CN111848780A - 一种IL-36的可溶性受体sIL-36R及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白介素‑36(IL‑36)的可溶性受体(sIL‑36R)，其仅含有IL‑36受体(IL‑36R)的配体结合区域，缺失跨膜区和胞内区，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该可溶性受体可以抑制IL‑36激活的NF‑KB和p38MAPK信号通路，抑制IL‑36诱导的炎症反应，抑制IL‑36诱导的抗菌蛋白REG3A的表达，以及可以减轻银屑病的病理症状，对银屑病有治疗作用。本发明还公开了该可溶性受体(sIL‑36R)的制备方法。

Description

一种IL-36的可溶性受体sIL-36R及其应用

技术领域

本发明涉及生物化学、分子生物学、免疫学和皮肤病学领域，涉及一种IL-36的可溶性受体sIL-36R及其应用，尤其涉及一种可溶性受体及其在抑制银屑病炎症应答和治疗银屑病的作用。

背景技术

银屑病(psoriasis)俗称牛皮癣，是一种由免疫介导的慢性炎症性皮肤病，其典型特征是患病皮肤出现大小不等的丘疹、红斑，表皮增生，表面覆盖着银白色鳞屑^1-4。银屑病不仅使皮肤产生斑块和脓疱，引起皮肤红肿、瘙痒，还可能造成指甲损伤和关节病变甚至导致关节畸形，不但使患者遭受身体上的痛苦，而且给患者带来了严重的精神伤害⁵。因目前对银屑病的发病机制仍知之甚少，所以至今没有根治银屑病的方法和药物。

已有研究发现IL-1家族细胞因子中的IL-36在银屑病患者皮损中的表达显著增加，和银屑病病理状态成正相关⁶。本发明课题组在研究皮肤受损诱发银屑病(Koebnerphenomenon)过程中发现受损细胞所释放的RNA通过直接激活角质形成细胞(keratinocyte,KC)上的TLR3诱导KC表达IL-36(包括IL-36α、IL-36β和IL-36γ)，IL-36又反过来作用于KC诱导KC表达REG3A来促进KC快速增殖，从而引发银屑病表皮增生^7,8。Manfred Kopf等证明IL-36不仅能作用于KC，还能诱导树突状细胞(Dendritic cell,DC)表达IL-23作用于Th17、γδT等细胞产生大量的IL-17。随后IL-17作用于KC，诱导KC表达大量的趋化因子和IL-36，形成银屑病的炎症应答循环体系⁹。另外，他们还发现将小鼠的IL-36R敲除后用咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)无法诱导出小鼠的银屑病病理症状。这些研究结果证明IL-36是诱发银屑病并维持银屑病病理状态的关键因子之一，而IL-36和其受体IL-36R也将作为银屑病治疗的潜在靶点。

IL-1家族细胞因子的活性和它们诱导的炎症反应会受到一些抑制剂的严格调控，这些抑制剂一部分是IL-1家族的拮抗剂，还有一部分是IL-1R家族中与膜结合且缺少胞内段的受体或者是可溶性的诱骗受体(decoy receptors)。在IL-1R家族中，已经发现了多种诱骗受体的存在。IL-1R2是上世纪80年代最先被克隆研究的受体。相较于80kDa的IL-1R1，IL-1R2由于缺少胞内区域，仅仅只有68kDa，导致IL-1R信号通路不能向下传递¹⁰。除了膜结合的形式，IL-1R2被细胞膜上的蛋白酶在临近IL-1R2胞外的位置切割后释放的胞外段可作为可溶性的IL-1R2，被切割下来的可溶性IL-1R2能与细胞膜上的IL-1R2竞争结合其配体来发挥抑制作用^11-15。另外，IL-1家族中的IL-33通常结合到受体ST2上发挥作用，而其可溶性受体sST2可作为诱骗受体与ST2竞争结合IL-33来抑制IL-33/ST2信号通路¹⁶。然而，关于IL-36家族是否含有天然的可溶性受体与IL-36R竞争结合IL-36，从而抑制IL-36/IL-36R信号通路，进而抑制、治疗、减轻、缓解银屑病的技术内容，目前尚未有相关的报道。

发明内容

本发明提出了一种白介素-36(IL-36)的可溶性受体(sIL-36R)，以及其制备方法和应用。该可溶性受体利用大肠杆菌体系表达后利用亲和层析和离子交换纯化获得。所述可溶性受体仅含有IL-36受体(IL-36R)的配体结合区域，缺失跨膜区和胞内区。该可溶性受体通过与IL-36R竞争结合IL-36来抑制IL-36/IL-36R激活的NF-KB和p38MAPK信号通路，抑制IL-36诱导的抗菌蛋白REG3A的表达，以及可以减轻由IL-36细胞因子诱导的炎症反应，抑制银屑病的病发，减轻银屑病的病理症状，对银屑病有治疗作用。

本发明所述可溶性受体可在生物体(如人体)正常生理状态下由IL-36R pre-mRNA可变性剪接产生。

2016年的JBC发表的Guanghui Yi,Structural and functional attributes ofthe Interleukin-36receptor中提到了白介素受体36胞外段的335、258以及126-211也能够抑制IL36诱导的IL36信号通路的激活(如图16所示)。但是从氨基酸序列对比来看，本发明提出的可溶性受体sIL36R与其序列长度不同，本发明所述可溶性受体sIL36R的序列更短，可以更好到应用转化，并且本发明是在细胞内发现的一种天然IL36信号通路的拮抗剂。

NF-KB，核因子活化B细胞κ轻链增强子(简称为NF-κB)，是一种控制DNA转录的蛋白复合体，由p50和p65两个亚基组成。NF-κB几乎存在于所有类型的动物细胞中并参与细胞对诸多刺激的响应。这些刺激包括应激、细胞因子、自由基、紫外线照射、氧化LDL及细菌或病毒抗原。在针对感染的免疫反应中，NF-κB起到了重要的调节作用(κ轻链是免疫球蛋白的重要组成部分)。NF-κB的调控失常与癌症、炎症和自身免疫病、感染性休克、病毒感染以及免疫发育异常有关。

p38MAPK，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)，是一组能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。由于MAPK是培养细胞在受到生长因子等丝裂原刺激时被激活而被鉴定的，因而得名。所有的真核细胞都能表达MAPK。MAPK通路的基本组成是一种从酵母到人类都保守的三级激酶模式，包括MAPK激酶激酶(MAP kinase kinasekinase,MKKK)、MAPK激酶(MKK)和MAPK，这三种激酶能依次激活，共同调节着细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应等多种重要的细胞生理/病理过程。促***素原活化蛋白激酶(MAP激酶,MAPK)链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，在基因表达调控和细胞质功能活动中发挥关键作用。MAPK链由3类蛋白激酶MAP3K-MAP2K-MAPK组成，通过依次磷酸化将上游信号传递至下游应答分子。

IL-36是指白介素36，属于白细胞介素-1家族的细胞因子，与急性、慢性炎症有关，在天然免疫应答中发挥重要的作用。包含三个成员分别为IL36α、IL36β以及IL36γ。

其中，所述白介素-36(IL-36)的可溶性受体(sIL-36R)的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：MGVTSLLFCGVFFLLLLFVAADTCEDIFMHNVIISEGQPFPFNCTYPPETNGAVNLTWYKTPSKSPVSNNRHLRVHQDQTWILFLPLTLEDSGIYQCVIRNAHNCYQIAVNLTVLKNHWCDSSMEGSPVNSPDVYQQILPIGKSGSLNCHLYFPESCALDSIKWYKGCEEIKAGKKYSPSGAKLLVNNVAVEDGGSYACSARLTHLGRHFTIRNYIAVNTKEVEYGRRIPNITYPKNNSIEVPLEPMCP。

其中，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列只含有全长受体(IL-36R)的配体结合区域，不含有全长受体(IL-36R)的跨膜区域和胞内区域。本发明SEQ ID NO.1所示的可溶性受体与IL-36R相比，不仅在长度不同，在功能上也不同于IL-36R。

本发明所述白介素-36(IL-36)的可溶性受体是由缺失第3个外显子IL-36R mRNA转录、翻译后得到，由于IL-36R mRNA缺失第3个外显子使得转录提前终止，因此翻译后蛋白只含有配体结合区域，分泌至胞外，如图1所示。

本发明还提供了所述白介素-36(IL-36)的可溶性受体在制备抑制IL-36γ诱导的细胞因子、趋化因子和抗菌蛋白产生的药物中的应用。体外实验表明IL-36γ能够诱导大量的趋化因子CXCL1、CCL20、CXCL2以及抗菌蛋白REG3A和细胞因子的表达，即，本发明所述的可溶性受体可以抑制IL-36γ诱导的趋化因子CXCL1、CCL20、CXCL2以及抗菌蛋白REG3A和细胞因子的表达。

本发明中，所述细胞因子包括Il23、Il17a。

本发明中，所述抗菌蛋白REG3A是指在肠道和皮肤上皮细胞表达的一种能够抑制细菌生长的蛋白。

本发明还提供了所述白介素-36(IL-36)的可溶性受体在制备抑制IL-36γ诱导的p38MAPK信号通路的药物中的应用。IL-36γ通过激活p38MAPK信号通路来诱导抗菌蛋白REG3A等的表达，即，本发明所述的可溶性受体可以抑制IL-36γ诱导的p38MAPK磷酸化。

本发明还提供了所述白介素-36(IL-36)的可溶性受体在制备抑制IL-36γ激活的NF-κB信号通路的药物中的应用。IL-36γ能够激活NF-κB来诱导趋化因子和细胞因子等的表达，即，本发明所述的可溶性受体可以抑制IL-36γ激活的NF-κB，进而抑制趋化因子和细胞因子的表达。

其中，所述趋化因子包括CCL20、CXCL1、CXCL2。

本发明还提供了所述白介素-36(IL-36)的可溶性受体在制备抑制角质形成细胞增殖的药物中的应用。其中，角质形成细胞划痕实验证明：IL-36γ能诱导角质形成细胞增殖来促进伤口愈合，本发明所述的可溶性受体可以抑制由IL-36γ诱导的细胞增殖，进而抑制伤口愈合。

本发明还提供了所述白介素-36(IL-36)的可溶性受体在制备抑制、治疗、减轻、缓解银屑病的药物中的应用。

所述可溶性受体与IL-36结合，抑制IL-36激活的IL-36R信号通路的活化，进而起到抑制、治疗、减轻、缓解银屑病的作用。其中，IL36激活的IL36R信号通路包含激活了下游的NF-KB和p38MAPK。

在IMQ诱导的银屑病小鼠中注射重组的本发明所述的可溶性受体蛋白能够缓解银屑病小鼠的病理症状，起到抑制、治疗、减轻、缓解银屑病的作用。

本发明还提供了一种抑制剂或药物组合物，其包括如上所述的可溶性受体sIL-36R。

本发明还提供了一种抑制、治疗、减轻、缓解银屑病的方法，向受试者个体施用如上所述的可溶性受体sIL-36R，或如上所述的抑制剂或药物组合物，进而抑制、治疗、减轻、缓解银屑病。

本发明首次提出了采用基因工程方法制备所述可溶性受体sIL-36R，所述方法利用大肠杆菌体系表达，然后通过离子交换和超滤纯化，获得所述可溶性受体sIL-36R。

具体地，所述方法包括以下步骤：

(1)载体构建

以常用于蛋白纯化的pET系列载体(pET32a)为构建载体，将从角质形成细胞克隆出的sIL36R的基因片段连入载体中，将构建的pET32a-sIL36R质粒进行测序鉴定后备用。

(2)转化大肠杆菌

将(1)中构建好且测序正确的pET32a-sIL36R质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中。

(3)培养、表达

待(2)中转化后的BL21(DE3)菌株在平板上长出菌落，接种单菌落培养过夜后，将过夜培养物转接于新鲜培养基中继续培养；当OD600为0.6～0.8时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，收集诱导后的菌体，进行破菌和洗涤；分别取诱导前后、破菌上清和沉淀以及洗涤后的上清沉淀的样品进行SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。

(4)纯化

溶解包涵体后，进行蛋白的复性和透析，滤膜过滤除菌后上柱(阴离子柱)，用不同浓度的洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱液进行SDS-PAGE检测目的蛋白洗脱情况。根据显示结果收集洗脱样品进行透析、超滤和浓缩，收集超滤前后样品进行SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况，其余样品分装后冻存于-80℃备用。

具体地，所述制备过程如实施例9所述。

本发明的有益效果在于：本发明提供的一种白介素-36(IL-36)的可溶性受体，可以抑制IL-36激活的IL-36R信号通路，进而减轻银屑病的炎症反应，达到治疗银屑病的目的。本发明提供的一种白介素-36(IL-36)的可溶性受体还可以抑制由IL36信号通路过度激活导致的炎症性疾病的发生。本发明中，所述可溶性受体只含有IL36R的部分结构即配体结合区，并不包含跨膜和信号传导结构，在功能上能起到抑制IL36R功能的作用。

附图说明

图1表示可溶性受体sIL-36R的mRNA和蛋白结构的简要示意图。

图2表示本发明可溶性受体具有结合IL-36γ的能力。

图3表示本发明可溶性受体具有能与IL-36R竞争结合IL-36γ的能力。

图4表示本发明可溶性受体在角质形成细胞中阻断IL-36γ激活的IL-36R信号通路，其中，A为可溶性受体在角质形成细胞中阻断IL-36γ诱导的p38MAPK的磷酸化；B为可溶性受体在角质形成细胞中阻断IL-36γ诱导的NF-κB亚基p65的磷酸化。

图5表示本发明可溶性受体抑制IL-36γ激活的NF-KB启动子。

图6表示本发明可溶性受体抑制IL-36γ激活的AP-1。

图7表示本发明可溶性受体在角质形成细胞中抑制IL-36γ诱导的趋化因子；其中，A为可溶性受体在角质形成细胞中抑制IL-36γ诱导CCL20的表达；B为可溶性受体在角质形成细胞中抑制IL-36γ诱导CXCL1的表达；C为可溶性受体在角质形成细胞中抑制IL-36γ诱导CXCL2的表达；D为可溶性受体在角质形成细胞中抑制IL-36γ诱导REG3A mRNA的表达。

图8表示本发明可溶性受体在角质形成细胞中抑制IL-36γ诱导的REG3A蛋白的表达。

图9表示本发明可溶性受体在角质形成细胞中抑制IL-36γ促进的细胞增殖和伤口愈合；其中，A为细胞划痕实验统计图；B为转染空载质粒用IL-36γ刺激前的划痕照片；C为转染可溶性受体质粒用IL-36γ刺激前的划痕照片；D为转染空载质粒用IL-36γ刺激后的划痕照片；E为转染可溶性受体质粒用IL-36γ刺激后的划痕照片。

图10表示实施例9重组sIL-36R蛋白的制备；其中，A为在大肠杆菌中诱导表达sIL-36R蛋白，蛋白以包涵体的形式存在；B为用不同浓度NaCl洗脱的sIL-36R蛋白，50mM-250mMNaCl为最佳洗脱范围；C为超滤浓缩纯化得到的sIL-36R蛋白。

图11表示注射重组sIL-36R蛋白能够减缓银屑病样小鼠的病症。

图12表示注射重组sIL-36R蛋白使得银屑病样小鼠耳朵厚度变薄。

图13表示注射重组sIL-36R蛋白抑制银屑病样小鼠皮损中趋化因子和炎症因子mRNA的表达；其中，A为注射重组sIL-36R蛋白抑制银屑病样小鼠皮损中Ccl20的表达；B为注射重组sIL-36R蛋白抑制银屑病样小鼠皮损中Mip2的表达；C为注射重组sIL-36R蛋白抑制银屑病样小鼠皮损中Il23的表达；D为注射重组sIL-36R蛋白抑制银屑病样小鼠皮损中Il17a的表达。

图14表示注射重组sIL-36R蛋白使银屑病样小鼠皮损中CD45阳性细胞、树突状细胞以及中性粒细胞的募集减少；其中，A为注射重组sIL-36R蛋白使银屑病样小鼠皮损中CD45阳性细胞减少；B为注射重组sIL-36R蛋白使银屑病样小鼠皮损中CD45阳性CD11c阳性的树突状细胞减少；C为注射重组sIL-36R蛋白使银屑病样小鼠皮损中CD45阳性Ly6G阳性的中性粒细胞减少。

图15表示注射重组sIL-36R蛋白抑制银屑病样小鼠皮损中p38MAPK、NF-KB的磷酸化水平(活化)以及IL36γ蛋白的表达。

图16表示文献Guanghui Yi,JBC,2016中提到的白介素受体示意图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：可溶性受体具有结合IL-36γ的能力

培养人肾上皮细胞(293T)细胞，接种在10cm皿中，设置三组进行实验，当293T细胞长至70％时，第一组向细胞内转染对应的空载(EV)，第二组向细胞内转染带Flag标签的IL-36R质粒，第三组转染带Flag标签的如本发明SEQ ID NO.1所示的可溶性受体sIL-36R超表达质粒，6h换液，换液后待36h后轻柔的吹下细胞，各自收取在EP管中用PBS洗两次，用加有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行细胞裂解收取蛋白，将三组收取的蛋白与Flagbeads共孵育过夜后用Flag peptides竞争洗脱，将三组洗脱下来的蛋白测取浓度后，将等摩尔的空载组蛋白、IL-36R-Flag和sIL-36R-Flag分别与IL-36γ-6his 4℃孵育过夜，加入Flagbeads再孵育2h后，用Washbuffer洗5次后将Flagbeads富集的蛋白用蛋白免疫印迹法检测IL36γ-his的表达。

实验结果表明，如图2所示，转染空载组为对照，没有可视的IL36γ条带证明其没有与IL36γ结合；而转染IL-36R质粒和sIL-36R质粒组都通过免疫印迹法显示出IL36γ条带，证明sIL-36R与IL-36R一样具有受体的特征能够和其配体IL-36γ进行结合。

实施例2：可溶性受体具有与IL-36R竞争结合IL-36γ的能力

培养人***上皮(Hela)细胞，接种在6孔板里，当Hela细胞长至70％时，一组向Hela细胞内转染带GFP标签的IL-36R质粒，另一组向细胞内共同转染带GFP标签的IL-36R质粒和如本发明SEQ ID NO.1所示的可溶性受体超表达质粒sIL-36R，6h换液，换液后待36h后加入带6xhis标签的IL-36γ蛋白刺激。45分钟后弃去上清，轻柔的吹下细胞收集在EP管中用PBS洗两次后用PE-anti-his的染料进行染色30分钟，然后用PBS洗两次后过滤细胞，用流式细胞仪分析两组处理组中GFP+PE+双阳性的细胞的百分比，纵坐标SSC-H指征细胞位置。实验结果表明，如图3所示，当sIL-36R与IL-36R同时存在的情况下，sIL-36R能与IL-36R竞争结合IL-36γ，既有GFP荧光又含有PE荧光的细胞从35.2％下降到27.6％，说明因为超表达sIL-36R后竞争结合了一部分IL-36γ而使IL36R结合的IL-36γ减少。

实施例3：可溶性受体在角质形成细胞中阻断IL-36γ激活的IL-36R信号通路

培养人角质形成细胞(NHEK)细胞，接种在6孔板内，当NHEK细胞长至70％时，向NHEK细胞内转染如本发明SEQ ID NO.1所示的可溶性受体超表达质粒sIL-36R，6h换液，换液后待24h后用将100ng/ml重组IL-36γ蛋白刺激细胞30分钟之后收集蛋白，蛋白免疫印迹法检测p38MAPK和p65的磷酸化。实验结果表明，如图4所示，IL-36γ可以诱导p38MAPK以及p65的磷酸化，通过免疫印迹法可以看到，当GAPDH内参蛋白一致的情况下，IL36γ能够明显诱导p38MAPK以及NF-κB亚基p65的磷酸化即p-p38和p-p65的表达。当超表达sIL-36R质粒后，IL-36γ诱导的p38MAPK以及p65的磷酸化条带减弱，说明超表达可溶性受体后则抑制了IL-36γ诱导的p38MAPK以及p65的磷酸化。

实施例4：可溶性受体抑制IL-36γ激活的NF-KB启动子

培养人***上皮(Hela)细胞，接种在24孔板内，当Hela细胞长至70％时，向Hela细胞内共转如本发明SEQ ID NO.1所示的可溶性受体超表达质粒sIL-36R、NF-κB启动子质粒以及Renillna质粒，对照组共转如本发明SEQ ID NO.1所示的可溶性受体超表达质粒的空载(pCMV)、NF-κB启动子质粒以及Renillna质粒，每三个孔为一个复孔，设置6个可溶性受体超表达质粒的转染浓度梯度：0ng、50ng、100ng、150ng、200ng、250ng，转染完6h换液同时加入100ng/ml IL-36γ，24h后用荧光素酶报告基因试剂盒检测每个孔的荧光读值。如图5所示，转染250ng的可溶性受体质粒组可以显著抑制IL-36γ激活的NF-κB启动子活性，说明可溶性受体能够很好地抑制IL-36γ激活的NF-κB启动子的活性。

实施例5：可溶性受体抑制IL-36γ促进的AP-1启动子的激活

培养人***上皮(Hela)细胞，接种在24孔板内，当细胞长至70％时，向细胞内共转如本发明SEQ ID NO.1所示的可溶性受体超表达质粒sIL-36R、AP-1启动子质粒，对照组共转如本发明SEQ ID NO.1所示的可溶性受体超表达质粒的空载(pCMV)、AP-1启动子质粒，每三个孔为一个复孔，设置6个可溶性受体超表达质粒的转染浓度梯度：0ng、50ng、100ng、150ng、200ng、250ng，转染完6h换液同时加入100ng/ml IL-36γ，24h后加入反应底物，检测每个孔的吸收光读值。

如图6所示，IL-36γ可以激活AP-1启动子，而可溶性受体则抑制IL-36γ激活的AP-1启动子的活性，可以使激活的AP-1反应的底物量从60U/L降低到40U/L。

实施例6：可溶性受体在角质形成细胞中抑制IL-36γ诱导的炎症因子和趋化因子

培养人角质形成细胞(NHEK)细胞，接种在6孔板内，当细胞长至70％时，向细胞内转染如本发明SEQ ID NO.1所示的可溶性受体超表达质粒，6h换液，换液后待24h后将细胞用胰酶消化均分到24孔板内，待细胞贴壁长到70％，加入100ng/ml IL-36γ，6h之后抽提RNA检测趋化因子CCL20、CXCL1、CXCL2以及抗菌肽REG3A的表达。

实验结果表明，如图7所示，IL-36γ能够诱导大量的趋化因子CCL20、CXCL1、CXCL2以及抗菌肽REG3A的表达，超表达可溶性受体后能够抑制IL-36γ诱导的趋化因子CCL20、CXCL1、CXCL2以及抗菌肽REG3A的表达。

实施例7：可溶性受体在角质形成细胞中抑制IL-36γ诱导的抗菌蛋白REG3A的表达

培养人角质形成细胞(NHEK)细胞，接种在6孔板内，当细胞长至70％时，实验分为六组，第一和第四组不做转染处理，第二组和四五组向细胞内转染带空载对照质粒PCMV，而第三组和第六组向细胞内如本发明SEQ ID NO.1所示的可溶性受体超表达质粒sIL-36R，6h换液，向第四、五、六组加入100ng/ml IL-36γ，6h之后收集蛋白，通过蛋白免疫印迹法检测REG3A的表达。

实验结果如图8所示，在内参蛋白Actin一致的情况下，IL-36γ可以诱导大量REG3A的表达，而超表达可溶性受体后则可以抑制IL-36γ诱导的REG3A蛋白的表达。

实施例8：可溶性受体在角质形成细胞中抑制IL-36γ诱导的细胞增殖和伤口愈合

在12孔板中接种HaCaT细胞，当HaCaT细胞密度达到60％时，实验分为四组，第一组和第三组转染对照空载质粒PCMV，第二组和第四组转染如本发明SEQ ID NO.1所示的可溶性受体质粒，6h换液，24h后用1ml Tip在培养板底部正中间划出一道伤口，DPBS洗去漂浮的细胞，加入培养基，向第二组和第四组孔内加入IL-36γ，拍照统计伤口。

实验结果表明，如图9所示，选取40h伤口照片，与初始伤口进行对比显示和左图数据统计都可明显看出，超表达可溶性受体质粒会在Hacat细胞中抑制IL-36γ促进细胞增殖而抑制伤口愈合。

实施例9：可溶性sIL36R蛋白的制备

以角质形成细胞的总RNA反转录的cDNA为模板，用克隆引物进行PCR扩增sIL36R的基因片段,将PCR产物纯化后，进行双酶切***pET32a载体，获得pET32a-His-sIL36R质粒后测序鉴定。将测序正确的pET32a-His-sIL36R质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，接种单菌落培养过夜；转接8mL过夜培养物于200ml LB(Amp+)培养基中继续培养；当OD600为0.6～0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG，37℃，220rpm诱导4h；4℃，6000rpm离心30min收集菌体，用破菌缓冲液(Tris 50mM、NaCl 250mM、Imizol 20mM；pH＝8.0)重悬后冰浴超声破碎菌体；4℃，12000rpm离心20min，弃上清，包涵体沉淀用包涵体洗涤缓冲液(Tris 20mM、NaCl 50mM、EDTA 5mM、1％Trition-X 100；pH＝8.0)洗涤两次；分别取诱导前后、破菌上清和沉淀以及洗涤后的上清沉淀的样品进行SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。如图10所示，重组蛋白pET32a-sIL36R(250aa,27.927kDa,pI为6.74)通过IPTG诱导表达了，但是表达的目的蛋白主要是不可溶的包涵体。向洗涤后的包涵体中加5mL溶解缓冲液(50mM Tris、6M Gua-HCl、10mM DTT；pH＝8.0)溶解包涵体，用移液枪吹散后置于4℃摇床过夜；4℃，12000rpm离心20min，取上清，置于20mL注射器，下方用1mL针头，逐滴加入复性缓冲液(50mM PB、250mMNaCl、10mM KCl、0.5M Arg、1mM EDTA、0.05％PEG4000、0.05％Triton X-100、1mM GSH、0.1mM GSSG；pH＝8.0)，4℃静置24h；4℃，12000rpm离心20min，取上清，用透析袋进行透析24h，每隔4h更换一次透析缓冲液(20mM PB)；4℃，12000rpm离心20min，用灭菌的0.22μm滤膜过滤除菌后上柱(阴离子柱)，用20ml不同浓度的洗脱缓冲液(不同浓度的NaCl溶解于20mM PB洗脱，将洗脱液各取40μl加入10μl 5×蛋白上样缓冲液煮样后进行SDS-PAGE，检测目的蛋白洗脱情况。如图10所示，目的蛋白主要是在50～250mMNaCl的PB洗脱缓冲液(#4～8)范围内被洗脱下来。将50mM NaCl，以及合并的100～250mM NaCl范围内的洗脱样品，用透析袋进行透析；然后用超滤管超滤浓缩50mM和100-250mM洗脱下来的蛋白，用灭菌的0.22μm滤膜过滤除菌后，取样测蛋白浓度并进行SDS-PAGE检测，其余样品分装后冻存于-80℃备用。

实施例10：注射重组sIL36R蛋白能够减缓银屑病小鼠的病理症状

纯化得到如实施例1所示的可溶性受体蛋白，在WT小鼠的左耳注射PBS对照，右耳注射500ng sIL-36R蛋白，隔一天后在小鼠耳朵涂抹10mg的咪喹莫特乳膏(IMQ)，每天对病灶部位进行拍照，连续涂抹药膏7天。

实验结果表明，如图11、12所示，从第一天拍照起(D0)诱导六天(D6)，注射本发明可溶性受体蛋白的小鼠相较于对照组红肿皮屑症状明显减轻。且统计数据后，注射PBS组耳朵厚度为0.6mm，而注射可溶性受体蛋白的小鼠耳朵厚度则在0.4左右，耳朵厚度明显变薄。

如图13所示，通过抽提组织的RNA并且定量检测趋化因子和细胞因子在mRNA水平上的变化，发现可溶性受体注射组银屑病小鼠皮损中趋化因子Ccl20几乎检测不到、而趋化因子Mip2以及细胞因子Il23、Il17a的mRNA水平相较于对照组银屑病小鼠明显降低。

如图14所示，CD45阳性细胞、中性粒细胞(CD45阳性Ly6G阳性细胞)和树突状细胞(CD45阳性CD11c阳性细胞)的比例都低于对照组。

如图15所示，通过免疫印迹法检测了注射PBS和注射可溶性受体组小鼠各五只，发现注射可溶性受体组银屑病小鼠皮损中p38MAPK、NF-KB的磷酸化水平以及IL36γ蛋白的表达与注射PBS组相比条带减弱，表明注射可溶性受体后减弱了银屑病中的p38MAPK、NF-KB的磷酸化。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

1Rosa,P.,Symmons,D.P.M.,Griffiths,C.E.M.&Ashcroft,D.M.Globalepidemiology of psoriasis:a systematic review of incidence andprevalence.Journal of Investigative Dermatology133,377-385(2013).

2Lebwohl,M.Psoriasis.Lancet361,1197-1204(2003).

3Griffiths,C.E.&Barker,J.N.Pathogenesis and clinical features ofpsoriasis.Lancet370,263-271(2007).

4Grine,L.,Dejager,L.,Libert,C.&Vandenbroucke,R.E.An inflammatorytriangle in psoriasis:TNF,type I IFNs and IL-17.Cytokine&Growth FactorReviews26,25-33(2015).

5Rapp,S.R.,Feldman,S.R.,Exum,M.L.,Jr,F.A.&Reboussin,D.M.Psoriasiscauses as much disability as other major medical diseases.Journal of theAmerican Academy of Dermatology41,401-407(1999).

6Lorenzi,S.IRF1 and NF-kB in neuroblastoma:from immune escape toimmune recognition.(2013).

7Jiang,Z.et al.Interleukin-36γinduced by the TLR3-SLUG-VDR axispromotes wound healing via REG3A.Journal of Investigative Dermatology137,S0022202X17327379(2017).

8Lai,Y.et al.The Antimicrobial Protein REG3A Regulates KeratinocyteProliferation and Differentiation after Skin Injury.Immunity37,74-84(2012).

9Luigi,T.et al.Psoriasiform dermatitis is driven by IL-36-mediatedDC-keratinocyte crosstalk.Journal of Clinical Investigation122,3965(2012).

10Mcmahan,C.J.et al.A novel IL-1 receptor,cloned from B cells bymammalian expression,is expressed in many cell types.Embo Journal10,2821-2832(1991).

11Cui,X.,Rouhani,F.N.,Hawari,F.&Levine,S.J.Shedding of the Type IIIL-1 Decoy Receptor Requires a Multifunctional Aminopeptidase,AminopeptidaseRegulator of TNF Receptor Type 1 Shedding.Journal of immunology171,6814-6819(2003).

12Kuhn,P.H.et al.Regulated Intramembrane Proteolysis of theInterleukin-1 Receptor II byα-,β-,and γ-Secretase.Journal of BiologicalChemistry282,11982-11995(2007).

13Lorenzen,I.et al.The membrane-proximal domain of A Disintegrin andMetalloprotease 17(ADAM17)is responsible for recognition of the interleukin-6receptor and interleukin-1 receptor II.Febs Letters586,1093-1100(2012).

14Martin,P.et al.A10.02 Deficiency in IL-1 receptor type 2 aggravatesK/BXN serum transfer-induced arthritis in mice,but has no effect inendotoxemia.Cytokine76,92-92(2015).

15Reddy,P.et al.Functional analysis of the domain structure of tumornecrosis factor-alpha converting enzyme.Journal of Biological Chemistry275,14608(2000).

16Palmer,G.,Lipsky,B.P.,Smithgall,M.D.&Meininger,D.The IL-1 receptoraccessory protein(AcP)is required for IL-33 signaling and soluble AcPenhances the ability of soluble ST2 to inhibit IL-33.Cytokine42,358-364(2008).

SEQUENCE LISTING

<110> 华东师范大学

<120> 一种IL-36的可溶性受体sIL-36R及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 249

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Gly Val Thr Ser Leu Leu Phe Cys Gly Val Phe Phe Leu Leu Leu

1 5 10 15

Leu Phe Val Ala Ala Asp Thr Cys Glu Asp Ile Phe Met His Asn Val

20 25 30

Ile Ile Ser Glu Gly Gln Pro Phe Pro Phe Asn Cys Thr Tyr Pro Pro

35 40 45

Glu Thr Asn Gly Ala Val Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Thr Pro Ser Lys

50 55 60

Ser Pro Val Ser Asn Asn Arg His Leu Arg Val His Gln Asp Gln Thr

65 70 75 80

Trp Ile Leu Phe Leu Pro Leu Thr Leu Glu Asp Ser Gly Ile Tyr Gln

85 90 95

Cys Val Ile Arg Asn Ala His Asn Cys Tyr Gln Ile Ala Val Asn Leu

100 105 110

Thr Val Leu Lys Asn His Trp Cys Asp Ser Ser Met Glu Gly Ser Pro

115 120 125

Val Asn Ser Pro Asp Val Tyr Gln Gln Ile Leu Pro Ile Gly Lys Ser

130 135 140

Gly Ser Leu Asn Cys His Leu Tyr Phe Pro Glu Ser Cys Ala Leu Asp

145 150 155 160

Ser Ile Lys Trp Tyr Lys Gly Cys Glu Glu Ile Lys Ala Gly Lys Lys

165 170 175

Tyr Ser Pro Ser Gly Ala Lys Leu Leu Val Asn Asn Val Ala Val Glu

180 185 190

Asp Gly Gly Ser Tyr Ala Cys Ser Ala Arg Leu Thr His Leu Gly Arg

195 200 205

His Phe Thr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala Val Asn Thr Lys Glu Val Glu

210 215 220

Tyr Gly Arg Arg Ile Pro Asn Ile Thr Tyr Pro Lys Asn Asn Ser Ile

225 230 235 240

Glu Val Pro Leu Glu Pro Met Cys Pro

245

Claims (13)

1.一种IL-36的可溶性受体sIL-36R，其特征在于，所述受体仅包括IL-36R的配体结合区域；其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MGVTSLLFCGVFFLLLLFVAADTCEDIFMHNVIISEGQPFPFNCTYPPETNGAVNLTWYKTPSKSPVSNNRHLRVHQDQTWILFLPLTLEDSGIYQCVIRNAHNCYQIAVNLTVLKNHWCDSSMEGSPVNSPDVYQQILPIGKSGSLNCHLYFPESCALDSIKWYKGCEEIKAGKKYSPSGAKLLVNNVAVEDGGSYACSARLTHLGRHFTIRNYIAVNTKEVEYGRRIPNITYPKNNSIEVPLEPMCP。

2.如权利要求1所述的可溶性受体sIL-36R，其特征在于，所述氨基酸序列只含有全长受体IL-36R的配体结合区域，不具有全长受体IL-36R的跨膜区域和胞内区域。

3.如权利要求1所述的可溶性受体sIL-36R在制备抑制IL-36诱导的细胞因子、趋化因子和抗菌蛋白产生的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述细胞因子包括Il23、Il17a。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述趋化因子包括CXCL1、CCL20、CXCL2。

6.如权利要求3所述的可溶性受体sIL-36R在制备抑制IL-36诱导的抗菌蛋白REG3A表达的药物中的应用。

7.如权利要求1所述的可溶性受体sIL-36R在制备抑制IL-36激活的p38 MAPK和/或NF-KB的药物中的应用。

8.如权利要求1所述的可溶性受体sIL-36R在制备抑制角质形成细胞增殖的药物中的应用。

9.如权利要求1所述的可溶性受体sIL-36R在制备抑制、治疗、减轻、缓解银屑病的药物中的应用。

10.如权利要求3-9之任一项所述的应用，其特征在于，所述受体与IL-36结合，抑制IL-36激活的IL-36R信号通路的活化，进而起到抑制、治疗、减轻、缓解银屑病的作用。

11.一种抑制剂或药物组合物，其特征在于，其包括如权利要求1所述的可溶性受体sIL-36R。

12.一种抑制、治疗、减轻、缓解银屑病的方法，其特征在于，向受试者个体施用如权利要求1所述的可溶性受体sIL-36R，或如权利要求11所述的抑制剂或药物组合物，进而抑制、治疗、减轻、缓解银屑病。

13.如权利要求1或2所述的可溶性受体sIL-36R的制备方法，其特征在于，利用大肠杆菌体系表达，然后通过离子交换和超滤纯化，获得所述可溶性受体sIL-36R。

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