MX2011005295A - Moduladores de tgr5 y metodo de uso de los mismos. - Google Patents

Moduladores de tgr5 y metodo de uso de los mismos.

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Abstract

La invención se refiere a compuestos de la fórmula A: (A) o una sal, solvato, hidrato o profármaco de los mismos. Los compuestos de la fórmula A son moduladores de TGR5 útiles para el tratamiento de varias enfermedades, incluyendo enfermedad metabólica, enfermedad inflamatoria, enfermedad hepática, enfermedad autoinmune, enfermedad cardíaca, enfermedad de riñón, cáncer y enfermedad gastrointestinal.

Description

MODULADORES DE TGR5 Y MÉTODO DE USO DE LOS MISMOS SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama prioridad a la solicitud Europea No. 08169462.2, presentada el 19 de noviembre de 2008, los contenidos de la cual se incorporan áMa presente por referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a compuestos que modulan TGR5 y composiciones útiles en métodos para el tratamiento y/o prevención de varias enfermedades.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El receptor TGR5 es un receptor acoplado de proteína G que ha sido identificado como un receptor, de superficie celular que. es responsivo a ácidos biliares (BAS). Se ha descubierto que la estructura primaria de TGR5 y su respuesta a ácidos biliares se conservan altamente en TGR5 entre humanos, bovino, conejo, rata y ratón, y de esta manera sugiere que TGR5 tiene funciones fisiológicas importantes. Se ha descubierto que TGR5 se distribuye ampliamente no sólo en tejidos linfoides sino también en otros tejidos. Se han detectado niveles altos de mARN de TGR5 en placenta, bazo y monocitos/macrófagos. Los ácidos biliares han mostrado que inducen internalización de la proteína de fusión de TGR5 de la membrana celular al citoplasma. Kawamata y otros 2003, J. Bio. Chem., 278, 9435. Se ha descubierto que TGR5 es idéntico a hGPCR19 registrado por Takeda y otros, 2002, FEBS Lett. 520, 97-101.
TGR5 está asociado con la acumulación intracelular de cAMP, que se expresa ampliamente en diversos tipos celulares. Mientras que la activación de. este receptor de membrana en macrófagos disminuye la producción de citoquina pro-inflamatoria, (Kawamata, Y., y otros, J. Biol. Chem. 2003, 278, 9435-9440) la estimulación de TGR5 por BAS en adipocitos y miocitos realza el gasto de energía (Watanabe, M. y otros, Nature, 2006, 439, 484-489). Este último efecto involucra la inducción dependiente de cAMP de yodotironina desyododinasa tipo 2 (D2), que, al convertir localmente T4 en T3, da auge a actividad aumentada de hormona tiroide. Consistente con el papel de TGR5 en el control de metabolismo de energía, los ratones noqueados de TGR5 hembra muestran una acumulación significativa de grasa con ganancia de peso corporal al ser retados con una dieta alta en grasa, indicando que la falta de TGR5 disminuye el gasto de energía y provoca obesidad (Maruyama, T., y otros, J. Endocrinol. 2006, 191, 197-205). Además y en linea con el involucramiento de TGR5 en homeostasis de energía, la activación de ácido biliar del receptor de membrana también ha sido registrado para promover la producción de péptido 1 tipo glucagon (GLP-1) en líneas celulares enteroendócrinas de murina (Katsuma, S., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 329, 386-390). Sobre la base de todas las observaciones anteriores, TGR5 es un objetivo atractivo para el tratamiento de enfermedad, por ejemplo, obesidad, diabetes y síndrome metabólico.
Además del uso de agonistas de TGR5 para el tratamiento y prevención de enfermedades metabólicas, los compuestos que modulan moduladores de TGR5 también son útiles para el tratamiento de otras enfermedades,, por ejemplo, enfermedades nerviosas centrales así como enfermedades inflamatorias (WO 01/77325 y WO 02/84286). Los moduladores de TGR5 también proveen métodos de regular ácido biliar y homeostasis de colesterol, absorción de ácido graso, y digestión de proteína y carbohidrato.
En la literatura se ha descrito relativamente pocos ejemplos de agonistas de TGR5. Recientemente, se han registrado derivados 23-alquilo-sustituidos y 6,23-alquilo-disustituidos de ácido quenodesoxicólico (CDCA), tal como el compuesto de ácido 6a-etilo-23(S)-metilo-quenodesoxicólico mostrado más adelante, como agonistas potentes y selectivos de TGR5 (Pellicciari, R.¡ y otros J. Med. Chem. 2007, 50, 4265-4268). > En particular, la metilación (configuración S) en la posición C23 de ácidos biliares (BAS) naturales confiere una selectividad marcada a ac-tivación de TGR5. sobre FXR (receptor farnesoide X), mientras que la sustitución de 6a-alquilo aumenta la potencia en ambos receptores. Algunos ejemplos de otros agonistas de TGR5 incluyen éster bencílico de ácido 6-metil-2-oxo-4-tiofen-2-il-1 ,2,3,4-tetrahidro-pirimidina-5-carboxílico (WO004067008, Takeda Chemical Industries LTD, Japón, 2004) y ácido oleanoico (Sato, H. y otros, Biochem. And Biophys. Res. Commun. 2007, 362, 793-798; Ito, F. y otros WO2004067008, 2004). Más recientemente, la primera síntesis de ácido quenodesoxicólico enantiomérico (CDCA) y ácido litocólico (LCA) ha permitido acceso a estudiar la especificidad de la interacción de BAS naturales con TGR5 (Katona, B. W. y otros, J. Med. Chem. 2007, 50, 6048-6058).
Los agonistas de TGR5 recientemente desarrollados también han provisto por primera vez una diferenciación farmacológica de efectos genómicos contra no genómicos de BAS y también han permitido estudios informativos sobre la relación de estructura- actividad, por ejemplo, la presencia de una bolsa de unión de accesorio en TGR5 se ha descubierto que juega un papel pivotal en determinar la selectividad de ligando (ver, Pellicciari, y otros, J. Med. Chem. 2007, 50, 4265-4268). En este contexto, la disponibilidad de moduladores de TGR5 más potentes y selectivos es necesaria para identificar más características adicionales de afectar activación de receptor y caracterizan las acciones fisiológicas y farmacológicas de este receptor a fin de entender mejor su relación a la prevención y tratamiento de la enfermedad.
- A este extremo, de interés particular fueron las propiedades biológicas y fisicoquímicas del compuesto ácido cólico (CA), que tiene la estructura mostrada más adelante: El ácido cólico es un ácido biliar primario en humano y muchas especies animales, también se registra como uno de los componentes principales junto con bilirrubina de Calculus Bovis, una medicina china tradicional altamente valuada (Chen, X., Biochem. Pharmacol. 2002, 63, 533-541 ). El ácido cólico (CA) difiere de ácido quenodesoxicólico (CDCA) y sus derivados descritos antes por la presencia en C-12 de un grupo alfa-hidroxilo adicional orientado en el lado polar de la molécula. Esta diferencia estructural "menor" explica las características fisicoquímicas y biológicas notablemente diferentes de estos dos ácidos biliares. Con respecto a CDCA, CA protonado es aproximadamente 4-veces más solubles y relativamente menos detergente como un resultado de su balance y polaridad hidrofóbica/hidrof ílica. Además, CA carece de actividad hacia receptor de FXR (EC50 ? 100 µ?) al mismo tiempo mostrando actividad agonística moderada en TGR5 (EC50 = 13.6 µ?). Como una consideración incluso más importante, previamente se registró que la administración farmacológica de CA a 0.5% p/p en ratones obesos inducidos con dieta previene y trata eficientemente el síndrome metabólico (Katsuma, S., Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005, 329, 386). Mientras que este estudio proveyó resultados interesantes con relación a las funciones endocrinas de ácidos biliares, la alta dosificación requerida (0.5% p/p) todavía limitó la prueba de concepto concerniente a la relevancia terapéutica de TGR5 en el contexto de enfermedades metabólicas, ya que la modulación de otros objetivos y objetivos desconocidos no se pudo descartar a esa dosis. Un tema adicional también fue el riesgo asociado con la prueba de una dosis alta de CA en pruebas clínicas debido a la producción del metabolito secundario tóxico BA DCA vía 7a-deshidroxilación de bacteria intestinal extensiva y eficiente (Nagengast, F. M., Eur. J. Cáncer, 1995, 31A, 1067).
De esta manera, se necesita el desarrollo de moduladores de TGR5 para el tratamiento y/o prevención de varias enfermedades. La presente invención tiene compuestos identificados que modulan TGR5 así como métodos de usar estos compuestos para tratar y prevenir enfermedades.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a moduladores de TGR5 y su uso para tratar y/o prevenir varias enfermedades. La invención se refiere a compuestos de acuerdo con la fórmula A: A) o una sal, solvato, hidrato o profármaco de los mismos. En la fórmula A, los variables R R2, R3, R4, R5, R6. R7, Re, R9 y R10 se pueden seleccionar a partir de los grupos respectivos de porciones químicas definidas después en la descripción detallada. La invención incluye una composición que comprende un compuesto de la invención o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo farmacéuticamente aceptable y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. La invención incluye un compuesto para usarse en un método de tratar o prevenir enfermedad en un sujeto. La invención también incluye el uso de una composición o compuesto de la invención o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad en un sujeto. En un aspecto, la enfermedad se selecciona de enfermedad metabólica, enfermedad inflamatoria, enfermedad del 1 hígado, enfermedad autoinmune, enfermedad cardiaca, enfermedad del riñon, cáncer y enfermedad gastrointestinal.
La descripción anterior establece bastante ampliamente las características más importantes de la presente invención a fin de que la descripción detallada de la misma que sigue se pueda entender, y a fin de que las presentes contribuciones a la técnica sean mejor apreciadas. Otros objetos y características de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada considerada junto con los ejemplos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es una gráfica que muestra el impacto del compuesto Ih3e en ganancia de peso corporal en ratones alimentados de comida chow y dieta alta en grasa.
Las figuras 2A-2I son una serie de nueve gráficas que muestran cambios en el perfil metabólico de ratones alimentados altos en grasa tratados con el compuesto Ih3e. El análisis de plasma en ratones obesos inducidos con dieta tratados con el compuesto Ih3e. Las figuras 2A-2D se refieren a enzimas del hígado. Las figuras 2F-21 se refieren a lípidos de plasma.
Las figuras 3A-3B son una serie de gráficas que muestran los resultados de análisis de insulina de plasma y prueba oral de tolerancia a la glucosa en ratones alimentados con comida chow y dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e.
La figura 4 es una gráfica que muestra cambios en niveles de glucosa en ratones con dieta de comida chow tratados con el compuesto Ih3e.
Las figuras 5A-5D son una serie de gráficas que muestran liberación de insulina in vivo después de un alimento de prueba en ratones alimentados con comida chow y dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e.
Las figuras 6A-6D son una serie de gráficas que muestran consumo de oxígeno y producción de C02 como se midió por calorimetría indirecta en ratones alimentados con comida chow y dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e.
Las figuras 7A-7C son tres gráficas que muestran el valor de la relación de intercambio respiratorio (RER) como se calculó después de la calorimetría indirecta en ratones alimentados con comida chow y dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e.
Las figuras 8A-8B son una serie de gráficas que muestran actividad locomotora y absorción de alimento y agua para ratones alimentados con comida chow y dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e.
Las figuras 9A-9C son una serie de gráficas que muestran cambios en peso de órgano para ratones alimentados con comida chow y dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e.
La figura 10 es una gráfica que ilustra la tensión superficial ploteada contra el logaritmo de la concentración del compuesto Ih3e (mM) en NaCI 0.15M.
La figura 11 es una gráfica de flujo biliar para un experimento de infusión duodenal realizado usando el compuesto Ih3e.
La figura 12 es una gráfica de flujo biliar para un experimento de infusión femoral usando el compuesto Ih3e.
La figura 13 es una gráfica que ilustra velocidades de secreción contra el tiempo en experimentos de infusión femoral y duodenal realizados usando el compuesto Ih3e.
Las figuras 14A-14D son una serie de gráficas relacionadas con el compuesto Ih3e y sus metabolitos. La figura 14A que muestra el compuesto Ih3e y sus metabolitos principales identificados en bilis usando espectrometría de masa en el experimento iv. Los datos se registran como valores absolutos de área. La figura 14b es un visualizador en zoom de la figura 14A. La figura 14C muestra el compuesto Ih3e y sus metabolitos principales identificados en bilis usando espectrometría de masa. La figura 14D es un visualizador en zoom de la figura 14C.
La figura 15 es una gráfica que muestra la estabilidad del compuesto Ih3e (triángulo) y CA (cuadrado) en cultivo de deposición humana.
La figura 16 es una gráfica de barras que muestra la liberación dependiente de dosis de GLP-1 ex vivo inducida por el compuesto Ih3e La figura 17A muestra trazos de correlación para expresión de mARN de hígado de TGR5 y CoxVM a en la población de referencia genética BxD de ratón (n = 41).
La figura 17B es una gráfica de barras que muestra actividad de Cox en células STC-1 tratadas durante 1 hora con el compuesto Ih3e a la concentración indicada. El vehículo o inhibidor de adenilato ciclasa MDL-12330-A (MDL) (1 µ ) se agregó 15 minutos antes del tratamiento (n = 3).
La figura 17C es una gráfica que muestra consumo de oxígeno en células STC-1 como se midió usando el analizador de flujo extracelular XF24 (Seahorse Bioscience). La primera línea punteada vertical indica la adición de vehículo o MDL-12330-A (MDL) a medio de cultivo, y la segunda línea punteada ilustra el tratamiento con el compuesto Ih3e a 1 µ? (n = 10).
La figura 17D es una gráfica de barras que muestra relación de ATP/ADP en células STC-1 tratadas como en la figura B (n = 3).
La figura 17E muestra trazos de correlación para expresión de mARN de hígado de TGR5 y Kir6.2 en la población de referencia genética BxD de ratón de acuerdo con una estrategia similar como se describe en la figura A.
La figura 17F es una gráfica de barras que muestra niveles de expresión de mARN de TGR5, CoxIV y Kir6.2 en células STC-1 transfectadas durante 36 horas con control o shARN de mTGR5 como se midió por PCR cuantitativo en tiempo real. Los niveles de mARN objetivo se normalizaron a niveles de mARN de 36B4 (n = 3). Los datos están representados como medio ± SE; prueba t desasociada del Alumno; *p ? 0.05.
La figura 18A muestra trazos de correlación para expresión de mARN de hígado de TGR5 y Cav2.2 en la población de referencia genética BxD de ratón (n = 41) como se descubrió en el sitio de internet de la Universidad GeneNetwork de Tennessee.
Las figuras 18B y 18C son gráficas que muestran nivel de calcio intracelular en células NCI-H716 trahsfectadas con vector falso, vector de expresión hTGR5, o siARN de hTGR5 durante 36 horas y tratadas con 1 (B) o 10 µ? (C) del compuesto Ih3e. La flecha representa tratamiento del compuesto Ih3e (n = 3).
La figura 18D es una gráfica que muestra el nivel de calcio intracelular en células NCI-H716 tratadas con 3 µ? del compuesto Ih3e (indicadas por la flecha) en presencia de vehículo o inhibidor de adenilato ciclasa MDL-12330-A (MDL) (10 µ?). Se agregó MDL o vehículo 15 minutos antes del tratamiento del compuesto Ih3e (n = 3).
La figura 18E es una gráfica que muestra el nivel de calcio intracelular en células NCI-H716 tratadas con 1% de glucosa y entonces con 1 µ? del compuesto Ih3e (n = 3).
La figura 18F es una gráfica de barras que muestra liberación de GLP-1 en células NCI-H716 tratadas con 1% de glucosa o con 1 µ? del compuesto lh3e,o una combinación de ambos agentes (n = 3) La Figura 18G es una gráfica de barras que muestra liberación de GLP-1 en células STC-1 transfectadas durante 36 horas con control, vector de expresión de mTGR5, o shARN de mTGR5 y después expuestas 30 minutos al compuesto Ih3e a la concentración indicada. Se agregó un inhibidor de DPP4 (Millipore) en medio de cultivo a 0.1% (n = 3).
La figura 18H es una gráfica de barras que muestra el impacto de 30 minutos del tratamiento del compuesto Ih3e en liberación de GLP-1 en células STC-1 transfectadas con vector de expresión mTGR5 en presencia de vehículo o inhibidor de adenilato ciclasa MDL-1 2330-A (10 µ?). Se agregó MDL o vehículo 15 minutos antes del tratamiento del compuesto Ih3e. Se agregó un inhibidor de DPP4 (Millipore) en medio de cultivo a 0.1% (n = 3). Los datos están representados como medio ± SE. Prueba t desasociada del Alumno; p ? 0.05 vehículo contra tratamiento del compuesto Ih3e; #p ? 0.05 vehículo contra tratamiento de MDL-1 2330-A.
La figura 19A es una gráfica que muestra los resultados de una prueba oral de tolerancia a la glucosa (OGTT) en ratones macho de TGR5-Tg alimentados durante 10 semanas con dieta alta en grasa y en carnadas de macho de la misma edad alimentados con comida chow o una dieta alta en grasa por la misma duración. Todos los ratones tenían 8 semanas al inicio de la dieta alta en grasa. El peso corporal de TGR5-Tg y carnada de control fue 37.9 ± 1.7 g y 37.0 ± 1.8 g, respectivamente (n = 8; no estadísticamente diferente). La gráfica de barras adyacente representa el área promedio bajo la curva (AUC) (n = 8).
Las figuras 19B y 19C muestran niveles de plasma de insulina (panel superior) y GLP-1 (panel inferior) durante OGTT (19B) o antes y después de un reto de alimento de prueba (19C) (n = 8).
La figura 19D es una gráfica de barras que muestra niveles de GLP-1 de explantas ¡leales aisladas de ratones macho de control y de TGR5-Tg alimentados durante 18 semanas con dieta alta en grasa y expuestos durante 1 hora a las concentraciones indicadas de LCA (n = 4).
La figura 19E es una serie de fotos que son secciones representativas pancreáticas manchadas con insulina inmunof luorescente de ratones macho de TGR5-Tg alimentados con una dieta alta en grasa durante 20 semanas o de carnadas de macho de la misma edad alimentados con comida chow o una dieta alta en grasa por la misma duración.
La figura 19F es una gráfica de barras que muestra un perfil de distribución de islotes pancreáticos de ratones macho de TGR5-Tg y carnadas de control alimentados con una comida chow o una dieta alta en grasa como se describe en (figura 19E). Los islotes fueron contados y medidos por el software de análisis ImageJ en cuatro secciones pancreáticas alternadas manchadas con H&E separadas cada una por 150 µ? (n = 5).
La figura 19G es una gráfica de barras que muestra contenido de insulina en islotes pancreáticos aislados con colagenasa de ratones macho de TGR5-Tg y carnadas de control alimentadas con una comida chow o una dieta alta en grasa como se describe en (figura 19E).
La figura 19H es una gráfica que muestra los resultados de un OGTT en ratones macho de TGR5"'" y TGR5+/+ alimentados con una dieta alta en grasa durante 8 semanas. La inserción representa el AUC promedio. El peso corporal de los ratones macho de TGR5"'" y TGR5+/+ al momento del análisis fue 46.3 ± 3.9 g y 51.9 ± 2.0 g, respectivamente (n = 8; no estadísticamente diferente).
Las figuras 191 y 19J son gráficas que muestran niveles de GLP-1 de plasma en ratones de TGR5+/+ alimentados con comida chow (figura 191) y TGR5-/- (figura 19J) después de un reto de glucosa oral, precedido 30 minutos antes por la administración oral de solución salina o compuesto Ih3e (30 mg/kg), solo o en combinación con un inhibidor de dipeptidilo-peptidasa-4 (DPP4i; 3 mg/kg) (n = 6). Los datos están representados como medio ± SE. Prueba t desasociadas del Alumno; #p ? 0.05, ratones alimentados con dieta alta en grasa contra alimentados con comida chow excepto por (I) y (J), en donde * evaluó ratones tratados con solución salina o DPP4¡ contra compuesto Ih3e o ratones tratados con Ih3e + DPP4i, y ratones tratados con * solución salina contra DPP4L La figura 20A es una gráfica que muestra los resultados de medición por HPLC de niveles de compuesto Ih3e de plasma en ratones C57BL6/J macho tratados con Ih3e alimentados con comida chow y dieta alta en grasa.
La figura 20B es una gráfica que muestra el resultado de intervención de dieta con el compuesto Ih3e (30 mg/kg/d) se inició después de un periodo de 14 semanas de alimentación con dieta alta en grasa al tiempo indicado por la flecha. La evolución del peso corporal en todos los grupos fue seguida a lo largo del estudio (n = 8).
La figura 20C es una gráfica de barras que muestra composición corporal como se evaluó por qNMR después de 8 semanas de intervención con dieta (n = 8).
La figura 20D es una gráfica de barras que muestra masa de órgano como se expresa por porcentaje del peso de ratones de control alimentados con comida chow.
La figura 20E es una gráfica de barras que muestra absorción de alimento (n = 8).
La figura 20F es una serie de gráficas de barras que muestran actividad horizontal espontánea y gasto de energía, evaluadas por la medición de consumo de oxígeno (V02) y liberación de dióxido de carbono (VC02), que se monitorearon sobre un periodo de 18 horas 6 semanas después del inicio de la intervención con dieta. El cociente respiratorio (RQ) fue calculado como la relación VC02/V02. Las gráficas de barras representan el AUC promedio. Para el RQ, las gráficas de barras representan el promedio (n = 8).
La figura 20 G es una gráfica de barras que muestra expresión de gen en BAT por PCR cuantitativo en tiempo real después de 18 semanas de intervención con dieta. Se normalizaron los niveles de mARN objetivo a niveles de m ARN 36B4 (n = 8).
La figura 20H es una gráfica que muestra adipocitos cafés primarios aislados de ratones macho C57BL/6J alimentados con comida chow se cultivaron durante 12 horas con vehículo o 3 µ? de compuesto Ih3e, y se midió el consumo de 02 al usar el analizador de flujo extracelular XF24 (Seahorse Bioscience) (n = 5). Las líneas punteadas ilustran la adición del agente de desacoplamiento FCCP a dosis sucesivas de 250 y 500 nM.
La figura 20I es una serie de fotos que son fotos representativas de manchado de rojoO (ORO) de aceite de criosecciones (panel superior) y manchado con rojo Sirius de secciones incrustadas con parafina (panel inferior) del hígado al final de la intervención con dieta. La fibrosis es indicada por la flecha.
La figura 20J es una serie de gráficas de barras que muestran contenido de 1 lípido en muestras de hígado extraídas de acuerdo con el método de Folch (n = 8).
La figura 20K y 20L es una serie de gráficas de barras que muestran niveles de plasma de enzimas de hígado (figura 20K) y lípidos (figura 20L) al final de la intervención con dieta (n = 8). Los datos son representados como el medio ± SE. Prueba t desasociada del alumno; *p ? 0.05, ratones alimentados con dieta alta en grasa en comparación con tratados con Ih3e con dieta alta en grasa; y *p ? 0.05, ratones alimentados con dieta alta en grasa contra comida chow.
La figura 21A es una gráfica que muestra el resultado de un OGTT en ratones macho C57BL6/J alimentados con comida chow y dieta alta en grasa suplementados con 30 mg/kg/d de compuesto Ih3e durante 8 semanas después del comienzo de obesidad inducida al alimentar una dieta alta en grasa durante 10 semanas. La inserción representa el AUC promedio. El peso corporal de ratones tratados con vehículo y compuesto Ih3e fue 38.08 ± 1.83 g y 32.26 ± 0.95 g, respectivamente (n = 8; p ? 0.05).
La figura 21B es una gráfica que muestra glicemia e insulinemia por ayuno (4 horas de ayuno) en ratones DIO después de 3 semanas de intervención con dieta con el compuesto Ih3e (panel superior). Niveles de insulina de plasma durante OGTT en ratones D\( (panel inferior).
La figura 21C es una gráfica que muestra el resultado de un OGTT en ratones macho db/db alimentados con comida chow de 14 semanas tratados con 30 mg/kg/d compuesto Ih3e durante 6 semanas. La inserción muestra el AUC promedio (n = 8).
La figura 21D es una gráfica que muestra glicemia e insulinemia por ayuno (4 horas) en ratones db/db después de 6 semanas de tratamiento con compuesto Ih3e (panel superior). Niveles de insulina de plasma durante OGTT en ratones DIO (panel inferior).
La figura 21E es una serie de dos gráficas de barras que muestran sensibilidad evaluada a través de velocidad de infusión de glucosa promedio a equilibrio (euglicemia) en una pinza euglicémica hiperinsulinémica (10 mU insulina/min/kg) en ratones DIO (después del comienzo de obesidad inducida al alimentar una dieta alta en grasa durante 10 semanas) después de 10 semanas de intervención con dieta con compuesto Ih3e (30 mg/kg/d) (n = 5). La evaluación de producción de glucosa de hígado y su supresión por insulina, así como la velocidad de desaparición de glucosa, se evaluó a equilibrio usando 3H-glucosa (n = 5).
La figura 21F es una serie de gráficas de barras que muestran absorción de glucosa estimulada por insulina en los tejidos indicados se midió al usar trazadores de 14C-2-desoxiglucosa (n = 5).
La figura 21G es una serie de gráficas de barras que muestran expresión de gen retratando un hígado que se realizó por PCR cuantitativo en tiempo real. Se normalizaron los niveles de mARN objetivo a niveles de 36B4 (n = 8). Los datos están representados como medio ± SE. Prueba t desasociada del Alumno; *p ? 0.05, ratones tratados con dieta alta en grasa en comparación con compuesto Ih3e con dieta alta en grasa; y p ? 0.05, ratones alimentados con dieta alta en grasa contra comida chow.
La figura 22A es una serie de gráficas que muestra los resultados de un estudio en donde ratones macho TGR5+ + y TGR5"'" fueron alimentados una dieta alta en grasa durante 9 semanas, y un primero OGTT se realizó después. Entonces se suplemento dieta alta en grasa con compuesto Ih3e a 30 mg/kg/d. Un segundo OGTT se realizó 4 semanas después de iniciado el tratamiento con compuesto Ih3e. Las curvas representan tolerancia a la glucosa antes y después de 4 semanas de tratamiento con compuesto Ih3e en ratones TGR5+/* (panel izquierdo) y TGR5';~ (panel derecho). La inserción representa el AUC promedio. En ratones TGR5+ el peso corporal antes y después de tratamiento con compuesto Ih3e fue 46.86 ± 3.54 g 43.50 ± 3.47 g, respectivamente (n = 8; no estadísticamente diferente). En ratones TGR5- , el peso corporal antes y después de tratamiento con compuesto Ih3e fue 54.34 ± 2.23 g y 52.30 ± 2.72 g, respectivamente (n = 8; no estadísticamente diferente).
La figura 22B es una serie de gráficas que muestran niveles de insulina de plasma que se midieron concurrentemente durante el OGTT en DIO en ratones TGR5+/+ (panel izquierdo) y TGR5-/- (panel derecho) antes y después de tratamiento de 4 semáYias con compuesto Ih3e. La inserción representa el AUC promedio (n = 8). Los datos están representados como medio ± SE. Prueba t desasociada- del Alumno, *p ? 0.05, ratones tratados como- veh ículo en comparación con compuesto Ih3e 7.
La figura 23 es una gráfica que muestra velocidades de flujo de bilis de los . compuestos Ih3e e l¡3e en un experimento de infusión femoral a 1 pmol/min/kg durante 1 hora y velocidad de flujo de bilis en un experimento femoral como control infundiendo 3% de solución fisiológica de BSA durante 1 hora.
La figura 24 es una gráfica que muestra velocidades contra tiempo de secreción de compuesto Ih3e y tauro-lh3e en un experimento femoral a 1 pmol/min/kg durante 1 hora.
La figura 25 es una gráfica que muestra velocidades contra tiempo de secreción de compuesto I i 3 e y tauro-M3e en experimento femoral a 1 pmol/min/kg durante 1 hora.
La figura 26 es una gráfica que muestra el compuesto Ih3e y sus metabolitos principales identificados en muestras de bilis recolectadas durante el experimento de infusión femoral. Los datos son registrados como valores de área absolutos.
La figura 27 es una visualizacion en zoom de la figura 26.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los detalles de una o más modalidades de la invención se establecen en la descripción acompañante a continuación. Aunque se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a aquellos descritos en la- presente, en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción. En la especificación, las formas singulares también incluyen el plural a menos que el contexto claramente dicte lo contrario. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la cual pertenece esta invención. En el caso de conflicto, la presente especificación controlará.
Definiciones Para conveniencia, ciertos términos usados en la especificación, ejemplos y reivindicaciones anexas son recolectados aquí.
El término "tratar", como se usa en la presente, significa aliviar, disminuir, reducir, eliminar, modular o mejorar, es decir, causar regresión del estado o condición de la enfermedad.
El término "prevenir", como se usa en la presente, significa detener por completo o casi por completo un estado o condición de enfermedad, de que ocurra en un paciente o sujeto, en especial cuahdo el paciente o sujeto está predispuesto a tal o en riesgo de contraer un estado o condición de enfermedad. Prevenir también puede incluir inhibir, es decir, detener el desarrollo, de un estado o condición de enfermedad, por ejemplo cuando el estado o condición de enfermedad quizá ya esté presente.
El término "6-Et,23(S)-MeCA" se refiere al compuesto Ih3e teniendo la estructura química: Alternativamente, el compuesto Ih3e también puede ser referido como ácido 6a-etilo-(23S)-metilo-3a,7a,12a-trihidroxi-5P-colan-24-oico.
Como se usa en la presente, "BA" significa ácido biliar y derivados de ácido biliar. Los ácidos biliares son ácidos carboxílicos esteroides derivados de colesterol. Los ácidos biliares primarios son ácidos cólicos y quenodesoxicólicos. En el cuerpo, estos ácidos están conjugados con glicina o taurina antes de ser secretados en la bilis.
"Alquilo" incluye grupos alifáticos saturados, incluyendo grupos alquilo de cadena recta (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo), grupos alquilo de cadena ramificada (por ejemplo, isopropilo, ter-butilo, isobutilo), grupos cicloalquilo (por ejemplo, alicíclicos) (por ejemplo, ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo), grupos cicloalquilo sustituidos con alquilo, y grupos alquilo sustituidos con cicloalquilo. En ciertas modalidades, un alquilo de cadena recta o cadena ramificada tiene seis o menos átomos de carbono en su estructura, referido como "alquilo menor" (por ejemplo, Ci-C6 para cadena recta significando 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 átomos de carbono, C3-C6 para cadena ramificada significando 3, 4, 5 ó 6 átomos de carbono). En algunos ejemplos, un alquilo de cadena recta o cadena ramificada tiene cuatro o menos átomos de carbono en su estructura. Además, los cicloalquilos tienen 3, 4, 5, 6, 7 u 8 átomos de carbono en su estructura de anillo.
El término "alquilo sustituido" se refiere a una porción de alquilo teniendo un sustituto reemplazando uno o más átomos de hidrógeno en por lo menos uno o más carbonos de la estructura de hidrocarburo. Dichos sustitutos pueden incluir, por ejemplo, alquilo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterÓciclilo, alquilarilo o una porción aromática o heteroaromática.
" A r i I o " incluye grupos con aromaticidad, incluyendo grupos aromáticos de 5 y 6 miembros "no conjugados" o de un solo anillo, que pueden incluir de cero a cuatro heteroátomos, así como sistemas "conjugados", o multicíclicos, con al menos un anillo aromático. Ejemplos de grupos arilo incluyen benceno, fenilo, pirrol, furano, tiofeno, tiazol, isotiazol, imidazol, triazol, tetrazol, pirazol, oxazol, isooxazol, piridina, pirazina, piridazina y pirimidina, y similares. Además, el término "arilo" incluye grupos arilo multicíclicos, por ejemplo, tricíclicos, bicíclicos, por ejemplo, naftaleno, benzoxazol, benzodioxazol, benzotiazol, benzoimidazol, benzotiofeno, metilenodioxifenilo, quinolina, isoquinolina, naftridina, indol, benzofurano, purina, benzofurano, deazapurina, o indolizina. Aquellos grupos arilo teniendo heteroátomos en la estructura de anillo también pueden ser referidos como "arilo heterociclos", "heterociclos", "heteroarilos" o "heteroaromáticos". El anillo aromático se puede sustituir por lo menos una posición de anillo con dichos sustitutos como se describió antes, como por ejemplo, halógeno, hidroxilo, alcoxi, alquilcarboniloxi , arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, alquilaminocarbonilo, aralquilaminocarbonilo, alquenilaminocarbonilo, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, alquenilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilarñino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, ¡mino, sulfidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, a I q u i I a r i I o o una porción aromática o heteroaromática. También se pueden fusionar o hacer puente los grupos arilo con anillos alicíclicos o heterocíclicos, que no son aromáticos en cuanto a formar un sistema multicíclico (por ejemplo, tetralina, metilenodioxifenilo).
A menos que el número de carbonos de lo contrario sea especificado, "alquilo menor" incluye un grupo alquilo, como se definió antes, pero teniendo de uno a diez, por ejemplo, de uno a seis, átomos de carbono en su estructura principal.
El término "alcoxi" o "alcoxilo" incluye grupos alquilo, alquenilo o alquinilo ligados cova lentemente a un átomo de oxígeno. Ejemplos de grupos alcoxi (o radicales de alcoxilo) incluyen grupos metoxi, etoxi, isopropiloxi, propoxi, butoxi y pentoxi.
El término "éter" incluye compuestos o porciones que contienen un oxígeno unido a dos átomos o heteroátomos de carbono diferentes. Por ejemplo, el término incluye "alcoxialquilo" que se refiere a un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo unido covalentemente a un átomo de oxígeno que está covalentemente unido a otro grupo alquilo.
El término "éster" incluye compuestos y porciones que contienen un carbono o un heteroátomo unido a un átomo de oxígeno que sé une al carbono de un grupo carbonilo. El término "éster" incluye grupos alcoxicarboxi tales como metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, propoxicarbonilo, butoxicarbonilo, pentoxicarbonilo, etc. Los grupos alquilo, alquenilo o alquinilo son como se definió antes.
El término "hidroxi" o "hidroxilo" incluye grupos con un -OH o - El término "halógeno" incluye flúor, bromo, cloro, yodo, etc. El término "perhalogenado" por lo general se refiere a una porción en donde todos los hidrógenos son reemplazados por átomos de hidrógeno.
Un "grupo aniónico", como se usa en la presente, se refiere a un grupo que está negativamente cargado a pH fisiológico. Los grupos aniónicos incluyen carboxilato, sulfato, sulfonato, sulfinato, sulfamato, tetrazolilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, o fosforotioato o equivalentes funcionales de los mismos. "Equivalentes funcionales" de grupos aniónicos deben incluir bioisoésteres, por ejemplo, bioisoésteres de un grupo carboxilato. Los bioisoésteres abarcan tanto equivalentes clásicos bioisoestéricos como equivalentes bioisoestéricos no clásicos. Los bioisoésteres clásicos y no clásicos son conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Silverman, R. B. "The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action", Academic Press, Inc.: San Diego, Calif., 1992, pp. 19-23). Otro grupo aniónico es un carboxilato.
El término "funcionalidad inestable" se refiere a un patrón de sustitución que contiene una ligadura voluble, por ejemplo, una funcionalidad o enlace que es susceptible a hidrólisis o corte bajo condiciones fisiológicas (por ejemplo, soluciones acuosas en el rango- de pH neutral). Ejemplos de funcionalidades inestables incluyen acétales y cetales.
Los términos "polimorfos de cristal" o "polimorfos" se refieren a la existencia de más de una forma de cristal para un compuesto, sal o solvato del mismo. Los polimorfos de cristal de los compuestos análogos ácidos de bilis se preparan por cristalización bajo condiciones diferentes.
El término "R-EMCA" se refiere al compuesto ácido 6a-etilo-23(R)-metilcólico teniendo la estructura: . Alternativamente, puede ser referido como ácido 6a-etilo-(23S)-metilo-3a,7a,12a-trihidroxi-5 -colan-24-oico.
Adicionalmente, los compuestos de la presente invención, por ejemplo, las sales de los compuestos, pueden existir en forma hidratada o no hidratada (el anhídrido) o como solvatos con otras moléculas solventes. Ejemplos no limitantes de hidratos incluyen monohidratos, dihidratos, etc. Ejemplos no limitantes de solvatos incluyen etanol solvatos, acetona solvatos, etc.
"Solvatos" significa formas de adición de solvente que contienen cantidades estoiquiométricas o no estoiquiométricas de solvente. Algunos compuestos tienen una tendencia a atrapavr una relación molar fija de moléculas de solvente en el estado sólido cristalino, de esta manera formando un solvato. Si el solvente es agua, el solvato for-mado es un hidrato, cuando el solvente es alcohol, el solvato formado es un alcoholato. Los hidratos se forman por la combinación de una o más moléculas de agua con una de las sustancias en donde el agua retiene su estado molecular como H20, dicha combinación siendo capaz de formar uno o más hidratos.
Se señalará que la estructura de algunos de los compuestos de la invención incluye átomos de carbono asimétricos. Se debe entender por consiguiente que los isómeros que surgen de dicha asimetría (por ejemplo, todos los enantiómeros y diaestereómeros) se incluyen dentro del alcance de la invención, a menos que se indique lo contrario. Dichos isómeros se pueden obtener en forma sustancialmente pura por técnicas de separación clásica y por síntesis estereoq u ím ica mente controlada. Los enantiómeros (configuraciones R y S) son nombrados de acuerdo con el sistema desarrollado por R.S. Cahn, C. Ingold y V. Prelog.
Además, las estructuras y otros compuestos discutidos en esta solicitud incluyen todos los isómeros atrópicos de los mismos. Los isómeros atrópicos son un tipo de estereoisómero en donde los átomos de dos isómeros están dispuestos de manera diferente en espacio. Los isómeros atrópicos deben su existencia a una rotación restringida por impedimento de rotación de grupos grandes acerca de un enlace central. Dichos isómerds atrópicos típicamente existen como una mezcla, no obstante como un resultado de avances recientes en técnicas de cromatografía, ha sido posible separar mezclas de dos isómeros atrópicos en-casos selectos.
"Compuesto estable" y "estructura estable" deben indicar un compuesto que es suficientemente robusto para sobrevivir aislamiento a un grado útil de pureza a partir de una mezcla de reacción, y formulación en un agente terapéutico eficaz.
Como se usa en la presente, el término "análogo" se refiere a un compuesto químico que es estructuralmente similar a otro pero difiere ligeramente en composición (como en el reemplazo de un átomo por un átomo de un elemento diferente o en presencia de un grupo funcional particular, o el reemplazo de un grupo funcional por otro grupo funcional). De esta manera, un análogo es un compuesto que es similar a o comparable en función y apariencia al compuesto de referencia.
Como se define en la presente, el término "derivado", por ejemplo, en el término "derivados de ácido biliar", se refiere a compuestos que tienen una estructura de anillo de 4 miembros de núcleo común, y se sustituyen con varios grupos como se describe en la presente.
El término "bioisoéster" se refiere a un compuesto que resulta del intercambio de un átomo o de un grupo de átomos con otro átomo, ampliamente similar, o grupo de átomos. El reemplazo bioisoestérico puede ser fisicoquímica o topológicamente basado. Ejemplos^ de bioisoésteres de ácido carboxílico incluyen acilo sulfonimidas, tetrazoles, sulfonatos y fosfonatos. Ver, por ejemplo, Patani y LaVoi.e, Chem. Rev. 96, 3147-3176 (1996).
"Terapia de combinación" (o "co-terapia") incluye la administración de un compuesto de la invención y por lo menos un segundo agente como parte de un régimen de tratamiento específico destinado para proveer el efecto benéfico de la co-acción de estos agentes terapéuticos (es decir, el compuesto de la invención y por lo menos un segundo agente). El efecto benéfico de la combinación incluye, pero no se limita a, co-acción farmacocinética o farmacodinámica resultando de la combinación de agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación típicamente se lleva a cabo sobre un periodo de tiempo definido (usualmente minutos, horas, días o semanas dependiendo de la combinación seleccionada). "Terapia de combinación" puede, pero por lo general no, tratar de abarcar la administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de regímenes separados de monoterapia que de manera incidental y arbitraria resultan en las combinaciones de la presente invención. "Terapia de combinación" debe abarcar la administración de estos agentes terapéuticos en una manera secuencial, es decir, en donde cada agente terapéutico se administra a un tiempo diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o por lo menos dos de los agentes terapéuticos, en una manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede lograr, por ejemplo, al administrar al sujeto una sola cápsula teniendo una relación fija de cada agente terapéutico o en múltiples cápsulas individuales para cada uno de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico se puede realizar por cualquier vía apropiada incluyendo, pero sin limitación a, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y absorción directa a través de tejidos de membrana mucosa. Los agentes terapéuticos se pueden administrar por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada se puede administrar por inyección intravenosa mientras los otros agentes terapéuticos de la combinación se pueden administrar de manera oral. Alternativamente, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos se pueden administrar oralmente o todos los agentes terapéuticos se pueden administrar por inyección intravenosa. La secuencia en donde los agentes terapéuticos son administrados no es estrechamente crítica.
"Terapia convencional" también abarca la administración de los agentes terapéuticos como se describió antes en otra combinación con otros ingredientes biológicamente activos y terapias de no fármaco (por ejemplo, tratamientos quirúrgicos o mecánicos). En donde la terapia de combinación además comprende un tratamiento de no fármaco, el tratamiento de no fármaco se puede conducir en cualquier tiempo adecuado siempre y cuando se logre un efecto benéfico de la co-acción de la combinación de los agentes terapéuticos y tratamiento de no fármaco. Por ejemplo, en vcasos apropiados, el efecto benéfico todavía se logra cuando el tratamiento de no fármaco es eliminado temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, quizás por días o incluso semanas.
Los términos "administración parenteral" y "administrado parenteralmente" como se usa en la presente se refieren a modos de administración diferentes de la administración enteral y tópica, usualmente por inyección, e incluye, sin limitación, inyección intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraq uea I , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal e intraesternal e infusión.
El término "pulmonar" como se usa en la presente se refiere a cualquier parte, tejido u órgano cuya función primaria es intercambio de gas con el ambiente externo, por ejemplo, intercambio de O2/CO2, dentro de un paciente. "Pulmonar" típicamente se refiere a los tejidos del tracto respiratorio. De esta manera, la frase "administración pulmonar" se refiere a administrar las formulaciones descritas en la presente a cualquier parte, tejido u órgano cuya función primaria es intercambio de gas con el ambiente externo (por ejemplo, boca, nariz, faringe, orofaringe, laringofaringe, laringe, tráquea, carina, bronquio, bronquiolos, alvéolos). Para propósitos de la presente invención, "pulmonar" también incluye un tejido o cavidad que sea contingente al tracto respiratorio, en particular, los senos nasales.
Una "cantidad terapéuticamente^ efectiva" de un compuesto de la invención, o una combinación de compuestos es una cantidad (cantidad o concentración) de compuesto o compuestos. En una modalidad, cuando se administra una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto a un sujeto en necesidad de tratamiento, los síntomas que surgen de la enfermedad son mejorados de inmediato o después de la administración del compuesto una o más veces. La cantidad del compuesto a ser administrado a un sujeto dependerá del trastorno particular, el modo de administración, compuestos co-administrados, si acaso, y las características del sujeto, tales como salud general, otras enfermedades, edad, sexo, genotipo, peso corporal y tolerancia a fármacos. El experto en la técnica podrá determinar dosificaciones apropiadas dependiendo de estos y otros factores.
El término "cantidad profilácticamente efectiva" significa una cantidad (cantidad o concentración) de un compuesto de la presente invención, o una combinación de compuestos, que se administra para prevenir o reducir el riesgo de una enfermedad - en otras palabras, una cantidad necesaria para proveer un efecto preventivo o profiláctico. La cantidad del presente compuesto a ser administrado a un sujeto dependerá del trastorno particular, el modo de administración, compuestos co-administrados, si acaso, y las características del sujeto, tales como salud general, otras enfermedades, edad, sexo, genotipo, peso corporal y tolerancia a fármacos. El experto en la técnica podrá determinar dosificaciones apropiada's dependiendo de estos y otros factores.
El término "reducir el riesgo de", como se usa en la presente, significa reducir la -posibilidad o probabilidad de una enfermedad del sistema nervioso central, enfermedad inflamatoria y/o enfermedad metabólica de que ocurra en un paciente, en especial cuando el paciente o sujeto está predispuesto a dicha ocurrencia.
Una "sal farmacéuticamente aceptable" o "sal" de un compuesto de la invención es un producto del compuesto que contiene un enlace iónico, y típicamente se produce al hacer reaccionar el compuesto con un ácido o una base, adecuado para administrar a un sujeto.
Como se usa en la presente, "sales farmacéuticamente aceptables" se refieren a derivados de los compuestos de la invención en donde el compuesto origen es modificado al hacer sales ácidas o base de los mismos. Ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales ácidas minerales u orgánicas de residuos básicos tales como aminas; sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos; y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario del compuesto origen formado, por ejemplo, de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Por ejemplo, dichas sales no tóxicas convencionales incluyen, pero no se limitan a, aquellas derivadas de ácidos inorgánicos y orgánicos seleccionados a partir de ácido 2-acetoxibenzoico, 2-hidroxietano sulfónico, acético, ascórbico, benceno sulfónico, benzoico, bicarbónico, carbónico, cítrico, edético, etano disulfónico, etano sulfónico, fumárico, glucoheptónico, glucónico, glutámico, glicólico, glicoliarsanílico, hexilresorcínico, hidrabámico, bromhídrico, clorhídrico, yodhidrato, hidroximaleico, hidroxinaftoico, isetiónico, láctico, lactobiónico, laurilo sulfónico, maleico, mélico, mandélico, metano sulfónico, napsílico, nítrico, oxálico, pamoico, pantoténico, fenilacético, fosfórico, poligalacturónico, propiónico, salicílico, esteárico, subacético, succínico, sulfámico, sulfanílico, sulfúrico, tánico, tartárico y tolueno sulfónico.
Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención se pueden sintetizar del compuesto origen que contiene una porción básica o ácida por métodos químicos convencionales. Por lo general, dichas sales se pueden preparar al hacer reaccionar las formas libres de ácido o base de estos compuestos con una cantidad estoiquiométrica de la base o ácido apropiado en agua o en un solvente orgánico, o en una mezcla de los dos; por lo general, se prefieren medios no acuosos como éter, etilo acetato, etanol, ¡sopropanol, o acetonitrilo. Listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edición, Mack Publishing Company, Easton, PA, EL) A, p. 1445 (1990).
La frase "farmacéuticamente aceptable" es reconocida en la técnica. En ciertas modalidades, el término incluye composiciones, polímeros y otros materiales y/o formas de dosificación que, dentro del alcance de juicio médico sano, son adecuados para usarse en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicicfad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación razonable de beneficio/riesgo.
La frase "portador farmacéuticamente aceptable" es reconocida en la técnica, e incluye, por ejemplo, materiales farmacéuticamente aceptables, composiciones o vehículos, tales como un relleno líquido o sólido, diluyente, excipiente, solvente o material encapsulante, involucrado en portar o transportar cualquier composición sujeto de un órgano, o porción del cuerpo, a otro órgano, o porción del cuerpo. Cada portador debe ser "aceptable" en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes de una composición sujeto y no perjudicial al paciente. En ciertas modalidades, un portador farmacéuticamente aceptable es no pirogénico. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de papa; (3) celulosa y sus derivados tales como carboximetilo celulosa de sodio, etilo celulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como mantequilla de cacao y ceras de supositorio; (9) aceites, tales como aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de girasol, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soya; (10) glicoles, tal como propileno glicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietileno glicol; (12) ésteres, tales como etilo oleato y etilo laurato; (13) agar; (14) agentes reguladores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógeno; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) soluciones reguladoras de fosfato; y (21) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.
Una "composición" o "composición farmacéuticamente aceptable" es una formulación que contiene un compuesto de la invención o sal, solvato, hidrato, o profármaco del mismo. En una modalidad, la composición farmacéutica está en volumen o en forma de dosis unitaria. La forma de dosificación unitaria es cualquiera de una variedad de formas, incluyendo, por ejemplo, una cápsula, una bolsa IV, una tableta, una bomba individual en un inhalador en aerosol, o un frasco. La cantidad de ingrediente activo (por ejemplo, una formulación de un compuesto de la invención o sales de la misma) en una dosis unitaria de composición es una cantidad efectiva y es variada de acuerdo con el tratamiento particular involucrado. Un experto en la técnica apreciará que a veces es necesario hacer variaciones de rutina a la dosificación dependiendo de la edad y condición del paciente. La dosificación también dependerá de la ruta de administración. Una variedad de rutas son contempladas, incluyendo oral, pulmonar, rectal, parenteral, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intranasal y similares. Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de un compuesto de esta invención incluyen polvos, aspersores, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhaladores. En otra modalidad, el compuesto activo se mezcla bajo condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable, y con cualquier conservador, regulador o propulsor que se requiera.
El término "dosis instantánea" se refiere a formulaciones de compuesto que son formas de dosificación rápidamente dispersantes.
El término "liberación inmediata" se define como una liberación de compuesto de forma de dosificación en un periodo de tiempo relativamente breve, por lo general hasta aproximadamente 60 minutos. El término "liberación modificada" se define para incluir liberación retrasada, liberación extendida y liberación a pulso. El término "liberación a pulso" es definido como una serie de liberaciones de fármaco de una forma de dosificación. El término "liberación sostenida" o "liberación extendida" es definido como liberación continua de un compuesto de una forma de dosificación sobre un periodo prolongado.
Un "sujeto" incluye mamíferos, por ejemplo, humanos, animales compañeros (por ejemplo, perros, gatos, pájaros y similares), animales de granja (por ejemplo, vacas, ovejas, cerdos, caballos, aves y similares) y animales de laboratorio (por ejemplo, ratas, ratones, conejillos de indias, pájaros y similares). Típicamente, el sujeto es humano.
Los compuestos de la invención también incluyen profármacos o derivados fisiológicamente equivalentes. Un "profármaco" o "derivado fisiológicamente equivalente" incluye una forma de precursor del fármaco que se convierte metabólicamente in vivo para producir el fármaco activo. La invención contempla además el uso de profármacos que se convierten in vivo a los compuestos moduladores de TGR5 usados en los métodos de la invención (ver, por ejemplo, R. B. Silverman, 1992, "The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action", Academic Press, capítulo 8). Dichos profármacos se pueden usar para alterar la biodistribución (por ejemplo, para permitir compuestos que típicamente no cruzarían la barrera de sangre-cerebro para cruzar la barrera de sangre-cerebro) o la fa rmacocinética del compuesto modulador de TGR5. Por ejemplo, un grupo aniónico, por ejemplo, un carboxilato, sulfato o sulfonato, se puede esterificar, por ejemplo, con un grupo alquilo (por ejemplo, un grupo metilo) o un grupo fenilo, para dar un éster. Cuando el éster es administrado a un sujeto, el éster es cortado, enzimática o no enzimáticamente, de manera reductiva o hidrolítica, para revelar el grupo aniónico. Dicho éster puede ser cíclico, por ejemplo, un sulfato o sulfona cíclico, o dos o más porciones aniónicas se pueden esterificar a través de un grupo de ligadura. Un grupo aniónico se puede esterificar con porciones (por ejemplo, ésteres de aciloximetilo) que son cortados para revelar un compuesto modulador de TGR5 intermedio que posteriormente se descompone para dar el compuesto modulador de TGR5 activo. En una modalidad, el profármaco es una forma reducida de un carboxilato, sulfato o sulfonato, por ejemplo, un alcohol o tiol, que se oxida in vivo al compuesto modulador de TGR5. Además, una porción aniónica se puede esterificar a un grupo que se transporta activamente in vivoy, o que es absorbido selectivamente por órganos objetivo.
Como se usa en la presente, el término "conjugados de amino ácido" se refiere a conjugados de los compuestos de la invención con cualquier amino ácido adecuado. Taurina ( NH( CH2 )2S 03H ) y glicina (NHCH2C02H) son ejemplos de conjugados de amino ácido. Los conjugados de amino ácido adecuados de los compuestos tienen la ventaja agregada de realzar integridad en fluidos biliares o intestinales. Los amino ácidos adecuados no están limitados a taurina y glicina. La invención abarca conjugados de amino ácido de los compuestos de la invención. Más específicamente, la invención incluye conjugados de amino ácido del compuesto Ih3e. Incluso más específicamente, la invención incluye los conjugados de taurina y glicina del compuesto Ih3e.
El término "compuestos de la invención" se refiere a compuestos teniendo las fórmulas descritas en la presente.
El término "modulador de TGR5" significa cualquier compuesto que interactúe con el receptor TGR5. La interacción no está limitada a un compuesto actuando como un antagonista, agonista, agonista parcial, o agonista inverso del receptor TGR5. En un aspecto, los compuestos de la presente invención actúan como un antagonista del receptor TGR5. En otro aspecto, los compuestos de la presente invención actúan como un agonista del receptor TGR5. En otro aspecto, los compuestos de la presente invención actúan como un agonista parcial del receptor TGR5. En otro aspecto, los compuestos de la presente invención actúan 00*1110 un agonista inverso del receptor TGR5. El perfil de un ligando, tradicionalmente, endógeno o sintético, se caracteriza por su eficacia intrínseca 'e' "originalmente descrita por Furchgott en 1966. Se usa para expresar el grado al que los ligandos diferentes producen respuestas biológicas variantes al mismo tiempo ocupando el mismo número de receptores. Por lo general, el término "agonista" significa un compuesto que realza la actividad de otra molécula o sitio receptor. Un agonista, por definición clásica, ya sea uno ortoestérico, alostérico, inverso o un co-agonista tiene una propiedad para unir al receptor, alterar su estado receptor y resultar en una acción biológica. En contraste a esto, un "antagonista" es en esencia un agonista con alta afinidad a la misma macromolécula receptora, pero con muy poca o insignificante eficacia intrínseca, y de esta manera estéricamente previene las acciones biológicas de un agonista. Como una propiedad, el antagonismo puede ser funcional o fisiológico, en donde un agonista tiene una competencia directa para el sitio receptor en efectos anteriores y opuestos vía un sistema en el último. Más específicamente, un agonista de TGR5 es un ligando receptor o compuesto que une a TGR5 y aumenta la concentración de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) por al menos 20% en células que expresan el factor". A la inversa, un antagonista de TGR5 sería un compuesto que antagonice o bloquee la actividad de un agonista, así realizando una reducción en la concentración de cAMP.
La presente invención se refiere a compuestos que tienen actividad moduladora de receptor TGR5 y su uso para tratar y/o prevenir varias enfermedades incluyendo enfermedad metabólica, enfermedad inflamatoria, enfermedad del hígado, enfermedad autoinmune, enfermedad cardiaca, enfermedad de riñon, cáncer y enfermedad gastrointestinal. Además, la presente invención se refiere a compuestos de las fórmulas descritas en la presente.
Compuestos y Composiciones En un aspecto, la invención se refiere a un compuesto de la fórmula A: (A) o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde: R! es hidrógeno, hidroxi, alquilo sustituido o no sustituido, o halógeno; R2 es hidrógeno o a-hidroxi; R3 es hidrógeno, hidroxi, NH(CH2)mS03H, o NH(CH2)nC02H; R4 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o halógeno; R5 es alquilo sustituido o no sustituido, o arilo; R6 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o R5 y R6 tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un anillo de tamaño 3, 4, 5 ó 6 átomos; R7 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o hidroxi; R8 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido; R9 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido o tomados juntos R8 y R9 forman un carbonilo; R10 es R3 o SO3H; m es un entero de 0, 1 , 2, 3, 4 ó 5; y n es un entero de 0, 1 , 2, 3, 4 ó 5. En un aspecto, cuando R5 es metilo, R, es hidroxilo, y R3 es hidroxilo o NHCH2CH2S03H, entonces R4 no es hidrógeno.
En un aspecto de la invención, RT es hidrógeno o hidroxi. Ri es hidroxi. R1 es hidrógeno. R2 es a-hidroxi. R1 es hidroxi. R1 es hidroxi y R2 es a-hidroxi. R-¡ es hidroxi y R2 es H. RT es hidroxi y R2 es H.
Por lo menos uno de R^ o R2 es hidroxi. Por lo menos uno de R^ o R2 es hidrógeno. R, y R2 son lo mismo. R-\ y R2 son cada uno a-hidroxi.
R, y R2 son cada uno hidrógeno.
En otro aspecto de la invención, R10 es R3. R3 es hidroxilo, NH(CH2)mS03H, o NH(CH2)nC02H. R3 es. hidroxilo. R3 no es hidroxilo.
R3 es NCH(CH2)mS03H. R3 es N H(CH3)mS03H y m es 2. R3 es NH(CH2)nC02H. R3 es NH(CH2)nC02H y n es 1.
En otro aspecto de la invención, R4 es hidrógeno o alquilo no sustituido. R4 es hidrógeno. R4 es alquilo no sustituido. R4 es alquilo no sustituido. R4 es metilo o etilo. R es metilo. R4 es etilo. R3 y R son lo mismo. R3 y R4 son diferentes. R3 y R4 son cada uno hidrógeno. R3 es hidroxilo y R4 es hidrógeno. R3 es NH(CH2)mS03H y R es hidrógeno. R3 es NH(CH2)mS03H , R4 es hidrógeno, y m es 2. R3 es NH(CH2)nC02H y R4 es hidrógeno. R3 es NH(CH2)nC02H, R4 es hidrógeno, y n es 1. R3 es H y R es alquilo no sustituido. R3 es OH y R es metilo. R3 es OH y R4 es etilo. R3 es OH y R es metilo.
En otro aspecto, R5 es alquilo sustituido o no sustituido. R5 está en la configuración S. R5 está en la configuración R. R5 es metilo o etilo. R5 es S-metilo. R5 es R-metilo. R5 es S-etilo. R5 es R-etilo. R5 es alquilo sustituido, sustituido con fenilo. R5 es bencilo. R5 es S-bencilo. R5 es R-bencilo. R5 es arilo. R5 es fenilo. R4 y R5 son cada uno alquilo no sustituido. R y R5 son cada uno alquilo no sustituido, en donde R5 está en la configuración S y R4 está en la configuración alfa. R y R5 son cada uno alquilo no sustituido y R es hidroxi. R4 y R5 son cada uno alquilo no sustituido y R2 es hidrógeno. R4 y R5 son cada uno alquilo no sustituido, RT es hidroxi, y R2 es hidrógeno.
En un aspecto de la invención, ,, R2, R3 y R4 son hidrógeno. R2, R3 y R4 son hidrógeno. R2 y R3 son hidrógeno. Por lo menos uno de R1, R2, R3 o R4 es hidrógeno. Por lo menos dos de R1 r R2, R3 o R4 son hidrógeno. Por lo menos tres de R R2, R3 o R son hidrógeno. Por lo menos cuatro de R R2, R3 o R son hidrógeno.
En un aspecto de la invención, Ri, R2 y R4 son hidrógeno y R3 es OH. R2 y R4 son hidrógeno y R3 es OH. R2 es hidrógeno y R3 es OH. Por lo menos uno de R,, R2 o R4 es hidrógeno y R3 es OH. Por lo menos dos de Ri, R2 o R4 son hidrógeno y R3 es OH. R,, R2 y R4 son hidrógeno y R3 es OH.
En otro aspecto de la invención, por lo menos uno de R^ o R7 es alquilo no sustituido. Por lo menos uno de Ri o R7 es metilo. Por lo menos uno de R^ o R7 es etilo. Por lo menos uno de R, o R7 es propilo. Rv es metilo. R^ es etilo. Ri es>propilo. R7 es metilo. R7 es etilo. R7 es propilo. Tanto R^ como R7 son alquilo no sustituido. Tanto Ri como R7 son- metilo. Tanto Ri como R7 son etilo. R7 es hidrógeno. R7 es hidroxi. Ri es hidrógeno. Ri es hidroxilo. Uno de R o R7 es alquilo no sustituido y el otro R, o R7 es hidrógeno. Uno de RT O R es alquilo no sustituido y el otro R^ o R7 es hidroxi. Por lo menos uno de R^ o R7 es alquilo no sustituido y R5 es alquilo sustituido o no sustituido. Por lo menos uno de Ri o R7 es metilo y R5 es metilo. R7 es hidroxi y tanto R¡ como R5 son alquilo no sustituido. R es hidroxilo y tanto R como R5 son alquilo no sustituido. Por lo menos uno de R^ o R es alquilo no sustituido y R5 es alquilo sustituido o no sustituido, además en donde R5 está en la configuración S. Por lo menos uno de Ri o R7 es alquilo no sustituido y R5 es alquilo sustituido o no sustituido, además en donde R5 está en la configuración R.
En otro aspecto, Ri es hidroxi y R7 es metilo. R- es metilo y R7 es hidroxi. R6 es alquilo no sustituido. R6 es metilo. R6 es etilo. Rs es propilo.
En otro aspecto, R8 es hidrógeno. R8 es alquilo no sustituido. R8 es metilo. R8 es etilo. R8 es propilo. R2 es a-hidroxi y R8 es alquilo no sustituido. En otro aspecto, R8 y R9 forman un carbonilo.
En un aspecto, R10 es R3. R3 es hidroxilo. Por lo menos uno de R8 o Rg es hidrógeno. R8 y R9 ambos son hidrógeno. Por lo menos uno de R8 o R9 es alquilo no sustituido. Por lo menos uno de R8 o R9 es metilo. Povr lo menos uno de R8 o R9 es etilo. En otro aspecto, R10 es S03H.
En otro aspecto de la presente . invención, cuando R2, R y R6 son cada uno hidrógeno, R3 es hidroxilo, y uno de R, y R7 es hidrógeno o hidroxilo, entonces el otro R, o R7 no es metilo. En otro aspecto, cuando R2 es a-OH; R3 es hidroxilo; R4 y R6 son cada uno hidrógeno; y uno de Ri y R7 es hidrógeno o hidroxilo, entonces el otro Ri o R7 no es metilo. En otro aspecto, la presente invención no incluye los siguientes compuestos: ácido 3a,7a-dihidroxi-7 -metilo-5P-colanoico, ácido 3a,7p-dihidroxi-7a-metilo-5P-colanoico, ácido 3a-hidroxi-7 -metilo-5 -colanoico, ácido 3a,7 ,12a-trihidroxi-7a-metilo-5 -colan-24-oico; ácido 3a,7a,12a-trihidroxi-7p-metilo-5 -colan-24-oico; y ácido 3a, 12a-dihidroxi-7e-metilo-5 -colan-24-oico.
En otro aspecto de la presente invención, cuando R3 es hidroxilo y uno de R1 y R7 es metilo y el otro R^ y R es hidrógeno o hidroxilo, entonces R2, R, y Re no son todos hidrógeno. En otro aspecto, cuando R2 es a-OH, R3 es hidroxilo, y uno de R, y R7 es metilo y el otro R1 y R7 es hidrógeno o hidroxilo, entonces R y R6 no son todos hidrógeno.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención provee un compuesto de la fórmula I: (I) o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde: es hidrógeno, o halógeno; R2 es hidrógeno o a-hidroxi; R3 es hidroxi, N H( CH2)mS03H , o NH(CH2)nC02H; R4 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o halógeno; R5 es alquilo no sustituido o sustituido, o arilo; R6 es hidrógeno o R5 y R6 tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un anillo de tamaño 3, 4, 5 ó 6 átomos; m es un entero 0, 1 , 2, 3, 4 ó 5, y n es un entero 0, 1, 2, 3, 4 ó 5. En un aspecto, cuando R5 es metilo, Ri es hidroxilo, y R3 es hidroxilo o NHCH2CH2SO3H, entonces R4 no es hidrógeno.
En un aspecto, la presente invención provee compuestos en donde R^ es hidrógeno o hidroxi. R-\ es hidroxi. R^ es hidrógeno. Rt es a-hidroxi. R^ es ß-hidroxi.
En otro aspecto, la presente invención provee compuestos en donde R1 es halógeno. R-i es flúor. Ri es a-flúor. R^ es ß-flúor. La estereoquímica de R-? en las configuraciones a y ß se muestra a continuación: configuración alfa (a-) R configuración beta (ß-) En otro aspecto, la presente invención provee compuestos en donde R2 es a-hidroxi. R2 es- hidrógeno. es ß-hidroxi y R2 es a- hidroxi. Ri es ß-hidroxi y R2 es H. R-, es a-hidroxi y R2 es H.
En otro aspecto, la presente invención provee compuestos en -donde por lo menos- uno de R-? o R2 es hidroxi. En otro aspecto, por lo menos uno dé RT O R2 es hidrógeno. R^ y R2 son lo mismo. R^ y R2 son cada uno a-hidroxi. Ri y R2 son cada uno hidrógeno.
En otro aspecto, la presente invención provee compuestos en donde R3 es hidrógeno, hidroxilo, N H ( C H 2)mS 03H , o NH(CH2)nC02H. R3 es hidroxilo. R3 no es hidroxilo. R3 es NH(CH2)mS03H. En otro aspecto, R3 es NH(CH2)mS03H y m es 2. R3 es NH(CH2)nC02H . En otro aspecto, R3 es NH(CH2)nC02H y n es 1. .
En otro aspecto, R4 es hidrógeno o alquilo. R4 es hidrógeno. R es alquilo menor. R4 es alquilo menor y el grupo alquilo menor está en la configuración alfa. R4 en la configuración alfa significa que R4 tiene la estereoquímica mostrada en la estructura a continuación.
R configuración alfa (a-) En otro aspecto, R4 es halógeno. R4 es flúor. R4 es halógeno y el halógeno está en la configuración alfa. R4 es a-flúor.
En otro aspecto, R4 es metilo o etilo. R4 es metilo. R4 es etilo. R4 es a-metilo. R4 es a-etilo. R3 y R, son lo mismo. R3 y R4 son diferentes. R3 y R4 son cada uno hidrógeno. R3 es NH(CH2)mS03H y R4 es hidrógeno. R3 es hidroxilo y R4 es hidrógeno. En otro aspecto, R3 es NH(CH2)mS03H, R4 es hidrógeno y m es 2. R3 es NH(CH2)nC02H y R es hidrógeno. En otro aspecto, R3 es NH(CH2)nC02H, R4 es hidrógeno y n es 1.
En otro aspecto, R3 es OH y R4 es alquilo. R3 es OH y R4 es alquilo menor. Alquilo menor está en la configuración alfa. R3 es OH y R4 es metilo. R3 es OH y R4 es etilo. R3 es OH y R es a-metilo. R3 es OH y R4 es a-etilo. _ En otro aspecto, R5 es alquilo no sustituido o sustituido. R5 es alquilo menor no sustituido o sustituido. R5 está en la configuración S. R5. está en la configuración R. R5 es metilo o etilo. R5 es S-metilo. R5 es R-metilo. R5 es S-etilo. R-etilo. R5 es alquilo sustituido con fenilo. R5 es alquilo menor sustituido con fenilo. R5 es bencilo. R5 es S-bencilo. R5 es R-bencilo.
En otro aspecto, R5 es arilo. R5 es fenilo.
En otro aspecto, R y R5 son cada uno alquilo no sustituido. R y R5 son cada uno alquilo menor no sustituido. R4 y R5 son cada uno alquilo no sustituido menor y R5 está en la configuración S. R y R5 son cada uno alquilo menor 'no sustituido y R4 está en la configuración alfa. En otro aspecto, R4 y R5 no son hidrógeno.
En otro aspecto, R4 y R5 son cada uno alquilo menor no sustituido y Ri es a-hidroxi. R4 y R5 son cada uno alquilo menor no sustituido y R2 es hidrógeno. R y R5 son cada uno al-quilo menor no sustituido, R1 es a-hidroxi, y R2 es hidrógeno.
En otro áspecto, R5 y R6 tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un anillo tamaño de 3, 4, 5 ó 6 átomos. R5 y R6 tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un anillo de 3 miembros. El anillo de 3 miembros tiene la siguiente estoiquioquímica : El anillo de 3 miembros tiene la siguiente estoiquioquímica: En otro aspecto, R1, R2, R3 y R4 son hidrógeno. R2, R3 y R4 son hidrógeno. R2 y R3 son hidrógeno. En otro aspecto, R1, R2 y R4 son hidrógeno y R3 es OH. R2 y R4 son hidrógeno y R3 es OH. R2 es hidrógeno y R3 es OH.
En otro aspecto, por lo menos uno de R' , R2, R3 o R4 es hidrógeno. En otro aspecto, por lo menos dos de R1 f R2, R3 o R4 son hidrógeno. En otro aspecto, por lo menos tres de R,, R2, R3 o R4 son hidrógeno. En otro aspecto, R,, R2, R3 y R son hidrógeno. En otro aspecto, por lo menos uno de R,, R2 o R4 es hidrógeno y R3 es OH. En otro aspecto, por lo memos dos de R,, R2 o R4 son hidrógeno y R3 es OH. En otro aspecto, R1 t R2 y 4 son hidrógeno y R3 es OH. En otro aspecto, la presente invención no incluye cuando R5 es metilo, R4 es hidrógeno y R2 es H u OH.
En otro aspecto de la presente invención, el compuesto se selecciona a partir de los compuestos la, Ib, le, lg, Ih, l¡, lo, Ip, Iq, Ia1, Ib1, leí, Ig1, Ih1, lil, 111, Im1, In1, lo1, Ip1, Iq1, Ia2, Ib2, Ic2, Id2, Ie2, If 2 , Ig2, Ih2, l¡2, II2, Im2, In2, lo2, Ip2, Iq2, Ia3, Ib3, Ic3, Id3, Ie3, If 3, Ig3, Ih3, I i 3 , II3, Im3, In3, Ia4, Ib4, Ic4, Id4, Ie4, If4, Ig4, Ih4, Ii4, 114, Im4, In4, Ia5, I b 5 , Ic5, Id 5, Ie5, I f 5 , Ig5, Ih5, I ¡ 5 , 115, Im5, In5, Ib3e, Ic3e, Id3e, If3e, Ig3e, Ih3e, M3e, 113 e , Im3e, In3e, Ia4e, Ib4e, Ic4e, Id4e, If4e, Ig4e, Ih4e, Ii4e, 114 e , Im4e, In4e, Ia5e, Ib5e, Ic5e, Id35e, Ie5e, If5e, Ig5e, Ih5e, I i 5 e , 115 e , Im5e, lo5, Ip5, Iq5 e Ir5.
En otro aspecto de la presente invención, el compuesto no se selecciona a partir de los compuestos Id, le, If, I d 1 , II, Im e In. En otro aspecto, el compuesto no se selecciona a partir de leí e If1.
Otro aspecto de la presente invención, incluye una composición o medicamento que comprende un compuesto de la fórmula I: 4 (I), o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, y por lo menos un excipiente * farmacéuticamente aceptable en donde Ri es hidrógeno, hidroxi o halógeno; R2 es hidrógeno o a-hidroxi; R3 es hidroxi, NH(CH2)mS03H o NH(CH2)nC02H; R4 es hidrógeno, alquilo no sustituido p sustituido, o halógeno; R5 es alquilo menor no sustituido o sustituido, o arilo; R6 es hidrógeno o R5 y R6 tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un anillo de tamaño 3, 4, 5 ó 6 átomos; m es un entero 0, 1, 2, 3, 4 ó 5; y n es un entero 0, 1, 2, 3, 4 ó 5. En otro aspecto, la presente invención incluye una composición o medicamento que comprende un compuesto de la fórmula I con la condición de que cuando R5 es metilo, R¾ es hidroxilo, y R3 es hidroxi o NHCH2CH2S03H, entonces R4 no es hidrógeno.
Otro aspecto de la invención incluye compuestos de la fórmula IA: (IA) o una sal, solvato, hidrato o pr'ofármaco del mismo, en donde: R1 es Ndrógeno, hidroxi, alquilo sustituido o no sustituido, o halógeno; R2 es hidrógeno o a-hidroxi; R3 es hidroxi, hidrógeno, NH(CH2)mS03H, o NH(CH2)nC02H; R4 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o halógeno; R5 es alquilo sustituido o no sustituido, o arilo; R6 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o R5 y R6 tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un anillo de tamaño 3, 4, 5 ó 6 átomos; R7 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o hidroxi; m es un entero 0, 1 , 2, 3, 4 ó 5; y n es un entero 0, 1 , 2, 3, 4 ó 5. En un aspecto, cuando R5 es metilo, R es hidroxilo, y R3 es hidroxi o NHCH2CH2S03H, entonces R4 no es hidrógeno.
En un aspecto, Ri es hidrógeno o hidroxi. R-? es hidroxi. R, es hidrógeno. R1 es hidroxi y R2 es a-hidroxi. R1 es hidroxi y R2 es H. RT es hidroxi y R2 es H. Por lo menos uno de R1 o R2 es hidroxi. Por lo menos uno de R o R2 es hidrógeno. R1 y R2 son lo mismo. Ri es hidroxilo y R2 es a-hidroxi. R1 y R2 son cada uno hidrógeno.
En un aspecto, R3 es hidrógeno, hidroxi, NH(CH2)mS03H, o NH(CH2)nC02H. R3 es hidroxi. R3 no es hidroxi. R3 es NH(CH2)mS03H.
R3 es NH(CH2)mS03H y m es 2. R3 es N H( CH2)nC02H . R3 es NH(CH2)nC02H y n es 1.
En otro aspecto, R es hidrógeno o alquilo no sustituido. R4 es hidrógeno. R4 es alquilo no sustituido. R es alquilo no sustituido. R4 es metilo o etilo. R4 es metilo. R4 es etilo. R3 y R4 son lo mismo. R3 y R4 son diferentes. R3 y R4 son cada uno hidrógeno. R3 es OH y R4 es hidrógeno. * En otro aspecto, R3 es N H(CH2)mS03H y R4 es hidrógeno. R3 es NH(CH2)mS02H, R4 es hidrógeno, y m es 2. R3 es NH(CH2)nC02H y R4 es hidrógeno. R3 es NH(CH2)nC02H, R es hidrógeno, y n es 1. R3 es OH y R4 es alquilo no sustituido. R3 es OH y R4 es alquilo no sustituido. R3 es OH y R es metilo. R3 es OH y R es etilo. R3 es OH y R4 es metilo.
En un aspecto, R5 es alquilo sustituido o no sustituido. R5 está en la configuración S. R5 está en la configuración R. R5 es metilo o etilo. R5 es S-metilo. R5 es R-metilo. R5 es S-etilo. R5 es R-etilo. R5 se sustituye con fenilo. R5 es bencilo. R5 es S-bencilo. R5 es R-bencilo. En otro aspecto, R5 es arilo. Por ejemplo, R5 es fenilo.
R y R5 son cada uno alquilo no sustituido. R y R5 son cada uno alquilo no sustituido, además en donde R5 está en la configuración S. R4 y R5 son cada uno alquilo no sustituido. R„ y R5 son cada uno alquilo no sustituido y RT es hidroxi. R4 y R5 son cada uno alquilo no sustituido y R2 es hidrógeno. R4 y R5 son cada uno alquilo no sustituido, R, es hidroxi, y R2 es hidrógeno.
En un aspecto, R,, R2, 3 y R4 son hidrógeno. R2, R3 y R4 son hidrógeno. R2 y R3 son hidrógeno. Por lo menos uno de R,, R2 L R3 o R4 es hidrógeno. Por lo menos dos de R T R2, R3 o R4 son hidrógeno. Por lo menos tres de R R2, R3 o R4 son hidrógeno. R|, R2, R3 y R4 es hidrógeno.
En un aspecto, R1 , R2 y R4 son hidrógeno y R3 es OH. R2 y R4 son hidrógeno y R3 es OH. R2 es hidrógeno y R3 es OH. Por lo menos uno de R1 T R2 o R4 es hidrógeno y R3 es OH. Por lo menos dos de R-i , R2 o R son hidrógeno y R3 es OH. Todos de R1 T R2 y R4 son hidrógeno y R3 es OH.
En otro aspecto, por lo menos uno de R1 o R7 es alquilo no sustituido. Por lo menos uno de R^ o R7 es metilo. Por lo menos uno de R1 o R7 es etilo. Por lo menos uno de R, o R7 es propilo. Tanto R^ como R7 son alquilo no sustituido. Tanto como R7 son metilo. Tanto R1 como R7 son etilo. R, y R7 son lo mismo. R, y R7 son diferentes. R7 es hidrógeno. R7 es hidroxi. Uno de Ri o R7 es alquilo no sustituido y el R, o R7 restante es hidrógeno. Uno de R! o R7 es alquilo no sustituido y el R1 o R7 restante es hidroxi. Por lo menos uno de R1 o R7 es alquilo no sustituido y R5 es alquilo no sustituido o sustituido. Por lo menos uno de R o R7 es metilo y R5 es metilo.
Tanto RÍ como R5 son alquilo no sustituido y R7 es hidroxi. Tanto R7 como R5 son alquilo no sustituido y R1 es hidroxi. R^ o R7 es alquilo no sustituido y R5 es alquilo no sustituido o sustituido además en donde R5 está en la configuración S. R1 o R7 es alquilo no sustituido y R5 es alquilo no sustituido o sustituido, además en donde R5 está en la configuración R.
En otro aspecto, R, es hidroxi y R7 es metilo. R^ es metilo y R7 es hidroxi. R6 es alquilo no sustituido. R6 es metilo. R6 es etilo. R2 y R6 son cada uno hidrógeno. R2 y R6 son hidrógeno y R5 es alquilo no sustituido. R2 y R6 son hidrógeno, R5 es alquilo no sustituido, y por lo menos uno de Ri o R7 es alquilo no sustituido.
En un aspecto, el compuesto se selecciona a partir de los compuestos Ia6, Ib6, Ic6, I g 6 , I h 6 , Ii6, I06, Ip6, I q 6, Ia7, Ib7, Ic7, Ig7, Ih7, l¡7, II7, Im7, In7, lo7, Ip7, Iq7, Ia8, Ib8, Ic8, I d 8 , Ie8,. If8, Ig8, Ih8, liS, II8, Im8, In8, I08, Ip8, I q 8 , Ia9, I b 9 , Ic9, Id9, Ie9, If 9 , Ig9, Ih9, l¡9, II9, Im9, In9, Ia10, Ib10, Ic10, Id19, Ie10, If 10 , I g 10, I h 10 , l i 10 , 1110, Im10, In10, la 11 , I b 11 , Ic11, Id11, I e 11 , If11, I g 11 , I h 11 , I i 11 , 1111, Im11, In11, Ia9e, Ib9e, Ic9e, Id9e. Ie9e, If9e, Ig9e, Ih9e, Ii9e, Il9e, Im9e, In9e, Ia10e, Ib10e, Ic10e, Id10e, Ie10e, If10e, Ig10e, Ih10e, IMOe, IMOe, Im10e, In10e, Ia11e, Ib11e, Ic11e, Id11e, Ie11e, If 11 e, Ig11e, Ih11e, I i 11 e , I111 e , Im11e e In11e.
En otro aspecto de la presente invención, cuando R2, R4 y R6 son cada uno hidrógeno, R3 es hidroxilo, y uno de R-¡ y R7 es hidrógeno o hidroxilo, entonces el otro R- O R7 no es metilo. En otro aspecto, cuando R2 es a-OH; R3 es hidroxilo; R4 y R6 son cada uno hidrógeno; y uno de R^ y R7 es hidrógeno o hidroxilo, entonces el otro R1 o R7 no es metilo. En otro aspecto, la presente invención no incluye los siguientes compuestos: ácido 3a,7a-dihidroxi-7 -metilo-dß-colanoico, ácido 3a,7 -dihidroxi-7a-metilo-5 -colanoico, ácido 3a- hidroxi-7£-meti!o-5 -colanoico, ácido 3a,7P,12a-trihidroxi-7a-metilo-53-colan-24-oico; ácido 3a,7a,12a-trihidroxi-7P-metilo-5p-colan-24-oico; y 3a, 12a-di idroxi-7e-metilo-5 -colan-24-oico.
En otro aspecto de la presente invención, cuando R3 es hidroxilo y uno de R^ y R7 es metilo y el otro R, y R7 es hidrógeno o hidroxilo, entonces R2, R4 y 6 no todos son hidrógeno. En otro aspecto, cuando R2 es a-OH, R3 es hidroxilo y uno de R, y R7 es metilo y el otro R y R7 es hidrógeno o hidroxilo, entonces R y R6 no son hidrógeno.
Otro aspecto de la invención incluye una composición o medicamento que comprende un compuesto de la fórmula IA: (IA), o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable en donde: Ri es hidrógeno, hidroxi, alquilo sustituido o no sustituido o halógeno; R2 es hidrógeno o u-hidroxi; R3 es hidroxi, NH(CH2)mS03H, o NH(CH2)nC02H ; R4 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o halógeno; R5 es alquilo sustituido o no sustituido, o arilo; R6 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o R5 o R6 tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un anillo de tamaño 3, 4, 5 ó 6 átomos; R7 es hidrógeno; alquilo sustituido o no sustituido, o hidroxi; y m es un entero 0, 1, 2, 3, 4 ó 5; y n es un entero 0, 1 , 2, 3, 4 ó 5.
En un aspecto de la invención, cuando R5 es metilo, Ri es hidroxilo, y R3 es hidroxilo o NHCH2CH2SO3H, entonces R4 no es hidrógeno.
Otro aspecto de la presente invención incluye un compuesto de la fórmula II: (II) o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde: Ri es hidrógeno, hidroxi, alquilo sustituido o no sustituido, o halógeno; R2 es hidrógeno o a-hidrox¡; R4 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o halógeno; R5 es alquilo sustituido o no sustituido, o arilo; R6 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o R5 y R6 tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un anillo de tamaño 3, 4, 5 ó 6 átomos; R7 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o hidroxi; y R8 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido. En un aspecto, cuando R5 es metilo y Ri es hidroxilo, entonces R4 no es hidrógeno.
En un aspecto, R1 es hidrógeno o hidroxi. R, es hidroxi. R es hidrógeno. R es ß-hidroxi. R2 es a-hidroxi. R-i es hidroxi y R2 es a-hidroxi. R1 es hidroxi y R2 es H. Por lo menos uno de R1 o R2 es hidroxi. Por lo menos uno de o R2 es hidrógeno. R^ y R2 son lo mismo. Ri es hidroxilo y R2 es a-hidroxi. R^ y R2 son cada uno hidrógeno.
En otro aspecto, R4,es hidrógeno o alquilo no sustituido. R4 es hidrógeno. R4 es alquilo no sustituido. R4 es alquilo no sustituido. R es metilo o etilo. R4 es metilo. R4 es etilo.
En un aspecto, R5 es alquilo sustituido o no sustituido. R5 está en la configuración S. R5 está en la configuración R. R5 es metilo o etilo. R5 es S-metilo. R5 es R-metilo. R5 es S-etilo. R5 es R-etilo. R5 se -sustituye con fenilo. R5 es bencilo. R5 es S-bencilo. R5 es R-bencilo. R5 es arilo. R5 es fenilo. R4 y R5 son cada uno alquilo no sustituido. R4 y R5 son cada uno alquilo no sustituido, además en donde R5 está en la configuración S. R y R5 son cada uno alquilo no sustituido y R1 es hidroxi. R4 y R5 son cada uno alquilo no sustituido y R2 es hidrógeno. R4 y R5 son cada uno alquilo no sustituido, R<\ es hidroxi y R2 es hidrógeno.
En un aspecto, R1, R2 y R4 son hidrógeno. R2 y R4 son hidrógeno. R2 es hidrógeno. Por lo menos uno de R1 ( R2 o R4 es hidrógeno. Por lo menos dos de R1, R2 o R4 es hidrógeno. Todos de Ri, R2 o R4 es hidrógeno.
En un aspecto, R, o R7 es alquilo no sustituido. R^ o R7 es metilo. R1 o R7 es etilo. R† o R7 es propilo. Tanto R! como R7 son alquilo no sustituido. R7 es hidrógeno. R7 es hidroxi. Uno de R-i o R7 es alquilo no sustituido y el R, o R7 restante es hidrógeno. Uno de R1 o R7 es alquilo no sustituido y el R, o R7 restante es hidroxi. Por lo menos uno de R! o R7 es alquilo no sustituido y R5 es alquilo sustituido o no sustituido. Por lo menos uno de Ri o R7 es metilo y R5 es metilo. R7 es hidroxi y tanto R-¡ como R5 son alquilo no sustituido. R† es hidroxi y tanto R7 como R5 son alquilo no sustituido. Por lo menos uno de R, o R7 es alquilo no sustituido y R5 es alquilo sustituido o no sustituido, además en donde R5 está en la configuración S. Por lo menos uno de Ri o R es alquilo no sustituido y R5 es alquilo sustituido o no sustituido, además en donde R5 está en la configuración R. R7 es hidroxi y tanto Ri como R5 son alquilo no sustituido, además en donde R5 está en la configuración S. R7 es hidroxi y tanto Ri como R5 son alquilo no sustituido, además en donde R5 está en la configuración R. R^ es hidroxi y tanto R7 como R5 son alquilo no sustituido, además en donde R5 está en la configuración S. Ri es hidroxi y tanto R7 como R5 son alquilo no sustituido, además en donde R5 está en la configuración R. Ri es hidroxi y R7 es metilo. R-i es metilo y R7 es hidroxi.
En otro aspecto, R6 es alquilo no sustituido. R6 es metilo. R5 es etilo. R8 es hidrógeno.
R8 es alquilo no sustituido. R8 es metilo. R8 es etilo. R2 es a-hidroxi y R8 es alquilo no sustituido.
En otro aspecto de la invención, el compuesto se selecciona a partir de los compuestos: Ia12, Ib 12, Ic12, I g 12, Ih12, Ii12, lo12, Ip12, Iq12, Ia13, Ib13, Ic13, Ig13, I h13, I i 13 , 1113, Im13, In13, lo13, Ip13, Iq13, Ia14, Ib14, Ic14, Id14, Ie14, If 1 , Ig14, Ih14, l¡14, 1114, Im14, In14, lo14, Ip14, Iq14, Ia15, Ib15, Ic15, Id15, Ie15, If 15, Ig15, I h 15 , 1 i 15 , 1115, Im15, In15, la 16, Ib16, Ic16, Id16, Ie16, If 16, I g 16, Ih16, Ii16, 1116, Im16, In16, Ia17, I b 17 , Ic17, I d 17 , Ie17, If17, Ig17, Ih17, l¡17, 1117, Im17, In17, Ia15e, Ib15e, Ic15e, Id15e, Ie15e, If15e, Ig15e, Ih15e, I i 15 e , 1115e , Im15e, In15e, Ia16e, Ib16e, Ic16e, Id16e, Ie16e, If16e, Ig16e, Ih16e, I i 16e, 1116e, Im16e, In16e, Ia17e, Ib17e, Ic17e, Id17e, Ie17e, If17e, Ig17e, Ih17e, Ii17e, 1117e , Im17e e In17e * Otro aspecto de la invención incluye una composición o medicamento que comprende un compuesto de la fórmula II: (II), o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable en donde: Ri es hidrógeno, hidroxi, alquilo sustituido o no sustituido o halógeno; R2 es hidrógeno o a-hidroxi; R es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o halógeno; R5 es alquilo sustituido o no sustituido, o arilo; R6 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o R5 y R6 tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un anillo de tamaño 3, 4, 5 0 6 átomos; R7 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido, o hidroxi; y R8 es hidrógeno o alquilo sustituido o no sustituido. En un aspecto, cuando R5 es metilo, Ri es hidroxilo, y R3 es hidroxilo o NHCH2CH2SO3H, entonces R4 no es hidrógeno.
Otro aspecto de la invención incluye un compuesto de conformidad con la fórmula III: (III) o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R1 es hidrógeno, hidroxi o halógeno; R2 es hidrógeno o a-hidroxi; R3 es hidroxi, NH(CH2)mS02H, o H(CH2)nC02H; 5 es alquilo sustituido o no sustituido, o arilo; R6 es hidrógeno o R5 y R6 tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un anillo de tamaño 3, 4, 5 ó 6 átomos; R7 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido o hidroxi; R8 es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido; Rg es hidrógeno, alquilo sustituido o no sustituido o Re y Rg tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un carbonilo; R10 es R3 o S03H; m es un entero 0, 1, 2, 3, 4 ó 5; y n es un entero 0, 1, 2, 3, 4 ó 5.
Otro aspecto de la invención incluye un compuesto de conformidad con la fórmula IIIA: (IIIA) o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R^ es hidrógeno, hidroxi o halógeno; R3 es hidroxi, NH(CH2)mS03H, o NH(CH2)nC02H; R5 es alquilo no" sustituido o sustituido, o arilo; R6 es hidrógen'o o R5 y R6 tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un anillo de tamaño 3, 4, 5 ó 6 átomos; R7 es hidrógeno, alquilo no sustituido o sustituido o hidroxi; R8 es hidrógeno, alquilo no sustituido o sustituido; R9 es hidrógeno, alquilo no sustituido o sustituido o R8 y Rg tomados junto con los carbonos a los cuales de fijan forman un carbonilo; R10 es R3 o S03H; m es un entero 0, 1 , 2, 3, 4 ó 5; y n es un entero 0, 1, 2, 3, 4 ó 5.
Un aspecto de la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde Ri es hidroxilo. Otro aspecto de la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R8 y Rg tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un carbonilo y R10 es R3. En un aspecto, R3 se selecciona a partir de hidroxi, NH(CH2)2S03H, y NHCH2C02H. En un aspecto, R3 es hidroxi. En un aspecto, R3 es NH(CH2)2S03H. En un aspecto, R3 es NHCH2C02H. Un aspecto de la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R6 es hidrógeno. Un aspecto de la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R5 es alquilo no sustituido. En un aspecto, R5 es metilo. Un aspecto de la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R5 está en la configuración S. Un aspecto de la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R5 está en la configuración S y R5 es metilo. Un aspecto - de la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R7 es hidrógeno.
Un aspecto de la invención incluye un compuesto seleccionado a partir de los compuestos: Ig3e, Ih3e, l¡3e, Ig4e, Ih4e, M4e, Ig5e, Ih5e e I i 5 e .
Otro aspecto de la invención incluye un compuesto de conformidad con la fórmula IIIB: - (IHB) o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R3 es hidroxi, NH(CH2)mS03H, o H( CH2)nC02H ; R5 es alquilo no sustituido o sustituido, o arilo; R8 es hidrógeno, alquilo no sustituido o sustituido; R9 es hidrógeno, alquilo no sustituido o sustituido o R8 y g tomados junto con el carbono al cual se fijan forman un carbonilo; Ri0 es R3 o S03H; m es un entero 0, 1, 2, 3, 4 ó 5; y n es un entero 0, 1, 2, 3, 4 ó 5. Un aspecto de la invención incluye un compuesto o una sal, solvato., hidrato o profármaco del mismo, en donde R5 es alquilo no sustituido. En un aspecto, R5 es metilo. Un aspecto de la invención incluye un compuesto o sal, solvato, hidrato o profármacovdel mismo, en donde R5 está en la configuración S. Un aspecto de la invención incluye un compuesto o sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R8 y R9 tomados junto con el carbono al cual se fijan forman un carbonilo. Un aspecto de la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R10 es R3. En un aspecto, R3 se selecciona a partir de hidroxi, NH(CH2)2S03H, y NHCH2C02H. En un aspecto, R3 es hidroxi. En un aspecto, R3 es NH(CH2)2S03H. En un aspecto, R3 es NHCH2C02H.
Otro aspecto de la invención incluye un compuesto de conformidad con la fórmula IIIC: (IIIC) o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R3 es hidroxi, N H( CH2)mS03H , o NH(CH2)nC02H; R5 es alquilo no sustituido o sus-tituido, o arilo; m es un entero 0, 1, 2, 3, 4 ó 5; y n es un entero 0, 1, 2, 3, 4 ó 5. Un aspecto de la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R3 se selecciona a partir de hidroxi, NH(CH2)2S03H, y NHCH2C02H. En un aspecto, R3 es hidroxi. En un aspecto, R3 es NH(CH2)2S03H. En un aspecto, R3 es NHCH2C02H. Un aspecto de la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R5 es alquilo no sustituido. En in aspecto, R5 es metilo. Un aspecto de la invención incluye un compuesto o sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R5 está en la configuración S. Un aspecto de la invención incluye un compuesto o sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R5 está en la configuración S y R5 es metilo.
Otro aspecto de la invención incluye un compuesto de conformidad con la fórmula IV: (IV) o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde: Rt es hidrógeno, hidroxi, o halógeno; R2 es hidrógeno o a-hidroxi; R3 es hidroxi, NH(CH2)mS03H, o NH(CH2)nC02H; R5 es alquilo no sustituido o sustituido, o arilo; R6 es hidrógeno o R5 y R6 tomados junto con los carbonos a los cuales se fijan forman un anillo de tamaño 3, 4, 5 ó 6 átomos; m es un entero 0, 1, 2, 3, 4 ó 5; y n es un entero 0, 1, 2, 3, 4 ó 5.
En un aspecto, la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde Ri es hidroxi. En otro aspecto, la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde es alfa hidroxi. En un aspecto, la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde RT es beta hidroxi. En un aspecto, la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde Ri es metilo.
En un aspecto, la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R5 es alquilo no sustituido. En un aspecto, la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R5 es metilo. En un aspecto, la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R5 está en la configuración R. En un aspecto, la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R5 está en la configuración S.
En un aspecto, la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R6 es hidrógeno. En un aspecto, la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R2 es hidrógeno. En un aspecto, la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R2 es alfa hidroxi. En un aspecto, la invención incluye un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo, en donde R2 es hidroxilo.
Un aspecto de la invención incluye un compuesto seleccionado a partir de los compuestos: Ib3e, Ic3e, Id3e, Ie3e, If3e, Ig3e, Ih3e, l¡3e, Il3e, Im3e, In3e, Ia4e, Ib4e, Ic4e, Ie4e, If4e, Ig4e, Ih4e, l¡4e, M4e, Im4e, In4e, Ia5e, Ib5e, Ic5e, Id5e, Ie5e, If5e, Ig5e, Ih5e, l¡5e, Il5e, Im5e, In5e, Ia9e, Ib9e, Ic9e, Id9e, le9e, If9e, Ig9e, Ih9e, Ii9e, Il9e, Im9e, In9e, Ia10e, Ib10e, Ic19e, Id10e, If10e, Ig10e, Ih10e, I i 1 Oe, IMOe, Im10e, In10e, Ia11e, Ib11e, Ic11e, Id11e, Ie11e, If 11 e, Ig11e, Ih11e, Ii11e, 1111 e , Im11e, In11e, Ia15e, Ib15e, Ic15e, Id15e, Ie15e, If15e, Ig15e, Ih15e, Ii15e, IM5e, Im15e, In15e, Ia16e, Ib16e, Ic16e, Id16e, Ie16e, If 16e, Ig16e, Ih16e, Ii16e, 1116e , Im16e, In16e, Ia17e, Ib17e, Ic17e, Id17e, Ie17e, If17e, Ig17e, Ih17e, Ii17e, Il17e, Im17e e In17e. invención incluye el compuesto Ih3e o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo. En un aspecto, la invención incluye el conjugado de taurina del compuesto Ih3e: o una sal, solvato hidrato o profármaco del mismo. En un aspecto, incluye el conjugado de glicina del compuesto Ih3e: > o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo.
Un aspecto de la invención incluye los compuestos Ib3e, Ic3e, Id3e, If3e, Ig3e, Ih3e, I i 3 e , M3e, Im3e, In3e, Ia4e, Ib4e, Ic4e, Id4e, Ie4e, If4e, Ig4e, Ih4e, I i 4 e , Il4e, Im4e, In4e, Ia5e, Ib5e, Ic5e, Id5e, Ie5e, If5e, Ig5e, Ih5e, I i 5 e 115 e , Im5e e In5e Un aspecto de la invención incluye los compuestos Ia9e, Ib9e, Ic9e, Id9e, Ie9e, If9e, Ig9e, Ih9e, Ii9e, M9e, Im9e, In9e, Ia10e, Ib10e, Ic10e, Id10e, Ie10e, IHOe, Ig10e, Ih10e, Ii10e, IMOe, Im10e, In10e, Ia11e, Ib11e, Ic11e, Id11e, If 11 e, Ig11e, Ih11e, I ¡ 11 e, 1111 e , Im11 e e In11 e.
Un aspecto de la invención incluye los compuestos Ia15e, Ib15e, Ic15e, Id15e, Ie15e, If15e, Ig15e, Ih15e, Ii15g, H15g, Im15e, In15e, la16e, Ib16e, Ic16e, Id16e, Ie16e, If16e, Ig16e, Ih16e, I i 16e, M16e, Im16e, In16e, Ia17e, Ib17e, Ic17e, Id17e, Ie17e, If17e, Ig17e, Ih17e, Ii17e, 1117e , Im17e e In17e.
En un aspecto, la invención incluye un compuesto de la invención, en donde el compuesto es una sal farmacéuticamente aceptable.
Un aspecto de la invención incluye una composición que comprende un compuésto de la invención o una sal, solvato, hidrato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
- La presente invención también incluye compuestos radiomarcados de la invención. Los compuestos radiomarcados se pueden preparar usando técnicas convencionales. Por ejemplo, los compuestos radiomarcados de la invención se pueden preparar al hacer reaccionar el compuesto de la invención con gas de tritio en presencia de un catalizador apropiado para producir compuestos radiomarcados teniendo las fórmulas descritas en la presente. En una modalidad, los compuestos de la invención son tritiados.
Usos y Métodos La invención incluye el uso de un compuesto o una sal, solvato, hidrato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo, en la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad en un sujeto. La invención también incluye un método de tratar o prevenir enfermedad en un sujeto al administrar un compuesto de la invención o una sal, hidrato o profármaco farmacéuticamente aceptable del mismo.
Un aspecto de la invención incluye el uso o método, en donde la enfermedad se selecciona a partir de enfermedad metabólica, enfermedad inflamatoria, enfermedad del hígado, enfermedad autoinmune, enfermedad cardiaca, enfermedad de riñon, cáncer y enfermedad gastrointestinal.
En un aspecto, la invención incluye una enfermedad metabólica seleccionada a partir de obesidad, diabetes, diabesidad, síndrome metabólico, resistenc-ia a insulina, incluyendo resistencia a insulina pre-diabética , hipertensión y dislipidemia. En un aspecto, la enfermedad metabólica es obesidad. En otro aspecto, la enfermedad metabólica es diabetes. En un aspecto, la diabetes se selecciona a partir de pre-diabetes y diabetes tipo II. En un aspecto, la enfermedad metabólica es síndrome metabólico. En un aspecto, la enfermedad metabólica es resistencia a insulina. En un aspecto, la enfermedad metabólica es dislipidemia. En un aspecto, la enfermedad metabólica es diabesidad. El término "diabesidad" se refiere a una condición en donde el sujeto tiene tanto diabetes como peso excesivo.
En un aspecto, la invención incluye una enfermedad inflamatoria seleccionada a partir de alergia, osteoartritis (OA), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), apendicitis, asma bronquial, pancreatitis, sarpullido alérgico y psoriasis.
En un aspecto, la invención incluye una enfermedad autoinmune seleccionada a partir de artritis reumatoide, esclerosis múltiple y diabetes tipo I.
En un aspecto, la invención incluye una enfermedad gastrointestinal seleccionada a partir de enfermedad del intestino inflamatorio (enfermedad de Crohn, colitis ulcerante), síndrome de intestino corto (colitis posterior a radiación), colitis microscópica, síndrome del intestino irritable (mala absorción) y crecimiento excesivo bacteriano.
En un aspecto, la invención incluye enfermedad de riñon seleccionada a partir de nefropatía diabética, fallo renal- crónico, nefritis glomerular, nef rosclerosis hipertensa, glomerulonefritis crónica, glumerolopatía de trasplante crónica, nefritis intersticial crónica y enfermedad de riñon polisístico.
En un aspecto, la invención incluye cáncer seleccionado a partir de cáncer colorectal, cáncer de hígado, carcinoma heptacelular, carcinoma de colangio, cáncer renal, cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer de próstata e insulanoma.
En un aspecto, la invención incluye enfermedad del hígado seleccionada a partir de esteatohepatitis no alcohólica, enfermedad del hígado graso no alcohólico, hepatitis viral crónica, enfermedad del hígado alcohólico, hepatitis inducida por fármaco, hemocromatosis, cirrosis biliar primario, colangitis esclerosa primaria, hipertensión portal, desaturación biliar, enfermedad de Gaucher, enfermedad de Wilson, deficiencia de a 1 -antitripsina, nutrición parenteral total (TPN), colelitiasis, colestasis asociada con TPN y sepsis.
En un aspecto, la invención incluye el eritematoso de enfermedad autoinmune.
En un aspecto, la invención incluye enfermedad cardiaca seleccionada a partir de fallo al corazón congestivo, infarto al miocardio, aterosclerosis, pectoris de angina, árterioesclerosis y enfermedad cerebrovascular (hemorragia, embolia, infarto cerebrovascular).
En un aspecto, la invención incluye un uso-o método, en donde el compuesto de la invención es un agonista de TGR5. En un aspecto, la relación de selectividad de TGR5 EC50 a FXR EC50 es menos de 0.05.
En un aspecto, la invención incluye un uso o método, en donde el compuesto o composición se administra al sujeto de manera oral, parenteral, intravenosa o tópica. En un aspecto, el sujeto es humano.
Un aspecto de la invención incluye un uso o método que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la invención. En un aspecto, la invención incluye un uso o método que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo. La presente invención incluye un uso o método que comprende administrar a un sujeto una cantidad profilácticamente efectiva del compuesto de la invención.
Los compuestos y composiciones de la presente invención se pueden administrar por varias rutas, por ejemplo, oral, subcutánea, intramuscular, intravenosa o intraperitoneal. Las rutas de administración referidas de las composiciones farmacéuticas son oral, subcutánea e intravenosa a dosis diarias de aproximadamente 0.01-5000 mg, preferiblemente 5-500 mg, del ligando FXR para un humano adulto de 70 kg por día. La dosis apropiada se puede administrar en una única dosis diaria o como dosis divididas presentadas a intervaíos apropiados, por ejemplo como dos, tres, cuatro o más subdosis por día.
Para preparar composiciones farmacéuticas que contienen un compuesto - de la invención, se usan portadores inertes y farmacéuticamente aceptables. El portador farmacéutico puede ser sólido ó líquido. Las preparaciones en forma sólida incluyen, por ejemplo, polvos, tabletas, gránulos dispersables, cápsulas, pildoras y supositorios. Un portador sólido puede ser una o más sustancias que también pueden actuar como diluyentes, agentes saborizantes, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspensión, aglutinantes, o agentes desintegrantes de tableta; también puede ser un material encapsulante.
En polvos, el portador por lo general es un sólido finamente dividido que está en una mezcla con el componente activo finamente dividido, por ejemplo, un compuesto de la invención. En tabletas, el ingrediente activo se mezcla con el portador teniendo las propiedades de unión necesarias en proporciones adecuadas y compactadas en la forma y tamaño deseados.
Para preparar composiciones farmacéuticas en la forma de supositorios, una cera de baja fundición tal como una mezcla de glicéridos de ácido graso y mantequilla de cacao primero se funde y el ingrediente activo se dispersa ahí, por ejemplo, por agitación. La mezcla homogénea fundida entonces es vertida en moldes de tamaño conveniente y se dejan enfriar y solidificar.
Los polvos y tabletas contienen de preferencia entre alrededor de 5% a aproximadamente 70% en peso del ingrediente activo del compuesto de la invención. Los portadores adecuados incluyen, por ejemplo, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, lactosa, azúcar, pectina, dextrina, almidón, tragacanto, metilo celulosa, carboximetilo celulosa de sodio, una cera de baja fundición, mantequilla de cacao y similares.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluir la formulación del compuesto activo con material encapsulante como un portador que provee una cápsula en donde el compuesto de la invención (con o sin otros portadores) está rodeado por el portador, de modo que el portador de esta manera está en asociación con el compuesto. En una manera similar, también se pueden incluir pildoras. Se pueden usar tabletas, polvos, pildoras y cápsulas como formas sólidas de dosificación adecuadas para administración oral.
Las composiciones farmacéuticas líquidas incluyen, por ejemplo, soluciones adecuadas para administración oral o parenteral, suspensiones, y emulsiones adecuadas para administración oral. Las soluciones de agua estéril del componente activo o soluciones estériles del componente activo en solventes que comprenden agua, agua regulada, solución salina, PBS, etanol o propileno glicol son ejemplos de composiciones líquidas adecuadas para administración parenteral. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables como se requiere para aproximar condiciones fisiológicas, tal como agentes ajustadores y reguladores de pH, agentes ajustadores de tonicidad, agentes de humidificación, detergentes y similares.
Se pueden preparar soluciones estériles al disolver el componente activo (por ejemplo, un compuesto de la invención) en el sistema de solvente deseado, y después pasar la solución resultante a través de un filtro de membrana para esterilizarlo o, alternativamente, al disolver el compuesto estéril en un solvente previamente esterilizado bajo condiciones estériles. Las soluciones acuosas resultantes se pueden empacar para usarse como es, o liofilizadas, la preparación liofilizada siendo combinada con un portador acuoso estéril antes de la administración. El pH de las preparaciones típicamente será entre 3 y 11, más preferible de 5 a 9, y muy preferible de 7 y 8.
Las composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de la invención se pueden administrar para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones se administran en una cantidad suficiente para curar, revertir o por lo menos parcialmente reducir o arrestar los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para curar, revertir, o por lo menos parcialmente reducir o arrestar el síntoma de la enfermedad y sus complicaciones como se define como una "dosis terapéuticamente efectiva". En aplicaciones profilácticas, las composiciones se administran en una cantidad suficiente para prevenir los síntomas de la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para prevenir el síntoma de la enfermedad y sus complicaciones se define, como una "dosis profilácticamente efectiva".
La cantidad efectiva para uso terapéutico dependerá de la severidad de la enfermedad o condición y el peso y estado general del paciente, pero por lo general varía de alrededor de 0.1 mg a aproximadamente 2,000 mg del compuesto por día para un paciente de 70 kg, con dosificaciones de alrededor de 5 mg a aproximadamente 500 mg del compuesto por día para un paciente de 70 kg siendo más comúnmente usado.
En aplicaciones profilácticas, las composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de la invención se administran a un paciente susceptible a o de lo contrario en riesgo de desarrollar enfermedad, en una cantidad suficiente para retrasar o prevenir el comienzo de los síntomas de la enfermedad. Dicha cantidad es definida como una "dosis profilácticamente efectiva". En este uso, las cantidades precisas del compuesto una vez más dependen del estado de salud y peso del paciente, pero por lo general varían de alrededor de 0.1 mg a aproximadamente 2,000 mg para un paciente de 70 kg por día, más comúnmente de alrededor de 5 mg a aproximadamente 500 mg para un paciente de 70 kg por día.
Las administraciones individuales o múltiples de las composiciones se pueden llevar a cabo con niveles de dosis y patrón siendo seleccionados por el médico tratante. En cualquier caso, las formulaciones farmacéuticas deben proveer una cantidad de un compuesto de la invención suficiente para efectivamente tratar o prevenir enfermedad en el paciente.
La invención también provee equipos para prevenir o tratar enfermedad de acuerdo con el uso y método de la presente invención. En un aspecto, la invención incluye equipo para tratar o prevenir enfermedad en un sujeto, en donde el equipo comprende un compuesto de la invención o una sal, solvato, hidrato o profármaco del mismo. Los equipos típicamente incluyen una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva de un compuesto de la invención, así como material de información que contiene instrucciones de cómo dispensar la composición farmacéutica, incluyendo descripción del tipo de pacientes que pueden ser tratados, el horario (por ejemplo, dosis y frecuencia) y ruta de administración, y similares.
Algunos compuestos representativos de la invención se muestran a continuación.
Los siguientes compuestos debajo de Ia-lr5 pertenecen a por lo menos la fórmula I: Ta; Rf- a-OIL K2= I ;= O!J, Rr H, Rs= ( .?)??·. Rri=H Ib; -= a-QH, R2= H, R3- OH, RA** H, R5= (5) e, ¾=H Ic; R,= a-OH, R2- H, R3= OH, R4= H, Rs~ (R)Me, R¿=H Id: R - ß-??, 2- H, R3= OH, R4= H, R5- (5. i?) Me, R,,-l I le: R)- ß-??, R2= H, R.3= OH, R^ H, R.s* (5)Me} R^-H IT: i- ß-??, R2= K, R = OH, R4=H, R5= (R)Mc, R6= Ig: i~ a-OH, R2= -OH, OH, R - H, 5- (5,i?)Me, R6=H Ih: Ri~ a-OH, R2- a- H. R3= OH, R= H, R5= (.S) et R< =H I¡: ?? - a-OH, -OH, R^= OH, 4- I I, R5- (J¾Mee R6=H II: Ri- ß-??, R2= a-OH, R3- OH, ¾= H, Rs=. (,S,7í) c, R6=H lin: In: R5= ß-??, R2~ a-OH, R== OH, H, Rs= (/í)Me, ^=H lo: R]=» II, R2= II, R3- OH, R = H, R>- (S Mc, R6-l I Ip: Ri- H,.Rr= H, R3= OH, R^ IL >- (5) e, R*-H lq: R|= R 2= H, R3=OH! R.,= H, R5= (R)Me, R<S=H lal: R,= a-OH, R3= H, - NTHCH2CH?.SO»H, R,= H. R5= (S, ?)Me, RÓ=H Ibl: R<HI leí: R¡= a-OH. 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R,= a-Me, R5- (¾R)Me, R*=H 1e4: JT4: R¡= ß-??, R2=* H, 3« NHCF¼CH2S03H, R4= a-Me, R5= (R) e, fi-H Ig4: Rr a-OH, R2=-ct-OH, R3= HCH2CH2.SO3H: R4- a-Me, Rs~ ( ,R)Me, R*=H Ih4: R,= a-OH} R2- -OH, R3=N1 -ICH2CH2S03'Hr R^ -Me, R5= (S)Ue, R6=H Ji4; R5- a-OH, R2= a-OH, R.j- NHC112CH S0H, R4- a-Mc, R5= (R)Mt, Rg-? 114: R,= p-OH, (S,R)Mc, Ra-H lm4: R,« p-OH, R >= a-OJL R3- HCH2CH2S03Ii ?,- a-Me, Rs~ (S)Me, R6=U Iii4: R.,= ß-??, R2= a-OI 1, R3= I1C112CH2SO3I I, R4= a-Mc, s= (R)Mc, Rs=H la5: R ct-OH, Ra- H, R3= MHCH2C02H, Rvct-Mc, R5« (S )Mcf 1¾-I I !b5: ,- a-OH, R2= H, R:,= NHCH2CO:R R4=a-N4e, R5= (S)Me, R6=H lc5: Rt= a-OH, R2~H, R3= NHCH2C02R R*= a-Mc, Rs= (/)Mc} R6=H ld5: Rj~ p-OH, R>= H, R3= NHCH2C02R R,= -Mc, R,= (.y,R)M.c, Rrt=H Ic5: R, p-OH, 2- R R3«NHCH2C02Hs Rr* -Me, R5= (S)Me, R6-H IfS: R,= p-Oll, R2= R R3=NHCI ½CO2H, R*= a-Mc, R5= (K)Mc, R,-H Ig5: R,= a-OH, R2= a-OH; R3« Nl ICH2C02R R4- a-Me, R5- (.S*./ e: R,vrTi IhS: R,= a-OH, R2= a-OR R3= HCH2C02H, ^ a-Me, R -= (S)Mc, R6-| 1 Ii5: R,= a-OH, R2= a-ÜH, R3= liCH2C02H, 4- a-Me. Rs= (R)Mc, ¾~.?-? 115: R,= ß-?? J, R2= a-OH, R3= NMCJ l2CO,l 1, R= a-Mc, R5= (,S',R)Mc RA=H Jra5: Rr p-OI Í, R2- a-OJ K Ry" N.I !CJ í2C02H; R4" -Me, R5- (.5)Mc, R6-H ???5: R,= p-OH, R2= a-??', R3= NTÍCHjCO.11, R,= a- c, R5= (R)Mc, =H Tb3e: R3« a-Ol l, R2= H, OHf R4= a-Et, R5» (S)Me, R6-H lc3e: R,= a-OH, R2= H, Rj- OR Rd= a-Et, R5= (i?)Me, R<f=H M3e: R,= ß-??, R2~-= H, R3= OH, R4= a-EL Rs- (S,R)Mc: R6--l I Ie3e; Ri- ß-??, R2- I I, If3e: R,« ß-??, R>= 11, R ~ OR 4- a-Et, R5« (R)Me, R6-l 1 Ig3e> t Ih3c: R|- a-OH, R?~ a-OR R3- OR R4- a-Et, R.5« (S)Me, R6-H li3e: R,= a-OH5 R2= a-QR R3= OR R.= a-Eí, R5= (tf)Mc, R< =H I13e: R,« [3-011, R2= a-OH, R3- OJ 1, RSS a-EL R3« (6R)Mc, R6-H Ii«3e: R,= ß-??, R2= a-OR R3= OH, &»= a-Ft. R5= (S)Mes R6=H ln3e: Rr- ß-??, R - a-OM, R3- 011 R- a-Et R5= (R)Mc, R««H Ia4e. <S,.K) e, Rf-| 1 Ib e: R - a-OH, R2= H, R3= NHCHaCH2§Q)H, R = -Et, R5= (S)M¾.R*«H Ic4e: R¡= a-OH, R2= H, R3=NHCH2CJ l2S03R R4= a-Et, Rs= (7?) .e, R^-fJ Icl4c: Ri- ß-OR R2= H, R3~ NHCH2CH2SOj R4« a-Kl? R5= (*S;R)Me, R«=H Ic4c: R.= ß-??, R2= R R3= NHCH3CH2SOjH, - a-??, Rs= (S Mc, R,=H If4e: R ß~0'?, R2= R R3= NI lCRCRSOjR R4- -El, R5= (R)Me. R6=H J.g4e: R,= a-OR R -OI L R - ( 1CH2CI ]>SO.;l L R¡= a-Et, Rs= (S',R)M^ R.-11 Ih4e; R,= a-OH, R2= a-OH, a= NHCH2C.H2S03H, R4= a-El, R5= (^Mc, R ^H Ji4e: R|- a-OH: 2- a-OH. R3- NI]CI I:CiI2SO3H, Ra- a-Et, R5- (7?)M , R -H I14e: t- ß-??? R2-u ()H. R3- NHCI -I2CHÍSOJH, R,= -liL Rs= {.V,R):V1e5 R6=l-I lm4e: R,= ß-??. R2- a-Ol-L R3= NliCH2C.H2S0311, R.r a-Et, Rs- (5 Mc, =F i In4c: R,= ß-??? R2= a-OU, R3= NHCH2CH2SG3H, R,-- a-lZt: Rs= (R)Me< R¿=H Ia5e: R,« a-OIE R- I I. R3- NHCH2CO2H: R4» a-El, R5- ($,R)M<£, R( \ ihSe: R6=H Ic5c: ,= a-OW, R.2= 1-1, R3= NHC! l2C02R, R4= a-Et, R5= (R)Me, R6= I Id5e: K,= (3-OH, R2= H, R5= NHCH2C02R R a-Et, R== (S,/)Me, R6=H IcSe: R,= ß-??, R2- 11, R3~ NMCf l2C02H, R. a-Et, Rs= (5) ie? R6=l-J Jf5e: IgSc: Ri- a-OH, R2= -OIl, R3* NHCH2C02H, 4- -Et, R5= (Stf)Me, ¾ *H IhSc: a-OI L R2= -Ol l. R3=NHCH2C02R R„= a-Ets Rs= (.S)Me, R*=H I;i5e: R,= -OI 1, R2« a-OIl R-¡- NHCH2C02R, R4= a-Bt, R5- (?)Me, Rs=¾ IlSe: R,= ß-??, R2= a-OR R,= WCH2C02H, R, a-Ev, R5= (S,«)Me, R*=H IinSe: Rr- ß-??, f<2- ct~OR 3~ NHCH2C02R R»= a-Et, R<r= (5)Me» InSe: lt¾: Los siguientes compuestos In6-ln11e pertenecen a por lo menos la fórmula IA: la6: «Me TI.6: Me Ic6: R,= OI l, R2= R Ry= OH, R4= H, R= (R)Me, R6-R R7= Me Id6: Rr Me, R2- H, Ief>: Rñ Me, R2= I I. R3= OI I, R4- 11; Rs= (S)Me, R<r l, R7=OH lf6: R.,= Me R2= H, R3= OH, R.,=R R5= (?)?ß, R6-R R7=OH Ig6: R,= OH, Rr= a-OH, R3= OH, R4- II Rs- fólQMe, R<,=R R7= Me Ih6: R|= OH, R2= a-OH, R3= OH, .R*= R R5= (S)Me, R«=H. R7= Me Ii6; R,= OH, Rr= a-OH, R3= OH, R,= H, Rs= (R)Mc, R6=H, R7= Me .116: R,« Me, R2= a-OH, R3« OH, R H, Rs= (5,/?) e, R6=H, R.7=OH Ím6: R,= Me, R2= a-OH, l¾= Oí-I, R,,= 11, R5= (S)Me, R^H, R7=OH In6: R Me, R2= a-OH. R3= OH, R - I I, R5= (tf)Mc. ¾= R7=OH I06: Me Ip6: H, R2~ H, R3= OH, R4- H, R5= (S)Mef R«=H, R7= Me Jq6: R,= I i, R2= H, R3~ OH, H.» H, R5= (R)Me, Rf,=H, R7- .Me Ia7: R(- OI I, Me 11)7. R - OH, Rr= H.. R:"- NHCH2CH2SO3H, R = R R3= (.S')Me, R6= R,= Me Ic7: R,= OH, R2= H, R;,= NHCH2CH2SO3R R4- 11, R5= (R)Me, R^H, R7~ Me 1(17: |- Me, R.2« H, R3- NHCH2CH2SO3H, < H, R.5- ($,/?) Me, R**H, R7OH lc7: R,- Me, R7OH ??: r Me, 2* H, 3= NHCH:CH2SO3H, R.-R R5« (R)Me, R -R R7=OH Ig7: R,= OH, R2= a-OH, R3= NHCH2Cll2SO3H, R,= RRS= (S )Mc, R6=R Rv~ Me Ih7: R,= OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2SO3R R4- R R5= (S)Mc, R6«H, 7- Me H7: Me I!7: Rr= Me. R2= a-OH, R3= NHCH2CH2SO3H, „= H, R5= (t;/f)M.e, R6=H, R7=OH Im7: R,= Me, R2= a-OH, R3= NHCH2CH2SO3H, R»= H, R5= (S)Mc, R6-H. R7=OH ???7: R|- Me, R2= a-??, R3=NHCH2CH2S<¼H, R¿= H, Rs= (R)Mc, R^-H, R?=OH Io7: Me Ip7: R,~ H, R3- H, Rj-NHCIbCHjSOj R4= H, Rs~(.S)Me, R5-H, R7= e Iq7: R|- H, R2= H, R3= NH fcCHaSQjH, R H, R5 (R)Me, R6=H, R7- Me Ia8: R,= Olí, R2- 11 Rf NHCH2C02I1 R4- II, Rs* (i;R)Me: 6=H, R7- Me Ib8: c Ic8: R,- OH, R2= H, 3= NHCII2CO,J 1 R - II. Rs= (R)Me, R^l-I, 7- Me M8: R,« Me, R2= H, R3= NHCH2CO2H, R*- H, Rs« ( ./?)Me? C=IL R7OH IeS Rr Me.
R7OH If8: R,- Me, R2= H, R3= NHCI Í2CO2R ^H, R5= (R)M.e, ¾~I 1 Rr OH lg8: Me II18: R,= OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CO2H, R H, R5= («S')Me, R< H, 7- Me 1¡8: R,= OH, 2- a-OJ i R:,= NHCH2CO2R R4= H, R5= (fl)Me, R^R R?~ Me 118: R|- Me, R2= a-0H: 3= NHCH2CO2H. R4= H, - (.V.R)Me, R^H. R7-OI 1 !n>8: R>~ Me, 2- a-OR R3= NHCH2CO2.R R * H, 5- <S) e, R<rH, R7-OH IH8: R¡= MC, R2= a-OH, R3= NHCl I2CO R - H. Rá= (R) e, R6= l, R7=0H I08: i- I I, R2- I I, R>= NHCH2CO2H, Ra= I I. R5= (S, ?)M , R^ll, R7- e Ip8: R,= R R.2= H, R = ICII2CO2R 4- 11 R5= (S)Mc, ¿= R7= e lf|8: Me Ia9: R,- OH R2= R R = Ol-L R,= a- e, R,= (5't/?)Mc, ¾ -l I. R7- Mc Ib9: R,~ OH, R2* M, R3= OH, R = a- er R:::: (S)Me, R,= Me Ic9: R|- OH, R2= l-l, R;J= 011 R4= a- e, R - (A'jMe. R.,-11, R7= c lc!9: Ri- Me, R2= H, 3= OH, R4- a- e; 5= (../íJMc, R^-H. R7=OH Ie9: R Mc, R2~ H, R - OH, R4» cx-Me. R5« (S)Me, G, R?-OH JfV: R,= Mc, 2- H, 3- OH, Rtl= - e, R5= (iV)Me, R6=I L R7=OH Ig9: Me Hi9: Ri~ OH. R2= u-OH, R3= 011 R4= a- e, R5= ^Mc. R«-H, R7= e li9: R,= OH, R2= a-OH, Rr 011. r a-Me, R5= (R)Me, R6=! i R7~ Me 119: i- Me, Rr a-OH, R¿rH, RrOH lm9: Me, R2= a-OH, R3= OH, R a-Me, R5= (S)Me, R6=H. RrOH Jn9: Rr Me, R a-OR R OH, Rr «-Me, R5=(R)Mes R6 H, ?^OH la 10: Rr OH, R2= H, R3= jNHCH2CH2$03H, a-Me, R5= (S,R)M t Re=H. R7= Me lb]0: R,= OH, Rr H, R3= NHCH2CH2S03H, Rr a-Mc, R5= (5) e, 6-R R7= Me Id ¾ Rr OH, R2= H, r NHCH2CH2S03H, Rr a-Me. R5= (R)M , R,rl 1, R7= Me Id 10: R,= Me, R2= 11, R3« NHC112C11,S03R R a-Me, Rs= (S OMe, R6-H, R7OH TdO: R,= Me, R = l L R3= NHC1 l2CRS03R R a-Me, R5= OS'jMe, Rf)=H, R7=0H IflO: Rr Me, Rr H, R N.HCH3C.li2S03H, Rr a-Me, R5= (?)?e, ¾=?, RrOH IglO: R|- OH, R2= a-OH, Rr HCH2CH2S03H, Rr a-Me, Rr (S,R)Mc, R<rH, r Me IhlO: R,= OH, R2~ a-OH, R_r NHCH2CH2S03H, Rr a-Me, Rs= (SjMe, R«-rR R Me lili): R,= OH, R2= a-OH, R3= NHCH2CI12S03H, R4= a-Me, Rs= (/í)Me, R<rH, R7= Me 1110: R|- Me, r a-OH, R3= NHCH2CI12S03H, Rr a-Me, Rs« (S,R)Mc, Ra-TI, R7-OH ImlO: Rr Me, Rr a-OH, R3= NHCH2CH SOjH, Rr a-Me, R5= (#Mc, R<pR R7OH InlO: R, = Me, R2= a-OR R.3= NI 1CRC 12S03R r a-Me, Rs~ (7?)Me. RrR R7=OH la 11: Rr OH, R2= 11, Rr NHCH:C02H, R4= a-Me, R5=- (,SV/í)Me, R R ?= Me íb l R|- OH, R H. R3- NHCH2C02R R a-Me. Rs« (S)Mc RrH. Rr Me Icl 1 : Rr OH, Rr H, R.r NI 1C112C02I I. R,= a-Mc, R (ií)Mc, R*-H, R7= Me Idl 1; Rt= Me, R2= R NI ICH2C02l I, R4=a-Me, R5= ( ;/?)Me, rH R7OH leí 1 : R ' Me, R H, R3~ NI1CH2C0211. a-Me, R.r {S)Mc, R^l 1, R--OH ???: R,= Mc, R2= R Rr NH'CH2CO;H, Rr a-Me, R5= (/?)Mc, RrR R7=OH t¾ll: r- OH. R2= a-OH, R I1CI12C02H, R," a-Mc, R5= (5,R)Mc. ¾-?, R.~ Me Ihll: R,= OH, R2= a-OH, R3= NHCH2C02H, R4= a-Me, R5= (.V)M'e, R6=H, .?^ Me lili: (i-)Mc, Rt,-ll, 7- Me 1111: R,= Me, R2- a-OH, R3= NHCH2C02H, ,R,= a-Me? R5= (S,R)Mc, RÓ=H, R7-OH Imll: R,- Me, R2=a-OH, 3= NIIC1I2C02H. R,= a-Mc, R5= {S)Mc, R,,=H, R7-OH Inll: - Me, R a-OH, R NHCH2C07J !, Rr a-Mc, 5- (R)Mc. R(-\\, R7-OH Ia9e: R,= OH, Rr H. R3- OH, r a-??, R.r (S,R)Me. R6=H, R7- Me Jb9e: R,= OH. R2= II, 3= 011; P = a-Et, Rs= (<S) c, 6=H, R7= e Jc9e: i- OH, R2~ H, R3« OK, R4* -Et R.s« Me 'l(J9c; Ie9e: R,= Me, 2- I I, R3« OH, R4= a-Et, R5S (S)Me, R6»!-L R7«OH If9e: R,= Mc, R2= H, R3= 011, R4- a-Et Rs- (?)Me, R6=H, R7=OH !g9c: ] = OH, R2= -OH, 3= O.H, 4= a-Ei: R5= (S.Rí e, R<=! -I. R7= e Ih9c: R,= OH, R2= a-OH, R3= O1L R¡(= a-El, Rs~(S)Me, R6«HS R7- Me Ii9c: R)- OH, Mc ri9e: Rr Me, R2= ot-OH, R3= OH, R4= a-El, R5= (S\R)Mü, R«=H, R7=OH Im9e: R,** Me, In9c: R,= Me: R2= a-OH, R3= 0?, R4= a-Et, s= (f)Me, ¾=?, R7=O.H lalOe: Me IblOe: e iclOc: R,= OH: R2= H. R3= NHCH2CH2S03H; R.= -Bt, R5= (R)Me, Rr=H, R7= Me IdlOe: R,= Mc, R2= H, R3=NHCH2Ci-!2S03H, = a-Et, R5= (S,R)Mt, R¿»íl, R7=OI 1 IclOc: R,« Mc, R2= H, R3* NHCH2CH2S03H, R= a-Et, R5= (S)Me5 R*«l 1, R7-OH mOe: R}= Mc, R2= I I. R3= NHCH2CH.2S03I1, R4- a-Et, R5= (tf) c, R«=H, RrOH IglOc: R,* OH, R2= a-OH, R ~ NHCH CH S03H, R4» a-Et, R5« CS'^jMc. R$eH, R7= Me IlilOe: 01-1, e lilOc: ]~ OH, R2* -O! L R3* NI1CH2C1I,S03IL j- a-Et. R5= (/{)Me, R¿*U, R7= Mc lllOe: R|- Me, InilOc: |~ Me, R2- -OM, R3-= N1ICH2CH2S03H, a-Et, Rs» (5)Me, ¾=? ? R?"011 InlOc: R,= Me, R2= a-OH, R3= NI ICI I2CI l2SO:5l 1, R,,= a-lt, R5= (R)Mc. ¾-| 1, R-OH Jal lc: R,= OIE R2= H, R= NUCI 12C0 I I, R4= a-Et, Rs= (S.R)Me, R6¾H.Rr= Me IbJJc: R,= OH, R2= II, R3= NHCH.CC^U, R..,= a-Ei, R5= (5)Mc, R(,=H, p Mc Icl lc: Me Idl le: R,= Mc, R2= H, R3= NHCH2C02H. R- a-Et, R5= (.S',/i)Me, R6=H, RT=OH Iellc: R,= Me, R2= I R3= NHCI !2C02I !: R»* a-El, Rs** (S)Me, R6=H, R7=OH iri le: , = Me, R2= II, Rj- NHCl ]2C02H, R^a-Et, R5= (R)Mc, R6=H, R7=OH Iglle: R,= Ol 1, R2= a-O.f-1, R3= NHCH2C02l l; 4= a-Et R5~ (5, fl)Me. R<,=H, R7= Me Ihlle: Me lill c: Me Hile: R,= Me, R2= a-OH, R3= NHCH2C02 R,= a-El, Rs= (-S'./?)Me, ¾t?, R7OI I Los siguientes compuestos In12-ln17e pertenecen a por lo menos la fórmula II: Iai2: R,= OH, 2= H, R4= H, R5= (S,tf)Me. R =H, R7= Me, ¾=H I 2: Rj - OI-I, R2= H. R = I I, R5= (S)Me, R6«H, R7- Me, Rs-H Icl2: R¡= Olí R2= 1L 4- H, ¾~ (R)Mc; R6=l I, 7= Me, Ra=H Id 12: R , ---· Me, R2= H, R,= 11 Rs= (S, R)M.e, R7=OÍ L ¾=H leí 2: R,= Me, R2= II, R4= II, R5= ($)Me, R^-11, R7=0I1, RS=H if.1.2: Ri™ Me, 2~ H, R.,=H, 5- (K)Me, Re=H, R?-Oll RS=H I.gl2: R,= 011, R2= a-OH, R4-= II, R5= (J?,R)MeT R6=H, R7= Mc, R8=H Ihl2: R,= OH, R2= a-OH, R.i- 11. Rs= (S)Me; R¿=H; R7- Me, ¾-H 1112: R,= OH, R2= a-OH, R4~ H, R5= (/í)Mc5 R6=H, R.~ Mc, Rx-I I 1112: R¡- Mc, R2- a-OH, Rr* H, Rs= (S,R)Me, ¾-H, R7OH, R8=H im 12: R,= Me, R2= a-OH, R*= H. R5= (S)Me, Rf=H, R7=OH, R*=H I.nl2: R|- Me, R2= a-OH, R4- H, R5- (R)Me, R6-H, R7-OHt Rs-H Iol2: Mc, R8-M Ipl2: R,= I I, R2= H, R4- H, R?- (.S')Me, R^H, 7- Me, R^II Iql2: IaI3: R3= OH, R3= H, 4- II, R5- (.5, ?)Me, ¾=H? R7- Me, R8-H I 13 : R,= OH, R H, R,- H, R5= (S)Mc, R6=H, R7- Me, RS=H IcB: Í= Oí l R2- H, T - 11. Rs= (R)Me. R6=H, R7= Me, RS=H Idl3: R|- Me, 2- I I, R4~ H, R5~ ( R)Me, R.t~H, R7OH, Rrll lel3: R,= Mer R2= R R4- H, R$= ($) e. R**H, R =OR R8=H Ifl3: Rr Me, R2= H. R^I Rs«<tf)Me, ¾=H, R7=OH, R.¾-H Ig.13: R¡~ OH, R.2= a-OH, I, R5^ (S, ?)Me, R«rH, I " Me, R8=H lhl3: R,= OH, R2= a-OH, R4= 11, R5= (.SJMe, RÓ=H, R7= Me, R8='H Ii 13: R[- OH, R2* a-OH, Rr II, R$= (R)Me, R/;-i K R * Me, R¡rH 1113: Im13: R,= Me, 2- a-Oí l, R«= H, Rs-= (.S)Me. ^H, R7=OH, R»=H Inl3: lol3: R[= H, R.2« H, Rt- I ). R5= (S,/?)Me, R6-H, Rf- Me, R8---H Ípl3: Iql3: Rr H, R2- 11, R_ H, Rr (R)Me, R6=H, R:- Me. Rs=H Ial4: R OH, R2~ I I, r* li R5- {S,R)M<¿, ¾»H, R7« Me, Rg=H Ibl4: ]" OH, R2- li R«= H, R5= (.V)Me, Rfl=H. R7= Me, R8=H Icl4: Rt-OR R2= H, H, Rs~ (R)Me, R.--I1. R7= Me, RB-H Id 14: i* Me, R2= H. R4= H. Rs= 0S',R}Me, tr R7OH, RS=H lel4: R,= e, R.2= H, R H, R5= (5)Me, R«=H, R7=OH, R^H ?.?4: = Me, 2- H, R»=H, R5= (/?)Me, R6=H, R7OH, RS=H Igl4: R.|¾ OH, R2 a-OH, 4« H, R5 (S,R)Mc, R6*H, R?~ e, R8--1J Ihl4 R,-- OH, R2= a-OH, R,,= íi R5= (S')Mc, \{, H, Me, Rs-H 1Í14: R OH, R2~ a-OH. R - li Rs= (R)Me, R6= 1, R?- Me, R8=t I 1114: R,= Me, ¿= a-OH, R4= H, R~ (^R)Me, R^Ii R7=OH. Rs-H Iral4: ,- Me, R2- a-OH, R4- H, Rs- (S)Me, R6=Ii R7=OH, RS=H I11I4. l 14: R,= ?. R2= H, R4= H, ^ (S <)Ma, R(f H, R7- Me, RS=H Tpl4: R,= I R2= ?, l-l, 1*5= («S)Me, R6=I ?, R?= Me, RK=H Iql4; t« H, R2= H, R4- H, 5- (R)Me, R6=H, R = Me, R«=M la 1.5: R| - OH. R2--* H, R*- a-Me, R5~ (S <)Mc, R^H, R7» Me, Rs-H. Ib 15: R, = OH, Rr= II, a-Me, Rs= (SMe, R¿= R?= Me, j H Id 5: R,« OH, R2~ H, R4- a-Me, R3= <7?)Me, R«»H, R?- Me, R8~H Id 15: R$= Me, R2= H, R4= a-Me, R5= (.S:R)Me, R«=H, R7=OH, Re=H lel5:JRt= Me, R2= H, 4= a-Me, R5= (5) e, RirH, R7-OH, Re=H ??5: r= Me, R3** H, R4- a-Me, R5= (R)Me. R6=H, R7OH, Rs-I- f lgl5: Mil : R,= OH, R2= a-OH, R = a-Me, R,= (.V)Me, R6=H, R7= Me, R«=H I¡15: Ri- OH, R2= a-OH, R4» a-Me, R3~ (?)??, R&=H, R7= Me, Rs~l [ 1115: R,= Me, R,= a-OH, R, - a-Me, R¾- (&tf)Me, 1 - R7=OI I, R^H InilS: R,= Me, R2= a-OH, R4= a-Me, R5= (.5) Me, Rf~H, R7OH. R8=H lnl5: Rr~Me. R2= a-OH, Í - a-Me, Rs= (R)Me, R^IL R7OH, R.s-H lal6: R,= OH, R2= H, R¿¡= a-Me, R5~ (SR)Mc, R6=H, R7= Me, R5-H Íbl6: (<S)Me, RHL R7- Me. Rg-H Icl6: R,=* OH, 2« H, R*= a-Me, R5= (R)Me, R6-H, R7= Me, Rs-H id 16: R,= Me, R2= H, a-Me, R.<= (S/?)Mc, ͽ=H, R7OH, R8=H Iel6; Rf~ Me, R2= H, ¿- a-Mc, R3= (.S'JMe, R<,-H, R7=Ol 1, R*=H Ifl6 R¡- Me, R2= H, R4- a-Me. R : (R).\k, R,«Ht R7OI 1, R:,==J l lgl.6:R}= OH, R2= a-OH, R4= a-Mc, R3= (&R)Me, R6=H, R?= Me, RH I Ih16: Ri= OH. R2- a-OH. 4- a-Me, 5* (5 Me, R6-H, R7- Me, RH I «16: R¡= OH. R2- a-OH, R,- a-Me, R5= (7?)Me, R6=H, R?- Me, Rs-H «16: R,= Me, R2« a-OH, R4~ a-Me, R5- (5.i?)Me, R -H, R7=OH, Rs^H I.ml6: i* Me, R2= a-OH, = a-Me, R5= (.S')Me. R6-H, R7-OH. Rs=H Inl6: R,= Me, R^H la 1.7: R OH. R2* H, R a-Mc, s- (S,R)Mc R^H, R7= Me, ^ ll 11)17: Rt= OH, R2= H, R a-Me, 5- (.SlMe, R6=H} 7"· Me, Icl.7: Rr OH, R2« H, R.r a-Me, R_v= (i?)Me. R6--=H, 7~ Me, Rrf ?.1?7: ,= Me, R IL R4= a-Me, Rs= (.S,R)Me, R¿=H, RrOH, R8H-Í IeJ7: R,= Me, R2- H, Rr a-Me, R (S)Me, R< H R7OI 1, RS=H 1Í.I7: Rr Me, ¾« I I, R4= a-Me, R = (R)Me, R =H, R7OI], R H Igl7: Rr OH, R2~ ot^OH, Rr a-Me, Rr (5,/?)Mc,¾=l-ls R7- Me, Re=Il Í 17: R,= OH, R2= a-OH, Rr -Me, R>= (S)Me, Rs=í I, R7- Me: R>rH Til 7: R,= OH, » a-OH, R a-Me, R5= (R)Me, R-H, R7= Me. R8=.H 1117: R,-= Me, R2= a-OH, Rr a-Me, Rs= (S,R)Mc, R^ll ??~0\ !, R«H ! Iml7: R - Me, R2= a-OH, Rr a-Me, R5* (S)Me, R6=H, R7OH, R¡rH Ínt7: R,« Me, R2= a-OH, Rr a-Me, R5-= (/?)Me, R<rH, R7=OH, R8=H. Ial5e; Rr Ol-I, 2- i i R-ñ a Et, Rr ( RjMe. Rfrf I, R7= Me, R^í G IblSe: R,= OH, R2= H, Rr a-Et, R.5= (,S')Me, R6=H, 7~ Me, R«=H IclSc: Rr OH, R2- H, Rr a-Eí, R.r (R)Me. R^R R7~ Me, R*=H Idl5e: R,= Me. r i L Rr a-Et, R5- (SWMc, R6=i I, R7=OH, Rs¡=H J.elSe: R Me, R2= H, r" a-Et, R5- (S)Me, RrH, R7--OH, Rrll rf!5e: R,= Me, Rr H, Rr a-Et, R5=(R)Me, R,.=H RvOH, R»=H IglSc: R OH, R2» a-OH, Rr «-El. Rr (S, R)Me, R6=H, R7= Me, Rril IlilSe: Rr OH, R2= a-OH, Rr a-Et. Rr [S)Mc, R6H-1, = Me, R,=H Iil5c: r OH, Rr a-OH. R_r a-Eu R:r (R)Me, R6-H, R?= Me, R«rl I 1115c: Rr Me, Rra-OH. Rr «-El. Rr (,V.R)Me, RrH R7-OI I, RJTH Jmi5e: Rr- Me, R2- a-OH* Rr a-Et. Rs= (5)Me, RrH. R7=OR R8-ÍI 1iil5e: Rr Me, Rr a-OH, Rr a-Et, Rr (i?)Me, H, RrOH, R8=H Ja16e: Rr OH, Rr H, R4- a-Ht. 5= (.V;R)Me. ¾=H; R7= Me, R,=H iblíe: R,= OH, R2= H, a-Et, R5= (-')Me, rlE R~- Me, R8=H Ic16e: R,= OH. R2= H, R= CX-EL R5- (R)Me, R*=H, Rf= Me?- R*=H IdI6e: R,= Me, R2~ H, R4~ a-Ei, 5= (£R)Me, R6«H, R7OH, Rj-H íel <íe: R ,= Mc, R2= 11, R. ct-Bt, R- <5) e, R<H 1, R7=OR RS=H Ifl6e. R,~ Me, Rf* ¾ R - a-Ht, R5= (i¾)Mc, R$=H, R7=OH, 3 H Iglóe :R,= OI i, R2= a-OR 4= a-Et, R5= (S )Mc, R6-- R7= Me, RS=H lhl6e: R|- OH, R2=a-OR 4= a-Bu R5= (S)Me, R6«H, 7- e, R8=l-1 lil 6e; R,= OH, R2= a-OH, ¾= a-BL s= ( )Me, R$=H, R7= Me, RS=H. * II 16e: R,- Me, 2= a-OR a-Et} R5- (S,R)Mc, - R7OH? RS=H Iml6e: R,= Me, R2= a-OH, 4» o.-Kt3 R3= (S) c, R6=R R7=OH, R*-H ln!6e: R. - e, R2= a-OH, ct-Bl, 5~ (jR)Me, ReHR, R7-OHs Rg-H Ial7e: R,= QH. R2= H» R4= ot-Et, R5= (S,#)Me, R^R R7= Me, R«-H Il>17e: Icl7e: Idl7e: R,~ Me, R2--= H, R4= Ct-Bt, R5=($,R)Met R6=.H, R7=OH, Rs-H Iel 7e: R,= Me, R= H, R»= a-Et, R.3« <-S)Me, R6=H, R7=OH, ¾=H IfJ7e: R,= Me, R2= H, R4= a-Et, R5= <¾)Mc, R*=H, R7OH, R8=H Igne: R,= O R2= -OH, R4- a-Et, R5= (S,R)Mc, R¿HI, R7== Me, RS=H Ih17e: R,= OH, R2« a-OH, R= a-Et, R5= (5)?¾ R< *H, R7= Mc, RS=H IÍ17e: R,= OH, R,- a-OH, ,- a-Et, R5= (R)Mc, R6-H, R-= e? R8=H IU7e: R¡" Mc, R2« a-OH, a-Hi, R5¾ (^R)Me, R^H, R?~OH. R«=ll lml7e: R,= Me, R2= a-OH, R4= a-Ei. Rs= (8)Mc, R,=OH', ^H Inl e: R, Mc. 2- a-OH. R5- a-Et, 5= (R)Mc; R,-H, R7OÍB s-H Todas las publicaciones y documentos de patente citados en la presente se incorporan a la presente por referencia como si cada dicha publicación o documento fue específica e individualmente indicado para incorporarse a la presente por referencia. La cita de publicaciones y documentos de patente no pretende ser una admisión de que cualquiera es técnica anterior pertinente, ni constituye ninguna admisión en cuanto al contenido o fecha del mismo. La invención habiendo sido descrita ahora por medio de descripción escrita, aquellos expertos en la técnica reconocerán que la invención se puede practicar en una1, variedad de modalidades y que la descripción anterior y ejemplos a continuación son para propósitos de ilustración y no limitación de las reivindicaciones que siguen.
EJEMPLO 1: SÍNTESIS DE MODULADORES DE TGR5 Los compuestos de la invención, y derivados relacionados, se pueden sintetizar por métodos conocidos en la técnica. Los métodos detallados para sintetizar estos compuestos se describen más adelante. Ver, también, WO 02/072598, WO 2004/0007521, EP 1568706 y EP 135782. En el caso del compuesto en donde es hidrógeno, R2 y R3 son hidroxi y R4 es un grupo alquilo menor, el compuesto de la fórmula (I) se puede obtener de conformidad con el siguiente esquema: Ib lo Esquema 1 (i) 3,4-DHP, p-TSA, dioxano, temperatura ambiente; (i¡) a) L DA , CH3I -78°C; b) HCI, CH3OH, temperatura ambiente; ¡ii) NaOH, CH3OH, reflujo.
Se protegió metilo quenodesoxicolanoato (1) en la posición 3 y 7 por tratamiento con 3,4-dihidro-2H-pirano en dioxano en presencia de cantidad catalítica de ácido p-toluenosulfónico (p-TSA) para dar el análogo correspondiente de 3a,7a-tetrahidropiraniloxi (2). La reacción de 2 con yoduro de metilo (o con un haluro de alquilo apropiado), a -78°C usando diisopropilamida de litio como una base y tetrahidrofurano (THF) como solvente, seguido por tratamiento con HCL metanólico dio el 23-metilo-3a,7a-di idroxi-5 -colan-24-oato de metilo correspondiente (3). La hidrólisis con álcali del éster metílico 3 y purificación por cromatografía instantánea dio el ácido 23(S)-metilo-3a,7a-dihidroxi-5 -colan-24-oico (Ib) y ácido 23( R)-metilo-3a,7a-dihidroxi-5 -colan-24-oico (le) deseados.
Preparación de ácido 23(R)- y 23(S)-metilo-3a,7a-dihidroxi-5P-cola ?-24-oico (Ib, le) a) 3a,7a-ditetrahidropiraniloxi-5p-colan-24-oato de metilo (2) Se agregó ácido p-toluenosulfónico (78 mg, 0.41 mmol), 3,4-dihidro-2H-pirano (20.1 mi, 0.098 mol) a una solución de 3a, 7a-dihidroxi-5P-colan-24-oato de metilo (1) (2.0 g, 4.9 mmol) en dioxano (6 mL). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. H20 (50 mL) entonces se agregó y la mezcla se concentró parcialmente al vacío y se extrajo con EtOAc (3 x 50 mL). Las fracciones orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (1 x 50 mL), secaron ( a2S04) y evaporaron al vacío. El residuo se purificó por cromatografía sobre columna de gel de sílice. Elución con petróleo/etilo acetato ligero 80/20 dio 2.5 g del compuesto puro 2 (90% rendimiento). 1H-NMR (CDCI3) d: 0.64 (s, 3H, CH3-18), 0.89 (s, 3H, CH3-19), 0.92 (d, 3H, CH3-2I), 3.31-3.67 (m, 4H, -CH2OCH-), 3.65 (s, 3H, C02CH3), 3.67 (m, 1H, CH-3), 3.88 (brs, 1H, CH-7), 4.67 (brs, 1H, -O-CH-O-), 4.73 (brs, IH, -O-CH-O-). b) 23(R,S)-metilo-3a,7a-dihidroxi-5 -colan-24-oato de metilo (3) Se agregó en forma de gotas litio de n-butilo (4.3 mL, 2.2 M solución en hexano) a -78°C a una solución de diisopropilamina (1.4 mL, 10.1 mmol) en THF seco (50 mL). El sistema se mantuvo a -78°C durante 30 minutos adicionales y entonces, 3a, 7a, 12a-tetrahidropiraniloxi-5 -colan-24-oato de metilo (2) (1.8 g, 3.2 mmol) disuelto en THF seco (14 mL) se agregó en forma de gotas a la mezcla. Después de 20 minutos de yoduro de metilo (1.4 mL, 22.0 mmol) disuelto en THF seco (7 mL) se agregó lentamente y la mezcla se dejó calentar a temperatura ambiente durante la nbche. Los solventes fueron eliminados al vacío y acidificados por 10% de HCI y extraídos con EtOAc (5 x 50 mL), lavados con 5% de solución de Na2S203 (2 x 50 mL), secados (-sobre Na2S04 anhídrido), filtrados y evaporados al vacío. El residuo crudo entonces fue tratado con una solución de 2N HCI en MeOH (50 mL) durante 12 horas. El residuo se evaporó al vacío y absorbido con EtOAc (100 mL), lavado con una solución de NaHC03 saturado (2 x 50 mL), secado (Na2S04) y evaporado al vacío. El residuo se purificó por cromatografía instantánea sobre gel de sílice. La elución con petróleo/etilo acetato ligero 70/30 dio 1.1 g (2.7 mmol) del compuesto puro 3 (84% de rendimiento).
H-NMR (CDCI3) d: 0.62 (s, 3H, CH3-18), 0.87 (s, 3H, CH3-19), 0.92 (d, 3H, CH3-2I), 2.38 (m, 1H, CH-23), 3.27-3.40 (m, 1H, CH-3), 3.55 (brs, 1H, CH-7), 3.63 (s, 3H, C02CH3). c) Ácido 23(/?)-metilo-3a,7a-dihidroxi-5P-colan-24-o¡co (Ib) y ácido 23(S)-metilo-3a,7a-dihidroxi-5p-colan-24-oico (le) Se disolvió 23-metilo-3a,7a-dihidroxi-53-colan-24-oato de metilo 0.97 g (2.3 mmol) en MeOH (25 ml_) y se agregó con 10% de NaOH en eOH (5.7 ml_, 14.2 mmol). La mezcla se refluyó durante 16 horas. La mezcla se acidificó con 3N HCI y extrajo con EtOAc (3 x 20 mL). Las fracciones orgánicas combinadas se lavaron con salmuera- (1 x 50 mL), secaron (Na2S04) y evaporaron al vacio. El residuo se purificó por cromatografía instantánea sobre gel de sílice. Elución con CHCI3:MeOH (95/5) dio 1.5 g (65%) de ácido 23-(S)-metilo-3a,7a-dih¡droxi-5P-colan-24-oico y 330 mg de ácido 23(R)-metilo-3a,7a-dihidroxi-5 -colan-24-oico. Ácido 23(S)-metilo-3a,7a-dihidroxi-5P-colan-24-oico (Ib): punto de fundición: 125-126°C. H-NMR (CDCI3 + CD3OD) d: 0.44 (s, 3H, CH3-18), 0.69 (s, 3H, CH3-19), 0.73-0.76 (d, 3H, CH3-21), 0.93-0.97 (d, 3H, -CH3), 2.36 (m, 1H, CH-23), 3.15-3.38 (m, 1H, CH-3), 3.62 (brs, 1H, CH-7). 13C-NMR ( CDCI3 + CD3OD) d: 11.55, 18.43, 18.87, 20.49, 22.69, 28.15, 28.57, 30.14, 32.65, 34.43, 34.61, 34.94, 35.23, 37.06, 39.17, 39.60, 80.41, 41.40, 42.57, 46.54, 50.29, 56.63, 68.24, 71.62, 179.99. Ácido 23(R)-metilo-3a,7a-dihidrox¡-5 -colan-24-oico (le): punto de fundición: 163-164°C. 1 H-N MR (CDCI3 + CD3OD) d: 0.43 (s, 3H, CH3-18), 0.65 (s, 3H, CH3-19), 0.65-0.69 (d, 3H, CH3-21), 0.83-0.86 (d, 3H, -CH3), 2.20 (m, 1H, CH-23), 3.09-3.15 (m, 1H, CH-3), 3.58 (brs, 1H, CH-7). 13C-NMR (CDC!3+CD3OD) d: 11.94, 16.40, 18.30, 20.93, 23.06, 23.89, 28.85, 30.52, 33.08, 34.16, 34.91, 35.38, 35.68, 37.14, 39.49, 39.69, 40.04, 40.17, 41.92, 43.05, 50.69, 57.10, 68.51, 72.01, 181.09.
EJEMPLO 2: PREPARACIÓN DE ÁCIDO 23(S)- Y 23( R)-M ETI LO-6a- METILO-3a,7a-DIHIDROXI-53-COLAN-24-OICO (Ib3, Ic3) Los siguientes compuestos fueron preparados por alquilación de ácido 6a-?t??????-3a,7?:^?? G??1-5ß-???3?-24-???? de conformidad con el procedimiento del ejemplo 1. Ácido 23(S)-metilo-6a-metilo-3a,7a-dihidrox¡-5p-colan-24-oico (Ib3): punto de fundición: 98-100°C. 1 H-NMR (CDCI3) d: 0.63 (s, 3H, CH3-18), 0.89 (s, 3H, CH3-19), 0.92-1.00 (m, 6H, CH3-21 y CH3-6), 1.15-1.19 (d, 3H, -CH3), 2.45-2.73 (m, 1H, CH-23), 3.31-3.52 (m, 1H, CH-3), 3.58 (brs, 1H, CH-7). 13C-NMR (CDCI3) d: 11.76, 15.72, 18.58, 18.88, 20.63, 23.11, 23.65, 28.19, 30.21, 30.47, 32.64, 33.79, 34.61, 35.42, 35.66, 37.03, 39.60, 40.01, 40.71, 42.71, 47.35, 50.44, 56.60, 72.34, 72.87, 182.37. Ácido 23(R)-metilo-3a,7a-dihidroxi-5 -colan-24-oico (Ic3): punto de fundición: 89-90°C. 1H-NMR (CDCI3 + CD3OD) d: 0.65 (s, 3H, CH3-I8), 0.88 (s, 3H, CH3-19), 0.88-0.92 (m, 3H, CH3-6), 0.95-0.99 (d, 3H, CH3-2I), 1.08-1.14 (d, 3H, -CH3), 2.35 (m, 1H, CH-23), 3.29-3.48 (m, 1H, CH-3), 3.57 (brs, 1H, CH-7). 13C-NMR (CDCI3 + CD3OD) d: 11.70, 15.66, 16.02, 18.00, 20.61, 23.09, 23.60, 28.51, 30.39, 32.61, 33.72, 33.92, 35.38, 35.65, 36.33, 39.57, 39.94, 42.77, 47.30, 50.39, 56.53, 72.22, 72.83, 180.50.
EJEMPLO 3: PREPARACIÓN DE ÁCIDO 23(A)- Y 23( S)-M ETI LO- 3a.7a.12a-TRIHIDROXI-5B-COLAN-24-OICO (1h, 1i) Los siguientes compuestos fueron preparados por alquilación de ácido 3a,7a, 12a-trihidroxi-5 -colan-24-oico de conformidad con el procedimiento del ejemplo 1. Ácido 23(S)-metilo-3a,7a, 12a-trihidroxi-5 -colan-24-oico (Ih): punto de fundición: 237-239°C. 1 H-N M R (CDCI3) d: 0.63 (s, 3H, CH3-18), 0.87 (s, 3H, CH3-19), 0.96-0.98 (m, 3H, CH3-21), 1.07-1.11 (d, 3H, -CH3), 2.44-2.73 (m, 1H, CH-23), 3.35-3.50 (m, 1H, CH-3), 3.82 (brs, 1H, CH-7), 3.95 (brs, 1H, CH-12). 13C-NMR (DMSO) d: 12.72, 17.60, 19.24, 19.24, 23.00, 23.19, 26.59, 27.78, 28.88, 30.72, 34.77, 35.22, 35.66, 37.19, 41.84, 46.19, 47.27, 49.01, 66.69, 70.88, 71.45, 178.25. Ácido 23(R)-metilo-3a,7a,12a-trihidroxi-5p-colan-24-oico (l¡): punto de fundición: 221-223°C. ?-NMR (CDCI3) d: 0.63 (s, 3H, CH3-18), 0.87 (s, 3H, CH3-19). 0.96-0.98 (m, 3H, CH3-21), 1.07-1.11 (d, 3H, -CH3), 2.44-2.73 (m, 1H, CH-23), 3.35-3.50 (m, 1H, CH-3), 3.82 (brs, 1H, CH-7), 3.95 (brs, 1H, CH-12). 13C-NMR (DMSO) d: 12.76, 16.88, 17.31, 23.04, 23.24, 26.62, 28.12, 28.94, 30.81, 33.97, 34.80, 35.28, 35.71, 37.20, 41.85, 46.29, 47.44, 66.67, 70.86, 71.45, 178.77.
EJEMPLO 4: PREPARACIÓN DE ÁCIDO 23(/?)- Y 23(S)-METILO-6a- METILO-3a,7a,12a-TRIHIDROXI-5B-COLAN-24-OICO (Ih3, l¡3) Los siguientes compuestos fueron preparados por alquilación de ácido 6a-metilo-3a,7a, 12a-trih¡droxi-5ß-colan-24-o¡co de conformidad con el procedimiento del ejemplo 1. Ácido 23(S)-met¡lo-6a-metilo-3a,7a,12a-trihidroxi-5 -dOlan-24-oico (Ih3): punto de fundición: 131-134eC. 1 H-NMR (CDCI3 + CD3OD) d: 0.65 (s, 3H, CH3-18), 0.87 (s, 3H, CH3-19), 0.97.-1.00 (m, 3H, CH3-21), 1.14-1.18 (d, 3H, -CH3), 1.23 (m, 1H, CH-6), 2.52 (m, 1H, CH-23), 3.32-3.50 (m, 1H, CH-3), 3.55 (brs, 1H, CH-7), 3.94 (brs, 1H, CH-12). 13C-NMR (CDCI3 + CD3OD) d: 12.43, 145.66, 17.62, 18.92, 22.70, 23.14, 26.21, 27.45, 28.01, 30.03, 33.44, 34.11, 34.42, 35.30, 36.71, 39.97, 40.45, 41.73, 46.45, 47.25, 72.13, 72.76, 73.01, 180.53. Ácido 23(R)-metilo-6a-metilo-3a,7a,12a-trihidroxi-5 -colan-24-oico (l¡3): punto de fundición: 109-110°C. 1 H-NMR (CD3OD) d: 0.72 (s, 3H, CH3-I8), 0.91 (s, 3H, CH3-19), 1.07-1.11 (m, 6H, -CH3 y CH3-21), 2.37-2.53 (m, 1H, CH-23), 3.15-3.42 (m, 1H, CH-3), 3.53 (brs, 1H, CH-7), 3.97 (brs, 1H, CH-12). 13C-NMR (CD3OD) d: 11.61, 15.04, 15.32, 16.15, 22.04, 22.75, 26.27, 27.62, 28.18, 29.61, 32.91, 33.74, 34.31, 35.06, 35.18, 36.56, 39.70, 40.25, 41.68, 46.19, 46.31, 71.76, 71.77, 72.62, 180.11.
EJEMPLO 5: PREPARACIÓN DE ÁCIDO 23(A)- Y 23(S)- ETILO-3a- HIDROXI-5B-COLAN-24-OICO (Ip, Iq) Los siguientes compuestos fueron preparados por alquiiación de ácido 3a-h¡droxi-5 -colan-24-oico de conformidad con el procedimiento del ejemplo 1. Ácido 23(S)-metilo-3a-hidrox1-5p-colan-24-o¡co (Ip) punto de fundición: 161-162°C. H-N M R (CDCI3 + CD3OD) d: 0.60 (s, 3H, CH3-18), 0.88 (s, 3H, CH3-19), 0.92-1.01 (m, 3H, CH3-21), 1.13-1.16 (d, 3H, -CH3), 2.55 (m, 1H, CH-23), 3.60 (m, 1H, CH-3). 13C-NMR (CDCI3 + CD3OD) d: 11.97, 18.52, 18.87, 20.73, 23.30, 24.14, 26.34, 27.10, 28.15, 30.18, 34.48, 34.50, 35.23,' 35.74, 36.06, 37.01, 40.13, 40.34, 40.74, 41.99, 42.68, 56.43, 56.75, 71.70, 181.42. Ácido 23(f?)-metilo-3a-hidroxi-5 -colan-24-oico (lq): punto de fundición: 152-153°C. 1H-NMR (CDCI3 + CD3OD) d: 0.63 (s, 3H, CH3-18), 0.89 (s, 3H, CH3-19), 0.94-1.03 (m, 3H, CH3-21), 2.45 (m, 1H, CH-23), 3.59 (m, 1H, CH-3). 13C-NMR (CD3OD) d: 11.98, 15.97, 18.00, 20.75, 23.31, 24.14, 26.34, 27.11, 28.48, 30.26, 33.68, 34.50, 35.26, 35.77, 36.15, 36.46, 39.59, 40.13, 4.036, 42.01, 42.79, 56.45, 56.76, 71.71, 181.02.
EJEMPLO 6: PREPARACIÓN DE ÁCIDO 23(S)-M ETI LO-3a,7a, 12a- TRIHIDROXI-6a-ETILO-5B-COLAN-24-OICO (Ih3e) lh3o Reactivos y condiciones: a) pTSA, MeOH, ultrasonido, cantidad, b) CH2(OCH3)2, P2O5, CHCI3, 97%. c) LDA, Mel, -78°C. d) MeOH, HCI, 45°C. e) MeOH, NaOH, 45°C, 41%. Rendimiento global: 39.7%.
Síntesis de 23(S)-metilo-3a,7a,12a-trihidroxi-6a-etilo-5p-colan-24-oato (2): A una solución de 1 (2.78 g, 6.37 mmol) en MeOH (120 mi), se agregó pTSA (0.12 g, 0.63 mmol), y la mezcla se trató con ultrasonido durante 90 minutos. La mezcla entonces se concentró bajo presión reducida, y el residuo resultante se diluyó con AcOEt (120 mi), se lavó con H20 (3x100 mi), salmuera (100 mi), se secó sobre Na2S04 anhídrido, y se concentró bajo presión reducida para dar 2 (rendimiento cuantitativo) que se usó para el siguiente paso sin purificación adicional. 1 H-NMR (CDCI3) d: 0.63 (3H, s, 18-CH3), 0.84-0.88 (6H, s, 19-CH3 + CH3CH2), 0.97 (3H, d, J = 6.62 Hz, 21-CH3), 3.30 (1H, m, 3-CH), 3.48 (3H, s, COOCH3), 3.62 (1 H, m, 7-CH), 3.97 (1H, m, 12-CH). 3a,7a,12a-trihidróxi-6a-etilo-5P-24-oato de metilo (3): A una solución de 2 (2.50 g, 5.55 mmol) en CHCI3 (60 mi) y dimetoximetano (34.10 mi, 166.66 mmol), P205 (14.18 g, 99.90 mmol) se agregó en forma de porción, y la suspensión resultante se agitó mecánicamente durante 45 minutos. La mezcla entonces fue decantada, y la capa orgánica fue tratada con NaHC03 10% (50 mi) durante 10 minutos. La capa orgánica entonces fue separada, y la capa acuosa fue extraída con CHCI3 (3x50 mi). Las capas orgánicas recolectadas fueron lavadas con salmuera (100 mi), secadas sobre Na2S04 anhídrido y concentradas bajo presión reducida para dar 3 (3.14 g, 97%), que se usó para el siguiente paso sin purificación adicional. 1 H-N M R (CDCI3) d: 0.67 (3H, s, 18-CH3). 0.88-1.04 (9H, m, 19-CH3 + CH3CH2 + 2I-CH3), 3.30 (1 H, m, 3-CH), 3.30-3.40 (7H, m, 3-CH + 2 x CH3OCH20), 3.45 (3H, s, CH3OCH20), 3.50 (1H, m, 7-CH), 3.66 (3H, s, COOCWs), 3.79 (1H, m, 12-CH), 4.57-4.75 (6H, m, 3 x C/-/3OCH20). Ácido 23(S)-metilo-3a,7a,12a-trihidroxi-6a-etilo-5P-colan-24-oico (Ih3e).
A una solución de diisopropilamina (0.56 mi, 4.026 mn ol) en THF frescamente destilado (15 mol) enfriada a -78°C y bajo atmósfera de N2, se agregó en forma de gotas 11BuLi 2.5 N en hexano (1.53 mi, 3.840 mmol). La reacc-ión se agitó a -78°C durante 30 minutos y después una solución de 3 (350 mg, 0.601 mmol) disuelta en THF frescamente destilado (7 mi) se agregó en forma de gotas. La solución resultante se agitó a -78°C durante 90 minutos. Se agregó yodometano (0.56 mi, 9.015 mmol), la mezcla de reacción se agitó a -78°C durante 60 minutos, y después se calentó lentamente a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla entonces se concentró bajo presión reducida, y el residuo resultante se diluyó con H20 (30 mi) y extrajo con AcOEt (3x30 mi). Las capas orgánicas recolectadas se lavaron con salmuera (60 mi), secaron sobre Na2S04 anhídrido, y concentraron bajo presión reducida. El residuo entonces fue tratado con una solución de MeOH/HCI 37% (20 mi, 20:1 vol/vol) a 45° durante 8 horas. La mezcla se concentró bajo presión reducida, y el residuo resultante se diluyó con H20 (30 mi) y extrajo con AcOEt (3x30 mi). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (100 mi), se secaron sobre Na2S04 anhídrido y concentraron bajo presión reducida. El residuo resultante fue tratado con una solución de NaOH 10% en MeOH (15 mi) a 45°C durante 24 horas. La mezcla entonces se concentró bajo presión reducida, y el residuo resultante se diluyó con H20 (20 mi), se lavó con iPr20 (3x1 5 mi), acidificó con HCI 3N, y finalmente se extrajo con CHCI3 (3x20 mi). Las capas orgánicas se lavaron con salmuera (100 mi), secaron sobre Na2S04 anhídrido y se concéntraron. El residuo resultante se purificó por cromatografía a presión media (columna: "RP-1 8 Lobar B", MeOH/H20 de 5:5 a 6:4, 50 psi) para dar 4 (47 mg, 4 1%) Punto de fundición: 195-197°C. 1 H-NMR (CDCI3 + CD3OD) d: 0.63 (3H, s, 18-CH3), 0.84-0.88 (6H, m, I9-CH3 + CH3CH2), 0.98 (3H, d, J = 6.60 Hz, 21-CH3), 1.10 (3H, d, J = 6.80 Hz, CH(CH3)COOH), 2.61 (m, 1H, C H ( C H3)C O O H ) , 3.35 (1 H, m. 3-CH), 3.65 (1H, m, 7-CH), 3.92 (1H, m, 12-CH). 13C-NMR (CDCI3 + CD3OD) d: 11.51 , 12.34, 17.52, 19.19, 22.09, 22.67, 23.11 , 26.65, 27.40, 28.05, 29.83, 33.31 , 34.56, 35.06, 35.40, 38.67, 39.90, 41.11 , 41.39, 41.69, 45.10, 46.39, 47.32, 70.65, 71.79, 72.90, 182.07.
EJEMPLO 7: SÍNTESIS DE COMPUESTOS lo5, Ip5, Iq5 e Ir5 (i) EDA, Rh2(OAc)4, CH2CI2, temperatura ambiente; (ü) (a) NaOH, EtOH, reflujo, (b) MPLC Ácidos 3a,7a-dih¡droxi-22,23-metileno-5p-colan-24-oico (??5, I 5 , I q 5 e Ir5).
Lentamente se agregó diazoacetato de etilo (0.478 g, 1.19 mmol) en CH2CI2 seco (15 mL) en forma de gotas a una suspensión agitada de 3a,7a-diacetoxi-5-norcolan-22,23-eno (1) (0.6 g, 1.39 mmol) en presencia de tetraacetato de dirodio (II) (9 mg, 0.02 mmol) en CH2CI2 seco (15 mL) bajo nitrógeno a temperatura ambiente. La •mezcla de reacción se filtró y lavó con H20 (20 mL), secó (Na2S04), y evaporó al vacío, así dando una mezcla de los cuatro ásteres diaestereoisoméricos 2. Los ésteres 2 se disolvieron sucesivamente en EtOH (15 mL) y trataron con una solución de 2N HCI, y extrajeron con EtOAc (3 x 15 mL). La fase orgánica se lavó con salmuera (10 mL), se secó (Na2S0 ), y concentró al vacío. El residuo se cromatografió sobre gel de sílice. Elución con CH2CI2/MeOH 96/4 con AcOH 0.1% dio 0.087 g (15% rendimiento) de ácido (22S,23S)-3a,7a-dih¡droxi-22,23-metileno^-colan-24-o¡co (lo5) y 0.065 g (11.5% rendimiento) de (22R,23R)-3a,7a-dihid oxi-22,23-metileno-5 -colan-24-oico (Iq5). Elución con CH2CI2/MeOH 95.5/4.5 con 0.1% AcOH dio 0.18 g (32% rendimiento) de ácido (22S,23ft)-3a,7a-dihidrox¡-22,23-metileno-5p-colan-24-oico (Ip5) y 0.15 g (26.7% rendimiento) de (22f?,23S)-3a,7a-dihidro i-22,23-metileno-5p-colan-24-oico (Ir5) como sólidos blancos. ??5. Punto de fundición: 148-150°C [a]20D + 5.16 (c 1, EtOH). 1 H-N M R (CD3OD y CDCI3) d: 0.67 (s, 3H, 18-CH3), 0.90 (s, 3H, 19-CH3), 0.96 (d, J = 6.68 Hz, 3H, 21-CH3), 3.40-3.50 (m, 1H, 3-CH), 3.85 (m, 1H, 7-CH). 13C-NMR (CDCI3) d: 12.20, 16.80, 17.08, 20.80, 21.00, 23.15, 24.10, 28.30, 30.80, 31.30, 33.30, 34.80, 34.90, 35.40, 35.70, 39.80, 39.90, 41.80, 43.40, 50.55, 58.20, 68.90, 72.30, 177.00.
Iq5. Punto de fundición: ri230°C. [a]20D-38.19 (c 1.1, CH3CI/MeOH 1:1). 1 H-N M R (CD3OD y CDCI3) d: 0.50 (s, 3H, 18-CH3), 0.86 (s, 3H, 19-CH3), 0.96 (d, J = 6.40 Hz, 3H, 21-CH3), 3.40-3.60 (m, 1H, 3-CH), 3.80 (m, 1H, 7-CH). 13C-NMR (CDCI3) d: 12.00, 12.50, 20.90, 21.00, 21.10, 23.00, 23.80, 27.10, 30.50, 31.00, 32.10, 33.10, 34.80, 35.30, 35.60, 39.50, 39.70, 39.85, 41.80, 43.00, 50.40, 58.50, 68.60, 72.00, 176.90.
Ip5. Punto de fundición: 221-225°C. [a]20D-40.22 (c1, EtOH). 1 H- M R (CD3OD y CDCI3) d: 0.56 (s, 3H, 18-CH3), 0.86 (s, 3H, 19-CH3), 1.16 (d, J = 6.60 Hz, 3H, 21-CH3), 3.10-3.30 (m, 1H, 3-CH), 3.85 (m, 1H, 7-CH). 13C-NMR (CDCI3) d: 12.10, 18.30, 18.55, 20.00, 20.90, 23.10, 24.00, 28.20, 30.70, 31.70, 33.20, 34.80, 35.40, 35.70, 39.80, 40.10, 41.80, 43.15, 50.40, 57.80, 68.90, 72.20, 178.40.
Ir5. Punto de fundición: 136-140°C. [a]20D + 13.66 (c 1, EtOH). 1H-NMR (CD3OD y CDCI3) d: 0.56 (s, 3H, 18-CH3), 0.86 (s, 3H, 19-CH3), 0.96 (d, J=6.66 Hz, 3H, 21-CH3), 3.40-3.60 (m, 1H, 3-CH), 3.80 (m, 11 o 1 H, 7-CH). 13C-NMR (CDCI3) d: 12.00, 13.50, 19.90, 20.90, 22.50, 23.10, 24.00, 28.00, 30.70, 31.60, 33.20, 34.90, 35.40, 35.65, 39.70, 39.73, 41.80, 43.10, 50.40, 58.00, 68.80, 72.20, 177.60.
EJEMPLO 8: ACTIVIDAD IN VITRO DE TGR5 Y FXR La potencia y eficacia de los compuestos de la invención en receptor TGR5 fue evaluada usando ensayos in vitro.
La tabla 1 muestra que los compuestos de la invención son moduladores de TGR5 potentes y selectivos. La introducción de un grupo alquilo en la posición C-23 de ácido biliar da selectividad para el receptor TGR5 con respecto a FXR. Esto es evidente por la observación de los resultados biológicos obtenidos para CDCA, 6-MeCDCA y 6,23-diMe-CDCA (mezcla de isómeros 23-R.S) en FXR y TGR5 como se muestra en la tabla 1. 6,23-diMe-CDCA es 100 veces más potente en TGR5 con respecto al receptor FXR. Para una descripción de unión de receptor TGR5 usando un ensayo in vitro, ver, por ejemplo, Kawamata, J. Biol. Chem 2003, vol. 278 No. 11, p. 9435-9440). Se ensayó la actividad en FXR por transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) para reclutamiento del péptido SRC-1 a FXR humano usando una ELiSA libre de célula. Ver, Blanchard y otros WO 00/37077.
Tabla 1: EC50 (µ?) de los compuestos de ejemplo en receptor FXR y TGR5 Las tablas 2 y 3 muestran compuestos adicionales evaluados para actividad de TGR5. Se determinó actividad de Luciferasa en células de CHO establemente expresando hTGR5 o transitoriamente cotransfectadas con un vector de expresión hTGR5 y un gen reportero de luciferasa impulsado por elemento responsivo a cAMP (CRE). Algunos de los compuestos se sometieron a un ensayo de reportero de luciferasa para calificar su capacidad de activar el receptor FXR de ácido biliar nuclear.
Tabla 2.
*Datos representan valores promedio de por lo menos tres experimentos independientes de ensayos de reportero de luciferasa impulsado por CRE en células CHO transf ectadas con TGR5. Las unidades son µ? para EC50 y % de 10 µ M valor de LCA para eficiencia.
Tabla 3. Actividades3 de TGR y FXR "Nivel de activación de meseta no alcanzado; la concentración máxima basada fue 125 µ? para Ib y 100 mM para li.
Los datos en las tablas 2 y 3 se pueden determinar usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe más adelante.
Plásmidos El clon de la Colección de Genes de Mamífero NIH MGC.40597 (también, llamado pCMVS PORT6/hTGR5) y pcADN3.1( + ) fueron obtenidos de Invitrogen (Carlsbad, CA). pCRE-Luc y pCMVp fueron obtenidos de Clontech (Palo Alto, CA). pCMX-hFXR y pCMX-mRXRa fueron obsequios generosos del Dr. David J. Mangelsdorf (Instituto Médico *Howard Hughes, Universidad de Texas Centro Médico Southwestern). pEcREx7-Luc fue un obsequio generoso del Dr. Richard A. Heyman (X-ceptor Therapeutics, CA).
. Cultivo celular Se obtuvieron células de ovario de hámster chino (CHO), células NCI-H716, células Hep3B y células COS1 de la colección American Type Culture Collection (Manassas, VA). El medio de cultivo celular, suero y suplementos fueron de Invitrogen o Sigma-Aldrich. Todas las células de CHO se mantuvieron en medio esencial mínimo a (a-???) suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal (FBS) y 100 µ? de aminoácidos monoesenciales (NEAA). Las células NCI-H716 se mantuvieron en suspensión en RPMI-1640 suplementado con 10% (v/v) FBS, 10 mM HEPES y 1 mM piruvato de sodio. Las células Hep3B se mantuvieron en medio de Eagle suplementado con 10% (v/v) FBS y 100 µ? de NEAA. Las'células COS1 se mantuvieron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v/v) FBS. Todo el medio de cultivo celular se suplemento con 100 unidades/m1 penicilina y 100µg/ml sulfato de estreptomicina.
Las células crecieron a 37°C en una atmósfera e 5% de C02, después de cada 2-6 días y se chaparon frescamente para cada experimento.
Transfecciones transitorias Se chaparon células de CHO en placas de 96 pozos a una densidad de 3.5x104 células/pozo, cultivadas durante 24 horas, y después transfectadas con 150ng de plásmido humano (h) de expresión de TGR5 (pCMVSPORT6/hTGR5) y 100ng de plásmido reportero de luciferasa impulsado por elemento responsivo a cAMP (CRE) (pCRE-Luc) en cada pozo usando reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 6 horas de incubación, las células fueron lavadas una vez con solución salina regulada con fosfato (PBS) y el medio fue intercambiado por DMEM conteniendo 0.1% (p/v) de albúmina de suero bovino (BSA). Después de incubar durante otras 18 horas, las células fueron tratadas durante 5 horas con concentraciones diferentes de cada compuesto en DMEM fresco conteniendo 0.1% (p/v) de BSA. Después de tratamiento, las células se Usaron con 50 µ I de regulador de lisis (25mM Tris-CI (pH7.6), 2mM EDTA, 1mM ditiotreitol ( DTT), 10% (v/v) glicerol y 1% (v/v) tritón X-100) por un ciclo de congelación-deshielo y sometido a ensayos de luciferasa como se describe más adelante.
Se chaparon células COS1 en placas de 96 pozos a una densidad de 2.5 x 104 células/pozo en DMEM suplementadas con 10% (v/v) FBS despojado con carbón, cultivadas durante 24 horas, y después transfectadas con 25ng de plásmido de expresión hFXR (pCMX-hFXR), 25ng de plásmido de expresión a receptor X retinoide de ratón (m) (pCMX-mRXRa), 50ng de plásmido reportero (pEcREx7-Luc) y 50ng de pCMVp como control interno en cada pozo, usando reactivo de Lipofectamine 2000. Después de 24 horas, las células fueron lavadas dos veces con PBS y tratadas con concentracibVies diferentes de cada compuesto en DMEM fresco suplementado con 10% (v/v) FBS despojado con carbón durante 24 horas. Después de tratamiento, las células se Usaron con 50µ? de regulador de lisis por un ciclo de congelación-deshielo y sometidas a ensayos de luciferasa y ß-ga lactosidasa como se describe más adelante. Se determinaron valores de luciferasa normalizados al dividir la actividad de luciferasa por la actividad de ß-galactosidasa.
Ensayos de luciferasa y ß-galactosidasa Para ensayos de luciferasa, 20 I de lisato celular se mezcló con 100 µ I de regulador de reacción de luciferasa [235 µ? de luciferina, 265 µ? de ATP y 135 µ? de coenzima A (CoA)] y se determinó la luminiscencia con Centro XS3 LB960 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemania). Para ensayos de ß-galactosidasa, se mezcló 10 pl de lisato celular con 100 µ? de regulador Z [60 mM de Na2HP04, 10mM KC1 , 1mM MgS04, 50 mM de ß-mercaptoetanol y 0.75 mg/ml de o-nitrofenil^-D-galactopiranosida (ONPG)] e incubado a.37°C durante 0.5-3 horas.
Las reacciones se detuvieron al agregar 50 I de regulador Stop ( 1 M Na2C03) y se determinó la densidad óptica a 420nm.
Establecer células de CHO establemente expresando TGR5 humano (células de CHO-TGR5) Se transfectaron células de CHO con 3.8pg de plásmido de expresión hTGR5 (pCMVSPO T6/hTt3R5)*, 3.8pg de plásmido reportero de luciferasa impulsado por CRE (pCRE-Luc) y 0.4pg de plásmido de expresión de gen resistente a neomicina [pcADN3.1 ( + )] usando Lipofectamine- 2000. Los transfectores fueron seleccionados -con 400pg/ml de G418 sulfato y clones individuales fueron crecidos en placa de 96 pozos, independientemente. Se tamizaron líneas celulares por tratamientos de LCA, seguido por ensayos de luciferasa.
Análisis de producción de cAMP Se chaparon células de NCI-H716 en placas de 96 pozos revestidas con 0.75mg/ml Matrigel (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante justo antes de usarse, a una densidad de 6x104 células/pozo en DMEM suplementado con 10% (v/v) FBS, 100 unidades/m.1 penicilina y 100pg/ml sulfato de estreptomicina, y cultivadas durante 24 horas, lo cual permitió adhesión celular al fondo de la placa. Se chaparon células de CHO-TGR5 en placas de 96 pozos a una densidad de 3.5 x 104 células/pozo en un a-MEM suplementado con 10% (v/v) FBS, 100µ? de NEAA, 100 unidades/ml de penicilina y 100pg de sulfato de estreptomicina, y cultivadas durante 24 horas. Las células se lavaron dos veces con PBS y el medio fue intercambiado por medio de ensayo de cAMP [DMEM conteniendo 0.1% (p/v) BSA y 0.5mM 1-1-metilxantina de 3-isobutilo (IBMX)]. Después de incubar durante 30 minutos a 37°C, las células fueron tratadas con cada compuesto en medio de ensayo de cAMP fresco durante 30 minutos. Después de tratamiento, se descartó el medio y se determinaron cantidades de cAMP usando equipo cA P-Screen (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Concentraciones 50% efectivas (EC50) y determinación de eficacia Se realizaron ensayos en triplicado y cuadriplicado para cada condición. Se determinaron los valores de EC50 por análisis de probit. Se determinó la eficacia al calcular porcentajes de 10 µ? de valor de LCA para estudio de agonista de TGR5 y 10 µ? de valor de 6a-Et-CDCA para estudio de agonista de FXR, respectivamente.
Después de sustraer el valor promedio de la condición basal (tratado con vehículo), se aplicaron valores a determinaciones de EC50 y/o eficacia. Se realizó el cálculo de EC50 promedio y comparación del EC50 entre compuestos diferentes después de la transformación de logaritmo.
Análisis estadístico Se realizó análisis estadístico por prueba t del Alumno y ??0.05 fue considerado considerablemente significativo.
Tabla 3A.
Ensayo FRET Ensayo de FRET-cAMP AlphaScreen (cAMP) transsobre TGR5 NCI-H716 activación expresando células Hek293 Compuesto hFXR (CDCA hTGR5 (LCA hTGR5 (LCA hTGR5 (LCA = = 1020 µ?) = 48 µ?) = 16 µ?) 0.35 µ?) (Referencia Estándar) EC50 (µ?) EC50 (pm) EC50 (µ ) EC50 (µ?) Ih3e 175 0.9 1.7 0.001 Los datos en la tabla 3A fueron generados al usar métodos descritos más adelante.
Ensayo FRET (Detección de niveles de cAMP intracelulares).
El ensayo de unión a receptor se realizó al medir el nivel de AMP cíclico (cAMP) usando ensayo FRET. Se chaparon líneas celulares intestinales humanas (NCI-H716) en placas de 96 pozos revestidas con 0.75 mg/ml Matrigel (BD Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante justo antes de usarse, a una densidad de 12x103células/pozo en DMEM suplementado con 10% (v/v) FBS, 100 unidades/ml penicilina y 100 pg/ml sulfato de estreptomicina, y cultivadas durante 24 horas, lo cual permitió adhesión celular al fondo de la placa. Las células se lavaron dos veces con PBS y el medio fue intercambiado para, medio de ensayo de cAMP [OPTIMEM que contiene 0.1% (p/v) BSA y 1 mM 1-1-metilxantina de 3-isobutilo (IBMX)]. Después de incubar durante 60 minutos a 37°C, las células fueron tratadas con concentraciones en aumento del compuesto I h 3 en regulador de estimulación (5 mM HEPES, 0.1% BSA en HBSS pH 7.4) conteniendo el quelato de europio - estreptavidina y el anti-cAMP de anticuerpo conjugado con ALEXA Fluor-647 ( PerkinElmer) durante 1 hora a temperatura ambiente. El nivel de cAMP intracelular se determinó con el equipo Lance (PerkinElmer). Se usó ácido litocolico como ligando de control. Se usó factor Z' para validar ensayos. Se realizaron curvas de regresión no lineales, sin restricciones, al usar ecuación de cuatro parámetros y GraphPad Prism Software (GraphPad Inc.), para obtener los valores de EC50.
Ensayo AlphaScreen Se ensayó la actividad en FXR al usar tecnología de Alphascreen en un ensayo coactivador de reclutamiento. AlphaScreen es un ensayo químico a base de glóbulo usado para estudiar interacciones biomoleculares. La unión de moléculas capturada en glóbulos conduce a una transferencia de energía de un glóbulo al otro, finalmente produciendo una señal luminiscente. Cuando las parejas interactúan, la energía química es transferida de glóbulos de Donador a Aceptador y se produce una señal. Con la estimulación de ácidos biliares, el GST-FXR-LBD interactúa con el péptido Src-1. Se usaron glóbulos del Aceptador revestidos con anti-GST para capturar el FXR-LBD de fusión con GST mientras que el péptido SRC-1 biotinilado fue capturado" por los glóbulos del Donador de estreptavidina . Al iluminar a 680 nm, se transfiere energía química de glóbulos de Donador a Aceptador sobre el complejo estreptavidina-Donador/Src-1 Biotin/GSTFXR-LBD/Anti-GST-Aceptador y se produce una señal. El ensayo fue realizado en Optiplacas de 384 pozos, blancas, de bajo volumen, (PerkinElmer) usando un volumen final de 25 µ? conteniendo concentraciones finales de 10 nM de proteína FXR-LBD etiquetada con GST purificado, 30 nM de péptido Src-1 biotinilado, 20 Mg/ml glóbulos de aceptador anti-GST y 10 Mg/ml de glóbulo donador de estreptavidina (PerkinElmer). El regulador del ensayo contuvo 50 niM de Tris (pH 7.4), 50 mM de KCI, 0.1% de BSA, y 1 mM de DTT. Los tiempos de estimulación con 1 µ? de ligandos (solubilizados en 100% de DMSO) se fijaron a 30 minutos a temperatura ambiente. La concentración de DMSO en cada pozo se mantuvo a una concentración final de 4%. Después de la adición de la mezcla de detección (glóbulos de aceptador y donador), las placas se incubaron en la oscuridad durante 4 horas a temperatura ambiente y después se leyeron en un analizador de microplaca Envision (PerkinElmer). Se realizaron curvas de respuesta a dosis en triplicado y se usó factor Z' para validar los ensayos. Se realizaron curvas de regresión no lineal, sin restricciones, al usar ecuación de cuatro parámetros y GraphPad Prism Software (GraphPad Inc.), para obtener los valores de EC50.
Cultivo celular, transfección y ensayo de luciferasa Se cultivaron células HEPG2 y HEK293T en E-MEM y DMEM, respectivamente, suplementadas con 1% de penicilina/estreptomicina, 1% de L-glutamina y 10% de suero bovino fetal (glucosa alta) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Células crecieron a 37°C en 5% C02. Todas las transfecciones se hicieron usando reactivo de Transfección 5:2 Fugene HD (µ?) a ADN (pg) respectivamente (Roche). Veinticuatro horas antes de transfección, se sembraron células HEK293T y HepG2 en una placa de 96 pozos a una densidad de 10.000 ó 15.000 células/pozo, respectivamente. Se realizaron transfecciones transitorias usando 100 ng de vector reportero pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro] (Promega), 40ng de pGL4.74 (Renilla), como control interno para eficiencia de transfección, y 10 ng de plásmido de expresión pCMV-SPORT6-hTGR5, el clon de la colección NIH Mammalian Gene Collection MGC:40597 (Invitrogen). El vector pGEM se agregó para normalizar las cantidades de ADN transfectado en cada ensayo (2 pg). Veinticuatro horas posteriores a la transfección, las células fueron estimuladas con concentraciones en aumento del compuesto Ih3e durante 18 horas. Los cultivos de control recibieron vehículo solo (0.1% DMSO). Las células entonces se lisaron al agregar 75 µ? de reactivo Dual-Glo Luciferasa (Promega) a 75 µ? de medio conteniendo células/pozo. Se midió la actividad de re n i 11 a luciferasa al agregar un volumen de reactivo Dual-Glo Stop & Glo y medio de cultivo original. Se expresaron actividades de luciferasa como relación entre unidad de luciferasa y unidad de renilla luciferasa. Cada punto de datos es el promedio de ensayos en triplicado. Cada experimento fue repetido por lo menos tres veces.
Tabla 3A. Comparación directa de ácido 23-metilo cólico 6-etilo contra 6-metilo sustituido Se prefieren compuestos teniendo un grupo alfa-etilo en la posición C-6 en el anillo de ácido biliar. Más específicamente, los compuestos teniendo un grupo alfa-etilo en la posición C-6 del ácido 23-metilo cólico son los más preferidos. Como se muestra en la tabla 3A arriba, los compuestos teniendo un grupo alfa-etilo en la posición C-6 son de manera sorprendente e inesperada más potentes que el derivado correspondiente de C-6 alfa-metilo. * EJEMPLO 9: ACTIVIDADES METABÓLICAS DE ÁCIDO OLEANÓLICO Y ÁCIDO 6-ETILO, 23-METILO CÓLICO (Ih3e) EN UN MODELO DE RATÓN DE OBESIDAD INDUCIDO CON DIETA El objetivo del estudio es definir si agonistas de TGR5 (ácido oleanoico (OA) o ácido 6-etilo, 23-metilo cólico (Ih3e) corrigen el desarrollo de obesidad y resistencia asociada a insulina in vivo. Para probar esta posibilidad, se administraron OA/lh3e vía administración de alimento durante 16 semanas a ratones macho C57BL6J que previamente habían sido sometidos durante 10 semanas a una dieta a Ita en grasa.
II- Protocolo En un estudio previo, se observó OA como un agonista de TGR5 selectivo que no causó aversión a alimento. Los animales tratados con una dosis de 100 mg/kg/día de OA mostraron, no obstante, algunas señales de toxicidad, mientras que se toleró bien una dosis menor. Por lo tanto, se administró OA a la' dosis de 50 mg/kg/d en este estudio.
Estudios in vitro han identificado Ih3e como un ligando de TGR5 potente y selectivo. No se esperaron problemas de toxicidad con Ih3e, el cual se administró a concentración menor de ~ 50 -veces.
Para este estudio, 48 ratones machó C57BL6J (5 semanas de edad) se dividieron en dos grupos: un grupo de 24 (grupo 1, 2 & 3) animales recibieron dieta con alimento chow mientras que los otros 24 recibieron una dieta alta en -grasa durante un periodo de 10 semanas (grupos 4, 5 & 6). Los animales entonces fueron analizados durante un periodo de 16 semanas. Cinco grupos de 10 animales fueron asignados de la siguiente manera: 1 : dieta con chow 2: dieta con chow + OA 50 mg/kg/día 3: dieta con chow + 6Et23MeCA (Ih3e) 30 mg/kg/día 4: dieta alta en grasa 5: dieta alta en grasa + OA 50 mg/kg/día 6: dieta alta en grasa + 6Et23MeCA (Ih3e) 30 mg/kg/día Durante el estudio entero, se monitoreó el peso corporal y absorción de alimento dos veces a la semana.
Semana 2: Se analizó composición corporal, para todos los grupos, por absorciometría de rayos X de energía dual (dexascan).
Semana 1: Se midieron los niveles de suero de transaminasas, glucosa, triglicéridos , colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina en todos los grupos después de un periodo de ayuno de 12 horas y los ratones entonces fueron colocados en las dietas como se indica (día 0).
Semana 2: Se midieron los niveles de suero de transaminasas, glucosa, triglicéridos, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina en todos los grupos de¾pués de un periodo de ayuno de 12 horas (día 14).
Semana 4: Se determinó la tolerancia a glucosa al someter todos los animales a una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT). Los animales ayunaron -durante 12 horas antes de esta prueba. Se midió el gasto de energía nocturno de los grupos 1, 4, 5 y 6 (dieta con chow, dieta alta en grasa y dieta alta en grasa OA / 6Et23MeCDCA (Ih3e) por calorimetría indirecta.
Semana 8: Una vez más se analizó la composición del peso corporal por dexascan para todos los grupos. Se midieron los niveles de suero de transaminasas, glucosa, triglicéridos, colesterol, HDL-C, LDL-C e insulina en todos los grupos después de un periodo de ayuno de 12 horas (día 56).
Semana 9: Se estudió la actividad circadiana de los grupos 4, 5 ó 6 (ratones alimentados con dieta alta en grasa) durante un periodo de 30 horas.
Semana 10: Se realizó medición de presión sanguínea y ritmo cardiaco en los grupos 4, 5 y 6.
Semana 11: Se midió la temperatura rectal de todos los animales a temperatura ambiente a las 10:00 a.m.
Se realizó medición de actividad circadiana en los grupos 1, 2, 3 y 4.
Semana 12: Se analizó la tolerancia a la glucosa al realizar una prueba de tolerancia a glucosa intraperitoneal (IPGTT) en los grupos 4, 5 y 6. Durante el IPGTT, también se recolectó sangre para analizar los niveles de insulina. Los animales ayunaron 12 horas antes de estas pruebas. Se recolectaron heces en todos los grupos sobre un periodo de tiempo de 24 horas y se midió el contenido de lípidos fecales.
Semana"16: Se realizó prueba en frío en todos los animales al medir la temperatura corporal de animales expuestos a 4°C.
Tres días después, los animales fueron sacrificados. En el sacrificio, se recolectó sangre y se analizó para: lípidos de plasma (TC, TG, HDL-C, FFAs); funciones del hígado (ALAT, ASAT, Pase alcalino, ?-GT); glucosa e insulina; perfiles de lipoproteína de grupos selectos de plasma (cromatografía de tamaño-exclusión).
Se recolectaron hígado, intestino delgado, tejidos adiposos (WAT y BAT), páncreas, corazón y músculo, pesaron y mantuvieron para más análisis incluyendo: histología estándar (manchado de HE, manchado de succinato deshidrogenasa, manchado de aceite-rojo-O y morfología celular); contenido de lípido de tejido; microscopía electrónica en BAT y músculo para analizar mitocondria; aislamiento de ARN para estudios de expresión de genes seleccionados involucrados en homeostasis de metabolismo y energía por RT-PCR cuantitativo; extracción de proteína para el estudio de modificaciones post-transferentes tal como acetilación de proteína de interés (por ejemplo, PGC-1a).
III- Procedimientos detallados A- Procedimiento animal y dietas Alojamiento y manejo de animales Los ratones fueron alojados en grupos (5 animales / jaula) en condiciones específicas libres de patógeno con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas:12 horas (a las 7:00), en una temperatura (20-22°C) y vivero de humedad controlada, de acuerdo con las especificaciones de la Comunidad Europea. A los animales se les permitió libre acceso a agua y alimento.
Agua potable La composición química del agua potable fue regularmente analizada para verificar la ausencia de sustancias tóxicas potenciales en el Instituí d'Hydrologie, ULP, Strasbourg. El agua potable fue tratada con HCI y HCI04 para mantener pH entre 5 y 5,5 y concentración de clorina entre 5 y 6 ppm.
Dieta Se obtuvo la dieta con chow en roedor estándar de UAR y la dieta alta en grasa se obtuvo de Research Diet. Los ratones fueron alimentados, ya sea con dieta de chow (16% proteína, 3% grasa, 5% fibra, 5% ceniza) o con dieta alta en grasa (20% proteína, 20% carbohidrato, 60% grasa). Se mezcló ácido oleanólico y 6Et23MeCDCA (Ih3e) con dieta chow en polvo o dieta alta en grasa en polvo en las siguientes proporciones: 0.5 g de OA/kg de alimento para el tratamiento de 50 mg/kg/día y 0.08 g de 6Et23MeCA (Ih3e)/kg de alimento para el tratamiento de 10 mg/kg/día. Entonces se reconstituyeron las pastillas. Los grupos de control recibieron pildoras de alimento como se proveyó por la compañía. Debido a la consistencia de la dieta alta en grasa, no se agregó agua en la mezcla con OA. En el caso de la dieta con chow, que es más duro de reconstituir, se agregó una cantidad mínima de agua al polvo para reconstituir pildoras, las cuales después se secan al aire. Se prepararon lotes nuevos de alimento a la semana.
Recolección de sangre Se recolectó sangre del seno nasal retro-orbital bajo anestesia o de la vena de la cola.
Anestesia Para el experimento de escaneo dexa, los animales fueron anestesiados con una mezcla de cetamina (200 mg/kg)/Xylasine (10 mg/kg) administrada por inyección intra-peritoneal. Para la venopunción, los animales fueron anestesiados por inhalación de una mezcla de isoflurano-02.
B-Bioquímica Las pruebas fueron realizadas con una estación de trabajo de laboratorio automático Olympus AU-400 usando reactivos comerciales (Olympus).
Análisis de lípidos y lipoproteínas Se determinaron triglicéridos de suero, total y HDL colesterol por ensayos enzimáticos. Se determinó el contenido de HDL colesterol de suero después de precipitación de lipoproteínas con apo B con ácido fosfotungstíco/Mg (por ejemplo, Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Se determinó el nivel de ácido graso libre con un equipo de Wako (por ejemplo, Neuss, Alemania) como se especifica por el proveedor.
Exploración metabólica y endocrina Se midió la concentración de glucosa de sangre por un analizador Precisión Q.I.D. (por ejemplo, sistema Medisense), usando electrodos Medisense Precis (por ejemplo, Abbot Laboratories, productos Medisense, Bedford, EUA). Este método fue validado, al comparar valores del analizador Precisión Q.I.D con mediciones clásicas de glucosa. El método Precisión Q.I.D fue elegido ya que requiere una cantidad mínima de sangre y por tanto se puede emplear para múltiples mediciones tal como durante un IPGTT. Se determinó insulina de plasma (por ejemplo, Merco'dia, Uppsala, Suecia) por ELISA de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
C- Prueba metabólica Perfiles de lipoproteina Se obtuvieron perfiles de lipoproteina por cromatografía líquida de proteína rápida, permitiendo separación de las tres clases de lipoproteina principales VLDL, LDL y HDL.
Prueba intraperitoneal de tolerancia a glucosa (IPGTT) - Prueba oral' de tolerancia a glucosa Se realizó IPGTT en ratones que ayunaron durante la noche (12 horas). Los ratones fueron inyectados intraperitonealmente (IPGTT) con una solución de 20% de glucosa en solución salina estéril (0.9% NaCI) a una dosis de 2 g de glucosa/kg peso corporal. Se recolectó sangre de la vena de la cola, para monitoreo de glucosa e insulina, antes y 15, 30, 45, 75, 90, 120, 150, 180 minutos después de la administración de la solución de glucosa. El área incremental de la curva de glucosa se calculó como una medida de sensibilidad a insulina, mientras que los niveles correspondientes de insulina indican reservas secretorias de insulina.
Gasto de energía Se evaluó el gasto de energía a través de calorimetría indirecta al medir consumo de oxígeno con el aparato Oxymax (por ejemplo, Columbus Instruments, Columbus, OH) durante 12 horas. Este sistema consiste de un circuito abierto con entrada de aire en y fuera de jaulas de plástico (un ratón por jaula). A los animales se les permitió acceso libre a alimento y agua. Un sensor de CO2 y 02 muy preciso midió la diferencia en concentraciones de 02 y C02 en ambos volúmenes de aire, lo cual dio la cantidad de oxígeno consumido en un periodo de tiempo dado que el flujo de aire entrante en la jaula fue constante. Los datos provenientes fuera del aparato se procesaron en una computadora conectada, se analizaron y se mostraron en un archivo de Excel exportable. Los valores fueron expresados como ml.kg Vh"1, que comúnmente se conoce como el vo2.
Determinación de contenido de grasa corporal por escaneo Dexa Los análisis Dexa fueron realizados por el Densitómetro Serie PIXIMUS de resolución ultra alta (0.18 x 0.18 mm pixeles, GE Medical Systems, Madison, Wl, EUA). Se determinó densidad mineral ósea (BMD en g/cm2) y composición corporal al usar el software PIXIMUS (versión 1.4x GE Medical Systems).
Medición y pulso de presión sanguínea D-no-invasiva El sistema de análisis de presión sanguínea Visitech BP-2000 es un sistema de cola-puño automático de computadora que se usa para tomar mediciones múltiples en 4 ratones despiertos · simultáneamente sin intervención de operador. Los ratones estuvieron en cámaras oscuras individuales en una plataforma calentada con sus colas enroscadas a través de un puño de cola. El sistema mide presión sanguínea al determinar la presión del puño en donde el flujo de sangre a la cola fue eliminado. Un sensor fotoeléctrico detecta el pulso del espécimen. El sistema genera resultados que han sido mostrados para corresponder cercanamente con presión intra-arterial media medida* simultáneamente en la arteria carótida. Esto permite valores reproducibles de presión sanguínea sistólica y ritmo cardiaco a obtenerse. Esto requirió entrenamiento de los animales durante una semana en el sistema.
E- Actividad cardiaca Se midió la actividad locomotora espontánea usando cajas individuales, cada una compuesta con una puerta deslizante, una jaula desmontable, y equipada con captores infra-rojos permitiendo medición de actividad locomotora ambulatoria y partes traseras. Las cajas estaban ligadas a una computadora usando una interface electrónica (por ejemplo, Imetronic, Pessac, Francia). Los ratones fueron probados durante 32 horas a fin de medir habituación al aparto así como actividades nocturnas y diurnas. La cantidad de agua consumida fue medida durante el periodo de prueba usando un medidor de lamidas.
Los resultados del estudio se muestran en las figuras 1-9. La figura 1 muestra el impacto del compuesto Ih3e en ganancia de peso corporal en ratones alimentados con chow y dieta alta en grasa. La ganancia de peso corporal fue medida en 16 semanas. Los ratones alimentados con dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e mostraron menos ganancia de peso que los ratones alimentados con dieta alta en grasa tratados con vehículo. La figura 2 muestra que el compuesto Ih3e mejora el perfil metabólico de ratones alimentados con dieta alta en grasa. Los resultados del análisis de plasma de sangre y ritmo "cardiaco en ratones obesos inducidos con dieta tratados con el compuesto Ih3e se muestran en la figura 2, incluyendo niveles de glucosa en la sangre, enzimas del hígado (LDH. 'ASAT y ALAT) y llpidos plásmidos (colesterol total, HDL-col, LDL-col y triglicéridos). Los ratones alimentados con dieta alta en grasa tratados con compuesto Ih3e mostraron glucosa en la sangre menor, enzimas de hígado, y lípidos de plasma que los ratones alimentados con dieta alta en grasa tratados con vehículo. El ritmo cardiaco de ratones alimentados con dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e también mostraron un ritmo cardiaco menor en comparación con ratones alimentados con dieta alta en grasa tratados con vehículo. La figura 3 muestra que el compuesto Ih3e mejora la tolerancia a la glucosa en ratones alimentados con dieta alta en grasa. Después de 10 semanas, los niveles de insulina en plasma fueron aumentados tanto en ratones alimentados con chow como en dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e en comparación con ratones tratados con vehículo como se muestra en la figura 3A. Después de 12 semanas, los niveles de glucosa mostraron ser menores en ratones alimentados con dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e como se muestra en la figura 3B. La figura 4 muestra resultados de la prueba oral de tolerancia a glucosa (OGTT) como niveles de glucosa sobre un periodo de 200 minutos en ratones alimentados con comida chow tratados con el compuesto Ih3e. La figura 5 (gráficas A-D) muestra liberación de insulina in vivo después de un alimento de. prueba. La figura 5A muestra liberación de insulina en 30 minutos. La figura 5B muestra aumento de pliegues en liberación de insulina en comparación con nivel de insulina basal. Los niveles de insulina alcanzaron niveles más altos a ~ 12 minu'tos en ratones alimentados con dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e en comparación con ratones tratados con vehículo. Las figuras 5C y 5D muestran el aumento de pliegues en liberación de insulina en comparación con niveles de insulina basal. El aumento de pliegues en ratO/nes alimentados con dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e fue mayor tanto en los puntos de tiempo de 15 como 30 minutos como se muestra en la figura 5D. Las figuras 6 (gráficas A-D) y 7 (gráficas A-C) muestran que los ratones tratados con el compuesto Ih3e tienen un aumento en relación de intercambio respiratorio (RER) con HFD (dieta alta en grasa) que se puede explicar como ligada a su sensibilidad a insulina mejorada la cual mantiene su habilidad de oxidar glucosa. La figura 8 (gráficas A y B) muestra actividad locomotora y absorción de comida/agua de ratones tratados alimentados con dieta alta en grasa y tratados alimentados con comida chow en comparación con los tratados con , vehículo. La ingesta de comida/agua para ratones alimentados con una dieta alta en grasa y tratados con el compuesto Ih3e mostró un aumento ligero en ingesta contra ratones tratados con vehículo. La figura 9 (gráficas A-C) muestra cambios en peso de órgano. Las figuras 9B y 9C muestran el porcentaje de cambio en peso corporal, hígado, riñon, corazón, peri WAT, epi WAT, Se WAT y BAT en comparación con peso en ratones alimentados con comida chow. En todos los órganos, los ratones alimentados con dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e mostraron un cambio reducido en porcentaje.
EJEMPLO 10: PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS Solubilidad en agua Se suspendió BA sólido (en forma protonada para el compuesto Ih3e) en 5 mi de 0.1 M de HCI. Las soluciones saturadas, después de incubación durante 1 semana, se filtraron en un filtro Millipore (0.22 µ???) y la concentración de BA se midió por HPLC-ESI-MS/MS usando columna C18 (150mm x 2mm i.d., 4pm) y fases móviles de agua conteniendo 15m de ácido acético pH 5 y acetonitrilo. La velocidad de flujo fue 150 µ?/min. La adquisición de espectrometría de masa se realizó en el modo de monitoreo de reacción múltiple usando la fuente ESI en ionización negativa. La solubilidad en agua fue expresada como pmol/litro.
La solubilidad en agua del compuesto Ih3e es 99 pM un valor mayor que dihidroxi BA correspondiente y comparable con aquél de CA (ver tabla 4).
Tabla 4. aWs: solubilidad en agua se refiere a BA como especie protonada y por tanto no evaluada para TCDCA, y TUDCA que son altamente solubles (hs). bCMC: concentración micelar crítica determinada en 0,15 M de solución en agua de NaCI.
CSTC C: tensión superficial a CMC en 0.15 M de solución en agua de NaCI. dLogPA: coeficiente de partición de 1 -octanol-agua de los ácidos biliares estudiados como especie ionizada. *: valores de la literatura.
La presencia de un grupo 23-metilo en el compuesto Ih3e no compromete la solubilidad en agua. El compuesto Ih3e exhibe un valor de solubilidad en el rango de BA que ocurre de manera natural y análogos sintéticos estudiados previos. Además, dada la relativamente buena unión de albúmina del compuesto Ih3e, se puede facilitar la circulación del compuesto Ih3e en la sangre, así favoreciendo el objetivo sistémico de TGR5 en tejidos periféricos tal como tejido adiposo de músculo y café. Los ejemplos 9, 16 y 17 soportan además esta hipótesis.
Concentración micelar crítica (CMC) La detergencia, es decir, la tendencia a formar micelas fue evaluada para todas las moléculas cargadas que son solubles- en agua como sal de sodio (2 unidades hasta el pKa). La concentración micelar crítica (CMC) fue determinada por mediciones de tensión superficial (ST) usando un método máximo de presión de burbuja que da valores de tensión superficial ligeramente afectados por impurezas potenciales como son los métodos estáticos. El tensiómetro fue un Sensadyne 6000 (Chem-Dyne Research Corp., Mllwaukee, Wl) equipado con dos sondas de vidrio de diámetros de 0.5 y 4.0 mm conectado a una fuente de nitrógeno. La frecuencia de burbuja fue 1 burbuja/segundo en agua destilada a 26°C (P=2.7 atm) y se hizo la calibración con agua doble destilada y metanol. La tensión superficial de soluciones de sales sódicas de BA en NaCI 0.15 M se midió a varias concentraciones dentro del rango de 0.13-50 mM. Los valores de tensión superficial fueron trazados contra el logaritmo de la concentración de sal biliar; las líneas de regresión correspondientes a las dos partes de la curva (fases monoméricas y micelares) se calcularon usando el método de menos cuadros, y la intersección de las líneas fue tomada como el valor de CMC. A partir de las curvas de ST contra concentración, el valor de la tensión superficial en el CMC (equilibrio entre especies de monómeros y multímeros) también se calculó dando información acerca del poder de detergencia que se relaciona con el tamaño de las micelas con capacidad reductora de tensión superficial asociada.
La CMC fue evaluada por mediciones de tensión superficial en condiciones de no equilibrio, es decir, en condiciones que impurezas afectan ligeramente los resultados de tensión superficial (figura 10). El compuesto Ih3e presenta una CMC baja sino una capacidad reductora de detergencia moderada y tensión superficial como se muestra por los valores de tensión superficial a la CMC (baja detergencia significa baja toxicidad a membrana o células).
Coeficiente de partición de octanol/agua Ya que el sulfato y análogos sulfonados siempre se ionizan a todos los valores de pH, el coeficiente de partición de octanol/agua se midió para todas las moléculas en forma ionizada y por tanto los análogos de carboxi fueron estudiados a pH alto. El coeficiente de partición de 1 -octa no l/a g u a (log P) fue evaluado usando un procedimiento convencional de matraz. Los experimentos se llevaron a cabo en 0.1 mM solución de sal biliar regulada a pH 8 con 0.1 M de regulador de fosfato para asegurar ionización completa del BA; los valores de log P se refieren al BA en la forma ionizada, no a las especies protonadas, y la concentración inicial de cada BA estuvo debajo de su propio valor de CMC. El regulador acuoso fue previamente pre-saturado con 1-octanol, 5 mi de 1-octanol pre-saturado con agua después se agregó y las muestras se dejaron equilibrar por 2 semanas bajo agitación continua a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, las dos fases se separaron con cuidado. La concentración de BA en la fase de agua se midió con HPLC-ES MS/MS usando columna C18 (150mm x 2mm i.d., 4 pm) y, como fases móviles, agua que contiene 15 mM ácido acético pH 5 y acetonitrilo. La velocidad de flujo fue 150 pál/min y la columna se mantuvo a 45°C. La adquisición de espectrometría de masa se realizó en modo de monitoreo de reacción múltiple usando la fuente de ESI en ionización negativa.
El compuesto carboxilato Ih3e con tres grupos hidroxilo en posición 3a, 7a y 12a presenta una liofilicidad ligeramente mayor con respecto al análogo natural CA, 1.4 contra 1.1 como un resultado de la presencia de un etilo en posición 6 y un metilo en posición 23.
Unión de albúmina El grado de unión de albúmina fue evaluado por diálisis de equilibrio a una relación de BA-albúmina fija. Se disolvió BA a una concentración de 100 µ? en 5% de albúmina de suero bovino-solución salina (pH 7.2) y se dejó reposar durante 24 horas a 25°C. Dos mililitros de esta solución se dializaron en sacos de celulosa teniendo un corte de peso molecular de 12-14,000 contra 25 mi de solución salina. El sistema fue equilibrado por agitación mecánica suave durante 72 horas a 25°C. La concentración de BA de la solución dializada (correspondiente a la fracción no unida libre) y de la solución de partida se determinó con HPLC-ESI-MS/MS en las mismas condiciones del análisis previo.
El por ciento de unión de albúmina se calculó a partir de la concentración de BA inicial y de la concentración no unida en la fracción dializada. Los datos se registran en la tabla 4.
El por ciento de unión de albúmina del compuesto Ih3e es ligeramente mayor que CA y esto deriva de la presencia de ios grupos 23 metilo y 6 etilo.
EJEMPLO 11: ESTABILIDAD METABÓLICA IN VITRO EN CULTIVO DE HECES HUMANAS Estabilidad a bacteria intestinal Ejemplo 11a: 7a-deshidroxilación Heces humanas frescas homogenizadas (500 mg) se transfirieron a frascos estériles a los cuales se agregó 5 mL de medio esterilizado de carne picada-glucosa (Scott Lab., Fiskville, Rl). Después se agregó BA a una concentración final de 0.05 mM. Los frascos se incubaron a 37°C; después, a 0, 1, 2, 4, 8 y 24 horas después de la adición del BA, la reacción se detuvo con 150 µ? de 30% de KOH. Las muestras se centrifugaron a 3500 rpm durante 10 minutos; del sobrante líquido el BA fue aislado por extracción de fase sólida C-18 y analizado por TLC y H PLC-ES-MS/ S .
Se empleó cromatografía de capa delgada (TLC), utilizando placas con grosor de 0.25 mm de gel de sílice (Merck, Darmstat, Alemania), . como la primera prueba de exploración. El sistema de solvente usado para la separación de BA conjugado fue compuesto de ácido propiónito/acetato de isoamilo/agua/N-propanol (3:4:1:2, v/v/v/v; solvente I), y aquél del BA no conjugado fue ácido acético/tetracloruro de carbono/éter isopropílico/acetato de isoamilo/agua/N-propanol/benceno (1:4:6:8:2:2, v/v/v/v/v/v; solvente II). Se reveló BA separado con 5% de solución de etanol de ácido fosfomol íbdico.
El compuesto Ih3e fue muy estable cuando se incubó en cultivos de heces humanas e incluso después de 24 horas, más de 85% del compuesto fue recuperado no modificado. Por el contrario, el CDCA natural de referencia presentó un tiempo de media vida de casi una hora y después de 8 horas de incubación casi se metabolizó por completo (7-deshidroxilado) para formar ácido litocólico.
Después de un largo tiempo de incubación para Ih3e, prácticamente se abolieron la 7-deshidroxilación y la formación intermedia de un 7-oxo derivado.
Ejemplo 11b: Se sabe que la bacteria intestinal hidroliza el enlace de C24 amida y BAs conjugados con taurina y glicina y elimina el grupo 7a-hidroxilo de CA, conduciendo a la formación de BAs secundarios lipofílicos tóxicos tal como ácido desoxicólico (DCA) (Ridlon, J. ., y otros, J. Lipid Res. 2006, 47, 241-259). Para determinar la sensibilidad del compuesto Ih3e a 7-deshidroxilación mediada por flora intestinal, su estabilidad metabólica fue evaluada en cultivo de caldo de heces humanas como se describe en Roda, A., y otros, J. Lipid Res. 1994, 35, 2268-2279. El compuesto Ih3e parece no ser sensible a este proceso y se mostró ser altamente estable con más de 95% del compuesto no modificado después de 12 horas de incubación. En comparación, más de 50% de CA (ácido cólico) se metabolizó después de 1 hora y hasta 90% dentro de 8 horas (figura 15). Es probable que la estabilidad extendida del compuesto Ih3e se relacione con la alquilación de la posición 6 que provee obstáculo estérico al proceso de 7a-deshidroxilación bacteriana.
Estabilidad de cadena lateral De acuerdo con estos resultados, la cadena lateral del compuesto Ih3e no se modificó por actividades enzimáticas bacterianas intestinales.
Estos datos sugieren que la presencia del grupo etilo en la posición C-6 protege el grupo 7-hidroxilo hacia oxidación o eliminación por obstáculo estérico. Además, el compuesto Ih3e es muy estable también para metabolismo de cadena lateral. No se ha descubierto metabolitos menores por HPLC-ES-MS/MS . Estos datos sugieren que en el contenido intestinal menor en presencia de bacteria anaeróbica estos análogos son estables.
EJEMPLO 12: SECRECIÓN BILIAR Y METABOLISMO DEL COMPUESTO Ih3e EN FÍSTULA BILIAR DE RATA DESPUÉS DE ADMINISTRACIÓN DUODENAL (id) Y FEMORAL (iv) Ejemplo 12A: Objetivo y fundamento Las modificaciones estructurales de ácidos biliares podrían afectar su ingesta hepática, transportes hepáticos y secreción y absorción intestinal. Por lo tanto, el conocimiento de secreción biliar después de tanto administración iv como id su metabolismo es un punto clave en selección de compuesto para estudios adicionales.
Para evaluar el modo y eficiencia de la absorción intestinal del compuesto Ih3e, el compuesto fue administrado tanto intravenosamente (infusión femoral) como oralmente (infusión duodenal) a la misma dosis y su velocidad de secreción biliar fue evaluada en modelo de fístula biliar de rata.
Las diferencias en el área bajo la curva de la secreción biliar contra el tiempo entre administración iv e id, explican su absorción intestinal y dan información acerca de su biodisponibilidad. Además, el metabolismo hepático e intestinal también pudo ser bastante diferente y por tanto, se determinó la secreción biliar del compuesto Ih3e y sus metabolitos hepáticos principales.
Efecto colerético -Infusión duodenal El modelo de fístula biliar de rata se desarrolló en las instalaciones de laboratorio de la Universidad de Bologna. El compuesto Ih3e fue administrado a una dosis de 1 pmol/kg/min (1 hora de infusión) a un grupo de ratas vía infusión duodenal (id). Las ratas tuvieron una fístula biliar para recolectar muestras biliares en tiempos diferentes antes, durante y después de la infusión. Para experimento de infusión duodenal, 6 ratas (250 + 10 g) fueron tratadas. Se recolectaron muestras de bilis cada 15 minutos durante cuatro horas. Además, 3 ratas de control fueron tratadas con solución salina bajo las mismas condiciones por tiempos y muestreo (ratas de control duodenal).
La infusión duodenal del compuesto Ih3e aumentó significativamente la velocidad de flujo biliar que alcanzó el valor máximo de aproximadamente 120 pL/min/kg. Este fenómeno comenzó durante el periodo de infusión y continuó durante por lo menos 3 horas.
El compuesto Ih3e presentó el efecto colerético potente y esto se cree se relaciona con su estructura; un grupo metilo en la posición C-23 parcialmente previene conjugación y esta molécula puede pasar por un paso de percance colehepático. Para comparación, la infusión duodenal de CDCA ligeramente aumentado el flujo biliar, que no excedió 80 pL/min/kg.
-Infusión intravenosa Para experimento de infusión femoral, 6 ratas fueron tratadas.
La figura 12 muestra flujo biliar durante el estudio. La infusión femoral comenzó des'pués 75 minutos de estado estable y continuó por 60 minutos. Se recolectaron muestras biliares cada 15 minutos por cuatro horas. Además, 3 ratas fueron tratadas con 3% BSA solución salina bajo las-mismas condiciones por tiempos y muestreo (ratas de control de femoral). El flujo biliar durante infusión iv de 3% BSA vehículo de solución salina (control, n = 1) mantuvo un valor que varía de 40 a 80 pL/min/kg por el periodo entero del experimento.
La infusión iv del compuesto Ih3e aumentó significativamente la velocidad de flujo biliar y el fenómeno comenzó 15 minutos después de comenzar el periodo de infusión y continuó durante al menos dos horas. El efecto colerético fue bastante similar a eso lograr en el experimento de infusión id.
Las muestras biliares recolectadas durante los experimentos iv e id fueron analizadas para determinar la secreción biliar del compuesto Ih3e y sus metabolitos.
Análisis HPLC-ES-MS/MS Se obtuvo polvo cristalino puro del compuesto Ih3e del laboratorio R. Pellicciari de Perugia. Se prepararon soluciones de reserva en metanol a 1 mmol/l y se prepararon soluciones de trabajo al diluir volúmenes apropiados de la solución primaria. Metanol y acetonitrilo fueron de pureza de grado HPLC. Amoniaco fue 30% y ácido acético fue 99.8%. Todos los reactivos fueron obtenidos de Cario Erba Reagents. Se preparó agua con grado de HPLC por un sistema Milli-Q.
Preparación de muestra Las muestras de bilis de rata fueron llevadas a temperatura ambiente, brevemente agitadas, y diluidas 1:100 v/v (muestras de bilis de orinfusión duodenal) y 1:100 o 1:200 v/v (muestras de bilis de infusión femoral) con 15 mM regulador de acetato de amonio (pH = 5.0):acetonitrilo = 70:30 (v/v). La solución final se transfirió en un frasco de automuestra, y se inyectó 10 µ? en la columna cromatográfica.
Método de HPLC-ESI-MS/MS Se analizaron muestras de rata biliar por cromatografía liquida-espectrometría de masa tándem (HPLC-MS/MS) usando fuente de electrospray (ES) en modo de ionización negativo. Para cromatografía líquida, se usó un módulo de separación Waters Alliance 2695 acoplado con muestreador automático. El muestreador automático se mantuvo a 7°C. Se realizó separación en una columna Synergi Hydro-RP columna de C 8 (150x2.0 mm i.d., tamaño de partícula 4 pm), protegida por un SecurityGuard ODS 4x2. Omm i.d. precolumna, ambos suministrados de Phenomenex. El analito fue eluido usando 15 mM regulador de acetato de amonio (pH = 5.00) como fase móvil A y acetonitrilo como fase móvil B. La fase móvil B se aumentó de 30% a 64% en 10 minutos, entonces a 100% en 10 minutos, y se mantuvo constante durante 10 minutos. La velocidad de flujo fue 150 pL/min y la columna se mantuvo a 45°C. El efluente de columna se introdujo en fuente de ESI conectada a un espectrómetro de masa cuádruple triple (Quattro-LC, Micro.mass) operando en modo de adquisición Múltiple Reaction Monitoring (Monitoreo de reacción múltiple - MRM). Se usó nitrógeno como gas nebulizador a 100 L/h velocidad de flujo y como gas de desolvación a 930 L/h. Las temperaturas de bloque de fuente de iones y desolvación fueron ajustadas respectivamente a 80°C y 180°C. El voltaje capilar fue 3.0 k.V. Se usó software MassLynx versión 4.0 para adquisición de datos y procesamiento. Además, usando espectrometría de masa tanto MS individual como experimentos de configuración de MS/MS tándem se realizaron para identificar metabolitos.
Cuantificación Se preparó una curva de calibración de 5 puntos diariamente y se inyectó en duplicado. Se obtuvieron muestras de calibración en el rango de concentración de 0.1 a 20 pmol/L en fase móvil. Se obtuvieron parámetros de curva de calibración lineal del trazo del área pico de analito contra concentración de analito usando por lo menos análisis de regresión de cuadros (peso = 1/x2). Los coeficientes de correlación fueron =0.981.
Los metabolitos conjugados de taurina del compuesto Ih3e también fueron estimados. Los factores correctivos para considerar las diferentes respuestas en ES-MS/MS entre Especies libres y conjugadas de taurina, fueron estimados y aplicados a los valores de área obtenidos de cromatogramas de serie de datos de HPLC-MRM. Finalmente, se" usaron curvas de calibración obtenidas para los ácidos biliares libres para estimar los metabolitos conjugados de taurina.
Farmacocinética (secreción biliar) de los análogos administrados: comparación iv contra id Los datos se refieren a la velocidad de secreción del compuesto recuperado en bilis tal como después de infusión duodenal y femoral a una dosis de 1 umol/Kg/min.
La tabla 5 muestra valores de concentración y secreción para el compuesto Ih3e obtenidos de muestras biliares de rata recolectadas durante la infusión duodenal (1 hora variando de 75 a 135 minutos).
Tabla 5. Valores de concentración y secreción del compuesto Ih3e obtenidos de muestras biliares de rata recolectadas durante la infusión duodenal (1 hora variando de 75 a 135 minutos) La tabla 6 muestra valores de concentración y secreción obtenidos de muestras biliares de rata recolectadas durante la ¡nfusión femoral (1 hora variando de 75 a 135 minutos) Tabla 6. Valores de concentración y secreción del compuesto Ih3e obtenidos de muestras biliares de rata recolectadas durante la infusión duodenal (1 hora variando de 75 a 135 minutos) a-: no calculado Tabla 6A. Valores de concentración y secreción del Tauro-lh3e obtenidos de muestras biliares de rata recolectadas durante la infusión duodenal (1 hora variando de 75 a 135 minutos) Tiempo (min) Ih3e (n = 4) Conc. (mmol/L) Secreción (pmol/kg/min) 90 0.017 0.001 120 0.63 0.051 150 0.68 0.053 180 0.75 0.091 210 0.68 0.063 240 0.60 0.054 270 0.64 0.074 300 0.74 0.053 Tabla 6B. Valores de concentración y secreción del Tauro-lh3e obtenidos de muestras biliares de rata recolectadas durante la infusión duodenal (1 hora variando de 75 a 135 minutos) La secreción biliar del compuesto Ih3e después de administración iv fue eficiente y el compuesto fue recuperado en bilis en un porcentaje relativamente alto. El perfil cinético indicó que el compuesto fue eficientemente absorbido en el hígado y secretado en bilis parcialmente tal como y también, a un grado menor, metabolizado a más compuestos polares (figuras 13, 14a y 14b). Sin quererse limitar por ninguna teoría en particular, se cree que la presencia del grupo metilo en la posición C-23 impide el proceso de conjugación con taurina y glicina que en parte es relevante para una secreción eficiente de casi todo el BA carboxiladb que ocurre de manera natural; esto es fundamental para BA de dihidroxi y a un grado menor para BA de trihidroxi. El grado de su recuperación en bilis también se refiere a la dosis administrada. Después de administración id, la recuperación en bilis fue ligeramente menor que la recuperación después de administración iv sugiriendo que el compuesto no es eficientemente absorbido por el intestino (figura 13, 14c y 14d). Considerando las propiedades fisicoquímicas, se espera que este compuesto pudiera ser absorbido por mecanismo de difusión pasivo (LogP = 1.44) y un mecanismo activo no pareció estar involucrado. La presencia de tres grupos hidroxilo permite a la molécula en un lado ser eficientemente absorbido por el hígado y parcialmente secretada en bilis. También previene que la molécula sea absorbida por el intestino.
Ejemplo 12B Los resultados en la tabla mostrada a continuación revelan que el compuesto Ih3e tiene un efecto coleretico potente con la velocidad de secreción biliar máxima (SVO) siendo significativamente mayor que aquellos de CDCA y CA.
Tabla. Parámetros de secreción de lípido biliar después de infusión iv e id a una dosis de 1 (pmol/min)/kg peso corporal sobre 1 hora de BAsa aLos datos representan valores promedio y desviaciones estándar de seis experimentos diferentes. El vehículo usado para la administración id fue solución salina. El vehículo usado para la administración iv fue 3% BSA solución salina, pH 7.2. SV0: velocidad máxima de secreción biliar (/vl_/min)/kg peso corporal). SBA- velocidad máxima de secreción de BA ((^mol/min)/kg peso corporal). % libre: porcentaje de la dosis administrada recuperado en bilis de las moléculas como tales. % conjugado: porcentaje de la dosis administrada recuperada como BA conjugado.
Por consiguiente, los resultados en la tabla arriba muestran que el compuesto Ih3e es resistente a conjugación, con más de 90% del compuesto siendo secretado en la bilis en su forma no conjugada después de infusión intravenosa o intraduodenal. En contraste, CDCA y CA no se pueden secretar en bilis como tal, requiriendo el paso de conjugación. De esta manera, se prevee que el grupo metilo C23(S) del compuesto Ih3e previene activación de CoA carboxilo y conjugación posterior, así favoreciendo su paso shunt colehepático con una absorción ductular y un potente efecto colerético.
- Para estudiar más la influencia de la configuración del grupo metilo C23 en la amidación de cadena lateral y efecto colerético del compuesto, también se llevaron a cabo análisis similares en el otro epímero, a saber, ácido 6a-etilo-23( )-metilcólico (R-EMCA en la tabla anterior). La inspección de la velocidad máxima de secreción biliar (SVO) muestra que el efecto colerético de R-EMCA es todavía mayor que CA, aunque menor que el compuesto Ih3e. Como un resultado, estos datos sugieren que la orientación del grupo metilo C23 es importante para la conjugación del grupo carboxilo, con la porción de metilo cabiendo pobremente en el bolsillo catalítico de la enzima conjugadora en el caso del epímero C23(S). En general, estos resultados muestran que el compuesto Ih3e es eficientemente absorbido y pasa por ciclo enterohepático aunque con relativamente poca conjugación de hígado. La velocidad baja de conjugación también puede permitir al compuesto Ih3e que escape despeje de primer paso hepático y alcance la circulación sanguínea sistémica.
Metabolismo hepático Para una exploración preliminar, la búsqueda de los posibles metabolitos se realizó sobre la base de los compuestos esperados de acuerdo con experimentos y datos previos y la estructura y propiedades fisicoquímicas del compuesto Ih3e.
El compuesto Ih3e se secreta principalmente como compuesto origen (no modificado) y sólo se metabolizó ligeramente por el hígado. El metabolito principal fue el conjugado de taurina y el mono glucoronida estuvo presente en una cantidad baja. El metabolismo es similar tanto para administración iv como id. Considerando la recuperación en bilis, se espera identificar otros metabolitos. La presencia del grupo metilo en la posición C23 impide el proceso de conjugación con taurina y glicina que en parte es requerido para una secreción eficiente de casi todos los BAs carboxilados que ocurren de manera natural; esto es fundamental para hidroxi BA y a un grado menor para trihidroxi BA ya que son bastante más polares. La formación de glucurónidos podrían ser relevantes si se administran a dosis mayores.
La figura 14a muestra al compuesto Ih3e y sus metabolitos principales identificados en bilis usando espectrometría de masa en el experimento iv. Se registran datos como valores de área absolutos (n = 5). La figura 14b es un visualización en zoom de la figura 14a. La figura 14c muestra el compuesto Ih3e y sus metabolitos principales identificados en bilis usando espectrometría de masa en el experimento id. Se registran datos como valores de área absolutos. La figura 14d es una visualización en zoom de la figura 14c.
En resumen, el compuesto Ih3e es moderadamente hidrofílico y tiene una detergencia suave. Su absorción hepática parece eficiente. La secreción biliar también es eficiente considerando que el compuesto es secretado principalmente no modificado y, a un grado limitado, conjugado con taurina. La absorción intestinal también es eficiente, incluso si no está completa, y la molécula no requiere metabolismo hepático extensivo a la dosis administrada a ser secretada en bilis. La presencia del grupo metilo en la posición C23 previene conjugación extensiva con taurina para secreción biliar. Por lo tanto, hay un aumento en el tiempo de resonancia hepático de la molécula que pasa por un camino shunt colehepático, que es responsable por su potente efecto colerético.
EJEMPLO 13: TOXICIDAD IN VITRO EN CÉLULA HepG2 Los compuestos de la invención fueron evaluados para toxicidad in vitro usando un ensayo de célula HepG2. La citotoxicidad de célula HepG2 fue determinada al monitorear disminución de ATP y se determinó apoptosis de célula HepG2 al monitorear activación de caspasa-3. Los resultados se muestran en la tabla 7.
Citotoxicidad Se midió la viabilidad celular usando Perkinelmer ATP-Lite 1 STEP. ATP es un marcador para viabilidad celular ya que está presente en todas las células metabólicamente activas y la concentración declina muy rápidamente cuando las células pasan por necrosis o apoptosis. Se Sembraron células HepG2 (1x104) en placa de 96 pozos y estimuladas con diluciones de 10 pliegues de 1 nM a 300 µ? del compuesto Ih3e durante 4 horas a 37°C. Las placas fueron equilibradas a temperatura ambiente durante 10 minutos y 100 pl de ATP-Lite 1 STEP. Se agregó reactivo a 100 pl de células con medio de cultivo. Se leyó luminiscencia con Víctor Light (PerkinElmer). La señal experimental fue sustraída del fondo. Se usó tamoxifeno como control positivo de citotoxicidad celular, mientras que el control negativo fue las células no tratadas.
Apoptosis Las caspasas participan en el control molecular de apoptosis y Sustrato TruPoínt Caspasa-3 permite ensayo de fluorescencia resuelto en tiempo sensible, robusto y homogéneo de actividad de caspasa-3. Se sembraron células de hepatocitos humanos (HepG2) (1x104) en placa de 96 pozos con medio de HepG2 sin piruvato de sodio. Las células fueron estimuladas 4 horas a 37°C con diluciones en serie del compuesto de prueba Ih3e de 1nM a 300 µ? en triplicado. Se usó estaurosporina como control positivo de células apoptóticas. Los controles negativos fueron: 1. Células no estimuladas; 2. Medio solo sin células; 3. Células incubadas sin el sustrato de caspasa. Se agregó regulador de lises y sustrato de caspasa-3 a las células y 1 hora y 24 horas después se midió la fluorescencia con EnVision.
Necrosis La necrosis celular fue analizada al medir- la liberación de Lactato Deshidrogenasa (LDH) de las células necróticas usando el ensayo de integridad de membrana homogénea CytoTox ONE de Promega. Se sembraron células HepG2 (1x104) en una placa de 96 pozos. Después de 18 horas de incubación, se reemplazó medio fresco sin piruvato de sodio y libre de suero y se agregó compuesto Ih3e en respuesta de dosis de 0.1 µ? a 500 µ?. Se usó 1% de tritón como control máximo de liberación de LDH. Se usó tamoxifeno como inductor de necrosis. Las células chapadas se colocaron de nuevo en la incubadora durante 4 horas adicionales. El sobrante líquido fue transferido en una placa nueva y se agregó a la placa el mismo volumen de. reactivo CytoTox-ONE. Después de 1 hora de incubación, se leyó la fluorescencia con el lector de placa de multietiqueta EnVision con una longitud de onda de excitación de 560 nm y una emisión de 590 nm.
Tabla 7.
Toxicidad In Vitro en células HePG2 Compuesto CITOTOXICIDAD APOPTOSIS NECROSIS Disminución de ATP Activación de Caspasa-3 Liberación de LDH EC„<M ) ECM (µ ) ???(µ?) Estaurosporina 15 3 n.d.
Tamoxifeno(Wecros's| 47 4 35 LCA 84 65 105 CDCA 650 890 >1000 UDCA >1000 n.d. n.d.
CA >1000 n.d. n.d.
Compuesto Ih3e >1000 n.d. n.d.
EJEMPLO 14: ENSAYOS DE SELECTIVIDAD DE NR La selectividad de los compuestos de la invención se calculó usando métodos de ensayo conocidos en la técnica. Específicamente, se usaron los siguientes métodos de ensayo: FXR y LXR: Reclutamiento de coactivador (alfascreen); TGR5: nivel de cAMP en línea celular intestinal humana (NCI-H716); PXR: Ensayo de competencia de ligandos (Ensayo de unión) CAR: Reclutamiento de coactivador (Lanthascreen) La tabla 8 muestra los resultados de estos ensayos.
Ensayo de coactivador TR-FRET Se usó ensayo Lanthascreen (Invitrogen) para ensayo de selectividad receptora nuclear. El equipo usa un anticuerpo anti-GST marcado con terbio, un péptido coactivador marcado con f luoresce ína , y un dominio de unión a ligando NR que es marcado con glutationa-S-transferasa (GST) en un formato de ensayo de mezclar-y-leer homogéneo. Los ensayos fueron realizados en placas de 384 micropozos ( PerkinElmer). Una reacción de ensayo total de 20 pt incluyó 5 nM NRs marcados con GST, 125 nM de péptido co-regulador, 5 nM de anticuerpo marcado con TB-anti-GST (terbio-anti-glutationa S transferasa marcada), 5 mM DTT y concentración variante del compuesto Ih3e en el regulador de ensayo suministrado por Invitrogen. El control negativo fue desprovisto del compuesto Ih3e pero contuvo todo lo demás contenido en el pozo agonista. Después de 1 hora de incubación en la oscuridad, se hicieron mediciones de TR-FRET en la Envision. La relación de emisión 520/495 fue trazada contra concentraciones de ligando variantes. Los datos fueron analizados usando GraphPad Prism usando la ecuación de curva sigmoidal con inclinación variable para obtener los valores de EC50. v Tabla 8.
Ensayos de Selectividad de NR EJEMPLO 15: ESTABILIDAD DE COMPUESTO La estabilidad del compuesto Ih3e fue determinada usando métodos conocidos en la técnica. La concentración de fracción celular fue 1 mg/ml sobre un curso de tiempo de 0-15-30-60-120-240-360-1440 minutos. Los controles positivos fueron testosterona (1000 ng/ml); 7-hidroxi coumarina (1296 ng/ml); ácido benzoico (2440 ng/ml) sobre un curso de tiempo de 0-10-20-40-60-120. El método analítico usado fue separación de LC/MS en columna C18 por polaridad de gradiente; adquisición realizada en Monitoreo de un solo ión. Los resultados se muestran más adelante en la tabla 9.
Tabla 9.
EJEMPLO 16: LIBERACIÓN DE GLP-1 EX VIVO La figura 16 muestra que el compuesto Ih3e dramáticamente y de manera dependiente de dosis induce la liberación de GLP-1 ex vivo. La figura 16 muestra el impacto de 1 hora de exposición a concentración indicada del compuesto Ih3e en liberación de GLP-1 ex vivo en explantas ¡leales aisladas de ratones machó de TGR5-Tg alimentados con dieta alta en grasa de 18 semanas (n = 4). Los datos son representados como medio ± SE: prueba t no asociada del Alumno, (*) P ? 0.05, explantas ¡leales tratadas con compuesto Ih3e contra tratadas con vehículo.
Los siguientes procedimientos experimentales se utilizan en los ejemplos 17-21.
Químicos and Reactivos Todos los reactivos bioquímicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich a menos que se indique lo contrario. El inhibidor DPP4 (DPP4Í) sitagliptina fue un regalo generoso de Dr. C. Ullmer (Hoffman-La Roche). El compuesto Ih3e se sintetizó como se describió previamente ( Macchiarulo y otros, 2008; Pellicciari y otros, 2007).
Cultivo celular Se llevaron a cabo experimentos in vitro en células tratadas STC-1 o NCI-H716 tratadas con vehículo (DMSO) o el compuesto Ih3e. El compuesto Ih3e fue evaluado para su actividad agonística en TGR5 como se describió previamente (Macchiarulo y otros, 2008, J. Chem. Inf. Model. 48, 17*92; Pellicciari y otros, 2007, J. Med. Chem. 50, 4265-4268). Se realizó producción de cAMP como se describe (Sato y otros, 2008, J. Med. Chem. 51, 1831; Watanabe y otros, 2006, Nature 439, 484). La actividad de- Cox fue evaluada al seguir la oxidación de citocroma c completamente reducido (Sigma) a 550 nm (Feige y otros, 2008b, Cell Metab. 8, 347). Se midieron relación de ATP/ADP y liberación de GLP-1 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Biovision y Millipore, respectivamente). Se prepararon adipocitos cafés primarios como se describió previamente (Watanabe y otros, 2006, Nature 439, 484), y explantas ¡leales se prepararon de acuerdo con un método establecido (Cima y otros, 2004, J. Exp. Med. 200, 1635-1646).
Cuantificación de calcio intracelular Se sembró NCI-H716 (40,000 células) en placas negras de 96 pozos revestidas con Matrigel (BD Biosciences). Setenta y dos horas después de la transfección , se lavaron células dos veces en regulador de ensayo (HBSSIx, 20mM HEPES [pH 7.4]) y ensayadas para calcio intracelular con Fluo-4 AM de acuerdo con el protocolo del fabricante ( I n vitroge n ).
Bioquímica e Histoquímica Se midieron los parámetros de plasma y contenido de lípido fecal como se describe (Mataki y otros, 2007, Mol. Cell. B i o 1. 27, 8330-8339). Se realizó manchado con hematoxilina y eosina (H&E), Sirius rojo y aceite rojo como se describe (Mark y otros, 2007, Curr. Protoc. Mol. Biol. Capítulo 29, unidad 29B, 24), y se tomaron micrografías en microscopios de campo amplio (Leica) con una cámara de CCD. Para secreciones pancreáticas, se confeccionaron islotes y se contaron de cuatro secciones alternadas manchadas con HE separadas de 150 µ? usando software ImageJ (cinco animales por grupo). Se realizó manchado inmunofluorescente de insulina como se describe (Fajas y otros, 2004, J. Clin. Invest. 113, 1288). Adicionalmente, se aislaron islotes pancreáticos por digestión de colagenasa de páncreas de ratones de TGR5-Tg alimentados con dieta alta en fibra de acuerdo con procedimientos disponibles en línea (por ejemplo, ver LOVE (sitio web Journal of Visualized Experiments)). Se extrajo insulina después de incubación O/N a -20°C en etanol ácido y medido por ELISA en muestras diluidas de PBS de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mercodia). Se midió liberación de GLP-1 in vitro, ex vivo, e in vivo de acuerdo con los métodos conocidos en la técnica.
Medición de consumo de oxígeno Se midió el consumo de oxígeno celular usando un analizador Seahorse Bioscience XF24 con diez réplicas biológicas por condición (Feige y otros, 2008b, Cell Metab. 8, 347).
Experimentos animales Los animales fueron alojados y criados de acuerdo con procedimientos estandarizados (Argmann "y Auwerx, 2006b). Se usaron ratones macho de la misma edad para todos los experimentos. Se generaron modelos de ratón genéticamente maquinados (GEMMs), es decir, TGR5-Tg y TGR-/-, como se describe en los Datos Suplementarios. DIO en los GEMMs o ratones C57BL/6J (Charles River) se indujo al alimentar ratones de 8 semanas con una dieta alta en grasa (60% cal/grasa, D12492; Research Diets) durante al menos 8 semanas, como se mencionó en las leyendas de texto y figura. En los experimentos de intervención con dieta, el compuesto Ih3e se mezcló con dieta (Feige y otros, 2008a, Curr. Protoc. Mol. Biol. Capítulo 29, unidad 29B, 25) a la dosis suficiente para alcanzar una dosis in vivo de 30 mg/kg/d. Se realizaron experimentos de fenotipo de ratón de acuerdo con protocolos EMPRESS (ver, por ejemplo, sitio web Empress (Recurso de Fenotipo de Ratón Europeo de Visualización Estandarizada)) y fueron dirigidos para evaluar la ingesta de alimento y agua, composición corporal (Argmann y otros, 2006a, Curr. Protoc. Mol. Biol. Capítulo 29, unidad 29A, 23), gasto de energía (Argmann y otros, 2006a, Curr. Protoc. Mol. Biol. Capítulo 29, unidad 24a, 23), homeostasis de glucosa y lípido (Argmann y otros, 2006b, Curr. Protoc. Mol. Capítulo 29, Unidad 29A, 22); Heikkinen y otros, 2007, Curr. Protoc. Mol. Capítulo 29, Unidad 29B, 23; Mataki y otros, 2007, Mol. Cell. Biol. 27, 8330), y bioquímica de plasma (Argmann y Auwerx, 2006a, Curr. Protoc. Mol. Biof. Capítulo 29, Unidad 29A, 22). Se recolectaron tejidos y sangre y procesaron para histopatolog ía, química sanguínea, y expresión de gen de acuerdo con procedimientos estandarizados (Argmann y Auwerx, 2006a; Feige y otros, 2008b; Mark y otros, 2007; Watanabe y otros, 2006). Se realizaron estudios hiperinsulinémicos euglicémicos con pinza como se describe (Feige y otros, 2008b), con modificaciones menores incluyendo un cambio en el bolo de insulina inicial (30 mU/kg) y velocidad de infusión de insulina (10 mU/min/kg). Se midieron los niveles de GLP-1 de plasma por ELISA (Millipore) en sangre recolectada por punción retro-orbital. Se realizaron experimentos con ratones db/db (Charles River) en animales de 14 semanas alimentados con CD sin o con compuesto Ih3e (30 mg/kg/d) durante 6 semanas (Feige y otros, 2008a).
Esbozo de expresión de gen Se realizó esbozo de expresión de gen por PCR cuantitativo en tiempo real (Feige y otros, 2008b; Watanabe y otros, 2006). Las secuencias de imprimador han sido previamente publicadas, excepto aquellas usadas para el gen Kir6.2: R-5' AGATGCTAAACTTGGGCTTG (SEC ID NO. 1), F-5' TAAAGTGCCCAC ACC ACTC (SEC ID NO. 2).
Estadística Se realizaron análisis estadísticos al usar la prueba t no asociada del Alumno. Los datos se expresan como medio ± SEM, y los valores P menores de 0.05 fueron considerados estadísticamente significativos.
EJEMPLO 17: EXPRESIÓN DE TGR5 mARN Previamente se había establecido un unión entre BAs y gasto de energía in vivo (Watanabe y otros, 2006, Nature, 439, 484-489), de esta manera se especuló que la activación de señalización de TGR5 podría impactar actividad de la mitocondria en un modo más general. Para encontrar apoyo inicial para esta hipótesis, se analizó expresión de TGR5 mARN vía la base de datos de mARN de hígado de GeneNetwork en la población de referencia genética BxD como se encontró en el sitio web GeneNetwork de la Universidad de Tennessee. Un amplio rango de variación en expresión de TGR5 mARN fue evidente entre las cepas de ratón BxD diferentes. De manera interesante, la expresión de TGR5 mARN fue altamente correlacionada de manera significativa con la expresión de varios genes codificando para subunidades de complejos involucrados en fosforilación oxidante, tal como citocroma c oxidasa (Cox) (por ejemplo, CoxVMa, figura 17A) y ATP sintasa (Atp6v0b, ATPase H + transportando VO subunidad B; Atpaf2, factor 2 de ensamble de complejo de ATP sintasa mitocondrial F1; Atp1 a3, ATPase Na+/K + transportando alfa 3 polipéptido; Atp6v1 b2, ATPase H + transportando VI subunidad B isoforma 2). Consistente con esta observación, el tratamiento de células STC-1 con el compuesto Ih3e resultó en un aumento dependiente de cAMP en actividad de Cox (figura 17B), el cual se asoció con un aumento en consumo de oxígeno celular (figura 17C) y un aumento en la relación de ATP/ADP (figura 17D). Este resultado fue confirmado en la línea celular enteroendócrina humana NCI-H716, en donde el tratamiento con compuesto Ih3e aumentó producción de ATP en una manera dependiente de cAMP. De manera interesante, la expresión de TGR5 también se correlacionó fuertemente con aquella de Kir6.2, un componente del canal de potasio dependiente de ATP (KATP ) (figura 17E). Estas correlaciones fueron corroboradas además por interferencia de TGR5 ARN en células STC-1, que resultaron en una caída concomitante en la expresión de CoxIV y Kir6.2 mARNs (figura 17F).
EJEMPLO 18: ACTIVACIÓN DE RUTA DE SEÑALIZACIÓN DE TGR5 AUMENTA NIVELES DE CALCIO INTRACELULAR Y ESTIMULA LIBERACIÓN DE GLP-1 EN CÉLULAS L E N TE RO E N D ÓC R I N AS En células ß pancreáticas, se establece bien que un aumento en la relación de ATP/ADP derivada de metabolismo de glucosa cierra los canales de KATP, resultando en despolarización de la membrana de plasma. Esta despolarización de membrana a su vez abre canales de voltaje con calcio (Cav), causando influjo de calcio. El aumento resultante en calcio- intracelular entonces dispara la interacción directa entre proteínas exocitóticas situadas en la membrana granular con insulina y aquellas ubicadas en la membrana de plasma (Yang y Berggren, 2006, Endocr. Rev. 27, 621-676), conduciendo a la liberación posterior de insulina (Nichols, 2006, Nature, 440, 470-476). Descubrimientos recientes soportan la hipótesis de que los canales de KATP y Ca„ también juegan un papel pivotal en liberación de GLP-1 de células L enteroendócrinas (Reimann y Gribble, 2002, Diabetes 51, 2757-2763; Reimann y otros, 2008, Cell Metab. 8, 532-539). De manera fascinante, en la población de referencia BxD, también se descubrió que la expresión de TGR5 correlacionada con la expresión de Cav2.2 (Figura 18A), cuya expresión se describió previamente en células enteroendócrinas (Reimann y otros, 2005, J. Physiol. 563, 161-175) y que participa en liberación de insulina estimulada con calcio en células 3 pancreáticas (Yang y Berggren, 2006, Endocr. Rev. 27, 621-676).
Junto con esto, el compuesto Ih3e aumentó robustamente el influjo de calcio en la línea celular enteroendócrina humana NCI-H716, un efecto que fue potenciado por sobre-expresión de TGR5 y, en contraste, desafilado por interferencia de TGR5 ARN (figuras 18B y 18 C ) o por la adición del inhibidor de adenilato ciclasa MDL-1 2330A(MDL) (figura 18D). Además, la presencia de glucosa realzó el aumento dependiente de TGR5 en calcio intracelular (figuVa 18E). Este efecto se correlacionó con un aumento en liberación de GLP-1 de la células NCI-H716 (figura 18F), que fue inhibido por MDL-12-330A.
La liberación de GLP-1 mediada por TGR5 disparada por el compuesto Ih3e se confirmó más en las células STC-C enteroendócririas de ratón en donde el impacto del compuesto Ih3e en liberación de GLP-1 fue realzado por sobre-expresión de TGR5, al mismo tiempo siendo prevenido por interferencia de ARN (figura 18G) o por MDL-12-330A, además subrayando la dependencia de cAMP de liberación de GLP-1 mediada por TGR5 (figura 18H). Tomados juntos, estos datos demuestran que TGR5 regula una ruta clave que gobierna la liberación de GLP-1 de células L enteroendócrinas.
EJEMPLO 19: SOBRE-EXPRESIÓN DE TGR5 MODULA SECRECIÓN DE GLP-1 IN VIVO Para evaluar más el papel metabólico de señalización de TGR5, se evaluó el impacto de sobre-expresión transgénica de TGR5 in vivo en el contexto de DIO en ratones. Los ratones transgénicos de TGR5 (TGR5-Tg) fueron generados por inyección de oocito del cromosoma artificial bacteriano (BAC) RP23-278N1. Por PCR cuantitativo en tiempo real, los ratones de TGR5-Tg mostraron haber integrado seis copias del clon RP23-278N1 1 BAC, conduciendo a una expresión robusta de TGR5 mARN, restringido a la mayoría de los .tejidos que expresan TGR5 normalmente. * La tolerancia a la glucosa fue notablemente mejorada en ratones de TGR5-Tg retados durante 10 semanas con una dieta alta en grasa (HF) en comparación con crías alimentadas con dieta alta en grasa de control (figura 19A), mientras que no se notó ninguna diferencia en ratones a dieta de chow (CD) (datos no mostrados). En contraste con nuestras expectativas, no se observaron diferencias en ganancia de peso corporal entre ratones de tipo silvestre y de TGR5-Tg en dieta de CD o HF, demostrando que la mejora de tolerancia a la glucosa en ratones de TGR5-Tg no se pudo atribuir a los efectos confundidos de pérdida de peso. La ausencia de ganancia de peso en ratones de TGR5-Tg, en la consecuencia de un aumento en gasto de energía, fue explicada por una reducción de actividad locomotora. Ya que los ratones knockout receptores de GLP-1 muestran una hiperactividad notable (Hansotia y otros, 2007, J. Clin. Invest. 117, 143-152), se administró el agonista receptor Ex4 de GLP-1 a ratones de tipo silvestre a fin de evaluar si la disminución en actividad locomotora en ratones de TGR5-Tg se podría ligar a secreción de GLP-1. Ex4 de manera eficiente y dependiente de dosis redujo actividad locomotora en ratones. De manera interesante, a 1 nmol/Kg, se notó una disminución significativa en actividad locomotora mientras que los ratones todavía estaban comiendo propiamente.
De manera interesante, y de acuerdo con las expectativas, la tolerancia a la glucosa en ratones de TGR5-Tg se asoció con una secreción de GLP-1 robusta y liberación de insulina en respuesta a una ¾arga de glucosa oral (figura 19B). La importancia de la secreción de GLP-1 realzada fue subrayada por el hecho de que las mediciones de niveles de GLP-1 de plasma se realizaron sin administración oral preliminar de un inhibidor de dipeptidilo peptidasa-4 (DPP4) a los ratones. Esta liberación de GLP-1 realzada en ratones de TGR5-Tg ayuda a explicar la actividad locomotora disminuida en estos ratones. Para investigar más el impacto de sobre-expresión de TGR5 en secreción de GLP-1, los ratones alimentados con dieta alta en grasa posteriormente fueron retados con una comida de prueba para estimular liberación de BA de la vesícula. De manera interesante, el impacto de sobre-expresión de TGR5 en insulina y secreción de GLP-1 se pronunció más postprandialmente ,que después del simple reto de glucosa (figura 19C). Se especula que estos efectos se deben al flujo de BA aumentado disparado por la comida de prueba en comparación con el reto de glucosa. En línea con esta hipótesis, el tratamiento de explantas ¡leales de ratones de TGR5-Tg y control con ácido litocólico (LCA) confirmó que los BAs proveen una señal excelente para inducir liberación de GLP-1 en el contexto de alta expresión de TGR5 (figura 19D). Estos datos además están de acuerdo con los resultados obtenidos en células STC-1 transfectadas con TGR5 en donde la liberación de GLP-1 también fue impulsada por expresión aumentada de TGR5 (figura 19G). Se especula que en el contexto de explantas ¡leales de tipo silvestre, la degradación rápida de GLP-1 por enzima DPP4 puede enmascarar el aumento moderado en liberación de GLP-1 disparada por LCA.
El impacto de GLP-1 en función pancreática se ha documentado extensivamente durante la última década y varía de efectos de insulina-secretagogo a la promoción de sobrevivencia y proliferación de islote pancreático (Drucker, 2006, Cell Metab. 3, 153-165). En este contexto, el manchado inmunofluorescente de insulina en secciones pancreáticas reveló que, en contraste con islotes hipertróficos con bajo contenido de insulina, como se observó en ratones de control alimentados con dieta alta en grasa, islotes de ratones de TGR5-Tg alimentados con dieta alta en grasa no fueron hipertróficos y manchados más intensivamente para insulina (figura 19E). En línea con estos datos, el conteo y dimensión de islotes pancreáticos confirmó que la expresión de TGR5 resulta en el mantenimiento de un perfil de distribución de islote normal (figura 19F), probablemente debido a niveles realzados de GLP-1 de plasma. Además, el contenido de insulina de islotes pancreáticos aislados fue significativamente mayor en ratones de TGR5-Tg alimentados con dieta alta en grasa que en controles (figura 19G).
Para establecer más un papel de señalización de TGR5 en el mantenimiento de homeostasis de glucosa, se evaluó la tolerancia a glucosa de ratones deficientes de TGR5 de la línea germinal (TGR5"'" ) generada al criar ratones en donde el alelo de TGR5 se hizo flox con ratones transgénicos de CMV-Cre. En contraste directo con lo que se observó en ratones de TGR5-Tg, la tolerancia a la glucosa fue dañada en ratones de TGR5_ " retados con una dieta alta en grasa durante 8 semanas (figura 19H), mientras que no se observó diferencia en ratones alimentados con chow (datos no mostrados). Entonces se probó la secreción de GLP-1 al retar ratones de TGR5 + / + y TGR5"'" con una carga de glucosa oral 30 minutos después de la administración de solución salina o el compuesto Ih3e solo, o en combinación con el inhibidor de DPP4 (DPP41), sitaglitina. La administración previa del compuesto Ih3e aumentó moderadamente la liberación de GLP-1 después de un reto de glucosa en ratones de TGR5 + /+ (figura 191). Sin embargo, este efecto fue marcadamente más pronunciado que cuando se co-administró DPP4¡ como una consecuencia de su habilidad de prolongar la vida media de GLP-1 de plasma (Drucker y Nauck, 2006, Lancet, 368, 1696-1705) (figura 191). En contraste, los efectos del compuesto Ih3e en niveles de GLP-1 de plasma fueron desafilados en ratones de TGR5+ + (figura 19J). Juntos, estos datos subrayan el papel crítico de señalización de TGR5 en el control de liberación de GLP-1 y demuestran además la especificidad del compuesto Ih3e agonista semi-sintético in vivo.
EJEMPLO 20: EL COMPUESTO lh3e AGONISTA DE TGR5 AUMENTA GASTO DE ENERGÍA Y REDUCE ESTEATOSIS HEPÁTICO Y OBESIDAD AL ALIMENTAR CON DIETA ALTA EN GRASA En vista del perfil mejorado de glucosa e insulina en ratones de TGR5-Tg, se evaluó después el potencial terapéutico del compuesto Ih3e mixto a una dosis de 30 rhg/kg/día (mkd) con la dieta en un estudio de intervención en ratones C57BL/6J en donde la diabesidad fue inducida por alimentar con dieta a ta en grasa durante 14 semanas. Como es de esperarse, el perfil de HPLC de BAs de plasma confirmó la presencia del compuesto Ih3e en los ratones tratados solamente (figura 20A). Los niveles de plasma del compuesto Ih3e estuvieron dentro del rango de aquellos de CA y ácido 3-muricólico. Cabe señalar que el tratamiento con compuesto Ih3e no afectó la composición de BA de plasma ni el perfil de expresión de las enzimas involucradas en síntesis de BA, cuya expresión principalmente está bajo el control de receptores nucleares. La ausencia completa de cambios en el nivel de expresión de genes objetivo clásicos de FXR en el hígado, tal como 7a-hidroxilasa de colesterol (CYP7A1) y bomba de exportación de sal biliar (BSEP) (Thomas y otros, 2008, Nat. Rev. Drug Discovery 7, 678-693), confirmó además la especificidad del compuesto Ih3e hacia TGR5.
Después de 10 semanas de tratamiento con el compuesto Ih3e, una atenuación significativa de ganancia de peso corporal de aproximadamente 15%, en asociación con una reducción aguda en masa de grasa, se observó en ratones tratados con Ih3e alimentados con dieta alta en grasa relativos a controles alimentados con dieta alta en grasa (figuras 20B y 20C). El aumento en masa de almohadilla de hígado y grasa también se atenuó en ratones tratados con Ih3e alimentados con dieta alta en grasa (figura 20D). Como se notó en el estudio previo con CA (Watanabe y otros, 2006, Nature, 439, ¾84-489), la disminución en masa de BAT se relacionó a una disminución de tejido adiposo blanco (WAT) en la región interescapular (figura 20D y datos no mostrados). Los cambios metabólicos entre ratones alimentados con dieta alta en grasa de control y alimentados con dieta alta en grasa tratados con Ih3e no fueron causados por una ingesta calórica reducida (figura 20E) o pérdida de energía fecal, sino fueron la consecuencia de gasto de energía realzado, como se indica por la medición de consumo de 02 y producción de C02 durante calorimetría indirecta (figura 20F). Durante el periodo oscuro, el cociente respiratorio de ratones tratados con Ih3e fue significativamente reducido, consistente con quema aumentada de grasa (figura 20F). El esbozo de expresión de gen de BAT confirmó que la activación de la ruta de señalización de TGR5 dispara el aumento de varios genes de la mitocondria involucrados en gasto de energía junto con una inducción de expresión de gen de tipo 2-desyodinasa (figura 20G). La activación de la cadena respiratoria de la mitocondria por el compuesto Ih3e se evidenció más al medir consumo de 02 en adipocitos cafés primarios aislados de ratones C57BL/6J tratados durante 12 horas con el compuesto Ih3e. Además del agente de no acoplamiento, carbonilcianida-ptrifluorometoxifenilhidrazona (FCCP), impulsó consumo de O2 basal en todas las condiciones pero fue significativamente menos pronunciado en aquellos tratados con el compuesto Ih3e (figura 20H). Además del consumo de energía realzado, también mejoró la función del hígado, como se evidenció por la reducción en esteatosis de hígado, que se evaluó por manchado de aceite rojo O (figura 201 ) y cua ntif icación bioquímica de contenido de lípido de hígado (figura 20J). Además, los niveles de plasma de enzimas de hígado se redujeron notablemente en comparación con controles alimentados con dieta alta en grasa, correlacionando con la ausencia de fibrosis de hígado en secciones de hígado de ratones tratados con Ih3e manchados con rojo Sírius (figuras 20I y 20K). La mejora en función hepática también se reflejó por la caída significativa en triglicéridos de plasma y ácidos grasos no esterificados (NEFAs) en ratones alimentados con dieta alta en grasa tratados con el compuesto Ih3e (figura 20L).
EJEMPLO 21: EL COMPUESTO Ih3e AGONISTA DE TGR5 MEJORA SENSIBILIDAD A INSULINA EN RATONES OBESOS Se determinó la habilidad del compuesto Ih3e para mejorar homeostasis de glucosa. En ambos ratones DIO y db/db, un modelo ambiental y genético de diabesidad, respectivamente, tratamiento con el compuesto Ih3e (30 mkd) mixto con la tolerancia a la glucosa robustamente mejorada con dieta después de un reto oral con glucosa (figuras 21A y 21C), junto con una mejora del perfil de secreción de insulina estimulado con glucosa (figuras 21B y 21D, panel inferior). Esta característica es consistente con una mejora mediada con GLP-1 en función pancreática. Además, los niveles de glucosa e insulina por ayuno fueron disminuidos en ratones DIO y db/db que fueron tratados con el compuesto Ih3e (figuras 21B*y 21D, panel superior). Para caracterizar además el impacto del compuesto Ih3e en homeostasis de glucosa y sensibilidad a insulina, se realizó una pinza de glucosa hiperinsulinémica euglicémica en estos ratones DIO. Consistente con la tolerancia a glucosa mejorada, la velocidad de infusión de glucosa requerida para mantener euglicemia en ratones DIO tratados con el compuesto Ih3e fue casi idéntica a aquella observada en ratones de control alimentados con chow (figura 21E). Aunque los ratones alimentados con dieta alta en grasa resistentes a insulina mostró una producció endógena aumentada de glucosa hepática, junto con una reducción de velocidad de eliminación de glucosa y la supresión de producción de glucosa por insulina, tratamiento con compuesto Ih3e de ratones alimentados con dieta alta en grasa normalizaron estos parámetros a los valores observados en ratones alimentados con chow (figura 21E). La medición de absorción de 14C-desoxiglucosa estimulada con insulina durante la pinza de glucosa hiperinsulinémica euglicémica indicó que la mejora en homeostasis de glucosa por el compuesto Ih3e pudo atribuirse principalmente a resistencia reducida a insulina en hígado y músculo (figura 21F). Estos efectos se correlacionaron con la normalización en la expresión de genes clave involucrados en homeostasis de glucosa hepática (figura 21G).
Para tratar la especificidad del compuesto Ih3e con respecto a TGR5 in vivo, el impacto de tratamiento de 4 semanas con el compuesto Ih3e a 30 mkd en tolerancia a glucosa se comparó en ratones de TGR5' y TGR5, cebados por alimentación alta en grasa por 9 semanas. Incluso sobre este periodo de tiempo corto, el compuesto Ih3e mejoró significativamente la tolerancia a la glucosa en TGR5 + /+ alimentado una dieta alta en grasa (figura 6A), junto con -una normalización de secreción de insulina durante reto de glucosa oral (figura 6B). Estos efectos fueron desafilados en ratones de TGR5 + / + , así proveyendo más argumentos para soportar la especificidad del compuesto Ih3e para TGR5 (figuras 22A y 22B).
EJEMPLO 22: FARMACOC1 ÉTICA Y METABOLISMO EN RATAS CON FÍSTULA BILIAR DESPUÉS DE ADMINISTRACIÓ IV PARA COMPUESTOS Ih3e E Ii3e La diferencia entre los dos diaestereoisómeros puros, Ih3e e I i 3 e , es que el grupo C-23 metilo está orientado de modo diferente, así generando las formas 23S y 23R. Esta modificación de estructura en parte pudo modificar las propiedades fisicoquímicas, metabolismo y farmacocinética de los dos compuestos. La introducción de un grupo C-23 metilo en la cadena lateral orientada de manera diferente produjo dos isómeros en donde también el grupo carboxi está orientado de manera diferente y su reactividad en el proceso de amidación o en la desconjugación de la forma amidada puede ser diferente entre los dos diasetereoisómeros. La orientación del grupo carboxi diferente también es responsable de un balance diferente hidrofóbico/hidrof ílico de las dos moléculas lo que podría resultar en propiedades biológicas y metabolismo diferentes. A fin de aclarar este punto, los dos isómeros puros fueron administrados por infusión femoral (i.v.) a un modelo de rata de fístula biliar a una sola dosis de 1 pmol/min/kg peso corporal durante 1 hora y se recolectaron muestras biliares durante 3 horas. El efecto en flujo de bilis, en secreción biliar del compuesto origen y del metabolito principal también fueron evaluados.
Flujo biliar, efecto colerético Métodos Este estudio se realizó por administración de los dos compuestos vía infusión femoral (iv); 6 ratas (peso corporal 267 ± 12 g) fueron tratadas con cada diaestereoisómero a una dosis de 1 pmol/min/kg. La infusión femoral inició después de 75 minutos de estado estable y continuó durante 60 minutos. Se recolectaron muestras biliares cada 15 minutos durante 2 horas. Además, 3 ratas fueron tratadas con 3% de solución salina de BSA bajo las mismas condiciones por momentos y muestreo (ratas de control femoral).
Resultados El flujo biliar durante infusión iv del vehículo de control de 3% solución salina de BSA mantuvo un valor variando de 40 a 60 pL/min/kg durante el periodo entero de los experimentos. La infusión iv del compuesto Ih3e aumentó significativamente la velocidad de flujo biliar y este fenómeno inició 15 minutos después del comienzo del periodo de infusión y continuó durante al menos 2 horas después del final del periodo de infusión (figura 23). La infusión iv del compuesto lh-3e también aumentó la velocidad de flujo biliar pero este efecto es significativamente menor que aquél" observado para el compuesto Ih3e de isómero (figura 23).
Farmacoci nética (secreción biliar) de los isómeros administrados después de infusión iv Se analizaron las muestras biliares recolectadas en tiempos diferentes durante los experimentos iv para determinar las secreciones biliares de los isómeros administrados y sus metabolitos principales recuperados en la bilis.
Materiales Se obtuvo polvo cristalino puro de cada compuesto del laboratorio de R. Pellicciari en la Universidad de Perugia. Se prepararon soluciones de reserva en metanol a 1 mmol/L y se prepararon soluciones de trabajo a I diluir volúmenes apropiados de la solución primaria. Metanol y acetonitrilo fueron de pureza de grado de HPLC. El amoniaco fue 30% puro y el ácido acético fue 99.8% puro. Todos los reactivos se obtuvieron de Cario Erba Reagents. Se preparó agua con grado de HPLC por un sistema de Milli-Q.
Preparación de muestra * Las muestras biliares de rata fueron llevadas a temperatura ambiente, brevemente agitadas, y diluidas 1:100 o 1:200 v/v con 15 mM de regulador de acetato de amonio (pH = 5.0): acetonitrilo (70:30 v/v). La solución final se transfirió en un frasco de auto-muestra y se inyectó 10 pL en la columna cromatográfica. Cuando las muestras fueron encontradas fuera de rango de linealidad, se diluyeron y volvieron a analizar.
Método de H PLC-ESI-MS/MS Se analizaron muestras biliares de rata por HPLC-ESI-MS/MS usando la fuente de ESI en modo de ionización negativa. Para cromatografía líquida, se usó un módulo de separación Waters Alliance 2695 acoplado con automuestreador. El automuestreador se mantuvo a 7"C. Se realizó separación en una columna Synergi Hydro-RP C18 (150 x 2.0 mm i.d., 4 pm tamaño de partícula), protegido por una precolumna SecurityGuard ODS 4 x 2.0 mm i.d., ambos suministrados por Phenomenex. El analito se eluyó usando 15 mM de regulador de acetato de amonio (pH = 5.0) como fase móvil A y acetonitrilo como fase móvil B. La fase móvil B se aumentó de 30% a 64% en 10 minutos, después a 100% en 10 minutos, y se mantuvo constante durante 10 minutos. La velocidad de flujo fue 150 pL/min y la columna se mantuvo a 45°C. El efluente de columna se introdujo en modo de adquisición de monitoreo de reacción múltiple (MRM). Se usó nitrógeno como gas nebulizador a velocidad de flujo 100 L/h y como gas de desolvatación a 930 L/h1: El bloque de fuente de iones y temperaturas de desolvatación se ajustaron respectivamente a 80°C y 180°C. El voltaje capilar fue 3.0 kV. -Se usó software MassLynx versión 4.0 para adquisición y procesamiento de datos. Además, usando espectrometría de masa tanto en configuraciones de MS individual como MS/MS tándem, se realizaron experimentos para identificar metabolitos.
Cuantificación Se preparó una curva de calibración de 5 puntos diariamente y se inyectó en duplicado. Se obtuvieron muestras de calibración en el rango de concentración de 0.1-20 pmol/l preparadas en la fase móvil. Se obtuvieron parámetros de curva de calibración lineal usando un análisis de regresión de menos cuadros (peso = 1/x2). Los coeficientes de correlación fueron = 0.994. Los metabolitos conjugados de taurina de los compuesto Ih3e e I i 3e también fueron estimados incluso si no hubo estándares disponibles. Un factor correctivo, para considerar las diferentes respuestas en ES-MS/MS entre especies conjugadas libres y taurinas, estimado previamente se aplicó a los valores de área obtenidos de cromatogramas de serie de datos de HPLC-MRM. Finalmente, se usaron curvas de calibración obtenidas para el BA libre para estimar metabolitos conjugados de taurina.
Resultados de secreción biliar, compuesto Ih3e > La secreción biliar del compuesto Ih3e después de administración iv fue eficiente y el compuesto fue recuperado en bilis a un porcentaje relativamente alto de la dosis administrada. El perfil cinético indica que el compuesto Ih3e fue tomado eficientemente por el hígado y secretado en bilis principalmente no modificado y también, a un grado mejor conjugado con taurina (figura 24); otros metabolitos menores incluyendo glucuronidas se han identificado en bilis en cantidades de rastro (figuras 26 y 27).
La presencia del grupo metilo en la posición C-23 impide el proceso de conjugación fisiológica con taurina y glicina que es relevante para secreción eficiente de casi todo el BA carboxilado que ocurre de manera natural; esto es crucial para dihidroxi-BA y a un grado menor para trihidroxi-BA. El grado de su recuperación en bilis también se relaciona con la dosis administrada como ha sido observada para ácido cólico (Roda A. y otros, Hepatology, 8, 1571-6, 1988).
Considerando las propiedades fisicoquímicas del compuesto Ih3e, se esperó que este compuesto fuese absorbido por un mecanismo pasivo de difusión (Log P = 1.44) y un mecanismo activo no pareció estar involucrado. La presencia de tres grupos hidroxilo permite a la molécula ser eficientemente absorbida por el hígado y secretada en bilis. El grupo 6 -e ti I o previene también 7-deshidroxilación de bacteria intestinal como se muestra en el reporte previo.
Resultados - Secreción Biliar - Compuesto M3e - La secreción biliar del compuesto M3e después de infusión iv se reporta en la figura 25. El perfil cinético indica que el compuesto se metaboliza por el hígado más extensivamente que el compuesto Ih3e. El compuesto origen es secretado en bilis como tal y a un grado menor como conjugado de taurina. Con respecto a este compuesto Ih3e de diaestereoisomero, el porcentaje de conjugación es mayor y la velocidad máxima de secreción de la forma no conjugada es menor. Esto sugiere que el isómero C-23(R) presenta una geometría de cadena lateral y orientación más adecuada para el proceso de amidación con respecto al isómero (S) que es secretado como forma no conjugada a porcentaje mayor. La conjugación con taurina contribuye a mejorar la recuperación del compuesto I i 3 e en bilis que es aproximadamente 70-80% de la dosis administrada. Otros metabolitos menores incluyendo glucuronidas han sido identificados en bilis en cantidad de rastro (figuras 28-29).
Metabolismo hepático Métodos Usando los datos obtenidos de experimentos previos así como propiedades estructurales y fisicoquímicas de los análogos estudiados, se llevó a cabo una visualizacion preliminar para buscar posibles metabolitos.
Compuesto Ih3e Esta molécula fue secretada principalmente como compuesto origen (no modificado) y sólo se metabolizó ligeramente por el hígado. Ei metabolito principal fue la especie conjugada de taurina y, a niveles muy bajos, se detectó la especie de mono-glucuronida (figuras 26-27).
La presencia del grupo metilo en la posición C-23 impide el proceso de conjugación con taurina y glicina que se requiere para una secreción eficiente de casi todos los BAs carboxilados que ocurren de manera natural; es crucial para dihidroxi BA y a un grado menor para trihidroxi BA ya que ya son bastante polares. La formación de glucuronidas podría ser relevante si se administra a dosis mayores.
I Compuesto I i 3 e Esta molécula principalmente fue secretada como compuesto origen (no modificado) y también se metabolizó por el hígado para formar la especie conjugada taurina y, a niveles muy bajos, la especie de mono-glucuronida (figuras 27-29)., La presencia del grupo metilo én la posición C-23 impide el proceso de conjugación con taurina y glicina que se requiere para una secreción eficiente de casi todos los BAs carboxilados que ocurren de manera natural; es crucial para dihidroxi BA y a un grado menor para trihidroxi BA ya que ya son bastante polares. La formación de glucuronidas podría ser relevante si se administra a dosis mayores.
El compuesto I i 3 e es secretado en bilis en porcentaje mayor que el compuesto Ih3e de diaestereoisomero como forma conjugada de taurina, 20-30% contra 5-10% y esto cuenta por la geometría diferente de cadena lateral y a una lipofilicidad ligeramente mayor del compuesto I i 3 e .
El compuesto Ih3e es moderadamente hidrofílico y tiene una detergencia leve. Su absorción hepática parece eficiente. La secreción biliar también es eficiente considerando que el compuesto es secretado principalmente no modificado y, a un grado limitado, conjugado con taurina. La absorción intestinal ocurre vía mecanismo pasivo como BA no conjugado que ocurre de manera natural y la cinética es similar a aquella de ácido cólico ligeramente menor que ácidos biliares de dihidroxi (Aldini R. y otros, Steroids, 61, 590-7, 1996).
El compuesto Ih3e no requiere metabolismo hepático extensivo a la dosis administrada a ser secretada en bilis. La presencia del grupo metilo en la posición C-23 (S) previene conjugación extensiva con taurina y la molécula se puede secretar eficientemente no modificada.1" Un tiempo de residencia hepático aumentado de la molécula resulta de una absorción ductular ya que esta molécula pasa por una ruta shunt colehepática, la cual es responsable por su efecto colerético potente.
El compuesto M3e es el diaestereoisómero del compuesto Ih3e. El compuesto I i 3e se caracteriza por una hidrofilicidad ligeramente menor como un resultado de la geometría diferente de cadena lateral. Por lo tanto, el grupo carboxi C-23 está orientado de manera diferente y esto cuenta por el balance hidrof ílico-hidrofóbico diferente de la molécula. Como una consecuencia de su lipofilicidad mayor la molécula requiere una conjugación más extensiva con taurina con respecto al compuesto Ih3e. La geometría de cadena lateral del último compuesto probablemente produce un BA con una especificidad de sustrato menor hacia la enzima responsable por la conjugación mediada por proceso de activación de CoA. El resultado final es que el compuesto M3e es secretado en bilis en un porcentaje conjugado mayor que el compuesto Ih3e.
Otras modalidades Aunque la invención ha sido descrita junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior debe ilustrar y no limitar el alcance de la invención, la cual es definida por el alcance de las reivindicaciones anexas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Se entenderá por aquellos expertos en la técnica que se pueden hacer varios cambios en forma y detalles ahí sin alejarse del alcance de la invención abarcada por las reivindicaciones anexas.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1.- Un compuesto Ih3e teniendo la estructura química: , o una sal, hidrato, o conjugado de aminoácido de glicina o taurina del mismo.
2. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, en donde el compuesto es un conjugado de aminoácido de glicina.
3. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, en donde el compuesto es un conjugado de aminoácido de taurina.
4.- El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el compuesto es una sal farmacéuticamente aceptable.
5. - Una composición farmacéuticamente aceptable que comprende un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.
6. - Un compuesto para usarse en un método de tratar o prevenir enfermedad en un sujeto, el método que comprende administrar un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o una sal o hidrato del mismo farmacéuticamente aceptable, además en donde la enfermedad se selecciona a partir de enfermedad metabólica, enfermedad inflamatoria, enfermedad del hígado, enfermedad autoinmune, enfermedad cardiaca, enfermedad de riñon, cáncer y enfermedad gastrointestinal.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK1392714T3 (da) 2001-03-12 2006-01-09 Intercept Pharmaceuticals Inc Steroider som agonister for FXR
US10987362B2 (en) 2004-03-12 2021-04-27 Intercept Pharmaceuticals, Inc. Treatment of fibrosis using FXR ligands
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JP5292310B2 (ja) 2007-01-19 2013-09-18 インターセプト ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｔｇｒ５調節剤としての２３−置換胆汁酸およびその使用方法
CN105037476B (zh) 2008-07-30 2018-06-12 英特塞普特医药品公司 Tgr5调节剂及其使用方法
HUE039171T2 (hu) * 2008-11-19 2018-12-28 Intercept Pharmaceuticals Inc TGR5 modulátorok és azok alkalmazási eljárása
WO2010062861A2 (en) 2008-11-26 2010-06-03 Satiogen Pharmaceuticals, Inc. Bile acid recycling inhibitors for treatment of obesity and diabetes
WO2010062863A2 (en) * 2008-11-26 2010-06-03 Satiogen Pharmaceuticals, Inc. Compositions containing satiogens and methods of use
EP2575821B1 (en) 2010-05-26 2015-08-12 Satiogen Pharmaceuticals, Inc. Bile acid recycling inhibitors and satiogens for treatment of diabetes, obesity, and inflammatory gastrointestinal conditions
CN107375932B (zh) 2011-10-28 2021-12-21 夏尔人类遗传性治疗公司 用于治疗小儿胆汁淤积性肝病的胆汁酸再循环抑制剂
US9982008B2 (en) 2012-06-19 2018-05-29 Intercept Pharmaceuticals, Inc. Preparation and uses of obeticholic acid
CA3028207A1 (en) 2012-06-19 2013-12-27 Intercept Pharmaceuticals, Inc. Preparation, uses and solid forms of obeticholic acid
CN110151591A (zh) 2012-10-09 2019-08-23 宝洁公司 鉴定协同化妆品组合的方法
US10302630B2 (en) 2012-10-09 2019-05-28 The Procter & Gamble Company Method of identifying or evaluating beneficial actives and compositions containing the same
US9884066B2 (en) 2013-06-06 2018-02-06 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Bile acid-basic amino acid conjugates and uses thereof
AU2014278833A1 (en) * 2013-06-13 2016-01-07 Fast Forward Pharmaceuticals B.V. CD40 signalling inhibitor and a further compound, wherein the further compound is a bile acid, a bile acid derivative, an TGR5-receptor agonist, an FXR agonist or a combination thereof, for the treatment of chronic inflammation, and the prevention of gastrointestinal cancer or fibrosis.
JP6621409B2 (ja) 2013-11-22 2019-12-18 ミナ セラピューティクス リミテッド Ｃ／ＥＢＰα小分子活性化ＲＮＡ組成物
SI3626725T1 (sl) 2014-05-29 2023-04-28 Bar Pharmaceuticals S.R.L. Derivati holana za uporabo pri zdravljenju in/ali preprečevanju bolezni, posredovanih s FXR in TGR5/GPBAR1
US20180236064A1 (en) * 2014-10-03 2018-08-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Targeting tgr5 to treat disease
MX2017005935A (es) * 2014-11-06 2018-01-11 Enanta Pharm Inc Análogos de ácido biliar como agonistas fxr/tgr5 y métodos de uso de los mismos.
TWI686401B (zh) 2014-11-19 2020-03-01 英商Ｎｚｐ英國有限公司 化合物（三）
CA2968309A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 NZP UK Limited 6-alkyl-7-hydroxy-4-en-3-one steroids as intermediates for the production of steroidal fxr modulators
CA2968301C (en) 2014-11-19 2023-05-16 NZP UK Limited 5.beta.-6-alkyl-7-hydroxy-3-one steroids as intermediates for the production of steroidal fxr modulators
WO2016079520A1 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Dextra Laboratories Limited 6.alpha.-alkyl-6,7-dione steroids as intermediates for the production of steroidal fxr modulators
CN105985396A (zh) * 2015-02-16 2016-10-05 苏州泽璟生物制药有限公司 氘代鹅去氧胆酸衍生物以及包含该化合物的药物组合物
US20180148470A1 (en) * 2015-04-28 2018-05-31 Jiangsu Hansoh Pharmaceutical Group Co., Ltd. Cholic acid derivative, and preparation method and medical use thereof
CA2989167A1 (en) * 2015-06-19 2016-12-22 Intercept Pharmaceuticals, Inc. Tgr5 modulators and methods of use thereof
DK3310801T3 (da) 2015-06-19 2021-06-21 Intercept Pharmaceuticals Inc Tgr5-modulatorer og fremgangsmåder til anvendelse deraf
MX2018003649A (es) * 2015-09-24 2018-05-11 Intercept Pharmaceuticals Inc Metodos e intermedios para la preparacion de derivados de acido biliar.
IL258359B2 (en) * 2015-10-07 2023-11-01 Intercept Pharmaceuticals Inc Paranoid X receptor modulators.
CN109467585A (zh) * 2016-03-11 2019-03-15 深圳市塔吉瑞生物医药有限公司 用于预防或治疗fxr-介导疾病的胆烷酸化合物
KR102377338B1 (ko) 2016-04-13 2022-03-21 인터셉트 파마슈티컬즈, 인크. 암의 치료 방법
GB201608777D0 (en) 2016-05-18 2016-06-29 Dextra Lab Ltd Compounds
US10654834B2 (en) * 2016-07-01 2020-05-19 Venenum Biodesign, LLC Non-systemic TGR5 agonists
WO2018222701A1 (en) * 2017-05-30 2018-12-06 Intercept Pharmaceuticals, Inc. Treatment of renal diseases with a bile acid derivative
CN109021056B (zh) * 2017-06-09 2021-03-09 博瑞生物医药（苏州）股份有限公司 法尼酯x受体激动剂
KR20200031145A (ko) 2017-07-24 2020-03-23 인터셉트 파마슈티컬즈, 인크. 동위원소 표지된 담즙산 유도체
AU2018330495A1 (en) 2017-09-08 2020-03-26 Mina Therapeutics Limited Stabilized hnf4a sarna compositions and methods of use
GB201812382D0 (en) 2018-07-30 2018-09-12 Nzp Uk Ltd Compounds
US20220096495A1 (en) * 2019-02-04 2022-03-31 Intercept Pharmaceuticals, Inc. Treatment and prevention of intestinal inflammatory diseases with a bile acid derivative
CN116925168A (zh) * 2019-08-23 2023-10-24 深圳云合医药科技合伙企业(有限合伙) 胆汁酸衍生物及其组合物和应用
WO2021071837A1 (en) 2019-10-07 2021-04-15 Kallyope, Inc. Gpr119 agonists
CA3178994A1 (en) 2020-05-19 2021-11-25 Iyassu Sebhat Ampk activators
CN116390925A (zh) 2020-06-26 2023-07-04 卡尔优普公司 Ampk活化剂
KR20220004451A (ko) * 2020-07-03 2022-01-11 연세대학교 산학협력단 지방간 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물
CN113774142A (zh) * 2021-10-11 2021-12-10 北京化工大学 Tgr5在制备治疗肠癌药物及诊断性试剂盒中的应用

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0101554B1 (en) 1982-07-29 1986-10-15 Lehner A.G. New derivatives of biliary acids, process for the production thereof and pharmaceutical compositions containing the same
IT1206112B (it) 1983-04-29 1989-04-14 Lehner Ag Nuovi derivati di acidi biliari, procedimento per la loro preparazione e relative composizioni farmaceutiche.
IT1212835B (it) 1983-08-18 1989-11-30 Lehner Ag Derivati di acidi biliari, procedimento per la loro preparazione e relative composizioni farmaceutiche.
US4892868A (en) * 1984-08-17 1990-01-09 Gipharmex, S.P.A. Derivatives of biliary acids, process for the production thereof and corresponding pharmaceutical compositions
IT1196377B (it) 1984-12-21 1988-11-16 Lehner Ag Derivati di acidi biliari,procedimento per la loro preparazione e relative composizioni farmaceutiche
IT1223313B (it) * 1987-10-20 1990-09-19 Gipharmex Spa Derivati di acidi biliari loro preparazione e composizioni farmaceutiche che li contengono
US5175320A (en) * 1989-04-17 1992-12-29 Giuliani S.P.A. Fluorinated bile acid derivatives, processes for the preparation thereof and pharmaceutical compositions containing them
IT1229570B (it) 1989-04-17 1991-09-04 Giuliani Spa Derivati fluorurati di acidi biliari, loro preparazione e composizioni farmaceutiche che li contengono.
ES2074113T3 (es) * 1989-12-13 1995-09-01 Mitsubishi Chem Corp Nuevos derivados de acido pirazolil acrilico, utiles como fungicidas sistemicos para la proteccion de plantas y materiales.
AU1856997A (en) 1996-02-02 1997-08-22 Merck & Co., Inc. Method for raising hdl cholesterol levels
GB9604242D0 (en) 1996-02-28 1996-05-01 Glaxo Wellcome Inc Chemical compounds
GB9606805D0 (en) 1996-03-30 1996-06-05 Glaxo Wellcome Inc Medicaments
US5689791A (en) 1996-07-01 1997-11-18 Xerox Corporation Electrically conductive fibers
CA2260044A1 (en) 1996-07-12 1998-01-22 Stephen Alistair Smith Novel treatment of leptine resistance
US6008237A (en) * 1997-12-19 1999-12-28 Merck & Co., Inc. Arylthiazolidinedione derivatives
US6200995B1 (en) 1998-01-29 2001-03-13 Tularik Inc. PPAR-γ modulators
JP2002528721A (ja) 1998-10-23 2002-09-03 グラクソ グループ リミテッド 核内受容体のリガンド用のアッセイ
DE69940958D1 (de) 1998-12-23 2009-07-16 Glaxo Group Ltd Bestimmungsmethode fur liganden der nuklearen rezeptoren
US6465258B1 (en) 1999-01-07 2002-10-15 Tularik, Inc. FXR receptor-mediated modulation cholesterol metabolism
EP1473042B1 (en) 1999-03-26 2006-06-21 City of Hope Screening for FXR receptor modulators
US20020132223A1 (en) 1999-03-26 2002-09-19 City Of Hope Methods for modulating activity of the FXR nuclear receptor
CA2368234A1 (en) 1999-03-26 2000-10-05 City Of Hope Method of affecting cholesterol catabolism using nuclear bile acid receptor
US6906057B1 (en) * 1999-06-11 2005-06-14 Allergan, Inc. Methods for modulating FXR receptor activity
BR0011743A (pt) 1999-06-11 2002-03-05 Allergan Sales Inc Método para modular a atividade de receptor de fxr
US6559188B1 (en) * 1999-09-17 2003-05-06 Novartis Ag Method of treating metabolic disorders especially diabetes, or a disease or condition associated with diabetes
EP1284728A4 (en) 1999-10-22 2004-05-19 Merck & Co Inc MEDICINES FOR TREATING ADDICTIC ADDICTION
WO2001077325A1 (fr) 2000-04-12 2001-10-18 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouvelle proteine de recepteur couple aux proteines g et adn de celle-ci
US6627636B2 (en) * 2000-06-15 2003-09-30 Bristol-Myers Squibb Company HMG-CoA reductase inhibitors and method
AU2001288623A1 (en) * 2000-09-05 2002-03-22 Tularik, Inc. Fxr modulators
US20020119958A1 (en) 2001-02-13 2002-08-29 Shinichiro Tojo Therapeutic agent for hyperlipidemia
DK1392714T3 (da) * 2001-03-12 2006-01-09 Intercept Pharmaceuticals Inc Steroider som agonister for FXR
WO2002084286A1 (fr) 2001-04-12 2002-10-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de criblage
US20070010562A1 (en) 2001-08-13 2007-01-11 Ulrike Bauer Nr1h4 nuclear receptor binding compounds
EP1285914B1 (en) * 2001-08-13 2007-12-19 PheneX Pharmaceuticals AG Nr1h4 nuclear receptor binding compounds
EP1423113A4 (en) 2001-08-13 2007-04-18 Phenex Pharmaceuticals Ag NR1H4 NUCLEAR RECEPTOR BINDING COMPOUNDS
US20030144360A1 (en) 2001-11-19 2003-07-31 Allergan Sales, Inc. Composition and method for modulating BAR/FXR receptor activity
WO2003080803A2 (en) 2002-03-21 2003-10-02 Smithkline Beecham Corporation Methods of using farnesoid x receptor (fxr) agonists
CA2482195A1 (en) 2002-04-12 2003-10-23 The University Of Chicago Farnesoid x-activated receptor agonists
US6987121B2 (en) 2002-04-25 2006-01-17 Smithkline Beecham Corporation Compositions and methods for hepatoprotection and treatment of cholestasis
WO2004000752A1 (ja) 2002-06-19 2003-12-31 Availvs Corporation 人造石壁材
ITMI20021532A1 (it) 2002-07-12 2004-01-12 Roberto Pellicciari Composti chimici
EP1562915A1 (en) 2002-11-22 2005-08-17 SmithKline Beecham Corporation Farnesoid x receptor agonists
EP1591120A4 (en) 2003-01-28 2009-06-10 Takeda Chemical Industries Ltd RECEPTOR AGONISTS
WO2005032549A1 (en) 2003-09-26 2005-04-14 Smithkline Beecham Corporation Compositions and methods for treatment of fibrosis
EP1568706A1 (en) 2004-02-26 2005-08-31 Intercept Pharmaceuticals, Inc. Novel steroid agonist for FXR
EP2712617B2 (en) 2004-03-12 2020-11-18 Intercept Pharmaceuticals, Inc. Treatment of fibrosis using Fxr ligands
ITMI20050912A1 (it) 2005-05-19 2006-11-20 Erregierre Spa Processo di preparazione di acidi 3-a-ya(b)-diidrossi-6-a(b)-alchil-5b-colanici
DK2040713T3 (da) 2006-06-27 2014-09-29 Intercept Pharmaceuticals Inc Galdesyrederivater som fxr-ligander til forebyggelsen eller behandlingen af fxr-medierede sygdomme eller tilstande
EP1947108A1 (en) 2007-01-19 2008-07-23 Intercept Pharmaceuticals, Inc. TGR5 modulators and methods of use thereof
JP5292310B2 (ja) * 2007-01-19 2013-09-18 インターセプト ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｔｇｒ５調節剤としての２３−置換胆汁酸およびその使用方法
HUE039171T2 (hu) * 2008-11-19 2018-12-28 Intercept Pharmaceuticals Inc TGR5 modulátorok és azok alkalmazási eljárása

Also Published As

Publication number Publication date
KR20110086177A (ko) 2011-07-27
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DK2698375T3 (en) 2018-05-28
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LT2698375T (lt) 2018-07-10
ZA201104077B (en) 2012-02-29
HK1166327A1 (en) 2012-10-26
US20180016295A1 (en) 2018-01-18
US8114862B2 (en) 2012-02-14
AU2009316566B9 (en) 2014-05-15
IL244812B (en) 2019-03-31
IL212969A0 (en) 2011-07-31
EP2376519B1 (en) 2013-11-13
EA201170714A1 (ru) 2012-01-30
JP2015232020A (ja) 2015-12-24
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HUE039171T2 (hu) 2018-12-28
ES2663948T3 (es) 2018-04-17
AU2009316566A1 (en) 2010-05-27
PL2698375T3 (pl) 2018-08-31
IL212969A (en) 2016-04-21
EP2698375A2 (en) 2014-02-19
DK2376519T3 (da) 2014-02-03
BRPI0921983B1 (pt) 2021-04-20
JP2012509348A (ja) 2012-04-19

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AU2014204505B2 (en) TGR5 Modulators and Method of Use Thereof

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