MX2011002153A

MX2011002153A - Usos de citocinas de las familias de interleucina-22, interleucina-17 e interleucina-1 en enfermedades autoinmunitarias.

Info

Publication number: MX2011002153A
Application number: MX2011002153A
Authority: MX
Inventors: Kyriaki Dunussi-Joannopoulos; Yijun Carrier; Hak-Ling Ma; Quintus G Medley
Original assignee: Wyeth Llc
Priority date: 2008-08-28
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2011-03-29
Also published as: WO2010025369A3; EP2337799A2; CN102197051A; WO2010025369A2; KR20110048536A; US20110159011A1; RU2011105466A; JP2012501184A; IL211165A0; AU2009285585A1; CA2735155A1

Abstract

Se proporcionan procedimientos de detección de trastornos inflamatorios usando isoformas de lL-1; también se proporcionan procedimientos de tratamiento de un trastorno inflamatorio con un anticuerpo anti-IL-1; también se proporcionan procedimientos de tratamiento de un trastorno inflamatorio con un anticuerpo anti-IL-1 y al menos uno de un anticuerpo anti-IL-22, un anticuerpo anti-IL-17 o un anticuerpo anti-TNFa.

Description

USOS DE CITOCINAS DE LAS FAMILIAS DE INTERLEUCINA-22. INTE LEUCIN A-17 E INTERLEUCINA-1 EN ENFERMEDADES AUTOINMUNITARIAS Esta solicitud se refiere a la solicitud provisional de Estados Unidos N° 61/092,743, presentada el 28 de agosto de 2008 y a la solicitud provisional de Estados Unidos N° 61/193,087, presentada el 27 de octubre de 2008, que se incorpora cada una al presente documento por referencia para cualquier fin.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan procedimientos de detección de trastornos inflamatorios usando isoformas de IL-1. También se proporcionan procedimientos de tratamiento de un trastorno inflamatorio con un anticuerpo anti-IL-1. También se proporcionan procedimientos de tratamiento de un trastorno inflamatorio con un anticuerpo anti-IL-1 y al menos uno de un anticuerpo anti-IL-22, un anticuerpo anti-IL-17 o un anticuerpo anti-TNFa.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las citocinas de la familia de interleucina-1 (IL-1) clásicas, IL-1a, IL-1 ß e IL-18, juegan papeles clave en la inflamación. Se identificaron diversos miembros novedosos de la familia de IL-1 de citocinas a partir de búsquedas en bases de datos de ADN para homólogos de IL-1. IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1 F9 se pueden producir mediante los queratinocitos y aumentar en la piel inflamada. IL-22, una citocina proinflamatoria derivada de células Th17, actúa sobre los queratinocitos e induce la expresión génica tanto de citocina proinflamatoria como de péptido antimicrobiano.

La interleucina 22 (IL-22) es un miembro del subgrupo similar a interleucina 10 (IL-10) de las citocinas de tipo II. (Renauld, J.-C. Nature Reviews Immunology 3, 667-76 (2003)). Se propone que los miembros de este subgrupo (es decir, IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24 e IL-26) tienen una unidad funcional y estructural de seis a-hélices conservada que también se comparte con los interferones. (Renauld et al. Nature Reviews Immunology 3, 667-76 (2003) and Langer et al. Cytokine & Growth Factor Reviews 15, 33-48 (2004)). IL-22 se produce mediante linfocitos CD4+ T auxiliares (Th)17 activados, así como monocitos, y su expresión es altamente dependiente de IL-23 (Liang, S.C. et al. Journal of Experimental Medicine 203, 2271-9 (2006) y Zheng, Y. et al. Nature 445, 648-51 (2007)). Se sabe que IL-22 regula la inflamación de tejido local mientras actúa sólo sobre células no inmunitarias y juega un papel decisivo en la inmunidad de la mucosa así como en la inflamación desregulada observada en una enfermedad autoinmunitaria. (Wolk, K. et al. Immunity 21 , 241-54 (2004); Wolk et al., Cytokine & Growth Factor Reviews 17, 367-80 (2006); Wolk et al. Journal of Immunology 168, 5397-402 (2002); Pan et al. Cellular & Molecular Immunology 1 , 43-9 (2004); Zenewicz et al. Immunity 27, 647-59 (2007); Aujla, S.J. et al. Nature Medicine 14, 275-81 (2008); y Zheng, Y. et al. Nature Medicine 14, 282-89 (2008)). Recientes estudios preclínicos y clínicos implican fuertemente las actividades de IL-22 y de células Th17 en la progresión de la psoriasis, una enfermedad autoinmunitaria humana de la piel (Zheng et al. Nature 445, 648-51 (2007); Nickoloff et al. Nature Medicine ' ' 13, 242-244 (2007); Zaba et al. Journal of Experimental Medicine 204, 3183-94 (2007); Ma et al. Journal of Clinical Investigation in press(2008); Lowes et al. Nature 445, 866-73 (2007); y Wolk et al. European Journal of Immunology 36, 1309-23 (2006). Se ha mostrado que la administración de IL-22 induce la hiperproliferación de queratinocitos de la piel y el engrosamiento resultante de la epidermis, ambas características de lesiones psoriásicas (Boniface et al. Journal of Immunology 174, 3695-702 (2005) ). Además, se ha mostrado que la administración de IL-22 induce la expresión génica a partir de queratinocitos que parecen estar implicados en el reclutamiento de células inmunitarias y en el mantenimiento de la inflamación psoriásica de tejido (Wolk et al. European Journal of Immunology 36, 1309-23 (2006) ; Boniface et al. Journal of Immunology 174, 3695-702 (2005); y Sa et al. Journal of Immunology 178, 2229-40 (2007)[aparece una errata en J Immunol. 2007 Jun 1 ;178(1 1):7487]).

La expresión de IL-22 está aumentada en los linfocitos T por IL-9 o ConA (Dumoutier L et al. (2000) Proc Nati Acad Sci EE.UU. 97(18): 10144-9). Estudios adicionales han mostrado que la expresión de ARNm de IL-22 se induce in vivo en respuesta a administración de LPS y que IL-22 modula parámetros indicadores de una respuesta de fase aguda (Dumoutier L. er al. (2000) anteriormente; Pittman D. et al. (2001 ) Genes and Immunity 2:172). Tomadas conjuntamente, estas observaciones indican que IL-22 juega un papel decisivo en la inflamación (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3): 223-40).

Se cree que el receptor de superficie celular para IL-22 es un complejo de receptores que consta de un receptor de IL-22 (IL-22R) y una unidad del receptor 2 de IL-22 (IL-10R2), cada uno de los cuales es un miembro de la familia de receptores de citocina de tipo II (CRF2) (Xie M.H. et al. (2000) J Biol Chem 275(40):31335-9; Kotenko S.V. et al. (2001 ) J Biol Chem 276(4): 2725-32). Los miembros de CRF2 son receptores para IFNa/ß, IFNy, factor de coagulación Vlla, IL-10 y las proteínas relacionadas con IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, así como las citocinas similares a IFN identificadas recientemente, IL-28 e IL-29 (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3): 223-40; Kotenko, S.V. et al. (2000) Oncogene 19(21 ):2557-65; Sheppard, P. et al. (2003) Nature Immunology 4(1):63-8; Kotenko, S.V. er al. (2003) Nature Immunology 4(1 ):69-77). Cada una de las subunidades, o cadenas, del complejo de receptores de IL-22 están presentes en células epiteliales y algunos fibroblastos dentro de varios tejidos (Wolk et al. Journal of Immunology 168, 5397-402 (2002); Xie et al. Journal of Biológica! Chemistry 275, 31335-9 (2000); Kotenko et al. Journal of Biological Chemistry 276, 2725-32 (2001); Ikeuchi et al. Arthritis & Rheumatism 52, 1037-46 (2005); Andoh er al. Gastroenterology 129, 969-84 (2005)). Ambas cadenas del complejo de receptores de IL-22 también se expresan constitutivamente en una serie de órganos y se ha mostrado que las líneas celulares epiteliales derivadas de estos órganos son responsables de IL-22 in vitro (Kotenko S.V. (2002) Cytokine & Growth Factor Reviews 13(3): 223-40).

Aunque las subunidades de IL-22R e IL-10R2 contribuyen individualmente a la formación de diferentes complejos de receptores para otras citocinas de tipo II, conjuntamente las subunidades forman un único complejo de receptores que es específico para IL-22. Se cree que IL-22 se une en primer lugar al dominio extracelular (ECD) de IL-22R. (Logsdon et al. Journal of Inferieron & Cytokine Research 22, 1099-1 12 (2002) y Li et al. International Immunopharmacology 4, 693-708 (2004)). Debido a un cambio conformacional inducido de IL-22R en IL-22 propuesto, IL-10R2 se puede unir a la superficie de IL-22/IL-22R (Li et al. International Immunopharmacology 4, 693-708 (2004) y Logsdon et al. Journal of Molecular Biology 342, 503-14 (2004)). El complejo IL-22/IL-22R/IL-10R2 resultante, o bien un heterotrímero o multímero del mismo, transmite una señal en la célula por medio de las rutas de señalización de JAK/STAT y de MAPK (por ejemplo, ERK) (Dumoutier et al. Journal of Immunology 164, 1814-9 (2000)). Dumoutier et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 10144-9 (2000); y Lejeune et al. Journal of Biological Chemistry 277, 33676-82 (2002)). IL-22 induce la activación de las rutas de JAK/STAT3 y de MAPK (por ejemplo, ERK), así como intermedios de otras rutas de MAPK ((Dumoutier L. et al. (2000) anteriormente; Xie M.H. et al. (2000) anteriormente; Dumoutier L. et al. (2000) J Immunol 164(4): 1814-9; Kotenko S.V. et al. (2001) J Biol Chem 276(4):2725-32; Lejeune, D. et al. (2002) J Biol Chem 277(37): 33676-82).

Se ha caracterizado la interacción entre IL-22R e IL-10R2 en un formato basado en ELISA usando citocina biotinilada y dimeros de fusión Fe de dominio de receptor extracelular (ECD). Véase, por ejemplo, la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos n°. 2005-0042220. Se mostró que IL-22 tiene afinidad medible por el ECD de IL-22R y afinidad no detectabie por IL-10R2 sola. También se mostró que IL-22 tiene una afinidad sustancialmente mayor por ECD de IL-22R/IL-I0R2 presentada como heterodímeros Fe. Parece que IL-10R2 se une a una superficie creada por la asociación entre IL-22 e IL-22R, sugiriendo que el ECD de IL-10R2 estabiliza adicionalmente la asociación de IL-22 dentro de su complejo de receptores de citocina. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente publicada de Estados Unidos n°. 2005-0042220.

Además de la unión al complejo de receptores de IL-22, IL-22 también se une a una proteína de unión a IL-22 (IL-22BP), que es un "receptor" secretado específico para IL-22 y tiene una identidad de secuencia primaria del 33% del dominio extracelular (ECD) de IL-22R (Dumoutier, L., Lejeune, D., Colau, D. & Renauld, J.C. Cloning and characterization of IL-22 binding protein, a natural antagonist of IL-10-related T cell-derived inducible factor/IL-22. Journal of Immunology 166, 7090-5 (2001 )). Aunque no se ha identificado específicamente una forma de superficie celular de IL-22BP, se ha mostrado que IL-22BP, in vitro, actúa como un receptor señuelo y bloquea la señalización de IL-22 en la célula (Dumoutier et al. Journal of Immunology 166, 7090-5 (2001 ) y Xu et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 951 1-6 (2001 )).

Se ha generado la neutralización de anticuerpos anti-IL-22 y se ha caracterizado en términos de su especificidad de unión, afinidad y actividad neutralizante de IL-22. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos n°. 2005-0042220. Se ha mostrado que la administración de IL-22 in vivo induce parámetros de una respuesta de fase aguda y se ha mostrado que la administración de un anticuerpo anti-IL-22 neutralizante reduce la actividad de IL-22 y mejora los síntomas inflamatorios en un modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) en ratón. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente publicada n°. 2005-0042220. Además, se ha mostrado que la expresión del ARNm de IL-22 puede aumentar dentro de áreas inflamadas. Por consiguiente, los antagonistas de IL-22, tales como, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-22 neutralizantes y fragmentos de los mismos, se pueden usar para inducir inmunosupresión in vivo y proporcionan un planteamiento prometedor al tratamiento de varios trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios.

Las células Th17 se definen por su capacidad para expresar IL-17A e IL-17F (Aggarwal et al., J. Biol. Chem., (2003) 278: 1910-14; Langrish ef al., J. Exp. Med., (2005) 201 :233-40; Harrington et al., Nat. Immunol., (2005) 6: 1 123-32; Park et al., Nat. Immunol., (2005) 6:1 133-41 ; Veldhoen et al., Immunity, (2006) 24:179-89; Mangan er a/., Nature, (2006) 441 :231-34; Bettelli et ai, Nature, (2006) 441 :235-38). La diferenciación de células Th17 está iniciada por la señalización de TGF-ß en el contexto de citocinas pro-inflamatorias, particularmente IL-6 y también IL-1 ß y TNF-a. El mantenimiento y la supervivencia de las células Th17, en contraste, spm dependientes de IL-23, un miembro de la familia de IL-12 compuesto de subunidades de IL-12p40 e IL-23p19. Ratones deficientes de IL-23 producen significativamente menos IL-17 en varios modelos de infección y enfermedad murinos (Langrish et al., J. Exp. Med., (2005) 201 :233-40; Murphy et al., J. Exp. Med., (2003) 198:1951-57; Happel et al., J. Exp. Med., (2005) 202:761-69; Khader et al., J. Immunol., (2005) 175:788-95). Por tanto, la diferenciación de Th17 está iniciada por citocinas pro-inflamatorias y TGF-ß y posteriormente mantenida por IL-23.

La familia de IL-17 está compuesta de cinco miembros de la familia (IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (IL-25) e IL-17F) que comparten una homología relativa entre el 17 y el 55% (Aggarwal et al., Cytokine Growth Factor Rev., (2003) 14:155-74; Kolls et al., Immunity, (2004) 21 :467-76). La expresión de los miembros de la familia de IL-17 es bastante diversa. IL-17A e IL-17F son las más homologas (55%) y están localizadas adyacentes entre sí en el cromosoma humano 1. Los ARNm de IL-17A e IL-17F se expresan a niveles más altos en las células Th17 en comparación con las células Th1 o Th2. En contraste, IL-17B, IL-17C e IL-17D se expresan predominantemente en tejidos no linfoides. IL-17E (IL-25) se expresa en células Th2 (Fort et al., Immunity, (2001) 15:985-95). Además de IL-17A e IL-17F, también se han identificado TNF-a, IL-6 y GM-CSF como genes inducidos por IL-23 y se expresan potencialmente por células Th17 (Langrish et al., J. Exp. Med., (2005) 201 :233-40; Infante-Duarte et al., J. Immunol., (2000) 165:6107-15). Sin embargo, debido a que las células Th1 pueden expresar TNF-a y las células Th2 pueden expresar IL-6 y GM-CSF, la expresión de IL-6, TNF-a y GM-CSF no se restringe al linaje de Th17. En contraste, se cree que las células Th17 producen IL-17A e IL-17F de manera específica de linaje.

Subgrupos de células efectoras CD4 están implicadas en un número de enfermedades diferentes. En algunos casos, su actividad es provechosa para el organismo. Sin embargo, en otras enfermedades su actividad no es deseable o incluso es dañina. La identificación de estos subgrupos de células dentro de la población de efectoras CD4 que son responsables de una patología particular permite la regulación dirigida de estas células sin la supresión innecesaria de otras células efectoras CD4. De manera similar, el conocimiento de las citocinas producidas por subgrupos celulares y cómo interactúan estas citocinas es un prerrequisito para el desarrollo de terapias extensas que proporcionen una mejora en el tratamiento de enfermedades que implican estas citocinas.

IL-22 también es una citocina de Th17 que puede actuar cooperativamente y, en algunos casos, sinérgicamente, con IL-17A o IL-17F. Véase la solicitud de patente publicada n°. 20080031882. Además, se ha demostrado la inducción de IL-22 por IL-23. Id.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En ciertas realizaciones, se proporciona un procedimiento de detección de un trastorno inflamatorio. En ciertas realizaciones, el procedimiento de detección de un trastorno inflamatorio comprende identificar el aumento de al menos una de (a) al menos una isoforma de IL-1 y (b) IL-1 Rrp2 en un paciente, en el que la al menos una isoforma de IL-1 es IL-1 F6, IL-1 F8 o IL-1 F9. En ciertas realizaciones, el trastorno inflamatorio es psoriasis, lupus o artritis. En ciertas realizaciones, se determina el aumento de al menos una de (a) la al menos una isoforma de IL-1 y (b) IL-1Rrp2 detectando niveles de ARNm. En ciertas realizaciones, se determina el aumento de al menos una de (a) la al menos una isoforma de IL-1 y (b) IL-1Rrp2 detectando niveles de proteína. En ciertas realizaciones, se determina la detección del aumento de al menos dos de (a) la al menos una isoforma de IL-1 y (b) IL-1 Rrp2 detectando niveles de proteína de al menos una de (a) la al menos una isoforma de IL-1 y (b) IL-1 Rrp2 y detectando niveles de ARNm de al menos una de (a) la al menos una isoforma de IL-1 y (b) IL-1 Rrp2. La expresión de la al menos una de (a) al menos una isoforma de IL-1 y (b) IL-1 Rrp2 en el paciente se puede comparar con el nivel de expresión en una muestra de control, en la que un incremento en la expresión de al menos una isoforma de IL-1 o IL-1 Rrp2 en el paciente, en comparación con la expresión en la muestra de control, indica la presencia de trastorno inflamatorio en el paciente.

En ciertas realizaciones, se proporciona un procedimiento de tratamiento de un trastorno asociado con IL-22. En ciertas realizaciones el procedimiento de tratamiento de un trastorno asociado con IL-22 comprende administrar al menos un inhibidor de al menos una de IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1F9 a un paciente con dicho trastorno asociado con IL-22. En ciertas realizaciones, el al menos un inhibidor es un anticuerpo anti-IL-1 F6. En ciertas realizaciones, el al menos un inhibidor es un anticuerpo anti-IL-1 F8. En ciertas realizaciones, el al menos un inhibidor es un anticuerpo anti-IL-1 F9. En ciertas realizaciones, el al menos un inhibidor es un anticuerpo anti-IL-1 Prp2.

En ciertas realizaciones, se proporciona un procedimiento de tratamiento de un trastorno asociado con IL-1. En ciertas realizaciones el procedimiento de tratamiento de un trastorno asociado con IL-1 comprende administrar un inhibidor de IL-22 a un paciente con dicho trastorno asociado con IL-1. En ciertas realizaciones, el inhibidor de IL-22 es un anticuerpo anti-IL-22.

En ciertas realizaciones, se proporciona un procedimiento de tratamiento de un trastorno inflamatorio. En ciertas realizaciones, un procedimiento de tratamiento de un trastorno inflamatorio comprende administrar a un paciente con un trastorno inflamatorio una combinación de a) al menos uno de (i) un anticuerpo anti-IL-1 F6, (ii) un anticuerpo anti-IL-1 F8, (iii) un anticuerpo anti-IL-1 F9 y (iv) un anticuerpo anti-IL-1 Rrp2; y (b) un anticuerpo anti-IL-22 o un antagonista de IL-22. En ciertas realizaciones, un procedimiento de tratamiento de un trastorno inflamatorio comprende administrar a un paciente con un trastorno inflamatorio un anticuerpo anti-IL-1 , tal como un anticuerpo anti-IL-1 F6, un anticuerpo anti-IL-1 F8 o un anticuerpo antí-IL-1 F9, y un anticuerpo anti-IL-17A o un antagonista de IL-17A. En ciertas realizaciones, un procedimiento de tratamiento de un trastorno inflamatorio comprende administrar a un paciente con un trastorno inflamatorio una combinación de a) al menos uno de (i) un anticuerpo anti-IL-1 F6, (ii) un anticuerpo anti-IL-1 F8, (¡ii) un anticuerpo anti-IL-1 F9 y (iv) un anticuerpo anti-IL-1 Rrp2; (b) un anticuerpo anti-IL-22 o un antagonista de IL-22; y (c) un anticuerpo anti-IL-17A o un antagonista de IL-17A. En otras realizaciones, un procedimiento de tratamiento de un trastorno inflamatorio comprende administrar a un paciente una combinación de a) al menos uno de (i) un anticuerpo anti-IL-1 F6, (ii) un anticuerpo anti-IL-1 F8, (¡ii) un anticuerpo anti-IL-1F9 y (iv) un anticuerpo anti-IL-1 Rrp2; y (b) un anticuerpo anti-TNFa o un antagonista de TNFa. En ciertas realizaciones, el trastorno inflamatorio es psoriasis, lupus o artritis.

En ciertas realizaciones, se proporciona un procedimiento para determinar la efectividad de un agente terapéutico en el tratamiento, la reducción, la prevención y/o la mejora de un trastorno inflamatorio en un sujeto. En ciertas realizaciones, el procedimiento para determinar la efectividad de un agente terapéutico comprende detectar el nivel de expresión génica en el sujeto en comparación con un nivel de expresión génica en una muestra de control, en el que la expresión génica detectada es la expresión génica a partir de al menos una de IL-1 F6, IL-1 F8, IL-1F9, IL-1Rrp; y en el que un nivel más bajo de expresión génica en el sujeto en comparación con el control indica la efectividad del agente terapéutico en el tratamiento, la reducción, la prevención y/o la mejora del trastorno inflamatorio en el sujeto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1A-1 C muestran el incremento de la expresión de las citocinas IL-1 , IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1 F9 y su receptor IL- Rrp2 en los tejidos de oreja de ratón psoriasiforme. Se indujo la psoriasis (Pso.) en ratones scid/scid con transferencia adaptativa de linfocitos T CD4+CD25" CD45RBhl naturales mientras que los ratones de control (Cont.) recibieron inyección salina. Se recogieron las orejas de los ratones 70 días después de la infección. Las figuras 1A y 1C muestran niveles de transcritos de citocinas IL-1 y su receptor IL-1 Rrp2 evaluados por RT-PCR cuantitativa. El eje Y indica las copias de ARNm relativas del gen indicado en comparación con las del gen de mantenimiento GAPDH con una suposición de 1.000 copias de ARNm de GAPDH por célula. Se realizó un análisis estadístico con una prueba t de dos colas independientes. "*" indica significancia estadística (p<0.001). La figura 1 B muestra proteínas ß-actina e IL-1 F6 en muestras de oreja individuales detectadas por anticuerpos frente a las proteínas respectivas (R&D Systems) en transferencia de Western.

La figura 2 muestra la disminución de la expresión de citocinas IL-1 , en los tejidos de oreja de ratón psoriasiforme después de la neutralización de IL-22 sistémica. A ratones receptores de células T CD4+CD25" CD45RBhi (n=5) se les suministraron 16 mg/kg de IL-22 (IL22-104, Wyeth, símbolos de relleno) o anticuerpos de control de isotipo (círculos abiertos), intraperitonealmente una vez por semana durante 11 semanas. 48 horas después del último tratamiento, se recogieron las orejas de los ratones, se evaluaron copias de transcritos de los genes indicados y se mostraron como expresión relativa frente a GAPDH. "*" indica significancia estadística (p< 0.01).

La figura 3 muestra el incremento de expresión de citocinas IL-1 y su receptor IL-1 Rrp2 en orejas de ratón tratadas con IL-22. Se sometieron a inyección intradérmicamente orejas de ratones BALB/c (n=4) cada dos días durante 2 semanas con 500 ng de IL-22 de ratón recombinante (BD Biosciences) o solución salina en un volumen total de 20 ul. Seis horas después del último tratamiento, se recogieron las orejas de los ratones, se evaluaron niveles de transcritos de los genes indicados y se mostraron como expresión relativa frente a GAPDH. "*" indica significancia estadística (p< 0.1 ).

Las figuras 4A y 4B muestran los niveles de transcritos de IL-1 F6, IL-1 F8, IL-1F9 y del receptor IL-1 Rrp2 en queratinocitos humanos primarios después del tratamiento con la cantidad indicada de IL-22 humana recombinante durante 48 horas. Se purificaron ARN a partir de lisados celulares y se evaluaron copias de transcritos de genes indicados y se mostró como expresión relativa frente a GAPDH. Los datos en las figuras 4A y 4B representan experimentos independientes.

Las figuras 5A-5C muestran que IL-22 actúa de forma sinérgica con IL-17A para inducir la expresión génica de isoforma de IL-1 en queratinocitos primarios humanos. Se recogieron células 48 horas después de no recibir tratamiento, de recibir 200 ng/ml de IL-22 humana recombinante (Wyeth) sola, 20 ng/ml de IL-17A humana recombinante (Wyeth) sola, o 200 ng/ml de IL-22 y 20 ng/ml de IL-17A. Las figuras 5A y 5C muestran los niveles de transcritos de IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1 F9 en el lisado celular. La figura 5B muestra niveles de proteína de ß-actina e IL-1 F9 en lisado celular evaluado mediante transferencia de Western usando anticuerpos frente a las proteínas respectivas (R&D Systems).

Las figuras 6A-6C muestran los niveles de transcritos de IL-1 F6, IL-1F8, IL-1 F9 y del receptor IL-1 Rrp2 en las muestras de piel lesional y no lesional emparejadas. Se purificó el ARN a partir de biopsias de tejido congelado y se evaluó la expresión génica mediante RT-PCR cuantitativo. La figura 6A muestras copias promedio del transcrito del gen indicado por grupo ± desviación estándar (n=11). Se indicó la significancia estadística mediante valores p representados en cada gráfico. Las figuras 6B y 6C muestran la expresión génica en muestras lesiónales y no lesiónales a partir de pacientes individuales.

Las figuras 7A y 7B muestran correlaciones de expresión génica lineal entre IL-1 F6, IL-1F8, IL-1 F9 y citocinas IL-22 e IL-17A de Th17. Se realizaron gráficos de copias de transcritos de IL-1 F6, IL-1 F8, IL-1 F9 y del receptor IL-1 IL-1 Rrp2 a partir de biopsias de piel lesional de pacientes humanos frente a copias de transcritos de IL-22 e IL17A en las mismas muestras de tejido. La figura 7A muestra una correlación positiva entre la expresión génica de IL-1 F6, IL-1 F8, IL-1 F9 e IL-22 o IL-17A en lesiones de piel psoriásicas. También se indican en cada gráfico los valores de R cuadrado y de P. La figura 7B no muestra correlación entre la expresión génica del receptor IL-1 Rrp2 e IL-22 o IL-17A en lesiones de piel psoriásicas. También se indican en cada gráfico los valores de R cuadrado y de P.

La figura 8 muestra un incremento de la expresión génica de IL-1 F8 e IL-1 F9 detectado en los leucocitos de ratones con artritis inducida por colágeno. Se inmunizaron intradérmicamente ratones DBA1 con 200 ng de colágeno de tipo II bovino (Chondrex) emulsionado en CFA. El día 21 , todos los ratones recibieron un refuerzo de 200 ng de colágeno en IFA. El día 35, se sacrificaron los ratones y se recogió la sangre para el análisis de expresión génica. Se purificó el ARN de los leucocitos usando el mini kit para sangre QIAGEN RNeasy® (QIAGEN), se evaluaron los niveles de ARNm de IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1 F9 con RT-PCR. Se representaron copias de transcritos relativas de IL-1F8 e IL-1 F9 por grupo ± desviación estándar (n=5). El nivel de ARNm de IL-1 F6 estaba por debajo del límite de detección. Los datos en la figura 8 muestran uno de dos experimentos independientes.

La figura 9 muestra un incremento de la expresión génica de IL-1 F6 e IL-1 F9 detectado en los leucocitos de ratones psoriasiformes. Se indujo psoriasis en ratones tal como se describe en las figuras 1A-1C. Se recogió la sangre de ratón el día 70 después de transferir células T adoptivas y someter a análisis de expresión génica tal como se describe para la figura 8. Se representaron copias de transcritos relativas de IL-1 F6, IL-1 F9 y del receptor IL-1 Rrp2 por grupo ± desviación estándar (n=5). El nivel de ARNm de IL-1 F8 estaba por debajo del límite de detección. Los datos en la figura 9 muestran uno de dos experimentos independientes.

La figura 10 muestra un incremento de transcritos del gen de citocinas del receptor IL-1 Rrp2, IL-1 F6 e IL-1F9 detectado en los leucocitos de ratones NZBWF/1 propensos al lupus. Se recogió sangre de ratones de cepa NZBWF/1 de 10 semanas y de 7 meses de edad que son genéticamente susceptibles de desarrollar lupus de manera espontánea. Se usaron como controles ratones sin C57BL/6 de 10 semanas de edad que no son susceptibles de desarrollar lupus de manera espontánea. Se representaron copias de transcritos relativas de IL-1 F6, IL-1 F9 y del receptor IL-Rrp2 por grupo ± desviación estándar (n=5). El nivel de ARNm de IL-1 F8 estaba por debajo del límite de detección. Los datos en la figura 10 muestran uno de dos experimentos independientes.

La figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos de IL-22 humana y la secuencia de aminoácidos de IL-22 humana.

La figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos de IL-22 de ratón y la secuencia de aminoácidos de IL-22 de ratón.

La figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos de IL-1F6 humana y la secuencia de aminoácidos de IL-1F6 humana.

La figura 14 muestra la secuencia de nucleótidos de IL-1F8 humana y la secuencia de aminoácidos de IL-1F8 humana.

La figura 15 muestra la secuencia de nucleótidos de IL-1 F9 humana y la secuencia de aminoácidos de IL-1 F9 humana.

La figura 16 muestra la secuencia de nucleótidos de IL-1 Rrp2 humana y la secuencia de aminoácidos de IL-1 Rrp2 humana.

La figura 17 muestra la secuencia de nucleótidos de ARNm de IL-17A humana y la secuencia de aminoácidos de IL-17A humana.

La figura 18 muestra el factor de incremento de la expresión de IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1F9 en queratinocitos 48 horas después de la incubación con 20 ng/ml de TNF-a y combinaciones de IL-22 (200 ng/ml) y TNF-a (20 ng/ml). Se agruparon los datos de 3 dadores y se representaron los promedios ± DE.

La figura 19 muestra el factor de incremento de la expresión de IL-1 F8 e IL-1 F9 en queratinocitos 48 horas después de la incubación con las concentraciones indicadas de IL-12 con o sin 20 ng/ml de TNF-a. No se detectó el factor de incremento de la expresión de IL-1 F6. Se agruparon los datos de 5 dadores y se representaron los promedios ± DE.

La figura 20 muestra el incremento en veces de la expresión de IL-1 F8 en queratinocitos 48 horas después de la incubación con 20 ng/ml de IL-17A, 20 ng/ml de TNF-a o la combinación de ambos. Se agruparon los datos de 3 dadores y se representaron los promedios ± DE.

La figura 21 muestra la expresión de IL-1 F8 e IL-1 F9 con relación a GAPDH en queratinocitos 48 horas después de la incubación con 200 ng/ml de IL-21 o una combinación de 200 ng/ml de IL-21 y 200 ng/ml de IL-22. Se muestran los datos de 2 dadores individuales.

La figura 22 muestra el factor de incremento de la expresión de illa e H1b en queratinocitos 48 horas después de la incubación con IL-22 (200 ng/ml), IL-17A (20 ng/ml), IL-22 (200 ng/ml) más IL-17A (20 ng/ml), IL-12 (200 ng/ml), IFN-? (20 ng/ml) o IL-12 (200 ng/ml) más IFN-? (20 ng/ml). Se agruparon los datos de 5 dadores y se representaron los promedios ± DE.

Las figuras 23A-23D muestran el factor de incremento de la expresión de IL1a (figura 23A), ß (figura 23B), IL-1 F6 (figura 23C) e IL-1 F9 (figura 23D) en queratinocitos 72 horas después de la incubación con 1000 ng/ml de IL-1 F6, F8 y F9 o en combinación de IL-17A (20 ng/ml), IFN-? (20 ng/ml) o TNF-a (20 ng/ml). Se muestran los datos de 1 dador.

Las figuras 24A-24G muestran el factor de incremento de la expresión de saa1/2 (figura 24A), serpin e1 (figura 24B), plau (figura 24C), plat (figura 24D), tnfa (figura 24E) e ¡16 (figura 24F) en queratinocitos 72 horas después de la incubación con 1000 ng/ml de IL-1 F6, F8 y F9 solos o en combinación con IL-17A (20 ng/ml), IFN-? (20 ng/ml) o TNF-a (20 ng/ml). Se muestran los datos de 1 dador.

Las figuras 25A-25D muestran la expresión de s100a7 y def4 con relación a GAPDH (figura 25A) y (figura 25C) o el factor de crecimiento de la expresión génica de s100a7 y def4 (figura 25B) y (figura 25D) en queratinocitos 72 horas después de la incubación con 1000 ng/ml de IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1 F9, solos o en combinación con IL-17A (20 ng/ml), IFN-? (20 ng/ml) o TNF-a (20 ng/ml). Se muéstran los datos de 1 dador.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE CIERTAS REALIZACIONES A menos que se indique de otro modo, todos los términos científicos y técnicos tienen el mismo significado tal como se entiende comúnmente por un experto en la técnica. Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o en la comprobación de las reivindicaciones, a continuación se describen procedimientos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patentes, patentes y otras referencias mencionadas en el presente documento se incorporan mediante referencia en su totalidad. En caso de conflicto, se controlará la presente especificación, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Para que la presente invención se pueda entender más fácilmente, se definen primero ciertos términos. Definiciones adicionales se exponen por toda la descripción detallada. A menos que se proporcionen definiciones específicas, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y las técnicas de laboratorio de, la química analítica, la química de síntesis orgánica y la química médica y farmacéutica que se describen en el presente documento se conocen bien y se usan comúnmente en la técnica. Se pueden usar técnicas estándar para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, administración y tratamiento de pacientes.

En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural, a menos que se establezca específicamente de otro modo. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o", a menos que se establezca de otro modo. En el contexto de una reivindicación dependiente múltiple, el uso de "o" se vuelve a referir a más de una reivindicación dependiente o independiente precedente sólo con carácter alternativo. Además, el uso del término "incluyendo," asi como otras formas, tales como "incluye" e "incluido," no es limitante. También, términos tales como "elemento" o "componente" abarca tanto elementos y componentes que comprenden una unidad como elementos y componentes que comprenden más de una subunidad a menos que se establezca específicamente de otro modo.

Otras características y ventajas serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las siguientes reivindicaciones.

La presente solicitud proporciona, al menos en parte, anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se unen a IL-22, en particular, IL-22 humanos, con afinidad y especificidad altas. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-IL-22 o fragmentos de los mismos se pueden usar para diagnosticar, tratar o prevenir trastornos asociados con IL-22 y/o trastornos inflamatorios, por ejemplo, trastornos autoinmunitarios, por ejemplo, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis asociada a lupus o espondilitis anquilosante), esclerodermia, lupus eritematoso sistémico, VIH, síndrome de Sjogren, vasculitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), miastenia gravis, enfermedad inflamatoria intestinal (Ell), enfermedad de Crohn, colitis, diabetes mellitus (tipo I); afecciones inflamatorias de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), el hígado (por ejemplo, hepatitis), el riñon (por ejemplo, nefritis) y el páncreas (por ejemplo, pancreatitis); trastornos cardiovasculares, por ejemplo, trastornos metabólicos del colesterol, daño por radicales libres de oxígeno, isquemia; trastornos asociados con curación de heridas; trastornos respiratorios, por ejemplo, asma y EPOC (por ejemplo, fibrosis quística); afecciones inflamatorias (por ejemplo, endotoxemia, sepsis y septicemia, síndrome de choque tóxico y enfermedad infecciosa); rechazo de trasplante y alergia. En una realización, el trastorno asociado con IL-22 es, un trastorno artrítico, por ejemplo, un trastorno elegido de uno o más de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, o espondilitis anquilosante; un trastorno respiratorio (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), o una afección inflamatoria de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), el hígado (por ejemplo, hepatitis), el riñon (por ejemplo, nefritis), el páncreas (por ejemplo, pancreatitis) y órganos gastrointestinales, por ejemplo, colitis, enfermedad de Crohn e Ell.

El término "interleucina-22" o "IL-22" se refiere a una citocina de clase II (que puede ser de mamífero) capaz de unirse a IL-22R y/o un complejo de receptores de IL-22R e IL-10R2, y que tiene, al menos, una de las siguientes características: (1) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de IL-22 de mamífero natural (de longitud completa o de forma madura) o un fragmento de la misma, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO.:1 (humana) o SEQ ID NO.:3 (murina) o un fragmento de la misma; (2) una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO.:1 o los aminoácidos 34-179 de la misma (humana) o SEQ ID NO.:3 (murina) o un fragmento de la misma; (3) una secuencia de aminoácidos que se codifican por una secuencia de nucleótidos de IL-22 de mamífero natural o un fragmento de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO.:2 o los nucleótidos de 71 a 610 (humana) o SEQ ID NO.:4 (murina) o un fragmento de la misma); (4) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos el 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a, una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO.:2 o los nucleótidos de 71 a 610 de la misma (humana) o SEQ ID NO.:4 (murina) o un fragmento de la misma; (5) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que degenera a una secuencia de nucleótidos de IL-22 natural o un fragmento de la misma, por ejemplo, SEQ ID NO.:2 (humana) o SEQ ID NO.:4 (murina) o un fragmento de la misma; o (6) una secuencia de nucleótidos que se híbrida a una de las secuencias de nucleótidos precedentes bajo condiciones rigurosas, por ejemplo, condiciones altamente rigurosas. La IL-22 se puede unir a IL-22R y/o un complejo de receptores de IL-22R e IL-10R2 de origen mamífero, por ejemplo, humano o de ratón.

El ADNc de IL-22 humano se depositó en la American Type Culture Collection (10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, EE.UU. 20110-2209) el 28 de abril de 1999 como un depósito original sometido al Tratado de Budapest y se les asignaron los números de referencia de la ATCC 207231.

La frase "una actividad de IL-22" o "actividad asociada con IL-22" se refiere a una o más de las actividades biológicas de un polipéptido de IL-22, por ejemplo, un polipéptido de IL-22 madura (por ejemplo, un mamífero, por ejemplo, IL-22 humana o murina que tiene una secuencia de aminoácidos tal como se muestra en SEQ ID NO.:2 y 4, respectivamente), incluyendo, pero sin limitarse a, (1) interactuar con, por ejemplo, unirse a, un receptor de IL-22 (por ejemplo, un IL-22R o IL-10R2 o un complejo de las mismas, preferiblemente de mamífero, por ejemplo, de origen murino o humano); (2) asociarse con una o más moléculas de transducción de señales; (3) estimular la fosforilación y/o activación de una proteína cinasa, por ejemplo, JAK/STAT3, ERK y MAPK; (4) modular, por ejemplo, estimular o disminuir, la proliferación, la diferenciación, la función celular efectora, la actividad citolítica, la secreción de quimiocinas o citocinas y/o la supervivencia de una célula que responde a IL-22, por ejemplo, una célula epitelial de, por ejemplo, riñon, hígado, colon, intestino delgado, glándula tiroides, páncreas, piel); (5) modular al menos un parámetro de una respuesta de fase aguda, por ejemplo, un cambio metabólico, hepático, hematopoyético (por ejemplo, anemia, incremento de plaquetas) o un cambio neuroendocrino, o un cambio (por ejemplo, un incremento o una disminución en una proteína de fase aguda, por ejemplo, un incremento en fibrinógeno y/o amiloide sérico A o una disminución en albúmina); y/o (6) modular al menos un parámetro de un estado inflamatorio, por ejemplo, modular acciones proinflamatorias mediadas por citocinas (por ejemplo, fiebre, y/o síntesis de prostaglandina, por ejemplo síntesis de PGE2), modular respuestas inmunitarias celulares, modular la producción y/o secreción de citocinas, quimiocinas (por ejemplo, GR01 ), o linfocinas (por ejemplo, producción y/o secreción de una citocina proinflamatoria).

La presente solicitud proporciona, al menos en parte, anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se unen a IL-1 F6, en particular, IL-1F6 humanos, con afinidad y especificidad altas. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-IL-1 F6 o fragmentos de los mismos se pueden usar para diagnosticar, tratar o prevenir trastornos asociados con IL-1 F6 y/o trastornos inflamatorios, por ejemplo, trastornos autoinmunitarios, por ejemplo, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis asociada a lupus o espondilitis anquilosante), esclerodermia, lupus eritematoso sistémico, VIH, síndrome de Sjogren, vasculitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), miastenia gravis, enfermedad inflamatoria intestinal (Ell), enfermedad de Crohn, colitis, diabetes mellitus (tipo I); afecciones inflamatorias de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), el hígado (por ejemplo, hepatitis), el riñon (por ejemplo, nefritis) y el páncreas (por ejemplo, pancreatitis); trastornos cardiovasculares, por ejemplo, trastornos metabólicos del colesterol, daño por radicales libres de oxígeno, isquemia; trastornos asociados con curación de heridas; trastornos respiratorios, por ejemplo, asma y EPOC (por ejemplo, fibrosis quística); afecciones inflamatorias (por ejemplo, endotoxemia, sepsis y septicemia, síndrome de choque tóxico y enfermedad infecciosa); rechazo de trasplante y alergia. En una realización, el trastorno asociado con IL-1F6 es, un trastorno artrítico, por ejemplo, un trastorno elegido de uno o más de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, o espondilitis anquilosante; un trastorno respiratorio (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); o una afección inflamatoria de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), el hígado (por ejemplo, hepatitis), el riñon (por ejemplo, nefritis), el páncreas (por ejemplo, pancreatitis) y órganos gastrointestinales, por ejemplo, colitis, enfermedad de Crohn e EN.

El término "IL-1F6" se refiere a una citocina de IL-1 , y tiene al menos una de las siguientes características: (1) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de IL-1F6 de mamífero natural (de longitud completa o de forma madura) o un fragmento de la misma, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO.:6 o un fragmento de la misma; (2) una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO.:6 o un fragmento de la misma; (3) una secuencia de aminoácidos que se codifican por una secuencia de nucleótidos de IL-1F6 de mamífero natural o un fragmento de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO.:5 o un fragmento de la misma); (4) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos el 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a, una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO.:5 o un fragmento de la misma; (5) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que degenera a una secuencia de nucleótidos de IL-1 F6 natural o un fragmento de la misma, por ejemplo, SEQ ID NO.:5 o un fragmento de la misma; o (6) una secuencia de nucleótidos que se híbrida a SEQ ID NO.:5 bajo condiciones rigurosas, por ejemplo, condiciones altamente rigurosas.

La presente solicitud proporciona, al menos en parte, anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se unen a IL-1 F8, en particular, IL-1 F8 humanos, con afinidad y especificidad altas. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-IL-1 F8 o fragmentos de los mismos se pueden usar para diagnosticar, tratar o prevenir trastornos asociados con IL-1 F8 y/o trastornos inflamatorios, por ejemplo, trastornos autoinmunitarios, por ejemplo, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis asociada a lupus o espondilitis anquilosante), esclerodermia, lupus eritematoso sistémico, VIH, síndrome de Sjogren, vasculitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), miastenia gravis, enfermedad inflamatoria intestinal (Ell), enfermedad de Crohn, colitis, diabetes mellitus (tipo I); afecciones inflamatorias de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), el hígado (por ejemplo, hepatitis), el riñon (por ejemplo, nefritis) y el páncreas (por ejemplo, pancreatitis); trastornos cardiovasculares, por ejemplo, trastornos metabólicos del colesterol, daño por radicales libres de oxígeno, isquemia; trastornos asociados con curación de heridas; trastornos respiratorios, por ejemplo, asma y EPOC (por ejemplo, fibrosis quística); afecciones inflamatorias (por ejemplo, endotoxemia, sepsis y septicemia, síndrome de choque tóxico y enfermedad infecciosa); rechazo de trasplante y alergia. En una realización, el trastorno asociado con IL-1F8 es, un trastorno artrítico, por ejemplo, un trastorno elegido de uno o más de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, o espondilitis anquilosante; un trastorno respiratorio (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); o una afección inflamatoria de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), el hígado (por ejemplo, hepatitis), el riñon (por ejemplo, nefritis), el páncreas (por ejemplo, pancreatitis) y órganos gastrointestinales, por ejemplo, colitis, enfermedad de Crohn e Eli.

El término "IL-1 F8" se refiere a una citocina de IL-1 , y tiene al menos una de las siguientes características: (1) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de IL-1F8 de mamífero natural (de longitud completa o de forma madura) o un fragmento de la misma, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO.:8 o un fragmento de la misma; (2) una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO.:8 o un fragmento de la misma; (3) una secuencia de aminoácidos que se codifican por una secuencia de nucleótidos de IL-1F8 de mamífero natural o un fragmento de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO.:7 o un fragmento de la misma); (4) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a, una secuencia de nucleótidos mostrada como SEO. ID NO.:7 o un fragmento de la misma; (5) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que degenera a una secuencia de nucleótidos de IL-1 F8 natural o un fragmento de la misma, por ejemplo, SEQ ID NO.:7 o un fragmento de la misma; o (6) una secuencia de nucleótidos que se híbrida a SEQ ID NO.:7 bajo condiciones rigurosas, por ejemplo, condiciones altamente rigurosas.

La presente solicitud proporciona, al menos en parte, anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se unen a IL-1 F9, en particular, IL-1 F9 humanos, con afinidad y especificidad altas. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-IL-1 F9 o fragmentos de los mismos se pueden usar para diagnosticar, tratar o prevenir trastornos asociados con IL-1 F9 y/o trastornos inflamatorios, por ejemplo, trastornos autoinmunitarios, por ejemplo, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis asociada a lupus o espondilitis anquilosante), esclerodermia, lupus eritematoso sistémico, VIH, síndrome de Sjogren, vasculitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), miastenia gravis, enfermedad inflamatoria intestinal (Ell), enfermedad de Crohn, colitis, diabetes mellitus (tipo I); afecciones inflamatorias de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), el hígado (por ejemplo, hepatitis), el riñon (por ejemplo, nefritis) y el páncreas (por ejemplo, pancreatitis); trastornos cardiovasculares, por ejemplo, trastornos metabólicos del colesterol, daño por radicales libres de oxígeno, isquemia; trastornos asociados con curación de heridas; trastornos respiratorios, por ejemplo, asma y EPOC (por ejemplo, fibrosis quística); afecciones inflamatorias (por ejemplo, endotoxemia, sepsis y septicemia, síndrome de choque tóxico y enfermedad infecciosa); rechazo de trasplante y alergia. En una realización, el trastorno asociado con IL-1F9 es, un trastorno artrítico, por ejemplo, un trastorno elegido de uno o más de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, o espondilitis anquilosante; un trastorno respiratorio (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); o una afección inflamatoria de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), el hígado (por ejemplo, hepatitis), el riñon (por ejemplo, nefritis), el páncreas (por ejemplo, pancreatitis) y órganos gastrointestinales, por ejemplo, colitis, enfermedad de Crohn e EII.

El término "IL-1 F9" se refiere a una citocina de IL-1 , y tiene al menos una de las siguientes características: (1) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de IL-1 F9 de mamífero natural (de longitud completa o de forma madura) o un fragmento de la misma, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO.:10 o un fragmento de la misma; (2) una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO.:10 o un fragmento de la misma; (3) una secuencia de aminoácidos que se codifican por una secuencia de nucleótidos de IL-1 F9 de mamífero natural o un fragmento de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO.:9 o un fragmento de la misma); (4) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a, una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO.:9 o un fragmento de la misma; (5) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que degenera a una secuencia de nucleótidos de IL-1 F9 natural o un fragmento de la misma, por ejemplo, SEQ ID NO.:9 o un fragmento de la misma; o (6) una secuencia de nucleótidos que se híbrida a SEQ ID NO.:9 bajo condiciones rigurosas, por ejemplo, condiciones altamente rigurosas.

La presente solicitud proporciona, al menos en parte, anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se unen a IL-1 Rrp2, en particular, IL-1Rrp2 humanos, con afinidad y especificidad altas. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-IL-1 Rrp2 o fragmentos de los mismos se pueden usar para diagnosticar, tratar o prevenir trastornos asociados con IL-1Rrp2 y/o trastornos inflamatorios, por ejemplo, trastornos autoinmunitarios, por ejemplo, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis asociada a lupus o espondilitis anquilosante), esclerodermia, lupus eritematoso sistémico, VIH, síndrome de Sjogren, vasculitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), miastenia gravis, enfermedad inflamatoria intestinal (Ell), enfermedad de Crohn, colitis, diabetes mellitus (tipo I); afecciones inflamatorias de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), el hígado (por ejemplo, hepatitis), el riñon (por ejemplo, nefritis) y el páncreas (por ejemplo, pancreatitis); trastornos cardiovasculares, por ejemplo, trastornos metabólicos del colesterol, daño por radicales libres de oxígeno, isquemia; trastornos asociados con curación de heridas; trastornos respiratorios, por ejemplo, asma y EPOC (por ejemplo, fibrosis quística); afecciones inflamatorias (por ejemplo, endotoxemia, sepsis y septicemia, síndrome de choque tóxico y enfermedad infecciosa); rechazo de trasplante y alergia. En una realización, el trastorno asociado con IL-1 Rrp2 es, un trastorno artrítico, por ejemplo, un trastorno elegido de uno o más de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, o espondilitis anquilosante; un trastorno respiratorio (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); o una afección inflamatoria de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), el hígado (por ejemplo, hepatitis), el riñon (por ejemplo, nefritis), el páncreas (por ejemplo, pancreatitis) y órganos gastrointestinales, por ejemplo, colitis, enfermedad de Crohn e Ell.

El término "IL-1 Rrp2" se refiere a un receptor de citocina de IL-1 , (receptor 2 similar a interleucina 1 (IL-1RL2))y tiene al menos una de las siguientes características: (1) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de IL-1 Rrp2 de mamífero natural (de longitud completa o de forma madura) o un fragmento de la misma, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO.: 12 o un fragmento de la misma; (2) una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos el 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO.:12 o un fragmento de la misma; (3) una secuencia de aminoácidos que se codifican por una secuencia de nucleótidos de IL-1 Rrp2 de mamífero natural o un fragmento de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO.:1 1 o un fragmento de la misma); (4) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos el 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a, una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO.:1 1 o un fragmento de la misma; (5) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que degenera a una secuencia de nucleótidos de IL-1Rrp2 natural o un fragmento de la misma, por ejemplo, SEQ ID NO.:1 1 o un fragmento de la misma; o (6) una secuencia de nucleótidos que se híbrida a SEQ ID NO.:1 1 bajo condiciones rigurosas, por ejemplo, condiciones altamente rigurosas.

La presente solicitud proporciona, al menos en parte, anticuerpos y fragmentos de unión a antígenos de los mismos que se unen a IL-17A, en particular, IL-17A humanos, con afinidad y especificidad altas. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-IL-17A o fragmentos de los mismos se pueden usar para diagnosticar, tratar o prevenir trastornos asociados con IL-17A y/o trastornos inflamatorios, por ejemplo, trastornos autoinmunitarios, por ejemplo, artritis (incluyendo artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, artritis asociada a lupus o espondilitis anquilosante), esclerodermia, lupus eritematoso sistémico, VIH, síndrome de Sjogren, vasculitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis (incluyendo dermatitis atópica y dermatitis eccematosa), miastenia gravis, enfermedad inflamatoria intestinal (Ell), enfermedad de Crohn, colitis, diabetes mellitus (tipo I); afecciones inflamatorias de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), el hígado (por ejemplo, hepatitis), el riñon (por ejemplo, nefritis) y el páncreas (por ejemplo, pancreatitis); trastornos cardiovasculares, por ejemplo, trastornos metabólicos del colesterol, daño por radicales libres de oxígeno, isquemia; trastornos asociados con curación de heridas; trastornos respiratorios, por ejemplo, asma y EPOC (por ejemplo, fibrosis quística); afecciones inflamatorias (por ejemplo, endotoxemia, sepsis y septicemia, síndrome de choque tóxico y enfermedad infecciosa); rechazo de trasplante y alergia. En una realización, el trastorno asociado con IL-17A es, un trastorno artrítico, por ejemplo, un trastorno elegido de uno o más de artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriásica, o espondilitis anquilosante; un trastorno respiratorio (por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC); o una afección inflamatoria de, por ejemplo, la piel (por ejemplo, psoriasis), el sistema cardiovascular (por ejemplo, aterosclerosis), el sistema nervioso (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer), el hígado (por ejemplo, hepatitis), el riñon (por ejemplo, nefritis), el páncreas (por ejemplo, pancreatitis) y órganos gastrointestinales, por ejemplo, colitis, enfermedad de Crohn e Ell.

El término "IL-17A" se refiere a una citocina de IL-17, y tiene al menos una de las siguientes características: (1) una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de IL-17A de mamífero natural (de longitud completa o de forma madura) o un fragmento de la misma, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO.: 14 o un fragmento de la misma; (2) una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a, una secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO.:14 o un fragmento de la misma; (3) una secuencia de aminoácidos que se codifican por una secuencia de nucleótidos de IL-17A de mamífero natural o un fragmento de la misma (por ejemplo, SEQ ID NO.:13 o un fragmento de la misma); (4) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica a, por ejemplo, al menos el 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idéntica a, una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO : 13 o un fragmento de la misma; (5) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos que degenera a una secuencia de nucleótidos de IL-17A natural o un fragmento de la misma, por ejemplo, SEQ ID NO.: 13 o un fragmento de la misma; o (6) una secuencia de nucleótidos que se híbrida a SEQ ID NO.:13 bajo condiciones rigurosas, por ejemplo, condiciones altamente rigurosas.

La expresión "actividad de citocina", usada genéricamente o bien como se aplica a citocinas particulares tales como, pero sin limitarse a, IL-22, IL-17A, IL-1 F6, IL-1 F8 o IL-1 F9, se refiere a, al menos, un proceso celular iniciado o interrumpido como resultado de la unión de esa citocina a su(s) receptor(es) en una célula. Las actividades de citocina para IL-22 incluyen al menos una de, pero no se limitan a: (1) unirse a un complejo o una subunídad de receptor celular, tal como IL-22R1 , IL-10R2 o IL-22R1/IL-10R2; (2) asociarse con moléculas de transducción de señales (por ejemplo, JAK-1); (3) estimular la fosforilación de las proteínas STAT (por ejemplo, STAT5, STAT3 o una combinación de las mismas); (4) activar proteínas STAT; (5) inducir parámetros indicativos de una respuesta de fase aguda, incluyendo la modulación de reactivos de fase aguda (por ejemplo, amiloíde sérico A, fibrinógeno, haptoglobina o albúmina sérica) y células (por ejemplo, neutrófilos, plaquetas o eritrocitos; y (6) modular (por ejemplo, incrementar o disminuir) la proliferación, diferenciación, función celular efectora, actividad citolítica, secreción de citocinas, supervivencia o combinaciones de las mismas, de células epiteliales, fibroblastos o células inmunitarias. Las células epiteliales incluyen, pero no se limitan a, células de la piel, el intestino, el hígado y el riñon, así como células endoteliales. Los fibroblastos incluyen, pero no se limitan a, fibroblastos sinoviales: Las células inmunitarias pueden incluir células T CD4+ y CD8+, linfocitos NK, linfocítos B, macrófagos, megacariocitos y células inmunitarias de tejido o especializadas, tales como las encontradas en tejidos inflamados o las que expresan un receptor de IL-22.

Las actividades de citocina para IL-17A e IL-17F incluyen al menos una de, pero no se limitan a: (1) unirse a un receptor celular, tal como IL-17R, IL-17A, IL-17RC, IL-17RH1 , IL-17RL, IL-17RD o IL-17RE; (2) inhibición de angiogénesis; (3) modular (por ejemplo, incrementar o disminuir) la proliferación, diferenciación, función celular efectora, actividad citolítica, secreción de citocinas, supervivencia o combinaciones de las mismas, de células hematopoyéticas o células presentes en el cartílago, el hueso, el menisco, el cerebro, el riñon, el pulmón, la piel y el intestino; (4) inducir la producción de IL-6 y/o IL-8; y (5) estimular la producción de óxido nítrico.

Los términos "inducir", "reducir", "inhibir", "potenciar", "elevar", "incrementar", "disminuir" o similares, por ejemplo, que denotan diferencias cuantitativas entre dos estados, se refieren a al menos diferencias estadísticamente significativas entre los dos estados.

El término "unión específica" o la expresión "se une específicamente" se refieren a dos moléculas que forman un complejo que es relativamente estable bajo condiciones fisiológicas. La unión específica se caracteriza por una afinidad alta y una capacidad de baja a moderada tal como se distingue de la unión no específica que normalmente tiene una afinidad baja con una capacidad de moderada a alta. Típicamente, la unión se considera específica cuando la constante de asociación KA es mayor de 106 M . Si es necesario, se puede reducir la unión no específica sin afectar sustancialmente a la unión específica variando las condiciones de la unión. Las condiciones de unión apropiadas, tales como, la concentración de los anticuerpos, la fuerza iónica de la solución, la temperatura, el tiempo permitido para la unión, la concentración de un agente bloqueante (por ejemplo, albúmina sérica, caseína de leche), etc., se puede optimizar por una experto usando técnicas rutinarias.

El término "agente de unión específica" se refiere a una molécula natural o no natural que se une específicamente a una diana. Ejemplos de agentes de unión específica incluyen, pero no se limitan a, proteínas, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos y compuestos de moléculas pequeñas. En ciertas realizaciones, un agente de unión específica es un anticuerpo. En ciertas realizaciones, un agente de unión específica es una región de unión a antígeno.

El término "estructura" abarca tanto estructuras de productos biológicos (por ejemplo y sin limitación, anticuerpos y fragmentos de los mismos) como moléculas pequeñas.

El término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina o un fragmento de la misma, tal como Fab, Fab', F(ab')2, Fe, Fd, Fd', Fv, anticuerpos de cadena sencilla (scFv por ejemplo), anticuerpos de dominio variable sencillo (Dab), diacuerpos (bivalentes y biespecíficos) y anticuerpos quiméricos (por ejemplo, humanizados), que se pueden producir mediante la modificación de anticuerpos completos o los sintetizados de novo usando tecnologías de ADN recombinante. Estos fragmentos de anticuerpos funcionales retienen la capacidad de unirse selectivamente con su receptor o antígeno respectivo. Los anticuerpos y los fragmentos de anticuerpos pueden ser de cualquier clase de anticuerpos incluyendo, pero sin limitarse a, IgG, IgA, IgM, IgD e IgE, y de cualquier subclase (por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4) de anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoclonales o policlonales. El anticuerpo también puede ser un anticuerpo monoespecífico, poliespecífico, no específico, humanizado, humano, de cadena sencilla, quimérico, sintético, recombinante, híbrido, mutado, CDR-injertado y/o generado in vitro. El anticuerpo puede tener una región constante de cadena pesada elegida a partir de, por ejemplo, lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4. El anticuerpo también puede tener una cadena ligera elegida entre, por ejemplo, kappa o lambda. Las regiones constantes de los anticuerpos se pueden alterar, por ejemplo, mutar, para modificar las propiedades del anticuerpo (por ejemplo, para incrementar o disminuir una o más de: unión a receptor de Fe, glucosilación de anticuerpos, el número de residuos de cisterna, función celular efectora o función de complemento). Típicamente, el anticuerpo se une específicamente a un antígeno predeterminado, por ejemplo, un antígeno asociado con un trastorno, por ejemplo, un trastorno neurodegenerativo, metabólico, inflamatorio, autoinmunitario y/o maligno. A menos que esté precedido por la palabra "intacto", el término "anticuerpo" incluye, además de moléculas de anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpos tales como Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb y otros fragmentos de anticuerpos que retienen la función de unión a antígeno.

Típicamente, tales fragmentos comprenden un dominio de unión a antígeno. El anticuerpo puede incluir adicionalmente una región constante de cadena ligera y pesada, para de este modo formar una cadena de inmunoglobulina ligera y pesada, respectivamente. En ciertas realizaciones, el anticuerpo es un tetrámero de dos cadenas de inmunoglobulina pesadas y dos cadenas de inmunoglobulina ligeras, en el que las cadenas de inmunoglobulina ligeras y pesadas están interconectadas mediante, por ejemplo, enlaces disulfuro. La región constante de la cadena pesada está compuesta de tres dominios, CH1 , CH2 y CH3. La región constante de la cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. La región variable de las cadenas ligera y pesada contiene un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos median típicamente la unión del anticuerpo a factores o tejidos del huésped, incluyendo varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.

Las expresiones "dominio de unión a antígeno" y "fragmento de unión a antígeno" se refieren a una parte de una molécula de anticuerpo que comprende aminoácidos responsables de la unión específica entre anticuerpo y antígeno. La parte del antígeno que específicamente se reconoce y se une mediante el anticuerpo se conoce como "epítopo." Un dominio de unión a antígeno puede comprender una región variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una región variable de cadena pesada de anticuerpo (VH); sin embargo, no tiene que comprender ambas. Los fragmentos Fd, por ejemplo, tienen dos regiones VH y a menudo retienen alguna función de unión a antígeno del dominio de unión a antígeno. Ejemplos de fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen (1 ) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que tiene los dominios VL, VH, CL y CH1 ; (2) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que tiene dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (3) un fragmento Fd que tiene los dos dominios H y CH1 ; (4) un fragmento Fv que tiene los dominios VL y VH de un brazo sencillo de un anticuerpo, (5) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 : 544-546), que tiene un dominio VH; (6) una región determinante de complementariedad aislada (CDR); y (7) un Fv de cadena sencilla (scFv). Aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, usando procedimientos recombinantes, mediante un engarce sintético que les permite prepararse como una cadena de proteína sencilla en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como cadena sencilla Fv (scFv); véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 85:5879-5883). Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y se evalúan los fragmentos para determinar su función de la misma manera que a los anticuerpos intactos.

Tal como se usa en el presente documento, el término "inmunoglobulina" se refiere a una proteína que consta de uno o más polipéptidos codificados sustancialmente por genes de inmunoglobulina. Los genes de inmunoglobulina humana reconocidos incluyen los genes de regiones constantes kappa, lambda, alfa (lgA1 e lgA2), gamma (lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4), delta, epsilon y mu, así como la miríada de genes de las regiones variables de inmunoglobulinas. Las "cadenas ligeras" de inmunoglobulinas de longitud total (aproximadamente 25 Kd o 214 aminoácidos) están codificadas por un gen de región variable en el extremo NH2 (aproximadamente 110 aminoácidos) y un gen de región constante kappa o lambda en el extremo COOH. Las "cadenas pesadas" de inmunoglobulina de longitud total (aproximadamente 50 Kd o 446 aminoácidos), están codificadas de manera similar por un gen de región variable (aproximadamente 116 aminoácidos) y uno de los otros genes de región constante mencionados anteriormente, por ejemplo gamma (que codifica aproximadamente 330 aminoácidos).

Tal como se usa en el presente documento, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpos (por ejemplo, IgM o IgGI) que están codificados por genes de región constante de la cadena pesada.

La expresión "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones constantes y variables que corresponden sustancialmente a secuencias de inmunoglobulinas de línea germinal humana conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, las descritas por Kabat et al. (Véase Kabat, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N.°: 91-3242). En ciertas realizaciones, los anticuerpos humanos pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis específica de sitio o aleatoria in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las CDR y en particular, CDR3. El anticuerpo humano puede tener al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o más posiciones reemplazadas con un residuo de aminoácidos que no está codificado por la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana.

El término "aislado" se refiere a una molécula que está sustancialmente libre de su entorno natural. Por ejemplo, una proteína aislada está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas de la fuente de tejido o de célula a partir del que se derivó. El término también se refiere a preparaciones en las que la proteína aislada es suficientemente pura para composiciones farmacéuticas, o al menos pura al 70-80% (p/p); o al menos pura al 80-90% (p/p); o al menos pura al 90-95%; o al menos pura al 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o al 100% (p/p).

El término "agente terapéutico" es una sustancia que trata o asiste en el tratamiento de un trastorno médico. Agentes terapéuticos pueden incluir, pero no se limitan a, sustancias que modulan las células inmunitarias o las respuestas inmunitarias de modo que complementa la actividad de IL-22 de los anticuerpos anti-IL-22. En el presente documento se describen ejemplos no limitantes y usos de agentes terapéuticos.

El término "tratamiento" se refiere a una medida preventiva o terapéutica. Se puede administrar el tratamiento a un sujeto que tiene un trastorno médico o que en último término puede adquirir el trastorno, para prevenir, curar, retrasar, reducir la gravedad de, y/o mejorar uno o más síntomas de un trastorno o un trastorno recurrente, o para prolongar la supervivencia más allá de lo que se espera en ausencia de tal tratamiento.

La expresión "cantidad efectiva" se refiere a una dosificación o cantidad que es suficiente para regular una actividad para mejorar síntomas clínicos o lograr un resultado biológico deseado, por ejemplo, disminuir la actividad de linfocitos B o de linfocitos T, la supresión de la autoinmunidad, la supresión del rechazo al trasplante, etc.

La expresión "en combinación" en el contexto de tratamiento con dos agentes significa que los agentes se dan de forma sustancialmente contemporánea, bien simultánea o secuencialmente. Si se dan secuencialmente, al comienzo de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos es preferiblemente aún detectable a concentraciones efectivas en el sitio de tratamiento.

La expresión "idénticas en porcentaje" o "porcentaje de identidad" se refiere a la similitud entre al menos dos secuencias diferentes. Este porcentaje de identidad se puede determinar mediante algoritmos de alineamiento estándar, por ejemplo, la herramienta de alineamiento local básico (BLAST) descrita por Altshul eí a/. ((1990) J. Mol. Biol., 215: 403410); the algorithm of Needleman et al. ((1970) J. Mol. Biol., 48: 444453); o el algoritmo de Meyers eí al. ((1988) Comput. Appl. Biosci., 4: 11 17). Un grupo de parámetros puede ser la matriz de puntuación Blosum 62 con una penalización por hueco de 12, una penalización por extensión del hueco de 4 y una penalización por hueco de desplazamiento de fase de 5. También se puede determinar el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización por longitud del hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Normalmente el porcentaje de identidad se calcula comparando secuencias de longitud similar.

En ciertas realizaciones, se proporcionan secuencias similares u homologas (por ejemplo, al menos aproximadamente una identidad de secuencia del 85%) a las secuencias descritas. En ciertas realizaciones, la identidad de secuencia puede ser aproximadamente del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor. Alternativamente, existe identidad sustancial cuando los segmentos de ácidos nucleicos hibriden bajo condiciones de hibridación selectivas (por ejemplo, condiciones de hibridación altamente restrictivas) al complemento de la hebra. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.

Se pueden usar polinucleótidos aislados como cebadores y sondas de hibridación para identificar y aislar ácidos nucleicos que tienen secuencias idénticas a o similares a las que codifican los polinucleótidos descritos. Se pueden usar polinucleótidos aislados de esta manera, por ejemplo y sin limitación, para producir anticuerpos frente a IL-22 u otras citocinas similares a IL-10 o para identificar células que expresan tales anticuerpos. Los procedimientos de hibridación para identificar y aislar ácidos nucleicos incluyen hibridaciones Southern, hibridaciones in situ e hibridaciones Northern, y son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Las reacciones de hibridación se pueden realizar bajo condiciones de rigurosidad diferentes. Preferiblemente, cada polinucleótido de hibridación se híbrida a su polinucleótido correspondiente bajo condiciones de rigurosidad reducida, más preferiblemente condiciones rigurosas y lo más preferiblemente condiciones altamente rigurosas. Ejemplos de condiciones de rigurosidad se muestran en el cuadro 1 a continuación: las condiciones altamente rigurosas son las que, al menos son tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones A-F; las condiciones rigurosas son, al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones G-L; y las condiciones de rigurosidad reducida son, al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones M-R.

CUADRO 1 1 La longitud del híbrido es la que se prevé para la(s) región/regiones hibridada(s) de los polinucleótidos de hibridación. Cuando se híbrida un polinucleótido a un polinucleótido diana de secuencia desconocida, se asume que la longitud del híbrido es la del polinucleótido de hibridación. Cuando se hibridan polinucleótidos de secuencia conocida, se puede determinar la longitud del híbrido alineando las secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o las regiones de complementariedad de secuencia óptima. 2 SSC (I xSSPE es NaCI 0.15 M, NaH2P04 10 mM y EDTA 1.25 mM, pH 7.4) se puede sustituir por SSPE (1 xSSC es NaCI 0.15 M y citrato de sodio 15 mM) en los tampones de hibridación y de lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos después de que se complete la hibridación.

TB* - TR*: La temperatura de hibridación para híbridos que se prevé que sean de menos de 50 pares de bases de longitud debería ser de 5-10°C menos que la temperatura de fusión (Tf) del híbrido, en el que se determina la Tf de acuerdo con las ecuaciones siguientes. Para híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tf(°C) = 2(n°. de bases A + T) + 4(n° de bases G + C). Para híbridos de entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tf(°C) = 81.5 + 16.6(log10Na+) + 0.41 (%G + C) - (600/N), en la que N es el número de bases en el híbrido, y Na+ es la concentración de iones de sodio en el tampón de hibridación (Na+ para 1X SSC = 0.165 M).

Se proporcionan ejemplos adicionales de condiciones de rigurosidad para la hibridación de polinucleótidos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Chs. 9 y 11 , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), y Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Seccs. 2.10 y 6.3-6.4, John Wiley & Sons, Inc. (1995), incorporados en el presente documento por referencia.

Se pueden usar polinucleótidos aislados como cebadores y sondas de hibridación para identificar y aislar ADN que tienen secuencias que codifican variantes alélicas de los polinucleótidos descritos. Las variantes alélicas son formas alternativas naturales de los polinucleótidos descritos que codifican polinucleótidos que son idénticos a o tienen similitud significativa con los polipéptidos codificados por los polinucleótidos descritos. Preferiblemente, las variantes alélicas tienen al menos una identidad de secuencia del 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o del 99% con los polinucleótidos descritos.

Se pueden usar polinucleótidos aislados como cebadores y sondas de hibridación para identificar y aislar ADN que tienen secuencias que codifican homólogos de los polipéptidos a los polinucleótidos descritos. Estos homólogos son polinucleótidos y polipéptidos aislados a partir de especies diferentes de las de los polinucleótidos y polipéptidos descritos, o dentro de las mismas especies, pero con similitud de secuencia significativa con los polinucleótidos y polipéptidos descritos. En ciertas realizaciones, los homólogos de los polinucleótidos tienen al menos una identidad del 50%, 75%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o del 99% con los polinucleótidos descritos, mientras que los homólogos de los polipéptidos tienen al menos una identidad del 30%, 45%, o del 60% con los polipéptidos/anticuerpos descritos. En ciertas realizaciones, los homólogos de los polinucleótidos y polipéptidos descritos son los aislados a partir de especies de mamíferos.

También se pueden usar los polinucleótidos aislados como cebadores y sondas de hibridación para identificar células y tejidos que expresan proteínas, incluyendo anticuerpos, y las condiciones bajo las que éstos se expresan.

Se entiende que los polipéptidos y los antagonistas, por ejemplo, anticuerpos, pueden tener sustituciones de aminoácidos no esenciales o conservadoras adicionales, que no tienen un efecto sustancial en sus funciones. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" es una en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadena laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

Se describen secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de IL-22 en la patente de los EE.UU 7.307.161 y se proporcionan a continuación.

También se puede determinar la secuencia de nucleótidos de cada clon secuenciando el clon depositado de acuerdo con los procedimientos conocidos. Tal como se usa en el presente documento, una proteína "secretada" es una que, cuando se expresa en una célula huésped adecuada, se transporta a través de o por una membrana, incluyendo el transporte como resultado de secuencias señal en su secuencia de aminoácidos. Las proteínas "secretadas" incluyen sin limitación proteínas secretadas totalmente (por ejemplo, proteínas solubles) o parcialmente (por ejemplo, receptores) desde la célula en la que se expresan. Las proteínas "secretadas" también incluyen sin limitación proteínas que se transportan a través de la membrana del retículo endoplásmico.

Se puede usar cualquier forma de proteínas IL-22 de menos de la longitud completa en los procedimientos y las composiciones de las presentes reivindicaciones. Se pueden producir fragmentos de IL-22, por ejemplo, proteínas IL-22 de menos de la longitud completa, expresando un fragmento correspondiente del polinucleótido que codifica la proteína IL-22 de longitud completa en una célula huésped. Se pueden preparar los polinucleótidos modificados tal como se describen anteriormente mediante técnicas de biología molecular estándar, incluyendo la construcción de mutantes de deleción deseada apropiados, procedimientos de mutagénesis dirigida a sitio o mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores de oligonucleótidos apropiados.

Se puede usar cualquier forma de proteínas IL-1F6 de menos de la longitud completa en los procedimientos y las composiciones de las presentes reivindicaciones. Se pueden producir fragmentos de IL-1 F6, por ejemplo, proteínas IL-1 F6 de menos de la longitud completa, expresando un fragmento correspondiente del polinucleótido que codifica la proteína IL-1 F6 de longitud completa en una célula huésped. Se pueden preparar los polinucleótidos modificados tal como se describen anteriormente mediante técnicas de biología molecular estándar, incluyendo la construcción de mutantes de deleción deseada apropiados, procedimientos de mutagénesis dirigida a sitio o mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores de oligonucleótidos apropiados.

Se puede usar cualquier forma de proteínas IL-1F8 de menos de la longitud completa en los procedimientos y las composiciones de las presentes reivindicaciones. Se pueden producir fragmentos de IL-1 F8, por ejemplo, proteínas IL-1 F8 de menos de la longitud completa, expresando un fragmento correspondiente del polinucleótido que codifica la proteína IL-1F8 de longitud completa en una célula huésped. Se pueden preparar los polinucleótidos modificados tal como se describen anteriormente mediante técnicas dé biología molecular estándar, incluyendo la construcción de mutantes de deleción deseada apropiados, procedimientos de mutagénesis dirigida a sitio o mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores de oligonucleótidos apropiados.

Se puede usar cualquier forma de proteínas IL-1F9 de menos de la longitud completa en los procedimientos y las composiciones de las presentes reivindicaciones. Se pueden producir fragmentos de IL-1F9, por ejemplo, proteínas IL-1 F9 de menos de la longitud completa, expresando un fragmento correspondiente del polinucleotido que codifica la proteína IL-1 F9 de longitud completa en una célula huésped. Se pueden preparar los polinucleótidos modificados tal como se describen anteriormente mediante técnicas de biología molecular estándar, incluyendo la construcción de mutantes de deleción deseada apropiados, procedimientos de mutagénesis dirigida a sitio o mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores de oligonucleótidos apropiados.

Se puede usar cualquier forma de proteínas IL-1 Rrp2 de menos de la longitud completa en los procedimientos y las composiciones de las presentes reivindicaciones. Se pueden producir fragmentos de IL-1Rrp2, por ejemplo, proteínas IL-1 Rrp2 de menos de la longitud completa, expresando un fragmento correspondiente del polinucleotido que codifica la proteína IL-1 Rrp2 de longitud completa en una célula huésped. Se pueden preparar los polinucleótidos modificados tal como se describen anteriormente mediante técnicas de biología molecular estándar, incluyendo la construcción de mutantes de deleción deseada apropiados, procedimientos de mutagénesis dirigida a sitio o mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores de oligonucleótidos apropiados.

Se puede usar cualquier forma de proteínas de IL-17A de longitud menor de la completa en los procedimientos y las composiciones de las presentes reivindicaciones. Se pueden producir fragmentos de IL-17A, por ejemplo, las proteínas IL-17A de menos de la longitud completa, expresando un fragmento correspondiente del polinucleótido que codifica la proteína IL-17A de longitud completa en una célula huésped. Se pueden preparar los polinucleótidos modificados tal como se describen anteriormente mediante técnicas de biología molecular estándar, incluyendo la construcción de mutantes de deleción deseada apropiados, procedimientos de mutagénesis dirigida a sitio o mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores de oligonucleótidos apropiados.

Fragmentos de la proteína pueden estar en forma lineal, o pueden ciclarse usando procedimientos conocidos, por ejemplo, tal como se describen en H.U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992) y en R.S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245-9253 (1992), estando ambos incorporados en el presente documento por referencia. Tales fragmentos se pueden fusionar a moléculas transportadoras tales como ¡nmunoglobulinas para muchos fines, incluyendo incrementar la valencia de los sitios de unión a proteína. Por ejemplo, los fragmentos de la proteína se pueden fusionar a través de secuencias "de engarce" a la parte Fe de una inmunoglobulina. Para una forma bivalente de la proteína, la fusión tal puede ser a la parte Fe de una molécula de IgG. Se pueden usar otros isotipos de inmunoglobulina para generar tales fusiones. Por ejemplo, se puede usar una fusión con proteína-lgM para generar una forma decadente de la proteína.

Las proteínas IL-22 y fragmentos de las mismas incluyen proteínas con longitudes de secuencia de aminoácidos que son al menos el 25% (más preferiblemente al menos el 50%, y lo más preferiblemente al menos el 75%) de la longitud de una proteína descrita y tienen al menos una identidad de secuencia del 60% (más preferiblemente, al menos una identidad del 75%, lo más preferiblemente al menos una identidad del 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o del 100% a lo largo de la longitud del fragmento) con esa proteína descrita, donde la identidad de secuencia se determina comparando las secuencias de aminoácidos de las proteínas cuando se alinean de tal forma que maximizan el solapamiento y la identidad mientras que minimizan los huecos de la secuencia. En ciertas realizaciones, las proteínas y fragmentos de proteína contienen un segmento que comprende 8 ó más (más preferiblemente 20 ó más, lo más preferiblemente 30 ó más) aminoácidos contiguos que comparten al menos una identidad de secuencia del 75% (más preferiblemente, al menos una identidad del 85%; lo más preferiblemente al menos una identidad del 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o del 99%) con cualquier segmento tal de cualquiera de las proteínas descritas.

Las proteínas IL-1 F6 y fragmentos de las mismas incluyen proteínas con longitudes de secuencia de aminoácidos que son al menos el 25% (más preferiblemente al menos el 50%, y lo más preferiblemente al menos el 75%) de la longitud de una proteína descrita y tienen al menos una identidad de secuencia del 60% (más preferiblemente, al menos una identidad del 75%, lo más preferiblemente al menos una identidad del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o del 100% a lo largo de la longitud del fragmento) con esa proteína descrita, donde la identidad de secuencia se determina comparando las secuencias de aminoácidos de las proteínas cuando se alinean de tal forma que maximizan el solapamiento y la identidad mientras que minimizan los huecos de la secuencia. En ciertas realizaciones, las proteínas y fragmentos de proteína contienen un segmento que comprende 8 ó más (más preferiblemente 20 ó más, lo más preferiblemente 30 ó más) aminoácidos contiguos que comparten al menos una identidad de secuencia del 75% (más preferiblemente, al menos una identidad del 85%; lo más preferiblemente al menos una identidad del 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o del 99%) con cualquier segmento tal de cualquiera de las proteínas descritas.

Las proteínas IL-1 F8 y fragmentos de las mismas incluyen proteínas con longitudes de secuencia de aminoácidos que son al menos el 25% (más preferiblemente al menos el 50%, y lo más preferiblemente al menos el 75%) de la longitud de una proteína descrita y tienen al menos una identidad de secuencia del 60% (más preferiblemente, al menos una identidad del 75%, lo más preferiblemente al menos una identidad del 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o del 100% a lo largo de la longitud del fragmento) con esa proteína descrita, donde la identidad de secuencia se determina comparando las secuencias de aminoácidos de las proteínas cuando se alinean de tal forma que maximizan el solapamiento y la identidad mientras que minimizan los huecos de la secuencia. En ciertas realizaciones, las proteínas y fragmentos de proteína contienen un segmento que comprende 8 ó más (más preferiblemente 20 ó más, lo más preferiblemente 30 ó más) aminoácidos contiguos que comparten al menos una identidad de secuencia del 75% (más preferiblemente, al menos una identidad del 85%; lo más preferiblemente al menos una identidad del 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o del 99%) con cualquier segmento tal de cualquiera de las proteínas descritas.

Las proteínas IL-1 F9 y fragmentos de las mismas incluyen proteínas con longitudes de secuencia de aminoácidos que son al menos el 25% (más preferiblemente al menos el 50%, y lo más preferiblemente al menos el 75%) de la longitud de una proteína descrita y tienen al menos una identidad de secuencia del 60% (más preferiblemente, al menos una identidad del 75%, lo más preferiblemente al menos una identidad del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o del 100% a lo largo de la longitud del fragmento) con esa proteína descrita, donde la identidad de secuencia se determina comparando las secuencias de aminoácidos de las proteínas cuando se alinean de tal forma que maximizan el solapamiento y la identidad mientras que minimizan los huecos de la secuencia. En ciertas realizaciones, las proteínas y fragmentos de proteína contienen un segmento que comprende 8 ó más (más preferiblemente 20 ó más, lo más preferiblemente 30 ó más) aminoácidos contiguos que comparten al menos una identidad de secuencia del 75% (más preferiblemente, al menos una identidad del 85%; lo más preferiblemente al menos una identidad del 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o del 99%) con cualquier segmento tal de cualquiera de las proteínas descritas.

Las proteínas IL-1 Rrp2 y fragmentos de las mismas incluyen proteínas con longitudes de secuencia de aminoácidos que son al menos el 25% (más preferiblemente al menos el 50%, y lo más preferiblemente al menos el 75%) de la longitud de una proteína descrita y tienen al menos una identidad de secuencia del 60% (más preferiblemente, al menos una identidad del 75%, lo más preferiblemente al menos una identidad del 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o del 100% a lo largo de la longitud del fragmento) con esa proteína descrita, donde la identidad de secuencia se determina comparando las secuencias de aminoácidos de las proteínas cuando se alinean de tal forma que maximizan el solapamiento y la identidad mientras que minimizan los huecos de la secuencia. En ciertas realizaciones, las proteínas y fragmentos de proteína contienen un segmento que comprende 8 ó más (más preferiblemente 20 ó más, lo más preferiblemente 30 ó más) aminoácidos contiguos que comparten al menos una identidad de secuencia del 75% (más preferiblemente, al menos una identidad del 85%; lo más preferiblemente al menos una identidad del 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o del 99%) con cualquier segmento tal de cualquiera de las proteínas descritas.

Las proteínas IL-17A y fragmentos de las mismas incluyen proteínas con longitudes de secuencia de aminoácidos que son al menos el 25% (más preferiblemente al menos el 50%, y lo más preferiblemente al menos el 75%) de la longitud de una proteína descrita y tienen al menos una identidad de secuencia del 60% (más preferiblemente, al menos una identidad del 75%, lo más preferiblemente al menos una identidad del 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o del 100% a lo largo de la longitud del fragmento) con esa proteína descrita, donde la identidad de secuencia se determina comparando las secuencias de aminoácidos de las proteínas cuando se alinean de tal forma que maximízan el solapamiento y la identidad mientras que minimizan los huecos de la secuencia. En ciertas realizaciones, las proteínas y fragmentos de proteína contienen un segmento que comprende 8 ó más (más preferiblemente 20 ó más, lo más preferiblemente 30 ó más) aminoácidos contiguos que comparten al menos una identidad de secuencia del 75% (más preferiblemente, al menos una identidad del 85%; lo más preferiblemente al menos una identidad del 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o del 99%) con cualquier segmento tal de cualquiera de las proteínas descritas.

Los polinucleótidos recombinantes se pueden unir operativamente a una secuencia de control de expresión tal como, por ejemplo y sin limitación, los vectores de expresión pMT2 o pED descritos en Kaufman et al., Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991 ), para producir la proteína recombinantemente. Se conocen en la técnica muchas secuencias de control de expresión adecuadas. También se conocen procedimientos generales de expresar proteínas recombinantes y se ejemplifican en R. Kaufman (1990) Methods in Enzymology 185, 537-566. Tal como se define en el presente documento, "unido operativamente" significa que el polinucleótido aislado y una secuencia de control de expresión están situados dentro de un vector o célula en un modo tal que la proteína se expresa por una célula huésped que se ha transformado (transfectado) con la secuencia de control de expresión/ el polinucleótido ligados.

Se pretende que el término "vector", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de cadena doble circular dentro del que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en el que se pueden ligar segmentos de ADN adicionales dentro del genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episómicos). Se pueden integrar otros vectores (por ejemplo, vectores mamíferos no episómicos) en el genoma de una célula huésped tras la introducción en la célula huésped, y de este modo se replican junto con el genoma del huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que ellos están operativamente unidos. Tales vectores se conocen en el presente documento como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante a menudo están en forma de plásmidos.

El término "secuencia reguladora" tal como se usa en el presente documento, incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Se apreciará por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras para la expresión en células huésped de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, elementos víricos que dirigen niveles altos de expresión de proteínas en células de mamíferos, tales como promotores y/o potenciadores derivados del promotor FF-1 a y poliA de BGH, citomegalovirus (CMV) (tal como el promotor/potenciador de CMV), virus del simio 40 (SV40) (tal como el promotor/potenciador de SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)) y polioma. Para una descripción adicional de los elementos reguladores víricos, y de las secuencias de los mismos, véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. N°. 5.168.062 de Stinski, la patente de EE.UU. N° 4.510.245 de Bell ef al. y la patente de EE.UU. N°. 4.968.615 de Schaffner et al.

En ciertas realizaciones, los vectores de expresión recombinantes pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células huésped (por ejemplo, orígenes de replicacion) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células huésped en las que se ha introducido el vector (véanse por ejemplo, las patentes de EE.UU. N— . 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas por Axel et al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para usar en células huésped dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418).

Una serie de tipos de células pueden actuar como células huésped adecuadas para expresión de una proteína (o de la proteína de fusión). Se puede usar cualquier tipo celular capaz de expresar la proteína IL-22 funcional. Las células huésped de mamíferos adecuadas incluyen, por ejemplo, células COS de mono, células de ovario de hámster chino (CHO), células 293 de riñon humanas, células A431 epidérmicas humanas, células Colo205 humanas, células 3T3, células CV-1 , otras líneas celulares de primates transformadas, células diploides normales, cepas celulares derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HeLa, células L de ratón, BHK, HL-60, U937, HaK, Rat2, BaF3, 32D, FDCP-1 , PC12, M1x o células C2C12.

En ciertas realizaciones, también se puede producir una proteína o proteína de fusión uniendo operativamente un polinucleótido aislado a secuencias control adecuadas en uno o más vectores de expresión de insectos, y empleando un sistema de expresión de insectos. Los materiales y procedimientos para los sistemas de expresión de células de insectos/de baculovirus están disponibles comercialmente en forma de kit de, por ejemplo, Invitrogen, San Diego, Calif. EE.UU. (el kit MaxBac®), y tales procedimientos se conocen bien en la técnica, tal como se describe en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin N.° 1555 (1987), incorporado en el presente documento por referencia. También se pueden producir las formas solubles de la proteína IL-22 en células de insectos usando polinucleótidos aislados apropiados tal como se describe anteriormente.

Alternativamente, se puede producir la proteína o la proteína de fusión en eucariotas inferiores tales como levaduras o en procariotas tales como bacterias. Las cepas de levadura adecuadas incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, cepas de Kluyveromyces, Candida, o cualquier cepa de levadura capaz de expresar proteínas heterólogas. Las cepas bacterianas adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cualquier cepa bacteriana capaz de expresar proteínas heterólogas.

La expresión en bacterias puede dar como resultado la formación de cuerpos de inclusión que incorporan la proteína recombinante. Por tanto, se puede requerir el replegado de la proteína recombinante para producir material activo o más activo. Se conocen en la técnica varios procedimientos para obtener proteínas heterólogas plegadas correctamente a partir de cuerpos de inclusión bacterianos. Estos procedimientos implican generalmente solubilizar la proteína a partir de los cuerpos de inclusión, desnaturalizando después completamente la proteína usando un agente caotrópico. Cuando los residuos de cisteína están presentes en la secuencia de aminoácidos primaria de la proteína, a menudo es necesario llevar a cabo el replegado en un entorno que permita la formación correcta de los enlaces disulfuro (un sistema redox). Los procedimientos generales de replegado se describen en Kohno, Meth. Enzym., 185:187-195 (1990). El documento EP 0433225 y la solicitud en trámite junto con el presente documento de EE.UU. con n°. de serie 08/163.877 describen otros procedimientos apropiados.

También se puede expresar una proteína o proteína de fusión como un producto de animales transgénicos, por ejemplo, como un componente de la leche de vacas, cabras, cerdos u ovejas transgénicas que se caracterizan por células somáticas o germinales que contienen una secuencia de polinucleótidos que codifica la proteína o proteína de fusión.

Se puede preparar la proteína o proteína de fusión cultivando células huésped transformadas de un cultivo bajo condiciones de cultivo necesarias para expresar la proteína deseada. Después se puede purificar la proteína expresada resultante a partir del medio de cultivo o de los extractos celulares. Se pueden purificar las formas solubles de la proteína o proteína de fusión a partir de medios condicionados. En ciertas realizaciones, se pueden purificar las formas unidas a membrana de proteína preparando una fracción de membrana total a partir de la célula que está expresando y extrayendo las membranas con un detergente no iónico tal como Tritón X-100.

En ciertas realizaciones, se puede purificar la proteína usando procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, y sin limitación, se puede concentrar la proteína usando un filtro de concentración de proteína comercialmente disponible, incluyendo, pero sin limitarse a, una unidad de ultrafiltracion Amicon o Millipore Pellicon. Después de la etapa de concentración, se puede aplicar el concentrado a una matriz de purificación tal como un medio de filtración de gel. Alternativamente, se puede emplear una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o sustrato que tenga grupos dietilaminoetilo (DEAE) o polietilenoimina (PEI) laterales. Las matrices pueden ser acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos empleados comúnmente en la purificación de proteínas. Alternativamente, se puede emplear una etapa de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen varias matrices insolubles que comprenden grupos sulfopropilo o carboximetilo. En ciertas realizaciones, se prefieren los grupos sulfopropilo (por ejemplo, columnas de S-Sepharose ®). La purificación de la proteína o proteína de fusión a partir de sobrenadante de cultivo también puede incluir una o más etapas de columna sobre resinas de afinidad tales como concanavalina A-agarosa, heparina-toyopearl® o azul cibacron 3GA-Sepharose®; o mediante cromatografía de interacción hidrófoba usando resinas tales como éter fenílico, éter butílico o éter propílico, o mediante cromatografía de inmunoafinidad. Finalmente, para purificar adicionalmente la proteína, se pueden emplear una o más etapas de cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) que emplean medios de RP-HPLC hidrófobos, por ejemplo, gel de sílice que tiene metilo u otros grupos alifáticos laterales. También se pueden usar columnas de afinidad que incluyen anticuerpos para la proteína en la purificación de acuerdo con procedimientos conocidos. También se pueden emplear algunas o todas de las siguientes etapas de purificación, en varias combinaciones o con otros procedimientos adecuados, para proporcionar una proteína recombinante aislada sustancialmente purificada. Preferiblemente, la proteína aislada se purifica de tal forma que está sustancialmente libre de otras proteínas de mamíferos.

También se pueden producir polipéptidos mediante síntesis química convencional conocida. Los procedimientos para construir proteínas mediante medios sintéticos son conocidos por los expertos en la técnica. Las secuencias de proteínas construidas sintéticamente, en virtud de que comparten características estructurales y/o conformacionales primarias, secundarias o terciarias con proteínas pueden poseer propiedades biológicas en común con las mismas, incluyendo la actividad proteica. Por tanto, se pueden emplear como sustitutos inmunológicos o biológicamente activos para proteínas purificadas, naturales, en el rastreo de compuestos terapéuticos y en procedimientos inmunológicos para el desarrollo de anticuerpos.

Los anticuerpos, también conocidos como inmunoglobulinas, son proteínas glucosiladas típicamente tetraméricas compuestas de dos cadenas ligeras (L) de aproximadamente 25 kDa cada una y de dos cadenas pesadas (H) de aproximadamente 50 kDa cada una. En los anticuerpos se pueden encontrar dos tipos de cadenas ligeras, denominadas lambda y kappa. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de las cadenas pesadas, se pueden asignar las inmunoglobulinas a cinco clases principales: A, D, E, G y M, y varias de éstas se pueden dividir además en subclases (isotipos), por ejemplo IgGi, lgG2, lgG3, lgG4, IgAi e lgA2. Cada cadena ligera incluye un dominio variable (V) N-terminal (VL) y un dominio constante (C) (CL). Cada cadena pesada incluye un dominio variable (V) N-terminal (VH), tres o cuatro dominios C (CH). El dominio CH más próximo al VH se designa como CH1. Los dominios VH y VL constan de cuatro regiones de secuencias relativamente conservadas denominadas regiones marco conservadas (FR1 , FR2, FR3 y FR4), que forman un armazón para tres regiones de secuencias hipervariables (regiones determinantes de complementariedad, CDR). Las CDR contienen la mayoría de los residuos responsables de las interacciones específicas del anticuerpo con el antígeno. Las CDR se conocen como CDR1 , CDR2 y CDR3. Por consiguiente, los constituyentes de las CDR en la cadena pesada se conocen como H1 , H2 y H3, mientras que los constituyentes de las CDR en la cadena ligera se conocen como L1 , L2 y L3.

La CDR3 es típicamente la mayor fuente de diversidad molecular dentro del sitio de unión a anticuerpo. H3, por ejemplo, puede ser tan corto como de dos residuos aminoácidos o mayor de 26 aminoácidos. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien en la técnica. Para una recapitulación de la estructura de los anticuerpos, véase Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, eds. Harlow et al., 1988. Un experto en la técnica admitirá que cada estructura de la subunidad, por ejemplo, una estructura de CH, VH, CL, VL, CDR, FR comprende fragmentos activos, por ejemplo, la parte de la subunidad de VH, VL o CDR que se une al antígeno, es decir, el fragmento de unión a antígeno o, por ejemplo, la parte de la subunidad de CH que se une a y/o activa, por ejemplo, un complemento y/o un receptor de Fe. Las CDR se refieren típicamente a las CDR de Kabat, tal como se describe en Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991 ), eds. Kabat et al. Otro estándar para caracterizar el sitio de unión a antígeno es referirse a los bucles hipervariables tal como se describe por Chothia. Véanse, por ejemplo, Chothia, D. et al. (1992; J. Mol. Biol. 227:799-817; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J, 14:4628-4638. Aún otro estándar es la definición de AbM usada por el software de modelización de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Véase, en general, por ejemplo, Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. En: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S. y Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). Se pueden implementar alternativamente realizaciones descritas con respecto a las CDR de Kabat usando relaciones descritas similares con respecto a los bucles hipervariables de Chothia o a los bucles definidos de AbM.

El fragmento Fab (fragmento de unión a antígeno) consta de dominios VHCHI y VLCL unidos covalentemente mediante un enlace disulfuro entre regiones constantes. El fragmento Fv es más pequeño y consta de dominios VH y VL unidos no covalentemente. Para solucionar la tendencia de los dominios unidos no covalentemente a disociarse, se puede construir un fragmento de Fv de cadena sencilla (scFv). El scFv contiene un polipéptido flexible que une (1) el extremo C de VH al extremo N de VL, o (2) el extremo C de VL al extremo N de VH. Se puede usar un péptido 15-mero (Gly4Ser)3 como engarce, aunque se conocen otros engarces en la técnica.

La secuencia de genes de anticuerpo después del ensamblaje y de la mutación somática es altamente variada y se estima que estos genes variados codifican 1010 moléculas de anticuerpo diferentes (Immunoglobulin Genes, 2a ed., eds. Jonio et al., Academic Press, San Diego, CA, 1995).

Están disponibles numerosos procedimientos conocidos por los expertos en la técnica para la obtención de anticuerpos o de fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos usando procedimientos de ADN recombinante (patente de los EE.UU. 4.816.567). También se pueden producir anticuerpos mediante generación de hibridomas {véase por ejemplo, Kohler y Milstein (1975) Nature, 256: 495499) de acuerdo con procedimientos conocidos. Después se rastrean los hibridomas formados de esta manera usando métodos estándar, tales como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) el análisis de resonancia de plasmón superficial (BIACORE™), para identificar uno o más hibridomas que producen un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno específico. Se puede usar cualquier forma del antígeno específico como inmunogen, por ejemplo, antigen recombinante, formas naturales, cualquier variante o fragmento de los mismos, así como un péptido antigénico de los mismos.

Un procedimiento ejemplar de preparar anticuerpos incluye el rastreo de bibliotecas de expresión de proteínas, por ejemplo, bibliotecas de presentación de ribosomas o fagos. La presentación de fagos se describe, por ejemplo, en Ladner et al., patente de los EE.UU. N°. 5.223.409; Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson et al. (1991 ) Nature, 352: 624628; Marks et al. (1991 ) J. Mol. Biol., 222: 581597; los documentos WO 92/18619; WO 91/17271 ; WO 92/20791 ; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690 y WO 90/02809.

Además del uso de bibliotecas de presentación, se puede usar el antígeno especificado para inmunizar un animal no humano, por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, ratón, hámster, rata, mono, camello, llama, pez, tiburón, cabra, ratón y bovino. En ciertas realizaciones, los animales no humanos incluyen al menos una parte de un gen de inmunoglobulina humano. Por ejemplo, es posible diseñar cepas de ratón deficientes en la producción de anticuerpo de ratón con grandes fragmentos de locus de Ig humano. Usando la tecnología de hibridoma, se pueden producir y seleccionar anticuerpos monoclonales específicos de antígeno derivados de los genes con la especificidad deseada. Véase, por ejemplo., XENOMOUSE™, Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21 , los documentos US 2003-0070185, WO 96/34096, publicado el 31 de octubre de 1996 y la solicitud PCT N°.

PCT/US96/05928, presentada el 29 de abril de 1996.

En ciertas realizaciones, se obtiene un anticuerpo monoclonal a partir de un animal no humano, por ejemplo, incluyendo, pero sin limitarse a, ratón, hámster, rata, mono, camello, llama, pez, tiburón, cabra, ratón y bovino y después se modifica, por ejemplo, humanizado o desinmunizado. En ciertas realizaciones, se pueden producir los anticuerpos quiméricos usando técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica. Se han descrito una variedad de aproximaciones para la preparación de anticuerpos quiméricos. Véase por ejemplo, Morrison er a/., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 81 :6851 , 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985, Cabilly et al., patente de los EE.UU. N° 4.816.567; Boss et al., patentes de los EE.UU. N°. 4.816.397; Tanaguchi er a/., publicación de patente europea EP171496; publicación de patente europea 0173494, patente del Reino Unido GB 2177096B. También se pueden producir anticuerpos humanizados, por ejemplo, usando ratones transgénicos que expresan genes de cadena ligera y pesada humanos, pero son incapaces de expresar los genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina de ratón endógena. Winter describe un procedimiento para injertar CDR ejemplar que se puede usar para preparar los anticuerpos humanizados descritos en el presente documento (patente de los EE.UU. N°. 5.225.539). Se pueden reemplazar todas las CDR de un anticuerpo humano particular con al menos una parte de una CDR no humana o sólo se pueden reemplazar alguna de las CDR con CDR no humanas. Sólo es necesario reemplazar el número de CDR requeridas para la unión del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado.

Se pueden generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos reemplazando secuencias de dominio variable de Fv que no estén implicadas directamente en la unión a antígeno con secuencias equivalentes de dominios variables de Fv humano. Se proporcionan procedimientos ejemplares para generar anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos en Morrison (1985) Science 229:1202-1207; en Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; y en los documentos US 5,585,089; US 5,693,761 ; US 5,693,762; US 5,859,205; y US 6,407,213. Esos procedimientos incluyen aislar, manipular y expresar las secuencias de ácidos nucleicos que codifican todas o parte de los dominios variables Fv de inmunoglobulinas de al menos una de una cadena ligera o pesada. Se pueden obtener tales ácidos nucleicos a partir de un hibridoma que produzca un anticuerpo frente a una diana predeterminada, tal como se describió anteriormente, así como a partir de otras fuentes. Después se puede clonar el ADN recombinante que codifica la molécula de anticuerpo humanizado dentro de un vector de expresión apropiado.

En ciertas realizaciones, se optimiza un anticuerpo humanizado mediante la introducción de sustituciones conservadoras, sustituciones de secuencia de consenso, sustituciones de línea germinal y/o retromutación. Se pueden preparar moléculas de inmunoglobulina alterada mediante cualquiera de las diversas técnicas conocidas en la técnica, (por ejemplo, Teng et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 80: 7308-7312, 1983; Kozbor et al., Immunology Today, 4: 7279, 1983; Olsson et al., Meth. Enzymol., 92: 3-16, 1982), y se pueden preparar de acuerdo con las enseñanzas de la publicación PCT Publication WO92/06193 o del documento EP 0239400).

También se puede modificar un anticuerpo o fragmento del mismo mediante la deleción específica de epítopos de linfocitos T humanos o la "desinmunización" mediante los procedimientos descritos en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Brevemente, se pueden analizar los dominio variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo para determinar los péptidos que se unen al MHC de clase II; estos péptidos representan epítopos de células T potenciales (tal como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de epítopos de linfocitos T potenciales, se puede aplicar una estrategia a la modelización por ordenador denominada "enroscado de péptidos", y además se puede buscar una base de datos de péptidos de unión a MHC de clase II humanos para determinar motivos presentes en las secuencias de VH y V|_, tal como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos principales de DR de MHC de clase II, y por tanto constituyen epítopos de células T potenciales. Se pueden eliminar los epítopos de células T potenciales detectados sustituyendo pequeños números de residuos de aminoácidos en los dominios variables, o preferiblemente, mediante sustituciones de aminoácidos sencillas. Típicamente, se realizan sustituciones conservadoras. A menudo, pero no exclusivamente, se puede usar un aminoácido común a una posición en las secuencias de anticuerpo de línea germinal humanas. Se describen las secuencias de línea germinal humanas, por ejemplo, en Tomlinson, et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today Vol. 16 (5): 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817; y Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638. El directorio de V BASE proporciona un directorio extenso de secuencias de regiones variables de inmunoglobulina humana (recopiladas por Tomlinson, I.A. et al. MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, R.U.). Se pueden usar estas secuencias como uná fuente de secuencia humana, por ejemplo, para CDR y regiones marco conservadas. También se pueden usar regiones marco conservadas humanas de consenso, por ejemplo, tal como se describe en la patente de los EE.UU. N°. 6.300.064.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo puede contener una región Fe o constante de inmunoglobulina alterada. Por ejemplo, una anticuerpo producido de acurdo con las enseñanzas del presente documento se puede unir más fuertemente o con más especificidad a moléculas efectoras tales como receptores de Fe y/o de complemento, que pueden controlar varias funciones inmunitarias del anticuerpo tales como actividad de células efectoras, lisis, actividad mediada por complemento, aclaración del anticuerpo y tiempo de vida media del anticuerpo. Los receptores de Fe típicos que se unen a una región de un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo de IgG) incluyen, pero no se limitan a, receptores de las subclases FcRn y FcyRI, FcyRIl y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y alternativamente formas ayustadas de estos receptores. Los receptores de Fe se recapitulan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92, 1991 ; Capel et al. , Immunomethods 4:25-34,1994; y de Haas et ai, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 , 1995).

Para técnicas de producción de anticuerpos adicionales, véase Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Un anticuerpo bifuncional o biespecífico es un anticuerpo híbrido artificial que tiene dos pares de cadenas ligeras/pesadas diferentes y dos sitios de unión diferentes. Se pueden producir anticuerpos biespecíficos mediante una variedad de procedimientos incluyendo la fusión de hibridomas o la unión de fragmentos Fab. Véase, por ejemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992). En ciertas realizaciones, el anticuerpo biespecífico comprende un primer polipéptido de dominio de unión, tal como un fragmento Fab', unido por medio de una región constante de inmunoglobulina a un segundo polipéptido de dominio de unión.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser anticuerpos de dominio sencillo. Los anticuerpos de dominio sencillo pueden incluir anticuerpos con regiones determinantes complementarias que son parte de un polipéptido de dominio sencillo. Ejemplos incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos de cadena pesada, anticuerpos desprovistos de manera natural de cadenas ligeras, anticuerpos de dominio sencillo derivados de anticuerpos de 4 cadenas convencionales, anticuerpos diseñados y armazones de dominio sencillo distintos de los derivados de anticuerpos. Los anticuerpos de dominio sencillo pueden ser cualesquiera de la técnica, o cualquiera de los anticuerpos de dominio sencillo futuros. Los anticuerpos de dominio sencillo se pueden derivar de cualquier especie incluyendo, pero sin limitarse a ratón, humano, camello, llama, pez, tiburón, cabra, conejo y bovino. En un aspecto de la invención, un anticuerpo de dominio sencillo se puede derivar de una región variable de la inmunoglobulina encontrada en peces, tales como, por ejemplo, la que se deriva del isotipo de inmunoglobulina conocida como receptor de antígeno novedoso (NAR) encontrada en el suero del tiburón. Los procedimientos de producción de anticuerpos de dominio sencillo derivados de una región variable de NAR ("IgNAR") se describen en el documento WO 03/014161 y Streltsov (2005) Protein Sci. 14:2901-2909.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, un anticuerpo de dominio sencillo es un anticuerpo de dominio sencillo natural conocido como anticuerpo de cadena pesada desprovisto de cadenas ligeras. Tales anticuerpos de dominio sencillo se describen en el documento WO 9404678, por ejemplo. Por razones de claridad, este dominio variable derivado de un anticuerpo de cadena pesada desprovisto de manera natural de cadena ligera se conoce en el presente documento como un VHH o nanocuerpo para distinguirlo del VH convencional de inmunoglobulinas de cuatro cadenas. Una molécula de VHH de este tipo se puede derivar de anticuerpos obtenidos de la especie de los camélidos, por ejemplo, camello, llama, dromedario, alpaca y guanaco. Otras especies aparte de los camélidos pueden producir anticuerpos de cadena pesada desprovistos de manera natural de cadena ligera; tales VHH están dentro del alcance de la invención.

La invención también contempla el uso de proteínas de fusión de dominio de unión de inmunoglobulina incluyendo un polipéptido de dominio de unión que está fusionado, o bien conectado, a un polipéptido de región bisagra o que actúa como bisagra de inmunoglobulina, que a su vez está fusionado, o bien conectado, a una región que comprende una o más regiones constantes diseñadas o nativas de una cadena pesada de inmunoglobulina, diferente de CH1 , por ejemplo, las regiones CH2 y CH3 de IgG e IgA, o las regiones CH3 y CH4 de IgE {véase por ejemplo, el documento U.S. 2005/0136049 de Ledbetter, J. et al. para una descripción más completa). La proteína de fusión de dominio de unión de inmunoglobulina puede incluir además una región que incluye un polipéptido de región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina diseñado o nativo (o CH3 en el caso de un constructo derivado en su totalidad o en parte de IgE) que está fusionado, o bien conectado, al polipéptido de región bisagra y un polipéptido de región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina diseñado o nativo (o CH4 en el caso de un constructo derivado en su totalidad o en parte de IgE) que está fusionado, o bien conectado, al polipéptido de región constante CH2 (o CH3 en el caso de un constructo derivado en su totalidad o en parte de IgE). Típicamente, tales proteínas de fusión de dominio de unión de inmunoglobulinas son capaces de al menos una actividad inmunológica seleccionada del grupo que consta de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos, fijación de complemento y/o unión a una diana, por ejemplo, un antígeno diana.

En ciertas realizaciones, se proporcionan proteínas terapéuticas, es decir, una proteína o un péptido que tiene un efecto biológico sobre una región en el cuerpo sobre el que actúa o sobre una región del cuerpo en la que actúa remotamente por medio de intermedios, y un procedimiento de diseño y de preparación de estas proteínas terapéuticas. Las proteínas terapéuticas de la presente invención pueden incluir miméticos de péptidos. Los miméticos son moléculas que contienen péptidos que imitan elementos de la estructura secundaria de la proteína. Véase, por ejemplo, Johnson et al., "Peptide Turn Mimetics" en BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY, Pezzuto et ai, Eds., Chapman y Hall, Nueva York (1993), incorporado en el presente documento por referencia. El fundamento que subyace tras el uso de miméticos de péptidos es que el esqueleto peptídico de las proteínas existe principalmente para orientar las cadenas laterales de aminoácidos de modo que faciliten las interacciones moleculares, tales como las de anticuerpo y antígeno. Se espera que un mimético de péptido permita interacciones moleculares similares a la molécula natural. Junto con la información proporcionada por la presente invención, estos principios se pueden usar para diseñar moléculas de segunda generación que tienen muchas de las propiedades naturales de los péptidos dirigidos descritos en el presente documento. Estas moléculas de segunda generación también se pueden alterar y proporcionar características potencialmente mejoradas. Usando la presente invención, se pueden diseñar productos terapéuticos tanto de proteínas como de moléculas pequeñas para interrumpir la actividad de citocina deseada, por ejemplo, diseñándose específicamente para unirse a las posiciones deseadas, es decir, a las posiciones de aminoácidos que se ha demostrado que son importantes para un complejo de unión, y por lo tanto inhibiendo o reduciendo de manera efectiva la actividad asociada con la citocina y su receptor o complejo de receptores.

Otras realizaciones de proteínas terapéuticas incluyen proteínas de fusión. Estas moléculas generalmente tienen todo o una parte sustancial de un péptido dirigido, por ejemplo, IL-22 o un anticuerpo anti-IL-22, unido en el extremo N o en el C, a toda o a una parte de una segunda proteína o un segundo polipéptido. Por ejemplo, las fusiones pueden emplear secuencias líder de otras especies para permitir la expresión recombinante de una proteína en un huésped heterólogo. Otra fusión útil incluye la adición de un dominio inmunológicamente activo, tal como un epítopo de anticuerpo, para facilitar la purificación de la proteína de fusión. La inclusión de un sitio de escisión en o cerca de la unión de la fusión facilitará la retirada del polipéptido extraño después de la purificación. Otras fusiones útiles incluyen la unión de dominios funcionales, tales como sitios activos de enzimas, dominios de glucosilación, señales dirigidas a células o regiones transmembrana. Ejemplos de proteínas o péptidos que se pueden incorporar en una proteína de fusión incluyen proteínas citostáticas, proteínas citocidas, agentes de proapoptosis, agentes anti-angiogénicos, hormonas, citocinas, factores de crecimiento, fármacos peptídicos, anticuerpos, fragmentos Fab de anticuerpos, antígenos, proteínas de receptores, enzimas, lectinas, proteínas de MHC, proteínas de adhesión celular y proteínas de unión. Los procedimientos de generación de proteínas de fusión son bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales proteínas se pueden producir, por ejemplo, mediante el acoplamiento químico usando reactivos de reticulación bifuncionales, mediante síntesis de novo de la proteína de fusión completa o mediante el acoplamiento de una secuencia de ADN que codifica el péptido dirigido con una secuencia de ADN que codifica el segundo péptido o la segunda proteína, seguido de la expresión de la proteína de fusión intacta.

En ciertas realizaciones, el péptido dirigido, por ejemplo, IL-22 o un anticuerpo anti-IL-22, está fusionado con una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, tal como un fragmento de Fe, que contiene dos dominios de región constante y una región bisagra pero carece de región variable (véase, las patentes de los EE.UU. N-. 6.018.026 y 5.750.375, incorporadas en el presente documento por referencia). La región Fe puede ser una región de Fe natural, o se puede alterar para mejorar ciertas cualidades, tales como cualidades terapéuticas, tiempo de circulación, agregación reducida, etc. Los péptidos y las proteínas fusionadas a una región Fe típicamente muestran una tiempo de vida media mayor in vivo que el homólogo no fusionado. Además, una fusión a una región Fe permite la dimerización/multimerización del polipéptido de fusión.

En ciertas realizaciones, se usa la mutagénesis para hacer que un anticuerpo sea más similar a una o más secuencias de línea germinal. Esto puede ser deseable cuando se introducen mutaciones en la región marco conservada de un anticuerpo a través de mutagénesis somática o a través de PCR propensa a errores. Se pueden identificar secuencias de línea germinal para los dominios VH y VL realizando alineamientos de secuencias de ácidos nucleicos y de aminoácidos frente a la base de datos VBASE (MRC Center for Protein Engineering, R.U.). VBASE es un directorio extenso de todas las secuencias variables de línea germinal humana recopiladas a partir de más de mil secuencias publicadas, incluyendo las secuencias de las actuales publicaciones de las bibliotecas de datos Genbank y EMBL. En algunas realizaciones, se mutan las regiones de FR de los scFv de conformidad con las coincidencias más próximas en la base de datos VBASE y se mantienen intactas las partes de la CDR.

Usando metodología de ADN recombinante, se puede introducir una secuencia de CDR descrita en un repertorio de dominios VH O Vl carentes de la CDR respectiva (Marks et al. (BioTechnology (1992) 10: 779783). Por ejemplo, se pueden usar un cebador adyacente al extremo 5' del dominio variable y un cebador al tercer FR para generar un repertorio de secuencias de dominio variable carentes de CDR3. Este repertorio se puede combinar con una CDR3 de un anticuerpo descrito. Usando técnicas análogas, se pueden reordenar las partes de una secuencia de CDR descrita con partes de secuencias de CDR de otros anticuerpos para proporcionar un repertorio de fragmentos de unión a antígeno que se unen a IL-22. Se puede expresar cualquier repertorio en un sistema de huésped tal como presentación de fagos (descrito en el documento WO 92/01047 y en su correspondiente patente de los EE.UU. N°. 5.969.108) de modo que se pueden seleccionar fragmentos de unión a antígeno que se unan a IL-22.

Una alternativa adicional usa mutagénesis aleatoria de las secuencias de VH O Vl descritas para generar dominios VH o VL variantes capaces aún de unirse a IL-22. Una técnica que usa PCR propensa a error se describe en Gram et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. (1992) 89: 35763580).

Otro procedimiento usa mitagénesis directa de las secuencias de VH o V|_ descritas. Tales técnicas se describen en Barbas et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. (1994) 91 : 38093813) y Schier et al. (J. Mol. Biol. (1996) 263: 551567).

Una parte de un dominio variable comprenderá al menos una región CDR sustancialmente tal como se menciona en el presente documento y, opcionalmente, regiones marco conservadas interpuestas de los dominios VH O VL tal como se menciona en el presente documento. La parte puede incluir la mitad C-terminal de FR1 y/o la mitad N-terminal de FR4. Puede que los residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal del dominio variable no sean los mismos residuos encontrados en anticuerpos naturales. Por ejemplo, la construcción de anticuerpos mediante técnicas de ADN recombinante a menudo introduce residuos N o C-terminales de su uso de engarces. Se pueden usar algunos engarces para juntar dominios variables con otros dominios variables (por ejemplo, diacuerpos), dominios constantes o marcadores proteínicos.

Se pueden modificar los anticuerpos para alterar su glucosilación; esto es, al menos un resto de carbohidrato se puede eliminar o añadir al anticuerpo. Se puede llevar a cabo la deleción o adición de sitios de glucosilación cambiando la secuencia de aminoácidos para eliminar o crear sitios de consenso de glucosilación, que se conocen bien en la técnica. Otros medios para añadir restos de carbohidratos es el acoplamiento químico o enzimático de glucósidos a residuos aminoácidos del anticuerpo (véase el documento WO 87/05330 y Aplin ef al. (1981) CRC Crít. Rev. Biochem., 22: 259306). Se puede llevar a cabo la eliminación de restos de carbohidratos química o enzimáticamente (véase Hakimuddin ef al. (1987) Arch. Biochem. Biophys., 259: 52; Edge et al. (1981 ) Anal. Biochem., 1 18: 131 ; Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol., 138: 350).

Los procedimientos para alterar una región constante de anticuerpo se conocen en la técnica. Los anticuerpos con función alterada (por ejemplo, afinidad alterada por un ligando efector, tal como FcR en una célula, o el componente C1 del complemento) se puede producir reemplazando al menos un residuo de aminoácido en la parte constante del anticuerpo por un residuo diferente (véanse por ejemplo, los documentos EP 388.151 A1 , US 5.624.821 y US 5.648.260). Se podrían describir tipos de alteraciones similares que si se aplican al anticuerpo murino o de otra especie, reducirían o eliminarían funciones similares.

Por ejemplo, es posible alterar la afinidad de una región Fe de un anticuerpo (por ejemplo, una IgG, tal como una IgG humana) para FcR (por ejemplo, Fe de gamma R1 ) o C1q. Se puede alterar la afinidad reemplazando al menos un residuo específico con el menos un residuo que tenga una funcionalidad apropiada en su cadena lateral o introduciendo un grupo funcional cargado, tal como glutamato o aspartado, o quizás un residuo no polar aromático tal como fenilalanina, tirosina, triptofano o alanina (véase por ejemplo, el documento US 5.624.821).

En otro ejemplo, el reemplazo del residuo 297 (asparagina) con alanina en la región constante de IgG inhibe significativamente el reclutamiento de células efectoras, aunque sólo se reduce ligeramente (aproximadamente tres veces más débil) la afinidad para CIq (véase por ejemplo, el documento US 5.624.821 ). La numeración de los residuos en la cadena pesada es el del índice EU (véase Kabat et al., 1991 anteriormente). Esta alteración destruye el sitio de glucosilación y se cree que se requiere la presencia de carbohidrato para la unión de receptor de Fe. Se cree que cualquier otra sustitución en este sitio que destruya el sitio de glucosilación provoca una disminución similar en la actividad lítica. También se conoce que otras sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, el cambio de uno cualquiera de los residuos 318 (Glu), 320 (Lys) y 322 (Lys), por Ala, abóle la unión de CIq a la región Fe de anticuerpos de IgG (véase por ejemplo, el documento US 5.624.821 ).

Se pueden producir anticuerpos modificados que tiene una interacción reducida con una receptor de Fe. Por ejemplo, se ha mostrado que en lgG3 humana, que se une al receptor de gamma R1 de Fe, el cambio de Leu 235 por Glu destruye su interacción con el receptor. También se pueden usar mutaciones en sitios adyacentes o cercanos en la región de unión de bisagra de un anticuerpo (por ejemplo, el reemplazo de los residuos 234, 236 o 237 con Ala) para afectar la afinidad del anticuerpo por el receptor de gamma R1 de Fe. La numeración de los residuos en la cadena pesada se basa en el índice EU (véase Kabat et al., 1991 anteriormente).

Procedimientos adicionales para alterar la actividad lítica de un anticuerpo, por ejemplo, alterando al menos un aminoácido en la región N-terminal del dominio CH2, se describen en los documentos WO 94/29351 de Morgan et al. y US 5,624,821.

En ciertas realización, los anticuerpos se pueden marcar con un marcador funcional o detectable. Estos marcadores incluyen radiomarcadores (por ejemplo, 1311 o 99Tc), marcadores enzimáticos (por ejemplo, peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina), y otros restos químicos (por ejemplo, biotina).

En ciertas realizaciones, los antagonistas de IL-22 son anticuerpos, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno de los mismos) que se unen a IL-22 de mamífero (por ejemplo, humana o murina). En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-IL22 o el fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Fv de cadena simple) es un anticuerpo monoclonal o de especificidad única. El anticuerpo o fragmento del mismo también puede ser un anticuerpo humano, humanizado, quimérico, o generado in vitro frente a la IL-22 humana.

En ciertas realizaciones, los antagonistas de IL-1 F6 son anticuerpos, o fragmentos de los mismos {por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno del mismo), que se unen a IL-1 F6 de mamífero (por ejemplo, humana o murina). En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-IL-1 F6 o fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Fv de cadena simple) es un anticuerpo monoclonal o de especificidad única. El anticuerpo o fragmento del mismo también puede ser un anticuerpo humano, humanizado, quimérico, o generado in vitro frente a la IL-1 F6 humana.

En ciertas realizaciones, los antagonistas de IL-1 F8 son anticuerpos, o fragmentos de los mismos {por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno del mismo), que se unen a IL-1 F8 de mamífero (por ejemplo, humana o murina). En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-IL-1 F8 o fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Fv de cadena simple) es un anticuerpo monoclonal o de especificidad única. El anticuerpo o fragmento del mismo también puede ser un anticuerpo humano, humanizado, quimérico, o generado in vitro frente a la IL-1 F8 humana.

En ciertas realizaciones, los antagonistas de IL-1 F9 son anticuerpos, o fragmentos de los mismos {por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno del mismo), que se unen a IL-1 F9 de mamífero (por ejemplo, humana o murina). En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-IL- F9 o fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Fv de cadena simple) es un anticuerpo monoclonal o de especificidad única. El anticuerpo o fragmento del mismo también puede ser un anticuerpo humano, humanizado, quimérico, o generado in vitro frente a la IL-1 F9 humana.

En ciertas realizaciones, los antagonistas de IL-1 Rrp2 son anticuerpos, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno del mismo), que se unen a IL-1 Rrp2 de mamífero (por ejemplo, humana o murina). En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-IL-1 Rrp2 o fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Fv de cadena simple) es un anticuerpo monoclonal o de especificidad única. El anticuerpo o fragmento del mismo también puede ser un anticuerpo humano, humanizado, quimérico, o generado ¡n vitro frente a la IL-1 Rrp2 humana.

En ciertas realizaciones, los antagonistas de IL-17A son anticuerpos, o fragmentos de los mismos {por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno del mismo), que se unen a IL-17A de mamífero (por ejemplo, humana o murina). En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-IL-17A o fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Fv de cadena simple) es un anticuerpo monoclonal o de especificidad única. El anticuerpo o fragmento del mismo puede ser también un anticuerpo humano, humanizado, quimérico, o generado in vitro contra la IL-17A humana.

En ciertas realizaciones, los antagonistas de TNFa son anticuerpos, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno del mismo), que se unen a TNFa de mamífero (por ejemplo, humana o murina). En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-TNFa o fragmento del mismo (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2, Fv o Fv de cadena simple) es un anticuerpo monoclonal o de especificidad única. El anticuerpo o fragmento del mismo también puede ser un anticuerpo humano, humanizado, quimérico, o generado in vitro frente a la TNFa humana.

Ejemplos de antagonistas de TNFa incluyen anticuerpos para TNF (por ejemplo, TNFa humano), tales como D2E7 (anticuerpo anti-TNFa humano, documento U.S. 6.258.562, Humira™, BASF); CDP-571/CDP-870/BAY-10-3356 (anticuerpos anti-TNFa humanizados, Celltech/Pharmacia); cA2 (anticuerpo anti-TNFa quimérico, Remicade™, Centocor); y fragmentos de anticuerpos anti-TNF (por ejemplo, CPD870). Otros ejemplos incluyen fragmentos de receptor de TNF soluble (por ejemplo, p55 o p75 humano) y derivados, tales como p55 kdTNFR-lgG (proteína de fusión de IgG-receptor de TNF de 55 kD, Lenercept™) y 75 kdTNFR-lgG (proteína de fusión de IgG-receptor de TNF de 75 kD, Enbrel™, Immunex, véase, por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A). Ejemplos adicionales incluyen antagonistas de enzima (por ejemplo, inhibidores de enzima convertidora de TNFa (TACE) tales como derivado de ácido alfa-sulfonil-hidroxámico (documento WO 01/55112) o inhibidor de N-hidroxiformamida (GW 3333, -005, o -022)) y TNF-bp/s-TNFR (proteína de unión a TNF soluble TNF, véase por ejemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, N°. 9 (suplemento), S284; y Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. (1995) Vol. 268, páginas 37-42). Los antagonistas de TNF pueden ser fragmentos de receptor de TNF solubles (por ejemplo, p55 o p75 humano) y derivados, tales como 75 kdTNFR-lgG e inhibidores de enzima convertidora de TNFa (TACE).

La producción de anticuerpos anti-IL-22 se describe con más detalle en las solicitudes de patente publicadas de los EE.UU. N— . 2005-0042220 y 2007-0243589. Un ejemplo no limitativo de un anticuerpo anti-IL22 que interfiere con la unión de IL-22 a IL-22R se conoce como "Ab-04" o "IL22-04" en la solicitud de patente publicada de los EE.UU. N°. 2005-0042220. Ab-04 (en el presente documento también se conoce como anticuerpo monoclonal de rata "P3/2") se une a la IL-22 humana y neutraliza la actividad de IL-22 humana. Una línea celular de hibridoma que produce Ab-04 se ha registrado en la ATCC el 5 de junio de 2003 y se le ha asignado el número de acceso de ATCC PTA-5255. Otro ejemplo no limitativo de un anticuerpo anti-IL22 que interfiere con unión de IL-22 a IL-10R2 es "Ab-02"o "IL22-02". Ab-02 (en el presente documento también se conoce como anticuerpo monoclonal de rata "P3/3") se une a IL-22 humana y de ratón y neutraliza la actividad de IL-22 humana y de ratón. Una línea celular de hibridoma que produce Ab-02 se ha depositado el 5 de junio de 2003 en la ATCC y se le ha asignado el número de acceso de ATCC PTA-5254. Ejemplos adicionales of anticuerpos de IL-22 que reducen, inhiben o antagonizan la actividad de IL-22 se encuentran en la solicitud de patente publicada de los EE.UU. No. 2007-0243589, que describe anticuerpos de línea germinal identificados como GIL01 , GIL16, GIL45, GIL60, GIL68, GIL92, 062A09, 087B03, 166B06, 166G05, 354A08, 355B06, 355E04, 356A11 y 368D04.

También se pueden usar anticuerpos para detectar la presencia de una o más moléculas, tales como, pero sin limitarse a, IL-22, IL-1F6, IL- 1 F8, IL-1 F9 e IL-17A, en muestras biológicas. Correlacionando la presencia o el nivel de estas proteínas con una afección médica, un experto en la técnica puede diagnosticar la afección médica asociada. Por ejemplo, IL-22 induce cambios asociados con los causados por citocinas inflamatorias (tales como IL-1 y TNFOa), y los inhibidores de IL-22 mejoran los síntomas de artritis reumatoide (documento WO 2005/000897 A2). Afecciones médicas ejemplares que se pueden diagnosticar por los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, psoriasis, lupus, enfermedad inflamatoria intestinal, pancreatitis, y rechazo de trasplante.

Ciertos procedimientos descritos en esta solicitud utilizan composiciones adecuadas para su uso farmacéutico y la administración a pacientes. Estas composiciones comprenden un excipiente farmacéutico y uno o más anticuerpos, uno o más receptores solubles, una o más proteínas de unión o combinaciones de estos anticuerpos, receptores solubles y/o estas proteínas de unión. Tal como se usa en el presente documento, "excipiente farmacéutico" incluye disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, etc., que sean compatibles con la administración farmacéutica. El uso de estos agentes como sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Las composiciones también pueden contener otros compuestos activos que proporcionen funciones terapéuticas complementarias, adicionales o potenciadas. Las composiciones farmacéuticas también se pueden incluir en un recipiente, un envase o un dispensador junto con instrucciones de administración.

Una composición farmacéutica se puede formular para que sea compatible con la vía de administración que se pretenda. Los procedimientos para llevar a cabo la administración son conocidos para los expertos en la técnica. También es posible crear composiciones que se puedan administrar tópica u oralmente, que se sean capaces de la transmisión a través de las membranas mucosas. Por ejemplo, la administración puede ser intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intracavidad, subcutánea, cutánea o transdérmica.

Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación intradérmica o subcutánea incluyen típicamente al menos uno de los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua, solución salina, aceites fijados, polietilenglicol, glicerina, propilenglicol, u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabeno, antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); tampones tales como acetato, citrato o fosfato; y agentes de tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. Se puede ajusfar el pH con ácidos o bases. Tales preparaciones se pueden encerrar en ampollas, jeringuillas desechables o viales de dosis múltiple.

Las soluciones o suspensiones usadas para la administración intravenosa incluyen un vehículo tal como suero salino fisiológico, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ), etanol o poliol. En todos los casos, la composición debe ser estéril y fluida para una fácil inyectabilidad. A menudo se puede obtener una fluidez apropiada usando lecitina o tensioactivos. Las composición también debe ser estable bajo las condiciones de preparación y almacenamiento. Se puede lograr la prevención de microorganismos con agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, etc. en muchos casos, se pueden incluir en la composición agentes isotónicos (azúcar), polialcoholes (manitol y sorbitol), o cloruro de sodio. Se puede llevar a cabo la absorción prolongada de la composición añadiendo un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las composiciones orales incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. La composición se puede encerrar en gelatina o comprimir en comprimidos. Con el fin de la administración oral, se pueden incorporar los anticuerpos con excipientes y colocarlos en comprimidos, trociscos o cápsulas. Se pueden incluir en la composición materiales adyuvantes o agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles. Los comprimidos, trociscos y cápsulas pueden contener (1) un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; (2) un excipiente tal como almidón o lactosa, (3) un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; (4) un lubricante tal como estearato de magnesio; (5) un deslizante tal como dióxido de silicona coloidal; o (6) un agente edulcorante o un agente aromatizante.

La composición farmacéutica también se puede administrar por vía transdérmica o transmucosa. Por ejemplo, los anticuerpos que comprenden una parte de Fe pueden ser capaces de atravesar membranas mucosas en el intestino, la boca o los pulmones(por medio de receptores de Fe). Se puede llevar a cabo la administración transmucosa con el uso de pastillas masticables, pulverizaciones nasales, inhaladores o supositorios. También se puede llevar a cabo la administración transdérmica con el uso de una composición que contenga pomadas, ungüentos, geles o cremas conocidas en la técnica. Para la administración transdérmica o transmucosa, se usan penetrantes apropiados para la barrera que se va a permear. Para la administración por inhalación, los anticuerpos se administran en una pulverización de aerosol desde un dispensador o recipiente presurizado, que contiene un propulsor (por ejemplo, líquido o gas) o un nebulizador.

En ciertas realizaciones, se preparan las composiciones farmacéuticas con vehículos para proteger el componente activo de su eliminación rápida del cuerpo. A menudo se usan polímeros biodegradables (por ejemplo, acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, ácido poliláctico). Los procedimientos para la preparación de tales formulaciones son conocidos por los expertos en la técnica. También se pueden usar suspensiones liposómicas como vehículos farmacéuticamente aceptables. Los liposomas se pueden preparar de acuerdo con los procedimientos establecidos en la técnica (patente de los EE.UU. N°. 4.522.811).

Las composiciones farmacéuticas se administran en cantidades terapéuticamente efectivas, tal como se ha descrito. Las cantidades terapéuticamente efectivas pueden variar con la edad, la condición, el sexo del sujeto y con la gravedad de la afección médica. Se puede administrar la dosificación apropiada por un médico basándose en las indicaciones clínicas. Se pueden proporcionar las composiciones como una dosis en embolada para maximizar los niveles en circulación del componente activo de la composición para el mayor periodo de tiempo. También se puede usar la infusión continua después de la dosis en embolada.

Tal como se usa en el presente documento, se pretende que el término "sujeto" incluya animales no humanos y humanos. La expresión "animales no humanos" de la invención incluye todos los vertebrados, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Ejemplos de intervalos de dosificación que se pueden administrar a un sujeto se puede elegir de: de 1 pg/kg a 20 mg/kg, de 1 pg/kg a 10 mg/kg, de 1 Mg/kg a 1 mg/kg, de 10 pg/kg a 1 mg/kg, de 10 pg/kg a 100 pg/kg, de 100 pg/kg a 1 mg/kg, de 250 pg/kg a 2 mg/kg, de 250 pg/kg a 1 mg/kg, de 500 pg/kg a 2 mg/kg, de 500 pg/kg a 1 mg/kg, de 1 mg/kg a 2 mg/kg, de 1 mg/kg a 5 mg/kg, de 5 mg/kg a 10 mg/kg, de 10 mg/kg a 20 mg/kg, de 15 mg/kg a 20 mg/kg, de 10 mg/kg a 25 mg/kg, de 15 mg/kg a 25 mg/kg, de 20 mg/kg a 25 mg/kg, de and 20 mg/kg a 30 mg/kg (o mayores). Estas dosificaciones se pueden administrar diariamente, semanalmente, bisemanalmente, mensualmente o con menos frecuencia, por ejemplo, bianualmente, dependiente de la dosificación, del procedimiento de administración, del trastorno o síntoma(s) que se va a tratar y de las características del sujeto individual. Las dosificaciones también se pueden administrar por medio de infusión continua (tal como a través de una bomba). La dosis administrada también puede depender de la vía de administración. Por ejemplo, la administración subcutánea puede requerir una dosificación mayor que la administración intravenosa.

En ciertas circunstancias, puede ser ventajoso formular composiciones en forma farmacéutica unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma farmacéutica unitaria tal como se usa en el presente documento, se refiere a unidades físicamente diferenciadas adecuadas para el paciente. Cada unidad de dosificación contiene una cantidad predeterminada de anticuerpo calculada para producir un efecto terapéutico junto con el vehículo. La unidad de dosificación depende de las características de los anticuerpos y del efecto terapéutico particular que se va a lograr.

La toxicidad y la eficacia terapéutica de la composición farmacéutica se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o en animales de experimentación, por ejemplo, determinando la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente efectiva para el 50% de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación DL50/DE5o.

Los datos obtenidos a partir de los ensayos con cultivos celulares y estudios animales se pueden usar para formular un intervalo de dosificación en humanos. La dosificación de estos compuestos puede estar dentro del intervalo de concentraciones en circulación de anticuerpos en la sangre, que incluye la DE50 con poca o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de composición de dosificación empleada y de la vía de administración. La dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente usando ensayos con cultivos celulares. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración de plasma circulante que incluya la CI50 (es decir, la concentración de agente que logra una inhibición semimáxima de los síntomas). Los efectos de cualquier dosificación particular se pueden monitorizar mediante un bioensayo adecuado. Ejemplos de bioensayos adecuados incluyen ensayos de replicación de ADN, ensayos basados en transcripción, ensayos de unión a receptor y otros ensayos inmunológicos.

Los antagonistas, anticuerpos y fragmentos de unión discutidos anteriormente también se pueden usar para detectar la presencia de al menos una de IL-22, IL-17A, IL-17F, IL-1 F6, IL-1F8, IL-1 F9 e IL-1 Rrp2 en una muestra biológica. Estas citocinas y estos receptores se pueden detectar extracelularmente o bien intracelularmente usando procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo los procedimientos descritos en esta solicitud. Correlacionando la presencia o el nivel de estas proteínas con una afección médica, un experto en la técnica puede diagnosticar la afección médica asociada. Por ejemplo, IL-22 induce cambios asociados con los causados por citocinas inflamatorias (tales como IL-1 y TNFa), y los inhibidores de IL-22 mejoran los síntomas en un modelo animal de artritis reumatoide (documento WO 02/068476 A2).

Los procedimientos de detección basados en anticuerpos son bien conocidos en la técnica e incluyen ELISA, radioinmunoensayos, inmunotransferencias, transferencia de Western, citometría de flujo, inmunofluorescencia, inmunoprecipitación y otras técnicas relacionadas. Los anticuerpos se pueden proporcionar en un kit de diagnóstico. El kit puede contener otros componentes, envasado, instrucciones u otro material para permitir la detección de la proteína y el uso del kit.

Los anticuerpos se pueden modificar con marcadores detectables, incluyendo grupos de ligando (por ejemplo, biotina), fluoróforos y cromóforos, radioisótopos, reactivos electrodensos o enzimas. Las enzimas se detectan por su actividad. Por ejemplo, la peroxidasa de rábano se detecta por su capacidad para convertir tetrametilbencidina (TMB) en un pigmento azul, cuantificable con un espectrofotómetro. Otros elementos de unión adecuados incluyen biotina y avidina, IgG y proteína A, y otros pares receptor ligando conocidos en la técnica.

Los anticuerpos también pueden estar funcionalmente unidos (por ejemplo, mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a al menos una entidad molecular más, tal como a otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un multiespecífico), toxinas, radioisótopos, agentes citotóxicos o citostáticos, entre otros. Otras permutaciones y posibilidades son evidentes para los expertos en la técnica y se consideran equivalentes dentro del alcance de esta invención.

En ciertas realizaciones, cuando el procedimiento de detección es un procedimiento in vitro, incluye: (i) poner en contacto la muestra o una muestra de control con un primer reactivo que se une a una primera diana (por ejemplo y sin limitación IL-1 F6), y un segundo reactivo que se une a una segunda diana (por ejemplo, y sin limitación IL-1 F8); y (ii) detectar la formación de un complejo entre el primer y segundo reactivos y la muestra o la muestra de control, en el que un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en la muestra con relación a una muestra de control, es indicativo de la presencia de las citocinas en la muestra. En una realización, el procedimiento incluye poner en contacto una muestra que comprende células con un reactivo marcado, tal como un anticuerpo fluorescente, que se une a una diana seleccionada de una de IL-22, IL-1 F6, IL-1 F8, IL-1 F9, IL-1 Rrp2 o IL-17A dentro de las células. La cantidad de reactivo detectado dentro de una célula es directamente proporcional a la cantidad de la diana intracelular expresada dentro de la célula. En ciertas realizaciones, la muestra es una muestra de sangre de un paciente. Muestras adicionales en las que se pueden medir niveles de expresión incluyen, pero no se limitan a, líquido sinovial, frotis bucales, piel, material retirado para biopsia, por ejemplo y sin limitación, piel de un paciente con psoriasis retirada para una biopsia, semen, pelo, hueso, orina, secreciones nasales y esputo, incluyendo, pero sin limitarse a, fluidos obtenidos a partir de un lavado bronquial durante una broncoscopia.

El procedimiento de detección también puede ser un procedimiento de detección in vivo (por ejemplo, imagen in vivo en un sujeto). El procedimiento se puede usar para diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno tal como se describe en el presente documento. El procedimiento incluye: (i) administrar un primer reactivo que se une a una primera diana (por ejemplo y sin limitación IL-1 F6), y un segundo reactivo que se une a una segunda diana (por ejemplo, y sin limitación IL-1 F8) a un sujeto o a un sujeto de control bajo condiciones que permitan la unión del primer y el segundo reactivos a sus dianas; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el primer y segundo reactivos y sus dianas, en el que un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en el sujeto con relación a un control, por ejemplo, un sujeto de control, es indicativo de la presencia de las citocinas.

En ciertas realizaciones, un procedimiento de detección también puede ser un procedimiento de detección in vitro que mida niveles de ARNm. El procedimiento se puede usar para diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno tal como se describe en el presente documento. En ciertas realizaciones, el procedimiento incluye: (1) recoger una muestra de un paciente, y (2) detectar los niveles de ARNm diana en la muestra. En ciertas realizaciones, el ARNm diana incluye al menos una de ARNm de IL-22, ARNm de IL-1 F6, ARNm de IL-1 F8, ARNm de IL- F9, ARNm de IL-1 Rrp2 y ARNm de IL-17A. Los procedimientos para detectar y cuantificar el ARNm son conocidos en la técnica. En ciertas realizaciones el procedimiento comprende RT-PCR cuantitativamente. En ciertas realizaciones, la muestra es una muestra de sangre de un paciente. Muestras adicionales en las que se pueden medir niveles de expresión incluyen, pero no se limitan a, líquido sinovial, frotis bucales, piel, material retirado para biopsia, por ejemplo y sin limitación, piel de un paciente con psoriasis retirada para una biopsia, semen, pelo, hueso, orina, secreciones nasales y esputo, incluyendo, pero sin limitarse a, fluidos obtenidos a partir de un lavado bronquial durante una broncoscopia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Incremento de expresión de proteínas y genes de citocínas IL-1 en un modelo de ratón psoriasiforme La psoriasis vulgaris es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel caracterizada por epidermis hiperproliferativa e infiltrado mixto de linfocitos cutáneo. Aunque inicialmente se considera como una enfermedad primaria de alteración de queratinocitos, las terapias que modulan la respuesta inmune efectivas demuestran el papel que juegan las células inmunitarias y las citocinas que producen en la patogénesis de la enfermedad psoriásica.

Se transfectaron 4x105 células CD4+CD45RBhiCD25~ en CB17 scid/scid libres de patógenos para inducir un aumento de placas escamosas en la piel con ciertas características semejantes a la psoriasis humana. El día 60 después de la transferencia, la mayoría de los ratones desarrollaron inflamación de la piel psoriasiforme, tal como un engrosamiento de la epidermis (acantosis) debida al incremento de la proliferación de queratinocitos (paraqueratosis), proyecciones papilares hacia abajo de la epidermis (basilar papilla), así como infiltrados celulares inflamatorios en la epidermis y la dermis.

Para probar los componentes de citocina de las lesiones de la piel, se recogieron orejas de ratón el día 70 después de la transferencia adaptiva y se sometieron a RT-PCR cuantitativa para evaluar la expresión génica de IL-1 F6, IL-1 F8, IL-1 F9 y de su receptor específico IL-1 Rrp2. Se aisló en ARN de las biopsias de las orejas de ratón congeladas usando el kit QIAGEN RNeasy® (QIAGEN). Se examinó la expresión de los genes de atocinas usando kits Taqman® RT-PCR con sondas y cebadores precualificados (Applied Biosystems) de acuerdo con el cuadro siguiente.

CUADRO 2 Gen N° de catálogo de Applied N° de catálogo de Applied Biosystems Biosystems Humano Ratón 11-1 Rrp2 Hs00187259 m1 Mm00519250 m1 IL-1 F6 Hs00205367 m1 Mm00457645 m1 IL-1 F8 Hs00205359 m1 m01337545 m1 IL-1 F9 Hs00219742 m1 Mm00463327 m1 GAPDH Hs99999905 m1 Mm99999915_g1 Se normalizó la expresión génica a la expresión del gen de mantenimiento GAPDH con la suposición de 1.000 copias de ARNm de GAPDH por célula.

Comparado con el control los ratones que recibieron inyección salina, los ratones que desarrollaron formación psoriasiforme tuvieron una expresión significativamente elevada de citocinas IL-1, IL-1 F6 (~500 veces), IL-1 F8 (~60 veces) e IL-1 F9 (~50 veces) en muestras de oreja (figuras 1A y 1C). También se incrementaron los transcritos de su receptor, IL-1 Rrp2 aproximadamente 3-5 veces, aunque el incremento no alcanzó significancia estadística. Además, se detectaron un incremento de tres veces en la expresión de IL-1 F6 y un incremento de cinco veces en la expresión de IL-1F9 en los leucocitos de los ratones con psoriasis.

Para confirmar que el incremento de la expresión génica se correlacionó con el incremento de la producción de proteínas en la células, se analizó el nivel de proteínas de una de las tres citocinas, IL-1 F6, en el lisado de oreja mediante transferencia de Western. Se detectó proteína IL- F6 de tres a cuatro veces más medíante transferencia de Western en las biopsias de oreja de ratones receptores de células CD4+CD45RBhlCD25~ en comparación con las muestras de orejas del control (figura 1 B), indicando un incremento en la producción de proteínas consecuente con el incremento observado en la expresión génica.

EJEMPLO 2 IL-22 regula la expresión de citocinas IL-1 en la piel de ratón Se requiere IL-22 para la patología mediada por células Th17 en psoriasis y la neutralización de IL-22 sola es suficiente para prevenir la progresión de la psoriasis. Se transfectaron 4x105 células CD4+CD45RBhiCD25~ en ratones CB17 scid/scid libres de patógenos tal como se describió en el ejemplo 1. Se inyectó por vía intravenosa un anticuerpo que neutraliza IL-22 en los ratones CB17 scid/scid libres de patógenos una vez por semana comenzando el día de la transferencia adaptativa de las células T CD4+CD45RBh'CD25~. La inyección intravenosa del anticuerpo que neutraliza IL-22 prevenía el desarrollo de las lesiones psoriasiformes en los ratones receptores. Correlacionado con la disminución de los síntomas el día 70 después de la transferencia, también se redujeron los niveles de transcritos de las citocinas IL-1 en las orejas: reducción de ~9 veces en el nivel de expresión de IL-1 F6, reducción de ~2.25 veces en el nivel de expresión de IL-1 F8 y reducción de -2.2 veces en el nivel de expresión de - IL-1 F9 (figura 2). Sin embargo, la neutralización de IL-22 no tuvo efecto sobre la elevación del nivel de expresión génica del receptor IL-1 Rrp2. Se midieron los niveles de transcritos mediante RT-PCR tal como se describió en el ejemplo 1.

Para demostrar que la expresión de las citocinas IL-1 estaba relacionada con la concentración de IL-22 en el nivel local, se inyectó a los ratones BALB/c de tipo salvaje directamente en las orejas con 500 ng de IL-22 de ratón recombinante cada dos días durante dos semanas Seis horas después del tratamiento, se recogieron las orejas de ratón y se midieron los niveles de transcritos mediante RT-PCR tal como se describió en el ejemplo 1. Los niveles de transcritos para IL-1 F6, IL-1F8 e IL-1 F9 se incrementaron todos ~6 veces en las orejas derechas que recibieron IL-22 en comparación con las orejas izquierdas de los mismos ratones que recibieron solución salina como controles (figura 3). El ARNm de receptor IL-1 Rrp2 también tuvo una tendencia al aumento en las orejas tratadas con IL-22. Estos datos sugieren que la citocina de Th17, IL-22, puede regular directamente la expresión génica de las citocinas IL-1 en el sitio de la inflamación.

EJEMPLO 3 Efectos de las citocinas en la producción de citocinas 1L-1 en los queratinocitos humanos IL-22. IL-17A e lL-17F Para confirmar además la inducción directa de las isoformas de IL-1 por IL-22, se trataron queratinocitos epiteliales humanos primarios con IL-22 durante dos días antes del examen de expresión génica mediante RT-PCR cuantitativa. Se usaron queratinocitos humanos como pasos p1-p3 después de descongelar y se trataron con concentraciones variables de IL-22 desde 0 ng/ml hasta 200 ng/ml tal como se muestra en las figuras 4A o 4B. Se midieron los niveles de transcritos mediante RT-PCR tal como se describió en el ejemplo 1. En un primer grupo de experimentos, en queratinocitos tratados con 200 ng/ml de IL-22, los niveles de transcritos de IL-1 F9 se incrementaron 4 veces en comparación con las células no tratadas. Los transcritos de IL-1 F8 aumentaron desde niveles no detectables hasta niveles detectables. Los transcritos de IL-1 F6 estaban por debajo del nivel detectable y la expresión de IL-1 Rrp2 no tuvo cambios. En un segundo grupo de experimentos, se observó un incremento de dosis dependiente en los transcritos de IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1 F9. A pesar de la gran diferencia en los números de copias de transcritos (en relación con gapdh, E"6 para los transcritos H1f6, E'5 para H1f8 y E"3 para H1f9 ), se detectó en general un incremento de 2 - 4 veces en los niveles de transcritos ¡I1f6, H1f8 y H1f9 en queratinocitos cultivados con 200 ng/ml de IL-22 en comparación con los cultivados sólo con medio. (Fig. 4B) Sin embargo, IL-22 no tuvo efecto sobre la expresión del receptor H1rl2 (datos no mostrados).

IL-22 e IL-17A están coexpresados por células Th17. IL-22 e IL- 17A actúan sinérgicamente para potenciar la expresión de varios péptidos antimicrobianos, por ejemplo, ß-defensina 2, S100A7, S100A8 y S100A9. Para investigar además la relación funcional de estas citocinas Th17, se examinó la expresión de las isoformas de IL-1 y se examinó su receptor en queratinocitos primario tratados con combinaciones de IL-22, IL- 7A e IL-17F. Tal como se muestra en la figura 5A, se trataron los queratinocitos primarios con IL-22 (200 ng/ml) o IL-17A(20 ng/ml) solas o la combinación de IL-22 (200 ng/ml) e IL-17A (20ng/ml) durante dos días antes del examen de expresión génica. Se midieron los niveles de transcritos mediante RT-PCR tal como se describió en el ejemplo 1. Aunque la IL-17A sola puede inducir la expresión de IL-1 F6 (-20 veces) , IL-1 F8 (-1 vez) e IL-1 F9 (~7 veces), la presencia de IL-22 indujo sinérgicamente la expresión de IL-1 F6 (-80 veces) e IL-1 F9 (-15 veces), y potenció de manera acumulativa la expresión de IL-1 F8 (-2 veces) (figuras 5A y 5C). Sin embargo, el tratamiento con IL-17F sola no indujo la expresión génica de estas citocinas IL-1 y de su receptor IL-1 Rrp2, y la combinación de IL-22 e IL-17F no indujo la expresión génica de las citocinas IL-1 y de IL-1 Rrp2 más de lo que se observó con II-22 sola. Se examinó la cantidad de proteína IL-1 F9 en queratinocitos tratados con IL-22+IL-17A mediante transferencia de Western (figura 5B), confirmando que el incremento del nivel de transcritos se correlacionaba con el incremento de la producción de proteína. Se detectó al menos un incremento de dos veces de la señal mediante transferencia de Western en los queratinocitos tratados con IL-22+IL-17A en comparación con los que no tuvieron tratamiento.

TNF-a TNF-a es otra citocina proinflamatoria importante que inicia y mantiene las respuestas inflamatorias en la piel. Estudios clínicos han demostrado que el bloqueo de la ruta de TNF es un tratamiento efectivo en pacientes con psoriasis. Gottlieb A.B. et al., J. Immunol. 175, 2721-29 (2005). En vista de la eficacia clínica del bloqueo de TNF, se examinó la posible regulación de IL-1 F6, IL- F8 e IL-1 F9 por TNF-a en nuestro sistema de cultivo de queratinocitos humanos in vitro. Tal como se muestra en la figura 18, los queratinocitos estimulados con TNF-a tuvieron un incremento de 10-20 veces en transcritos de genes de H1f6, H1f8 e H1f9 en comparación las células cultivadas sólo con medio. El incremento de la expresión génica de IL-1 se pudo potenciar además con la adición de IL-22 al cultivo. Juntos, estos datos sugirieron que IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1 F9 eran citocinas efectoras en dirección 3' de su inducción mediante IL-17A, IL-22 y TNF-a en la piel.

IFN-? e IL-12 La inducción y progresión del daño en el tejido en la psoriasis se ha asociado tradicionalmente a las células T Th1 y a sus citocinas distintivas IFN-? e IL-12. Se examinó el efecto de estas citocinas Th1 sobre la expresión de los genes de H1f6, H1f8 y H1f9 en queratinocitos primarios. Tal como se muestra en la figura 19, se indujo 2 veces la expresión de H1f8 por IL-12 a una concentración de 200 ng/ml y los niveles de transcritos de H1f9 no mostraron cambio. El tratamiento sólo con IFN-? indujo aproximadamente un incremento de 10 veces del transcrito de H1f8 aunque tuvo un efecto mínimo sobre la expresión génica de H1f9. La adición de IL-12 a los cultivos de queratinocito de IFN-? no potenció sustancialmente los transcritos de H1f8 ni de H1f9 inducidos sólo por IFN-?. Cabe anotar, en contraste con el incremento significativo en los niveles de transcritos de H1f6 en queratinocitos en respuesta a las citocinas Th17 o a las citocinas TNF-?, Th1 , que no tuvo efecto sobre la expresión de H1f6. Estos datos demuestran que en nuestro sistema de queratinocitos in vitro, la expresión de IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1 F9 está regulada predominantemente por citocinas Th17 pero no por citocinas Th1.

IL-17A e IFN-? Ya que a menudo la célula Th1 y las células Th17 están colocalizadas en placas psoriásicas humanas, se examinó el efecto combinado de IL-17A e IFN-? sobre la expresión de las isoformas de IL-1 por queratinocitos humanos. Tal como se muestra en la figura, IL-17A potenció la inducción del transcrito de H1f8 por IFN-? en otras 3 veces. Sin embargo, la combinación de citocinas no potencia el incremento del transcrito de ¡11 f 6 ni de ¡11 f9 por IL-17A (datos no mostrados).

EJEMPLO 4 Incremento de la expresión génica de citocinas IL-1 correlacionado con IL-17 A, IL-22, TNF-a e IFN-? en las lesiones de psoriasis de piel humana Para confirmar las observaciones en el modelo de ratón de psoriasis, se examinaron muestras de piel lesional y no lesional emparejadas humanas que se obtuvieron a partir de pacientes psoriásicos. Se examinaron niveles de expresión de un panel de citocinas proinflamatorias en 1 1 muestras de piel emparejadas usando RT-PCR cuantitativa. Se midieron los niveles de transcritos mediante RT-PCR tal como se describió en el ejemplo 1. Todos los pacientes tuvieron un incremento de la expresión de IL-1 F6 (promedio de aproximadamente 20 veces mayor), IL-1 F8 (promedio de 100 veces mayor) e IL-1 F9 (promedio de 4 veces mayor) en las lesiones psoriásicas como un grupo (figura 6A) o bien individualmente (figuras 6B y 6C). ARNm de IL-1 F9 alcanzó el mayor número de copias por célula: el 44% de las copias de ARNm de GAPDH (figura 6A), indicando una fuerte función biológica en la inflamación de la piel. No se detectaron transcritos de IL-1 Rrp2 elevados en las lesiones psoriásicas. El nivel de expresión de IL-1 Rrp2 se moduló negativamente en las lesiones en comparación con las copias de ARNm en los tejidos de piel normal.

Tal como se esperaba, la expresión de las tres isoformas de IL-1 en las lesiones de piel humana se correlacionaron fuertemente con la expresión de las citocinas Th17 IL-22, IL-21 e IL-17A (cuadro 3, figura 7A y cuadro A), aún así la expresión del receptor IL-1 RL2 no tuvo correlación con las citocinas Th17 (cuadro 3 y figura 7B). La expresión de IL-21 R también se correlacionó con las isoformas de IL-1 , pero no con IL-22R ni IL-22BP. En consonancia con la observación anterior del efecto de IL-17F sobre los queratinocitos in vitro, no hubo correlación entre la expresión de las isoformas de IL-1 y la expresión de IL-17F (cuadro A). Adicionalmente, la expresión de las tres isoformas de IL-1 se comparó con la expresión de IL-22R, IL-22BP, IL-21 , IL-21 R, IL-23 y TGFa. La expresión de IL-1 F6 e IL-1 F8 también se correlacionó con la otra citocina Th17, IL-21 y su receptor. La expresión de IL- 1 F9 también se correlacionó con la expresión de IL-23, y la expresión de IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1 F9 se correlacionó con la expresión de TGFa.

CUADRO A Resumen de las correlaciones de expresión génica entre IL-1F6. IL-1F8 e IL-1F9, y otros biomarcadores proinflamatorios en lesiones de piel de psoriasis humana. Se realizó un análisis estadístico usando una prueba de Pearson de dos colas con un intervalo de confianza del 95%. Se consideró significativa la correlación cuando p < 0.05.

¿Es significativa la correlación? IL-1 Rrp2 IL-1 F6 IL-1 F8 IL-1 F9 IL-22 No Sí Sí Sí IL-22R No No No No IL-22BP No No No No IL-21 No Sí Sí No IL-21 R No Sí Sí Sí IL-17A No Sí Sí Sí IL-17F No No No No IL-23 No No No Sí TNF ct No Sí Sí Sí CUADRO 3 Correlación de perfiles de expresión de citocinas en lesiones psoriásicas humanas. En el cuadro 3, se determinaron correlaciones estadísticas mediante la prueba de correlación de Pearson y se determinaron mediante la prueba t de Student de dos colas.

F6 F8 F9 RL2 r -0.324 -0.324 - 0.154 0.524 IL-12p35 P , 0.331 0.332 0.098 0.651 R2 0.105 0.105 0.274 0.024 r 0.848 0.795 0.705 -0.037 IL-17A P 0.001 0.004 0.015 0.913 R2 0.719 0.632 0.497 0.001 r 0.491 0.562 0.237 -0.351 IL-17F p 0.125 0.072 0.482 0.290 R2 0.241 0.316 0.056 0.123 r 0.823 0.781 0.535 -0.169 IL-21 P„ 0.002 0.005 0.090 0.619 R 0.678 0.609 0.286 0.029 r 0.932 0.919 0.726 -0.303 IL-21R p <0.0001 O.0001 0.01 1 0.366 R2 0.869 0.844 0.527 0.092 r 0.894 0.873 0.629 -0.103 IL-22 p„ 0.000 0.001 0.038 0.764 R2 0.799 0.761 0.395 0.01 1 r -0.219 -0.236 0.136 0.263 IL-22R p„ 0.517 0.486 0.435 0.691 R2 0.048 0.055 0.069 0.018 r -0.481 -0.507 - 0.499 0.572 IL-22BP P 0.135 0.1 11 0.066 0.1 18 R 0.231 0.258 0.327 0.249 r 0.588 0.600 0.790 0.000 IL-23 p„ 0.057 0.051 0.004 1.000 R 0.346 0.360 0.624 0.000 r 0.863 0.810 0.862 -0.171 IFN-y P 0.001 0.003 0.001 0.615 R2 0.745 0.656 0.742 0.029 r 0.618 0.677 0.676 0.162 TNF-a P„ 0.043 0.022 0.023 0.635 R 0.382 0.459 0.457 0.026 Corroborando la expresión de queratinocitos de isoformas de IL- 1 sobre la estimulación de TNF-a in vitro, la expresión de TNF se correlacionó con la expresión de las citocinas IL-1 en lesiones psoriásicas. Además, también se detectó expresión elevada de IFN-?, pero no de IL-12p35, en las lesiones y se correlacionó bien con la expresión de IL-1 F6, IL- F8 e IL-1 F9, indicando una implicación colaborativa tanto de células Th1 como Th17 en psoriasis.

EJEMPLO 5 Expresión diferenciada de citocinas IL-1 como biomarcadores en los modelos animales de enfermedades autoinmunitarias Para evaluar el potencial de IL-1 F6, IL-1 F8, IL-1 F9 y su receptor como biomarcadores de enfermedades autoinmunitarias, se examinó la expresión de estos genes en sangre obtenida a partir de tres modelos de ratón autoinmunitarios diferentes.

Se examinaron las isoformas de IL-1 IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1 F9 en el modelo de ratón de artritis inducida por colágeno (CIA), en el que se induce la inflamación mediante inmunización con colágeno y adyuvante. Para inducir la enfermedad, se inmunizaron ratones DBA1 con 200 ng de colágeno de tipo II bovino (Chondrex) emulsionado en CFA por vía intradérmica. El día 21 , todos los ratones recibieron un refuerzo de 200 ng de colágeno en IFA. El día 35, se recogió la sangre e inmediatamente se sometió a extracción de ARN usando el mini kit para sangre QIAGEN RNeasy®. Se usaron leucocitos para el análisis de expresión génica por medio de RT-PCR cuantitativa. Se midieron los niveles de transcritos mediante RT-PCR tal como se describió en el ejemplo 1. En comparación con los ratones de control sin tratar, el ARNm de IL-1 F8 e IL-1 F9 se incrementó ~10 veces y -4.3 veces respectivamente en la sangre de los ratones enfermos, aunque el mensaje de IL-1 F6 fue indetectable tanto en ratones enfermos como en los de control (figura 8).

También se examinaron las isoformas de IL- IL-1F6, IL- F8 e IL-1 F9 en un modelo de ratón con inflamación de piel psoriasiforme que se indujo en ratones scid/scid mediante transferencia intravenosa de células T efectoras (CD4+CD45RBhiCD25~) a partir de ratones Balb/c de tipo salvaje sin tratar. Se recogió sangre de ratón el día 70 de la inducción de la enfermedad y se analizó la expresión génica en leucocitos. Se midieron los niveles de transcritos mediante RT-PCR tal como se describió en el ejemplo 1 . Los niveles de transcritos de IL-1 F6 e IL-1 F9 se incrementaron 3-6 veces en los ratones receptores que desarrollaron psoriasis en comparación con los ratones de control que recibieron inyección salina. El nivel de transcritos de IL-1 F8 en la sangre estaba por debajo del nivel de detección. La expresión del receptor IL-1 Rrp2 también era bastante baja y parecía descender en la sangre de los ratones psoriasiformes (figura 9).

También se examinaron las isoformas de IL-1 IL-1F6, IL-1 F8 e IL-1 F9 en un modelo de ratón con lupus espontáneo. La cepa NZBWF/1 de ratones generalmente es susceptible al desarrollo espontáneo del lupus. La colonia usada presenta típicamente síntomas de lupus detectables tales como proteinuria o anticuerpos anti-ADNds aproximadamente a las 20 semanas. Se recogieron muestras de sangre de estos ratones 10 semanas antes y 7 meses después del comienzo de la enfermedad, y se examinó la expresión génica y se comparó con ratones C57BL/6 sanos de 10 semanas de edad, una cepa que no desarrolla el lupus espontáneo. Se midieron niveles de transcritos mediante RT-PCR tal como se describió en el ejemplo 1. En el momento temprano de 10 semanas en la enfermedad, se incrementó la expresión génica de IL-1 F6, IL-1 F9 e IL-1 Rrp2 (figura 10), indicando que estos genes puede ser biomarcadores tempranos para el lupus. Los transcritos para IL-1F6 se elevaron además en los ratones de 7 meses de edad que habían desarrollado los síntomas del lupus de proteinuria e incrementaron los anticuerpos anti-ADNds. Sin embargo, los transcritos de IL- F9 y del receptor IL-1 Rrp2 descendieron en este momento aún mucho más en comparación con los ratones C57BL/6 de control. Los transcritos de IL-1 F8 eran demasiado bajos para ser detectados en la sangre de los ratones con lupus NZBWF1/J.

Estos resultados demostraron que el aumento de la expresión de ARNm de las isoformas de IL-1 está asociado con enfermedades inflamatorias y se puede detectar a partir de muestras de sangre de los animales enfermos. Previamente estas isoformas sólo se habían detectado en muestras de tejido de la piel y en queratinocitos. Los niveles diferentes de inducción y de expresión de IL-1 F6, IL-1 F8 e IL- F9 así como de su receptor específico en los diferentes modelos de enfermedad indican que estos genes se expresan de manera anómala en varias enfermedades autoinmunitarias, sugiriendo un uso potencial de la expresión de las isoformas de IL-1 (por ejemplo, ARNm o proteína) como biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades autoinmunitarias e inflamatorias humanas.

EJEMPLO 6 Las isoformas de IL-1 no están reguladas por IL-21 in Vitro Tal como se muestra en la figura 21 , IL-21 disminuye los transcritos de H1f8 e H1f9 en el dador 1 , pero incrementa ligeramente su expresión en el dador 2, indicando que IL-21 no regula directamente las isoformas de IL-1 en queratinocitos. Además, la adición de IL-22 a los cultivos no afecta de manera significativa a la expresión de las isoformas de IL-1 . Los niveles de transcritos de H1f6 en queratinocitos cultivados conjuntamente con IL-21 estaban por debajo del límite de detección.

EJEMPLO 7 La expresión de IL-1a e 1L-13 no está regulada por citocinas de Th17 o Th1 in Vitro Recientes ensayos clínicos han demostrado que los agentes biológicos que bloquean la ruta de IL-12/23p40 son eficaces en la psoriasis. Krueger, G. et al. N Engl J Med 356, 580-592 (2007). Además, la evidencia clínica preliminar indica que el bloqueo de IL-17A también tiene un efecto beneficioso. Patel, D. En ACR/ARHP Annual Scientific Meeting, San Francisco (2008). En contraste, el bloqueo de las rutas de IL-1a and IL-1 ß con un antagonista de IL-1 R recombinante mostró que era de un beneficio modesto en estudios de psoriasis piloto. Gibbs, A. G. et al. En 25th European Workshop for Rheumatology Research. Arthritis Research and Therapy, Glasgow, RU. 68 (2005). Se examinó la regulación de illa e H1b por citocinas derivadas de células T en nuestro sistema de cultivo in vitro. Se indujo un ligero incremento (-1.5-2 veces) en las expresiones de illa e ¡11 b por IL-17A o IFN-? en queratinocitos (figura 22). Sin embargo, ni IL-22 ni IL- 2 tuvieron un efecto, solas o en combinación con IL-17A o IFN-?, respectivamente. Estos datos sugieren que IL-1a e IL-1 ß puede que no sean los mediadores inmunitarios locales principales que son importantes para la patogénesis de psoriasis. Sin embargo, la fuerte inducción de IL-1F6, IL-1 F8 e IL-1F9 por citocinas de Th17 sugiere que estas isoformas de IL-1 pueden representar mediadores locales principales de la enfermedad.

EJEMPLO 8 La expresión de IL-1 a, IL-1F6 e IL-1F9 está regulada por isoformas de IL- 1 in Vitro Para investigar el efecto en dirección 3' de la elevación de las isoformas de IL-1 en la psoriasis, se examinó la capacidad de IL-16, IL-1 F8 e IL-1 F9 para regular la expresión de IL-1 a, I L- 1 ß , IL-1 F6 e IL-1 F9 en nuestro sistema de cultivo in vitro (figuras 23A-23D). Se indujo un ligero incremento (-2-6 veces) en la expresión de illa por IL-1 F6, IL-1 F8 o IL-1 F9 solas. La adición de IL-17A incrementó además la inducción por las isoformas de IL-1. Sin embargo, la adición de IFN-? o de TNF-a no tuvo efecto adicional sobre la expresión de IL-1 a. Las tres isoformas de IL-1 mostraron una pequeña regulación de la expresión de IL-? ß, solas o bien en combinación con las citocinas de Th1 o Th17. Las tres isoformas de IL-1 indujeron la expresión de IL-1 F6 y se detectó este incremento tan solo 6 h (datos no mostrados) después del cultivo conjunto. IL- 7A actuó de forma sinérgica con las tres isoformas y potenció fuertemente la inducción de ARNm de H1f6. La adición de TNF-a también potenció este incremento pero con una intensidad menor.

IL-1 F8 e IL-1 F9 indujeron fuertemente la expresión de IL-1 F9 hasta 10 veces. De nuevo, IL-17A actuó de forma sinérgica con IL-1 F8 e IL-1 F9 para incrementar el nivel de transcripción de H1f9 hasta ~80 veces. La adición de TNF-a tuvo efectos ligeramente aditivos mientras que la adición de IFN-? no tuvo efectos. Estos datos sugieren que las isoformas de IL-1 novedosas no sólo inducen sus propias expresiones génicas, sino que cooperan con las citocinas de Th17 para potenciar adicionalmente su autorregulación. IFN-? tiene efectos modestos en la autopotenciación de las isoformas de IL-1 , lo que es consecuente con su efecto modesto en la inducción de la expresión génica de IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1 F9.

EJEMPLO 9 Efecto sinérgico de las isoformas de IL-1 en la inducción de reactante de fase aguda IL- F6, IL-1F8 o IL-1 F9 solas indujeron un ligero incremento (-1 -3 veces) en la expresión génica de varios reactivos de fase aguda, incluyendo saa1/2 (amiloide sérico A1/2), serpinel (inhibidor de la activación de plasminógeno-1 , también conocido como PAI-1 , Serpin E1), plau (activador de plasminógeno de tipo urocinasa, también conocido como u-PA), plat (activador de plasminógeno de tejido, también conocido como t-PA), tnfa e ¡16 (figuras 24A-24G).

La adición de TNF-a tuvo un efecto sinérgico con las tres isoformas de IL-1 , potenciando fuertemente la expresión de los transcritos de saa1/2 inducidos por las isoformas de IL-1. La adición de IL-17A o IFN-? tuvo un efecto aditivo sobre la expresión del gen de saa1/2. La adición de TNF-a también tuvo un efecto sinérgico con IL-1 F6 e IL-1 F8, potenciando fuertemente la expresión de los transcritos de plau y plat inducidos por cada una de las isoformas de IL-1 . La adición de IL-17A o IFN-? no tuvo un efecto adicional sobre la expresión de los genes de plau y plat.

IL-17A actuó de forma sinérgica con IL-1 F9, mientras que IFN-? actuó de forma sinérgica con IL-1 F6 e IL-1 F8 para incrementar la expresión de los transcritos de tnfa inducidos por las isoformas de IL-1 en ~40-60 veces. TNF-a indujo su propia expresión en aproximadamente 10 veces, pero no se observó sinergia cuando se combinó con las isoformas de IL-1 (figuras 24A-24G).

IFN-? actuó de forma sinérgica con IL-1 F6 e IL-1F8 para incrementar la expresión de los transcritos de ¡16 en -230-4000 veces 6 h después del cultivo conjunto. Esta fuerte inducción del gen de ¡16 todavía se observó 72 h después del cultivo conjunto. IFN-? también tuvo un efecto sinérgico con IL-1 F9, incrementando la expresión de los transcritos de ¡16 en ~20 veces. IL-17A también mostró efectos sinérgicos con IL-1 F6 e IL-1 F9 sobre la expresión de ¡16, aunque la respuesta sinérgica no fue tan fuerte como la de IFN-?. La combinación de TNF-a con las tres isoformas de IL-1 no tuvo un efecto sinérgico sobre la expresión de ¡16 (figuras 24A-24G).

EJEMPLO 10 Las isoformas de IL-1 inducen péptidos antimicrobianos en cooperación con IL-17A Se sabe que IL-17A induce la expresión de péptidos antimicrobianos asociados con la defensa del huésped, incluyendo ß-defensina 2 (símbolo génico: def4) y S100A7 (símbolo génico: s100a7). Para examinar si las isoformas de IL-1 pueden inducir los mismos genes por sí mismos o en combinación con citocinas de Th17 o Th1 , se incubaron queratinocitos con citocina de IL-1 individual o en combinación emparejada de estas citocinas. Las isoformas de IL-1 no indujeron fuertemente la expresión del gen de ß-defensina 2 ni de S100A7 solo, sino en combinación con IL-17A, IL-1 F8 indujo un incremento de ~16 veces de transcritos de s100a7, mientras que IL-1 F6, IL-1 F8 e IL-1 F9, en combinación con IL-17A, incrementó el nivel de transcripción de def4 en -600-800 veces. Figuras 25A-25D. TNF-a tiene efectos aditivos con IL-1 F8 en la inducción de la expresión de s100a7 1 IFN-? tiene efectos adjetivos con las tres isoformas de IL-1 en la expresión génica de def4 (figuras 25A-25D).

Los siguientes documentos proporcionan información adicional sobre las citocinas IL-1 y el receptor IL-1 Rrp2, y están incorporadas en el presente documento por referencia para cualquier fin.

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Wang, P., B. Meinhardt, R. Andre, B. R. Renshaw, I. Kimber, N. J. Rothwell y E. Pinteaux. 2005. The interleukin-1 -related cytokine IL-1 F8 is expressed in glial cells, but fails to induce IL-1 beta signalling responses. Cytokine 29:245-250.

Los expertos en la técnica conocerán o serán capaces de determinar, usando no más experimentación que la de rutina, muchos equivalentes a las realizaciones específicas descritas en el presente documento. Tales equivalentes están abarcados por las reivindicaciones siguientes.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro de detección de un trastorno inflamatorio que comprende identificar el aumento de al menos una de (a) al menos una isoforma de IL-1 y (b) IL-1 Rrp2 en una muestra de un paciente, en el que la al menos una isoforma de IL-1 es IL-1 F6, IL-1 F8 o IL-1 F9.

2. El procedimiento in vitro de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el trastorno inflamatorio es psoriasis, lupus o artritis.

3. El procedimiento in vitro de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el aumento de al menos una de (a) la al menos una isoforma de IL-1 y (b) IL-1 Rrp2 se determina detectando niveles de ARNm.

4. El procedimiento in vitro de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el aumento de al menos una de (a) la al menos una isoforma de IL-1 y (b) IL-1 Rrp2 se determina detectando niveles de proteína.

5. El procedimiento in vitro de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la detección del aumento de al menos dos de (a) la al menos una isoforma de IL-1 y (b) IL-1 Rrp2 se detecta detectando niveles de proteína de al menos una de (a) la al menos una isoforma de IL-1 y (b) IL-1 Rrp2 y detectando niveles de ARNm de al menos una de (a) la al menos una isoforma de IL-1 y (b) IL-1 Rrp2.

6. El uso de al menos un inhibidor de al menos una de IL-1 F6, IL- F8 e IL-1F9, en la elaboración de un medicamento para tratar un trastorno asociado con IL-22.

7. El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en el que el al menos un inhibidor es un anticuerpo anti-IL-1 F6.

8. El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en el que el al menos un inhibidor es un anticuerpo anti-IL-1 F8.

9. El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en el que el al menos un inhibidor es un anticuerpo anti-IL-1 F9.

10. El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en el que el al menos un inhibidor es un anticuerpo anti-IL-1 Rrp2.

11. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en el que el trastorno asociado con IL-22 es psoriasis, lupus o artritis.

12. El uso de a) al menos uno de (i) un anticuerpo anti-IL-1 F6, (ii) un anticuerpo anti-IL-1 F8, (iii) un anticuerpo anti-IL-1 F9 y (iv) un anticuerpo anti-IL-1 Rrp2; y (b) un anticuerpo anti-IL-22, en la elaboración de un medicamento para tratar un trastorno inflamatorio.

13. El uso de un anticuerpo anti-IL-1 y un anticuerpo anti-IL-17A, en la elaboración de un medicamento para tratar un trastorno inflamatorio.

14. El uso de a) al menos uno de (i) un anticuerpo anti-IL-1 F6, (ii) un anticuerpo anti-IL-1 F8, (iii) un anticuerpo anti-IL-1 F9 y (iv) un anticuerpo anti-IL-1 Rrp2; (b) un anticuerpo anti-IL-22; y (c) un anticuerpo anti-IL-17A, en la elaboración de un medicamento para tratar un trastorno inflamatorio.

15. Un procedimiento para determinar la efectividad de un agente terapéutico en el tratamiento, la reducción, la prevención y/o la mejora de un trastorno inflamatorio en un sujeto detectando un nivel de expresión génica en el sujeto en comparación con un nivel de expresión génica en una muestra de control, en el que la expresión génica detectada es la expresión génica a partir de al menos una de IL-1 F6, IL-1 F8, IL-1 F9, IL-1 Rrp; y en el que un nivel más bajo de expresión génica en el sujeto en comparación con el control indica la efectividad del agente terapéutico en el tratamiento, la reducción, la prevención y/o la mejora del trastorno inflamatorio en el sujeto.

16. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en donde el trastorno inflamatorio es psoriasis, lupus o artritis.

17. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado además porque el trastorno inflamatorio es psoriasis, lupus o artritis.