MX2012008985A - Metodos y composiciones para predecir la capacidad de respuesta al tratamiento con el inhibidor de tnf-alfa. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona los métodos para determinar o predecir la sensibilidad de un sujeto al tratamiento con un inhibidor de TNFa, tal como un anticuerpo de TNFa mediante la determinación de los factores genéticos.

Description

METODOS Y COMPOSICIONES PARA PREDECIR LA CAPACIDAD DE RESPUESTA AL TRATAMIENTO CON EL INHIBIDOR DE TNF-ALFA Referencia a las Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reclama la prioridad a la Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/300,807, presentada el 2 de febrero de 2010, Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/353,595, presentada el 10 de junio de 2010, Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/359,009, presentada el 28 de junio de 2010, Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/409,461 presentada el 2 de noviembre de 2010, y Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/434,296, presentada el 19 de enero de 2011, el contenido entero de cada una, incluyendo la especificación, cualquier dibujo, y listado de secuencias, se incorpora en la presente por referencia.

Listado de Secuencias La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha presentado en formato ASCII por medio de EFS-Web y se ha incorporado en este medio por referencia en su totalidad. La copia de ASCII, creada el 1 de febrero de 2011, se nombra como 11781316.txt y tiene un tamaño de 28,619.

Antecedentes de la Invención La artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) se considera un trastorno autoinmune inflamatorio crónico. La RA es una condición incapacitante e inflamatoria dolorosa que puede conducir a la pérdida sustancial de movilidad debido al dolor y destrucción articular. La RA conduce a la hinchazón del tejido suave de las articulaciones.

El tratamiento convencional para la RA se basa en métodos desarrollados para la población paciente con RA en conjunto. Como resultado, los tratamientos conocidos pueden conducir a que algunos pacientes sufran alteraciones a través de los tratamientos no efectivos. Así, existe una necesidad por medicina personalizada para tratar mejor la RA y para identificar opciones de tratamiento efectivas para un paciente dado. El poder predecir adecuadamente una respuesta de un paciente de RA a un agente terapéutico, facilitaría el tratamiento. La identificación en pacientes anticipados que son propensos a responder a un agente terapéutico determinado, también permite a los pacientes con AR tratarse a tiempo, por ejemplo, prevenir el daño de articulación irreversible y discapacidad resultante.

Una variedad de biomarcadores para RA se han identificado como asociados con la condición de enfermedad de la RA (ver, por ejemplo, Poole y Dieppe (1994) Seminars in Arthritis and Rheumatism 23:17; Nakamura (2000) J Clin Lab Analysis 14:305; e Young y colaboradores (2001) Annals Rhuematic Diseases 60:545; Rioja y colaboradores ((2008) Arthritis & Rheum 58(8):2257). A veces, los biomarcadores también se han identificado como que influencian la eficacia clínica de ciertos anticuerpos terapéuticos. Por ejemplo los polimorfismos de FCGR2A y FCGR3A se han encontrado que influencian la eficacia clínica del anticuerpo infliximab en pacientes con RA (Cañete y colaboradores (2009) Ann Rheum Dis 68:1547; Tsukahara y colaboradores (2008) Ann Rheum Dis 67:1791). A pesar de estos resultados, sigue habiendo una necesidad por medios más efectivos para determinar qué pacientes con AR responden a varias opciones de tratamiento.

Breve Descripción de la Invención La identificación de un marcador genético o marcadores genéticos que ayudarán a predecir o determinar la eficacia de un tratamiento dado para RA sigue siendo un desafío. La presente invención, por lo menos en parte, identifica tres biomarcadores que pueden utilizarse solos, o en combinación con otro, para predecir si un sujeto que tiene artritis reumatoide será sensible al tratamiento con un inhibidor de TNFa. La presente invención se basa, por lo menos en parte, en la identificación de marcadores moleculares que puedan utilizarse para determinar la capacidad de respuesta de un sujeto a un tratamiento, por ejemplo, antes de o concomitantemente con la administración de los tratamientos, por ejemplo, anticuerpos de TNFa humano, o porciones de unión al antígeno de los mismos. Específicamente, la presente invención proporciona métodos y composiciones que pueden utilizarse para determinar si un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, tal como artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) será sensible al tratamiento con un inhibidor del TNFa. La invención se basa, por lo menos en parte, en observar que la presencia o número de copia de alelos particulares, por ejemplo, HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés), polimorfismo de IL-4R I50V, y/o polimorfismo de FcyRIIb I232T, en un sujeto se asocia con la capacidad de respuesta creciente o disminuida al tratamiento con un inhibidor del TNFa y/o metotrexato (MTX, por sus siglas en inglés).

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona métodos para determinar, predecir, o valorar la capacidad de respuesta al tratamiento con un inhibidor del TNFa en un sujeto que tiene un trastorno autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), y métodos para tratar un sujeto que tiene un trastorno autoinmune, por ejemplo, RA, que incluyen determinar el genotipo del sujeto, en donde el genotipo indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

En un aspecto, la invención proporciona de un método para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto que tiene un trastorno autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoide (AR, por sus siglas en inglés), al tratamiento con un inhibidor del TNFa, el método comprende determinar la presencia o, por ejemplo, el número de copias, de un alelo HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés) en una muestra del sujeto, en donde la presencia de una o dos copias del alelo HLA- DRB1 SE indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, tal como, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) que comprende administrar un inhibidor del TNFa al sujeto para el tratamiento de la RA, con la condición de que por lo menos una copia, por ejemplo, una o dos copias, de un alelo HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés) esté presente en una muestra del sujeto.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona un método para tratar un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, tal como artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), el método comprende determinar el número de copias de un alelo HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés) en una muestra del sujeto, y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor del TNFa, si el sujeto tiene una o dos copias del alelo HLA-DRB1 SE.

En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), el método comprende determinar el número de copias de un alelo HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés), y la presencia de un alelo IL-4R I50 en una muestra del sujeto, y, administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor del TNFa, si el sujeto no tiene ningún alelo HLA-DRB1 SE, y si el sujeto tiene por lo menos uno (preferiblemente dos) alelos IL-4R I50 en la muestra.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar si un inhibidor del TNFa será efectivo para el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), el método comprende detectar la presencia de por lo menos una copia de un alelo HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés) en una muestra del sujeto, en donde la presencia del alelo HLA-DRB1 SE indica que el inhibidor del TNFa será efectivo para el tratamiento de la enfermedad autoinmune, por ejemplo, RA, en el sujeto.

En una modalidad, el número de copias del alelo HLA-DRB1 SE es determinado mediante el ensayo del ácido nucleico, por ejemplo, ADN, o proteína en la muestra. En otra modalidad, el número de copias del alelo HLA-DRB1 SE es determinado utilizando un método de ensayo seleccionado del grupo que consiste de análisis de micromatriz, secuenciación de ADN, o técnicas de PCR, incluyendo, pero sin limitarse a PCR específica para el alelo.

En ciertas encarnaciones de la invención, los métodos adicionalmente comprenden determinar el número de copias de un alelo IL-4R I50 en una muestra del sujeto, en donde la presencia del alelo IL-4R I50 (AA o AG) en la muestra indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

En otras modalidades, los métodos de la invención adicionalmente comprenden determinar la presencia de dos alelos FcyRIIb T232 (FcyRIlb-CC, por sus siglas en inglés) en una muestra del sujeto, en donde la presencia de dos alelos FcyRIIb T232 (FcyRIlb-CC, por sus siglas en inglés) en la muestra indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

En otras modalidades, los métodos de la presente invención adicionalmente comprenden determinar el número de copias de un alelo IL-4R 150 en una muestra del sujeto y determinar la presencia de dos alelos FcyRIIb T232 (FcyRIlb-CC, por sus siglas en inglés) en una muestra del sujeto, en donde la presencia del alelo IL-4R 150 (AA o AG) en la muestra y la presencia de dos alelos FcyRIIb T232 (FcyRIlb-CC, por sus siglas en inglés) en la muestra indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, por ejemplo, RA, para el tratamiento con un inhibidor del TNFa, el método comprende determinar el número de copia de un alelo FcyRIIb T232 en una muestra del sujeto, en donde la presencia de dos copias del alelo FcyRIIb T232 (FcyRIlb-CC, por sus siglas en inglés) indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), que comprende administrar un inhibidor del TNFa al sujeto para el tratamiento de la enfermedad autoinmune, por ejemplo, RA, a condición de que dos copias del alelo FcyRIIb T232 (FcyRIlb-CC, por sus siglas en inglés) estén presentes en una muestra del sujeto.

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar si un inhibidor del TNFa será efectivo para el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), el método comprende determinar el número de copia de un alelo FcyRIIb T232 en una muestra del sujeto, en donde la presencia de dos copias del alelo FcyRIIb T232 (FcyRIlb-CC, por sus siglas en inglés) indica que el inhibidor del TNFa será efectivo para el tratamiento de la enfermedad autoinmune, por ejemplo, RA en el sujeto.

En una modalidad, la presencia del alelo FcyRIIb T232 es determinada mediante el ensayo del ácido nucleico, por ejemplo, ADN, o proteína en la muestra. En otra modalidad, la presencia del alelo FcyRIIb T232 es determinada utilizando un método de ensayo seleccionado del grupo que consiste de análisis de micromatriz, secuenciación de ADN, o técnicas de PCR, incluyendo, pero sin limitarse a PCR específica para el alelo.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), para tratar con un inhibidor del TNFa, el método comprende determinar el número de copias de un alelo IL-4R V50 en una muestra del sujeto, en donde la presencia de dos copias del alelo IL-4R V50 (GG) en la muestra indica que el sujeto no será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa, a menos que el sujeto también tenga por lo menos una copia de un alelo HLA-DRB1 SE.

En una modalidad, el número de copias del alelo IL-4R V50 es determinado mediante el ensayo del ácido nucleico, por ejemplo, ADN, o proteína en la muestra. En otra modalidad, el número de copias del alelo IL-4R V50 es determinado utilizando un método de ensayo seleccionado del grupo que consiste de análisis de micromatriz, secuenciación de ADN, o técnicas de PCR, incluyendo, pero sin limitarse a PCR específica para el alelo.

La invención también incluye un método para determinar o predecir la capacidad de respuesta al tratamiento con un inhibidor del TNFa en un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, tal como artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), el método comprende determinar la presencia de un alelo IL-4R I50 en una muestra del sujeto, en donde la presencia del alelo IL-4R I50 (preferiblemente dos copias del alelo IL-4R I50, por ejemplo, un genotipo del AA) en la muestra indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

En una modalidad, la presencia del alelo IL-4R 150 es determinada mediante el ensayo del ácido nucleico, por ejemplo, ADN, o proteína en la muestra. En otra modalidad, la presencia del alelo IL-4R 150 es determinada utilizando un método de ensayo seleccionado del grupo que consiste de análisis de micromatriz, secuenciación de ADN, o técnicas de PCR, por ejemplo, pero sin limitarse a PCR específica para el alelo.

La invención también incluye un método para tratar un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, tal como artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), el método comprende determinar la presencia de un alelo IL-4R 150 en una muestra del sujeto, y administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor del TNFa, si el sujeto tiene por lo menos un alelo IL-4R 150 (por ejemplo, el genotipo es AA o AG).

En una modalidad, la presencia del alelo IL-4R 150 es determinada , mediante el ensayo del ácido nucleico, por ejemplo, ADN, o proteína en la muestra. En otra modalidad, la presencia del alelo IL-4R 150 es determinada utilizando un método de ensayo seleccionado del grupo que consiste de análisis de micromatriz, secuenciación de ADN, o técnicas de PCR, por ejemplo, pero sin limitarse a PCR específica para el alelo.

La presente invención también proporciona un método para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), para tratamiento con un inhibidor del TNFa, el método comprende determinar el número de copias de un alelo HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés) en una muestra del sujeto y el número de copias de un alelo IL-4R I50 en una muestra del sujeto, en donde la presencia del alelo HLA-DRB1 SE y la presencia del alelo IL-4R I50 (AA o AG) en la muestra indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para tratar un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), que comprende administrar un inhibidor del TNFa al sujeto para el tratamiento de la RA, a condición de que una o dos copias de un alelo HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés) y una o dos copias de un alelo IL-4R I50 (AA o AG) estén presentes en una muestra del sujeto.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para determinar si un inhibidor del TNFa será efectivo para el tratamiento de un sujeto que tiene una enfermedad autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), el método comprende detectar la presencia de por lo menos una copia de un alelo HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés) en una muestra del sujeto y del número de copias de un alelo IL-4R I50 en una muestra del sujeto, en donde la presencia del alelo HLA-DRB1 SE y la presencia de una o dos copias del alelo IL-4R I50 (AA o AG) indica que el inhibidor del TNFa será efectivo para el tratamiento de la RA en el sujeto.

En una modalidad, la presencia del alelo IL-4R I50 es determinada mediante el ensayo del ácido nucleico, por ejemplo, ADN, o proteína en la muestra. En otra modalidad, la presencia del alelo IL-4R I50 es determinada utilizando un método de ensayo seleccionado del grupo que consiste de análisis de micromatriz, secuenciación de ADN, o técnicas de PCR, por ejemplo, pero sin limitarse a PCR específica para el alelo.

En una modalidad de la invención, el sujeto es un humano.

En otra modalidad de la invención, la RA es artritis reumatoide temprana.

En aún otra modalidad, el método determina o predice la capacidad de respuesta clínica en el sujeto.

En otra modalidad, el sujeto se diagnostica con RA con una duración de enfermedad de menos de 1 año.

En otra modalidad, el sujeto tiene un DAS28 de >3.2.

En otra modalidad, el sujeto no tiene ninguna exposición anterior a terapias anti-TNFa sistémicas, tratamiento mediante MTX o >2 DMARDs, y/o no tiene ninguna otra enfermedad articular inflamatoria aguda.

En otra modalidad, el sujeto es además, por ejemplo, simultáneamente, administrado con MTX.

En otra modalidad, el sujeto es administrado con MTX una vez semanalmente, y adalimumab una vez cada 2 semanas.

En una modalidad, el método de la invención incluye el ensayo de una muestra (o muestras múltiples de un sujeto) para marcadores genéticos múltiples, incluyendo, por ejemplo, el alelo HLA-DRB1 SE (por ejemplo, número de copia del mismo) y alelo IL-4R 150. Alternativamente, la invención incluye el ensayo de una muestra para el alelo HLA-DRB1 SE (por ejemplo, número de copia del mismo) y el alelo IL-4R V50 (por ejemplo, para determinar si el sujeto es homocigótico para el alelo). Además, el uso del polimorfismo de nucleótido sencillo de FcyRIIb I232T puede utilizarse solo o en combinación con cualquiera de los métodos descritos en la presente, incluyendo el número de copia del alelo HLA-DRB1 SE y/o la presencia del alelo IL-4R I50 y/o si el sujeto es homocigótico para el alelo IL-4R V50.

En una modalidad, el inhibidor del TNFa es un anticuerpo anti-TNFa, o porción de unión al antígeno del mismo, o una proteína de fusión, por ejemplo, etanercept.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa, o porción de unión al antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo multivalente.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa quimérico, o porción de unión al antígeno del mismo, es infliximab.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es adalimumab o golimumab.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa humanizado, o porción de unión al antígeno del mismo, es certolizumab pegol.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano aislado que disocia de TNFa humano con un Kd de 1 x 10"8 M o menor y una constante koff de 1 x 10"3 s"1 o menor, ambas determinadas mediante resonancia de plasmón superficial, y neutraliza la citotoxicidad del TNFa humano en un ensayo L929 in vitro estándar con una Cl50 de 1 x 10"7 M o menor.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano aislado con las siguientes características: se disocia del TNFa humano con una constante koff de 1 x 10"3 s"1 o menor, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial; tiene un dominio de CDR3 cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, o modificado de la SEC ID NO: 3 por una sola sustitución de alanina en las posiciones 1, 4, 5, 7 ó 8 o por una a cinco sustituciones de aminoácido conservadoras en las posiciones 1, 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9; y tiene un dominio de CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4, o modificado de la SEC ID NO: 4 por una sola sustitución de alanina en las posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11 o por una a cinco sustituciones conservadoras del aminoácido en las posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y/o 12.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano aislado con una región variable de cadena ligera (LCVR, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1 y una región variable de cadena pesada (HCVR, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2.

La invención también ofrece un kit para predecir o evaluar una capacidad de respuesta de un sujeto a un inhibidor del TNFa para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, tal como artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), el kit comprende un medio para determinar la presencia de un alelo HLA-DRB1 SE en una muestra del sujeto, e instrucciones para el tratamiento recomendado para el sujeto basado en el número de copias del alelo HLA-DRB1 SE, en donde la presencia del alelo HLA-DRB1 SE indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

La presencia del alelo HLA-DRB1 SE puede determinarse de acuerdo con los métodos estándar conocidos en la técnica. En una modalidad, el medio para determinar el número de copias del alelo HLA-DRB1 SE comprende un ácido nucleico que hibridiza a HLA-DRB1 SE. En otra modalidad, el medio para determinar el número de copias del alelo HLA-DRB1 SE comprende un anticuerpo que une a una proteína que corresponde a HLA-DRB1 SE.

En una modalidad, el kit adicionalmente comprende un medio para detectar la presencia de un alelo IL-4R 150 en la muestra del sujeto, e instrucciones para el tratamiento recomendado para el sujeto basado en la presencia del alelo IL-4R 150, en donde la presencia combinada del alelo IL-4R 150 y el alelo HLA-DRB1 SE indica que el sujeto será sensible al tratamiento de RA con el inhibidor del TNFa.

En un aspecto, la presente invención proporciona un kit para predecir o evaluar la capacidad de respuesta de un sujeto a un inhibidor del TNFa para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, tal como artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), el kit comprende un medio para determinar la presencia de un alelo FcyRIIb T232 en una muestra del sujeto, e instrucciones para el tratamiento recomendado para el sujeto basado sobre la presencia de dos alelos FcyRIIb T232 (FcyRIIb-CC), en donde la presencia de dos alelos FcyRIIb T232 indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

En una modalidad, el medio para determinar la presencia del alelo FcyRIIb T232 comprende un ácido nucleico que hibridiza a una molécula del ácido nucleico que codifica FcyRIIb T232, o una porción del mismo que contiene el I232T SNP. En otra modalidad, el medio para determinar la presencia del alelo FcyRIIb T232 comprende un anticuerpo que une específicamente a una proteína que corresponde a una proteína de FcyRIIb T232.

En una modalidad, el kit adicionalmente comprende un medio para detectar la presencia de un alelo IL-4R 150 en la muestra del sujeto, e instrucciones para el tratamiento recomendado para el sujeto basado en la presencia del alelo IL-4R 150, en donde la presencia combinada del alelo IL-4R 150 y el alelo FcyRIlb-CC indica que el sujeto será sensible al tratamiento o RA con el inhibidor del TNFa. Opcionalmente, el kit adicionalmente comprende un medio para detectar la presencia de un alelo HLA-DRB1 SE en la muestra del sujeto, e instrucciones para el tratamiento recomendado para el sujeto basado en la presencia del alelo HLA-DRB1 SE, en donde la presencia combinada del alelo FcyRIlb-CC, el alelo IL-4R I50, y el alelo HLA-DRB1 SE indica que el sujeto será sensible al tratamiento de RA con el inhibidor del TNFa.

En aún otra modalidad, el kit adicionalmente comprende medios para detectar la presencia de un alelo HLA-DRB1 SE en la muestra del sujeto, e instrucciones para el tratamiento recomendado para el sujeto basado en la presencia del alelo HLA-DRB1 SE, en donde la presencia combinada del alelo FcyRIlb-CC y el alelo HLA-DRB1 SE indica que el sujeto será sensible al tratamiento de RA con el inhibidor del TNFa.

En una modalidad, los kits adicionalmente comprenden un medio para obtener la muestra del sujeto.

La invención también proporciona un kit para predecir o evaluar la capacidad de respuesta de un sujeto a un inhibidor del TNFa para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, tal como artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), el kit comprende un medio para determinar la presencia de un alelo IL-4R 150 en una muestra del sujeto, e instrucciones para el tratamiento recomendado para el sujeto basado en la presencia de un alelo IL-4R 150, en donde la presencia del alelo IL-4R 150 (preferiblemente dos copias del alelo IL-4R 150) en la muestra indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

En una modalidad, el medio para determinar la presencia del alelo IL-4R 150 comprende un ácido nucleico que hibridiza a IL-4R 150. En otra modalidad, el medio para determinar la presencia del alelo IL-4R 150 comprende un anticuerpo que une a una proteína que corresponde a una proteína IL-4R 150.

Las características adicionales de la invención al kit para predecir o evaluar la capacidad de respuesta de un sujeto a un inhibidor del TNFa para el tratamiento de una enfermedad autoinmune, tal como artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), el kit comprende un medio para determinar el número de copias de un alelo IL-4R V50 en una muestra del sujeto, e instrucciones para el tratamiento recomendado para el sujeto basado en la presencia de un alelo IL-4R V50, en donde dos copias del alelo IL-4R V50 en la muestra indican que el sujeto no será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa, a menos que el sujeto también tenga por lo menos una copia del alelo HLA-DRB1 SE.

En una modalidad, el medio para determinar la presencia del alelo IL-4R V50 comprende un ácido nucleico que hibridiza a IL-4R V50. En una modalidad, el medio para determinar la presencia del alelo IL-4R V50 comprende un anticuerpo que une a una proteína que corresponde a una proteína IL-4R V50.

En una modalidad, los kits de la invención incluyen el medio para determinar la presencia y/o número de copia en una muestra (o muestras múltiples de un sujeto) para marcadores genéticos múltiples, incluyendo, por. ejemplo, el alelo HLA-DRB1 SE (por ejemplo, número de copia del mismo) y el alelo IL-4R 150. Alternativamente, el kit incluye el medio para determinar la presencia y/o número de copia del alelo HLA-DRB1 SE (por ejemplo, número de copia del mismo) y el alelo IL-4R V50. Además, los kits de la invención pueden incluir el medio para determinar la presencia y/o número de copia del polimorfismo de nucleótido del único FcyRIIb I232T solo o en combinación con cualquiera de los kits descritos en la presente, incluyendo kits que comprenden el medio para determinar la presencia y/o número de copia del alelo HLA-DRB1 SE y/o la presencia del alelo IL-4R I50 y/o si el sujeto es homocigótico para el alelo IL-4R V50.

En una modalidad, el inhibidor del TNFa es un anticuerpo anti-TNFa, o porción de unión al antígeno del mismo, o una proteína de fusión, por ejemplo, etanercept.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa, o porción de unión al antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, y un anticuerpo polivalente.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa quimérico, o porción de unión al antígeno del mismo, es infliximab.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es adalimumab o golimumab.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa humanizado, o porción de unión al antígeno del mismo, es certolizumab pegol.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano aislado que disocia del TNFa humano con un K<¡ de 1 x 10"8 M o menor y una constante koff de 1 x 10"3 s"1 o menor, ambo determinados mediante resonancia de plasmón superficial, y neutraliza la citotoxicidad del TNFa humano en un ensayo L929 in vitro estándar con una CI5o de 1 x 10"7 M o menor.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano aislado con las siguientes características: disocia del TNFa humano con una constante kof, de 1 x 10"3 s' o menor, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial; tiene un dominio de CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 3, o modificado de la SEC ID NO: 3 por una sola sustitución de alanina en las posiciones 1, 4, 5, 7 u 8 o por una a cinco sustituciones conservadoras del aminoácido en las posiciones 1, 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9; y tiene un dominio de CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4, o modificado de la SEC ID NO: 4 por una sola sustitución de alanina en las posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11 o por una a cinco sustituciones conservadoras del aminoácido en las posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y/o 12.

En una modalidad, el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano aislado con una región variable de cadena ligera (LCVR, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2.

Se contempla que todas las modalidades de la invención descritas en la presente, incluyendo las descritas bajo diferentes aspectos de la invención, pueden combinarse con cualquiera de otras modalidades a menos que sean inadecuadas o negadas explícitamente.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra el diseño del estudio de OPTIMA.

La Figura 2 muestra las diferencias en puntos de porcentaje, por la presencia del alelo HLA-DRB1 SE, entre los grupos de tratamiento (adalimumab + metotrexato contra placebo + metotrexato) para sujetos que alcanzaron las respuestas ACR20, ACR50 y ACR70 en la semana 26.

La Figura 3 muestra las diferencias en puntos de porcentaje, por la presencia del alelo HLA-DRB1 SE, entre los grupos de tratamiento (adalimumab + metotrexato contra placebo + metotrexato) para los sujetos que cumplieron con el criterio DAS28 para LDA y remisión en la semana 26.

La Figura 4 muestra las diferencias en puntos de porcentaje, por la presencia de los alelos IL-4 (AA, AG y GG), entre los grupos de tratamiento (adalimumab + metotrexato contra placebo + metotrexato) para los sujetos que alcanzaron las respuestas ACR20, ACR50 y ACR70 en la semana 26.

La Figura 5 muestra las diferencias en puntos de porcentaje, por la presencia de los alelos IL-4 (AA, AG y GG), entre los grupos de tratamiento (adalimumab + metotrexato contra placebo + metotrexato) para los sujetos que cumplieron con el criterio DAS28 para LDA y la remisión en la semana 26.

La Figura 6 muestra una gráfica de barras que muestra el porcentaje de pacientes tratados son adalimumab con IL-4R-AA que alcanza ACR50 y DAS28 en la semana 26, por número de copia de SE.

La Figura 7 muestra una gráfica de barras que representa el porcentaje de pacientes tratados con adalimumab con el IL-4R-AG que alcanza ACR50 y DAS28 en la semana 26, por número de copia de SE.

La Figura 8 representa gráficamente el porcentaje de pacientes tratados con adalimumab con IL-4R-GG que alcanza ACR50 y DAS28 en la semana 26, por número de copia de SE.

La Figura 9 muestra una gráficas de barras que describe el porcentaje de pacientes con actividad de baja enfermedad DAS28, por genotipo.

Descripción Detallada de la Invención Definiciones Para poder entender más fácilmente la presente invención, primero se definen ciertos términos.

El término "TNFa humano" (abreviado en la presente como hTNFa, o simplemente hTNF), como se utiliza en la presente, se desea para referirse a una citocina humana que existe como una forma secretada 17 kD y forma una forma asociada a membrana 26 kD, la forma biológicamente activa la cual se compone de un trímero de moléculas 17 kD no covalentemente unidas. La estructura de hTNFa se describe adicionalmente en, por ejemplo, Pennica, D., y colaboradores (1984) Nature 312:724-729; Davis, J.M., y colaboradores (1987) Biochemistry 26:1322-1326; y Jones, E.Y., y colaboradores (1989) Nature 338:225-228. El término TNFa humano se desea para incluir, en una modalidad, el TNFa humano recombinante (rhTNFa), que puede prepararse mediante métodos de expresión recombinantes estándar o comprado comercialmente (R & D Systems, Catalog No. 210-TA, Minneapolis, MN). El TNFa también se refiere como TNF o TNFa.

El término "inhibidor del TNFa" incluye agentes que interfieren con actividad de TNFa. El término también incluye cada uno de los anticuerpos humanos anti-TNFa y porciones del anticuerpo descritas en la presente asi como las descritas en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,090,382; 6,258,562; 6,509,015, y en la Solicitud de Patente Norteamericana Números de Serie 09/801185 y 10/302356. En una modalidad, el inhibidor del TNFa usado en la invención es un anticuerpo anti-TNFa, o un fragmento del mismo, incluyendo infliximab (REMICADE®, Johnson & Johnson; descrito en la Patente Norteamericana No. 5,656,272, incorporada por referencia en la presente), CDP571 (un anticuerpo monoclonal humanizado lgG4 anti-TNF-alfa), CDP 870 (un fragmento monoclonal humanizado del anticuerpo anti-TNF-alfa; certolizumab pegol o CIMZIA®; Grupo UCB), un dAb anti-TNF (Peptech), CNTO 148 (golimumab; Medarex and Centocor, ver el documento WO 02/12502), y adalimumab (HUMIRA®, Abbott Laboratories, un mAb anti-TNF humano, descrito en el documento US 6,090,382 como D2E7). Los anticuerpos de TNF adicionales que pueden utilizarse en la invención se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,593,458; 6,498,237; 6,451,983; y 6,448,380, cada una de las cuales se incorporan por referencia en la presente. En otra modalidad, el inhibidor del TNFa es una proteína de fusión de TNF, por ejemplo, etanercept (ENBREL®, Amgen; descrito en los documentos WO 91/03553 y WO 09/406476, incorporados por referencia en la presente). En otra modalidad, el inhibidor del TNFa es una proteína de unión a TNF recombinante (r-TBP-l, por sus siglas en inglés) (Serono).

El término "anticuerpo", como se utiliza en la presente, se desea para referir a moléculas de inmunoglobulina comprendidas de cuatro cadenas de polipéptido, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces de disulfuro. Cada cadena pesada se comprende de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se comprende de dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera se comprende de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera se comprende de un dominio, CL. Las regiones de VH y VL pueden además subdividirse en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés), entremezcladas con regiones que son conservadas, llamadas regiones estructurales (FR, por sus siglas en inglés). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, colocadas de amino-terminal a carboxilo-terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Los anticuerpos de la invención se describen en detalle adicional en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,090,382; 6,258,562; y 6,509,015, que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

El término "porción de unión al antígeno" o "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción del anticuerpo"), como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conserven la capacidad de unir específicamente a un antígeno (por ejemplo, hTNFa). Se ha mostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante los fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los fragmentos de unión incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, cadenas sencillas, y anticuerpos de cadena sencilla. Los ejemplos de fragmentos de unión comprendidos dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (¡i) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fa ligados por un puente de disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y colaboradores (1989) Nature 341:544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificadas mediante genes separados, ellos pueden unirse, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permite hacerlos como una sola cadena de proteína en la cual las regiones de VL y VH se combinan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv, por sus siglas en inglés); ver por ejemplo, Bird y colaboradores (1988) Science 242:423-426; y Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tales anticuerpos de cadena sencilla también se desean para comprenderse dentro del término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo. Otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como diacuerpos también se comprenden. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los cuales los dominios de VH y VL se expresan en una sola cadena de polipéptido, pero utilizando un enlazador que sea demasiado corto para permitir combinarse entre los dos dominios en la misma cadena, de tal modo forzando los dominios a combinarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión al antígeno (ver por ejemplo, Holliger y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak y colaboradores (1994) Structure 2:1121-1123). Las porciones de anticuerpo de la invención se describen en detalle adicional en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,090,382, 6,258,562, 6,509,015, que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad.

Aún adicionalmente, un anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo puede ser parte de moléculas inmunoadhesión más grandes, formada mediante asociación covalente o no covalente del anticuerpo o a porción de anticuerpo con una o más otras proteínas o péptidos. Los ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región central de estreptavidina para hacer una molécula de scFv tetramérica (Kipriyanov, S.M., y colaboradores (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido de marcador y etiqueta de polihistidina C-terminal para hacer las moléculas de scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S.M., y colaboradores (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Porciones de anticuerpo, tal como fragmentos Fab y F(ab')2, pueden prepararse de anticuerpos enteros utilizando técnicas convencionales, tal como digestión de papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos enteros. Por otra parte, anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión pueden obtenerse utilizando técnicas de ADN recombinante estándar, como se describe en la presente.

Una "sustitución de aminoácido conservadora", como se utiliza en la presente, es una en cuál el residuo de aminoácido se sustituye con otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, Usina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Los "anticuerpos quiméricos" se refieren a anticuerpos en donde una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de cadenas pesada y ligera es homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenece a una clase particular, mientras el segmento restante de las cadenas es homólogo a secuencias correspondientes de otras especies. En una modalidad, la invención se caracteriza por un anticuerpo quimérico o fragmento de unión al antígeno, en el cual las regiones variables de cadenas ligeras y pesadas imitan las regiones variables de anticuerpos derivados a partir de una especie de mamíferos, mientras las porciones constantes son homólogas a las secuencias en los anticuerpos derivados de otras especies. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos quiméricos se hacen injertando CDR de un anticuerpo de ratón sobre las regiones estructurales de un anticuerpo humano.

Los "anticuerpos humanizados" se refieren a anticuerpos que comprende por lo menos una cadena que comprende residuos de entramado de región variables sustancialmente de una cadena de anticuerpo humano (designada como inmunoglobulina aceptadora o anticuerpo) y por lo menos una región determinante de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) sustancialmente de un anticuerpo no humano (por ejemplo, ratón). Además del injerto de las CDR, anticuerpos humanizados experimentan típicamente alteraciones adicionales para mejorar la afinidad y/o inmunogenicidad.

El término "anticuerpo polivalente" se refiere a un anticuerpo que comprende más de un sitio de reconocimiento del antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo "bivalente" tiene dos sitios de reconocimiento del antígeno, mientras un anticuerpo "tetravalente" tiene cuatro sitios de reconocimiento del antígeno. Los términos "monoespecífico", "biespecífico", "triespecífico", "tetraespecífico", etc. se refieren al número de diferentes especificidades del sitio de reconocimiento del antígeno (en comparación con el número de sitios de reconocimiento del antígeno) presentes en un anticuerpo multivalente. Por ejemplo, los sitios de reconocimiento del antígeno de un anticuerpo " monoespecífico" todos unen el mismo epítopo. Un anticuerpo" "biespecífico" o "dual específico" tiene por lo menos un sitio de reconocimiento del antígeno que une un primer epítopo y por lo menos un sitio de reconocimiento del antígeno que une un segundo epítopo que es diferente del primer epítopo. Un anticuerpo "monoespecífico multivalente" tiene sitios de reconocimiento del antígeno múltiples donde todos unen al mismo epítopo. Un anticuerpo "biespecífico multivalente" tiene sitios de reconocimiento del antígeno múltiples, un cierto número del cual une un primer epítopo y cierto número del cual une un segundo epítopo que es diferente del primer epítopo.

El término "anticuerpo humano", como se utiliza en la presente, se desea para incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o de sitio específico in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo en CDR y en particular CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", como se utiliza en la presente, no se desea para incluir anticuerpos en los cuales las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie mamífera, tal como un ratón, se han injertados sobre secuencias de entramado humanas.

El término "anticuerpo humano recombínante", como se utiliza en la presente, se desea para incluir todos los anticuerpos humanos que sean preparados, expresados, creados o aislados mediante medios recombinantes, tal como anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombínante transfectado en una célula hospedadora (descrita adicionalmente más adelante), anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpo humano recombínante, combinatoria (descrita adicionalmente más adelante), anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humanos (ver por ejemplo, Taylor y colaboradores (1992) Nucí. Acids Res. 20:6287) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que involucre el empalmado de secuencias del gene de inmunoglobulina humana a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando un animal transgénico para secuencias de Ig humana se utiliza, en mutagénesis somática in vivo) y así las secuencias de aminoácidos de las regiones de VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras se derivan de y relacionan con secuencias de VH y VL de línea germinal humana, no pueden existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal del anticuerpo humano in vivo.

Tales anticuerpos quiméricos, humanizados, humanos, y específicos duales pueden producir mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo utilizando métodos descritos en la Solicitud Internacional PCT No. PCT/US86/02269; Solicitud de Patente Europea No. 184,187; Solicitud de Patente Europea No. 171,496; Solicitud de Patente Europea No. 173,494; Publicación Internacional PCT No. WO 86/01533; Patente Norteamericana No. 4,816,567; Solicitud de Patente Europea No. 125,023; Better y colaboradores (1988) Science 240:1041 1043; Liu y colaboradores (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439 3443; Liu y colaboradores (1987) J. Immunol. 139:3521 3526; Sun y colaboradores (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:214 218; Nishimura y colaboradores (1987) Cáncer Res. 47:999 1005; Wood y colaboradores (1985) Nature 314:446 449; Shaw y colaboradores (1988) J. Nati. Cáncer Inst. 80:1553 1559); Morrison (1985) Science 229:1202 1207; Oi y colaboradores (1986) BioTechniques 4:214; Patente Norteamericana No. 5,225,539; Jones y colaboradores (1986) Nature 321:552 525; Verhoeyan y colaboradores (1988) Science 239:1534; y Beidler y colaboradores (1988) J. Immunol. 141:4053 4060, Queen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989), US 5,530,101, US 5,585,089, US 5,693,761, US 5,693,762, Selick y colaboradores, WO 90/07861, y Winter, US 5,225,539.

Un "anticuerpo aislado", como se utiliza en la presente, se desea para referirse a un anticuerpo que esté sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que une específicamente hTNFa está sustancialmente libre de anticuerpos que unen específicamente antígenos distintos a hTNFa). Un anticuerpo aislado que une específicamente hTNFa puede, sin embargo, tener reactividad cruzada a otros antígenos, tal como moléculas TNFa de otras especies. Por otra parte, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.

Un "anticuerpo neutralizante", como se utiliza en la presente (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad de hTNFa"), se desea para referirse a un anticuerpo cuyo unión a hTNFa da lugar a la inhibición de la actividad biológica de hTNFa. Esta inhibición de la actividad biológica de hTNFa puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de hTNFa, tal como citotoxicidad inducida por hTNFa (in vitro o in vivo), activación celular inducida por hTNFa y hTNFa unidos a los receptores hTNFa. Estos indicadores de actividad biológica de hTNFa pueden evaluarse por uno o más de varios ensayos in vitro o in vivo estándar conocidos en la técnica (ver Patente Norteamericana No. 6,090,382). Preferiblemente, la capacidad de un anticuerpo para neutralizar la actividad de hTNFa es evaluada mediante la inhibición de la citotoxicidad inducida por hTNFa de células L929. Como un parámetro adicional o alternativo de la actividad de hTNFa, la capacidad de un anticuerpo para inhibir la expresión inducida por hTNFa de ELAM-1 en HUVEC, como una medida de la activación celular inducida por hTNFa puede evaluarse.

El término "resonancia de plasmón superficial", como se utiliza en la presente, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo utilizando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suiza y Piscataway, NJ). Para descripciones adicionales, ver Ejemplo 1 de la Patente Norteamericana 6,258,562 y Jónsson y colaboradores (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19; Jónsson y colaboradores (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson y colaboradores (1995) J. Mol. Recognit. 8:125; y Johnnson y colaboradores (1991) Anal. Biochem.198:268.

El término " off", como se utiliza en la presente, se desea para referirse a la proporción off constante para la disociación de un anticuerpo del complejo de anticuerpo/antlgeno.

El término "Kd", como se utiliza en la presente, se desea para referirse a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

El término "Cl50" como se utiliza en la presente, se desea para referirse a la concentración del inhibidor requerido para inhibir el punto final biológica de interés, por ejemplo, neutralizar la actividad de citotoxicidad.

El término "dosis", como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad de inhibidor del TNFa que se administre a un sujeto.

El término "que dosifica", como se utiliza en la presente, se refiere a la administración de una sustancia (por ejemplo, un anticuerpo anti-TNFa) para alcanzar un objetivo terapéutico (por ejemplo, tratamiento de la artritis reumatoide).

Una "régimen de dosificación" describe un horario de tratamiento para un inhibidor del TNFa, por ejemplo, un horario de tratamiento durante un periodo de tiempo prolongado y/o a través del curso del tratamiento, por ejemplo administrando una primera dosis de un inhibidor del TNFa en la semana 0 seguido por una segunda dosis de un inhibidor del TNFa en un régimen de dosificación bisemanal.

Los términos "régimen dosificación bisemanal", "dosificación bisemanal", y "administración bisemanal", como se utiliza en la presente, se refieren al curso de tiempo de administrar una sustancia (por ejemplo, un anticuerpo anti-TNFa) a un sujeto para alcanzan un objetivo terapéutico, por ejemplo, a través del curso del tratamiento. El régimen de dosificación bisemanal no se desea para incluir un régimen de dosificación semanal. En una modalidad, la sustancia se administra cada 9-19 días, cada 11-17 días, cada 13-15 días, y cada 14 días. En una modalidad, el régimen de dosificación bisemanal se inicia en un sujeto en la semana 0 del tratamiento. En otra modalidad, una dosis de mantenimiento se administra en un régimen de dosificación bisemanal. En una modalidad, las dosis del carga y mantenimiento se administran de acuerdo con un régimen de dosificación bisemanal. En una modalidad, la dosificación bisemanal incluye un régimen de dosificación en donde las dosis de un inhibidor del TNFa se administran a un sujeto cada otro inicio de semana en la semana 0. En una modalidad, la dosificación bisemanal incluye un régimen de dosificación donde las dosis de un inhibidor del TNFa se administran a un sujeto cada otra semana consecutivamente por un periodo de tiempo dado, por ejemplo, 4 semanas, 8 semanas, 16 semanas, 24 semanas, 26 semanas, 32 semanas, 36 semanas, 42 semanas, 48 semanas, 52 semanas, 56 semanas, etc. Los métodos de dosificación bisemanales también se describen en el documento US 20030235585, incorporado por referencia en la presente.

El término "combinación" como en la frase "un primer agente en combinación con un segundo agente" incluye la coadministración de un primer agente y un segundo agente, que por ejemplo pueden disolverse o intermezclarse en el mismo portador farmacéuticamente aceptable, o administración de un primer agente, seguida por el segundo agente, o la administración del segundo agente, seguida por el primer agente. La presente invención, por lo tanto, incluye métodos de tratamiento terapéutico de combinación y composiciones farmacéuticas de combinación.

El término "concomitante" como en la frase "tratamiento terapéutico concomitante" incluye administrar un agente en presencia de un segundo agente. Un método de tratamiento terapéutico concomitante incluye métodos en los cuales el primer, segundo, tercero, o agentes adicionales son coadministrados. Un método de tratamiento terapéutico concomitante también incluye métodos en los cuales los primeros o adicionales agentes se administran en presencia de segundos o adicionales agentes, en donde los segundos o adicionales agentes, por ejemplo, pueden haberse administrados previamente. Un método de tratamiento terapéutico concomitante puede ejecutarse por etapas mediante diferentes agentes. Por ejemplo, un agente puede administrar a un sujeto un primer agente y un segundo agente puede administrar al sujeto un segundo agente, y las etapas de administración pueden ejecutarse al mismo tiempo, o casi al mismo tiempo, o a tiempos distantes, siempre y cuando el primer agente (y los agentes adicionales) están después de la administración en presencia del segundo agente (y los agentes adicionales). El agente y sujeto pueden ser la misma entidad (por ejemplo, un humano).

El término "terapia de combinación", como se utiliza en la presente, se refiere a la administración de dos o más sustancias terapéuticas, por ejemplo, un anticuerpo anti-TNFa y otro fármaco. Los otros fármacos pueden administrarse concomitante con, antes de, o después de la administración de un anticuerpo anti-TNFa.

El término "tratamiento", como se utiliza dentro del contexto de la presente invención, se significa para incluir el tratamiento terapéutico, así como medidas profilácticas o represivas, para el tratamiento de la artritis reumatoide. Por ejemplo, el término tratamiento puede incluir la administración de un inhibidor del TNFa antes o después del inicio de la artritis reumatoide de tal modo que previene o elimina signos de la enfermedad o trastorno. Como otro ejemplo, la administración de un inhibidor del TNFa después de la manifestación clínica de la artritis reumatoide para combatir los síntomas y/o complicaciones y trastornos asociados con artritis reumatoide comprende el "tratamiento" de la enfermedad. Además, se ha desarrollado la administración del agente después del inicio y después de síntomas clínicos y/o complicaciones donde la administración afecta los parámetros clínicos de la enfermedad o trastorno y tal vez al mejoramiento de la enfermedad, comprende el "tratamiento" de la artritis reumatoide. En una modalidad, el tratamiento de la artritis reumatoide en un sujeto comprende reducir signos y síntomas. En otra modalidad, el tratamiento de la artritis reumatoide en un sujeto comprende inducir la respuesta clínica importante de la artritis reumatoide. En otra modalidad, el tratamiento de la artritis reumatoide en un sujeto comprende inhibir la progresión del daño estructural. En una modalidad, el tratamiento de la artritis reumatoide comprende mejorar la función física en pacientes adultos con enfermedad moderada a severamente activa.

Aquellos "en necesidad del tratamiento" incluyen mamíferos, tal como humanos, ya teniendo artritis reumatoide, incluyendo aquellos en los cuales la enfermedad o trastorno debe prevenirse.

Un inhibidor del TNFa el cual se utiliza en los métodos y composiciones de la invención incluye cualquier agente que interfiera con la actividad de TNFa. En una modalidad preferida, el inhibidor del TNFa puede neutralizar la actividad de TNFa, particularmente la actividad de TNFa perjudicial que se asocia con artritis reumatoide, y complicaciones y síntomas relacionados.

En una modalidad, el inhibidor del TNFa usado en la invención es un anticuerpo de TNFa (también designado en la presente como un anticuerpo de TNFa), o un fragmento de unión al antígeno del mismo, incluyendo anticuerpos quiméricos, humanizados, y humanos. Ejemplos de anticuerpos TNFa que pueden utilizarse en la invención incluyen, pero sin limitarse a, infliximab (RE ICADE®, Johnson y Johnson; descrito en la Patente Norteamericana No. 5,656,272, incorporada por referencia en la presente), CDP571 (un anticuerpo lgG4anti-TNF-alfa monoclonal humanizado), CDP 870 (un fragmento del anticuerpo anti-TNF-alfa monoclonal humanizado), un dAb anti-TNF (Peptech), CNTO 148 (golimumab; Medarex y Centocor, ver el documento WO 02/12502), y adalimumab (HUMIRA®, Abbott Laboratories, un mAb anti-TNF humano, descrito en el documento US 6,090,382 como D2E7). Los anticuerpos TNF adicionales que pueden utilizarse en la invención se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,593,458; 6,498,237; 6,451,983; y 6,448,380, cada una de las cuales se incorporan por referencia en la presente.

Otros ejemplos de inhibidores de TNFa que pueden utilizarse en los métodos y composiciones de la invención incluyen etanercept (Enbrel, descrito en el documento WO 91/03553 y WO 09/406476), el receptor de TNF soluble Tipo I, un receptor de TNF soluble pegilado Tipo I (PEGs TNF-R1), p55 TNFR IgG (Lenercept), y la proteína de unión a TNF recombinante (r-TBP-l, por sus siglas en inglés) (Serono).

En una modalidad, el término "inhibidor del TNFa" excluye el infliximab. En una modalidad, el término "inhibidor del TNFa" excluye el adalimumab. En otra modalidad, el término "inhibidor del TNFa" excluye el adalimumab e infliximab.

En una modalidad, el término "inhibidor del TNFa" excluye el etanercept, y, opcionalmente, adalimumab, infliximab, y adalimumab e infliximab.

En una modalidad, el término "anticuerpo de TNFa" excluye el infliximab. En una modalidad, el término "anticuerpo de TNFa" excluye el adalimumab. En otra modalidad, el término "anticuerpo de TNFa" excluye el adalimumab e infliximab.

Como se utiliza en la presente, el término "paciente" se refiere a cualquier animal común, más preferiblemente un mamífero (incluyendo humanos y animales no humanos tal como, por ejemplo, perros, gatos, caballos, conejos, animales de parque zoológico, vacas, cerdos, ovejas, y primates no humanos), para el cual se desea el tratamiento. Más preferiblemente, el paciente en la presente es un humano.

Como se utiliza en la presente, un "sujeto" es cualquier sujeto humano común, incluyendo un paciente, elegible para el tratamiento que está experimentando o ha experimentado uno o más signos, síntomas, u otros indicadores de la RA, si, por ejemplo, diagnosticado nuevamente o diagnosticado previamente y ahora experimenta una recurrencia o recaída, o está en riesgo para la RA, sin importar la causa. Deseado a incluirse como un sujeto son cualquier sujeto involucrado en los ensayos de búsqueda clínicos que no mostraron ningún signo clínico de la enfermedad, o sujetos involucrados en estudios epidemiológicos, o sujetos usados una vez como controles. El sujeto puede haber sido tratado con un medicamento para la RA, incluyendo un inhibidor del TNFa, o no así haber sido tratado previamente.

Un "kit" es cualquier artículo de fabricación (por ejemplo, un paquete o recipiente) que comprende por lo menos un reactivo, por ejemplo, un medicamento para el tratamiento de la RA, o una prueba para específicamente detectar un gen biomarcador o una proteína de la invención. El artículo de la fabricación se promueve, distribuye, o vende preferiblemente como unidad para realizar los métodos de la presente invención.

El término "muestra" significará generalmente cualquier muestra biológica obtenida del individuo, fluido corporal, tejido corporal, línea celular, cultivo de tejido, u otra fuente. Los fluidos corporales son, por ejemplo, linfa, sueros, sangre fresca entera, células mononucleares de sangre periférica, sangre entera congelada, plasma (incluyendo fresca o congelada), orina, saliva, semen, fluido sinovial, y fluido espinal. Las muestras también incluyen tejido sinovial, piel, folículo pelo, y médula. Los métodos para obtener biopsias de tejido y fluidos corporales de mamíferos son bien conocidos en la técnica. Si el término "muestra" se utiliza solo, todavía significará que la "muestra" es una "muestra biológica", es decir, los términos se utilizan alternativamente. Una "muestra genética" es una muestra que contiene el material genético tal como ácidos nucleicos, especialmente ADN. Típicamente, el material genético puede extraerse de la muestra mediante medios convencionales y analizado para polimorfismos y alelos para determinar la presencia o expresión de biomarcadores. Las muestras genéticas incluyen sangre y otros fluidos corporales así como tejidos y células.

Los verbos "determinan" y "evalúan" tendrá el mismo significado y se utilizan alternativamente a través de la solicitud. Marcadores Genéticos Usados en Modalidades de la Invención La invención proporciona tres marcadores genéticos, es decir, el alelo HLA-DRB1 SE, polimorfismo de un solo nucleótido de IL-4R I50V (SNP, por sus siglas en inglés) y/o FcyRIIb I232T SNP (usado solo o en combinación entre sí) para evaluar si un sujeto que tiene artritis reumatoide será sensible al tratamiento con un inhibidor del TNFa, incluyendo por ejemplo, un anticuerpo anti-TNFa humano, tal como adalimumab.

Como se utiliza en la presente, los aminoácidos individuales en una secuencia se representan como o AN o NA o ANA, en donde A es el aminoácido en la secuencia y N es la posición en la secuencia. Por ejemplo, I50V representa un polimorfismo de un solo aminoácido en la posición 50 del aminoácido, en donde la isoleucina (I) está presente en la variante de proteína más frecuente en la población y valina (V) está presente en la variante menos frecuente. En otro ejemplo, 150 representa una isoleucina en la posición 50.

HLA-DRB1 del Epítopo Compartido (SE, por sus siglas en inglés) El alelo del epítopo compartido HLA-DRB1 (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés) es un factor genético implicado como que es responsable de 1/3 de la susceptibilidad de la RA y en actividad de enfermedad modulante (ver Calin A y colaboradores, Arthritis Rheum. 32:1221-5 (1989)). Los alelos HLA-DRB1 SE se refieren colectivamente como alelos del "epítopo compartido" (SE) debido a su similitud de secuencia en las posiciones 70-74 dentro de la tercera región hipervariable de los alelos HLA-DRB1 (Gregersen y colaboradores, Arthritis Rheum., 30:1205-1213 (1987)). El nucleótido y secuencias de aminoácidos de HLA-DRB1 se conocen y pueden encontrarse en, por ejemplo, el Acceso de GenBank No. NM_002124.2 y NP_002115, el contenido entero del cual se incorpora en la presente por referencia. La secuencia de aminoácido más altamente conservada dentro de los alelos HLA-DRB1 SE es "RAA" en las posiciones 72-74. En una modalidad, un alelo HLA-DRB1 SE adecuado para uso en los métodos y composiciones de la invención es uno o más de HLA-DRB1 *0101 (QRRAA) (SEC ID NO:43), *0102 (QRRAA) (SEC ID NO:44), *0103 (DERAA) (SEC ID NO:45), *03 (QKRGR) (SEC ID NO:46), *0401 (QKRAA) (SEC ID NO:47), *0402 (DERAA) (SEC ID NO:48), *0403 (QRRAE) (SEC ID NO:49), *0404 (QRRAA) (SEC ID NO:50), *0405 (QRRAA) (SEC ID NO:51), *0407 (QRRAE) (SEC ID NO:52), *0408 (QRRAA) (SEC ID NO:53), *0411 (QRRAE) (SEC ID NO:54), *07, (DRRGQ) (SEC ID NO:55), *08 (DRRAL) (SEC ID NO:56), *0901 (RRRAE) (SEC ID NO:57), *1001 (RRRAA) (SEC ID NO:58), *1101 (DRRAA) (SEC ID NO:59), *1102 (DERAA) (SEC ID NO:60), *1103 (DERAA) (SEC ID NO:61), *1104 (DRRAA) (SEC ID NO:62), *12 (DRRAA) (SEC ID NO:63), *1301 (DERAA) (SEC ID NO:64); *1302 (DERAA) (SEC ID NO:65); *1303 (DKRAA) (SEC ID NO:66), *1323 (DERAA) (SEC ID NO:67), *1401 (RRRAA) (SEC ID NO:68), *1402 (QRRAA) (SEC ID NO:69), *1404 (RRRAE) (SEC ID NO:70), *15 (QARAA) (SEC ID NO:71), and *16 (DRRAA) (SEC ID NO:72) (ver, por ejemplo, Essentials of Genomic and Personalized Medicine, eds. G. Ginsberg and H. Willard (2010) Academic Press, San Diego, CA, p. 553, el contenido de los cuales se incorpora en la presente por referencia; los residuos de aminoácidos indicados entre paréntesis después del alelo HLA-DRB1 SE corresponden a los residuos 70-74 de NP_002115). En otra modalidad, un alelo HLA-DRB1 SE adecuado para el uso en los métodos de la invención es uno o más de *01, por ejemplo, *0101 , *0102, y *0103, *04, por ejemplo, *0401, *0402, *0403, *0404, *0405, *0407, *0408, y *0411, *1001 , y *14, por ejemplo, •1401 , *1402, y *1404.

IL-4R El receptor de interleucina 4 (IL-4R, por sus siglas en inglés) es un citocina multifuncional que desempeña un papel en la regulación de las inmunorespuestas (Nelms y colaboradores (1999) Ann Rev Immunol 17:701). El polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés) de IL-4R I50V (A?G [I50V]) es un marcador genético asociado con la erosión de articulación temprana (ver Prots I. y colaboradores, Arthritis Rheum. 54:1491-500 (2006)). "polimorfismo de un solo nucleótido de IL-4R I50V" o "IL-4R I50V SNP" como se utiliza en la presente se refiere a una variación en la posición 50 de la secuencia de aminoácido de IL-4R. Esta variación alélica es cambiar una isoleucina a una valina, que es causada por una variación en el gen codificado correspondiente de A a G del polinucleótido correspondiente. Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de IL-4R se conocen y pueden encontrarse en, por ejemplo, los Accesos de GenBank Nos. N _000418.2, NM_001008699, NP_000409.1, y NP_001008699.1 , el contenido entero de los cuales se incorpora en la presente por referencia. Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de IL-4R pueden también encontrarse en la Patente Norteamericana No. 7205106, que se incorpora en la presente por referencia. Las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de la proteína IL-4R madura también se proporcionan más adelante como las SC ID Nos: 38 y 39.

MKVLQEPTCVSDYMSISTCEWKMNGPTNCSTELRLLYQLVFLL SEAHTCIPENNGGAGCVCHLLMDDVVSADNYTLDLWAGQQLLWKG SFKPSEHVKPRAPGNLTVHTNVSDTLLLTWSNPYPPDNYLYNHLTYA VN I WSENDPADFRI YNVTYLEPSLRIAAST LKSG I SYRAR VRAWAQCYNT TWSEWSPSTK WHNSYREPFE QHLLLGVSVSCIVILAVCLL CYVSITKIKK EWWDQIPNPA RSRLVAIIIQ DAQGSQWEKR SRGQEPAKCPHWKNCLTKLL PCFLEHNMKR DEDPH KAAKE MPFQGSGKSA WCPVEISKTV LWPESISVVRCVELFEAPVE CEEEEEVEEE KGSFCASPES SRDDFQEGRE GIVARLTESL FLDLLGEENGGFCQQDMGES CLLPPSGSTS AH PWDEFPS AGPKEAPPWG KEQPLHLEPS PPASPTQSPD NLTCTETPLV IAGNPAYRSF SNSLSQSPCP RELGPDPLLARHLEEVEPEM PCVPQLSEPT TVPQPEPETWEQILRRNVLQHGAAAAPVSAPTSGYQEFVH AVEQGGTQASAVVGLGPPGE AGYKAFSSLL ASSAVSPEKC GFGASSGEEG YKPFQDLIPGCPGDPAPVPV PLFTFGLDREPPRSPQSSHL PSSSPEHLGL EPGEKVEDMP KPPLPQEQAT DPLVDSLGSG IVYSALTCHLCGHLKQCHGQ EDGGQTPVMA SPCCGCCCGD RSSPPTTPLR APDPSPGGVP LEASLCPASL APSGISEKSK SSSSFHPAPG NAQSSSQTPK IVNFVSVGPT YMRVS (SEC ID NO: 38) (I50V SNP se destaca en en negritas/subrayado) atgaaggtcttgcaggagcccacctgcgtctccgactacatgagcatctctacttgc gagtggaagatgaatggtcccaccaattgcagcaccgagctccgcctgttgtaccagctgg tttttctgctctccgaagcccacacgtgtatccctgagaacaacggaggcgcggggtgcgtg tgccacctgctcatggatgacgtggtcagtgcggataactatacactggacctgtgggctgg gcagcagctgctgtggaagggctccttcaagcccagcgagcatgtgaaacccagggccc caggaaacctgacagttcacaccaatgtctcc gacactctgctgctgacctggagcaacccgtatccccctgacaattacctgtataatcatctc acctatgcagtcaacatttggagtgaa aacgacccgg cagatttcag aatctataac gtgacctacctagaaccctc cctccgcatc gcagccagca ccctgaagtc tgggatttcc tacagggcacgggtgagggc ctgggctcag tgctataaca ccacctggag tgagtggagc cccagcacca agtggcacaa ctcctacagg gagcccttcg agcagcacct cctgctgggc gtcagcgtttcctgcattgt catcctggcc gtctgcctgt tgtgctatgt cagcatcacc aagattaagaaagaatggtg ggatcagatt cccaacccag cccgcagccg cctcgtggct ataataatccaggatgctca ggggtcacag tgggagaagc ggtcccgagg ccaggaacca gccaagtgcccacactggaa gaattgtctt accaagctct tgccctgttt tctggagcac aacatgaaaagggatgaaga tcctcacaag gctgccaaag agatgccttt ccagggctct ggaaaatcagcatggtgccc agtggagatc agcaagacag tcctctggcc agagagcatc agcgtggtgcgatgtgtgga gttgtttgag gccccggtgg agtgtgagga ggaggaggag gtagaggaagaaaaagggag cttctgtgca tcgcctgaga gcagcaggga tgacttccag gagggaagggagggcattgt ggcccggcta acagagagcc tgttcctgga cctgctcgga gaggagaatgggggcttttg ccagcaggac atgggggagt catgccttct tccaccttcg ggaagtacga gtgctcacat gccctgggat gagttcccaa gtgcagggcc caaggaggca cctccctggggcaaggagca gcctctccac ctggagccaa gtcctcctgc cagcccgacc cagagtccag acaacctgac ttgcacagag acgcccctcg tcatcgcagg caaccctgct taccgcagct tcagcaactc cctgagccag tcaccgtgtc ccagagagct gggtccagac ccactgctggccagacacct ggaggaagta gaacccgaga tgccctgtgt cccccagctc tctgagccaaccactgtgcc ccaacctgag ccagaaacct gggagcagat cctccgccgaaatgtcctccagcatggggc agctgcagcc cccgtctcgg cccccaccag tggctatcag gagtttgtacatgcggtgga gcagggtggc acccaggcca gtgcggtggt gggcttgggt cccccaggag aggctggtta caaggccttc tcaagcctgc ttgccagcag tgctgtgtcc ccagagaaatgtgggtttgg ggctagcagt ggggaagagg ggtataagcc tttccaagac ctcattcctggctgccctgg ggaccctgcc ccagtccctg tccccttgtt cacctttgga ctggacagggagccacctcg cagtccgcag agctcacatc tcccaagcag ctccccagag cacctgggtctggagccggg ggaaaaggta gaggacatgc caaagccccc acttccccag gagcaggccacagaccccct tgtggacagc ctgggcagtg gcattgtcta ctcagccctt acctgccacctgtgcggcca cctgaaacag tgtcatggcc aggaggatgg tggccagacc cctgtcatgg ccagtccttg ctgtggctgc tgctgtggag acaggtcctc gccccctaca acccccctgagggccccaga cccctctcca ggtggggttc cactggaggc cagtctgtgt ccggcctccc tggcaccctc gggcatctca gagaagagta aatcctcatc atccttccat cctgcccctggcaatgctca gagctcaagc cagaccccca aaatcgtgaa ctttgtctcc gtgggacccacatacatgag ggtctct (SEC ID NO: 39) (I50V SNP se destaca en negritas/subrayado) FcvRllb Receptor Fcy llb (FcvRllb; también designado CD32 o FCGR2B) se involucra en la fagocitosis de complejos inmunes y en la regulación de la producción del anticuerpo mediante células B. El FcyRIlb I232T (T?C [I232T]) SNP se asocia con daño de articulación radiológico rápido en pacientes con enfermedad erosiva definida, así como otras enfermedades tal como lupus (ver Radstake y colaboradores Arthritis Rheum. 54:3828-37 (2006); Kono y colaboradores (2005) Hum Mol Genetic 14:2881. "Polimorfismo de un solo nucleótido de FcyRIlb I232T" o "FcyRI Ib I232T SNP" como se utiliza en la presente se refiere a una variación en la posición 232 de la secuencia de aminoácido de FcyRIlb. Esta variación alélica es cambiar una isoleucina a una treonina, la cual es causada por una variación en el gen codificado correspondiente de T a C del polinucleótido correspondiente. Las secuencias del nucleótido y aminoácido de FcyRIlb se conocen y pueden encontrase en, por ejemplo, Acceso de GenBank No. NM_001002273.2, NM_001002274.2, NM_001002275.2, NM_001190828.1 , NM_004001.4, NP_001002273.1 , NP_001002274.1 , NP_001002275.1 , NP_001177757.1 , NP_003992.3, el contenido entero de los cuales se incorpora en la presente por referencia. Las secuencias ejemplares de aminoácidos y nucleótidos de FcyRIlb se proporcionan más adelante como SEC ID NOS: 40 y 41, respectivamente.

MG ILSFLPVLATESDWADCKSPQPWGH MLLWTAVLFLAPVAG TPAAPPKAVLKLEPQWI N VLQEDSVTLTCRGTHSPESDSIQ WFH NG NLI PTHTQ PSYRFKAN N DSGEYTCQTGQTSLSDPVHLTVLSEWLVL QTPHLEFQEGETIVLRCHSWKDKPLVKVTFFQNGKSKKFSRSDPNF SIPQANHSHSGDYHCTGNIGYTLYSSKPVTITVQAPSSSPMGIIVAVV TGI AAIVAAVVALIYCRKKRISANPT PDEADKVGAENTITYSLLMH PDALEEPDDQNRI (SEC ID NO: 40) (I232T SNP se destaca en negritas/subrayado; Acceso No. NP_001002274 sin secuencia de señal) atg ggaatcctgt cattcttacc tgtccttgcc actgagagtg actgggctgactgcaagtcc ccccagcctt ggggtcatat gcttctgtgg acagctgtgc tattcctggctcctgttgct gggacacctg cagctccccc aaaggctgtg ctgaaactcg agccccagtggatcaacgtg ctccaggagg actctgtgac tctgacatgc cgggggactc acagccctgagagcgactcc attcagtggt tccacaatgg gaatctcatt cccacccaca cgcagcccagctacaggttc aaggccaaca acaatgacag cggggagtac acgtgccaga ctggccagaccagcctcagc gaccctgtgc atctgactgt gctttctgag tggctggtgc tccagacccctcacctggag ttccaggagg gagaaaccat cgtgctgagg tgccacagct ggaaggacaagcctctggtc aaggtcacat tcttccagaa tggaaaatcc aagaaatttt cccgttcggatcccaacttc tccatcccac aagcaaacca cagtcacagt ggtgattacc actgcacaggaaacataggc tacacgctgt actcatccaa gcctgtgacc atcactgtcc aagctcccagctcttcaccg atggggatca ttgtggctgt ggtcactggg attgctgtag cggccattgttgctgctgta gtggccttga tctactgcag gaaaaagcgg atttcagcca atcccactaatcctgatgag gctgacaaag ttggggctga gaacacaatc acctattcac ttctcatgcacccggatgct ctggaagagc ctgatgacca gaaccgtatt tag (SEC ID NO: 41) (I232T SNP se destaca en negritas/subrayado; Acceso No. NM_001002274) Diagnósticos En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para predecir o evaluar capacidad de respuesta de un sujeto que tiene o es propenso a tener artritis reumatoide, a un inhibidor anti-TNFa. Los métodos incluyen generalmente determinar la presencia o ausencia (por ejemplo, el número de copia de) un HLA-DRB1 SE, IL-4R I50V SNP y/o FcyRIIb I232T SNP en una muestra biológica obtenida del sujeto, en donde la presencia de alelos particulares en la muestra es una indicación que el sujeto responderá al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

En una modalidad, utilizando los métodos descritos en la presente y conocidos en la técnica, una muestra de un sujeto puede probarse para la presencia de uno o ambo alelos asociados con un SNP. Por ejemplo, una muestra de un sujeto puede probarse para la presencia del alelo IL-4R 150 (o, alternativamente, el alelo IL-4R V50) para determinar si el sujeto tiene un genotipo AA (1501), AG (I50V), o GG (V50V), y, por lo tanto, si el sujeto será sensible al tratamiento con un inhibidor del TNFa. Similarmente, una muestra de un sujeto puede probarse para la presencia del alelo FcyRIIb 1232 (o, alternativamente, el alelo FcyRIIb T232) para determinar si el sujeto tiene un genotipo TT (12321), TC (I232T), o CC (T232T), y, por lo tanto, si el sujeto será sensible al tratamiento con un inhibidor del TNFa. La detección de un SNP, como se describe más adelante, se refiere para determinar qué alelos tiene un sujeto.

En una modalidad, utilizando los métodos descritos en la presente y conocidos en la técnica, una muestra de un sujeto puede probarse para la presencia de un alelo HLA-DRB1 SE. Por ejemplo, una muestra de un sujeto puede probarse para la presencia de la región SE del HLA-DRB1, por ejemplo, en el ADN o proteína. Debe observarse que la muestra puede también probarse para la ausencia del alelo HLA-DRB1 SE, equivalente a un alelo SE de conteo 0.

La detección del alelo HLA-DRB1 SE, IL-4R I50V SNP y/o FcyRIIb I232T SNP puede realizarse utilizando los métodos descritos en la presente y/o utilizando cualquiera de los kits comercialmente disponibles y/o técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, como se describe en el ejemplo anexo, el tipificación de alta resolución con kits de secuenciado Protrans S4 (Medipro) puede utilizarse para determinar si un paciente tiene homocigosis y heterocigosis de HLA-DRB1 SE, PCR de alelo específica utilizando Assay-on-Demand (Applied Biosystems) se utilizó para determinar IL-4R (A a G [I50V]) SNP, y PCR específico de alelo utilizando Assay-by-Design (Applied Biosystems) se utilizó para determinar el variante de FcyRIIb (T a C [I232T]).

Los métodos para detectar los marcadores genéticos (SE y/o polimorfismos) incluyen protocolos que examinan la presencia y/o expresión del SNP o SE en una muestra de un sujeto. Determinar la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, alelo IL-4R I50 y/o V50 (así distinguiendo el polimorfismo de I50V), y/o alelo FcyRIIb I232 y/o alelo T232 (así distinguiendo el polimorfismo de I232T) en la muestra biológica puede también realizarse utilizando cualquier otra técnica bien conocida tal como reacción de amplificación de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), análisis de PCR de la transcriptasa inversa, análisis de polimorfismo de conformación monocatenaria (SSCP, por sus siglas en inglés), detección de división incorrecta, análisis de heterodúplex, análisis de Southern blot, análisis de Western blot, secuenciado de ácido desoxirribonucleico, análisis del polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, análisis de haplotipo, serotipado, y combinaciones o sub-combinaciones de los mismos.

Por ejemplo, tales muestras, incluyendo muestras de tejido o célula, pueden probarse convenientemente para, por ejemplo, mARNs o ADN del marcador genético utilizando, por ejemplo, un método Northern blot, un método Southern blot, un dot-blot, análisis de PCR, hibridación de arreglo, análisis de protección de RNasa, un método de FISH, un método de CGH, un método de chip de ARN, o un método de chip de ADN, tal como un micromatriz de chip de ADN SNP (por ejemplo, sistema de micromatriz de Affymetrix o Tecnología de BeadArray de lllumina). Los micromatrizs de chip de ADN SNP están comercialmente disponibles, incluyendo instantáneas de micromatriz de ADN. En una modalidad, los métodos y kits de la invención se practican utilizando análisis de micromatriz. En una modalidad, los métodos de la invención se realizan utilizando una matriz génica o micromatriz de ADN que comprende sondas de ácido nucleico específicas para HLA-DRB1 SE, FcyRIIb I232T SNP, y/o IL-4R I50V SNP.

Por ejemplo, una muestra de mARN puede obtenerse del sujeto (por ejemplo, aislado a partir de células mononucleares de sangre periférica, con métodos estándar) y expresión de mARNs que codifican un alelo HLA-DRB1 SE, alelo IL-4R I50 y/o V50 y/o alelo FcyRIIb I232 y/o T232 en la muestra de mARN puede detectarse utilizando técnicas biologías moleculares estándar, tal como análisis de PCR. Un método preferido de análisis de PCR es la reacción en cadena de transcriptasa-polimerasa inversa (RT-PCR, por sus siglas en inglés). Otros sistemas adecuados para el análisis de muestra de mARN incluyen análisis de micromatriz (por ejemplo, utilizando el sistema de micromatriz de Affymetrix o Tecnología de BeadArray de lllumina).

Por ejemplo, los ensayos de PCR en tiempo real (RT-PCR, por sus siglas en inglés) tal como ensayos de cuantitativos PCR pueden también utilizarse para detectar la presencia o ausencia de los biomarcadores descritos en la presente, y tales métodos son bien conocidos en la técnica. En una modalidad ilustrativa de la invención, un método para detectar un mARN de FcyRIIb I232T SNP en una muestra biológica comprende producir el cADN de la muestra mediante transcripción inversa utilizando por lo menos un cebador; amplificando el cADN así producido utilizando polinucleótidos de FcyRIIb I232T SNP como cebadores sentido y antisentido de amplificar cADN de FcyRIIb I232T SNP en el mismo; y detectando la presencia del cADN de FcyRIIb I232T SNP amplificado. Además, tales métodos pueden incluir una o más etapas que permitan uno para determinar los niveles de mARN de FcyRllb I232T SNP en una muestra biológica (por ejemplo, simultáneamente examinando los niveles de una secuencia de mARN de control comparativa de un gen de "gestión interna" tal como un miembro de la familia de actinia). Opcionalmente, la secuencia del cADN de FcyRIIb I232T SNP amplificado puede determinarse.

En una modalidad específica, el genotipado del polimorfismo de IL-4RI50V o FcyRIIb I232T puede realizarse por tecnología de RT-PCR, utilizando el ensayo de discriminación del 5'-alelo TAQMAN™, un análisis basado en PCR del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción, o un instrumento de PYROSEQUENCER™. Además, el método para detectar una variación genética o un polimorfismo indicado en la Patente Norteamericana No. 7,175,985, incorporada por referencia, puede utilizarse. En este método un ácido nucleico se sintetiza utilizando el extremo 3' hibridizado, el cual es sintetizado mediante síntesis de cadena complementaria, en una región específica de una secuencia de nucleótido objetivo que existe como la secuencia de nucleótido de la misma cadena como el origen para la siguiente ronda de la síntesis de cadena complementaria.

Las sondas usadas para PCR pueden etiquetarse con un marcador perceptible, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, compuesto fluorescente, compuesto bioluminiscente, compuesto quimioluminescentes, quelante de metal, o enzima. Tales sondas y cebadores pueden utilizarse para detectar la presencia de polinucleótidos de SNP o SE en una muestra y como un medio para detectar una célula que expresa proteínas de SE o SNP. Como se entenderá por el experto en la técnica, un gran número diferente de cebadores y sondas puede prepararse basado en las secuencias proporcionado en la presente y utilizado efectivamente para amplificar, clonar, y/o determinar la presencia y/o niveles de mARN de SNP o SE.

Cualquiera de los marcadores genéticos de la invención, o porciones, de los mismos pueden también secuenciarse para determinar la presencia o ausencia en una muestra del SNP o SE. Cualquiera de los métodos bien conocidos para secuenciar una o ambas cadenas del alelo HLA-DRB1 SE, alelo IL-4R I50 y/o V50 y/o alelo FcyRIIb I232 y/o T232 pueden utilizarse en los métodos de la invención, tal como los métodos descritos en, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,075,216, Engelke y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 85, 544-548 and Wong y colaboradores (1987) Nature 330, 384-386; Maxim and Gilbert (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 74:560; o Sanger (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 74:5463. Además, cualquiera de una variedad de métodos de secuenciado automatizados pueden utilizarse. Ver, por ejemplo, Naeve, C.W. y colaboradores (1995) Biotechniques 19:448, incluyendo el secuenciado mediante espectrometría de masa (ver, por ejemplo, Publicación Internacional PCT No. WO 94/16101; Cohén y colaboradores (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; y Griffin y colaboradores (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159. En una modalidad, el alelo HLA-DRB1 SE de una muestra de un sujeto se secuencia directamente para determinar si el sujeto tiene por lo menos una copia del alelo HLA-DRB1 SE.

Como se indica antes, determinando la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, un alelo IL-4R I50 y/o un alelo IL-4R V50, y/o alelo ab FcyRIIb I232 o T232, puede incluir, por ejemplo, análisis del polimorfismo de longitud de fragmento de restricción. El análisis del polimorfismo de longitud de fragmento de restricción (RFLPS, por sus siglas en inglés) se basa en cambios en un sitio de enzima de restricción. Por otra parte, el uso de ribozimas específicas de secuencia (ver, por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,498,531) puede utilizarse para el conteo para la presencia de un sitio de división de ribozima específico.

Otra técnica para determinar la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, alelo IL-4R I50, alelo V50 y/o alelo FcyRIIb I232 o alelo T232 involucra hibridizar segmentos de ADN los cuales se están analizando (ADN objetivo) con una sonda de oligonucleótido complementaria, etiquetados como se describe en, por ejemplo, Wallace y colaboradores (1981) Nucí. Acids Res. 9, 879-894. A partir de un dúplex de ADN que contienen incluso un solo par de base incorrecto exhibe alta inestabilidad térmica, la temperatura de fusión diferencial puede utilizarse para distinguir ADN objetivos que son perfectamente complementarios a la sonda de los ADN objetivos que solamente difieren por un solo nucleótido. Este método se ha adaptado para detectar la presencia o ausencia de un sitio de restricción específico, como se describe en, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 4,683,194. El método involucra utilizar una sonda de oligonucleótido etiquetada en el extremo a través de un sitio de restricción que se hibridiza a un ADN objetivo. El dúplex hibridizado de ADN entonces se incuba con la enzima de restricción apropiada para ese sitio. Los sitios de restricción reformados serán divididos mediante digestión en el pares de dúplex entre la sonda y el objetivo mediante utilizar la endonucleasa de restricción. El sitio de restricción específico está presente en el ADN objetivo si se detectan moléculas de sonda acortadas.

Otros métodos para determinar la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, alelos IL-4R I50 y/o V50, y/o alelo FcyRIIb I232 y/o alelo T232 incluyen métodos en los cuales la protección de agentes de división se utiliza para detectar bases incorrectas en heterodúplexes de RNA/RNA o RNA/ADN (como se describe en, por ejemplo, Myers y colaboradores (1985) Science 230:1242. En general, la técnica anterior de "división incorrecta" inicia proporcionando heterodúplexes formados mediante hibridación de ARN o ADN (etiquetado) que contienen la secuencia polimórfica con ARN o ADN potencialmente polimórfica obtenida de una muestra. Los dúplex bicatenarios son tratados con un agente que divide las regiones monocatenarias del dúplex tal como el cual existirá debido al par de bases incorrectas entre las cadenas control y muestra. Por ejemplo, los dúplex de RNA/ADN pueden tratarse con RNasa e híbridos de ADN/ADN tratados con nucleasa S1 par enzimáticamente digerir las regiones incorrectas. En otras modalidades, los dúplex de ADN/ADN o RNA/ADN pueden tratarse con tetróxido de hidroxilamina u osmio y con piperidina para digerir regiones incorrectas. Después de la digestión de las regiones incorrectas, el material resultante entonces es separado por tamaño en la desnaturalización de geles de poliacrilamida. Ver, por ejemplo, Cotton y colaboradores (1988) Proc. Nati Acad Sci USA 85:4397; Saleeba y colaboradores (1992) Methods Enzymol. 217:286-295. En una modalidad preferida, el ADN o ARN control puede etiquetarse para detección.

En otra modalidad, las alteraciones en movilidad electroforética pueden utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB 1 SE, alelo IL-4R I50 y/o V50 y/o alelo FcY II 1232 y/o T232. Por ejemplo, el polimorfismo de conformación monocatenario (SSCP, por sus siglas en inglés) puede utilizarse para detectar diferencias en movilidad electroforética entre varios alelos HLA-DRB1 SE, IL-4R I50V y/o FcYRIIb I232T (como se describe en, por ejemplo, Orita y colaboradores (1989) Proc Nati. Acad. Sci. USA: 86:276; Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; y Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79). Los fragmentos de ADN monocatenario de la muestra y ácidos nucleicos control pueden desnaturalizarse y permitir la naturalización repetida. La estructura secundaria de ácidos nucleicos monocatenarios varia de acuerdo con la secuencia, la alteración resultante en movilidad electroforética permite la detección incluso de un solo cambio de base. Los fragmentos de ADN pueden etiquetarse o detectar con las sondas etiquetadas. La sensibilidad del ensayo puede mejorarse usando ARN (algo que ADN), en el cual la estructura secundaria es más sensible a un cambio en secuencia. En una modalidad preferida, el método sujeto utiliza análisis de heterodúplex para separar moléculas de heterodúplex bicatenarios en base de cambios en la movilidad electroforética (Keen y colaboradores (1991) Trends Genet. 7:5).

En aún otra modalidad, el movimiento de una molécula del ácido nucleico en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente del desnaturalizante se ensayan utilizando la desnaturalización de electroforesis del gel de gradiente (DGGE, por sus siglas en inglés) (como se describe en, por ejemplo, Myers y colaboradores (1985) Nature 313:495. Cuando DGGE se utiliza como el método de análisis, el ADN puede modificarse para asegurarse de que no desnaturaliza totalmente, por ejemplo agregando una abrazadera de GC de 40 bp, del ADN rico en GC de alta fusión mediante PCR. En una modalidad adicional, un gradiente de temperatura se utiliza en lugar de un gradiente de desnaturalización para identificar diferencias en la movilidad del ADN control y muestra (Rosenbaum and Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).

Ejemplos de otras técnicas para determinar la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, IL-4R I50V SNP y/o FcYRIIb I232T SNP incluyen, pero no se limitan a, hibridación selectiva del oligonucleótido, amplificación selectiva, o extensión selectiva del cebador. Por ejemplo, las cebadores del oligonucleótido pueden ser preparados en los cuales la región polimórfica se coloca centralmente y después se hibridiza a ADN etiquetado bajo condiciones que permitan la hibridación solamente si se encuentra un fósforo perfecto (Saiki y colaboradores (1986) Nature 324:163; Saiki y colaboradores (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:6230). Tales oligonucleótidos específicos del alelo se hibridizan al ADN objetivo amplificado por PCR o un número de diferentes polimorfismos cuando los oligonucleótidos se unen a la membrana hibridizante e hibridizan con el ADN objetivo etiquetado.

Otro proceso para determinar la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, IL-4R I50V SNP y/o FcyRIIb I232T SNP es el proceso de extensión del cebador que consiste de hibridizar un cebador de oligonucleótido etiquetado a un ARN o ADN de molde y después utilizando una polimerasa de ADN y trifosfatos de desoxinucleósido para ampliar el cebador al extremo 5' del molde. La resolución del producto de extensión del cebador etiquetado entonces es hace fraccionando en base de tamaño, por ejemplo, mediante electroforesis a través de un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Este proceso es de uso frecuente para comparar segmentos de ADN homólogos y detectar diferencias debido a la inserción o eliminación del nucleótido. Las diferencias debido a la sustitución del nucleótido no se detectan puesto que el tamaño es el único criterio usado para caracterizar el producto de extensión de cebador.

Por otra parte, cualquiera de los métodos bien conocidos para genotipar tales SNP (por ejemplo, secuenciación de ADN, técnicas de hibridación, ensayo basado en PCR, ensayo de PCR basado en agente de tinte fluorescente y enfriado rápido (sistema de detección de PCR de Taqman), técnicas basadas en PTFR, polimorfismo conformacional monocatenario (SSCP, por sus siglas en inglés), electroforesis de gel del gradiente denaturatizante (DGGE, por sus siglas en inglés), electroforesis de gel del gradiente de temperatura (TGGE, por sus siglas en inglés), división incorrecta química (CMC, por sus siglas en inglés), sistema basado en análisis de heterodúplex, técnicas basadas en espectroscopia de masa, ensayo de división invasora, secuenciado de relación al polimorfismo (PRS, por sus siglas en inglés), micromatrizs, un ensayo de extensión de círculo rodante, técnicas basadas en CLAR, técnicas basadas en DHPLC, ensayo de extensión del oligonucleótido (OLA, por sus siglas en inglés), ensayo basado en extensión (ARMS, (Sistema de Mutación Refractaria de Amplificación), ALEX (Extensión Lineal de Mutación Refractaria de Amplificación), SBCE (extensión de cadena base sencilla), un ensayo de faro molecular, invasor (Tecnología de tercera onda), un ensayo de reacción en cadena de ligasa, técnicas basadas en ensayo de 5'-nucleasa, electroforesis de arreglo capilar de hibridación (CAE, por sus siglas en inglés), pirosecuenciado, ensayo de truncamiento de proteína (PTT, por sus siglas en inglés), inmunoensayos, análisis de haplotipo, e hidridización de fase sólida (transferencia en mancha, transferencia en mancha inversa, chips) se conocen muy bien en la técnica y describe en, por ejemplo, Siitari, Nucleic acid diagnostics market, Technology Review 125/2002, ISDN 1239-758; Caplin (1999) Biochemica 1:5-8; Neville, (2002) BioTechniques 32:34-43; Underhill (197) Genome Res 7:996-1005; Oefner (2000) J Chromatogr B Biomed Sci Appl 739:345-55, y publicación de Patente Norteamericana No. 20010049586 y puede utilizarse en los métodos de la invención.

Aún otro método adecuado para determinar la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, IL-4R I50V SNP y/o FcyRIIb I232T SNP es el suerotipado de muestras biológicas de un sujeto que usa, por ejemplo, anticuerpos comercialmente disponibles para un alelo HLA-DRB1 SE, IL-4R I50V SNP y/o FcyRIIb I232T SNP en un ensayo de ELISA.

En ciertas situaciones las muestras pueden ensayarse para la expresión de un alelo HLA-DRB1 SE, alelo IL-4R I50 y/o V50 y/o alelo FcyRIIb I232 y/o T232 en el nivel de proteína, utilizando un reactivo de detección que detecte el producto de proteína codificado mediante el mARN del marcador. Por ejemplo, si un reactivo de anticuerpo está disponible que unes específicamente al producto de proteína del alelo HLA-DRB1 SE, el alelo IL-4R I50 o el alelo IL-4R V50, y/o el alelo FcyRIIb I232 o T232 a detectarse, y no para otras proteínas, después tal reactivo de anticuerpo puede utilizarse para detectar la expresión del alelo HLA-DRB1 SE, alelo IL-4R I50 o alelo V50 y/o alelo FcyRIIb I232 o T232 en una muestra del sujeto, o una preparación derivada de la muestra, utilizando técnicas basadas en anticuerpos estándar conocidas en la técnica, tal como análisis de FACS, ELISA y similares. En una modalidad, el anticuerpo puede distinguir entre los dos productos de proteína del alelo I50 IL-4R y el alelo V50 IL-4R. En otra modalidad, el anticuerpo puede distinguir entre los dos productos de proteína del alelo FcyRIIb I232 y el alelo FcyRIIb T232. En una modalidad, el anticuerpo usado en el método de detección puede identificar los aminoácidos 70-74 de la proteína HLA-DB1, y, en una modalidad adicional, es especifico para el SE.

Cualquier muestra obtenida de un sujeto que tiene o es propenso a tener artritis reumatoide puede utilizarse para determinar la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, IL-4R I50V SNP y/o FcvRI Ib I232T SNP. Por ejemplo, la muestra puede ser cualquier fluido o subcomponente de la misma, por ejemplo, fluidos de sangre, vómito, fluido intraarticular, saliva, linfa, fluido quístico, orina, fluidos recolectados mediante lavado bronquial, fluidos recolectados mediante enjuague peritoneal, o fluidos ginecológicos, obtenidos del sujeto. En una situación típica, el fluido puede ser una muestra de sangre, o un componente del mismo, obtenido del sujeto. La muestra puede también ser cualquier tejido o fragmentos o subcomponente del mismo, por ejemplo, hueso, tejido conectivo, cartílago, pulmón, hígado, riñón, tejido muscular, corazón, páncreas, y piel, obtenida del sujeto.

Las técnicas o métodos para obtener muestras de un sujeto son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, obtención de muestras mediante una esponja de boca o enjuague bocal; extracción de sangre; u obtención de una biopsia. El aislamiento de subcomponentes de muestras de fluido o tejido (por ejemplo, células o ARN o ADN) puede ser realizado utilizando técnicas bien conocidas en la técnica y las descritas en la sección de Ejemplos más adelante.

En otro aspecto, la invención pertenece a un método para predecir o evaluar la capacidad de respuesta de un sujeto que tiene o es propenso a tener artritis reumatoide, a un inhibidor del TNFa puesto en contacto con una muestra biológica derivada del sujeto con un agente capaz de detectar la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, IL-4R I50V SNP y/o FcyRIIb I232T SNP en la muestra, en donde la presencia del alelo HLA-DRB1 SE y/o alelo IL-4R I50 y/o alelo FcyRIlb-CC (T232T) en la muestra es una indicación que el sujeto responderá al inhibidor del TNFa, de tal modo prediciendo o evaluando la capacidad de respuesta del sujeto al inhibidor del TNFa. Poniendo en contacto una muestra biológica derivada del sujeto con un agente capaz de detectar la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, IL-4R I50V SNP y/o FcYRIIb I232T SNP en la muestra, la muestra es transformada o cambiada necesariamente de cierta manera de su forma original tal que la detección de la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, IL-4R I50V SNP y/o FcyRIIb I232T SNP en la muestra pueden alcanzarse. El agente con el cual se pone en contacto la muestra biológica puede ser, por ejemplo, PCR/cebador de secuenciado, nucleótidos y enzimas adecuadas para amplificar y/o secuenciar y/o etiquetar el alelo HLA-DRB1 SE, el alelo IL-4R I50 o V50 y/o el alelo FcyRIIb I232 o T232 (por ejemplo, una región distinta dentro del alelo HLA-DRB1 SE (por ejemplo, secuencia del ácido nucleico que corresponde a los aminoácidos 70-74), el alelo IL-4R I50 o V50 (es decir, la región que distingue el SNP) y/o alelos FcyRIIb 1232 o T232) presentes en la muestra, un anticuerpo capaz de detectar un alelo HLA-DRB1 SE, de distinguir IL-4R I50V SNP y/o de distinguir FcyRIIb I232T SNP en la muestra, una enzima de restricción, y/o un micromatriz.

La medida de los niveles de expresión del biomarcador o presencia puede realizarse mediante utilizar un programa de software ejecutado mediante un procesador adecuado. El software y procesadores adecuados son bien conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles. El programa puede incorporarse en el software almacenado en un medio tangible tal como un CD-ROM, un disco flexible, un disco dura, un DVD, o una memoria asociada con el procesador, pero los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que el programa o partes enteras del mismo podrán ejecutarse alternativamente por un dispositivo con excepción de un procesador, y/o incorporar en el firmware y/o hardware dedicado de una manera bien conocida.

Seguido de la medición de los niveles de expresión o presencia de los genes identificados en la presente, o sus productos de expresión, y la determinación que un sujeto es probable o no probable de responder al tratamiento con un inhibidor del TNFa, los resultados del ensayo, conclusiones, diagnósticos, predicciones, y/o recomendaciones del tratamiento pueden registrarse y comunicarse a los técnicos, médicos, y/o pacientes, por ejemplo. En ciertas modalidades, las computadoras se utilizarán para comunicar tal información a las partes interesadas, tal como pacientes y/o médicos de asistencia. En algunas modalidades, los ensayo serán realizados o los resultados del ensayo serán analizados en un país o jurisdicción que difiera del país o jurisdicción a los cuales se comunican los resultados o diagnósticos.

En una modalidad preferida, un diagnóstico, predicción, y/o recomendación del tratamiento basado en el nivel de expresión o presencia de un marcador genético en un sujeto de prueba de uno o más de los marcadores genéticos en la presente se comunica al sujeto tan pronto sea posible después de que se terminó el ensayo y generó el diagnóstico y/o predicción. Los resultados y/o información relacionada pueden comunicarse al sujeto por el médico que trata al sujeto. Alternativamente, los resultados pueden comunicarse directamente a un sujeto de prueba por cualquier medio de comunicación, incluyendo escrito, formas electrónicas de comunicación, tal como correo electrónico, o teléfono. La comunicación puede facilitarse mediante una computadora, tal como en el caso de comunicaciones de correo electrónico. En ciertas modalidades, la comunicación que contiene los resultados de una prueba de diagnóstico y/o conclusiones basadas en la misma y/o recomendaciones de tratamiento basadas en la prueba puede generarse y entregarse automáticamente al sujeto utilizando una combinación de hardware y software de computadora que sea familiar a los experto en la técnica en telecomunicaciones. Un ejemplo de un sistema de comunicaciones de orientado a la asistencia médica se describe en la Patente Norteamericana No. 6,283,761; sin embargo, la presente invención no se limita a métodos que utilizan este sistema de comunicaciones particular. En ciertas modalidades de los métodos de la invención, todas o algunas de las etapas del método, incluyendo el ensayo de muestras, diagnóstico de enfermedades, y comunicación de resultados de ensayo o diagnósticos, pueden realizarse en diferentes jurisdicciones (por ejemplo, extranjeras).

Selección y Uso de Regímenes de Tratamiento con Inhibidores de TNFa Dada la observación que la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, alelos IL-4R I50 y/o V50, y/o alelos FcyRIIb I232 y/o T232 en un sujeto que tiene o es propenso a tener artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) influye en la capacidad de respuesta del sujeto a un tratamiento con un inhibidor del TNFa, por ejemplo, un anticuerpo TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, tal como, pero sin limitarse a, adalimumab, uno puede seleccionar un régimen de tratamiento apropiado para el sujeto basado en la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, alelos IL-4R I50 y/o V50, y/o alelos FcyRIIb I232 y/o T232 en el sujeto. Por consiguiente, en una modalidad, la invención proporciona un método para seleccionar un régimen de tratamiento con el inhibidor del TNFa basado sobre la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, alelos IL-4R I50 y/o V50, y/o alelos FcyRIIb 1232 y/o T232 en el sujeto. En otro aspecto, el método adicionalmente comprende administrar el inhibidor del TNFa al sujeto de acuerdo con el régimen de tratamiento tal que la artritis reumatoide es tratada en el sujeto. En otro aspecto, el método con todo comprende además administrar MTX y el inhibidor del TNFa al sujeto de acuerdo con el régimen de tratamiento tal que la artritis reumatoide es tratada en el sujeto.

En un aspecto, la invención proporciona un método para seleccionar un régimen de tratamiento para la terapia con un inhibidor del TNFa, por ejemplo, un anticuerpo de TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, tal como, pero sin limitarse a, adalimumab, en un sujeto que tiene o es propenso a tener artritis reumatoide. El método incluye determinar la presencia o ausencia (o número de copias) de un alelo HLA-DRB1 SE, alelos IL-4R I50 y/o V50, y/o alelos FcyRIIb I232 y/o T232 en el sujeto; y seleccionando un régimen de tratamiento con el inhibidor del TNFa basado sobre la presencia o ausencia (o número de copias) de un alelo HLA-DRB1 SE, alelos IL-4R I50 y/o V50, y/o alelos FcyRIIb I232 y/o T232 en el sujeto.

En un aspecto, la invención proporciona un método para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto que tiene artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) para tratamiento con un inhibidor del TNFa, por ejemplo, un anticuerpo TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, por ejemplo, pero sin limitarse a, adalimumab, determinando si el sujeto tiene un alelo HLA-DRB1 SE. En un aspecto, una muestra se obtiene del sujeto y evalúa para la presencia (o ausencia/o número de copias) de un alelo HLA-DRB1 SE. En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar un sujeto que tiene RA administrando un inhibidor del TNFa, a condición de que por lo menos una copia de un alelo HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés) esté presente en una muestra del sujeto. En una modalidad, una muestra del sujeto se prueba para la presencia de por lo menos una copia de un alelo HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés). Como se describe en los ejemplos más adelante, la presencia de por lo menos una copia del alelo HLA-DRB1 SE indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

En un aspecto, la invención proporciona un método para predecir la capacidad de respuesta de un sujeto que tiene artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) para tratamiento con un inhibidor del TNFa, por ejemplo, un anticuerpo TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, por ejemplo, pero sin limitarse a, adalimumab, determinando si el sujeto tiene un alelo FcyRIIb T232 (o, alternativamente si el sujeto tiene un alelo FcyRIIb I232). En un aspecto, una muestra se obtiene del sujeto y evalúa para la presencia (o ausencia/o número de copias) de un alelo FcyRIIb T232 (o, alternativamente si el sujeto tiene un alelo FcyRIIb I232). En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar un sujeto que tiene RA administrando un inhibidor del TNFa, a condición de que dos copias de un alelo FcvRllb T232 estén presentes en una muestra del sujeto. Como se describe en los ejemplos más adelante, la presencia de alelo FcYRIlb-CC indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor del TNFa.

En una modalidad de la invención, la presencia (o ausencia/o número de copias) de un alelo HLA-DRB1 SE se prueba en combinación con la presencia de un alelo FcyRIIb I232 y/o un alelo FcyRIIb T232 para determinar si un sujeto que tiene RA será sensible al tratamiento con un inhibidor del TNFa, por ejemplo, un anticuerpo TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, por ejemplo, pero no se limita a, adalimumab. En una modalidad de la invención, se prueba la presencia de un alelo HLA-DRB1 SE en combinación con la presencia de alelo IL-4R I50 y/o IL-4R V50 para determinar si un sujeto que tiene RA será sensible al tratamiento con un inhibidor del TNFa. En una modalidad de la invención, se prueba la presencia de un alelo HLA-DRB1 SE en combinación con la presencia de un alelo IL-4R I50 y/o IL-4R V50, y un alelo FcyRIIb I232 y/o FcyRIIb T232 para determinar si un sujeto que tiene RA será sensible al tratamiento con un inhibidor del TNFa. En una modalidad, la presencia de un alelo FcyRIIb I232 y/o FcyRIIb T232 se prueba en combinación con la presencia de un alelo IL-4R I50 y/o IL-4R V50 para determinar si un sujeto que tiene RA será sensible al tratamiento con un inhibidor del TNFa.

En una modalidad, los marcadores genéticos descritos en la presente pueden utilizarse en un método para seleccionar a un paciente que tiene RA que será sensible al tratamiento con un inhibidor del TNFa, por ejemplo, un anticuerpo TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, por ejemplo, pero sin limitarse a, adalimumab.

En una modalidad, en determinar la presencia de un alelo, el método puede incluir determinar del número de copias del alelo. Alternativamente, el método de ensayo puede apenas determinar la presencia o ausencia del marcador genético.

En otra modalidad, la invención también proporciona un método para tratar un sujeto que tiene artritis reumatoide con un inhibidor del TNFa. El método incluye determinar la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, alelos IL-4R I50 y/o V50, y/o alelos FcyRIIb I232 y/o T232 en el sujeto, seleccionando un régimen de tratamiento con un inhibidor del TNFa basado sobre la presencia o ausencia de un alelo HLA-DRB1 SE, alelos IL-4R I50 y/o II-4R V50, y/o alelos FcyRIIb I232 y/o T232 en el sujeto, y administrando el inhibidor del TNFa de acuerdo con el régimen de tratamiento tal que el sujeto es tratado para la artritis reumatoide.

El régimen de tratamiento que es seleccionado típicamente incluye por lo menos uno de los siguientes parámetros y puede incluir muchos o todos los siguientes parámetros: el tipo de agente elegido para la administración, la dosificación, la formulación, la ruta de administración y/o la frecuencia de administración.

Como se describe en los ejemplos más adelante, incluyendo, por ejemplo, en sujetos con por lo menos 1 copia del alelo HLA-DRB1 SE o el alelo FcYRIlb-CC, la terapia de combinación con adalimumab y metotrexato se asociaron con las respuestas clínicas significativamente mejoradas comparadas con la monoterapia de metotrexato. Además, la respuesta clínica significativamente mejorada se observó para pacientes en adalimumab y metotrexato que fueron homocigotos o heterocigotos para los alelos de IL-4R I50 (AA o AG) pero no en pacientes con dos alelos IL-4R V50 (GG). FcYRIlb-CC se asoció significativamente con alcanzar las respuestas clínicas. Además, en combinación, el efecto del número de copia de SE se mutó en los antecedentes tipo silvestre IL-4R-AA y FcyRI Ib-TT, pero evidente cuando por lo menos 1 copia de o las variantes genéticas IL-4R (AG o GG) o FcyRIIb (TC o CC) están presentes.

Los métodos de tratamiento descritos en la presente pueden incluir la administración de un inhibidor del TNFa a un sujeto para alcanzan una meta terapéutica, por ejemplo, alcanzando una cierta respuesta de ACR, por ejemplo, ACR20, ACR50, ACR70 y/o mejorando el conteo DAS28, incluyendo, por ejemplo, actividad baja de enfermedad de DAS28 (DAS28 LDA, por sus siglas en inglés) o remisión de DAS28.

DAS28 (conteo de actividad de enfermedad) se conoce en la técnica como una medida aceptada de la actividad de la artritis reumatoide en un sujeto afectado. Se incluyen los siguientes parámetros en el cálculo: Número de articulaciones sensibles al tacto (TEN, por sus siglas en inglés); Número de articulaciones hinchadas (SW, por sus siglas en inglés); Velocidad de sedimentación de los eritrocitos (ESR, por sus siglas en inglés); Evaluación del paciente de la actividad de la enfermedad (VAS; mm) (ver Van der Heijde y colaboradores Ann Rheum Dis 1990;49:916-20). En DAS modificado (DAS28) se evaluaron 28 articulaciones (ver Prevoo MLL, y colaboradores Arthritis Rheum 1995;38:44-8).

Los criterios preliminares de la Universidad Americana de Reumatología para la mejora en Artritis Reumatoide (ACR20, 50, 70 respuestas) se desarrolló para proporcionar medidas de eficacia para los tratamientos de la artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés). ACR20, ACR50 y ACR70 requiere mayor del 20%, 50% y 70% de mejor respectivamente. Los criterios de respuesta se detallan en Felson DT, Anderson JJ, Boers M, Bombardier C, Furst D, Goldsmith C, y colaboradores American College of Rheumatology preliminary definition of improvement in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 1995;38:727-35, incorporado por referencia en la presente. Generalmente, los pacientes se examinan clínicamente en el cribado, línea base, y frecuentemente durante el tratamiento. La eficacia primaria para los signos y síntomas se mide a través de los criterios preliminares de la Universidad Americana de Reumatología para la mejora (ACR20) en 12 semanas. Un punto final primario adicional incluye la evaluación de cambios radiológicos durante 6 a 12 meses para determinar cambios en daño estructural.

En una modalidad, el sujeto se trata con un inhibidor del TNFa de acuerdo con un régimen de dosificación bisemanal. Los regímenes de dosificación bisemanales se describen adicionalmente en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 10/163657 (US 20030235585), incorporada por referencia en la presente.

En un aspecto de la invención, el inhibidor del TNFa se administra al sujeto que tiene RA como una dosis fija (en contraste con una dosis mg/kg). En una modalidad, la dosis fija es de aproximadamente 20-80 mg, aproximadamente 20-60 mg, aproximadamente 30-50 mg, o aproximadamente 40 mg. En una modalidad adicional, la dosis fija es de aproximadamente 50 mg.

En una modalidad, el sujeto es administrado subcutáneamente 40 mg de un anticuerpo TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, cada otra semana para el tratamiento de la RA.

En otro aspecto de la invención, el sujeto se trata con un inhibidor del TNFa de acuerdo con un régimen de dosificación mensual. En una modalidad, el sujeto es administrado subcutáneamente 50 mg de un anticuerpo TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, una vez al mes para el tratamiento de la RA.

En una modalidad adicional, el inhibidor del TNFa se administra al sujeto en combinación con metotrexato para el tratamiento de la RA.

Inhibidores del TNFa de la invención Los inhibidores de TNFa particularmente preferidos son agentes biológicos que se han aprobado por la FDA para uso en humanos en el tratamiento de la artritis reumatoide o están experimentando la prueba clínica para el tratamiento de la artritis regmatoide.

En una modalidad, la invención se caracteriza por los usos y composición para predecir o determinar la eficacia de un inhibidor del TNFa para el tratamiento de la artritis reumatoide, en donde el anticuerpo del TNFa es un anticuerpo humano aislado, o porción de unión al antígeno del mismo, que une al TNFa humano con alta afinidad y una disociación baja, y también tiene una alta capacidad de neutralización. Preferiblemente, los anticuerpos humanos usados en la invención son anticuerpos anti-hTNFa humanos recombinantes, neutralizantes. El anticuerpo recombinante, neutralizante más preferido de la invención se refiere en la presente como D2E7, también referido como HUMIRA® o adalimumab (la secuencia de aminoácido de la región VL D2E7 se muestra en SEC ID NO: 1; la secuencia de aminoácido de la región VH D2E7 se muestra en SEC ID NO: 2; la secuencia del ácido nucleico de los dominios de VL y VH se describe en la DEC ID NOs: 36 y 37, respectivamente). Las propiedades de D2E7 (adalimumab/HUMIRA®) se han descrito en Salfeld y colaboradores, Patentes Norteamericanas Nos. 6,090,382, 6,258,562, y 6,509,015, que cada una se incorpora por referencia en la presente.

En una modalidad, el inhibidor del TNFa es un anticuerpo TNFa completamente humano que es un biosimilar a adalimumab. En una modalidad, el inhibidor del TNFa es altamente similar a adalimumab, y puede, por ejemplo, incluir diferencias menores en componentes clínicamente inactivos. En una modalidad, el inhibidor del TNFa es intercambiable con adalimumab, y puede, por ejemplo, producir el mismo resultado clínico como adalimumab en cualquier paciente dado.

En una modalidad, el método de la invención incluye determinar de la eficacia de los anticuerpos D2E7 y las porciones del anticuerpo, los anticuerpos relacionado con D2E7 y las porciones del anticuerpo, o de otros anticuerpos y porciones del anticuerpo humanos con propiedades equivalentes a D2E7, tal como alta afinidad que une a hTNFa con cinética de baja disociación y alta capacidad neutralizante, para el tratamiento de la artritis reumatoide. En una modalidad, la invención proporciona el tratamiento con un anticuerpo humano aislado, o una porción de unión al antígeno del mismo, que disocia de TNFa humano con un Kd de 1 x 10'8 M o menor y una constante koff de 1 x 10"3 s" o menor, ambos determinados mediante resonancia de plasmón superficial, y neutraliza la citotoxicidad del TNFa humano en un ensayo L929 in vitro estándar con una Cl50 de 1 x 10"7 M o menor. Más preferiblemente, el anticuerpo humano aislado, o porción de unión al antígeno del mismo, disocia del TNFa humano con un koff de 5 x 10"4 s" o menor, o aún preferiblemente, con un k0 de 1 x 10"4 s"1 o menor. Más preferiblemente, el anticuerpo humano aislado, o porción de unión al antígeno del mismo, neutraliza la citotoxicidad del TNFa humano en un ensayo L929 in vitro estándar con una Cl50 de 1 x 10"8 M o menor, más preferiblemente con una Cl50 de 1 x 10"9 M o menor y aún preferiblemente con una CI5o de 1 x 10"10 M o menor. En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante humano aislado, o una porción de unión al antígeno del mismo.

Es bien conocido en la técnica que los dominios de CDR3 de cadena pesada y ligera del anticuerpo desempeñan un papel importante en la especificada/afinidad de unión de un anticuerpo para un antígeno. Por consiguiente, en otro aspecto, la invención pertenece para tratar la enfermedad de Crohn administrando anticuerpos humanos que tienen cinética de lenta disociación para la asociación con el hTNFa y que tienen dominios de CDR3 de cadena ligera y pesada que estructuralmente son idénticos a o relacionados con los de D2E7. La posición 9 del CDR3 de VL de D2E7 puede ocuparse por Ala o Thr sin sustancialmente afectar al koff. Por consiguiente, un motivo de consenso para el CDR3 de VL de D2E7 comprende la secuencia de aminoácido: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEC ID NO: 3). Adicionalmente, la posición 12 del CDR3 de VH de D2E7 puede ocuparse por Tyr o Asn, sin sustancialmente afectar al koff. Por consiguiente, un motivo de consenso para el CDR3 VH D2E7 comprende la secuencia de aminoácido: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEC ID NO: 4). Por otra parte, como se demuestra en el Ejemplo 2 de la Patente Norteamericana No. 6,090,382, del dominio CDR3 de las cadenas pesada y ligera de D2E7 es favorable para la sustitución con un solo residuo de alanina (en la posición 1, 4, 5, 7 u 8 dentro del CDR3 de VL o en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11 dentro del CDR3 de VH) sin sustancialmente afectar al koff. Aún además, el experto en la técnica apreciará que, dada la docilidad de los dominios de CDR3 de y VH de D2E7 a sustituciones por alanina, la sustitución de otros aminoácidos dentro de los dominios CDR3 puede ser posible mientras que todavía conserva la constante de disociación baja del anticuerpo, en particular sustituciones con aminoácidos conservadores. Preferiblemente, no más de una a cinco sustituciones conservadoras del aminoácido se hacen dentro de los dominios de CDR3 de VL y/o VH de D2E7. Más preferiblemente, no más de una a tres sustituciones conservadoras del aminoácido se hacen dentro de los dominios de CDR3 de VL y/o VH de D2E7. Adicionalmente, las sustituciones conservadoras del aminoácido no deben hacerse en las posiciones del aminoácido críticas para unir al hTNFa. Las posiciones 2 y 5 del CDR3 de VL de D2E7 y posiciones 1 y 7 del CDR3 de VH de D2E7 son críticas para la interacción con hTNFa y así, las sustituciones conservadoras del aminoácido no se hacen preferiblemente en estas posiciones (aunque una sustitución de alanina en la posición 5 del CDR3 de VL de D2E7 es aceptable, como se describe anteriormente) (ver Patente Norteamericana No. 6,090,382).

Por consiguiente, en otra modalidad, el anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo contiene preferiblemente las siguientes características: a) disocia del TNFa humano con una constante koff de 1 x 10"3 s"1 o menor, como se determina mediante resonancia de plasmón superficial; b) tiene un dominio de CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 3, o modificado de la SEC ID NO: 3 por una sola sustitución de alanina en la posición 1, 4, 5, 7 u 8 o por una a cinco sustituciones conservadoras del aminoácido en las posiciones 1, 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9; c) tiene un dominio de CDR3 de cadena pesada que comprende de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4, o modificado de la SEC ID NO: 4 por una sola sustitución de alanina en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11 o por una a cinco sustituciones conservadoras del aminoácido en las posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y/o 12.

Más preferiblemente, el anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, disocia del TNFa humano con un koff de 5 x 10'4 S'1 o menor. Aún más preferiblemente, el anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, disocia del TNFa humano con un koff de 1 x 10"4 s"1 o menor.

En aún otra modalidad, el anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo contiene preferiblemente una región variable de cadena ligera (LCVR, por sus siglas en inglés) que tiene un dominio de CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 3, o modificado de la SEC ID NO: 3 por una sola sustitución de alanina en la posición 1, 4, 5, 7 u 8, y con una región variable de cadena pesada que tiene un dominio de CDR3 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4, o modificado de la SEC ID NO: 4 por una sola sustitución de alanina en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 u 11. En una modalidad, la LCVR adicionalmente tiene un dominio de CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 5 (es decir, CDR2 de VL de D2E7) y la HCVR adicionalmente tiene un dominio de CDR2 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 6 (es decir, el CDR2 de VH de D2E7). En una modalidad, la LCVR adicionalmente tiene el dominio CDR1 que comprende de la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 7 (es decir, el CDR1 de VL de D2E7) y la HCVR tiene un dominio de CDR1 que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 8 (es decir, el CDR1 de VH de D2E7). Las regiones de entramado para VL son preferiblemente de la familia de línea germinal humana VJ, más preferiblemente del gen Vk de línea germinal humana A20 y más preferiblemente de las secuencias de entramado de VL de D2E7 mostradas en las Figuras 1A y 1B de la Patente Norteamericana No. 6,090,382. Las regiones de entramado para VH son preferiblemente de la familia de línea germinal humana VH3, más preferiblemente del gen de VH de línea germinal humano DP-31 y más preferiblemente de las secuencias de entramado de VH de D2E7 mostradas en las Figuras 2A y 2B de la Patente Norteamericana No. 6,090,382.

Por consiguiente, en otra modalidad, el anticuerpo o porción de unión al antígeno del mismo contiene preferiblemente una región variable de cadena ligera (LCVR, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1 (es decir, la VL de D2E7) y una región variable de cadena pesada (HCVR, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2 (es decir, la VH de D2E7). En ciertas modalidades, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada, tal como una región constante de lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM o IgD. Preferiblemente, la región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada I g G 1 o una región constante de cadena pesada lgG4. Además, el anticuerpo puede comprender una región constante de cadena ligera, una región constante de cadena ligera kappa o una región constante de cadena ligera lambda.

Preferiblemente, el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera kappa. Alternativamente, la porción del anticuerpo puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab o un fragmento Fv de cadena sencilla.

En aún otras modalidades, la invención incluye usar un anticuerpo humano aislado, o porciones de unión al antígeno del mismo, que contiene los dominios de CDR3 de VL y VH relacionados con D2E7. Por ejemplo, anticuerpos, o porciones de unión al antígenos del mismo, con una región variable de cadena ligera (LCVR, por sus siglas en inglés) que tiene un dominio CDR3 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 3, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15, SEC ID NO: 16, SEC ID NO: 17, SEC ID NO: 18, SEC ID NO: 19, SEC ID NO: 20, SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22, SEC ID NO: 23, SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25 y SEC ID NO: 26 o con una región variable de cadena pesada (HCVR, por sus siglas en inglés) que tiene un dominio CDR3 que comprende una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste de la SEC ID NO: 4, SEC ID NO: 27, SEC ID NO: 28, SEC ID NO: 29, SEC ID NO: 30, SEC ID NO: 31, SEC ID NO: 32, SEC ID NO: 33, SEC ID NO: 34 y SEC ID NO: 35.

Los métodos de la invención pueden también realizarse utilizando anticuerpos anti-hTNFa murinos quiméricos y humanizados que han experimentado la prueba clínica para el tratamiento de la artritis reumatoide (ver por ejemplo, Elliott, M.J., y colaboradores (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliot, M.J., y colaboradores (1994) Lancet 344:1105-1110; Rankin, E.C., y colaboradores (1995) Br. J. Rheumatol. 34:334-342).

El anticuerpo del TNFa usado en los métodos y composiciones de la invención puede modificarse para el tratamiento mejorado de la artritis reumatoide. En algunas modalidades, fragmentos del anticuerpo TNFa o unión al antígeno del mismo, químicamente se modifican para proporcionar un efecto deseado. Por ejemplo, la pegilación de anticuerpos y fragmentos del anticuerpo de la invención pueden realizarse mediante cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la técnica, como se describe, por ejemplo, en las siguientes referencias: Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992); EP 0 154 316; y EP 0 401 384 (que se incorporan por referencia en la presente en su totalidad). Preferiblemente, la pegilación se realiza a través de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Un polímero soluble en agua preferido para la pegilación de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de la invención es polietilenglicol (PEG, por sus siglas en inglés). Como se utiliza en la presente, el "polietilenglicol" se significa para comprender cualquiera de las formas unas de PEG que se han utilizado para derivatizar otras proteínas, tal como mono (CI-CIO) alcoxi- o ariloxi-polietilenglicol.

Los métodos para preparar anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pegilados de la invención comprenderán generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo con polietilenglicol, tal como un éster o aldehido reactivo derivado de PEG, bajo condiciones en donde el anticuerpo o fragmento de anticuerpo llaga a unirse a uno o más grupos de PEG, y (b) obtener los productos de reacción. Será evidente a un experto en la técnica seleccionar las condiciones de reacción óptimas o las reacciones de acilación basadas en parámetros conocidos y el resultado deseado.

Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pegilados pueden utilizarse generalmente para tratar artritis reumatoide mediante la administración de los anticuerpos del TNFa y los fragmentos de anticuerpo descritos en la presente. Generalmente los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pegilados han aumentado la vida promedio, con respecto a los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpo no pegilados. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo pegilados pueden emplearse solos, juntos, o en combinación con otras composiciones farmacéuticas.

En aún otra modalidad de la invención, los anticuerpos del TNFa o fragmentos del mismo pueden alterarse en donde la región constante del anticuerpo se modifica para reducir por lo menos una función efectora biológica mediada por región constante con relación a un anticuerpo sin modificar. Para modificar un anticuerpo de la invención tal que exhiba reducir la unión al receptor Fe, el segmento de región constante de inmunoglobulina del anticuerpo puede mutarse en regiones particulares necesarias para las interacciones del receptor Fe (FcR, por sus siglas en inglés) (ver por ejemplo, Canfield, S.M. and S.L. Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1 83-1491; y Lund, J. y colaboradores (1991) J. of Immunol. 1 7:2657-2662). La reducción en la capacidad de unión de FcR del anticuerpo puede también reducir otras funciones efectoras que confíen en las interacciones de FcR, tal como opsonización y fagocitosis y citotoxicidad celular dependiente de antígeno.

Un anticuerpo o porción de anticuerpo usado en los métodos de la invención puede derivatizarse o ligarse a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por consiguiente, los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención se desean para incluir formas derivatizadas y de otra manera modificadas de los anticuerpos anti-hTNFa humanos descritos en la presente, incluyendo moléculas de inmunoadhesión. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención puede ligarse funcionalmente (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más otras entidades moleculares, tal como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico, y/o una proteína o péptido que puede mediarse asociado del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región central de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).

Un tipo de anticuerpo derivatizado es producido mediante reticular dos o más anticuerpos (del mismo tipo o de diferentes tipos, por ejemplo, para crear anticuerpos biespecíficos). Los reticuladores adecuados incluyen los que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos distintamente reactivos separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) o homobifuncional (por ejemplo, suberato de disuccinimidilo). Tales enlazadores están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

Los agentes detectables útiles con los cuales un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención pueden derivatizarse incluyen compuestos fluorescentes. Los agentes detectables fluorescentes ejemplares incluyen fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1 -nafalensulfonilo, ficoeritrina y similares. Un anticuerpo puede también derivatizarse con enzimas detectables, tal como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo se derivatiza con una enzima significativa, es detectado agregando reactivo adicionales que la enzima utiliza para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando el agente detectable peroxidasa de rábano picante está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina lleva a un producto de reacción coloreado, el cual es detectable. Un anticuerpo puede también derivatizarse con biotina, y detectarse mediante la medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina.

Un anticuerpo, o porción de anticuerpo, usada en los métodos y composiciones de la invención, puede prepararse mediante expresión recombinante de genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina en una célula hospedadora. Para expresar un anticuerpo recombinante, una célula hospedadora se transfecta con uno o más vectores de expresión recombinantes que llevan fragmentos de ADN que codifican cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina del anticuerpo tal que las cadenas ligeras y pesadas están expresadas en la célula hospedadora y, preferiblemente, secretadas en el medio en el cual se cultivan las células hospedadoras, en donde el medio de los anticuerpos puede recuperarse. Las metodologías del ADN recombinante estándar se utilizan para obtener genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo, incorporan estos genes en vectores de expresión recombinantes e introducen los vectores en células hospedadoras, tal como las descritas en Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F.M. y colaboradores (eds.) Current Prptocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) y Patente Norteamericana No. 4,816,397 de Boss y colaboradores.

Para expresar el anticuerpo relacionado con adalimumab (D2E7) o adalimumab (D2E7), los fragmentos de ADN que codifican las regiones variables de cadena ligera y pesada primero se obtienen. Estos ADN puede obtenerse mediante la amplificación y modificación de secuencias variables de cadena ligera y pesada de línea germinal utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés). Las secuencias de ADN de línea germinal para genes de región variable de cadena pesada y ligera humanos se conocen en la técnica (ver por ejemplo, la base de datos de secuencia de línea germinal humana "Vbase"; ver también Kabat, E.A., y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación de NIH No. 91-3242; Tomlinson, I.M., y colaboradores (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveáis about Fifty Groups of VH Segmente with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; y Cox, J.P.L. y colaboradores (1994) "A Directory of Human Germ-line V7B Segments Reveáis a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; el contenido de las cuales se incorporan expresamente en la presente por referencia). Para obtener un fragmento de ADN que codifica la región variable de cadena pesada de D2E7, o un anticuerpo relacionado con D2E7, un miembro de la familia VH3 de genes de VH de línea germinal humanos se amplifica mediante PCR estándar. Más preferiblemente, se amplifica la secuencia de línea germinal de VH de DP-31. Para obtener un fragmento de ADN que codifica la región variable de cadena ligera de D2E7, o un anticuerpo relacionado con D2E7, un miembro de la familia VJ de genes de VL de línea germinal humanos se amplifica mediante PCR estándar. Más preferiblemente, se amplifica la secuencia de línea germinal de VL A20. Los cebadores de PCR adecuados para uso en amplificar las secuencias de VL de línea germinal VH y línea germinal A20 de DP-31 pueden diseñarse basados en las secuencias de nucleótido descritas en las referencias citadas posteriormente, utilizando métodos estándar.

Una vez que se obtienen los fragmentos de VH y VL de línea germinal, estas secuencias pueden mutarse para codificar el D2E7 o secuencias de aminoácidos relacionadas con D2E7 descritas en la presente. Las secuencias de aminoácidos codificadas mediante las secuencias de ADN de VH y VL de línea germinal son primer comparadas al D2E7 o secuencias de aminoácidos de VH y VL relacionadas con D2E7 para identificar residuos de aminoácidos en el D2E7 o secuencia relacionada con D2E7 que difieren de línea germinal. Entonces, los nucleótidos apropiados de las secuencias de ADN de línea germinal se mutan tal que la secuencia de línea germinal mutada codifica el D2E7 o secuencia de aminoácido relacionada con D2E7, utilizando el código genético para determinar qué cambios del nucleótido deben realizarse. La mutagénesis de las secuencias de línea germinal es realizada mediante métodos estándar, tal como mutagénesis mediada por PCR (en la cual se incorporan los nucleótidos mutados en los cebadores de PCR tal que el producto de PCR contiene las mutaciones) o mutagénesis dirigida al sitio.

Por otra parte, debe observarse que si las secuencias de "línea germinal" obtenidas mediante amplificación de PCR codifican diferencias de aminoácido en las regiones de entramado de la configuración verdadera de línea germinal (es decir, diferencias en la secuencia amplificada con respecto a la secuencia verdadera de línea germinal, por ejemplo como un resultado de la mutación somática), puede ser deseable cambiar estas diferencias del aminoácido de nuevo a las secuencias verdaderas de línea germinal (es decir, "retromutación" de residuos de entramado a la configuración de línea germinal).

Una vez que los fragmentos de ADN que codifican D2E7 o segmentos de VH y VL relacionados con D2E7 se obtienen (mediante amplificación y mutagénesis de genes de VH y VL de línea germinal, como se describe anteriormente), estos fragmentos de ADN pueden manipularse además mediante técnicas de ADN recombinante estándar, por ejemplo para convertir los genes de región variable a genes de cadena del anticuerpo de longitud completa, a genes de fragmento Fabs o a un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica la VL o VH se liga operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante del anticuerpo o un enlazador flexible. El término "ligado operativamente", como se utiliza en este contexto, se desea para significar que los dos fragmentos de ADN están unidos tal que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN siguen siendo en entramado.

El ADN aislado que codifica la región de VH puede convertirse a un gen de cadena pesada de longitud completa operativamente ligando el ADN que codifica la VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de genes de región constante de cadena pesada humanos se conocen en la técnica (ver por ejemplo, Kabat, E.A., y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación de NIH No. 91-3242) y fragmentos de ADN que comprenden estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación de PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero más preferiblemente es una región constante lgG1 o lgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmento Fab, el ADN que codifica la VH puede ligarse operativamente a otra molécula de ADN que codifica solamente la región constante CH1 de cadena pesada.

El ADN aislada que codifica la región de VL puede convertirse a un gen de cadena ligera de longitud completa (así como un gen de cadena ligera Fab) operativamente ligando el ADN que codifica la VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de región constantes de cadena ligera humanos se conocen en la técnica (ver por ejemplo, Kabat, E.A., y colaboradores (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicació de NIH No. 91-3242) y fragmentos de ADN que comprenden estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación de PCR estándar. La región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda, pero más preferiblemente es una región constante kappa.

Para crear un gen scFv, los fragmentos ADN que codifica VH y VL se ligan operativamente a otro fragmento que codifica una enlazador flexible, por ejemplo, codificando la secuencia de aminoácido (Gly4-Ser)3 (SEC ID NO:42) tal que las secuencias de VH y VL pueden expresarse como una proteína de cadena sencilla contigua, con las regiones de VL y VH unidas mediante el enlazador flexible (ver por ejemplo, Bird y colaboradores (1988) Science 242:423-426; Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty y colaboradores, Nature (1990) 348:552-554).

Para expresar los anticuerpos, o porciones del anticuerpo usadas en la invención, los ADN que codifica cadenas ligeras y pesadas parciales o de longitud completa, obtenidas como se describe anteriormente, se inserta en vectores de expresión tal que los genes están ligados operativamente a las secuencias control transcriptivas y de translación. En este contexto, el término "ligado operativamente" se desea para significar que un gen de anticuerpo está ligado en un vector tal que las secuencias control transcriptivas y de translación dentro del vector sirve para su función deseada de regular la transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y secuencias control de expresión se eligen para ser compatibles con la célula hospedadora de expresión usada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gene de cadena pesada de anticuerpo pueden insertarse en vector separado o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpos son insertados en el vector de expresión mediante métodos estándar (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento y vector del gen de anticuerpo, o y ligación de extremo romo si no hay sitios de restricción presentes). Antes de la inserción del D2E7 o secuencias de cadena ligera o pesada de relacionadas con D2E7, el vector de expresión puede ya llevar secuencias de región constantes de anticuerpo. Por ejemplo, un proceso para convertir el D2E7 o secuencias de VH y VL relacionadas con D2E7 a genes de anticuerpo de longitud completa es insertarlos en los vectores de expresión que codifican ya las regiones constantes de cadena pesada y constantes de cadena ligera, respectivamente, tal que el segmento de VH está ligado operativamente a los segmentos de CH dentro del vector y el segmento de VL está ligado operativamente al segmento de CL dentro del vector. Adicional o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de cadena de anticuerpo desde una célula hospedadora. El gen de cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector tal que el péptido de señal es ligado en entramado al amino terminal del gen de cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína de no inmunoglobulina).

Además de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula hospedadora. El término "secuencia reguladora" se desea para incluir promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Se apreciará por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras puede depender de tales factores como la elección de la célula hospedadora a transformarse, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión de la célula hospedadora mamífera incluyen elementos virales que dirige los altos niveles de la expresión de proteína en células mamíferas, tal como promotores y/o mejoradores derivados de citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés) (tal como el promotor/mejorador de CMV), Simian virus 40 (SV40, por sus siglas en inglés) (tal como el promotor/mejorador de SV40), adenovirus, (por ejemplo, promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP, por sus siglas en inglés)) y polioma. Para descripción adicional de elementos reguladores virales, y secuencias de los mismos, ver por ejemplo, Patente Norteamericana No. 5,168,062 de Stinski, Patente Norteamericana No. 4,510,245 de Bell y colaboradores y Patente Norteamericana No. 4,968,615 de Schaffner y colaboradores.

Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes usados en la invención pueden llevar secuencias adicionales, tal como secuencias que regulen la replicación del vector en células hospedadoras (por ejemplo, orígenes de la réplica) y genes de marcador seleccionables. El gen de marcador seleccionable facilita la selección de células hospedadoras en las cuales se ha introducido el vector (ver por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 4,399,216, 4,634,665 and 5,179,017, todas de Axel y colaboradores). Por ejemplo, típicamente el gene de marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tal como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedadora en la cual se ha introducido el vector. Los genes de marcador seleccionares preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR, por sus siglas en inglés) (para uso en células hospedadoras dhfr" con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para la selección G418).

Para la expresión de las cadenas ligeras y pesadas, los vectores de expresión que codifica las cadenas pesadas y ligeras se transfectan en una célula hospedadora mediante técnicas estándar. Las varias formas del término "transfección" se desean para comprender una gran variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación, precipitación de calcio-fosfato, transfección de DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en células hospedadoras procarióticas o eucarióticas, expresión de anticuerpos en células eucarióticas, y más preferiblemente células hospedadoras mamíferas, es más preferida debido a que tales células eucarióticas, y en particular células mamíferas, son más probables que las células procarióticas se junten y secreten un anticuerpo correctamente plegado e inmunológicamente activo. La expresión procariótica de genes de anticuerpo se ha reportado ser inefectiva para la producción de altos rendimientos del anticuerpo activo (Boss, M.A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

Las células hospedadoras mamíferas preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células dhfr-CHO, descritas en Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, utilizado con un marcador seleccionable de DHFR, por ejemplo, como se describe en R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. Cuando los vectores de expresión recombinante codifican genes de anticuerpo se introducen en células hospedadoras mamíferas, los anticuerpos son producidos cultivando las células hospedadoras por un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se hacen crecen las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteína estándar.

Las células hospedadoras pueden también utilizarse para producir porciones de anticuerpos intactos, tal como fragmentos Fab o moléculas scFv. Se entiende que las variaciones en el método anterior están dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, puede ser deseable I transfectar una célula hospedadora con ADN que codifica la cadena ligera o la cadena pesada (pero no ambas) de un anticuerpo de esta invención. La tecnología de ADN recombinante puede también utilizarse para eliminar algo o todo el ADN que codifica cualquiera o ambas de las cadenas ligeras y pesadas que no son necesarias para unir al hTNFa. Las moléculas expresadas de tales moléculas de ADN truncadas también están comprendidas por los anticuerpos de la invención. Además, los anticuerpos bifuncionales pueden producirse en los cuales una cadena ligera y una pesada es un anticuerpo de la invención y la otra cadena pesada y ligera es específica para un antigeno con excepción de hTNFa reticulando un anticuerpo de la invención a un segundo anticuerpo mediante métodos de reticulación química estándar.

En un sistema preferido para la expresión recombinante de un anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de la invención, un vector de expresión recombinante que codifica la cadena pesada de anticuerpo y la cadena ligera de anticuerpo es introducido en células dhfr-CHO mediante transfección mediada con fosfato-calcio. Dentro del vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera de anticuerpo están cada uno ligados operativamente a elementos reguladores del mejorador de CM V/promotor de AdMLP para conducir altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también lleva un gen de DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector utilizando selección/amplificación de metotrexato. Las células hospedadoras transformantes seleccionadas son cultivadas para permitir la expresión de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo y el anticuerpo intacto se recupera del medio de cultivo. Las técnicas de biología molecular estándar se utilizan para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar células hospedadoras, cribar transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo.

En vista de lo anterior, las composiciones del ácido nucleico, vector y célula hospedadora que pueden utilizarse para la expresión recombinante de los anticuerpos y porciones de anticuerpo usadas en la invención incluye ácidos nucleicos, y vectores que comprenden los ácidos nucleicos, comprenden el adalimumab del anticuerpo de TNFa humano (D2E7, por sus siglas en inglés). La secuencia de nucleótido que codifica la región variable de cadena ligera D2E7 se muestra en SEC ID NO: 36. El dominio CDR1 de la LCVR comprende los nucleótidos 70-102, el dominio CDR2 comprende los nucleótidos 148-168 y el dominio CDR3 comprende los nucleótidos 265-291. La secuencia de nucleótido que codifica la región variable de cadena pesada D2E7 se muestra en la SEC ID NO: 37. El dominio CDR1 de la HCVR comprende los nucleótidos 91-105, el dominio CDR2 comprende los nucleótidos 148-198 y el dominio CDR3 comprende los nucleótidos 295-330. Será apreciado por un experto en la técnica que las secuencias de nucleótido que codifican los anticuerpos relacionado con D2E7, o porciones de los mismos (por ejemplo, un dominio CDR, tal como un dominio CDR3), pueden derivarse de las secuencias de nucleótido que codifican la LCVR y HCVR de D2E7 utilizando el código genético y técnicas de biología molecular estándar.

Los anticuerpos humanos recombinantes de la invención además de D2E7 o una porción de unión al antígeno de los mismos, o anticuerpos relacionados con D2E7 descritos en la presente pueden aislar cribando una biblioteca de anticuerpo combinatoria recombinante, preferiblemente una biblioteca de exhibición de fago scFv, preparada utilizando cADN de VL y VH humanos preparados a partir de mARN derivado de linfocitos humanos. Las metodologías para preparar y cribar tales bibliotecas se conocen en la técnica. Además de los kits comercialmente disponibles para generar bibliotecas de exhibición de fago (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catálogo no. 27-9400-01; y el Stratagene SurfZAP™ phage display kit, Catálogo no. 240612), ejemplos de métodos y reactivo particularmente favorables para el uso en la generación y cribado de bibliotecas de exhibición de anticuerpo pueden encontrarse en, por ejemplo, Ladner y colaboradores Patente Norteamericana No. 5,223,409; Kang y colaboradores Publicación PCT No. WO 92/18619; Dower y colaboradores Publicación PCT No. WO 91/17271; Winter y colaboradores Publicación PCT No. WO 92/20791; Markland y colaboradores Publicación PCT No. WO 92/15679; Breitling y colaboradores Publicación PCT No. WO 93/01288; McCafferty y colaboradores Publicación PCT No. WO 92/01047; Garrard y colaboradores Publicación PCT No. WO 92/09690; Fuchs y colaboradores (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay y colaboradores (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-65; Huse y colaboradores (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty y colaboradores, Nature (1990) 348:552-554; Griffiths y colaboradores (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins y colaboradores (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson y colaboradores (1991) Nature 352:624-628; Gram y colaboradores (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard y colaboradores (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom y colaboradores (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas y colaboradores (1991) PNAS 88:7978-7982.

En una modalidad preferida, para aislar anticuerpos humanos con alta afinidad y una disociación baja para hTNFa, un anticuerpo anti-hTNFa murino que tiene alta afinidad y una disociación baja para hTNFa (por ejemplo, MAK 195, el hibridoma para el cual tiene número de depósito ECACC 87050801) primero se utiliza para seleccionar secuencias de cadena pesada y ligera humanas que tienen actividad de unión similar hacia hTNFa, utilizando el epítopo que imprime los métodos descritos en Hoogenboom y colaboradores, Publicación PCT No. WO 93/06213. Las bibliotecas de anticuerpo usadas en este método son preferiblemente bibliotecas de scFv preparadas y cribadas como se describe en McCafferty y colaboradores, Publicación PCT No. WO 92/01047, McCafferty y colaboradores, Nature (1990) 348:552-554; y Griffiths y colaboradores, (1993) EMBO J 12:725- 734. Las bibliotecas de anticuerpo de scFv se criban preferiblemente utilizando el TNFa humano recombinante como el antígeno.

Una vez que seleccionan los segmentos de VL y VH humanos iniciales, "mezclar y comparar" los experimentos, en los cuales diferentes pares de los segmentos de VL y VH seleccionados inicialmente se criban para la unión de hTNFa, se realizan para seleccionar combinaciones del par de VL/VH preferidas. Adicionalmente, para mejora adicional la afinidad y/o constante de disociación para la unión de hTNFa, los segmentos de VL y VH de los pares de VL/VH preferidos pueden mutarse aleatoriamente, preferiblemente dentro de la región CDR3 de VH y/o VL, en un proceso análogo al proceso de mutación somático in vivo responsable de la maduración de afinidad de anticuerpos durante una inmunorespuesta natural. Esta maduración de afinidad in vitro puede lograrse amplificando las regiones de VH y VL utilizando las cebadores de PCR complementarios al CDR3 de VH o CDR3 de VL, respectivamente, cuyos cebadores se han "adicionado" con una mezcla aleatoria de las cuatro bases de nucleótido en ciertas posiciones tal que los productos de PCR resultantes codifican los segmentos de VH y VL en los cuales las mutaciones aleatoria se han introducido en las regiones de CDR3 de VH y/o VL. Estos segmentos de VH y VL mutados aleatoriamente pueden cribarse nuevamente para unir al hTNFa y pueden seleccionarse secuencias que exhiben alta afinidad y disociación baja para la unión de hTNFa.

El siguiente cribado y aislamiento de un anticuerpo anti-hTNFa de la invención de una biblioteca de exhibición de inmunoglobulina recombinante, el ácido nucleico que codifica el anticuerpo seleccionado se puede recuperar del conjunto de exhibición (por ejemplo, del genoma del fágo) y subclonarse en otros vectores de expresión por técnicas estándar de ADN recombinante. Si se desea, el ácido nucleico se puede manipular adicionalmente para crear otras formas de anticuerpo de la invención (por ejemplo, ligadas al ácido nucleico que codifica los dominios adicionales de inmunoglobulina, tal como las regiones constantes adicionales). Para expresar un anticuerpo humano recombinante aislado con el cribado de una biblioteca combinatoria, el ADN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en las células hospedadoras mamíferas, según lo descrito en detalle adicional previamente.

Los métodos para aislar los anticuerpos neutralizantes humanos con alta afinidad y una constante de disociación baja para hTNFa, se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 6,090,382, 6,258,562, y 6,509,015., que se incorporan por referencia en la presente.

Los anticuerpos, porciones de anticuerpo, y otros inhibidores de TNFa para el uso en los métodos de la invención, se pueden incorporar en las composiciones farmacéuticas convenientes para la administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo, una porción de anticuerpo, u otro inhibidor de TNFa, y un portador farmacéuticamente aceptable. Según lo usado en la presente, el "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antihongos, isotópicos y agentes de retraso de absorción, y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de portadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, es preferible incluir los agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tal como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio, en la composición. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender adicionalmente cantidades menores de sustancias auxiliares tal como agentes humectantes o emulsificantes, conservadores o amortiguadores, que mejoran la vida útil o eficacia del anticuerpo, porción de anticuerpo, u otro inhibidor de TNFa.

Las composiciones para el uso en los métodos y composiciones de la invención pueden estar en una variedad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, las formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tal como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo previsto de administración y del uso terapéutico. Las composiciones preferida típicas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tal como composiciones similares a aquellas usadas para la inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos u otros inhibidores de TNFa. El modo preferido de administración es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En una modalidad preferida, el anticuerpo u otro inhibidor de TNFa se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad preferida, el anticuerpo u otro inhibidor de TNFa se administra mediante inyección intramuscular o subcutánea.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición se puede formular como solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura solicitada conveniente a alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del compuesto activo (es decir, el anticuerpo, la porción de anticuerpo, u otro inhibidor de TNFa) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por la esterilización mediante filtración. Generalmente, las dispersiones son preparadas mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básicos y los otros ingredientes requerido de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de las soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos para la preparación son el secado al vacío y el secado por congelamiento, que producen un polvo de ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución del mismo filtrada previamente de manera estéril. La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede causar mediante la inclusión en la composición de un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

En una modalidad, la invención incluye las composiciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor efectivo de TNFa y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el inhibidor efectivo de TNFa se puede utilizar para tratar la artritis reumatoide.

En una modalidad, el anticuerpo o porción de anticuerpo para el uso en los métodos de la invención se incorpora en una formulación farmacéutica según lo descrito en el documento PCT/IB03/04502 y la Solicitud de Patente Norteamericana No. 20040033228, incorporadas por referencia en la presente. Esta formulación incluye una concentración de 50 mg/ml del anticuerpo D2E7 (adalimumab), en donde una jeringa prellenada contiene 40 mg de anticuerpo para la inyección subcutánea. Las formulaciones alternativas que contienen altas concentraciones de adalimumab se describen en los documentos US20090291062 y US20100278822, cuyo contenido se incorpora por referencia en la presente.

Los anticuerpos, porciones de anticuerpo, y otros inhibidores de TNFa de la presente invención se pueden administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la ruta/modo preferido de administración es parenteral, por ejemplo, inyección subcutánea. En otra modalidad, la administración es a través de la inyección intravenosa o infusión.

Como será apreciado por los expertos en la técnica, la ruta y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo se puede preparar con un portador que proteja el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes, parches transdérmicos, y sistemas de suministro microencapsulados. Los polímeros biodegradables y biocompatibles se pueden utilizar, tal como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones se patentan o conocen generalmente por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, Robinson, ed., Dekker, Inc., New York, 1978.

En una modalidad, los anticuerpos e inhibidores de TNFa usados en la invención se suministran a un sujeto de manera subcutánea. En una modalidad, el sujeto se administra a sí mismo el inhibidor de TNFa, que incluye, pero sin limitarse a, anticuerpo de TNFa, o porción de unión al antígeno del mismo.

Los anticuerpos e inhibidores de TNFa usados en la invención se pueden también administrar en forma de formulaciones cristalinas de proteína que incluyen una combinación de cristales de proteína encapsulados dentro de un portador polimérico para las formar partículas recubiertas. Las partículas recubiertas de la formulación cristalina de proteína pueden tener una morfología esférica y ser microesferas de hasta 500 micrómetros de diámetro o pueden tener alguna otra morfología y estar en micropartículas. La concentración mejorada de cristales de proteína permite que el anticuerpo de la invención sea suministrado de manera subcutánea. En una modalidad, los anticuerpos de TNFa de la invención se suministran a través de un sistema de suministro de proteína, en donde uno o más de una formulación cristalina de proteína o la composición, se administran a un sujeto con un trastorno relacionado con TNFa. Las composiciones y métodos para preparar las formulaciones estabilizadas de los cristales de anticuerpo entero o cristales de fragmentos de anticuerpo también se describen en el documento WO 02/072636, que es incorporado por referencia en la presente. En una modalidad, una formulación que comprende los fragmentos de anticuerpo cristalizados descritos en el documento PCT/IB03/04502 y en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 20040033228, incorporados por referencia en la presente, se utiliza para tratar la artritis reumatoide mediante el uso de los métodos de tratamiento de la invención.

En ciertas modalidades, el anticuerpo, la porción de anticuerpo, u otro inhibidor de TNFa de la invención se pueden administrar de manera oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) se pueden también incluir en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en tabletas, o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, los compuestos se pueden incorporar con los excipientes y utilizar en forma de tabletas ingeribles, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención mediante una administración distinta a la administración parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o co-administrar el compuesto con, un material para prevenir su desactivación.

Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones. En ciertas modalidades, un anticuerpo o una porción de anticuerpo para el uso en los métodos de la invención se co-formula con y/o co-administra con uno o más agentes terapéuticos adicionales, que incluyen un inhibidor o un antagonista de la artritis reumatoide. Por ejemplo, un anticuerpo anti-hTNFa o una porción del anticuerpo de la invención se puede co-formular y/o co-administrar con uno o más anticuerpos adicionales que unen otros objetivos asociados con los trastornos relacionados con TNFa (por ejemplo, los anticuerpos que unen otras citosinas o que unen las moléculas de la superficie celular), una o más citosinas, receptor soluble de TNFa (ver por ejemplo, la Publicación PCT No. WO 94/06476) y/o uno o más agentes químicos que inhiben la producción o actividad de hTNFa (tal como derivados de ciclohexano-ilideno según lo descrito en la Publicación PCT No. WO 93/19751) o cualquier combinación de los mismos. Además, uno o más anticuerpos de la invención se pueden utilizar en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones más bajas de los agentes terapéuticos administrados, para evitar así los efectos secundarios, complicaciones o bajo niveles de respuesta posibles del paciente asociado a varias monoterapias.

Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectivo" de un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la invención. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo, porción de anticuerpo, u otro inhibidor de TNFa puede variar de acuerdo con los factores tal como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y de la capacidad del anticuerpo, porción de anticuerpo, u otro inhibidor de TNFa de producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo, porción de anticuerpo, u otro inhibidor de TNFa sea compensado por los efectos terapéutico beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado profiláctico deseado. Típicamente, puesto que una dosis profiláctica se utiliza en los sujetos antes de o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.

Kits de la invención La invención también proporciona los kits para determinar la capacidad de respuesta de un sujeto a un inhibidor de TNFa para el tratamiento de la artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), así como kits para tratar a un sujeto que tiene artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés). Estos kits incluyen el medio para determinar el número de copias (o presencia o ausencia) de un alelo HLA-DRB1 SE, IL-4R I50 y/o V50, y/o alelo FcyRIIb I232 y/o T232 y las instrucciones para el uso del kit.

Los kits de la invención pueden comprender opcionalmente los componentes adicionales útiles para realizar los métodos de la invención. A modo de ejemplo, los kits pueden comprender el medio para obtener una muestra biológica de un sujeto, una muestra de control, por ejemplo, una muestra de un sujeto, uno o más compartimientos de muestrea, un material de instrucción que describa el funcionamiento de un método de la invención y de los controles/estándares específicos.

Las instrucciones pueden, por ejemplo, instrucciones impresas para realizar el ensayo para evaluar los resultados.

El medio para aislar una muestra biológica de un sujeto pueden comprender uno o más reactivos que se puedan utilizar para obtener un fluido o tejido de un sujeto. El medio para obtener una muestra biológica de un sujeto pueden también comprender el medio para aislar las células mononucleares de la sangre periférica de una muestra de sangre, por ejemplo, mediante la selección positiva de los monocitos o mediante la selección negativa en la cual se elimina el resto de los tipos de célula distintos a los monocitos.

Los kits de la invención pueden además contener un inhibidor de TNFa.

Preferiblemente, el kit se diseña para el uso con un sujeto humano.

Los kits de la invención se pueden utilizar para determinar si un sujeto con RA será sensible con eficacia a un inhibidor de TNFa. Estos kits pueden comprender un medio portador que está dividido en compartimientos para recibir en confinamiento cercano uno o más medios de contención tal como frascos, tubos, y similares, cada uno de los medios de contención comprenden uno de los elementos separados que se utilizarán en el método. Por ejemplo, uno de los medios de contención puede comprender una sonda que es o pueda ser etiquetada de manera detectable. Tal sonda puede ser un anticuerpo o polinucleótido específico para una proteína o un biomarcador (SE HLA-DRB1, IL-4R I50V SNP, y/o FcYRIIb I232 SNP), gen o mensajero, respectivamente. Donde el kit utiliza la hibridación de ácido nucleico para detectar el ácido nucleico objetivo, el kit puede también tener recipientes que contienen los nucleótidos para la amplificación de la secuencia de ácido nucleico objetivo y/o un recipiente que comprende un medio reportero, tal como una proteína de unión a biotina, por ejemplo, avidina o estreptavidina, unida a una molécula reportera, tal como una etiqueta enzimática, fluorescente, o radioisótopo.

Tal kit comprenderá típicamente el recipiente descrito anteriormente y uno o más de otros recipientes que comprenden los materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluye amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos del empaque con las instrucciones para el uso. Una etiqueta puede estar presente en el recipiente para indicar que la composición se utiliza para una aplicación específica, y puede también indicar las direcciones para el uso in vivo o in vitro, tal como aquellos descritas anteriormente.

Los kits de la invención tienen un número de modalidades. Una modalidad típica es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta en el recipiente, y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición incluye uno o más polinucleótidos que hibridizan un complemento de IL-4R I50V SNP, y/o FcyRI Ib 1232 SNP y/o HLA-DRB1 SE bajo condiciones astringentes, y la etiqueta en el recipiente indica que la composición se puede utilizar para evaluar la presencia de IL-4R I50V SNP, y/o FcyRIIb I232 SNP, y/o HLA-DRB1 SE en una muestra, y en donde el kit incluye las instrucciones para utilizar los polinucleótidos para evaluar la presencia SNP y/o SE de ARN o ADN en un tipo particular de muestra.

Otro aspecto es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta en el recipiente, y una composición contenida dentro del recipiente, en donde la composición incluye un anticuerpo primario que une a un biomarcador de proteína o autoanticuerpo, y la etiqueta en el recipiente indica que la composición se puede utilizar para evaluar la presencia de tales proteínas o anticuerpos en una muestra, y en donde el kit incluye las instrucciones para utilizar el anticuerpo para evaluar la presencia de proteínas del biomarcador en un tipo particular de muestra. El kit puede comprender adicionalmente un conjunto de instrucciones y materiales para preparar una muestra y aplicar el anticuerpo a la muestra. El kit puede incluir un anticuerpo primario y secundario, en donde el anticuerpo secundario se conjuga con una etiqueta, por ejemplo, una etiqueta enzimática.

Otros componentes opcionales del kit incluyen uno o más amortiguadores (por ejemplo, amortiguador de bloque, amortiguador de lavado, amortiguador de sustrato, etc.), otros reactivo tal como sustrato (por ejemplo, cromógeno) que se altera químicamente por una etiqueta enzimática, solución de recuperación de epítopo, muestras de control (controles positivos y/o negativos), portaobjetos de control, etc. Los kits pueden también incluir las instrucciones para interpretar los resultados obtenidos utilizando el kit.

En otras modalidades específicas, para los kits basados en anticuerpos, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, unido a un soporte sólido) que une a una proteína de biomarcador; y, opcionalmente, (2) un segundo, diferente anticuerpo que une a la proteína o al primer anticuerpo y se conjuga con una etiqueta detectable.

Para los kits basados en oligonucleótidos, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un oligonucleótido, por ejemplo, un oligonucleótido etiquetado de manera detectable, que hibridiza una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de biomarcador o (2) un par de cebadores útiles para amplificar una molécula de ácido nucleico de biomarcador. El kit puede también comprender, por ejemplo, un amortiguador, conservador, o un agente estabilizador de proteínas. El kit puede comprender adicionalmente los componentes necesarios para detectar la etiqueta detectable (por ejemplo, una enzima o un sustrato). El kit puede también contener una muestra de control o una serie de muestras de control que se pueden probar y comparar con la muestra de prueba. Cada componente del kit puede incluirse dentro de un recipiente individual, y todos los varios recipientes pueden ser incluidos dentro de un solo paquete, junto con las instrucciones para interpretar los resultados de los ensayo realizados utilizando el kit.

También se proporcionan mediante la invención los artículos de la fabricación que contienen los materiales útiles para el tratamiento de la RA. El artículo fabricado comprende un recipiente y una etiqueta o un inserto de empaque en o asociado con el recipiente. En este aspecto, el inserto de empaque está en o asociado con el recipiente. Los recipientes convenientes incluyen, por ejemplo, botellas, frascos, jeringas, etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales tal como vidrio o plástico. El recipiente aloja o contiene un antagonista que es efectivo para tratar la RA y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es el antagonista de células B. La etiqueta o inserto de empaque indica que la composición está utilizada para tratar la RA en un sujeto elegible para el tratamiento con la pauta específica con respecto a las cantidades e intervalos de dosificación del antagonista y de cualquier otro medicamento que sea proporcionado.

Los kits y artículos de fabricación en la presente también incluyen la información, por ejemplo en forma de inserto o etiqueta de empaque, que indica que la composición se utiliza para tratar la RA, donde los genotipos que muestran el polimorfismo y/o SE en la presente se detectan en una muestra genética del paciente con la enfermedad. El inserto o etiqueta puede tomar cualquier forma, tal como papel o medios electrónicos, por ejemplo, un medio grabado magnéticamente (por ejemplo, disco flexible) o un CD-ROM. La etiqueta o inserto puede también incluir otra información referente a las composiciones farmacéuticas y a las formas de dosificación en el kit o artículo fabricado.

Generalmente, tal información ayuda a los pacientes y médicos a utilizar efectivamente y con seguridad las composiciones farmacéuticas y formas de dosificación incluidas. Por ejemplo, la siguiente información con respecto al antagonista se puede suministrar en el inserto: farmacocinética, farmacodinámica, estudios clínicos, parámetros de eficacia, indicaciones y uso, contraindicaciones, advertencias, precauciones, reacciones adversas, sobredosis, dosificación apropiada y administración apropiadas, cómo suministrarse, condiciones de almacenamiento, referencias, e información de patente.

En una modalidad específica de la invención, se proporciona un artículo de fabricación junto con el empaque, con una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de TNFa y un vehículo farmacéuticamente aceptable y una etiqueta que indica que el inhibidor o composición farmacéutica están indicados para el tratamiento de pacientes con RA de los cuales se ha obtenido una muestra genética que muestra la presencia de IL-4R I50V SNP, y/o FcyRIIb 1232 SNP y/o alelo HLA-DRB1 SE. Esto puede se puede demostrar mediante la evaluación de la expresión genética como un biomarcador de un IL-4R I50V SNP, y/o FcyRIIb I232 SNP y/o alelo HLA-DRB1 SE.

Además, la invención proporciona un método para fabricar un inhibidor de TNFa o una composición farmacéutica del mismo que comprende combinar en un paquete el inhibidor de TNFa o una composición farmacéutica y una etiqueta que indique que el inhibidor TNFa inhibidor o la composición farmacéutica está indicada para el tratamiento de pacientes con RA a partir de la cual se obtiene una muestra genética que muestra la presencia de un HLA-DRB1 SE, un FcyRIIb I232 SNP, y/o un IL-4R I50V SNP. Por otra parte, los alelos específicos asociados a cada SNP correlacionada con una respuesta pueden ser recitados. La etiqueta puede posteriormente afirmar que esto se puede demostrar mediante la evaluación de la expresión genética como un biomarcador de un IL-4R I50V SNP, y/o FcyRIIb I232 SNP, y/o HLA-DRB1 SE. En particular, cada uno de los marcadores genéticos identificados en la invención puede ser descrito individualmente o en combinación unos con otros.

El contenido de todas las referencias, las patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud se incorporan aquí por referencia.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante el siguiente ejemplo, que no debe interpretarse como limitante.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Respuesta de la artritis reumatoide temprana al tratamiento con adalimumab más metotrexato contra metotrexato solo: Respuesta clínica predicha por análisis de marcadores genéticos.

El siguiente estudio y los ejemplos 2-4, examinaron la contribución de factores genéticos en el tratamiento de la artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) con un inhibidor de TNFa, el adalimumab, más metotrexato en comparación con metotrexato solo.

El objetivo del estudio fue analizar de forma prospectiva la asociación de 3 factores de riesgo genético (epítope compartido HLA-DRB1 (SE), FcyRIIb, e IL-4R) para AR grave con la actividad clínica de la enfermedad después de 26 semanas de terapia de combinación con adalimumab (ADA) y metotrexato (MTX) o monoterapia con MTX en un subestudio del ensayo OPTIMA (un estudio multicéntrico, aleatorio, de doble período, doble ciego para determinar el protocolo óptimo para el inicio del tratamiento con terapia de combinación de metotrexato y adalimumab en pacientes con artritis reumatoide temprana).

OPTIMA es un curso de 78 semanas de estudio con periodos de 26 y 52 semanas. Los pacientes elegibles tenían RA <1 año (1987-clasificación ACR revisada), con Rango de Actividad de Enfermedad 28 (DAS28)>3.2, =6 articulaciones inflamadas (TJC68 =6), y =8 articulaciones sensibles (SSJC66 = 8). Los pacientes tenían elevación de la velocidad de sedimentación globular (ESR) =28 mm/h, o la proteína C reactiva (PCR) =1,5 mg/dl y =1 de los siguientes: erosión >1, factor reumatoide positivo (RF + ), o anticuerpo de péptido anti-cíclico citrulinado positivo (anti-CCP + ). Los criterios de exclusión incluyeron una exposición previa a terapias sistémicas anti-TNF, tratamiento con MTX o modificadores de la enfermedad >2, los fármacos antirreumáticos (DMARD), otras enfermedades aguda con esteroides o quirúrgico dentro de 4 semanas o 2meses, respectivamente.

Los pacientes fueron de genotipo cadena de reacción de polimerasa de alelo específico (PCR) y secuenciación directa, según sea necesario para determinar la presencia de la HLA-DRB1 SE (homo o héterocigosis, el polimorfismo de nucleótido único (SNP) FcyRIIb 1232T (a través de alelo específico PCR utilizando el Assay-on-Demand (Applied Biosystems)), y la IL-4R I5QV SNP (a través de alelo específico PCR utilizando Assay-on-Demand (Applied Biosystems)).

Como se muestra en la Figura 1, pacientes sin tratamiento previo con TX fueron inicialmente seleccionados aleatoriamente, 1:1 para recibir MTX oral (aumentó a 20 mg) por semana, además de adalimumab (ADA) 40 mg cada dos semanas o placebo (PBO) mediante inyección subcutánea, para las primeras 26 semanas de tratamiento (período 1). En el período 2, los que respondían a la terapia de combinación, por ejemplo, que tenían actividad de la enfermedad (LDA) DAS28 baja, los criterios (DAS28 <3,2), fueron seleccionados de nuevo de manera aleatoria 1:1 para permanecer en ADA + MTX o "renunciar" a PBO + MTX en las semanas 26-78. En el primer grupo de monoterapia con PBO + MTX, los sujetos que alcanzaron DAS28 LDA después del período de 1 permanecieron ciegos a PBO + MTX para el período 2. Cualquier sujeto que no cumplió con los criterios de DAS28 LDA en las semanas 22 y/o 26 recibieron ADA + MTX abierto después de la semana 26. Los datos genéticos se asociaron con la Semana de la respuesta clínica-26.

Para la evaluación clínica, el porcentaje de sujetos que han logrado una mejora del 20%, 50% y 70% respecto al valor basal las puntuaciones del ACR se determinó después de la semana 26 utilizando un método de imputación no respondedor. Las puntuaciones del DAS28(CPR)1 se evaluaron en la semana 26. La proporción de sujetos que lograron LDA (DAS28<3.2) y los criterios de remisión (DAS28<2,6) se determinaron usando un método de imputación no respondedor.

Para el análisis estadístico, la distribución de los alelos entre grupos de tratamiento se evaluó mediante la prueba de chi cuadrada o prueba exacta de Fisher en los casos en que los datos eran escasos. La prueba de chi cuadrada se utilizó para comparar la proporción de sujetos que lograron ACR20/50/70 y DAS28 LDA (<3,2) o remisión (<2,6) en y entre los grupos de tratamiento.

La población de estudio incluyó 1032 pacientes asignados aleatoriamente a PBO + MTX (N = 517) o ADA+ TX (N = 515) durante las primeras 26 semanas. Durante el Período 1, 106 sujetos (10%) abandonaron prematuramente (PBO + MTX: N = 57, el 11%, y ADA + MTX: N = 49, 10%). De los 1032 pacientes enrolados, 894 sujetos (87%) presentaron los datos genéticos disponibles para este subanálisis (PBO + MTX: N=451, el 87%, y ADA+MTX: N = 443, 86%).

Como se ve a continuación en la Tabla 1, los 3 factores genéticos estaban en equilibrio Hardy Weinberg en ambos grupos de tratamiento. Los grupos con MTX y ADA+MTX no presentaron diferencias significativas en los porcentajes de pacientes portadores de la HLA-DRB1 SE (63% contra 67%, respectivamente) o en los porcentajes de pacientes portadores de 0, 1 o 2 copias de SE (MTX: 37%, 48%, 15%; ADA+MTX: 33%, 49%, 19%). De la misma manera, los porcentajes de pacientes con alelos IL-4R I50V no difirieron significativamente entre los grupos con MTX y ADA + MTX (homocigosis de alelo A: 29% contra 33%; homocigosis del alelo G: 20% contra 20%; héterocigosis: 52% contra 47%). Por el contrario, y por casualidad, la distribución del alelo FcYRIIb I232T difirió significativamente entre los grupos, con exclusión de este alelo de mayor análisis. El análisis del alelo FcyRIIb I232T se proporciona en el Ejemplo 4.

Tabla 1. Distribución de Alelo " valores P con base en la prueba de chi cuadrada Las demografías base y las características de la enfermedad de sujetos estratificados por HLA-DRB1 SE y alelos IL-4R se muestran en las Tablas 3 y 3, respectivamente.

Tabla 2. Demografías base y Características de Enfermedad por Número de Copias HLA-DRB1 SE.

Tabla 3. Demografías base y Características Enfermedad por Alelos IL-4R AA AG GG N = 275 N = 443 N = 176 Género, n/N (%) 201/275 (73%) 320/443 (72%) 133/176 mujer (76%) Raza, n/N (%) 250/275 (91%) 395/443 (89%) 156/176 blanca (89%) Edad, años 50.6 (13.2) 50.8 (14.0) promedio (SD) Fumador, n/N (%) 139/275 (51%) 227/443 (51%) 92/176 (52%) RF+, n/N (%) 241/271 (89%) 385/441 (87%) 147/173 (85%) RF >50 IU, n/N (%) 177/271 (65%) 297/441 (67%) 111/173 (64%) anti-CCP+, n/N (%) 226/271 (83%) 368/441 (83%) 142/174 (82%) RF+ y anti-CCP+, 214/268 (80%) 348/440 (79%) 134/172 n/N (%) (78%) CRP, (SD) mg/dl 2.82 (3.03) 3.00 (3.34) 2.80 (3.09) promedio DAS28, (SD) 6.0 (0.99)a 6.1 (0.94)b 6.0(1.00)c promedio HAQ, (SD) promedio 1.6 (0.65)d 1.6 (0.68)e 1.6 (0.65) aN = 267; N = 436; CN = 175; dN = 274; eN = 442.

En general, los sujetos que recibieron la terapia de combinación ADA+MTX respondieron significativamente mejor al tratamiento de 26 semanas, en comparación con los sujetos del grupo de tratamiento PBO + MTX.

Como se muestra a continuación en la Figura 2 y las Tablas 4a-4c, el número de copias de HLA-DRB1 SE se asoció con la respuesta clínica. Sin embargo, mientras que el aumento de número de copias se asocia con disminución de los logros de las mejoras a escala de calificación del Colegio Americano de Reumatología (ACR20, ACR50, y ACR70) y el criterio de remisión de la Calificación de Actividad de la Enfermedad 28 para el grupo MTX, el aumento de número de copias fue significativo y directamente correlacionado con una mejor respuesta clínica para el grupo con ADA + MTX (por ejemplo, ACR50 para 0, 1, y 2 copias: 40%, 33% y 29% para el grupo con MTX contra 42%, 53% y 65% para ADA+MTX). Estos datos muestran que en los sujetos con al menos una copia de SE, la terapia de combinación con ADA+MTX se asoció significativamente con las tasas de mejora ACR20/50/70 de respuesta en comparación con la monoterapia con MTX y que los incrementos acumulados en las respuestas ACR a ADA+MTX se observaron en los sujetos con 1 o 2 copias del alelo SE.

Tabla 4a. Tasas de Respuesta a ACR20 en la semana 26, por Presencia de HPLA-DRB1 SE # El valor P comparado en las respuestas de grupo de tratamiento: valor P para diferencia entre los grupos de tratamiento; valores P con base en la prueba de chi cuadrada.

Tabla 4b. Tasas de Respuesta de ACR 50 en la semana 6, por Presencia de HLA-DRB1 SE.

* El valor P comparado en las respuestas de grupo de tratamiento: valor P para diferencia entre los grupos de tratamiento; valores P con base en la prueba de chi cuadrada.

Tabla 4c. Tasas de Respuesta de ACR70 en la semana 26, r Presencia de HLA-DRB1 SE * El valor P comparado en las respuestas de grupo de tratamiento: valor P para diferencia entre los grupos de tratamiento; valores P con base en la prueba de chi cuadrada.

Por otra parte, como se muestra en la Figura 3 y la Tabla 5 a continuación, en sujetos con al menos una copia de SE, la terapia de combinación con ADA + MTX se asoció significativamente con las respuestas mejoradas de DAS28 en comparación con la monoterapia con MTX. Los incrementos acumulados en la proporción de sujetos con ADA + MTX que cumplan con los criterios de DAS28 LDA se observaron en pacientes con 1 o 2 copias del alelo SE. La presencia de SE no se asoció con las respuestas DAS28 a la monoterapia con MTX.

Tabla 5. Proporción de Sujetos que cumplen con los criterios DAS28 para LDA y Remisión en la semana 26, por Presencia de HLA-DRB1 SE.

LDA Remisión n/N (%) DAS28 <3.2 DAS28 <2.6 Sujetos 0 copias 1 copia 2 Valor 0 1 copia 2 Valor P copias n P* copias copias ADA+MT 54/145 100/216 48/82 37/145 74/216 31/82 0.008 0.10 X (37%) (46%) (59%) (26%) (34%) (38%) PBO+MT 49/167 50/215 16/69 28/167 35/215 11/69 0.36 0.99 X (30%) (23%) (24%) (17%) (16%) (16%) Valor P' 0.16 <0.001 <0.001 0.06 <0.001 0.003 * El valor P comparado en las respuestas de grupo de tratamiento: valor P para diferencia entre los grupos de tratamiento; valores P con base en la prueba de chi cuadrada.

Como se ve a continuación en la Figura 4 y las Tablas 6a 6c, una respuesta clínica significativamente mejorada se observó para los pacientes con ADA+MTX que eran homocigotos o heterocigotos para los alelos de IL-4R I50 pero no en pacientes con dos alelos IL- 4R V50. Los sujetos que llevan por lo menos 1 alelo IL-4R I50 (AA o AG) han demostrado mejorar significativamente las respuestas ACR a la terapia de combinación con ADA + MTX en relación a la monoterapia con MTX. Los sujetos tratados con ADA + MTX que eran homocigotos (AA) o heterocigoticos (AG) para el alelo IL-4R 150 tienen una respuesta ACR20 significativamente mayor en comparación con los sujetos con ADA+MTX con el alelo IL-4R V50V (GG). Los alelos IL-4R no se asociaron con una respuesta diferencial a PBO + MTX según la evaluación las tasas de respuesta de ACR20/50/70.

Tabla 6a. Tasas de Respuesta de ACR20 en la semana 26, por Alelos IL-4R Tabla 6b. Tasas de Respuesta de ACR50 en la semana 26, por Alelos IL-4R Tabla 6c. Tasas de Respuesta de ACR70 en la semana 26, por Alelos IL-4R Como se ve a continuación en la Figura 5 y la Tabla 7, para las respuestas de ACR, los sujetos que lleven al menos 1 de los alelos IL-4R I50 (AA o AG) demostraron respuestas de mejoras significativas de DAS28 a la terapia de combinación con ADA + MTX con respecto a la monoterapia con MTX. Una mayor proporción de los sujetos tratados con ADA+MTX que eran homocigotos (AA) o heterocigóticos (AG) para el alelo I50 lograron un DAS28 LDA, comparado con los sujetos con ADA + MTX con el alelo IL-4R V50V (GG). Por el contrario, la presencia del alelo I50 se asoció con una tendencia hacia una disminución de la proporción de los sujetos tratados con la monoterapia con MTX que cumplieron con DAS28 LDA y los criterios de remisión.

Tabla 7. Proporción de sujetos que cumplieron con los Criterios de DAS28 LDA y Remisión en la semana 26, por alelos IL-4R.

LDA Remisión DAS 28 <3.2 DAS28 <2.6 Sujetos AA AG GG Valor P* AA AG GG Valor ?· 68/145 99/210 35/88 46/145 68/210 28/88 ADA+MTX (47%) (47%) (40%) 0.47 (32%) (32%) (32%) 0.99 31/130 58/233 26/88 18/130 37/233 19/88 PBO+MTX (24%) (25%) (30%) 0.61 (14%) (16%) (22%) 0.30 Valor P* <0.001 <0.001 0.15 <0.001 <0.001 0.13 El valor P comparado en las respuestas de grupo de tratamiento: valor P para diferencia entre los grupos de tratamiento; valores P con base en la prueba de chi cuadrada.

En conclusión, el epítope compartido HLA-DRB1 y polimorfismo IL-4R 150V fueron independientemente relacionados con diferentes respuestas de tratamiento en pacientes con AR temprana. La presencia del epítope compartido HLA-DRB1 o el alelo IL-4R I50 incrementaron las respuestas clínicas en pacientes tratados con adalimumab más metotrexato. El epítope compartido HLA-DRB1 y el alelo IL-4R I50 fueron independientemente relacionados con metotrexato comparado con la monoterapia con monotrexato. Puesto que resultados del estudio muestran que HLA-DRB1 SE e IL-4R I50V contribuyeron a la respuesta clínica a la terapia con ADA+MTX. Por lo tanto el análisis marcador puede facilitar la medicina personalizada en pacientes con AR temprana, y se puede utilizar para predecir si el sujeto será o no responsable del tratamiento de la AR con un inhibidor de TNFa.

Ejemplo 2. Impacto de las Interacciones genéticas en la respuesta a Adalimumab más Metotrexato en comparación con Metotrexato solo: Resultados de seis meses del Ensayo OPTIMA La identificación de factores genéticos que afectan la severidad de la enfermedad artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) y la respuesta al tratamiento puede guiar alcances terapéuticos personalizados. Para explorar el impacto de los factores genéticos candidatos en los cambios en la actividad de la enfermedad, el siguiente estudio examinó la contribución de factores genéticos al tratamiento de la artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) con adalimumab más metotrexato en comparación con metotrexato solo.

OPTIMA es un curso de 78 semanas de estudio con periodos de 26 y 52 semanas. Los detalles del diseño de estudio y el criterio de elección/exclusión de los pacientes se describen en el Ejemplo 1 anterior. Brevemente, los pacientes elegibles tenían RA <1 año (DAS28)>3.2, =6 SJC, TJC=8. (ESR)=28 mm/h, o CRP=1,5 mg/dl y =1 de los siguientes: erosión >1, factor reumatoide positivo (RF + ), o anti-CCP+ (ver previamente). Los pacientes sin tratamiento con MTX fueron seleccionados aleatoriamente con ADA 40 mg cada semana +MTX o placebo (PBO) + MTX (ver previamente). Los pacientes fueron de genotipo cadena de reacción de polimerasa de alelo específico (PCR) y secuenciación directa, según sea necesario para determinar la presencia del epítope compartido HLA-DRB1 (SE), el polimorfismo de nucleótido sencillo FcyRIIb 1232T (SNP) e IL-4R I50V SNP. Las respuestas clínicas a las 26 semanas de tratamiento fueron examinadas por antecedentes genéticos para cada alelo independientemente, y en las combinaciones de alelo para SE e IL-4R.

Los sujetos en los grupos de tratamiento mostraron una distribución similar de 0, 1 o 2 copias de la molécula HLA-DRB1 SE (PBO + MTX: 37%, 48%, 15%; ADA+MTX: 33%, 49%, 19%, respectivamente, P=0.28, ver Tabla 1 anterior). Asimismo, los alelos IU-4R, AA, AG, y GG, se distribuyeron de manera similar entre los grupos de tratamiento (PBO + MTX: 29%, 52%, 20%; ADA + MTX: 33%, 47%, 20%, respectivamente, P=0.38, ver Tabla 1 anterior). Los alelos FcYRIIb, sin embargo, fueron apropiados entre grupos de tratamiento (véase la Tabla 1 anterior), y ningún análisis posterior se llevó a cabo en este SNP en este ejemplo pero se proporcionan en el Ejemplo 4.

La presencia de SE no afecta la respuesta del tratamiento a MTX solo (por ejemplo ACR50 de 40%, 33% y 29% para 0, 1 o 2 copias, P = 0.23, ver Tabla 4 anterior).

Por el contrario, las tasas de respuesta al tratamiento se mejoraron proporcionalmente con el aumento de las copias de SE en los sujetos que recibieron ADA + MTX (ACR59 de 42%, 53% y 65% para 0, 1, 2 SE, P = 0.004, ver Tabla 4 anterior).

Por lo tanto, la presencia de una copia de SE otorga un aumento del 20% en ACR50 de ADA + MTX para sujetos relativos al grupo con PBO + MTX (p<0.001), y 2 copias de SE aumentaron ACR50 en ADA + MTX en un 36% más en comparación con PBO + MTX (p <0.001). Ver la Tabla 4 anterior.

De la misma manera, las respuestas clínicas a MTX no se vieron afectados por los alelos IL-4R, mientras que los resultados del tratamiento con ADA+MTX fueron mayores en sujetos con AA o AG alelos de IL-4R. Ver Tabla 6 anterior.

El examen de la respuesta al tratamiento para combinaciones de SE y alelo IL-4R en el grupo con PBO + MTX no muestra ninguna alteración en las respuestas por el genotipo, apoyando los resultados del análisis de los alelos individuales. Sin embargo, en ausencia de SE, el genotipo IL-4R afecta la respuesta al tratamiento ADA+MTX, mientras que la presencia de SE enmascara los efectos de los alelos IL-4R (Ver Tabla 8).

Tabla 8. Interacción genética entre HLA-DRB1 SE e IL-4R Los resultados presentados en este documento muestran que la respuesta clínica con adalimumab más metotrexato son independientemente afectados tanto por el epítope compartido HLA-DRB1 y los alelos IL-4R, mientras que no hubo impacto de genotipo en la respuesta a la monoterapia con metotrexato. Además, existe una interacción entre el epítope HLA-DRB1 compartida y alelos IL-4R en la respuesta al tratamiento con adalimumab más metotrexato.

Ejemplo 3: Impacto de las interacciones genéticas en respuesta a adalimumab más metotrexato en comparación con metotrexato solo: Resultados de seis meses del ensayo OPTIMA Antecedentes La identificación de factores genéticos que influyen en la gravedad de la enfermedad artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) y respuesta al tratamiento pueden guiar a los enfoques terapéuticos personalizados.

Mientras que los factores genéticos específicos han sido implicados en la susceptibilidad y la severidad de la artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), el efecto de los componentes genéticos en la respuesta a los tratamientos biológicos con AR no se ha explorado ampliamente.

Objetivo El objetivo de este estudio fue explorar el impacto de factores genéticos candidatos en los cambios de actividad de la enfermedad después del tratamiento con adalimumab (ADA) y metotrexato (MTX) o MTX sólo. Además, el impacto de los factores candidatos genéticos en los cambios en la actividad de la enfermedad en pacientes con AR temprana que siguen tratamiento pon adalimumab (ADA) y metotrexato (MTX) o MTX sólo también fue explorado.

Métodos Diseño del estudio (Figura 1) OPTIMA es un estudio multicéntrico de Fase 4, de 2 períodos, doble ciego, ensayo clínico aleatorio controlado con placebo para determinar el protocolo óptimo para el inicio del tratamiento con la terapia de combinación de Metotrexato y Adalimumab en pacientes con AR temprana.

Los principales criterios de inclusión para los pacientes elegibles fueron: 1 ) 18 años de edad 2) AR (criterio de clasificación 1987 ACR) <1 año del diagnosis 3) DAS28>3.2 4) TJC68=8 y SJC66=6 5) ESR=28 mm/h o CRP=1.5 mg/dL Los sujetos en este subestudio genético dieron un consentimiento informado voluntario de consentimiento para participar.

Los pacientes sin tratamiento previo con MTX fueron seleccionados aleatoriamente 1:1 para ADA (40 mg eow) + MTX (ajustado a 20 mg semanales a la semana 8) o placebo (PBO) + MTX durante las primeras 26 semanas.

A cualquier sujeto que no cumplió con LDA (DAS28 <3.2) en la semana 22 y/o 26 se le ofreció la opción de continuar el tratamiento abierto con ADA + MTX.

Los sujetos tratados inicialmente con ADA+MTX que respondieron y que alcanzaron LDA en las semanas 22 y 26 fueron seleccionado de nuevo de manera aleatoria para comparar la terapia combinada continua frente a la retirada con ADA hasta la semana 78. Los sujetos con tratamiento con PBO+MTX con LDA en las semanas 22 y 26 se mantuvieron ciegos en monoterapia con MTX.

OPTIMA es un curso de 78 semanas de estudio con periodos de 26 y 52 semanas. Los pacientes elegibles tenían RA <1 año (DAS28)>3.2, =6 SJC, TJC=8. (ESR)=28 mm/h, o CRP=1,5 mg/dl y =1 de los siguientes: erosión >1, factor reumatoide positivo (RF + ), o anti-CCP + . Los pacientes sin tratamiento con MTX fueron seleccionados aleatoriamente con ADA 40 mg cada semana o placebo (PBO) + MTX. Los pacientes fueron de genotipo cadena de reacción de polimerasa de alelo específico (PCR) y secuenciación directa, según sea necesario para determinar la presencia del epítope compartido HLA-DRB1 (SE), el polimorfismo de nucleótido sencillo FcyRIIb 1232T (SNP) e IL-4R I50V SNP. Las respuestas clínicas a las 26 semanas de tratamiento fueron examinadas por antecedentes genéticos para cada alelo independientemente, y en las combinaciones de alelo para SE e IL-4R.

Análisis genético Para determinar el omocigosis o heterocigosis del HLA-DRB1 SE, la tipificación del HLA-DRB1 se realizó en un procedimiento en dos etapas. En primer lugar, todos los pacientes que han sido escritos en un nivel de resolución más baja utilizando el ensayo LABType SSO (One Lambda Inc). DRB1 * 01, * 04, * 10 y * 14 pacientes positivos se han escrito posteriormente en un nivel de alta resolución utilizando la escritura de secuencia basada (AlleleSEQR, Abbott Molecular Diagnostics). En el caso de ambigüedades, el kit DRB SSO de alta resolución de Biotest se utilizó adicionalmente.

En ciertos casos, la mecanografía de alta resolución con Protrans S4 Sequencig Kit (Medipro) se utilizó para determinar si un paciente tiene homocigosis o heterocigosis de HLA-DRB1 SE.

El PCR específico de alelo utilizando Assay-on-Demand (Applied Biosystems) se utilizó para determinar la IL-4R (A a G [I50V]) SNP.

Los PCR específicos de alelo utilizando Assay-on-Demand (Applied Biosystems) se utilizó para determinar el la variante FcyRIIb (T a C [(I232T]).

Evaluaciones clínicas El porcentaje de sujetos que han conseguido una mejora del 50% en la puntuación ACR desde la línea base se determinó en la semana 26 utilizando un método de imputación no respondedor. El porcentaje de sujetos que consiguieron DAS28 (CRP) la remisión (DAS28 <2,6) se determinó en la semana 26 utilizando un método de imputación no respondedor.

Análisis estadístico La distribución de los alelos entre grupos de tratamiento se evaluó mediante utilizando la prueba de chi cuadrada o prueba exacta de Fisher en los casos en que los datos eran escasos. La regresión logística multivariada se utilizó para evaluar el efecto del tratamiento, los alelos individuales, la interacción entre el tratamiento y los componentes genéticos, y los datos demográficos de referencia y características de la enfermedad en la respuesta clínica a las 26 semanas.

Resultados Población de estudio Disposición del sujeto Los ensayos OPTIMA seleccionaron 1032 pacientes: PBO + MTX: N = 517 y ADA+MTX: N = 515 Durante el primer período de 26 semanas, 106 sujetos (10%) abandonaron antes de tiempo: PBO + MTX: N = 57, el 11% y el ADA + MTX: N=49, 10% En este subestudio genético, 894 de 1032 sujetos (87%) tenían datos genotípicos disponibles para este análisis: PBO + MTX: N = 451, el 87% ADA + MTX: N = 443, el 86% Características base La asignación aleatoria no se estratificó según el tipo de alelo: Los sujetos en cada grupo de tratamiento mostraron una distribución similar de HLA-DRB1 SE y variantes de alelo IL-4R, sin embargo el FcyRIIb SNP se distribuyó de manera desigual y se excluyó del análisis (ver Tabla 9 a continuación), pero se analizaron en un análisis por separado descrito en el Ejemplo 4.

Tabla 9: Distribución de alelo. El número (%) de Sujetos que expresan los genotipos indicados.

PBO + MTX ADA+MTX Total Valor P ' Genotipo N = 451 N = 443 N = 894 HLA-DRB1 SE (# de 0.28 copia) 0 167 (37%) 145 (33%) 312 (35%) 1 215(48%) 216 (49%) 431 (48%) 2 69(15%) 82(19%) 151 (17%) IL-4R 0.38 AA (I50/I50) 130 (29%) 145 (33%) 275 (31%) AG (I50/I50V) 233 (52%) 210(47%) 443 (50%) GG (I50V/I50V) 88 (20%) 88 (20%) 176 (20%) FcyRIIb 0.03 TT (I232/I232) 333 (74%) 360 (81%) 693 (78%) TC (I232/I232T) 111 (25%) 77 (17%) 188 (21%) CC (I232T/I232T) 7(1.6%) 6(1.4%) 13(1.5%) Valores "P con base en la prueba chi cuadrada.

Los datos demográficos de referencia y características de la enfermedad fueron similares entre las variantes alélicas entre los grupos de tratamiento (Tablas 10 y 11): Un porcentaje creciente de pacientes con anti-CCP+ se observó con el aumento de las copias de la SE.

Más fumadores se identificaron en el grupo de PBO + MTX para los pacientes con una copia de SE en comparación con los pacientes con ADA + MTX con un alelo SE.

Tabla 10. Datos demográficos base y características de Enfermedad por un Número de Copias de SE 0 copias SE 1 copia SE 2 copias N = 312 N = 431 SE N = 151 Género, n/N (%) mujer 245/312 (79%) 303/431 (70%) 106/151 (70%) Raza, n/N (%) blanca 257/312(82%) 398/431 (92%) 146/151 (97%) Edad, años promedio 51.0 (13.1) 51.4(13.9) 47.6 (14.6) (SD) Fumador, n/N (%) 150/312 (48%) 232/431 (54%) 76/151 (50%) RF+, n/N (%) 260/310(83%) 375/425 (87%) 138/150 (91%) RF >50 IU, n/N (%) 177/310(57%) 299/425 (70%) 109/150 (73%) anti-CCP+, n/N (%) 227/311 (73%) 370/426 (87%)* 139/149 (93%) RF+ y anti-CCP+, n/N 216/309 (70%) 347/422 (82%) 133/149 (89%) (%) CRP, (SP) mg/dl 2.71 (3.19) 2.99 (3.25) 3.04 (3.05) promedio DAS28, (SD) 6.1 (0.99)" 6.0 (0.99)b 6.0 (0.86)° promedio HAQ, (SD) promedio 1.6 (0.69)a 1.6 (0.67)" 1.7 (0.60) "Diferencia significante entre grupos de tratamiento (193/213, 91 % PBO+MTX, 177/213, 83% ADA+MTX, P = 0.02). "N = 301 ; bN = 428; CN = 149; eN = 311 ; "N = 430.

Tabla 11. Datos demográficos base y características Enfermedad por Alelos IL-4R AA AG GG N = 275 N = 443 N = 176 Género, n/N (%) mujer 201/275 (73%) 320/443 (72%) 133/176 (76%) Raza, n/N (%) blanca 250/275 (91%) 395/443 (89%) 156/176 (89%) Edad, años promedio 50.6(13.2) 50.8(14.0) 50.3 (14.2) (SD) Fumador, n/N (%) 139/275 (51%) 227/443(51%) 92/176 (52%) RF+, n/N (%) 241/271 (89%) 385/441 (87%) 147/173 (85%) RF >50 IU, n/N (%) 177/271 (65%) 297/441 (67%) 111/173(64%) anti-CCP+, n/N (%) 226/271 (83%) 368/441 (83%) 142/174 (82%) RF+ y anti-CCP+, n/N 214/268 (80%) 348/440 (79%) 134/172 (78%) (%) CRP, (SD) mg/dl 2.82 (3.03) 3.00 (3.34) 2.80 (3.09) promedio DAS28, (SD) 6.0 (0.99)" 6.1 (0.94) 6.0(1.00)° promedio HAQ, (SD) promedio 1.6 (0.65)" 1.6 (0.68)" 16 (0.65) "N = 267; N = 436; CN = 175; dN = 274; "N = 442.

Respuesta al tratamiento Para controlar las posibles variables de confusión, un análisis de regresión multivariable se utilizó para explorar la influencia de los factores genéticos con características demográficas básales y variables de la enfermedad del estado. En la regresión multivariable, el efecto del tratamiento para ADA + TX fue significativa (P <0.001) para lograr tanto la remisión de ACR50 y DAS28 en la semana 26.

Número de copias SE ACR50 El padrón inverso de las tasas de respuesta se observó en los 2 grupos de tratamiento: las respuestas con ACR50 en el grupo con PBO + MTX mostró una tendencia decreciente con la multiplicidad SE (Tabla 4), mientras que las tasas de respuesta de ACR50 a ADA+MTX aumenta en pacientes con presencia cada vez mayor de SE (Tabla 4).

Debido a la relación inversa entre el número de copias SE y la respuesta al tratamiento en los 2 grupos de tratamiento, más modelos multivariados se llevaron a cabo dentro de cada grupo de tratamiento. Se descubrió que, cuando se cuentan las variables base de referencia de sexo, fumador, RF +, anti-CCP +, TJC68 y DAS28, hubo un efecto significativo del número de copias de SE, en el grupo con PBO + MTX (QR [95% intervalo de confianza, IC]: 0.469 [0.247, 0.893] para 2x contra Ox SE). Además, en el grupo de con ADA+MTX, se descubrió que el efecto del número de copias de SE también fue significativo (OR [IC 95%]: 2.048 [1.127, 3.722] para 2x Ox contra SE).

Remisión DAS28 Entre los sujetos con PBO + MTX, no hubo efecto del número de copias SE en remisión DAS28 (Tabla 5). Sin embargo, un patrón de aumento de las tasas de respuesta DAS28 se observó en los sujetos con ADA + MTX con copias cada vez mayor de SE (Tabla 5). Además, dentro de los grupos con PBO + MTX o ADA + MTX, no hubo efecto significativo del número de copias de SE en la remisión DAS28 por la regresión multivariable.

Atelos IL-4R ACR50 ACR50 en la semana 26 no fue influenciada significativamente por los alelos IL-4R para los sujetos que recibieron cualquiera de los ADA + MTX o PBO + MTX (Tabla 6).

La remisión DAS28 Los alelos IL-4R no influyeron en la tasa de remisión DAS28 respuesta en la semana 26 para los sujetos dentro de cualquiera de los grupos de tratamiento PBO + MTX o ADA+MTX (Tabla 7). Estas observaciones fueron apoyadas por la regresión multivariable, con un efecto significativo de los alelos IL-4R en cualquier variable de la respuesta al tratamiento.

Efectos combinados de alelo De acuerdo con los resultados de análisis de componentes individuales, las tasas de respuesta de ACR50 y DAS28 en pacientes tratados con ADA+MTX fueron realzadas con la presencia de por lo menos una copia de SE, con la excepción de aquellos sujetos que son homocigotos para el alelo IL-4R AA (Figuras 6, 7 y 8). No hubo un patrón consistente de influencia de combinaciones alélicas de SE e IL-4R en tasas de respuesta a PBO + MTX (datos no presentados).

En resumen, los sujetos en los grupos de tratamiento mostraron una distribución similar de 0, 1 o 2 copias de la molécula HLA-DRB1 SE (PBO + MTX: 37%, 48%, 15%; ADA + MTX: 33%, 49%, 19%, respectivamente, P = 0.28). Asimismo, los alelos IL-4R, AA, AG, y GG, se distribuyeron de manera similar entre los grupos de tratamiento (PBQ + MTX: 29%, 52%, 20%; ADA + MTX: 33%, 47%, 20%, respectivamente, P = 0.38). Los alelos FcyRIIb, sin embargo, fueron apropiados entre grupos de tratamiento, y no su posterior análisis se llevó a cabo en este SNP (análisis adicional se presenta en el Ejemplo 4 más adelante).

La presencia de SE no afectó la respuesta al tratamiento con MTX solo (por ejemplo, ACR50 de 40%, 33% y 29% para 0, 1 ó 2 copias, P = 0.23). Por el contrario, las tasas de respuesta al tratamiento se mejoraron proporcionalmente con el aumento de las copias de SE en los sujetos que recibieron ADA+MTX (ACR50 del 42%, 53% y 65% para 0, 1, 2 SE, p = 0.004). Por lo tanto, la presencia de una copia de SE permitió un aumento del 20% en ACR50 de sujetos tratados con ADA + MTX relativos al grupo tratado con PBO + MTX (p <0.001), y 2 copias de SE aumentaron ACR50 en ADA+MTX en n 36% más sobre PBO + MTX (p <0.001). Del mismo modo, las respuestas clínicas a MTX no se vieron afectadas por los alelos IL-4R, mientras que los resultados del tratamiento con ADA+MTX se acentúa en personas con AA o AG alelos IL-4R. El examen de la respuesta al tratamiento de SE y de combinaciones de alelos IL-4R en el grupo tratado con PBO + MTX, no hubo alteración en las respuestas por el genotipo, el apoyo a los resultados obtenidos del análisis de los alelos individuales. En ausencia de SE, el genotipo IL-4R afectó la respuesta al tratamiento a ADA + MTX, mientras que la presencia de SE enmascaró los efectos de los alelos IL-4R (véase Tabla 8).

Conclusiones Se descubrió que el tratamiento con ADA + TX ofreció una ventaja significativa para el logro de ACR50 o DAS28 a las 26 semanas de tratamiento en comparación con PBO + MTX. El epítope HLA-DRB1 compartido demostró un efecto significativo en la respuesta al tratamiento (ACR50), incluso en la contabilización de las características demográficas básales y variables del estado de la enfermedad. Además, el IL-4R no mostró ningún efecto apreciable en las respuestas ACR50 o remisión de DAS28 de regresión multivariable. Por lo tanto, una comprensión de los componentes genéticos que contribuyen a las respuestas de tratamiento a los antagonistas del TNF puede ayudar a orientar las decisiones terapéuticas.

En resumen, las respuestas clínicas a adalimumab más metotrexato se vieron afectadas de manera independiente tanto por el epítope compartido HLA-DRB1 y los alelos IL-4R, mientras que no hubo efecto de genotipo en la respuesta a la monoterapia con metotrexato. Por lo tanto, no había una interacción entre el epítope HLA-DRB1 compartido y los alelos IL-4R alelos en la respuesta al tratamiento con adalimumab más metotrexato.

Ejemplo 4: Influencia genética de HLA-DRB1, IL-4R, y FcvRllb en la respuesta al tratamiento con adalimumab más metotrexato en pacientes con artritis reumatoide temprana: resultados de 26 semanas de OPTIMA.

Los factores genéticos se conocen porque influyen en la manifestación, la severidad y la progresión radiográfica de la artritis reumatoide. Su efecto sobre la respuesta al tratamiento con agentes anti-TNF no está claro.

El objetivo de, este estudio fue examinar la respuesta a adalimumab más metotrexato (ADA + MTX) o placebo (PBO) + MTX en las siguientes 26 semanas de tratamiento en función de 3 candidatos loci: el epítope HLA-DRB1 compartido (SE), la variante de IL-4R I50V, y el polimorfismo I232T FcvRllb.

Métodos Los pacientes = 18 años de edad, sin tratamiento con MTX con AR <1 año y enfermedad activa (DAS28> 3.2, ESR= 28 mm/h, o CRP = 1,5 mg/dl), y/o bien erosiones > 1, RF + , o anti-CCP + fueron asignados aleatoria a ADA + MTX (N = 515) o de PBO + MTX (N = 517) durante 26 semanas. Este análisis presenta los resultados clínicos de 26 semanas por el número de copias de HLA-DRB1 SE (Ox, 1x, 2x o), IL-4R I50V (AA, AG, o GG), y FcyRIIb I232T (TT, CT, CC) alelos. La imputación de los pacientes que no respondieron se utilizó para calcular el porcentaje de pacientes que alcanzaron ACR20/50/70 y actividad baja de la enfermedad DAS28 (LDA, DAS28 <3.2) y la remisión (DAS28 <2.6). La regresión logística múltiple se utilizó para evaluar la influencia de las variables potenciales de confusión de referencia. Las variables categóricas de referencia explicativas incluyen el sexo, fumador, RF (> 50 o = 50 Ul), anti-CCP (= 3 veces o < 3x ULN), CRP (= 1.5 y <1.5 mg/dl), y la presencia de erosiones (0 o > 0). Los valores continuos de línea de base TJC68, SJC66 y DAS28 también fueron incluidos.

Resultados En este sgbestudio, los datos genéticos estaban disponibles para 451 y 443 pacientes asignados aleatoria a PBO + MTX o ADA + MTX, respectivamente. La distribución de los alelos fue similar entre los grupos de tratamiento para la SE e IL-4R. Los alelos FcYRIIb se distribuyen de manera desigual entre los pacientes en ambos grupos de tratamiento (PBO-MTX) contra (ADA + MTX), como el grupo PBO + MTX tenía más TC y menos CC los pacientes con FcYRIIb. La comparación entre ambos grupos de tratamiento para FcyRIIb no se realizó, sin embargo, fue posible analizar el impacto de los tres genotipos FcyRIIb dentro de un solo brazo en respuesta a su tratamiento respectivo.

Para cada lugar, los datos demográficos base fueron similares en todos los alelos. Una mayor proporción de pacientes anti-CCP+ se observó entre las personas con copias cada vez mayores de SE.

Las respuestas a ADA + MTX aumentaron al aumentar el número de copias de SE, disminuyeron con IL-4R-GG, y aumentaron con FcYRIlb-CC. Un patrón inverso se detectó en los pacientes del grupo PBO + MTX (por ejemplo, DAS28 <3.2, Figura 9)· Debido a esta diferencia, la regresión logística múltiple se llevó a cabo dentro de cada grupo de tratamiento. En respuesta al tratamiento con PBO+MTX, el número de copias de SE ha demostrado un efecto negativo significativo sobre ACR20 y ACR50. IL-4R y FcYRIIb no mostraron una asociación significativa con las respuestas de 26 semanas a PBO + MTX.

En el modelo para las respuestas ADA + MTX, el número de copia de SE se asoció significativamente obteniendo ACR20/50/70 y LDA DAS28. La tasa aleatoria mostró que los pacientes con 2 copias de SE fueron aproximadamente dos veces más probabilidades de alcanzar estos objetivos, como aquellos con alelos SE 0. IL-4R solo no tiene un impacto en la respuesta al tratamiento de 26 semanas a ADA+MTX. FcyRIlb-CC se asoció significativamente cuando se obtuvo ACR70 y la remisión DAS28, con tasa aleatoria superior a 10 veces que la de FcYRIlb-TC. En combinación, el efecto del número de copias de SE era silenciado en antecedentes de tipo salvaje de IL-4R-AA y FcyRIlb-TT, pero aparente cuando al menos 1 copia de cualquiera de las variantes genéticas de IL-4R o FcyRIIb estaban presentes.

En conclusión, independientemente de su origen genético, las tasas de respuesta al tratamiento fue mayor para los pacientes en tratamiento con ADA+MTX en comparación con el grupo con PBO + MTX. Sobre la base de múltiples modelos de regresión logística, IL-4R por sí solo no se relacionó con los resultados del tratamiento. HLA-DRB1 SE y FcyRIIb fueron predictores significativos independientes positivos de la respuesta al tratamiento con ADA + MTX. Las posibles interacciones entre estas ubicaciones garantizan una mayor exploración de la función de estos componentes genéticos, en respuesta a agentes anti-TNF, aunque se desprende de los datos presentados en este informe que el HLA-DRB1 SE y FcyRIIb solo o en combinación (y/o más en combinación con IL-4R) son cada uno predictores de la respuesta del paciente al tratamiento con un inhibidor de TNFa.

EQUIVALENTES Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando no más que experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención aquí descritas. Dichos equivalentes están destinados a ser comprendidos por las siguientes reivindicaciones.

Claims (45)

REIVINDICACIONES

1. Un método para predecir la sensibilidad de un sujeto que tiene artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) al tratamiento con un inhibidor de TNFa, que comprende determinar la presencia de un alelo HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés) en una muestra del sujeto, en donde la presencia de por lo menos una copia del alelo HLA-DRB1 SE indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor de TNFa.

2. Un método para tratar un sujeto que tiene artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés) que comprende administrar un inhibidor de TNFa al sujeto para el tratamiento de la RA, con la condición de que por lo menos una copia de un alelo HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés) esté presente en una muestra del sujeto.

3. Un método para determinar si un inhibidor de TNFa será efectivo para el tratamiento de un sujeto que tiene artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), que comprende detectar la presencia de por lo menos de una copia de un alelo HLA-DRB1 del epítopo compartido (HLA-DRB1 SE, por sus siglas en inglés) en una muestra del sujeto, en donde la presencia del alelo HLA-DRB1 SE indica que el inhibidor de TNFa será efectivo para el tratamiento de la RA en el sujeto.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, ó 3, en donde la presencia del alelo HLA-DRB1 SE se determina mediante el análisis del ácido nucleico o proteína en la muestra.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, ó 3, en donde la presencia del alelo HLA-DRB1 SE se determina al usar un método de ensayo seleccionado del grupo que consiste de análisis de micromatriz, secuenciación de ADN, o técnicas de PCR.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, que adicionalmente comprende determinar la presencia de un alelo IL-4R I50 en una muestra del sujeto, en donde la presencia del alelo IL-4R I50 (AA o AG) en la muestra indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor de TNFa.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 ó 3, que adicionalmente comprende determinar la presencia de dos alelos FcvRllb T232 (FcYRIlb-CC) en una muestra del sujeto, en donde la presencia de dos alelos FcyRIIb T232 (FcyRIlb-CC) en la muestra indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor de TNFa.

8. El método de la reivindicación 7, que adicionalmente comprende determinar la presencia de un alelo IL-4R I50 en una muestra del sujeto, en donde la presencia del alelo IL-4R I50 (AA o AG) en la muestra indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor de TNFa.

9. Un método para predecir la sensibilidad de un sujeto que tiene RA al tratamiento con un inhibidor de TNFa, que comprende determinar el número de copia de un alelo FCYRIID T232 en una muestra del sujeto, en donde la presencia de dos copias del alelo FCYRIID T232 (FCYRIID-CC) indica que el sujeto será sensible al tratamiento con el inhibidor de TNFa.

10. Un método para tratar un sujeto que tiene artritis regmatoide (RA, por sus siglas en inglés) que comprende administrar un inhibidor de TNFa al sujeto para el tratamiento de la RA, con la condición de que dos copias del alelo FcYRIIb T232 (FcYRIlb-CC) estén presentes en una muestra del sujeto.

11. Un método para determinar si un inhibidor de TNFa será efectivo para el tratamiento de un sujeto que tiene artritis reumatoide, que comprende determinar el número de copias de un alelo FcYRIIb T232 en una muestra del sujeto, en donde la presencia de dos copias del alelo FcYRIIb T232 (FcYRIlb-CC) indica que el inhibidor de TNFa será efectivo para el tratamiento del RA en el sujeto.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde la presencia del alelo FcYRIIb T232 se determina mediante el análisis del ácido nucleico o proteína en la muestra.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde la presencia del alelo FcYRIIb T232 se determina al usar un método de análisis seleccionado del grupo que consiste de análisis de micromatriz, secuenciación de ADN, o técnicas de PCR.

14. Un método para predecir la sensibilidad de un sujeto que tiene RA al tratamiento con un inhibidor de TNFa, que comprende determinar el número de copias de un alelo IL-4R V50 en una muestra del sujeto, en donde la presencia de dos copias del alelo IL-4R V50 (GG) en la muestra indica que el sujeto no será sensible al tratamiento con el inhibidor de TNFa, a menos que el sujeto también tenga por lo menos una copia de un alelo HLA-DRB1 SE.

15. El método de la reivindicación 14, en donde el número de copias del alelo IL-4R V50 se determina mediante el análisis del ácido nucleico o proteína en la muestra.

16. El método de la reivindicación 14, en donde el número de copias del alelo IL-4R V50 se determina al usar un método de análisis seleccionado del grupo que consiste de análisis de micromatriz, secuenciación de ADN, o técnicas de PCR.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde el inhibidor de TNFa es un anticuerpo anti-TNFa, o porción de unión al antígeno del mismo, o una proteína de fusión.

18. El método de la reivindicación 17, en donde la proteína de fusión es etanercept.

19. El método de la reivindicación 17, en donde el anticuerpo anti-TNFa, o porción de unión al antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo humano, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, y un anticuerpo polivalente.

20. El método de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo anti-TNFa quimérico, o porción de unión al antígeno del mismo, es infliximab.

21. El método de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es adalimumab o golimumab.

22. El método de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano aislado que se disocia del TNFa humano con una Kd de 1 x 108 M o menos y una constante koff de 1 x 10"3 s"1 o menos, ambas determinadas por la resonancia superficial de plasmón, y neutraliza la citotoxicidad de TNFa humano en un análisis in vitro estándar L929 con una Cl50 de 1 x 1 O"7 M o menos.

23. El método de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano aislado con las siguientes características: a) se disocia del TNFa humano con una constante koff de 1 x 10"3 s" o menos, según lo determinado por la resonancia superficial de plasmón; b) tiene un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de SEC ID NO: 3, o modificado de la SEC ID NO: 3 por una sola sustitución de alanina en la posición 1, 4, 5, 7 ó 8 o por una a cinco sustituciones conservadoras de aminoácido en las posiciones 1, 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9; y c) tiene un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4, o modificado de la SEC ID NO: 4 por una sola sustitución de alanina en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ó 11 o por una a cinco sustituciones conservadoras de aminoácido en las posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y/o 12.

24. El método de la reivindicación 19, en donde el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano aislado con una región variable de cadena ligera (LCVR, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1 y una región variable de cadena pesada (HCVR, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2.

25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-24, en donde el sujeto se diagnostica con RA con una duración de la enfermedad de menos de 1 año.

26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-25, en donde el sujeto tiene un DAS28 de >3.2.

27. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-26, en donde el sujeto es administrado adicionalmente con MTX.

28. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1, 3, 9 y 11, en donde el método determina o predice la sensibilidad clínica en el sujeto.

29. Un kit para predecir la sensibilidad de un sujeto a un inhibidor de TNFa para el tratamiento de la artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), que comprende un medio para determinar la presencia de un alelo HLA-DRB1 SE en una muestra del sujeto, y instrucciones para el tratamiento recomendado para el sujeto basado en la presencia del alelo HLA-DRB1 SE, en donde la presencia del alelo HLA-DRB1 SE indica que el sujeto será sensible al tratamiento de la RA con el inhibidor de TNFa.

30. El kit de la reivindicación 29, en donde el medio para determinar la presencia del alelo HLA-DRB1 SE comprende un ácido nucleico que se hibridiza con una molécula de ácido nucleico que codifica HLA-DRB1 SE, o una porción de la misma que contiene la región SE, o un anticuerpo que une específicamente a una proteína que corresponde a HLA-DRB1 SE.

31. El kit de la reivindicación 29 ó 30, que adicionalmente comprende un medio para detectar la presencia de un alelo IL-4R I50 en la muestra del sujeto, y las instrucciones para el tratamiento recomendado para el sujeto basado en la presencia del alelo IL-4R 150 , en donde la presencia combinada del alelo IL-4R I50 y el alelo HLA-DRB1 SE indica que el sujeto será sensible al tratamiento de la RA con el inhibidor de TNFa.

32. Un kit para predecir o determinar la sensibilidad de un sujeto a un inhibidor de TNFa para el tratamiento de la artritis reumatoide (RA, por sus siglas en inglés), que comprende a) un medio para determinar la presencia de un alelo FcYRIIb T232 en una muestra del sujeto, y b) las instrucciones para el tratamiento recomendado para el sujeto basado en la presencia de dos alelos FcYRIIb T232 (FCYRI Ib-CC), en donde la presencia de dos alelos FcyRIIb T232 indica que el sujeto será sensible al tratamiento de la RA con el inhibidor de TNFa.

33. El kit de la reivindicación 32, en donde el medio para determinar la presencia del alelo FcYRIIb T232 comprende un ácido nucleico que se hibridiza con una molécula de ácido nucleico que codifica FcYRIIb T232, o una porción del mismo que contiene I232T SNP, o un anticuerpo que une específicamente a una proteína que corresponde a una proteína de FcYRIIb T232.

34. El kit de la reivindicación 32 ó 33, que adicionalmente comprende un medio para detectar la presencia de un alelo IL-4R 150 en la muestra del sujeto, y las instrucciones para el tratamiento recomendado para el sujeto basado en la presencia del alelo IL-4R 150, en donde la presencia combinada del alelo IL-4R 150 y el alelo FcYRIlb-CC indica que el sujeto será sensible al tratamiento de la RA con el inhibidor de TNFa.

35. El kit de la reivindicación 34, que adicionalmente comprende un medio para detectar la presencia de un arelo HLA-DRB1 SE en la muestra del sujeto, y las instrucciones para el tratamiento recomendado para el sujeto basado en la presencia del alelo HLA-DRB1 SE, en donde la presencia combinada del alelo FcYRIlb-CC, alelo IL-4R 150 , y el alelo HLA-DRB1 SE indica que el sujeto será sensible al tratamiento de la RA con el inhibidor de TNFa.

36. El kit de la reivindicación 32 ó 33, que adicionalmente comprende un medio para detectar la presencia de un alelo HLA-DRB1 SE en la muestra del sujeto, y las instrucciones para el tratamiento recomendado para sujeto basado en la presencia del alelo HLA-DRB1 SE, en donde la presencia combinada del alelo FcyRIlb-CC y alelo HLA-DRB1 SE indica que el sujeto será sensible al tratamiento de la RA con el inhibidor de TNFa.

37. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 29-36, que adicionalmente comprende el medio para obtener la muestra del sujeto.

38. El kit de cualquiera de las reivindicaciones 29-37, en donde el inhibidor de TNFa es un anticuerpo anti-TNFa, o porción de unión al antígeno del mismo, o una proteína de fusión.

39. El kit de la reivindicación 38, en donde la proteína de fusión es etanercept.

40. El kit de la reivindicación 38, en donde el anticuerpo anti-TNFa, o porción de unión al antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste de un anticuerpo humano, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, y un anticuerpo polivalente.

41. El kit de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo anti-TNFa quimérico, o porción de unión al antígeno del mismo, es infliximab.

42. El kit de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es adalimumab o golimumab.

43. El kit de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano aislado que se disocia del TNFa humano con una Kd de 1 x 10*8 M o menos y una constante k0ff de 1 x 10'3 s'1 o menos, ambas determinadas por la resonancia superficial de plasmón, y que neutraliza la citotoxicidad humana de TNFa en un análisis in vitro estándar L929 con una Cl50 de 1 x 10'7 M o menos.

44. El kit de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano aislado con las siguientes características: a) se disocia del TNFa humano con un constante k0ff de 1 x 10"3 s"1 o menos, según lo determinado por la resonancia superficial de plasmón; b) tiene un dominio CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 3, o modificado de la SEC ID NO: 3 por una sola sustitución de alanina en la posición 1, 4, 5, 7 ó 8 o por una a cinco sustituciones conservadoras del aminoácido en las posiciones 1, 3, 4, 6, 7, 8 y/o 9; y c) tiene un dominio CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 4, o modificado de la SEC ID NO: 4 por una sola sustitución de alanina en la posición 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ó 11 o por una a cinco sustituciones conservadoras de aminoácido en las posiciones 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 y/o 12.

45. El kit de la reivindicación 40, en donde el anticuerpo anti-TNFa humano, o porción de unión al antígeno del mismo, es un anticuerpo humano aislado con una región variable de cadena ligera (LCVR, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 1 y una región variable de cadena pesada (HCVR, por sus siglas en inglés) que comprende la secuencia de aminoácido de la SEC ID NO: 2.