JP5784640B2 - バークホルデリア(Burkholderia)属の単離菌株およびそれに由来する殺虫性代謝物 - Google Patents
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Description
プロテオバクテリアのβ‐亜門(β-subdivision)である、バークホルデリア(Burkholderia)属は、様々な環境的隙間に生息する40を超える種を含む(Compantら、2008)。バークホルデリア属の菌種は、土壌及び根圏に遍在する生物体である(CoenyeとVandamme、2003;ParkeとGurian-Sherman、2001)。伝統的に、これらは、植物病原菌として知られており、バークホルデリア・セパシア(B. cepacia)は、タマネギの疾病を惹起する病原体として発見され、同定された最初のものである(Burkholder、1950)。数種類のバークホルデリア種は、これらの植物宿主との有益な相互作用を発達させている(例えば、Cabballero-Melladoら、2004、Chenら、2007参照)。また、かなりのバークホルデリア種は、ヒトに対して日和見の病原性があることが見出されている(例えば、ChengとCurrie、2005、およびNiermanら、2004参照)。
オキサゾール、チアゾールおよびインドールは、植物、藻類、海綿、および微生物に広く分布している。多くの天然産物は、1以上の5員環のオキサゾール、チアゾールおよびインドール核/部位(moiety)を含む。これらの天然産物は、立証可能な治療的価値のある幅広い生物活性スペクトルを示す。例えば、広く処方される抗癌剤である、ブレオマイシンA(Tomohisaら)は、DNAの酸化的分解反応に影響を与え、ビチアゾール部分を利用して、その標的DNA配列に結合する(Vanderwallら、1997)。チアゾリン含有ペプチド系抗生物質である、バシトラシン(Mingら、2002)は、C55-バクトプレノールピロホスファート(C55-bactoprenolpyrophosphate)との錯体形成によって細菌の細胞壁の新たな生合成を阻止する。チアンガゾール(Kunzeら、1993)は、1つのオキサゾールと、3つのチアゾリンのタンデム配列を含み、抗ウイルス活性を示す(Jansenら、1992)。
(A)配列番号8、11および12に示す配列と少なくとも99%の同一性を有する、フォワード配列と、配列番号9、10、13、14及び15と少なくとも99%の同一性を有する、リバース配列とを含む、16S rRNA遺伝子配列を有し;
(B)農薬活性を有し;かつ
(C)テンプラゾールA、テンプラゾールB、テンプラミドA、テンプラミドB、FR90128及びFR901465からなる群から選ばれる農薬化合物を産生する。
前記記載の菌株の培養物、前記記載の菌株の細胞画分、全細胞培養物、それらの上清、及びそれらの抽出物からなる群から選ばれるものである、ことを特徴とする農薬混合物。
前記農薬混合物が、バークホルデリア(Burkholderia)A396(NRRL寄託番号B-50319)から得られる、テンプラゾールA、テンプラゾールB、テンプラミドA、テンプラミドB、FR90128及びFR901465からなる群から選ばれるものである、ことを特徴とする単離された化合物を有効成分として含有する農薬混合物。
(1)前記菌株を20〜30°Cで3〜7時間培養する培養工程、
(2)前記菌株の培養物を室温で1〜3時間振蘯することにより、樹脂で抽出する工程、
(3)前記工程(2)で得られた樹脂と細胞との塊を布で濾過し;前記樹脂、細胞塊及び前記布を有機溶媒に浸し;前記有機溶媒を濾別して乾燥させることによって、粗抽出物を得る工程と;
(4)前記工程(3)で得られた粗抽出物を、C18逆相液体クロマトグラフィーを用いて分画する工程と、を含み、
前記化合物は、テンプラゾールA、テンプラゾールB、テンプラミドA、テンプラミドB、FR90128及びFR901465を含む、ことを特徴とする方法。
(a)バークホルデリア菌株の純粋培養物、細胞画分、全細胞培養物、上清、及びこれらの抽出物からなる群から選ばれる第1の物質と、(b)化学農薬又は生物農薬である第2の物質と、を含む農薬組成物。
(c)担体、希釈剤、界面活性剤及びアジュバントからなる群から選ばれる、少なくとも1種以上をさらに含む、前記記載の農薬組成物。
前記第2の物質は、殺線虫剤、除草剤、防カビ剤、および殺虫剤からなる群から選ばれる農薬である、前記記載の農薬組成物。
植物、その種子、及び前記植物の成長に使用される基質からなる群から選ばれる少なくとも1つに、下記の化合物及び下記の組成物からなる群から選ばれるいずれかを、植物における有害生物の蔓延をモジュレートするのに有効な量で適用することを含む、有害生物の蔓延をモジュレートするための方法:
(1)バークホルデリア(Burkholderia)A396(NRRL寄託番号B-50319)から得られる、テンプラゾールA、テンプラゾールB、テンプラミドA、テンプラミドB、FR90128及びFR901465からなる群から選ばれる単離された農薬化合物;
(2)バークホルデリア菌株由来の純粋培養物、細胞画分、全細胞培養物、上清、及びこれらの抽出物からなる群から選ばれる第1の物質と、(b)化学農薬又は生物農薬である第2の物質と、を含む農薬組成物;
(3)担体、希釈剤、界面活性剤及びアジュバントからなる群から選ばれる、少なくとも1つをさらに含む、上記(2)に記載の農薬組成物;及び
(4)前記第2の物質は、殺線虫剤、除草剤、防カビ剤、および殺虫剤からなる群から選ばれる農薬である、上記(2)に記載の農薬組成物。
単子葉植物である雑草、カヤツリグサ科の雑草、双子葉植物である雑草及び土壌からなる群から選ばれる少なくとも1つ以上に、下記の化合物及び下記の組成物からなる群から選ばれるいずれかを、前記雑草の出現及び/又は成長をモジュレートするのに有効な量で適用することを含む、前記雑草の出現及び/又は成長をモジュレートするための方法:
(1)バークホルデリア(Burkholderia)A396(NRRL寄託番号B-50319)から得られる、テンプラゾールA、テンプラゾールB、テンプラミドA、テンプラミドB、FR90128及びFR901465からなる群から選ばれる単離された農薬化合物;
(2)バークホルデリア菌株由来の純粋培養物、細胞画分、全細胞培養物、上清、及びこれらの抽出物からなる群から選ばれる第1の物質と、(b)化学農薬又は生物農薬である第2の物質と、を含む農薬組成物;
(3)担体、希釈剤、界面活性剤及びアジュバントからなる群から選ばれる、少なくとも1つをさらに含む、上記(2)に記載の農薬組成物;及び
(4)前記第2の物質は、殺線虫剤、除草剤、防カビ剤、および殺虫剤からなる群から選ばれる農薬である、上記(2)に記載の農薬組成物。
特定の実施態様においては、単離菌株には下記の単離菌株が含まれるが、これに限定されない。
非バークホルデリア・セパシア、非バークホルデリア・プランタリ(non-Burkholderia plantari)、非バークホルデリア・グラディオリ(non-Burkholderia gladioli)である、バークホルデリア種であって、下記の特性を有する単離菌株を提供する。
a.配列番号8、11および12に示す配列と少なくとも99.0%の同一性を有する、フォワード配列と、配列番号9、10、13〜15と少なくとも99.0%の同一性を有する、リバース配列とを含む、16S rRNA遺伝子配列を有し;
b.農薬活性、特に、除草活性、殺虫活性、殺真菌活性、および殺線虫活性を有し;
c.(i)(a) 液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/Mass)によって決定された分子量が約525-555であり; (b) 1 H NMRの値が、6.22, 5.81, 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31, 3.93, 3.22, 3.21, 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02であり; (c) 13 C-NMRの値が、172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51であり、そして(c) 水:アセトニトリル(CH 3 CN)のグラジエントを用い逆相C18-HPLCカラム上における高速液クロマトグラフィー(HPLC)の保持時間が、約10〜15分である化合物である。
(iii) 少なくとも1つのベンジル部位と、少なくとも1つのオキサゾール部位と、少なくとも1つの置換アルキル基及びアミド基と;少なくとも15個の炭素と、少なくとも2個の酸素と2個の窒素とを含む、オキサゾリル‐ベンジル構造を有する化合物;
(iv) 少なくとも1つのエステルと、少なくとも1つのアミドと、少なくとも3個のメチレン基と、少なくとも1つのテトラヒドロピラノース部と、少なくとも3つのオレフィン二重結合と;少なくとも6個のメチル基と、少なくとも3個のヒドロキシル基と;少なくとも25個の炭素と少なくとも8個の酸素と1個の窒素とを含む化合物;であって、
d.哺乳類、鳥類、及び魚類等の脊椎動物に対しては非病原性(非感染性)であり、
e.カナマイシン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、ピペラシン、イミペネム、及びスルファメトキサゾール及びトリメトプリムに対して感受性があり(susceptible)、
f.16:0、シクロ17:0、16:0、3-OH、14:0、シクロ19:0ω8c, 18:0の脂肪酸を含む、
からなる群より選ばれる少なくとも1つの化合物を産生する。
特別の実施態様において、この株はバークホルデリアA396株(NRRL受託番号B-50319)と同定される特性を有する。
特に、単離された殺虫性の(pesticidal)化合物は、下記のものを含むがこれらに限定されない:
(A) 以下の特性を有する化合物:(i) 液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)によって決定された分子量が約525〜555 (LC/MS); (ii) 1 H NMR δ 値が 6.22, 5.81, 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31, 3.93, 3.22, 3.21, 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (iii) 13 C NMRδ 値が 172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51 及び (iv) 水‐アセトニトリル(CH 3 CN)グラジエントを用いた逆相C-18 HPLCカラム上での高速液体クロマトグラフィー (HPLC)の保持時間が約10〜15分;
(B) 少なくとも1つのインドール部分、少なくとも1つのオキサゾール部分、少なくとも1つの置換アルキル基、少なくとも1つカルボン酸エステル基;少なくとも17個の炭素、少なくとも3つの酸素、および2つの窒素を含むオキサゾリル‐インドール構造を有する化合物;
(C) 少なくとも1つのベンジル部分、少なくとも1つのオキサゾール部分、少なくとも1つの置換アルキル基、少なくとも1つアミド基;少なくとも15個の炭素、少なくとも2つの酸素、および2つの窒素を含むオキサゾリル‐ベンジル構造を有する化合物;
(D) 少なくとも1つのエステル、少なくとも1つのアミド、少なくとも3つのメチレン基、少なくとも1つのテトラヒドロピラノース部分、少なくとも3つのオレフィン二重結合、少なくとも6つのメチル基、少なくとも3つのヒドロキシル基、少なくとも25個の炭素、少なくとも8つの酸素、および1つの窒素を有する、化合物;並びに、
(E)少なくとも1つのエステル、少なくとも1つのアミド、エポキシドメチレン基、少なくとも1つのテトラヒドロピラノース部分、少なくとも3つのオレフィン二重結合、少なくとも6つのメチル基、少なくとも3つのヒドロキシル基、少なくとも25個の炭素、少なくとも8個の酸素、および少なくとも1つの窒素を有する、化合物。
(A)少なくとも1つのインドール部分、少なくとも1つのオキサゾール部分、少なくとも1つの置換アルキル基、少なくとも1つのカルボン酸エステル基、少なくとも17個の炭素、少なくとも3つの酸素、及び少なくとも2つの窒素を含んだオキサゾリル‐インドール構造を有し;次に示すものを少なくとも1つ有する、化合物:(i)分子量が約275〜435;(ii) 1H NMR δ値が 8.44, 8.74, 8.19, 7.47, 7.31, 3.98, 2.82, 2.33, 1.08;
(iii) 13C NMR δ 値が 163.7, 161.2, 154.8, 136.1, 129.4, 125.4, 123.5, 123.3, 121.8, 121.5, 111.8, 104.7, 52.2, 37.3, 28.1, 22.7, 22.7; (iv) 水‐アセトニトリル(CH3CN)グラジエント溶媒系と210nmにおけるUV検出を用いた逆相C-18 HPLCカラム上での高速液体クロマトグラフィー (HPLC)の保持時間が約10〜20分;(v) UV 吸収帯が約226, 275, 327 nm.;
(A) 構造##STR001##を有する化合物、または農薬として(pesticidally)許容され得るその塩又はそれらの立体異性体、ここで、Mは1, 2, 3 又は4であり; nは0, 1, 2, 又は3であり; p及びqは独立に1又は2であり; XはO, NH又はNR; R1, R2及びR3は、同一又は異なっており、独立して、アミノ酸側鎖部位またはアミノ酸側鎖誘導体であり、Rは、低級鎖アルキル、アリール、またはアリールアルキル部分である;
(C)構造##STR002a##を有する化合物
(D) 構造##STR003##を有する化合物
(E) 下記の構造##STR003a##を有する化合物
(F) 下記の構造##STR004a##を有する化合物
(G)構造##STR004b##を有する化合物
(H) 構造 ##STR004c##を有する化合物
(I) 構造##STR005##を有する化合物
(J) 構造##STR006a##を含む化合物
もっとも特別な実施形態においては、前記化合物は以下のものを含むが、これらに限られない。
(ii) テンプラゾール B:
(iii) テンプラミド A:
(iv) テンプラミド B:
(v) FR90128;
また、上記の化合物を得るための方法も提供される。特に、上記方法は、本明細書中で開示されたバークホルデリア種を培養する工程と、上記化合物を産生する工程とを含む。さらに、バークホルデリア株によって産生された化合物を単離することによって、これらの化合物を単離する方法を提供する。この方法は、バークホルデリア株の培養上清から製造された化合物を単離する工程を含む。
(a) (i) 農薬として任意に使用することができる、上記のバークホルデリア株由来の純粋な培養物、細胞の画分、又は上清又はそれらの抽出物からなる群から選ばれる第1物質;(ii) 上記の1以上の化合物;(b) 任意の第2物質、ここで上記第2物質は、化学的又は生物学的な農薬であり、そして:(c) 任意の、少なくとも1つの担体、希釈剤、界面活性剤、アジュバント、又は農薬を含む組み合わせ(combination)が提供される。特別な実施形態では、前記組み合わせは組成物である。関連する特徴では、上記組成物で被覆された種子が提供される。
(II)上述した組成物もしくは組合せ。
別の関連する態様では、植物における害虫の蔓延をモジュレートするための上述した菌株、培養物、抽出物、上清、組み合わせ、化合物の使用、および/または、単子葉類の雑草、カヤツリグサ科の雑草もしくは双子葉類の雑草の発生もしくは成長を調節するための方法が提供される。この使用は、植物および/またはそれらの種子および/または上記植物の成長に使用する基質に適用することを含む。
本明細書に記載される値域については特に指定がない限り、それぞれのその範囲内の値(intervening value)は、下限値の10分の1までの値、上限値と下限値の間の値及びその指定範囲内の、いずれの指定値又はその指定範囲内に入るいずれの値を含むものとする。指定の範囲内で、特に排除制限がなければ上限値及び下限値もこの範囲に含まれる。
ここに使用されるように用語“アルキル基”はメチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、t-ブチル基、n-ヘキシル基などを含む炭素原子数約1〜12を有する一価の直鎖または分枝鎖炭化水素基を指す。
ここに使用されるように、“アルケニル”の語は1つ以上の炭素-炭素二重結合及び約2〜12の炭素原子数を有する直鎖または分枝鎖ヒドロカルビル基を指し、“置換アルケニル基”は、更に1つ以上の上記置換基を有するアルケニル基を指す。
ここに使用されるように、用語“アルキニル”は、少なくとも1つの炭素-炭素三重結合及び約2〜12の炭素原子数を有する直鎖または分枝鎖ヒドロカルビル基を指し、用語“置換アルケニル”は更に1つ以上の上記置換基を有するアルキニル基を指す。
ここに使用されるように、“ヘテロアリール”の語は、環状構造の一部に1つ以上のヘテロ原子(例えば、N, O, Sなど)を含み、3〜14の炭素数を有する芳香環を指し、“置換へテロアリール”は、更に1つ以上の上記置換基を有するヘテロアリール基を指す。
ここに使用されるように、“アルコキシル基”は--O-アルキル基を指し、アルキル基は上記規定で定義した通りである。“置換アルコキシル基”は、更に1つ以上の上記置換基を有するアルコキシル基を指す。
ここに使用されるように“シクロアルキル基”は、3〜8の炭素原子数を有する環状アルキル基を指し、“置換シクロアルキル基”は更に1つ以上の上記置換基を有するシクロアルキル基を指す。
ここに使用されるように“複素環”は、環状構造の一部にに1つ以上のヘテロ原子(例えば、N, O, S など)及び3〜14の炭素原子数を有する環式基(即ち、環を含む)を指し、“置換複素環”は更に1つまたは1つ以上の上記置換基を有する複素環基を指す。
本明細書で説明するバークホルデリア菌株は、非セパシア菌群(non-Burkholderia cepacia complex)、 非苗立枯細菌病菌(non-Burkholderia plantari)、 非首腐病菌
( non-Burkholderia gladioli)のバークホルデリア属種(Burkholderia sp)であり、鳥類、哺乳動物及び魚類等脊椎動物に対し非病原性である。この菌株は公知の技術及びLorchら(Lorch et al.,1995)の記載により土壌サンプルから分離できる。バークホルデリア菌株は様々な異なる土壌または増殖培地から分離し得る。サンプルはポテトデキストロ−ス寒天培地(PDA)に植菌する。バクテリアはグラム陰性であり、クリーム色の円形不透明なコロニーを形成する。このコロニーは、時間の経過に伴いピンク色からピンクがかった褐色に変色し、ムコイド又は粘液性に変化する。
バークホルデリア菌株は、カナマイシン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、ピペラシリン、イミペネム及びスルファメトキサゾールとトリメトプリムの組み合わせなどに感染しやすく、16:0, cyclo 17:0, 16:0 3-OH, 14:0, cyclo 19:0, 18:0 の脂肪酸を含む。
このバークホルデリア菌株は、ポテトデキストロース寒天(PDA)培地、またはグルコース、マルトース、フルクトース、ガラクトースなどの定義された炭素原及びペプトン、トリプトン、ソイトン(soytone)及びNZ アミンなどの定義されていない窒素原を含む発酵培地上でバークホルデリア A396(NRRL 受託番号 50319)の特徴を同定できる微生物を培養することにより得られる。
ここに開示する農薬化合物は下記性質を有し得る。(a) 新規なバークホルデリア種、すなわち、A396から得られる; (b) 特に、殆どの農業病害虫に有毒である;(c)約525〜555の分子量を有すること、特には、液体クロマトグラフィ/質量分析(LC/MS)測定による分子量540を有すること;(d)1H NMRの値が 6.22, 5.81, 5.69, 5.66, 5.65, 4.64, 4.31, 3.93, 3.22, 3.21, 3.15, 3.10, 2.69, 2.62, 2.26, 2.23. 1.74, 1.15, 1.12, 1.05, 1.02; (d) 13C NMRの値が172.99, 172.93, 169.57, 169.23, 167.59, 130.74, 130.12, 129.93, 128.32, 73.49, 62.95, 59.42, 57.73, 38.39, 38.00, 35.49, 30.90, 30.36, 29.26, 18.59, 18.38, 18.09, 17.93, 12.51であること;
及び水:アセトニトリルのグラジエント溶媒系(0-20分; 90-0%の水性アセトニトリル
, 20-24分; 100%のアセトニトリル, 24-27分; 0-90%の水性アセトニトリル, 27-30
分;90%の水性アセトニトリル)を用いる高速液体クロマトグラフィー(HPLC)おいて、
流速0.5 ml/min下で210 nm におけるUV検出結果、カラムにおける保持時間が約10
〜15分、より詳細には約12分、更に詳細には約12.14分であること;
有すること;(g) 13C NMRスペクトルにおいて、5個のメチル基、4個のメチレン基、
9個のメチン基を及び6個の4級炭素原子を含む計24個の炭素シグナルが観測される
こと;(g) 1H NMRスペクトルおいて、3個のアミノプロトン[4.63,4.31, 3.93]及び1
個のエステルカルビノールプロトン[5.69]を含むデプシペプチド独特の特性が示され
ること。
ある特定の実施形態において、この化合物は##STR001##の構造を有する。
ある特定の実施形態において、化合物はFR90128の構造を有する。
他の特定の実施形態において、##STR002##族化合物は(vi)-(xix)に示す化合物であっても良い。
化合物##STR003##も提供する。
さらに、化合物##STR005##を提供する。
ある特定の実施形態において##STR005##族化合物、例えば、以下に示す化合物xx-xxiiiは自然物ソースまたは市販品もしくは化学合成品である。
(b) 分子量が約530〜580であり、より詳しくは、液体クロマトグラフィー/質量分析測定(LC/MS)による分子量が555であること;
(c) 1H NMR δ 値が6.40, 6.39, 6.00, 5.97, 5.67, 5.54, 4.33, 3.77, 3.73, 3.70, 3.59, 3.47,3.41, 2.44, 2.35, 2.26, 1.97, 1.81, 1.76, 1.42, 1.37, 1.16, 1.12, 1.04であること;
(d) 13C NMR δ 値が 173.92, 166.06, 145.06, 138.76, 135.71, 129.99, 126.20, 123.35, 99.75,82.20, 78.22, 76.69, 71.23, 70.79, 70.48, 69.84, 60.98, 48.84, 36.89, 33.09, 30.63, 28.55,25.88, 20.37, 18.11, 14.90, 12.81, 9.41であること;
を含む13個のメチン及び4個の4級炭素に帰属できる28個の異なる炭素シグナルを
示すこと;
(g) エレクトロスプレ−質量分析及(ESIMS)及び核磁気共鳴分析(NMR)分析による分
子式がC28H45NO10であること;
(h) 210-450nmに、最も明確には234nm にUV吸収帯を有すること.
##STR004a##の構造を有する化合物も提供する。
ある特定の実施形態において、化合物は##STR004b##の構造を有する。
さらに、ある特定の実施形態において、化合物は下記構造を有するテンプラミド(Templamide) Aである。
また、他の実施形態において、化合物はバークホルデリア種から得られる少なくとも1つのエステル、少なくとも1つのアミド、1つのエポキシドメチレン基、少なくとも1つのテトラヒドロピラノース基、及び少なくとも3つのオレフィン二重結合、少なくとも6つのメチル基、少なくとも3つのヒドロキシル基、少なくとも25個の炭素及び少なくとも8個の酸素と1個の窒素を含む構造を有し、殺虫効果を有することを特徴とする化合物である。この化合物は更に少なくとも下記特性の1つを含む。
(b) 分子量が520〜560であり、より詳しくは、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)により決定された分子量が537であること;
(c) 1H NMR δ 値が 6.41, 6.40, 6.01, 5.97, 5.67, 5.55, 4.33, 3.77, 3.75, 3.72, 3.64, 3.59, 3.54, 3.52, 2.44, 2.34, 2.25, 1.96, 1.81, 1.76, 1.42, 1.38, 1.17, 1.12, 1.04であること;
(d) 13C NMR δ 値が174.03, 166.12, 143.63, 137.50, 134.39, 128.70, 126.68, 124.41,98.09, 80.75, 76.84, 75.23, 69.87, 69.08, 68.69, 68.60, 48.83, 41.07, 35.45,31.67, 29.19, 27.12, 24.55, 19.20, 18.95, 13.48, 11.39, 8.04であること;
(f) エレクトロスプレ−質量分析及(ESIMS)及び核磁気共鳴分析(NMR)による分子式がC28H43NO9であること;
(g) 210-450nmに、最も明確には234nm にUV吸収帯を有すること。
ある特定の実施形態において、化合物は構造##STR006a##を有する。
ある特定の実施形態において、化合物は下記構造を有する。
ある特定の実施形態において、化合物は下記構造を有するテンプラミドB(Templamide B)である。
(b) 分子量が約510〜550であり、より詳しくは、液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)により決定された分子量が523であること;
(c) 1H NMR δ 値が 6.41, 6.40, 6.01, 5.98, 5.68, 5.56, 4.33, 3.77, 3.75, 3.72, 3.65,3.59, 3.55,3.50, 2.44, 2.26, 2.04, 1.96, 1.81, 1.75, 1.37, 1.17, 1.04であること;
(d) 13C NMR δ 値が172.22, 167.55, 144.98, 138.94, 135.84, 130.14, 125.85, 123.37, 99.54, 82.19, 78.28, 76.69, 71.31, 70.13, 69.68, 48.83, 42.52, 36.89, 33.11,30.63, 25.99, 21.20, 20.38, 18.14, 14.93, 12.84であること;
(g) 凡そ210-450nmに、最も明確には234nm にUV吸収帯を有すること。
ある特定の実施形態において、化合物は下記構造を有する公知のFR901465である。この化合物は、従来からシュードモナス菌種No.2663(Nakajima et al. 1996)のバクテリアから培養ブロスにより分離されることが知られており、抗癌活性を有することがすでに報告されている。
本発明のバークホルデリア菌株から生成される実質的に純粋な培養物、細胞画分又は上澄み及び化合物は殺虫組成物を形成し得る。
上記物質は、何れかの方法により組成物を形成し得る。非制限形成例には乳剤(EC)、水和剤(WP)、可溶性液体(SL)、エアロゾル、超微量濃縮物(ULV)、可溶性粉末(SP)、マイクロカプセル化、水分散粒子、流動性物質(FL)、マイクロエマルション(ME)、ナノエマルション(NE)等が含まれるが、これらの形態に限られない。特に、濃縮物、粉末、粒子、乳剤などは凍結乾燥することができる。ここに記載する何れの剤形においても、活性成分の割合は0.01%〜99.99%である。
固形組成物は農薬化合物溶液に固体担体を浮遊させ、懸濁物を穏やかな条件、例えば、室温で蒸発または65℃以下で真空蒸発させることにより生成させることができる。
本発明の組成物は、本発明のバークホルデリア菌株に由来するゲルカプセル化合物を含むことができる。このようなカプセル化されたゲル状組成物は、本発明の方法に用いられる農薬化合物溶液にゲル形成を引起すゲル形成剤(例えば、ゼラチン、セルロース又はリグニン)を混合することにより生成することができる。
の生物殺菌剤または殺菌剤を含むことができる。これらの殺菌剤にはベンズイミダゾール、脱メチル化反応阻害剤(DMI)(例えば、イミダゾール、ピペラジン、ピリミジン、トリアゾール)、モルホリン、ヒドロキシピリミジン、アニリノピリミジ、ホスホロチオラート、キノンアウトサイド阻害剤、キノリン、ジカルボキスイミド、カルボキスイミド、フェニルアミド、アニリノピリミジン、フェニルピロ−ル、芳香族炭化水素、桂皮酸、ヒドロキシアニリド、抗生物質、ポリオキシン、アシルアミン、フタルミド、ベンゼノイド(キシリルアアラニン)のシングルサイト抗菌剤が含まれ得るが、これらのシングルサイト抗菌剤に限定されない。
発芽後除草剤において、施用される処方成分にはスメクタイト粘土、アタパルジャイ
ト粘土及び類似の膨潤粘土、増粘剤、例えば、キサンタンゴム、アラビア・ゴム及び他の多糖増粘剤及び非イオン性界面活性剤(例えば、ポリオキシエチレンモノラウレート)等分散安定剤などが含まれることができる。
本明細書に記載されるバークホルデリア属菌株由来の組成物及び農薬化合物は農薬として、特には殺昆虫剤、殺線虫剤、殺菌剤及び除草剤として利用することができる。
特に上記説明の方法を用いて抑制できる線虫には根こぶ、リング(ring)、 スティング(sting)、 ランス(lance)、嚢胞等寄生線虫及び下記病変線虫(lesion nematodes)が含まれるが、これらの線虫に限られない。上記病変線虫にはメロイドジン属(Meloidogyne)、ヘテロデラ属(Heterodera)及びグロボデラ種(Globodera spp.);特には、メロイドジン・インコグニタ(Meloidogyne incognita)(ネコブセンチュウ)、及びグロボデラ・ロストシネンシス(Globodera rostochiensis)とグロボデラ・パイリダ(globodera pailida)(ジャガイモシストセンチュウ);ヘテロデラ・グリシネス(Heterodera glycines)(ダイズシストセンチュウ); ヘテロデラ・スキャッティ(Heterodera schachtii)(ビートシストセンチュウ)及びヘテロデラ・アヴェナエ(Heterodera avenae)(ムギシストセンチュウ)が含まれるが、これら病変線虫に限られない。
ある特定の実施形態において、昆虫はスジキリヨトウ属(Spodoptera)の一種であればよく、特にはシロイチモジヨトウ(Spodoptera exigua)、モモアカアブラムシ(Myzus Persicae)、コナガ(Plutella xylostella)またはエウスキスツス種(Euschistus sp.)である。
ある特定の実施形態において、雑草は、アカザアルバム(Chenopodium album)、イチビ(Abutilon theophrasti)、ヒマワリ(Helianthus annuus)、アンブロシア・アルテミシフォリア(Ambrosia artemesifolia)、アオゲイトウ(Amaranthus retroflexus)、セイヨウヒルガオ(Convolvulus arvensis)、野生のマスタード(Brassica kaber)、セイヨウタンポポ(Taraxacum officinale)、イヌホオズキ(Solanum nigrum)、マルバ・ネグレクト(Malva neglect)、セタリア・ルテセンス(Setaria lutescens)、ウマノチャヒキ(Bromus tectorum)、スズメノカタビラ(Poa annua)、ナガハグサ(Poa pratensis)、ホノムギ(Lolium perenne L.var.Pace)、トールフェスク(Festuca arundinaceae Schreb. var. Aztec II)、アンテムII(Anthem II)、LS1100、ヒメイヌビエ(Echinochloa crus-galli)、レタス(Lactuca sativa)であっても良い。
[実施例]
上記組成物及び方法を以下の非制限実施例においてさらに詳しく説明する。これらの実施例は、様々な実施形態を説明するものであり、クレームした本発明を、ここに記載する原料、条件、重量比、プロセスパラメータなどのみに限定するものではない。
1.1 微生物の分離
日本日光輪王寺にある常緑樹の下の土壌からサンプル採集し、既知技術を用いて微生物を分離した。Lorchら(Lorch et al., 1995)により詳細に記載された手順に従い、ポテトデキストロース寒天培地(PDA)を用いて、分離を行なった。この手順では、まず土壌サンプルを滅菌水で希釈し、その後、ポテトデキストロース寒天(PDA)のような固体寒天培地にプレートした。プレートを25℃で5日間成長させ、個々の微生物コロニーを分離し、それぞれ異なるPDAプルートに移した。分離されたバクテリアはグラム陰性であり、クリーム色の円形で不透明なコロニーを形成する。コロニーは、時間の経過に伴ってピンク色及びピンクがかった褐色に変色し、ムコイド又は粘液に変化した。
微生物の同定は、遺伝子配列に基づいてユニバーサルバクテリアプライマーを用いて16S rRNA部位を増幅させることにより行なった。以下のプロトコールに従い実施した。バークホルデリア種A396をポテトデキストリン培地で培養した。24時間培養後、培養物を滅菌済みのループでかき取り、DNA抽出緩衝液に再懸濁させた。DNAはMoBio Ultra Clean Microbial DNA抽出キットを用いて抽出した。DNA抽出液5μlを1%アガロースゲルに展開し定性、定量を行なった。
PCR産物中の過剰プライマー、dNTPs及び酵素はMoBio PCR clean up kitを用いて取除いた。浄化したPCR産物はプライマー27F(同上)、530F(5'-GTGCCAGCCGCCGCGG-3'(配列番号3))、1114F(5'-GCAACGAGCGCAACCC(配列番号4))及び1525R(5'-AAGGAGGTGWTCCARCC-3'(配列番号5))、1100R(5'-GGGTTGCGCTCGTTG-3'(配列番号6))、519R(5'-GWATTACCGCGGCKGCTG-3'(配列番号7)を用いて直接に配列解析を行なった。
フォワード配列、27Fプライマーを有するDNA配列、815ヌクレオチド(SEQ ID NO:8);
リバース配列、1453bp、使用プライマー1525R、1100R、519R(SEQ ID NO:9);リバース配列、824bp、使用プライマー907R(SEQ NO:10);フォワード配列1152bp、使用プライマー530F(SEQ NO:11);フォワード配列1067bp 使用プライマー1114F(SEQ NO:12);リバース配列1223bp、使用プライマー1525R(SEQ NO:13);リバース配列1216bp、使用プライマー1100R(SEQ ID NO:14);リバース配列1194bp、使用プライマー 519R(SEQ ID NO:15)
1.3.1 特異的なPCRプライマーを用いる分子生物学研究
バークホルデリアA396がバークホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)であることを特定するために、更にハウスキーピング遺伝子の遺伝子配列解析を行った。バークホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)は、セパシア菌群(Burkholderia cepacia complex)として知られている。Mahenthiralingamらの記載(Mahenthiralingam et al.,2000)に従い、遺伝子recAに着目し、下記のプライマーを用いてPCR反応を行った。
A396分離株がバークホルデリア新種であることを確認するために、バークホルデリア・マルチボランス(Burkholderia multivorans)(16S rRNAに最も近似配列を有する)を用いて、DNA-DNAハイブリダイゼーション実験を行なった。A396及びバークホルデリア・マルチボランス(B.multivorans)の 生物体量(Biomass)ともISP2培養液で、ファーンバック(Fernbach)フラスコ中で、200rpm/25℃下、48時間培養した。遠心分離により無菌的に生物体を得た。培養液をデカントし、細胞ペレットを水:イソプロパノール1:1の溶液に再懸濁させた。
炭素原利用プロフィール作成のために、A396をポテトデキストロース寒天(PDA)培地で一晩培養した。製造メーカ(Biolog, Hayward,CA)の推奨に従い、培養物をBUG培地に移し、生物学的実験に適切な培養物を産生させた。
微生物の生化学的プロフィールは、Biolog GN2 plateに培養物を植菌し、MicroLog 4自動マイクロステーションシステムを用いて、24時間インキュベーション後のプレートを読み取ることにより作成した。未知のバクテリアの同定は、作成したバクテリアの炭素ユーティライゼイションパタンをMicrolog 4 グラム陰性データベースと比較して行なった。
その結果を表1に示す。
28℃において24時間インキュベーションした。白金耳量の良く増殖した生育細胞を採取し、脂肪酸メチルエステルを調製、分離した。Vandammeら(Vandamme et al., 1992)の記載に従いSherlock Microbial Identificationo System(MIDI社)を用いて同定を行なった。バークホルデリアA396中に存在する主な脂肪酸は下記の通りであった。16:0 (24.4%), シクロ 17:0(7.1%), 16:0 3-OH(4.4%), 14:0(3.6%), 19:0ω8c(2.6%)シクロ, 18:0(1.0%)。合計された特徴(summed feature)8(18:1ω7cを含む)及び合計された特徴3(16:1ω7c及び16:1ω6cを含む)は、それぞれ全ピーク面積の26.2%及び20.2%に対応した。
A396の脂肪酸組成物を、MIDIデータベースにおける既知微生物菌株の脂肪酸と比較すると、新規A396に含まれる脂肪酸はBurkholderia cenocepacia脂肪酸に最も類似することが示された。
バークホルデリアA396の抗生物質感受性は抗生物質ディスク法を用いてPML Microbiological's technical data sheet #535に記載されるように、ミューラー・ヒントン(Muller Hinton)培地において試験した。25℃で72時間インキュベート後に得られた結果を表2に示す。
2.1 実験#1
初期の除草剤スクリーニングで発見したその活性を確認するために、新規バークホルデリア種の5日目の全細胞の培養液に由来する、アンバーライト7XAD樹脂の抽出物を使用してin vivo実験を行った。0.2%非イオン性活性面活剤(glycosperse)を含む4%エタノール中に、乾燥粗抽出物を10mg/mlの濃度で再懸濁し、更に5.0mg/mlの濃度に希釈した。この2つの試料を4週齢のサンシキヒルガオ(Convolvulus arvensis)に散布し、その植物を2週間、室温25度で生育光の下に維持し、毒性を評価した。同じ実験で、細菌の培養物から抽出した粗抽出物を、その濃度を高めながら2週齢のレッドルート・アカザに散布した。試験濃度を、1.25、2.5、5.0及び10.0mg/mlとし、その植物の毒性評価の前に、上記の通りにインキュベートした。
図2(サンシキヒルガオ)と図3(アカザ)に示した異なる濃度のバークホルデリア種粗抽出物の植物毒性効果の結果から、アカザには低濃度でも除草効果がある事が示された。いずれの濃度(5mg/mlと10mg/ml)の抽出物を使用した場合でも、サンシキヒルガオの発育は阻止された。
新規バークホルデリア種A396を、定義されていないミネラル培地の中で、5日間(25度、200rpm)増殖させた。全細胞培養物をXAD7樹脂を使って抽出した。0.2%非イオン性界面活性剤(glycosperse)を含む4%エタノール中に、この乾燥粗抽出物を10mg/mlの濃度で再懸濁し、更に5.0mg/ml、2.5mg/ml、及び1.25mg/mlの濃度に希釈した。その後、4種全ての試験溶液を使用して、下記の表3に挙げた広葉種とイネ科雑草種を試験した。
全植物種を3個づつ、4インチX4インチのプラスチック製の鉢の中で試験した。未処理(UTC)の植物には、キャリア溶液(0.2%glycosperseを含む4%エタノール)を、陽性対照の植物には1エーカーにつき6液量オンスに相当する割合でラウンドアップを散布した。
処理した植物を、温室中で12時間ずつ、明暗の条件下で維持した。植物毒性のデータを#1−8種については、テスト液散布後22日目に測定し、#9−12種については12日目に測定し、その結果をそれぞれ表5及び表6にまとめた。表4には、表5及び表6に使用した評価スケールを示した。
テスト液を塗布した7日目に、苗を評価した。観察された症状は、火傷、歪み、白斑を含む。除草活性は、テスト液を塗布した葉に隣接する上の葉で観察された。テストした雑草中で、全般的効果は見られなかった。
2回目の実験で、同じ粗抽出物(10 mg/ml)を5個の画分を、上記と同じ実験計画で評価した。カラシと麦とメヒシバの苗を処理した。試験後7日目及び20日目に、C−18カラム(Phenomenex Sepra C18-E, 50 μm, 65Å)を使用した5つの画分のうち、4つ画分を用いた(091113B4F6, 091113B4F7, 091113B4F8と091113B4F9)カラシで、除草活性の症状が現れた。症状はテスト液を塗布した葉に隣接する上の葉で見られた。テストした雑草では全草的な活性は見られなかった。
3.1. 接触活性の検討
新規なバークホルデリア種の培養物からの化合物が、レピドプテランペスト(幼虫)に対し接触活性があるかどうかを決めるために、初期のスクリーニング段階で、以下のアッセイを使用した。このアッセイを、全細胞培養液の抽出物から得られた活性画分とピークとを決定するために、さらにバイオアッセイ誘導分別のツールとして使用した。
第3齢後半期の幼虫であるキャベツルーパ(Tricoplusia ni)又は第3齢早期の幼虫シロイチモンジヨトウ(Spodoptera exigua)のいずれかを、各1.25オンスのプラスチックカップの中に入れて、試験を行った。
注射後、それぞれのカップを空気穴の空いたパラフィルムで覆い、その後、そのカップを26℃で3日間、インキュベートした。投薬24時間後から致死率の評価を開始し、毎日評価した。
図4及び図5には接触活性テストの結果を示す。その結果によれば、バークホルデリア種の培養物からのフィルター滅菌された培養物は、テストしたすべての害虫の約40%を3日以内に殺した。希釈した培養物(50%)は活性が低く、テストしたいずれの害虫でも対照の約10%であった。
200μlの固形のシロイチモンジヨトウ虫用の人工餌を各ウェルの中に入れ、マイクロタイタープレートを使い、下記の96ウェルプレートのアッセイフォーマットを用いるダイエットーオーバーレイテスト(diet-overlay test)により、餌を介しての直接的な毒性作用をテストした。それぞれの試料100μlを餌の上に滴下し(各ウェル中に1個のサンプルを入れた)、試料の表面が乾燥するまで風乾した。それぞれの試料(0.2ミクロンの滅菌フィルターを通してフィルター滅菌した)について各6匹を用いて試験を行った。陰性対照として水を使用し、陽性対照として市販のBt(B.thuringiensis)を使用した。
テスト害虫の3齢幼虫(キャベツルーパー(Trichoplusia ni);シロイチモンジヨトウ(Spodoptera exiqua);コナガ(Plutella xylostella)を1匹ずつそれぞれのウェルの中に置き、そしてそのプレートを空気穴を開けたプラスチックで覆った。
このデータは、希釈せずにフィルター滅菌した培養液で、7日間のインキュベーション期間の終わりには100%コントロールする事が出来る事を示している。4倍希釈した培養液でも似たようなコントロールが得られ、実験の終わりに、未希釈培養液と4倍希釈培養液の双方を、陽性対照として使用したBtと比較した。しかしながら、Btの効果はバークホルデリア培養液の効果より有意に早かった。アワヨトウの幼虫に対するエフィカシーは、培養液の濃度に依存し、また、最も低い濃度と2番目に低い濃度の培養液(12.5%と6.125%)とを、最も高い濃度と2番目に高い濃度の培養液と比べると、より低いコントロールとなっていた。しかしながら、12.5%の希釈液は25%の希釈液に比べて、それ程低くはなかった。16倍に希釈した培養液ははっきりした十分な活性を示さなかったが、7日間の実験の間に、部分的ではあったが、アワヨトウの(33%)コントロールが出来た。キャベツルーパーとコナガの幼虫にも同じ希釈した濃度の培養液を使用し、それらによる死亡率は、6.25%の培養液でキャベツルーパーの死亡率は80%で、コナガの死亡率は50%と少し高めだった。
5匹の成虫カメムシ(Euschistus sp.)を、それぞれ一枚のペーパタオルが敷いてある16ozの各プラスチック容器内に置いた。2mlの各試料(フィルター滅菌済みの全培養液)を入れたマイクロ遠心チューブに綿球で蓋をし、各プラスチック容器の底にねかせた。そのチューブの横に、1粒のヒマワリの種の餌を置いた。陰性対照として水を使用し、陽性対照として、推奨されている割合のピレトリンとPBOとの市販品を使用した。それぞれの容器の蓋を閉め、7日間25度でインキュベートし、毎日、死亡率をチェックした。
濾過した全細胞培養液のin vivoでのエフィカシーを、テスト害虫としてのモモアカアブラムシ(Myzus persicae)と植物のカラシとを用いて試験した。約1カ月齢のフロリダ広葉マスタード(Brassica sp.)に、フィルター滅菌済みのバークホルデリア種の全細胞培養液を、異なる2つの濃度(1x及び0.5x)で、パッシェ(Paasche)のエアブラシを使って、スプレーした。陰性対照として水を、陽性対照として市販品であるアベルメクチン(Avid)を使用した。植物をベンチ上で乾燥させ、その後、空気穴の開いている蓋付きの6カップのプラスチック容器の中に置いた。成長段階の異なる10匹のアブラムシを、それぞれのテスト植物の上に置き、その植物を25℃で、7日間、生育光の下でインキュベートした。各植物に付いているアブラムシの数を毎日評価し、ノートに記録した。
5.1 実験#1
若い根瘤線虫(Meloidogyne incognita VW6)の活動において、フィルター滅菌済みのバークホルデリア種A396の活性(そして、その後の回復)を調べるために、24ウェルプラスチックカルチャープレートを使って、下記のテストをした。
各テスト容液300μLのアリコート(1xまたは0.5xフィルター滅菌済みの培養液のいずれか)を、それぞれの適当なウェルの中に加え、その後で10μLの脱イオン化水中に分散されている15匹の線虫を各ウェル中に入れ、プレートの蓋を閉め、そして24時間、25度でインキュベートした。陰性対照として水を、陽性対照として20,000X倍に希釈したアビド(Avid)をそれぞれ使用した。
図6に記載したこの結果は、フィルター滅菌済み培養液のいずれのテスト濃度でも、自由に活動していた若い根瘤線虫を、非可動化出来たことを示した。この効力は、少なくとも24時間続き、それによって、バークホルデリア種A396の培養液が線虫による感染から植物を守るために使用できることを示唆している。
実験材料と方法
ミニドレンチテスト:バークホルデリアA396の全細胞培養液を、45mLのポットの中で行う温室アッセイで試験した。
砂土壌で満たされているポットの中に、キュウリシーズ cv.トーチカ(Cucumber seeds cv. Toshka)の種を直接蒔いた。10日後、各ポットを5mLの懸濁液で処理した。使用した具的的な量を表9に示した。
第1のミニドレンチテストにおいて(図9参照)、100mL/L濃度のバークホルデリアA396を適用した場合には、処理効果は非常に高く、ほぼ100%減少した。フォスチアゼート(Fosthiazate)は通常通りに作用した(20ppmで100%制御)。
第2のミニドレンチテストでは(図10参照)、最高濃度100mL/Lで根瘤の100%減少が達成されたが、1.5mL/L濃度では約50%に低下した。フォスチアゼートは通常通り作用した(20ppmで100%制御)。
バークホルデリアA396の線虫作用を立証するために、根瘤線虫を(メロイジン・インコグニタ)を制御するための試験品として、バークホルデリアA396の全細胞培養液を使って、きゅうり(Cucumis sativus)の温室実験を行った。1個のポット当たり1つのきゅうりを土壌中に植え、人工光の下で28度の温室で成長させた。植物を植えた各ポットを、未希釈の試験品、水で5%に希釈した試験品のいずれかのアリコート(約80mL)で処理した。バークホルデリア処理、陽性対照処理としてのテミック(Temik)(ラベルに表示された割合で)処理、及び陰性対象として未添加液処理は、それぞれ各5の試料数(replicate)で行った。植物は温室中で60日間成長させ、その後、各植物を採取して、新シュート重量と根の重量とを評価した。各ポットの中の線虫卵の数を記録し、根重量1g当たりの卵の数を示すパラメターを計算した。統計学的分析(ANOVA)を行い、そして、処理平均値間の統計的差異をp<0.1で計算した。下記表10は、未処理の対照との間で統計的な差が不十分であったとしても、未処理の対照ポットよりA396の全培養液で処理したポットでは、虫卵の数が少なかったことを示す。一個の根塊当たりの卵の数として計算した効果は、希釈した培養液を処理液として使った時に、より明確であった。
実験方法と材料
バークホルデリア種の細胞培養物から抽出したテンプラゾールAとBとを精製するために、下記の手順を用いた。ハイソイ増殖培地中、10Lのバークホルデリア(A396)培養物から得た培養液を、アンバーライトXAD-7樹脂 (アソルカー他、2006)(Asolkar et al., 2006)で抽出した。この抽出は、室温で2時間、225rpmで上記樹脂と細胞懸濁液と一緒に振盪させて行った。チーズクロス(荒目薄地の綿布)を通して濾過して樹脂と細胞の塊を集め、そして脱イオン化水で洗って塩分を除去した。上記樹脂、上記細胞塊及び上記綿布をアセトン中に2時間浸漬し、その後、アセトンを濾別して、ロータリーエバポレーターを用いて真空乾燥させ、粗抽出物にを得た。その後、逆相C18真空液体クロマトグラフィー(H2O/CH3OH;グラジエント90:20から0:100%)を用いて、粗抽出物を10の画分に分画した。
その後、活性画分を、逆相HPLC(スペクトラシステム (Spectra System) P4000 (Thermo Scientific社)にかけて精製化合物を得た。得られた精製化合物を、活性合物の所在と活性とを明らかにするために、上記に記述したバイオアッセイを使って、スクリーンニングした。その化合物の同定を確認するために、LC/MSやNMR等の追加の分光分析データを記録した。
テンプラゾールAの構造解明のため、分子量298の精製化合物を、さらに500MHzのNMRを使って分析したところ、1H NMRのδ値は、8.44、8.74、8.19、7.47、7.31、3.98、2.82、2.33、1.08であり、13C NMRのδ値は、163.7、161.2、154.8、136.1、129.4、125.4、123.5、123.3、121.8、121.5、111.8、104.7、52.2、37.3、28.1、22.7、22.7であった。
δ3.75のメチレン信号は、パラ置換芳香族分子部分のC−2と、同様にC−5やC−4とも関連していた。観察されたこれらすべての相関は、イソブチルと示されたような骨格構造にとってのp−置換ベンジル部分間の関連性を示唆している。加えて、H−4”及びH−6”位の芳香族性プロトンで観測されたHMBC相関に基づいて、ベンジル部分のパラ位にカルボキシアミド基が与えられた。この様に、上記のデータに基づいて、上記構造は、テンプラゾールBと特定された。
アンバーライトXAD-7樹脂(アソルカーら(Asolkar et al.), 2006)と細胞懸濁液とを室温で2時間、225rpmで振盪し、定義されていない成育培地中で培養したバークホルデリア種から得た全細胞培養液を抽出した。上記樹脂と細胞との塊をチーズクロスで濾別して集め、脱イオン水で洗って塩分を除いた。その後、上記樹脂、上記細胞の塊及び上記クロスをアセトンに浸漬し、その後、アセトンを濾過し、ロータリーエバポレーターを用いて真空下に乾燥させ、粗抽出物を得た。その後、上記粗抽出物を、逆相C18真空液体クロマトグラフィー(H2O/CH3OH;90:20から0:100%のグラジエント)を使用して分画し、10個の画分を得た。
活性化合物FR90128(分子量540)の除草活性を、96ウェルプレートのプラットフォームの中の1週齢のイヌビエ(Echinochloa crus-galli)の苗を使用する実験室アッセイで試験した。99μLの脱イオン水を含む各ウェル中に、1個の雑草の苗を植えた。純粋化合物のエタノール溶液(10mg/ml)のアリコート1μLを各ウェルに加え、プレートを蓋で密閉した。1μLのエタノールと99μLの水を、陰性対照として使用した。この処理を、8個のウェル(8 replicates)について行い、密閉したプレートを、人工光(12時間の明/暗サイクル)下、温室中でインキュベートした。5日後に、その結果を調べた。活性化合物で処理した全8個のウェルの雑草の苗は、緑色の組織を残すことなく枯れたが、陰性対照のウェルの苗は活発に成長した。
活性化合物FR90128の殺虫効果を、接触バイオアッセイ系を使って実験室アッセイで試験した。上記化合物を100%エタノールに溶解し、0.001、0.005、0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、及び0.5μg/μLの濃度とした。シロイチモジヨトウ(Spodoptera exigua)の3齢期初期の幼虫を、1cm2片の人工飼料(バイオサーブ(Bio-Serv)社製)と共に、1.25オンスのプラスチックカップ中に入れた。ハミルトンのマイクロピペットを使用して、1μLの化合物をそれぞれの幼虫の胸部に適用する。パラフィルムを引っ張ってカップを覆い、通気のために、パラフィルムに一か所、穴を開けた。各濃度当たり10匹の幼虫を処理した。このアッセイを12時間明/12時間暗、25℃でインキュベートした。適用後、48時間及び72時間で、スコアを付けた。LC50値を調べるためにプロビット分析を行い、化合物(分子量540)については、0.213と認定された。
実験方法と材料
以下の手順で、バークホルデリア種の細胞培養物から抽出した化合物を精製した(図7参照):
ハイソイ増殖培地中で増殖させた10Lのバークホルデリア(A396)からの培養液を、室温で2時間、225rpmで、樹脂と細胞懸濁液とを振蘯することによって、アンバーライトXAD-7樹脂(Asolkarら、2006)で抽出した。樹脂と細胞塊とをチーズクロスを通して濾別して集め、 脱イオン水で洗って塩を除いた。上記樹脂、細胞塊、及びチーズクロスをアセトン中に2時間浸漬し、その後、アセトンを濾過し、ロータリーエバポレーターを用いて真空下で乾燥させ、粗精製物を得た。その後、この粗精製物を、逆相C18真空液体クロマトグラフィー(H2O/CH3OH;グラジエント90:20から0:100%)を使用して分画し、10個の画分を得た。その後、ロータリーエバポレーターを用いてこれらの画分を濃縮し、得られた乾燥残渣を96ウェルプレートのレタス播種アッセイ(除草性)と3齢のシロイチモジヨトウアッセイ(殺虫性)に使い、生物学的活性をスクリーンニングした。その後、逆相HPLC分離(スペクトルシステムP4000 (Spectra System P4000)、サーモサイエンティフィック(Thermo Scientific)社)に繰り返し供して、純粋な化合物を得た。その後、この活性化合物を上記のバイオアッセイでスクリーニングして、この活性化合物がどこに含まれているか、及び同定を行った。上記化合物の同定を確認するために、LC/MSやNMR等の追加の分光分析データを加えて記録した。
テンプラミドAの構造解明のために、分子量が555である上記精製化合物を、600MHzのNMRを使用して分析したところ、1H NMRのδ値が、6.40, 6.39, 6.00, 5.97, 5.67, 5.54, 4.33, 3.77, 3.73, 3.70, 3.59, 3.47, 3.41, 2.44, 2.35, 2.26, 1.97, 1.81, 1.76, 1.42, 1.37, 1.16, 1.12, 1.04、13C NMRのδ値が、173.92, 166.06, 145.06, 138.76, 135.71, 129.99, 126.20, 123.35, 99.75, 82.20, 78.22, 76.69, 71.23, 70.79, 70.48, 69.84, 60.98, 48.84, 36.89, 33.09, 30.63, 28.55, 25.88, 20.37, 18.11, 14.90, 12.81, 9.41であった。上記13C NMRのスペクトルは28個の離散した炭素シグナルを示し、6個のメチル、4個のメチレン炭素、と5個のsp2を含む13個のメチン、4個の四級炭素に帰属された。
1H−1H COSY、HMBC及びHMQCスペクトルデータは、下記の構造(I-IV)及び2個の分離されたメチレン基及びシングレットメチル基を示した。これらの構造は、のちに使用する、上記化合物に平面構造を与える、キーHMBC(the key HMBC)相関と関連する。その構造は、まだ、文献にも報告されてはおらず、テンプラミドAとして指定されてもいない。このポリケチド分子は、2個のテトラヒドロピラノース環と、1個の共役アミドとを含む。
第2の除草性化合物の(+)ESIMS分析は、分子量537に相等する、538.47 [M+H]+及び560.65 [M+H]+にm/zイオンを示した。この化合物の分子式C28H43NO9は、ESIMS及びNMRデーだ分析によって決定された。この化合物の1H及び13C NMRは、テンプラミドAにおけるカップリングしていないメチレン基の代わりに、新たに分離された-CH2-が現れている点を除き、テンプラミドAに類似していた。4.3Hzの小さな初期のカップリング定数は、エポキシドメチレン基が存在するという特徴である。このエポキシドメチレンの存在は、テンプラミドAでの60.98から、分子量537の化合物の41.07への13C NMRのシフトから、さらに確認された。これら2つの化合物の間の分子式の相違は、エポキシド形成に続く水分子の除去によって合理的に説明される。このように、NMRとMS分析の基本に基づいて、新規化合物の構造が与えられ、テンプラミドBと特定された。
このNMRデータは、上記化合物が、アミノ基、エステル基、カルボン酸基、脂肪族メチル基、エチル基、メチレン基、オキシメチレン基、メチン基、オキシメチン基、及び硫黄族基を含むことを示唆した。詳細な1D及び2D NMR分析から、上記化合物FR90128の構造が既知の化合物であることが確認された。
テンプラミドA、B、FR901465及びFR90128の除草効果を、96のウェルプレートプラットフォームの中に植えた1週齢のイヌビエ(Echinochloa crus-galli)及びレタス(Lactuca sativa L.)の苗を使用して、実験室アッセイにより試験した。99μLの脱イオン水を入れた各ウェル中に、雑草の苗を1つずつ置き、各ウェル中に、上記の純粋な化合物のエタノール溶液(10 mg/ml)のアリコートを1μL添加し、プレートをフタで密封した。1μLのエタノールを加えた99μLの溶液を、陰性対照として使用した。
8ウェルに植えた苗についてこの処理を行い、密閉したプレートを、人工光(12時間の明/暗サイクル)下、温室中でインキュベートした。5日後に、その結果を調べた。活性化合物で処理した全8個のウェルの雑草の苗は、緑色の組織を残すことなく枯れたが、陰性対照のウェルの苗は活発に成長した。テンプラミドAの除草活性は、雑草に対するよりも、レタスの苗に対して、わずかに低かった。一方、テンプラミドBはテンプラミドAよりも、レタスの苗(広葉雑草のモデル系として使用した)をよりよく制御した(100%)。
テンプラミドA、テンプラミドB、FR901465、及びFR90128の殺虫効果は、200μLの固形の、シロイチモンジヨトウの人工飼料を、各ウェル中に入れたマイクロプレートを使用する、シロイチモンジヨトウの1齢期の幼虫による96ウェル飼料オーバーレイアッセイを使用した、実験室アッセイで試験した。飼料(各ウェルごとに1個の試料)の上部にピペットで100μLの各試験サンプルを載せ、表面が乾燥するまで試料を気流下で乾燥させた。各サンプルについて6個のウェルを使用して試験し、水及び市販のBt(バチルス・チューリンゲンシス(B. thuringiensis))産物を、陰性対照及び陽性対照として、それぞれ使用した。試験昆虫(シロイチモンジヨトウ‐(Spodoptera exiqua))の1齢期の幼虫を1匹ずつ、各ウェルに入れ、上記プレートを通気孔を有するプラスチックカバーで覆った。昆虫を入れたプレートを、26℃で6日間インキュベートし、毎日の死亡率を評価した。表12に示す結果に基づいて、テンプラミドA及びBは、それぞれ、40%及び80%の死亡率であった。
3種類の植物の病原性真菌(ボトリチス・シネレア(Botrytis cinerea)、フィトフトラ属(Phytora sp.)、モニリア・フルクチコラ(Monilinia fructicola))に対するFR90128(分子量540)の抗真菌作用を、in vitroのPDA(ポテトデキストロース寒天)プレートアッセイで試験した。プラグ法を使用して、プレートに真菌を接種した。真菌が定着し、増殖培地上で増殖し始めた後に、8個の滅菌フィルター濾紙ディスクを、円の端から約1cmの位置に、各プレート上に置いた。20、15、10、7.5、5、2.5及び1.25 mg FR90128/mLを含む10μLのエタノール溶液を濾紙ディスクに滴下し、そして、その溶液をエバポレートして蒸発させた。10μLの純エタノールを浸み込ませた1個のディスクを陰性対照として使用した。各アッセイを、3枚のディスクを使って行った。プレートを5日間、室温でインキュベートし、その後、抗真菌作用を異なる濃度のFR90128に対応する、各濾紙ディスク上周囲の阻止円を測定して記録した。その結果によると、FR90128は、モニリニアの増殖に対する効果はないが、ボトリチス及びとフィトフトラの双方に対しては、菌糸の成長の制御に効果を示した。ボトリチス及びフィロフトラについては、閾値濃度10 mg/mL及び1.25 mg/mLで、明らかな濃度依存性の増殖阻止があると考えられた(図8)。
下記の生物材料を、ブタペスト条約の下、アメリカ合衆国 イリノイ州 61604、ペオリア、大学通り、1815北のアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション(Agricultural Research Culture Collection)(NRRL)に寄託し、下記の番号が付された。
バークホールデリア種 A396 NRRL B-50319 2009年9月15日
本明細書では種々の参考文献を引用しており、これらの開示は、引用によりすべて本明細書中に組み込まれる。
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Claims (9)
- バークホルデリア(Burkholderia)A396(NRRL寄託番号B-50319)の単離菌株であって、次に示す特性を有する単離菌株:
(A)配列番号8、11および12に示す配列と少なくとも99%の同一性を有する、フォワード配列と、配列番号9、10、13、14及び15と少なくとも99%の同一性を有する、リバース配列とを含む、16S rRNA遺伝子配列を有し;
(B)農薬活性を有し;かつ
(C)テンプラゾールA、テンプラゾールB、テンプラミドA、テンプラミドB、FR90128及びFR901465からなる群から選ばれる農薬化合物を産生する。 - 請求項1に記載の菌株の培養物、請求項1に記載の菌株の細胞画分、全細胞培養物、それらの上清、及びそれらの抽出物からなる群から選ばれるものを含む、農薬混合物。
- 前記農薬混合物は、バークホルデリア(Burkholderia)A396(NRRL寄託番号B-50319)から得られる、テンプラゾールA、テンプラゾールB、テンプラミドA、テンプラミドB、FR90128及びFR901465からなる群から選ばれる単離化合物を有効成分として含有する、ことを特徴とする、請求項2に記載の農薬混合物。
- 請求項1に記載の前記バークホルデリア菌株からの化合物の産生方法であって、
(1)請求項1に記載の菌株を20〜30°Cで3〜7時間培養する培養工程と;
(2)前記菌株の培養物を室温で1〜3時間振蘯し、樹脂で抽出する工程と;
(3)前記工程(2)で得られた樹脂と細胞との塊を布で濾過し;前記樹脂、細胞塊及び前記布を有機溶媒に浸し;前記有機溶媒を濾別して乾燥させることによって、粗抽出物を得る工程と;
(4)前記工程(3)で得られた粗抽出物を、C18逆相液体クロマトグラフィーを用いて分画する工程と;を含み、
ここで、前記化合物は、テンプラゾールA、テンプラゾールB、テンプラミドA、テンプラミドB、FR90128及びFR901465を含む、ことを特徴とする方法。 - (a)請求項1に記載の菌株の純粋培養物、細胞画分、全細胞培養物、上清、及びこれらの抽出物からなる群から選ばれる第1の物質と、(b)化学農薬又は生物農薬である第2の物質と、を含む農薬組成物。
- (c)担体、希釈剤、界面活性剤及びアジュバントからなる群から選ばれる、少なくとも1種以上をさらに含む、請求項5に記載の農薬組成物。
- 前記第2の物質は、殺線虫剤、除草剤、防カビ剤、および殺虫剤からなる群から選ばれる農薬である、請求項4又は5に記載の農薬組成物。
- 植物、その種子、及び前記植物の成長に使用される基質からなる群から選ばれる少なくとも1つに、下記の化合物及び下記の組成物からなる群から選ばれるいずれかを、植物における有害生物の蔓延をモジュレートするのに有効な量で適用することを含む、有害生物の蔓延をモジュレートするための方法:
(1)バークホルデリア(Burkholderia)A396(NRRL寄託番号B-50319)から得られる、テンプラゾールA、テンプラゾールB、テンプラミドA、テンプラミドB、FR90128及びFR901465からなる群から選ばれる単離された農薬用化合物;
(2)請求項1に記載の菌株由来の純粋培養物、細胞画分、全細胞培養物、上清、及びこれらの抽出物からなる群から選ばれる第1の物質と、(b)化学農薬又は生物農薬である第2の物質と、を含む農薬組成物;
(3)担体、希釈剤、界面活性剤及びアジュバントからなる群から選ばれる、少なくとも1つをさらに含む、上記(2)に記載の農薬組成物;及び
(4)前記第2の物質として、殺線虫剤、除草剤、防カビ剤、および殺虫剤からなる群から選ばれる農薬を含む、上記(2)に記載の農薬組成物。 - 単子葉植物である雑草、カヤツリグサ科の雑草、双子葉植物である雑草及び土壌からなる群から選ばれる少なくとも1つ以上に、下記の化合物及び下記の組成物からなる群から選ばれるいずれかを、前記雑草の出現及び/又は成長をモジュレートするのに有効な量で適用することを含む、前記雑草の出現及び/又は成長をモジュレートするための方法:
(1)バークホルデリア(Burkholderia)A396(NRRL寄託番号B-50319)から得られる、テンプラゾールA、テンプラゾールB、テンプラミドA、テンプラミドB、FR90128及びFR901465からなる群から選ばれる単離された農薬化合物;
(2)請求項1に記載の菌株由来の純粋培養物、細胞画分、全細胞培養物、上清、及びこれらの抽出物からなる群から選ばれる第1の物質と、(b)化学農薬又は生物農薬である第2の物質と、を含む農薬組成物;
(3)担体、希釈剤、界面活性剤及びアジュバントからなる群から選ばれる、少なくとも1つをさらに含む、上記(2)に記載の農薬組成物;及び
(4)前記第2の物質として、殺線虫剤、除草剤、防カビ剤、および殺虫剤からなる群から選ばれる農薬を含む、上記(2)に記載の農薬組成物。
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