MX2011004557A - Formulaciones de moleculas de union a antigeno de dominio sencillo. - Google Patents

Formulaciones de moleculas de union a antigeno de dominio sencillo.

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Abstract

La invención se relaciona con formulaciones de moléculas de unión a antígeno de dominio individual, por ejemplo moléculas de nanocuerpo, en particular formulaciones de moléculas de nanocuerpo de unión a TNF; las moléculas de unión a antígeno de dominio individual pueden incluir uno o más dominios de unión individual que interactúan con, por ejemplo, se unen a, una o más proteínas diana; las formulaciones son útiles, por ejemplo como formulaciones farmacéuticas; también se describe el método de preparación y uso de las formulaciones descritas aquí para tratar, por ejemplo, trastornos asociados con TNF.

Description

FORMULACIONES DE MOLÉCULAS DE UNIÓN A ANTÍGENO DE DOMINIO SENCILLO REFERENCIA CRUZADA CON RESPECTO A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reivindica prioridad con respecto al documento Número de Serie US 61/109,474, presentado el 29 de octubre de 2008, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.
REFERENCIA A LISTADO DE SECUENCIAS La presente solicitud contiene una Lista de Secuencias que se ha presentado mediante EFS-Web y se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad. Dicha copia ASCII, creada el 27 de octubre de 2009, se denomina W22373WO.txt, y tiene un tamaño de 8.343 bytes.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Avances en biotecnología han hecho posible producir una variedad de proteínas para aplicaciones farmacéuticas usando técnicas de ADN recombinante. Debido a que las proteínas tienden a ser más grandes y más complejas que los fármacos orgánicos e inorgánicos tradicionales, la formulación de dichas proteínas presenta problemas especiales. Para que una proteína permanezca biológicamente activa, la formulación debe conservar la integridad conformacional de al menos una secuencia núcleo de los aminoácidos de las proteínas, protegiendo el mismo tiempo de la degradación los grupos funcionales múltiples de la proteína. Las rutas de degradación para las proteínas pueden implicar inestabilidad química (es decir, cualquiera de los procesos que impliquen modificación de la proteína por formación de enlaces o escisión dando como resultado una nueva entidad química) o inestabilidad física (es decir, cambios en la estructura de mayor de orden de la proteína). La inestabilidad química puede dar como resultado, por ejemplo, la desamidación, racemización, hidrólisis, oxidación, eliminación beta o intercambio de puentes disulfuro. La inestabilidad física puede resultar de, por ejemplo, la desnaturalización, agregación, precipitación o adsorción. Tres rutas de degradación comunes en las proteínas son la agregación, desamidación y oxidación de las proteínas (Cleland y col. Crítical Reviews in Therapeutic Drug Carríer Systems 10(4): 307-377 (1993)).
El secado por congelación es una técnica comúnmente empleada para conservar las proteínas que sirve para eliminar el agua de la preparación de la proteína de interés. El secado por congelación o liofilización, es un procedimiento mediante el cual el material a secar se congela primero y después el disolvente helado o congelado se elimina mediante sublimación en un entorno al vacío. Puede incluirse un excipiente en las formulaciones pre- liofilizadas para potenciar la estabilidad durante el procedimiento de secado por congelación y/o mejorar la estabilidad del producto liofilizado durante el almacenamiento (Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990) y Arakawa y col., Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)).
Por lo tanto, aún existe la necesidad de desarrollar formulaciones de proteínas, particularmente para administración subcutánea, cuya conservación y suministro sean estables durante mucho tiempo..
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a formulaciones de moléculas de unión a antígeno de dominio sencillo (también denominado en el presente documento "moléculas UADS" (por ejemplo, moléculas de nanocuerpo, en particular formulaciones de moléculas de nanocuerpos de unión a TNF)). La molécula de UADS puede incluir uno o más dominios de unión a antígeno sencillos que interaccionan con, por ejemplo, uniéndose a, una o más proteínas diana. Las formulaciones son útiles, por ejemplo, como formulaciones farmacéuticas, para administración a un sujeto, por ejemplo, un ser humano. También se desvelan procedimientos para preparar y usar las formulaciones descritas en el presente documento, para tratar o prevenir, por ejemplo, trastornos asociados a TNF.
[Nota: Nanobody™ y Nanobodies™ son marcas comerciales registradas de Ablynx N. V] Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención se refiere a una formulación que incluye (a) una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula nanobody (por ejemplo, una molécula nanobody de unión a TNF); (b) un lioprotector; (c) (opcionalmente) un tensioactivo; (d) (opcionalmente) un agente formador de volumen; (e) (opcionalmente) un agente ajustador de la tonicidad; (f) (opcionalmente) un estabilizante; (g) (opcionalmente) un conservante, y (h) un tampón, de manera que el pH de la formulación sea de aproximadamente 5.0 a 7.5. En algunas realizaciones, la formulación es una formulación líquida, una formulación liofilizada, una formulación liofilizada reconstituida, una formulación en aerosol, o una formulación de almacenamiento a granel (por ejemplo, formulación de almacenamiento a granel congelada). En algunas realizaciones, la formulación se administra a un sujeto por inyección (por ejemplo, subcutánea, intravascular, intramuscular o intraperitoneal) o por inhalación.
En algunas realizaciones, la molécula de UADS, por ejemplo, la molécula nanobody (por ejemplo, la molécula nanobody de unión a TNF), en la formulación está en una concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 350 mg/ml, aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml, aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml, aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 130 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 130 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 120 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml a aproximadamente 120 mg/ml, aproximadamente 88 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml o aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 130 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml o aproximadamente 300 mg/ml.
En otras realizaciones, el lioprotector de la formulación es un azúcar, por ejemplo, sacarosa, sorbitol o trehalosa. Por ejemplo, el lioprotector puede ser sacarosa, sorbitol o trehalosa a una concentración de aproximadamente 2.5 % a aproximadamente 10 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %, aproximadamente 5 % a aproximadamente 8 % o aproximadamente 4 %, aproximadamente 4.5 %, aproximadamente 5 %, aproximadamente 5.5 %, aproximadamente 6 %, aproximadamente 6.5 %, aproximadamente 7 %, aproximadamente 7.5 %, aproximadamente 8 %, aproximadamente 8.5 % o aproximadamente 9 % (peso/volumen).
En otras realizaciones adicionales, el tampón en la formulación es un tampón de histidina a una concentración aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 40 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM o aproximadamente 10 mM, aproximadamente 20 mM o aproximadamente 30 mM. En otras realizaciones, el tampón en la formulación es un tampón Tris presente a una concentración menor de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 40 mM, aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM, o aproximadamente 10 mM, aproximadamente 20 mM o aproximadamente 30 mM. El pH de los tampones de la formulación está generalmente entre aproximadamente 5 y 7. En algunas realizaciones específicas, el pH del tampón de la formulación es de aproximadamente 5 a aproximadamente 7.5, aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.2. Por ejemplo, el pH del tampón puede ser aproximadamente 5, 5.5, 5.8-6.1 , 6, 6.1 , 6.5 ó 7.
En algunas realizaciones, la formulación (opcionalmente) incluye un tensioactivo a una concentración de aproximadamente 0.001 % a 0.6 %, por ejemplo, aproximadamente 0.01 % a 0.6 %, aproximadamente 0,1 % a 0,6 %, aproximadamente 0,1 % a 0.5 %, aproximadamente 0.1 % a 0.4 %, aproximadamente 0.1 % a 0.3 %, aproximadamente 0.1 % a 0.2 % o aproximadamente 0.01 % a 0.02 %. En algunos casos, la formulación contiene más del 0 % y hasta aproximadamente 0,6 % (por ejemplo, aproximadamente 0.1 % a 0.2 % de polisorbato-20, polisorbato-40, polisorbato-60, polisorbato-65, polisorbato-80, polisorbato-85, poloxámero-188, monolaurato de sorbitán, monopalmitato de sorbitán, monoestearato de sorbitán, monooleato de sorbitán, trilaurato de sorbitán, triestearato de sorbitán, trioleastato de sorbitán, o una combinación de los mismos. En realizaciones específicas, la formulación contiene aproximadamente 0.001 %, 0.002 %, 0.003 %, 0.004 %, 0.005 %, 0.006 %, 0.007 %, 0.008 %, 0.009 %, 0.01 % a 0.02 %, 0.01 %, 0.02 %, 0.03 %, 0.04 %, 0.05 %, 0.06 %, 0.07 %, 0.08 %, 0.09 %, 0.1 %, 0.1 % a 0.2 %, 0.1 1 %, 0.12 %, 0.13 %, 0.14 %, 0.15 %, 0.16 %, 0.17 %, 0.18 %, 0.19 % o 0.2 % de polisorbato-80. Como alternativa, la formulación puede incluir poloxámero-188 a aproximadamente 0,01 % a 0,6 %, aproximadamente 0.1 % a 0.6 %, aproximadamente 0.1 % a 0.5 %, aproximadamente 0.1 % a 0.4 %, aproximadamente 0,1 % a 0,3 % o aproximadamente 0.1 % a 0.2 %.
En algunas realizaciones, la formulación (opcionalmente) incluye un agente formador de volumen, por ejemplo, glicina, a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 25 a aproximadamente 175 mM, de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 75 a aproximadamente 125 mM o aproximadamente 100 mM.
En otras realizaciones, la formulación (opcionalmente) incluye adicionalmente un agente ajustador de la tonicidad, por ejemplo, una molécula que hace que la formulación sea sustancialmente isotónica o isoosmótica con la sangre humana. Los agentes ajustadores de tonicidad ejemplares incluyen sacarosa, sorbitol, glicina, metionina, manitol, dextrosa, inositol, cloruro sódico, arginina y clorhidrato de arginina.
En otras realizaciones adicionales, la formulación (opcionalmente) incluye adicionalmente un estabilizante, por ejemplo, una molécula que, cuando se combina con una proteína de interés (por ejemplo, la molécula de UADS) previene o reduce sustancialmente la inestabilidad química y/o física de la proteína de interés en forma de almacenamiento, liofilizada o líquida. Los estabilizantes ejemplares incluyen sacarosa, sorbitol, glicina, inositol, cloruro sódico, metionina, arginina y clorhidrato de arginina. En algunas realizaciones, las formulaciones incluyen un estabilizante en uno o más de los siguientes intervalos: sacarosa de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 12 % (por ejemplo, aproximadamente 5 %, aproximadamente 7.5 %, aproximadamente 8 % o aproximadamente 0 %); sorbitol de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 7 % (por ejemplo, aproximadamente 3 %, aproximadamente 4 %, aproximadamente 5 %); inositol de aproximadamente el 1 % a aproximadamente el 5 %; glicina de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 125 mM (por ejemplo, aproximadamente 25 mM a 100 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 90 mM o aproximadamente 100 mM); cloruro sódico de aproximadamente 10 mM a 150 mM (por ejemplo, aproximadamente 25 mM a 100 mM, aproximadamente 55 mM); metionina de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 mM (por ejemplo, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 100 mM); arginina de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 125 mM (por ejemplo, aproximadamente 25 mM a aproximadamente 120 mM o aproximadamente 100 mM); clorhidrato de arginina de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 70 mM (por ejemplo, aproximadamente 10 mM a aproximadamente 65 mM o aproximadamente 55 mM).
En otras realizaciones, la formulación puede incluir adicionalmente metionina, a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mM, de aproximadamente 25 a aproximadamente 175 mM, de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 mM, de aproximadamente 75 a aproximadamente 125 mM, o aproximadamente 100 mM.
En una realización, un componente de la formulación puede actuar como uno o más de un lioprotector, un agente ajustador de tonicidad y/o un estabilizante. Por ejemplo, dependiendo de la concentración de un componente, por ejemplo sacarosa, puede servir como uno o más de un lioprotector, un agente ajustador de tonicidad y/o un estabilizante. En otras realizaciones cuando se necesitan varios de los componentes en una formulación, se usan diferentes componentes. Por ejemplo, cuando la formulación necesita un lioprotector, un agente ajustador de tonicidad y un estabilizante, se usan diferentes componentes (por ejemplo, sacarosa, glicina e inositol pueden usarse en combinación dando como resultado un combinación de un lioprotector, un agente ajustador de tonicidad y un estabilizante, respectivamente).
En una realización, la formulación incluye (a) una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula nanobody (por ejemplo, una molécula nanobody de unión a TNF) a una concentración de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 300 mg/ml, por ejemplo, a aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 88 rng/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 1 18 mg/ml, aproximadamente 130 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml o aproximadamente 250 mg/ml; (b) sacarosa a una concentración de aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %, por ejemplo, aproximadamente 5 %, aproximadamente 6 %, aproximadamente 6.5 %, aproximadamente 7 %, aproximadamente 7.5 %, aproximadamente 8 %, aproximadamente 10 %; (c) polisorbato-80 a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 0,6 %, por ejemplo, 0.01 %, 0.02 %, 0.05 %, 0.1 %, 0.2 %, 0.3 %, 0.4 %, 0.5 % o 0.6 %; (d) (opcionalmente) glicina a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 100 m , por ejemplo, 100 mM; (e) (opcionalmente) metionina a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, 100 mM; y (f) un tampón de histidina (a una concentración aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM) o un tampón Tris (a una concentración aproximadamente 20 mM), de manera que el pH de la formulación sea de aproximadamente 5.0 a 7.5, por ejemplo, 5, 5.5, 5.8-6.1 , 6, 6.1 , 6.5 ó 7.
En una realización, la formulación es una formulación líquida. En una realización representativa la formulación líquida incluye a) una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula nanobody (por ejemplo, una molécula nanobody de unión a TNF) a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 88 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 118 mg/ml, aproximadamente 130 mg/ml; (b) sacarosa a una concentración de aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %, por ejemplo de aproximadamente 7 % a aproximadamente 8 %, por ejemplo, 7.5 % o sorbitol de aproximadamente 1 % a aproximadamente 7 % (por ejemplo, aproximadamente 3 %, aproximadamente 4 %, aproximadamente 5 %) (c) polisorbato-80 a una concentración de aproximadamente, por ejemplo, aproximadamente 0.01 % a 0.02 % (por ejemplo, 0.01 %); (d) (opcionalmente) glicina a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, 100 mM; (e) (opcionalmente) metionina a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, 100 mM; y (f) un tampón de histidina (a una concentración aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM) o un tampón Tris (a una concentración aproximadamente 20 mM), de manera que el pH de la formulación sea aproximadamente 5 a 7.5, por ejemplo, 5, 5.5, 5.8-6.1 , 6, 6.1 , 6.5 ó 7. La formulación líquida puede estar presente en un artículo de preparación, tal como un dispositivo, una jeringa o un vial con instrucciones para su uso. En algunas realizaciones, la jeringa o un vial está compuesto de vidrio, plástico o un material polimérico, tal como polímero o copolímero de olefina cíclica. En otras realizaciones, la formulación puede estar presente en un dispositivo inyectable (por ejemplo, una jeringa inyectable, por ejemplo, una jeringa inyectable previamente cargada). La jeringa puede adaptarse para administración individual, por ejemplo, como un sistema de un solo vial que incluye un autoinyector (por ejemplo, un dispositivo inyector de pluma) y/o instrucciones para su uso. La formulación puede administrarse a un sujeto, por ejemplo, un paciente mediante inyección, por ejemplo, administración periférica (por ejemplo, administración subcutánea, intravascular, intramuscular o intraperitoneal).
En otras realizaciones, la formulación es una formulación liofilizada. En una realización representativa, la formulación liofilizada incluye a) una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula nanobody (por ejemplo, una molécula nanobody de unión a TNF) a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 150 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 88 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 118 mg/ml, aproximadamente 130 mg/ml; (b) sacarosa a una concentración de aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %, por ejemplo, aproximadamente 4 % a aproximadamente 7 %, por ejemplo, 5 %; (c) polisorbato-80 a una concentración de aproximadamente, por ejemplo, 0,01 % a 0.02 % (por ejemplo, 0.01 %); (d) (opcionalmente) glicina a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, 100 mM; (e) (opcionalmente) metionina a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, 100 mM; y (f) un tampón de histidina (a una concentración aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM, por ejemplo, aproximadamente 20 mM), o un tampón Tris (a una concentración aproximadamente 20 mM), de manera que el pH de la formulación sea de aproximadamente 5 a 7.5, por ejemplo, 5, 5.5, 5.8-6.1 , 6, 6.1 , 6.5 ó 7. La formulación liofilizada puede reconstituirse mezclando el liofilizado con una composición acuosa adecuada.
En otras realizaciones adicionales, la formulación es una formulación de almacenamiento a granel. En una realización representativa, la formulación de almacenamiento a granel incluye a) una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula nanobody (por ejemplo, una molécula nanobody de unión a TNF) a una concentración de aproximadamente 80 mg/ml a 300 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 175 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml, aproximadamente 275 mg/ml o aproximadamente 300 mg/ml; (b) sacarosa a una concentración de aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %, por ejemplo aproximadamente 4 % a aproximadamente 8 %, por ejemplo, 5 % o 7.5 %; (c) polisorbato-80 a una concentración de aproximadamente, por ejemplo, 0.01 % a 0.02 %; (d) (opcionalmente) glicina a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, 100 mM; (e) (opcionalmente) metionina a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, 100 mM; y (f) un tampón de histidina (a una concentración aproximadamente 10 mM a aproximadamente 20 mM) o un tampón Tris (a una concentración aproximadamente 20 mM), de manera que el pH de la formulación sea de aproximadamente 5 a 7.5, por ejemplo, 5, 5.5, 5.8-6.1 , 6, 6.1 , 6.5 ó 7. La formulación de conservación a granel puede congelarse. En algunas realizaciones, la formulación de conservación a granel puede prepararse a gran escala, por ejemplo, más de 10 litros, 50 litros, 100, 150, 200 o más litros.
En algunas realizaciones, la molécula de UADS, por ejemplo, la molécula nanobody (por ejemplo, la molécula nanobody de unión a TNF) de la formulación incluye uno o más dominios de unión sencillos (por ejemplo, uno o más nanocuerpos). Por ejemplo, la molécula nanobody puede comprender o consistir en un polipéptido, por ejemplo, un polipéptido monocatenario que comprende al menos un dominio variable de inmunoglobulina (que incluye una, dos o tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR)). Los ejemplos de moléculas UADS incluyen moléculas desprovistas naturalmente de cadenas ligeras (por ejemplo, nanocuerpos, VHH o anticuerpos derivados de camélidos). Dichas moléculas UADS pueden derivar u obtenerse de camélidos tales como camello, llama, dromedario, alpaca y guanaco. En otras realizaciones, la molécula de UADS puede incluir moléculas de dominio sencillo que incluyen, pero sin limitación, otras moléculas de dominio sencillo de origen natural, tales como polipéptidos de dominio sencillo de tiburón (IgNAR); y armazones de dominio sencillo (por ejemplo, armazones de fibronectina). Las moléculas de dominio sencillo pueden derivar de tiburón.
En una realización, la molécula de UADS de la formulación es un polipéptido monocatenario que comprende una o más moléculas de dominio sencillo. En realizaciones, la molécula nanobody es monovalente o multivalente (por ejemplo, bivalente, trivalente o tetravalente). En otras realizaciones, la molécula nanobody es monoespecifica o multiespecífica (por ejemplo, biespecífica, triespecífica o tetraespecífica). La molécula de UADS puede comprender una o más moléculas de dominio sencillo que son recombinantes, injertadas con CDR, humanizadas, camelizadas, desinmunizadas y/o generadas in vitro (por ejemplo, seleccionadas por presentación de fagos). Por ejemplo, la molécula de UADS puede ser un polipéptido de fusión monocatenario que comprende uno o más moléculas de dominio sencillo que se unen a uno o más antígenos diana. Típicamente, el antígeno diana es una proteína de mamíferos, por ejemplo, un ser humano. En determinadas realizaciones, la molécula de UADS se une a una proteína sérica, por ejemplo, proteínas de suero humano seleccionadas de uno o más de albúmina de suero (albúmina de suero humana (ASH)), fibrina, fibrinógeno o transferrina.
En una realización ejemplar, la molécula de UADS de la formulación es una molécula biespecífica, trivalente compuesta por una fusión de polipéptido monocatenario de dos moléculas de dominio sencillo (por ejemplo, dos regiones variables de camélido) que se unen a un antígeno diana, por ejemplo, factor a de necrosis tumoral (TNF-a), y una molécula de dominio sencillo (por ejemplo, una región variable de camélido) que se une a una proteína sérica, por ejemplo, ASH. Las moléculas de dominio sencillo de la molécula de UADS pueden disponerse en el siguiente orden desde el extremo N- al C-: molécula de dominio sencillo de unión a TNFa - molécula de dominio sencillo de unión a ASH - molécula de dominio sencillo de unión a TNFa. Se apreciará que cualquier orden o combinación de las moléculas de dominio sencillo contra una o más dianas puede formularse como se describe en el presente documento.
En una realización, la molécula de UADS de la formulación se denomina en el presente documento "ATN-103," comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 30 (SEQ ID NO: 1), o una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de al menos 85 %, 90 %, 95 % o más idéntica a o que tiene hasta 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 cambios de aminoácidos (por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 30). Los ejemplos de moléculas de nanocuerpos biespecíficas trivalentes adicionales que pueden formularse como se describe en el presente documento incluyen TNF24, TNF25, TNF26, TNF27, TNF28, TNF60 y TNF62 desveladas en la Tabla 29 del documento WO 2006/122786.
En algunas realizaciones, al menos uno de la molécula de dominio sencillo de la molécula de UADS de la formulación se une a TNFa, incluye una, dos o tres CDR que tienen la secuencia de aminoácidos: DYWMY (SEQ ID NO: 2) (CDR1), EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO: 3) (CDR2) y/o SPSGFN (SEQ ID NO: 4) (CDR3), o que tiene una CDR que difiere en menos de 3, 2 ó 1 sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones conservativas) de una de dichas CDR. En otras realizaciones, la molécula de dominio sencillo comprende una región variable que tiene la secuencia de aminoácidos a partir de aproximadamente los aminoácidos 1 a 115 de la Figura 30 o una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la misma, (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos al menos el 85 %, 90 %, 95 % o más idéntica a, o que tiene hasta 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 cambios de aminoácidos (por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 30). En realizaciones, la molécula de dominio sencillo de unión a TNFa tiene una o más actividades biológicas de la molécula de anticuerpo de dominio sencillo de unión a TNFa mostrado en la Figura 30. Por ejemplo, la molécula de dominio sencillo de unión a TNFa se une al mismo o a un epítopo similar como el epítopo reconocido por la molécula de dominio sencillo de unión a TNFa mostrado en la Figura 30 (por ejemplo, se une a TNFa en su forma trimérica; se une al sitio TNFa poniendo en contacto el receptor de TNF; se une a un epítopo en el trímero TNFa que comprende Gln en la posición 88 y Lys en la posición 90 del primer monómero de TNF (monómero A), y Glu en la posición 146 del segundo monómero de TNF (monómero B), o un epítopo como se desvela en el documento WO 06/122786). En otra realización, la molécula de dominio sencillo de unión a TNFa tiene una actividad (por ejemplo, afinidad de unión, constante de disociación, especificidad de unión, actividad inhibidora con respecto a TNF) similar a cualquiera de la molécula de dominio sencillo de unión a TNFa desvelada en el documento WO 06/122786.
En otras realizaciones, la molécula nanobody de unión a TNFa comprende uno o más de los nanocuerpos desvelados en el documento WO 2006/122786. Por ejemplo, la molécula nanobody de unión a TNFa puede ser una molécula nanobody de unión a TNFa trivalente, bivalente, monovalente desvelada en el documento WO 2006/122786. Los nanocuerpos de unión a TNFa ejemplares incluyen pero sin limitación, TNF1 , TNF2, TNF3, formas humanizadas de los mismos (por ejemplo, TNF29, TNF30, TNF31 , TNF32, TNF33). Los ejemplos adicionales de nanocuerpos de unión a TNFa monovalentes se desvelan en la Tabla 8 del documento WO 2006/122786. Las moléculas nanobody de unión a TNFa bivalentes ejemplares incluyen, pero sin limitación, TNF55 y TNF56, que comprenden dos nanocuerpos TNF30 unidos mediante engarce peptídico para formar un solo polipéptido de fusión (desvelado en el documento WO 2006/122786). Se desvelan ejemplos adicionales de moléculas nanobody de unión a TNFa bivalentes en la Tabla 19 del documento WO 2006/122786 como TNF4, TNF5, TNF6, TNF7, TNF8).
En otras realizaciones, al menos uno de la molécula de dominio sencillo de la molécula de UADS de la formulación se une ASH incluye una, dos, o tres CDR que tienen las secuencias de aminoácidos: SFGMS (SEQ ID NO: 5) (CDR1), SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 6) (CDR2) y/o GGSLSR (SEQ ID NO:7) (CDR3), o que tiene una CDR que difiere en menos de 3, 2 ó 1 sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones conservativas) de una de dichas CDR. En otras realizaciones, la molécula de dominio sencillo comprende una región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de aproximadamente 125 a 239 aminoácidos de la Figura 30 (SEQ ID NO: 1), o una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a la misma (por ejemplo, una secuencia de aminoácidos de al menos el 85 %, 90 %, 95 % o más de identidad o que tiene hasta 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, 1 cambios de aminoácidos (por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservativas) con respecto a la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 30 (SEQ ID NO: 1). En realizaciones, la molécula de dominio sencillo de unión a ASH tiene una o más actividades biológicas de la molécula de dominio sencillo de unión a ASH mostrada en la Figura 30 (SEQ ID NO: 1). Por ejemplo, la molécula de dominio sencillo de unión a ASH se une a la misma o a un epítopo similar como el epítopo reconocido por la molécula de dominio sencillo de unión a ASH mostrado en la Figura 30 (SEQ ID NO: 1). En otra realización, la molécula de domino sencillo de unión a ASH tiene una actividad (por ejemplo, afinidad de unión, constante de disociación, especificidad de unión) similar a cualquiera de la molécula de dominio sencillo de unión a ASH desvelada en el documento WO 06/122786.
En otras realizaciones, la molécula de UADS de unión a ASH comprende uno o más de los nanocuerpos desvelados en el documento WO 2006/122786. Por ejemplo, la molécula de UADS de unión a ASH puede ser una molécula nanobody de unión a ASH trivalente, bivalente, monovalente desvelada en el documento WO 2006/122786. En otras realizaciones, la molécula de UADS de unión a ASH puede ser una molécula monoespecifica o multiespecífica que tiene al menos una de las especificidades de unión que se unen a ASH. Los nanocuerpos de unión a TNF ejemplares incluyen, pero sin limitación, ALB1, formas humanizadas de los mismos (por ejemplo, ALB6, ALB7, ALB8, ALB9, ALB10), desveladas en el documento WO 06/122786.
En otras realizaciones, se fusionan dos o más de las moléculas de dominio sencillo de las moléculas UADS, con o sin un grupo de enlace, como una fusión genética o polipeptídica. El grupo de unión puede ser cualquier grupo de unión evidente para los expertos en la materia. Por ejemplo, el grupo de unión puede ser un polímero biocompatible con una longitud de 1 a 100 átomos. En una realización, el grupo de unión incluye o consiste en poliglicina, poliserina, polilisina, poliglutamato, poliisoleucina o restos de poliarginina o una combinación de los mismos. Por ejemplo, los engarces de poliglicina o poliserina pueden incluir al menos cinco, siete, ocho, nueve, diez, doce, quince, veinte, treinta, treinta y cinco y cuarenta restos de glicina y serina. Los engarces que pueden usarse incluyen repeticiones de Gly-Ser por ejemplo, repeticiones de (Gly)4-Ser (SEQ ID NO: 8) de una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más repeticiones. En realizaciones, el engarce tiene las siguientes secuencias: (Gly)4-Ser-(Gly)3-Ser (SEQ ID NO: 9) o ((Gly)4-Ser)n (SEQ ID NO: 10), en el que n es 4, 5 ó 6.
Las formulaciones de la presente invención pueden incluir una molécula de UADS que se modifica asociando, por ejemplo, de manera covalente o no covalente un segundo resto. Por ejemplo, la molécula nanobody puede unirse covalentemente a un polímero adecuado farmacológicamente aceptable, tal como poli(etilenglicol) (PEG) o un derivado del mismo (tal como metoxipoli(etilenglicol) o mPEG). Los ejemplos de moléculas nanobody pegiladas se desvelan como TNF55-PEG40, TNF55-PEG60, TNF56-PEG40 y TNF56-PEG60 en el documento WO 06/122786.
En otra realización, las formulaciones de la presente invención son estables durante al menos 3, 6, 9, 12 meses (por ejemplo, al menos 24, 30, 36 meses), a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 25 °C (por ejemplo, de aproximadamente 4 °C o 25 °C). En algunas realizaciones, la integridad de la molécula de UADS se mantiene después del almacenamiento en la formulación durante al menos 3, 6, 9, 12 meses (por ejemplo, al menos 24, 30, 36 meses), a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 25 °C (por ejemplo, aproximadamente 4 °C o 25 °C). Por ejemplo, la molécula de UADS en la formulación conserva al menos el 50 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o hasta el 100 % de una actividad biológica, por ejemplo, actividad de unión de la molécula de UADS después del almacenamiento a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 25 °C (por ejemplo, aproximadamente 4 °C o 25 °C). En algunas realizaciones, la formulación incluye especies de peso molecular elevado (APM) de menos de 10 %, 9 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menor después del almacenamiento en la formulación durante al menos 3, 6, 9, 12 meses (por ejemplo, al menos 24, 30, 36 meses), a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 25 °C (por ejemplo, aproximadamente 4 °C o 25 °C). En otras realizaciones, la formulación incluye especies de peso molecular bajo (BPM) de menos del 10 %, 9 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menor después del almacenamiento en la formulación durante al menos 3, 6, 9, 12 meses (por ejemplo, al menos 24, 30, 36 meses), a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 25 °C (por ejemplo, aproximadamente 4 °C o 25 °C). En otras realizaciones adicionales, la formulación incluye especies ácidas de menos del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menor después del almacenamiento en la formulación durante al menos 3, 6, 9, 12 meses (por ejemplo, al menos 24, 30, 36 meses), a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 25 °C (por ejemplo, aproximadamente 4 °C o 25 °C). En otras realizaciones adicionales, la formulación incluye especies básicas de menos del 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % o menos después del almacenamiento en la formulación durante al menos 3, 6, 9, 12 meses (por ejemplo, al menos 24, 30, 36 meses), a una temperatura de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 25 °C (por ejemplo, aproximadamente 4 °C o 25 °C). Las especies APM, BPM, ácidas y básicas pueden detectarse en las formulaciones usando técnicas convencionales tales como cromatografía líquida de alto rendimiento por exclusión de tamaño (HPLC- SEC) y similares descritas en este documento.
En algunas realizaciones, después de la reconstrucción de la formulación de UADS liofilizada, la formulación conserva al menos el 80 %, 90 %, 95 % o más de la estructura de UADS comparada con la formulación antes de la liofilización. La estructura UADS se determina, por ejemplo, mediante ensayo de unión, bioensayo, o la proporción de especies APM con respecto a especies BPM.
Las formulaciones de la invención también pueden incluir un segundo agente, por ejemplo, un segundo agente activo terapéutica o farmacológicamente activo que es útil en el tratamiento de un trastorno asociado a TNF-a, por ejemplo, trastornos inflamatorios o autoinmunológicos, que incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide (RA) (por ejemplo, artritis reumatoide moderada a grave), estados artríticos (por ejemplo, artritis psoriásica, artritis idiopática juvenil poliarticular (AIJ), espondilitis anquilosante (AS), psoriasis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria y/o esclerosis múltiple. Por ejemplo, el segundo agente puede ser un anticuerpo anti-TNF o un fragmento de unión a TNF del mismo, en el que el segundo anticuerpo TNF se une a un epítopo diferente al de la molécula de UADS de unión a TNF de la formulación. Otros ejemplos no limitantes de agentes que pueden co-formularse con la molécula de UADS de unión a TNF incluyen, pero sin limitación, un inhibidor de citocina, un inhibidor del factor de crecimiento, un inmunosupresor, un agente anti-inflamatorio, un inhibidor metabólico, un inhibidor enzimático, un agente citotóxico, un agente citostático. En una realización, el agente adicional es un tratamiento convencional para artritis, que incluye, pero sin limitación, agentes antiinflamatorios no esteroideos. (AINE); corticosteroides, que incluyen prednisolona, prednisona, cortisona y triamcinolona; y fármacos antireumáticos modificadores de enfermedades (FARMD), tales como metotrexato, hidroxicloroquina (Plaquenil) y sulfasalázina, leflunomida (Arava®), inhibidores del factor de necrosis tumoral, que incluyen etanercept (Enbrel®), infliximab (Remicade®) (con o sin metotrexato), y adalimumab (Humira®), anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo, Rituxan®), receptor de interleucina-1 soluble, tal como anakinra (Kineret®), oro, minociclina (Minocin®), penicilamina y agentes citotóxicos, que incluyen azatioprina, ciclofosfamida y ciclosporina. Dichas terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones más bajas de los agentes terapéuticos administrados, por lo tanto se evitan posibles toxicidades o complicaciones asociados con las monoterapias diversas.
Siguiendo la orientación proporcionada en el presente documento pueden identificarse y ensayarse combinaciones de excipientes y/o agentes terapéuticos secundarios alternativos.
En otra realización adicional, las formulaciones descritas en el presente documento son adecuadas para administración a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano (por ejemplo un paciente que tiene un trastorno asociado a TNFa). La formulación puede administrarse al sujeto por inyección (por ejemplo, subcutánea, intravascular, intramuscular o intraperitoneal) o por inhalación.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento o proceso para preparar las formulaciones descritas en el presente documento. El procedimiento o proceso incluye: expresar la molécula de UADS en un cultivo celular; purificar la molécula de UADS, por ejemplo, haciendo pasar la molécula de UADS a través de al menos una etapa de purificación cromatográfica, etapas de ultrafiltración/diaflltración; ajustar la concentración de la molécula de UADS, por ejemplo, a aproximadamente 10 a 250 mg/ml en una formulación que contiene un lioprotector, un tensioactivo y un tampón como se describe en el presente documento, por ejemplo, sacarosa a una concentración de aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %, por ejemplo, aproximadamente 5 %, aproximadamente 0 %; polisorbato-80 a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 0.02 %, por ejemplo, 0.01 %, 0.02 %; (opcionalmente) glicina a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, 100 mM; (opcionalmente) metionina a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, 100 mM; y (f) una Histidina (a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mM) o un tampón Tris (a una concentración aproximadamente 20 mM), de manera que el pH de la formulación sea aproximadamente 5 a 7.5, por ejemplo, 5, 5.5, 5.8-6.1 , 6, 6.1 , 6.5 Ó 7.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento o proceso para preparar una formulación reconstituida que contiene una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula de UADS de unión a TNF como se describe en el presente documento. El procedimiento incluye: liofilizar una mezcla de una molécula de UADS, un lioprotector, un tensioactivo y un tampón, formando por lo tanto una mezcla liofilizada; y reconstituir la mezcla liofilizada en un diluyente, preparando de esta manera una formulación como se describe en el presente documento. En una realización, la formulación incluye (a) una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula nanobody de unión a TNF a una concentración de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 200 mg/ml, por ejemplo, a aproximadamente 1 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 88 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 118 mg/ml; (b) sacarosa a una concentración de aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %, por ejemplo, aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %; (c) polisorbato-80 a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 0.02 %, por ejemplo, 0.01 %, 0.02 %; (d) (opcionalmente) glicina a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 00 mM, por ejemplo, 100 mM; (e) (opcionalmente) metionina a una concentración de aproximadamente 0 a aproximadamente 100 mM, por ejemplo, 100 mM; y (f) una Histidina (a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mM) o un tampón Tris (a una concentración aproximadamente 20 mM), de manera que el pH de la formulación sea de aproximadamente 5 a 7.5, por ejemplo, 5, 5.5, 5.8-6.1 , 6, 6.1 , 6.5 ó 7.
En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para tratar o prevenir en un sujeto (por ejemplo., un sujeto humano) un trastorno asociado con TFNa, por ejemplo, trastornos inflamatorios o autoinmunes, que incluyen, pero sin limitación, artritis reumatoide (AR) (por ejemplo, artritis reumatoide de moderada a grave), afecciones artríticas (por ejemplo, artritis psoriásica, artritis idiopática juvenil (AIJ) poliarticular, espondilitis anquilosante (SA), soriasis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria y/o esclerosis múltiple. El procedimiento incluye administrar a un sujeto, por ejemplo, a un paciente humano, una composición farmacéutica que incluye una formulación de UADS de unión a TNF, como se describe en presente documento, por ejemplo, una formulación que contiene una molécula de UADS de unión a TNF, en solitario o en combinación con cualquiera de las terapias de combinación descritas en el presente documento, en tal cantidad que uno o más de los síntomas del trastorno asociado a TNFct se reduce.
En otro aspecto, la invención presenta un kit o un artículo de fabricación que incluye un dispositivo, una jeringa o un vial que contiene las formulaciones descritas en el presente documento. El kit o artículo puede incluir opcionalmente instrucciones para su uso. En algunas realizaciones, la jeringa o un vial se fabrica con vidrio, plástico o con un material polimérico, tal como polímero o copolímero de olefina cíclica. En otras realizaciones, la formulación puede presentarse en un dispositivo inyectable (por ejemplo, una jeringa inyectable, por ejemplo, una jeringa inyectable previamente cargada). La jeringa puede adaptarse para administración individual, por ejemplo, como un sistema de vial sencillo que incluye un autoinyector (por ejemplo, un dispositivo de inyector de pluma) y/o instrucciones para su uso. En una realización, el dispositivo inyectable es una pluma previamente cargada u otro dispositivo autoinyectable adecuado, opcionalmente con instrucciones para su uso y administración.
En algunas realizaciones, al sujeto se le proporciona el kit o artículo de fabricación (por ejemplo, la pluma o jeringa previamente cargada con una unidad de dosis sencilla o múltiple), por ejemplo, a un paciente o a un proveedor de servicios sanitarios, ya envasado con instrucciones para administración (por ejemplo, auto-administración) pro inyección {por ejemplo, subcutánea, intravascular, intramuscular o intraperitoneal).
En otras realizaciones, la invención presenta, un dispositivo para la administración nasal, transdérmica e intravenosa de las formulaciones descritas proporcionadas en el presente documento. Por ejemplo, se proporciona un parche transdérmico para la administración de las formulaciones descritas en el presente documento. En otros casos adicionales, se proporciona una bolsa intravenosa para la administración de las formulaciones descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, la bolsa intravenosa se proporciona con solución salina normal o dextrosa al 5%.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para enseñar al paciente (por ejemplo, un paciente humano), que necesita dicha molécula de UADS, por ejemplo, una molécula de nanocuerpo de TNFa, cómo administrar una formulación descrita en el presente documento. El procedimiento incluye: (i) proporcionar al paciente al menos una dosis unitaria de una formulación de la molécula de UADS descrita en el presente documento; y (ii) enseñar al paciente cómo auto-administrar al menos una dosis unitaria, por ejemplo, por inyección (por ejemplo, subcutánea, intravascular, intramuscular o intraperitoneal). En una realización, el paciente padece un trastorno asociado con TNFa, por ejemplo, trastornos inflamatorios o autoinmunes como se describe en el presente documento.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para enseñar a un receptor acerca de la administración de una formulación de una molécula de nanocuerpo de TNFa descrita en el presente documento. El procedimiento incluye enseñar al receptor (por ejemplo, un usuario final paciente, médico, farmacia minorista o mayorista, distribuidor o departamento de farmacia de un hospital, clínica de residencia de ancianos u OMH (Organización para el Mantenimiento de la Salud)) como debe administrase la formulación al paciente.
En otro aspecto, se proporciona un procedimiento de distribución de una formulación de una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula de nanocuerpo de TNFa, descrita en el presente documento. El procedimiento incluye proporcionar a un receptor (por ejemplo, un usuario final, paciente, médico, farmacia minorista o mayorista, distribuidor o departamento de farmacia de un hospital, clínica de una residencia de ancianos u OMH) un envase que contiene dosificaciones unitarias de la molécula de UADS, por ejemplo, una molécula de nanocuerpo de TNFa, suficientes para tratar a un paciente durante al menos 6, 12, 24 ó 36 meses.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento o procedimiento para evaluar la calidad de un envase o lote de envases {por ejemplo, para determinar si ha caducado) de una formulación descrita en el presente documento que contiene una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula de nanocuerpo de TNFa. El procedimiento incluye evaluar si el envase ha caducado. La fecha de caducidad es de al menos 6, 12, 24, 36 ó 48 meses, por ejemplo, mayor de 24 ó 36 meses, a partir de un acontecimiento preseleccionado, tal como fabricación, ensayo o envasado. En algunas realizaciones, como resultado del análisis, se toma una decisión o se realiza una etapa, por ejemplo, la molécula de UADS en el envase se usa o se rechaza, se clasifica, se selecciona, se distribuye o se retiene, se fleta, se traslada a una nueva localización, se distribuye al comercio, se vende o se ofrece para la venta, se retira del comercio o ya no se ofrece para la venta, dependiendo de si el producto ha caducado.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para almacenar, distribuir o usar una formulación de una molécula de UASD, por ejemplo, una molécula de nanocuerpo de TNF, descrita en el presente documento. El procedimiento incluye: conservar la formulación durante un periodo a una temperatura determinada, por ejemplo, menos de 25 °C, por ejemplo, por debajo del punto de congelación o por debajo de 15 °C, 10 °C o 4 °C. En algunas realizaciones, el procedimiento incluye adicionalmente proporcionar la formulación a un receptor, por ejemplo, a un usuario final, por ejemplo, a un paciente o proveedor de servicios sanitarios, para almacenar en condiciones similares o diferentes (por ejemplo, una temperatura superior a la del primer periodo de almacenamiento). La formulación puede ser una formulación líquida, liofilizada o reconstituida.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para analizar un producto o un procedimiento, por ejemplo, un procedimiento de fabricación. El procedimiento incluye proporcionar una formulación de una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula de nanocuerpo de TNF, como se describe en el presente documento, y evaluar un parámetro de la formulación, tal como color (por ejemplo, de incoloro a ligeramente amarillo o de incoloro a amarillo), transparencia (por ejemplo, de claro a ligeramente opalescente o de claro a opalescente) o viscosidad (por ejemplo, entre aproximadamente de 1 a 5 cP cuando se mide a temperatura ambiente, tal como a 20 °C-30 °C, por ejemplo, 25 °C), cantidad de una o más especies de AP , BPM, ácidas y/o básicas, como se describe en el presente documento. La evaluación puede incluir una valoración de uno o más parámetros. Opcionalmente, se determina si el parámetro cumple con un criterio preseleccionado determinado, por ejemplo, se determina si el criterio preseleccionado está presente, o está presente en un intervalo preseleccionado, analizando de esta manera el procedimiento.
En una realización, la evaluación del procedimiento incluye medir la estabilidad de la formulación de la molécula de UADS. La estabilidad de la formulación de anticuerpo puede medirse, por ejemplo, por formación de agregados, que se ensaya, por ejemplo, por cromatografía líquida a alta presión por exclusión de tamaño (HPLC-SE), por color, transparencia o viscosidad como se describe en el presente documento. Puede determinarse una formulación para que sea estable y por lo tanto, aceptable para posterior procesamiento o distribución, si el cambio en un parámetro de ensayo es menor de aproximadamente el 10%, 5%, 3%, 2%, 1 %, 0.5%, 0.05% ó 0.005% o inferior, durante un periodo de tiempo preestablecido y opcionalmente a una temperatura determinada.
En una realización, el procedimiento incluye adicionalmente comparar el valor determinado con un valor de referencia, para analizar por lo tanto el procedimiento de fabricación.
En una realización, el procedimiento incluye adicionalmente conservar el procedimiento de fabricación basándose, al menos en parte, en el análisis. En una realización, el procedimiento incluye adicionalmente modificar el procedimiento de fabricación basándose en el análisis.
En otra realización el procedimiento incluye evaluar un procedimiento, por ejemplo, un procedimiento de fabricación de una formulación de una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula de nanocuerpo de TNF, fabricada mediante un procedimiento seleccionado, que incluye realizar una determinación sobre el procedimiento basándose en un procedimiento o análisis descrito en el presente documento. En una realización, el procedimiento incluye adicionalmente conservar o modificar el procedimiento de fabricación basándose, al menos en parte, en el procedimiento o análisis. Por tanto, en otra realización la parte de realizar la evaluación no sigue el procedimiento o análisis descrito en el presente documento sino que solamente se basa en resultados que se obtienen mediante un procedimiento o análisis descrito en el presente documento.
En otra realización el procedimiento incluye comparar dos o más preparaciones en un procedimiento de seguimiento o de control de variación lote a lote o comparar una preparación con un patrón de referencia.
En otra realización adicional, el procedimiento puede incluir adicionalmente tomar una decisión, por ejemplo, clasificar, seleccionar, aceptar o rechazar, distribuir o retener, procesar un producto farmacológico, fletar, trasladar a otra localidad, formular, etiquetar, envasar, distribuir al comercio, vender u ofrecer para la venta la preparación, basándose, al menos en parte, en la determinación.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para evaluar la calidad de una formulación de una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula de nanocuerpo de TNF como se describe en el presente documento, por ejemplo, en un análisis de control de calidad o especificación de distribución. El procedimiento incluye proporcionar una evaluación de una formulación de una molécula de UADS para un parámetro, tal como color (por ejemplo, de incoloro a ligeramente amarillo o de incoloro a amarillo), transparencia (por ejemplo, de transparente a ligeramente opalescente o de transparente a opalescente) o viscosidad (por ejemplo, entre aproximadamente de 1 a 5 cP cuando se mide a temperatura ambiente, tal como de 20 °C a 30 °C, por ejemplo, 25 °C). La evaluación puede incluir valorar uno o más de los parámetros anteriores. El procedimiento también incluye, opcionalmente, determinar si el parámetro de la solución cumple un criterio preseleccionado, por ejemplo, si el criterio preseleccionado está presente o está presente en un intervalo preseleccionado. Si el parámetro de la solución observado está dentro de un intervalo de valores preseleccionado o cumple los criterios patrones preseleccionados, entonces la preparación se selecciona, tal como para el envasado, uso, venta, distribución al comercio, rechazo, etc.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para cumplir con un requisito regulador, por ejemplo, un requisito de una agencia reguladora aprobado posteriormente, por ejemplo, la FDA (administración de fármacos y alimentos). El procedimiento incluye proporcionar una evaluación de una formulación de anticuerpo para un parámetro, como se describe en el presente documento. El requisito aprobado posteriormente puede incluir una medición de uno o más de los parámetros anteriores. El procedimiento también incluye, opcionalmente, determinar si el parámetro de la solución observado cumple un criterio preseleccionado o si el parámetro está en un intervalo preseleccionado; opcionalmente, registrar el valor o resultado de análisis o comunicar con la agencia, por ejemplo, transmitiendo el valor o resultado a la agencia reguladora.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para fabricar un lote de una formulación de una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula de nanocuerpo de TNF, que tenga una propiedad preseleccionada, por ejemplo, que cumpla una especificación de distribución, un requisito de etiquetado o un requisito compendiado, por ejemplo, una propiedad descrita en le presente documento. El procedimiento incluye proporcionar una formulación de ensayo; analizar la formulación de ensayo, de acuerdo con un procedimiento descrito en el presente documento; determinar si la formulación de ensayo satisface un criterio preseleccionado; por ejemplo, que tenga una relación preseleccionada con un valor de referencia, por ejemplo, uno o más valores de referencia descritos en el presente documento y seleccionar la preparación de anticuerpo de ensayo para fabricar un lote de producto.
En otro aspecto, la invención presenta lotes múltiples de una formulación de una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula de nanocuerpo de TNF, en el que, para cada lote, uno o más parámetros {por ejemplo, un valor o parámetro de solución determinado por un procedimiento descrito en el presente documento) varía menos de un intervalo preseleccionado a partir de un valor de referencia o criterio deseado preseleccionado, por ejemplo, un intervalo o criterio descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, para uno a más lotes de formulación, se determina uno o más parámetros y como resultado de la determinación se determina uno o varios lotes. Algunas realizaciones incluyen comparar los resultados de la determinación con un valor o criterio preseleccionado, por ejemplo, un patrón de referencia. Otras realizaciones incluyen ajustar la dosis del lote a administrar, por ejemplo, basándose en el resultado de la determinación del valor o parámetro.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento de uno o más de: proporcionar un informe a una entidad receptora de informes, evaluar una muestra de una formulación de una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula de nanocuerpo de TNF, en cumplimiento con un patrón de referencia, por ejemplo, un requisito de la FDA, solicitando indicaciones a la otra parte de que una preparación de la molécula de UADS cumple algún requisito predefinido o presentar información a la otra parte acerca de una preparación de una molécula de UADS. Las entidades u otras partes receptoras ejemplares incluyen un gobierno, por ejemplo, el gobierno federal de los Estados Unidos, por ejemplo, una agencia gubernamental, por ejemplo, la FDA. El procedimiento incluye una o más (o todas) las siguientes etapas para fabricar y/o ensayar una formulación acuosa de la molécula de UADS en un primer país, por ejemplo, los Estados Unidos; enviar al menos una alícuota de la muestra fuera del primer país, por ejemplo, enviarla fuera de los Estados Unidos, a un segundo país; preparar, o recibir, un informe que incluya datos sobre la estructura de la preparación de la molécula de UADS, por ejemplo, datos relacionados con una estructura y/o cadena descrita en el presente documento, por ejemplo, datos generados por uno o más de los procedimientos descritos en el presente documento y proporcionar dicho informe a una entidad receptora de informes.
En una realización, la entidad receptora de informes puede determinar si un requisito predeterminado o valor de referencia coincide con los datos y opcionalmente, se recibe una respuesta de la entidad receptora de informes, por ejemplo, por un fabricante distribuidor o vendedor de una formulación de una molécula de UADS. En una realización, después de recibir la aprobación de la entidad receptora de informes, la preparación de una formulación de una molécula de UADS se selecciona, se envasa y se comercializa.
En otro aspecto, la invención presenta un procedimiento para evaluar una formulación de una molécula de UADS. El procedimiento incluye recibir datos con respecto a la presencia o nivel de un molécula de UADS, por ejemplo, en el que los datos se prepararon mediante uno o más procedimientos descritos en el presente documento; proporcionar un registro que incluya dichos datos y opcionalmente incluir un identificador para un lote de una molécula de UADS; someter dicho registro a una autoridad, por ejemplo, una agencia gubernamental, por ejemplo, la FDA; opcionalmente, recibir una comunicación de dicha autoridad; opcionalmente, decidir la distribución o comercialización del lote de la molécula de UADS basándose en la comunicación de la autoridad. En una realización, el procedimiento incluye adicionalmente distribuir la muestra.
Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado al normalmente entendido por un experto habitual en la técnica a la cual pertenece la presente invención. Aunque en la realización práctica o ensayo de la presente invención, pueden usarse procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen procedimientos y materiales adecuados. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
A partir de la descripción detallada, dibujos y reivindicaciones, serán evidentes otras características y ventajas de la presente invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Fig. 1 representa resultados de la actividad biológica de una formulación liofilizada de 106 U/mg de nanocuerpo de unión a TNF (ATN-103) almacenada como una preparación de polvo seco (PS) hasta seis meses. La formulación se almacenó a las temperaturas indicadas.
La Fig. 2 representa resultados de actividad de unión a Albúmina de Suero Humana (ASH) de una formulación liofilizada de nanocuerpo de unión a TNF (ATN-103). Los resultados se muestran como porcentaje (%) del patrón de referencia del nanocuerpo de unión a TNF.
La Fig. 3 representa resultados de HPLC por exclusión de tamaño (HPLC-SE) en cuanto al % de especies de alto peso molecular (APM) para la formulación liofilizada.
La Fig. 4 representa resultados de electroforesis capilar en SDS (CE-SDS) en cuanto a % de nanocuerpo de unión a TNF para la formulación liofilizada.
La Fig. 5 representa resultados de HPLC-SE para el % de especies de APM para la formulación sometida a ciclos de liofilización de control y solidez.
La Fig. 6 representa resultados de la actividad biológica de 106 U/mg del nanocuerpo de unión a TNF después de almacenar hasta seis meses una formulación líquida a alta concentración.
La Fig. 7 representa resultados de la actividad de unión a Albúmina se Suero Humana (ASH) (porcentaje de Patrón de Referencia de nanocuerpo de unión a TNF) de una formulación líquida a alta concentración almacenada hasta seis meses a las temperaturas indicadas.
La Fig. 8 representa resultados de HPLC-SE para el % de especies de APM de una formulación líquida a alta concentración después de almacenar hasta seis meses a las temperaturas indicadas.
La Fig. 9 representa resultados de HPLC-SE para el % de especies de BPM de una formulación líquida a alta concentración después de almacenar hasta seis meses a las temperaturas indicadas.
La Fig. 10 representa resultados de CE-SDS para el % de ATN- 103 de una formulación líquida a alta concentración después de almacenar hasta seis meses a las temperaturas indicadas.
La Fig. 11 representa resultados de HPLC-SE para el % de especies de APM de una formulación líquida a alta concentración en una jeringa previamente cargada.
La Fig. 12 representa resultados de HPLC-SE para el % de especies de BPM de una formulación líquida a alta concentración en una jeringa previamente cargada.
La Fig. 13 representa resultados del % de especies ácidas por HPLC-CEX de una formulación líquida a alta concentración en una jeringa previamente cargada.
La Fig. 14 representa resultados del % de especies básicas por HPLC-CEX de una formulación líquida a alta concentración en una jeringa previamente cargada.
La Fig. 15 representa resultados del % de especies de APM, por HPLC-SE, de formulaciones líquidas a alta concentración - Otras Formulaciones (identificación de otros excipientes estabilizantes y desestabilizantes) La Fig. 16 representa resultados del % de especies de APM, por HPLC-SE, de una formulación líquida a alta concentración del nanocuerpo de unión a TNF.
La Fig. 17 representa resultados del % de especies de BPM, por HPLC-SE, de una formulación líquida a alta concentración del nanocuerpo de unión a TNF.
La Fig. 18 representa resultados del % de especies ácidas, por HPLC-CEX, de una formulación líquida a alta concentración del nanocuerpo de unión a TNF.
La Fig. 19 representa resultados del % de especies básicas, por HPLC-CEX, de una formulación líquida a alta concentración del nanocuerpo de unión a TNF.
La Fig. 20 representa resultados del % de especies de APM, por HPLC-SE, de una formulación líquida a alta concentración del nanocuerpo de unión a TNF después de 10 ciclos de congelación-descongelación.
La Fig. 21 representa resultados del % de especies de BPM, por HPLC-SE, de una formulación líquida a alta concentración del nanocuerpo de unión a TNF después de 10 ciclos de congelación-descongelación.
La Fig. 22 representa la Turbidez (Absorbancia a 455 nm) de la formulación líquida a alta concentración del nanocuerpo de unión a TNF después de 10 ciclos de congelación-descongelación.
La Fig. 23 representa la Concentración (por absorbancia UV a 280 nm) de la formulación líquida a alta concentración del nanocuerpo de unión a TNF después de 10 ciclos de congelación-descongelación.
La Fig. 24 representa el % de especies de APM, por HPLC-SE, de la formulación líquida a alta concentración del nanocuerpo de unión a TNF: después de estrés térmico de corta duración posiblemente hallado en procedimientos de fabricación.
La Fig. 25 representa resultados del % de especies de APM, por HPLC-SE, de la formulación líquida a baja concentración como una función de pH y formulación (40 °C).
La Fig. 26 representa resultados del % de especies de BPM, por HPLC-SE, de la formulación líquida a baja concentración como una función de pH y formulación (40 °C).
La Fig. 27 representa resultados del % de especies de APM, por HPLC-SE, de la formulación líquida a baja concentración como una función de pH y formulación (4 °C).
La Fig. 28 representa resultados del % de especies de APM, por HPLC-SE, de la formulación líquida a baja concentración como una función de pH y formulación después de agitar.
La Fig. 29 representa un diagrama esquemático de la estructura de ATN-103 predicha.
La Fig. 30 representa la secuencia de aminoácidos de la cadena polipeptídica de ATN-103 (SEQ ID NO: 1).
La Fig. 31 corresponde a gráficos de barras que representan el % de especies de APM, detectadas por HPLC-SE, de las formulaciones indicadas que contienen aproximadamente 100 mg/ml de ATN-103 (HST, HSGT, HSGMT, HSorb y control) almacenadas en las condiciones indicadas.
La Fig. 32 corresponde a gráficos de barras que representan el % de especies de BPM, detectadas por HPLC-SE, de las formulaciones indicadas que contienen aproximadamente 100 mg/ml de ATN-103 (HST, HSGT, HSGMT, HSorb y control) almacenadas en las condiciones indicadas. En el punto de tiempo inicial o después de dos semanas a 4°C, no se detectaron especies de BPM.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se ha identificado que las formulaciones estables que incluyen una molécula de UADS, por ejemplo, una molécula de nanocuerpo (por ejemplo, una molécula de nanocuerpo de unión a TNF), son adecuadas para la conservación de concentraciones altas y bajas de la molécula de UADS (una "formulación"). La molécula de UADS que se formula es preferentemente esencialmente pura y deseablemente esencialmente homogénea (es decir, libre de proteínas contaminantes, etc.). Proteína "esencialmente pura" significa una composición que comprende al menos aproximadamente el 90 % en peso de la proteína, basándose en el peso total de la composición, preferentemente al menos aproximadamente el 95 % en peso. Proteína "esencialmente homogénea" significa una composición que comprende al menos aproximadamente el 99 % en peso de proteína, basándose en el peso de la composición.
La integridad de la molécula de UADS en la formulación se conserva generalmente siguiendo un almacenamiento a largo plazo como un producto líquido o liofilizado en diversas condiciones. Por ejemplo, la integridad de la molécula de UADS se conserva adecuadamente después de exposición en un amplio intervalo de temperaturas de almacenamiento (por ejemplo, -80° C a 40 °C), cizallamiento (por ejemplo, agitación) y estrés interfacial (ciclos de congelación-descongelación).
Adicionalmente, para material liofilizado, la integridad de la molécula de UADS se conserva adecuadamente durante el proceso de reconstitución. Además, la integridad de la molécula de UADS se conserva suficientemente para su uso como un medicamento como se demuestra mediante acumulaciones relativamente bajas de especies BPM y especies AP , bioactividad in vitro, actividad de unión in vitro después de almacenamiento a largo plazo (por ejemplo hasta 12 meses) a diversas temperaturas (por ejemplo, -80 °C a 40 °C).
Para que la presente invención pueda comprenderse mejor, se definen en primer lugar algunos términos. Se exponen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.
Como se usan en el presente documento, los artículos "uno" y "una" se refieren a uno o a más de uno (por ejemplo, al menos uno) del objeto gramatical del artículo.
El término "o" como se usa en el presente documento, se refiere y se usa de manera intercambiable con el término "y/o", a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Los términos "proteínas" y "polipéptidos" se usan de manera intercambiable en el presente documento.
"Alrededor de" y "aproximadamente" significará generalmente un grado aceptable de error de la cantidad medida dada la naturaleza o precisión de las mediciones. Los grados de error ejemplares están dentro del 20 por ciento (%), típicamente, dentro del 10 % y más típicamente, dentro del 5 % de un valor determinado o intervalo de valores.
Una formulación "estable" de una molécula de UADS muestra escaso o ningún síntoma de ninguna o más de agregación, fragmentación, desamidación, oxidación o cambio en la actividad biológica durante un período prolongado de tiempo, por ejemplo, 6, 12 meses, 24 meses, 36 meses o más. Por ejemplo, en una realización, menos del 10 % de la molécula de UADS se agrega, fragmenta u oxida. La agregación, precipitación y/o desnaturalización puede evaluarse mediante procedimientos conocidos, tales como examen visual de color y/o transparencia o mediante dispersión de luz UV o cromatografía por exclusión de tamaño. La capacidad de la proteína para conservar su actividad biológica puede evaluarse detectando y cuantificando formas químicamente modificadas del anticuerpo. La modificación de tamaño (por ejemplo, recorte), que puede evaluarse usando cromatografía por exclusión de tamaño y/o SDS-PAGE, por ejemplo. Otros tipos de modificación química incluyen modificación de carga (por ejemplo, que se produce como resultado de desamidación), que puede evaluarse mediante cromatografía de intercambio iónico, por ejemplo.
Una molécula de UADS "conserva su actividad biológica" en una formulación farmacéutica, si la actividad biológica de la molécula en un momento determinado está dentro de aproximadamente 50 % o más de la actividad biológica mostrada en el momento de la formulación farmacéutica preparada como se determina en un ensayo de unión a antígeno, por ejemplo.
Una formulación "reconstituida" es una que se ha preparado disolviendo una formulación de proteína liofilizada en un diluyente tal como la proteína que se dispersa en la formulación reconstituida. La formulación reconstituida es adecuada para administración (por ejemplo administración parenteral o periférica) a un paciente a tratar con la proteína de interés y en determinadas realizaciones de la invención puede ser una que sea adecuada para la administración subcutánea.
"Isotónico" o "¡so-osmótico" se refiere a que la formulación de interés tiene similar o esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones isotónicas o ¡so-osmóticas generalmente tendrán una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. La ¡sotonicidad puede medirse usando un osmómetro de presión de vapor o crioscópico, por ejemplo.
Un "agente ajustador de la tonicidad" se refiere a un compuesto que hace que la formulación sea sustancialmente ¡sotónica o ¡so-osmótica con la sangre humana. Los agentes ajustadores de tonicidad ejemplares son: sacarosa, sorbitol, glicina, metionina, manitol, dextrosa, inositol, cloruro sódico, arginina, o clorhidrato de arginina. Típicamente, los agentes ajustadores de la tonicidad se añaden en una cantidad tal que la formulación global ejerce una resistencia osmótica similar a la de la sangre humana. Por ejemplo, la sangre humana contiene solutos aproximadamente 300 mM. Típicamente, los productos farmacéuticos dirigen una molaridad total de 300 mM. Esto corresponde a una presión osmótica de aproximadamente 300 a 310 mOsm, con un intervalo típico de 250 mOsm a 350 mOsm. La cantidad de agente ajustador de tonicidad requerida puede estimarse inicialmente mediante cálculo. La contribución con respecto a la molaridad total puede estimarse a partir del peso molecular de una molécula de excipiente y propiedades conocidas de la molécula, por ejemplo, si la molécula se disocia en dos especies iónicas o la molécula es no iónica (no se disocia). Adicionalmente, es necesario entender la contribución osmótica de la molécula de proteína específica como una función de la concentración de proteína. Este parámetro puede determinarse experimentalmente.
Por ejemplo, comenzando con una formulación (tonicidad no corregida) de histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, polisorbato 80 al 0,01 %, con una concentración de proteína de nanocuerpo anti-TNF de 100 mg/ml, como una primera etapa, la molaridad estimada de la formulación de partida puede calcularse de la siguiente manera: histidina 10 mM = 10 mM sacarosa 5 % corresponde aproximadamente a 146 mM 5 % = 5 g/100 mi = 50 g/l? (50 g/l) / (342.3 g/mol) = 0.146 mol/l = 146 mM El polisorbato 80 al 0.01 % ejerce esencialmente una molaridad cero y puede descartarse. La proteína 100 mg/ml: se determinó a través de la experimentación de manera que 100 mg/ml de proteína de nanocuerpo anti-TNF ejerce una presión osmótica que corresponde aproximadamente a 48 mM.
Por lo tanto, sumando todas las contribuciones para la molaridad en la formulación inicial: 10 mM + 146 mM + 48 mM = 204 mM.
Si la molaridad diana es de 310 mM, entonces la molaridad de cantidad correspondiente para componer el resto de la diana es: 310 mM - 204 mM = 106 mM Por tanto, la cantidad recomendada de agente ajustador de tonicidad es de 106 mM de un agente ajustador de tonicidad no iónico o 53 mM de un agente ajustador de la tonicidad iónico que se disocia completamente en dos especies iónicas.
Después de determinar el cálculo inicial del agente ajustador de tonicidad, se recomienda ensayar la formulación experimentalmente. Por lo tanto, en el ejemplo proporcionado, se añadió glicina 100 mM a la formulación inicial. (La recomendada 106 mM se redondeó a la baja a 100 mM para simplificar). La osmolaridad esperada sería: histidina 10 mM + sacarosa 146 mM + proteína 48 mM + glicina 100 mM = 304 mM El valor de la presión osmótica experimental de la formulación es = 305 mOsm.
Un "lioprotector" es una molécula que, cuando se combina con una proteína de interés, impide o reduce significativamente la inestabilidad química y/o física de la proteína después de la liofilización y posterior almacenamiento. Los lioprotectores ejemplares incluyen azúcares tales como sacarosa, sorbitol o trehalosa; un aminoácido tal como glutamato monosódico o histidina; una metilamina tal como betaína; una sal liotrópica tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como alcoholes de azúcar trihidricos o superiores, por ejemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol; propilenglicol; polietilenglicol; plurónicos y combinaciones de los mismos. Típicamente, el lioprotector es un azúcar no reductor, tal como trehalosa o sacarosa. El lioprotector se añade a la formulación pre-liofilizada en una "cantidad lioprotectora" lo que significa que, después de la liofilización de la proteína en presencia de la cantidad lioprotectora del lioprotector, la proteína conserva esencialmente su estabilidad física y química y la integridad después de la liofilización y almacenamiento.
Un "estabilizante" se refiere a una molécula que, cuando se combina con una proteína de interés (por ejemplo, la molécula de UADS) impide o reduce sustancialmente inestabilidad química y/o física de la proteína de interés en forma liofilizada, reconstituida, líquida o de almacenamiento. Los estabilizantes ejemplares incluyen sacarosa, sorbitol, glicina, inositol, cloruro sódico, metionina, arginina y clorhidrato de arginina.
El "diluyente" de interés en el presente documento es uno que es farmacéuticamente aceptable (inocuo y no tóxico para la administración en un ser humano) y es útil para la preparación de una formulación reconstituida. Los diluyentes ejemplares incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (ABPI), una solución tamponada con pH (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa.
Un "conservante" es un compuesto que puede añadirse al diluyente para reducir esencialmente la acción bacteriana en la formulación reconstituida facilitando de esta manera la producción de una formulación reconstituida multiuso, por ejemplo. Los ejemplos de posibles conservantes incluyen cloruro de amonio de octadecildimetilbencilo, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de amonio de alquilbencildimetilo en el que los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de bencetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquil parabenos tales como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciciohexanol, 3-pentanol y m-cresol. El conservante más preferido en el presente documento es alcohol bencílico.
Un "agente formador de volumen" es un compuesto que añade masa a la mezcla liofilizada y contribuye a la estructura física del liofilizado (por ejemplo, facilita la producción de un liofilizado esencialmente uniforme que conserva una estructura de poro abierto). Los agentes formadores de volumen ejemplares incluyen manitol, glicina, polietilenglicol y sorbitol.
Los procedimientos y composiciones de la presente invención incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos que tienen las secuencias especificadas o secuencias sustancialmente idénticas o similares a las mismas, por ejemplo, secuencias con una identidad de al menos el 85 %, 90 % y 95 % o superior con la secuencia especificada. En el contexto de una secuencia de aminoácidos, la expresión "sustancialmente idéntica" se usa en el presente documento para referirse a un primer aminoácido que contiene un número suficiente o mínimo de resto aminoacídicos que son i) idénticos a, o ii) sustituciones conservativas de restos aminoacídicos alineados en una segunda secuencia de aminoácidos de manera que la primera y segunda secuencia de aminoácidos puedan tener un dominio estructural común y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos que contienen un dominio estructural común tienen al menos aproximadamente una identidad del 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con respecto a una secuencia de referencia. En otras realizaciones, la secuencia de aminoácidos puede contener una o más inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos (por ejemplo, sustituciones conservativas) para llegar a un porcentaje de identidad de al menos aproximadamente el 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con respecto a la secuencia de referencia.
En el contexto de secuencia de nucleótidos, la expresión "sustancialmente idéntico" como se usa en el presente documento se refiere a una primera secuencia de ácidos nucleicos que contiene un número suficiente o mínimo de nucleótidos que son idénticos a nucleótidos alineados en una segunda secuencia de ácidos nucleicos de manera que la primera y segunda secuencias de nucleótidos codifican un polipéptido que tiene una actividad funcional común o codifican un dominio polipeptídico estructural común o una actividad polipeptídica funcional común. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos que tienen al menos aproximadamente una identidad del 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % con respecto a una secuencia de referencia.
También se incluyen como polipéptidos de la presente invención fragmentos, derivados, análogos o variantes de los anteriores polipéptidos y cualquier combinación de los mismos. Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a proteínas de la presente invención incluyen cualquiera de los polipéptidos que conserven al menos una de las propiedades funcionales del anticuerpo o polipéptido natural correspondiente. Los fragmentos de polipéptidos de la presente invención incluyen fragmentos proteolíticos, así como fragmentos de deleción, además de fragmentos de anticuerpos específicos descritos en cualquier parte del presente documento. Las variantes de los polipéptidos de la presente invención incluyen fragmentos como se ha descrito anteriormente y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos modificadas debido a sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden ser de origen natural o de origen no natural. Las variantes de origen natural pueden producirse usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones, deleciones o adiciones conservativas o no conservativas de aminoácidos. Los derivados de los fragmentos de la presente invención son polipéptidos que se han modificado para mostrar características adicionales no encontradas en el polipéptido natural. Los ejemplos incluyen proteínas de fusión. Los polipéptidos variantes también se denominan en el presente documento "análogos de polipéptido." Como se usa en el presente documento un "derivado" de un polipéptido se refiere a un polipéptido sujeto que tiene uno más restos químicamente derivatizados por reacción de un grupo lateral funcional. También se incluyen como "derivados" los polipéptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos convencionales. Por ejemplo, la 4-hidroxiprolina puede sustituir prolina; 5-hidroxilisina puede sustituir lisina; 3-metilhistidina puede sustituir histidina; homoserina puede sustituir serina y ornitina puede sustituir lisina.
La expresión "variante funcional" se refiere a polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica con respecto a la secuencia de origen natural o se codifican mediante una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica y pueden tener una o más actividades de la secuencia de origen natural.
Los cálculos de homología o identidad de secuencia entre las secuencias (los términos en este documento se usan de manera intercambiable) se realizan de la siguiente manera.
Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias se alinean con propósitos de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o las dos de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para el alineamiento óptimo y secuencias no homologas pueden descartarse para propósitos de comparación). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada por motivos de comparación es al menos el 30 %, preferentemente al menos el 40 %, más preferentemente al menos el 50 %, 60 % e incluso más preferentemente al menos el 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Los restos aminoacídicos o nucleótidos en las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos se comparan después. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto aminoacídico o nucleótido que en la posición correspondiente en la segunda secuencia entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en el presente documento aminoácido o como se usa en el presente documento "identidad" de aminoácidos o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácidos o ácido nucleico).
El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas que comparten las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco que necesita introducirse para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.
La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede conseguirse usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete informático GCG (disponible en http://www.gcg.com) usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250 y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización adicional preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete informático GCG (disponible en http://www.gcg.com) usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso de longitud de 1 2, 3, 4, 5 ó 6. Una serie de parámetros particularmente preferidos (y uno que se usaría a menos que se especifique de otra manera) es una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización de hueco de 12, una penalización de extensión de hueco de 4 y una penalización de desfase del marco de lectura de hueco de 5.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ((1989), CABIOS 4: 11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de restos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.
Las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas descritas en el presente documento pueden usarse como una "secuencia problema" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas con respecto, por ejemplo, a identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden realizarse usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de AltschuI, y col (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 00, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una molécula de ácido nucleico de la invención (SEQ ID NO 1). Las búsquedas de proteínas BLAST puede realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una molécula de proteína de una proteína (SEQ ID NO 1) de la invención. Para obtener alineamientos de hueco para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en AltschuI y col, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) pueden usarse.
Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el resto aminoacídico se sustituye por un resto aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. Las familias de restos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales no cargadas polares (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptofano), cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
Se describen con mayor detalle a continuación diversos aspectos de la invención.
Moléculas de Unión a Antígeno de Dominio Sencillo (UADS) Las moléculas de unión a antígeno de dominio sencillo (UADS) incluyen moléculas cuyas regiones determinantes de la complementariedad forman parte de un polipéptido de dominio sencillo. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, dominios variables de cadena pesada, moléculas de unión desprovistas de forma natural de cadenas ligeras, dominios sencillos derivados de anticuerpos convencionales de 4 cadenas, dominios modificados por ingeniería genética y armazones de dominios sencillos distintos a los derivados de anticuerpos. Las moléculas de UADS pueden ser cualquiera de la técnica o cualquier molécula de dominio sencillo futura. Las moléculas de UADS pueden derivar de cualquier especie incluyendo, pero sin limitación ratón, ser humano, camello, llama, pez, tiburón, cabra, conejo y bovino. Este término también incluye moléculas de anticuerpo de dominio sencillo de origen natural de especies distintas de Camélidos y tiburones.
En un aspecto de la invención, la molécula de UADS puede derivar de una región variable de la inmunoglobulina encontrada en peces, tal como, por ejemplo, la que deriva del isotipo de inmunoglobulina conocido como receptor de antígeno nuevo (NAR) encontrado en el suero de tiburón. Los procedimientos para producir moléculas de dominio sencillo derivadas de una región variable de NAR ("IgNARs") se describen en el documento WO 03/014161 y Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, una molécula de UADS es una molécula de unión a antígeno de dominio sencillo de origen natural que se conoce como cadena pesada desprovista de cadenas ligeras. Dichas moléculas de dominio sencillo se desvelan en el documento WO 9404678 y Hamers-Casterman, C. y col (1993) Nature 363:446-448, por ejemplo. Para aclarar, este dominio variable derivado de una molécula de cadena pesada desprovista de forma natural de cadena ligera se conoce en este documento como una VHH o nanocuerpo para diferenciarla de la VH convencional de inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Dicha molécula de VHH puede proceder de especies de Camélidos, por ejemplo de camello, llama, dromedario, alpaca y guanaco. Otras especies junto con los Camélidos pueden producir moléculas de cadena pesada desprovistas naturalmente de cadena ligera; tales VHH se encuentran dentro del alcance de la invención.
Las moléculas de UADS pueden ser recombinantes, injertarse a CDR, humanizadas, camelizadas, desinmunizadas y/o generarse ¡n vitro (por ejemplo seleccionadas por presentación de fago) como se describe con más detalle a continuación.
La expresión "unión a antígeno" pretende incluir la parte de un polipéptido, por ejemplo, una molécula de dominio sencillo descrita en el presente documento, que comprende determinantes que forman una interfaz que se une a un antígeno diana o un epítopo del mismo. Con respecto a las proteínas (o miméticos de proteína), el sitio de unión a antígeno específico incluye uno o más bucles (de al menos cuatro aminoácidos o miméticos de aminoácidos) que forman una interfaz que se une al antígeno diana. Típicamente, el sitio de unión a antígeno del polipéptido, por ejemplo, la molécula de anticuerpo de dominio sencillo, incluye al menos una o dos CDR, o más típicamente al menos tres, cuatro, cinco o seis CDR.
La expresión "dominio variable de inmunoglobulina" se comprende frecuentemente en la técnica como que es idéntica o sustancialmente idéntica a un dominio VL o un dominio VH de origen humano o animal. Deberá reconocerse que el dominio variable de inmunoglobulina puede haber evolucionado en determinadas especies, por ejemplo, tiburones y llama para diferenciarse en secuencias de aminoácidos de seres humanos o mamíferos de VL o VH. Sin embargo, estos dominios se implican en primer lugar en la unión al antígeno. La expresión "dominio variable de inmunoglobulina" incluye típicamente al menos una o dos CDR o más típicamente al menos tres CDR.
Uno "dominio de inmunoglobulina constante" o "región constante" pretende incluir un dominio de inmunoglobulina que es idéntico o sustancialmente idéntico a un dominio CL, CH1 , CH2, CH3 o CH4, de origen humano o animal. Véase, por ejemplo, Charles A Hasemann y J. Donald Capra, Immunoglobulins: Structure and Function, in William E. Paul, ed., Fundamental Immunology, segunda edición, 209, 210-218 (1989). La expresión "Región de Fe" se refiere a la parte de Fe del dominio constante de inmunoglobulina que incluye dominios CH2 y CH3 de inmunoglobulina o dominios de inmunoglobulina sustancialmente similares a estos.
En algunas realizaciones, la molécula de UADS es una molécula monovalente o multiespecífica (por ejemplo como una molécula bivalente, trivalente o tetravalente). En otras realizaciones, la molécula de UADS es una molécula monoespecífica, biespecífica, triespecífica o tetraespecífica. Si una molécula es "monoespecífica" o "multiespecífica", por ejemplo, "biespecífica", se refiere al número de diferentes epítopos con los que un polipéptido de unión reacciona. Las moléculas multiespecíficas pueden ser específicas para diferentes epítopos de un polipéptido diana descrito en el presente documento o pueden ser específicas para un polipéptido diana así como para un epítopo heterólogo tal como polipéptido heterólogo o material de soporte sólido.
Como se usa en el presente documento el término "valencia" se refiere al número de posibles dominios de unión, por ejemplo, dominios de unión a antígeno, presentes en una molécula de UADS. Cada dominio de unión se une específicamente a un epítopo. Cuando una molécula de UADS comprende más de un dominio de unión, cada dominio de unión puede unirse específicamente al mismo epítopo, para un anticuerpo con dos dominios de unión, denominado "monoespecífico bivalente", o a epítopos diferentes para una molécula de UADS con dos dominios de unión, denominada "biespecífico bivalente". Una molécula de UADS también puede ser biespecifica y bivalente para cada especificidad (denominadas "moléculas tetravalentes biespecíficas"). Las moléculas bivalentes y biespecíficas y los procedimientos para prepararlas se describen por ejemplo en las patentes de Estados Unidos N° 5,731 ,168; 5,807,706; 5,821 ,333; y en la Publicación de Solicitud de Estados Unidos N° 2003/020734 y 2002/0155537, cuyas descripciones completas se incorporan por la presente en este documento. Las moléculas tetravalentes biespecíficas y los procedimientos para prepararlas se describen, por ejemplo, en el documento WO 02/096948 y WO 00/44788, cuyas descripciones se incorporan por referencia en el presente documento. Véase, generalmente, las publicaciones PCT WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt y col, J. Immunol. 147:60-69 (1991 ); Patentes de Estados Unidos N° 4,474,893; 4,714,681 ; 4,925,648; 5,573,920; 5,601 ,819; Kostelny y col, J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992).
En algunas realizaciones, la molécula de UADS es un polipéptido de fusión de cadena sencilla que comprende una o más moléculas de dominio sencillo (por ejemplo, nanocuerpos), desprovistos de un dominio variable complementario o una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, Fe, que se une a uno o más antígenos diana. Un antígeno diana ejemplar reconocido por los polipéptidos de unión a antígeno incluye factor a de necrosis tumoral (TNF a). En algunas realizaciones, la molécula de dominio sencillo de unión a antígeno se une a una protema sérica, por ejemplo, una proteína sérica humana seleccionada de uno o más de albúmina de suero (albúmina de suero humana (ASH)) o transferina.
TNFa En la técnica se sabe que el factor de alfa de necrosis tumoral está asociado con enfermedades inflamatorias tales como artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa y esclerosis múltiple. Tanto el TNFa como los receptores (CD120a y CD120b) se han estudiado con gran detalle. El TNFa en su forma bioactiva es un trímero. Se han desarrollado varias estrategias para antagonizar la acción de TNFa usando anticuerpos anti-TNFa y están actualmente disponibles en el mercado tal como Remicade® y Humira®. Se conocen moléculas de anticuerpo contra TNFa. Numerosos ejemplos de moléculas de unión a antígeno de dominio sencillo de unión a TNFa (por ejemplo, nanocuerpos) se desvelan en los documentos WO/2004/041862, WO 2004/041865, WO 2006/122786 cuyos contenidos completos se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad. Los ejemplos adicionales de moléculas de unión a antígeno de dominio sencillo se desvelan en los documentos US 2006/286066, US 2008/0260757, WO 06/003388, US 05/0271663, US 06/0106203 cuyos contenidos totales se incorporan por referencia en el presente documento en su totalidad. En otras realizaciones, los anticuerpos de dominio sencillo mono, bi, tri y otros multiespecíficos contra TNFa y una proteína sérica, por ejemplo, ASH, se desvelan en estas referencias.
En realizaciones específicas, la molécula de nanocuerpo de unión a TNFa comprende uno o más de los nanocuerpos descritos en el documento WO2006/122786. Por ejemplo, la molécula de nanocuerpo de unión a TNFa puede ser una molécula de nanocuerpo de unión a TNFa monovalente, bivalente, trivalente desvelada en el documento WO2006/ 122786. Los nanocuerpos de unión a TNFa ejemplares incluyen, pero sin limitación, TNF1 , TNF2, TNF3, formas humanizadas de los mismos (por ejemplo, TNF29, TNF30, TNF31 , TNF32, TNF33). Los ejemplos adicionales de nanocuerpos de unión a TNFa monovalentes se desvelan en la Tabla 8 del documento WO2006/122786. Las moléculas de nanocuerpos de unión a TNFa bivalentes ejemplares incluyen, pero sin limitación, TNF55 y TNF56, que comprenden dos nanocuerpos TNF30 unidos mediante engarce peptídico para formar un polipéptido de fusión sencillo (desvelado en el documento WO2006/122786). Los ejemplos adicionales de moléculas de nanocuerpo de unión a TNFa bivalentes se describen en la Tabla 19 del documento WO2006/122786 como TNF4, TNF5, TNF6, TNF7 y TNF8).
En otras realizaciones, la molécula de nanouerpo de unión a ASH comprende uno o más de los nanocuerpos descritos en el documento WO2006/122786. Por ejemplo, la molécula de nanocuerpo de unión a ASH puede ser una molécula de nanocuerpo de unión a ASH monovalente, bivalente, trivalente descrita en el documento WO2006/122786. En otras realizaciones, la molécula de nanocuerpo de unión a ASH puede ser una molécula monoespecífica o multiespecífica que tiene al menos una de las especificidades de unión unidas a ASH. Los nanocuerpos de unión a TNFa ejemplares incluyen, pero sin limitación, ALB1 , formas humanizadas de los mismos (por ejemplo, ALB6, ALB7, ALB8, ALB9, ALB10), desvelados en el documento WO 06/122786.
En otras realizaciones, dos o más de las moléculas de dominio sencillo de las moléculas de nanocuerpo están fusionadas, con o sin un grupo de engarce, como una fusión polipeptídica o genética. El grupo de engarce puede ser cualquier grupo de engarce evidente para los expertos en la técnica. Por ejemplo, el grupo de engarce puede ser un polímero biocompatible con una longitud de 1 a 100 átomos. En una realización, el grupo de enlace incluye o consiste en restos de poliglicina, poliserina, polilisina, poliglutamato, poliisoleucina o poliarginina o una combinación de los mismos. Por ejemplo, los engarces de poliglicina o poliserina pueden incluir al menos cinco, siete, ocho, nueve, diez, doce, quince, veinte, treinta, treinta y cinco y cuarenta restos de glicina y serina. Los engarces ejemplares que pueden usarse incluyen repeticiones Gly-Ser, por ejemplo, repeticiones de (GlyVSer (SEQ ID NO 8) de una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete o más repeticiones. En realizaciones, el enlace tiene las siguientes secuencias: (Gly)4-Ser-(Gly)3-Ser (SEQ ID NO 9) o ((Gly)4-Ser)n (SEQ ID NO 10), en la que n es 4, 5 ó 6.
En una realización ejemplar, un polipéptido de unión a antígeno compuesto de una fusión polipeptídica de cadena sencilla de dos moléculas de anticuerpo de dominio sencillo (por ejemplo, dos regiones variables de camélido) que se unen a un antígeno diana, por ejemplo, factor alfa de necrosis tumoral (TNFa) y una molécula de anticuerpo de dominio sencillo (por ejemplo una región variable de camélido) que se une a una proteína sérica, por ejemplo, ASH, denominada en el presente documento "ATN-103" se demostró que se unía a la proteína A o a una variante funcional de la misma. La ATN-103 es una proteína de fusión humanizada trivalente biespecífica, de inhibición de TNFa. El antígeno para esta proteína es el factor alfa de necrosis tumoral (TNF). La Figura 29 proporciona una representación esquemática de la estructura predicha de ATN-103. Esta proteína de fusión deriva de camélidos y tiene un alto grado de homología de secuencia y estructural con respecto a los dominios de VH de inmunoglobulina humana. Su cadena polipeptídica sencilla está compuesta de dos dominios de unión a TNFa y uno a albúmina de suero humana (ASH), con dos engarces G-S de nueve aminoácidos que conectan los dominios. En el documento WO 06/122786 se proporciona una descripción detallada de ATN- 03.
La secuencia completa de aminoácidos de la cadena polipeptídica ATN-103 predicha a partir de la secuencia de ADN del vector de expresión correspondiente se muestra en la Figura 30 (los restos se numeran comenzando con el extremo NH2 como resto número 1 de SEQ ID NO 1 ). El último resto aminoacídico codificado por la secuencia de ADN es S363 y constituye el extremo COOH de la proteína. La masa molecular predicha para ATN-103 unida por puentes disulfuro (sin modificaciones postraduccionales) es 38434.7 Da. ATN-103 no contiene secuencias consenso de glicosilación unidas a N. La masa molecular observada para la isoforma predominante mediante espectrometría de masas en tiempo de vuelo de cuadrupolo con ionización por nanoelectropulverización corresponde a 38433.9 Da lo que confirma la ausencia de modificaciones post-traduccionales.
En la Figura 30, se subrayan las regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Los enlaces disulfuro intramoleculares predichos se ilustran por conexiones de los restos cisteina implicados. Los dominios de unión a TNF se muestran en negrita y el dominio de unión a ASH se muestra en cursiva y negrita. Los engarces de aminoácidos que conectan estos dominios de unión están en cursiva. El péptido de señal ("19 MGW...VHS"1) también se muestra para la cadena polipeptídica.
Preparación de las Moléculas de UADS Las moléculas de UADS pueden comprender una o más moléculas de dominios sencillos (por ejemplo, nanocuerpos) que son recombinantes, injertadas a CDR, humanizadas, camelizadas, desinmunizadas y/o generadas in vitro (por ejemplo, seleccionadas por presentación de fagos). Las técnicas para generar anticuerpos y moléculas de UADS y modificarlas de manera recombinante se conocen en la técnica y se describen con detalle a continuación.
Numerosos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica se encuentran disponibles para obtener anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden producirse por generación de hibridomas de acuerdo con procedimientos conocidos. Después los hibridomas formados de esta manera se exploran usando procedimientos convencionales, tales como ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y análisis por resonancia de plasmón superficial (BIACORE™), para identificar uno o más hibridomas que producen un nanocuerpo que se une específicamente a un antígeno específico. Cualquier forma del antígeno especificado puede usarse como el inmunógeno, por ejemplo, antígeno recombinante, formas de origen natural, cualquier variante o fragmento de los mismos así como péptidos antigénicos de los mismos.
Un procedimiento ejemplar para preparar anticuerpos y moléculas de UADS incluye explorar bibliotecas de expresión de proteínas, por ejemplo, bibliotecas de presentación de fagos o ribosomas. En Ladner y col., Patente de Estados Unidos N° 5,223,409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; documentos WO 92/18619; WO 91/17271 ; WO 92/20791 ; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; y WO 90/02809 se describen presentaciones de fagos.
Además del uso de bibliotecas de presentación, el antígeno especificado puede usarse para inmunizar a un animal no humano, por ejemplo, un roedor, por ejemplo un ratón, hámster o rata. En una realización, el animal no humano incluye al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humano. Por ejemplo, es posible modificar genéticamente cepas de ratón carentes de producción de anticuerpos de ratón con grandes fragmentos de loci Ig humano. Usando la tecnología de hibridoma, pueden producirse y seleccionarse anticuerpos mono-clónales específicos de antígeno derivados de genes con la especificidad deseada. Véase, por ejemplo, XENOMOUSE™, Green y col. (1994) Nature Genetics 7:13-21 , el documento US 2003-0070185, WO 96/34096, publicado el 31 de octubre de 1996, y la solicitud PCT N°. PCT/US96/05928, presentada el 29 de abril 1996.
En otra realización, se obtiene una molécula de UADS de un animal no humano y después se modifica, por ejemplo, humanizada, desinmunizada, quimérica, puede producirse usando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Se han descrito diversas estrategias para fabricar anticuerpos quiméricos y moléculas de UADS. Véase por ejemplo, Morrison y col., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 81 :6851 , 1985; Takeda y col., Nature 314:452, 1985, Cabilly y col., Patente de Estados Unidos N° 4,816,567; Boss y col., Patente de Estados Unidos N°. 4,816,397; Tanaguchi y col., Publicación de Patente Europea EP171496; Publicación de Patente Europea 0173494, patente de Reino Unido GB 2177096B. También puede producirse anticuerpos humanizados y moléculas de UADS, por ejemplo, usando ratones transgénicos que expresan genes de cadena humana pesada y ligera, pero que no pueden expresar los genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina endógena de ratón. Winter describe un procedimiento de injerto de CDR ejemplar que puede usarse para preparar los anticuerpos humanizados y moléculas de UADS descritos en este documento (Patente de Estados Unidos N° 5.225,539). Todas las CDR de un anticuerpo humano particular pueden sustituirse al menos con una parte de una CDR no humana o solamente algunas CDR pueden sustituirse con CDR no humanas. Sólo es necesario sustituir el número de CDR necesarias para la unión de anticuerpo humanizado y molécula de UADS a un antígeno predeterminado.
Los anticuerpos humanizados pueden generarse sustituyendo secuencias del dominio variable Fv que no están directamente implicadas en la unión a antígeno con secuencias equivalentes de dominios variables de Fv humanos. Los procedimientos ejemplares para generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos se proporcionan por Morrison (1985) Science 229:1202-1207; por Oi y col. (1986) BioTechniques 4:214; y por los documentos US 5,585,089; US 5,693,761 ; US 5,693,762; US 5,859,205; y US 6,407,213. Estos procedimientos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácido nucleico que codifican todo o parte de los dominios variables Fv de inmunoglobulina a partir de al menos una cadena pesada o ligera. Dichos ácidos nucleicos pueden obtenerse de un hibridoma produciendo un nanocuerpo contra una diana predeterminada, como se ha descrito anteriormente, así como a partir de otras fuentes. El ADN recombinante que codifica la molécula de UADS humanizada, por ejemplo molécula de nanocuerpo, puede después clonarse en un vector de expresión apropiado.
En algunas realizaciones, una molécula de UADS humanizada, por ejemplo, molécula de nanocuerpo, se optimiza mediante la introducción de sustituciones conservativas, sustituciones de secuencias consenso, sustituciones de línea germinal y/o retromutacíones. Dichas moléculas de inmunoglobulina modificadas pueden fabricarse mediante cualquiera de diversas técnicas conocidas en el campo técnico (por ejemplo, Teng y col., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor y col., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson y col., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982) y pueden fabricarse de acuerdo con las enseñanzas de la publicación PCT W092/06193 o el documento EP 0239400).
Las técnicas para humanizar moléculas de UADS, por ejemplo moléculas de nanocuerpo, se desvelan en el documento WO 06/122786.
Una molécula de UADS, por ejemplo, molécula de nanocuerpo, también puede modificarse mediante delecíón específica de epítopos de linfocitos T humanos o "desinmunización" mediante los procedimientos descritos en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. En resumen, los dominios variables de cadena pesada y ligera de, por ejemplo, un nanocuerpo pueden analizarse para determinar péptidos que se unen a CMH de Clase II; estos péptidos representan posibles epítopos de linfocitos T como se definen en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de posibles epitopos de linfocitos T, puede aplicarse una estrategia de modelación informatizada denominada "ensartamiento peptídico" y además puede buscarse en una base de datos de péptidos de unión al CMH humano de clase II motivos presentes en las secuencias VH y VL, como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos DR principales del CMH de clase II y de esta manera constituyen posibles epitopos de linfocitos T. Los posibles epitopos de linfocitos T detectados pueden eliminarse sustituyendo pocos restos aminoacídicos en los dominios variables o, preferentemente, mediante sustituciones sencillas de aminoácidos. Típicamente, se realizan sustituciones conservativas. Con frecuencia, pero no exclusivamente, puede usarse un aminoácido común en una posición en las secuencias de anticuerpo de la línea germinal humana. Las secuencias de la línea germinal humana, por ejemplo, se desvelan en Tomlinson, y col. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. y col. (1995) Immunol. Today Vo\. 16 (5): 237-242; Chothia, D. y col. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; y Tomlinson et al. (1995) EMBOJ. 14:4628-4638. El directorio V BASE proporciona un directorio exhaustivo de secuencias de regiones variables de inmunoglobulina humana (recopilado por Tomlinson, I.A. y col. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, RU). Estas secuencias pueden usarse como una fuente de secuencias humanas, por ejemplo, para regiones marco conservadas y las CDR. Las regiones marco conservadas humanas consenso también puede usarse, por ejemplo, como se describe en el documento US 6.300.064.
Las moléculas de UADS, por ejemplo, moléculas de nanocuerpo, pueden producirse mediante células huéspedes vivas que se han modificado genéticamente para producir la proteína. En la técnica se conocen bien procedimientos para modificar genéticamente células para producir proteínas. Véase, por ejemplo, Ausabel y col., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, Nueva York). Dichos procedimientos incluyen la introducción de ácidos nucleicos que codifican y permiten la expresión de la proteína en células huéspedes vivas. Estas células huéspedes pueden ser células bacterianas, células fúngicas o preferentemente, células de animales que crecen en cultivo. Las células huésped bacterianas incluyen, pero sin limitación, células de Escherichia coli. Los ejemplos de cepas de E. coli adecuadas incluyen: HB101 , DH5a, GM2929, JM109, KW251. NM538, NM539, y cualquier cepa de E. coli que no escinda ADN extraño. Las células huéspedes fúngicas que pueden usarse incluyen, pero sin limitación, células de Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Aspergillus. Escasos ejemplos de líneas celulares animales que pueden usarse son CHO, VERO, BHK, HeLa, Cos, MDCK, 293, 3T3 y WI38. Usando procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia pueden establecerse nuevas líneas celulares animales (por ejemplo, por transformación, infección viral y/o selección). Opcionalmente, las células huéspedes pueden secretar la proteína en el medio.
Moléculas de UADS modificadas Las formulaciones de la presente invención pueden contener al menos una molécula de UADS, por ejemplo, molécula de nanocuerpo, que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere al menos en una posición de aminoácido en una de las regiones marco conservadas de la secuencia de aminoácidos de dominio de origen natural, por ejemplo dominio VH.
Deberá entenderse que las secuencias de aminoácidos de algunas de las moléculas de UADS de la presente invención, tal como las moléculas de UADS humanizadas, pueden diferir en al menos una posición de aminoácido en al menos una de las regiones marco conservadas de las secuencias de aminoácidos de dominio de origen natural, por ejemplo, dominios VHI-I de origen natural.
La presente invención también incluye formulaciones de derivados de las moléculas de UADS. Dichos derivados pueden generalmente obtenerse por modificación y en particular por modificación química y/o biológica (por ejemplo enzimática), de las moléculas de UADS y/o de uno o más de los restos aminoacídicos que forman las moléculas de UADS descritas en el presente documento.
Los ejemplos de dichas modificaciones, así como ejemplos de restos aminoacídicos dentro de la secuencia de la molécula de UADS que puede modificarse de tal manera (es decir sobre el armazón de la proteína pero preferentemente en una cadena lateral), procedimientos y técnicas que pueden usarse para introducir dichas modificaciones y los posibles usos y ventajas de dichas modificaciones se harán obvias para el experto en la materia.
Por ejemplo, dicha modificación puede implicar la introducción (por ejemplo mediante enlace covalente u otra manera adecuada) de uno o más grupos funcionales, restos o residuos en o sobre la molécula de UADS y en particular de uno o más grupos funcionales, restos o residuos que confieren una o más propiedades deseadas o funcionalidades a las moléculas de UADS. Los ejemplos de dichos grupos funcionales serán obvios para un experto en la materia.
Por ejemplo, dicha modificación puede comprender la introducción (por ejemplo, por unión covalente o de cualquiera otra manera adecuada) de uno o más grupos funcionales que aumentan la semivida, la solubilidad y/o la absorción de la molécula de UADS, que reduce la inmunogenicidad y/o la toxicidad de la molécula de UADS, que elimina o atenúa cualquiera de los efectos secundarios no deseables de la molécula de UADS y/o que confiere otras propiedades ventajosas a y/o reduce las propiedades no deseadas de la molécula de UADS; o cualquier combinación de dos o más de las anteriores. Los ejemplos de dichos grupos funcionales y/o procedimientos para introducirlas serán evidentes para el experto en la materia y generalmente puede comprender todos los grupos funcionales y procedimientos mencionados en la técnica anterior general y citados anteriormente en el presente documento así como los grupos funcionales y procedimientos conocidos en sí mismos para la modificación de proteínas farmacéuticas y en particular para la modificación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (incluyendo los ScFv y 148 anticuerpos de dominio sencillo), cuya referencia se realiza, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Dichos grupos funcionales pueden unirse, por ejemplo, directamente (por ejemplo de manera covalente) a un Nanocuerpo de la presente invención u opcionalmente mediante un engarce o espaciador adecuado, como de nuevo será evidente para el experto en la materia.
Una de las técnicas ampliamente usadas para aumentar la semivida y/o reducir la inmunogenicidad de las proteínas farmacéuticas comprende la adhesión de un polímero adecuado farmacológicamente aceptable, tal como poli(etilenglicol) (PEG) o derivados del mismo (tales como metoxipoli(etilenglicol) o mPEG). Generalmente, puede usarse cualquier forma adecuada de pegilación, tal como la pegilación usada en la técnica para anticuerpos y fragmentos de anticuerpo (que incluyen pero sin limitación anticuerpos de dominio (sencillo) y los ScFv); se hace referencia, por ejemplo, en Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese y Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), Harris y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) y el documento WO 04/060965. Diversos reactivos para pegilación de proteínas se encuentran también disponibles en el mercado, por ejemplo de Nektar Therapeutics, Estados Unidos.
Preferentemente, se usa la pegilación dirigida, en particular mediante un resto de cisteína (véase, por ejemplo Yang y col., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003). Por ejemplo, para este propósito, el PEG puede unirse a un resto de cisteína que se produce de manera natural en una molécula de UADS, una molécula de UADS puede modificarse de manera que se introducen adecuadamente uno o más restos de cisteína para unirse a PEG o una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más restos de cisteína para unirse a PEG puede fusionarse al extremo N y/o C de un Nanocuerpo de la presente invención, todo ello usando procedimientos de modificación genética de proteínas conocidas en sí mismas por el experto en la materia.
Preferentemente, para la molécula de UADS, se usa un PEG con un peso molecular de más de 5000, tal como más de 10.000 y menos de 200.000, tal como menos de 100.000; por ejemplo en el intervalo de 20.000-80.000.
Con respecto a la pegilación, debe observarse que generalmente, la presente invención también incluye cualquier molécula de UADS que se ha pegilado en una o más posiciones de aminoácidos, preferentemente de tal manera que dicha pegilación (1) aumenta la semivida in vivo; (2) reducir la inmunogenicidad; (3) proporciona una o más propiedades beneficiosas adicionales conocidas en sí mismas para la pegilación; (4) no influye esencialmente en la afinidad de la molécula de UADS (por ejemplo no reduce dicha afinidad en más del 90 %, preferentemente no en más del 50 % y no en más del 10 %, como se determina mediante un ensayo adecuado, tal como se describe en los Ejemplos más adelante); y/o (4) no influye en ninguna del resto de propiedades deseadas de la molécula de UADS. Los grupos PEG y procedimientos para unirlos, tanto específicamente como no específicamente, serán evidentes para el experto en la materia.
Además, modificaciones normalmente menos preferidas comprenden glicosilación unida a N o unida a O, normalmente como parte de modificación co-traduccional y/o post-traduccional, dependiendo de la célula huésped usada para la expresión de la molécula de UADS.
Formulaciones Una formulación de una molécula de UADS, por ejemplo, molécula de nanocuerpo, incluye una molécula de UADS, un compuesto que puede servir como un crioprotector y un tampón. El pH de la formulación es generalmente pH 5.5 - 7.0. En algunas realizaciones, una formulación se conserva como un líquido. En otras realizaciones, se prepara una formulación como un líquido y después se seca, por ejemplo, mediante liofilización o secado por pulverización, antes de almacenar. Puede usarse una formulación seca como un compuesto seco, por ejemplo, como un aerosol o polvo o reconstituirse a su concentración original u otra, por ejemplo, usando agua, un tampón, u otro líquido apropiado.
El procedimiento de purificación de la molécula de UADS se diseña para permitir la transferencia de la molécula de UADS en una formulación adecuada para conservar a largo plazo como un líquido congelado y posteriormente para secar por congelación (por ejemplo, usando una formulación de histidina/sacarosa). La formulación se liofiliza con la proteína a la concentración específica. La formulación liofilizada después puede reconstituirse según sea necesario con un diluyente adecuado (por ejemplo, agua) para resolubilizar los componentes de la formulación originales a una concentración deseada, generalmente la misma o mayor concentración en comparación con la concentración antes de la liofilización.
La formulación liofilizada puede reconstituirse para producir una formulación que tenga una concentración que difiere de la concentración original (es decir, antes de la liofilización), dependiendo de la cantidad de agua o diluyente añadido al liofilizado con respecto al volumen de liquido que originalmente se secó por congelación. Las formulaciones adecuadas pueden identificarse ensayando uno o más parámetros de la integridad de los anticuerpos. Los parámetros ensayados son generalmente el porcentaje de especies APM o el porcentaje de especies BPM.
El porcentaje de especies APM o especies BPM se determina como un porcentaje del contenido de proteína total en una formulación o como un cambio en el aumento del porcentaje a lo largo del tiempo (es decir, durante el almacenamiento). El porcentaje total de especies APM en una formulación aceptable no es superior al 10 % de especies APM después del almacenamiento como un liofilizado o líquido a -20 °C a 40 °C (por ejemplo, de -20 °C a 25 °C, de -20 °C a 15 °C, de 2 °C a 8 °C, a aproximadamente 2 °C, o a aproximadamente 25 °C) durante al menos un año o no superior a aproximadamente el 10 % de especies BPM después del almacenamiento como un liofilizado o líquido de -20 °C a 40 °C durante al menos un año. "Aproximadamente" se refiere a + 20 % de un valor numérico citado. Por tanto, "aproximadamente 20 °C" significa de 16 °C a 24 °C.
Típicamente, el perfil de estabilidad es menor del 10 % de APM/BPM de 2° - 8 °C para un producto refrigerado y 25 °C para un producto a temperatura ambiente. Las especies de APM o las especies de BPM se ensayan en una formulación conservada como un liofilizado después de reconstituir el liofilizado. La temperatura de 40 °C es un estado acelerado que generalmente se usa para ensayar la estabilidad y determinar la estabilidad durante exposiciones de corta duración con respecto a condiciones de no conservación, por ejemplo, como puede ocurrir durante la transferencia de un producto durante el transporte.
Cuando el parámetro ensayado es el cambio de porcentaje de especies APM o especies BPM, el porcentaje de proteína total en una o ambas especies después del almacenamiento se compara con el porcentaje de proteína total en una o ambas especies antes del almacenamiento (por ejemplo, después de la preparación de la formulación). Se determina la diferencia de porcentajes. En general, el cambio de porcentaje de proteína de especies de APM o especies de BPM en formaciones líquidas no es superior al 10 %, por ejemplo, no superior a aproximadamente el 8 %, no superior a aproximadamente el 7 %, no superior a aproximadamente el 6 %, no superior a aproximadamente el 5 %, no superior a aproximadamente el 4 %, o no superior a aproximadamente el 3 % después del almacenamiento a 2 °C - 82 °C o 25 °C durante aproximadamente de 18 a 24 meses. "Aproximadamente" significa ± 20 % de un valor numérico citado, típicamente, dentro del 10 % y más típicamente, dentro del 5 % de un valor o intervalo de valores determinado. Por tanto, aproximadamente el 10 % significa del 8 % al 12 %. Las formulaciones almacenadas como producto liofilizado generalmente tienen menos de aproximadamente el 5 %, menos de aproximadamente el 4 %, menos de aproximadamente el 3 %, menos de aproximadamente el 2 % o menos de aproximadamente el 1 % de especies de APM o menos de aproximadamente el 5 %, menos de aproximadamente el 4 %, menos de aproximadamente el 3 % o menos de aproximadamente el 2 % o menos de aproximadamente el 1 % de especies de BPM después de la reconstitución o en una formulación líquida, después del almacenamiento a -30 °C - 8 °C (por ejemplo, 4 °C o -20 °C) durante aproximadamente seis, nueve, diez, doce, quince, dieciocho a veinticuatro meses.
Las formulaciones de moléculas de UADS (por ejemplo, moléculas de nanocuerpo de unión a TNF) pueden almacenarse como una formulación liquida congelada o como un liofilizado, durante, por ejemplo, al menos seis, nueve, diez, doce meses o al menos dos años, al menos tres años, al menos cuatro años o al menos cinco años. En un ejemplo, una formulación de la molécula de nanocuerpo de unión a TNF contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, moléculas de nanocuerpo de unión a TNF 50 mg/ml y tiene un pH de 6.0. En otro ejemplo, la formulación de molécula de nanocuerpo de unión a TNF contiene histidina 20 mM, sacarosa ai 7.5 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, moléculas de nanocuerpo de unión a TNF 50 mg/ml y tiene un pH de 6.0. En otro ejemplo, la formulación contiene histidina 20 mM, sacarosa al 10 %, Polisorbato 80 al 0.02 %, molécula de nanocuerpo de unión a TNF 100 mg/ml y tiene un pH de 6.0. En otro ejemplo, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, molécula de nanocuerpo de unión a TNF 50 mg/ml y tiene un pH de 6.0. En otro ejemplo adicional, la formulación contiene histidina 20 mM, sacarosa al 0 %, nanocuerpo de unión a TNF 100 mg/ml y tiene un pH de 6.0. En otro ejemplo, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, aproximadamente 80 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6.0. En otro ejemplo adicional, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, Arginina (de base) 100 mM, de 88 a 100 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 5.8. En otro ejemplo, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0,01 %, NaCI 55 mM, de 88 a 100 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6.1. En otro ejemplo adicional, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, HCI Arginina 55 mM, de 88 a 100 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6.1. En otro ejemplo, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0,01 %, Glicina 100 mM, de 88 a 100 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6.0. En otro ejemplo adicional, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, Metionina 100 mM, de 88 a 100 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF, y tiene un pH de 6.0. En otro ejemplo, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 8 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, de 88 a 100 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6,0. En otro ejemplo adicional, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, de 88 a 100 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6,0. En otro ejemplo, la formulación contiene Histidina 20 mM, Sacarosa al 5 %, 118 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6.0. En otro ejemplo adicional, la formulación contiene Tris 20 mM, Sacarosa al 5 %, 117 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 7.2. En otro ejemplo, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, aproximadamente 80 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6,0. En otro ejemplo adicional, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, aproximadamente 50 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6.0. En un ejemplo, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0,01 %, aproximadamente 1 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 5,5. En otro ejemplo, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0,01 %, HCI arginina 150 mM, aproximadamente 1 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 5,5. En otro ejemplo adicional, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0.01 %, cloruro sódico 75 mM, aproximadamente 1 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 5.5. En otro ejemplo, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0,01 %, aproximadamente 1 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6.0. En otro ejemplo, la formulación contiene histidina 0 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0,01 %, HCI arginina 150 mM, aproximadamente 1 mg/ml de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6,0. En otro ejemplo adicional, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0.01 %, cloruro sódico 75 mM, aproximadamente 1 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6.0. En un ejemplo, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0.01 %, aproximadamente 1 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6.5. En otro ejemplo, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0.01 %, HCI arginina 150 mM, aproximadamente 1 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6,5. En otro ejemplo adicional, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0,01 %, cloruro sódico 75 mM, aproximadamente 1 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6.5. En un ejemplo, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0.01 %, aproximadamente 1 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF, y tiene un pH de 7.0. En otro ejemplo, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0.01 %, HCI arginina 150 mM, aproximadamente 1 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 7.0. En otro ejemplo adicional, la formulación contiene histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0,01 %, cloruro sódico 75 mM, aproximadamente 1 mg/ml de molécula de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 7,0. En otro ejemplo adicional, la formulación de la molécula de nanocuerpo de unión a TNF contiene histidina 20 mM, sacarosa al 7.5 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, 250 mg/ml de moléculas de nanocuerpo de unión a TNF y tiene un pH de 6.0.
Posteriormente se proporcionan detalles adicionales relacionados con componentes de formulaciones y procedimientos para ensayar la integridad de la molécula de UADS, por ejemplo, la molécula de nanocuerpo de unión a TNF en una formulación.
En las formulaciones, las concentraciones de la molécula de UADS están generalmente entre aproximadamente 0.1 mg/ml y aproximadamente 350 mg/ml, por ejemplo, 0,5 mg/ml a aproximadamente 350 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 150 mg/ml, de -aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 130 mg/ml, de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 130 mg/ml, de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 120 mg/ml, de aproximadamente 80 mg/ml a aproximadamente 120 mg/ml, de aproximadamente 88 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, o aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 80 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml, aproximadamente 130 mg/ml, aproximadamente 150 mg/ml, aproximadamente 200 mg/ml, aproximadamente 250 mg/ml o aproximadamente 300 mg/ml. En el contexto de intervalos, "aproximadamente" significa - 20 % del valor del intervalo numérico citado más bajo y +20 % del valor del intervalo numérico citado más alto. En el contexto de intervalos, por ejemplo, de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, se refiere a entre 8 mg/ml y 120 mg/ml. En algunos casos, las concentraciones de la molécula de UADS en las formulaciones puede ser, por ejemplo, entre 0.1 mg/ml y 200 mg/ml, por ejemplo, 0.5 mg/ml y 100 mg/ml, 0.5 mg/ml y 1 ,0 mg/ml, 0.5 mg/ml y 45 mg/ml, 1 mg/ml y 10 mg/ml, 10 mg/ml y 40 mg/ml, 10 mg/ml y 50 mg/ml, 50 mg/ml y 100 mg/ml, 100 mg/ml y 200 mg/ml. Dichas formulaciones de moléculas de UADS pueden usarse como agentes terapéuticos. Por consiguiente, la concentración de la molécula de UADS en una formulación es suficiente para proporcionar dichas dosificaciones en un volumen de la formulación que tolere el sujeto a tratar y sea apropiada para el procedimiento de administración. En un ejemplo no limitante, para proporcionar una dosificación elevada por vía subcutánea, en la que la limitación de volumen es pequeña, (por ejemplo, de aproximadamente 1 mi a 1 ,2 mi por inyección), la concentración de la molécula de UADS es generalmente al menos de 100 mg/ml o superior, por ejemplo, de 100 mg/ml a 500 mg/ml, de 100 mg/ml a 250 mg/ml o de 100 mg/ml a 150 mg/ml. Dichas concentraciones elevadas pueden conseguirse, por ejemplo, reconstituyendo una formulación liofilizada en un volumen de diluyente apropiado (por ejemplo, agua estéril para inyección, solución salina tamponada). En algunos casos, la formulación reconstituida tiene una concentración de entre aproximadamente 100 mg/ml y 300 mg/ml (por ejemplo, 100 mg/ml, 125 mg/ml, 150 mg/ml, 175 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 275 mg/ml, 300 mg/ml). Para el almacenamiento a largo plazo, pueden usarse concentraciones elevadas, por ejemplo hasta 250 mg/ml, por ejemplo, almacenamiento congelado de preparaciones grandes de la molécula de UADS.
Para la administración por inhalación, la formulación está generalmente algo concentrada (por ejemplo, entre aproximadamente 100 mg/ml y 500 mg/ml) para proporcionar una dosis suficiente en un volumen limitado de aerosol para inspiración. En algunos casos, se usan bajas concentraciones (por ejemplo, entre aproximadamente 0,05 mg/ml y 1 mg/ml). En la técnica se conocen procedimientos para adaptar la dosificación administrada con respecto al procedimiento de administración, por ejemplo, un nebulizador a chorro o un aerosol de dosis medida.
Tampones y Crioprotectores El pH de una formulación como se describe en el presente documento es generalmente de aproximadamente pH 5.0 a aproximadamente 7.0, por ejemplo, pH de aproximadamente 5.5 a aproximadamente 6.5, pH aproximadamente de 5.5 a aproximadamente 6.0, pH de aproximadamente 6.0 a aproximadamente 6.5, pH 5.5, pH 6.0 o pH 6.5. En general, se usa un tampón que puede mantener una solución a pH de 5.5 a 6.5 para preparar una formulación, por ejemplo, un tampón que tenga una pKA de aproximadamente 6.0. Los tampones adecuados incluyen, sin limitación, tampón de histidina, TRIS, ácido 2-(N-morfolino)etanosulfónico (MES), cacodilato, fosfato, acetato, succinato y citrato. La concentración del tampón es de aproximadamente entre 4 mM y aproximadamente 60 mM, por ejemplo, de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 25 mM, por ejemplo, se usa generalmente histidina a una concentración de hasta 60 mM. En algunos casos, el tampón de histidina se usa a una concentración de aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM o aproximadamente 20 mM. En algunos casos, se usa tampón de acetato o succinato a una concentración de aproximadamente 5 mM o aproximadamente 10 mM.
En la técnica se conocen crioprotectores e incluyen, por ejemplo, sacarosa, trehalosa y glicerol. Generalmente se usa un crioprotector que muestra baja toxicidad en sistemas biológicos. El crioprotector se incluye en la formulación a una concentración de aproximadamente "del 0.5 % al 15 %, de aproximadamente el 0,5 % al 2 %, de aproximadamente el 2 % al 5 %, de aproximadamente el 5 % al 10 %, de aproximadamente el 10 % al 15 % y de aproximadamente el 5 % (peso/volumen).
El tampón de histidina, que puede usarse como un tampón en una formulación de nanocuerpo de unión a TNF, puede tener propiedades crioprotectoras. En algunas realizaciones de la invención, se usa un tampón de histidina junto con un crioprotector tal como un azúcar, por ejemplo, sacarosa. Una formulación de la presente invención puede excluir específicamente el uso de histidina en cualquier cantidad sustancial, por ejemplo, ni el tampón ni el componente crioprotector de la formulación es una histidina.
La viscosidad de una formulación es generalmente una que es compatible con la vía de administración de la formulación. En algunas realizaciones, la viscosidad de la formulación es de entre 1 cP y 4 cP, por ejemplo, de aproximadamente 2 cP a 3,5 cP. En otras realizaciones, la viscosidad de la formulación es entre aproximadamente 5 cP y aproximadamente 40 cP. En realizaciones específicas, la viscosidad de la formulación es aproximadamente 1 cP, 2 cP, 2,4 cP a 2,8 cP, 3 cP, 3,1 cP a 3,2 cP, 4 cP, 5 cP, 10 cP, 15 cP, 20 cP, 25 cP, 30 cP, 35 cP o 40 cP.
Tensioactivos En algunas realizaciones, se incluye un tensioactivo en la formulación. Los ejemplos de tensioactivos incluyen, sin limitación, tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbato-20, polisorbato-40, polisorbato-60, polisorbato-65, polisorbato-80 o polisorbato-85); Tritón™; dodecil sulfato sódico (SDS); lauril sulfato sódico; octil glucósido sódico; lauril-sulfobetaína, miristil-sulfobetaína, linoleil-sulfobetaína, estearil-sulfobetaína, lauril-sarcosina, miristil-sarcosina, linoleil-sarcosina, estearil-sarcosina, linoleil-betaína, miristil-betaína, cetil-betaína, lauroamidopropil-betaina, cocamidopropil-betaína, linoleamidopropil-betaína, miristamidopropil- betaína, palmidopropil- betaína, isoestearamidopropil-betaína (por ejemplo lauroamidopropilo), miristarnidopropil-, palmidopropil-, o isostearamidopropil-dimetilamina; metil cocoil- sódico o metil ofeil-taurato disódico y la serie Monaquat™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietilenglicol, polipropilglicol y copolimeros de etileno y propilenglicol por ejemplo, poloxámeros (por ejemplo, poloxamer 188).
La cantidad de tensioactivo añadida es tal que reduce la agregación de la proteína reconstituida a un nivel aceptable según se ensaya, usando, por ejemplo, HPLC-SEC de especies APM o especies DPM y minimiza la formación de partículas después de la reconstitución de un liofilizado de una formulación de nanocuerpo de unión a TNF. También se ha demostrado que la adicción de tensioactivo reduce el tiempo de reconstitución de una formulación liofilizada de anticuerpos de unión a TNF y ayuda en la desgasificación de la solución. Por ejemplo, el tensioactivo puede estar presente en la formulación (líquido o antes de la liofilización) en una cantidad de aproximadamente el 0.001 % al 0.6 %, por ejemplo, de aproximadamente el 0.005 % al 0.05 %, de aproximadamente el 0.005 % a aproximadamente el 0.2 % y de aproximadamente el 0.01 % al 0.2 %.
Adiciones a las Formulaciones Las formulaciones se almacenan como soluciones estériles o liofilizados estériles. La prevención de la acción de microorganismos en las formulaciones también puede conseguirse incluyendo al menos un agente antibacteriano y/o antifúngico en una formulación, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En algunos casos, un liofilizado se reconstituye con agua bacteriostática (por ejemplo, agua que contiene alcohol bencílico al 0.9 %). En la técnica se conocen consideraciones para la inclusión de un conservante en una formulación así como procedimientos para identificar conservantes que son compatibles con un procedimiento de administración y formulación específica (por ejemplo, véase Gupta, et al. (2003), AAPS Pharm. Sci. 5: artículo 8, p. 1-9).
En algunos casos, la formulación es isotónica. En general, cualquier componente conocido en la técnica que contribuya a la osmolaridad/tonicidad de la solución puede añadirse a una formulación (por ejemplo, sales, azúcares, polialcoholes o una combinación de los mismos). La isotonicidad generalmente se consigue usando un componente de una formulación básica (tal como sacarosa) en una concentración isotónica o añadiendo un componente adicional, tal como un azúcar, un polialcohol tal como manitol o sorbitol o una sal tal como cloruro sódico.
En algunos casos se usa una sal en una formulación de nanocuerpo de unión a TNF, por ejemplo, para conseguir la isotonicidad o para aumentar la integridad del nanocuerpo de unión a TNF de la formulación. Las sales adecuadas para su uso se describen, anteriormente. La concentración de sal puede ser de aproximadamente 0 mM a aproximadamente 300 mM.
En algunos casos, la formulación se prepara con Tween (por ejemplo Tween® 20, Tween® 80) para disminuir la degradación interfacial. La concentración de Tween puede ser de aproximadamente el 0.001 % a aproximadamente el 0.05 %. En un ejemplo, se usa Tween 80 a una concentración de 0.01 % en la formulación.
En otros casos determinados, la formulación se prepara con arginina. La concentración de arginina en la formulación puede ser de aproximadamente el 0.01 % a aproximadamente el 5 %. En un ejemplo, se usa arginina a una concentración del 2 % en la formulación. En algunos casos se añaden Tween y arginina a las formulaciones de unión de TNF descritas en el presente documento.
En otros casos adicionales, la formulación puede prepararse al menos uno de: sorbitol, glicina, metionina o cloruro sódico. Si en la formulación se incluye sorbitol, este puede añadirse a una concentración de entre aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 10 %. En un ejemplo, se encuentra sorbitol en la formulación a una concentración del 5 %. Si en la formulación se incluye glicina, esta puede añadirse a una concentración de entre aproximadamente el 0.1 % a aproximadamente el 2 %. En un ejemplo, se observa glicina en la formulación a una concentración del 1 %. Si en la formulación se incluye metionina, esta puede añadirse a una concentración de entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 150 mM. En un ejemplo, se añade metionina en la formulación a una concentración de 00 mM. En otro ejemplo, a la formulación se añade metionina a una concentración de aproximadamente 10 mM, aproximadamente 20 mM o aproximadamente 70 mM. Si en la formulación se incluye cloruro sódico, este puede añadirse a una concentración de entre aproximadamente 5 mM y aproximadamente 100 mM. En un ejemplo, se añade cloruro sódico a la formulación a una concentración de 55 mM.
Procedimientos de Almacenamiento y Preparación Congelación En algunos casos, las formulaciones que contienen anticuerpo se congelan para el almacenamiento. Por consiguiente, es deseable que la formulación sea relativamente estable en dichas condiciones, que incluyen, ciclos de congelación/descongelación. Un procedimiento para determinar la idoneidad de una formulación es someter una formulación de muestra a al menos dos, por ejemplo, tres, cuatro, cinco, ocho, diez o más ciclos de congelación (a, por ejemplo, -20 °C o -80 °C) y descongelación (por ejemplo por descongelación rápida en un baño caliente a 37 °C o descongelación lenta a 2o - 8 °C), determinando la cantidad de especies APM y/o especies BPM que se acumulan después de los ciclos de congelación/descongelación y comparándolas con la cantidad de especies APM o especies BPM presentes en la muestra antes del procedimiento de congelación-descongelación. Un aumento de especies APM o BPM indica que la estabilidad disminuye.
Liofilización Las formulaciones pueden almacenarse después de la liofilización. Por lo tanto, es útil ensayar una formulación para determinar la estabilidad del componente de proteína de la formulación después de la liofilización para determinar la idoneidad de una formulación. El procedimiento es similar al descrito, anteriormente, para congelación, excepto que la formulación de la muestra se liofiliza en lugar de congelarse, se reconstituye a su volumen original y se ensaya para determinar la presencia de especies APM y/o especies BPM. La formulación de la muestra liofilizada se compara con una formulación de muestra correspondiente que no se ha liofilizado. Un aumento de las especies de APM o BPM en la muestra liofilizada en comparación con la muestra correspondiente indica estabilidad disminuida en la muestra liofilizada.
En general, un protocolo de liofilización incluye cargar una muestra en un liofilizador, un periodo de pre-enfriamiento, congelación, iniciación al vacío, nivelación hasta la primera temperatura de secado, secado primario, nivelación hasta la segunda temperatura de secado, segundo secado, y detener la muestra. Los parámetros adicionales que pueden seleccionarse para un protocolo de liofilización incluyen vacío (por ejemplo, en micrómetros) y temperatura de condensación. Las tasas de nivelación adecuadas para temperatura están entre aproximadamente 0.1 °C/min a 2 °C/min, por ejemplo, 0.1 °C/min a 1.0 °C/min, de 0.1 °C/min a 0.5 °C/min, de 0.2 °C/min a 0.5 °C/min, 0.1 °C/min, 0.2 °C/ min, 0.3 °C/ min, 0.4 °C/ min, 0.5 °C/min, 0.6 0C/min, 0.7 °C/min, 0.8 °C/m¡n, 0.9 °C/ min y 1.0 °C/min. Las temperaturas válidas adecuadas durante la congelación para un ciclo de liofilización son generalmente de aproximadamente -55 °C a -5 °C, de -25 °C a -5 °C, de -20 °C a -5 °C, de -15 °C a -5 °C, de -10 °C a -5 °C, -10 °C, -1 1 °C, -12 °C, -13 °C , -14 °C, -15 °C, -16 °C, -17 °C, -18 °C, -19 °C, -20 °C, -21 °C, -22 °C, -23 °C, -24 °C o -25 °C. Las temperaturas válidas pueden ser diferentes del primer y segundo secado, por ejemplo, el primer secado puede realizarse a una temperatura inferior al segundo secado. En un ejemplo no limitante, el primer secado puede ejecutarse a 0 °C y un secado secundario a 25 °C.
En algunos casos, se usa un protocolo de recalentamiento durante la congelación y antes de iniciar el vacío. En dichos casos, el tiempo de recalentamiento debe seleccionarse y la temperatura está generalmente por encima de la temperatura de transición vitrea de la composición. En general, el tiempo de recalentamiento es de aproximadamente 2 a 15 horas, de aproximadamente 3 a 12 horas, de aproximadamente 2 a 10 horas, de aproximadamente 3 a 5 horas, de aproximadamente 3 a 4 horas, de aproximadamente 2 horas, de aproximadamente 3 horas, de aproximadamente 5 horas, de aproximadamente 8, de aproximadamente 10 horas, de aproximadamente 12 horas o de aproximadamente 15 horas. La temperatura para el recalentamiento es generalmente de aproximadamente -35 °C a aproximadamente -5 °C, por ejemplo de aproximadamente -25 °C a aproximadamente -8 °C, de aproximadamente -20 °C a aproximadamente -10 °C, de aproximadamente -25 °C, de aproximadamente -20 °C, de aproximadamente -15 °C, de aproximadamente 0 °C o de aproximadamente -5 °C. En algunos casos, la temperatura de recalentamiento es generalmente de -35 °C a 0 °C, por ejemplo, de -25 °C a -8 °C, de -20 °C a -10 °C, -25 °C, -20 °C, -15 °C, 0 °C.
La estabilidad de las formulaciones descritas en el presente documento puede ensayarse usando una diversidad de parámetros de liofilización que incluyen: las primeras temperaturas válidas de secado de -25 °C a 30 °C y duraciones de secado secundarias de 2 horas a 9 horas a 0 °C a 30 °C.
En un ejemplo no limitante, se formuló a granel y se liofilizó una formulación de histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, polisorbato 80 al 0.01 %, pH 6.0 a una concentración de proteína de 50 mg/ml de nanocuerpo de unión a TNF. Después de liofilización, el producto se reconstituyó con aproximadamente la mitad del volumen de carga para administrar la proteína a 100 mg/ml. Se demostró que el anticuerpo TNF era fuerte después de la liofilización a extremos en temperaturas producto. El perfil de estabilidad después del almacenamiento a 50 °C durante 4 semanas fue idéntico para material que se había preparado usando una diversidad de ciclos de liofilización (por ejemplo, véanse las Figuras 16-20), algunas de las cuales tuvieron diferencias de casi 10 °C en la temperatura del producto durante el secado primario (por ejemplo, Figura 13). En general, un ciclo de liofilización puede realizarse desde 10 horas a 100 horas, por ejemplo, 20 horas a 80 horas, 30 horas a 60 horas, 40 horas a 60 horas, 45 horas a 50 horas, 50 horas a 65 horas.
Los ejemplos delimitantes del intervalo de temperatura para el almacenamiento de una formulación de anticuerpo es de aproximadamente -20 °C a aproximadamente 50 °C, por ejemplo, de aproximadamente -15 °C a aproximadamente 30 °C, de aproximadamente -15 °C a aproximadamente 20 °C, de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 25 °C, de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 20 °C, de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 15 °C, de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 12 °C, de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 10 °C, de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 8 °C, de aproximadamente 2 °C a aproximadamente 6 °C o aproximadamente de 2 °C, 3 °C, 4 °C, 5 °C, 6 °C, 7 °C, 8 °C, 10 °C, 15 °C, 25 °C o 30 °C. En algunos casos, al margen de las temperaturas de almacenamiento, las muestras son estables a cambios de temperatura que pueden producirse transitoriamente durante las condiciones de almacenamiento y transporte de lo que pudiera preverse para dichas composiciones.
Secado por Pulverización En algunos casos, una formulación se seca por pulverización y después se almacena. El secado por pulverización se realiza usando procedimientos conocidos en la técnica y pueden modificarse para usar secado por pulverización líquido o congelado (por ejemplo, usando procedimientos tales como los de Niro Inc. (Madison, Wl), Upperton Particle Technologies (Nottingham, Inglaterra), o Buchi (Brinkman Instruments Inc., Westbury, NY), o Publicaciones de Patente de Estados Unidos N° 20030072718 y 20030082276).
Determinación de la Integridad de la Molécula de UADS La acumulación de especies APM y especies BPM son medidas útiles de inestabilidad de anticuerpos. La acumulación de APM o BPM en una formulación es indicativa de inestabilidad de una proteina almacenada como parte de la formulación. La cromatografía con HPLC por exclusión de tamaño puede usarse para determinar la presencia de especies APM y BPM. En la técnica se conocen sistemas adecuados para dichas mediciones, por ejemplo sistemas HPLC (Waters, Milford, MA). En la técnica pueden usarse otros sistemas conocidos para evaluar la integridad de los anticuerpos en una formulación, por ejemplo, SDS-PAGE (para controlar especies APM y BPM), bioensayos de actividad de anticuerpos, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas, capacidad para unir proteínas diana purificadas (por ejemplo, TNFa) y HPLC de intercambio catiónico (HPLC-CEX; para detectar variantes y controlar cambios superficiales). En un ejemplo, un bioensayo es un ensayo basado en células en el que la inhibición de la actividad dependiente de TNFa se examina en presencia de diferentes concentraciones de la molécula de nanocuerpo formulada para demostrar la actividad biológica.
Artículos de Fabricación La presente solicitud también proporciona un artículo de fabricación que incluye una formulación como se describe en el presente documento y proporciona instrucciones para su uso en la formulación.
Las formulaciones a usar para administrar a un sujeto, por ejemplo, como un agente farmacéutico debe ser estéril. Esto puede conseguirse usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de, o después, de la formulación de un líquido o liofilización y reconstitución. Como alternativa, cuando esto no dañe la estructura, los componentes de la formulación pueden esterilizarse usando autoclave y después combinarse con componentes esterilizados por radiación o filtro para producir la formulación.
En la formulación farmacéutica puede administrarse con un dispositivo de administración transcutánea, tal como una jeringa, que incluye una jeringa hipodérmica o multicámara. En una realización, el dispositivo es una jeringa previamente cargada en la que se incorpora o integra una aguja. En otras realizaciones, el dispositivo es una jeringa previamente cargada que no tiene incorporada una aguja. La aguja puede envasarse con la jeringa previamente cargada. En una realización, el dispositivo es un dispositivo autoinyector, por ejemplo, una jeringa autoinyectora. En otra realización el dispositivo de inyección es una pluma inyectora. En otra realización adicional, la jeringa es una jeringa con aguja en estaca, jeringa luer lock o jeringa luer slip. Otros dispositivos de administración adecuados incluyen endoprótesis vasculares, catéteres, microagujas y dispositivos de liberación controlada implantables. La composición puede administrarse por vía intravenosa con equipo convencional IV, que incluye, por ejemplo, catéteres para entubado IV, con o sin filtros en línea.
En algunas realizaciones, una jeringa es adecuada para su uso con un dispositivo autoinyector. Por ejemplo, el dispositivo autoinyector puede incluir un sistema vial sencillo, tal como dispositivo inyector de pluma para el suministro de una solución. Dichos dispositivos se encuentran disponibles en el mercado de los fabricantes tales como BD Pens, BD Autojector®, Humaject®, NovoPen®, B-D®Pen, AutoPen® y OptiPen®, GenotropinPen®, Genotronorm Pen®, Humatro Pen®, Reco-Pen®, Roferon Pen®, Biojector®, Iject®, J-tip Needle-Free Injector®, DosePro®, Medi-Ject®, por ejemplo, como se fabrica o desarrolla por Becton Dickensen (Franklin Lakes, N. J.), Ypsomed (Burgdorf, Suiza, www.ypsomed.com; Bioject, Portland, Oreg.; National Medical Products, Weston Medical (Peterborough, Reino Unido), Medi-Ject Corp (Minneapolis, Minn.), y Zogenix, Inc, Emeryville, CA. Los dispositivos reconocidos que comprenden un sistema vial dual incluyen los sistemas inyectores de pluma para reconstituir un fármaco liofilizado en un cartucho para el suministro de la solución reconstituida tal como HumatroPen®.
El artículo de fabricación puede incluir un envase adecuado para contener la formulación. Un envase adecuado puede ser, sin limitación, un dispositivo, frasco, vial, jeringa, tubo de ensayo, nebulizador (por ejemplo nebulizadores de malla ultrasónicos o de vibración), bolsa de solución i.v. o inhalador (por ejemplo, un inhalador de dosis medida (IDM) o inhalador en polvo seco (IPS)). El envase puede formarse mediante cualquier material adecuado tal como vidrio, metal o un plástico tal como policarbonato poliestireno o polipropileno. Por ejemplo, el envase (por ejemplo, jeringa o vial) puede fabricarse con vidrio, plástico o un copolímero de olefina cíclica o un polímero de olefina cíclica. Opcionalmente, el envase (por ejemplo, jeringa o vial) tiene un tapón, por ejemplo, un tapón de goma. Las realizaciones específicas de envases para almacenar las presentes formulaciones incluyen: (i) líquido en un vial de vidrio con tapón de goma; (ii) líquido en una jeringa previamente cargada de vidrio con émbolo de goma; y (iii) líquido en una jeringa polimérica que puede cargarse previamente, por ejemplo copolímero de olefina cíclico (COC) o polímero de olefina cíclico (COP), con émbolo de goma.
En general, el envase es de un material que no absorbe cantidades significativas de proteína de la formulación y no reacciona con los componentes de la formulación.
En algunas realizaciones, el envase es un vial de vidrio transparente con un tapón, por ejemplo, un tapón gris de silicona West 4432/50 1319 o un tapón Durafluor West 4023. En algunas realizaciones, el envase es una jeringa. En realizaciones específicas, la formulación comprende 100 mg/ml del nanocuerpo de unión a TNF, histidina 20 mM, sacarosa al 7.5 %, polisorbato-80 al 0.01 %, pH 6.0 en una jeringa previamente cargada. En otra realización, la formulación comprende aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml del nanocuerpo de unión a TNF, histidina 20 mM, sacarosa al 7.5 %, polisorbato-80 al 0.01 %, pH 6 en una jeringa de olefina cíclica previamente cargada y un émbolo de goma gris de silicona West 4432/50. En otras realizaciones, las formulaciones incluyen aproximadamente 10 mg/ml, aproximadamente 50 mg/ml, aproximadamente 100 mg/ml del nanocuerpo de unión a TNF, histidina 20 mM, sacarosa al 7,5 %, polisorbato-80 al 0,01 %, pH 6 en una jeringa de vidrio previamente cargada y un émbolo gris de silicona West 4432/50 o émbolo de goma West 4023/50 revestido con Flourotec/B2 Daikyo.
Los artículos de fabricación descritos en el presente documento pueden incluir adicionalmente un material de envasado. El material de envasado proporciona, además de información para su uso o administración, por ejemplo, información necesaria por una agencia reguladora respecto a las condiciones en las que puede usarse el producto. Por ejemplo, el material de envasado puede proporcionar instrucciones al paciente de cómo inyectar una jeringa previamente cargada que contiene las formulaciones descritas en el presente documento o como reconstituir la formulación liofillizada en un diluyente acuoso para formar una solución en un periodo especificado, por ejemplo, durante un periodo de 2-24 horas o superior. Las formulaciones reivindicadas actualmente son útiles para el uso del producto farmacéutico en seres humanos.
En algunas realizaciones, las formulaciones pueden administrarse como nebulizadores. Los ejemplos de nebulizadores incluyen, en ejemplos no limitantes, nebulizadores a chorro, nebulizadores ultrasónicos y nebulizadores de malla con vibración. Estas clases usan diferentes procedimientos para crear un aerosol a partir de un líquido. En general, cualquier dispositivo que genere un aerosol que pueda conservar la integridad de la proteína en estas formulaciones es adecuado para la administración de formulaciones como se describe en el presente documento.
En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmico sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las Patentes de Estados Unidos N° 5,399,163, 5,383,851 , 5,312,335, 5,064,413, 4,941 ,880, 4,790,824 ó 4,596,556. Los ejemplos de implantes bien conocidos y módulos incluyen: Patente de Estados Unidos N° 4.487.603 que describe una bomba microinfusora implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada: la Patente de Estados Unidos N° 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la Patente de Estados Unidos N° 4,447,233, que describe una bomba ¡nfusora de medicación para administrar medicación a una velocidad de infusión exacta; la Patente de Estados Unidos N° 4,447,224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua del fármaco; la Patente de Estados Unidos N° 4,439,196, que describe un sistema de suministro de fármaco osmótico que tienen compartimentos multicámaras y la Patente de Estados Unidos N° 4,475,196 que describe un sistema de administración de fármaco osmótico. La composición terapéutica también puede estar en forma de una formulación de liberación prolongada biodegradable o no biodegradable para administración subcutánea o intramuscular. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 3,773,919 y 4,767,628 y la Solicitud PCT N° WO 94/15587. La administración continua también puede conseguirse usando una bomba implantable o externa. La administración también puede realizarse de manera intermitente, por ejemplo, inyección diaria sencilla o de manera continua a una dosis baja, por ejemplo, formulación de liberación prolongada. El sistema de suministro puede modificarse para ajustarse de manera óptima a la administración de la molécula de UADS. Por ejemplo, puede fabricarse una jeringa de silicona hasta el punto de que sea óptima para el almacenamiento y suministro de la molécula de UADS. Por supuesto, también se conocen muchos otros de estos implantes, sistemas de suministro y módulos. La invención también presenta un dispositivo para administrar un primer y segundo agente. El dispositivo puede incluir, por ejemplo, una o más carcasas para almacenar preparaciones farmacéuticas y puede configurarse para administrar dosis unitarias del primer y segundo agente. El primer y segundo agentes pueden almacenarse en el mismo compartimento o individuales. Por ejemplo, el dispositivo puede combinar los agentes antes de la administración. También es posible el uso de diferentes dispositivos para administrar el primer y segundo agente.
Administración y Procedimiento del Tratamiento Las formulaciones de la presente invención pueden administrarse a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano) en solitario o en combinación con un segundo agente, por ejemplo, un segundo agente terapéutica o farmacológicamente activo, para tratar o prevenir (por ejemplo, reducir o mejorar uno o más de los síntomas asociados con) un trastorno asociado con TNFa, por ejemplo, trastornos inflamatorios o autoinmunológicos. El término "tratamiento" se refiere a administrar una terapia en una cantidad, manera y/o modo eficaz para mejorar una afección, síntoma o parámetro asociado con un trastorno o para prevenir el avance de un trastorno a un grado estadísticamente significativo o a un grado detectable para un experto en la materia. Una cantidad eficaz, manera o modo puede variar dependiendo del sujeto y puede ajustarse al sujeto.
Los ejemplos no limitantes de trastornos inmunológicos que pueden tratarse incluyen, pero sin limitación, trastornos autoinmunológicos, por ejemplo, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis asociada con lupus o espondilitis anquilosante), esclerodermia, lupus sistémico eritematoso, síndrome de Sjogren, vasculitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), miastenia grave, enfermedad intestinal inflamatoria (IBD), enfermedad de Crohn, colitis, diabetes mellitus (tipo I); afecciones inflamatorias de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, soriasis); afecciones inflamatorias agudas (por ejemplo endotoxemia, sepsis y septicemia, síndrome de choque tóxico y enfermedades infecciosas); rechazo al transplante y alergia. En una realización, el trastorno asociado con TNFa es un trastorno artrítico, por ejemplo, un trastorno seleccionado de uno o más de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil (RA) (por ejemplo artritis reumatoide de moderada a grave), osteoartritis, artritis psoriásica o espondilitis anquilosante, artritis idiopática juvenil (AIJ) poliarticular; o psoriasis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria y/o esclerosis múltiple.
En algunas realizaciones, las formulaciones incluyen un segundo agente terapéutico. Por ejemplo, para nanocuerpos de TNF, el segundo agente puede ser un anticuerpo anti-TNF o un fragmento de unión a TNF del mismo, en el que el segundo anticuerpo de TNF tiene una especificidad epitópica diferente a la de la molécula de UADS de unión a TNF de la formulación. Otros ejemplos no limitantes de agentes que pueden coformularse con UADS de unión a TNF incluyen, por ejemplo, un inhibidor de citocina, un inhibidor de factores de crecimiento, un inmunosupresor, un agente antiinflamatorio, un inhibidor metabólico, un inhibidor enzimático, una gente citotóxico y un agente citostático. En una realización, el agente adicional es un tratamiento patrón para artritis, que incluye, pero sin limitación, agentes antiinflamatorios no esteroideos (AINE); corticosteroides, que incluyen prednisolona, prednisona, cortisona y triamcinolona; y fármacos antireumáticos modificadores de enfermedades (FARMD), tales como metotrexato, hidroxicloroquina (Plaquenil) y sulfasalacina, leflunomida (Arava®), inhibidores del factor de necrosis tumoral, incluyendo etanercept (Enbrel®), infliximab (Remicade®) (con o sin metotrexato) y adalimumab (Humira®), anticuerpo anti-CD20 (por ejemplo Rituxan®), receptor soluble de interleucina-1, tal como anakinra (Kineret), oro, minociclina (Minocin®), penicilamina y agentes citotóxicos que incluyen azatioprina, ciclofosfamida y ciclosporina. Dichas terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosificaciones menores de los agentes terapéuticos administrados impidiendo de esta manera posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.
Las formulaciones de la presente invención pueden estar en forma de una solución líquida (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles). Dichas composiciones pueden administrarse por un modo parenteral (por ejemplo, inyección subcutánea, intraperitoneal o intramuscular) o por inhalación. Las frases "administración parenteral" y "administrada por vía parenteral" como se usa en el presente documento significan modos de administración distintos a la administración entérica y tópica, normalmente por inyección e incluyen administración subcutánea o intramuscular, así como administración intravenosa, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcuticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal e infusión. En una realización, las formulaciones descritas en el presente documento se administran por vía subcutánea.
Las formulaciones farmacéuticas son estériles y estables en las condiciones de la fabricación y almacenamiento. Una composición farmacéutica también puede ensayarse para garantizar que cumple las normas reguladoras y de industria para la administración.
Una formulación farmacéutica puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada a elevada concentración de proteína. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando un agente descrito en el presente documento en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes indicados anteriormente, si fuera necesario, seguido por esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando un agente descrito en el presente documento en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios a partir de los enumerados anteriormente. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede realizarse incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
En algunas realizaciones, se describen las características de los parámetros que describen las formulaciones, por ejemplo, parámetros que pueden aparecer en la etiqueta del producto. Dichos parámetros incluyen, por ejemplo, color (típicamente incoloro o ligeramente amarillo o de incoloro a amarillo), transparencia (típicamente de transparente a ligeramente opalescente o de transparente a opalescente) y viscosidad (típicamente entre aproximadamente 1 y 5 cP cuando se mide a temperatura ambiente, tal como de 20 °C a 30 °C). Dichos parámetros pueden medirse por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la transparencia puede medirse usando patrones de opalescencia disponibles en el mercado (disponibles de, por ejemplo, Hach Company, Loveland, CO 80539).
EJEMPLOS La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos. Los ejemplos se proporcionan con propósitos únicamente ilustrativos. Estos no deben interpretarse como una limitación del alcance o contenido de la presente invención de ninguna manera.
EJEMPLO 1 Estabilidad de Formulación Liofilizada a Alta Concentración de ATN-103 (duración de 6 meses) Un procedimiento para almacenar un anticuerpo para su uso para, por ejemplo, aplicaciones terapéuticas, es un polvo seco preparado por liofilización. Por consiguiente, se estudió la estabilidad a largo plazo de una formulación de unión a TNF liofilizada.
En resumen, se preparó una formulación que contenía un nanocuerpo de unión a TNF humanizado (50 mg/ml), histidina 10 mM, sacarosa al 5 % (peso/volumen), polisorbato-80 al 0.01 %, pH 6.0, por filtración estéril y se suministró en un vial en forma de tubo de vidrio sin pirógeno de 5 mi y después se liofilizó. La formulación se almacenó a 4 °C, 25 °C o 40 °C durante un mes, tres meses y seis meses, después se reconstituyó con agua estéril (USP) produciendo la formulación reconstituida de tal manera que la formulación era nanocuerpo de unión a TNF 100 mg/ml, histidina 20 mM, sacarosa al 10 %, Polisorbato-80 al 0.02 %, pH 6.0.
La estabilidad del líquido de concentración elevada se ensayó por actividad biológica, unión a Albúmina de Suero Humana (ASH), porcentaje de APM y porcentaje de BPM mediante HPLC-SE, porcentaje de nanocuerpo de unión a TNF y porcentaje de impureza sin producto por SDS-CE y evaluación mediante HPLC-CEX de tiempo de retención relativo y compatibilidad del perfil de elución con respecto al patrón de referencia del nanocuerpo de unión a TNF.
Las formulaciones de nanocuerpo de unión a TNF liofilizadas se ensayaron para actividad biológica usando un ensayo desvelado en el documento WO 2006/122786. La Figura 1 ilustra los datos de dicha serie de ensayos. Los datos se expresaron con unidades por mg. Las muestras eran aproximadamente de 5 - 5.5 x 106 U/mg antes del almacenamiento y eran aproximadamente de 4,5 - 5.5 x 106 U/mg después de la incubación. En general, no hubo cambio sustancial en la cantidad de bioactividad después de seis meses de almacenamiento en ninguna de las muestras. Por tanto, la formulación es, como se determina mediante actividad biológica, adecuada para almacenamiento de la formulación liofilizada durante al menos seis meses.
Las formulaciones de nanocuerpo de unión a TNF liofilizadas también se ensayaron para la actividad de unión a Albúmina de Suero Humana (ASH). La Figura 2 ilustra los datos de dicha serie de ensayos de unión. La actividad de unión inicial de la formulación era de aproximadamente el 100 % de la muestra de referencia y no cambió sustancialmente para ninguna de las muestras durante un periodo de seis meses de ensayo. Por tanto, la formulación es, como se determina mediante ensayo de unión a ASH, adecuada para almacenamiento de la formulación liofilizada durante al menos seis meses.
El porcentaje de especies APM se ensayó usando HPLC-SE. El porcentaje de especies APM en la formulación antes de la liofilización y reconstitución fue de aproximadamente 0.1 % de la proteína total en la formulación y también entre aproximadamente 0.1 % y 0.2 % en todas las muestras almacenadas a 4 °C y 25 °C (Fig. 3). Después de seis meses de almacenamiento a 40 °C, las formulaciones tenían aproximadamente 0,35 % de especies APM (Fig. 3). Por tanto, no hubo aumento sustancial en el nivel de especies APM en las muestras almacenadas a 4 °C y 25 °C durante seis meses.
El porcentaje de especies BPM se ensayó usando HPLC-SE. El porcentaje de especies BPM en la formulación estaba por debajo del límite de detección (es decir 0,0 %) a temperaturas de 4 °C, 25 °C y 40 °C durante hasta seis meses.
El porcentaje de nanocuerpo de unión a TNF se ensayó usando SDS-CE. El porcentaje inicial del nanocuerpo de unión a TNF en la formulación era de aproximadamente el 100 % y no cambió sustancialmente en ninguna de las muestras durante los seis meses del periodo del ensayo (Fig. 4).
El porcentaje de impurezas sin productos se ensayó usando SDS-CE. Se observaron impurezas insignificantes sin producto mediante SDS-CE para la formulación a temperaturas de 4 °C, 25 °C y 40 °C durante hasta seis meses.
Las formulaciones de nanocuerpo de unión a TNF liofilizadas también se ensayaron para determinar la identidad usando HPLC-CEX. El perfil de elución para la formulación era comparable a patrones de referencia a temperaturas de 4 °C, 25 °C y 40 °C durante hasta seis meses. El tiempo de retención relativo del pico designado se mantuvo sin cambios a un patrón de ,00 a temperaturas de 4 °C, 25 °C y 40 °C durante hasta seis meses.
El efecto de la adición de Polisorbato-80 sobre las propiedades de reconstitución para la formulación de nanocuerpo de unión a TNF liofilizado también se ensayó. La adición de polisorbato 80 al producto liofilizado mejora la calidad del producto mejorando el aspecto y disolución del polvo liofilizado como puede observarse en la siguiente tabla.
TABLA 1 Los datos descritos en el presente documento muestran cambios limitados en cuanto a la degradación de los productos como una función del tiempo de almacenamiento a diversas temperaturas.
EJEMPLO 2 Solidez de la formulación del nanocuerpo de unión a TNF para la liofilización Además de la formulación liofilizada aplicando el ciclo de liofilización diana (Ejemplo 1), se prepararon dos lotes adicionales de productos farmacológicos aplicando dos ciclos adicionales de liofilización "sólida", a la misma formulación. Los dos ciclos de liofilización "sólida" imitan desviaciones de procedimientos significativos que podrían ocurrir en un entorno de fabricación. Se usó la misma formulación del producto farmacológico en el estudio de solidez como en el estudio del ciclo de liofilización diana (control). Histidina 10 mM, Sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, nanocuerpo de unión a TNF 50 mg/ml a pH 6.0. Después de la reconstitución, (usando un volumen de diluyente de reconstitución de aproximadamente la mitad del de producto cargado antes de la liofilización) la formulación de ATN-103 es la siguiente: Histidina 20 mM, Sacarosa al 10 %, Polisorbato 80 al 0.02 %, nanocuerpo de unión a TNF 100 mg/ml a pH 6.0.
Los dos ciclos de liofilización sólida que imitan desviaciones de procedimiento significativos se denominan "humedad elevada" y "agresión". La Figura 5 demuestra que la formulación sometida a los ciclos de liofilización sólida muestran estabilidad comparable con la del ciclo diana (control). Los viales de liofilización de formulación sólida se sometieron a estabilidad acelerada junto con el ciclo de liofilización de control y se analizaron por HPLC-SE.
Estos datos demuestran que la formulación de ATN-103 liofilizada es sólida con respecto a desviaciones de procedimientos significativos sin impacto sobre el producto.
El porcentaje de especies BP para formulación sometidas a ciclos de liofilización de control y solidez se ensayó usando HPLC-SE. El porcentaje de especies BPM por HPLC-SE para el nanocuerpo de unión a TNF liofilizado estaba por debajo del límite de detección (es decir 0.0 %) a t0 y 50 °C durante hasta un mes para los tres ciclos.
Prácticas de Liofilización En todos los procesos, se usó una capa protectora de papel de aluminio delante de la puerta y una altura de almacenamiento de 63 mm para minimizar la radiación dentro del liofilizador. En todos los procesos se cargó por completo una bandeja para conservar una carga homogénea en el liofilizador. Los tapones se esterilizaron en autoclave y se secaron en todos los viales con proteínas. Todos los viales para muestras con proteínas se aclararon con agua desionizada y sin pirógeno. Los viales y tapones que se usaron para cargar el resto de la bandeja no se trataron.
Se prepararon viales sembrados con la formulación de nanocuerpo de unión a TNF asépticamente en una cabina bioprotectora con una diana de 160 mg/vial. Para los estudios de estabilidad, los viales se cargaron con 3.2 mí de formulación recién preparada antes de cada proceso (material que no se había líofilizado previamente). Durante la liofilización, se cargaron otros viales con tampones adecuados que eran compatibles con el ciclo de liofilización en diana para mantener una carga homogénea en el liofilizador. La liofilización se controló mediante el uso de termopares dentro de la matriz de proteína.
Calorimetría Diferencial de Barrido Modulada (mDSC) Para la mDSC, todas las muestras se procesaron de modo modulado con una amplitud de 0.5 °C y un periodo de 100 segundos. Para los polvos después de la liofilización, las muestras se calentaron a 2 °C/min hasta 150 °C. Todas las muestras en polvo se prepararon usando una guantera protectora depurada con nitrógeno. Para las muestras líquidas, se realizaron todos los aumentos de temperatura a 0.5 °C/min y las temperaturas se ajustaron a las utilizadas en los ciclos de liofilización. El aumento de calentamiento final se realizó a 2 °C/min para ampliar la transición vitrea. Las muestras líquidas se prepararon en el laboratorio.
Análisis de Humedad Para ensayar las muestras liofilizadas se usó la valoración de Karl Fischer. Las muestras liofilizadas se reconstituyeron con 3 mi de metanol.
Se realizaron inyecciones por duplicado o triplicado de 500 µ?.
Como un control adecuado después del uso se inyectó agua convencional al 1 %.
Espectroscopia Infrarroja Transformada de Fourier (FTIR) La FTIR midió la estructura secundaria del anticuerpo en estado de polvo sólido. Un gránulo que contenía aproximadamente 1 mg de proteína seca, formulada dispersada dentro de 300 mg de KBr se presionó y escaneó 200 veces. Después de la recogida de datos, el análisis implicó la sustracción espectral de placebo de sacarosa, corrección de la línea basal, alisamiento, derivado secundario y normalización del área.
Estabilidad La estabilidad del anticuerpo liofilizado en las formulaciones se ensayó como una función de tiempo de almacenamiento y temperatura. Las muestras del nanocuerpo de unión a TNF liofilizado se ensayaron después de la liofilización, después de cuatro semanas de almacenamiento a 2 °C - 8 °C y después de dos semanas y cuatro semanas de almacenamiento a 50 °C. Las muestras refrigeradas se almacenaron en una sala fría refrigerada. Las muestras a alta temperatura se almacenaron en una Incubadora Lab Line Imperial ajustada a 50 °C. A los puntos de tiempo apropiados las muestras se sacaron del almacenamiento y se dejó que se calentasen o enfriasen a temperatura ambiente antes de realizar el ensayo.
Reconstitución y Aspecto Visual Los viales de las formulaciones líofilízadas del análisis después de la liofilización y análisis de estabilidad de almacenamiento se inspeccionaron visualmente antes, durante y después de reconstituirse con 1.3 mi de agua estéril para inyección. Los viales se inspeccionaron en una caja lumínica frente un fondo blanco y negro para determinar el color, la integridad húmeda partículas y defectos de la torta antes de reconstituir. Después de la inspección visual, la torta liofilizada, el tapón y el precinto se quitaron del vial usando un desprecintador. El tapón se quitó y el agua estéril para inyección se introdujo lentamente en el vial usando una pipeta apropiada. El diluyente se suministró usando un movimiento formando remolinos para garantizar la humectación completa de la torta. Una vez que el diluyente estaba completamente distribuido, se inició la temporización de la reconstitución con un temporizador de laboratorio convencional y el vial se cerró de nuevo. La reconstitución se consideró completa cuando la última parte del sólido se disolvió. Haciendo rodar el vial entre las manos se facilita la reconstitución. A medida que la torta liofilizada estaba en el proceso de reconstrucción, se registraban las observaciones sobre el estado de la disolución de la solución tal como transparencia, formación de burbujas y espuma. Una vez completada la reconstitución, el tiempo de reconstitución se registró y los viales se dejaron en el banco de trabajo durante algunos minutos de manera que la solución resultante pudiera asentarse y la mayoría de las burbujas formadas durante la reconstitución pudieran disiparse. La solución reconstituida se inspeccionó después en una caja lumínica contra fondo blanco y negro para determinar el color, transparencia y partículas.
Cromatografía de Alto Rendimiento por Exclusión de Tamaño (HPLC-SEC) Se inyectaron dos microlitros de muestras netas de formulación de nanocuerpo de unión a TNF en una columna G3000swxl con una columna protectora (TosoHaas Partes N° 08541 y 08543). La fase móvil era solución salina tamponada con fosfato (PBS) con cloruro sódico 250 mM añadido. El caudal era de 0.75 ml/min y el tiempo de proceso era de 30 minutos. Se controló la absorbancia ultravioleta a una longitud de onda de 280 nm. El cromatograma se integró para separar el pico principal de nanocuerpo de unión a TNF de especies de alto y bajo peso molecular usando el programa informático Waters Empower™.
Espectroscopia de Absorbancia Visible Ultravioleta para Determinar la Concentración (A?BQ) Las muestras de la formulación tenían anticuerpos a una concentración de 100 mg/ml que se diluyeron a aproximadamente 0.5 mg/ml y 0..25 mg/ml añadiendo 10 µ? de muestra a 1990 µ? y 3990 µ? de histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, pH, 6.0, respectivamente. Doscientos microlitros de las soluciones resultantes se colocaron en pocilios individuales en una microplaca de 96 pocilios junto con un blanco de tampón. La placa se leyó en un lector de placa Spectramax® Plus para la absorbancia ultravioleta a longitudes de onda de 280 nm y 320 nm. Restando la absorbancia a 320 nm de la absorbancia a 280 nm y dividiendo por el coeficiente de extinción (1.405 ml/mg-cm) multiplicado por la longitud de trayectoria (1 cm) se determinaron las concentraciones de proteína de la solución en cada pocilio. Se aplicó el factor de dilución apropiado y se determinó una concentración de proteína promedio.
Espectroscopia de Absorbancia Visible Ultravioleta para Dispersión Lumínica (A4?o) Doscientos microlítros de cada muestra de nanocuerpo de unión a TNF a analizar se dividió en alícuotas en pocilios individuales en una microplaca de 96 pocilios. Un blanco de tampón sirvió como control. La placa se leyó en un lector de placa Spectramax Plus para la absorbancia visible a una longitud de onda de 420 nm.
Estrategia de Desarrollo de Ciclos Se usó una serie de etapas secuenciales (descritas a continuación) para desarrollar un ciclo de liofilízación.
Identificación de la Temperatura Crítica del Producto La temperatura crítica del producto para un nanocuerpo de unión a TNF se identificó por calorimetría de barrido diferencial modulada (mDSC). Este procedimiento se usó para identificar la temperatura de transición vitrea del producto congelado (mDSC). Un cíelo de liofilízación que mantiene el producto por debajo de esta temperatura durante el primer secado debe producir una estructura de torta intacta. Se supuso que la temperatura adecuada menor era de 25 °C y por eso esta temperatura se incluyó generalmente en los procedimientos diseñados para las condiciones y formulaciones del ensayo cuando se desarrolla una formulación y procedimientos para la liofilización de un anticuerpo como se describe en el presente documento.
Ejecución del Ciclo de Liofilización Basándose en los resultados a partir de los estudios descritos anteriormente, se realizaron tres ciclos diferentes de liofilización para examinar tres parámetros de interés en el desarrollo de un procedimiento de liofilización adecuado para preparar una formulación liofilizada adecuada para almacenar otros procedimientos. El primer parámetro examinado fue el ciclo de control, con ciclos repetidos procedentes de estudios previos de estabilidad. Todos los ciclos para la estabilidad del desarrollo anteriores utilizan este ciclo, ya que sirve como un punto de partida para este análisis.
El segundo parámetro ensayado fue el impacto de no realizar la segunda etapa de secado, para generar tortas liofilizadas con contenido de humedad residual elevado. Este ciclo de liofilización sirve como una evaluación de la sensibilidad de una formulación de nanocuerpo de unión a TNF con respecto a contenido de humedad residual elevado y puede usarse en la evaluación de desviaciones de fabricación durante lotes clínicos tempranos antes de ejecutar estudios de solidez de liofilización formales.
El tercer parámetro ensayado fue un ciclo de agresividad.
Aumentando la temperatura de secado primaria significativamente por encima del punto de ajuste del ciclo de control puede aumentar significativamente la temperatura del producto de formulación de nanocuerpo de unión a TNF durante el primer secado. Este ciclo de liofilización sirve como una evaluación de la sensibilidad de una formulación de nanocuerpo de unión a TNF para la temperatura del producto durante la liofilización y puede usarse en la evaluación de las desviaciones de fabricación durante lotes clínicos tempranos antes de la ejecución de estudios de solidez de liofilización formales.
Evaluación de los Ciclos de Liofilización La evaluación de los ciclos de liofilización seleccionados sobre las formulaciones de nanocuerpo de unión a TNF se dividió en dos aspectos: comparación inmediata basándose en los ensayos realizados después de la liofilización y posible impacto a largo plazo causado después de la incubación en condiciones aceleradas.
Identificación de la Temperatura Crítica del Producto En el producto de formulación del nanocuerpo de unión a TNF contenía casi el 50 % de proteína. Como tal, se preveía que la proteína dominaba las propiedades físicas de los estados congelados y liofilizados. Antes de la liofilización, se investigó con Calorimetría de Barrido Diferencial modulada sub-ambiental (mDSC) la temperatura de transición vitrea de la fase amorfa concentrada congelada de la formulación. Basándose en datos del ciclo de desarrollo de liofilización agresivo, se seleccionó una temperatura del producto de -12 °C como la temperatura crítica por debajo de la que se debía conservar durante la liofilización.
EJEMPLO 3 Estabilidad de la Formulación Líquida a Alta Concentración del Nanocuerpo de Unión a TNF (6 meses de duración) En algunos casos, es deseable almacenar una formulación de nanocuerpo de unión a TNF en un formato líquido. Por consiguiente, la estabilidad prolongada de una formulación de unión a TNF líquida que contiene una concentración relativamente alta del nanocuerpo de unión a TNF se estudió. Brevemente, una formulación que contenía un nanocuerpo de unión a TNF humanizado (aproximadamente 80 mg/ml), histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, polisorbato 80 al 0,01 %, pH 6,0 se preparó para almacenar por filtración estéril la formulación en recipientes de acero inoxidable sin pirógeno. La formulación se almacenó a -20 °C o 4 °C, durante aproximadamente tres meses y seis meses. La estabilidad del líquido de alta concentración se evaluó por actividad biológica, unión a Albúmina de Suero Humana (ASH), porcentaje de APM y porcentaje de BPM por HPLC-SE, porcentaje de ATN- 03 y porcentaje de impureza sin producto mediante SDS-CE y evaluación HPLC-CEX del tiempo de retención relativo y comparabilidad del perfil de elución con respecto al patrón de referencia del nanocuerpo de unión a TNF.
Se usó un ensayo de actividad biológica como parámetro de estabilidad para la formulación del nanocuerpo de unión a TNF líquido de alta concentración. En ensayo se realizó como se ha descrito, anteriormente, en el Ejemplo 1. Las muestras se almacenaron a -20 °C y 4 °C durante aproximadamente tres meses y seis meses. Los datos se expresaron como unidades por mg (Figura 6). Las muestras eran aproximadamente de 6 x 106 U/mg antes del almacenamiento y aproximadamente 4.5 - 5 x 106 U/mg después de la incubación. Esto esencialmente no refleja cambios en las bioactividad de las muestras durante el almacenamiento. La variabilidad de los valores refleja la variabilidad intrínseca en el ensayo. Debido a que no disminuye la cantidad de actividad biológica en las muestras, estos datos proporcionan un soporte adicional para la idoneidad de la formulación para el almacenamiento de la unión a TNF.
Otro parámetro de estabilidad adicional se examinó usando la formulación de nanocuerpo de unión a TNF líquida a alta concentración: el de la actividad de unión. En estos experimentos, el porcentaje de actividad de unión de la formulación se determinó en comparación con un control después del almacenamiento a -20 °C y 4 °C durante 6 meses. El ensayo controla específicamente la afinidad de unión de la unión de TNF a la Albúmina de Suero Humana (ASH). La actividad de unión inicial de la formulación era de aproximadamente el 100 % de la muestra de referencia y no cambió sustancialmente en ninguna de las muestras durante el periodo de seis meses del ensayo (Fig. 7). La actividad de unión medida fue de hasta aproximadamente el 110 % de la referencia, que, dado el error generalmente observado en este ensayo, refleja esencialmente que no hay cambios en actividad de unión de las muestras a lo largo del tiempo y que no hay tendencias relacionadas con la temperatura en los resultados de ensayo.
El porcentaje de especies APM se ensayó usando HPLC-SEC.
El porcentaje de especies de alto peso molecular en la formulación líquida de alta concentración antes del almacenamiento era entre 0.1 % y 0. 5 % de la proteína total en la formulación y era aproximadamente el 0.1 % en las muestras almacenadas a -20 °C y aproximadamente el 0.2 % de las muestras almacenadas a 4 °C hasta seis meses de almacenamiento (Fig. 8). Por tanto, no hubo aumento sustancial en el nivel de especies APM en las muestras almacenadas a -20 °C y 4 °C durante al menos seis meses.
El porcentaje de especies BPM en la formulación de nanocuerpo de unión a TNF líquida a alta concentración también se ensayó en la formulación líquida de nanocuerpo de unión a TNF. El porcentaje de especies BPM en la formulación estaba por debajo del límite de detección (es decir 0.0 %) a la temperatura de -20 °C y era aproximadamente de 0.1 % en muestras almacenadas a 4 °C durante hasta seis meses (FIG. 9). Por tanto, no hubo aumento sustancial en el nivel de especies BPM en las muestras almacenadas a -20 °C y 4 °C durante al menos seis meses.
El porcentaje de especies BPM se ensayó usando HPLC-SE. El porcentaje de especies BPM en la formulación líquida a alta concentración estaba por debajo del límite de detección (es decir 0,0 %) a temperaturas de 4 °C, 25 °C y 40 °C hasta seis meses.
El porcentaje de nanocuerpo de unión a TNF se ensayó usando SDS-CE. El porcentaje inicial del nanocuerpo de unión a TNF en la formulación líquida de alta concentración era de aproximadamente el 100 % y no hubo cambio sustancialmente en ninguna de las muestras durante el periodo de ensayo de seis meses (Fig. 10).
El porcentaje de impurezas sin producto se ensayó usando SDS-CE. Se observó impureza sin producto insignificante por SDS-CE para la formulación de nanocuerpo de unión a TNF líquida a concentración elevada a temperaturas de -20 °C y 4 °C durante seis meses.
Las formulaciones líquidas de alta concentración también se ensayaron para identificar usando HPLC-CEX. La HPLC-CEX se empleó como un ensayo de identidad. El perfil de elución para la unión a TNF de la formulación liquida de alta concentración era comparable al patrón de referencia a temperaturas de -20 °C y 4 °C durante hasta seis meses. El tiempo de retención relativo de picos diseñados no cambió a un patrón de 1 ,00 a temperaturas de -20 °C y 4 °C durante hasta seis meses.
Los datos descritos en el presente documento muestran cambios limitados en los productos de degradación como una función del tiempo de conservación a diversas temperaturas.
EJEMPLO 4 Estabilidad de la Formulación Líquida de Alta Concentración del nanocuerpo de unión a TNF en una jeringa para líquidos previamente cargada (12 meses de duración) La estabilidad de un líquido de alta concentración de nanocuerpo de unión a TNF cargado en una jeringa previamente cargada en la siguiente formulación: Histidina 10 mM, Sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0,01 %, aproximadamente 80 mg/ml de nanocuerpo de unión a TNF, a pH 6,0 se ensayó por porcentaje de APM y porcentaje de BPM por HPLC-SE y porcentaje de especies acidas y básicas por HPLC-CEX y evaluación del tiempo de retención relativo y comparabilidad del perfil de elución con respecto al patrón de referencia de nanocuerpo de unión a TNF. La formulación se almacenó a 4 °C durante doce meses, a 25 °C durante tres meses y a 40 °C durante dos meses.
En el punto de tiempo inicial, había aproximadamente el 0.7 % de especies APM. Después de doce meses a 4 °C había un aumento mínimo de aproximadamente el 0,8 % de especies APM. Después de tres meses a 25 °C, las especies APM aumentaron aproximadamente el 1.8 %. Después de dos meses a 40 °C, las especies APM aumentaron a lo largo del tiempo a aproximadamente 27 % (Fig. 1 1).
En el punto de tiempo inicial, había un 0,1 % de especies BPM. Después de doce meses a 4 °C había un aumento mínimo a 0.25 % de especies BPM. Después de tres meses a 25 °C, había un pequeño aumento a aproximadamente el 0.5 % de BPM. Después de dos meses a 40 °C, la degradación aumentó a lo largo del tiempo a aproximadamente el 1.4 % de especies de BPM (Fig. 12).
En el punto de tiempo inicial, había aproximadamente un 6 % de especies ácidas. Después de doce meses a 4 °C había aproximadamente un 7.5 % de especies ácidas. Después de tres meses a 25 °C, había aproximadamente un 7.3 % de especies ácidas, aumentando las especies ácidas a lo largo del tiempo. Después de dos meses a 40 °C, las especies ácidas aumentaban a lo largo del tiempo a aproximadamente 8.3 % (Fig. 13).
En el punto de tiempo inicial, había aproximadamente un 1.7 % de especies básicas. Después de doce meses a 4 °C había aproximadamente un 2.9 % de especies básicas. Después de tres meses a 25 °C, había aproximadamente 2.9 % de especies básicas, aumentando las especies básicas a lo largo del tiempo. Después de dos meses a 40 °C, las especies básicas aumentaron a lo largo del tiempo a aproximadamente el 27 % (Fig. 14).
Los tiempos de retención relativos y perfiles de elución de todas las muestras eran comparables al patrón de referencia del nanocuerpo de unión a TNF.
Los datos muestran cambios limitados en cuanto a los productos de degradación como una función de tiempo de almacenamiento a 4 °C y 25 °C, lo que indica que la formulación es adecuada como un líquido en una jeringa previamente cargada. Se observaron algunos cambios perceptibles en los productos de degradación a 40 °C, que es un estado de estrés para un líquido.
EJEMPLO 5 Estabilidad de ATN-103 Líquido a Alta Concentración - Otras Formulaciones (identificación de otros excipientes estabilizantes y desestabilizantes) Con objeto de explorar posibles excipientes para una formulación líquida de nanocuerpo de unión a TNF, se examinó la estabilidad de otras formulaciones líquidas de nanocuerpo de unión a TNF de alta concentración. Se realizó un trabajo complementario usando diversos excipientes para proporcionar estabilidad adicional y preparar la formulación isotónica (adecuada para inyección en sujetos humanos). La concentración de nanocuerpo de unión a TNF varía de 88 mg/ml a 100 mg/ml.
Las formulaciones examinadas fueron: 1. histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, polisorbato-80 al 0.01 %, Arginina (base) 100 mM, pH 5.8. 2. histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, polisorbato-80 al 0.01 %, NaCI 55 mM, pH 6.1. 3. histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, pol¡sorbato-80 al 0.01 %, Arginina (base) 55 mM, pH 6,1. 4. histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, polisorbato-80 al 0.01 %, Glicina 100 mM, pH 6,0. 5. histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, polisorbato-80 al 0.01 %, Metionina 100 mM, pH 6,0. 6. histidina 10 mM, sacarosa al 8 %, polisorbato-80 al 0.01 %, pH 6,0 CTL: histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, polisorbato-80 al 0.01 %, pH 6,0.
Las propiedades de la solución inicial se analizaron para pH, osmolaridad, concentración, turbidez y viscosidad. Todas las formulaciones dieron como resultado soluciones isotónicas y mostraron transparencia aceptable mediante medición por A455 y baja viscosidad (de 2.4 cP a 3.1 cP), lo que muestra viabilidad de jeringa previamente cargada y autoinyector.
TABLA 2 La estabilidad del líquido de alta concentración se evaluó por porcentaje de APM y porcentaje de BPM por HPLC-SE. Estos materiales se sometieron a estabilidad a 5 °C, 25 °C y 40 °C durante 3 meses. Los datos de 2 semanas a 40 °C se muestran en la Figura 15.
Se observaron algunos cambios perceptibles en los productos de degradación a 40 °C, que es un estado de estrés para un líquido. La estabilidad breve acelerada (2 semanas a 40 °C) muestra que las formulaciones 4, 5 y 6 ofrecen estabilidad comparable o mejorada con respecto al control (histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, polisorbato-80 0,01 %, pH 6,0). Las formulaciones 1 , 2 y 3 parecen tener un impacto negativo sobre la estabilidad.
Los datos muestran que la glicina, metionina y sacarosa aumentada son estabilizantes con respecto a las formulaciones líquidas de nanocuerpo de unión a TNF de alta concentración. Los datos muestran que la base de arginina, el clorhidrato de arginina y el cloruro sódico pueden ser desestabilizantes a formulaciones líquidas de nanocuerpo de unión a TNF a alta concentración en algunas condiciones.
EJEMPLO 6 Estabilidad del nanocuerpo de unión a TNF de la Formulación Líquida a Alta Concentración, de corta duración (2 semanas de duración), tampones de Histidina y Tris En las siguientes Figuras 16-19 se ilustra la estabilidad del nanocuerpo de unión a TNF como un líquido. Se examinaron dos formulaciones: ATN-103 a 118 mg/ml en Histidina 20 mM, Sacarosa al 5 %, pH 6 y ATN-103 a 117 mg/ml en Tris 20 mM, Sacarosa al 5 %, pH 7,2. Se ensayó la estabilidad de las formulaciones por porcentaje de APM y porcentaje de BPM mediante HPLC-SE y porcentaje de especies ácidas y porcentaje de especies básicas por HPLC-CEX. Los datos muestran cambios limitados en los productos de degradación, como una función del tiempo de almacenamiento a 4 °C. Se observaron algunos cambios perceptibles en los productos de degradación a 40 °C, que es un estado de estrés para un liquido. Los datos muestran que la estabilidad del nanocuerpo de unión a TNF en tampones de Histidina y Tris es esencialmente similar en estas condiciones de formulación, rindiendo de manera ligeramente más favorable con histidina (ligeramente menos BPM). Las actividades de pre-formulación determinarían finalmente que el pH elevado (7 o superior) da como resultado un mayor grado de formación de BPM, explicando la ventaja observada a continuación.
EJEMPLO 7 Estabilidad de Formulación Líquida de Alta Concentración de nanocuerpo de unión a TNF: Evaluación de estrés interfacial (congelación/descongelación) Las figuras 20-23 demuestran la estabilidad de formulación de nanocuerpo de unión a TNF líquida a aproximadamente 80 mg/ml en Histidina 10 mM, Sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, pH 6.0. La evaluación se basó en HPLC por exclusión de tamaño, turbidez y valoración de concentración seguido de ciclos múltiples de congelación/descongelación de -80 °C y 37 °C.
Los datos muestran cambios limitados en la estabilidad como una función de ciclado múltiple de congelación/descongelación de -80 °C y 37 °C.
EJEMPLO 8 Estabilidad de Formulación Liguida de Alta Concentración del nanocuerpo de unión a TNF: Valoración del estrés térmico de corta duración posiblemente encontrado en los procedimientos de fabricación La figura 24 demuestra que el nanocuerpo de unión a TNF líquido es sólido con respecto a estrés térmico de corta duración que podría posiblemente encontrarse durante los procedimientos de preparación de las sustancias farmacológicas y productos farmacológicos. El líquido de concentración elevada se estudió en Histidina 10 mM, Sacarosa al 5 %, Polisorbato 80 al 0.01 %, pH 6.0 a aproximadamente 80 mg/ml y 50 mg/ml. La evaluación se basó en el porcentaje de APM y porcentaje de BP por HPLC de exclusión de tamaño, después de exposición durante 8 horas a 40 °C, 7 días a 25 °C y 29 días a 5 °C. Los datos muestran cambios limitados en agregados como una función del tiempo de almacenamiento a 5 °C y 25 °C. Se observaron algunos cambios en los agregados a 40 °C, que es un estado de estrés para un líquido.
El porcentaje de especies APM por HPLC-SE para el líquido de alta concentración del nanocuerpo de unión a TNF estaba por debajo del límite de detección (es decir 0,0 %) a las temperaturas y duraciones indicadas.
EJEMPLO 9 Estabilidad de la Formulación Líquida de Baja Concentración de ATN- 103: Valoración del pH y Formulación Óptimos Las Figuras 25-28 demuestran la estabilidad de una formulación de nanocuerpo de unión a TNF líquida a concentración baja (aproximadamente 1 mg/ml) tamponada a pH 5.5, 6.0, 6.5 y 7.0. La estabilidad del nanocuerpo de unión a TNF líquido de baja concentración se examinó como una función de formulación y pH en respuesta al estrés tal como exposición a 40 °C de temperatura (Figuras 25 y 26), agitación (Fig. 28) y congelación/descongelación. Se valoraron cuatro pH para cada una de las tres formulaciones siguientes: histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0.01 %; histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0.01 %, HCI arginina 150 mM; e histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0.01 %; cloruro sódico 75 mM. En este conjunto de datos, se usó Tween-80 como un sinónimo del Polisorbato 80. Las muestras del estudio se evaluaron usando HPLC-SE y UV (tanto para la concentración como para la turbidez - medida por A455).
Códigos de las Figuras: HST: histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0.01 % HSTA: histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0.01 %, HCI arginina 150 mM HSTS: histidina 10 mM, sacarosa al 5 %, Tween-80 al 0.01 %, cloruro sódico 75 mM.
Los resultados muestran que el intervalo de pH de 5.5 - 7.0 es adecuado para la formulación. Los datos demuestran que en estas mismas condiciones, el pH 7,0 puede mostrar algunos efectos perjudiciales (aumento de especies de bajo peso molecular). Los datos demuestran que no hay beneficio significativo en cuanto a la adición de HCI arginina o cloruro sódico a la formulación de sustancia farmacológica y en algunos casos puede ser desestabilizante.
La Figura 27 muestra el porcentaje de especies APM por HPLC-SE para el nanocuerpo de unión a TNF después del almacenamiento a 4 °C, en el que no se observó cambio esencial después de 4 semanas. El porcentaje de especies BPM mediante HPLC-SE para el nanocuerpo de unión a TNF a concentración baja fue inferior al límite de detección (es decir 0.0 %) a 4 °C para todas las condiciones de la solución ensayada. No se observaron cambios significativos en especies AMP o BPM por HPLC-SE o UV A280 o A455 como resultado de ciclos de congelación/descongelación múltiples.
EJEMPLO 10 Nanocuerpo de unión a TNF Líquido a Baja Concentración: Evaluación del Efecto de la Agitación como una Función del pH y Formulación También se presentan datos que demuestran que el nanocuerpo de unión a TNF es sensible a la agitación a 300 rpm durante 4 horas (a 15 °C) durante este intervalo de pH (Fig. 28). Las formulaciones que contienen cloruro sódico y arginina son especialmente sensibles a la agitación. La formulación de histidina, sacarosa, tween-80 mostró la menor degradación de bajo peso molecular en cada grupo de pH. La formulación de histidina, sacarosa y tween-80 a pH 6.0 y 7.0 mostró la menor degradación APM.
La absorbancia UV del nanocuerpo de unión a TNF de baja concentración después de la agitación se controló a 280 nm (para controlar la concentración) y 455 nm (para controlar la turbidez). No se observaron cambios significativos como resultado de la agitación.
Las soluciones de nanocuerpo de unión a TNF de baja concentración se examinaron después de múltiples ciclos de congelación/descongelación por HPLC-SE y análisis UV a 280 nm (para controlar la concentración) y 455 nm (para controlar la turbidez). No se observaron cambios significativos en HPLC-SE o UV A280 o A455 como resultado de ciclos múltiples de congelación/descongelación.
EJEMPL0 11 Estabilidad de nanocuerpo de unión a TNF de Formulación Líquida a Alta Concentración, de corta duración (2 semanas de duración), examinando agentes ajustadores de la tonicidad La estabilidad del nanocuerpo de unión a TNF como un liquido se ilustra en lo siguiente: Se examinaron cinco formulaciones como se muestra en las Figuras 31 y 32 denominadas en el presente documento HST, HSGT, HSG T, HSorb y Control. Cada una de las formulaciones examinadas se describe a continuación.
Fig. 31 y 32 Formulaciones HST 100 mg/ml de nanocuerpo de unión a TNF, histidina 20 mM, sacarosa al 8 %, polisorbato 80 al 0,01 % HSGT 100 mg/ml de nanocuerpo de unión a TNF, histidina 20 mM, sacarosa al 5 %, glicina 80 mM, polisorbato 80 al 0,01 % HSGMT 100 mg/ml de nanocuerpo de unión a TNF, histidina 20 mM, sacarosa al 5 %, glicina 80 mM, metionina 10 mM, polisorbato 80 al 0,01 % HSorb 100 mg/ml de nanocuerpo de unión a TNF, histidina 20 mM, sorbitol al 5 % Control 100 mg/ml de nanocuerpo de unión a TNF, histidina 20 mM, sacarosa al 5 % Las formulaciones se almacenaron como un liquido durante dos semanas a 4 °C y 40 °C (estado de estrés) en tubos de polipropileno y en jeringas previamente cargadas de copolímero de olefina cíclica con un émbolo de goma.
La estabilidad de las formulaciones se evaluó por porcentaje de APM y porcentaje de BPM por HPLC-SE como se representa en las Figuras 31 y 32. Los datos demuestran cambios limitados en los productos de degradación como una función del tiempo de almacenamiento a 4 °C. Para las muestras mostradas en la Figura 32, no se detectó BPM en el punto de tiempo inicial o después de dos semanas a 4 °C. Sólo se detectó BPM en las muestras a 40 °C (con estrés). Los datos muestran que las cinco formulaciones muestran cambios comparables en los productos de degradación como una función del tiempo de almacenamiento en el estado de estrés a 40 °C. Por lo tanto, los datos muestran que todas las formulaciones son adecuadas para formas de dosificación líquidas.
EJEMPLO 12 Estabilidad de nanocuerpo de unión a TNF en Formulación Liquida a Baja Concentración y Alta Concentración, confirmando la formulación diana y examinando recipientes de envasado primarios La estabilidad del nanocuerpo de unión a TNF como un líquido se ilustra a continuación: Se examinaron tres formulaciones: (a) 10 mg/ml de nanocuerpo de unión a TNF, histidina 20 mM, sacarosa al 7.5 %, polisorbato 80 al 0.01 %; (b) 50 mg/ml de nanocuerpo de unión a TNF, histidina 20 mM, sacarosa al 7.5 %, polisorbato 80 al 0.01 %; (c) 100 mg/ml de nanocuerpo de unión a TNF, histidina 20 mM, sacarosa al 7.5 %, polisorbato 80 al 0.01 %; La formulación se preparó en los siguientes recipientes de envasado primarios: (a) jeringa de calidad farmacéutica de vidrio pre-cargable de Tipo I de un proveedor y un émbolo de goma gris de silicona West 4432 (b) jeringa de calidad farmacéutica de vidrio pre-cargable de Tipo I de un segundo proveedor y un émbolo de goma gris de silicona West 4432 (c) copolímero de olefina cíclica previamente cargado y un émbolo de goma gris de silicona West 4432.
Las formulaciones se analizaron a t=0 y se observó que eran satisfactorias. La formulación se había almacenado a 4 °C, 25 °C y 40 °C durante tres meses.
Equivalentes Todas las referencias citadas en el presente documento se incorporan en el mismo por referencia en su totalidad y para todos los fines como si se indicase individual y específicamente para cada publicación, patente o solicitud de patente individual incorporada por referencia en su totalidad para todos los fines.
El alcance de la presente invención no se limita a las realizaciones específicas descritas en el presente documento. De hecho, diversas modificaciones de la invención además de las descritas en el presente documento, serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y figuras acompañantes. Se pretende que dichas modificaciones estén incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Una formulación que comprende: (a) una molécula de nanocuerpo de unión a TNF a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 250 mg/ml; (b) un lioprotector elegido entre sacarosa, sorbitol o trehalosa a una concentración de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 10 %; (c) un tensioactivo elegido entre polisorbato-80 o poloxamer-188 a una concentración de aproximadamente el 0.01 % al 0.6 %; y (d) un tampón elegido entre tapón de histidina a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mM o un tampón Tris a una concentración de aproximadamente 20 mM de manera que el pH de la formulación sea de aproximadamente 5.0 a 7.5, en la que la molécula de nanocuerpo de unión a TNF en la formulación conserva al menos aproximadamente el 70 % de su actividad de unión después de almacenamiento durante al menos tres meses a 4 °C. 2.- La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque tiene: (i) menos del 5 % de especies de alto peso molecular (APM) después de almacenamiento durante al menos 12 meses a 4 °C; (i¡) menos del 5 % de especies de bajo peso molecular (BPM) después de almacenamiento durante al menos 12 meses a 4 °C; (iii) menos del 10 % de especies ácidas después de almacenamiento durante al menos 12 meses a 4 °C; y/o (iv) menos del 5 % de especies básicas después de almacenamiento durante al menos 12 meses a 4 °C. 3. - La formulación de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizada además porque está en forma de un almacenamiento a granel líquido, liofilizado, liofilizado reconstituido o congelado. 4. - La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada además porque es una formulación líquida o liofilizada que comprende: (a) una molécula de nanocuerpo de unión a TNF a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 130 mg/ml; (b) sacarosa a una concentración de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 10 %; (c) polisorbato-80 a una concentración de aproximadamente 0.01 %-0.02 %; y (d) un tampón seleccionado entre el grupo que consiste en tampón de histidina a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mM, de manera que el pH de la formulación sea de aproximadamente 5.0 a 7.5. 5. - La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizada además porque es una formulación de almacenamiento a granel que comprende: (a) una molécula de nanocuerpo de unión a TNF a una concentración de aproximadamente 80 mg/ml a aproximadamente 280 mg/ml; (b) sacarosa a una concentración de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 10 %; (c) polisorbato-80 a una concentración de aproximadamente el 0.01 % al 0.02 %; y (d) un tampón seleccionado entre el grupo que consiste en tampón de histidina a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mM, de manera que el pH de la formulación sea de aproximadamente 5.0 a 7,5; en la que al menos 100 litros de la formulación se almacenan en condiciones por debajo de la congelación. 6.- La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, caracterizada además porque el pH de la formulación se selecciona del grupo que consiste en 5, 5.5, 5.8-6.1 , 6.0, 6.1 , 6.5 y 7. 7. - La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizada además porque la sacarosa, sorbitol o trehalosa está a una concentración de aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 7.5 % o aproximadamente el 10 %. 8. - La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada además porque la molécula de nanocuerpo de unión a TNF es un polipéptido monocatenario que comprende una o más moléculas de dominio sencillo. 9. - La formulación de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la molécula de nanocuerpo de unión a TNF es monovalente o multivalente. 10. - La formulación de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la molécula de nanocuerpo de unión a TNF es monoespecífica o multiespecífica. 1 1 - La formulación de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque una o más moléculas de dominio sencillo están injertadas a CDR, humanizadas, camelizadas, desinmunizadas o seleccionadas por presentación de fagos. 12. - La formulación de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque la molécula de nanocuerpo de unión a TNF es un polipéptido de fusión monocatenario que comprende una o más moléculas de domino sencillo que se une al factor a de necrosis tumoral (TNFa) y una molécula de domino sencillo que se une a la proteina de albúmina de suero humana (ASH). 13. - La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada además porque la molécula de nanocuerpo de unión a TNF comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos al menos 90 % idéntica a la misma. 14. - La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada además porque al menos una de las moléculas de dominio sencillo de la molécula de nanocuerpo de unión a TNF comprende tres CDR que tienen la secuencia de aminoácidos: DYWMY (SEQ ID NO: 2) (CDR1), EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO: 3) (CDR2) y SPSGFN (SEQ ID NO: 4) (CDR3), o que tiene una CDR que difiere en una sustitución de aminoácidos conservativa de una de dichas CDR. 15.- La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada además porque al menos una de las moléculas de dominio sencillo de la molécula de nanocuerpo de unión a TNF comprende una región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de aproximadamente 1 a 1 15 aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una región variable que difiere en hasta 10 aminoácidos de dicha región variable. 16. - La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada además porque la molécula de nanocuerpo de unión a TNF comprende adicionalmente al menos una molécula de dominio sencillo que se une a ASH y comprende tres CDR que tienen la secuencia de aminoácidos: SFGMS (SEQ ID NO: 5) (CDR1), SISGSGSDTLYADSVKG (SEQ ID NO: 6) (CDR2) y GGSLSR (SEQ ID NO: 7) (CDR3) o que tiene una CDR que difiere en una sustitución de aminoácido conservativa de una de dichas CDR. 17. - La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizada además porque al menos una de las moléculas de domino sencillo de la molécula de nanocuerpo de unión a TNF se une a ASH y comprende una región variable que tiene la secuencia de aminoácidos de aproximadamente 125 a 239 aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , o una región variable que difiere en hasta 10 aminoácidos de dicha región variable. 18. - Un procedimiento o proceso para preparar una formulación de un nanocuerpo de unión a TNF, que comprende: expresar el nanocuerpo de unión a TNF en un cultivo celular; purificar el nanocuerpo de unión a TNF haciendo pasar el nanocuerpo de unión a TNF a través de al menos una etapa de purificación de cromatografía, o una etapa de ultrafiltración/diafiltración; ajustar la concentración del nanocuerpo de unión a TNF aproximadamente de 10 a 250 mg/ml en una formulación que contiene sacarosa a una concentración de aproximadamente el 5 % a aproximadamente el 10 %; polisorbato-80 a una concentración de aproximadamente el 0.01 %, el 0.02 % y un tampón de histidina a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mM o un tampón de Tris a una concentración de aproximadamente 20 mM, de manera que el pH de la formulación sea de aproximadamente 5 a 7.5. 19.- Un procedimiento para preparar una formulación reconstituida que contiene una molécula de nanocuerpo de unión a TNF, que comprende: liofilizar una mezcla de una molécula de nanocuerpo de unión a TNF y un lioprotector, un tensioactivo y un tampón, formando por lo tanto una mezcla liofilizada y reconstituir la mezcla liofilizada en un diluyente, preparando de esta forma, la formulación, en el que la formulación reconstituida comprende (a) una molécula de nanocuerpo de unión a TNF a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 130 mg/ml; (b) un lioprotector seleccionado del grupo que consiste en sacarosa o trehalosa a una concentración de aproximadamente 5 % a aproximadamente 10 %; (c) polisorbato-80 como el tensioactivo a una concentración de aproximadamente 0.01 % a 0.02 % y (d) un tampón de histidina a una concentración de aproximadamente 10 a aproximadamente 20 mM o un tampón de Tris a una concentración de aproximadamente 20 mM de manera que el pH de la formulación sea aproximadamente de 5.0 a 7.5. 20. - Un kit o un artículo de fabricación que comprende un envase que contiene la formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1-17 e instrucciones para su uso. 21. - El kit o artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la formulación se presenta en un vial o en una jeringa inyectable. 22. - El kit o artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque la formulación se presenta en una jeringa inyectable previamente cargada. 23.- El kit o artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la jeringa o un vial está compuesto de vidrio, plástico o un material polimérico seleccionado de un polímero o copolímero de olefina cíclica. 24. - El uso de la formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, para preparar un medicamento para tratar o prevenir un trastorno relacionado con TNF en un sujeto. 25. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 24, en donde el trastorno relacionado con TNF es un trastorno inflamatorio o autoinmune. 26.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 24, en donde el trastorno relacionado con TNF se selecciona entre artritis reumatoide (AR), afecciones artríticas (por ejemplo, artritis psoriásica, artritis idiopática juvenil (AIJ) poliarticular, espondilitis anquilosante (EA), psoriasis, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria o esclerosis múltiple. 27. - Un procedimiento para analizar un proceso de fabricación, que comprende: proporcionar una muestra de la formulación de cualquiera de las reivindicaciones 1-17; evaluar un parámetro de la formulación seleccionado de color, claridad, viscosidad o una cantidad de uno o más de especies APM, BPM ácidas o básicas, determinar si el parámetro cumple un criterio preseleccionado, analizando de esta manera el proceso. 28. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque comprende adicionalmente comparar dos o más formulaciones de una muestra en un procedimiento de control o supervisión de variación de lote a lote o comparar la muestra con respecto a un patrón de referencia. 29. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque comprende adicionalmente clasificar, seleccionar, aceptar o descartar, distribuir o retener, procesar en un producto farmacológico, transportar, trasladar a una localización diferente, formular, marcar, envasar la formulación, en base a la comparación. 30. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque comprende adicionalmente proporcionar un registro que incluye datos relacionados con el parámetro evaluado de la formulación y opcionalmente incluye un identificador para un lote de la formulación; someter dicho registro a la persona que toma decisiones; opcionalmente, recibir un comunicado de dicha persona que toma decisiones; opcionalmente, decidir si se distribuye o se pone a la venta el lote de formulación en base a la comunicación de la persona que toma decisiones.
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