agregó fluoruro de perfluoro-1 -butan-sulfonilo adicional (3.6 mililitros, 20.2 milimoles). Después de 18 horas, la mezcla de reacción se transfirió a un embudo de separación y se lavó dos veces con 50 mililitros de HCI 1.0 N (¡Precaución! se produce una gran cantidad de calor), dos veces con una solución acuosa saturada de NaHC03, y una vez con H20 y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2S0 anhidro, se filtró, y se concentró, para proporcionar un aceite crudo color café. El (3 ,4 )-3-fluoro-4-vinil-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo puro se obtuvo en un 81 por ciento de rendimiento (4.1 gramos) como un aceite amarillo mediante cromatografía en columna por evaporación instantánea (Si02, el 10 por ciento al 30 por ciento de EtOAc en hexanos). Rf = 0.55 (EtOAc al 30 por ciento en hexanos). H NMR (CDCI3, 400 MHz): d 7.37-7.25 (5H, m), 5.9 (1H, m), 5.24 (2H, m), 5.14 (2H, m), 5.03 (1H, dt, J = 52.8, 3.2 Hz), 3.9-3.5 (3H, m), 3.53 (1H, m), 2.83 (1H, m). 13C NMR (CDCI3, 100 MHz): d 154.7, 154.6, 136.6, 131.89, 131.83, 128.48, 128.02, 127.94, 119.00, 118.94, 95.23, 94.47, 93.42, 92.67, 66.99, 66.94, 53.16, 52.94, 52.83, 52.60, 48.17, 48.02, 47.91, 47.83, 47.2, 47.1. LC/MS (uplc): MH+ 250.0, 0.93 minutos.

Disociación Oxidativa de Vinil-fluoro-pirrolidina A una solución de (3R,4R)-3-fluoro-4-vinil-pirrolidin-1-carboxilato de bencilo (1.78 gramos, 7.15 milimoles) en CH3OH y H20 (2:1, 30 mililitros, solución 0.2 M), se le agregó una solución de Os04 en H20 (3 mililitros de una solución al 4 por ciento en peso/volumen, 0.5 milimoles). Se agregó entonces Nal04 (4.6 gramos, 21.5 milimoles) en una sola porción, y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente. Después de 2 horas, la mezcla se filtró para remover los sólido blancos precipitados, y la torta del filtro se lavó con EtOAc. El filtrado se concentró al vacío para remover la mayor parte de los solventes orgánicos. El residuo se extrajo con tres porciones de EtOAc, y la capa orgánica combinada se secó sobre Na2S0 anhidro, se filtró, y se concentró. El (3f?,4S)-3-fluoro-4-formil-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo crudo se utilizó para el siguiente paso sin mayor purificación. LC/MS (uplc): H+ 208.2 (-44), 252.0, 0.69 minutos.

Síntesis de 2,5-difluoro-benzotioamida Una solución agitada de 2,5-difluoro-benzonitrilo (25 gramos, 180 milimoles) en piridina (90 mililitros) se trató con sulfuro de amonio al 20 por ciento en peso en agua (67.4 mililitros, 198 milimoles), y trietil-amina (27.4 mililitros, 198 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a 50°C durante 5 horas hasta que la reacción estuvo completa. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con agua fría, y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se separó, luego se lavó con H20 (3 veces), salmuera (3 veces), entonces se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró, y se evaporó bajo presión reducida, para dar el producto crudo. La purificación en columna de gel de sílice (EtOAc al 20 por ciento en hexanos), para proporcionar la 2,5-difluoro-benzotioamida como un sólido amarillo (31.0 gramos, 99 por ciento). 1H NMR (CDCI3, 300 MHz): d 7.12 (m, 2H), 7.90 (br, 2H), 8.08 (m, 1H). LC/MS (uplc): MH + 174.0, 0.64 minutos.

Síntesis de 2,5-difluoro-bencimido-hidrazida A una solución agitada de 2,5-difluoro-benzotioamida (22.5 gramos, 129.7 milimoles) en EtOH (150 mililitros), se le agregó hidrazina (6.1 mililitros, 194.5 milimoles). Después de agitar a temperatura ambiente durante 30 minutos, la reacción estaba completa de acuerdo con la LC/MS, y se precipitó un sólido blanco. El precipitado se filtró y se lavó con Hexanos para proporcionar la 2,5-difluoro-bencimido-hidrazida (5.52 gramos, 94 por ciento).

Acilación de 2,5-difluoro-bencimido-hidrazida La N-Boc-D-terbutil-glicina (7.5 gramos, 32.4 milimoles) se convirtió hasta un anhídrido mixto mediante la adición de cloro-formato de etilo (3.41 mililitros, 35.6 milimoles), y Et3N (6.8 mililitros, 48.6 milimoles) en tetrahidrofurano anhidro (65 mililitros, 0.5 M) de -5°C a 0°C. La mezcla se agitó a -5°C durante 30 minutos. El sólido resultante se filtró, y se agregó tetrahidrofurano anhidro adicional para lavar el precipitado. La solución de la reacción resultante se agregó entonces a una solución en tetrahidrofurano de 2,5-difluoro-bencimido-hidrazida (5.53 gramos, 32.4 milimoles) a -5°C. Entonces, la reacción se calentó gradualmente a temperatura ambiente, y se agitó durante la noche. Una vez que la reacción estuvo completa, la mezcla se dividió entre EtOAc y H20. La capa orgánica se separó y se lavó con H20, salmuera, entonces se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró, y se evaporó bajo presión reducida, para dar el producto crudo, el cual se purificó en columna de gel de sílice (EtOAc al 50 por ciento en hexanos), para proporcionar el (#)-1 -(2-((2,5-difluoro-fenil)-(imino)-metil)-hidrazinil)-3,3-dimetil-1 -oxobutan-2-il-carbamato de terbutilo (67 por ciento). Rf = 0.4 (EtOAc al 50 por ciento en hexanos). LC/MS (uplc): MH+ 385.3, 0.65 minutos.

Síntesis de (R)-1 -(3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo El (ft)-1-(2-((2,5-difluoro-fenil)-(imino)-metil)-hidrazinil)-3,3-dimetil-1 -oxobutan-2-il-carbamato de terbutilo (8.35 gramos, 21.7 milimoles) se disolvió en xilenos (200 mililitros). Se equipó una trampa Dean-Stark, y la mezcla de reacción se calentó a 150°C. Una vez que la reacción estuvo completa, la mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente, entonces se dividió entre EtOAc y una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se separó, luego se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03, H20, y salmuera, entonces se secó sobre Na2S04, se filtró, y se evaporó bajo presión reducida, para dar el ( )-1 -(3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo (7.81 gramos, 98 por ciento), el cual se utilizó para el siguiente paso sin mayor purificación. LC/MS (uplc): MH+ 367.2, 0.98 minutos.

Alquilación de (R)-1 -(3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo con bromuro de bencilo A una suspensión agitada de (R)-1 -(3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo (5.89 gramos, 16.1 milimoles), y Cs2C03 (10.5 gramos, 32.2 milimoles) en N,N-dimetil-formamida (46 mililitros, 0.35 M), se le agregó bromuro de bencilo (2.11 mililitros, 17.7 milimoles). Una vez que la capa orgánica se separó y se lavó con H20 y salmuera, entonces se secó sobre Na2S04, se filtró, y se evaporó al vacío, para dar el (R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo. El regioisómero deseado se obtuvo en una columna de gel de sílice (del 0 por ciento al 100 por ciento de EtOAc en hexanos, 3.25 gramos, 44.3 por ciento). La estructura se verificó mediante experimentos de 1H NMR nOe.

Para el isómero deseado, (( )-1 -(1 -bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo): cristales, LC/MS (uplc): MH+ 457.2, 1.36 minutos. 1H NMR (CDCI3, 300 MHz): d 7.78 (m, 1H), 7.29-7.39 (m, 5H), 7.00-7.18 (m, 2H), 5.53 (s, 2H), 5.20 (d, 2H), 4.83 (m, 2H), 1.41 (s, 9 H), 0.91 (s, 9H). Para el isómero indeseado, ((R)-1 -(1 -bencil-5-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-3-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo): aceite incoloro, LC/MS (uplc): MhT 457.2, 1.25 minutos. 1H NMR (CDCI3, 300 MHz): d 7.25 (m, 5H), 7.15 (m, 2H), 7.05 (m, 1H), 5.45 (d, 2H), 5.28 (s, 2H), 4.85 (d, 2H), 1.43 (s, 9H), 0.97 (s, 9H).

Desprotección de (R)-1 -(1 -bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo El (R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo (3.25 gramos, 7.13 mili-moles) se trató con ácido trifluoro-acético (10 mililitros) en CH2CI2 (30 mililitros). Una vez que la reacción estuvo completa, la reacción se concentró al vacío, y entonces se dividió entre EtOAc y una solución acuosa saturada de NaHC03. Los orgánicos se separaron, entonces se lavaron con H20, salmuera, entonces se secaron sobre Na2S04, se filtraron, y se evaporaron bajo presión reducida, para dar la (R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propan-1 -amina, la cual se utilizó directamente para el siguiente paso sin mayor purificación (2.32 gramos, 91 por ciento). LC/MS (uplc): MH+ 357.1, 0.82 minutos.

Alquilación Reductiva A una solución de (R)-1 -(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propan-1 -amina (2.55 gramos, 7.15 mili-moles) en CH2CI2 (59 mililitros), se le agregó el (3ft,4S)-3-fluoro-4-formil-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo crudo (obtenido a partir de 1.4 equivalentes del (3R, 4 )-3-fluoro-4-vinil-pirrolid in-1 -carboxilato de bencilo) en CH2CI2 (10 mililitros), y NaBH(OAc)3 (2.3 gramos, 10.7 milimoles). La mezcla de reacción se agitó luego durante 16 horas a temperatura ambiente. Después de apagarse con una solución acuosa saturada de NaHC03, la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró, y se concentró. El producto crudo de la aminación reductiva estaba contaminado por el producto de alqueno eliminado con HF, el cual no se pudo separar ya sea mediante cromatografía en columna de sílice o bien mediante HPLC de preparación en fase inversa. Por consiguiente, la mezcla cruda (3.0 gramos) se disolvió en acetona y agua (5:1, 120 mililitros). A esta mezcla de reacción se le agregaron N-óxido de 4-metil-morfolina (715 miligramos, 6.1 milimoles), y Os04 (2.15 mililitros de una solución al 4 por ciento en peso/volumen), la cual se agitó luego durante el fin de semana a temperatura ambiente. Después de la remoción de la acetona al vacío, la capa acuosa restante se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró, y se concentró. Se obtuvo el (3R,4R)-3-(((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-am i no)-metil)-4-fluoro-pirrol id i n- -carboxilato de bencilo deseado sobre cromatografía en columna de sílice (del 35 por ciento al 80 por ciento de EtOAc en hexanos, 1.5 gramos, 35 por ciento). LC/MS (uplc) MH+ 592.3, 0.97 minutos.

Alquilación Reductiva A una solución de (ft)-1 -(1 -bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H- 1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propan-1 -amina (2.55 gramos, 7.15 mili-moles) en CH2CI2 (59 mililitros), se le agregó el (3f?,4S)-3-fluoro-4-formil-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo crudo (obtenido a partir de 1.4 equivalentes de (3f?,4f?)-3-fluoro-4-vinil-pirrolidin-1-carboxilato de bencilo) en CH2CI2 (10 mililitros), y NaBH(OAc)3 (2.3 gramos, 10.7 milimoles). La mezcla de reacción se agitó luego durante 16 horas a temperatura ambiente. Después de apagarse con una solución acuosa saturada de NaHC03, la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró, y se concentró. El producto crudo de la aminación reductiva estaba contaminado por el producto de alqueno eliminado con HF, el cual no se pudo separar ya sea mediante cromatografía en columna de sílice o bien mediante HPLC de preparación en fase inversa. Por consiguiente, la mezcla cruda (3.0 gramos) se disolvió en acetona y agua (5:1, 120 mililitros). A esta mezcla de reacción se le agregaron N-óxido de 4-metil-morfolina (715 miligramos, 6.1 milimoles), y Os04 (2.15 mililitros de una solución al 4 por ciento en peso/volumen), la cual se agitó luego durante el fin de semana a temperatura ambiente. Después de la remoción de la acetona al vacío, la capa acuosa restante se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró, y se concentró. Se obtuvo el(3R,4R)-3-(((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-amino)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo deseado sobre cromatografía en columna de sílice (del 35 por ciento al 80 por ciento de EtOAc en hexanos, 1.5 gramos, 35 por ciento). LC/MS (uplc) H+ 592.3, 0.97 minutos.

Preparación de Cloruro de Ácido El ácido (S)-tetrahidrofuran-2-carboxílico (5. 1 g ramos, 44 mi I i-moles) se disolvió con SOCI2 (1 5 mililitros) . La mezcla de reacción se puso a reflujo du rante 30 min utos. Después de remover el material volátil al vacío, se utilizó el cloruro de (S)-tetrahidrofuran-2-carbonilo crudo (6.0 gramos, >99 por ciento) para el siguiente paso.

Formación de Enlace de Amida A una solución de (3R,4f?)-3-(((R)-1 -(1 -bencil-3-(2 , 5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2 ,4-triazol-5-il)-2 ,2-dimetil-propil-amino)-metil)-4-fluoro-pirrolidin- 1 -carboxilato de bencilo (500 milig ramos, 0.845 milimoles) en dicloro-metano (8.5 mililitros, solución 0.1 M) a temperatura ambiente, se le ag regó trietil-amina (236 microlitros, 1 .69 milimoles) . El cloruro de (S)-tetrah idrofuran-2-carbonilo crudo (227 miligramos, 1 .69 milimoles) se agregó entonces por goteo durante 2 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente d urante la noche. La mezcla de reacción se apagó con H20 y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró. Después de que se removieron los materiales orgánicos volátiles al vacío, el (3R,4R)-3-(((S)-N-((R)-1 -(1 -bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-tetrahidrofuran-2-carboxamido)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo deseado se purificó mediante cromatografía en columna por evaporación instantánea (rendimiento: N/A) del 0 por ciento al 100 por ciento de EtOAc en hexanos). LC/MS (uplc): MH+ 690.5, 1.35 minutos.

Desprotección A una solución de (3fi,4ft)-3-(((S)-N-((R)-1 -(1 -bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-tetrahidrofuran-2-carboxamido)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo (583 miligramos, 0.845 milimoles) en EtOAc desgasificado (8 mililitros, solución 0.1 M), se le agregó Pd/C (899 miligramos, 10 por ciento en peso) bajo una atmósfera de N2 anhidro. Después de inundar con gas de hidrógeno, la mezcla de reacción equipada con un globo de gas de hidrógeno se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se filtró a través de un cojín de Celite® que se lavó con EtOAc. El filtrado orgánico volátil se removió al vacío, para dar el producto crudo, el cual se purificó mediante HPLC de preparación en fase inversa. Las fracciones combinadas del producto se neutralizaron con una solución saturada de NaHC03, la cual se extrajo entonces con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró al vacío. El producto seco se disolvió entonces en acetonitrilo y agua (proporción de 1:1), y se liofilizó durante 48 horas. La (S)-N-((R)-1 -(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3S,4f?)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-tetrahidrofuran-2-carboxamida pulverulenta blanca se obtuvo en un 27.9 por ciento de rendimiento (131 miligramos) como la amina libre. 1H NMR (CD3CI, 400 MHz): d 7.82 (1H, m), 7.53 (2H, m), 7.35-7.27 (3H, m), 7.14 (1H, m), 7.06 (1H, m), 6.14 (1H, s), 5.45 (2H, m), 4.85 (2H, m), 4.72 (1H, m), 4.21 (1H, m), 3.97 (1H, m), 3.83 (1H, m), 3.02 (1H, m), 2.80 (1H, m), 2.33-1.80 (6H, m), 1.25 (1H, s), 1.01 (1H, m), 0.99 (9H, s). LC/MS (uplc): MH+ 556.4, 0.99 minutos.

Ejemplo 2 N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2,6-dimetil-morfolin-4-carboxamida Procedimiento Formación de urea A una solución de (3 ?,4/?)-3-(((R)-1 -(3-(2,5-difluoro-fenil)-1 -(3-fluoro-bencil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-amino)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo (110 miligramos, 0.186 milimoles) en dicloro-metano (1.9 mililitros, solución 0.1 M), se le agregó trietil-amina (78 microlítros, 0.558 milimoles), seguida por la adición de fosgeno al 20 por ciento en tolueno (66 miligramos, 0.223 milimoles) a temperatura ambiente. Después de que la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos (LC/MS (uplc): MH+ 654.3, 1.37 minutos para el (3S,4R)-3-((((R)-1 -(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-(cloro-ca rbonil)-amino)-metil)-4-fluoro-pirrol id in-1 -carboxilato de bencilo), se agregó la 2,6-dimetil-morfolina (64 miligramos, 0.558 milimoles), y se calentó a 40°C durante la noche (en un tubo sellado). La mezcla de reacción se apagó con H20 y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con una solución de NaHC03 y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró. Después de que se removieron los materiales orgánicos volátiles al vacío, el producto crudo se purificó mediante HPLC de preparación en fase inversa. Las fracciones combinadas del producto se neutralizaron con una solución saturada de NaHC03, la cual se extrajo entonces con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró al vacío, para proporcionar el (3R,4R)-3-(((2S,6R)-N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-2,6-dimetil-morfolin-4-carboxamido)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo deseado (91 miligramos, 66.7 por ciento, en 2 pasos). LC/MS (uplc): MH+ 733.5, 1.41 minutos.

Desprotección A una solución de (3f?,4R)-3-(((2S,6R)-N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-2,6- dimetil-morfolin-4-carboxamido)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo (91 miligramos, 0.124 milimoles) en etanol desgasificado (12 mililitros, solución 0.1 ), se le agregó Pd/C (2.64 miligramos, 10 por ciento en peso) bajo una atmósfera de N2 anhidro. Después de inundar con gas de hidrógeno, la mezcla de reacción equipada con un globo de gas de hidrógeno se agitó a temperatura ambiente durante 45 minutos. La mezcla de reacción se filtró a través de un cojín de Celite® que se lavó con EtOAc. El filtrado orgánico volátil se removió al vacío, para dar el producto crudo, el cual se purificó mediante HPLC de preparación en fase inversa. Las fracciones combinadas del producto se neutralizaron con una solución saturada de NaHC03, la cual se extrajo entonces con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró al vacío. El producto seco se disolvió entonces en acetonitrilo y agua (proporción de 1:1), y se liofilizó durante 48 horas. La (2S,6ft)-N-((R)-1-(1 -bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3S,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2,6-dimetil-morfolin-4-carboxamida pulverulenta blanca se obtuvo en un 94 por ciento de rendimiento (70 miligramos) como la amina libre. 1H NMR (CD3CI, 300 Hz): d 7.83 (1 H, m), 7.52 (2H, m), 7.34-7.27 (3H, m), 7.08 (1H, m), 7.04 (1H, m), 5.94 (2H, m), 5.41 (1H, s), 3.92-3.62 (3H, m), 3.60-3.45 (3H, m), 3.17-2.58 (3H, m), 2.57-2.37 (1H, m), 2.35-2.04 (2H, m), 1.85 (2H, m), 1.20 (6H, s), 0.9 (1H, m), 0.8 (9H, s). LC/MS (uplc): MH+ 599.5, 1.06 minutos.

Ejemplo 3 N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-benc¡l)-1 H-1 ,2,4-triazol-5- ¡l)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-p¡rrol¡d¡n-3-il)-metil)-2,6-dimetil-morfolin-4-carboxamida Procedimiento Alquilación de (R)-1 -(3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo con bromuro de 3-fluoro-bencilo (para CHIR782903) A una suspensión agitada de ( ?)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo (5.89 gramos, 16.1 milimoles), y Cs2C03 (10.5 gramos, 32.2 milimoles) en N,N-dimetil-formamida (46 mililitros, 0.35 M), se le agregó bromuro de 3-fluoro-bencilo (2.17 mililitros, 17.7 milimoles). Una vez que la reacción estuvo completa, la mezcla se dividió entre EtOAc y H20. La capa orgánica se separó y se lavó con H20, salmuera, entonces se secó sobre Na2S04, se filtró, y se evaporó al vacío, para dar el ( )-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo. El regioisómero menos polar deseado se obtuvo by columna de gel de sílice (del 0 por ciento al 100 por ciento de EtOAc en hexanos, 5.05 gramos, 66.2 por ciento).

Para el isómero deseado de -(3-(2,5-difluoro-fenil)-1 -(3-fluoro-bencil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo: LC/MS (uplc) 475.2, 1.35 minutos. Para el isómero indeseado de (R)-1 -(5-(2,5-difluoro-fenil)-1 -(3-fluoro-benc¡l)-1 H-1,2,4-triazol-3-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo: LC/MS (uplc) MH+ 475.2, 1.24 minutos.

Desprotección de (R)-1 -(1 -bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo (para CHIR782903) El («)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-carbamato de terbutilo (5.05 gramos, 10.7 milimoles) se trató con ácido trifluoro-acético (10 mililitros) en CH2C12 (30 mililitros). Una vez que la reacción estuvo completa, la reacción se concentró al vacío, y entonces se dividió entre EtOAc y una solución acuosa saturada de NaHC03. Los orgánicos se separaron, entonces se lavaron con H20, salmuera, entonces se secaron sobre Na2S04, se filtraron, y se evaporaron bajo presión reducida, para dar la ( )-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propan-1 -amina, la cual se utilizó directamente para el siguiente paso sin mayor purificación (2.55 gramos, 64 por ciento). LC/MS (uplc) MH+ 375.1, 0.83 minutos.

Alquilación Reductiva A una solución de la (f?)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propan-1-amina (2.55 gramos, 6.8 milimoles) en CH2CI2 (58 mililitros), se le agregó el (3R,4S)-3-fluoro-4-formil-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo crudo (obtenido a partir de 1.4 equivalentes de (3f?,4/:?)-3-fluoro-4-vinil-pirrolidin-1-carboxilato de bencilo) en CH2CI2 (10 mililitros), y NaBH(OAc)3 (2.2 gramos, 10.2 milimoles). La mezcla de reacción se agitó luego durante 16 horas a temperatura ambiente. Después de apagarse con una solución acuosa saturada de NaHC03, la mezcla de reacción se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró, y se concentró. El producto crudo de la aminación reductiva estaba contaminado por el producto de alqueno eliminado con HF, el cual no se pudo separar ya sea mediante cromatografía en columna de sílice o bien mediante HPLC de preparación en fase inversa. Por consiguiente, la mezcla cruda (2.89 gramos) se disolvió en acetona y agua (5:1, 120 mililitros). A esta mezcla de reacción se le agregaron N-óxido de 4-metil-morfolina (667 miligramos, 5.7 milimoles), y Os04 (1.51 mililitros de una solución al 4 por ciento en peso/volumen), la cual se agitó luego durante el fin de semana a temperatura ambiente. Después de la remoción de la acetona al vacío, la capa acuosa restante se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con agua y salmuera, se secó sobre Na2S0 anhidro, se filtró, y se concentró. El (3 ,4R)-3-(((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-amino)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo deseado se obtuvo mediante cromatografía en columna de sílice (del 40 por ciento al 90 por ciento de EtOAc en hexanos, 2.16 gramos, 52 por ciento). LC/MS (uplc): MH+ 610.2, 0.99 minutos.

Formación de Urea A una solución de (3f?,4R)-3-(((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil-amino)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo (30 miligramos, 0.049 mili-moles) en dicloro-metano (450 microlitros, solución 0.1 M), se le agregó trietil-amina (20.6 microlitros, 0.148 milimoles), seguida por la adición de fosgeno al 20 por ciento en tolueno (6.2 microlitros, 0.059 milimoles) a temperatura ambiente. Después de que la solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos (LC/MS (uplc): MhT 654.3, 1.37 minutos para el (3S,4f?)-3-((((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-(cloro-carbonil)-amino)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo), se agregó 2,6-dimetil-morfolina (64 miligramos, 0.558 milimoles), y se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se apagó con H20 y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se lavó con una solución de NaHC03 y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró. Después de que se removieron los materiales orgánicos volátiles al vacío, el producto crudo se purificó mediante HPLC de preparación en fase inversa. Las fracciones combinadas del producto se neutralizaron con una solución saturada de NaHC03, la cual se extrajo entonces con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró al vacío, para proporcionar el (3ft,4R)-3-(((2S,6R)-N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1 H-1 ,2,4-tr¡azol-5-M)-2,2-dimetil-propil)-2,6-dimetil-morfolin-4-carboxamido)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo deseado (30 miligramos, 81 por ciento, en 2 pasos). LC/MS (uplc): MH+ 751.5, 1.39 minutos.

Desprotección A una solución de (3R,4fi)-3-(((2S,6R)-N-((R)-1 -(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-2,6-dimetil-morfolin-4-carboxamido)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1-carboxilato de bencilo (35 miligramos, 0.047 milimoles) en etanol desgasificado (10 mililitros, solución 4.7 mM), se le agregó Pd/C (0.99 miligramos, 10 por ciento en peso) bajo una atmósfera de N2 anhidro. Después de inundar con gas de hidrógeno, la mezcla de reacción equipada con un globo de gas de hidrógeno se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se filtró a través de un cojín de Celite® que se lavó con EtOAc. El filtrado orgánico volátil se removió al vacío, para dar el producto crudo, el cual se purificó mediante HPLC de preparación en fase inversa. Las fracciones combinadas del producto se neutralizaron con una solución saturada de NaHC03, la cual se extrajo entonces con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró al vacío. El producto seco se disolvió entonces en acetonitrilo y agua (proporción de 1:1), y se liofilizó durante 48 horas. La (2S,6R)-N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3S,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2,6-dimetil-morfolin-4-carboxamida pulverulenta blanca se obtuvo en un rendimiento del 63 por ciento (18 miligramos) como la amina libre. 1H NMR (CD3CI, 300 MHz): d 7.84 (1H, m), 7.32-6.95 (6H, m), 5.79 (2H, m), 5.36 (1H, s), 4.58 (1H, m), 3.91-3.72 (3H, m), 3.65-3.50 (3H, m), 3.04 (1H, m), 2.97- 2.65 (2H, m), 2.53 (1H, m), 2.36 (1H, m), 2.18 (1H, m), 1.20 (6H, s), 0.9 (1H, m), 0.84 (9H, s). LC/MS (uplc): MH+ 617.5, 1.06 minutos.

Ejemplo 4 (S)-N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2-hidroxi-propanamida Procedimiento Formación de Enlace de Amida A una solución de (3R,4 )-3-(((R)-1 -(1 -bencil-3-(2,5-difluoro-f e n i I ) - 1 H-1 ,2,4-triazol-5-¡l)-2,2-dimetil-propil-amino)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1-carboxilato de bencilo (1.5 gramos, 2.53 milimoles) en dicloro-metano (25 mililitros, solución 0.1 M) a temperatura ambiente, se le agregó trietil-amina (458 microlitros, 3.29 milimoles). Entonces se agregó por goteo acetato de (S)-1 -cloro-1 -oxopropan-2-ilo (416 microlitros, 3.29 milimoles) durante 2 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se apagó con H20 y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró.

Después de que se removieron los materiales orgánicos volátiles al vacío, el (3ft,4R)-3-(((S)-2-acetoxi-N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-propanamido)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo deseado se purificó mediante cromatografía en columna por evaporación instantánea (del 0 por ciento al 100 por ciento de EtOAc en hexanos). LC/MS (uplc): MH+ 706.5, 1.34 minutos.

Desprotección Global A una solución de (3 ,4 )-3-(((S)-2-acetoxi-N-((R)-1 -(1 -bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-propanamido)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1-carboxilato de bencilo (1.78 gramos, 2.53 milimoles) en EtOAc desgasificado (25 mililitros, solución 0.1 M), se le agregó Pd/C (178 miligramos, 10 por ciento en peso) bajo una atmósfera de N2 anhidro. Después de inundar con gas de hidrógeno, la mezcla de reacción equipada con un globo de gas de hidrógeno se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se filtró a través de un cojín de Celite® que se lavó con EtOAc. El filtrado orgánico volátil se removió al vacío, para dar la amina cruda (LC/MS (uplc): H+ 572.4, 1.11 minutos). Entonces, el producto crudo se disolvió en metanol (168 mililitros, solución 0.015 M), seguido por la adición de carbonato de potasio anhidro (3.5 gramos, 25 milimoles). La reacción se agitó luego durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de que el precipitado blanco se removió mediante filtración, el filtrado orgánico se concentró al vacío. El producto crudo se purificó mediante HPLC de preparación en fase inversa. Las fracciones combinadas del producto se neutralizaron con una solución saturada de NaHC03, la cual se extrajo entonces con EtOAc (200 mililitros). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró al vacío. El producto seco se disolvió entonces en acetonitrilo y agua (proporción de 1:1), y se liofilizó durante 48 horas. La (S)-N-((R)-1 -(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3S,4f?)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2-hidroxi-propanamida pulverulenta blanca se obtuvo en un 65.5 por ciento de rendimiento (876 miligramos, en 3 pasos) como la amina libre. 1H NMR (CD3CI, 400 MHz): d 7.82 (1H, m), 7.52 (2H, m), 7.34-7.25 (3H, m), 7.16 (1H, m), 7.07 (1H, m), 6.09 (1H, s), 5.44 (2H, s), 4.61 (2H, m), 4.39 (1H, m), 3.78 (1H, m), 3.60 (1H, m), 2.92 (1H, m), 2.56 (1H, m), 2.16 (2H, m), 1.44 (3H, m), 1.22 (1H, m), 0.99 (9H, s), 0.42 (1H, m). LC/MS (uplc): MH+ 530.3, 1.05 minutos.

Ejemplo 5 (S)-N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1,2,4- triazol-5-il)-2 ,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pi rrolidin-3-il)- metil)-tetrahid rofu ran-2-carboxamida Procedimiento Formación de En lace de Amida A una solución de (3f?,4f?)-3-(((R)-1 -(3-(2 ,5-difluoro-fenil)-1 -(3-fluoro-bencil)-1 H- 1 ,2 ,4-triazol-5-il)-2 ,2-dimetil-propil-amino)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo (500 milig ramos, 0.82 mili-moles) en dicloro-metano (4 mililitros, solución 0.2 M) a temperatura ambiente , se le agregó trietil-amina (229 microlitros, 1 .64 milimoles) . El cloruro de (S)-tetrahidrofu ran-2-carbonilo crudo (221 miligramos, 1 .64 milimoles) se agregó entonces por goteo durante 2 minutos. La solución resultante se agitó a temperatu ra ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se apagó con H20 y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró. Después de que se removieron los materiales orgánicos volátiles al vacío, el (3 ,4R)-3-(((S)-N-((R)- 1 -(3-(2 ,5-difluoro-fenil)-1 -(3-fluoro-bencil)-1 H-1 ,2 ,4-triazol-5-il)-2 ,2-dimetil-propil)-tetrahidrofu ran-2-carboxamido)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo deseado se pu rificó mediante cromatog rafía en columna por evaporación instantánea (rendimiento N/A; del 0 por ciento al 100 por ciento de EtOAc en hexanos) . LC/MS (uplc): M H+ 708.4, 1 .35 minutos.

Desp rotección A una solución de (3R,4ft)-3-(((S)-N-((R)-1 -(3-(2 ,5- difluoro-fenil)-1 -(3-fluoro-bencil)-1 H-1 ,2 ,4-triazol-5-il)-2 ,2-dimetil-propil)-tetrah idrofuran-2-carboxamido)-metil)-4-fluoro-pirrolid i n-1 -carboxilato de bencilo (580 miligramos, 0.82 milimoles) en EtOAc desgasificado (80 mililitros, solución 0.1 M) , se le agregó Pd/C (873 milig ramos, 1 0 por ciento en peso) bajo u na atmósfera de N2 anhidro. Después de inundar con gas de hidrógeno, la mezcla de reacción equipada con un globo de gas de hidrógeno se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se filtró a través de un cojín de Celite® que se lavó con EtOAc. El filtrado orgánico volátil se removió al vacío, para dar el producto crudo, el cual se purificó mediante HPLC de preparación en fase inversa. Las fracciones combinadas del producto se neutralizaron con una solución saturada de NaHC03, la cual se extrajo entonces con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró al vacío. El producto seco se disolvió entonces en acetonitrilo y agua (proporción de 1:1), y se liofilizó durante 48 horas. La (S)-N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3S,4/R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-tetrahidrofuran-2-carboxamida pulverulenta blanca se obtuvo en un 10.4 por ciento de rendimiento (48.9 miligramos) como la amina libre. 1H NMR (CD3CI, 400 MHz): d 7.82 (1H, m), 7.34-7.25 (3H, m), 7.22 (1H, m), 7.15 (1H, m), 7.07 (1H, m), 6.98 (1H, m), 6.10 (1H, s), 5.44 (2H, m), 4.86 (2H, m), 4.19 (1H, m), 3.96 (1H, m), 3.86 (2H, m), 3.05 (1H, m), 3.05 (1H, m), 2.37-1.70 (2H, m), 1.35-1.02 (5H, m), 0.99 (9H, s). LC/MS (uplc): MH+ 574.4, 0.98 minutos.

Ejemplo 6 (S)-N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrol¡din-3-il)-metil)-2-hidroxi-propanamida Formación de En lace de Amida A una solución de (3ft,4R)-3-(((R)-1 -(3-(2 , 5-difluoro-fenil)-1 -(3-fluoro-bencil)-1 H- 1 ,2 ,4-triazol-5-il)-2 ,2-dimetil-propil-amino)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo ( 1 .48 g ramos, 2.43 mili-moles) en dicloro-metano (25 mililitros, solución 0.1 M) a temperatura ambiente, se le agregó trietil-amina (440 microlitros, 3.16 milimoles) . Entonces se ag regó por goteo acetato de (S)-1 -cloro-1 -oxopropan-2-ilo (400 microlitros, 3. 16 milimoles) durante 2 minutos. La solución resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se apagó con H20 y se extrajo con EtOAc. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se filtró. Después de q ue se removieron los materiales orgánicos volátiles al vacío, el (3R,4R)-3-(((S)-2-acetoxi-N-((R)-1 -(3- (2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-propanamido)-metil)-4-fluoro-pirrolidin-1 -carboxilato de bencilo deseado se purificó mediante cromatografía en columna por evaporación instantánea (del 0 por ciento al 100 por ciento de EtOAc en hexanos). LC/MS (uplc) MH+ 724.4, 1.34 minutos.

Desprotección Global A una solución de (3R,4 )-3-(((S)-2-acetoxi-N-((R)-1 -(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propi l)-p ropa na mido)-metil)-4-flu oro-pirro lid i n-1 -carboxilato de bencilo (2.24 gramos, 3.09 milimoles) en EtOAc desgasificado (25 mililitros, solución 0.1 M), se le agregó Pd/C (224 miligramos, 10 por ciento en peso) bajo una atmósfera de N2 anhidro. Después de inundar con gas de hidrógeno, la mezcla de reacción equipada con un globo de gas de hidrógeno se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se filtró a través de un cojín de Celite® que se lavó con EtOAc. El filtrado orgánico volátil se removió al vacío, para dar la amina cruda. Entonces, el producto crudo se disolvió en metanol (200 mililitros, solución 0.015 M), seguido por la adición de carbonato de potasio anhidro (4.2 gramos, 30.9 milimoles). La reacción se agitó luego durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de que el precipitado blanco se removió mediante filtración, el filtrado orgánico se concentró al vacío. El producto crudo se purificó mediante HPLC de preparación en fase inversa. Las fracciones combinadas del producto se neutralizaron con una solución saturada de NaHC03, la cual se extrajo entonces con EtOAc (200 mililitros). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró, y se concentró al vacío. El producto seco se disolvió entonces en acetonitrilo y agua (proporción de 1:1), y se liofilizó durante 48 horas. La (S)-N-((R)-1 -(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3S,4R)-4-fluoro-pirrolid¡n-3-il)-metil)-2-hidroxi-propanamida pulverulenta blanca se obtuvo en un 57 por ciento de rendimiento (962 miligramos, en 3 pasos) como la amina libre. 1H NMR (CD3OD, 400 Hz): d 7.81 (1H, m), 7.40-7.16 (5H, m), 7.06 (1H, m), 6.12 (1H, s), 5.44 (2H, m), 4.77 (2H, m), 3.87 (1H, m), 2.82 (2H, m), 2.28 (1H, m), 2.17 (1H, m), 1.95 (1H, m), 1.43 (3H, m), 1.22 (1H, m), 0.91 (9H, s). LC/MS (uplc): MH+ 548.3, 0.94 minutos.

Ejemplo 7 Ensayo para determinar la actividad de la proteína de huso de cinesina (KSP) Este ejemplo proporciona un ensayo in vitro representativo para determinar la actividad de la proteína de huso de cinesina (KSP) in vitro. Los microtúbulos purificados obtenidos a partir de cerebro bovino se adquirieron en Cytoskeleton I nc. (Denver, Colorado, EUA) . El dominio motor de la proteína de huso de cinesina (KSP) humana (Eg 5, KNSL1 ) se clonó, se expresó, y se purificó hasta una homogeneidad mayor del 95 por ciento. El Biomol Green se adquirió en B IOMOL I nternational L. P . (Plymouth Meeting , Pensilvania , EUA). Los microtúbulos se descongelaron rápidamente a 37°C durante 1 0 minutos antes de hacer la dilución . Los microtúbulos y la proteína motora de la KSP (es decir, el dominio motor de la proteína de h uso de cinesina (KSP)) se diluyeron en el regulador de ensayo (Tris-HCI 20 mM (pH de 7.5) , MgCI2 1 mM , DTT 1 0 mM , y albúmina de suero bovino (BSA) al 0.125 por ciento) hasta una concentración final de 50 microgramos/mililitro de microtúbulos y KSP 3 nM .

A cada pozo de la placa de prueba (placa de media área de 96 pozos) que conten ía 1 .25 microlitros de in h ibidor o del compuesto de prueba en sulfóxido de dimetilo (o sulfóxido de dimetilo solamente en el caso de los controles), se le ag rega ron 25 microlitros de solución de ATP (ATP diluido a una concentración de 250 µ? en el regulador de ensayo) , y 25 microlitros de la solución de microtúbulo/KSP anteriormente mencionada. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas. En seguida de la incubación , se agregaron a cada pozo 65 microlitros de Biomol Green (un tinte basado en verde de malaquita que detecta la liberación del fosfato inorgánico) con Tween 20 al 0.015 por ciento. Las placas se incubaron durante 15 a 20 minutos adicionales, y entonces se determinó la absorbencia a 650 nanómetros utilizando un Espectrofotómetro Molecular Devices. La cantidad de absorbencia a 650 nanómetros correspondió a la cantidad de actividad de proteína de huso de ci nesina (KSP) en las muestras. La I C50 de cada inh ibidor o del compuesto de prueba se determinó entonces basándose en la disminución en la absorbencia a 650 nanómetros en cada concentración , por medio de regresión no lineal utilizando cualqu iera de XLFit para Excel o el software de análisis de datos Prism de Graph Pad Software I nc.

Los compuestos preferidos de la invención tienen una actividad biológica medida por una IC50 de menos de aproximadamente 1 mM en los protocolos de ensayo descritos en el Ejemplo 7, teniendo las modalidades preferidas una actividad biológica de menos de aproximadamente 25 µ ? , teniendo las modalidades particularmente preferidas u na actividad biológica de menos de aproximadamente 1000 nM , y teniendo las modalidades muy preferidas una actividad biológica de menos de aproximadamente 1 00 n M .

La Tabla 1 enlista las estructuras, los valores I C50, los datos de espectrometría de masas, y el tiempo de retención para los ejemplos ilustrativos que representan la presente invención .

Tabla 1 Los compuestos adicionales de la invención se encuentran en la Tabla 2 más adelante. Estos compuestos se prepararon de una manera similar a los descritos anteriormente, e incorporan un grupo alcoxilo en R1. La porción que contiene alcoxilo de estos compuestos se puede hacer como se ilustra en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 8 Metilación del ácido (R)-2-((terbutoxi-carbonil)-amino)-3-hidroxi-3-metil-butanoico A una solución de una suspensión de hidruro de sod io en aceite mineral (al 60 por ciento en peso) (3.86 gramos, 96 milimoles) en tetrahidrofu rano seco (60 mililitros) se le ag regó lentamente ácido ( )-2-((terbutoxi-carbonil)-amino)-3-hidroxi-3-metil-butanoico (7.5 gramos, 32.2 milimoles) en tetrahidrofurano (50 mililitros) a 0°C. Después de agitar durante 1 hora a temperatura ambiente, se agregó yodo-metano (4.31 mililitros, 38.6 milimoles). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después de apagarse con agua, la mezcla de reacción se extrajo con éter. Las capas acuosas se acidificaron a un pH = 3 mediante la adición de HCI 6 N, y entonces se extrajeron con EtOAc. La capa orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró a través de un embudo Buchner, y se concentró, para proporcionar el ácido (R)-2-((terbutox¡-carbon¡l)-amino)-3-metox¡-3-met¡l-butanoico crudo (7 gramos, 28.3 milimoles, 88 por ciento), el cual se utilizó en la reacción del siguiente paso sin purificación. LC/MS (uplc): MH+ 160.1 , 0.68 minutos.

Acilación de 2,5-difluoro-bencimido-hidrazida El ácido (R)-2-((terbutoxi-carbonil)-amino)-3-metoxi-3-metil-butanoico crudo (4 gramos, 16.2 milimoles) se convirtió hasta un anhídrido mixto mediante la adición de Et3N (3.38 mililitros, 24.26 milimoles), y cloro-formato de etilo (1.931 gramos, 17.79 milimoles) en tetrahidrofurano anhidro (32.4 mililitros, 0.5 M) de -5°C a 0°C. La mezcla se agitó a -5°C durante 30 minutos. El sólido resultante se filtró, y se agregó tetrahidrofurano anhidro adicional para lavar el precipitado. La solución de la reacción resultante se agregó entonces a una solución en tetrahidrofurano de 2,5-difluoro-bencimido-hidrazida (2.77 gramos, 16.18 milimoles) a -5°C. Entonces, la reacción se calentó gradualmente a temperatura ambiente, y se agitó durante la noche. Una vez que la reacción estuvo completa, la mezcla se dividió entre EtOAc y H20. La capa orgánica se separó y se lavó con H20, salmuera, entonces se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró, y se evaporó bajo presión reducida, para dar el producto crudo, el cual se purificó en columna de gel de sílice (EtOAc al 50 por ciento en hexanos), para proporcionar el ( ?)-(1 -(2-((2,5-difluoro-fenil)-(imino)-metil)-hidrazinil)-3-metoxi-3-metil-1-oxobutan-2-il)-carbamato de terbutilo (1 gramo, 15 por ciento). LC/MS (uplc): MH+ 401.2, 0.61 minutos.

Síntesis de (S)-(1 -(3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2-metoxi-2-metil-propil)-carbamato de terbutilo El (f?)-1-(2-((2,5-difluoro-fenil)-(imino)-metil)-hidrazinil)-3,3-dimetil-1-oxobutan-2-il-carbamato de terbutilo (1.0 gramos, 2.497 milimoles) se disolvió en xilenos (8 mililitros). Se equipó una trampa Dean-Stark, y la mezcla de reacción se calentó a 160°C. Una vez que la reacción estuvo completa, la mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente, entonces se dividió entre EtOAc y una solución acuosa saturada de NaHC03. La capa orgánica se separó, luego se lavó con una solución acuosa saturada de NaHC03, H20, y salmuera, entonces se secó sobre Na2S0 ) se filtró, y se evaporó bajo presión reducida, para dar el (S)-(1 -(3-(2,5-difluoro-fenil)-1 H- 1 ,2,4-triazol-5-il)-2-metoxi-2-metil-propil)-carbamato de terbutilo (0.97 gramos, 98 por ciento), el cual se utilizó para el siguiente paso sin mayor purificación. LC/MS (uplc): MH* 383.2, 0.9 minutos.

Tabla 2 En seg uida se proporcionan los datos de N MR para los compuestos representativos de este tipo: Ejemplo 9 Inhibición de Proliferación Celular en las Líneas Celulares Tumorales Tratadas con los Inhibidores de la Proteína de Huso de Cinesina (KSP) Las células se colocan en placas de 96 pozos en densidades de aproximadamente 500 células por pozo de una placa de 96 pozos, y se les permite crecer durante 24 horas. Las células entonces se tratan con diferentes concentraciones de los compuestos durante 72 horas. Entonces, se agregan 100 microlitros de solución CelITiter-Glo®. El ensayo CelITiter-Glo® mide la cantidad de ATP presente en el pozo después de lisar las células; el ATP liberado se utiliza en una reacción enzimática que incluye la enzima Luciferasa y su sustrato Luciferina. La cantidad de luz emitida es proporcional a la cantidad de ATP, la cual a su vez es proporcional al número de células vivas en el pozo. (Véase el Catálogo de Productos Promega #G7573, Ensayo de Viabilidad Celular Luminiscente CelITiter-Glo®). Las células se incuban entonces en la oscuridad durante 30 minutos. La cantidad de luminiscencia se determina para cada pozo utilizando un lector de placas Wallac Trilux, la cual se correlaciona con el número de las células por pozo. El número de células viables en los pozos que reciben solamente sulfóxido de dimetilo (0.5 por ciento) sirve como una indicación de la inhibición del 0 por ciento, mientras que los pozos sin células sirven como la inhibición del 100 por ciento del crecimiento celular. La concentración del compuesto que da como resultado una inhibición del crecimiento del 50 por ciento (Gl50) se determina gráficamente a partir de las curvas sigmoidales de respuesta a la dosis de los valores de dosis transformados por el registro (log) contra los conteos de células (porcentaje del control) a las 72 horas de exposición continua al compuesto .

Las líneas celula res utilizadas se enlistan en seg uida .

El ensayo de proliferación celular se lleva a cabo como se describe anteriormente.

Líneas Celulares de Cá ncer Coló 205 - carcinoma de colon RPM I 1640 + 1 0 por ciento de FBS + 1 por ciento de L-glutamina + 1 por ciento de P/S + 1 por ciento de NaPyr.+ Hepes +4.5g/L de Glucosa + 1 por ciento de NaBicarb .

M DA 435- cáncer de mama - alta met EM EM + 1 0 por ciento de suero bovino fetal + 1 por ciento de P/S + 1 por ciento de L-Glutamina + 1 por ciento de N EAA + 1 por ciento de NaPyr + 1 por ciento de vitaminas HCT-1 5 y HCT1 16 - carcinoma de colon RPM I 1 640 + 1 0 por ciento de FBS + 1 por ciento de L-glutamina + 1 por ciento de P/S Líneas Celulares Resistentes a Fármacos KB3.1 - carcinoma epidérmico de colon ; línea celular progen itora Iscove + 1 0 por ciento de FBS + 1 por ciento de L-glutamina + 1 por ciento de P/S KBV1 - línea celular resistente a múltiples fármacos asociada con p-glicoprote ína RPM I 1640 + 1 0 por ciento de FBS + 1 por ciento de L-glutamina + 1 por ciento de P/S + 0.2 microg ramos/mililitro de Vinblastina KB8.5 - línea celular resistente a múltiples fármacos asociada con p-glicoprote ína DM EM + 1 0 por ciento de FBS + 1 por ciento de L-glutamina + 1 por ciento de P/S + 10 nanog ramos/mililitro de Colquicina Los compuestos preferidos de la invención tienen una actividad biológica medida por u na Gl50 de menos de aproximadamente 1 mM en los protocolos de ensayo descritos, teniendo algu nas modalidades una actividad biológica de menos de aproximadamente 25 µ? , teniendo otras modalidades una actividad biológica de menos de aproximadamente 1 000 nM , y teniendo todavía otra modalidad una Gl50 de menos de aproximadamente 1 00 n M .

Ejem plo 10 Protocolo de Ensayo Clonogénico de Agar Blando Las células de cáncer humanas se aplican a una densidad de 3x1 05 células por pozo en u na placa de 6 pozos. Al d ía siguiente, se agrega a cada pozo un compuesto de interés a cierta concentración. Después de 24 y 48 horas de incubación , las célu las se cosechan , se lavan , y se cuentan . Los sig uientes pasos se llevan a cabo utilizando el robot M ultimek 96. Entonces, se aplican 500 célu las viables por pozo a una placa de 96 pozos que se recubre con PoliHema para impedir la unión de las células al fondo del pozo. La agarosa (suministro ai 3 por ciento) se funde, se diluye en un medio calentado, y se agrega a las células hasta una concentración final del 0.5 por ciento. Después de que se solidificó el agar blando, las placas se incuban a 37°C durante 6 d ías. Se ag rega tinte azul Alamar, y las placas se incuban du rante 6 horas adicionales. El cambio se mide en un lector de placas, y se considera que se correlaciona con el número de colonias formadas en agar blando. Una célula cancerosa es capaz de crecer sobre el agar y, por consiguiente, mostrará u n aumento en la densidad óptica. Una lectura de densidad óptica reducida sig nifica q ue se están inhibiendo las células de cáncer. Se contempla que los compuestos de esta invención exhibirán una dismin ución en la densidad óptica .

Claims (37)

1. REIVIN DICACIONES 1 . Un compuesto de la fórmula I en donde: R1 se selecciona a parti r de a lcoxi lo de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono, y -cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono; R2 se selecciona a partir de H , y alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono; R3 representa -pirrolid inilo sustituido por (CH2)o-3 o insustituido; R4 se selecciona a partir de -C (0)-CH2OH , -C(O)-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH (CH3)-OH , -C(0)-morfolinilo insustituido, y -C(0)-morfolinilo sustituido con hasta tres grupos alquilo; R5 se selecciona a partir de bencilo sustituido o insustituido, en donde los sustituyentes se seleccionan a partir de Cl, F, Br, y I ; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta tres átomos de halógeno. 2. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R1 se selecciona a partir de alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono, y -cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono. 3. El compuesto de la reivindicación 1, en donde R es alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono. 4. Un compuesto de la reivindicación 1, en donde: R1 se selecciona a partir de alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono; R2 representa H; R3 representa -pirrolidinilo sustituido por (CH2)i.3; R4 se selecciona a partir de -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH(CH3)-OH, -C(0)-morfolinilo sustituido con hasta tres grupos alquilo; R5 representa bencilo, o bencilo sustituido con hasta dos átomos de flúor; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta dos átomos de halógeno. 5. Un compuesto de la reivindicación 2, en donde: R1 representa terbutilo; R3 representa -(CH2)-fluoro-pirrolidinilo; R4 se selecciona a partir de -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH(CH3)-OH, -C(0)-2,6-dimetil-morfolinilo; R5 representa bencilo, o bencilo sustitu ido con un átomo de flúor; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta dos átomos de flúor. 6. Un compuesto de la reivindicación 4 o de la reivindicación 5, en donde: R3 representa -CH2- 3-fluoro-pirrolidinilo ; y R4 representa -C(0)-2-tetrahidro-furan ilo, -C(0)-CH(CH3)- -C(0)-2 ,6-dimetil-morfolinilo 7. Un compuesto de la reivindicación 6 , en donde: R3 representa : se selecciona a partir de -C(0)-C H (CH3)-OH , y 8. U n compuesto de la reivindicación 7, en donde: R5 representa: R es; 9. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de reivindicaciones anteriores, en donde R4 se selecciona a partir de 10. Un compuesto de la reivindicación 1, seleccionado a partir de: N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R>4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2,6-dimetil-morfolin-4-carboxamida; N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2,6-dimetil-morfolin-4-carboxamida; (S)-N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-tetrahidrofuran-2-carboxamida; (S)-N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R14R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-tetrahidrofuran-2-carboxamida; (S)-N-((R)-1-(3-(2,5-difluoro-fenil)-1-(3-fluoro-bencil)-1H-1,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3RI4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2-hidrox¡-propanamida; y (S)-N-((R)-1-(1-bencil-3-(2,5-difluoro-fenil)-1H-1 ,2,4-triazol-5-il)-2,2-dimetil-propil)-N-(((3R,4R)-4-fluoro-pirrolidin-3-il)-metil)-2-hidroxi-propanamida; y las sales farmacéuticamente aceptables de cualquiera de estos compuestos. 11. Un compuesto de la fórmula I seleccionado a partir de: y las sales farmacéuticamente aceptables de estos compuestos. 1 2. Un compuesto de la fórmula (I I ): en donde: R1 se selecciona a partir de alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono, alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono, y -cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono; R3 representa -pirrolidin ilo sustitu ido por (C H2)o-3 o insustituido, o alqu ilo de 3 a 5 átomos de ca rbono sustituido con hasta tres grupos seleccionados a partir de amino y halógeno; R4 se selecciona a partir de -C(0)-CH2OH , -C(O)-tetrahidro-fu ranilo, -C(0)-CH(CH3)-OH , -C(0)-morfolinilo insustituido, y -C(0)-morfolinilo sustituido con hasta tres grupos alq uilo; R5 se selecciona a partir de bencilo sustituido o insustituido, en donde los sustituyentes se seleccionan a partir de Cl, F, Br, y I ; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta tres átomos de halógeno. 13. El compuesto de la reivindicación 12, en donde: R1 se selecciona a partir de alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono, y cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono; R3 representa -pirrolidinilo sustituido por (CH2)o-3 o -CH2-CH2-CH(NH2)-CH2F; R4 se selecciona a partir de -C(0)-CH2OH, -C(O)-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH(CH3)-OH, -C(0)-morfolinilo insustituido, y -C(0)-morfolinilo sustituido con hasta tres grupos alquilo; R5 se selecciona a partir de bencilo sustituido o insustituido, en donde los sustituyentes se seleccionan a partir de Cl, F, Br, y I; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta tres átomos de halógeno. 14. El compuesto de la reivindicación 12 ó 13, en donde R1 es alquilo de 1 a 4 átomos de carbono sustituido por metoxilo. 15. El compuesto de la reivindicación 14, en donde R1 es 2-metoxi-2-propilo. 16. Un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, en donde: R2 representa H; R3 representa -pirrolidinilo sustituido por (CH2)1.3 o -CH2-CH2-CH(NH2)-CH2F; R4 se selecciona a partir de -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH(CH3)-OH, y -C(0)-morfolin¡lo sustituido con hasta tres grupos alquilo; R5 representa bencilo, o bencilo sustituido con hasta dos átomos de flúor; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta dos átomos de halógeno. 17. Un compuesto de la reivindicación 16, en donde: R1 representa 2-metoxi-2-propilo; R3 representa -(CH2)-fluoro-pirrolidinilo o -CH2-CH2-CH(NH2)-CH2F; R4 se selecciona a partir de -C(0)-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH(CH3)-OH, y -C(0)-2,6-dimetil-morfolinilo; R5 representa bencilo, o bencilo sustituido con un átomo de flúor; y R6 se selecciona a partir de fenilo sustituido con hasta dos átomos de flúor. 18. Un compuesto de la reivindicación 17, en donde: R3 representa -(CH2)i-3-fluoro-pirrolidinilo o -CH2-CH2-CH(NH2)-CH2F; y R4 representa -C(0)-2-tetrahidro-furanilo, -C(0)-CH(CH3)-OH, y -C(0)-2,6-dimetil-morfolinilo. 19. Un compuesto de la reivindicación 18, en donde: R3 representa: se selecciona a partir de -C(0)-CH (CH3)-OH 20. El compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 12 en donde R4 se selecciona a partir de: 141 y y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. 22. Una composición farmacéutica, la cual comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 23. La composición de la reivindicación 22, la cual comprende además cuando menos un agente adicional para el tratamiento de cáncer. 24. La composición de la reivindicación 23, en donde el agente adicional para el tratamiento de cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en irinotecano, topotecano, gemcitabina, imatinib, trastuzumab, 5-fluoro-uracilo, leucovorina, carboplatina, cisplatina, docetaxel, paclitaxel, tezacitabina, ciclofosfamida, alcaloides vinca, antraciclinas, rituximab, y trastuzumab. 25. Un método para el tratamiento de un trastorno mediado, cuando menos en parte, por la proteína de huso de cinesina (KSP) en un paciente mamífero, el cual comprende administrar a un paciente mamífero que necesite dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o composición farmacéutica de cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 26. El método de la reivindicación 25, en donde el trastorno es una enfermedad proliferativa celular. 27. El método de la reivindicación 26, en donde la enfermedad proliferativa celular es cáncer. 28. El método de la reivindicación 27, en donde el cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en cáncer de pulmón y bronquios; próstata; mama; páncreas; colon y recto; tiroides; estómago; hígado y conducto biliar intrahepático; riñon y pelvis renal; vejiga urinaria; cuerpo uterino; cérvix uterino; ovario; mieloma múltiple; esófago; leucemia mielógena aguda; leucemia mielógena crónica; leucemia linfocítica; leucemia mieloide; cerebro; cavidad oral y faringe; laringe; intestino delgado; linfoma no de Hodgkin; melanoma; y adenoma de colon velloso. 29. El método de la reivindicación 28, en donde el agente adicional para el tratamiento de cáncer se selecciona a partir del grupo que consiste en irinotecano, topotecano, gemcitabina, imatinib, trastuzumab, 5-fluoro-uracilo, leucovorina, carboplatina, cisplatina, docetaxel, paclitaxel, tezacitabina, ciclofosfamida, alcaloides vinca, antraciclinas, rituximab, y trastuzumab. 30. Un método para inhibir la proteína de huso de cinesina (KSP) en un paciente mamífero, en donde este método comprende administrar al paciente una cantidad inhibidora de la proteína de huso de cinesina (KSP) efectiva de un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 . 31 . Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , para utilizarse en terapia . 32. El compuesto de la reivindicación 31 , en donde el compuesto es para utilizarse en el tratamiento de u n trastorno proliferativo celular. 33. El compuesto de la reivindicación 32 , en donde el trastorno proliferativo celular es un cáncer seleccionado a partir del grupo que consiste en cáncer de pulmón y bronquios; próstata ; mama ; páncreas; colon y recto; tiroides; estómago; h ígado y conducto biliar intrahepático; riñon y pelvis renal; vejiga urinaria; cuerpo uterino ; cérvix uterino; ovario; mieloma múltiple; esófago; leucemia mielógena aguda; leucemia mielógena crónica ; leucemia linfocítica ; leucemia mieloide; cerebro; cavidad oral y faringe; laringe; intestino delgado; linfoma no de Hodgkin ; melanoma; y adenoma de colon velloso. 34. Un método para hacer una pirrolidina fluorada , el cual comprende hacer reaccionar una pirrolidi na tra ns-3,4-disustituida protegida de la fórmula V: (V) con un reactivo de fluoración , pa ra proporcionar un compuesto de la fórmula VI: (VI) y oxidar el compuesto de la fórmula VI hasta obtener un aldehido de la fórmula VII: en donde PG representa un grupo protector, y R se selecciona a partir de H y un grupo alquilo o arilo opcionalmente sustituido. 35. El método de la reivindicación 34, el cual comprende además la aminación reductiva del compuesto de la fórmula VII con un compuesto de la fórmula la: en donde: R1 se selecciona a partir de alcoxilo de 1 a 6 átomos de carbono-alquilo de 1 a 4 átomos de carbono, alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono , alquilo de cadena ramificada de 3 a 6 átomos de carbono, y -cicloalquilo de 3 a 6 átomos de carbono; R2 se selecciona a partir de H , y alquilo de cadena recta de 1 a 6 átomos de carbono; R5 se selecciona a pa rtir de bencilo sustituido o insustituido, en donde los sustituyentes se seleccionan a partir de Cl, F, Br, y I ; y R6 se selecciona a partir de fen ilo sustituido con hasta tres átomos de halógeno; para proporcionar un compuesto de la fórmula Ib: 36. El método de la reivindicación 34, el cual comprende además sintetizar el compuesto de la fórmula (V) a partir de un epóxido de la fórm ula ( IV) : mediante la abertura del epóxido con un reactivo organometálico de la fórmula: en donde R es H o un grupo alq uilo o arilo opcionalmente sustituido, y M es un grupo metálico seleccionado a partir de Li, MgX, y ZnX, en donde X es un halógeno. 37. El método de la reivindicación 36, en donde el reactivo organometálico es: en donde X es Cl, Br o I . RESUM E N La presente invención proporciona compuestos de triazol de la fórmula I : como se describen adicionalmente en la presente. La invención también proporciona una composición farmacéutica, la cual comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula I , y un método pa ra el tratamiento de un trastorno mediado, cuando menos en parte, por la proteína de huso de cinesina (KSP) en un paciente mamífero, el cual comprende administrar a un paciente mam ífero que necesite d icho tratamiento, una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula I . (l )