MX2012009909A - Cepa bacteriana aislada del genero burkholderia y metabolitos pesticidas del mismo. - Google Patents

Cepa bacteriana aislada del genero burkholderia y metabolitos pesticidas del mismo.

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Pamela MARRONE
Ratnakar Asolkar
Huazhang Huang
Ana Lucia Cordova-Kreylos
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Abstract

La presente invención se refiere a especies de Burkholderia sp sin patogenicidad conocida a vertebrados pero con actividad pesticida (por ejemplo, plantas, insectos, hongos, malezas y nemátodos). También se proporcionan productos naturales derivados de un cultivo de las especies y métodos para controlar las plagas usando los productos naturales.

Description

CEPA BACTERIANA AISLADA DEL GÉNERO BURKHOLDERIA Y METABOLITOS PESTICIDAS DEL MISMO CAMPO DE LA INVENCIÓN Proporcionada en la presente está una especie de Burkholderia sp sin patogenicidad conocida a vertebrados, tales como mamíferos, peces y aves pero actividad pesticida contra plantas, insectos, hongos y nemátodos. También se proporcionan productos naturales derivados de un cultivo de las especies y métodos para controlar la germinación y crecimiento de dicotiledóneas, monocotiledóneas y malezas de juncias, modulando el crecimiento de hongo y controlando placas tales como insectos y nemátodos usando los productos naturales.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los productos naturales son sustancias producidas por microbios, plantas y otros organismos. Los productos naturales microbianos ofrecen una fuente abundante de diversidad química, y existe una larga historia para utilizar productos naturales para propósitos farmacéuticos. Uno de tal compuesto es FR901228 aislado de Chromobacterium y se ha encontrado por ser útil como un agente antibacteriano y agente antitumoral (véase, por ejemplo, Ueda et al., Patente Estadounidense No. 7,396,665).
Sin embargo, metabolitos secundarios producidos por microbios también han sido exitosamente encontrados por tener usos para control de plagas y malezas en aplicaciones agrícolas (véase, por ejemplo, Nakajima et al. 1991 ; Duke et al., 2000; Lydon & Duke, 1999; Gerwick et al., Patente Estadounidense No. 7,393,812). Productos naturales microbianos han sido también exitosamente desarrollados en insecticidas agrícolas (véase, por ejemplo, Salama et al. 1981 ; Thompson et al., 2000; Krieg et al. 1983). Algunas veces, tales productos naturales se han combinado con pesticidas químicas (véase, por ejemplo, Gottlieb, Patente Estadounidense No. 4,808,207).
Burkholderia El género Burkholderia, subdivisión ß de la proteobacteria, comprenden más de 40 especies que inhabitan nichos ecológicos diversos (Compant et al., 2008). Las especies bacterianas en el género Burkholderia son organismos ubicuos en suelo y rizosfera (Coenye and Vandamme, 2003; Parke and Gurian-Sherman, 2001 ). Tradicionalmente, se han conocido como patógenos vegetales, B. cepacia es el primero descubierto e identificado como el patógeno que causa la enfermedad en cebolla (Burkholder, 1950). Varias especies de Burkholderia han desarrollado interacciones benéficas con sus hospederos vegetales (véase, p.ej., Cabballero-Mellado et al., 2004, Chen et al., 2007). Algunas especies de Burkholderia también se han encontrado por ser patógenos humanos oportunistas (véase, p.ej., Cheng and Currie, 2005 y Nierman et al., 2004). Adicionalmente, algunas especies de Burkholderia se han encontrado por tener potencial como productos de biocontrol (véase p.ej., Burkhead et al., 1994; Knudsen et al., 1987; Jansiewicz et al., 1988; Gouge et al., Solicitud de Patente Estadounidense No. 2003/0082147; Parke et al., Patente Estadounidense No. 6,077,505; Casida et al., Patente Estadounidense No. 6,689,357; Jeddeloh et al., WO2001055398; Zhang et al., Patente Estadounidense No. 7,141 ,407). Algunas especies en este género han sido efectivas en bioremedios para descontaminar suelos contaminados o aguas subterráneas (véase, p.ej., Leahy et al. 1996). Además, algunas especies de Burkholderia se han encontrado por secretar una variedad de enzimas extracelulares con actividades proteolíticas, lipolíticas y hemolíticas, así como también toxinas, antibióticos y sideróforos (véase, por ejemplo, Ludovic et al., 2007; Nagamatsu, 2001 ).
Oxazoles, Tlazoles e Indoles Oxazoles, tiazoles e Índoles son ampliamente distribuidos en plantas, algas, esponjas y microorganismos. Un gran número de productos naturales contienen uno o más de las porciones de núcleo oxazol, tiazol e indol de cinco elementos.
Estos productos naturales exhiben un amplio espectro de actividad biológica de valor terapéutico demostrable. Por ejemplo, la bleomicina A (Tomohisa et al.), un fármaco anticancerígeno ampliamente descrito, efectúa la degradación oxidatíva de ADN y usa una porción de bitiazol para enlazar sus secuencias de ADN objetivo (Vanderwall et al., 1997). La Bacitracina ( ing et al., 2002), un antibiótico peptídico que contiene tiazolina, pone en entre dicho la nueva biosíntesís de la pared celular bacteriana por formación de complejos con C55-bactoprenolpirofosfato. El Tiangazol (Kunze et al., 1993) contiene un arreglo en serie de un oxazol y tres tiazolinas y exhibe actividad antiviral (Jansen et al., 1992). Aún otros productos naturales que contienen oxazol/tiazol tales como tiostreptona (Anderson et al., 1970) y GE2270A (Selva et al., 1997) inhiben las etapas de traducción en la síntesis de proteína bacteriana. Más de 1000 alcaloides con el esqueleto indol se han reportado a partir de microorganismos. Un tercio de estos compuestos son péptidos con masas más allá de 500 Da en donde el indol es derivado de triptofano. La variedad estructural de los dos tercios remanentes es superior, y su actividad biológica parece cubrir un intervalo más amplio, que incluye actividad antimicrobiana, antiviral, citotóxica, insecticida, antitrombótica o inhibidora de enzima.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN Proporcionada en la presente está una cepa aislada de una no Burkholderia cepacia, no Burk olderia plantari, no Burkholderia gladioli, Burkholderia sp. la cual tiene las siguientes características: a. Tiene una secuencia de gen de 16S rARN que comprende secuencias delanteras que tienen al menos 50% de identidad a las secuencias expuestas en la SEC ID NO:8, 11 y 12 y una secuencia inversa que tiene al menos 99.5% de identidad con la SEC ID NO:9, 10, 13-15; b. Tiene actividad pesticida, en particular, herbicida, insecticida, fungicida y nematicida; c. Produce al menos uno de los compuestos seleccionados a partir del grupo que consiste de: (i) un compuesto que tiene las siguientes propiedades: (a) un peso molecular de aproximadamente 525-555 como se determina por Cromatografía Líquida/Espectroscopia de Masas (LC/MS); (b) H NMR con valores de 6.22, 5.81 , 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31 , 3.93, 3.22, 3.21 , 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (c) tiene 13C NMR con valores de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51 y (c) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando un gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN); (ii) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos una porción indol, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo éster carboxíiico; al menos 17 carbonos y al menos 3 oxígenos y 2 nitrógenos; (iii) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos una porción bencilo, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo amida; al menos 15 carbonos y al menos 2 oxígenos y 2 nitrógenos; (iv) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos una porción tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco carbonos y al menos ocho oxígenos y un nitrógeno y d. es no patogénico (no infeccioso) a animales vertebrados, tales como mamíferos, aves y peces; e. es susceptible a canamicina, clora nfen icol, ciprofloxacina, piperacilina, imipenem, y una combinación de sulfametoxazol y trimetoprim y f. contiene los ácidos grasos 16:0, ciclo 17:0, 16:0 3- OH, 14:0, ciclo 19:0 UJ8C, 18:0.
En una modalidad particular, la cepa tiene las características de identificación de una cepa de Burkholdena A396 (NRRL Acceso No. B-50319).
Descritos en la presente están compuestos aislados los cuales son opcionalmente obtenibles por derivados de especies de Burkholdena, o alternativamente, organismos capaces de producir estos compuestos que pueden ser usados para controlar varias plagas, particularmente plagas fitopatogénicas en planta, ejemplos de las cuales incluyen pero no se limitan a insectos, nemátodos, bacterias, hongos. Estos compuestos también pueden ser usados como herbicidas.
En particular, los compuestos pesticidas aislados pueden incluir pero no se limitan a: (A) un compuesto que tiene las siguientes propiedades: (i) un peso molecular de aproximadamente 525-555 como se determina por Cromatografía Líquida/Espectroscopia de Masas (LC/MS); (ii) 1H NMR con valores d de 6.22, 5.81 , 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31 , 3.93, 3.22, 3 21 , 3 15, 3.10, 2.69. 2.62, 2.26. 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (iii) tiene 13C NMR con valores d de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51 y (iv) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando un gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN); (B) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos una porción indol, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo éster carboxílico; al menos 17 carbonos y al menos 3 oxígenos y 2 nitrógenos; (C) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos una porción bencilo, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo amida; al menos 15 carbonos y al menos 2 oxígenos y 2 nitrógenos; (D) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos una porción tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco carbonos y al menos ocho oxígenos y un nitrógeno y (E) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, un grupo metileno epóxido, al menos una porción tetrahidropiranosa, al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 carbonos, al menos 8 oxígenos y al menos 1 nitrógeno.
En una modalidad particular, los compuestos aislados pueden incluir pero no se limitan a: (A) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos una porción indol, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido, al menos un grupo éster carboxílico, al menos 17 carbonos, al menos 3 oxígenos y al menos 2 nitrógenos; y los cuales tienen al menos uno de los siguientes: (i) un peso molecular de aproximadamente 275-435; (ii) 1H NMR d valores a 8.44, 8.74, 8.19, 7.47, 7.31 , 3.98, 2.82, 2.33, 1.08; (iii) 13C NMR con valores d de d 163.7, 161.2, 154.8, 136.1 , 129.4, 125.4, 123.5, 123.3, 121.8, 121.5, 111.8, 104.7, 52.2, 37.3, 28.1 , 22.7, 22.7; (iv) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 10-20 minutos en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando agua:acetonitrilo (CH3CN) con un sistema de solvente gradiente y detección UV de 210 nm; (v) bandas de absorción UV a aproximadamente 226, 275, 327 nm.; (B) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos una porción bencilo, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo amida; al menos 15 carbonos y al menos 2 oxígenos, al menos 2 ni-trógenos; y al menos una de las siguientes caracte-rísticas: (i) un peso molecular de aproximadamente 240-290 como se determina por Cromatografía Líquida/Espectroscopia de Masas (LC/MS); (ii) 1H NMR va-lores d a aproximadamente 7.08, 7.06, 6.75, 3.75, 2.56, 2.15, 0.93, 0.93; (iii) 13C NMR con valores de d 158.2, 156.3, 155.5, 132.6, 129.5, 129.5, 127.3, 121.8, 115.2, 115.2, 41.2, 35.3, 26.7, 21.5, 21.5; (iv) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos, en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando un gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) y (v) bandas de absorción UV a aproximadamente 230, 285, 323 nm; (C) un compuesto no epóxido que comprende al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos una porción tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco carbonos, al menos ocho oxígenos y un nitrógeno y al menos una de las siguientes características: (i) un peso molecular de aproximadamente 530-580 como se determina por Cromatografía Líquida/Espectroscopia de Masas (LC/MS); (ii) 1H NMR con valores d de 6.40, 6.39, 6.00, 5.97, 5.67, 5.54, 4.33, 3.77, 3.73, 3.70, 3.59, 3.47, 3.41, 2.44, 2.35, 2.26, 1.97, 1.81 , 1.76, 1.42, 1.37, 1.16, 1.12, 1.04; (iii) 13C NMR con valores de d 173.92, 166.06, 145.06, 138.76, 135.71 , 129.99, 126.20, 123.35, 99.75, 82.20, 78.22, 76.69, 71.23, 70.79, 70.48, 69.84, 60.98, 48.84, 36.89, 33.09, 30.63, 28.55, 25.88, 20.37, 18.11 , 14.90, 12.81 , 9.41 ; (iv) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 7-12 minutos, en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando agua:acetonitrilo (CH3CN) con un sistema de solvente gradiente y detección UV de 210 nm; (v) una fórmula molecular de C2eH4SNOio la cual se determina por interpretación del análisis de datos ESI S y N R; (vi) UV bandas de absorción entre aproximadamente 210-450 nm; (D) un compuesto que comprende (i) al menos un éster, al menos una amida, un grupo metileno epóxido, al menos una porción tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 carbonos, al menos 8 oxígenos y al menos 1 nitrógeno, (ii) 13C NMR con valores d de 174.03, 166.12, 143.63, 137.50, 134.39, 128.70, 126.68, 124.41 , 98.09, 80.75, 76.84, 75.23, 69.87, 69.08, 68.69, 68.60, 48.83, 41.07, 35.45, 31.67, 29.19, 27.12, 24.55, 19.20, 18.95, 13.48, 11.39, 8.04, (iii) una fórmula molecular de C2eH 3N09 y al menos uno de: (i) 1H NMR d valores a aproximadamente 6.41 , 6.40, 6.01 , 5.97, 5.67, 5.55, 4.33, 3.77, 3.75, 3.72, 3.64, 3.59, 3.54, 3.52, 2.44, 2.34, 2.25, 1.96, 1.81 , 1.76, 1.42, 1.38, 1.17, 1.12, 1.04; (ii) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos, en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando un gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN); (iii) banda de absorción de UV entre aproximadamente 210-450 nm y muy particularmente a aproximadamente 234 nm.
En una modalidad más particular, se proporcionan compuestos que incluyen pero no se limitan a: (A) un compuesto que tiene la estructura ##STR001## o una sal pesticídicamente aceptable o estereoisómeros de la misma, en donde M es 1 , 2, 3 ó 4; n es 0, 1 , 2, ó 3; p y q son independientemente 1 ó 2; X es O, NH o NR; R1 , R2 y R3 son los mismos o diferentes e independientemente una porción de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y R es una porción de alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; (B) un compuesto que tiene la estructura ##STR002## ##STR002## en donde X, Y y Z son cada uno independientemente -O, -NR,, o -S, en donde R^ es ~H o alquilo C C10; R1 p R2 y m son cada uno independientemente -H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo y "m" puede ser localizado en cualquier lugar en el anillo oxazol; (C) un compuesto que tiene la estructura ##STR002a## en donde R^ es -H o alquilo C C10; R2 es un alquiléster; (D) un compuesto que tiene la estructura ##STR003## ##STRG03## en donde: X y Y son cada uno independientemente -OH, -NR1( o ~S, en donde es --H o alquilo C1-C10; i , R2 y m. un sustítuyente en el anillo oxazol, son cada uno independientemente -H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
(E) un compuesto que tiene la estructura ##STR003a## (F) un compuesto que tiene la estructura ##STR004a## En donde X, Y y Z son cada uno independientemente -O, -NR, o -S, en donde R es H o alquilo C C 0; Ri, R2, R3, R4, R5. 6. R7. Re. R9. R10. R11. R12. 13 son cada uno independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
(G) un compuesto que tiene la estructura ##STR004b## en donde R2, R3, R4, R5, 6, R7, Re. 9. Rio. Rn, R12. y R13 son cada uno independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo; (H) un compuesto que tiene la estructura ##STR004c## en donde R^ R2, R3, R , R5, R6, R7, Re. R11. son cada uno independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo; (I) un compuesto que tiene la estructura ##STR005## ##STR005## en donde X y Y son cada uno independientemente -OH,— NR1 , o ~S, en donde RL R2 son cada uno independientemente --H, alquilo (por ejemplo, alquilo Ci-C10), alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo; (J) un compuesto que tiene la estructura ##STR006a## En donde X, Y y Z son cada uno independientemente -O, -NR, o -S, en donde R es H o alquilo C Cío', i, R2. R3, R4, R5, Re, R7, Re. R11. R12. y R13 son cada uno independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, hete-roarilo sustituido, heterociclico, heterociclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
En una modalidad muy particular, los compuestos pueden incluir pero no se limitan a (i) templazol A; (ii) templazol B; (iii) templamida A; (iv) templamida B; (v) FR90128; (vi) (vi i i ) ?? ?? ?? (XL) FR901465 También se proporcionan métodos para obtener los compuestos expuestos anteriormente. En particular, el método comprende cultivar la cepa de Burkholderia descrita en la presente y producir el compuesto. Además se proporciona un método para aislar estos compuestos aislando el(los) compuesto(s) producido(s) por la cepa de Burkholderia que comprende aislar compuestos producidos a partir de un sobrenadante de un cultivo de la cepa de Burkholderia.
Además se proporciona una combinación que comprende (a) una primera sustancia seleccionada a partir del grupo que consiste de (i) un cultivo puro, fracción celular o sobrenadante derivado de la cepa de Burkholderia expuesta anteriormente o extracto de la misma para uso opcionalmente como un pesticida; (ii) uno o más de los compuestos expuestos anteriormente (b) opcionalmente una segunda sustancia, en donde la segunda sustancia es un pesticida químico o biológico y (c) opcionalmente al menos uno de un portador, diluyente, tensoactivo, adyuvante o pesticida. En una modalidad particular, la combinación es una composición. En un aspecto relacionado, proporcionada en la presente está una semilla recubierta con la composición.
En un aspecto relacionado, descrito está un método para modular la infestación de plagas en una planta que comprende aplicar a la planta y/o semillas de la misma y/o sustrato usado para hacer crecer la planta y/o un método para modular la emergencia y/o crecimiento, de monocotiledóneas, malezas de dicotiledóneas o juncias que comprende aplicar a la maleza o suelo una cantidad de (I) (a) los compuestos aislados expuestos anteriormente y (b) opcionalmente otra sustancia, en donde la sustancia es un pesticida (por ejemplo, nematicida, herbicida, fungicida, insecticida) o (II) la composición o combinación expuestos anteriormente en una cantidad efectiva para modular infestación de plagas y/o emergencia o crecimiento de monocotiledóneas, malezas de dicotiledóneas o juncias.
En oro aspecto relacionado, se proporciona el uso de las cepas, cultivos, extractos, sobrenadantes, combinaciones, compuestos expuestos anteriormente para modular infestaciones de plagas en una planta que comprende aplicar a la planta y/o semillas de la mismo y/o sustrato usado para hacer crecer la planta y/o un método para modular la emergencia y/o crecimiento de crecimiento de monocotiledóneas, malezas de dicotiledóneas o juncias.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la comparación de la velocidad de crecimiento de Burkholderia A396 a Burkholderia multivorans ATCC 17616.
La Figura 2 muestra el efecto del extracto de Burkholderia A396 en enredadera.
La Figura 3 muestra el efecto del extracto de Burkholderia A396 en bledo.
La Figura 4 muestra el efecto del extracto de Burkholderia A396 en Falso medidor de la col {Tricoplusia ni).
La Figura 5 muestra el efecto del caldo de cultivo de Burkholderia A396 en Gusano soldado de la remolacha {Spodoptera exigua).
La Figura 6 muestra el efecto del caldo de cultivo de Burkholderia A396 en la motilidad de nemátodos juveniles del nodulo de la raíz {Meloidogyne incógnita).
La Figura 7 es una representación esquemática del esquema de purificación para obtener los compuestos templazol y templamida.
La Figura 8 muestra resultados de un ensayo in vitro para probar el efecto fungicida de FR90128 en Botrytis cinérea (izquierda) y Phytophtora sp. (derecha).
La Figura 9 muestra el efecto del caldo de cultivo de Burkholderia A396 en el índice de vesícula promedio (% de control) de raíces de pepino contra Toschka inoculadas con 3000 huevos de Meloidogyne sp. 14 días después de la inoculación y aplicación.
La Figura 10 Efecto del caldo de cultivo de Burkholderia A396 en el índice de vesícula promedio de raíces de pepino contra Toschka inoculadas con 3000 huevos de Meloidogyne sp. 14 días después de la inoculación y aplicación.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Mientras las composiciones y métodos hasta ahora son susceptibles a varias modificaciones y formas alternativas, modalidades ejemplares serán aquí descritas en detalle. Se debe entender, sin embargo, que no se pretende limitar la invención a las formas particulares descritas, sino por el contrario, la invención es para cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que caen dentro del espíritu y alcance de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas.
En donde se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor de intervención, a la décima parte de la unidad del límite inferior a menos que el contexto claramente lo dicte de otro modo, entre el límite superior e inferior de tal intervalo y cualquier otro valor de intervención o declarado en tal intervalo declarado, está incluido aquí. Intervalos más pequeños están también incluidos. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños también están incluidos aquí, sometidos a cualquier límite específicamente excluido en el intervalo declarado.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y específicos usados aquí tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por uno de habilidad ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente también pueden ser usados en la práctica o prueba de la presente invención, los métodos y materiales preferidos son ahora descritos.
Se debe notar que como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "y" y "el", incluyen referencias plurales al menos que el contexto claramente lo dicte de otro modo.
Como se define en la presente, "derivado de" significa directamente aislado u obtenido de una fuente particular o alternativamente que tienen características de identificación de una sustancia u organismo aislado u obtenido de una fuente particular.
Como se define en la presente, un "compuesto aislado" está esencialmente libre de otros compuestos o sustancias, por ejemplo, al menos aproximadamente 20% puro, preferiblemente al menos aproximadamente 40% puro, más preferiblemente aproximadamente 60% puro, aún más preferiblemente aproximadamente 80% puro, muy preferiblemente aproximadamente 90% puro, y aún muy preferiblemente aproximadamente 95% puro, como se determina por métodos analíticos, que incluyen pero no se limitan a métodos cromáticos, métodos electroforéticos.
Como se usa en la presente, el término "alquilo" se refiere a un grupo hidrocarburo de cadena recta o ramificada monovalente que tienen de uno hasta aproximadamente 12 átomos de carbono, que incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, tere-butilo, n-hexilo, y similares.
Como se usa en la presente, "alquilo sustituido" se refiere a grupos alquilo que además portan uno o más sustituyentes seleccionados de hidroxi, alcoxi, mercapto, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, ariloxi, ariloxi sustituido, halógeno, ciano, nitro, amino, amido, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carboxilo, sulfonilo, sulfonamida, sulfurilo, y similares.
Como se usa en la presente, "alquenilo" se refiere a grupos hidrocarbilo de cadena recta o ramificada que tienen uno o más enlaces doble carbono-carbono, y que tienen en el intervalo de aproximadamente 2 hasta 12 átomos de carbono, y "alquenilo sustituido" se refiere a grupos alquenilo que además portan uno o más sustituyentes como se exponen anteriormente.
Como se usa en la presente, "alquinilo" se refiere a grupos hidrocarbilo de cadena recta o ramificada que tienen al menos un triple enlace carbono-carbono, y que tienen en el intervalo de aproximadamente 2 hasta 12 átomos de carbono, y "alquinilo sustituido" se refiere a grupos alquinilo que además portan uno o más sustituyentes como se exponen anteriormente.
Como se usa en la presente, "arilo" se refiere a grupos aromáticos que tienen en el intervalo de 6 hasta 14 átomos de carbono y "arilo sustituido" se refiere a grupos arilo que además portan uno o más sustituyentes como se exponen anteriormente.
Como se usa en la presente, "heteroarilo" se refiere a anillos aromáticos que contienen uno o más heteroátomos (p.ej., N, O, S, o similares) como parte de la estructura del anillo, y que tienen en el intervalo de 3 hasta 14 átomos de carbono y "heteroarilo sustituido" se refiere a grupos heteroarilo que además portan uno o más sustituyentes como se exponen anteriormente.
Como se usa en la presente, "alcoxi" se refiere a la porción --O-alquilo-, en donde alquilo es como se define anteriormente, y "alcoxi sustituido" se refiere a grupos alcoxi que además portan uno o más sustituyentes como se exponen anteriormente.
Como se usa en la presente, "tioalquilo" se refiere a la porción -S-alquilo-, en donde alquilo es como se define anteriormente, y "tioalquilo sustituido" se refiere a grupos tioalquilo que además portan uno o más sustituyentes como se exponen anteriormente.
Como se usa en la presente, "cicloalquilo" se refiere un anillo que contiene grupos alquilo que contienen en el intervalo de aproximadamente 3 hasta 8 átomos de carbono, y "cicloalquilo sustituido" se refiere a grupos cicloalquilo que además portan uno o más sustituyentes como se exponen anteriormente.
Como se usa en la presente, "heterocíclico", se refiere a grupos cíclicos (es decir, que contienen anillos) que contienen uno o más heteroátomos (por ejemplo, N, O, S, o similares) como parte de la estructura del anillo, y que tienen en el intervalo de 3 hasta 14 átomos de carbono y "heterocíclico sustituido" se refiere a grupos heterocíclico que además portan uno o más sustituyentes como se exponen anteriormente.
La cepa de Burkholderia La cepa de Burkholderia expuesta en la presente es un complejo no Burkholderia cepacia, no Burkholderia plantari, no Burkholderia gladioli, Burkholderia sp y no patogénica a vertebrados, tales como aves, mamíferos y peces. Esta cepa puede ser aislada de una muestra de suelo usando procedimientos conocidos en la técnica y descritos por Lorch et al., 1995. La cepa de Burkholderia puede ser aislada de diferentes tipos de medios de crecimiento o suelo. La muestra es entonces plaqueada sobre agar de dextrosa de papa (PDA). Las bacterias son gram negativas, y forman redondas coloreadas de crema opacas, redondas, que cambian a rosa y rosado marrón en color y mucoide o babosas con el tiempo.
Las colonias son aisladas de las placas de agar de dextrosa de papa y seleccionadas por aquellas que tienen características biológicas, genéticas, bioquímicas y/o enzimáticas de la cepa de Burkholderia de la presente invención expuestas en los Ejemplos siguientes. En particular, la cepa de Burkholderia tiene un gen 16S ARNr que comprende una secuencia delantera que es al menos aproximadamente 99.0%, preferiblemente aproximadamente 99.5%, más preferiblemente aproximadamente 99.9% y muy preferiblemente aproximadamente 100% idéntica a las secuencias expuestas en la SEC ID NO: 8, 11 y 12 y una secuencia delantera que es al menos aproximadamente 99.0, preferiblemente aproximadamente 99.5%, más preferiblemente aproxi-madamente 99.9% y muy preferiblemente aproximadamente 100% idéntica a las secuencias expuestas en la SEC ID NO: 9, 10, 13, 14 y 15 como se determina por análisis grupal. Además, como se expone abajo, esta cepa de Burkholderia puede, como se expone abajo, tener actividad pesticida, particularmente, virucida, herbicida, germicida, fungicida, nematicida, bactericida e insecticida y más particularmente, actividad herbicida, insecticida, fungicida y nematicida. No es patogénica a animales vertebrados, tales como mamíferos, aves y peces.
Adicionalmente, la cepa de Burkholderia produce al menos los compuestos pesticidas expuestos en la presente descripción.
La cepa de Burkholderia es susceptible a cánamicina, cloranfenicol, ciprofloxacina, piperacilina, imipenem, y una combinación de sulfametoxazol y trimetoprim y contiene los ácidos grasos 16:0, ciclo 17:0, 16:0 3- OH, 14:0, ciclo 19:0, 18:0.
Esta cepa de Burkholderia se puede obtener cultivando un microorganismo que tiene las características de identificación of Burkholderia A396 (NRRL Acceso No. B-50319) en Agar de Dextrosa de Papa (PDA) o en un medio de fermentación que contiene fuentes de carbono definidas tales como glucosa, maltosa, fructuosa, galactosa, y fuentes de nitrógeno no definidas tales como peptona, triptona, soytona y amina NZ.
Compuestos Pesticidas El compuesto pesticida descrito en la presente puede tener las siguientes propiedades: (a) es obtenible de una nueva especié de Burkholderia, p.ej., A396; (b) es, en particular, tóxico a plagas de insectos agrícolas muy comunes; (c) tiene un peso molecular de aproximadamente 525-555 y más particularmente, 540 como se determina por Cromatografía Líquida/Espectroscopia de Masas (LC/MS); (d) tiene 1H NMR con valores de 6.22, 5.81 , 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31 , 3.93, 3.22, 3.21 , 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (d) tiene 13C NMR con valores de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51 (e) tiene un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, más específicamente aproximadamente 12 minutos y aún más específicamente aproximadamente 12.14 min en una columna de HPLC C-18 de fase inversa (Phenomenex, Luna 5µ C18 (2) 100A, 100 x 4.60 mm) usando agua:acetonitrilo (CH3CN) con un sistema de solvente gradiente (0-20 min 90-0% CH3CN acuoso, 20-24 min 100% CH3CN, 24-27 min, 0-90% CH3CN acuoso, 27-30 min 90% CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0.5 mUmin y detección UV de 210 nm (f) tiene una fórmula molecular, C24H36N406S2, la cual es determinada por interpretación de datos 1 H, 13C NMR y LC/MS (g) un espectro 13C NMR con señales para los 24 carbonos, que incluyen 5 metilo, 4 metileno, 9 metina, y 6 carbonos cuaternarios y (g) espectro de 1H NMR que despliega características de un depsipéptído típico, que ilustra tres protones amino [4.63, 4.31 , 3.93], y un protón éster carbinol [5.69]. En una modalidad particular, el compuesto tiene la estructura ##STR001##: o una sal pesticídicamente aceptable o estereoisómeros de la misma, en donde M es 1 , 2, 3 ó 4; n es 0, 1 , 2, ó 3; p y q son independientemente 1 ó 2; X es O, NH o NR; R1 , R2 y R3 son los mismos o diferentes e independientemente una porción de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y R es una porción de alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior.
En una modalidad aún más particular, el compuesto tiene la estructura de FR90128: Proporcionada con esta están compuestos expuestos en ##STR002##: en donde: X, Y y Z son cada uno independientemente -O, -NR^ o -S, en donde R, es -H o alquilo C†-Cm Ri, R2 y m son cada uno independientemente— H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclico, heterociclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
En aún otra modalidad particular. Los compuestos de la Familia ##STR002## pueden ser los compuestos expuestos en (vi)-(xix).
IX) Ixix) Estos son de ya sea materiales o compuestos naturales obtenidos de fuentes comerciales o por síntesis química. Las fuentes naturales de los compuestos de la Familia ##STR002## incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, algas y esponjas. En una modalidad más particular, microorganismos los cuales incluyen los com-puestos de la Familia ##STR002## incluyen pero no se li-mitan a, o alternativamente, los compuestos de la Familia ##STR002## se pueden derivar de especies tales como Streptoverticillium waksmanii (compuesto vi) (Umehara, et al., 1984), Streptomyces pimprina (compuesto vii) (Naiket al., 2001), Streptoverticillium olivoreticuli (compuestos viii, ix, x) (Koyama Y., et al., 1981 ), Streptomyces sp (compuestos xi, xii) (Watabeet al., 1988), Pseudomonas syringae (compuestos xiii, xiv) (Pettit et al., 2002). Los compuestos de la Familia ##STR002## se pueden derivar de algas que incluyen pero no se limitan a algas rojas (compuesto xv) (N'Diaye, et al., 1996), algas rojas Martensia fragilis (compuesto xvi) (Takahashi S. et al., 1998), Diazona chinensis (compuestos xvii & xviii) (Lindquist N. et al., 1991 ), Rhodophycota haraldiophyllum sp (compuesto xix) (Guella et al.. 1994).
También se proporciona ##STR003##: en donde: X y Y son cada uno independientemente -OH, -IMR^ o --S, en donde Ri es -H o alquilo C1-C10; R1. R? y m, un sustituyente en el anillo oxazol, son cada uno independientemente -H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
Además se proporciona ##STR005##: en donde X y Y son cada uno independientemente --OH,— NR1 p o -S, en donde R1 F R2 son cada uno independientemente ~H, alquilo (por ejemplo, alquilo C-,-Cw), alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hídroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
En una modalidad particular, compuestos de la Familia ##STR005## tales como compuestos de xx-xxiii expuestos abajo se pueden derivar de fuentes naturales o comerciales o por síntesis química.
(XX) ( xii) Fuentes naturales de compuestos de la Familia ##STR005## incluyen, pero no se limitan a plantas, corales, microorganismos, y esponjas. Los microorganismos incluyen, pero no se limitan a Streptomyces griseus (compuesto xx) (Hirota et al., 1978), Streptomyces albus (compuesto xxi) (Werner et al., 1980). Los compuestos de la Familia STR004 se pueden derivar de algas que incluyen pero no se limitan a Haraldiophyllum sp (compuesto xxii (Guella et al., 2006), y algas rojas (compuesto xxiii) (N'Diaye et al., 1994).
En una modalidad, el compuesto se puede derivar de o es obtenible de un microorganismo, y en particular de especies de Burkholderia y caracterizar porque tiene una estructura que comprende al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos una porción tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco carbonos y al menos ocho oxígenos y un nitrógeno. El compuesto además comprende al menos una de las siguientes características: (a) propiedades pesticidas y en particular, propiedades nematicida, fungicida, insecticida y herbicida; (b) un peso molecular de aproximadamente 530-580 y más particularmente, 555 como se determina por Cromatografía Líquida/Espectroscopia de Masas (LC/MS); (c) 1H NMR con valores de d 6.40, 6.39, 6.00, 5.97, 5.67, 5.54, 4.33, 3.77, 3.73, 3.70, 3.59, 3.47, 3.41 , 2.44. 2.35, 2.26, 1.97, 1.81 , 1.76, 1.42, 1.37, 1.16, 1.12, 1.04; (d) 13C N R con valores de d 173.92, 166.06, 145.06, 138.76, 35.71 , 129.99, 126.20, 123.35, 99.75, 82.20, 78.22, 76.69, 71.23, 70.79, 70.48, 69.84, 60.98, 48.84, 36.89, 33.09, 30.63, 28.55, 25.88, 20.37, 18.11 , 14.90, 12.81 , 9.41 ; (e) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 7-12 minutos, más específicamente aproximadamente 10 minutos y aún más específicamente aproximadamente 10.98 min en una columna de HPLC C-18 de fase inversa (Phenomenex, Luna 5µ C18(2) 100 A, 100 x 4.60 mm) usando agua:acetonitr¡lo (CH3CN) con un sistema de solvente gradiente (0-20 min; 90-0% CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% CH3CN, 24-27 min; 0-90% CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0.5 mL/min y detección UV de 210 nm; (f) espectro 13C NMR el cual exhibe 28 señales de carbono discretas las cuales pueden ser atribuidas a seis metilos, cuatro carbonos metileno, y trece metinas que incluyen cinco sp2, cuatro carbonos cuaternarios; (g) una fórmula molecular de C28H 5 O10 la cual se determina por interpretación del análisis de datos ESI S y NMR; (h) bandas de absorción UV entre aproximadamente 210-450 nm y muy particularmente a aproximadamente 234 nm.
También se proporcionan compuestos que tienen la estructura ##STR004a##: En donde X, Y y Z son cada uno independientemente -O, -NR, o -S, en donde R es H o alquilo C^-Ci0; Ri , R2, R3. R4, R5, R6. R7, Re, R9. R10. R11. R12, y 13 son cada uno independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterociclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
En una modalidad particular, el compuesto tiene la estructura expuesta en ##STR004b##: en donde R^ R2, R3- R4, R5, 6. R7, Re. R9, R10. Rn> R12. y 13 son como se definen previamente para ##STR004a##.
En una modalidad más particular, el compuesto es Templamida A con la siguiente estructura: Templamida A En otra modalidad, se proporciona un compuesto que tiene formula ##STR004c##: En donde R2, R3, R4, R5, Re, R7, R», y R11 son como se definen previamente para ##STR004a##.
En otra modalidad, se proporciona un compuesto el cual se puede derivar de especies de Burkholderia y caracterizar porque tiene una estructura que comprende al menos un éster, al menos una amida, un grupo metileno epóxido, al menos una porción tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 carbonos y al menos 8 oxígenos y 1 nitrógeno, y actividad pesticida. El compuesto además comprende al menos una de las siguientes características: (a) propiedades pesticidas y en particular, propiedades insecticida, fungicida, nematocida y herbicida; (b) un peso molecular de aproximadamente 520-560 y particularmente 537 como se determina por Cromatografía Líquida/Espectroscopia de Masas (LC/MS); (c) 1 H NMR d valores a aproximadamente 6.41 , 6.40, 6.01 , 5.97, 5.67, 5.55, 4.33, 3.77, 3.75, 3.72, 3.64, 3.59, 3.54, 3.52, 2.44, 2.34, 2.25, 1.96, 1.81 , 1 .76, 1.42, 1.38, 1.17, 1.12, 1.04; (d) 3C NMR con valores de d 174.03, 166.12, 143.63, 137.50, 134.39, 128.70, 126.68, 124.41 , 98.09, 80.75, 76.84, 75.23, 69.87, 69.08, 68.69, 68.60, 48.83, 41.07, 35.45, 31 .67, 29.19, 27.12, 24.55, 19.20, 18.95, 13.48, 11.39, 8.04; (e) Tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos, más específicamente aproximadamente 8 minutos en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando un gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN), particularmente, un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 8-15 minutos, más específicamente aproximadamente 11 minutos y aún más específicamente aproximadamente 11.73 min en una columna de HPLC C-18 de fase inversa (Phenomenex, Luna 5µ C18(2) 100 A, 100 x 4.60 mm) usando agua:acetonitrilo (CH3CN) con un sistema de solvente gradiente (0-20 min; 90-0 % CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% CH3CN, 24-27 min; 0-90 % CH3CN acuoso, 27-30 min; 90 % CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0.5 mL/min y detección UV de 210 nm; (f) una fórmula molecular de C28H43 09 la cual se determina por interpretación del análisis de datos ESIMS y NMR; (g) banda de absorción de UV a aproximadamente 210-450 nm y muy particularmente a aproximadamente 234 nm.
En una modalidad particular, el compuesto tiene la estructura ##STR006a##: En donde X, Y y Z son cada uno independientemente -O, -NR, o -S, en donde R es H o alquilo C C10; R-i, R?, R3. F¾. R5. f¾. R7. Re. R11. R12. y 13 son cada uno independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
En una modalidad particular, el compuesto tiene la estructura: TemplamidaA En otra modalidad, se proporciona un compuesto que tiene formula ##STR006b##: En donde 1, R2, R3, R4, R5, Re, R7, Re. R11 son como se definen previamente para ##STR006a##. En una modalidad más particular, el compuesto es Templamida B con la siguiente estructura: Templamida B En. todavía otra modalidad particular, el compuesto se pueden derivar de especies de Burkholderia y caracterizar porque tiene una estructura que comprende al menos un éster, al menos una amida, un grupo metileno epóxido, al menos una porción tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 carbonos y al menos 8 oxígenos y al menos 1 nitrógeno. El compuesto además comprende al menos una de las siguientes características: (a) propiedades pesticidas y en particular, propiedades insecticida, fungicida, nematicida y herbicida; (b) un peso molecular de aproximadamente 510-550 y particularmente aproximadamente 523 como se determina por Cromatografía Líquida/Espectroscopia de Masas (LC/MS); (c) 1H N R valores d a aproximadamente 6.41 , 6.40, 6.01 , 5.98, 5.68, 5.56, 4.33, 3.77, 3.75, 3.72, 3.65, 3.59, 3.55, 3.50, 2.44, 2.26, 2.04, 1.96, 1.81 , 1.75, 1.37, 1.17, 1.04; (d) 13C NMR con valores d de 172.22, 167.55, 144.98, 138.94, 135.84, 130.14, 125.85, 123.37, 99.54, 82.19, 78.28, 76.69, 71.31 , 70.13, 69.68, 48.83, 42.52, 36.89, 33.11 , 30.63, 25.99, 21.20, 20.38, 18.14, 14.93, 12.84; (e) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos, más específicamente aproximadamente 8 minutos en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando un gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN), particularmente, un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 8-15 minutos, más específicamente aproximadamente 10 minutos y aún más específicamente aproximadamente 10.98 min en una columna de HPLC C-18 de fase inversa (Phenomenex, Luna 5µ C18(2) 100 A, 100 x 4.60 mm) usando agua:acetonitrilo (CH3CN) con un sistema de solvente gradiente (0-20 min; 90-0% CH3CN acuoso, 20-24 min; 100% CH3CN, 24-27 min; 0-90% CH3CN acuoso, 27-30 min; 90% CH3CN acuoso) a velocidad de flujo de 0.5 mL/min y detección UV de 210 nm; (f) una fórmula molecular de C27H4 09 la cual se determina por interpretación del análisis de datos ESIMS y NMR; (g) banda de absorción de UV a aproximadamente 210-450 nm y muy particularmente a aproximadamente 234 nm.
En una modalidad más particular, el compuesto es un compuesto conocido FR901465 el cual se aisló anteriormente del caldo de cultivo de una bacteria de Pseudomonas sp. No. 2663 (Nakajima et al. 1996) y se ha reportado por tener actividad anticancerígena con la siguiente estructura: F 901 65 En aún otra modalidad particular, compuestos de la Familia ##STR006a## pueden ser los compuestos expuestos en xxiv a xxxix. Son de ya sea materiales naturales o compuestos obtenidos de fuentes comerciales o por síntesis química. Fuentes naturales de compuestos de la Familia ##STR006a## incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, algas y esponjas. En una modalidad más particular, microorganismos los cuales incluyen los compuestos de la Familia ##STR006a## los cuales se pueden derivar de especies tales como Pseudomonas sp. No. 2663 (compuestos xxiv-xxvi) (Nakajima et al., 1996). Los análogos sintéticos de FR901464 (xxvii-xxxix) los cuales han sido sintetizados y patentados como Composiciones Un cultivo sustancialmente puro, fracción celular o sobrenadante y compuestos producidos por la cepa de Burkholderia de la presente invención, pueden ser formulados en composiciones pesticidas.
Las sustancias expuestas anteriormente pueden ser formuladas en cualquier manera. Ejemplos de formulación no limitantes incluyen pero no se limitan a concentrados emulsificables (EC), polvos humectables (WP), líquidos solubles (SL), aerosoles, soluciones de concentrados de ultra bajo volumen (ULV), polvos solubles (SP), microencapsulación, granulos dispersados en agua, fluibles (FL), microemulsiones (ME), nano-emulsiones (NE), etc. En particular, el concentrado, polvos, gránulos y emulsiones pueden ser secados por congelamiento. En cualquier formulación descrita en la presente, el porcentaje del ingrediente activo está dentro de un intervalo de 0.01% a 99.99%.
Las composiciones pueden estar en la forma de un líquido, gel o sólido. Composiciones líquidas comprenden compuestos pesticidas derivados de la cepa de Burkholderia, por ejemplo, una cepa que tienen las características de identificación de Burkholderia A396 (NRRL Acceso No. B-50319).
Una composición sólida se puede preparar suspendiendo un portador sólido en una solución de compuestos pesticidas y secando la suspensión bajo condiciones leves, tales como evaporación a temperatura ambiente o evaporación a vacío a 65°C o menos.
Una composición de la invención puede comprender compuestos encapsulados en gel derivados de la cepa de Burkholderia de la presente invención. Tales materiales encapsulados en gel se pueden preparar mezclando un agente que forma gel (por ejemplo, gelatina, celulosa o lignina) con una solución de compuestos pesticidas usados en el método de la invención; e induciendo la formación de gel del agente.
La composición puede comprender adicionalmente un tensoactivo a ser usado para el propósito de emulsificación, dispersión, humectación, dispersión, integración, desintegración, control, estabilización de ingredientes activos, y mejoramiento de fluidez o inhibición de moho. En una modalidad particular, el tensoactivo es un tensoactivo no iónico no fitotóxico el cual preferiblemente pertenece al EPA Lista 4B. En otra modalidad particular, el tensoactivo no iónico es monolaurato de polioxietileno (20). La concentración de tensoactivos puede variar entre 0.1-35% de la formulación total, el intervalo preferido es 5-25%. La elección de agentes emulsificantes y de dispersión, tales como agentes emulsificantes y dispersantes no iónicos, aniónicos, anfotéricos y catiónicos, y la cantidad empleada, se determina por la naturaleza de la composición y la capacidad del agente para facilitar la dispersión de estas composiciones.
La composición puede comprender además otros microorganismos y/o pesticidas (por ejemplo nematicida, fungicida, insecticida). El microorganismo puede incluir pero no se limita a un agente derivado de Bacillus sp., Pseudomonas sp., Brevabacillus sp., Lecanicillium sp., no Ampelomyces sp., Pseudozyma sp., Streptomyces sp, Burkholderia sp, Trichoderma sp, Gliocladium sp. Alternativamente, el agente puede ser un producto de aceite o aceite natural que tiene actividad fungicida y/o insecticida (por ejemplo, aceite parafínico, aceite del árbol del té, aceite de zacate limón, aceite de clavo, aceite de canela, aceite de cítricos, aceite de romero).
La composición, en particular, puede comprender además un insecticida. El insecticida puede incluir pero no se limita a avermectina, Bacillus thuríngiensis, aceite de neem y azadiractina, espinosad, Chromobacterium subtsugae, extracto de euca-lipto, bacteria entomopatogénica u hongo tal como Beauveria ba-ssiana, y Metarrhizium anisopliae e insecticidas químicas que incluyen pero no se limitan a compuestos organoclorados, compuestos organofosforosos, carbamatos, piretroides, y neonicotinoides.
La composición puede comprender además un nematicida. El nematicida puede incluir, pero no se limita a nematicidas químicos tales como fenamifos, aldícarb, oxamilo, carbofurano, nematicida de producto natural, avermectina, los hongos Paecilomyces ¡Hacinas y Muscodor spp., las bacterias Bacillus firmus y otros Bacillus spp. y Pasteuria penetrans.
La composición puede comprender además un biofungícida tal como extracto de R. sachalinensis (Regalía) o un fungicida. Tales fungicidas incluyen, pero no se limitan a, un agente anti-fúngico de sitio único el cual puede incluir pero no se limita a bencimidazol, un inhibidor de desmetilación (D I) (por ejemplo, imidazol, piperazina, pirimídina, triazol), morfolina, hidroxipirímidina, anilinopirimidina, fosforotiolato, inhibidor exterior de quinona, quinolina, dicarboximida, carboximida, fenilamida, anilinopirimidina, fenilpirrol, hidrocarburo aromático, ácido cinámico, hidroxianilída, antibiótico, polioxína, acilamina, ftalimida, benzenoide (xililalanina). En aún una modalidad adicional, el agente antifúngíco es un inhibidor de desmetilación seleccionado a partir del grupo que consiste de imidazol (p.ej., triflumizol), piperazina, pirimídina y triazol (por ejemplo, bítertanol, miclobutanilo, penconazol, propiconazol, triadimefon, bromuconazol, ciproconazol, diniconazol, fenbuconazol, hexaconazol, tebuconazol, tetraconazol, propiconazol).
El agente antímicrobiano también puede ser un fungicida química, de sitio múltiple no inorgánico, seleccionado a partir del grupo que consiste de un nitrito (p.ej., cloronitrilo o fludioxonilo), quinoxalina, sul-famida, fosfonato, fosfito, ditiocarbamato, cloralquiltio, fenilpiridin-amina, oxima de cianoacetamida.
Las composiciones se pueden aplicar usando métodos conocidos en la técnica. Específicamente, estas composiciones se pueden aplicar a plantas o partes de plantas. Las plantas se entienden por significar en el presente contexto todas las plantas y poblaciones de plantas tales como plantas de cultivo o plantas silvestres deseadas e indeseadas (que incluyen plantas de cultivo que se originan naturalmente). Las plantas de cultivo pueden ser plantas las cuales se pueden obtener por reproducción vegetal convencional y métodos de optimización o por métodos de ingeniería genética y biotecnológica o combinaciones de estos métodos, que incluyen las plantas transgénicas y que incluyen los cultivares vegetales protegidos o no protegidos por derechos de reproductores de plantas. Las partes vegetales se entienden por significar todas las partes y órganos de plantas arriba y abajo de la tierra, tales como brotes, hojas, flores y raíces, ejemplos los cuales pueden ser mencionados son hojas, acículas, tallos, troncos, flores, órganos fructíferos, frutos, semillas, raíces, tubérculos y rizomas. Las partes vegetales también incluyen material cosechado y material de propagación vegetativo y generativo, p.ej. esquejes, tubérculos, rizomas, retoños y semillas.
El tratamiento de las plantas y partes vegetales con las composiciones expuestas anteriormente se puede llevar a cabo directamente o permitiendo a las composiciones actuar en sus alrededores, hábitats o espacio de almacenaje mediante, por ejemplo, inmersión, atomización, evaporación, neblina, dispersión, pintura en, inyección. En el caso de que la composición se aplique a una semilla, la composición puede ser aplicada a la semilla como uno o más recubrimientos previo a plantar la semilla usando uno o más recubrimientos usando métodos conocidos en la técnica.
Como se indicó anteriormente, las composiciones pueden ser composiciones herbicidas. La composición puede comprender además uno o más herbicidas. Estos pueden incluir, pero no se limitan a, un bioherbicida y/o un herbicida químico. El bioherbicida puede ser seleccionado a partir del grupo que consiste de clavo, canela, zacate limón, aceites cítricos, aceite de cascara de naranja, tentoxina, cornexistina, toxina AAL, leptospermona, taxtomina, sarmentina, momilactona B, sorgoleona, ascaulatoxina y ascaulatoxina aglicona. El herbicida químico puede incluir, pero no se limita a, diflufenzopir y sales de los mismos, topramezona, tembotriona, S-metolaclor, atrazina, mesotriona, primisulfuron-metilo, ácido 2,4-diclorofenoxiacético, nicosulfurona, tifensulfuron-metilo, asulam, metribuzina, diclofop-metilo, fluazifop, fenoxaprop-p-etilo, asulam, oxifluorfeno, rimsulfuron, mecoprop, y quinclorac, tiobencarb, clomazona, cihalofop, propanilo, bensulfuron-metilo, penoxsulam, triclopir, imazetapir, halosulfuron-metilo, pendimetalina, biespiribac-sódico, carfentrazonetilo, bentazon sódico/acifluorfen sódico, glifosato, glufosinato y ortosulfamurona.
Las composiciones herbicidas pueden ser aplicadas en forma sólida o líquida como formulaciones pre-emergencia o post-emergencia.
Para formulaciones secas pre-emergencia, el tamaño del gránulo del portador es típicamente 1-2 mm (diámetro) pero los granulos pueden ser ya sea más pequeño o más grande dependiendo de la cobertura de tierra requerida. Los granulos pueden comprender partículas porosas o no porosas.
Para formulaciones post-emergencias, los componentes de formulación usados pueden contener arcillas esmectitas, arcillas atapulgitas y arcillas de expansión similares, espesantes tales como gomas de xantano, goma arábiga y otros espesantes de polisacárido así como también estabilizadores de dispersión tales como tensoactivos no iónicos (por ejemplo monolaurato de polioxietileno (20).
Usos Las composiciones y compuestos pesticidas derivados de la cepa de Burkholderia expuesta en la presente se pueden usar como pesticidas, particularmente como insecticidas, nematicidas, fungicidas y herbicidas.
Específicamente, los nemátodos que pueden ser controlados usando los métodos expuestos anteriormente incluyen pero no se limitan a nemátodos parasíticos tales como nemátodos nodulares de la raíz, anulares, picadura, lanza, quiste y lesión, que incluyen pero no se limitan a Meloidogyne, Heterodera y Globodera spp; particularmente Meloidogyne incógnita (nemátodos nodulares de la raíz), así como también Globodera rostochiensis y globodera pailida (nemátodos de quiste de papa); Heterodera glycines (nemátodo de quiste de soya); Heterodera schachtii (nemátodo de quiste de remolacha); y Heterodera avenae (nemátodo de quiste de cereal).
Insecto fitopatogénicos controlados por el método de la presente invención incluyen pero no se limitan a insectos del orden (a) Lepidoptera, p.ej., Aclerís spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp., Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochyiis spp., Coleophora spp., Crocidolomia binotalis, Cryptophiebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Earias spp., Ephestia spp., Eucosma spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantría spp., Lyonetia spp., Malacosoma spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia nubilalis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Ftorimaea operculella, Pieris rapae, Piéris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni y Yponomeuta spp.; (b) Coleóptera, por ejemplo, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Diabrotica spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp-, Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. y Trogoderma spp.; (c) Ortóptera, por ejemplo, Blatta spp., Blattella spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta spp. y Schistocerca spp.; (d) esóptera, por ejemplo, Reticulitermes spp.; (e) Psocóptera, por ejemplo, Liposcelis spp.; (f) Anopiura, por ejemplo, Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphigus spp. y Phylloxera spp.; (g) Malofaga, por ejemplo, Damalinea spp. y Tríchodectes spp.; (h) Tisanóptera, por ejemplo, Frankliniella spp., Hercinotnrips spp., Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci y Scirtothrips aurantii; (i) Heteróptera, por ejemplo, Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singularis, Scotinophara spp. y Tniatoma spp.; (j) Homóptera, por ejemplo, Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae, Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus dictyospermi, Coccus hesperidum, Empoasca spp., Eriosoma larigerum, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lecanium corni, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nephotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla spp., Pulvinaria aetiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sitobion spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza erytreae y Unaspis citri; (k) Himenóptera, por ejemplo, Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp., Solenopsis spp. y Vespa spp.; (I) Díptera, por ejemplo, Aedes spp., Antherigona soccata, Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila melanogaster, Fannia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomyza spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca spp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxis spp., Tabanus spp., Tannia spp. y Típula spp.; (m) Sifonaptera, por ejemplo, Ceratophyllus spp. und Xenopsylla cheopis y (n) del orden Tisanura, por ejemplo, Lepisma saccharina. Los ingredientes activos de conformidad con la invención se pueden usar además para controlar pulgón de cruciferas (Phyllotreta spp.), gusanos de la raíz (Delia spp.), picudo de la col (Ceutorhynchus spp.) y áfidos en cultivos de semillas para aceite tales como cañóla (colza), semilla de mostaza, e híbridos de los mismos, y también arroz y maíz.
En una modalidad particular, el insecto puede ser un miembro de la Spodoptera, más particularmente, Spodoptera exigua, Myzus persicae, Plutella xylostella o Euschistus sp.
Las sustancias y composiciones también pueden ser usadas para modular la emergencia en ya sea una formulación pre-emergente o post-emergente de monocotiledóneas, malezas de dicotiledóneas o juncias. En una modalidad particular, las malezas pueden ser Chenopodium álbum, Abutilón theophrasti, Helianthus annuus, Ambrosia artemesifolia, Amaranthus retroflexus, Convolvulus arvensis, Brassica kaber, Taraxacum officinale, Solanum nigrum, Malva neglect, Setaria lutescens, Bromus tectorum, Poa annua, Poa pratensis, Lolium perenne L. var. Pace, Festuca arundinaceae Schreb. var. Aztec II, Anthem II, LS1100, Echinochloa crus-galli, Lactuca sativa. La cepa de Burkholdena, compuestos y composiciones expuestos anteriormente también pueden ser usados como un fungicida. Los hongos dirigidos pueden ser un Fusarium sp., Botrytis sp., Monilinia sp., Colletotrichum sp, Verticillium sp.; Microphomina sp., Phytophtora sp, Mucor sp., Podosphaera sp._Rhizoctonia sp., Peronospora sp., Geotrichum sp., Phoma, y Penicillium. En otra modalidad muy particular, las bacterias son Xanthomonas.
La invención será ahora descrita en mayor detalle por referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
EJEMPLOS Las composiciones y métodos expuestos anteriormente serán mejor ilustrados en los siguientes Ejemplos no limitantes. Los ejemplos son ilustrativos de varias modalidades solamente y no limitan la invención reivindicada con respecto a los materiales, condiciones, relaciones en peso, parámetros de proceso y similares mencionados aquí. 1. Ejemplo . Aislamiento e identificación del microbio 1.1 Aislamiento del microorganismo El microbio es aislado usando técnicas establecidas conocidas en la técnica a partir de una muestra de suelo recolectada bajo un árbol de hoja perene en el Rinnoji Temple, Nikko, Japón. El aislamiento se hace usando agar de dextrosa de papa (PDA) usando un procedimiento descrito en detalle por Lorch et al., 1995. En este procedimiento, la muestra de suelo es primero diluida en agua estéril, después de lo cual es plaqueada en un medio de agar sólido tal como agar de dextrosa de papa (PDA). Las placas se hacen crecer a 25°C por cinco días, después de lo cual las colonias microbianas individuales son aisladas en placas de PDA separadas. La bacteria aislada es gram negativa, y forma colonias de color crema opacas, redondas que cambian a rosa y rosado marrón en color y mucoides o babosas con el tiempo. 1.2. Identificación en el microorganismo El microbio se identifica con base en el secuenciamiento del gen usando cebadores bacterianos universales para amplificar la región de 16S ARNr. Se usa el siguiente protocolo: Burkholderia sp A396 se cultiva en placas de agar de dextrosa de papa. El crecimiento de una placa de 24 horas se raspa con un bucle estéril y re-suspende en amortiguador de extracción de ADN. El ADN se extrae usando el kit de extracción de ADN Microbiano MoBio Ultra Clean. El extracto de ADN es verificado por calidad/cantidad corriendo 5µ? en un gel de agarosa al 1 %.
Las reacciones de PCR se establecieron como sigue: 2 µ? de extracto de ADN, 5 µ? de amortiguador de PCR, 1 µ? de dNTP (10 mM cada uno), 1.25 µ? de cebador delantero (27F; 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (SEC ID NO:1 ), 1.25 µ? de cebador inverso (907R; 5'-CCGTCAATTCCTTTGAGTTT-3' (SEC ID NO:2)) y 0.25 µ? de enzima Taq. El volumen de reacción se hace hasta 50 µ? usando agua libre de nucleasa estéril. La reacción de PCR incluye una etapa de desnaturalización inicial a 95°C por 10 minutos, seguida por 30 ciclos de 94°C/30 seg, 57°C/20 seg, 72°C/30 seg, y una etapa de extensión final a 72°C por 10 minutos.
La concentración y tamaño aproximado del producto se calcula corriendo un volumen de 5 µ? en un gel de agarosa al 1 % y comparando la banda del producto a una escalera de masa.
Cebadores de exceso, dNTPs y enzimas son removidos del producto de PCR con el kit limpiador de PCR MoBio. El producto de PCR se limpia directamente secuenciado usando cebadores 27F (los mismos como anteriormente), 530F (5'-GTGCCAGCCGCCGCGG-3' (SEC ID NO:3)), 1 1 14F (5'-GCAACGAGCGCAACCC (SEC ID NO:4)) y 1525R (5'-AAGGAGGTGWTCCARCC-3' (SEC ID NO:5)), 1 100R (5'-GGGTTGCGCTCGTTG-3' (SEC ID NO:6)), 519R (5 - GWATTACCGCGGCKGCTG-3' (SEC ID N0:7).
La secuencia del gen 16S ARNr de la cepa A396 es comparada con las secuencias del gen 16s ARNr disponibles de representantes de la ß-proteobacteria usando BLAST. La cepa A395 A396 es estrechamente relacionada a miembros del complejo de Burkholderia cepacia, con 99% o superior similitud a varios aislados de Burkholderia multivorans, Burkholderia vietnamensis, y Burkholderia cepacia. Una búsqueda BLAST que excluye el complejo de B. cepacia, mostró 90% de similitud a aislados de B. plantara, B. gladioli y Burkholderia sp.
Un árbol de la distancia de resultados usando el método de unión vecino, mostró que A396 está relacionada con Burkholderia multivorans y otros aislados de complejos de Burkholderia cepacia. Burkholderia plantarii Burkholderia glumae se agruparon en una rama separada del árbol.
La cepa de aislado de Burkholderia se encontró por contener las siguientes secuencias: secuencia delantera, secuencia de ADN con cebador 27F, 815 nucleótidos (SEC ID NO:8); secuencia inversa, 1453 bp, usando cebadores 1525R, 1100R, 519R (SEC ID NO:9); secuencia inversa 824 bp usando cebador 907R (SEQ NO: 10); secuencia delantera 1152 bp usando cebador 530F (SEC ID NO:11 ); secuencia delantera 1067 bp usando cebador 11 14F (SEC ID NO:12); secuencia inversa 1223 bp usando cebador 1525R (SEC NO: 13); secuencia inversa 1216 bp usando cebador 1100R (SEC ID NO:14); secuencia inversa 1194 bp usando cebador 519R (SEC ID NO: 15). 1.3. Prueba de que Burkholderia A396 no pertenece al complejo de Burkholderia cepacia. 1.3.1 Trabajo de Biología Molecular usando cebadores de PCR específicos Para confirmar la identificación de Burkholderia A396 como Burkholderia multivorans, se realizó secuenciamiento adicional de genes de mantenimiento. Burkholderia multivorans es un miembro conocido del complejo de Burkholderia cepacia. Se enfocaron esfuerzos en PCR de genes recA, como se describe por Mahenthiralingam et al., 2000. Se usaron los siguientes cebadores: (a) BCR1 y BCR2 expuesto en Mahenthiralingam et al., 2000 para confirmar el igualamiento del complejo B. cepacia y (b) BCRBM1 y BCRBM2 expuesto en Mahenthiralingam et al, 2000 para confirmar el igualamiento de B. multivorans. Una reacción de PCR que proporciona el producto para el primer cebador establecido podría confirmar que el microbio pertenece al complejo de B. cepacia. Una reacción de PCR para proporcionar el producto para el segundo cebador establecido podría confirmar que el microbio es sin embargo B. multivorans.
No se obtiene producto de PCR para cualquier par de cebadores. El desempeño de la reacción de PCR y cebadores se prueba usando Burkholdena multivorans ATCC 17616 (control positivo) y Pseudomonas fluorescens (control negativo). Se observaron bandas fuertes ambas para B. multivorans usando ambas series de cebadores. No se observaron bandas para Pseudomonas fluorescens. Los resultados indican que A396 es una Burkholderia, pero no un miembro del complejo B. cepacia, y no Burkholderia multivorans. Esto también se demuestra en un experimento de cultivo comparativo en el cual tanto A396 como un tipo de cultivo de 6. multivorans sé hacen crecer lado por lado en un cultivo sacudido, y el crecimiento se monitorea diariamente usando mediciones de densidad óptica a 600 nm. Bajo las condiciones establecidas, las nuevas especies de A396 crecen mucho más rápido que la cepa de tipo B. multivorans (Figura 1 ). 1.3.2 Hibridación de ADN-ADN Para confirmar que el aislado A396 es una nueva especie de Burkholderia, se conduce un experimento de hibridización de ADN-ADN con Burkholderia multivorans (el apareamiento de secuencia de 16S ARNr más cercana). La biomasa para tanto A396 como B. multivorans se produce en caldo de ISP2, crece durante 48 horas a 200 rpm/25°C en matraces Fernbach. La biomasa es asépticamente recolectada por centrifugación. El caldo es decantado y la pelotilla celular es resuspendida en una solución 1 :1 de agua:isopropanol. Se realizaron experimentos de hibridización de ADN-ADN por el DSMZ, la Colección Germana de Microorganismos y Cultivos Celulares en Alemania. El ADN es aislado usando una celda de presión French (Thermo Spectronic) y es purificado por cromatografía en hidroxiapatito como se describe por Cashion et al., 1977. La hibridización de ADN-ADN se lleva a cabo como se describe por De Ley et al. , 1970 bajo consideración de las modificaciones descritas por Huss et al., 1983 usando un espectrofotómetro UV/VIS modelo Cary 100 Bio equipado con un cambiador multicélulas 6x6 de termostato Peltier y un controlador de temperatura con una sonda de temperatura in situ (Varían). El DSMZ reportó % de similitud de ADN-AD entre A396 y Burkholderia multivorans de 37.4%. Los resultados indican que la cepa A396 de Burkholderia sp no pertenece a la especie Burkholderia multivorans cuando se consideran las recomendaciones de un valor umbral de 70% de similitud de ADN-ADN para la definición de especies bacterianas y el comité para esto (Wayne et al., 1987). 1.4. Perfil bioquímico usando placas Biolog GN2 Para el perfil de utilización de fuente de carbono, A396 se hace crecer en Agar de Dextrosa de Papa (PDA). El cultivo es transferido a agar BUG para producir un cultivo adecuado para experimentos Biolog como se recomienda por el fabricante (Biolog, Hayward, CA).
El perfil bioquímico del microorganismo se determina inoculando en una placa Biolog GN2 y leyendo la placa después de una incubación de 24 horas usando el sistema de microéstacion 4-automatizada MicroLog. La identificación de la bacteria desconocida se intenta comparando su patrón de utilización de carbono con la base de datos Gram Negativa de Microlog 4.
No se encontraron apareamientos definitivos transparentes al perfil Biolog. Los apareamientos más cercanos todos tienen menos de 35% de similitud con A396: Pseudomonas spinosa (Burkholderia), Burkholderia cepacia, y Burkholderia pseudomallei. Los resultados se muestran en la Tabla I.
Tabla 1. Perfil Bioquímico de A396 Sustrato Resultado Sustrato Resultado ] Ciclodextrina L-arabinosa Dextrina - D-arabitol - Glicógeno - D-celobiosa - Tween 40 + Eritritol - Tween 80 + D-Fructosa | N-acetil-D-Galactosamina - L-Fucosa - N-acetil-D-glucosamina - D-Galactosa +/- Adonitol - Gentibiosa ; _ ¡ Monometiléster del ácido - D-Glucosa succínico Ácido acético - m-lnositol - Ácido Cis-aconítico - - D-Lactosa ! - | Ácido cítrico Lactulosa Ácido fórmico + Maltosa ; Lactona de ácido D- - D-Manitol Galactónico Ácido D-Galacturónico D-Manosa ; Acido D-Glucón¡co - D-Melibiosa - Acido D-Glucosamínico - ß-metil-D-glucósido Ácido D-Glucurónico - D-Psicosa I Sustrato Resultado Sustrato Resultado ácido L-glutámico + D-serina ácido Glicil-L-Aspártico L-serina ácido Glicil-L-giutámico L-treonina L-histidina D,L-carnitina Hidroxi-L-prolina L-omitina L-leucina 1.5. Composición de ácido graso Después de la incubación por 24 horas a 28°C, asas de células que crecen en cavidad se recolectaron y se prepararon ésteres metílicos del ácido graso, separaron e identificaron usando el Sistema de Identificación Microbiana de Sherlock (MIDI) como se describe (véase Vandamme et al., 1992). Los ácidos grasos predominantes presentes en la Burk olderia A396 son como siguen: 16:0 (24.4%), ciclo 17:0 (7.1 %), 16:0 3- OH (4.4%), 14:0 (3.6%), 19:0 io8c (2.6%) ciclo, 18:0 (1.0%). La característica resumida 8 (que comprende 18: 1 OÜ7C) y característica resumida 3 (que comprende de 16: 1 io7c y 16:1 >6c) corresponde a 26.2% y 20.2 % del área de pico total, respectivamente. La característica resumida 2 que comprende 12:0 ALDE, 16:1 iso I, y 14:0 3-OH) corresponde a 5.8% del área de pico total mientras la característica resumida 5 que comprende 18:0 ANTE y 18:2 u)6,9c corresponde a 0.4%. Otros ácidos grasos detectados en A396 en cantidades menores incluyen: 13: 1 a 12-13 (0.2%), 14: 1 ou5c (0.2%), 15.0 3-OH (0.13%), 17: 1 u)7c (0.14%), 17:0 (0.15%), 16:0 iso 3-OH (0.2%), 16:0 2-OH (0.8%), 18: 1 io7c 11-metilo (0.15%), y 18:1 2-OH (0.4%).
Una comparación de la composición de ácido graso de A396 con aquella de cepas microbianas conocidas en la base de datos MIDI sugiere que los ácidos grasos en la nueva cepa A396 fueron muy similares con aquellos de Burkholderia cenocepacia. 1.6 Resistencia a Antibióticos La susceptibilidad antibiótica de Burkholderia A396 es probada usando discos antibióticos en medio Muller-Hinton como se describe en la hoja de datos técnicos Microbiológicos PML #535. Los resultados obtenidos después de 72 horas de incubación a 25°C se presentan en la Tabla 2 abajo.
Tabla 2: Susceptibilidad de MBI-206 a varios antibióticos. +++ muy susceptible, susceptible, - resistente Concentración (ug) Susceptible Tetraciclina 30 - Canamicina 30 +++ Eritromicina 15 - Estreptomicina 10 - Penicilina 10 - Ampicilina 10 - Oxitetraciclina 30 - Cloranfenicol 30 ++ Ciprofloxacina 5 ++ Gentamicina 10 - Piperacilina 100 +++ Cefuroxima 30 - Imipenem 10 +++ Sulfametoxazol-Trimetoprim 23.75/ 25 ++ Los resultados indican que el espectro de susceptibilidad antibiótica de Burkholdería A396 es casi diferente de cepas del complejo patogénico de B. cepacia. Burkholdería A396 es susceptible a canamicina, cloranfenicol, ciprofloxacina, piperacilina, imipenem, y una combinación de sulfametoxazol y trimetoprim. Como una comparación, Zhou et al., 2007 probó la susceptibilidad de 2,621 cepas diferentes en el complejo de fi. cepacia aislado de pacientes con fibrosis quística, y encontró que solamente 7% y 5% de todas las cepas fueron susceptibles a imipenem o ciprofloxacina, respectivamente. También se encontró que 85% de todas las cepas son resistentes a cloranfenicol (15% susceptible), y 95% son resistentes (5% susceptible) a la combinación de sulfametoxazol y trimetoprim. Los resultados de Zhou et al., 2007 son similares a aquellos de Pitt et al., 1996 quién determinó la resistencia antibiótica entre 366 aislados de B. cepacia y reportó que muchos de ellos son resistentes a ciprofloxacina, cefuroxima, imipenem, cloranfenicol, tetraciclina, y sulfametoxacol. 2. Ejemplo 2. Burkholderia sp. como un Herbicida 2.1 Estudio #1 Para confirmar la actividad encontrada en la selección inicial de herbicida, se condujo un estudio ¡n vivo usando el extracto de resina Amberlite 7 XAD de un caldo de células completo de 5 días de la nueva especie de Burkholderia. El extracto crudo seco se resuspendió en 4% de etanol y 0.2% de tensoactivo no iónico (glicospersa) a una concentración de 10 mg/mL, y además se diluyó a una concentración de 5.0 mg/mL. Las dos muestras se rociaron en plantas de enredadera de 4 semanas (Convolvulus arvensis), y las plantas se mantienen bajo luces de crecimiento a 25°C por 2 semanas, en tal punto, se realizaron las evaluaciones de fitotoxicidad. En el mismo estudio, plantas de bledo de raíz roja de 2 semanas se rociaron con concentraciones incrementadas del extracto crudo derivado del cultivo bacteriano. Las concentraciones de prueba son de 1.25, 2.5, 5.0 y 10.0 mg/mL, y las plantas se incuban como se describe arriba antes de las evaluaciones de fitotoxicidad.
Los resultados presentados en las Figuras 2 (enredadera) y 3 (bledo) muestran el efecto fitotóxico de extracto crudo de Burkholderia a diferentes concentraciones, y muestran buen efecto herbicida en bledo aún a bajas concentraciones de tratamiento. Ambos tratamientos de extractos (5 y 10 mg/mL) resultan en retraso del crecimiento en enredadera. 2.2 Estudio #2 Una nueva cepa de Burkholderia sp. A396 se hace crecer en un medio mineral no definido por 5 días (25°C, 200 rpm). El caldo celular completo es extraído usando resina XAD7. El extracto crudo seco se resuspendió en 4% de etanol y 0.2% de tensoactivo no iónico a una concentración de 10 mg/mL, y además se diluyó a concentraciones de 5.0, 2.5, y 1.25 mg/mL. Todas las cuatro soluciones de prueba son entonces probadas en las siguientes especies de malezas y hierbas de hoja ancha listadas en la Tabla 3: Tabla 3. Especies de malezas y hierbas de hoja ancha Probadas Nombre común Nombre científico Cenizo blanco común Chenopodium álbum Junco Conyza canadensis Lengua de vaca Rumex crispus Pasto colchón Digitaría sanguinalis Pasto azul Poa annua Diente de león Taraxacum officinale Hierba mora Solanum nigrurri Mostaza Brassica kaber Malva Malva neglecta Acacia Xanthium pensylvanicum Zacate Bermuda Cynodon dactylon Cola de zorro Setaria lutescens Cardo Sonchus oleraceus Una solución de 0.2% de glicospersa y Roundup a relación de 6 fl oz por galón (177.441 ml/litro) se usa como controles negativo y positivo, respectivamente.
Todas las especies de plantas se probaron en macetas de plástico de 4"x4" (10.16cmsx10.16cms) en tres réplicas. Las plantas de control no tratadas se rociaron con la solución portadora (4% de Etanol, 0.2% de glicospersa) y las plantas de control positivo con el Roundup a una velocidad que corresponde a 6 fl. oz/acre (177.441 ml/hectárea). Las plantas tratadas se mantienen en un invernadero bajo condiciones de 12 horas luz/12 horas oscuridad. Los datos de fitotoxicidad tomados 22 días después del tratamiento para las especies #1-8 y 12 días para las especies #9-12 se presentan en las Tablas 5 y 6, respectivamente. La escala de clasificación para ambas tablas se muestra en la Tabla 4.
Tabla 4. Escala de Clasificación Tabla 5. Datos de Fitotoxicidad para Especies #1-8 retraso en el crecimiento que resulta en plantas de aproximadamente la mitad del tamaño de plantas no tratadas.
Tabla 6. Datos de Fitotoxicidad para Especies #9-12 Tratamiento Acacia Cola de zorro Zacate Bermuda Cardo Malva UTC 0.0 0.7 0.0 0.0 2.8 1.25 mg/mL 0.5 0.3 0.3 0.0 2.0 2.5 mg/mL 0.5 0.7 0.5 0.0 2.7 5.0 mg/mL 0.8 0.3 0.2 0.0 2.2 10.0 mg/mL 0.7 0.7 0.3 0.2 1.7 Roundup 4.7 4.8 4.7 5.0 5.0 Basados en los resultados obtenidos en estos estudios, se probaron los compuestos extraídos de caldos de fermentación de los aislados de especies de Burkholderia tienen actividad herbicida contra varias especies de malezas. De las doce especies tratadas, el Cenizo blanco común y mostaza son muy susceptibles, seguidos por malva y junco. La concentración del extracto tan baja como 1.25 mg/mL es capaz de proporcionar casi control completo de Cenizo blanco común y mostaza, mientras concentraciones superiores-son requeridas para la malva y junco.
En un experimento separado, usando el mismo diseño como se describe arriba, se probó la actividad sistémica. 10 mg/ml de sobrenadante de extracto crudo de Burkholderia sp. A396 se pinta sobre primeras hojas verdaderas de Ambrosía, Mostaza, Hierba mora, Pasto colchón, Trigo y Pasto Pata de Gallo. Las plántulas se evaluaron 7 días después del tratamiento. Los síntomas observados incluyen: quema, deformación. La actividad herbicida de blanqueado se observa en la siguiente hoja arriba de la hoja tratada en Ambrosía, Mostaza y Hierba mora. No se observa actividad sistémica en los pastos probados. En un segundo experimento, cinco fracciones del mismo extracto crudo (10 mg/ml) se evaluaron usando el mismo diseño experimental como se describe arriba. Plántulas de Mostaza, Trigo y Pasto colchón se trataron. Siete y 20 días después del tratamiento, se observaron síntomas de actividad herbicida en Mostaza de cuatro de las cinco fracciones (091113B4F6, 091113B4F7, 091113B4F8 y 091 113B4F9) usando una columna C-18 (Phenomenex Sepra C18-E, 50 µ?t?, 65A). Se observaron síntomas en la siguiente hoja arriba de la hoja tratada. No se observa actividad sistémica en los pastos probados. 3. Ejemplo 3. Burkholderia sp. como un insecticida 3.1. Estudios de Actividad de Contacto Se usó el siguiente ensayo en la fase de selección inicial para determinar si los compuestos derivados de un cultivo de la nueva especie de Burkholderia tienen actividad de contacto contra una plaga de Lepidóptero (larvas). Además se usa como una herramienta para el fraccionamiento guiado por bioensayo para determinar las fracciones activas y picos derivados del extracto de caldo celular completo. La prueba se conduce en tazas de plástico individuales de 1.25 oz (35.52 mililitros) usando ya sea larvas de tercer estadio tardías de Falso medidor de la col (Tricoplusia ni) o larvas de tercer estadio tempranas del Gusano soldado de la remolacha (Spodoptera exigua). Una pieza de 1cm x 1cm de dieta sólida de Gusano soldado de la remolacha se coloca en el centro de cada taza junto con una larva. Una alícuota de 1ml de cada tratamiento (caldo celular completo o extracto de un cultivo de 5 días de Burkholderia A396) se inyecta en cada tórax de larva (lado dorsal) usando una Jeringa de Precisión Hamilton. Cada tratamiento es replicado diez veces. Se usa agua como un tratamiento de control negativo y malatión como el tratamiento de control positivo. Después de la inyección, cada taza es cubierta con película de parafina con un agujero para aire, y las tazas se incuban por tres días a 26°C. Las evaluaciones de mortalidad de hacen diariamente, partiendo 24 horas después del tratamiento.
Las Figuras 4 y 5 presentan los resultados de pruebas de actividad de contacto. De conformidad con los resultados, el caldo esterilizado por filtración de un cultivo de Burkholderia sp eliminó aproximadamente 40% de todos los insectos de la prueba dentro de 3 días. El caldo diluido (50%) tiene actividad inferior, resultando en aproximadamente 10% de control en ambos insectos probados. 3.2. Actividad Contra Larvas A través de Alimentación La toxicidad directa vía alimentación se prueba usando las pruebas de superposición de dieta con el siguiente formato de ensayo de placa de 96 cavidades usando placas microtituladoras con 200 mi de dieta artificial sólida de Gusano soldado de la remolacha en cada cavidad. Cien (100) microlitros de cada muestra de prueba se pipetean en la parte superior de la dieta (una muestra en cada cavidad), y la muestra se deja secar bajo un flujo de aire hasta que la superficie se seca. Cada muestra (esterilizada por filtración a través de un filtro de 0.2 micrones) se prueba en seis réplicas, y agua y el producto comercial de Bt (fí. thuringiensis) se usan como controles negativos y positivos, respectivamente. Larvas del tercer estadio del insecto de prueba (Falso medidor de la co\-Trichoplus¡a ni; Gusano soldado de la remolacha - Spodoptera exiqua; Polilla diamante negro - Plutella xylostella) se coloca en cada cavidad, y la placa se cubre con cubierta de plástico con agujeros para aire. Las placas con insectos se incuban a 26°C por 6 días con evaluaciones de mortalidad diarias.
La Figura 5 representa datos de un estudio de sobreposición de dieta con larvas de tercer estadio temprano de Gusano soldado de la remolacha (Spodoptera exigua) probadas a cuatro diferentes concentraciones de caldo:1x (100%), 1/4x (25%), 1/8x (12.5%), 1/16x (6.125%). Los datos muestran que el caldo esterilizado por filtración, no diluido, es capaz de dar 100% de control al final del periodo de incubación de 7 días. Se obtiene control similar con una dilución de 4 veces del caldo, y en el final del estudio, ambos caldos diluidos 4 veces y no diluidos son comparables con Bt usado como un control positivo. Sin embargo, el efecto de Bt es significantemente más rápido que aquel de los caldos de Burkholderia. La eficacia contra las larvas de gusano soldado es dependiente de la concentración del caldo, y las dos concentraciones del caldo más bajas (12.5% y 6.125%) proporcionan menos control que las dos más altas. Sin embargo, el desempeño de la dilución al 12.5% no es mucho más baja que la dilución al 25%. La dilución de 16 veces del caldo claramente no es bastante eficiente, y solamente proporciona control parcial (33%) de larvas de gusano soldado durante este estudio de 7 días. Las tasas de mortalidad correspondientes para la misma dilución de caldo usado en larvas de falso medidor de la col y polilla diamante negro son un poco superior con 6.125% de caldo que elimina 80% y 50% de larvas, respectivamente. 3.3. Actividad in vitro contra insectos chupadores Cinco adultos de chinches (Euschistus sp.) se colocaron en cada contenedor de plástico de 16 oz (473.18 mi) forrado con una pieza de papel secante. Un tubo microcentrífugo que contiene 2 mL de cada prueba de muestra (caldo completo esterilizado con filtro) se cubre con una bola de algodón, y se deja en el fondo del contenedor de plástico. Una semilla de girasol se coloca después en el tubo como cebo. Se usan agua y producto comercial como una mezcla de piretrina y PBO a una tasa recomendada como controles negativo y positivo, respectivamente. Cada contenedor se cierra con una tapa, y se incuba a 25°C por 7 días con verificaciones de mortalidad diariamente.
Los resultados son presentados abajo en la Tabla 7 y muestran aproximadamente 80% de control de insecto chupador (chinche) por el día 7 en este sistema in vitro con 50% de caldo diluido. En este estudio, el caldo de fermentación diluido de Burkholderia A396 es más efectivo en controlar chinches que el producto comercial usado como un control positivo. De manera interesante, el caldo no diluido resultó en control de insecto inferior, lo cual podría ser una indicación de propiedades antialimentarias (inhibición de alimentación) de los metabolitos activos secundarios producidos por esta nueva especie de Burkholderia.
Tabla 7. Efecto de A396 en Chinches 4. Ejemplo 4. Prueba in vivo de insecto chupador La eficacia in vivo del caldo celular filtrado completo se prueba en un ensayo de planta con plantas de mostaza y áfido de durazno verde (Myzus persicae) como el insecto de prueba. Se rocían plantas de mostaza de hoja ancha Florida (Brassica sp.) de aproximadamente un mes con dos diferentes concentraciones (1x y 0.5x) del caldo celular completo esterilizado por filtración de Burkholderia sp. usando un cepillo de aire Paasche. Se usan agua y un producto comercial de avermectina (Avid) como controles negativos y positivos, respectivamente. Las plantas se dejan secar en la mesa de trabajo, después de lo cual se colocan en un contenedor de plástico de 6 tazas con una tapa con agujeros para aire. Diez áfidos en varias etapas de desarrollo se colocan en cada planta de prueba, y las plantas se incuban bajo lámparas de crecimiento por 7 días a 25°C. Evaluaciones diarias para el número de áfidos en cada planta (resumida en la Tabla 8 abajo) se hacen y registran en un cuaderno de notas.
Tabla 8. Eficacia in vivo de A396 en Áfidos de Durazno Verde De conformidad con los resultados, ambas concentraciones del caldo esterilizado por filtración derivadas de un cultivo de una nueva especie de Burkholderia son capaces de controlar el crecimiento de población de un insecto chupador, M. persicae. 5. Ejemplo 5. Actividad Nematocida 5.1 Estudio #1 Para valorar el efecto de caldo de cultivo de Burkholderia sp A396 esterilizado por filtración en la motilidad (y recuperación subsecuente) de nemátodos del nodulo de la raíz juveniles (J2) {Meloidogyne incógnita VW6), se condujo la siguiente prueba en placas de cultivo de células de plástico de 24 cavidades: Una alícuota de 300-ul de cada solución de prueba (ya sea 1x o 0.5x de caldo esterilizado por filtración) se agrega en cavidades apropiadas después de lo cual, quince nemátodos dispensados en 10 pl de agua DI se agregan en cada cavidad, la placa se cierra con una tapa, e incuba a 25°C por 24 horas. Se usan agua y Avid a dilución de 20,000x como controles negativos y positivos, respectivamente. El efecto de cada compuesto en la movilidad del nemátodo se verifica después de 24 horas probando cada nemátodo con una aguja, y la proporción de nemátodos móviles en cada tratamiento se registró en una libreta de notas usando una escala en %. Para valorar la recuperación de movilidad en cada tratamiento, un volumen de 200 mi se remueve de cada cavidad, y la solución restante en cada cavidad se diluye agregando 2 ml_ de agua DI. Las placas son nuevamente incubadas por 24 horas como se describe arriba, después de lo cual se realiza la segunda evaluación de movilidad.
Los resultados presentados en la Figura 6 muestran que el caldo esterilizado por filtración a ambas concentraciones de prueba puede inmovilizar los nemátodos de vida libre juveniles del nodulo de la raíz. Este efecto dura al menos por 24-horas, lo cual sugiere que el caldo de Burkholderia A396 se puede usar para prevenir plantas de infección de nemátodos. 5.2 Estudio #2 Materiales y Métodos Prueba de Mini Empapado: Caldo celular completo de Burkholderia A396 se prueba en un ensayo de invernadero conducido en macetas de 45 mi. Semillas de pepino contra Toshka se muestran directamente en macetas llenas con un suelo franco arenoso. Diez días después, las macetas fueron cada una tratadas con 5 mi de una suspensión. Cantidades específicas usadas se muestran en la Tabla 9: Tabla 9 Compuestos Cepa A396 de Burkholderia Fostiazato (Estándar, EC 150) (control pos) especies de Meloidogyne sp. Aplicado a 3000 huevos por mini maceta mini prueba empapada (en 2 mi) plantas de Cucumis sativus (pepino cv. Toschka) prueba formulación de 100% de formulación líquida prueba concentración de 100, 50, 25, 12.5, 6, 3, 1.5 ml/L prueba aplicación de aplicación de humedad prueba Como se indica en la Tabla 9, las macetas son inoculadas con 3000 huevos de M. incógnita. Cuatro réplicas se prepararon para cada tratamiento y relación. El ensayo se recolectó catorce días después de la aplicación del ensayo e inoculación. El agailamiento de la raíz se valoró de conformidad con el índice de agailamiento Zeck (Zeck, 1971). La fitotoxicidad se midió como una reducción de agailamiento de la raíz en comparación con el control. Los resultados se muestran en las Figuras 9 y 10.
En la Prueba de Mini Empapado no. 1 (véase Figura 9), la actividad del tratamiento fue muy alta y una reducción de al menos 100% se observó cuando se aplicó a una concentración de 100 ml/L de Burkholderia A396. El fostiazato funcionó como es usual (100% de control a 20 ppm).
En la Prueba de Mini Empapado no. 2 (véase Figura 10) se observó 100% de reducción de agallamiento de la raíz a la concentración más alta de 100 ml/L cayendo a aproximadamente 50% a 1.5 ml/L. El fostiazato funcionó como es usual (100% de control a 20 ppm). 5.3 Estudio #3 Para demostrar la actividad nematicida de Burkholderia A396, se realizó un estudio de invernadero en pepino (Cucumis sativus) usando un caldo celular completo de Burkholderia A396 como el producto de prueba para controlar nemátodos nodulares de la raíz (Meloidogyne incógnita). Una planta de pepino por maceta se panta en el suelo y se hace crecer en un invernadero bajo luces artificiales a 28°C. Cada maceta con una planta es tratada con una alícuota (aproximadamente 80 ml_) de ya sea el producto de prueba no diluido o un producto de prueba diluido a 5% con agua. Cada tratamiento de Burkholderia A396 así como también un tratamiento de control positivo con Temik (en una relación de etiqueta) y un control negativo sin adiciones consiste de cinco réplicas. Las plantas se hacen crecer en un invernadero por 60 días, después de lo cual cada planta se recolectó y evaluó por pesos de raíz y brotes frescos. El número de huevos de nemátodos en cada maceta se registró y se calculó un parámetro que indica el número de huevos por un gramo de masa de raíz. Se realizó análisis estadístico (ANOVA), y se calculó la diferencia estadística entre medios de tratamiento a p<0.1. Los datos presentados en la Tabla 10 abajo muestran que aún aunque no fue estadísticamente diferente del control no tratado, las macetas tratadas con caldo celular completo de A396 contienen menos huevos de nemátodos que las macetas de control no tratadas. El efecto calculado como número de huevos por masa de raíz es más claro cuando se usa caldo no diluido como un tratamiento.
Tabla 10. El efecto de caldo celular completo A396 en el peso de raíz y brotes de pepino, número total de huevos de M. incógnita por maceta y el número de huevos por gramo de masa de raíz. peso de brote fresco peso de raíz fresco # de huevos # de huevos/g de raíz no tratado 15.22 b 1 1.76 be 67693 a 5252.0 ab A396 5% v/v 11.89 b 6.914 c 56084 a 8419.4 a A396 no diluido 15.66 b 1 1.09 be 40463 a 3929.2 ab Temik 15 G 5 Ib/a 29.54 a 29.74 a 68907 a 2604.4 b LSD a p < 0.1 5.34 6.9879 36509.2 3317.07 6. Ejemplo 6. Aislamiento de Templazol A y B Métodos y Materiales Se usó el siguiente procedimiento para la purificación de Templazol A y B extraído de cultivo celular de Burkholderia sp (véase Figura 7): El caldo de cultivo derivado de la fermentación 10-L Burkholderia (A396) en medio de crecimiento de · soya Hy es extraído con resina Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., 2006) sacudiendo la suspensión celular con la resina a 225 rpm por dos horas a temperatura ambiente. La resina y masa celular se recolectaron por filtración a través de una estopilla y se lavó con agua DI para remover las sales. La resina, masa celular y estopilla se empaparon entonces por 2h en acetona después de lo cual la acetona es filtrada y secada bajo vacío usando evaporador rotatorio para dar el extracto crudo. El extracto crudo es entonces dividido usando Cromatografía Líquida a vacío C18 de fase inversa (H20/CH3OH; gradiente 90:20 a 0:100%) para dar 10 fracciones. Estas fracciones entonces se concentraron a sequedad usando evaporador rotatorio y los residuos secos resultantes son seleccionados para determinar actividad biológica usando ensayo de plántulas de lechuga en placas de 96 cavidades. Las fracciones activas son entonces sometidas a HPLC de fase inversa (Spectra System P4000 (Thermo Scientific) para dar compuestos puros, los cuales son entonces seleccionados en bioensayos mencionados anteriormente para localizar/identificar los compuestos activos. Para confirmar la identidad del compuesto, los datos espectroscópicos adicionales tales como LC/ S y NMR son registrados.
La fracción activa 4 se purifica además usando una columna C-18 de HPLC (Phenomenex, Luna 10u C18(2) 100 A, 250 x 30), sistema solvente de gradiente agua:acetonitrilo (0-10 min; 80% de CH3CN acuoso, 10-25 min; 80-65% de CH3CN acuoso, 25-50 min; 65-50% de CH3CN acuoso, 50-60 min; 50-70% de CH3CN, 60-80 min; 70-0% de CH3CN acuoso, 80-85 min; 0-20% de CH3CN acuoso) a 8 mL/min de velocidad de flujo y detección UV de 210 nm, para dar templazol B, tiempo de retención 46.65 min. La otra fracción activa 6 también se purifica usando una columna C-18 de HPLC (Phenomenex, Luna 10u C18(2) 100 A, 250 x 30), sistema solvente de gradiente agua:acetonitrilo (0-10 min; 80% de CH3CN acuoso, 10-25 min; 80-60% de CH3CN acuoso, 25-50 min; 60-40% de CH3CN acuoso, 50-60 min; 40% de CH3CN, 60-80 min; 40-0% de CH3CN acuoso, 80-85 min; 0-20% de CH3CN acuoso) a 8 mL/min de velocidad de flujo y detección UV de 210 nm, para dar templazol A, tiempo de retención 70.82 min.
Análisis de Espectroscopia de Masas de compuestos puros se realiza en un instrumento de electrorrocío Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus (ESI) usando modos de ionización tanto positivos como negativos en un modo de exploración completo (m/z 100-1500 Da) en un Espectrómetro de Masas LCQ DECA XPplus (Thermo Electron Corp., San José, CA). Instrumento de Cromatografía Líquida de Alta Presión Thermo equipado con un detector Finnigan Surveyor PDA plus, automuestreador plus, bomba MS y una columna de 5 µ?? 4.6 mm x 100 mm Luna C18 (Phenomenex). El sistema solvente consiste de agua (solvente A) y acetonitrilo (solvente B). La fase móvil comienza a 10% de solvente B y se incrementa linealmente a 100% de solvente B durante 20 min y después se mantiene por 4 min, y finalmente se regresa a 10% de solvente B durante 3 min y se mantiene por 3 min. La velocidad de flujo es 0.5 mUmin. El volumen de inyección fue 10 pL y las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente en un automuestreador. Los compuestos se analizaron por LC-MS utilizando la cromatografía de fase inversa y LC. El análisis de espectroscopia de masas de los presentes compuestos se realiza bajo las siguientes condiciones: La velocidad de flujo del gas de nitrógeno se fija a 30 y 15 arb para la vaina y aux/velocidad de flujo de barrido de gas, respectivamente. Se realizó ionización por electrorrocío con un voltaje atomizador ajustado a 5000 V y un voltaje capilar a 35.0 V. La temperatura capilar se ajustó a 400°C. El dato se analizó un software Xcalibur. El compuesto activo templazol A tiene una masa molecular de 298 y mostró ión miz a 297.34 en modo de ionización negativo. El cromatograma de LC-MS para templazol B sugiere una masa molecular de 258 y exhibe ión m/z a 257.74 en modo de ionización negativo.
Los espectros H, 13C y 2D NMR se midieron en un espectrómetro de campo gradiente Bruker de 500 Hz y 600 MHz. La referencia se ajusta en el tetrametilsilano estándar interno (TMS, 0.00 ppm).
Para elucidar la estructura de templazol A, el compuesto purificado con un peso molecular 298 es además analizado usando un instrumento NMR de 500 MHz, y tiene 1H NMR valores d a 8.44, 8.74, 8.19, 7.47, 7.31 , 3.98, 2.82, 2.33, 1.08 y tiene 13C NMR con valores d de 163.7, 161.2, 154.8, 136.1, 129.4, 125.4, 123.5, 123.3, 121.8, 121.5, 111.8, 104.7, 52.2, 37.3, 28.1 , 22.7, 22.7. El Templazol A tiene bandas de absorción UV a 226, 275, 327 nm, lo cual sugiere la presencia de anillos indol y oxazol. La fórmula molecular, C17H18N203, es como se determina por interpretación de datos 1H, 13C NMR y HRESI MS m/z 299.1396 (M+H)* (Caled para C17H19N203, 299.1397), lo cual implica un alto grado de insaturación se mostró por 10 equivalentes de enlace doble. El espectro 3C NMR reveló señales para los 17 carbonos, que incluyen dos metilos, un metoxi, un carbono de metileno, una metina alifática, un éster de carbonilo, y once carbonos aromáticos. La presencia de indol 3'-sustituido se reveló de los datos espectrales 1H-1H COSY y HMBC. El 1H-1H COSY y HMBC también indica la presencia de un grupo de éster metílico del ácido carboxilico y una cadena lateral -CH2-CH-(CH3)2. Del análisis detallado de los datos 1H-1H COSY, 3C, y HMBC se deriva que el compuesto contiene un núcleo oxazol. Del análisis 2D se encontró que la cadena lateral isobutilo se unió en la posición C-2, un éster metílico del ácido carboxilico en la posición C-4 y la unidad indol en la posición C-5 para dar templazol A.
El segundo compuesto herbicidamente activo, templazol B, con un peso molecular 258 es además analizado usando un instrumento NMR de 500 MHz, y tiene 1H NMR valores d a 7.08, 7.06, 6.75, 3.75, 2.56, 2.15, 0.93, 0.93 y 13C NMR con valores de d 158.2, 156.3, 155.5, 132.6, 129.5, 129.5, 127.3, 121.8, 115.2, 115.2, 41.2, 35.3, 26.7, 21.5, 21.5. La fórmula molecular, es asignada como Ci5H18N202, la cual es determinada por interpretación de 1H, 13C NMR y datos de masa. El espectro 13C NMR reveló señales para todos los 15 carbonos, que incluyen dos metilos, dos carbonos de metileno, una metina alifática, una amida carbonilo, y nueve carbonos aromáticos. La naturaleza general de la estructura se deduce del espectro H y 13C NMR que mostró un anillo para-aromático sustituido [d 7.08 (2H, d, J = 8.8 Hz), 6.75 (2H, d, J - 8.8 Hz), y 132.7, 129.5, 115.2, 127.3, 115.2, 129.5]. El espectro de 1H NMR de esta estructura junto con el espectro 1H-1H COSY y HSQC, que exhibe señales características para una porción isobutilo [d 0.93 (6H, d, J = 6.9 Hz), 2.15 ( H, sept., J = 6.9 Hz), 2.57 (2H, d, J = 6.9 Hz). Además, un protón olefínico/aromático a (d 7.06, s), y un grupo carbono de carbonilo (d 158.9) se encontraron también en el espectro H y 3C NMR. En la inspección del espectro de HMBC, la señal H-1 ' en la porción isobutilo se correlaciona con el carbono olefínico (C-2, d 156.3), y el protón olefínico H-4 se correlaciona con (C-5, d 155.5; C-2, 156.3 & C-1", 41.2). La señal de metileno a d 3.75 se correlaciona con C-5, C-4 así como también el C-2" de la porción aromática para-sustituida. Todas estas correlaciones observadas sugieren la conectividad entre el isobutilo, y las porciones bencilo para-sustituidas para el esqueleto de la estructura como se muestra. Además, el grupo carboxamida es asignado a la posición para de la porción bencilo con base en la correlación HMBC del protón aromático en la posición H-4"& H-6". De este modo, con base en los datos anteriores, la estructura se diseñó como templazol B. 7. Ejemplo 7. aislamiento de FR90128 El caldo celular completo de la fermentación de Burkholderia sp. En un medio de crecimiento no definido es extraído con resina Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., 2006) sacudiendo la suspensión celular con resina a 225 rpm por dos horas a temperatura ambiente. La resina y masa celular se recolectaron por filtración a través de una estopilla y lavaron con agua DI para remover las sales. La resina, masa celular y estopilla se remojaron entonces por 2 h en acetona después de lo cual la acetona se filtró y secó bajo vacío usando evaporador rotatorio para dar el extracto crudo. El extracto crudo es entonces fraccionado usando cromatografía líquida a vacío C18 de fase inversa (H20/CH3OH; gradiente 90:20 a 0:100%) para dar 10 fracciones. Estas fracciones son entonces concentradas a sequedad usando evaporador rotatorio y los residuos secos resultantes son seleccionados por actividad biológica usando tanto bioensayos de insectos así como también bioensayos herbicidas. Las fracciones activas son entonces sometidas a HPLC de fase inversa/normal (Spectra System P4000; Thermo Scientific) para dar compuestos puros, los cuales son entonces seleccionados en bioensayos herbicidas, insecticidas y nematicidas descritos abajo para localizar/identificar los compuestos activos. Para confirmar la identidad del compuesto, se registraron datos espectroscópicos adicionales tales como LC/MS y NMR.
El análisis de espectroscopia de masas de picos activos se realiza en un instrumento de electrorrocío Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus (ESI) usando modos de ionización tanto positivos como negativos en un modo de exploración completo (m/z 100-1500 Da) en un Espectrómetro de masas LCQ DECA xpplus (Thermo Electron Corp., San José, CA). Instrumento de Cromatografía Líquida de Alta Presión Thermo equipado con un detector Finnigan Surveyor PDA plus, automuestreador plus, bomba MS y una columna de 5 pm 4.6 mm x 100 mm Luna C18 (Phenomenex). El sistema solvente consiste de agua (solvente A) y acetonitrilo (solvente B). La fase móvil comienza a 10% de solvente B y se incrementa linealmente a 100% de solvente B durante 20 min y después se mantiene por 4 min, y finalmente se regresa a 10% de solvente B durante 3 min y se mantiene por 3 min. La velocidad de flujo es 0.5 mL/m¡n. El volumen de inyección es 10 pL y las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente en un automuestreador. Los compuestos se analizaron por LC-MS utilizando la cromatografía de fase inversa y LC. El análisis dé espectroscopia de masas de los presentes compuestos se realiza bajo las siguientes condiciones: La velocidad de flujo del gas de nitrógeno se fija a 30 y 15 arb para la vaina y aux/velocidad de flujo de barrido de gas, respectivamente. Se realiza ionización de electrorrocío con un voltaje atomizador ajustado a 5000 V y un voltaje capilar a 35.0 V. La temperatura capilar se ajusta a 400°C. Los datos se analizan en software Xcalibur. Con base en el análisis de LC-MS, el compuesto insecticida activo de la fracción 5 tiene una masa molecular de 540 en modo de ionización negativo.
Para elucidar la estructura, el compuesto insecticida purificado de la fracción 5 con peso molecular de 540 es además analizado usando un instrumento NMR de 500 MHz, y tiene 1H NMR valores a 6.22, 5.81 , 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31 , 3.93, 3.22, 3.21, 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; y tiene 13C NMR con valores de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51. Los datos de NMR indican que el compuesto contiene grupos amino, éster, ácido carboxílico, metilo alifático, etilo, metileno, oximetileno, metina, oximetina y azufre. El análisis NMR 1D y 2D detallado confirma la estructura para el compuesto tan FR90128 como un compuesto conocido. 8. Ejemplo 8. Actividad herbicida de FR90128 La actividad herbicida del compuesto activo FR90128 (MW 540) se probó en un ensayo de laboratorio usando plántulas de Pasto Pata de Gallo (Echinochloa crus-galli) de una semana en una plataforma de placa de 96 cavidades. Se colocó una plántula de pasto en cada una de las cavidades que contiene 99 microlitros de agua DI. Una alícuota de microlitros del compuesto puro en etanol (10 mg/mL) se agrega en cada cavidad, y la placa se sella con una tapa. Un microlitro de etanol en 99 microlitros de agua se usa como un control negativo. Los tratamientos se hacen en ocho réplicas, y la placa sellada se incuba en un invernadero bajo luces artificiales (ciclo de 12 horas de luz/oscuridad). Después de cinco días, se leen los resultados. Las plántulas de pasto en todas las ocho cavidades que reciben el compuesto activo se leen sin dejar tejido verde, mientras las plántulas en las cavidades de control negativo se hicieron crecer activamente. 9. Ejemplo 9. Actividad insecticida de FR90128 La actividad insecticida del compuesto activo FR90128 (MW 540) se probó en un ensayo de laboratorio usando un sistema de bioensayo de contacto. El compuesto es disuelto en 100% de etanol a concentraciones de 0.001 , 0.005, 0.01 , 0.025, 0.05, 0.1 , 0.25, y 0.5 µ9/µ?-. Larvas individuales del tercer estadio temprano del Gusano soldado de la remolacha, Spodoptera exigua, se colocaron en tazas de plástico 1.25 onzas (35.52 mililitros) con una pieza de 1 cm2 de dieta artificial (Bio-Serv). Se usa una Micropipeta Hamilton para aplicar 1 pL del compuesto al tórax de cada larva. Las tazas son cubiertas con película de parafina estirada y un agujero único se corta en la película de parafina para aireación. Se trataron diez larvas por concentración. El ensayo se incuba a 25°C, 12h luz/12h oscuridad. Las larvas se registran a 48 y 72 horas después de la aplicación. Se realiza análisis probit para valorar el valor LC50 el cual se encuentra para el compuesto (MW 540) como 0.213. 10. Ejemplo 10. Aislamiento de Templamida A, B, FR901465 y FR90128 Métodos y Materiales Se usa el siguiente procedimiento para la purificación de compuestos extraídos del cultivo celular de Burkholderia sp (véase Figura 7): El caldo de cultivo derivado de la fermentación 10-L de Burkholderia (A396) en medio de crecimiento de soya Hy es extraído con resina Amberlite XAD-7 (Asolkar et al., 2006) sacudiendo la suspensión celular con resina a 225 rpm por dos horas a temperatura ambiente. La resina y masa celular se recolectaron por filtración a través de una estopilla y lavaron con agua DI para remover las sales. La resina, masa celular y estopilla se remojaron entonces por 2 h en acetona después de lo cual la acetona se filtró y secó bajo vacío usando evaporador rotatorio para dar el extracto crudo. El extracto crudo es entonces fraccionado usando cromatografía líquida a vacio C18 de fase inversa (H20/CH3OH; gradiente 90:20 a 0: 100%) para dar 10 fracciones. Estas fracciones son entonces concentradas a sequedad usando evaporador rotatorio y los residuos secos resultantes son seleccionados por actividad biológica usando plántulas de lechuga en placa de 96 cavidades (herbicida) y ensayo de 3er. estadio temprana del Gusano soldado de la remolacha (insecticida). Las fracciones activas son entonces sometidas repetidamente para separación de HPLC por fase inversa (Spectra System P4000 (Thermo Scientific) para dar compuestos puros, los cuales son entonces seleccionados en bioensayos mencionados anteriormente para localizar/identificar los compuestos activos. Para confirmar la identidad del compuesto, se registraron datos espectroscópicos adicionales tales como LC/MS, HR S y NMR.
La fracción activa 5 se purifica además usando una columna C-18 de HPLC (Phenomenex, Luna 10u C18(2) 100 A, 250 x 30), sistema solvente de gradiente agua:acetonitrilo (0-10 min; 80% de CH3CN acuoso, 10-25 min; 80-65% de CH3CN acuoso. 25-50 min; 65-50% de CH3CN acuoso, 50-60 min; 50-70% de CH3CN acuoso, 60-80 min; 70 - 0% de CH3CN acuoso, 80-85 min; 0 - 20% de CH3CN acuoso) a 8 mIJmin de velocidad de flujo y detección UV de 210 nm, para dar templamida A, tiempo de retención 55.64 min y FR901465, tiempo de retención 63.59 min y FR90128, tiempo de retención 66.65 min respectivamente. La otra fracción activa 6 también se purifica usando una columna C-18 de HPLC (Phenomenex, Luna 10u C18(2) 100 A, 250 x 30), sistema solvente de gradiente agua:acetonitrilo (0-10. min; 70-60% de CH3CN acuoso, 10-20 min; 60-40% de CH3CN acuoso, 20-50 min; 40-15% de CH3CN acuoso, 50-75 min; 15-0% de CH3CN, 75-85 min; 0-70% de CH3CN acuoso) a 8 mlJmin de velocidad de flujo y detección UV de 210 nm, para dar templamida B, tiempo de retención 38.55 min.
El análisis de espectroscopia de masas de compuestos puros se realiza en un instrumento de electrorrocío Thermo Finnigan LCQ Deca XP Plus (ESI) usando modos de ionización tanto positivos como negativos en un modo de exploración completo (m/z 100-1500 Da) en un Espectrómetro de Masas LCQ DECA xpplus (Thermo Electron Corp., San José, CA). Se usan un Instrumento de Cromatografía Líquida de Alta Presión Thermo equipado con un detector Finnigan Surveyor PDA plus, automuestreador plus, bomba MS y una columna de 5 um 4.6 mm x 100 mm Luna C18 (Phenomenex). El sistema solvente consiste de agua (solvente A) y acetonitrilo (solvente B). La fase móvil comienza a 10% de solvente B y se incrementa linealmente a 100% de solvente B durante 20 min y después se mantiene por 4 min, y finalmente regresa a 10% de solvente B durante 3 min y se mantiene por 3 min. La velocidad de flujo es 0.5 mL/min. El volumen de inyección es 10 pL y las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente en un automuestreador. Los compuestos se analizaron por LC-MS utilizando la cromatografía de fase inversa y LC. El análisis de espectroscopia de masas de los presentes compuestos se realiza bajo las siguientes condiciones: La velocidad de flujo del gas de nitrógeno se fija a 30 y 15 arb para la vaina y aux/velocidád de flujo de barrido de gas, respectivamente. Se realiza ionización de electrorrocío con un voltaje atomizador ajustado a 5000 V y un voltaje capilar a 45.0 V. La temperatura capilar se ajusta a 300°C. Los datos se analizan en software Xcalibur. El compuesto activo templamida A tiene una masa molecular de 555 con base en el pico m/z a 556.41 [M + H]+ y 578.34 [M + Na]+ en modo de ionización positiva: El análisis de LC/MS en ionización en modo positivo para templamida B sugiere una masa molecular de 537 con base en iones m/z a 538.47 [M + H]+ y 560.65 [M + Na]*. El peso molecular para los compuestos FR901465 y FR90128 se asigna como 523 y 540 respectivamente con base en el análisis de LCMS.
Los espectros 1H, 13C y 2D NMR se miden en un espectrómetro de campo gradiente Bruker de 600 MHz. La referencia se ajusta en el tetrametilsilano estándar interno (TMS, 0.00 ppm).
Para elucidar la estructura de templamida A, el compuesto purificado con peso molecular de 555 es además analizado usando un instrumento NMR de 600 MHz, y tiene 1H NMR valores d a 6.40, 6.39, 6.00, 5.97, 5.67, 5.54, 4.33, 3.77, 3.73, 3.70, 3.59, 3.47, 3.41 , 2.44, 2.35, 2.26, 1,97, 1.81 , 1.76, 1.42, 1.37, 1.16, 1.12, 1.04 y tiene 13C NMR con valores de 5 173.92, 166.06, 145.06, 138.76, 135.71 , 129,99, 126.20, 123.35, 99.75, 82.20, 78.22, 76.69, 71.23, 70.79, 70.48, 69.84, 60.98, 48.84, 36.89, 33.09, 30.63, 28.55, 25.88, 20.37, 18.11 , 14.90, 12.81 , 9.41. El espectro de 13C NMR exhibe 28 señales de carbono discretas las cuales son atribuidas a seis metilos, cuatro metileno carbonos, y trece metinas que incluyen cinco sp2, cuatro carbonos cuaternarios. La fórmula molecular, C28H45 O10, es determinada por interpretación de datos 1H, 3C NMR y HRESI MS. El análisis detallado de datos espectrales 1H-1H COSY, HMBC y HMQC revela las siguientes estructuras (I— IV) y dos grupos metileno aislados y metilo único. Estas subestructuras son conectadas después usando la correlación clave HMBC para dar las estructuras más plana para el compuesto, las cuales no han sido aún reportadas en la literatura y se designan como templamida A. Esta molécula de policétido contiene dos anillos tetrahidropiranosa, y una amida conjugada.
Las subestructuras l-IV son asignadas por análisis de datos espectroscópicos de NMR 1 D y 2D.
El análisis (+) ESIMS para el segundo compuesto herbicida, muestra iones miz a 538.47 [M + H]+ y 560.65 [M + Naf que corresponden al peso molecular de 537. La fórmula molecular de C28H43NO9 se determina por interpretación del análisis de datos ESIMS y NMR. El 1H y l3C NMR de este compuesto es similar a aquel de templamida A excepto que aparece un nuevo aislado de -CH2- en lugar del grupo metileno no acoplado en templamida A. La constante de acoplamiento germinal pequeña de 4.3 Hz es característica de la presencia de un grupo metileno epóxido. La presencia de este epóxido además se confirma a partir del cambio de 13C NMR de 60.98 en templamida A a 41.07 en el compuesto con MW 537. La diferencia molecular de la fórmula entre estos dos compuestos es razonablemente explicada por eliminación de la molécula de agua seguida por formación de epóxido. De este modo, con base en el análisis de base NMR y MS, se asigna la estructura para el nuevo compuesto y se designa como templamida B.
Para elucidar la estructura, el compuesto purificado de la fracción 5 con peso molecular de 523 es además analizado usando un instrumento NMR de 600 MHz, y tiene H NMR valores d a 6.41 , 6.40, 6.01, 5.98, 5.68, 5.56, 4.33, 3.77, 3.75, 3.72, 3.65, 3.59, 3.55, 3.50, 2.44, 2.26, 2.04, 1.96, 1.81 , 1.75, 1.37, 1.17, 1.04; y tiene 13C NMR con valores d de 172.22, 167.55, 144.98, 138.94, 135.84, 130.14, 125.85, 123.37, 99.54, 82.19, 78.28, 76.69, 71.31 , 70.13, 69.68, 48.83, 42.52, 36.89, 33.11 , 30.63, 25.99, 21.20, 20.38, 18.14, 14.93, 12.84. El análisis detallado de 1H y 13C NMR del compuesto sugiere que este compuesto fue casi similar al compuesto templamida B; la única diferencia fue en la cadena lateral de éster; una porción de acetato estuvo presente en lugar de una porción de propionato en la cadena lateral. El análisis N R 1D y 2D detallado confirma la estructura para el compuesto como FR901465 como un compuesto conocido.
Con base en el análisis de LC-MS, el otro compuesto de la fracción 5 tiene una masa molecular de 540 en modo de ionización negativo. Para elucidar la estructura, el compuesto purificado de la fracción 5 con peso molecular de 540 es además analizado usando un instrumento NMR de 500 MHz, y tiene 1H NMR valores d a 6.22, 5.81 , 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31 , 3.93, 3.22, 3.21 , 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; y tiene 13C NMR con valores de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51. Los datos de NMR indican que el compuesto contiene grupos amino, éster, ácido carboxílico, metilo alifático, etilo, metileno, oximetileno, metina, oximetina y azufre. El análisis NMR 1D y 2D detallado confirma la estructura para el compuesto como FR90128 como un compuesto conocido. 11. Ejemplo 11. Actividad herbicida de Templamida A, Templamida B, FR901465 y FR90128 La actividad herbicida de templamida A, B, FR901465 y FR90128 se prueba en un ensayo de laboratorio usando plántulas de Pasto Pata de Gallo (Echinochloa crus-galli) y lechuga (Lactuca sativa L.) de una semana en una plataforma de placa de 96 cavidades. Una plántula se coloca en cada una de las cavidades que contienen 99 microlitros de agua DI. En cada cavidad, a una alícuota de microlitros del compuesto puro en etanol (10 mg/mL) se agrega, y la placa se sella con una tapa. Un microlitro de etanol en 99 microlitros de agua se usa como un control negativo. Los tratamientos se hacen en ocho réplicas, y la placa sellada se incuba en un invernadero bajo luces artificiales (ciclo de 12 horas de luz/oscuridad). Después de cinco días, se leen los resultados. Las plántulas de pasto en todas las ocho cavidades que reciben el compuesto activo se leen sin dejar tejido verde, mientras las plántulas en las cavidades de control negativo se hacen crecer activamente. La actividad herbicida de templamida A contra plántulas de lechuga es ligeramente inferior que para el pasto. Por otro lado, la templamida B proporciona un mejor control (100%) de plántulas de lechuga (usadas como un sistema modelo para malezas de hoja ancha) que la templamida A (Tabla 11 ).
Tabla 11 : Datos de Bioensayos herbicidas para Templamida A, B, FR901465 y FR90128 110 pg/mL de concentración por cavidad 12. Ejemplo 12. Actividad insecticida de active compuestos La actividad insecticida de templamida A, B, FR901465 y FR90128 se probó en un ensayo de laboratorio usando un ensayo de sobre posición de dieta de 96 cavidades con larvas de 1er estadio de Gusano soldado de la remolacha usando placas microtituladoras con 200 µ? de dieta sólida artificial para Gusano soldado de la remolacha en cada cavidad. Cien (100) µ? de cada muestra de prueba se pipetearon en la parte superior de la dieta (una muestra en cada cavidad), y la muestra se dejó secar bajo flujo de aire hasta que la superficie se seca. Cada muestra se probó en seis réplicas, y agua y producto comercial de Bt (B. thuringiensis) se usan como controles negativos y positivos, respectivamente. Una larva de primer estadio del insecto de prueba (Gusano soldado de la remolacha - Spodoptera exiqua) se colocó en cada cavidad, y la placa se cubrió con cubierta de plástico con agujeros de aire. Las placas con insecto se incubaron a 26°C por 6 días con evaluaciones de mortalidad diarias. Con base en los resultados presentes en la Tabla 12, templamida A y B resultan en 40% y 80% de mortalidad, respectivamente.
Tabla 12: Datos de Bioensayo Insecticida para Templamida A, B, FR901465 y FR90128 contra 1er. estadio de Gusano Soldado de la Remolacha (Spodoptera exigua),¦¦ 110 pg/mL de concentración por cavidad Ejemplo 11. Actividad fungicida de FR90128 ( W 540) La actividad fungicida de FR90128 ( W 540) contra tres hongos patogénicos de planta {Botrytis cinérea, Phytophtora sp., Monilinia fructicola) se probó en un ensayo de placa de PDA (agar de dextrosa de papa) in vitro. Las placas son inoculadas en el hongo usando un método de obturación. Después que los hongos se han establecido y comenzado a crecer en él medio de crecimiento, se colocan ocho discos de papel filtro estériles en cada placa de aproximadamente 1 cm desde el borde en un círculo. Diez microlitros. de solución de etanol que contienen 20, 15, 10, 7.5, 5, 2.5 1.25 mg FR90128/mL se agregan en los discos de papel filtro, y la solución se deja evaporar. Un disco empapado con 10 mL de etanol puro se usa como un control negativo. El ensayo se hace con tres réplicas. Las placas se incuban a temperatura ambiente por 5 días, después de lo cual la actividad fungicida se registra midiendo la zona de inhibición alrededor de cada disco de papel filtro que corresponden a diferentes concentraciones de FR90128. De conformidad con los resultados, FR90128 no tiene efecto en el crecimiento de Monilinia pero es efectivo en controlar el crecimiento de hifas de tanto Botrytis y Phytophtora. Parece haber una clara respuesta de dosis en inhibición con concentraciones umbrales de 10 mg/mL y 1.25 mg/mL para Botrytis y Phytophtora, respectivamente (Figura 8).
DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO El siguiente material biológico ha sido depositado bajo los términos del Tratado de Budapest con la Colección de Cultivos de Investigación Agrícola (NRRL), 1815 N. University Street, Peoría, Illinois 61604 USA, y proporciona el siguiente número: Depósito Número de Acceso Fecha del Depósito Burkholderia sp A396 NRRL B-50319. 15 Septiembre 2009 La cepa se ha depositado bajo condiciones que aseguran que el acceso al cultivo estará disponible durante la tramitación de esta solicitud de patente a una determinada por el Comisionado de Patentes y Marcas para tener derecho a la misma bajo el C37 C.F.R. § 1.14 y 35 U.S.C. § 122. El depósito representa un cultivo sustancialmente puro de la cepa depositada. El depósito está disponible como se requiere por las leyes de patente extranjera en países donde las contrapartes de la solicitud objeto, o su progenie son presentadas. Sin embargo, se debe entender que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para practicar la invención objeto en la derogación de derechos de patente otorgados por la acción gubernamental.
La invención descrita y reivindicada en la presente no está siendo limitada en alcance por los aspectos específicos aquí descritos, puesto que estos aspectos están propuestos como ilustraciones de varios aspectos de la invención. Cualesquiera aspectos equivalentes están propuestos para estar dentro del alcance de esta invención. Sin embargo, varias modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente llegarán a ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción mencionada anteriormente. Tales modificaciones también están propuestas para caer dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. En el caso de conflicto, la presente descripción incluyendo definiciones regirán.
Se citan varias referencias en la presente, las descripciones de las cuales están incorporadas por referencia en sus totalidades.
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Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Una cepa aislada de una no Burkholderia cepacia, no Burkholderia plantan, no Burkholderia gladioli, Burkholderia sp. No Burkholderia cepacia, no Burkholderia multivorans, Burkholderia sp. la cual tiene las siguientes características: (A) una secuencia del gen 16S ARNr que comprende la secuencia delantera que tienen al menos 99% de identidad a las secuencias expuestas en la SEC ID NO:8, 11 , 12 y una secuencia inversa que tienen al menos 99% de identidad a las secuencias expuestas en la SEC ID NO:9, 10, 13, 14 y 15; (B) actividad pesticida; (C) produce un compuesto pesticida seleccionado a partir del grupo que consiste de: (i) un compuesto que tiene las siguientes propiedades: (a) un peso molecular de aproximadamente 525-555 como se determina por Cromatografía Líquida/Espectroscopia de Masas (LC/MS); (b) 1H NMR con valores de 6.22, 5.81 , 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31 , 3.93, 3.22, 3.21 , 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (c) tiene i3C NMR con valores de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51 y (c) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando un gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN); (iv) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos una porción indol, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo éster carboxílico, al menos 17 carbonos, al menos 3 oxígenos y al menos 2 nitrógenos; (v) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos una porción bencilo, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo amida, al menos 15 carbonos, al menos 2 oxígenos y al menos 2 nitrógenos; (vi) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos una porción tetrahidropiranosa, al menos tres enlaces dobles olefinicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco carbonos, al menos ocho oxígenos y al menos un nitrógeno y (vii) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, un grupo metileno epóxido, al menos una porción tetrahidropiranosa, al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 carbonos, al menos 8 oxígenos y al menos 1 nitrógeno; (D) es no patogénico a animales vertebrados; (E) es susceptible a canamicina, cloranfenicol, ciprofloxacina, piperacilina, imipenem, y una combinación de sulfametoxazol y trimetoprim y (F) contiene los ácidos grasos 16:0, ciclo 17:0, 16:0 3-OH, 14:0, ciclo 19:0 u)8c, 18:0.
2. La cepa de conformidad con la reivindicación 1 , CARACTERIZADA porque la especie Burkholderia es una cepa de Burkholderia que tiene las características de identificación de Burkholderia A396 (NRRL Acceso No. B-50319).
3. Un cultivo sustancialmente puro, fracción celular o sobrenadante CARACTERIZADO porque se deriva de la cepa de conformidad con las reivindicaciones 1 -2 o extracto de la misma.
4. Un compuesto pesticida aislado opcionalmente obtenible de una especie de Burkholderia CARACTERIZADO porque se seleccionado a partir del grupo que consiste de: (A) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos una porción indol, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo éster carboxílico; al menos 17 carbonos y al menos 3 oxígenos y 2 nitrógenos; y los cuales tienen al menos uno de los siguientes: (i) un peso molecular de 275-435; (ii) H N R d valores a 8.44, 8.74, 8.19, 7.47, 7.31 , 3.98, 2.82, 2.33, 1.08; (iii) 13C NMR con valores de S 163.7, 161.2, 154.8, 136.1 , 129.4, 125.4, 123.5, 123.3, 121.8, 121.5, 11 1.8, 104.7, 52.2, 37.3, 28.1 , 22.7, 22.7; (iv) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproxima-damente 10-20 minutos en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando agua:acetonitrilo (CH3CN) con un sistema de solvente gradiente y detección UV de 210 nm; (v) bandas de absorción UV a 226, 275, 327 nm.; (B) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos una porción bencilo, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido, al menos un grupo amida; al menos 15 carbonos, al menos 2 oxígenos y al menos 2 nitrógenos; y al menos una de las siguientes características: (i) un peso molecular de aproximadamente 240-290 como se determina por Cromatografía Líquida/Espectroscopia de Masas (LC/MS); (¡i) 1H NMR d valores a aproximadamente 7.08, 7.06, 6.75, 3.75, 2.56, 2.15, 0.93, 0.93; (iii) 13C NMR con valores de d 158.2, 156.3, 155.5, 132.6, 129.5, 129.5, 127.3, 121.8, 115.2, 115.2, 41.2, 35.3, 26.7, 21.5, 21.5; (iv) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos, en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando un gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN) y (v) bandas de absorción UV a aproximadamente 230, 285, 323 nm; (C) un compuesto no epóxido que comprende al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos una porción tetrahidropiranosa, al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxílo, al menos veinticinco carbonos, al menos ocho oxígenos y un nitrógeno y al menos una de las siguientes características: (i) tiene un peso molecular de aproximadamente 530-580 como se determina por Cromatografía Líquida/Espectroscopia de Masas (LC/MS); (ii) 1H NMR con valores de d 6.40, 6.39, 6.00, 5.97, 5.67, 5.54, 4.33, 3.77, 3.73, 3.70, 3.59, 3.47, 3.41 , 2.44, 2.35, 2.26, 1.97, 1.81 , 1.76, 1.42, 1.37, 1.16, 1.12, 1.04; (iii) 13C NMR con valores de d 173.92, 166.06, 145.06, 138.76, 135.71 , 129.99, 126.20, 123.35, 99.75, 82.20, 78.22, 76.69, 71.23, 70.79, 70.48, 69.84, 60.98, 48.84, 36.89, 33.09, 30.63, 28.55, 25.88, 20.37, 18.11 , 14.90, 12.81 , 9.41 ; (iv) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 7-12 minutos, en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando agua:acetonitrilo (CH3CN) con un sistema de solvente gradiente y detección UV de 210 nm; (v) tiene una fórmula molecular de C28H45 O10 la cual se determina por interpretación del análisis de datos ESIMS y NMR; (vii) tiene UV bandas de absorción entre aproximadamente 210-450 nm. (D) un compuesto que comprende (i) al menos un éster, al menos una amida, un grupo metileno epóxido, al menos una porción tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 carbonos, al menos 8 oxígenos y al menos 1 nitrógeno, (i¡) 13C NMR con valores de d 174.03, 166.12, 143.63, 137.50, 134.39, 128.70, 126.68, 124.41 , 98.09, 80.75, 76.84, 75.23, 69.87, 69.08, 68.69, 68.60, 48.83, 41.07, 35.45, 31.67, 29.19, 27.12, 24.55, 19.20, 18.95, 13.48, 11.39, 8.04, (iii) una fórmula molecular de C28H 3NO9 y al menos uno de: (i) 1H NMR d valores a aproximadamente 6.41 , 6.40, 6.01 , 5.97, 5.67, 5.55, 4.33, 3.77, 3.75, 3.72, 3.64, 3.59, 3.54, 3.52, 2.44, 2.34, 2.25, 1.96, 1.81 , 1.76, 1.42, 1.38, 1.17, 1.12, 1.04; (ii) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 6-15 minutos, en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando un gradiente de agua.acetonitrilo (CH3CN); (iii) UV bandas de absorción entre aproximadamente 210-450 nm.
5. El compuesto de conformidad con la reivindicación 4, CARACTERIZADO porque el compuesto tiene la estructura ##STR002a## (a) en donde RT es— H o alquilo C C10; R2 es un alquiléster. (b) ##STR003a## en donde es -H o alquilo CrC 0. (c) ##STR004a## en donde X, Y y Z son cada uno independientemente -O, -NR, o -S, en donde R es H o alquilo Cr C10; R-i, R2. R3. R4. R5, 6. R7. e. R9. Rio. R11. R12. y R13 son cada uno independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterociclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo; (d) en donde Rt, R2, R3, Rt, R5, Re, R7. Re, Rf>, R10, Rn, R12, y R13 son cada uno independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo; sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo; (f) en donde X, Y y Z son cada uno independientemente -O, -NR, o -S, en donde R es H o alquilo CV C10; Ri, R2. R3. R4. 5. 6. R7. R8. R11. R12. y 13 son cada uno independientemente H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo y en donde cuando Z es -NR, R3 es una porción no oxiformilo.
6. El compuesto de conformidad con las reivindicaciones 4-5, CARACTERIZADO porque el compuesto es seleccionado a partir del grupo que consiste de templazol A, templazol B, templamida A y templamida B, o pesticida biológico y (c) opcionalmente al menos uno de un portador, diluyente, tensoactivo, adyuvante.
7. Un método para producir un compuesto CARACTERIZADO porque se selecciona a partir del grupo que consiste de (A) un compuesto que tiene las siguientes propiedades: (i) un peso molecular de aproximadamente 525-555 como se determina por Cromatografía Liquida/Espectroscopia de Masas (LC/MS); (ii) 1H NMR con valores de 6.22, 5.81 , 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31 , 3.93, 3.22, 3.21 , 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (iii) tiene 13C NMR con valores de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167:59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51 y (iv) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando un gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN); (B) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos una porción indol, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido, al menos un grupo éster carboxílico; al menos 17 carbonos, al menos 3 oxígenos y al menos 2 nitrógenos; (C) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos una porción bencilo, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido, al menos un grupo amida, al menos 15 carbonos, al menos 2 oxígenos y al menos 2 nitrógenos; (D) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos una porción tetrahidropiranosa, al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco carbonos, al menos ocho oxígenos y al menos un nitrógeno y (E) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, un grupo metileno epóxido, al menos una porción tetrahidropiranosa, al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 carbonos, al menos 8 oxígenos, al menos 1 nitrógeno; (F) el compuesto de la reivindicación 4; en el cual el método comprende cultivar la cepa de conformidad con las reivindicaciones 1-2 y producir el compuesto.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, CARACTERIZADO porque el compuesto se selecciona a partir del grupo que consiste de (A) el compuesto de conformidad con la reivindicación 5; (B) un compuesto que tiene la estructura ##STR001## o una sal pesticídicamente aceptable o estereoisómeros de la misma, en donde M es 1 , 2, 3 ó 4; n es 0, 1 , 2, ó 3; p y q son independientemente 1 ó 2; X es O, NH o NR; R1 , R2 y R3 son los mismos o diferentes e independientemente una porción de cadena lateral de aminoácido o un derivado de cadena lateral de aminoácido y R es una porción de alquilo, arilo o arilalquilo de cadena inferior; (C) un compuesto que tiene la estructura ##STR002## ##STR002## en donde X, Y y Z son cada uno independientemente ~0, --NRi, o -S, en donde R, es -H o alquilo Ci-C1a', Ri. R2 y ?? son cada uno independientemente -H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo y "m" puede ser localizado en cualquier lugar en el anillo oxazol; (D) un compuesto que tiene la estructura ##STR003## ##STR003## en donde: X y Y son cada uno independientemente -OH, -NR^ o --S, en donde R, es -H o alquilo Ci-C 0; Ri, R2 y m, un sustituyente en el anillo oxazol, son cada uno independientemente -H, alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo. (E) un compuesto que tiene la estructura ##STR005## ##STR005 ## en donde: X y Y son cada uno independientemente -OH, -NR^ o -S, en donde R^ R2 son cada uno independientemente -H, alquilo (por ejemplo, alquilo CrC10), alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo, arilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heterocíclico, heterocíclico sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, tioalquilo, tioalquilo sustituido, hidroxi, halógeno, amino, amido, carboxilo, -C(0)H, acilo, oxiacilo, carbamato, sulfonilo, sulfonamida, o sulfurilo.
9. El método de conformidad con las reivin-dicaciones 7-8, CARACTERIZADO porque el compuesto producido es seleccionado a partir del grupo que consiste de: (i) templazol A; (ii) teplazol B; (iii) templamida A; (iv) templamida B (v) FR90128; ( i) 83 Ixviii) 86 (XL) FR901465.
10. Un método para aislar una cepa de Burkholderia, CARACTERIZADO porque comprende (a) producir un compuesto de conformidad con el método de las reivindicaciones 7-9; (b) aislar el compuesto producido en la etapa (a) del sobrenadante del cultivo.
11. Una combinación CARACTERIZADA porque comprende (a) una primer sustancia seleccionada del grupo que consiste de (i) un cultivo puro, fracción celular o sobrenadante derivado de la cepa de las reivindicaciones 1-2 o extracto de la misma; (ii) el compuesto de las reivindicaciones 4-6; (iii) un compuesto producido por la cepa de las reivindicaciones 1-2; y (iii) un compuesto aislado de conformidad con el método de la reivindicación 9; (b) opcionalmente una segunda sustancia, en donde la segunda sustancia es un pesticida químico o biológico y (c) opcionalmente al menos uno de un portador, diluyente, tensoactivo, adyuvante.
12. La combianción de conformidad con la reivindicación 11 , CARACTERIZADA porque la segunda sustancia es un pesticida seleccionado del grupo que consiste de nematicida, herbicida, fungicida e insecticida.
13. La combinación de conformidad con las reivindicaciones 11-12, CARACTERIZADA porque la combinación es una composición.
14. Un método para modular infestación de plagas en una planta, CARACTERIZADO porque comprende aplicar a la planta y/o semillas del mismo y/o sustrato usado para hacer crecer la planta, una cantidad de la combinación de las reivindicaciones 11-13, efectiva para modular la infestación de plagas.
15. Un método para modular la emergencia y/o crecimiento de monocotiledóneas, juncias o malezas dicotiledóneas, CARACTERIZADO porque comprende aplicar a la maleza o suelo una cantidad de la combinación de las reivindicaciones 11-13, efectiva para modular la emergencia y/o crecimiento de las malezas.
16. Una semilla CARACTERIZADA porque comprende la combinación de la reivindicación 13.
17. Uso de un compuesto seleccionado del grupo que consiste de (A) un compuesto que tiene las siguientes propiedades: (i) un peso molecular de aproximadamente 525-555 como se determina por Cromatografía Líquida/Espectroscopia de Masas (LC/MS); (ii) H NMR con valores de 6.22, 5.81 , 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31 , 3.93, 3.22, 3.21 , 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (iii) tiene 3C NMR con valores de 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51 y (¡v) un tiempo de retención de Cromatografía Líquida de Alta Presión (HPLC) de aproximadamente 10-15 minutos, en una columna de HPLC C-18 de fase inversa usando un gradiente de agua:acetonitrilo (CH3CN); (B) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-indol que comprende al menos una porción indol, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido, al menos un grupo éster carboxílico; al menos 17 carbonos, al menos 3 oxígenos y al menos 2 nitrógenos; (C) un compuesto que tiene una estructura oxazolil-bencilo que comprende al menos una porción bencilo, al menos una porción oxazol, al menos un grupo alquilo sustituido y al menos un grupo amida; al menos 15 carbonos, al menos 2 oxígenos, al menos 2 nitrógenos; (D) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, al menos tres grupos metileno, al menos una porción tetrahidropiranosa, al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos veinticinco carbonos, al menos ocho oxígenos y al menos un nitrógeno y (E) un compuesto que tiene al menos un éster, al menos una amida, un grupo metileno epóxido, al menos una porción tetrahidropiranosa y al menos tres enlaces dobles olefínicos, al menos seis grupos metilo, al menos tres grupos hidroxilo, al menos 25 carbonos, al menos 8 oxígenos, y al menos 1 nitrógeno, y opcionalmente un pesticida para formular una composición para modular la infestación de plagas en una planta y/o modular la emergencia y/o crecimiento de monocotiledóneas, malezas de dicotiledóneas o juncias.
18. El uso de conformidad con la reivindicación 17, en donde la plaga es seleccionada a partir del grupo que consiste de nemátodos, hongos, malezas e insectos.
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