MX2010008394A - Metodos optimizados para administracion de arndc focalizando el gen pcsk9. - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a métodos optimizados para tratar enfermedades causadas por expresión de gen PCSK9.

Description

MÉTODOS OPTIMIZADOS PARA ADMINISTRACIÓN DE ARNdc FOCALIZANDO EL GEN PCSK9 REFERENCIA CRUZADA DE LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 61/024,968, presentada el 1 de enero de 2008, la cual se incorpora a la presente por referencia en su totalidad, y reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 61/039,083, presentada el 24 de marzo de 2008, la cual se incorpora a la presente por referencia en su totalidad, y reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 61/076,54.8, presentada el 27 de junio de 2008, la cual se incorpora a la presente por referencia en su totalidad, y reclama el beneficio de la solicitud provisional de E.U.A. No. 61/188,765, presentada el 11 de agosto de 2008, la cual se incorpora a la presente por referencia en tu totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a métodos optimizados para tratar enfermedades causadas por expresión del gen PCSK9.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (PCSK9) es un miembro de la familia subtilisina serina proteasa. Las otras ocho subtilisi a proteasas de mamífero, PCSK1 -PCSK8 (también llamadas PC1/3, PC2, furina, PC4, PC5/6, PACE4, PC7, y S1P/SKI-1) son proproteínas convertasas que procesan una amplia variedad de proteínas en el trayecto secretorio y juegan roles en diversos procesos biológicos (Bergeron, F. (2000) J. Mol. Endocrinol. 24, 1-22, Gensberg, K., (1998) Semin. Cell Dev. Biol. 9, 11-17, Seidah, N. G. (1999) Brain Res. 848, 45-62, Taylor, N. A., (2003), FASEB J. 17, 1215-1227, y Zhou, A., (1999) J. Biol. Chem. 274, 20745-20748). PCSK9 ha sido propuesto para jugar un rol en el metabolismo de colesterol. La expresión de PCSK9 ARNm es regulada descendente al alimentar colesterol alimenticio en ratones (Maxwell, K. N., (2003) J. Lipid Res. 44, 2109-2119), es regulada ascendente por estatinas en células HepG2 (Dubuc, G., (2004) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 1454-1459), y es regulada ascendente en ratones transgénicos de proteína de unión de elemento regulador (SREBP) (Horton, J. D., (2003) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 100, 12027-12032), similar a las enzimas biosintéticas de colesterol y el receptor de lipoproteína de baja densidad (LDLR). Además, se ha descubierto que las mutaciones sin sentidos invertidas de PCSK9 están asociadas con una forma de hipercolesterolemia dominante autosomal (Abifadel, M., y otros (2003) Nat. Genet. 34, 154-156, Timms, K. M. , (2004) Hum. Genet. 114, 349-353, Leren, T. P. (2004) Clin. Genet. 65, 419-422). PCSK9 también puede jugar un rol en determinar niveles de colesterol de LDL en la población general, ya que los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) se han asociado con niveles de colesterol en una población japonesa (Shioji, K., (2004) J. Hum. Genet. 49, 109-114).

Las hipercolesterolemias dominantes autosomales (ADHs) son enfermedades monogénicas en donde los pacientes exhiben niveles de colesterol LDL y elevados totales, xantomas de tendón, y aterosclerosis prematura (Rader, D. J., (2003) J. Clin. Invest. 111, 1795-1803). La patogénesis de ADHs y una forma recesiva, hipercolesterolemia recesiva autosomal (ARH) (Cohén, J. C, (2003) Curr. Opín. Lipidol. 14, 121-127), se debe a defectos en absorción de LDL por el hígado. ADH puede ser causado por mutaciones de LDLR, que previenen absorción de LDL, o por mutaciones en la proteína en LDL, apolipoproteína B, que se une al LDLR. ARH es causado por mutaciones en la proteína ARH que son necesarias para endocitosis del complejo LDLR-LDL vía su interacción con clatrina. Por lo tanto, si la mutaciones d PCSK9 son causativas en familias de Hchola3, parece probable que PCSK9 juegue un rol en absorción de LDL mediada por receptor.

Estudios, de sobre-expresión señalan un rol para PCSK9 en controlar niveles de LDLR y, por tanto, absorción de LDL por el hígado (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., y otros (2004) J. Biol. Chem. 279, 48865-48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638). La sobre-expresión mediada por adenovirus de ratón o PCSK9 humano durante 3 ó 4 días en ratones resulta en niveles de colesterol elevados totales y LDL; este efecto no se observa en animales "knock-out" de LDLR (Maxwell, K. N. (2004) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101, 7100-7105, Benjannet, S., y otros (2004) J. Biol. Chem. 279, 48865-48875, Park, S. W., (2004) J. Biol. Chem. 279, 50630-50638). Además, la sobre-expresión de PCSK9 resulta en una reducción severa en proteína LDLR hepática, sin afectar niveles de ARNm LDLR, niveles de proteína SREBP, o relación nuclear a citoplásmica de proteína SREBP.

La pérdida de mutaciones de función en PCSK9 se han diseñado en modelos de ratón (Rashid y otros (2005) PNAS, 102, 5374-5379), e identificado en individuos humanos (Cohén y otros (2005) Nature Genetics 37:161-165). En ambos casos, la pérdida dé función de PCSK9 conduce a disminuir colesterol total y LDLc. En un estudio de resultado retrospectivo sobre 15 años, la pérdida de una copia de PCSK9 fue mostrada para cambiar niveles de LDLc y conducir a una protección aumentada de riesgo-beneficio de desarrollar enfermedad del corazón cardiovascular (Cohén y otros, (2006) N. Engl. J. Med., 354:1264-1272).

Recientemente, se ha mostrado que las moléculas de ARN de doble cadena (ARNdc) bloquean expresión de gen en un mecanismo regulador altamente conservado conocido como interferencia de ARN (ARNi). WO 99/32619 (Fire y otros) describe el uso de un ARNdc de por lo menos 25 nucleótidos en longitud para inhibir la expresión de genes en C. elegans. También se ha mostrado que ARNdc degrada ARN dirigido en otros organismos, incluyendo plantas (ver, por ejemplo, WO 99/53050, Waterhouse y otros; y WO 99/61631, Heifetz y otros), Drosophila (ver, por ejemplo, Yang, D., y otros, Curr. Biol. (2000) 10:1191-1200), y mamíferos (ver WO 00/44895, Limmer; y DE 101 00 586.5, Kreutzer y otros). Este mecanismo natural ahora se ha convertido en el foco para el desarrollo de una clase nueva de agentes farmacéuticos para tratar trastornos que son causados por la regulación aberrante o no deseada de un gen.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención provee métodos para tratar un sujeto que tiene un trastorno, por ejemplo, hiperlipidemia, síndrome metabólico, o un trastorno mediado por PCSK9, por la administración de un ácido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) focalizado a un gen PCSK9.

Por consiguiente, en la presente se describe un método para inhibir expresión de un gen PCSK9 en un sujeto, por ejemplo, un humano, el método que comprende administrar una primera dosis de un ARNdc focalizado al gen PCSK9 y después de un intervalo de tiempo administrar opcionalmente una segunda dosis del ARNdc en donde el intervalo de tiempo es no menos de 7 días. En algunas modalidades, el método inhibe expresión del gen PCSK9 por al menos 40% o por al menos 30%.

En una modalidad, el método incluye una sola dosis de ARNdc. El método puede disminuir colesterol de LDL de suero en el sujeto. En algunas modalidades, el método reduce colesterol de LDL de suero en el sujeto por al menos 7 días o al menos 14 días, o por lo menos 21 días. En otras modalidades, el método reduce colesterol de LDL de suero en el sujeto por al menos 30%. El método puede reducir colesterol de LDL de suero dentro de 2 días o dentro de 3 días o dentro de 7 días de administración de la primera dosis. En otra modalidad, el método reduce colesterol de LDL de suero por al menos 30% dentro de 3 días.

En otra modalidad, se reducen niveles de ApoB de suero circulante o :los niveles de HDLc son estables o los niveles de triglicéridos son estables o los niveles de triglicéridos en el hígado son estables o los niveles de colesterol en el hígado son estables. Todavía en otra modalidad, el método aumenta los niveles receptores de LDL (LDLR).

Además, el método puede reducir colesterol de suero total en el sujeto. En un aspecto, el método reduce colesterol total en el sujeto durante al menos 7 días o durante al menos 10 días o durante al menos 14 días o por lo menos 21 días. En otro aspecto, el método reduce el colesterol total en el sujeto por al menos 30%. En otro aspecto, el método reduce el colesterol total dentro de 2 días o dentro de 3 días o dentro de 7 días de administración.

El ARNdc usado en el método de la invención focaliza un gen PCSK9. En una modalidad, el ARNdc es un ARNdc descrito en la tabla 1a, tabla 2a, tabla 5a, o tabla 6 ó AD-3511. En otra modalidad, el objeto PCSK9 es SEC ID NO: 1523 o el ARNdc comprende una cadena de sentido que comprende por lo menos un desadaptación interno a SEC ID NO: 1523. En otra modalidad, el ARNdc comprende una cadena de sentido que consiste de SEC ID NO: 1227 y la cadena anti-sentido consiste de SEC ID NO: 1228. El ARNdc puede ser, por ejemplo, AD-9680.

Alternativamente, el ARNdc es focalizado a SEC ID NO: 1524 o el ARNdc comprende una cadena de sentido que comprende por lo menos un desadaptación interno a SEC ID NO: 1524. En un aspecto, el ARNdc comprende una cadena de sentido que consiste de SEC ID NO: 457 y una cadena anti-sentido que consiste de SEC ID NO: 458. El ARNdc puede ser, por ejemplo, AD-10792.

Como se describe en la presente, el método usa un ARNdc que comprende una cadena anti-sentido sustancialmente complementaria a menos de 30 nucleótidos consecutivos de un ARNm codificando PCSK9. En una modalidad, el ARNdc comprende una cadena anti-sentido sustancialmente complementaria a 19-24 nucleótidos de un ARNm codificando PCSK9. En otra modalidad, cada cadena del ARNdc es 19, 20, 21, 22, 23 ó 24 nucleótidos en longitud. En otra modalidad, por lo menos una cadena del ARNdc incluye por lo menos un nucleótido modificado adicional, por ejemplo, un nucleótido modificado con 2'-0-metilo, un nucleótido teniendo un grupo de 5'-fosforotioato, un nucleótido terminal enlazado a un derivado de colesteri lo , un nucleótido modificado con 2'-desoxi-2'-fluoro, un nucleótido modificado con 2'-desoxi, un nucleótido cerrado, un nucleótido abásico, un nucleótido 2'-amino-modificado, un nucleótido 2'-alquilo-modificado, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, y una base no' natural que comprende nucleótido. En un aspecto, el ARNdc se conjuga a un ligando, por ejemplo, un agente que facilita absorción sobre células de hígado, por ejemplo, Col-p-(GalNAc)3 (N-acetilo galactosamina colesterol) o LCO(GalNAc)3 (N-acetil galactosamina - 3'-Litocólico-oleoilo.

En el método de la invención, el ARNdc se puede administrar en una formulación. En una modalidad, el ARNdc se administra en una formulación de lípido, por ejemplo, una formulación de LNP o SNALP. El ARNdc se puede administrar a una dosificación de aproximadamente 0.01, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5 ó 5 mg/kg. En algunas modalidades, ARNdc se administra subdérmica o subcutánea o intravenosamente. En otras modalidades, un segundo compuesto se co-administra con el ARNdc, por ejemplo, un segundo compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de un agente para tratar hipercolesterolemia, aterosclerosis y dislipidemia, por ejemplo, una e s t a t i n a .

En algunas modalidades del método, el sujeto es un primate, por ejemplo, un humano, por ejemplo, un humano hiperlipidémico.

La invención también provee una composición que comprende cualquiera del ARNdc aislado descrito en la tabla 6 o el ARNdc AD-3511. En algunas modalidades, por lo menos una cadena del ARNdc descrito en la tabla 6 o AD3511 incluye por lo menos un nucleótido modificado adicional, por ejemplo, un nucleótido 2'-0-metilo modificado, un nucleótido que tiene un grupo 5'-fosforotioato, un nucleótido terminal enlazado a un derivado de colesterilo, un nucleótido 2'-desox¡-2'-fluoro modificado, un nucleótido 2'-desoxi-modificadó, un nucleótido cerrado, un nucleótido abásico, un nucleótido 2'-amino-modificado, un nucleótido 2'-alquilo-modificado, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, o una base no natural que comprende nucleótido.

En una modalidad de la composición, el ARNdc se conjuga a un ligando, por ejemplo, a un agente que facilita absorción sobre células del ¡ hígado, por ejemplo, a Col-p-(GalNAc)3 (N-acetil galactosamina colesterol) o LCO(GalNAc)3 (N-acetil galactosamina -3'-Litocólico-oleoilo.

En otra modalidad de la composición, el ARNdc está en una formulación de lípido, por ejemplo, una formulación de LPN o SNALP.

Los detalles de una o más modalidades de la invención se establecen en los dibujos acompañantes y la descripción a continuación. Otras características, objetos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la descripción y dibujos, y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los prefijos "AD-", "DP-" y "AL-DP-" se usan de manera intercambiable por ejemplo, AL-DP-9327 y AD-9237.

La figura 1 muestra la estructura del lípido ND-98.

La figura 2 muestra los resultados de la prueba in vivo de 16 ARNdcs de PCSK9 específicos de ratón (AL-DP-9327 a AL-DP-9342) dirigidos contra regiones ORF diferentes de PCSK9 ARNm (teniendo el primer nucleótido correspondiente a la posición ORF indicada en la gráfica) en ratones C57/BL6 (5 animales/grupo). La relación de PCSK9 ARNm a GAPDH ARNm en lisatos del hígado se promedió sobre cada grupo de tratamiento y se comparó a un grupo de control tratado con PBS o un grupo de control tratado con ARNic no relacionado (factor VII coagulación de sangre).

La figura 3 muestra los resultados de la prueba in vivo de 16 ARNics de PCSK9 de reactivos cruzados de humano/ratón/rata (ALDP-9311 a AL-DP-9326) dirigidos contra regiones de ORF de PCSK9 ARNm (teniendo el primer nucleótido correspondiente a la posición de ORF indicada en la gráfica) en ratones C57/BL6 (5 animales/grupo). La relación de PCSK9 ARNm a GAPDH ARNm en lisatos del hígado se promedió sobre cada grupo de tratamiento y se compara a un grupo de control tratado con PBS o un grupo de control tratado con ARNic no relacionado (factor VII de coagulación de sangre).

La figura 4 muestra los resultados de la prueba in vivo de 16 ARNic de PCSK9 específicos de ratón (AL-DP-9327 a AL-DP-9342) en ratones C57/BL6 (5 animales/grupo). Se promediaron los niveles totales dé colesterol de suero sobre cada grupo de tratamiento y se compararon a un grupo de control tratado con PBS o un grupo de control tratado con un ARNic no relacionado (factor VII de coagulación de sangre).

La figura 5 muestra los resultados de la prueba in vivo de 16 ARNics de PCSK9 reactivos cruzados de humano/ratón/rata (AL-DP-9311 a AL-DP-9326) en ratones C57/BL6 (5 animales/grupo). Se promediaron los niveles totales de colesterol de suero sobre cada grupo de tratamiento y se compararon a un grupo de control tratado con PBS o un grupo de control tratado con un ARNic no relacionado (factor VII de coagulación de sangre).

Las figuras 6A y 6B comparan resultados in vitro e in vivo, respectivamente, para silenciar PCSK9.

La figura 7A y la figura 7B son un ejemplo de resultados in vitro para silenciar PCSK9 usando hepatocitos primarios de mono.

La figura 7C muestra resultados para silenciar PCSK9 en hepatocitos primarios de chango usando AL-DP-9680 y versión químicamente modificada de AL-DP-9680.

La figura 8 muestra actividad in vivo de ARNics formulados con LNP-01 a PCSK-9.

Las figuras 9A y 9B muestran actividad in vivo de 9314 químicamente modificado formulado con LNP-01 y derivados con modificaciones químicas tales como AD- 0792, AD-12382, AD-12384, AD-12341 en tiempos diferentes posteriores a una sola dosis en ratones.

La figura 10A muestra el efecto de ARNic de PCSK9 en niveles de transcripción de PCSK9 y niveles totales de colesterol de suero en ratas después de una sola dosis de AD-10792 formulado. La figura 10B muestra el efecto de ARNic de PCSK9 en niveles totales de colesterol de suero en el experimento como 10A. Una sola dosis de AD-10792 formulado resulta en una reducción de ~60% de colesterol total en las ratas que regresa a la línea base por ~3-4 semanas. La figura 10C muestra el efecto de ARNic de PCSK9 en niveles hepáticos de colesterol y trig licéridos en el mismo experimento como 10A.

La figura 11 es un Western blot que muestra que los niveles receptores de LDL del hígado fueron regulados de manera ascendente después de la administración de ARNic de PCSK9 en rata.

Las figuras 12Á-12D muestran los efectos de ARNic de PCSK9 en niveles de proteína LDLc y ApoB, relaciones totales de colesterol/HDLc, y niveles de proteína PCSK9, respectivamente, en primates no humanos siguiendo una sola dosis de AD-10792 o AD-9680 formulado.

La figura 13A es una gráfica que muestra que ARNic-AD-A1A no modificado (AD-9314), pero no ARNÍC-AD-1A2 2'OMe-modifícado (AD-10792), IFNí-alfa inducido en monocitos de sangre primarios humanos. La. figura 13B es una gráfica que muestra que ARNic-AD-A 1 A no modificado (AD-9314), pero no ARNic-AD-1A2 2'OMe-modificado (AD-10792), también TNF-alfa inducido en monocitos de sangre primarios humanos.

La figura 14A es una gráfica que muestra que el PCSK9 ARNic ARNic-AD-1 A2 (alias LNP-PCS-A2 o alias "AD-10792 formulado") disminuyó los niveles de PCSK9 ARNm en hígado de ratones en una manera dependiente de dosis. La figura 14B es una gráfica que muestra que la administración única de 5 mg/kg de ARNic-AD-1A2 disminuyó los niveles totales de colesterol de suero en ratones en 48 horas.

La figura 15A es una gráfica que muestra que PCSK9 ARNic focalizando PCSK9 humano y de chango (LNP-PCS-C2) (alias "AD-9736 formulado"), y PCSK9 ARNic focalizando PCSK9 de ratón (LNP-PCS-A2) (alias "AD-10792 formulado"), redujo los niveles de PCSK9 de hígado en ratones transgénicos expresando PCSK9 humano. La figura 15B es una gráfica que muestra que LNP-PCS-C2 y LNP-PCS-A2 redujo los niveles de PCSK9 en plasma en los mismos ratones transgénicos.

La figura 16 muestra la estructura de un ARNic conjugado a Col-p-(GalNAc)3 vía ligadura de fosfato en el extremo 3'.

La figura 17 muestra la estructura de un ARNic conjugado a LCO(GalNAc)3 (un conjugado (GalNAc)3 - 3'-Litólico-oleoilo ARNic).

La figura 18 es una gráfica que muestra los resultados de ARNics conjugados en niveles de transcripción de PCSK9 y colesterol de suero total en ratones.

La figura 19 es una gráfica que muestra los resultados de ARNics formulados con lipido en niveles de transcripción de PCSK9 y colesterol de suero total en ratas.

La figura 20 es una gráfica que muestra los resultados de transfección de ARNic en niveles de transcripción de PCSK9 en células HeLa usando AD-9680 y variaciones de AD-9680 como se describió en la tabla 6.

La figura 21 es una gráfica que muestra los resultados de transfección de ARNic en niveles de transcripción en células HeLa usando AD-14676 y variaciones de AD-14676 como se describió en la tabla 6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención provee una solución al problema de tratar enfermedades que se pueden modular por la regulación descendente del gen PCSK9, tal como hiperlipidemia, al usar ácido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) para silenciar el gen PCSK9.

La invención provee composiciones y métodos para inhibir la expresión del gen PCSK9 en un sujeto usando un ARNdc. La invención también provee composiciones y métodos para tratar condiciones y enfermedades patológicas, tal como hiperlipidemia, que se puede modular al regular de manera descendente la expresión del gen PCSK9. ARNdc dirige la degradación específica de secuencia de ARNm a través de un proceso conocido como interferencia de ARN (ARNi).

El ARNdc útil para las composiciones y métodos de una invención incluyen una cadena de ARN (la cadena antisentido) teniendo una región que es menos de 30 nucleótidos en longitud, por lo general 19-24 nucleótidos en longitud, y es sustancialmente complementaria a por lo menos parte de una transcripción de ARNm del gen PCSK9. El uso de estos ARNdcs permite la degradación focalizada de un ARNm que está involucrado en la regulación de los niveles receptores de LDL y colesterol circulante. Usando ensayos a base de célula y animal, los presentes inventores han demostrado que dosificaciones muy bajas de estos ARNdcs pueden mediar específica y eficientemente ARNi, resultando en inhibición significativa de expresión del gen PCSK9. De esta manera, los métodos y composiciones incluyendo estos ARNdcs son útiles para tratar procesos patológicos que se pueden mediar al regular de manera ¡descendente PCSK9, taj como en el tratamiento de hiperlipidemia.

La siguiente descripción detallada describe cómo hacer y usar el ARNdc y composiciones que contienen ARNdc para inhibir la expresión del gen PCSK9 focalizado, así como composiciones y métodos para tratar enfermedades que se pueden modular al regular de manera descendente la expresión de PCSK9, tal como hiperlipidemia. Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen un ARNdc teniendo una cadena antisentido teniendo una región dé colmplementariedad que es menos de 30 nucleótidos en longitud, , por lo general 19-24 nucleótidos en longitud, y que es sustancialmente complementario a por lo menos parte de una transcripción de ARN del gen PCSK9, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

Por consiguiente, ciertos aspectos de la invención proveen composiciones farmacéuticas incluyendo el ARNdc que focaliza PCSK9 junto con un portador farmacéuticamente aceptable, métodos de usar las composiciones para inhibir expresión del gen PCSK9, y métodos de usar las composiciones farmacéuticas para tratar enfermedades al regular de manera descendente la expresión de PCSK9.

Definiciones Por conveniencia, el significado de ciertos términos y frases usados en la especificación, ejemplos y reivindicaciones anexas, se proveen más adelante. Si hay una discrepancia aparente entre el uso í de un término en otras partes de esta especificación y su definición provista |en esta sección, la definición en esta sección debe prevalecer. '< "G", "C", "A" y "U" cada cadena por lo general para un nucleótidp que contiene guanina, citosina, adenina y uracil como una base, respectivamente. UT" y "dT" se usan de manera intercambiable en la présente y se refieren a un desoxiribonucleótido en donde la nucleobaée es timina, por ejemplo, desoxiribotimina. Sin embargo, se entenderá que el término "ribonucleótido" o "nucleótido" o "desoxiribonucleótido" también se pueden referir a un nucleótido modificado, como se detalla más adelante, o una porción de reemplazó sustituto. El experto está bien al tanto de que guanina, citosina, adenina y uracil se pueden reemplazar por otras porciones sin alterar sustancialmente las propiedades de par base de un oligonucléótido comprendiendo un nucleótido con dicha porción de reemplazo. Por ejemplo, sin limitación, un nucleótido que comprende inosina como su base puede emparar base con nucleotidos conteniendo adenina, citosina o uracil. Por tanto, los nucleotidos que contienen uracil, guanina o adenina se pueden reemplazar en las secuencias de nucleótido de la invención por un nucleótido que contiene, por ejemplo, inosina. Las secuencias que comprenden dichas porciones de reemplazo son modalidades de la invención.

Como se usa en la presente, "PCSK9" se refiere al gen o prOteína proproteína convertasa subtilisina kexina 9 (también conocido como FH3, HCHOLA3, NARC-1, NARC1). Ejemplos de secuencias de ARNm a PCSK9 incluyen pero no se limitan a lo siguiente: humano:NM_174936; ratón:NM_153565 y rata: NM_199253. Ejemplos adicionales de secuencias de PCSK9 ARNm están prontamente disponibles usando, por ejemplo, GenBank.

Como se usa en la presente, el término "cadena que comprende una secuencia" se refiere a un oligonucleótido que comprende una cadena de nucleotidos que se describe por la secuencia referida a usar la nomenclatura de nucleótido estándar.

Como se usa en la presente, y a menos que se indique lo contrario, el término "complementario", cuando se usa para describir una primera secuencia de nucleótido en relación a una segunda secuencia de nucleótido, se refiere a la habilidad de un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la primera secuencia de nucleótido para hibridar y formar una estructura dúplex bajo ciertas condiciones con un oligonucleótido o polinucleótido que comprende la segunda secuencia de nucleótido, como se entenderá por el experto. Dichas condiciones, por ejemplo, pueden ser condiciones estrictas, en donde las condiciones estrictas pueden incluir: 400 nM NaCI, 40 nM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 50°C o 70°C durante 12-16 horas seguido por lavado. Otras condiciones, pueden aplicar tales como condiciones fisiológicamente relevantes como se puede encontrar dentro de un organismo. El experto podrá determinar la serie de condiciones más apropiadas para una prueba de complementariedad de dos secuencias de conformidad con la última aplicación de los nucleótidos hibridados.

Esto incluye pares base del oligonucleótido o polinucleótido teniendo la primera secuencia de nucleótido al oligonucleótido o polinucleótido teniendo la segunda secuencia de nucleótido sobre la longitud entera de las primeras y segundas secuencias de nucleótido. Dichas secuencias pueden ser referidas como "completamente complementarias" con respecto una de la otra. Sin embargo, en donde una primera secuencia es referida como "sustancialmente complementaria" con respecto a una segunda secuencia en la presente, las dos secuencias pueden ser completamente complementarias, o pueden formar uno o más, pero por lo general no más de 4, 3 ó 2 pares base desadaptados al hibridar, al mismo tiempo reteniendo la habilidad de hibridar bajo las condiciones más relevantes a su aplicación final. Sin embargo, en donde se diseñan dos oligonucleótidos para formar, al hibridar, una o más salientes de una cadena, dichas salientes no deberán ser vistas como desadaptaciones con respecto a la determinación de complementariedad. Por ejemplo, un ARNdc teniendo un oligonucleótido 21 nucleótidos en longitud y otro oligonucleótido 23 nucleótidos en longitud, en donde el oligonucleótido más largo tiene una secuencia de 21 nucleótidos que es completamente complementario al oligonucleótido más corto, puede ser referido como "completamente complementario".

Secuencias "complementarias", como se usa en la presente, también pueden incluir, o formarse enteramente de, pares base de no Watson-Crick y/o pares base formados de nucleótidos no naturales y modificados, en cuanto a se cumplen los requerimientos anteriores con respecto a su habilidad de hibridar.

Los términos "complementario", "completamente complementario" y "sustancialmente complementario" en la presente se pueden usar con respecto a la adaptación base entre la cadena de sentido y la cadena anti-sentido de un ARNdc, o entre la cadena antisentido de un ARNdc y una secuencia objetivo, como se entenderá a partir del contexto de su uso.

Como se usa en la presente, un polinucleótido que es "sustancialmente complementario a por lo menos parte de" un ARN mensajero (ARNm) se refiere a un polinucleótido que es sustancialmente complementario a una porción contigua del ARNm de interés (por ejemplo, codificando PCSK9) incluyendo un 5' UTR, un marco de lectura abierta (ORF), o un 3' UTR. Por ejemplo, un polinucleótido es complementario a por lo menos parte de un PCSK9 ARNm si la secuencia es sustancialmente complementaria a una porción no interrumpida de un ARNm codificando PCSK9.

El término "ARN de doble cadena" o "ARNdc", como se usa en la presente, se refiere a una estructura de dúplex que comprende dos cadenas de ácido nucleico anti-paralelas y sustancialmente complementarias, como se definió antes. Las dos cadenas formando la estructura dúplex pueden ser de diferentes porciones de una molécula de ARN más grande, o pueden ser moléculas de ARN separadas. En donde las moléculas de ARN, tal como ARNdc, a menudo son referidas en la literatura como ARNic "ARN de interferencia corta"). En donde las dos cadenas son parte de una molécula más grande, y por tanto están conectadas por una cadena ininterrumpida de nucleotidos entre el extremo 3' de una cadena y el extremo 5' de la otra cadena respectiva formando la estructura dúplex, la cadena de ARN conectora es referida como un "lazo de horquilla", "ARN de horquilla corta" o " ARHhc" . En donde las dos cadenas están conectadas covalentemente por medios diferentes que una cadena ininterrumpida de nucleotidos entre el extremo 3' de una cadena y el extremo 5' de la otra cadena respectiva formando la estructura dúplex, la estructura conectora es referida como un "entrelazador". Las cadenas de ARN pueden tener el mismo o un número diferente de nucleotidos. El número máximo de pares base es el número de nucleotidos en la cadena más corta del ARNdc menos cualquier saliente que esté presente en el dúplex. Además de la estructura dúplex, un ARNdc puede comprender una o más salientes de nucleotido. En general, la mayoría de nucleótidos de cada cadena son ribonucleótidos, pero como se describe en más detalle en la presente, cada una o ambas cadenas también puede incluir por lo menos un no-ribonucleótido, por ejemplo, un desoxiribonucleótido y/o un nucleotido modificado. Además, como se usa en la especificación, "ARNdc" puede incluir modificaciones químicas a ribonucleótidos, incluyendo modificaciones sustanciales en nucleótidos múltiples e incluyendo todos los tipos de modificaciones descritos en la presente o conocidos en la técnica. Cualquier dicha modificación, como se usa en una molécula de tipo ARNic, está abarcada por "ARNdc" para los propósitos de esta especificación y reivindicaciones.

Como se usa en la presente, una "saliente de nucleotido" se refiere a un nucleotido o nucleótidos sin par que salen de la estructura dúplex de un ARNdc cuando un extremo 3' de una cadena del ARNdc se extiende más allá del extremo 5' de la otra cadena, o viceversa. "Despunte" o "extremo despuntado" significa que no hay nucleótidos sin par en el extremo del ARNdc, es decir, ninguna saliente de nucleotido. Para claridad, las tapas químicas o porciones químicas de no nucleotido conjugadas en el extremo 3' o extremo 5' de un ARNic no son consideradas en determinar si un ARNic tiene una saliente o está despuntado en el extremo.

El término "cadena antisentido" se refiere a la cadena de un ARNdc que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una secuencia objetivo. Como se usa en la presente, el término "región de complementariedad" se refiere a la región en la cadena antisentido que es sustancialmente complementaria a una secuencia, por ejemplo una secuencia objetivo, com'o se define en la presente. En donde la región de complementariedad no es completamente complementaria a la secuencia objetivo, las desigualdades pueden estar en las regiones internas o terminales de la molécula. Por lo general, las desigualdades más toleradas están en las regiones terminales, por ejemplo, dentro de 6, 5, 4, 3 ó 2 nucleótidos en el extremo 5' o terminal 3'.

El término "cadena de sentido", como se usa en la presente, se refiere a la cadena de un ARNdc que incluye una región que es sustancialmente complementaria a una región de la cadena antisentido.

"Introducir en una célula", al referirse a un ARNdc, significa facilitar absorción en la célula, como se entiende por aquellos expertos en la técnica. La absorción o ingesta de ARNdc puede ocurrir a través de procesos celulares difusivos o activos sin ayuda, o por agentes o dispositivo auxiliares. El significado de este término no se limita a células in vitro; un ARNdc también se puede "introducir en una célula", en donde la célula es parte de un organismo viviente. En dicho caso, la introducción en la célula incluirá el surtido al organismo. Por ejemplo, para surtido in vivo, se puede inyectar ARNdc en un sitio de tejido o administrar sistémicamente. La introducción int vitro en una célula incluye métodos conocidos en la técnica tal como electroporación y lipofección.

Los términos "silencio", "inhibe la expresión de", "regula de manera descendente la expresión de", "suprime la expresión de", y similares, en cuanto a que se refieren al gen PCSK9, en la presente se refieren a la supresión por lo menos parcial de la expresión del gen PCSK9, como se manifiesta por una reducción de la cantidad de PCSK9 ARNm que se puede aislar de una primera célula o grupo de células en donde el gen PCSK9 se transcribe y que ha sido tratado de modo que se inhibe la expresión del gen PCSK9, en comparación con una segunda célula o grupo de células sustancialmente idénticas a la primera célula o grupo de células pero que no han sido tratadas así (células de control). El grado de inhibición usualmente se expresa en términos de (ARNm en células de control) - (ARNm en células tratadas» 100 % (ARNm en células de control) Alternativamente, el grado de inhibición puede ser dado en términos de una reducción de un parámetro que está funcionalmente enlazado a expresión de gen PCSK9, por ejemplo, la cantidad de proteína codificada por el gen PCSK9 que se produce por una célula, o el número de células exhibiendo un cierto fenotipo. En principio, se puede determinar silencio de gen objetivo en cualquier célula expresando el objetivo, ya sea constitutivamente o por ingeniería genómica, y por cualquier ensayo apropiado. Sin embargo, cuando se necesita una referencia a fin de determinar si un ARNdc dado inhibe la expresión del gen PCSK9 por un cierto grado y por tanto está abarcado por la presente invención, los ensayos provistos en los ejemplos más adelante deben servir como dicha referencia.

Como se usa en la presente en el contexto de expresión de PCSK9, los términos "tratar", "tratamiento" y similares, se refieren a ayuda o alivio de procesos patológicos que se pueden mediar al regular de manera descendente el gen PCSK9. En el contexto de la presente invención en cuanto a que se refiere a cualquiera de las otras condiciones recitadas en la presente más adelante (diferentes de procesos patológicos que se pueden mediar al regular de manera descendente el gen PCSK9), los términos "tratar", "tratamiento" y similares, significan ayudar o aliviar por lo menos un síntoma asociado con dicha condición, o reducir o invertir el progreso de dicha condición. Por ejemplo, en el contexto de hiperlipidemia, el tratamiento involucrará una disminución en los niveles de lípido de suero. f Como se usa en la presente, las frases "cantidad terapéuticamente efectiva" y "cantidad profilácticamente efectiva" se refieren a una cantidad que provee un beneficio terapéutico en el tratamiento, prevención o administración de procesos patológicos que se pueden mediar al regular de manera descendente el gen PCSK9 o un síntoma manifiesto de procesos patológicos que se pueden mediar al regular de manera descendente el gen PCSK9. La cantidad específica que es terapéuticamente efectiva se puede determinar prontamente por un médico ordinario, y puede variar dependiendo 'de factores conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, el tipo de procesos patológicos que se pueden mediar al regular de manera descendente el gen PCSK9, el historial y edad del paciente, la etapa de los procesos patológicos que se pueden mediar al regular de manera descendente expresión de gen PCSK9, y la administración de otros procesos anti-patológicos que se pueden mediar al regular de manera descendente expresión de gen PCSK9.

Como se usa en la presente, una "composición farmacéutica" incluye una cantidad farmacológicamente efectiva de un ARNdc y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente, "cantidad farmacológicamente efectiva", "cantidad terapéuticamente efectiva" ó simplemente "cantidad efectiva" se refiere a esa cantidad de un ARN efectiva para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo intencionado. Por ejemplo, si un tratamiento clínico dado es considerado efectivo en donde hay por lo menos 25% de reducción en un parámetro medible asociado con una enfermedad o trastorno, una cantidad terapéuticamente efectiva de un fármaco para el tratamiento de esa enfermedad o trastorno es la cantidad necesaria para realizar por lo menos 25% de reducción en ese parámetro.

El término "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere a un portador para la administración de un agente terapéutico. Dichos portadores incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina regulada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos y se describen en más detalle más adelante. El término excluye específicamente medio de cultivo celular.

Como se usa en la presente, una "célula transformada" es una célula en! donde un vector se ha introducido a partir del cual se puede expresar una molécula de ARNdc: Ácido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) Como se describe en más detalle más adelante, la invención provee métodos y composición teniendo moléculas de ácido ribonucleico de doble cadena (ARNdc) para inhibir la expresión del gen PCSK9 en una célula o mamífero, en donde el ARNdc incluye una cadena antisentido teniendo una región de complementariedad que es complementaria a por lo menos una parte de un ARNm formado en la expresión del gen PCSK9, y en donde la región de complementariedad es menos de 30 nucleótidos en longitud, por lo general 19-24 nucleótidos en longitud. En algunas modalidades, el ARNdc, al hacer contacto con una célula que expresa el gen PCSK9, inhibe la expresión de dicho gen PCSK9, por ejemplo, como se mide tal como por un ensayo descrito en la presente.

El ARNdc incluye dos cadenas de ácido nucleico que son suficientemente complementarias para hibridar para formar una estructura dúplex. Una cadena del ARNdc (la cadena antisentido) puede tener una región de complementariedad que es sustancialmente complementaria, y por lo general completamente complementaria, a una secuencia objetivo, derivada de la secuencia de un ARNm formado durante la expresión del gen PCSK9. La otra cadena (la cadena sentido) incluye una región que es complementaria a la cadena antisentido, de modo que las dos cadenas hibridan y forman una estructura dúplex cuando se combinan bajó condiciones adecuadas. Por lo general, la estructura dúplex es entre 15 y 30, más por lo general entre 18 y 25, todavía más por lo general entre 19 y 24, y muy por lo general entre 19 y 21 pares base en, ¡longitud. En una modalidad, la estructura dúplex es 21 pares base en longitud. En otra modalidad, la estructura dúplex es 19 pares base en longitud. De manera similar, la región de complementariedad a la secuencia objetivo es entre 15 y 30, más por lo general entre 18 y 25, todavía más por lo general entre 19 y 24, y muy por lo general entre 19 y 21 nucleótidos en longitud. En una modalidad, la región de complementariedad es 19 nucleótidos en longitud.

El ARNdc se puede sintetizar por métodos estándar conocidos en la técnica como se discute más adelante, por ejemplo, por el uso de un sintetizador de ADN automatizado, tal como están comercialmente disponibles de, por ejemplo, Biosearch, Applied Biosystems, Inc. En una modalidad, el gen PCSK9 es un gen PCSK9 humano. Én otras modalidades, la cadena antisentido del ARNdc incluye una primera cadena seleccionada a partir de las secuencias sentido de la tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a, y una segunda cadena seleccionada a partir de las secuencias antisentído de la tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a. Los agentes antisentido alternativos que focalizan en otra parte en la secuencia objetivo provistos en la tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a, se pueden determinar prontamente usando la secuencia objetivo y la secuencia PCSK9 flanqueadora.

Por ejemplo, el ARNdc AD-9680 (de la tabla 1a) focaliza ai gen PCSK9 en 3530-3548; por lo tanto la secuencia objetivo es de la siguiente manera: 5' UUCUAGACCUGUUUUGCUU 3' (SEC ID NO: 1523). El ARNdc AD-10792 (de la tabla 1a) focaliza al gen PCSK9 en 1091-1109; por lo tanto la secuencia objetivo es de la siguiente manera: 5' GCCUGGAGUUUAUUCGGAA 3' (SEC ID NO: 1524). Se incluye en la invención ARNdcs que tienen regiones de complementariedad a SEC ID NO: 1523 y SEC ID NO: 1524.

En otras modalidades, el ARNdc incluye por lo menos una secuencia de nucleótido seleccionada a partir de los grupos de secuencias provistos en la tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a. En otras modalidades, el ARNdc incluye por lo menos dos secuencias seleccionadas a partir de este grupo, en donde una de las por lo menos dos secuencias es complementaria a otra de las por lo menos dos secuencias, y una de las por lo menos dos secuencias es sustancialmente complementaria a una secuencia de un ARNm generado en la expresión del gen PCSK9. Por lo general, el ARNdc incluye dos oligonucleótidos, en donde un oligonucleótido se describe como la cadena sentido en la tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a y el segundo oligonucleótido se describe como la cadena antisentido en la tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a.

El experto en la técnica está muy consciente de que los ARNdcs teniendo una estructura dúplex de entre 20 y 23, pero específicamente 21, pares base se han aclamado como particularmente efectivos en inducir interferencia de ARN (Elbashir y otros, ÉMBO 2001, 20:6877-6888). Sin embargo, otros han descubierto que ARNdcs más cortos o más largos pueden ser efectivos también. En las modalidades descritas antes, en virtud de la naturaleza de las secuencias de oligonucleótido provistas en la tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a, los ARNdcs de la invención pueden incluir por lo menos una cadena de una longitud de mínimamente 21 nt. Se puede esperar de manera razonable que los ARNdcs más cortos teniendo una de las secuencias de la tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a menos sólo unos pocos nucleótidos en uno o ambos extremos pueden ser efectivos de manera similar en comparación con los ARNdcs descritos antes. Por tanto, los ARNdcs teniendo una secuencia parcial de por lo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más nucleótidos contiguos de una de las secuencias de la tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a, y que difieren en su habilidad de inhibir la expresión del gen PCSK9 en un ensayo FACS como se describe en la presente más adelante por no más de 5, 10, 15, 20, 25 ó 30% de inhibición de un ARNdc que comprende la secuencia completa, se contemplan por la invención. Otros ARNdcs que cortan dentro de la secuencia objetivo provistos en la tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a se pueden hacer prontamente usando la secuencia de PCSK9 y la secuencia objetivo provista.

Además, los agentes de ARNi provistos en la tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a identifican un sitio en el ÁRNm de PCSK9 que es susceptible a corte a base de ARNi. Como tal presente invención incluye además agentes de ARNi que focalizan dentro de la secuencia focalizada por uno de los agentes de la presente invención. Como se usa en la presente, un segundo agente de ARNi se dice focaliza dentro de la secuencia de un primer agente de ARNi si el segundo agente de ARNi corta el mensaje en cualquier lado dentro del ARNm que es complementario a la cadena antisentido del primer agente de ARNi. Dicho segundo agente por lo general consistirá de por lo menos 15 nucleótidos contiguos de una de las secuencias provistas en la tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a acopladas a secuencias de nucleótido adicionales tomadas de la región contigua a la secuencia seleccionada en el gen PCSK9. Por ejemplo, los últimos 15 nucleótidos de SEC ID NO: 1 (menos las secuencias AA agregadas) combinados con los siguientes 6 nucleótidos del gen PCSK9 objetivo produce un solo agente de cadena de 21 nucleótidos que se basa en una de las secuencias provistas en la tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a.

El ARNdc de la invención puede contener una o más desadaptaciones a la secuencia objetivo. En una modalidad, el ARNdc de la invención contiene no más de 1, no más de 2, o no más de 3 desádaptaciones. En una modalidad, la cadena antisentido del ARNdc contiene desadaptaciones a la secuencia objetivo, y el área de desadaptación no se ubica en el centro de la región de complementariedad. En otra modalidad, la cadena antisentido del ARNdc contiene desadaptaciones a la secuencia objetivo y la desadaptación es restringida a 5 nucleótidos desde cualquier extremo, por ejemplo, 5, 4, 3, 2 0 1 nucleótido del extremo 5' ó 3' de la región de complementariedad. Por ejemplo, para una cadena de ARNdc de 23 nucleótidos que es complementaria a una región del gen PCSK9, el ARNdc no contiene ninguna desadaptación dentro de los 13 nucleótidos centrales. Los métodos descritos dentro de la invención se pueden usar para determinar si un ARNdc que contiene una desadaptación a una secuencia objetivo es efectivo en inhibir la expresión del gen PCSK9. La consideración de la eficacia de ARNdcs con desadaptaciones en inhibir expresión del gen PCSK9 es importante, en especial si la región particular de complementariedad en el gen PCSK9 es conocida por tener variación de secuencia polimórfica dentro de la población.

En una modalidad, por lo menos un extremo del ARNdc tiene una saliente de nucleótido de una sola cadena de 1 a 4, por lo general 1 ó 2 nucleótidos. Los ARNdcs teniendo por lo menos una saliente de nucleótido tienen propiedades inhibidoras inesperadamente superiores que sus contrapartes con extremo despuntado. Además, los presentes inventores han descubierto que la presencia de sólo una saliente de nucleótido fortalece la actividad de interferencia del ARNdc, sin afectar su estabilidad global. El ARNdc teniendo sólo una saliente ha probado ser particularmente estable y efectivo in vivo, así como en una variedad de células, medios de cultivo celular, sangre y suero. Por lo general, la saliente de una sola cadena se ubica en el extremo terminal 3' de la cadena antisentido o, alternativamente, en el extremo terminal 3' de la cadena sentido. El ARNdc también puede tener un extremo despuntado, por lo general ubicado en el extremo 5' de la cadena antisentido. Dichos ARNdcs tienen estabilidad mejorada y actividad inhibidora, así permitiendo administración a dosificaciones bajas, es decir, menos de 5 mg/kg de peso corporal del recipiente por día. Por lo general, la cadena antisentido del ARNdc tiene una saliente de nucleótido en el extremo 3' y el extremo 5' está despuntado. En otra modalidad, uno o más de los nucleótidos en la saliente es reemplazado con un tiofosfato de nucleótido.

Modificaciones y conjugados químicos Todavía en otra modalidad, el ARNdc se modifica químicamente para potenciar la estabilidad. Los ácidos nucleicos de la invención se pueden sintetizar y/o modificar por métodos bien establecidos en la técnica, tales como aquellos descritos en "Current protocols in nucleic acid chemistry", Beaucage, S.L. y otros (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, NY, EUA, que se incorpora a la presente por referencia. Las modificaciones químicas pueden incluir, pero no se limitan a modificaciones 2', modificaciones en otros sitios del azúcar o base de un oligonucleótido, introducción de bases no naturales en la cadena de oligonucleótido, fijación covalente a un ligando o porción química, y reemplazo de ligaduras de fosfato de internucleótido con ligaduras alternas tales como tiofosfatos. Se puede emplear más de una dicha modificación.

La ligadura química de las dos cadenas separadas de ARNdc se puede lograr por cualquiera de una variedad de técnicas bien conocidas, por ejemplo, al introducir enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno; interacciones hidrofóbicas, interacciones van der Waals o de apilamiento; por medio de coordinación de metal iónico, o a través del uso de análogos de purina. Por lo general, los grupos químicos que se pueden usar para modificar el ARNdc incluyen, sin limitación, metileno azul; grupos bifuncionales, por lo general b i ( 2 -cloroetil)ámina; N-acetil-N'-(p-glioxilbenzoil)cistamina; 4-tiouracil; y soralen. En una modalidad, el enlazador es un enlazador de hexa-etileno glicol. En este caso, el ARNdc se produce por síntesis de fase sólida y el enlazador de hexa-etileno glicol se incorpora de conformidad con métodos estándar (por ejemplo, Williams, D.J. y K.B. Hall, Biochem. (1996) 35:14665-14670). En una modalidad particular, el extremo 5' de la cadena antisentido y el extremo 3' de la cadena sentido se enlazan químicamente vía un enlazador de hexaetileno glicol. En otra modalidad, por lo menos un nucleótido del ARNdc comprende un grupo fosforotioato o fosforoditioato. El enlace químico en los extremos del ARNdc por lo general se forma por enlaces de triple hélice. La tabla 1a, tabla 2a y tabla 5a proveen ejemplos de agentes de ARNi modificados de la invención.

Todavía en otra modalidad, los nucleótidos en uno o ambas de las dos cadenas individuales se pueden modificar para prevenir o inhibir I al s actividades de degradación de enzimas celulares, tales como, por ejemplo, sin limitación, ciertas nucleasas. Las técnicas para inhibir la actividad de degradación de enzimas celulares contra ácidos nucleicos son conocidas en la técnica incluyendo, pero sin limitación a, modificaciones de 2'-amino, modificaciones de azúcar de 2'-amino, modificaciones de azúcar 2'-F, modificaciones de 2'-F, modificaciones de azúcar de 2'-alquilo, modificaciones de estructura no cargada, modificaciones de morfolino, modificaciones d 2'-0-metilo, y fosforamidato (ver, por ejemplo, Wagner, Nat. Med. (1995) 1:1116-8). De esta manera, por lo menos un grupo 2'-hidroxilo de los nucleótidos de un ARNdc es reemplazado por un grupo químico, por lo general un grupo 2'-amino o 2'-metilo. También, por lo menos un nucleotido se puede modificar para formar un nucleotido cerrado. Dicho nucleotido cerrado contiene un puente de metileno que conecta el 2'-oxígeno de ribosa con el 4'-carbono de ribosa. Los oligonucleótidos que contienen el nucleotido cerrado se describe en Koshkin, A. A., y otros, Tetrahedron (1998), 54:3607-3630) y Obika, S. y otros, Tetrahedron Lett. (1998), 39:5401-5404). La introducción de un nucleotido cerrado en un oligonucleótido mejora la afinidad de secuencias complementarias y aumenta la temperatura de fundición por varios grados (Braasch, D A. y D.R. Corey, Chem. Biol. (2001), 8:1-7).

Conjugar un ligando a un ARNdc puede potenciar su absorción celular así como focalizar a un tejido particular o absorción por tipos específicos de células tales como células de hígado. En ciertos casos, un ligando hidrofóbico se conjuga al ARNdc para facilitar permeación directa de la membrana celular y/o absorción sobre las células de hígado. Alternativamente, el ligando conjugado al ARNdc es un sustrato para endocitosis mediada por receptor. Estas propuestas se han usado para facilitar permeación celular de oligonucleótidos antisentido así como agentes de ARNdc. Por ejemplo, colesterol se ha conjugado a varios oligonucleótidos antisentido resultando en compuestos que son sustancialmente más activos en comparación con sus análogos no conjugados. Ver M. Manoharan Aqtisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103. Otros compuestos lipofílicos que se han conjugado a oligonucleótidos incluyen ácido 1-pireno butírico, ,3-bi-O-(hexadecil)glicerol y mentol. Un ejemplo de un ligando para endocitosis mediada por receptor es ácido fólico. El ácido fótico entra a la célula por endocitosis mediada por folato-receptor. Los compuestos de ARNdc con ácido fólico serían transportados eficientemente en la célula vía la endocitosis mediada por folato-receptor. Li y colaboradores reportan que la fijación de ácido fólico a la terminal 3' de un oligonucleótido resultó en un aumento de 8 veces en absorción celular del oligonucleótido. Li, S.; Deshmukh, H. M.; Huang, L. Pharm. Res. 1998, 15, 1540. Otros ligandos que se han conjugado a oligonucleótidos incluyen polietileno glicoles, montones de carbohidrato, agentes de entrelazamiento, conjugados de porfirina, péptidos de surtido y lípidos tales como colesterol y colesterilamina. Ejemplos de montones de carbohidrato incluyen Col- p-(GalNAc)3 (N-acetil galactosamina colesterol) y LCO(GalNAc)3 (N-acetil galactosamina - 3'-litocólico-oleoilo.

En ciertos casos, la conjugación de un ligando catiónico a oligonucleótidos resulta en resistencia mejorada a nucleasas. Ejemplos representativos de ligandos catiónicos son propilamonio y dimetilpropilamonio. De manera interesante, se registraron oligonucleótidos antisentido para retener su alta afinidad de unión a ARNm cuando el ligando catiónico se dispersó a lo largo del oligonucleótido. Ver . Manoharan Antisense & Nucleic Acid Drug Development 2002, 12, 103 y referencias ahí.

En algunos casos, un ligando puede ser multifuncional y/o un ARNdc sé puede conjugar a más de un ligando. Por ejemplo, el ARNdc se puede conjugar a un ligando para absorción mejorada y a un segundo ligando para liberación mejorada.

El ARNdc conjugado con ligando de la invención se puede sintetizar por el uso de un ARNdc que porta una funcionalidad reactiva colgante, tal como aquél derivado de la fijación de una molécula entrelazadora en el ARNdc. Este oligonucleótido reactivo se puede hacer reaccionar directamente con ligandos comercialmente disponibles, ligandos que se sintetizan portando cualquiera de una variedad de grupos protectores, o ligandos que tienen una porción entrelazadora fijada ahí. Los métodos de la invención facilitan la síntesis de ARNdc conjugado con ligando por el uso de, en algunas modalidades, monómeros de nucleósido que se han conjugado de manera apropiada con ligandos y que además se pueden fijar a un material de soporte sólido. Dichos conjugados de ligando-nucleósido, fijados opcionalmente a un material de soporte sólido, se preparan de conformidad con ciertas modalidades de los métodos descritos en la presente vía reacción de un ligando de unión a suero seleccionado con una porción entrelazadora ubicada en la posición 5' de un nucleósido u oligonucleótido. En ciertos casos, un ARNdc portando un ligando de aralquilo fijado a la terminal 3' del ARNdc se prepara al fijar primero covalentemente un bloque constructor de monomero a un soporte dé vidrio de poro controlado vía un grupo aminoalquilo de cadena larga.' Entonces, los nucleótidos se unen vía técnicas de síntesis de fase sólida estándar al bloque constructor de monomero unido al soporte sólido. El bloque constructor de monómero puede ser un nucleósido u otro compuesto orgánico que es compatible con síntesis de fase sólida.

El ARNdc usado en los conjugados de la invención se puede hacer de manera conveniente y rutinaria a través de la técnica bien conocida de síntesis de fase sólida. El equipo para dicha síntesis se vende por varios proveedores incluyendo, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, CA). Cualquier otro medio para dicha síntesis conocido en la técnica se puede emplear adicional o alternativamente. También se sabe usar técnicas similares para preparar otros oligonucleótidos, tales como los fosforotioatos y derivados alquilados.

Síntesis Las enseñanzas con respecto a la síntesis de oligonucleótidos modificados particulares se pueden encontrar en las siguientes patentes de E.U.A.: Patentes de E.U.A. Nos. 5,138,045 y 5,218,105, dirigidas a oligonucleótidos conjugados con poliamina; patente de E.U.A. No. 5,212,295, dirigida a monómeros para la preparación de oligonucleótidos teniendo ligaduras de fósforo quiral; patentes de E.U.A. Nos. 5,378,825 y 5,541,307, dirigidas a oligonucleótidos teniendo estructuras modificadas; patente de E.U.A. No. 5,386,023, dirigida a oligonucleótidos modificados de estructura y la preparación de los mismos a través de acoplamiento reductor; patente de E.U.A. No. 5,457,191, dirigida a nucleobases modificadas cón base en el sistema de anillo de 3-desazapurina y métodos de síntesis de los mismos; patente de E.U.A. No. 5,459,255, dirigida a nucleobases modificadas con base en purinas ?-2-sustituidas; I patente de E.U.A. No. 5,521,302, dirigida a procesos para preparar oligonucleótidos teniendo ligaduras de fósforo quiral; patente de E.U.A. No. 5,539,082, dirigida a ácidos nucleicos de péptido; patente de E.U.A; No. 5,554,746, dirigida a oligonucleótidos teniendo estructuras de ß-lactama; patente de E.U.A. No. 5,571,902, dirigida a métodos y materiales para la síntesis de oligonucleótidos; patente de E.U.A. No. 5,578,718, dirigida a nucleósidos teniendo grupos alquiltio, en donde dichos grupos se pueden usar como entrelazadores a otras porciones fijadas a cualquiera de una variedad de ; posiciones del nucleósido; patentes de E.U.A. Nos. 5,587,361 y 5,599,797, dirigidas a oligonucleótidos teniendo ligaduras de fosforotioato de alta pureza quiral; patente de E.U.A. No. 5,506,351, dirigida a procesos para la preparación de 2'-0-alquilo guanosina y compuestos relacionados, incluyendo compuestos de 2,6-diaminopurina; patente de E.U.A. No. 5,587,469, dirigida a oligonucleótidos teniendo purinas N-2-sustituidas¡ patente de E.U.A. No. 5,587,470, dirigida a oligonucleótidos teniendo 3-desazapurinas; patente de E.U.A. No. 5,223,168, y patente de E.U.A. No. 5,608,046, ambas dirigidas a análogos de nucleósido de 4'-desmetilo conjugados; patentes de E.U.A. Nos. 5,602,240 y 5,610,289, dirigidos a análogos de oligonucleótido modificados de estructura; patentes de E.U.A. Nos. 6,262,241 y 5,459,255, dirigidas, entre otras cosas, a métodos de sintetizar 2'-fluoro-oligonucleótidos.

En el ARNdc conjugado con ligando y nucleósidos ligados específicos de secuencia portando ligando-molécula de la invención, los oligonucleótidos y oligonucleósidos se pueden ensamblar en un sintetizador de ADN adecuado utilizando precursores de nucleotido o nucleósido estándar, o precursores conjugados de nucleotido o nucleósido que ya portan la porción entrelazadora , precursores de ligando-nucleótido o nucleósido-conjugado que ya portan la molécula de ligando, o bloques constructores que portan ligando de no nucleósido.

Cuando se usan precursores de nucleótido-conjugado que ya portan una porción entrelazadora, la síntesis de los nucleósidos ligados específicos de secuencia se completa típicamente, y la molécula de ligando entonces se hace reaccionar con la porción entrelazadora para formar el oligonucleótido conjugado de ligando. Los conjugados de oligonucleótido portando una variedad de moléculas tales como esteroides, vitaminas, lípidos y moléculas reporteras, se ha descrito previamente (ver Manoharan y otros, Solicitud de PCT WO 93/07883). En una modalidad, los oligonucleótidos o nucleósidos entrelazados mostrados en la invención se sintetizan por un sintetizador automatizado usando fosforamiditas derivadas de conjugados de ligando-nucleósido además de las fosforamiditas estándar y fosforamiditas no estándar que están comercialmente disponibles y rutinariamente usadas en síntesis de oligonucleótido.

La incorporación de un grupo 2'-0-metilo, 2'-0-etilo, 2'-0-propilo, 2 '-O-al i lo, 2'-0-aminoalquilo o 2'-desoxi-2'-fluoro en nucleósidos de un oligonucleótido confiere propiedades de hibridación mejoradas al oligonucleótido. Además, los oligonucleótidos que contienen estructuras de fosforotioato tienen estabilidad de nucléasa mejorada. De esta manera, los nucleósidos funcionalizados, ligados de la invención se pueden aumentar para incluir una estructura de fosforotioato o ambas o un grupo 2'-0-metilo, 2'-0-etilo, 2'-0-propilo, 2'-0-aminoalquilo, 2 '-O-ali lo o 2'-desoxi-2'-fluoro. Una lista de resumen de algunas de las modificaciones de oligonucleótido conocidas en la técnica se encuentra en, por ejemplo, publicación de PCT WO 200370918.

En algunas modalidades, las secuencias de nucleósido f uncionalizado de la invención poseyendo un grupo amino en la terminal 5' se preparan usando un sintetizador de ADN, y después se hace reáccioínar con un derivado de éster activo de un ligando seleccionado.: Los derivados de éster activos son bien conocidos a aquellos; expertos en a técnica. Los ésteres activos representativos incluyen ésteres de N-hidrosuccinimida, ésteres tetrafluorofenólicos, ésteres pentafluorofenólicos y ésteres pentaclorofenólicos. La reacción del grupo amino y el éster activo produce un oligonucleótido en donde el ligando seleccionado se fija a la posición 5' a través de un grupo entrelazador. El grupo amino en la terminal 5' se puede preparar utilizando un reactivo de 5-amino-modificador-C6. En una modalidad, se pueden conjugar moléculas de ligando a oligonucleótidos en la posición 5' por el uso de una fosforamidita de ligando-nucleósido en donde el ligando se entrelaza al grupo 5'- ? hidroxi directa o indirectamente vía un entrelazador. Dichas fosforamiditas de ligando-nucleósido se usan típicamente al final de un procedimiento de síntesis automatizada para proveer un oligonucleótido conjugado con ligando portando el ligando en la terminal 5'.

Ejemplos de ligaduras de internucleósido modificado o estructuras incluyen, por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, fosforoditioatos, fosfotriést'eres, aminoalquilfosfotriésteres, metilo y otros alquilo fosfonatos incluyendo 3'-alquileno fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos incluyendo 3'-amino fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres, y boranofosfatos teniendo 3'-5' ligaduras normales, y análogos 2'-5' ligados de estos, y aquellos teniendo polaridad invertida en donde los pares adyacentes de unidades de nucleósido se entrelazan 3'-5' a 5'-3' ó 2'-5' a 5'-2'. También se incluyen varias sales, sales mixtas y formas de ácido libre.

Las patentes de E.U.A. representativas que se refieren a la preparación de las ligaduras que contienen fósforo-átomo anteriores incluyen, pero no se limitan a, patentes de E.U.A. Nos. 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050; y 5,697,248, cada una de las cuales se incorpora a la presente por referencia.

Ejemplos de ligaduras o estructuras de internucleósido modificadas que no incluyen un átomo de fósforo ahí (es decir, oligonucleósidos) tienen estructuras que se forman por ligaduras de interazúcar de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, heteroatomo mixto y ligaduras de interazúcar de alquilo o cicloalquilo, o una o más ligaduras de interazúcar heteroatómica o heterocíclica de cadena corta. Estas incluyen aquellas que tienen ligaduras de morfolino (formadas en parte de la porción de azúcar de un nucleósido); estructuras de siloxano; estructuras de sulfuro, sulfóxido y ¡éulfona; estructuras de formacetilo y tioformacetilo; estructuras de formacetilo y tioformacetilo de metileno; estructuras que contienen alqueno; estructuras de sulfamato; estructuras de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras de sulfonato y sulfonamida; estructuras de amida; y otras que tienen partes componentes mixtas de N, O, S y CH2.

Las patentes de E.U.A. representativas que se refieren a la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no se limitan a, patentes de E.U.A. Nos. 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225, 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437; y 5,677,439, cada una de las cuales se incorpora a la presente por referencia.

En ciertos casos, el oligonucleótido se puede modificar por un grupo de no ligando. Un número de moléculas de no ligando se han conjugado a . oligonucleótidos a fin de potenciar la actividad, distribución celular o absorción celular del oligonucleótido, y procedimientos para realizar dichas conjugaciones están disponibles en la literatura científica. Dichas porciones de no ligando han incluido porciones de lípido, tales como colesterol (Letsinger y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 1989, 86:6553), ácido cólico (Manoharan y otros, Bioorg. Med. Chem. Lett. , 1994, 4:1053), un tioéter, por ejemplo, hexil-S-tritiltiol (Manoharan y otros, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan y otros, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), un tiocolesterol (Oberhauser y otros, Nucí. Acids Res., 1992, 20:533), una cadena alifática, por ejemplo, dodecandiol o residuos de undecílo (Saison-Behmoaras y otros, EMBO J., 1991, 10:111; kabánov y otros, FEBS Lett., 1990, 259:327; Svinarchuk y otros, Biochrmie, 1993, 75:49), un fosfolípido, por ejemplo, di-hexadecil-rac-glicerol o 1 ,2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietilamonio (Manoharan y otros, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651; Shea y otros, Nucí. Acids Res., 1990, 18:3777), una cadena de poliamina o polietileno glicol (Manoharan y otros, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969), o ácido acético de adamantano (Manoharan y otros, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651), una porción de palmitilo (Mishra y otros, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), o una porción de octadecilamina o hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke y otros, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923). Las patentes de Estados Unidos representativas que enseñan la preparación de dichos conjugados de oligonucleótido se han listado antes. Los protocolos de conjugación típicos involucran la síntesis de oligonucleótidos portando un aminoenlazador en una o más posiciones de la secuencia. El grupo amino entonces se hace reaccionar con la molécula siendo conjugada usando reactivos apropiados acopladores o activadores. La reacción de conjugación se puede realizar ya sea con el oligonucleótido todavía unido al soporte sólido o siguiendo corte del oligonucleótido en fase de solución. La purificación del conjugado de oligonucleótido por HPLC típicamente da el conjugado puro. El uso de un conjugado de colesterol es particularmente preferido ya que dicha porción puede aumentar células de hígado focalizadoras, un sitio de expresión de PCSK9.

Agentes de ARNi codificados de vector En otro aspecto de la invención, las moléculas de ARNdc específicas de PCSK9 que modulan actividad de expresión de gen PCSK9 se expresan a partir de unidades de transcripción insertadas en vectores de ADN o ARN (ver, por ejemplo, Couture, A, y otros, TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., y otros, publicación de PCT internacional : No. WO 00/22113, Conrad, publicación de PCT internacional , No. WO 00/22114, y Conrad, patente de E.U.A. No. 6,054,299). Estos transgenes se pueden introducir como una construcción lineal, un plásmido circular, o un vector viral, que se pueden incorporar y heredar como un transgen integrado en el genoma huésped. El transgen también se puede construir para permitirle heredarse como un plásmido extracromosomal (Gassmann, y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1995) 92:1292).

Las cadenas individuales de un ARNdc se pueden trascribir por promotores en dos vectores de expresión separados y co-transfectados en una célula objetivo. Alternativamente, dicha cadena individual del ARNdc se puede transcribir por promotores de los cuales se ubican en el mismo plásmido de expresión. En una modalidad, un ARNdc se expresa como una repetición invertida unida por una secuencia de polinucleótido entrelazador de modo que el ARNdc tiene una estructura de tallo y lazo.

Los vectores de expresión de ARNdc recombinantes por lo general son plásmidos de ADN o vectores virales. Se pueden construir vectores virales expresando ARNdc con base en, pero sin limitación a, virus adeno-asociado (para una revisión, ver Muzyczka, y otros, Curr, Topics Micro. Immunol. (1992) 158:97-129)); adenovirus (ver, por ejemplo, Berkner, y otros, BioTechniques (1998) 6:616), Rosenfeld y otros (1991, Science 252:431-434), y Rosenfeld y otros (1992), Cell 68:143-155)); o alfavirus así como otros conocidos en la técnica. Se han usado retrovirus para introducir una variedad de genes en muchos tipos celulares diferentes, incluyendo células epiteliales, in vivo y/o in vitro (ver, por ejemplo, Eglitis, y otros, Science (1985) 230:1395-1398; Danos y Mulligan, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA (1998) 85:6460-6464; Wilson y otros, 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 85:3014-3018; Armentano y otros, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 87:6141-6145; Huber y otros, 1991, Proc. Nati. Aúad. Sci. EUA 88:8039-8043; Ferry y otros, 1991, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88:8377-8381; Chowdhury y otros, 1991, Science 254:1802-1805; van Beusechem, y otros, 1992, Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 89:7640-19; Kay y otros, 1992, Human Gene Therapy 3:641-647; Dai y otros, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:10892-10895; Hwu y otros, 1993, J. Immunol. 150:4104-4115; patente de E.U.A. No. 4,868,116; patente de E.U.A. No. 4,980,286; solicitud de PCT WO 89/07136; solicitud de PCT WO 89/02468; solicitud de PCT WO 89/05345; y solicitud de PCT WO 92/07573). Los vectores t retrovirales recombinantes capaces de transducir y expresar genes insertados en el genoma de una célula se pueden producir al transfectar el genoma retroviral recombinante en líneas celulares de empaque adecuadas tales como PA317 y Psi-CRIP (Comette y otros, 1991, Human Gene Therapy 2:5-10, Cone y otros, 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81:6349). Se pueden usar vectores adenovirales recombinantés para infectar una variedad amplia de células y tejidos en huéspedes susceptibles (por ejemplo, rata, hámster, perro y chimpancé) (Hsu y otros, 1992, J. Infectious Disease, 166:769), y también tienen a ventaja de no requerir células mitóticamente activas para infección.

Cualquier vector viral capaz de aceptar las secuencias codificadoras, para la(s) molécula(s) de ARNdc a expresarse se puede usar, por ejemplo, vectores derivados de adenovirus (AV); virus adeno-asociado (AAV); retrovirus (por ejemplo, lentivirus (LV), Rhabdovirus, virus de leucemia murina); herpes virus, y similares. El tropismo de vectores virales se puede modificar al seudotipificar los vectores con proteínas de sobre u otros antígenos de superficie de otros virus, o al sustituir diferentes proteínas de cápside viral, según sea apropiado.

Por ejemplo, lo vectores lentivirales de la invención se pueden seudotipificar con proteínas de superficie de virus estomatitis vesicular (VSV), rabias, ébola, Mokola, y similares, Los vectores de AAV de la invención se pueden hacer para focalizar diferentes células al ingeniar los vectores para expresar diferentes serotipos de i i proteína de cáspide. Por ejemplo, un vector de AAV expresando un serotipo 2 cáspide en un génoma serotipo 2 se llama AAV 2/2. Este gen serotipo 2 cáspide en el vector de AAV 2/2 se puede reemplazar por un gen serotipo 5 cáspide para producir un vector de AAV 2/5. Las técnicas para construir vectores de AAV que expresan diferentes serotipos de proteína de cápside están dentro de la experiencia en la técnica; ver, por ejemplo, Rabinowitz J E y otros (2002), J Virol 76:791-801, la descripción entera de la cual se incorpora a la presente por referencia.

La selección de vectores recombinantes virales adecuados para usarse en la invención, métodos para insertar secuencias de ácido nucleico para expresar el ARNdc en el vector, y métodos de surtir el vector viral a las células de interés están dentro de la experiencia en la técnica. Ver, por ejemplo, Dornbuxg R (1995), Gene Therap. 2:301-310; Eglitis M A (1988), Biotechniques 6:608-614; Miller A D (1990), Hum Gene Therap. 1:5-14; Anderson W F (1998), Nature 392:25-30; y Rubinson D A y otros, Nat. Genet. 33:401-406, las descripciones enteras de las cuales se incorporan a la presente por referencia.

Los vectores virales preferidos son aquellos derivados de AV y AAV. En una modalidad particularmente preferida, el ARNdc de la invención se expresa como dos moléculas de ARN de una sola cadena, separadas, complementarias de un vector de AAV recombinante teniendo, por ejemplo, ya sea los promotores U6 o H1 ARN, o el promotor de citomegalovirus (CMV).

Un vector de AV adecuado para expresar el ARNdc de la invención, un método para construir el vector de AV recombinante, y un método para entregar el vector en células objetivo, se describen en Xia H y otros (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010.

Los vectores de AAV adecuados para expresar el ARNdc de la invención, métodos para construir el vector de AV recombinante, y métodos para entregar los vectores en células objetivo se describen en Samulski R y otros (1987), J. Virol. 61:3096-3101; Fisher K J y otros (1996), J. Virol, 70:520-532; Samulski R y otros (1989), J. Virol. 63:3822-3826; patente de E.U.A. No. 5,252,479; patente de E.U.A. No. 5,139,941; solicitud de patente internacional No. WO 94/13788; y solicitud de patente internacional No. WO 93/24641, las descripciones enteras de las cuales se incorporan a la presente por referencia.

El promotor impulsando expresión de ARNdc en un plásmido de ADN o vector viral de la invención puede ser una polimerasa I de ARN eucariótico (por ejemplo, promotor de ARN ribosomal), polimerasa II de ARN (por ejemplo, promotor temprano de CMV o promotor de actina o promotor de U1 ARNns) o por lo general promotor de polimerasa II de ARN (por ejemplo, promotor de U6 ARNsn o 7SK ARN) o un promotor procariótico, por ejemplo el promotor T7, siempre y cuando el plásmido de expresión también codifique polimerasa de T7 ARN requerida para transcripción de un promotor T7. El promotor también puede dirigir expresión de transgen al páncreas (ver, por ejemplo, la secuencia reguladora de insulina para páncreas (Bucchini y otros, 1986, Proc. Nati. Acad. Sci.

EUA 83:2511-2515)).

Además, se puede regular con precisión la expresión del transgen, por ejemplo, al usar una secuencia reguladora inducible y sistemas de expresión tal como una secuencia reguladora que sea sensible a ciertos reguladores fisiológicos, por ejemplo, niveles de glucosa circulantes, u hormonas (Dicherty y otros, 1994, FASEB J 8.20-24). Dichos sistemas de expresión inducibles, adecuados para el control de expresión de transgen en células o en mamíferos incluyen regulación por ecdisoma, por estrógeno, progesterona, tetraciclina, inductores químicos de dimerización, e isopropil-beta-D1 -tiogalactopiranosída (EPTG). Un experto en la técnica podrá elegir la secuencia reguladora/promotora apropiada con base en el uso destinado del transgen de ARNdc.

Por lo general, los vectores recombinantes capaces de expresar moléculas de ARNdc se entregan como se describe más adelante, y persisten en células objetivo. Alternativamente, los vectores virales se pueden usar que proveen expresión transitoria de moléculas de ARNdc. Dichos vectores se pueden administrar repetidamente según sea necesario. Una vez expresados, los ARNdcs unen a ARN objetivo y modulan su función o expresión. El surtido de vectores expresando ARNdc puede ser sistémico, tal como por administración intravenosa o intramuscular, por administración a células objetivo explantadas del paciente seguido por reintroducción en el paciente, o por cualquier otro medio que permite introducción en una célula objetivo deseada.

Los plásmidos de ADN de expresión de ARNdc típicamente se transfectan en células objetivo como un complejo con portadores de lípido catiónicos (por ejemplo, Oligofectamina) o portadores a base de lipido no catiónico (por ejemplo, Transit-TKO™). Las múltiples transfecciones de lípido para regiones diferentes focalizadoras mediadas por ARNdc de un gen PCSK9 o múltiples genes PCSK9 sobre un periodo de una semana o más también se contemplan por la invención. La1 introducción exitosa de los vectores de la invención en células huésped se puede monitorear usando varios métodos conocidos. Por ejemplo, la transfección transitoria, se puede señalar con un reportero, tal como un marcador fluorescente, tal como Proteína Fluorescente Verde (GFP). La transfección estable de células ex vivo se puede asegurar usando marcadores que proveen la célula transfectada con resistencia a factores ambientales específicos (por ejemplo, antibióticos y fármacos), tal como resistencia a higromicina B.

Las moléculas de ARNdc específicas de PCSK9 también se pueden insertar en vectores y usar como vectores de terapia de gen para pacientes humanos. Los vectores de terapia de gen se pueden administrar a un sujeto, por ejemplo, por inyección intravenosa, administración local (ver patente de E.U.A. 5,328,470), o por inyección estereotáctica (ver, por ejemplo, Chen y otros (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia de gen puede incluir el vector de terapia de gen en un diluyente aceptable, o puede incluir una matriz de liberación lenta en donde se incrusta el vehículo de administración de gen. Alternativamente, en donde el vector de surtido de gen completo se puede producir intacto de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células que producen el sistema de surtido de gen.

Composiciones farmacéuticas que contienen ARNdc En una modalidad, la invención provee composiciones farmacéuticas que contienen un ARNdc, como se describe en la presente, y un portador farmacéuticamente aceptable y métodos de administrar los mismos. La composición farmacéutica que contiene el ARNdc es útil para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad de un gen PCSK9, tal como procesos patológicos mediados por expresión de PCSK9, por ejemplo, hiperlipidemiá. Dichas composiciones farmacéuticas se formulan con base en el modo de surtido.

Dosificación Las composiciones farmacéuticas mostrados en la presente se administran en dosificaciones suficientes para inhibir expresión de genes PCSK9. En general, una dosis adecuada de ARNdc estará en el rango de 0.01 a 200.0 miligramos por kilogramo de peso corporal del recipiente por día, por lo general en el rango de 1 a 50 mg por kilogramo de peso corporal por día. Por ejemplo, el ARNdc se puede administrar a!0.01 mg/kg, 0.05 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.5 mg/kg, 2 mg/kg, 3 rríg/kg, 5.0 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg ó 50 mg/kg por dosis individual.

La \ composición farmacéutica se puede administrar una vez al día, o el ARNdc se puede administrar como dos, tres o más sub-dosis a intervalos apropiados a lo largo del día. El efecto de una sola dosis en niveles de PCSK9 es de larga duración, de modo que las dosis posteriores se administran a no más de intervalos de 7 días, o a intervalos de no más de 1, 2, 3 ó 4.

En algunas modalidades, el ARNdc se administra usando infusión continua o surtido a través de una formulación de liberación controlada. En ese caso, el ARNdc contenido en cada sub-dosis debe ser correspondientemente más pequeño a fin de lograr la dosificación diaria total. La unidad de dosificación también puede estar compuesta para surtir sobre varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación sostenida convencional que provee liberación sostenida del ARNdc sobre un periodo de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en la técnica y son particularmente útiles para surtir agentes en un sitio particular, tal como se usaría con los agentes de la presente invención. En esta modalidad, la unidad de dosificación contiene un múltiple correspondiente de la dosis diaria.

El experto apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosificación y tiempo requeridos para tratar efectivamente un sujeto, I incluyendo, pero sin limitación a, la severidad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición puede incluir un solo tratamiento o una serie de tratamientos. Los estimados de dosificaciones efectivas y medias vidas in vivo para los ARNdcs individuales abarcados por la invención se pueden hacer usando metodologías convencionales o en la base de prueba in vivo usando un modelo animal apropiado, como se describe en cualquier otra parte en :l½ presente.

Avances en genética de ratón han generado un número de modelos de ratón para el estudio de varias enfermedades humanas, tales como proceso patológicos mediados por expresión PCSK9. Dichos modelos se usan para prueba in vivo de ARNdc, así como para determinar una dosis terapéuticamente efectiva. Un modelo de ratón adecuado es, por ejemplo, un ratón que contiene un PCSK9 humano expresando plásmido. Otro modelo de ratón adecuado es un ratón transgénico que lleva un transgen que expresa PCSK9 humano.

La toxicidad y eficacia terapéutica de dichos compuestos se puede determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar el LD50 (la dosis letal a 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación LD50/ED50. Se prefieren compuestos que exhiben altos índices terapéuticos.

Los. datos obtenidos de ensayos de cultivo celular y estudios animales se pueden usar en formular un rango de dosificación para usarse en humanos. La dosificación de composiciones mostradas en la invención se encuentra por lo. general dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen el ED50 con poca o nada de toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en los métodos mostrados en la invención, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar al inicio de ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para lograr un rango de concentración de plasma circulante del compuesto o, cuando sea apropiado, del producto de polipéptido de una secuencia objetivo (por ejemplo, logrando una concentración disminuida del polipéptido) que incluye el IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición media-máxima de síntomas) como se determina en cultivo celular. Dicha información se puede usar para determinar con más precisión dosis en humanos. Los niveles de plasma se puede medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alto rendimiento.

Además de su administración, como se discutió antes, los ARNdcs mostrados en la invención se pueden administrar en combinación con otros agentes conocidos efectivos en el tratamiento de procesos patológicos mediados por expresión de gen objetivo. En cualquier caso, el médico tratante puede ajustar la cantidad y tiempo de administración de ARNdc en la base de resultados observados usando medidas estándar de eficacia conocidas en la técnica o descritas en la presente.

Administración Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar en un número de maneras dependiendo si se desea tratamiento local o sistémico y del área a ser tratada. La administración puede ser tópica, pulmonar, por ejemplo, por inhalación o '¦; insuflación de polvos o aerosoles, incluyendo por nebulizador; intratráquea, intranasal, epidérmica y transdérmica, y subdérmica, oral o parenteral, por ejemplo, subcutánea.

Típicamente, cuando se trata un mamífero con hiperlipídemia, las moléculas de ARNdc se administran sistémicamente vía medios parentales. La administración parenteral incluye inyección o infusión intravenosa, intra-arterial, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o administración intracraneal, por ejemplo, intraparenquimal, intratecal o intraventricular. Por ejemplo, ARNdcs, conjugados o no conjugados o formulados con o sin liposomas, se pueden administrar intravenosamente a un paciente. Para tal, una molécula de ARNdc se puede formular en composiciones tales como soluciones acuosas estériles y no estériles, soluciones no acuosas en solventes comunes tales como alcoholes, o soluciones en bases oleosas liquidas o sólidas. Dichas soluciones también pueden contener reguladores, diluyentes u otros aditivos adecuados. Para administración parenteral, intratecal o intraventricular, una molécula de ARNdc se puede formular en composiciones tales como soluciones acuosas estériles, que también pueden contener reguladores, diluyentes, y otros aditivos adecuados (por ejemplo, potenciadores de penetración, compuestos portadores, y otros portadores farmacéuticamente aceptables). Se describen formulaciones en más detalle en la presente.

El ARNdc se puede administrar en una manera para focalizar un tejido particular, tal como el hígado (por ejemplo, los hepatocitos del hígado).

Formulaciones Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, que se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria, se pueden preparar de conformidad con técnicas convencionales bien conocidas en la industria farmacéutica. Dichas técnicas incluyen el paso de llevar en asociación los ingredientes activos con el portador(es) o excipiente(s) farmacéutico(s). En general, las formulaciones se preparan al llevar de manera uniforme e íntima en asociación los ingredientes activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y entonces, si es necesario, configurar el producto.

Las composiciones de la presente invención se pueden formular en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, pero sin limitación a, tabletas, cápsulas, cápsulas de ge I , jarabes líquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también se pueden formular como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mixtos. Las suspensiones acuosas además pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextran. La suspensión también puede contener estabilizadores.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, soluciones, emulsiones, y formulaciones que contienen liposoma. Estas composiciones se pueden generar de una variedad de componentes que incluyen, pero no se limitan a, líquidos preformados, sólidos auto-emulsionantes y semisólidos auto-emulsionantes. En un aspecto son formulaciones que focalizan el hígado al tratar trastornos hepáticos tal como hiperlipidemia.

Además, el ARNdc que focaliza el gen PCSK9 se puede formular en composiciones que contienen el ARNdc mixto, encapsulado, conjugado o de lo contrario asociado con otras moléculas, estructuras moleculares, o mezclas de ácidos nucleicos. Por ejemplo, una composición que contiene uno o más agentes de ARNdc que focalizan el gen PCSK9 puede contener otros agentes terapéuticos ,tales como otros agentes reductores de lípido (por ejemplo, estatinas) o uno o más compuestos de ARNdc que focalizan genes no PCSK9.

Formulaciones orales, parenterales, tópicas y biológicas Las composiciones y formulaciones para administración oral incluyen polvos o gránulos, micropartículas, nanopartículas, suspensiones o soluciones en agua o medios no acuosos, cápsulas, cápsulas de gel, bolsas, tabletas o minitabletas. Espesantes, agentes sabo'rizantes, diluyentes, emulsores, auxiliares de dispersión o aglutinantes pueden ser deseables. En algunas modalidades, las formulaciones orales son aquellas en donde ARNdcs mostrados en la invención se administran en conjunto con uno o más agentes tensioactivos o quelatadores potenciadores de penetración. Los agentes tensioactivos adecuados incluyen ácidos grasos y/o ésteres o sales de los mismos, ácidos biliares y/o sales de los mismos. Los ácidos/sales biliares adecuados incluyen ácido quenodesoxicólico (CDCA) y ácido ursodesoxiquenodesoxicólico (UDCA), ácido cólico, ácido deshidrocólico, ácido desoxicólico, ácido glucólico, ácido glicólico, ácido glicodesoxicólico, ácido taurocólico, ácido taurodesoxicólico, tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio y glicodihidrofusidato de sodio. Los ácidos grasos adecuados incluyen ácido araquidónico, ácido undecanoico, ácido oleico, ácido laúrico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina, í dilaurina, gliceril 1 -monocaprato, 1-dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un monoglicérido, un diglicérido o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos (por ejemplo, sodio). En algunas modalidades, se usan combinaciones de potenciadores de penetración, por ejemplo, ácidos/sales grasos en combinación con ácidos/sales biliares. Una combinación ejemplar es la sal de sodio de ácido laurico, ácido cáprico y UDCA. Más potenciadores de penetración incluyen éter de polioxietileno-9-laurilo, éter de polioxietileno-20-cetílo. Los ARNdcs mostrados en la invención se pueden administrar oralmente, en forma granular incluyendo partículas secas por aspersión, o complejadas para formar micro o nanopartículas. Los agentes de complejación de ARNdc incluyen poli-amino ácidos; poliiminas; poliacrilatos; polialquilacrilatos; polioxetanos, polialquilcrianoacrilatos; gelatinas cationizadas, albúminas, almidones, acrilatos, polietilenglicoles (PEG) y almidones; polialquilcianoacrilatos; poliiminas derivadas de DEAE, pollulans, celulosas y almidones. Los agentes de i complejación .adecuados incluyen quitosan, N-trimetilquitosan, poli-L-lisina, poli istidina, poliornitina, polisperminas, protamina, polivinilpiridina, politiodietilaminometiletileno P (TDAE), poliaminoestireno (por ejemplo, p-amino), poli(metilcianoacrilato), poli(etilcianoacrilato), poli(butilcianoacrilato), poli(isobutilciano-acrilato), poli(isohexilcianoacrilato), DEAE-metacrilato, DEAE-hexilacrilato, DEAE-acrilamida, DEAE-albúmina y DEAE-dextran, polimetilacrilato, polihexilacrilato, poli(D, L-láctico ácido), poli(DL- láct¡co-co-gl¡cólico ácido (PLGA), alginato, y polietilenglicol (PEG). Las formulaciones orales para ARNdcs y su preparación se describen en detalle en la patente de E.U.A. 6,887,906, publicación de patente de E.U.A. No. 20030027780, y la patente de E.U.A. No. 6,747,014, cada una de las cuales se incorpora a la presente por referencia.

Las composiciones y formulaciones para administración parenteral, intraparenquimal (en el cerebro), intratecal, intraventricular o intrahepática pueden incluir soluciones acuosas estériles que también pueden contener reguladores, diluyentes y otros aditivos tales como, pero sin limitación a, potenciadores de penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las cqmposiciones y formulaciones farmacéuticas para administración tópica pueden incluir parches transdérmicos, ungüentos, lo'ciones, cremas, geles, gotas, supositorios, aspersores, líquidos y polvos. Los portadores farmacéuticos convencionales, bases acuosas, en polvo o aceite, espesantes y similares pueden ser necesarios o ' deseables. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen aquellas en donde los ARNdcs mostrados en la invención están en mezcla con un agente de surtido tópico tales como lípidos, liposomas, ácidos grasos, ésteres de ácido graso, esteroides, agentes quelatadores y agentes tensioactivos. Los lípidos y liposomas adecuados incluyen neutral (por ejemplo, dioleoilfosfatidil DOPE etanolamina, dimiristoilfosfatidil colina DMPC, diestearolifosfatidil colina) negativo (por ejemplo, dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) y catiónico (por ejemplo, dioleoiltetrametilaminopropil DOTAP y dioleoilfosfatidil etanolamina DOTMA). Los ARNdcs mostrados en la invención se pueden encapsular dentro de liposomas o pueden formar complejos de los mismos, en particular a liposomas catiónicas. Los ácidos grasos o ésteres adecuados incluyen, pero no se limitan a, ácido araquidónico, ácido oleico, ácido eicosanoico, ácido laurico, ácido caprílico, ácido cáprico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina, dilaurina, gliceril 1 -monocaprato, 1 -dodecilazacicloheptan-2-ona, una acilcarnitina, una acilcolina, o un éster de alquilo de CM0 (por ejemplo, isopropilmiristato IPM), monoglicérido, diglicérido o sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Se describen formulaciones tópicas en detalle en la patente de E.U.A. No. 6,747,014, que se incorpora a la presente, por referencia. Además, se pueden administrar moléculas de ARNdc a un mamífero como medios biológicos o abiológicos como se describe en, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 6,271,359. Se puede lograr administración abiológica por una variedad de métodos incluyendo, sin limitación, (1) cargar liposomas con una molécula de ácido de ARNdc provista en la presente y (2) complejar una molécula de ARNdc con lípidos o liposomas para formar complejos de ácido nucleico-lípido o ácido nucleico-liposorhas. El liposoma puede estar compuesto de lípidos catiónicos o neutrales comúnmente usados para transfectar células in vitro. Los lípidos catiónicos pueden complejar (por ejemplo, carga-asociada) con ácidos nucleicos negativamente cargados para formar liposomas. Ejemplos de liposomas catiónicos incluyen, sin limitación, lipofectina, lipofectamina, lipofectace, y DOTAP. Los procedimientos para formar liposomas son bien conocidos en la técnica. Se pueden formar composiciones de liposoma, por ejemplo, de fosfatidilcolina, dimiristoil fosfatidilcolina, dipalmitoil fosfatidilcolina, dimiristoil fosfatidilglicerol, o dioleoil fosfatidiletanolamina. Numerosos agentes lipofílicos están comercialmente disponibles, incluyendo Lipofectin™ (Invitrogen/Life Technologies, Carlsbad, Calif.) y Effectene™ (Qiagen, Valencia, Calif.). Además, se pueden optimizar métodos de surtido sistémico usando lípidos catiónicos comercialmente disponibles tales como DDAB o DOTAP, cada uno de los cuales se puede mezclar con un lípido neutral tal como DOPE o colesterol. En algunos casos, se pueden usar liposomas tales como aquellos descritos por Templeton y otros (Nature Biotechnology, 15:647-652 (1997)). En otras modalidades, se pueden usar policationes tal como polietilenimina para lograr administración in vivo y ex vivo (Boletta y otros, J. Am Soc. Nephrol. 7:1728 (1996)). Se puede encontrar información adicional con respecto al uso de liposomas para surtir ácidos nucleicos en la patente de E.U.A. No. 6,271,359, publicación de PCT WO 96/40964 y Morrissey, D. y otros 2005, Nat Biotechnol. 23(8):1002-7.

Se puede lograr surtido biológico por una variedad de métodos incluyendo, sin limitación, el uso de vectores virales. Por ejemplo, vectores virales (por ejemplo, vectores de adenovirus y herpesvirus) se pueden usar para administrar moléculas de ARNdc a células de hígado. Se pueden usar técnicas de biología molecular estándar para introducir uno o más de los ARNdcs provistos en la presente en uno de los muchos vectores virales diferentes desarrollados previamente para administrar ácido nucleico a células. Estos vectores virales resultantes se pueden usar para surtir el uno o más ARNdcs a células, por ejemplo, por infección.

Caracterización de ARNdcs formulados Las formulaciones preparadas por el método estándar o libre de extrusión se puede caracterizar en maneras similares. Por ejemplo, las formulaciones se caracterizan típicamente por inspección visual. Deben ser soluciones translúcidas blancas libres de agregados o sedimento. El tamaño de partícula y distribución de tamaño de partícula de lípido-nanopartículas se puede medir por difusión de luz usando, por ejemplo, un Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EUA). Las partículas deben ser aproximadamente 20-300 nm, tal como 40-100 nm en tamaño. La distribución de tamaño de partícula debe ser unimodal. La concentración total de ARNis en la formulación, así como la fracción atrapada, se estima usando un ensayo de exclusión de tinte. Una muestra del ARNic formulado se puede incubar con un colorante de unión a ARN, tal como Ribogreen (Molecular Probes) en presencia o ausencia de una formulación interrumpiendo agente tensioactivo, por ejemplo, 0.5% Triton-X100. El ARNic total en la formulación se puede determinar por la señal desde la muestra que contiene el agente tensioactivo, relativo a una curva estándar. La fracción atrapada se determina al sustraer el contenido de ARNic "libre" (como se mide por la señal en ausencia de agente tensioactivo) desde el contenido de ARNic total. El por ciento de ARNic atrapado es típicamente >85%. Para formulación de SNALP, el tamaño de partícula es por lo menos 30 nm, por lo menos 40 nm, por lo menos 50 nm, por lo menos 60 nm, por lo menos 70 nm, por lo menos 80 nm, por lo menos 90 nm, por lo menos 100 nm, por lo menos 110 nm, y por lo menos 120 nm. El rango adecuado es típicamente alrededor de por lo menos 50 nm a aproximadamente por lo menos 110 nm, aproximadamente por lo menos 60 nm a alrededor de por lo menos 100 nm, o aproximadamente por lo menos 80 nm a alrededor de por lo menos 90 nm.

Formulaciones iiposomales Hay muchas estructuras de agente tensioactivo organizadas aparte de las microemulsiones que han sido estudiadas y usadas para la formulación de fármacos. Estas incluyen monocapas, micelas, bicapas y vesículas. Las vesículas, tales como líposomas, han atraído gran interés debido a su especificidad y la duración de acción que ofrecen desde el punto de vista de surtido de fármaco. Como se usa. en la presente invención, el término "liposoma" i significa una vesícula compuesta de lípidos anfifílicos dispuestos en una bicapa o bicapas esféricas.

Los liposomas son vesículas unilamelares o multilamelares que tienen una membrana formada de un material lipofílico y un interior acuoso. La porción acuosa contiene la composición a ser administrada. Los liposomas catiónicos poseen la ventaja de poderse fusionar a la pared celular. Los liposomas no catiónicos, aunque no pueden fusionarse tan eficientemente con la pared celular, son tomados por macrófagos in vivo.

A fin de cruzar la piel de mamífero intacta, las vesículas de lípido deben pasar a través de una serie de poros finos, cada uno con un diámetro de menos de 50 nm, bajo la influencia de un gradiente transdérmico adecuado. Por lo tanto, se desea usar un liposoma que sea altamente deformable y capaz de pasar a través de dichos poros finos.

Otras ventajas de liposomas incluyen: liposomas obtenidos de fosfolípidos : naturales son biocompatibles y biodegradables; liposomas pueden incorporar un rango amplio de agua y fármacos solubles de lípido; liposomas pueden proteger fármacos encapsulados en sus compartimentos internos del metabolismo y degradación (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, NY, volumen 1, p. 245). Consideraciones importantes en la preparación de formulaciones de liposoma son la carga de superficie de lípido, tamaño de vesícula y el volumen acuoso de los liposomas.

Los liposomas son útiles para la transferencia y surtido de ingredientes activos al sitio de acción. Ya que la membrana liposomal es estructuralmente similar a membranas biológicas, cuando se aplican liposomas a un tejido, los liposomas comienzan a fusionarse con las membranas celulares y conforme progresa la fusión del liposoma y célula, los contenidos liposomales son vaciados en la' célula en donde puede actuar el agente activo.

Las formulaciones liposomales han sido el foco de investigación extensiva como el modo de surtido para muchos fármacos. Hay evidencia creciente de que para administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas sobre otras formulaciones. Dichas ventajas incluyen efectos laterales reducidos relacionados con alta absorción sistémica del fármaco administrado, acumulación aumentada del fármaco administrado en el objetivo deseado, y la habilidad de administrar una variedad amplia de fármacos, ambos hidrofílicos e hidrofóbicos, en la piel.

Varios reportes han detallado la habilidad de liposomas para surtir agentes incluyendo ADN de peso molecular alto en la piel. Los compuestos que incluyen analgésicos, anticuerpos, hormonas y ADNs de peso molecular alto han sido administrados a la piel. La mayoría de aplicaciones resultó en la focalización de la epidermis superior.

Los liposomas caen en dos clases amplias. Los liposomas catiónicos son liposomas positivamente cargados que interactúan con las moléculas de ADN negativamente cargadas para formar un complejo estable. El complejo de ADN/liposoma positivamente cargado une a la superficie celular negativamente cargada y se internaliza en un endosoma. Debido al pH ácido dentro del endosoma, los liposomas son reventados, liberando sus contenidos en el citoplasma celular (Wang y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, 147, 980-985).

Los liposomas que son sensibles a pH o negativamente cargados, atrapan ADN en vez de complejo con él. Ya que tanto el ADN como el lípido son cargados de manera similar, ocurre repulsión en vez de la formación de complejo. No obstante, algún ADN es atrapado dentro del interior acuoso de estos liposomas. Se han usado liposomas sensibles a pH para surtir ADN codificando el gen timidina kinasa a monocapas celulares en cultivo. La expresión del gen exógeno se detectó en las células objetivo (Zhou y otros, Journal of Controlled Reléase, 1992, 19, 269-274).

Un tipo principal de composición liposomal incluye fosfolípidos diferentes de fosfatidilcolina derivada de manera natural. Las composiciones de liposoma neutral, por ejemplo, se pueden formar de dimiristoil fosfatidilcolina (DMPC) o dipalm itoil fosfatidilcolina (DPPC). Las composiciones de liposoma aniónico por lo general se forman de dimiristoil fosfatidilglicerol, mientras que los liposomas fusogénicos aniónicos se forman primariamente de dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE). Otro tipo de composición liposomal se forma de fosfatidilcolina (PC) tal como, por ejemplo, PC de soya, y PC de huevo. Otro tipo se forma de mezclas de fosfolípido y/o fosfatidilcolina y/o colesterol.

Varios estudios han evaluado el surtido tópico de formulaciones de fármaco liposomal a la piel. La aplicación de liposomas conteniendo interferón a piel de conejillo de indias resultó en una reducción de llagas de herpes de piel mientras que el surtido de interferón vía otros medios (por ejemplo, como una solución o como una emulsión) fueron inefectivos (Weiner y otros, Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Además, un estudio adicional probó la eficacia de interferón administrado como parte de una formulación liposomal a la administración de interferón usando un sistema acuoso, y concluyó que la formulación liposomal fue superior a la administración acuosa (du Plessis y otros, Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).

También se han examinado sistemas liposomales no iónicos para determinar su utilidad en el surtido de fármacos a la piel, en particular sistemas que comprenden agente tensioactivo no iónico y colesterol. Las formulaciones liposomales no iónicas comprendiendo Novasome™ I (gliceril dilaurato/colesterol/éter de polioxietíleno- 0-estearilo) y iviovasome™ II (gliceril * diestearato/colesterol/éter de polioxietileno-10-estaerilo) se usaron para surtir ciclosporin-A en la dermis de piel de ratón. Los resultados indicaron que dichos sistemas liposomales no iónicos fueron efectivos en facilitar la deposición de ciclosporin-A en capas diferentes de la piel (Hu y otros, S.T.P. Pharma. ScL, 1994, 4, 6, 466).

Los liposomas también incluyen liposomas "estéricamente estabilizados", un término que, como se usa en la presente, se refiere a liposomas que comprenden uno o más lípidos especializados que, cuando se incorporan en Iiposomas, resultan en tiempos de vida de circulación mejorados relativos a Iiposomas carentes de dichos lípidos especializados. Ejemplos de Iiposomas estéricamente estabilizados son aquellos en donde parte de la porción de lípido formando vesícula del liposoma (A) comprende uno o más glicolípidos, tal como monosialogangliosida GM-i , o (B) se deriva con uno o más polímeros hidrof ílicos, tal como una porción de polietileno glicol (PEG). Sin quererse limitar por ninguna teoría particular, se cree en la técnica que, por lo menos para Iiposomas estéricamente estabilizados que contienen gangliosidos, esf ingomielina, o lípidos derivados de PEG, la vida media de circulación mejorada de estos Iiposomas estéricamente estabilizados deriva de una absorción reducida en células del sistema reticuloendotelial (RES) (Alien y otros, FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu y otros, Cáncer Research, 1993, 53, 3765).

Varios Iiposomas que comprenden uno o más glicolípidos son conocidos en la técnica. Papahadjopoulos y otros (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) reportó la habilidad de monosialogangliosido GMi , galactocerebrosida sulfato y fosfatidilinositol para mejorar vidas medias de sangre de Iiposomas. Estos descubrimientos fueron expuestos pro Gabizon y otros (Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 1988, 85, 6949). La patente de E.U.A. No. 4,837,028 y WO 88/04924, ambos a Alien y otros, describen Iiposomas que comprenden (1) esfingomielina y (2) el gangliosido GMi o un éster de galactocerebrosido sulfato. La patente de E.U.A. No. 5,543,152 (Webb y otros) describe liposomas que comprenden esfinomielina. Los liposomas que comprenden 1 ,2-sn-dimiristoilfosfat-idilcolina se describen en WO 97/13499 (Lim y otros).

Muchos liposomas que comprenden lípidos derivados con uno o más polímeros hidrof ílicos , y métodos de preparación de los mismos, son conocidos en la técnica. Sunamoto y otros (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) describieron liposomas que comprenden un detergente no iónico, 2Ci2i5G. que contiene una porción de PEG. Illum y otros (FEBS Lett., 1984, 167, 79) señaló que el recubrimiento hidrofílico de partículas de poliestireno con glicoles poliméricos resulta en vidas medias de sangre significativamente mejoradas. Los fosfolípidos sintéticos modificados por la fijación de grupos carboxílicos de polialquileno glicoles (por ejemplo, PEG) se describen por Sears (patentes de E.U.A. Nos. 4,426,330 y 4,534,899). Klibanov y otros (FEBS Lett., 1990, 268, 235) describen experimentos que demuestran que los liposomas que comprenden fosfatidiletanolamina (PE) derivada con PEG o PEG estearato tienen aumentos significativos en medias vidas de circulación de sangre. Blume y otros (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) extendieron dichas observaciones a otros fosfolípidos derivados de PEG, por ejemplo, DSPE-PEG, formados de la combinación de diestearoilfosfatidiletanolamina (DSPE) y PEG. Los liposomas teniendo porciones de PEG covalentemente unidas en su superficie externa se describen en la patente europea No. EP 0 445 131 B1 y WO 90/04384 a Fisher. Las composiciones de liposoma que contienen 1-20 por ciento molar de PE derivado con PEG, y métodos de uso del mismo, se describen por Woodle y otros (patentes de E.U.A. Nos. 5,013,556 y 5,356,633) y Martin y otros (patente de E.U.A. No. 5/213,804 y patente europea No. EP 0 496 813 B1). Los liposomas que comprenden un número de otros conjugados de lípido-pollmero se describen en WO 91/05545 y patente de E.U.A. No. 5,225,212 (ambas a Martin y otros) y en WO 94/20073 (Zalipsky y otros). Los liposomas que comprenden lípidos de ceramida modificados con PEG se describen en WO 96/10391 (Choi y otros). La patente de E.U.A. No. 5,540,935 (Miyazaki y otros) y la patente de E.U.A. No. 5,556,948 (Tagawa y otros) describen liposomas que contienen PEG que se pueden derivar más con porciones funcionales en sus superficies.

Un número de liposomas que comprenden ácidos nucleicos son conocidos en la técnica. WO 96/40062 a Thierry y otros describe métodos para encapsular ácidos nucleicos de peso molecular alto en liposomas. La patente de E.U.A. No. 5,264,221 a Tagawa y otros describe liposomas unidos a proteína y asegura que los contenidos de dichos liposomas pueden incluir un ARNdc. La patente de E.U.A. No. 5,665,710 a Rahman y otros describe ciertos métodos de encapsular oligodesoxinucleótidos en liposomas. WO 97/04787 a Love y otros describe liposomas que comprenden ARNdcs focalizados al gen raf.

Las transfersomas todavía son otro tipo de liposomas, y son agregados de lípido altamente deformables que son candidatos atractivos para vehículos de surtido de fármaco. Los transfersomas se pueden describir como gotas de lípido que son tan altamente deformables que son fácilmente capaces de penetrar a través de poros que son más pequeños que la gota. Los transfersomas son adaptables al medio ambiente en donde se usan, por ejemplo, son auto-optimizantes (adaptivos a la forma de poros en la piel), auto-reparadores, con frecuencia alcanzan sus objetivos sin fragmentar, y a menudo auto-carga. Para hacer transfersomas es posible agregar activadores de borde de superficie, usualmente agentes tensioactivos, a una composición liposomal estándar. Se han usado transfersomas para surtir albúmina de suero a la piel. El surtido mediado por transfersoma de albúmina de suero se ha mostrado que es tan efectivo como inyección subcutánea de una solución que contiene albúmina de suero.

Los agentes tensioactivos encuentran amplia aplicación en formulaciones tales como emulsiones (incluyendo microemulsiones) y liposomas. La manera más común de clasificar y ordenar las propiedades de los muchos diferentes tipos de agentes tensioactivos, tanto naturales como sintéticos, es por el uso del balance de hidrófilo/lipofilo (HLB). La naturaleza del grupo hidrofílico (también conocido como la "cabeza") provee los medios más útiles para categorizar los diferentes agentes tensioactivos usados en formulaciones (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, p. 285).

Si no se ioniza la molécula de agente tensioactivo, se clasifica como un agente tensioactivo no iónico. Los agentes tensioactivos no iónicos encuentran aplicación amplia en productos farmacéuticos y cosméticos y son usables sobre un rango amplio de valores de pH. En general, sus valores de HLB varían de 2 a aproximadamente 18 dependiendo de su estructura. Los agentes tensioactivos no iónicos incluyen ésteres no iónicos tales como ésteres de etileno glicol, ésteres de propileno glicol, ésteres de glicerilo, ésteres de poliglicerilo, ésteres de sorbitán, ésteres de sacarosa, y ésteres etoxilados. Las alcanolamidas no iónicas y éteres tales como etoxilatos de alcohol graso, alcoholes propoxilados, y polímeros en bloque etoxilados/propoxilados también se incluyen en esta clase. Los agentes tensioactivos de polioxietileno son los miembros más populares de la clase de agente tensioactivo no iónico.

Sí la molécula de agente tensioactivo porta una carga negativa cuando se disuelve o dispersa en agua, el agente tensioactivo se clasifica como aniónico. Los agentes tensioactivos amónicos incluyen carboxilatos tales como jabones, acilo lactilatos, acil amidas de aminoácidos, ésteres de ácido sulfúrico tal como alquilo sulfatos y alquilo sulfatos etoxilados, sulfonatos tales como alquilo benceno sulfonatos, acilo isetionatos, acilo tauratos y sulfosuccinatos, y fosfatos. Los miembros más importantes de la clase de agente tensioactivo aniónico son los alquilo sulfatos y los jabones.

Si la molécula de agente tensioactivo porta una carga positiva cuando se disuelve o dispersa en agua, el agente tensioactivo se clasifica como catiónico. Los agentes tensioactivos catiónicos incluyen sales de amonio cuaternario y aminas etoxiladas. Las sales de amonio cuaternario son los miembros más usados de esta clase.

Si la molécula de agente tensioactivo tiene la habilidad de portar una carga positiva o negativa, el agente tensioactivo se clasifica como anfotérico. Los agentes tensioactivos anfotéricos incluyen derivados de ácido acrílico, alquilamidas sustituidas, N-alquilbetaínas y fosfatidas.

El uso de agentes tensioactivos en productos de fármaco, formulaciones y en emulsiones se han revisado (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., 1988, p. 285).

SNALPs En una modalidad, un ARNdc mostrado en la invención se encapsula por completo en la formulación de lípido para formar un SPLP, pSPLP, SNALP, u otra partícula de ácido nucleico-lípido. Como se usa en la presente, el término "SNALP" se refiere a una partícula de ácido nucleico-lípido que comprende ADN plásmido encapsulado dentro de una vesícula de lípido. Los SNALPs y SPLPs típicamente contienen un lípido catiónico, un lípido no catiónico, y un lípido que previene agregación de la partícula (por ejemplo, un conjugado de PEG-lípido). Los SNALPs y SPLPs son extremadamente útiles para aplicaciones sistémicas, ya que exhiben vidas de circulación extendidas después de la inyección intravenosa (i.v.) y se acumulan en sitios distales (por ejemplo, sitios físicamente separados del sitio de administración). Los SPLPs incluyen "pSPLP", que incluyen un complejo de agente condensador encapsulado-ácido nucleico como se establece en la publicación de PCT No. WO 00/03683. Las partículas de la presente invención típicamente tienen un diámetro promedio de alrededor de 50 nm a aproximadamente 150 nm, más típicamente de alrededor de 60 nm a aproximadamente 130 nm, más típicamente de alrededor de 70 nm a aproximadamente 110 nm, muy típicamente de alrededor de 70 a aproximadamente 90 nm, y son sustancialmente no tóxicos. Además, los ácidos nucleicos cuando están presentes en las partículas de ácido nucleico-lípido de la presente invención son resistentes en solución acuosa a degradación con una nucleasa. Las partículas de ácido nucleico-lípido y su método de preparación se describen en, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,976,567; 5,981,501; 6,534,484; 6,586,410; 6,815,432; y publicación de PCT No. WO 96/40964.

En una modalidad, la relación de lípido a fármaco (relación de masa/masa) (por ejemplo, relación de lípido a ARNdc) estará en el rango de alrededor de 1:1 a aproximadamente 50:1, de alrededor de 1:1 a aproximadamente 25:1, de alrededor de 3:1 a aproximadamente 15:1, de alrededor de 4:1 a aproximadamente 10:1, de alrededor de 5:1 a aproximadamente 9:1, o de alrededor de 6:1 a aproximadamente 9:1.

El lípido catiónico puede ser, por ejemplo, cloruro de N,N- d¡oleil-N,N-d¡met¡lamonio (DODAC), bromuro de N,N-diestearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(l-(2,3-dioleoiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), cloruro de N-(l-(2,3-diole¡loxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOT A), N,N-d¡metil-2,3-dioleilox¡)propilamina (DODMA), 1 ,2-DiLinoleilox¡-N,N-dimet¡laminopropano (DLinDMA), 1 ,2-DMinoleniloxi-N, N-dimetilaminopropano (DLenDMA), 1,2-Dilinoleilcarbámoiloxi-3-dimetilaminopropano (DLin-C-DAP), 1,2-Dilinole¡oxi-3-(dimetilamino)acetox¡propano (DLin-DAC), 1,2-Dilinoleloxi-3-morfolinopropano (DL¡n-MA), 1 ,2-Dilinoleoil-3-dimetilaminopropano (DLinDAP), 1 ,2-Dil¡noleiltio-3-dimetilam¡no-propano (DLin-S-DMA), 1 - Linóleo i l-2-linoleiloxi-3-dimetilamino-propano (DLin-2-DMAP), sal de cloruro de 1 ,2-Dilinoleiloxi-3-trimetil-aminopropano (DLin-TMA.CI), sal de cloruro de 1 ,2-Dilinoleoil-3-trimetiláminopropano (DLin-TAP.CI), 1 ,2-Dilinoleiloxi-3-(N-metilp¡peraz¡no)propano (DLin-MPZ), o 3-(N, N-Dilinoleilamino)- ,2-propanodiol (DLinAP), 3-(N,N-Diole¡lam¡no)-1 ,2-propanod¡ol (DOAP), 1,2-Dilinoleiloxo-3-(2-N,N-d¡metilamino)etoxipropano (DUn-EG-DMA), 2,2-D¡linoleil-4-dimetilam¡nomet¡l-[1,3]-dioxolano (DLin-K-DMA) o análogos de los mismos, o una mezcla de los mismos. El lípido catiónico puede comprender de alrededor de 20% molar a aproximadamente 50% molar o aproximadamente 40% molar del lípido total presente en la partícula.

En otra modalidad, el compuesto 2,2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1 ,3]-dioxolano se puede usar para preparar nanopartículas de lípido-ARNic. La síntesis de 2,2-Dilinoleil-4- d¡metilaminoet¡l-[ ,3]-d¡oxolano se describe en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos número 61/107,998 presentada el 23 de octubre de 2008, que se incorpora a la presente por referencia.

En una modalidad, la partícula de I í pido-AR N ic incluye 40% de 2-Dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1 ,3]-dioxolano: 10% DSPC: 40% Colesterol: 10% PEG-C-DOMG (por ciento molar) con un tamaño de partícula de 63.0 ± 20 nm y una relación de 0.027 de ARNic/Lípido.

El lípido no catiónico puede ser un lípido aniónico o un lípido neutral que incluye, pero no se limita a, diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), dioleoilfosfatidilcolina (DOPC), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG), dioleoi fosfatidiletanolamina (DOPE), palmitoiloleoilfos-fatidilcolina (POPC), palmitoiloleoil-fosfatidiletanolamina (POPE), di oleoil-fosfatidiletanol amina 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamina (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamina (DM E), diestearoil-fosfatidil-etanolamina (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1 trans PE, 1-estearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamina (SOPE), colesterol, o una mezcla de los mismos. El lípido no catiónico puede ser de alrededor de 5% molar a aproximadamente 90% molar, aproximadamente 10% molar o aproximadamente 58% molar, si se incluye colesterol, del lípido total presente en la partícula.

El lípido conjugado que inhibe agregación de partículas puede ser, por ejemplo, un polietilenglicol (PEG)-lípido incluyendo, sin limitación, un PEG-diacilglicerol (DAG), un PEG-dialquiloxipropilo (DAA), un PEG-fosfolípido, un PEG-ceramida (Cer), o una mezcla de los mismos. El conjugado de PEG-DAA puede ser, por ejemplo, un PEG-dilauriloxipropilo (Ci2), un PEG-dimiristiloxipropilo (Ci4), un PEG-dipalmitiloxipropilo (Ci6), o un PEG-diesteariloxipropilo (C]8). El lípido conjugado que previene agregación de partículas puede ser de 0% molar a aproximadamente 20% molar o alrededor de 2% molar del lípido total presente en la partícula.

En algunas modalidades, la partícula de ácido nucleico-lípido incluye además colesterol, por ejemplo, a alrededor de 10% molar a aproximadamente 60% molar o alrededor de 48% molar del lípido total présente en la partícula.

LNP En una modalidad, el lipidoide ND98 HCI (MW 1487) (Fórmula 1), Colesterol (Sigma-Aldrich), y PEG-Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) se puede usar para preparar nanopartículas de lípido-ARNic (es decir, partículas LNP01). Las soluciones de reserva de cada uno en etanol se, pueden preparar de la siguiente manera: ND98, 133 mg/ml; colesterol, 25 mg/ml, PEG-ceramida C16, 100 mg/ml. Entonces se, pueden combinar soluciones de reserva de ND98, Colesterol y PEG-Ceramida C16 en, por ejemplo, una relación molar de 42:48:10. La solución de lípido combinada se puede mezclar con ARNic acuoso (por ejemplo, en acetato de sodio pH 5) de modo que la concentración de etanol final es aproximadamente 35-45% y la concentración de acetato de sodio final es aproximadamente 100-300 mM. Las nanopartículas de lípido-ARNic típicamente se forman de manera espontánea al mezclar. Dependiendo de la distribución de tamaño de partícula deseado, la mezcla de nanopartícula resultante se puede extrudir a través de una membrana de policarbonato (por ejemplo, 100 nm corte) usando, por ejemplo, un extrusor de termobarril, tal como Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc.). En algunos casos, el paso de extrusión puede omitirse. La eliminación de etanol e intercambio regulador simultáneo se puede lograr, por ejemplo, por diálisis o filtración de flujo tangencial. Se puede intercambiar regulador con, por ejemplo, solución salina regulada con fosfato (PBS) a aproximadamente pH 7, por ejemplo, aproximadamente pH 6.9, aproximadamente pH 7.0, aproximadamente pH 7.1, aproximadamente pH 7.2, aproximadamente pH 7.3 o aproximadamente pH 7.4 describen formulaciones LNP01, por ejemplo, publicación de solicitud internacional No. WO 2008/042973, incorpora a la presente por referencia.

Emulsiones Las composiciones de la presente invención se pueden preparar y formular como emulsiones. Las emulsiones son típicamente sistemas heterogéneos de un líquido disperso en otro en la forma de gotas usualmente excediendo 0.1 pm en diámetro (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199; Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 245; Bloque en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger y Banker (eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 2, p. 335; Higuchi y otros, en Pharmaceutical Sciences de Remington, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301). A menudo las emulsiones son sistemas bifásicos que comprenden dos fases líquidas inmiscibles íntimamente mixtas y dispersas entre s!. En general, las emulsiones pueden ser de la variedad de agua-enaceite (w/o) o aceite*en-agua (o/w). Cuando una fase acuosa se divide finamente en y se dispersa como gotas de minuto en una fase oleosa de bulto, la composición resultante se llama una emulsión de agua-en-aceite (w/o). Alternativamente, cuando una fase oleosa se divide finamente y se dispersa como gotas de minuto en una fase acuosa de volumen, la composición resultante se llama una emulsión de aceite-en-agua (o/w). Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersas, y el fármaco activo que puede estar presente como una solución en la fase acuosa, fase oleosa o por sí mismos como una fase separada. Los excipientes farmacéuticos tales como emulsores, estabilizadores, tintes y antioxidantes también pueden estar presentes en emulsiones según sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas: también pueden ser emulsiones múltiples que están compuestas de más de dos fases tales como, por ejemplo, en el caso de emulsiones de aceite-en-agua-en-aceite (o/w/o) y agua-en-aceite-en-agua (w/o/w). Dichas formulaciones complejas a menudo proveen ciertas ventajas que las emulsiones binarias simples no proveen. Las emulsiones múltiples en donde gotas de aceite individuales de una emulsión de o/w encierran pequeñas gotas de agua constituyen una emulsión de w/o/w. Asimismo un sistema de gotas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizados en una fase continua oleosa provee una emulsión de o/w/o.

Las emulsiones se caracterizan por poca o ninguna estabilidad termodinámica. A menudo, la fase dispersa o discontinua de la emulsión es bien dispersa en la fase externa o continua y se mantiene en esta forma a través de los medios de emulsores o la viscosidad de la formulación. Cualquiera de las fases de la emulsión puede ser un semisólido o un sólido, como es el caso de bases y cremas de ungüento de estilo emulsión. Otros medios de estabilizar emulsiones abarcan el uso de emulsores que se pueden incorporar en cualquier fase de la emulsión. Los emulsores se pueden clasificar ampliamente en cuatro categorías: agentes tensioactivos sintéticos, emulsores que ocurren de manera natural, bases de absorción, y sólidos finamente dispersos (Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (eds.), 1988, arcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199).

Los agentes tensioactivos sintéticos, también conocidos como agentes de superficie activa, han encontrado aplicabilidad amplia en la formulación de emulsiones y se han revisado en la literatura (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 285; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199). Los agentes tensioactivos típicamente son anfifílicos y comprenden una porción hidrof ílica y una hidrofóbica. La relación de la naturaleza hidrofílica a la hidrofóbica del agente tensioactivo se ha denominado el balance de hidrófilo/lipofilo (HLB) y es una herramienta valiosa en categorizar y seleccionar agentes tensioactivos , en la preparación 'de formulaciones. Los agentes tensioactivos se pueden clasificar en clases diferentes con base en la naturaleza del grupo hidrofílico: no iónico, aniónico, catiónico y anfotérico (Rieger, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 285).

Los erriulsores que ocurren de manera natural usados en formulaciones de emulsión incluyen lanolina, cera de abejas, fosfatidas, le'citina y acacia. Las bases de absorción poseen propiedades hidrof ílicas de modo que pueden absorber agua para formar emulsiones de w/o aunque retengan sus consistencias semisólidas, tales como lanolina anhídrida y petrolato hidrofílico. También se han usado sólidos finamente divididos como emulsores buenos en especial en combinación con agentes tensioactivos y en preparaciones viscosas. Estas incluyen sólidos inorgánicos polares, tales como hidróxidos de metal pesado, arcillas que no se hinchan tales como bentonita, atapulgita, hectorita, caolina, montmorillonita, silicato de aluminio coloidal y silicato de magnesio aluminio coloidal, pigmentos y sólidos no polares tales como carbón o glicerilo triestearato.

Una variedad grande de materiales no emulsores también se incluye en formulaciones de emulsión y contribuyen a las propiedades de emulsiones. Estas incluyen grasas, aceites, ceras, ácidos grasos, alcoholes grasos, ésteres grasos, humectantes, coloides hidrofílicos, conservadores y antioxidantes (Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 335; Idson, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (eds.),, 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, P. 199).

Los coloides hidrofílicos o hidrocoloides incluyen gomas que ocurren de manera natural y polímeros sintéticos tales como polisacáridos (por ejemplo, acacia, agar, ácido algínico, carragenano, goma guar, goma karaya y tragacanto), derivados de celulosa (por ejemplo, carboximetilcelulosa y carboxipropilcelulosa), y polímeros sintéticos (por ejemplo, carbómeros, éteres de celulosa y polímeros de carboxivinilo). Estos se dispersan o hinchan en agua para formar soluciones coloidales que estabilizan emulsiones al formar películas interfaciales fuertes alrededor de las gotas de fase dispersa y al aumentar la viscosidad de lá fase externa.

Ya que las emulsiones a menudo contienen un número de ingredientes tales como carbohidratos, proteínas, esteróles y fosfatidas que pueden soportar prontamente el crecimiento de microbios, estas formulaciones a menudo incorporan conservadores. Los conservadores usados comúnmente incluidos en formulaciones de emulsión incluyen metil parabeno, propil parabeno, sales de amonio cuaternario, cloruro de benzalconio, ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, y ácido bórico. Los antioxidantes se agregan comúnmente a formulaciones de emulsión para prevenir deterioro de la formulación. Los antioxidantes usados pueden ser barredores de radical libre tales como tocoferoles, alquilo galatos, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, p agentes reductores tal como ácido ascórbico y metabisulfito de sodio, y sinergistas antioxidantes tales como ácido cítrico, ácido tartárico y lecitina.

La aplicación de formulaciones de emulsión vía rutas dermatológicas, orales y parenterales y métodos para su fabricación se han revisado en la literatura (Idson, en Phármaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (eds.), 1988, arcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199). Las formulaciones de emulsión para administración oral se han usado muy ampliamente debido a la facilidad de formulación, así como eficacia desde un punto de vista de absorción y biodisponibilidad (Rosoff, en Phármaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 245; Idson, en Phármaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 199). Los laxantes de base mineral-aceite, vitaminas solubles en aceite y preparaciones nutritivas de alta grasa están entre los materiales que se han administrado de manera común oralmente como emulsiones de o/w.

En una modalidad de la presente invención, las composiciones de ARNdcs y ácidos nucleicos se formulan como microemulsiones. Una microemulsión se puede definir como un sistema de agua, aceite y anfifilo que es una solución liquida ópticamente isotrópica y termodinámicamente estable (Rosoff, en Phármaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 245). Típicamente, las microemulsiones son sistemas que se preparan al dispersar primero un aceite en una solución de agente tensioactivo acuoso y después agregando una cantidad suficiente de un cuarto componente, por lo general un alcohol de longitud de cadena intermedia para formar un sistema transparente. Por lo tanto, también se han descrito microemulsiones como dispersiones termodinámicamente estables, isotrópicamente claras de dos líquidos inmiscibles que se estabilizan por películas interfaciales de moléculas de superficie activa (Leung y Shah, en: Controlled Reléase of Drugs: Polymers and Aggregate Systems, Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, Nueva York, páginas 185-215). Las microemulsiones se preparan comúnmente vía una combinación de tres a cinco componentes que incluyen aceite, agua, agente tensioactivo, co-agente tensioactivo y electrolito. Si la microemulsión es del tipo de agua-en-aceite (w/o) o aceite-en-agua (o/w) es dependiente de las propiedades del aceite y agente tensioactivo u.sados y de la estructura y empaque geométrico de las cabezas polares y colas de hidrocarburo de las moléculas de agente tensioactivo (Schott, en Pharmaceutical Sciences de Remington, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).

La propuesta fenomenológica utilizando diagramas de fase se ha estudiado extensivamente y ha producido un conocimiento comprensivo, a un experto en la técnica, de cómo formular microemulsiones (Rosoff, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 245; Block, en Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, N.Y., volumen 1, p. 335). En comparación con emulsiones convencionales, las microemulsiones ofrecen la ventaja de solubilizar fármacos insolubles en agua en una formulación de gotas termodinámicamente estables que se forman dé manera espontánea.

Los agentes tensioactivos usados en la preparación de microemulsiones incluyen, pero no se limitan a, agentes tensioactivos iónicos, agentes tensioactivos no iónicos, Brij 96, éteres de polioxietileno oleilo, monooleato de poliglicerol hexaglicerol (PO310), pentaoleato de hexaglicerol (PO500), monocaprato de decaglicerol (MCA750), monooleato de decaglicerol (MO750), sequioleato de decaglicerol (SO750), decaoleato de decaglicerol (DAO750), solos o en combinación con co-agentes tensioactivos. El co-agente tensioactivo, usualmente un alcohol de cadena corta tal como etanol, 1-propanol y 1-butanol, sirve para aumentar la fluidez interfacial al penetrar en la película de agente tensioactivo y consecuentemente creando una película desordenada debido al espacio hueco generado entre moléculas de agente tensioactivo. Sin embargo, se pueden preparar microemulsiones sin el uso de coragentes tensioactivos y sistemas de microemulsión auto-emulsores libres de alcohol se conocen en la técnica. La fase acuosa típicamente puede ser, pero no se limita a, agua, una solución acuosa del fármaco, glicerol, PEG300, PEG400, poligliceroles, propileno glicoles, y derivados de etilen glicol. La fase oleosa puede incluir, pero no se limita a, materiales tales cómo Captex 300, Captex 355, Capmul MCM, ésteres de ácido graso, mono-, di- y tri-glicéridos de cadena mediana (C8-C12), ésteres de ácido graso de glicerilo polioxietilado, alcoholes grasos, glicéridos poliglicolizados, glicéridos de C8-C10 poliglicolizados saturados, aceites vegetales y aceite de silicona.

Las microemulsiones son particularmente de interés desde el punto dé vista de solubilización de fármaco y la absorción mejorada de fármacos.? Las microemulsiones a base de lípido (ambos o/w y w/o) se han propuesto para mejorar la biodisponibilidad oral de fármacos, incluyendo péptidos (Constantinides y otros, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Las microemulsiones dan ventajas de solubilización de fármaco mejorada, protección de fármaco a partir de hidrólisis enzimática, posible mejora de absorción de fármaco debido a alteraciones inducidas por agente tensioactivo en fluidez de membrana y permeabilidad, facilidad de preparación, facilidad de administración oral sobre formas de dosificación sólida, potencia clínica mejorada, y toxicidad disminuida (Constantinides y otros, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho y otros, J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). A menudo las microemulsiones se pueden formar de manera espontánea cuando sus componentes son llevados juntos a temperatura ambiente. Esto puede ser particularmente ventajoso al formular fármacos termolábiles, péptidos o ARNdcs. Las microemulsiones también han sido efectivas en la administración transdérmica de componentes activos en aplicaciones cosméticas y farmacéuticas. Se espera que las composiciones y formulaciones de microemulsion de la presente invención faciliten la absorción sistémica aumentada de ARNdcs y ácidos nucleicos desde el tracto gastrointestinal, así como mejorar la absorción celular local de ARNdcs y ácidos nucleicos.

Las microemulsiones de la presente invención también pueden contener componentes y aditivos adicionales tal como monoesteárato de sorbitán (Grill 3), Labrasol, y potenciadores de penetración para mejorar las propiedades de la formulación y potenciar la absorción de los ARNdcs y ácidos nucleicos de la presente invención. Los potenciadores de penetración usados en las microemulsiones de la presente invención se pueden clasificar como perteneciendo a una de cinco categorías amplias— agentes tensioactlvos, ácidos grasos, sales biliares; agentes quelatadores, y no agentes tensioactivos no quelatadores (Lee y otros, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada una de estas clases se ha discutido antes.

Potenciadores de penetración En una modalidad, la presente invención emplea varios potenciadores de penetración para realizar la administración eficiente de ácidos nucleicos, en particular ARNdcs, a la piel de animales. La mayoría de los fármacos están presentes en solución en formas ionizadas y no ionizadas. Sin embargo, usualmente sólo fármacos solubles en lípido y lipofílicos cruzan prontamente membranas celulares. Se ha descubierto que incluso los fármacos no lipofílicos pueden cruzar membranas celulares si la membrana a ser cruzada se trata con un potenciador de penetración. Además de ayudar la difusión de fármacos no lipofílicos sobre membranas celulares, potenciadores de penetración también mejoran la permeabilidad de fármacos lipofílicos.

Los potenciadores de penetración se pueden clasificar como perteneciendo a una a cinco categorías amplias, es decir, agentes tensioactivos,; ácidos grasos, sales biliares, agentes quelatadores, y no agentes tensioactivos no quelatadores (Lee y otros, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Cada una de las clases mencionadas antes de potenciadores de penetración se describe más adelante en mayor detalle.

Agentes tensioactivos: En conexión con la presente invención, los agentes tensioactivos (o "agentes de superficie activa") son entidades químicas que, cuando se disuelven en una solución acuosa, reducen la tensión superficial de la solución o la tensión interfacial entre la solución acuosa y otro líquido, con el resultado que la absorción de ARNdcs a través de la mucosa se mejora. Además de las sales biliares y ácidos grasos, estos potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, lauril sulfato de sodio, éter de polioxietileno-9.laurilo y éter de polioxietileno-20-cetilo) (Lee y otros, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92); y emulsiones perfluoroquímicas, tal como FC-43. Takahashi y otros, J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252). Ácidos grasos: Varios ácidos grasos y sus derivados que actúan como potenciadores de penetración incluyen, por ejemplo, ácido oleico, ácido laúrico, ácido cáprico (ácido n-decanoico) , ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido linolénico, dicaprato, tricaprato, monooleina ( 1 -monooleoil-rac-glicerol), dilaurina, ácido caprílico, ácido araquidónico, glicerol 1-monocaprato, 1 -dodecilazacicloheptan-2-ona, acilcarnitinas, ácilcolinas, ésteres de alquilo de C1-10 de los mismos (por ejemplo, metilo, isopropilo y t-butilo), y mono- y di-glicéridos de los mismos (es decir, oleato, laurato, caprato, miristato, palmitato, estearato, linoleato, etc.) (Lee y otros, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri y otros, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).

Sales biliares: El rol fisiológico de bilis incluye la facilitación de dispersión y absorción de lípidos y vitaminas solubles en grasa (Brunton, capítulo 38 en: The Pharmacological Basis of Therapeutics de Goodman & Gilman, 9a edición, Hardman y otros, eds., McGraw-Mili, Nueva York, 1996, pp. 934-935). Varias sales biliares naturales, y sus derivados sintéticos, actúan como potenciadores de penetración. De esta manera, el término "sales biliares" incluye cualquiera de los componentes que ocurren de manera natural de bilis así como cualquiera de sus derivados sintéticos. Las sales biliares adecuadas incluyen, por ejemplo, ácido cólico (o su sal de sodio farmacéuticamente aceptable, colato de sodio), ácido dehidrocólico (dehidrocolato de sodio), ácido desoxicólico (desoxicolato de sodio), ácido glucólico (glucolato de sodio), ácido glicólico (g'licocholato de sodio), ácidó glicodesoxicólico (glicodesoxicholato de sodio), ácido taurocólico (taurocholato de sodio), ácido taurodesoxicólico (taurodesoxicholato de sodio), ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicholato de sodio), ácido ursodesoxicólico (UDCA), tauro-24,25-dihidro-fusidato de sodio (STDHF), glicodihidrofusidato de sodio y éter de polioxietileno-9-laurilo (POE) (Lee y otros, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Swinyard, capítulo 39 en: Pharmaceutical Sciences de Remington, 18a ed., Gennaro, ed., ack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, páginas 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto y otros, J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashíta y otros, J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).

Agentes quelatadores: Los agentes quelatadores, como se usan en conexión con la presente invención, se pueden definir como compuestos que eliminan iones metálicos de solución al formar complejos con los mismos, con el resultado de que mejora la absorción de ARNdcs a través de la mucosa. Con respecto a su uso como potenciadores de penetración en la presente invención, los agentes quelatadores tienen la ventaja agregada de que también sirven como inhibidores de DNasa, ya que la mayoría de las nucleasas de ADN caracterizadas requieren un ion metálico divalente para catálisis y de esta manera se inhiben por agentes quelatadores (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Los agentes quelatadores adecuados incluyen, pero no se limitan a, etilendiaminatetraacetato de disodio (EDTA), ácido cítrico, salicilatos (por ejemplo, salicilato de sodio, 5-metoxisalicilato y homovaniiato), derivados de N-acilo de colágeno, derivados de lauret-9 y N-amino acilo de beta-dicetonas (enaminas) (Lee y otros, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur y otros, J. Control Reí., 1990, 14, 43-51).

No agentes tensioactivos no quelatadores: Como se usa en la presente, los compuestos potenciadores de penetración de no agente tensioactivo no quelatador se pueden definir como compuestos que demuestran actividad insignificante como agentes quelatadores o como agentes tensioactivos pero que no obstante mejoran absorción de ARNdcs a través de la mucosa alimentaria (Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Esta clase de potenciadores de penetración incluye, por ejemplo, ureas cíclicas insaturadas, derivados de 1 -alquil- y 1 -alquenilazaciclo-alcanona (Lee y otros, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, página 92); y agentes anti-inflamatorios no esteroides tales como diclofenac sodio, indometacina y fenilbutazona (Yamashita y otros, J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).

Los agentes que mejoran absorción de ARNdcs al nivel celular también se pueden agregar a las composiciones farmacéuticas y otras composiciones de la presente invención. Por ejemplo, llpidos catiónicos, tal como lipofectina (Junichi y otros, patente de E.U.A. No. 5,705,188), derivados de glicerol catiónicos, y moléculas policatiónicas, tal como polilisina (Lpllo y otros, solicitud de PCT WO 97/30731), también son conocidos para mejorar la absorción celular de ARNdcs.

Se pueden utilizar otros agentes para mejorar la penetración de los ácidos nucleicos administrados, incluyendo glicoles tales como etilen glicol y propilen glicol, pirróles tal como 2-pirrol, azonas, y terpenos tales como limoneno y mentona.

Portadores ' Los ARNdcs de la presente invención se pueden formular en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Un "portador farmacéuticamente aceptable" (también referido en la presente como un "excipiente") es un solvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión, o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos o sólidos, iy se pueden seleccionar con la manera planeada de administración en mente para así proveer para el volumen deseado, consistencia y otras propiedades pertinentes de transporte y químicas.. Los portadores farmacéuticamente aceptables típicos incluyen, por medio de ejemplo y no limitación: agua; solución salina; agentes de unión (por ejemplo, polivinilpirrolidona o hidroxiprópilo metilcelulosa); rellenos (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, gelatina o sulfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, almidón, polieti ten glicol, o acetato de sodio); desintegrantes, (por ejemplo, almidón o glicolato de almidón de sodio); y agentes humidificadores (por ejemplo, lauril sulfato de sodio).

Ciertas composiciones de la presente invención también incorporan compuestos portadores en la formulación. Como se usa en la presente, "compuesto portador" o "portador" se puede referir a un ácido nucleico, o análogo del mismo, que es inerte (es decir, no posee actividad biológica por sí misma) pero se reconoce como un ácido nucleico por procesos ¡n vivo que reducen la biodisponibiiidad de un ácido nucleico teniendo actividad biológica, por ejemplo, al degradar el ácido nucleico biológicamente activo o promover su eliminación de circulación. La co-administración de un ácido nucleico y un compuesto portador, típicamente con un exceso de la última sustancia, puede resultar en una reducción sustancial de la cantidad de ácido nucleico recuperado en el hígado, riñon u otros depósitos extra-circulatorios, supuestamente debido a competencia entre el compuesto portador y el ácido nucleico para un receptor común. Por ejemplo, la recuperación de un ARNdc parcialmente fosforotioato en tejido hepático se puede reducir cuando se co-administra con ácido poliinosinico, dextran sulfato, ácido policitídico o ácido 4-acetamido-4'-isotiociano-estilbeno-2,2'-disulfónico (Miyao y otros, DsRNA Res., Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura y otros, DsRNA & Nucí. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183).

Excipientes En contraste con un compuesto portador, un "portador farmacéutico" o "excipiente" es un solvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para administrar uno o más ácidos nucleicos a un animal. El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, con la manera planeada de administración en mente, para así proveer el volumen deseado, consistencia, etc., cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes de una composición farmacéutica dada. Los portadores farmacéuticos típicos incluyen, pero no se limitan a, agentes de unión (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa, etc.); rellenos (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etil celulosa, poliacrilatos o fosfato de hidrógeno de calcio, etc.); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, benzoato de sodio, acetato de sodio, etc.); desintegrantes (por ejemplo, almidón, glicolato de almidón de sodio, etc.); y agentes humidificadores (por ejemplo, lauríl sulfato de sodio, etc.).

Los excipientes orgánicos o inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral que no reaccionan de manera dañina con ácidos nucleicos también se pueden usar para formular las composiciones de la presente invención. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, per¡o no se limitan a, agua, soluciones de sal, alcoholes, polietilen gl ico les , gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido esteárico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Las formulaciones para administración tópica de ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas estériles y no estériles, soluciones no acuosas en solventes comunes tales como alcoholes, o soluciones de los ácidos nucleicos en bases oleosas líquidas o sólidas. Las soluciones también pueden contener reguladores, diluyentes y otros aditivos adecuados. Se pueden usar excipientes orgánicos e inorgánicos farmacéuticamente aceptables adecuados para administración no parenteral que no reaccionan de manera dañina con ácidos nucleicos.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones de sal, alcohol, polietilen glicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido salicíco, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Otros componentes Las composiciones de la presente invención pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos convencionalmente encontrados en composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en la técnica. De esta manera, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales adicionales, compatibles, farmacéuticamente aceptables tales como, por ejemplo, antipruríticos, astringentes, anestésicos locales y agentes anti-inflamatorios, o pueden contener materiales adicionales útiles en físicamente formular varias formas de dosificación de las composiciones de la presente invención, tales como tintes, agentes saborizantes, conservadores, antioxidantes, opacificadores, agentes espesantes y estabilizadores. Sin embargo, dichos materiales, cuando se agregan, no deben interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo, lubricantes, conservadores, estabilizadores, agentes humidificadores, emulsores, sales para influir en presión osmótica, reguladores, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares que no interactúan de manera dañina con el ácido(s) nucleico de la formulación.

Suspensiones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la actividad de la suspensión incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextran. La suspensión puede también contener estabilizadores.

Métodos para inhibir expresión del gen PCSK9 Todavía en otro aspecto, la invención provee un método para inhibir la expresión del gen PCSK9 en un mamífero. El método incluye administrar una composición de la invención al mamífero de modo que la expresión del gen PCSK9 objetivo se disminuye durante una duración extendida, por ejemplo, por lo menos una semana, dos semanas, tres semanas, o cuatro semanas o más.

Por ejemplo, en ciertos casos, la expresión del gen PCSK9 se suprime por al menos aproximadamente 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% ó 50% por administración de un oligonucleótido de doble cadena descrito en la presente. En algunas modalidades, el gen PCSK9 se suprime por al menos aproximadamente 60%, 70% u 80% por administración del oligonucleótido de doble cadena. En algunas modalidades, el gen PCSK9 se suprime por al menos aproximadamente 85%, 90% ó 95% por administración del oligonucleótido de doble cadena. La tabla 1b, tabla 2b y tabla 5b proveen un rango amplio de valores para inhibición de expresión obtenida en un ensayo in vitro usando varias moléculas de ARMdc de PCSK9 a varias concentraciones.

El efecto del gen PCSK9 objetivo disminuido resulta de preferencia en una disminución en niveles de LDLc (colesterol de lipoproteína de baja densidad) en la sangre, y más en particular en el suero, del mamífero. En algunas modalidades, los niveles de LDLc son disminuidos por al menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% ó 60% o más, en comparación con los niveles de pretratamiento.

El método incluye administrar una composición que contiene un ARNdc, en donde el ARNdc tiene una secuencia de nucleótido que es complementaria a por lo menos una parte de una transcripción de ARN del gen PCSK9 del mamífero a ser tratado. Cuando el organismo a ser tratado es un mamífero tal como un humano, la composición se puede administrar por cualquier medio conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitación a rutas orales o parenterales, incluyendo administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica y respiratoria (aerosol). En algunas modalidades, las composiciones se administran por infusión o inyección intravenosa.

Los métodos y composiciones descritos en la presente se pueden usar 'para tratar enfermedades y condiciones que se pueden modular al regular de manera descendente expresión de gen PCSK9. Por ejemplo, las composiciones descritas en la presente se pueden usar para tratar hiperlipidemia y otras formas de desequilibrio de lípido tales como hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia y las condiciones patológicas asociadas con estos trastornos tales como enfermedades del corazón y circulatorias. En algunas modalidades, un paciente tratado con un PCKS9 ARNdc también es administrado un agente terapéutico no-ARNdc, tal como un agente conocido para tratar trastornos de lípido.

En un aspecto, la invención provee un método de inhibir la expresión del gen PCSK9 en un sujeto, por ejemplo, un humano. El método incluye administrar una primera dosis individual de ARNdc, por ejemplo, una dosis suficiente para deprimir niveles de PCSK9 ARNdc durante al menos 5, más preferiblemente 7, 10, 14, 21, 25, 30 ó 40 días; y opcionalmente, administrar una segunda dosis individual de ARNdc, en donde la segunda dosis individual se administra por lo menos 5, más preferible 7, 10, 14, 21, 25, 30 ó 40 días después de administrar la primera dosis individual, así inhibiendo la expresión del gen PCS 9 en un sujeto.

En una modalidad, se administran dosis de ARNdc no más de una vez cada cuatro semanas, no más de una vez cada tres semanas, no más de una vez cada dos semanas, o no más de una vez cada semana. En otra modalidad, las administraciones se pueden mantener durante uno, dos, tres o seis meses o un año o más.

En otra modalidad, la administración se puede proveer cuando los niveles de colesterol de lipoproteína de baja densidad (LDLc) alcanzan o pasan un nivel mínimo predeterminado, tal como mayor que 70mg/dL, 130mg/dL, 200 mg/dL, 300mg/dL, ó 400mg/dL.

En una modalidad, el sujeto se selecciona, por lo menos en parte, sobre ; la base de necesitar (a diferencia de seleccionar meramente un paciente con base en quién lo necesita) reducción de LDL, reducción de LDL sin reducir HDL, reducción de ApoB, o reducción de colesterol total sin reducción de HDL.

En una modalidad, el ARNdc no activa el sistema inmune, por ejemplo, no aumenta los niveles de citoquina, tales como los niveles de TNF-alfa o IFN-alfa. Por ejemplo, cuando se mide por un ensayo, tal corrió un ensayo PBMC in vitro, tal como se describe en la presente, el aumento en los niveles de TNF-alfa o IFN-alfa, es menos de 30%, 20% ó 10% de células de control tratadas con un ARNdc de control, tal como un ARNdc que no focaliza PCSK9.

En un aspecto, la invención provee un método para tratar, prevenir o administrar un trastorno, proceso patológico o síntomas, que, por ejemplo, se puede mediar al regular de manera descendente expresión de gen PCSK9 en un sujeto, tal como un sujeto humano. En una modalidad, el trastorno es hiperlipidemia. El método incluye administrar una primera dosis individual de ARNdc, por ejemplo, una dosis suficiente para deprimir niveles de PCSK9 ARNm durante por lo menos 5, más preferiblemente 7, 10, 14, 21, 25, 30 ó 40 días; y opcionalmente, administrar una segunda dosis individual de ARNdc, en donde la segunda dosis individual se administra por lo menos 5, más preferiblemente 7, 10, 14, 21, 25, 30 ó 40 días después de administrar la primera dosis individual, así inhibiendo la expresión del gen PCSK9 en un sujeto.

En otra modalidad, una composición que contiene un ARNdc mostrado en la invención, es decir, un ARNdc focalizando PCSK9, se administra con un agente terapéutico de no ARNdc, tal como un agente conocido para tratar un trastorno de lípido, tal como hipercolesterolemia, aterosclerosis o dislipidemia. Por ejemplo, un ARNdc mostrado en la invención se puede administrar con, por ejemplo, un inhibidor de HMG-CoA reductasa (por ejemplo, una estatína), un fibrato, un secuestrador de ácido biliar, niacina, un agente antiplaqueta, un inhibidor de enzima convertidor de angiotensína, un antagonista receptor de angiotensina II (por ejemplo, losartán potasio, tal como Cozaar® de Merck & Co.)> un inhibidor de acilCoA colesterol acetiltransferasa (ACAT), un inhibidor de absorción de colesterol, un inhibidor de proteína de transferencia de éster de colesterol (CETP), un inhibidor de proteína de transferencia de triglicérído microsomal (MTTP), un modulador de colesterol, un modulador de ácido biliar, un agonista receptor activado de proliferación de peroxisoma (PPAR), una terapia a base de genes, un protector vascular compuesto (por ejemplo, AGI-1067, de Atherogenics), un inhibidor de glicoproteína llb/llla, aspirina o un compuesto tipo aspirina, un inhibidor de IBAT (por ejemplo, S-8921, de Shiotiogi),¡ un inhibidor de escualeno sintasa, o un inhibidor de proteína monocito quimioatractivo (MCP)-I. Los inhibidores de HMG-CoA réductasa ejemplares incluyen atorvastatina (Lipitor® /Tahor/Sprtis/Xorvast/Cardyl de Pfizer), pravastatina (Pravachol de Bristol-Myers Squibb, Mevalotin/Sanaprav de Sankyo), simvastatina (Zocor® de Merck/Sinvacor, Denan de Boehrínger Ingelheim, Lipovas de Banyu), lovastatina (Mevacor/Mevinacor de Merck, Lovastatina de Bexal, Cepa; Liposcler de Schwarz Pharma), fluvastatina (Lescol®/Locol/Lochol de Novartis, Cranoc de Fujisawa, Digaril de Solvay), !cerivastatina (Lipobay de Bayer/Baycol de GlaxoSmithKIine), rosuvastatina (Crestor® de AstraZeneca), y pitivastatina (itavastatina/risivastatina) (Nissan Chemical, Kowa Kogyo, Sankyo, y Novartis)'. Los fibratos ejemplares incluyen, por ejemplo, bezafibrato (por ejemplo, Befizal®/Cedur®/Bezalip® de Roche, Bezatol de Kissei), clofibrato (por ejemplo, Atromid-S® de Wyet ), fenofibrato (por ejemplo, Lipidil/Lipantil de Fournier, Tricor® de Abbott, Lipantil de Takeda, genéricos), gemfibrozil (por ejemplo, Lopid/Lipur de Pfizer) y ciprofibrato (Modalim® de Sanofi-Synthelabo). Los secuestradores de ácido biliar ejemplares incluyen, por ejemplo, colestiramina (Questran® de Bristol-Myers Squibb y Questran Light™), colestipol (por ejemplo, Colestid de Pharmacia) y colesevalam (WelChol™ de Genzyme/Sankyo). Las terapias de niacina ejemplares incluyen, por ejemplo, formulaciones de liberación inmediata, tales como, Nicobid de Aventis, Niacor de Upsher-Smith, Nicolar de Aventis y Perycit de Sanwakagaku. Las formulaciones de liberación extendida de niacina incluyen, por ejemplo, Niaspan de Kos Pharmaceuticals y Slo-Niacin de Upsher-Smith. Los agentes antiplaqueta ejemplares incluyen, por ejemplo, aspirina (por ejemplo, aspirina de Bayer), clopidogrel (Plavix de Sanofi-Synthelabo/Bristol-Myers Squibb), y ticlopidina (por ejemplo, Ticlid de Sanofi-Synthelabo y Panaldine de Daiichi). Otros compuestos de tipo aspirina útiles en combinación con un ARNdc focalizando PCSK9 incluyen, por ejemplo, Asacard (aspirina de liberación lenta, por Pharmacia) y Pamicogrel (Kanebo/Angelini Ricercher/CEPA). Los inhibidores de enzima convertidores de angiotestina ejemplares incluyen, por ejemplo, ramipril (por ejemplo, Altace de Aventis) y enalapril (por ejemplo, Vasotec de Merck & Co.). Los inhibidores de acilo CoA colesterol acetiltransferasa (ACAT) ejemplares incluyen, por ejemplo, avasimibe (Pfizer), eflucimibe (BioMérieux Pierre Fabre/Eli Lilly), CS-505 (Sankyo y Kyoto), y SMP-797 (Sumito). Los inhibidores de absorción de colesterol ejemplares incluyen, por ejemplo, ezetimibe (Zetia® de Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals) y Pamaqueside (Pfizer). Los inhibidores de CEPT ejemplares incluyen, por ejemplo, Torcetrapib (también llamado CP-529414, Pfizer), JTT-705 (Japan Tobacco), y CETi-l (Avant Immunotherapeutics). Los inhibidores de proteina de transferencia de triglicérido microsomal (MTTP) ejemplares incluyen, por ejemplo, implitapide (Bayer), R-103757 (Janssen), y CP-346086 (Pfizer). Otros moduladores de colesterol ejemplares incluyen, por ejemplo, NO-1886 (Otsuka/TAP Pharmaceuticals), Cl-1027 (Pfizer) y WAY-135433 (Wyeth-Ayerst). Los moduladores de ácido biliar ejemplares incluyen, por ejemplo, HBS-107 (Hisamitsu/Banyu), Btg-511 (British Technology Group), BARI-1453 (Aventis), S-8921 (Shionogi), SD-5613 (Pfizer)!, y AZD-7806 (AstraZeneca). Los agonistas receptores activados de proliferación de peroxisoma (PPAR) ejemplares incluyen, por ejemplo, tesaglitazar (AZ-242) (AstraZeneca), Netoglitazone (MCC-555) (Mitsubishi/Johnson & Johnson), GW-409544 (Ligand Pharmaceuticals/GlaxoSmithKIine), GW-501516 (Ligand Pharmaceuticals/GlaxoSmithKIine), LY-929 (Ligand Pharmaceuticals y Eli Lilly), LY-465608 (Ligand Pharmaceuticals y Eli Lilly), LY-5 8674 (Ligand Pharmaceuticals y Eli Lilly), y MK-767 (Merck y Kyorin). Las terapias a base de genes ejemplares incluyen, por ejemplo, AdGWEGFI 21.10 (GenVec), ApoA1 (UCB Pharma/Groupe Fournier), EG-004 (Trinam) (Ark Therapeutics), y transportador de cásete de unión ATP -A1 (ABCA1) (CV Therapeutics/lncyte, Aventis, Xenón). Los inhibidores de glicoproteína llb/llla ejemplares incluyen, por ejemplo, roxifiban (también llamado DMP754, Bristol-Myers Squibb), Gantofiban (Merck KGaA/Yamanouchi), y Cromafiban (Millennium Pharmaceuticals). Los inhibidores de escualeno sintasa ejemplares incluyen, por ejemplo, BMS-1884941 (Bristol-Myers Squibb), CP-210172 (Pfizer), CP-295697 (Pfizer), CP-294838 (Pfizer) y TAK-475 (Takeda). Un inhibidor MCP-1 ejemplar es, por ejemplo, RS-504393 (Roche Bioscience). El agente anti-atersoclerótico BO-653 (Chugai Pharmaceuticals), y el derivado de ácido nicotínico Nyclin (Yamanouchi Pharmaceuticals) también son apropiados para administrar en combinación con un ARNdc mostrado en la invención. Las terapias de combinación ejemplares adecuadas para la administración con un ARNdc focalizando PCSK9 incluyen, por ejemplo, advicor (Niacin/lovastatin de Kos Pharmaceuticals), amlodipina/atorvastatina (Pfizer), y ezetimibe/simvastatina (por ejemplo, Vytorin® 10/10, 10/20, 10/40 y 10/80 tabletas por Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals). Los agentes para tratar hipercolesterolemia, y adecuados para la administración en combinación con un ARNdc focalizando PCSK9 incluyen, por ejemplo, Ibvastatina, tabletas de liberación extendida de niacina Altoprev® (Andrx Labs), tabletas de lovastatina Caduet® (Pfizer), besilato de amlodipina, tabletas de calcio atorvastatina Crestor® (AstraZeneca), cápsulas de calcio rosuvastatina Lescol® (Novartis), fluvastatina sódica Lescol® (Reliant, Norvatis), tabletas de fluvastatina sódica Lipitor® (Parke-Davis), cápsulas de atorvastatina calcio Lofibra® (Gate), tabletas de liberación extendida de niaspan (Kos), tabletas de niacina Pravachol (Bristol-Myers Squibb), tabletas de pravastatina sódica TriCor® (Abbott), tabletas de fenofibrato Vytorin® 10/10 (Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals), ezetimibe, tabletas de simvastatina WelChol™ (Sankyo), tabletas de clorhidrato de colesevelam Zetia® (Schering), tabletas de ezetimibe Zetia® (Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals) y tabletas de ezetimibe Zocor® (Merck).

En una modalidad, un ARNdc focalizando PCSK9 se administra en combinación con una combinación de ezetimibe/simvastatina (por ejemplo, Vytorin® (Merck/Schering-Plough Pharmaceuticals).

En una modalidad, el PCSK9 ARNdc se administra al paciente, y entonces el agente de no ARNdc se administra al paciente (o viceversa). En otra modalidad, el PCSK9 ARNdc y el agente terapéutico no ARNdc se administran al mismo tiempo.

En otro aspecto, las características de la invención, un método para dar instrucciones a un usuario final, por ejemplo, un cuidador o un sujeto, en cómo administrar un ARNdc descrito en la presente. El método incluye, opcionalmente, proveer al usuario final con una o más dosis del ARNdc, e instruir al usuario final para administrar el ARNdc en un régimen descrito en la presente, así instruyendo al usuario final.

Todavía en otro aspecto, la invención provee un método para tratar un paciente al seleccionar un paciente sobre la base que el paciente está en necesidad de bajar LDL, reducir LDL sin bajar HDL, reducir ApoB, o reducir colesterol total. El método incluye administrar al paciente un ARNdc focalizando PCSK9 en una cantidad suficiente para reducir los niveles de LDL del paciente o niveles de ApoB, por ejemplo, sin reducir sustancialmente los niveles de HDL. | En otro aspecto, la invención provee un método de tratar un paciente al seleccionar un paciente sobre la base de que el paciente está en necesidad de reducir los niveles de ApoB, y administrar al paciente un ARNdc focalizando PCSK9 en una cantidad suficiente para reducir los niveles de ApoB del paciente. En una modalidad, la cantidad de PCSK9 es suficiente para reducir los niveles de LDL así como niveles; de ApoB. En otra modalidad, la administración del PCSK9 ARNdc no afecta el nivel de colesterol HDL en el paciente.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos científicos y técnicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la que esta invención pertenece. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presénte se pueden usar en la práctica o prueba de la invención, se describen más adelante métodos y materiales adecuados. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias mencionadas se incorporan a la presente por referencia en su totalidad: En caso de conflicto, la presente especificación, incluyendo definiciones, controlarán. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos sólo y no deben ser limitantes.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Desplazamiento de genes del gen PCSK9 Se llevó a cabo el diseño de ARNic para identificar en dos selecciones separadas a) ARNics focalizando PCSK9 humano y ARNm de ratón o rata y b) todos los ARNics reactivos humanos con especificidad predicha al PCSK9 gen objetivo.

Se usaron secuencias de ARNm a PCSK9 de humano, ratón y rata. Se usó la secuencia humana NM_174936.2 como secuencia de referencia durante el procedimiento de selección de ARNic completo.

Se identificaron 19 extensiones mer conservadas en humano y ratón, y secuencias PCSK9 ARNm de humano y rata en el primer paso, resultando en la selección de ARNics reactivos cruzados a humano y ratón, y ARNics reactivos cruzados a objetivos de humano y rata.

Se identificaron ARNics focalizando específicamente PCSK9 humano en una segunda selección. Todas las 19mer secuencias potenciales de PCSK9 humano fueron extraídas y definidas como secuencias objetivo candidatas. Las secuencias reactivas cruzadas a humano, mono, y aquellas reactivas cruzadas a ratón, rata, humano y mono todas se listan en las tablas 1a y 2a. Las versiones químicamente modificadas de aquellas secuencias y su actividad en ensayos in vitro e in vivo también se listan en las tablas 1a y 2a. Los datos se describen en los ejemplos y en las figuras 2-8.

A fin de ordenar secuencias objetivo candidatas y sus ARNics correspondientes y seleccionar unas apropiadas, su potencial predicho para interactuar con objetivos irrelevantes (potencial fuera de objetivo) fue tomado como un parámetro de clasificación, los ARNics con potencial fuera de objetivo bajo fueron definidos como preferibles y más específicos in vivo.

Para predecir potencial fuera de objetivo especifico de ARNic, se hicieron las siguientes suposiciones: 1) las posiciones 2 a 9 (conteo 5' a 3') de una cadena (región de semilla) pueden contribuir más a potencial fuera de objetivo que el resto de la secuencia (región de sitio de corte y no semilla) 2) las posiciones 10 a 11 (conteo 5' a 3') de una cadena (región de sitio de corte) pueden contribuir más a potencial fuera de objetivo que la región de no semilla 3) las posiciones 1 a 19 de cada cadena son relevantes para interacciones fuera de objetivo 4) una calificación fuera de objetivo se puede calcular para cada gen y cada cadena, con base en complementariedad de secuencia de cadena de ARNic a la secuencia del gen y posición de desadaptaciones 5) número de objetivos fuera así como la calificación más alta fuera de objetivo se debe considerar para potencial fuera de objetivo 6) calificaciones fuera de objetivo se deben considerar más relevantes para potencial fuera de objetivo que los números de objetivos fuera 7) suponer aborto potencial de actividad de cadena sentido por modificaciones internas introducidas, sólo potencial fuera de Objetivo de cadena antisentido será relevante Para identificar genes fuera de objetivó potenciales, 19mer secuencias candidatas fueron sometidas a búsqueda de homología contra secuencias de ARNm humano públicamente disponibles.

Las siguientes propiedades fuera de objetivo para cada 19mer secuencia de entrada fueron extraídas para cada gen fuera de objetivo para calcular la calificación fuera de objetivo: Número de desadaptaciones en región de no semilla Número de desadaptaciones en región de semilla Número de desadaptaciones en región de sitio de corte La calificación fuera de objetivo se calculó para considerar suposición 1 a 3 de la siguiente manera: Calificación fuera de objetivo = número de desadaptaciones de semilla * 10 + número de desadaptaciones de sitio de corte * 1.2 + número de desadaptaciones de no semilla * 1 El gen fuera de objetivo más relevante para cada ARNic correspondiente a la 19mer secuencia de entrada se definió como el gen con la calificación fuera de objetivo más baja. Por consiguiente, la calificación fuera de objetivo más baja se definió como la calificación fuera de objetivo relevante para cada ARNic.

Ejemplo' 2. Síntesis de ARNdc Recurso de reactivos En donde el recurso de un reactivo no es dado específicamente en la preserve, dicho reactivo se puede obtener de cualquier proveedor de reactivos para biología molecular a un estándar de calidad/pureza para aplicación en biología molecular.

Síntesis de ARNic Se produjeron ARNs de una cadena por síntesis de fase sólida en una escala de 1 pmol usando un sintetizador Expedite 8909 (Applied , Biosystems, Applera Deutschland GmbH, Darmstadt, Alemania) y vidrio de poro controlado (CPG, 500A, Proligo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania) como soporte sólido. ARN y ARN conteniendo nucleótidos d 2'-0-metilo fueron generados por síntesis de fase sólida empleando las fosforamiditas y 2'-0-metil l I fosforamiditas correspondientes, respectivamente (Proiigo Biochemie GmbH, Hamburgo, Alemania). Estos bloques de construcción se incorporaron en sitios seleccionados dentro de la secuencia de la cadena de oligonucleótido usando química de fosforamidita de nucleósido estándar tal como se describe en protocolos actuales en química de ácido nucleico, Beaucage, S.L. y otros (eds.), John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, N.Y., EUA. Se introdujeron ligaduras de fosforotioato por reemplazo de la solución oxidante de yodo con una solución del reactivo de Beaucage (Chruachem Ltd., Glasgow, Reino Unido) en acetonitrilo (1%). Se obtuvieron más reactivos ancilares de Mallinckrodt Baker (Griesheim, Alemania).

La desprotección y purificación de los oligoribonucleótidos crudos por HPLC de intercambio de aniones se llevaron a cabo de conformidad con procedimientos establecidos. Se determinaron rendimientos y concentraciones por absorción de UV de una solución del ARN respectivo a una longitud de onda de 260 nm usando un fotómetro espectral (DU 640B, Beckman Coulter GmbH, U nterschlei heim, Alemania). Se generó ARN de doble cadena al mezclar una solución equimolar de cadenas complementarias en regulador de recocido (20 mM de fosfato sódico, pH 6.8; 100 mM cloruro sódico), calentado en un baño de agua a 85 - 90"C durante 3 minutos y enfriado a temperatura ambiente sobre un periodo de 3 - 4 horas. La solución de ARN de recocido se almacenó a -20°C hasta usarse.

ARN¡ es conjugados ? Para la- síntesis de ARNics 3'-colesterol-conjugados (en la presente referidos como -Col-3'), se usó un soporte sólido apropiadamente modificado para síntesis de ARN. Se preparó el soporte sólido modificado de la siguiente manera: Una solución acuosa de 4.7 M de hidróxido de sodio (50 mi) se agregó en una solución agitada, enfriada en hielo de clorhidrato de etilo glicinato (32.19 g, 0.23 mol) en agua (50 mi). Después, se agregó etilo acrilato (23.1 g, 0.23 mol) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente hasta lograr la terminación de la reacción por TLC. Después de 19 horas, la solución se dividió con diclorometano (3 x 100 mi). La capa orgánica se secó con sulfato sódico anhídrido, se filtró y evaporó. El residuo se destiló para dar AA (28.8 g, 61%). Éster etílico de ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxi carbón ¡I -a mino)-hexano¡l]-am¡no}-pro pión ico AB AB Se disolvió ácido Fmoc-6-amino-hexanoico (9.12 g, 25.83 mmol) en diclorometano (50 mi) y se enfrió con hielo. Se agregó düsoprppilcarbodiimida (3.25 g, 3.99 mi, 25.83 mmol) a la solución a 0°C. Después se siguió por la adición de dietil-azabutano-1 ,4-dicarboxilato (5 g, 24.6 mmol) y dimetilamino piridina (0.305 g, 2.5 I mmol). La solución fue llevada a temperatura ambiente y se agitó I durante 6 horas. La terminación de la reacción fue establecida por TLC. L a mezcla de reacción se concentró al vacío y se agregó etilo acetato para precipitar diisopropilo urea. Se filtró la suspensión. El filtrado se lavó con 5% de ácido clorhídrico acuoso, 5% de bicarbonato de sodio y agua. La capa orgánica combinada se secó i sobre sulfato sódico y se concentró para dar el producto crudo que se purificó por cromatografía de columna (50% EtOAC/Hexanos) para dar 11.87 g (88%) de AB. Éster etílico de ácido 3-[(6-amino-hexanoil)-etoxicarbonilmetil-aminoj-p'ropiónico AC AC Se disolvió éster etílico de ácido 3-{etoxicarbonilmetil-[6-(9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilamino)-hexanoil]-arnino}-propiónico AB (11.5 g, 21.3 mmol) en 20% de piperidina en dimetilformamida a 0°C. La solución continuó agitación durante 1 hora. La mezcla de reacción se concentró al vacío, se agregó agua al residuo, y el producto fue extraído con etilo acetato. El producto crudo se purificó por conversión en su sal de clorhidrato. Éster etílico de ácido 3-({6-[17-(1 ,5-dimetil-hexil)-10, 13-dimetil- 2,3,4,7,8,9,10,11,12, 13, 14, 15, 16,17-tetradecah idro-1 H-ciclopenta[a]-fenant re n-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}e toxica rbonilmet il-amino)-propiónico AD La sal de clorhidrato de éster etílico de ácido 3-[(6-amino- hexanoil)-etoxicarbonilmet¡l-am¡no]-propión¡co AC (4.7 g, 14.8 mmol) fue absorbida en diclorometano. La suspensión se enfrió a 0°C en hielo. Se agregó diisopropiletilamina (3.87 g, 5.2 mi, 30 mmol) a la suspensión. Se agregó colesterilo cloroformato (6.675 g, 14.8 mmol) a la solución resultante. La mezcla de reacción se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano y se lavó con 10% de ácido clorhídrico. El producto se purificó por cromatografía instantánea (10.3 g, 92%). Éster etílico de ácido 1-{6-[17-(1 ,5-dimetil-hexil)-10, 13-dimetil-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16, 7-tetradecahidro- H-ciclopentaIa]-fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-4-oxo-pirrolidina-3-carboxílico AE AE Se suspendió t-butóxido de potasio (1.1 g, 9.8 mmol) en 30 mi de tolueno seco. La mezcla se enfrió a 0°C en hielo y 5 g (6.6 mmol) de diéster AD se agregó lentamente con agitación durante 20 minutos. La temperatura se mantuvo a menos de 5°C durante la adición. La agitación continuó durante 30 minutos a 0°C y se agregó 1 mi de ácido acético glacial, seguido inmediatamente por 4 g de NaH2P04 H20 en 40 mi de agua. La mezcla resultante fue extraída i dos veces con 10 mi de regulador de fosfato, se evaporó a sequedad. El residuo se disolvió en 60 mi de tolueno, se enfrió a 0°C y se extrajo con tres porciones de 50 mi de regulador de carbonato frío i pH 9.5. Los extractos acuosos se ajustaron a pH 3 con ácido fosfórico, y se extrajeron con cinco porciones de 40 mi de cloroformo que se jcombinaron, secaron y evaporaron a sequedad. El residuo se purificó' por cromatografía de columna usando 25% de etilacetato/hexano para dar 1.9 g de b-cetoéster (39%). Éster de 17-(1 ,5-dimetil-hexil)-10, 13-dimetil- 2,3,4,7,l8,9,10,11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecah¡dro-1 H-ciclopenta[a]-fenantrén-3-ilo de ácido [6-(3-hidroxi-4-hidroximetil-pirrolidin-1 -il)-6-oxo-hexil]-carbámico AF AF Se agregó metanol (2 mi) en forma de gotas sobre un periodo de 1 hora a una mezcla de reflujo de b-cetoéster AE (1.5 g, 2.2 mmol) y borhidrato sódico (0.226 g, 6 mmol) en tetrahidrofurano (10 mi). Continuó la agitación a temperatura de reflujo durante 1 hora. Después de enfriar a temperatura ambiente, se agregó 1N HCI (12.5 ml), la mezcla fue extraída con etilacetato (3 x 40 mi). La capa de etilacetato combinado se secó sobre sulfato sódico anhídrido y se concentró al vacío para dar el producto que se purificó por cromatografía de columna (10% MeOH/CHCI3) (89%).

Ester de 17-(1 ,5-dimetil-hexil)-10, 13-dimetil- 2,3,4,7,8,9,10,11,12, 13, 14, 15, 16,17-tetradecahidro- 1 H-ciclopenta[a]fenantren-3-ilo de ácido (6-{3-[bi-(4-metoxi-fenil)-fenil-metoximetil]-4-hidro i-pirrolidin-1-il}-6-oxo-hexil)-carbámico AG AC Se secó diol AF (1.25 g, 1.994 mmol) al evaporar con piridina (2 x 5 mí) al vacío. Se agregó piridina anhídrida (10 ml) y 4,4'-dimetoxitritilcíoruro (0.724 g, 2.13 mmol) con agitación. La reacción se llevó a cabo a temperatura ambiente durante la noche. La reacción se extinguió por la adición de metanol. La mezcla de reacción se concentró al vacío y se agregó al diclorometano de residuo (50 mi). La capa orgánica se lavó con 1M de bicarbonato de sodio acuoso. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhídrido, se filtró y concentró. La piridina residual fue eliminada al evaporar con tolueno. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna (2% de MeOH/Cloroformo, Rf = 0.5 en 5% MeOH/CHCI3) (1.75 g, 95%). Éster de mono-(4-[bi-(4-metoxi-fenil)-fenil-rnetox¡metil]-1 -{6- [17-(1 ,5-dimet¡l-hexil)-10, 13-dimetil- 2,3,4,7,8,9,10,11 ,12, 13,14, 15, 16,17-tetradecahidro- 1 H-ciclopenta[a]-fenantren-3-iloxicarbonilamino]-hexanoil}-pirrolidin-3-ilo) de ácido succínico AH AI-I Se mezcló el compuesto AG (1.0 g, 1.05 mmol) con anhídrido succínico (0.¡150 g, 1.5 mmol) y DMAP (0.073 g, 0.6 mmol) y se secó al vacío a 40°C durante la noche. La mezcla se disolvió en dicloroetano anhídrido (3 mi), trietilamina (0.318 g, 0.440 mi, 3.15 mmol) se agregó y la solución se agitó a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón durante 16 horas. Después se diluyó con diclorometano (40 mi) y se lavó con ácido cítrico acuoso frío en hielo (5% en peso, 30 mi) y agua (2 x 20 mi). La fase orgánica se secó sobre sulfato sódico anhídrido y se concentró a sequedad. El residuo se usó como tal para el siguiente paso.

CPG Al derivado de colesterol Se disolvió succinato AH (0.254 g, 0.242 mmol) en una mezcla de diclorometano/acetonitrilo (3:2, 3 mi). A esa solución DMAP (0.0296 g, 0.242 mmol) en acetonitrilo (1.25 mi), se agregó con éxito 2,2'-ditio-bi(5-nitropiridina) (0.075 g, 0.242 mmol) en acetonitrilo/dicloroetano (3:1, 1.25 mi). A la solución resultante se agregó trifenilfosfina (0.064 g, 0.242 mmol) en acetonitrilo (0.6 mi). La mezcla de reacción se volvió naranja brillante en color. La solución se agitó brevemente usando un agitador de acción con muñeca (5 minutos). Se agregó alquilamina-CPG de cadena larga (LCAA-CPG) (1.5 g, 61 mM). La suspensión se agitó durante 2 horas. El CPG se filtró a través de un embudo sinterizado y se lavó con acetonitrilo, diclorometano y éter con éxito. Los grupos amino no reaccionados fueron enmascarados usando anhídrido acético/piridina. La carga lograda del CPG se midió al tomar medición de UV (37 mM/g).

La síntesis de ARNics portando un grupo bidecilamida de ácido 5'-12-dodecanoico (en la presente referido como "5'-C32-") o un grupo derivado de 5'-colesterilo (en la presente referido como "5'-Col-") se realizó como se describe en WO 2004/065601, excepto que, para el derivado de colesterilo, el paso de oxidación se realizó usando el reactivo de Beaucage a fin de introducir una ligadura de fosforotioato en el extremo 5' del oligómero de ácido nucleico.

La síntesis de ARNdcs conjugados a Col-p-(GalNAc)3(N-acetil galactosamina - colesterol) (figura 16) y LCO(GalNAc)3(N-acetil galactosamina - 3'-litocólico-oleoilo) (figura 17) se describe en la solicitud de patente de E.U.A. número 12/328,528, presentada el 4 de diciembre de 2008, que se incorpora a la presente por referencia.

Ejemplo 3. Selección de PCSK9 ARNic en HuH7. HepG2. HeLa y hepatocítos de mono descubre secuencias altamente activas Se obtuvieron células HuH-7 de JCRB Cell Bank (colección japonesa de Research Bioresources) (Shinjuku, Japón, no. cat.: JCRB0403). Se cultivaron células en MEM de Dulbecco (Biochrom AG, Berlín, Alemania, no. cat. F0435) suplementado para contener 10% suero de ternero fetal (FCS) (Biochrom AG, Berlín, Alemania, no. cat. S0115), Penicilina 100 U/ml, Estreptomicina 100 Mg/ml (Biochrom AG, Berlín, Alemania, no. cat. A2213) y 2mM L-glutamina (Biochrom AG, Berlín, Alemania, no. cat. K0282) a 37°C en una atmósfera con 5% C02 en una incubadora humidificada (Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Alemania). Se obtuvieron células HepG2 y HeLa de American Type Culture Collection (Rockville, MD, no. cat. HB-8065) y se cultivaron en MEM (Gibco Invitrogen, Karlsruhe, Alemania, no. cat. 21090-022) suplementado para contener 10% de suero de ternero fetal (FCS) (Biochrom AG, Berlín, Alemania, no. cat. S0115), Penicilina 100 U/ml, Estreptomicina 100 pg/ml (Biochrom AG, Berlín, Alemania, no. cat. A2213),: 1x aminoácidos no esenciales (Biochrom AG, Berlín, Alemania, no. cat. K-0293), y 1mM piruvato sódico (Biochrom AG, Berlín, Alemania, no. cat. L-0473) a 37°C en una atmósfera con 5% C02 en una incubadora humidificadora (Heraeus HERAcell, Kendro Laboratory Products, Langenselbold, Alemania).

Para transfeccion con ARNic, se sembraron células HuH7, HepG2, a una densidad de 2.0 x 104 células/pozo en placas de 96-pozo y se transfectaron directamente. La transfección de ARNic (30nM para selección de una sola dosis) se llevó a cabo con lipofectamina 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania, no. cat. 11668-019) como se describe por el fabricante. 24 horas después de la transfección se lisaron células HuH7 y HepG2 y se ' cuantif icaron los niveles de PCSK9 ARNm con el kit Quantigene Explore (Genospectra, Dumbarton Circle Fremont, EUA, no. cat. QG-000-02) de acuerdo con el protocolo. Se normalizaron los niveles de PCSK9 ARNm a GAP-DH ARNm. Para cada ARNic se recolectaron ocho puntos de datos individuales. Se usaron dúplex de ARNic no relacionados al gen PCSK9 como control. La actividad de un dúplex de ARNic específico de PCSK9 dado se expresó como concentración de PCSK9 ARNm de por ciento en células tratadas relativo a la concentración de PCSK9 ARNm en células tratadas con el dúplex de ARNic de control.

Se obtuvieron hepatocitos de mono cinomolgo primario (crioconservados) de In Vitro Technologies, Inc. (Baltimore, Maryland, EUA, no. cat. M00305) y se cultivaron en medio InVitroGRO CP (no. cat. Z99029) a 37°C en una atmósfera con 5% C02 en una incubadora humidificada.

Para transfección con ARNic, se sembraron células de mono cinomolgo primario en placas recubiertas con colágeno (Fishér Scientific, no. cat. 08-774-5) a una densidad de 3.5 x 104 células/pozo en placas de 96-pozo y se transfectaron directamente. La transfección de ARNic (ocho series de dilución de 2 veces partiendo de 2mM) en duplicados se llevó a cabo con lipofectamina 2000 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania, no. cat. 11668-019) como se describe por el fabricante. 16 horas después del medio de transfección cambió a medio InVitróGRO CP fresco con mezcla Torpedo Antibiotic (In Vitro Technologies, Inc., cat. No. Z99000) agregada. 24 horas después de Usaron células de mono cinomolgo primario de cambio mediano y se cuantificaron los niveles de PCSK9 ARNm con el equipo Quantigene Explore Kit (Genospectra, Dumbarton Circle Fremont, EUA, no. cat. QG-000-02) de acuerdo con el protocolo. Se normalizaron los niveles de PCSK9 ARNm a GAPDH ARNm. Entonces se compararon las relaciones normalizadas de PCSK9/GAPDH a relación de PCSK9/GAPDH de lipofectamina 2000 sólo control.

Las tablas 1b y 2b (y la figura 6A) resumen los resultados y proveen ejemplos de selecciones in vitro en diferentes líneas celulares a dosis diferentes. Se expresó el silenciamiento de transcripción de PCSK9 como porcentaje de transcripción restante a una dosis dada.

Las secuencias altamente activas son aquellas con menos de 70% de transcripción restante después del tratamiento con un ARNic dado a una dosis de menos que o igual a 100nM. Las secuencias muy activas son aquellas que tienen menos de 60% de transcripción restante después del tratamiento con una dosis de menos de o igual a 100nM. Las secuencias activas son aquellas que tienen menos de 90% de transcripción restante después del tratamiento con una dosis alta (100nM).

Ejemplos de ARNics activos también se seleccionaron in vivo en ratón en formulaciones lipidoides como se describe más adelante. Las secuencias activas in vitro también fueron activas por lo general in vivo (ver figuras 6A y 6B y ejemplo 4).

Ejemplo 4. Selección de eficacia in vivo de PCSK9 ARNics Se probaron 32 PCSK9 ARNics en LNP-01 liposomas in vivo en un modelo de ratón. LNP01 es una formulación lipidoide de colesterol, mPEG2000-C14 glicérido, y ARNdc. La formulación LNP01 es útil para administrar ARNdcs al hígado.

Procedimiento de formulación El LNP-01-4HCI (MW 1487) lipidoide (figura 1), colesterol (Sigma-Aldrich), y PEG-Ceramida C16 (Avanti Polar Lipids) se usaron para preparar nanopartículas de lípido-ARNic. Se prepararon soluciones de reserva de cada uno en etanol: LNP-01, 133 mg/ml; colesterol, 25 mg/ml, PEG-Ceramida C16, 100 mg/ml. Entonces se combinaron soluciones de reserva de LNP-01, colesterol, y PEG-ceramida C16 en una relación molar de 42:48:10. Se mezcló con rapidez solución de lipido combinado con ARNic acuoso (en acetato de sodio pH 5) de modo que la concentración final de etanol fue 35-45% y la concentración final de acetato de sodio fue 100-300 mM. Se formaron nanopartículas de lipido-ARNic de manera espontánea al mezclar. Dependiendo de la distribución de tamaño de partícula deseada, la mezcla de nanopartículá resultante en algunos casos fue extrudida a través de una membrana de policarbonato (100 nm corte) usando un extrusor de termobarril (Lipex Extruder, Northern Lipids, Inc.). En otros casos, se omitió el paso de extrusión. Se logró eliminación de etanol e intercambio de regulador simultáneo por diálisis o filtración de flujo tangencial. Se intercambió el regulador a solución de salina regulada de fosfato (PBS) pH 7.2.

Caracterización de formulaciones Las formulaciones preparadas por el método estándar o libre de extrusión se ^caracterizan en una manera similar. Las formulaciones primero se caracterizan por inspección visual. Deben ser soluciones translúcidas blancas libres de agregados o sedimento. Se mide el tamaño de partícula y la distribución de tamaño de partícula de lípido-nanoparticulas por difusión de luz dinámica usando un Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, EUA). Las partículas deben ser 20-300 nm, e idealmente, 40-100 nm en tamaño. La distribución de tamaño de partícula debe ser unimodal. La concentración total de ARNic en la formulación, así como la fracción atrapada, se estima usando un ensayo de exclusión de tinte. Una muestra del ARNic formulado se incuba con el tinte de unión de ARN Ribogreen (Molecular Probes) en presencia o ausencia de una formulación interrumpiendo agente tensioactivo, 0.5% Triton-X100. El ARNic total en la formulación se determina por la señal desde la muestra que contiene el agente tensioactivo, relativo a una curva estándar. La fracción atrapada se determina al sustraer el contenido de ARNic "libre" (como se mide por la señal en la ausencia de agente tensioactivo) a partir del contenido de ARNic total. ARNic atrapado de porcentaje es típicamente >85%.

Dosificación de pildora Se realizó dosificación de pildora de ARNics formulados en ratones C57/BL6 (5/grupo, 8-10 semanas de edad, Charles River Laboratories, MA) por inyección en la vena de la cola usando una aguja 27G. Se formularon ARNics en LNP-01 (y después se dializaron contra PBS) a una concentración de 0.5 mg/ml permitiendo la administración de la dosis de 5 mg/kg en 10 µ?/g de peso corporal. Los ratones se mantuvieron bajo una lámpara infrarroja durante aproximadamente 3 minutos antes de la dosificación para facilitar la inyección. 48 horas después de la dosificación los ratones fueron sacrificados por asfixia con C02. Se recolectó 0.2 mi de sangre por sangrado retro-orbital y el hígado fue cultivado y congelado en nitrógeno líquido. Se almacenaron suero e hígados a -80°C. µ? Se trituraron los hígados congelados usando el triturador 6850 Freezer/Mill Cryogenic Grinder (SPEX CentriPrep, Inc.) y polvos almacenados a -80°C hasta análisis.

Se detectaron niveles de PCSK9 ARNm usando el equipo a base de tecnología de ADN ramificado de QuantiGene Reagent System (Genospectra) de acuerdo , con el protocolo. 10-20 mg de polvos de hígado congelado se lisaron en 600 µ? de 0.16 pg/ml de proteinasa K ^Epicentre, #MPRK092) en solución de lisis de tejido y célula (Epicentre, #MTC096H) a 65°C durante 3 horas. Después 10 µ? de los lisatos se agregaron a 90 µ I del reactivo de trabajo de lisis (1 volumen de reserva de mezcla de lisis en dos volúmenes de agua) y se incubaron a 52°C durante la noche en placas de captura Genospectra con series de sonda a PCSK9 de ratón y GAPDH de ratón o ciclofilina B. Se seleccionaron secuencias de ácido nucleico para sondas de extensor de captura (CE), extensor de etiqueta (LE) y bloqueo (BL) de las secuencias de ácido nucleico de PCS 9, GAPDH y ciclofilina B con la ayuda del software QuantiGene ProbeDesigner Software 2.0 (Genospectra, Fremont, CA, EUA, no. cat. QG-002-02). Se leyó quimoluminescencia en un Victor2-Light (Perkin Elmer) como unidades de luz relativa. La relación de PCSK9 ARNm a GAPDH o ciclofilina B ARNm en lisatos de hígado se promedió sobre cada grupo de tratamiento y se comparó con un grupo de control tratado con PBS o un grupo de control tratado con un ARNic no relacionado (factor VII de coagulación de sangre).

Se midió colesterol de suero total en suero de ratón usando el equipo StanBio Cholesterol LiquiColor kit (StanBio Laboratory, Boerne, Texas, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se tomaron ¡mediciones en un contador Victor2 1420 Multilabel Counter (Perkín Elmer) a 495 nm. i; Resultados Por lo menos 10 PCSK9 ARNics mostraron más de 40% de PCSK9 ARNm rebajado en comparación con un grupo de control tratado con PBS, mientras que el grupo de control tratado con un ARNic no relacionado (factor VII de coagulación de sangre) no tuvo efecto (figuras 2-3). Silenciar la transcripción de PCSK9 también se correlacionó con una reducción de colesterol de suero total en estos animales (figuras 4-5). Los ARNics más eficaces con respecto a derribar PCSK9 ARNms también mostraron los efectos reductores de colesterol más pronunciados (comparar las figuras 2-3 y las figuras 4-5). Además fue una correlación fuerte ente aquellas moléculas que eran activas in vitro y aquellas activas in vivo (comparar las figuras 6A y 6B).

Támbién se seleccionaron secuencias que contienen modificaciones químicas diferentes in vitro (tablas 1 y 2) e in vivo. Como un ejemplo, menos secuencias modificadas AD-9314 y AD-9318, y versiones más modificadas de esa secuencia AD-9314 (AD-10792, AD-10793 y AD-10796); AD-9318-(AD-10794, AD-10795, AD- 10797) se probaron tanto in vitro (en hepatocitos de mono primario) como in vivo (AD-9314 y AD-10792) formulados en LNP-01. La figura 7 (también ver talas 1 y 2) muestra que las moléculas origen AD-9314 y AD-9318 y las versiones modificadas fueron todas activas in vitro. La figura 8 como un ejemplo muestra que tanto el AD-9314 origen como las secuencias AD-10792 más altamente modificadas eran activas in vivo mostrando 50-60% de silencio de PCSK9 endógeno en ratones. La figura 9 ejemplifica más esa actividad de otras versiones químicamente modificadas de AD-9314 y AD-0792.

AD-3511, un derivado de AD-10792, fue tan eficaz como 10792 (IC50 de -0.07-0.2 nM) (datos no mostrados). Las secuencias de las cadenas de sentido y antisentido de AD-3511 son de la siguiente manera: Cadena de sentido: 5' - GccuGGAGuuuAuucGGAAdTsdT SEC ID NO: 1521 Cadena antisentido: 5' - puUCCGAAuAAACUCcAGGCdTsdT SEC ID NO: 1522 Ejemplo 5: Duración de PCSK9 de experimentos de acción Ratas Se trataron ratas vía inyección en la vena de la cola con 5mg/kg de LNP01-10792 (ALDP-10792 formulado). Se extrajo sangre en los puntos de tiempo indicados (ver tabla 3) y la cantidad de colesterol total en comparación con animales tratados con PBS se midió por medios estándar. Los niveles de colesterol total disminuyeron en el día dos ~60% y regresaron á la linea base en el día 28. Estos datos muestran que las versiones formuladas de PCSK9 ARNics reducen los niveles de colesterol durante periodos de tiempo extendidos.

Monos Se trataron monos cinomolgos con LNP01 y se evaluaron los niveles de ARNdc formulado y LDL-C. Un total de 10 monos cinomolgos fueron asignados a grupos de dosis. Comenzando en el día 11, los animales fueron alimentados con límite dos veces al día de acuerdo con el siguiente horario: alimentación a las 9 a.m., eliminación de alimentación a las 10 a.m., alimentación a las 4 p.m., eliminación de alimentación a las 5 p.m. En el primer día de dosificación todos los animales fueron dosificados una vez vía infusión intravenosa de 30 minutos. Los animales fueron evaluados para cambios en señales clínicas, peso corporal, e índices de patología clínicos, incluyendo colesterol directo de LDL y HDL.

Sé usó venopunción a través de la vena femoral para recolectar muestras de sangre. Se recolectaron muestras antes de la alimentación de la mañana (es decir, antes de las 9 a.m.) y a aproximadamente 4 horas (comenzando a la 1 p.m.) después de la alimentación de la mañana en los días -3, -1, 3, 4, 5 y 7 para los grupos 1-7; en el día 14 para los grupos 1, 4 y 6; en los días 18 y 21 para el grupo 1; y en el día 21 para los grupos 4 y 6. Por lo menos dos muestras de 1.0 mi fueron recolectadas en cada punto de tiempo.

No se agregó anticoagulante a las muestras de suero de 1.0 mi, y se agregó el anticoagulante seco ácido etilendiaminatetraacético (K2) a cada ' muestra de plasma de 1.0 mi. Se dejaron reposar muestras de suero a temperatura ambiente durante por lo menos 20 minutos para facilitar la coagulación y después se colocaron las muestras en hielo. Las muestras de plasma se colocaron en hielo tan pronto como fue posible después de la colección de muestra. Se transportaron muestras al laboratorio de patología clínica dentro de 30 minutos para procesamiento adicional.

Se procesaron muestras de sangre a suero o plasma tan pronto como fue posible usando un centrífugo refrigerado, por procedimiento de operación Testing Facility Standard. Cada muestra se dividió en 3 volúmenes aproximadamente iguales, congelados con rapidez en nitrógeno líquido, y se colocaron a -70°C. Cada alícuota tuvo que tener un mínimo de aproximadamente 50 µ: Si el volumen de muestra total recolectada fue bajo 150 µ?, el volumen de muestra residual se fue en el último tubo. Cada muestra fue etiquetada con el número del animal, grupo de dosis, día de recolección, fecha, tiempo de colección nominal, y número(s) de estudio. Se midió colesterol de LDL de suero directamente por procedimientos estándar en un analizador Beckman de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Los resultados se muestran en la tabla 4. LNP01-10792 y LNP01-9680 administrados a 5 mg/kg disminuyeron el colesterol de LDL de suero en 3 a 7 días después de la administración de la dosis. El colesterol de LDL de suero regresó a los niveles de línea base en el día 14 en la mayoría de los animales recibiendo LNP01-10792 y en el día 21 en animales recibiendo LNP01-9680. Estos datos demostraron una duración mayor a 21 días de acción para reducir colesterol de ALDP-9680 formulado con LNP01.

Ejemplo 6. PCSK9 ARNics causan PCSK ARNm disminuido en extractos de hígado, y reducen niveles de colesterol de suero Para probar si el silencio agudo de la transcripción de PCSK9 por un PCSK9 ARNic (y regulación descendente de proteína de PCSK9 posterior), resultaría en niveles de colesterol total agudamente menores, se formuló molécula de ARNic AD-1a2 (AD-10792) en ,una formulación lipidoide de LNP01. Se muestran secuencias y modificaciones de estos ARNdcs en la tabla 5a. Se inyectó ARNic dúplex AD-1a2 (LNP01-1a2) formulado liposomal vía la vena de la cola en volúmenes bajos (-0.2 mi para ratón y -1.0 mi para ratas) a dosis diferentes en ratones C57/BL6 o ratas Sprague Dawley.

En ratones, se cosecharon hígados 48 horas después de la inyección, y se determinaron los niveles de transcripción de PCSK9. Además del hígado, se cosechó sangre y se sometió a un análisis de colesterol total. LNP01-1a2 exhibió una respuesta de dosis clara con supresión de mensaje de PCS 9 máxima (-60-70%) en comparación con una luciferasa focalizadora de ARNic de control (LNP01-ctrl) o animales tratados con PBS (figura 14A). La disminución de transcripción de PCSK9 a la dosis más alta se tradujo en una reducción de ~30% del colesterol total en ratones (figura 14B). Este nivel de reducción de colesterol es entre aquella registrada para ratones de PCSK9 heterocigotos y homocigotos (Rashid y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 102:5374-9, 2005, epub 1 de abril de 2005). De esta manera, la reducción de transcripción de PCSK9 a través de un mecanismo de ARNi es capaz de reducir agudamente colesterol total en ratones. Además, el efecto en la transcripción de PCSK9 persistió entre 20-30 días, con dosis mayores exhibiendo reducción de nivel de transcripción inicial mayor, y posteriormente efectos más persistentes.

La modulación descendente de colesterol total en ratas ha sido históricamente difícil en cuanto a que los niveles de colesterol permanecen sin cambios incluso a dosis altas de inhibidores de HMG-CoA reductasa. De manera interesante, en comparación con ratones, las ratas parecen tener un nivel mucho más alto de niveles de transcripción básales de PCSK9 como se midió por ensayos de ADNb. Las ratas fueron dosificadas con una sola inyección de LNP01-a2 vía la vena de la cola a 1, 2.5 y 5 mg/kg. Se cosechó tejido de hígado y sangre 72 horas después de la inyección. LNP01-1a2 exhibió un efecto de respuesta a dosis clara con máximo 50-60% de silencio de la transcripción de PCSK9 a la dosis más alta, en comparación con un ARNic de luciferasa de control y PBS (figura 10A). El silencio de ARNm se asoció con una reducción aguda de ~50-60% de colesterol de suero total (figuras 1 OA y 10B) durando 10 días, con un retorno gradual a niveles pre-dosis por ~3 semanas (figura 10B). Este resultado demostró que la reducción de PCSK9 vía focalización de ARNic tuvo efectos agudos, potentes y duraderos en colesterol total en el sistema de modelo de rata. Para confirmar que la reducción de transcripción observada fue debido a un mecanismo de ARNic, se sometieron extractos de hígado de animales tratados y de control a 5' RACE, un método previamente utilizado para demostrar que el evento de corte de ARNic predicho ocurre (Zimmermann y otros, Nature. 441:111-4, 2006, Epub 26 de marzo de 2006). Se observó amplificación por PCR y detección del evento de corte de ARNm específico de sitio predicho en animales tratados con LNP01 -1 a2, pero no animales de control de PBS o LNP01-ctrl. (Frank- amánetsky y otros (2008) PNAS 105:1197 5- 1920). Este resultado demostró que los efectos de LNP01-1a2 observados fueron debido a corte de la transcripción de PCSK9 vía un mecanismo específico de ARNic.

El mecanismo por el cual PCSK9 impacta los niveles de colesterol se ha ligado al número de LDLRs en la superficie celular. Las ratas (a diferencia de los ratones, NHP, y humanos) controlan sus niveles de colesterol a través de regulación apretada de síntesis de colesterol y a un grado menor a través del control de los niveles de LDLR. Para investigar si la modulación de LDLR estuvo ocurriendo durante la focalización terapéutica con ARNi de PCSK9, se cuantificarb!n los niveles de LDLR de hígado (vía western blotting) en ratas tratadas con 5mg/kg LNP01-1a2. Como se muestra en la figura 11, los animales tratados con LNP01-1a2 tuvieron una inducción significativa (promedio de ~3-5 veces) de niveles de LDLR 48 horas después de una dosis de LNP01-1a2 en comparación con animales tratados con ARNíc de control de PBS o LNP01-ctrl.

También se realizaron ensayos para probar si la reducción de PCSK9 cambia los niveles de triglicéridos y coiesterol en el hígado en sí. La reducción aguda de genes involucrados en ensamble de VLDL y secreción tal como proteína de transferencia de triglicérido microsomal ( TP) o ApoB por omisión genética, compuestos, o inhibidores de ARNic resulta en triglicéridos de hígado aumentados (ver, por ejemplo, Akdim y otros, Curr. Opin. Lipidol. 18:397-400, 2007). El espacio aumentado de coiesterol de plasma inducido por silencio de PCSK9 en el hígado (y un aumento posterior en los niveles de LDLR de hígado) no fue predicho para resultar en acumulación de triglicéridos de hígado. Sin embargo, para dirigir esta posibilidad, se cuantificaron las concentraciones de coiesterol de hígado y triglicérido en hígados de los animales tratados o de control. Como se muestra en la figura 10C, no hubo diferencia estadística en niveles de TG del hígado o niveles de coiesterol de ratas administradas PCSK9 ARNics en comparación con los controles. Estos resultados indicaron que el silencio de PCSK9 y reducción de coiesterol posterior no es probable que resulte en acumulación de lípido hepático en exceso.

Ejemplo 7. Modificaciones adicionales a ARNics no afectan el silencio v duración de reducción de colesterol en ratas Las modificaciones de fosforotioato en los extremos 3' de ambas cadenas de sentido y antisentido de un ARNdc pueden proteger contra exonucleasas. Las modificaciones de 2'OMe y 2'F en ambas cadenas de sentido y antisentido de un ARNdc pueden proteger contra endonucleasas. AD-1a2 (ver tabla 5b) contiene modificaciones de 2'OMe en ambas cadenas de sentido y antisentido. Se realizaron experimentos para determinar si la estabilidad inherente (como se midió por estabilidad de ARNic en suero humano) o el grado o tipo de modificación química (2'OMe contra 2'F o una mezcla) se relacionó a la eficacia de rata observada o la duración de efectos de silencio. La estabilidad de ARNics con la misma secuencia de núcleo de AD-1a2, pero conteniendo diferentes modificaciones químicas se crearon y probaron para actividad in vitro en hepatocitos de mono ciño primario. Una serie de estas moléculas que mantuvieron actividad similar como se midió por valores IC50 in vitro para silencio de PCSK9 (tabla 5b), entonces se probaron para su estabilidad contra corte de exo y endonucleasa en suero humano. Cada dúplex se incubó en suero humano a 37°C (un curso de tiempo), y se sometió a análisis de HPLC. La secuencia origen AD-1a2 tuvo un T1/2 de ~7 horas en suero humano reunido. Las secuencias AD-1a3, AD-1a5 y AD-1a4, que fueron modificadas más pesadamente (ver modificaciones químicas en la tabla 5) todas tuvieron T ½'s mayores a 24 horas. Para probar si las diferencias en modificación química o estabilidad resultaron en cambios en eficacia, se formularon secuencias de control de AD-1a2, AD-1a3, AD-1a5, AD-1a4 y AD y se inyectaron en ratas. Se recolectó sangre de animales a varios días posteriores a la dosis, y se midieron las concentraciones totales de colesterol. Los experimentos previos han mostrado una correlación muy apretada entre la reducción de niveles de transcripción de PCSK9 y valores de colesterol total en ratas tratadas con LNP01-1a2 (figura 10A). Todas las cuatro moléculas se observaron para reducir el colesterol total por ~60% día 2 posterior a la dosis (contra PBS o ARNic de control), y todas las moléculas tuvieron efectos iguales en niveles de colesterol total mostrando perfiles similares de magnitud y duración. No hay diferencia estadística en la magnitud de reducción de colesterol y la duración de efecto demostrada por estas moléculas, sin importar sus químicas diferentes o estabilidades en suero humano.

Ejemplo 8. LNP01-1a2 y LNP01-3a1 silencian PCSK9 humano y proteína de PCSK9 humano circulante en ratones transgénicos La eficacia de LNP01-1a2 (es decir, PCS-A2 o AD-10792) y otra molécula, AD-3a1 (es decir, PCS-C2 o AD-9736) (que focaliza sólo mensaje de PCSK9 humano y de mono), para silenciar el gen PCSK9 humano se probó in vivo. Se usó una línea de ratones transgénicos expresando PCSK9 humano bajo el. promotor ApoE (Lagace y otros, J Clin Invest. 116:2995-3005, 2006). Se diseñaron reactivos y anticuerpos de PCR específicos que detectaron las transcripciones humanas pero no de ratón y proteína, respectivamente. Se inyectaron cohortes de los ratones humanizados con una sola dosis de LNPQ1-1a2 (alias LNP-PCS-A2) o LNP01-3a1 (alias LNP-PCS-C2), y 48 horas después se recolectó hígados y sangre. Una sola dosis de LNP01-1a2 o LNP01-3a1 fue capaz de disminuir los niveles de transcripción de PCSK9 humano por >70% (figura 15A), y esta regulación descendente de transcripción resultó en niveles significativam.ente menores de proteína de PCSK9 humana circulante como se midió por ELISA (figura 15B). Estos resultados demostraron que ambos ARNics fueron capaces de silenciar la transcripción humana y posteriormente reducir l cantidad de proteína de PCSK9 humano de plasma circulante.

Ejemplo 9. Se regulan los niveles de PCSK9 secretado por dieta en NHP En ratones, se regulan los niveles de PCSK9 ARNm por el elemento regulador esterol de factor de transcripción uniendo proteína 2 y se reducen por ayuno. En la práctica clínica, y estudios de NHP estándar, se miden los niveles de colección de sangre y colesterol después de un periodo de ayuno durante la noche. Esto se debe en parte al potencial para cambios en TGs circulantes para interferir con el cálculo de valores de LDLc. Dada la regulación de niveles de PCSK9 al ayunar y alimentar comportamiento en ratones, se realizaron experimentos para entender el efecto de ayunar y alimentar en NHP.

Se aclimataron monos ciño a un horario e alimentación de dos veces al día durante lo cual se eliminó el alimento después de un periodo de una hora. Los animales fueron alimentados de 9-10 am en la mañana, después de lo cual se eliminó la comida. Los animales después fueron alimentados una vez más durante una hora entre 5pm-6pm con eliminación posterior del alimento. Se extrajo sangre después de un ayuno durante la noche (6pm hasta 9am la mañana siguiente), y una vez más, 2 y 4 horas después de la alimentación de las 9am. Los niveles de PCSK9 en plasma de sangre o suero se determinaron por ensayo de ELISA (ver Métodos). De manera interesante, se descubrió que los niveles de PCSK9 circulantes fueron más altos después del ayuno durante la noche y disminuyeron 2 y 4 horas después de la alimentación. Estos datos fueron consistentes con modelos roedores en donde los niveles de PCSK9 fueron altamente regulados por ingesta de alimento. Sin embargo, de manera inesperada, los niveles de PCSK9 bajaron durante las primeras pocas horas después de la alimentación. Este resultado permitió un experimento de NHP diseñado con más cuidado para sondear la eficacia de AD-1a2 formulado y otro PCSK9 ARNic (AD-2a1) que fue altamente activo en hepatocitos de ciño primario.

Ejemplo 10. PCSK9 ARNics reducen LDLc circulante. ApoB y PCSK9. pero no HDLc en primates no humanos (NHPs), Los ARNics focalizando PCSK9 redujeron agudamente tanto los niveles de PCSK9 como de colesterol total por 72 horas posteriores a la dosis y duraron ~21-30 días después de una sola dosis en ratones y ratas. Para extender estos descubrimientos a una especie cuyos perfiles de lipoproteína imitan más cercanamente aquella de humanos, se realizaron más experimentos en el modelo de mono cinomolgo (Ciño).

Se administraron ARNic 1 (LNP01 -10792) y ARNic 2 (LNP-01-9680), ambos focalizando PCSK9 a monos cinomolgos. Como se muestra en la figura 12, ambos ARNics causaron reducción de lípido significativa durante hasta 7 días después de la administración. ARNic 2 causó ~50% de reducción de lípido durante al menos 7 días después de la administración, y ~60% de reducción de lípido en el día 14 después de la administración, y ARNic 1 causó ~60% de reducción de LDLc durante al menos 7 días.

Primero se pre-seleccionaron cinos machos para aquellos que tuvieron LDLc de 40mg/dl o más. Entonces los animales elegidos fueron puestos en un régimen de ayuno/dieta alimenticia y se aclimataron durante 11 días. En el día ~3 y -1 previos a la dosis, se extrajo suero en ambos puntos de tiempo de ayuno y 4 horas posteriores a la alimentación y se analizaron los niveles de colesterol total (Te), LDL (LDLc), colesterol de HDL (HDLc), así como triglicéridos (TG) y plasma de PCSK9. Los animales fueron escogidos de manera aleatoria con base en sus niveles de LDLc del día -3. En el día de dosificación (día designado 1), 1 mg/kg o 5 mg/kg de LNP01-1a2 y 5mg/kg LNP01-2a1 fueron inyectados, junto con PBS y 1 mg/kg LNP01-ctrl como controles. Todas las dosis fueron bien toleradas con ningún descubrimiento en vida. Conforme progresó el experimento se hizo evidente (con base en la reducción de LDLc) que la dosis menor no fue eficaz. Por lo tanto, los animales del grupo PBS fueron dosificados en el día 14 con 5mg/kg LNP01-ctrl control ARNic, que después pudo servir como un control adicional para los grupos de dosis alta de 5 mg/kg LNP01-1a2 y 5 mg/kg LNP01-2a1. Al inicio se extrajo sangre de animales en los días 3, 4, 5 y 7 posteriores a , la dosis y se midieron las concentraciones de Te, HDLc, LDLc y TGs. Se llevaron a cabo extracciones adicionales de sangre de los grupos de dosis alta de LNP01-1a2, LNP01-2a1 en el día 14 y día 21 posteriores a la dosis (ya que los niveles de LDLc no regresaron a la línea base por el día 7).

Como se muestra en la figura 12A, una sola dosis de LNP0-1a2 o LNP01-2a1 resultó en una reducción estadísticamente significativa de LDLc comenzando en el día 3 posterior a la dosis que regresó a la línea base sobre -14 días (para LNP01-1a2) y -21 días (LNP01-2a1). Este efecto no fue observado en el PBS, los grupos de ARNic de control, o los grupos de tratamiento de 1 mg/kg. LNP01-2a1 resultó en una reducción promedio de LDLc de 56% 72 horas después de la dosis, con 1 a 4 animales logrando casi 70% de LDLc, y todas las demás logrando >50% de disminución de LDLc, en comparación con niveles pre-dosis, (ver figura 12A). Como se espera, la reducción de LDLc en los animales tratados también se correlacionan con una reducción de niveles de ApoB circulantes como se midió por ELISA de suero (figura 12B). De manera interesante, el grado de reducción de LDLc observado en este estudio de mono ciño fue mayor que aquellos que han sido reportados para estatinas de dosis alta, así como, por ejemplo, otro estándar actual de compuestos de cuidado para hipercolesterolemia. El comienzo de acción también es mucho más agudo que aquél de estatinas con efectos siendo observados tan pronto como 48 horas posteriores a la dosis.

Los tratamientos de LNPQ1-1a2 ni LNP01-2a1 resultaron en una reducción de HDLc. De hecho, ambas moléculas resultaron (en promedio) en una tendencia hacia una relación disminuida de Tc/HDL (figura 12C). Además, los niveles de triglicéridos circulantes, y con la excepción de un animal, los niveles de ALT y AST no fueron impactados de manera significativa.

También se midieron los niveles de proteína de PCSK9 en animales tratados y de control. Como se muestra en la figura 11, los tratamientos con LNP01-1a2 y LNP01-2a1 cada uno resultó en tendencias hacia niveles de proteína de PCSK9 circulantes disminuidos contra la pre-dosis. Específicamente, LNP01-2a1 de ARNic más activo demostró reducción significativa de proteína de PCSK9 circulante contra PBS (día 3-21) y control de ARNic de LNP01-ctrl (día 4, día 7).

Ejemplo 11. Respuestas inmunes de modificaciones de ARNic a ARNics Se probaron ARNics para activación del sistema inmune en monocitos de sangre humana primaria (hPBMC). Se descubrió que dos secuencias inductoras de control y el compuesto parenteral no modificado AD-1a1 indujeron tanto IFN-alfa como TNF-alfa. Sin embargo, las versiones químicamente modificadas de esta secuencia (AD-1a2, AD-1a3, AD-1a5 y AD-1a4) así como AD-2a1 fueron negativas para inducción tanto de IFN-alfa como TNF-alfa en estos mismos ensayos (ver tabla 5, y figuras 13A y 13B). De esta manera, las modificaciones químicas son capaces de humedecer ambas respuestas IFN-alfa y TNF-alfa a moléculas de ARNic. Además, ni AD-1a2 ni AD-2a1 activaron IFN-alfa cuando se formuló en liposomas y probó en ratones.

Ejemplo 12. Evaluación de conjugados de ARNic Se conjugó AD— 10792 a GalNAc)3/colesterol (figura 16) o GalNAc)3/LCO (figura 17). La cadena de sentido se sintetizó con el conjugado en el extremo 3'. Los ARNics conjugados fueron probados para efectos en niveles de transcripción de PCSK9 y colesterol de suero total en ratones usando los métodos descritos más adelante.

Brevemente, los ratones fueron dosificados vía inyección en la cola con uno de los dos de ARNics o PBS en tres días consecutivos: día 0, día 1 y día 2 con una dosificación de aproximadamente 100, 50, 25 ó 12.5 mg/kg. Cada grupo de dosificación incluyó 6 ratones. 24 horas posteriores a la última dosificación, los ratones fueron dosificados y se obtuvieron muestras de sangre e hígado, se almacenaron, y procesaron para determinar niveles de PCSK9 ARNm y colesterol de suero total.

Los resultados se muestran en la figura 18. En comparación con PBS de control, ambos conjugados de ARNic demostraron actividad con un ED50 de 3 x 50 mg/kg de AD-10792 conjugado de GalNAc)3/colesterol y 3 x 100 mg/kg para AD-10792 conjugado de GalNAc)3/LCO. Los resultados indican que ARNic conjugado de colesterol con GalNAc son activos y capaces de silenciar PCSK9 en el hígado resultando en reducción de colesterol.

Dosificación de pildora La dosificación de pildora de ARNics formulados en ratones C57/BL6 (6/grupo, 8-10 semanas de edad, Charles River Laboratories, MA) se realizó por inyección de vena en la cola usando una aguja 27G. Se formularon ARNics en LNP-01 (y después se dializarpn contra PBS) y diluyeron con PBS a concentraciones 1.0, 0.5, 0.25 y 0.125 mg/ml permitiendo la administración de dosis de 100; 50; 25 y 12.5 mg/kg en 10 µ?/g de peso corporal. Los ratones se mantuvieron bajo una lámpara infrarroja durante aproximadamente 3 minutos antes de dosificar para facilidad de inyección. 24 horas posteriores a la dosis, los ratones fueron sacrificados por asfixia con C02. Se recolectó 0.2 mi de sangre por sangrado retro-orbital y el hígado fue cosechado y congelado en nitrógeno líquido. Se almacenaron suero e hígados a -80°C. Los hígados congelados fueron triturados usando el triturador 6850 Freezer/Mill Cryogeníc Grinder (SPEX CentriPrep, Inc.) y polvos almacenados a -80°C hasta análisis.

Se detectaron los niveles de PCSK9 ARNm usando el equipo a base de tecnología de ADN ramificado de QuantiGene Reagent System (Panomics, EUA) de acuerdo con el protocolo. 10-20 mg de polvos de hígado congelado se lisaron en 600 µ? de 0.16 pg/ml de proteinasa K (Epicentre, #MPRK092) en solución de lisis de tejido y célula (Epicentre, #MTC096H) a 65°C durante 3 horas. Después 10 µ? de los lisatos se agregaron a 90 µ I del reactivo de trabajo de lisis (1 volumen de reserva de mezcla de lisis en dos volúmenes de agua) y se incubaron a 52°C durante la noche en placas de captura Genospectra con series de sonda a PCSK9 de ratón y GAPDH de ratón. Se adquirieron series de sondas para PCSK9 de ratón y GAPDH de ratón de Panomics, EÜA. Se leyó quimoluminescencia en un Victor2-Light (Perkin Elmer) como unidades de luz relativa. La relación de PCSK9 ARNm a GAPDH ARNm en lisatos de hígado se promedió sobre cada grupo de tratamiento y se comparó con un grupo de control tratado con PBS o un grupo de control tratado con un ARNic no relacionado (factor VII de coagulación de sangre).

Se midió colesterol de suero total en suero de ratón usando el ensayo de colesterol total (Wako, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se tomaron mediciones en un contador Victor2 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) a 600 nm.

Ejemplo 13. Evaluación de ARNics formulados con lípi'do Brevemente, las ratas fueron dosificadas vía inyección en la cola con ARNics formulados con SNALP o PBS con una sola dosificación de aproximadamente 0.3:1 y 3mg/kg de AD-10792 formulado con SNALP. Cada grupo de dosificación incluyó 5 ratas. 72 horas posteriores a la dosificación las ratas fueron sacrificadas y se obtuvieron muestras de sangre e hígado, se almacenaron y procesaron para determinar PCSK9 ARNm y niveles de colesterol de suero total. Los resultados se muestran en la figura 19. En comparación con PBS de control, AD-10792 formulado con SNALP (figura 19A) tuvo un ED50 de aproximadamente 1.0 mg/kg tanto para reducir los niveles de transcripción de PCSK9 como los niveles de colesterol de suero total. Estos resultados muestran que la administración de ARNic formulada con SNALP resulta en silencio efectivo y eficiente de PCSK9 y reducción posterior de colesterol total in vivo.

Dosificación de pildora La dosificación de pildora de ARNics formulados en ratas de Sprague-Dawley (5/grupo, 170-190 g de peso corporal, Charles River Laboratories, MA) se realizó por inyección de vena en la cola usando una aguja 27G. Se formularon ARNics en SNALP (y después se dializaron contra PBS) y diluyeron con PBS a concentraciones 0.066; 0.2 y 0.6 mg/ml permitiendo la administración de dosis de 0.3; 1.0 y 3.0 mg/kg de AD-10792 formulado con SNALP en 5 µ?/g de peso corporal. Las ratas se mantuvieron bajo una lámpara infrarroja durante aproximadamente 3 minutos antes de dosificar para facilidad de inyección. 72 horas posteriores a la última dosis, las ratas fueron sacrificados por asfixia con C02. Se recolectó 0.2 mi de sangre por sangrado retro-orbital y el hígado fue cosechado y congelado en nitrógeno líquido. Se almacenaron suero e hígados a -80°C. Los hígados congelados fueron triturados usando el triturador 6850 Freezer/Mill Cryogenic Grinder (SPEX CentriPrep, Inc.) y polvos almacenados a -80°C hasta análisis.

Se detectaron los niveles de PCSK9 ARÑm usando el equipo a base de tecnología de ADN ramificado de QuantiGene Reagent System (Panqmics, EUA) de acuerdo con el protocolo. 10-20 mg de polvos de hígado congelado se lisaron en 600 pl de 0.16 pg/ml de proteinasa K (Epicentre, #MPRK092) en solución de lisis de tejido y célula (Epicentre, #MTC096H) a 65°C durante 3 horas. Después 10 µ? de los lisatos se agregaron a 90µ? del reactivo de trabajo de lisis (1 volumen de reserva de mezcla de lisis en dos volúmenes de agua) y se incubaron a 52°C durante la noche en placas de captura Genospectra con series de sonda a PCSK9 de ratón y GAPDH de ratón. Sé adquirieron series de sondas para PCSK9 de ratón y GAPDH de ratón de Panomics, EUA. Se leyó quimoluminescencia en un Victor2-Light (Perkin Elmer) como unidades de luz relativa. La relación de PCSK9 ARNm a GAPDH ARNm en lisatos de hígado se promedió sobre cada grupo de tratamiento y se comparó con un grupo de control tratado con PBS o un grupo de control tratado con un ARNic no relacionado (factor VII de coagulación de sangre).

Se midió colesterol de suero total en suero de ratón usando el ensayo de colesterol total (Wako, EUA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se tomaron mediciones en un contador Victor2 1420 Multilabel Counter (Perkin Elmer) a 600 nm.

Ejemplo 14. Selección de eficacia in vitro de desplazamiento de desadaptáción de AD-9680 y AD-14676 ; Los efectos de variaciones en secuencia o modificación en la efectividad de AD-9680 y AD-14676 fueron ensayados en células HeLa. Uñ número de variantes fueron sintetizados como se muestra en la figura 6.

Se colocaron en placas HeLa en placas 96-pozos (8,000-10,000 células/pozo) en 100 µ? 10% de suero bovino fetal en medio Modified Eagle Médium de Dulbecco (DMEM). Cuando las células alcanzaron aproximadamente 50% de confluencia (-24 horas después) fueron ¡ transfectadas con diluciones seriales de cuatro veces de ARNic iniciando a 10 nM. Se usó 0.4 pl de reactivo de transfección Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) por pozo y se realizaron transfecciones de acuerdo con el protocolo del fabricante. A saber, los complejos de ARNic:Lipofectamine™ 2000 fueron preparados de la siguiente manera. La cantidad apropiada de ARNic sé diluyó en medio de suero Opti-MEM I Reduced Serum Médium sin suero y se mezcló con cuidado. El Lipofectamine™ 2000 se mezclo con cuidado antes de usarse, después para cada pozo de una placa de 96-pozos se diluyó 0.4 µ? en medio de suero de 25 µ? de Opti-MEM I Reduced Serum Médium y se mezcló con cuidado y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación de 5 minutos, se combinó 1 µ? del ARNic diluido con la Lipofectamine™ 2000 diluida (volumen total es 26.4 µ?). El complejo se mezcló con cuidado y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir que se formen los complejos de ARNic: Lipofectamine™ 2000. Después 100 µ? de 10% de suero bovino fetal en DMEM se agregó a cada uno de los complejos de ARNic:Lifi)ofectamine™ 2000 y se mezclaron con cuidado al mecer la placa hacia adelante y atrás. Se agregó 100 µ I de la mezcla anterior a cada pozo conteniendo las células y las placas se incubaron a 37°C en una incubadora de C02 durante 24 horas, entonces el medio de cultivo fue eliminado y se agregó 100 µ? de 10% de suero bovino fetal en DMEM. 24 horas después del medio se eliminó el medio de cambio, se lisaron células y se ensayaron lisatos celulares para PCSK9 ARNm silenciando por ensayo de ADNb (Panomics, EUA) siguiendo el protocolo del fabricante. Se leyó quimoluminescencia en un Victor2-Light (Perkin Elmer) como unidades de luz relativa. La relación de PCS 9 ARNm a GAPDH ARNm en lisatos de hígado se comparó con aquella de las células tratadas con Lipofectamine™ 2000 sólo control.

La figura 20 es curvas de respuesta a dosis de una serie de compuestos relacionados con AD-9680. La figura 21 es una curva de respuesta a dosis de una serie de compuestos relacionados con AD-14676 (21A). Los resultados muestran que DFTs o desadaptaciones en ciertas posiciones son capaces de aumentar la actividad (como se evidenció por valores de IC50 menores) de ambos compuestos origen. Sin limitarse por ninguna teoría, se plantea la hipótesis que la desestabilización de la cadena sentido a través de la introducción de desadaptaciones, o DFT puede resultar en eliminación más rápida de la cadena sentido.

Ejemplo 15. Inhibición de expresión de PCSK9 en humanos Un sujeto humano es tratado con ARNdc focalizado a un gen PCSK9 para inhibir expresión del gen PCSK9 y niveles de colesterol menores durante un periodo de tiempo extendido siguiendo una sola dosis.

Un sujeto en necesidad de tratamiento es seleccionado o identificado. El sujeto puede estar en necesidad de reducción de LDL, reducción de LDL sin reducir HDL, reducción de ApoB, o reducción de" colesterol total. La identificación del sujeto puede ocurrir en un ajuste clínico, o de lo contrario, por ejemplo, en el hogar del sujeto a través del propio uso del sujeto de un equipo de auto-prueba.

En el tiempo cero, una primera dosis adecuada de un anti- PCSK9 ARNic se administra subcutáneamente al sujeto. El ARNdc se formula como se describe en la presente. Después de un periodo de tiempo siguiendo la primera dosis, por ejemplo, 7 días, 14 días y 21 días, la condición del sujeto es evaluada, por ejemplo, al medir LDL, ApoB, y/o niveles de colesterol total. Esta medición puede estar acompañada por una medición de expresión de PCSK9 en dicho sujeto, y/o los productos de la focalización de ARNic exitosa de PCSK9 ARNm. Otros criterios relevantes también se pueden medir. El número y resistencia de dosis se ajustan de acuerdo con las necesidades del sujeto.

Después del tratamiento, los niveles de LDL, ApoB y colesterol total del sujeto se reducen relativos a los niveles existentes antes del tratamiento, o relativos a los niveles medidos en un sujeto similarmente afligido pero no tratado.

Aquellos expertos en la técnica están familiarizados con métodos y composiciones además de aquellos establecidos específicamente en la presente descripción que les permitirán practicar esta invención al alcance completo de las reivindicaciones anexas a la presente.

Tabla 1a: secuencias de ADNdc focalizadas a PCS 9 pofttcidn SEC on SEC ID humano K> NO: Nombro * acceso MO: Secuencia de cadena de sentido (5'-3')l Secuencia de cadena de antisentido (5'-3l1 de NM 1749 dúptea J« " AD- 836-854 ÜGÜAUCUCCUAGACACC A3T sT 263 CUGGUCUC UACGAGAUACAT 3 T 262 9516 AD- 836-854 uGu/iucu C cuAGAcAe CAGT a T 263 UGGUGUCiiAGGAGAuAcAT ñ G 264 9642 AD- 840-85* UC 0 C C U AG AC ACC AGCAU AT sT 265 UAUGCUSGUSUCUAGGAGATsT 266 9562 AD- 840-858 UCUCCUAGAcAccAGcAuAT3T 267 uA'JGCUGGUGUC AGGAGAT sT 2fi8 9688 UfcUfcCfuAfgAXcAfcCfaGfcAfuA AD 840-858 269 p- 270 £T_T uAi uGicUigGfuGiuCi AfgG-dGfaTsT 14677 UfCfUfCÍCfUfAGACfACfCfAGCÍAU 271 AD- 840-858 U f Ai;fGV.f UfGGl.'íGU fC fU G AGCAGATr.T 272 ÍAT3T 14687 AD- 840-858 UcUcCuAgAcAcCaGcAuATaT 273 P- 274 uAfuGtoUfgGí GíuCf AfgGf aGtaTsT I (W7 AIV 840-858 UcUcCuAgAcAcCaGcAuAl'a'!' 275 üfAUf GCíUf GGU GUf Cf UfAGGAC-ATs? 276 14707 U f CU CcC í liAii £ A *cA £ cC í aGZc A f uA ??>- 840-858 277 UAüGCugGUguCUAGGdgdTSl' 278 fl'sT 14717 840-S58 u Í c r ? f c f f u t AG AC f AC f c AGC f AU AD- 279 UAUGCu g SU g u CU AGGa g a T 3 T 2T0 fAVflT 14727 AD- 840-858 UcücCuAgACAcCaGcAuATsr 28 L UAUGCugGUguCUAGGagaT37 282 14737 AígGfcCCuGígAfgUfuU CciUf ucrgG AD- 840-858 2Í p- 204 £TS7 cCrgAfaurdAC-aC íuCícACgGrcCíuTsT 15083 AGGC£C£U£uGAGU£UfU£AU£U£CCGG ci c : GAA J u f c C u i 840-858 2S5 r AAAC í re r AGG c c r r T S AD- 2.6 TsT T 15093 840-858 AgG cCuGgAg UuUa U uC. gGT ? T 287 p- 288 AD- CC ígAf.TJ faA f aC fuCfcAfgGfcC f ?'Gpt 15103 CfCÍGAA'JfAAACÍiUfCf CÍAGGCfCfüí'Ta 8J0-SSS AgG cCuGg Ag U uUa!J y CgGT s T 2S9 290 AD- T 151 13 AfqGfcCfuGfgAfq'JfuUfaUfuCfqG AD- 840-S5R 291 CC G AAü aAAcj C C AGG ce L TsT 292 f T»T 15123 AGGCfC fJf GGAG'Jf Uf'JfAU £'J í'CfGG AD- : 840-858 293 CCGAAuaAAcuCCACGccuTsT 294 TST 15133 j ?1> 840-858 AgCcCuGgAgUuUaUuCgGTsT 295 CCGAAuaAAcyCCAGGccuTsT 296 15143 AD- ; 8 I-859 CUCCUAGACACCAGCAUACTsT 297 GUA'JCCUGCUGUCUAGC-AGTsT 298 9521 AD- ' 8 1 -859 c u cc u AGA C Ac c A G CA*I AcT s 299 GüAiJGOUGGUGUCuAGGAGTsT 300 9647 ¡ 842-860 ÜCC UAG ACACCAG CAUACA sT 3Ci UG'JAUSCUGGUGUCUAGGATsT AD- 302 9611 AD- ' 842-860 CC UAGAc ACCAG CAuACAT 3T UGu AU G UGGU G UC UAGG AT 3T .304 9737 843-86I C CU AGAC ACCAGC AL'ACAG? sT 3o:> CUG'JAOSC GGUGUCUAGGTsT 306 AD- 9592 AD- 841-8 1 c.cu AGACACKAG CAUARAG T f.T 307 ;.GuAür;CÜGGüGUCUAGG7ST 308 9718 847-865 GACACCAGCAUACAGAGUGTsT 33 CACtfCUSIJAUGCUGGUGUCTsT AD- 310 9S61 AD- 847-865 GACACCAGCAUACAGAGUCTST .1 OAC"JCUGuAUGCUGGUC-UCTsT 312 9687 AD- 8SS-S73 CAU AC AG AGUG AC CAC CGGT sT 3:.3 C GG^SGUCACU TJGUAU TST 31 9636 Al 855-871 cAuAcAGAGuGAccAccGGTsT V. ¾ CCGG'JSGUcACUC'JGuAUSTsT 3 1 *5 9762 Al 860-878 AGAGU GAC ACCGGGAAAC TsT 317 AUü'JCCCGGUGGUCACUCUTsT 318 9340 AD- 860-878 AGAGuGAccAccGGGAAAuTsT 313 AU ;: UCC GG;JGG u A UCU T 7 320 9666 AD- 861 879 GAGUGACCACCGGGAAAUCTST 321 GA U'JCCCGG'JGGUCACUCTsT 322 9535 861-879 GAGuGACCACcGGGAAAuCTsT \2i AD- GAUÜ'JCfXGGíJGG'JcACyC'rnT 324 96 1 U, C, A, G: ribonucleótido correspondiente; T: desoxitimidina; u, c, a, i g: ribonucleótido de 2'-0-metilo; Uf, Cf, Af, Gf: ribonucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro; en donde los nucleótidos están escritos en secuencia, están conectados por grupos 3'-5' fosfodiéster; nucleótid s con "s" interpuesta se conectan por grupos 3'-0-5'-0 fosforotiodiéster; a menos que se denote por el prefijo "p-", los oligonucleotidos están desprovistos de un grupo 5'-fosfato en el más 5'-nucleótido; todos los oligonucleotidos portan 3'-OH en el más 3'-nucleótidp.

I I Tabla 1b. Selección de ARNics focalizados a PCSK9 Tabla 2a. Secuencias de A Mdc modificado focalizado a PC8 9 U, C, A, G: ribonucleótido correspondiente; T: desoxitimidina; u, c, a, g: ribonucleótido de 2'-0-metilo; Uf, Cf, Af, Gf: ribonucleótido de 2'-desoxi-2'-f luoro; en donde los nucleótidos están escritos en secuencia, están conectados por grupos 3'-5' fosfodiéster; nucleótidps con "s" interpuesta se conectan por grupos 3'-0-5'-0 fosforotiodiéster; a menos que se denote por el prefijo "p-", los oligonucleótidos están desprovistos de un grupo 5'-fosfato en el más 5'-nucleótido; todos los oligonucleótidos portan 3'-OH en el más 3'-nucleótido.

Tabla 2b. Selección de ARNdcs focalizados a PCSK9 Tabla 3. Niveles de colesterol de ratas tratadas con LNP01-10792 Dosificación de 5 mg/kg, n = 6 ratas por grupo Tabla 4. Niveles de LDL-C de suero de mono cinomolqos tratados con ARNdcs formulados con LNP LDL-C de suero (relativo a pre-dosis) Día 3 Día 4 Día 5 Día 7 Día 14 Día 21 PBS n = 3 1.053 ±0 965 ± 1.033 ± 1.033 ± 1.009 10.158 |0.074 |0.085 10.157 0.034 Tabla 5a: ARNdc modificado focalizado a PCSK9 GUGUCuAGGAGAuAcACCudTsdT 1518 AD-ctrl N/A 2'OMe 2'0 e cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT 1519 (Uuc.) UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT 1520 U, C, A, G: ribonucleótido correspondiente; T: desoxitimidina; u, c, a, g: ribonucleótido de 2'-0-metilo; Uf, Cf, Af, Gf: ribonucleótido de 2'-desoxi-2'-fluoro; en donde los nucleótidos están escritos en secuencia, están conectados por grupos 3'-5' fosfodiéster; nucleótidos con "s" interpuesta se conectan por grupos 3'-0-5'-0 fosforotiodiéster; a menos que se denote por el prefijo "p-", los oligonucleótidos están desprovistos de un grupo 5'-fosfato en el más 5'-nucleótido; todos los oligonucleótidos portan 3'-OH en el más 3'-nucleótido.

Tabla 5b: Actividad silenciadora de ARNdc modificado en hepatocitos de mono Nombre Posición en IFN-a/ TNF- Sentido Antisentido Heoatocitos humano # a Inducción de mono acceso cinomolao Drimario -IC50. nM AD-1a1 1091 Si/Si No No 0.07-0.2 modificado modificado AD-1a2 1091 No/No 2'OMe 2'OMe 0.07-0.2 AD-1a3 1091 No/No Alt 2'F, Alt 2'F, 0.07-0.2 2'OMe 2'OMe AD-1a4 1091 No/No 2'OMe 2'F todo Pi, 0.07-0.2 5' Fosfato AD-1a5 1091 No/No 2'F 2'F todo Pi, 0.07-0.2 5'Fosfato AD-2a1; 3530 No/No 2'OMe 2'OMe 0.07-0.2 (3'UTR) Ad-3a1 833 No/No 2'OMe 2'OMe 0.1-0.3 i AD-ctrl N/A No/No 2'OMe 2'O e N/A (Luc.)Í Ta bla 6 : ARN d c foca liza d o a P CS K9 : desadaptac i ones v mod ificaci ones # d* dú lex SEC D Cadena NO: Secuencia 9* a 3' s 1531 uucuAGAccuGuuuuGcuudTsdT AD-9680 AS 1532 AAGcAAAAcAGGUCuAGAAdTsdT S 1535 uucuAGAcCuGuuuuGciiuTsT AD-3267 AS 1536 AAGcAAAAcAGGl.lCuAGAATsT S 1537 uucuAGAccUGuuuuGcuuTsT A -3268 AS 1538 AAGcAAAAcAGGUCuAGAATsT s 1539 uucuAGAcCIXiuuuuGcuuTsT AD-3269 AS 1540 AAGcAAAAcAGGUCuAGAATsT S 1541 uucuAGAcYluGuuuuGcuuTsT AD-3270 AS 1542 AAGcAAAAcAGGUCuAGAATsT S 1543 uucuAGAcYlUGuuuuGcuuTsT AD-3271 AS 1544 AAGcAAAAcAGGUCuAGAATsT S 1545 uiicuAGAccY lGuuuuGcuuTsT AD-3272 AS 1546 AAGcAAAAcAGGUCuAGAATsT S 1 547 uucuAG AcCY 1 GuuuuGcuuTsT ! AI>-3273 i AS 1 S4X AAGcAAAAcAGGUCuAGAATsT S 1549 uucuAG AccuY I uuuuGcuuTsT AD-3274 AS 1550 AAGcA AAAcAGG UCu AGAATsT S 1551 uucuAGAcCUY 1 uuuuGcuu TsT AD-3275 AS 1552 AAGcAAAAcAGCiUOuAGAATsT S' 1553 UfuCfuAfgAtcCftiGfuüftiUfgCfuLlfTsT ??? 676 AS 1554 p-aA fgCfaAfaAfc AtgGf uCfuAfgA faTsT s 1555 UfuCfuAfgAfcCuGfuUfuUfgCfuün sT AD-3276 AS 1556 p-aAfgCfa Afa AfcAfgGf C fuAfgAraTsT s 1557 UfuCfuAfgAfcCnJGfuUrulJfgCfuUITsT AÜ-3277 AS 1558 p-aAi'gCfaAfaAfcAfgCfuCfliAfgAtaTsT S 1559 V fiaC (uA fgArcC UG fuUfulIfgC fuUfTsT AD-327X AS 1560 I aAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfiiAfgAfaTsT S 1561 UfuCfuAfgAftYl uGfuUluUf'gCfuUfTsT i AD-3279 AS 1562 p-aAf'gCfaAíaAfcAfgGfiiCfuAfgAfaTsT S 1563 UfuCfuAfgAfcYlUGfuUfuUfgCfuUlTs l' · A -3280 AS 1564 p-aAfgCraAraArcAfgGfuCruAfgAfaTs T AD-32H1 S 1565 UfuCfuArgAlcCfYlG JfuUfgCfuUITsT SECID # de dúplex Cadena NO: Secuencia 5' a 3" AS 1566 p-aAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuAfgAfaTsT s 1567 lifuCfuAfgAfcCYlGfuUf'uUf'gCfuUrrsT AD-3282 AS 1568 p-aAigCfaAfaAfcAfgGfuCf«AfgAfaTsT s 1 69 UfuCfuAfgAfcCfuY 1 uUfuU¾CfuUfT*T AD-3283 AS 1570 p-aAfgCfaAfaAfcAfgGfuCfuAfgAfaTsT S 1571 UfiiCfu AfgAfcCUY 1 uUfuUfgCfuUfTsT AD-3284 AS 1572 p-aAfgCfaAfaAfcAfgGfaCfuAfgAfaTsT Cadena: ;S/Sentido; AS/Antisentido U, C, A, G: ribonucleotido correspondiente; T: desoxitimidina; u, c, a, g: ribonu|cleót¡do de 2'-0-metilo; Uf, Cf, Af, Gf: ribonucleotido de 2'-desoxi-2'!-fluoro; en donde los nucleótidos están escritos en secuencia, están conectados por grupos 3'-5' fosfodiéster; nucleótid.os con "s" interpuesta se conectan por grupos 3'-0-5'-0 fosforotiodiéster; a menos que se denote por el prefijo "p-", los oligonucleótidos están desprovistos de un grupo 5'-fosfato en el más 5'-nucleó|tido; todos los oligonucleótidos portan 3'-OH en el más 3'-nucleótidp.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. - Una composición que comprende un ADNdc focalizado a un gen PCSK9 y una formulación de lípido que contiene 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1 ,3]-dioxolano (XTC), en donde la cadena antisentido de ARNdc es complementaria a SEC ID NO: 1523.

2. - Una composición que comprende un ARNdc focalizado a un gen PCSK9 y una formulación de lípido que comprende 1,2-dilinoleiloxi-N.N-dimetilaminopropano (DLinDMA), en donde la cadena antisentido de ARNdc es complementaria a SEC ID NO: 1523.

3. - La composición de conformidad con las reivindicación 1 ó 2, en donde la cadena sentido de ARNdc consiste de SEC ID NO: 1227 y la cadena antisentido de ARNdc consiste de SEC ID NO: 1228.

4. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde el ARNdc es ALDP-9680.

5. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde por lo menos una cadena del ARNdc incluye por lo menos un nucleotido modificado.

6. - La composición de conformidad con la reivindicación 5, en donde por lo menos uno de dicho ARNdc incluye por lo menos un nucleotido modificado seleccionado a partir del grupo que consiste de nucleótido 2'-0-metilo modificado, un nucleotido teniendo un grupo 5'-fosforotioato, un nucleótido terminal entrelazado a un derivado de colesterilo, un nucleótido 2'-desoxi-2'-fluoro modificado, un nucleótido 2'-desoxi-modificado, un nucleótido cerrado, un nucleótido abásico, un nucleótido 2'-am¡no-modificado, un nucleótido 2'-alquilo-modificado, un nucleótido de morfolino, un fosforamidato, y una base no natural que comprende nucleótido.

7. - La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 y 3-6, en donde la formulación de lípido comprende aproximadamente 40% de 2-2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1 ,3]-dioxolano, aproximadamente 10% de DSPC, aproximadamente 40% de colesterol, y aproximadamente 10% de PEG-C-DOMG.

8. - La composición de conformidad con las reivindicaciones 2-6, en donde la formulación de lípido comprenden aproximadamente 40% de 1 ,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetilarninopropano (DLinD A), aproximadamente 10% de DSPC, aproximadamente 40% de colesterol, y aproximadamente 10% de PEG-C-DOMG.

9. - La composición de conformidad con las reivindicaciones 1-8, en donde el ARNdc se conjuga a un ligando o a un agente que facilita la absorción sobre células hepáticas o a un agente seleccionado a partir del grupo que consiste de Col-p-(GalNAc)3(N-acetil galactosamina colesterol) o LCO(GalNAc)3(N-acetil galactosamina - 3'-litocólico-oleoilo).

10.- Un método para inhibir expresión de un gen PCSK9 en un sujeto, el método que comprende administrar una primera dosis de las composiciones de conformidad con las reivindicaciones 1-9 y después de un intervalo de tiempo opcionaimente administrando una segunda dosis del ARNdc en donde el intervalo de tiempo es no menos de 7 días.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde dicho método reduce colesterol de LDL de suero o reduce colesterol total o aumenta los niveles receptores de LDL (LDLR) o no resulta en un cambio en los niveles de triglicérido de hígado o niveles de colesterol de hígado en el sujeto.

12. El método de conformidad con la reivindicación 10 u 11, en donde la primera o segunda dosis del ARNdc se administra a aproximadamente 0.01, 0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 2.5, 3.0 ó 5 mg/kg.

13. El método de conformidad con las reivindicaciones 10-12, en donde el sujeto es un primate o un humano o un humano hiperlipidémico. ~\4.- El método de conformidad con las reivindicaciones 10-13, en donde el ARNdc se administra subdérmica o subcutánea o intravenosamente. 15.- El método de conformidad con las reivindicaciones 10-14, en donde un segundo compuesto es co-administrado con el ARNdc. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 15, en donde un segundo compuesto seleccionado a partir del grupo que consiste de un agente para tratar hipercolesterolemia, aterosclerosis y dislipidemia ¡o una estatina.